KR20210119427A - 암의 치료를 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

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KR20210119427A
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손기영
김재화
윤선영
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Abstract

한 측면에서, 고형 종양과 같은 신생물을 치료하기 위한 방법 및 조성물이 제공되며, 이 방법 및 조성물은 a) 과립구 집락-자극 인자(G-CSF) 화합물; 및 b) 1-팔미토일-2-리놀레오일-3-아세틸글리세롤(PLAG)과 같은 모노아세틸 디아실글리세롤 화합물을 포함한다.

Description

암의 치료를 위한 방법 및 조성물
ASCII 파일로 제출된 "서열 목록", 표(table) 또는 컴퓨터 프로그램 목록 부록에 대한 참조
2019년 1월 16일에 생성된 파일 055312-578F01WO_SL.txt에 작성된 시퀀스 목록, 1,703바이트, 머신 형식(machine format) IBM-PC, MS Windows 운영 체제는 여기에 참조로 포함된다.
한 측면에서, 종양(tumor)과 같은 신생물(neoplasia)을 치료하기 위한 방법 및 조성물이 제공되며, 이 방법 및 조성물은 a) 과립구 집락-자극 인자(granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF) 화합물 및 b) 1-팔미토일- 2-리놀레오일-3-아세틸글리세롤(1-palmitoyl-2-linoleoyl-3-acetylglycerol, PLAG)와 같은 모노아세틸 디아실글리세롤(monoacetyl diacylglycerol) 화합물을 포함한다.
암은 비정상적이고 통제되지 않는 세포 성장이 특징이다. 암은 신체의 모든 조직을 침범할 수 있으며, 발생(origin) 조직 외부로 퍼질 수 있다. 통제되지 않은 증식 및 기타 세포 이상은 암성 종양(cancerous tumor)의 형성으로 이어질 수 있다. 종양은 그들이 발생한 조직의 기능을 방해하고 파괴할 수 있으며, 암세포가 전이되면, 2차 종양이 1차 성장 부위 근처에서 또는 다르게 발달할 수 있다. 암의 원인은 다양한 화학 물질, 바이러스, 박테리아 및 환경 노출과 관련이 있다.
방사선 치료 및 다양한 화학 요법과 같은 현재의 암 치료법은 상당한 독성 및 기타 부작용을 내포하고 있다. 무엇보다도, 과립구 집락-자극 인자(G-CSF)의 사용은 제거 대상이 되는 암성 종양의 원치 않는 성장을 초래한다. 예를 들어, Voloshin et al., Blood, 118(12): 3426-3435(2011) 참조한다.
따라서 개선된 암 치료법을 개선하는 것이 바람직할 것이다.
한 측면에서, 우리는 이제 암으로 고통받는 환자의 치료 및 예방을 위한 새로운 치료법을 제공한다.
특정 측면에서, 과립구 집락-자극 인자(G-CSF) 화합물을 받았거나 또는 받을 환자를 포함하는, 환자에서 종양 성장을 감소 또는 억제하기 위한 방법 및 조성물이 제공된다.
한 측면에서, 본 방법은 다음의 치료적 유효량을 종양 또는 기타 신생물 (neoplasia)을 가지는 인간과 같은 대상에게 투여하는 것을 포함한다:
a) 과립구 집락-자극 인자(G-CSF) 화합물; 및
b) 화학식 (I)의 모노아세틸 디아실글리세롤 화합물:
Figure pct00001
(I),
여기서 R1 및 R2는 독립적으로 14 내지 20의 탄소 원자를 포함하는 지방산 기이다. a) G-CSF 화합물 및 b) 화학식 (I)의 모노아세틸 디아실글리세롤 화합물은 조합 또는 다른 조정된 방식으로 환자에게 적합하게 투여된다.
바람직한 측면에서, b) 모노아세틸 디아실글리세롤은 하기 화학식 II의 화합물이다:
Figure pct00002
(II).
화학식 (II)의 화합물은 또한 PLAG(1-팔미토일-2-리놀레오일-3-아세틸글리세롤) 또는 EC-18로 지칭된다.
의미 있게, 우리는 이제 PLAG와 같은 모노아세틸 디아실글리세롤 화합물의 사용이 암 종양 부피를 감소시킬 수 있다는 것을 발견했다. 이러한 종양 부피 암 감소는 환자가 G-CSF 화합물로 치료를 받는 동안 발생할 수 있으며, 모노아세틸 디아실글리세롤 화합물과의 조합된 투여 없이 G-CSF 화합물로 치료하여 발생할 수 있는 종양 부피 증가와 대조된다. 다음 실시예 1의 결과를 참조한다.
추가 측면에서, 피검자는 또한 a) G-CSF 화합물 및 b) 화학식 (I)의 모노아세틸 디아실글리세롤 화합물과 구별되는 c) 추가의 화학 요법제를 투여 받는다. 예를 들어, 별개의 화학요법제는 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 독소루비신(doxorubicin), 에토포시드(etoposide), 이포스파미드(ifosfamide), 메스나(mesna), 시스플라틴(cisplatin), 젬시타빈(gemcitabine) 및/또는 타목시펜(tamoxifen), 또는 하나 이상의 다른 화학 요법제일 수 있다.
특정 측면에서, 화학식 (I)의 모노아세틸 디아실글리세롤 화합물을 G-CSF 화합물과 함께 공동 투여하기 전에, 피검자는 화학식 (I)의 모노아세틸 디아실글리세롤 화합물없이 G-CSF 화합물로 이전에 치료받았을 것이다. 예를 들어, 환자는 모노아세틸 디아실글리세롤 화합물의 투여 없이 화학 요법제 요법(regime)과 함께 G-CSF 치료를 받을 수 있다. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7일, 또는 2, 3 또는 4주 이상의 이러한 G-CSF 요법 후, PLAG와 같은 화학식 (I)의 모노아세틸 디아실글리세롤 화합물이 지속적인 G-CSF 투여와 협력하여 환자에 투여될 수 있다.
추가의 측면에서, a) 과립구 집락-자극 인자(G-CSF) 화합물 및 b) PLAG(1-팔미토일-2-리놀레오일-3-아세틸글리세롤)와 같은 모노아세틸 디아실글리세롤 화합물을 포함하는 제약 조성물이 제공된다. 바람직한 약제학적 조성물은 피검자에서 고형 종양을 포함하는 암을 치료하는데 적합하다.
또 다른 측면에서, 고형 종양을 포함하는 신생물을 치료 또는 예방하기 위한 키트가 제공된다. 본 발명의 키트는 적합하게 a) 과립구 집락-자극 인자(G-CSF) 화합물; 및 b) PLAG(1-팔미토일-2-리놀레오일-3-아세틸글리세롤)와 같은 모노아세틸 디아실글리세롤 화합물을 포함할 수 있다. 바람직하게, 키트는 치료적 유효량의 각각의 G-CSF 화합물 및 PLAG와 같은 모노아세틸 디아실글리세롤 화합물을 포함할 것이다. 바람직한 키트는 또한 고형 종양과 같은 암을 치료하기 위한 PLAG 및 G-CSF 화합물의 사용에 대한 지침서를 포함할 수 있다. 지침은 적절하게 제품 라벨을 포함하는, 서면 형식일 수 있다.
도 1A는 종양을 보유하고 있는 마우스(tumor-bearing mice)에서 G-CSF와 조합된 EC-18의 효과를 평가하기 위한 실험 도면이다. 대조군은 PBS-처리(4마리, 대조군), 및 실험군은 G-CSF 투여 그룹(5마리, PEG-G-CSF), 젬시타빈 투여 그룹(5마리, Gemcitabine), G-CSF와 젬시타빈 동시 투여 그룹(5마리 마우스, Gem+PEG), EC-18 동시 투여 그룹(5마리 마우스, Gem+PEG+EC-18)으로 처리하였다.
도 1B는 도 1A의 실험에서 마우스의 체중, 종양 중량, 체중에 대한 종양 중량의 비율 및 비장 중량의 변화를 보여준다.
도 1C는 도 1A의 실험에서 종양을 보유하고 있는 마우스로부터 종양의 사진을 보여준다.
도 2A는 도 1A의 실험에서 종양을 보유하고 있는 마우스로부터의 종양 크기를 보여준다.
도 2B는 도 2A의 그래프의 수치를 나타내는 표이다.
도 3A-3B는 PLAG 처리에 의한 TAN((Tumor associated Neutrophil, 종양 관련 호중구) 및 G-CSF 공동-배양(co-culture)에서 유방암 세포의 비정상적인 전이의 억제를 보여준다. 도 3A는 TAN 및 G-CSF 공동 배양 환경에서 유방암 세포의 이동성 감소가 PLAG 처리에 효과적임을 보여준다. 녹색 형광은 세포골격(cytoskeleton)에서 발현되었고 핵은 PI로 염색되었다. 도 3B는 TAN 및 G-CSF 공동-배양 환경에서 PLAG 처리에 의한 암세포의 비정상적인 침습 억제를 확인하기 위해 트랜스웰(transwell) 침습 분석을 사용함을 보여준다.
도 4A-4D는 PLAG 처리에 의한 TAN 및 G-CSF 공동 배양에서 유방암 세포의 상피-중간엽 전이(EMT, epithelial-mesenchymal transition) 마커 발현의 변화를 보여준다. 도 4A는 EMT 마커 유전자의 발현을 확인하기 위해 겔 분리 방법을 사용함을 나타낸다. 도 4B-4D는 Image J를 사용한 표적 유전자(도 4B: snail/actin; 도 4C: vimentin/actin; 및 도 4D: NCAD/actin)의 밴드 강도의 정량을 보여준다.
도 5A-5B는 PLAG 처리에 의한 TAN 및 G-CSF 공동-배양에서 유방암 세포의 사이토카인 발현의 변화를 보여준다. 도 5A는 암 세포의 비정상적 전사 활성화제인 TGF-β의 분비를 ELISA로 확인한 것을 보여준다. 도 5B는 암 세포 활성화 억제제인 IFN-γ의 분비량을 ELISA로 정량적으로 확인한 것을 보여준다.
도 6A-6B는 PLAG 처리에 의한 TGF-β 신호전달 경로의 변화를 보여준다. 도 6A는 PLAG 처리에 의한 Smad 단백질 활성 정도를 Western blotting으로 확인한 것을 보여준다. 도 6B는 PLAG 처리에 의한 Smads 복합체 형성의 변화가 IP 방법으로 확인한 것을 보여준다.
도 7은 PLAG 처리에 의한 Smad2/3 전위 변화를 보여준다. PLAG 처리에 의한 Smad2/3 단백질의 핵 위치는 공초점(confocal)을 사용하여 정성적으로 검증되었다.
용어 PLAG, EC-18 및 1-팔미토일-2-리놀레오일-3-아세틸글리세롤은 본원에서 상호 교환 가능하게 사용되며 본원에서 동일한 화합물을 지정한다.
본원에 사용된 약어는 화학 및 생물 분야 내에서 그들의 통상적인 의미를 갖는다. 본원에 기재된 화학 구조 및 화학식은 화학 분야에서 공지된 화학 원자가의 표준 규칙에 따라 구성된다.
본원에 개시된 특정 화합물이 호변이성체(tautomeric) 형태로 존재할 수 있고, 이러한 모든 호변이성체 형태는 본 발명의 범위 내에 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다.
본원에서 사용된 용어 "a"또는 "an"은 하나 이상을 의미한다. 예를 들어, 단수 형태의 "a", "an" 및 "the"는 문맥상 명백하게 다르게 나타내지 않는 한, 복수 형태를 포함하도록 의도된다. “포함한다(comprise, include)”, “가지다(have)”등의 용어들도 추가적으로 이해될 것이다. 본 명세서에 사용될 때, 명시되어 있는 특징, 범위, 정수, 단계, 프로세스, 연산, 요소 및/또는 구성 요소의 존재를 명시하지만, 하나 이상의 다른 특징, 범위, 정수, 단계, 프로세스, 연산, 요소, 구성 요소 및/또는 이들의 조합의 존재 또는 추가를 배제하지는 않는다.
"제약상 허용되는 부형제(Pharmaceutically acceptable excipient)" 및 "제약상 허용되는 담체(pharmaceutically acceptable carrier)"는 활성제의 투여 및 피검자의 흡수를 돕는 물질을 지칭하며, 환자에게 상당한 유해 독성 영향을 유발하지 않고 본원발명의 조성물에 포함될 수 있다. 제약상 허용되는 부형제의 비-제한적인 예시로는 물, NaCl, 생리식염수 용액(normal saline solution), 링거제(lactated Ringer’s), 수크로스(normal sucrose), 포도당(normal glucose), 바인더(binder), 충진제(filler), 정제 분해 물질(disintegrants), 윤활제(lubricant), 코팅제(coating), 감미제(sweetener), 향료(flavor), 염 용액(salt solutions, 예: 링거액), 알코올(alcohol), 오일(oil), 젤라틴(gelatin), 락토오스(lactose)와 같은 탄수화물(carbohydrate), 아밀로오스(amylose) 또는 녹말(starch), 지방산 에스테르(fatty acid ester), 하이드록시메틸셀루로오스(hydroxymethycellulose), 폴리비닐피롤리딘(polyvinyl pyrrolidine) 및 착색제 등이다. 이러한 조제용 물질은 멸균될 수 있고, 필요하다면, 본 발명의 화합물과 유해하게 반응하지 않는 윤활제(lubricant), 보존제(preservative), 안정화제(stabilizer), 습윤제(wetting agent), 유화제(emulsifier), 삼투압에 영향을 미치는 염(salt), 완충제(buffer), 착색제(coloring) 및/또는 방향족 물질 등과 같은 보조제(auxiliary agent)와 혼합될 수 있다. 당업자는 기타 약제학적 부형제가 본 발명에 유용하다는 것을 인식할 것이다.
본 발명에 사용되는 “치료(treating)”, ”처리(treatment)”는 예방적인 치료를 포함한다. 치료 방법은 치료 유효량의 활성제를 피험자에게 투여하는 것을 포함한다. 투여 단계는 단일 투여로 구성될 수 있거나, 연이은 투여를 포함할 수 있다. 치료 기간은 질환의 심각성, 환자의 연령, 활성제의 농도, 치료에 사용되는 조성물의 활성 또는 이들의 조합과 같은 다양한 요인에 따라 달라진다. 또한, 치료 또는 예방에 사용되는 작용제의 유효량은 특정 치료 또는 예방 요법 과정 동안에 증가 또는 감소될 수 있다. 투여량이 변경될 수 있고, 당 업계에 공지된 표준 진단 분석에 의해 명백해질 수 있다. 경우에 따라서는, 만성 투여가 필요할 수 있다. 예를 들면, 상기 조성물은 환자를 치료하기에 충분한 양 및 충분한 기간동안 피검자에게 투여된다. “치료”라는 용어 및 그것의 결합(conjugations)은 부상, 병리, 상태 또는 질환의 예방을 포함할 수 있다. 구체적인 예시에서, 치료는 예방이다. 구체적인 예시에서, 치료는 예방을 포함하지 않는다.
"예방(prevent)"의 용어는 환자에게서 질환 증상의 발생이 감소되는 것을 지칭한다. 기재한 바와 같이, 예방은 치료를 받지 않는 경우보다 더 적은 증상이 관찰되도록, 완전하거나(예를 들어, 검출 가능한 증상이 없음), 부분적으로 이루어질 수 있다.
"환자(patient)", "피검자(피검자, subject)", "필요한 환자(patient in need thereof)" 및 "필요한 피검자(피검자, subject in need thereof)"는 본원발명에서 상호 교환적으로 사용되며, 본원에 명시된 약학적 조성물을 투여하여 치료될 수 있는 질환 또는 상태로 고통받거나, 발생하기 쉬운 살아있는 유기체를 지칭한다. 비제한적인 예로는, 인간, 다른 포유 동물, 소, 쥐(rat), 생쥐(mice), 개, 원숭이, 염소, 양, 소, 사슴 및 다른 비-포유류 동물이 포함된다. 일부 구체적인 예시에서, 환자 또는 피검자는 인간이다.
"유효량(effective amount)"은 화합물의 부재(예를 들어, 투여 효과, 질환 치료, 효소 활성 감소, 효소 활성 증가, 이화 효소 활성 감소 또는 질환 또는 상태의 하나 이상의 증상 감소)와 관련하여 명시된 목적을 달성하기에 충분한 양이다. "유효량"의 예시는 질환의 증상 또는 증상의 치료, 예방 또는 감소에 기여하기에 충분한 양이며, 이는 "치료적 유효량(therapeutically effective amount)"으로도 지칭될 수 있다. 증상의 “감소” 또는 증상(및 이 구문의 문법적 등가물)은 증상의 심각성 또는 빈도가 감소하거나, 증상이 제거되는 것을 의미한다. 약물의 "예방 유효량(prophylactically effective amount)"은 피검자에게 투여될 때, 예를 들면, 부상, 질환, 병리 또는 상태의 발병(또는 재발)을 예방 또는 지연시키거나, 부상, 질환, 병리 또는 상태 또는 그들의 증상의 발병(또는 재발)의 가능도(likelihood)를 감소시키는 등의 의도된 예방 효과를 가질 수 있는 약물의 양이다. 완전한 예방 효과가 반드시 1회 용량의 투여에 의해 발생하는 것은 아니며, 연이은 용량의 투여 후에만 발생할 수 있다. 따라서, 예방 유효량은 하나 이상의 투여로 투여될 수 있다. 본원에 사용된 "활성 감소량"은 길항제(antagonist)의 부재를 기준으로, 효소의 활성을 감소시키는데 필요한 길항제의 양을 지칭한다. 본원에 사용된 "기능 파괴량(function disrupting amount)"은 길항제의 부재를 기준으로, 효소 또는 단백질의 기능을 파괴하는데 필요한 길항제의 양을 지칭한다. 정확한 양은 치료의 목적에 따라 달라질 것이며, 공지된 기술을 사용하여 당업자에게 확인될 수 있다(예를 들면, Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms(vols. 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Pickar, Dosage Calculations (1999); and Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, 2003, Gennaro, Ed., Lippincott, Williams & Wilkins).
본원에 사용된 바와 같이, 피검자에 대한 요법의 투여와 관련하여 용어 "조합으로(in combination)"는 치료 이익을 위한 하나 이상의 요법의 사용을 지칭한다. 투여의 맥락에서 용어 "조합으로"는 또한 적어도 하나의 추가 요법과 함께 사용되는 경우 피검자에 대한 요법의 예방적 사용을 지칭할 수 있다. "조합으로" 용어의 사용은 요법(예를 들어, 제1 및 제2 요법)이 대상에게 투여되는 순서를 제한하지 않는다. 제1 요법(예를 들어, i) G-CSF 화합물 또는 ii) PLAG와 같은 화학식 (I)의 모노아세틸 디아실글리세롤 화합물의 투여)은 고형 종양으로 진단된 피검자를 포함하여 암을 가졌거나, 갖고 있거나 또는 이에 걸리기 쉬운 피검자에게 제2 요법(예를 들어, i) PLAG와 같은 화학식 (I)의 모노아세틸 디아실글리세롤 화합물 또는 ii) G-CSF 화합물의 투여)의 투여 이전에(예를 들어, 1분, 5분, 15분, 30분, 45분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 12 시간, 24 시간, 48시간, 72시간, 96시간 또는 최대 약 1 일주일 전), 그와 동시에, 또는 이후(예를 들어, 1분, 5분, 15분, 30분, 45분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간 또는 최대 약 1 일주일 후)에 투여될 수 있다. 요법은 요법이 함께 작용할 수 있도록 순서대로 그리고 시간 간격 내에서 피검자에게 투여된다. 특정 실시예에서, 요법은 다른 방식으로 투여되는 경우보다 증가된 이점을 제공하도록 순서로 그리고 시간 간격 내에서 피검자에게 투여된다. 임의의 추가 요법은 다른 추가 요법과 함께 임의의 순서로 투여될 수 있다.
용어 "증식성 장애(proliferative disorder)" 및 "증식성 질환(proliferative disease)"은 암과 같은 비정상적인 세포 증식과 관련된 장애를 지칭한다.
본원에 사용된 "종양(Tumor)" 및 "신생물(neoplasm)" 또는 유사한 용어는 양성(benign) 또는 전암성 병변(pre-cancerous lesion)을 포함하는 악성의 과도한 세포 성장 또는 증식으로 인한 조직의 임의의 덩어리를 지칭한다.
논의된 바와 같이, 본 발명의 방법 및 조성물은 a) 과립구 집락-자극 인자(G-CSF) 화합물; 및 b) PLAG와 같은 화학식 (I)의 모노아세틸 디아실글리세롤 화합물을 포함한다.
본 발명의 방법 및 조성물은 환자, 예를 들어 a) 과립구 집락-자극 인자(G-CSF) 화합물 및 b) PLAG와 같은 화학식 (I)의 모노아세틸 디아실글리세롤 화합물의 요법을 받는 암 환자에서 종양 성장을 효과적으로 감소 또는 억제할 수 있다. G-CSF와 PLAG의 공동 치료(co-treatment)는 종양 부피가 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50% 이상 감소할 수 있다.
매우 다양한 유형의 암이 본 발명의 방법 및 조성물에 따라 치료될 수 있다. 예를 들어, 치료할 암은 고형 종양일 수 있다. 본 발명이 사용될 수 있는 예시적인 암은 방광암(bladder cancer), 백혈병(leukemias)(예를 들어, 혈소판(kemia), 급성 림프구성 백혈병(acute lymphocytic leukemia), 급성 골수성 백혈병(acute myelocytic leukemia), 급성 단구성 백혈병(acute myeloblastic leukemia), 급성 전골수구성 백혈병(acute promyelocytic leukemia), 급성 골수 단핵구 백혈병(acute myelomonocytic leukemia), 급성 단핵구 백혈병(acute monocytic leukemia), 급성 적혈구 백혈병(acute erythroleukemia), 만성 백혈병(chronic leukemia), 만성 골수성 백혈병(chronic myelocytic leukemia), 만성 림프성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia)), 진성적혈구증가증(polycythemia vera), 림프종(lymphoma)(호지킨 병(Hodgkin's disease), 비-호지킨병(non-Hodgkin's disease)), 발덴스트롬 마크로글로불린혈증(Waldenstrom's macroglobulinemia), 중쇄병(heavy chain disease), 및 육종(sarcoma) 및 암종(carcinoma)(예를 들어, 섬유육종(fibrosarcoma), 점액육종(myxosarcoma), 지방육종(liposarcoma), 연골육종(chondrosarcoma), 골육종(osteogenic sarcoma), 척색종(chordoma), 혈관육종(angiosarcoma), 내피육종(endotheliosarcoma), 림프관육종(lymphangiosarcoma), 림프관내피육종(lymphangioendotheliosarcoma), 활막암(synovioma), 중피종(mesothelioma), 유윙 종양(Ewing's tumor), 평활근육종(leiomyosarcoma), 횡문근육종(rhabdomyosarcoma), 결장암(colon carcinoma), 췌장암(pancreatic cancer), 유방암(breast cancer), 난소암(ovarian cancer), 전립선암(prostate cancer), 위 및 식도암(gastric and esophageal cancer), 두경부암(head and neck cancer), 직장암(rectal cancer), 편평세포암종(squamous cell carcinoma), 기저세포암(basal cell carcinoma), 선암(adenocarcinoma), 한선 암종(sweat gland carcinoma), 피지선암종(sebaceous gland carcinoma), 유두모양암종(papillary carcinoma), 유두선암(papillary adenocarcinomas), 낭선암종(cystadenocarcinoma), 수질암종(medullary carcinoma), 기관지암(bronchogenic carcinoma), 신장세포암종(renal cell carcinoma), 간암(hepatoma), 나일관암(nile duct carcinoma), 융모막암(choriocarcinoma), 정상피종(seminoma), 배아암종(embryonal carcinoma), 빌름스종양(Wilm's tumor), 자궁경부암(cervical cancer), 자궁암(uterine cancer), 고환암(testicular cancer), 폐 암종(lung carcinoma), 소형 세포 폐 암종(small cell lung carcinoma), 방광 암종(bladder carcinoma), 상피 암종(epithelial carcinoma), 신경교종(glioma), 다형성교아종(glioblastoma multiforme), 성세포종(astrocytoma), 수모세포종(medulloblastoma), 두개인두종(craniopharyngioma), 뇌실막종(ependymoma), 송과체종(pinealoma), 혈관아세포종(hemangioblastoma), 청신경종(acoustic neuroma), 희소돌기신경교종(oligodenroglioma), 슈반세포종(schwannoma), 수막종(meningioma), 흑색종(melanoma), 신경모세포종(neuroblastoma) 및 망막모세포종(retinoblastoma))과 같은 고형 종양을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
집락-자극 인자 3(CSF 3)으로도 알려진 과립구-집락 자극 인자(G-CSF)는 골수의 조혈 전구체 세포를 자극하여 성숙한 과립구 및 줄기세포로 증식 및 분화하여 혈류로 그들을 방출하는 당단백질(glycoprotein)이다. 인간의 경우, 두 가지 활성 형태로 존재하며, 그 중 174개 아미노산 길이가 더 풍부하다: 다른 하나는 177개의 아미노산 길이다. 자연적으로 발생하는 G-CSF의 약학적 유사체(analog)는 인간 174-아미노산 펩타이드(rhG-CSF)의 재조합 형태이고 다음을 포함한다: 동일한 활성을 갖지만 N-말단 메티오닌(methionine) 잔기를 갖고 글리코실화(glycosylation)가 부족한 점에서 천연 당단백질과 다른 E. coli에서 제조된 필그라스팀(filgrastim)(예를 들어, Amgen의 Neupogen®); 포유동물 세포(중국 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary, CHO) 세포)에서 만들어지므로, 본질적으로 인간 G-CSF와 구별할 수 없는 레노그라스팀(lenograstim)(예를 들어, Chugai의 Granocyte®); 필그라스팀의 N-말단 메티오닐 잔기에 공유 결합된 20kD 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜(monomethoxypolyethylene glycol) 일부(moiety)를 가지며, 이는 필그라스팀과 비교하여 용해도 및 작용의 지속 시간을 증가시키는 필그라스팀의 PEG화된 형태인 페그필그라스팀(pegfilgrastim)(예를 들어, Amgen의 Neulasta® 및 Roche의 Neulastim®).
본원에 언급된 과립구-집락 자극 인자(G-CSF)는 상기 형태의 모두를 제한 없이 포함한다.
화학식 (I)의 모노아세틸디아실글리세롤 화합물의 제조를 위한 화학적 합성 방법은 예를 들어, 대한민국 등록특허 제10-0789323호 및 제10-1278874호에 개시되어 있으며, 그 내용은 본 명세서에 참조문(reference)으로 포함된다. 예를 들어, PLAG는 글리세롤의 히드록시(hydroxy) 그룹을 아세틸(acetyl), 팔미토일(palmitoyl) 및 리놀레오일(linoleoyl) 작용기로 아실화하여 합성할 수 있다.
PLAG와 같은 화학식 (I)의 모노아세틸 디아실글리세롤 화합물 및 과립구 집락-자극 인자(G-CSF) 화합물의 치료 유효량은 초기에 세포 배양 검정으로부터 결정될 수 있다. 표적 농도는 본원에 기술되거나 당업계에 공지된 방법을 사용하여 측정된, 본원에 기술된 방법을 달성할 수 있는 활성 화합물(들)의 농도일 것이다. PLAG와 같은 화학식 (I)의 모노아세틸 디아실글리세롤 화합물 및 과립구 집락-자극 인자(G-CSF) 화합물의 처리량은 또한 이전에 보고된 바 있다.
당업계에 잘 알려진 바와 같이, 인간에 사용하기 위한 치료학적 유효량은 또한 동물 모델로부터 결정될 수 있다. 예를 들어, 인간에 대한 용량은 동물에서 효과적인 것으로 밝혀진 농도를 달성하도록 공식화될 수 있다. 인간의 투여량은 위에서 설명한 바와 같이, 화합물 효과를 모니터링하고 투여량을 증가 또는 아래로 조정함으로써, 조정할 수 있다. 위에서 설명한 방법 및 기타 방법을 기반으로 인간에서 최대 효능을 달성하기 위한 용량을 조정하는 것은 숙련된 기술자의 능력 범위 내에 있다.
투여량(dosage)은 환자의 요구 사항과 사용되는 화합물에 따라 달라질 수 있다. 본 발명의 문맥에서, 환자에게 투여되는 용량은 시간이 지남에 따라 환자에게 유익한 치료 반응을 나타내기에 충분해야 한다. 투여량의 사이즈(size)는 또한 임의의 부정적인 부작용의 존재, 성질(nature) 및 정도(extent)에 따라 결정된다. 특정 상황에 대한 적절한 투여량의 결정은 의사의 기술 범위 내에 있다. 일반적으로, 치료는 화합물의 최적 용량보다 적은 용량으로 시작된다. 그 후, 상황(circumstance) 하에서 최적의 효과에 도달할 때까지 용량을 조금씩 증량한다. 투여량 및 간격은 치료되는 특정 임상 징후에 효과적인 투여된 화합물의 수준을 제공하기 위해 개별적으로 조정될 수 있다. 이것은 개인의 질병 상태의 중증도에 상응하는 치료 요법을 제공할 것이다.
본원에 제공된 교시를 이용하여, 효과적인 예방 또는 치료 요법은 실질적인 독성을 유발하지 않지만 특정 환자에 의해 입증된 임상 증상을 치료하는데 효과적으로 계획할 수 있다. 이 계획에는 화합물 효능(potency), 상대적 생체 이용률(bioavailability), 환자 체중, 부작용의 존재 및 심각도, 선호하는 투여 방식 및 선택한 약제의 독성 프로파일과 같은 요인을 고려하여 활성 화합물을 신중하게 선택해야 한다.
포유동물에게 투여되는 투여량 및 빈도(단독 또는 다중 투여량)는 다양한 인자, 예를 들어 포유동물이 다른 질병을 앓고 있는지 여부 및 그의 투여 경로; 수혜자의 크기, 나이, 성별, 건강, 체중, 체질량 지수 및 식단; 치료 중인 질병의 증상의 성질(nature)과 정도, 동시 치료의 종류, 치료 중인 질병의 합병증 또는 기타 건강 관련 문제에 따라 달라질 수 있다. 다른 치료 요법 또는 제제가 본 출원인의 발명의 방법 및 화합물과 함께 사용될 수 있다. 확립된 투여량(예를 들어, 빈도 및 기간)의 조정 및 조작은 당업자의 능력 범위 내에 있다.
본 발명의 조성물의 투여 빈도는 특별히 제한되지 않으나, 1일 1회 또는 1일 수회 나누어 투여할 수 있다.
PLAG와 같은 화학식 (I)의 모노아세틸 디아실글리세롤 화합물 및 과립구 집락-자극 인자(G-CSF) 화합물은 국소 접촉(topical contact), 경구(oral), 정맥내(intravenous), 복강내(intraperitoneal), 근육내(intramuscular), 병변내(intralesional), 경막내(intrathecal), 비강내(intranasal) 또는 피하 투여(subcutaneous administration), 또는 피검자에 대한 서방성 장치(slow-release device), 예를 들어, 미니-삼투 펌프의 이식과 같은 다수의 경로 중 임의의 것에 의해 피검자에게 투여될 수 있다. 비경구 투여(Parenteral administration)는 예를 들어 정맥내(intravenous), 근육내(intramuscular), 세동맥내(intra-arteriole), 피내(intradermal), 피하(subcutaneous), 복강내(intraperitoneal), 뇌실내(intraventricular) 및 두개내(intracranial)를 포함한다.
약제학적 조성물은 PLAG와 같은 화학식 (I)의 모노아세틸 디아실글리세롤 화합물 및 과립구 집락-자극 인자(G-CSF) 화합물 중 하나 또는 둘 모두가 PLAG 화합물이 치료학적 유효량, 즉, 의도한 목적을 달성하는 데 효과적인 양으로 함유된 조성물을 포함할 수 있다. 특정 적용에 효과적인 실제 양은, 그 중에서도, 치료되는 상태에 따라 달라질 것이다. 질병을 치료하기 위한 방법으로 투여되는 경우, 이러한 조성물은 원하는 결과, 예를 들어 표적 분자의 활성 조절 및/또는 질병 증상의 감소, 제거 또는 진행을 늦추는 데 효과적인 활성 성분의 양을 함유할 것이다.
약제학적 조성물은 각 제형에 대해 약제학적으로 허용되는 추가 담체로 제조될 수 있다. 본원에서, 용어 "약제학적으로 허용되는 담체(pharmaceutically acceptable carrier)"는 유기체를 자극하지 않고 주입된 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미할 수 있다. 본 발명에서 사용할 수 있는 담체의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 산업분야에서 통상적으로 사용되는 담체 및 약학적으로 허용되는 담체를 모두 사용할 수 있다.
식염수(Saline), 멸균수(sterilized water), IV 유체(fluids), 완충 식염수(buffer saline), 알부민 주사 용액(albumin injection solution), 덱스트로오스 용액(dextrose solution), 말토덱스트린 용액(maltodextrin solution), 글리세롤(glycerol), 에탄올(ethanol)은 사용 가능한 담체의 비-제한적인 예시이다. 이들 담체는 단독 또는 2종 이상을 조합하여 사용할 수 있다. 담체는 비-천연 담체를 포함할 수 있다. 필요에 따라, 항산화제(antioxidant), 완충제(buffer) 및/또는 세균발육 저지제(bacteriostatic agent)와 같은 통상적으로 사용되는 다른 첨가제를 첨가하여 사용할 수 있다. 희석제(diluent), 분산제(dispersant), 계면활성제(surfactant), 결합제(bonding agent), 윤활제(lubricant)와 함께 수용액(aqueous solution), 현탁제(suspension), 유제(emulsion) 등의 주사액(injection solution), 및 환제(pill), 캡슐제(capsule), 과립제(granule) 또는 정제(tablet) 등으로 제제화할 수 있다.
비경구 적용이 필요하거나 원하는 경우, 약제학적 조성물에 포함된 화합물에 특히 적합한 혼합물은 주사용, 멸균 용액(sterile solution), 유성 또는 수용액, 뿐만 아니라 좌약(suppositories)을 포함하는, 현탁액, 에멀젼 또는 임플란트(implant)일 수 있다. 특히, 비경구 투여용 담체는 덱스트로오스, 식염수, 순수(pure water), 에탄올, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 땅콩유(peanut oil), 참기름(sesame oil), 폴리옥시에틸렌-블록 중합체(polyoxyethylene-block polymer) 등의 수용액을 포함한다. 앰플(Ampoule)은 편리한 단위 투여량이다. 본원에 제시된 약제학적 조성물에 사용하기에 적합한 약제학적 혼합물은 예를 들어, Pharmaceutical Sciences(17th Ed., Mack Pub. Co., Easton, PA) 및 WO 96/05309에 기재된 것들을 포함할 수 있으며, 이들 둘 모두의 교시 내용은 본원에 참조로 포함된다.
논의된 바와 같이, 키트가 또한 제공된다. 예를 들어, 이러한 측면에서, PLAG와 같은 화학식 (I)의 모노아세틸 디아실글리세롤 화합물 및 과립구 집락-자극 인자(G-CSF) 화합물 PLAG 화합물은 각각 적절하게 특정 치료에 대해 표지된 적합한 용기에 포장될 수 있다. 용기는 PLAG 화합물 또는 조성물 및 과립구 집락-자극 인자(G-CSF) 화합물 및 의도된 용도에 적절한 적절한 안정화제(suitable stabilizer), 담체 분자 등 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 키트는 하나 이상의 추가 화학요법제와 같이, 의도된 치료를 위한 하나 이상의 치료 시약(reagent)을 추가로 포함한다. 제품은 PLAG 화합물 또는 조성물 및/또는 과립구 집락-자극 인자(G-CSF) 화합물을 함유하는 용기(예를 들어, 바이알(vial), 병(jar), 병(bottle), 백(bag) 등)를 포함할 수 있다. 또한, 제품 또는 키트는 예를 들어 예방 또는 치료가 필요한 상태를 치료하거나 모니터링하기 위한 포장 재료, 사용 설명서, 주사기, 전달 장치를 추가로 포함할 수 있다.
제품에는 범례(legend)(예를 들어, 인쇄된 라벨 또는 삽입물(insert) 또는 제품의 사용을 설명하는 기타 매체(medium)(예를 들어, 오디오- 또는 비디오 테이프) 또한 포함될 수 있다. 범례는 용기(예를 들어, 용기에 부착됨)와 연관될 수 있으며, 그 안의 조성물이 투여되어야 하는 방식(예를 들어, 투여 빈도 및 투여 경로), 이에 대한 표시 및 기타 용도를 설명할 수 있다. 조성물은 투여를 위해 준비될 수 있고(예를 들어, 용량-적절한 단위로 존재함), 하나 이상의 추가의 약학적으로 허용가능한 보조제(adjuvant), 담체 또는 기타 희석제 및/또는 추가의 치료제를 포함할 수 있다. 대안적으로, 조성물은 예를 들어 희석제 및 희석을 위한 지침서와 함께 농축된 형태로 제공될 수 있다.
논의된 바와 같이, 과립구 집락-자극 인자(G-CSF) 화합물 및 PLAG와 같은 모노아세틸 디아실글리세롤 화합물은 화학요법제, 예를 들어, 하나 이상의 알킬화제(예를 들어, 백금-기반 약물(platinum-based drug), 테트라진(tetrazine), 아지리딘(aziridine), 니트로소우레아(nitrosourea), 질소 머스타드(nitrogen mustard)), 항-대사물질(anti-metabolites)(예를 들어, 항-엽산(anti-folates), 플루오로피리미딘(fluoropyrimidine), 데옥시뉴클레오시드 유사체(deoxynucleoside analogue), 티오퓨린(thiopurine)), 항-미세소관제(anti-microtubule)(예를 들어, 빈카 알칼로이드(vinca alkaloid), 탁산(taxane)), 토포이소머라제 억제제(topoisomerase inhibitor)(예를 들어, 토포이소머라제(topoisomerase) I 및 II 억제제), 세포독성 항생제(cytotoxic antibiotic)(예를 들어, 안트라사이클린(anthracycline)) 및 면역조절 약물(예를 들어, 탈리도마이드(thalidomide) 및 유사체)와 같은 항-신생물(anti-neoplasia)과 조합하여 투여될 수 있다. 특정 측면에서, 화학요법제는 시클로포스파미드, 독소루비신, 에토포시드, 이포스파미드, 메스나, 시스플라틴, 젬시타빈 및/또는 타목시펜 중 하나 이상일 수 있다.
과립구 집락-자극 인자(G-CSF) 화합물 및 PLAG와 같은 모노아세틸 디아실글리세롤 화합물은 적절하게는 조정된 방식으로, 예를 들어 동시에 또는 순차적으로 투여된다. 예를 들어, 과립구 집락-자극 인자(G-CSF) 화합물 및 PLAG와 같은 모노아세틸 디아실글리세롤 화합물은 실질적으로 동일한 시간에 피검자에게 투여될 수 있거나, 대신에 개별 투여 사이의 더 긴 기간이 적합할 수 있지만, 제제는 다른 시간에 피검자에게 적절하게는 몇 시간 내에 투여될 수 있다.
실시예
이전 부분(section)은 이해의 명료함을 위해 예 및 예시의 방식으로 일부 상세하게 설명되었지만, 특정 사소한 변경 및 수정이 상기 교시에 비추어 실시될 것이라는 것은 당업자에게 명백하다. 따라서, 설명 및 실시예는 본 명세서에 기재된 임의의 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
특허 출원 및 간행물을 포함하는, 여기에 인용된 모든 참고 문헌은 그 전체가 참고로 여기에 포함된다.
실시예 1: 이종이식(xenograft) 마우스 모델에서 인간 골수종 세포(myeloma cell)에 대한 G-CSF와 조합된 EC-18의 항암 효과
화학식 2의 화합물(EC-18)의 투여가 G-CSF의 투여에 의해 유도된 증가된 종양 성장을 극복할 수 있음을 입증하기 위해, BALB/c 7w 마우스에 4T1 세포주의 1 x 106 cells/100 μL 인산 완충 식염수를 피하 주사하여 종양을 보유하는 마우스를 제조하였다(0 일). 2일 및 3일에, 마우스에 젬시타빈 10 mg/kg을 두 번 투여하였다. 4일째에, 마우스에 1회 피하 주사를 통해 3㎍/mouse의 PEG-G-CSF(Pegfilgrastim)를 투여하였다. 연구의 매일마다, PBS로 희석된 50 mg/kg의 EC-18을 마우스에 경구 투여하였다. 총 24마리의 종양을 보유하는 마우스를 표 1 및 도 1A에 요약되어 있는 바와 같이, 대조 그룹(4마리, 대조군), G-CSF 투여 그룹(5마리, PEG-G-CSF), 젬시타빈(Gemcitabine) 투여 그룹(5마리, Gemcitabine), G-CSF 및 젬시타빈 동시 투여 그룹(5 마리, Gem+PEG) 및 EC-18 동시 투여 그룹(5 마리, Gem+PEG+EC-18)으로 구성된 5개 그룹으로 분류하였다.
그룹 n Gemcitabine PEG-G-CSF EC-18
대조군(Control) 4 - - -
PEG-G-CSF 5 3μg -
Gemcitabine 5 10 mg/kg - -
Gem+PEG 5 10 mg/kg 3μg -
Gem+PEG+EC-18 5 10 mg/kg 3μg 50mg/kg
마우스 관리 그룹
8일째에, 모든 마우스를 희생시키고 그들의 종양을 제거하였다. 종양의 크기와 무게를 측정하였다. 그 결과를 표 2 및 3에 나타내었고, 종양의 사진을 도 1C에 나타내었다.
종양 무게(Tumor Weight) (x 0.01 g)
No. 1 No. 2 No. 3 No. 4 No. 5 평균
(average)		 증가
(Increase)
대조군(Control) 19 41 38 30 - 32±10 -
PEG-G-CSF 47 30 53 30 31 38±11 +19.4
Gemcitabine 38 9 32 27 14 24±12 -25.0
Gem+PEG 11 41 54 23 31 32±16 +0.0
Gem+PEG+EC-18 20 22 15 16 21 19± 3 -41.2
종양 무게
% weight(% 중량)
No. 1 No. 2 No. 3 No. 4 No. 5 평균
(Average)		 증가
(Increase)
대조군(Control) 0.73 1.71 1.43 1.15 - 1.25±0.42 -
PEG-G-CSF 2.02 1.12 2.20 1.20 1.17 1.54±0.52 +22.7
Gemcitabine 1.55 0.36 1.32 1.08 0.54 0.97±0.51 -22.6
Gem+PEG 0.41 1.47 2.13 0.87 1.17 1.21±0.65 -3.5
Gem+PEG+EC-18 0.80 0.83 1 0.56 0.57 0.81 0.72±0.14 -43.0
종양 무게의 % 증가(+) 또는 % 감소(-)
데이터는 젬시타빈으로 처리된 마우스의 종양 무게가 대조군에 비해 약 25% 감소하여, 젬시타빈 처리의 항암 효과를 입증하는 것을 보여준다. 그러나, 데이터는 G-CSF(Filgrastitn)를 투여한 마우스의 종양 무게가 대조군에 비해 약 19.4% 증가하여, G-CSF에 의한 종양 성장을 촉진하는 부작용을 나타내는 것을 보여준다. 데이터는 젬시타빈과 G-CSF를 동시 투여한 마우스에서, 대조군과 비교하여 종양 무게의 변화가 관찰되지 않았으며, 호중구 감소증(neutropenia)에 대한 임의의 치료 효과와 상관없이 G-CSF의 동시 투여에 의해 화학요법의 효능이 감소함을 시사하는 것을 입증한다.
데이터는 EC-18과 젬시타빈 및 G-CSF의 공동 투여가 종양 중량을 최대 41%까지 유의하게 감소시켰음을 입증하며, 이는 젬시타빈 단독 투여에 의해 달성된 감소보다 더 큰 감소이다. 결과는 종양을 보유하는 마우스의 체중에 대한 종양 무게의 백분율 변화(표 3) 및 종양 조직의 사진(도 1C)과 일치한다. 데이터는 EC-18(즉, PLAG 또는 본 출원의 화학식 2의 화합물)이 종양 성장에 대한 G-CSF의 부작용을 최소화한다는 것을 입증한다.
실시예 2: PLAG 처리에 의한 TAN 환경에서의 MDA-MB-231 유방암 세포의 이상 전이 억제 및 G-CSF 동시 자극
재료 및 방법
세포 배양(cell culture)
MDA-MB-231 및 HL60 세포는 American Type Culture Collection(ATCC, Rockville, MD, USA)에서 얻었다. MDA-MB-231 세포는 10% 소태아혈청(fetal bovine serum)(HyClone, Waltham, MA, USA), 1% 항생제(antibiotic)(100 mg/l 스트렙토마이신(streptomycin), 100 U/ml 페니실린(penicillin)) 및 0.4% 2-머캅토에탄올(2-Mercaptoethanol)(Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 포함하는 DMEM 배지(WELGENE, Seoul, Korea)에서 성장시켰다. HL60 세포를 10% 소 태아 혈청 및 1% 항생제(100 mg/l 스트렙토마이신, 100 U/ml 페니실린)를 포함하는 DMEM 배지에서 성장시켰다. 5% CO2 분위기에서 37℃에서 세포를 성장시켰다. HL60 세포를 호중구 유사 세포로 분화시키기 위해, 세포를 5일 동안 10% DMSO(Sigma Aldrich)가 포함된 배지에서 성장시켰다.
상처 치유 분석(Wound healing assay)
MDA-MB-231을 커버 유리(cover glass)가 있는 12 웰 플레이트에 접종하고, 웰에서 100% 융합(confluence)하기 위해 배양하였다(incubate). 배양 후, 웰의 중앙에 상처 세포 단층을 만든다. PLAG 및 호중구 및 G-CSF 동시-자극을 지시 시간(indicate time) 동안 처리하였다. 5% CO2 분위기에서 37℃에서 지시된 시간과 용량으로 처리한 후, 세포를 3.7% 포름알데히드(formaldehyde)로 20분간 고정하고 0.2% Triton X-100으로 20분간 투과화시키고 0.1% Phalloidin-FITC로 40분간 염색하였다. 형광은 공초점으로 검출하였다(Carl Zeiss, Thornwood, NY, USA).
공초점(Confocal)(면역형광, Immunofluorescence)
MDA-MB-231을 커버 유리가 있는 12 웰 플레이트에 접종하고 웰에서 60% 융합하기 위해 배양하였다. 배양 후, PLAG 및 호중구 및 G-CSF 공동 자극을 지시 시간 동안 처리하였다. 5% CO2 분위기에서 37℃에서 지시된 시간 동안 처리한 후, 세포를 3.7% 포름알데히드로 20분간 고정하고 0.2% Triton X-100으로 20분간 투과화시키고 0.1% Phalloidin-FITC로 40분간 염색하였다. 세포를 PBS로 2회 세척하고 특정한 항체와 4℃에서 밤새 반응시켰다. 세포를 PBS로 2회 세척하고 2차 항체를 반응시켰다. 핵 검출을 위해, 1% Hoechst33342로 20분간 염색하였다. 형광은 공초점으로 검출하였다(Carl Zeiss, Thornwood, NY, USA).
트랜스웰 침입 분석(Transwell invasion assay)
24-웰 플레이트에 마트리겔(Matrigel)로 코팅된 8.0-μm 기공 폴리카보네이트(polycarbonate) 멤브레인 삽입물이 있는 변형된 Boyden 챔버(SPL lifescience, Seoul, Korea)를 사용하여 정량적 대식세포(macrophage) 화학유인(chemoattraction) 분석을 수행하였다. 하부 챔버는 화학유인을 위한 세포 고사 호중성 백혈구(apoptotic neutrophil)로 채워져 있다. 무-혈청 배지에서 MDA-MB-231 세포(5 x 104 cells/ml)를 상부 챔버에 첨가하고 PLAG로 처리하였다. 세포를 5% CO2 분위기에서 37℃에서 지시된 시간 동안 화학 유인(호중구 공동-배양 상청액)하도록 하였다. 화학유인이 되지 않은 세포는 면봉으로 긁어서 막의 상부 표면에서 제거하고, 화학유인된 세포는 MTT 분석에 의해 계산하였다.
결과
트랜스웰을 사용한 생체 외(ex vivo) 환경을 이용하는 것은 TAN(Tumor associated Neutrophil) 환경에 의한 유방암 세포에서 MDA-MB-231 이상 전이 억제 효과를 확인하기 위한 PLAG의 효과를 확인하였다. 그 결과, 호중구로 자극된 MDA-MB-231 세포의 이동성은 유도되었지만, PLAG 처리에 의해 이동성이 감소되는 것을 확인하였다. 또한, 우리는 배양액을 이용하여 MDA-MB-231 유방암 세포의 트랜스웰 침윤 효과를 확인하여 호중구로 자극된 배양액에서 침윤이 증가하는 반면 PLAG 처리 그룹에서 암세포의 침윤이 감소됨을 나타낸다. 반면, G-CSF와 호중구 동시-자극은 호중구 단독 그룹보다 암세포의 전이를 더 증가시켰다. 동시-자극 그룹에서, 암세포의 이동성 뿐만 아니라 트랜스웰 침습이 더욱 증가된 반면, PLAG 처리 그룹은 호중구-자극 그룹과 동일한 방식으로 암세포의 이상-전이를 억제하였다.
None PLAG 호중구 단독(NeutrophilOnly) Neutrophil + PLAG Neutrophil + G-CSF Neutrophil + G-CSF + PLAG
샘플 1
(Sample 1)		 106.250 89.583 327.083 212.500 366.667 252.083
샘플 2
(Sample 2)		 93.750 104.167 297.917 235.417 352.083 383.333
샘플 3
(Sample 3)		 85.417 102.083 331.250 216.667 383.333 287.500
도 3B에 대한 raw data. 침습성 세포 수(MTT 분석, % 형질전환(transform))
실시예 3: PLAG 처리에 의한 TAN 환경에서의 EMT 마커 발현 억제 및 G-CSF 동시 자극
재료 및 방법
세포 배양
MDA-MB-231 및 HL60 세포는 American Type Culture Collection(ATCC, Rockville, MD, USA)에서 얻었다. MDA-MB-231 세포는 10% 소태아혈청(HyClone, Waltham, MA, USA), 1% 항생제(100 mg/l 스트렙토마이신, 100 U/ml 페니실린), 및 0.4% 2-머캅토에탄올(Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 포함하는 DMEM 배지(WELGENE, Seoul, Korea)에서 성장시켰다. HL60 세포를 10% 소 태아 혈청 및 1% 항생제(100 mg/l 스트렙토마이신, 100 U/ml 페니실린)를 포유하는 DMEM 배지에서 성장시켰다. 세포는 5% CO2 대기에서 37 ℃에서 성장하였다. HL60 세포를 호중구 유사 세포로 분화시키기 위해, 세포를 5일 동안 10% DMSO(Sigma Aldrich)가 포함된 배지에서 성장시켰다.
폴리메라아제 연쇄 반응(PCR, Polymerase Chain Reaction)
총 RNA는 제조사의 지시에 따라 RiboEx(GeneAll biotechnology, Seoul, Korea)를 이용하여 추출하였고, cDNA는 제조사의 지시에 따라 ReverseAids cDNA 합성 키트(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)를 이용하여 생성하였다. PCR은 다음과 같은 온도 프로파일로 수행되었다: 95℃에서 10분의 사전-변성(pre-denaturation) 단계, 30초 동안 95℃, 30초 동안 annealing 온도 및 30초 동안 72℃ 및 10분 동안 72℃에 최종 노출(a final exposure to 72℃)의 35 사이클이 뒤따른다. 증폭(amplification)을 위한 특정한 프라이머 서열은 표 5에 있다.
유전자
(Gene)		 프라이머 서열(Primer Sequence) (5’-3’) 증폭 크기(Amplification size) (bp) Annealing Temp. (℃)
N-cadherin For: GACAATGCCCCTCAAGTGTT
(SEQ ID NO: 1)
Rev: CCATTAAGCCGAGTGATGGT
(SEQ ID NO: 2) 		179 59.5
Vimentin For: GAGAACTTTGCCGTTGAAG
(SEQ ID NO: 3)
Rev: TCCAGCAGCTTCCTGTAGGT
(SEQ ID NO: 4)		 170 59.5
Snail For: CCCCAATCGGAAGCCTAACT
(SEQ ID NO: 5)
Rev: ACAGAGTCCCAGATGAGCA
(SEQ ID NO: 6)		 157 60.0
β-actin For: CAAGGTCATCCATGACAACTTTG
(SEQ ID NO: 7)
Rev: GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG
(SEQ ID NO: 8)		 496 58.0
표적 유전자의 증폭을 위한 프라이머 서열
결과
PLAG 처리에 의한 TAN 환경 및 G-CSF의 자극에 의한 EMT 메이커 발현에 대한 MDA-MB-231 유방암 세포의 억제 효과를 확인하기 위해 PCR을 수행하였다. 그 결과, EMT(Epithelial mesenchymal transition) 메이커인 SNAIL 및 NCAD, Vimentin의 발현량은 호중구와 G-CSF 동시-자극 그룹에서 증가하였으나, PLAG 처리에서는 발현이 감소하였다.
Snail
None Neutrophil
only		 Neutrophil + PLAG Neutrophil + G-CSF Neutrophil + G-CSF + PLAG
샘플 1
(Sample 1)		 1 1.916 0.749 2.781 0.758
샘플 2
(Sample 2)		 1 1.134 0.527 1.635 0.525
샘플 3
(Sample 3)		 1 1.383 0.531 2.4 0.516
N-cadherin
None Neutrophil
only		 Neutrophil + PLAG Neutrophil + G-CSF Neutrophil + G-CSF + PLAG
샘플 1
(Sample 1)		 1 5.310 0.723 4.517 1.506
샘플 2
(Sample 2)		 1 4.730 0.747 4.511 1.584
샘플 3
(Sample 3)		 1 5.681 0.732 5.214 1.594
Vimentin
None Neutrophil
only		 Neutrophil + PLAG Neutrophil + G-CSF Neutrophil + G-CSF + PLAG
샘플 1
(Sample 1)		 1 1.16 0.501 1.832 0.46
샘플 2
(Sample 2)		 1 1.208 0.512 1.854 0.901
샘플 3
(Sample 3)		 1 1.192 0.504 1.867 0.885
(도 4B-4D)에 대한 raw data: PCR 굽힘(bend) 강도(상대적인 강도)
실시예 4: PLAG 처리에 의한 TAN 환경에서의 사이토카인 분비 변화 및 G-CSF 동시-자극
재료 및 방법
세포 배양
MDA-MB-231 및 HL60 세포는 American Type Culture Collection(ATCC, Rockville, MD, USA)에서 얻었다. MDA-MB-231 세포는 10% 소태아혈청(HyClone, Waltham, MA, USA), 1% 항생제(100 mg/l 스트렙토마이신, 100 U/ml 페니실린) 및 0.4% 2-머캅토에탄올(Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 포함하는 DMEM 배지(WELGENE, Seoul, Korea)에서 성장시켰다. HL60 세포를 10% 소 태아 혈청 및 1% 항생제(100 mg/l 스트렙토마이신, 100 U/ml 페니실린)를 포함하는 DMEM 배지에서 성장시켰다. 세포는 5% CO2 분위기에서 37℃에서 성장하였다. HL60 세포를 호중구 유사 세포로 분화시키기 위해, 세포를 5일 동안 10% DMSO(Sigma Aldrich)가 포함된 배지에서 성장시켰다.
효소 결합 면역 흡착제 검정법(ELISA)
세포 상청액 또는 혈장에서 사이토카인 분비의 수준은 제조사의 프로토콜에 따라 BD Bioscience의 사이토카인에 대해 특이적으로 효소 결합 면역 흡착제 검정법(ELISA)을 사용하여 분석되었다. 흡광도는 EMax Endpoint ELISA microplate 판독기(Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 450 nm에서 측정되었다.
결과
TAN 환경과 G-CSF 동시-자극에 의한 암 세포 전이 활성 마커인 TGF-β의 분비량을 ELISA로 확인하였다. 그 결과, TAN과 G-CSF 공동자극 환경에서 TGF-β의 분비량이 증가하였다. 그러나, PLAG 처리 시 TGF-β의 발현은 크게 감소하지 않는 것으로 확인되었다.
항-암 사이토카인인 IFN-γ의 분비는 PLAG 처리에 의해 유의하게 증가된 반면, TGF-β의 분비에는 변화가 없었다. 대조적으로, G-CSF 동시-자극 그룹에서 IFN-γ의 분비는 호중구 단독 그룹에서보다 유의하게 낮았다.
None PLAG Neutrophil
only		 Neutrophil + PLAG Neutrophil + G-CSF Neutrophil + G-CSF+ PLAG
샘플 1
(Sample 1)		 0.279 0.248 0.447 0.484 0.439 0.45
샘플 2
(Sample 2)		 0.265 0.287 0.485 0.476 0.446 0.413
샘플 3
(Sample 3)		 0.262 0.208 0.484 0.474 0.414 0.468
TGF-β ELISA(450 nm OD)의 도 5A에 대한 raw data
None PLAG Neutrophil
only		 Neutrophil + PLAG Neutrophil + G-CSF Neutrophil + G-CSF + PLAG
샘플 1
(Sample 1)		 0.131 0.144 0.124 0.181 0.139 0.161
샘플 2
(Sample 2)		 0.153 0.149 0.104 0.158 0.102 0.173
샘플 3
(Sample 3)		 0.155 0.156 0.102 0.164 0.094 0.184
IFN-γ ELISA(450nm OD)의 도 5B에 대한 raw data
실시예 5: PLAG 처리에 의한 TGF-β 의존성 암세포 전이 신호 경로 억제
재료 및 방법
세포 배양
MDA-MB-231 및 HL60 세포는 American Type Culture Collection(ATCC, Rockville, MD, USA)에서 얻었다. MDA-MB-231 세포는 10% 소태아혈청(HyClone, Waltham, MA, USA), 1% 항생제(100 mg/l 스트렙토마이신, 100 U/ml 페니실린) 및 0.4% 2-메르캅토에탄올(Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 포함하는 DMEM 배지(WELGENE, Seoul, Korea)에서 성장시켰다. HL60 세포를 10% 소 태아 혈청 및 1% 항생제(100 mg/l 스트렙토마이신, 100 U/ml 페니실린)를 함유하는 DMEM 배지에서 성장시켰다. 세포는 5% CO2 분위기에서 37℃에서 성장하였다. HL60 세포를 호중구 유사 세포로 분화시키기 위해, 세포를 5일 동안 10% DMSO(Sigma Aldrich)가 포함된 배지에서 성장시켰다.
면역 침전(IP, Immunoprecipitation)
PLAG로 처리하고 5% CO2 분위기에서 37℃에서 다양한 시간 동안 호중구 및 G-CSF 동시-자극을 유도하도록 자극한 MDA-MB-231 세포를 얼음처럼 차가운 IP 용해(lysis) 완충액(25mM Tris-HCl pH 7.4, 150mM NaCl, 1% NP-40, 1mM EDTA, 5% glycerol)을 사용하여 용해시켰다. 추출된 단백질을 Surebeads Protein G 특이적 항체 결합 자기 비드(magnetic bead)(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)와 함께 배양하였다. 비드를 Tween 20(PBST)이 포함된 PBS로 세척하고 1X 샘플 완충액에서 용리된 표적 단백질을 Western blotting으로 분석하였다.
공초점(면역형광)
MDA-MB-231 세포를 커버 유리가 있는 12 웰 플레이트에 접종하고 웰에서 60% 융합하기 위해 배양하였다. 배양 후, PLAG 및 호중구 및 G-CSF 공동-자극을 지시 시간 동안 처리하였다. 5% CO2 분위기에서 37℃에서 지시된 시간 동안 처리한 후, 세포를 3.7% 포름알데히드로 20분 동안 고정하고 0.2% Triton X-100으로 20분 동안 염색을 위해 투과화하였다. 세포를 PBST로 2회 세척하고 특이적 항체(SMAD2/3)와 4℃에서 밤새 반응시켰다. 세포를 PBST로 2회 세척하고 2차 항체를 반응시켰다. 핵 검출을 위해 1% Hoechst33342로 20분간 염색하였다. 형광은 공초점으로 검출하였다(Carl Zeiss, Thornwood, NY, USA).
결과
암세포 전이에 대한 TGF-β 의존적 신호전달 경로의 억제 효과는 PLAG 처리에 의해 TAN 환경에서 확인되었다. 그 결과, TAN 및 G-CSF 동시-자극에 의해 증가된 TGF-β 신호 경로인 SMAD 활성의 증가가 PLAG 처리에 의해 감소됨을 확인하였다. 또한, PLAG 처리에 따라 핵 전위를 위한 SMAD2/3-SMAD4 복합체의 형성이 감소함을 확인하였다. 우리는 TAN에 의해 SMAD2/3 및 SMAD4의 핵 전위가 증가하고 PLAG 처리에 따라 G-CSF 공동-자극이 감소함을 확인하였다.
본 명세서에 기술된 실시예 및 실시예는 단지 예시를 위한 것이며, 이에 비추어 다양한 수정 또는 변경이 당업자에게 제안될 것이며 본 출원의 사상 및 범위 및 첨부된 청구항의 범위 내에 포함되는 것으로 이해된다. 여기에 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 그 전체가 참고로 여기에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Enzychem Lifesciences Corporation <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATMENT OF CANCER <130> 21239-US <140> PCT/IB2019/000062 <141> 2019-01-16 <160> 8 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 1 gacaatgccc ctcaagtgtt 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 2 ccattaagcc gagtgatggt 20 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 3 gagaactttg ccgttgaag 19 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 4 tccagcagct tcctgtaggt 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 5 ccccaatcgg aagcctaact 20 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 6 acagagtccc agatgagca 19 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 7 caaggtcatc catgacaact ttg 23 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 8 gtccaccacc ctgttgctgt ag 22

Claims (9)

  1. 다음을 포함하는, 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법:
    대상체에게 투여하는 방법:
    a) 과립구 집락-자극 인자(G-CSF) 화합물; 및
    b) 화학식 (I)의 모노아세틸 디아실글리세롤 화합물:
    Figure pct00003
    (I)
    여기서, R1 및 R2는 독립적으로 14 내지 20의 탄소 원자를 포함하는 지방산 기이다.
  2. 다음을 포함하는, 고형 종양이 있는 대상체에서 종양 부피를 감소시키는 방법:
    유효량의 화학식 (I)의 모노아세틸 디아실글리세롤 화합물을 종양이 있는 대상체에게 투여하는 방법:
    Figure pct00004
    (I)
    여기서, R1 및 R2는 독립적으로 14 내지 20의 탄소 원자를 포함하는 지방산 기이고,
    및 여기서 종양의 부피가 감소된다.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 모노아세틸 디아실글리세롤 화합물이 화학식 II의 화합물인 방법:
    Figure pct00005
    (II).
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 이전에 화학식 (I)의 모노아세틸 디아실글리세롤 화합물 없이 G-CSF 화합물로 치료받은 적이 있는 것인 방법.
  5. 제2항에 있어서, 과립구 집락-자극 인자(G-CSF) 화합물이 또한 대상체에게 투여되는 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, a) G-CSF 화합물 및 b) 화학식 (I)의 모노아세틸 디아실글리세롤 화합물과 다른 c) 화학요법제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, c) 화학요법제는 시클로포스파미드, 독소루비신, 에토포시드, 이포스파미드, 메스나, 시스플라틴, 젬시타빈 및/또는 타목시펜으로부터 선택되는 것인 방법.
  8. 다음을 포함하는 암의 치료를 위한 키트:
    a) 과립구 집락-자극 인자(G-CSF) 화합물; 및
    b) 화학식 (I)의 모노아세틸 디아실글리세롤 화합물:
    Figure pct00006
    (I)
    여기서, R1 및 R2는 독립적으로 14 내지 20의 탄소 원자를 포함하는 지방산 기이다.
  9. 제8항에 있어서, 암의 치료를 위한 지침을 추가로 포함하는 것인 키트.
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