KR20210119176A - Composition for preventing or treating systemic scleroderma - Google Patents
Composition for preventing or treating systemic scleroderma Download PDFInfo
- Publication number
- KR20210119176A KR20210119176A KR1020200035738A KR20200035738A KR20210119176A KR 20210119176 A KR20210119176 A KR 20210119176A KR 1020200035738 A KR1020200035738 A KR 1020200035738A KR 20200035738 A KR20200035738 A KR 20200035738A KR 20210119176 A KR20210119176 A KR 20210119176A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- inhibitor
- scleroderma
- mir
- mir21
- preventing
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Description
본 발명은 피부경화증의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for preventing or treating scleroderma.
자가면역질환은 체내의 면역체계가 정상적이고 건강한 조직이나 기관 또는 기타 체내 성분 등을 공격하게 되는 질환을 의미한다. 다수의 자가면역 질병은 인체의 면역이상 반응으로부터 기인하며 자가 파괴를 유발한다. 유명한 예는 류마티스 관절염 (RA), 전신경화증 (SSc), 전신홍반루푸스 (SLE), 경피증, 다발근육염, 피부근육염, 아나필락시스 자반증, 쇼그렌 증후군 등을 포함한다. 원발 쓸개관 간경화증 (PBC), 만성 활성 간염, 및 하시모토 갑상선염과 같은 기타 질병은 모두 자가면역 질병과 관련된다.Autoimmune disease refers to a disease in which the body's immune system attacks normal and healthy tissues, organs, or other body components. Many autoimmune diseases result from an abnormal immune response in the body and cause self-destruction. Famous examples include rheumatoid arthritis (RA), systemic sclerosis (SSc), systemic lupus erythematosus (SLE), scleroderma, polymyositis, dermatomyositis, anaphylactic purpura, Sjogren's syndrome, and the like. Other diseases such as primary biliary cirrhosis (PBC), chronic active hepatitis, and Hashimoto's thyroiditis are all associated with autoimmune diseases.
한편, 피부경화증(Systemic scleroderma)은 피부경화증은 피부 섬유모세포에 의한 세포외 매트릭스 내로의 과도한 단백질 침착을 특징으로 하는, 피부 섬유증으로도 지칭되는 진행성 쇠약화 자가면역 장애로, 피부에서의 만연된 미세혈관 손상 및 진행성 섬유증을 특징으로 한다. 일반적으로 가장 명확한 임상적 증상은 예를 들어, 피부가 딱딱해지거나, 홍조를 띠거나, 또는 벗겨지는 등의 피부 경화 및 이와 관련된 상흔이다. SSc는 활성화된 섬유아세포(fibroblast)가 콜라겐(collagen) 등의 결합조직 구성물질을 과도하게 생성하는데 기인하며, 피부의 결합 조직에 변화를 일으켜 그 기능의 결함을 초래한다. SSc는 그 발병 부위에 따라, 피부 경화가 팔꿈지 이하의 손, 무릎 이하의 발, 얼굴에서만 발생되는 제한성(limited) 타입과, 이보다 더 많은 부위, 즉 팔꿈치 이상, 무릎 이상의 피부와 몸통에서도 피부가 딱딱해지는 변화가 나타나면서 신장, 폐 등의 내부 장기 침범이 동반되는 확산성(diffuse) 타입으로 크게 분류된다. 제한성 SSc를 보이는 환자는 90% 이상의 5년 생존율을 보이나, 미만성 SSc를 보이는 환자의 예후는 좋지 않아 50∼70% 정도에 그치는 5년 생존율을 나타낸다. 확산성 피부 질환을 갖는 환자는 종종 피부에서 독특한 마커, 예컨대, I형 인터페론(IFN)-유도된 유전자의 상향조절을 보여준다. IFN이 피부 섬유증에서 일정한 역할을 수행한다는 가설을 만성 바이러스 감염에 대한 IFN 치료를 받은 환자에서 발생하는 피부경화증의 최근 보고가 뒷받침한다 (Varga & Abraham (2007) J. Clin. Invest. 117:557-567 및 Coelho et al. (2008) Immunol. Lett. 118:110-115). SSc의 병변은 조직의 섬유증(tissue fibrosis), 세소혈관(細小血管, small blood vessel)의 맥관 장애(vasculopathy), 자가항체에 의한 특이적 자가면역반응 (autoimmune disease) 등의 증상으로 특징될 수 있다. On the other hand, Systemic scleroderma is a progressive, debilitating autoimmune disorder, also referred to as dermal fibrosis, characterized by excessive protein deposition into the extracellular matrix by skin fibroblasts. It is characterized by vascular damage and progressive fibrosis. In general, the most obvious clinical symptoms are skin hardening and associated scarring, for example, hardening, redness, or peeling of the skin. SSc is caused by activated fibroblasts that excessively produce connective tissue components such as collagen, and causes changes in the connective tissue of the skin, resulting in a defect in its function. SSc is a limited type in which skin hardening occurs only on the hands below the elbow, feet below the knee, and face, depending on the site of the disease, and skin is also affected in more areas, such as the skin above the elbow and above the knee, and the body. It is broadly classified as a diffuse type accompanied by invasion of internal organs such as the kidneys and lungs with changes in hardness. Patients with restricted SSc have a 5-year survival rate of more than 90%, but the prognosis of patients with diffuse SSc is poor, showing a 5-year survival rate of only 50 to 70%. Patients with diffuse skin disease often show upregulation of unique markers in the skin, such as type I interferon (IFN)-induced genes. The hypothesis that IFN plays a role in skin fibrosis is supported by a recent report of scleroderma in patients receiving IFN treatment for chronic viral infections (Varga & Abraham (2007) J. Clin. Invest. 117:557- 567 and Coelho et al. (2008) Immunol. Lett. 118:110-115). The lesion of SSc can be characterized by symptoms such as tissue fibrosis, vasculopathy of small blood vessels, and autoimmune disease specific to autoantibodies. .
현재 몇몇 이용 가능한 약제가 피부를 부드럽게 하고 염증을 감소시킬 수 있지만, 피부경화증의 병인 치료를 위한 부가적이고 효과적인 약물이 요구되는 실정이다.Although some currently available drugs can soften the skin and reduce inflammation, there is a need for additional and effective drugs for the etiological treatment of scleroderma.
본 발명의 목적은 피부경화증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating skin sclerosis.
또한, 본 발명의 목적은 STAT3 활성 억제제를 제공하는 것이다.It is also an object of the present invention to provide inhibitors of STAT3 activity.
아울러, 본 발명의 목적은 STAT3의 활성을 감소 또는 억제하는 방법을 제공하는 것이다.In addition, it is an object of the present invention to provide a method for reducing or inhibiting the activity of STAT3.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 miR-21-5p 억제제를 유효성분으로 함유하는 피부경화증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.In order to solve the above problems, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating scleroderma comprising a miR-21-5p inhibitor as an active ingredient.
또한, 본 발명은 miR-21-5p 억제제를 포함하는 STAT3 활성 억제제를 제공한다.In addition, the present invention provides an inhibitor of STAT3 activity comprising a miR-21-5p inhibitor.
아울러, 본 발명은 시험관 내에서 miR-21-5p 억제제를 처리하는 단계를 포함하는 STAT3의 활성을 감소 또는 억제하는 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for reducing or inhibiting the activity of STAT3 comprising the step of treating a miR-21-5p inhibitor in vitro.
본 발명에 따르면, miR-21-5p 억제제가 피부경화증의 증상을 완화 및 개선하고, 폐 섬유증을 감소시키며, 염증성 사이토카인을 감소시키고, STAT3 활성을 억제 및 감소시키므로, 이를 피부경화증의 예방 및 치료 용도로 이용할 수 있을뿐만 아니라, STAT3 활성 억제제로도 활용할 수 있다.According to the present invention, miR-21-5p inhibitor relieves and ameliorates the symptoms of scleroderma, reduces lung fibrosis, reduces inflammatory cytokines, and inhibits and reduces STAT3 activity, thereby preventing and treating scleroderma. It can be used as a STAT3 activity inhibitor as well as for use.
도 1은 miR21 억제제 처리에 의한 피부경화증의 증상 완화 효과를 확인한 도이다.
도 2는 miR21 전구체 처리에 의한 피부경화증의 증상 심화를 확인한 도이다.
도 3은 피부경화증 동물모델에서 miR21 억제제 처리에 의한 폐 섬유증 감소 효과를 확인한 도이다.
도 4는 피부경화증 동물모델에서 miR21 전구체 처리에 의한 폐 섬유증 증상 심화를 확인한 도이다.
도 5는 피부경화증 동물모델에서 miR21 억제제 처리에 의한 염증성 사이토카인 감소 효과를 확인한 도이다.
도 6은 피부경화증 동물모델에서 miR21 전구체 처리에 의한 염증성 사이토카인 증가를 확인한 도이다.
도 7은 피부경화증 동물모델에서 miR21 전구체 처리에 의한 STAT3 활성 증가를 확인한 도이다.
도 8은 피부경화증 동물모델에서 miR21 억제제 처리에 의한 STAT3 활성 억제 효과를 확인한 도이다.1 is a diagram confirming the symptom relief effect of scleroderma by treatment with a miR21 inhibitor.
2 is a diagram confirming the intensification of symptoms of scleroderma by miR21 precursor treatment.
3 is a diagram confirming the effect of reducing lung fibrosis by miR21 inhibitor treatment in an animal model of scleroderma.
4 is a diagram confirming the deepening of lung fibrosis symptoms by miR21 precursor treatment in an animal model of scleroderma.
5 is a diagram confirming the inflammatory cytokine reduction effect by the miR21 inhibitor treatment in an animal model of scleroderma.
6 is a diagram confirming the increase of inflammatory cytokines by miR21 precursor treatment in an animal model of scleroderma.
7 is a diagram confirming the increase in STAT3 activity by miR21 precursor treatment in an animal model of scleroderma.
8 is a diagram confirming the STAT3 activity inhibition effect by the miR21 inhibitor treatment in an animal model of scleroderma.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다. Hereinafter, the present invention will be described in detail as an embodiment of the present invention with reference to the accompanying drawings. However, the following embodiments are presented as examples of the present invention, and when it is determined that detailed descriptions of well-known techniques or configurations known to those skilled in the art may unnecessarily obscure the gist of the present invention, the detailed description may be omitted, and , the present invention is not limited thereby. Various modifications and applications of the present invention are possible within the scope of equivalents interpreted therefrom and the description of the claims to be described later.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.In addition, the terms used in this specification are terms used to properly express the preferred embodiment of the present invention, which may vary according to the intention of a user or operator, or customs in the field to which the present invention belongs. Accordingly, definitions of these terms should be made based on the content throughout this specification. Throughout the specification, when a part "includes" a certain component, it means that other components may be further included, rather than excluding other components, unless otherwise stated.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.All technical terms used in the present invention, unless otherwise defined, have the meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art of the present invention. In addition, although preferred methods and samples are described herein, similar or equivalent ones are also included in the scope of the present invention. The contents of all publications herein incorporated by reference are incorporated herein by reference.
일 측면에서, 본 발명은 miR-21-5p 억제제를 유효성분으로 함유하는 피부경화증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.In one aspect, the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating scleroderma comprising a miR-21-5p inhibitor as an active ingredient.
일 구현예에서, miR-21-5p 억제제는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 핵산 또는 이를 코딩 및 발현하는 핵산을 포함할 수 있고, 이를 포함하는 플라스미드일 수 있으며, 통상의 기술 분야에서 이용되는 플라스미드 형태, 벡터 형태, 안티센스 형태, shRNA 형태, 올리고 형태 등으로 투여될 수 있다.In one embodiment, the miR-21-5p inhibitor may include a nucleic acid represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or a nucleic acid encoding and expressing the same, and may be a plasmid comprising the same, and is used in the art. It can be administered in a plasmid form, a vector form, an antisense form, an shRNA form, an oligo form, and the like.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 miR-21-5p 억제제를 1회 투여 농도 10 내지 500 ㎍로, 전체 양은 10 - 5000 ㎍의 농도로 포함할 수 있다.In one embodiment, the composition of the present invention may contain the miR-21-5p inhibitor at a concentration of 10-500 μg per dose, and the total amount of the miR-21-5p inhibitor at a concentration of 10-5000 μg.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β, IL-6 또는 IL-17의 발현을 감소 또는 억제시킬 수 있다.In one embodiment, the composition of the present invention can reduce or inhibit the expression of inflammatory cytokines TNF-α, IL-1β, IL-6 or IL-17.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 STAT3의 활성을 감소 또는 억제시킬 수 있다.In one embodiment, the composition of the present invention is capable of reducing or inhibiting the activity of STAT3.
일 구현예에서, 상기 miR-21-5p는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 핵산을 포함할 수 있으며, 성숙 miRNA이다.In one embodiment, the miR-21-5p may include a nucleic acid represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, and is a mature miRNA.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 섬유화를 감소 또는 억제시킬 수 있다.In one embodiment, the composition of the present invention can reduce or inhibit fibrosis.
본 발명에서 사용된 용어 "miR21"는 "miR-21-5p"를 말하는 것으로, 서로 혼용될 수 있다. As used herein, the term “miR21” refers to “miR-21-5p” and may be used interchangeably.
본 발명에서 사용된 용어 "anti-miR21"는 "miR21 억제제(inhibitor)"를 말하는 것으로, "anti-miR-21-5p"와도 서로 혼용될 수 있다. As used herein, the term “anti-miR21” refers to a “miR21 inhibitor”, and may also be used interchangeably with “anti-miR-21-5p”.
작은 RNA(small RNA: 이하 "sRNA"라 칭함)는 생체 내에서 유전자 발현을 조절하는 역할을 하는 17 내지 25 뉴클레오티드(nucleotide: 이하 ”nt"라 칭함) 정도 길이의 리보핵산을 말한다. sRNA는 그 생성되는 방식에 따라 크게 마이크로RNA(microRNA, miR: 이하 "miRNA"라 칭함)와 작은 간섭 RNA(small interfering RNA: 이하 "siRNA"라 칭함)로 분류된다. miRNA는 부분적으로 이중나선을 이루는 헤어핀 RNA(hairpin RNA)로부터 생성되며, siRNA는 긴 이중가닥 RNA(double strand RNA: 이하 "dsRNA"라 칭함)로부터 유래한다. 일반적으로 생체 내의 여러 조절 과정에서 중요한 역할을 하는 sRNA는 miRNA이며, 실험 기술적으로 특정 유전자의 발현을 조절하는데 사용되는 sRNA는 siRNA로 분류된다.Small RNA (hereinafter referred to as “sRNA”) refers to a ribonucleic acid having a length of about 17 to 25 nucleotides (nucleotide: hereinafter referred to as “nt”), which plays a role in regulating gene expression in vivo. sRNA is largely classified into microRNA (microRNA, miR: hereinafter referred to as “miRNA”) and small interfering RNA (hereinafter referred to as “siRNA”) according to the method in which it is produced. miRNA is produced from partially double-stranded hairpin RNA, and siRNA is derived from long double-stranded RNA (hereinafter referred to as "dsRNA"). Generally, it plays an important role in various regulatory processes in vivo. sRNA that does this is miRNA, and sRNA used to control the expression of a specific gene in the experimental technique is classified as siRNA.
miRNA는 19-25 nt 길이의 단일 가닥 RNA(single strand RNA: 이하 "ssRNA"라 칭함) 분자로서 내재적(endogenous) 헤어핀-구조 전사체(hairpin-shaped transcript) (Bartel, D.P., Cell 116:281-297, 2004; Kim,V.N., Mol. Cells. 19:1-15, 2005)에 의해 생성된다. miRNA는 표적 mRNA의 3' 비번역 영역(UTRs)에 상보적으로 결합하여 전사 후 유전자 억압자(post-transcriptional gene suppressor)로서 작용하며, 번역 억제와 mRNA 불안정화를 유도함으로써 표적 유전자를 억제한다. miRNA는 발전(development), 분화, 증식, 세포사멸 및 신진대사(metabolism)과 같은 다양한 과정에서 중요한 역할을 한다. miRNA is an endogenous hairpin-shaped transcript (Bartel, DP, Cell 116:281-) as a single-stranded RNA (hereinafter referred to as “ssRNA”) molecule of 19-25 nt in length. 297, 2004; Acts as a transcriptional gene suppressor and suppresses target genes by inducing translational repression and mRNA destabilization miRNAs play an important role in various processes such as development, differentiation, proliferation, apoptosis and metabolism. do.
또한, miRNA 생합성은 RNA 폴리머레이즈 Ⅱ에 의한 전사를 통해 개시된다 (Cai. X., et al., RNA 10:1957-1966, 2004; Kim, V.N. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6:376-385, 2005; Lee, Y., et al., EMBO J 21:4663-4670,2002; Lee, Y., et al., EMBO J 23:4051-4060, 2004). 1차 miRNA(primary microRNA: 이하 "pri-miRNA”라 칭함)는 보통 수 Kb의 길이를 넘으며, 5' 캡(cap)과 폴리 A 테일(poly A teil)을 포함한다. pri-miRNA는 리보큐클레아제 Ⅲ, Drosha (Lee, Y., et al., Nature 425:415-419, 2003)와 이의 부요소인 DGCR8 (Gregory, R.I. et al., Nature 432:235-240, 2004; Han, J., et al., Genes Dev. 18:3016-3027, 2004; Landthaler, M., et al.,Curr. Biol. 14:2162-2167, 2004)로 구성된 마이크로프로세서(microprocessor)라는 복합체에 의해 맨 처음 절단되어 65 nt 정도의 헤어핀-구조 전구체(pre-miRNA)로 분리된다. pre-miRNA 프로세스는 miRNA 생합성에 중심적 단계로서, 길이가 긴 pre-miRNA에 mRNA 서열을 포함하는 분자의 한쪽 말단을 생성하는 과정으로 정의된다. 상기 개시 프로세스 이후 생성된 pre-miRNA는 핵 수송요소인 Exp5(exportin-5)에 의해 세포질로 수송된다 (Bohnsack, M.T., et al., RNA 10:185-191, 2004; Lund, E., et al., Science 303:95-98, 2004; Yi,R., et al., Genes Dev. 17:3011-3016, 2003). 세포질 안에서는 세포질내 RNase Ⅲ 타입 단백질인 다이서(Dicer)가 전달된 pre-miRNA를 절단하여 22 nt 정도의 miRNA 이중 가닥을 생성한다. 다이서 생성물의 한쪽 가닥(strand)은 성숙 miRNA로 세포질 속에 존재하여 miRNP(microribonucleoprotein) 또는 miRISC(miRNA-induced silencing complex)라 불리는 실행자 복합체(effector complex)와 조립된다 (Khvorova, A., et al., Cell 115:209-216, 2003; Schwarz,D.S., et al., Cell 115:199-208, 2003). sRNA에 의한 유전자 침묵 기작(gene silecing mechanism)인 RNAi 현상은 포유동물 시스템에서 효과적인 유전자 연구 수단으로 사용되고 있다. 효과적이며 안정한 유전자 넉다운(knockdown)은 작은 헤어핀 RNA(small hairpin RNA: 이하 "shRNA”라 칭함)로 발현하여 작은 간섭 RNA(siRNA)로 프로세스 되면서 일어난다. 최근 RNAi 기술의 비약적인 전진은 자연적 miRNA 유전자를 모방한 shRNA 발현카세트를 제작하면서 이루어졌다 (Dickins, R.A., et al., Nat. Genet. 37:1289-1295, 2005; Silva, J.M. et al., Nat. Genet. 37:1281-1288, 2005: Zeng, Y., et al., Mol. Cell 9:1327-1333. 2002). RNA 폴리머라아제 Ⅱ 프로모터에 의해 조정되는 miRNA를 기초한 shRNA는 동물 모델 같은 배양 세포 내에서 효과적이며 안정적으로 유전자 침묵(gene silencing) 조절을 유도한다.In addition, miRNA biosynthesis is initiated via transcription by RNA polymerase II (Cai. X., et al., RNA 10:1957-1966, 2004; Kim, VN Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6: 376-385, 2005; Lee, Y., et al., EMBO J 21:4663-4670,2002; Lee, Y., et al., EMBO J 23:4051-4060, 2004). Primary miRNA (primary microRNA: hereinafter referred to as “pri-miRNA”) usually exceeds a length of several Kb, and includes a 5' cap and poly A tail. pri-miRNA is ribocuclease III, Drosha (Lee, Y., et al., Nature 425:415-419, 2003) and its sub-element DGCR8 (Gregory, RI et al., Nature 432:235-240) , 2004; Han, J., et al., Genes Dev. 18:3016-3027, 2004; Landthaler, M., et al., Curr. Biol. 14:2162-2167, 2004). ) is first cleaved by a complex called ) and separated into about 65 nt hairpin-structure precursors (pre-miRNA). The pre-miRNA process is a central step in miRNA biosynthesis and is defined as the process of generating one end of a molecule containing an mRNA sequence in a long pre-miRNA. The pre-miRNA generated after the initiation process is transported to the cytoplasm by the nuclear transport factor Exp5 (exportin-5) (Bohnsack, MT, et al., RNA 10:185-191, 2004; Lund, E., et al.) al., Science 303:95-98, 2004; Yi, R., et al., Genes Dev. 17:3011-3016, 2003). In the cytoplasm, Dicer, an intracytoplasmic RNase III type protein, cuts the delivered pre-miRNA to generate a 22 nt miRNA double strand. One strand of the Dicer product is a mature miRNA that exists in the cytoplasm and assembles with an effector complex called miRNP (microribonucleoprotein) or miRISC (miRNA-induced silencing complex) (Khvorova, A., et al. , Cell 115:209-216, 2003; Schwarz, DS, et al., Cell 115:199-208, 2003). The RNAi phenomenon, which is a gene silencing mechanism by sRNA, is being used as an effective gene research tool in mammalian systems. Effective and stable gene knockdown occurs when small hairpin RNA (small hairpin RNA: hereinafter referred to as "shRNA") is expressed and processed into small interfering RNA (siRNA). Recent advances in RNAi technology have been made by constructing shRNA expression cassettes that mimic natural miRNA genes (Dickins, RA, et al., Nat. Genet. 37:1289-1295, 2005; Silva, JM et al., Nat Genet. 37:1281-1288, 2005: Zeng, Y., et al., Mol. Cell 9:1327-1333. 2002). The miRNA-based shRNA regulated by the RNA polymerase II promoter effectively and stably induces gene silencing regulation in cultured cells such as animal models.
본 발명의 약학적 조성물에는 보조제(adjuvant)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 보조제는 당해 기술분야에 알려진 것이라면 어느 것이나 제한 없이 사용할 수 있으나, 예를 들어 프로인트(Freund)의 완전 보조제 또는 불완전 보조제를 더 포함하여 그 면역성을 증가시킬 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may further include an adjuvant. The adjuvant may be used without limitation as long as it is known in the art, and for example, Freund's complete adjuvant or incomplete adjuvant may be further included to increase the immunity thereof.
본 발명의 용어, "치료"란, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미하며, 본 발명에서 사용된 상기 치료란 용어는 피부경화증을 치료하는 행위를 말한다. 따라서 포유동물에 있어서 피부경화증의 치료 또는 치료요법은 하기의 하나 이상을 포함할 수 있다:As used herein, the term "treatment" means, unless otherwise stated, the disease or condition to which the term applies, or one or more symptoms of the disease or disorder, which reverses, ameliorates, inhibits the progression, or It means to prevent, and the term treatment as used in the present invention refers to the act of treating scleroderma. Accordingly, treatment or therapy for scleroderma in a mammal may include one or more of the following:
(1) 피부경화증의 성장을 저해함, 즉, 그 발달을 저지시킴;(1) inhibiting the growth of scleroderma, ie, arresting its development;
(2) 피부경화증의 확산을 예방함, 즉, 전이를 예방함; (2) preventing the spread of scleroderma, ie, preventing metastasis;
(3) 피부경화증을 경감시킴; (3) alleviating scleroderma;
(4) 피부경화증의 재발을 예방함; 및 (4) preventing recurrence of scleroderma; and
(5) 피부경화증의 증상을 완화함(palliating) (5) alleviating the symptoms of scleroderma (palliating)
여기에서 사용된 용어 "포유동물"은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.As used herein, the term "mammal" refers to a mammal that is the subject of treatment, observation or experimentation, preferably a human.
만약, 수혜동물이 조성물의 투여에 견딜 수 있거나, 조성물의 그 동물에의 투여가 적합한 경우라면, 조성물은 "약학적으로 또는 생리학적으로 허용가능함"을 나타낸다. 투여된 양이 생리학적으로 중요한 경우에는 상기 제제는 "치료학적으로 유효량"으로 투여되었다고 말할 수 있다. 상기 제제의 존재가 수혜 환자의 생리학적으로 검출가능한 변화를 초래한 경우라면 상기 제제는 생리학적으로 의미가 있다.A composition is indicated to be "pharmaceutically or physiologically acceptable" if the recipient animal can tolerate administration of the composition, or if administration of the composition to that animal is suitable. When the amount administered is physiologically important, the agent can be said to have been administered in a "therapeutically effective amount". An agent is physiologically meaningful if the presence of the agent results in a physiologically detectable change in the recipient patient.
본 발명의 조성물의 치료적으로 유효한 양은 여러 요소, 예를 들면 투여방법, 목적부위, 환자의 상태 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 인체에 사용 시 투여량은 안전성 및 효율성을 함께 고려하여 적정량으로 결정되어야 한다. 동물실험을 통해 결정한 유효량으로부터 인간에 사용되는 양을 추정하는 것도 가능하다. 유효한 양의 결정시 고려할 이러한 사항은, 예를 들면 Hardman and Limbird, eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed.(2001), Pergamon Press; 및 E.W. Martin ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed.(1990), Mack Publishing Co.에 기술되어있다.The therapeutically effective amount of the composition of the present invention may vary depending on several factors, for example, the administration method, the target site, the condition of the patient, and the like. Therefore, when used in the human body, the dosage should be determined as an appropriate amount in consideration of both safety and efficiency. It is also possible to estimate the amount used in humans from the effective amount determined through animal experiments. These considerations in determining effective amounts are found, for example, in Hardman and Limbird, eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed. (2001), Pergamon Press; and E.W. Martin ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed. (1990), Mack Publishing Co.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 건강상태, 질병의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여, 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount. As used herein, the term "pharmaceutically effective amount" means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment and not to cause side effects, and the effective dose level is determined by the patient's Health status, disease type, severity, drug activity, drug sensitivity, administration method, administration time, administration route and excretion rate, treatment period, factors including drugs used in combination or concurrently, and other factors well known in the medical field can be determined according to The composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be administered singly or multiple times. In consideration of all of the above factors, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect with a minimum amount without side effects, which can be easily determined by those skilled in the art.
본 발명의 조성물은 또한 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 조성물을 생체 내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.The composition of the present invention may also include carriers, diluents, excipients or combinations of two or more commonly used in biological agents. A pharmaceutically acceptable carrier is not particularly limited as long as it is suitable for in vivo delivery of the composition, for example, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. Compounds described in , saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, and one or more of these components can be mixed and used as needed. Conventional additives may be added. In addition, diluents, dispersants, surfactants, binders and lubricants may be additionally added to formulate into injectable formulations such as aqueous solutions, suspensions, emulsions, pills, capsules, granules or tablets. Furthermore, it can be preferably formulated according to each disease or component using an appropriate method in the art or a method disclosed in Remington's Pharmaceutical Science (Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990).
본 발명의 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀전, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may be formulated in the form of oral dosage forms such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, external preparations, suppositories, or sterile injection solutions according to conventional methods, respectively. have.
본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 허용가능한"이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다. As used herein, the term “pharmaceutically acceptable” refers to exhibiting non-toxic properties to cells or humans exposed to the composition.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 중량부 내지 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.The pharmaceutical composition of the present invention may further include a pharmaceutically acceptable additive, wherein the pharmaceutically acceptable additive includes starch, gelatinized starch, microcrystalline cellulose, lactose, povidone, colloidal silicon dioxide, calcium hydrogen phosphate. , lactose, mannitol, syrup, gum arabic, pregelatinized starch, corn starch, powdered cellulose, hydroxypropyl cellulose, Opadry, sodium starch glycolate, lead carnauba, synthetic aluminum silicate, stearic acid, magnesium stearate, aluminum stearate, Calcium stearate, sucrose, dextrose, sorbitol and talc and the like can be used. The pharmaceutically acceptable additive according to the present invention is preferably included in an amount of 0.1 to 90 parts by weight based on the composition, but is not limited thereto.
본 발명에서 사용되는 용어, "투여"란, 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 목적하는 방법에 따라 비 경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 주사 제형으로 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. As used herein, the term "administration" means providing a predetermined substance to a patient by any suitable method, and parenteral administration (eg, intravenous, subcutaneous, intraperitoneal or topical administration according to a desired method) ) or oral administration, and the dosage varies according to the patient's weight, age, sex, health condition, diet, administration time, administration method, excretion rate, and severity of disease.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 개체의 연령, 체중, 성별, 신체 상태 등을 고려하여 선택된다. 상기 약학적 조성물 중 포함되는 유효성분의 농도는 대상에 따라 다양하게 선택할 수 있음은 자명하며, 바람직하게는 약학적 조성물에 0.01 ㎍/ml ~ 50 mg/ml의 농도로 포함되는 것이다. 그 농도가 0.01 ㎍/ml 미만일 경우에는 약학 활성이 나타나지 않을 수 있고, 50 mg/ml를 초과할 경우에는 인체에 독성을 나타낼 수 있다.The composition of the present invention may be administered parenterally (for example, intravenously, subcutaneously, intraperitoneally or topically) or orally, depending on the desired method, and the dosage may vary depending on the subject's age, weight, sex, physical condition, etc. is selected taking into account. It is self-evident that the concentration of the active ingredient included in the pharmaceutical composition can be variously selected depending on the subject, and is preferably included in the pharmaceutical composition at a concentration of 0.01 μg/ml to 50 mg/ml. If the concentration is less than 0.01 μg/ml, pharmaceutical activity may not appear, and if it exceeds 50 mg/ml, it may be toxic to the human body.
본 발명의 약학적 조성물은 다양한 경구 또는 비경구 투여 형태로 제형화될 수 있다. 경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경질, 연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제 (예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활택제 (예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/ 또는 폴리에틸렌 글리콜)를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 정제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제 및 감미제를 함유할 수 있다. 상기 제형은 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다. 또한, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것은 주사용 제제이며, 주사용 제제의 용매로서 물, 링거액, 등장성 생리식염수 또는 현탁액을 들 수 있다. 상기 주사용 제제의 멸균 고정 오일은 용매 또는 현탁 매질로서 사용할 수 있으며 모노-, 디-글리세라이드를 포함하여 어떠한 무자극성 고정오일도 이러한 목적으로 사용될 수 있다. 또한, 상기 주사용 제제는 올레산과 같은 지방산을 사용할 수 있다. The pharmaceutical composition of the present invention may be formulated in various oral or parenteral dosage forms. Formulations for oral administration include, for example, tablets, pills, hard, soft capsules, solutions, suspensions, emulsifiers, syrups, granules, and the like. crose, mannitol, sorbitol, cellulose and/or glycine), lubricants (eg, silica, talc, stearic acid and its magnesium or calcium salts and/or polyethylene glycol). In addition, the tablet may contain a binder such as magnesium aluminum silicate, starch paste, gelatin, tragacanth, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose and/or polyvinylpyrrolidine, and optionally starch, agar, alginic acid. or disintegrants such as sodium salts thereof or effervescent mixtures and/or absorbents, coloring, flavoring and sweetening agents. The formulation may be prepared by conventional mixing, granulating or coating methods. In addition, representative formulations for parenteral administration are injection formulations, and water, Ringer's solution, isotonic physiological saline, or suspension can be exemplified as a solvent for the injection formulation. The sterile, fixed oil of the injectable preparation may be used as a solvent or suspending medium, and any non-irritating fixed oil including mono- and di-glycerides may be used for this purpose. In addition, the injection preparation may use a fatty acid such as oleic acid.
본 발명에서, 용어 "예방"이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 피부경화증의 발생, 확산 및 재발을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.In the present invention, the term "prevention" refers to any action that inhibits or delays the occurrence, spread, and recurrence of scleroderma by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention.
일 측면에서, 본 발명은 miR-21-5p 억제제를 포함하는 STAT3 활성 억제제에 관한 것이다.In one aspect, the present invention relates to an inhibitor of STAT3 activity comprising a miR-21-5p inhibitor.
일 구현예에서, miR-21-5p 억제제는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 핵산을 포함할 수 있다.In one embodiment, the miR-21-5p inhibitor may include a nucleic acid represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
일 측면에서, 본 발명은 시험관 내(in vitro)에서 miR-21-5p 억제제를 처리하는 단계를 포함하는 STAT3의 활성을 감소 또는 억제하는 방법에 관한 것이다.In one aspect, the present invention relates to a method for reducing or inhibiting the activity of STAT3 comprising the step of treating a miR-21-5p inhibitor in vitro.
일 구현예에서, miR-21-5p 억제제는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 핵산을 포함할 수 있다.In one embodiment, the miR-21-5p inhibitor may include a nucleic acid represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
일 실시예에서, 피부경화증 동물모델에서 miR-21-5p가 STAT3를 억제하는 것이 아니라, 오히려 miR-21-5p를 억제하였을 때 STAT3가 억제되는 것을 확인한 바 있으므로, 이를 이용하여 시험관 내에서 STAT3의 활성을 감소 또는 억제할 수 있다.In one embodiment, it was confirmed that miR-21-5p does not inhibit STAT3 in an animal model of scleroderma, but rather inhibits STAT3 when miR-21-5p is inhibited. activity may be reduced or inhibited.
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.The present invention will be described in more detail through the following examples. However, the following examples are only for specifying the contents of the present invention, and the present invention is not limited thereto.
실시예 1. miR21 억제제의 피부 경화 감소 효과 확인Example 1. Confirmation of skin hardening reduction effect of miR21 inhibitor
1-1. miR21 억제제에 의한 피부 두께 감소 효과1-1. Skin thickness reduction effect by miR21 inhibitor
C57BL/6 혹은 balb/c 정상 마우스 등털을 제모한 뒤 미리 준비해둔 블레오마이신(bleomycin)을 0.9% 염화나트륨에 녹인 후 (1mg/ml), 100ul씩 매일 총 4주 동안 목부터 등 부위(정사각형 모양의 각 네 귀퉁이)에 피하주사를 하여 피부경화증 모델을 제작하였다. 그 후 상기 마우스 모델에 하기 표 1의 miR21 억제제(anti-miR21) (서열번호 1)를 코딩 및 발현하는 벡터를 마우스 (20~25g) 1마리 당 100㎍씩 1ml 부피(saline)으로 유체 역학 주입(hydrodynamic injection)하고, 2 주부터 5주까지 주 1회 총 3회 주입하였다. 그 후, 정상 마우스군 (대조군), 피부경화증 마우스군 (무처리 대조군) 및 miR21 억제제 투여 마우스군 (실험군)의 피부를 경화증 유도 35일 후에 각각 10% 포르말린으로 고정시켜 파라핀으로 블록을 제조하였다. 이로부터 피부 절편을 준비하여 슬라이드에 부착하였고, 자일렌을 이용하여 탈 파라핀 과정을 거친 뒤, 고농도 및 저농도 에탄올을 이용하여 함수시켰으며, 헤마톡실린과 에오신으로 피부 절편을 염색하였다. 또한, 교원질 섬유의 밀도를 알아보기 위해 메이슨스 트리크롬(Masson's Trichrome, MT)으로 피부 절편을 염색하였다.After depilating C57BL/6 or balb/c normal mouse back hair, pre-prepared bleomycin was dissolved in 0.9% sodium chloride (1mg/ml), 100ul each daily for a total of 4 weeks from the neck to the back (square shape). A scleroderma model was prepared by subcutaneous injection in each of the four corners). Thereafter, the vector encoding and expressing the miR21 inhibitor (anti-miR21) (SEQ ID NO: 1) of Table 1 below was hydrodynamically injected into the mouse model by 100 μg per mouse (20-25 g) in 1 ml volume (saline). (hydrodynamic injection), and injected once a week for a total of 3 times from 2 weeks to 5 weeks. Thereafter, the skin of the normal mouse group (control group), the scleroderma mouse group (untreated control group), and the miR21 inhibitor-administered mouse group (experimental group) were fixed with 10% formalin each 35 days after sclerosis induction to prepare blocks with paraffin. From this, skin sections were prepared and attached to slides, deparaffinized using xylene, hydrated using high- and low-concentration ethanol, and skin sections were stained with hematoxylin and eosin. In addition, the skin sections were stained with Masson's Trichrome (MT) to determine the density of collagen fibers.
그 결과, 정상 마우스 군에 비해 피부경화증 마우스 모델의 피부 두께 및 진피 내 교원질 섬유의 밀도가 조밀하고 공간이 없어졌으며, 모낭의 크기가 현저히 감소되고 혈관의 위치가 밑으로 쳐저 있어 손상되어 있었으나, miR21 억제제 처리에 의해 현저히 피부경화증의 증상이 완화된 것으로 나타났다 (도 1).As a result, compared with the normal mouse group, the thickness of the skin and the density of collagen fibers in the dermis of the scleroderma mouse model were dense and there was no space, and the size of the hair follicles was significantly reduced and the location of the blood vessels was drooping down. It was shown that the symptoms of scleroderma were remarkably alleviated by the inhibitor treatment (FIG. 1).
1-2. miR21 억제에 의한 효과 검증1-2. Effect verification by miR21 inhibition
상기 miR21 억제제에 의한 피부 경화 감소 효과가 miR21를 억제함으로써 나타난 효과임을 검증하기 위해, 상기 실시예 1-1에서 제작한 피부경화증 마우스 모델에 하기 표 2의 miR21 전구체를 투여하고 마우스 (20~25g) 1마리 당 DNA 벡터 100㎍을 1ml 부피(saline)으로 유체 역학 주입(hydrodynamic injection)하고, 2 주부터 5주까지 주 1회 총 3회 주입하였다. 그 후, miR21 전구체 투여군과 대조군의 피부 절편을 상기 실시예에서와 같이 헤마톡실린과 에오신으로 염색하고 메이슨스 트리크롬(Masson's Trichrome, MT)으로 피부 절편을 염색하였다.In order to verify that the effect of reducing skin hardening by the miR21 inhibitor is the effect shown by inhibiting miR21, the miR21 precursors in Table 2 below were administered to the scleroderma mouse model prepared in Example 1-1, and mice (20-25 g) 100 μg of the DNA vector per animal was hydrodynamically injected in a volume of 1 ml (saline), and a total of 3 times a week from 2 weeks to 5 weeks. Thereafter, the skin sections of the miR21 precursor-administered group and the control group were stained with hematoxylin and eosin as in the above example, and the skin sections were stained with Masson's Trichrome (MT).
그 결과, pre-miR21를 처리시 피부경화증 마우스 모델과 유사한 정도로 피부경화증 증상이 발생한 것으로 나타나 (도 2), 상기 실시예 1-1에서의 miR21 억제제의 효과가 miR21의 억제를 통한 효과임을 확인할 수 있었다.As a result, when pre-miR21 was treated, scleroderma symptoms occurred to a degree similar to that of the scleroderma mouse model ( FIG. 2 ), confirming that the effect of the miR21 inhibitor in Example 1-1 was through the inhibition of miR21. there was.
실시예 2. miR21 억제제의 피부 섬유화 감소 효과 확인Example 2. Confirmation of the effect of miR21 inhibitors on reducing skin fibrosis
2-1. miR21 억제제에 의한 섬유화 감소 효과2-1. Fibrosis Reduction Effect by miR21 Inhibitors
피부경화증 동물모델에서 miR21 억제제에 의한 폐 조직의 섬유화 손상 개선 효과를 확인하기 위해, 경화증 유도 후 35일에 정상 마우스군 (대조군), 피부경화증 마우스군 (무처리 대조군) 및 miR21 억제제 투여 마우스군 (실험군)의 폐를 각각 10% 포르말린으로 고정시키고 파라핀으로 블록을 제조하였다. 이로부터 폐 절편을 준비하여 슬라이드에 부착하였고, 자일렌을 이용하여 탈 파라핀 과정을 거친 후, 고농도 및 저농도 에탄올을 이용하여 함수시켰으며, 헤마톡실린과 에오신으로 폐 절편을 염색하였다.In order to confirm the effect of miR21 inhibitor on the improvement of lung tissue fibrotic damage in an animal model of scleroderma, 35 days after sclerosis induction, a normal mouse group (control group), a scleroderma mouse group (untreated control group), and a miR21 inhibitor-administered mouse group ( Lungs of the experimental group) were fixed with 10% formalin, respectively, and blocks were prepared with paraffin. From this, lung sections were prepared and attached to slides, deparaffinized using xylene, hydrated using high- and low-concentration ethanol, and lung sections were stained with hematoxylin and eosin.
그 결과, miR21 억제제를 처리하지 않은 피부경화증 마우스군 (무처리 대조군)에 비해서는 폐 섬유화가 현저히 증가되어 있었으나, miR21 억제제를 처리한 실험군은 대조군 대비 폐 섬유화가 감소되어 있었으며, 정상군의 폐 조직과 현저히 비슷하게 완화 되었음을 조직학적 분석 및 중증도 지수로 확인하였다 (도 3).As a result, lung fibrosis was significantly increased compared to the scleroderma mouse group (untreated control group) not treated with miR21 inhibitor, but the experimental group treated with miR21 inhibitor had decreased lung fibrosis compared to the control group, and lung tissue of the normal group It was confirmed by histological analysis and severity index that the relief was remarkably similar to
2-2. miR21 억제에 의한 효과 검증2-2. Effect verification by miR21 inhibition
상기 miR21 억제제에 의한 폐 섬유증 감소 효과가 miR21를 억제함으로써 나타난 효과임을 검증하기 위해, 피부경화증 마우스 모델에 miR21 전구체를 투여하고, 상기 실시예에서와 같이 헤마톡실린과 에오신으로 폐 절편을 염색하였다.In order to verify that the miR21 inhibitory effect on reducing lung fibrosis is the effect shown by inhibiting miR21, a miR21 precursor was administered to a scleroderma mouse model, and lung sections were stained with hematoxylin and eosin as in the above example.
그 결과, pre-miR21를 처리시 miR21 억제제를 처리하지 않은 피부경화증 마우스군 (무처리 대조군)보다도 폐 섬유증이 증가한 것으로 나타나 (도 4), 상기 실시예 2-1에서의 miR21 억제제의 효과가 miR21의 억제를 통한 효과임을 확인할 수 있었다.As a result, when pre-miR21 was treated, lung fibrosis was increased compared to the scleroderma mouse group (untreated control group) not treated with the miR21 inhibitor ( FIG. 4 ). It was confirmed that the effect was through the inhibition of
실시예 3. miR21 억제제의 염증성 사이토카인 억제 효과 확인Example 3. Confirmation of inflammatory cytokine inhibitory effect of miR21 inhibitor
3-1. miR21 억제제에 의한 염증성 사이토카인 억제 효과3-1. Inhibition of inflammatory cytokines by miR21 inhibitors
피부경화증 동물모델에서 miR21 억제제 처리에 의한 피부 조직의 진피 내 염증성 사이토카인 발현 정도를 확인하기 위해, 상기 실시예에서와 동일한 방식으로 정상 마우스군 (대조군), 피부경화증 마우스군 (무처리 대조군) 및 miR21 억제제 투여 마우스군 (실험군)에서 각각 피부 절편을 준비하여 슬라이드에 부착한 후, 자가면역 경화증과 관련된 대표적인 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β, IL-6 및 IL-17을 면역화학염색법을 이용하여 염색하였고, 이를 광학현미경으로 분석하였다.In order to confirm the level of inflammatory cytokine expression in the dermis of skin tissue by miR21 inhibitor treatment in an animal model of scleroderma, a normal mouse group (control group), a scleroderma mouse group (untreated control group) and After preparing a skin section from each miR21 inhibitor-administered mouse group (experimental group) and attaching it to a slide, immunochemical staining of TNF-α, IL-1β, IL-6 and IL-17, which are representative inflammatory cytokines related to autoimmune sclerosis, was performed. was used for staining, and it was analyzed with an optical microscope.
그 결과, 본 발명의 miR21 억제제 투여군의 피부 조직에서 TNF-α, IL-1β, IL-6 및 IL-17의 발현이 피부경화증 마우스군 (무처리 대조군)에 비해 현저히 억제되어 있었으며 (도 5), 상기 결과로부터 miR21 억제제가 자가면역 피부경화증 질환에 있어서 염증성 사이토카인의 활성을 조절할 수 있음을 확인할 수 있었다.As a result, the expression of TNF-α, IL-1β, IL-6 and IL-17 in the skin tissue of the miR21 inhibitor-administered group of the present invention was significantly suppressed compared to the scleroderma mouse group (untreated control group) (FIG. 5) , It was confirmed from the above results that the miR21 inhibitor can modulate the activity of inflammatory cytokines in autoimmune scleroderma disease.
3-2. miR21 억제에 의한 효과 검증3-2. Effect verification by miR21 inhibition
상기 miR21 억제제에 의한 염증성 사이토카인 감소 효과가 miR21를 억제함으로써 나타난 효과임을 검증하기 위해, 피부경화증 마우스 모델에 miR21 전구체를 투여하고, 상기 실시예에서와 같이 피부 조직에 대한 조직학적 검사를 수행하였다.In order to verify that the inflammatory cytokine reduction effect of the miR21 inhibitor is the effect shown by inhibiting miR21, the miR21 precursor was administered to a scleroderma mouse model, and histological examination of the skin tissue was performed as in the above example.
그 결과, pre-miR21를 처리시 miR21 억제제를 처리하지 않은 피부경화증 마우스군 (무처리 대조군)보다도 염증성 사이토카인 발현이 현저히 증가한 것으로 나타나 (도 6), 상기 실시예 3-1에서의 miR21 억제제의 효과가 miR21의 억제를 통한 효과임을 확인할 수 있었다. As a result, when pre-miR21 was treated, the expression of inflammatory cytokines was significantly increased compared to the scleroderma mouse group (untreated control group) not treated with the miR21 inhibitor ( FIG. 6 ). It was confirmed that the effect was through the inhibition of miR21.
실시예 4. miR21 억제제의 STAT3 활성 억제 효과 확인Example 4. Confirmation of the inhibitory effect of miR21 inhibitors on STAT3 activity
피부경화증 동물모델에서 miR21 억제제가 STAT3(signal transducer and activator of transcription-3)의 활성을 억제할 수 있는지를 알아보기 위하여 정상 마우스군 (대조군), 피부경화증 마우스군 (무처리 대조군), miR21 억제제 투여 마우스군 (실험군) 및 miR21 전구체 투여군의 마우스로부터 각각 비장을 적출하였다. 적출한 비장을 이용하여 동결절편(Optimal Cutting Temperature compound; O.C.T. compound)을 포매시킨 다음 액화질소에서 조직을 급속 냉각시키고, 냉동 절편기를 이용하여 5㎛ 두께로 슬라이드에 부착하였다. 이후 절편을 아세톤으로 고정하고, 10% 정상 염소 혈청을 도포하여 30분간 비특이적 반응을 차단하였다. 그 후, STAT3를 분석하기 위해서 PBS(pH7.5)에 1:100으로 희석된 PE-labeled anti-STAT3, PE-labeled anti-p-STAT3(s727) Ab 및 PE-labeled anti-p-STAT3(Y705) Ab를 1차 항체로 각각 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰으며, 다음 날 PBS 용액으로 세척하고, 염색한 조직을 공초점 현미경으로 분석하였다. In order to find out whether miR21 inhibitor can inhibit the activity of STAT3 (signal transducer and activator of transcription-3) in an animal model of scleroderma, normal mouse group (control group), scleroderma mouse group (untreated control group), miR21 inhibitor administration Spleens were extracted from the mice of the mouse group (experimental group) and the mice of the miR21 precursor group, respectively. The extracted spleen was used to embed a frozen section (Optimal Cutting Temperature compound; O.C.T. compound), the tissue was rapidly cooled in liquid nitrogen, and then attached to a slide with a thickness of 5 μm using a cryosectioning machine. Thereafter, the sections were fixed with acetone, and 10% normal goat serum was applied to block non-specific reactions for 30 minutes. Then, in order to analyze STAT3, PE-labeled anti-STAT3, PE-labeled anti-p-STAT3 (s727) Ab and PE-labeled anti-p-STAT3 ( Y705) Ab was reacted with a primary antibody at 4° C. overnight, washed with PBS solution the next day, and the stained tissue was analyzed with a confocal microscope.
그 결과, miR21 전구체 투여군에서 STAT3, Y705 인산화 STAT3 및 S727 인산화 STAT3 양성 세포수가 피부경화증 마우스군 (무처리 대조군)에서 보다도 현저히 증가하였으며 (도 7), 이는 miR21 억제제 처리군에서 현저하게 감소한 것으로 나타났다 (도 8).As a result, the number of STAT3, Y705 phosphorylated STAT3, and S727 phosphorylated STAT3 positive cells in the miR21 precursor group increased significantly more than in the scleroderma mouse group (untreated control group) ( FIG. 7 ), which was significantly decreased in the miR21 inhibitor-treated group ( FIG. 7 ). Fig. 8).
<110> THE CATHOLIC UNIVERSITY OF KOREA INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING SYSTEMIC SCLERODERMA <130> PN <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-miR-21-5p <400> 1 ucaacaucag ucugauaagc ua 22 <210> 2 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-21-5p <400> 2 uagcuuauca gacugauguu ga 22 <210> 3 <211> 72 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pre-miR-21-5p <400> 3 ugucggguag cuuaucagac ugauguugac uguugaaucu cauggcaaca ccagucgaug 60 ggcugucuga ca 72 <110> THE CATHOLIC UNIVERSITY OF KOREA INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING SYSTEMIC SCLERODERMA <130> PN <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-miR-21-5p <400> 1 ucaacaucag ucugauaagc ua 22 <210> 2 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-21-5p <400> 2 uagcuuauca gacugauguu ga 22 <210> 3 <211> 72 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pre-miR-21-5p <400> 3 ugucggguag cuuaucagac ugauguugac uguugaaucu cauggcaaca ccagucgaug 60 ggcugucuga ca 72
Claims (11)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020200035738A KR20210119176A (en) | 2020-03-24 | 2020-03-24 | Composition for preventing or treating systemic scleroderma |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020200035738A KR20210119176A (en) | 2020-03-24 | 2020-03-24 | Composition for preventing or treating systemic scleroderma |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
KR20210119176A true KR20210119176A (en) | 2021-10-05 |
Family
ID=78077781
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020200035738A KR20210119176A (en) | 2020-03-24 | 2020-03-24 | Composition for preventing or treating systemic scleroderma |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
KR (1) | KR20210119176A (en) |
-
2020
- 2020-03-24 KR KR1020200035738A patent/KR20210119176A/en not_active Application Discontinuation
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU2012238525B2 (en) | Medicament for liver regeneration and for treatment of liver failure | |
Zhao et al. | The long noncoding RNA Blnc1 orchestrates homeostatic adipose tissue remodeling to preserve metabolic health | |
EP3210611B1 (en) | Methods of treating vascular inflammatory disorders | |
JP2019500334A (en) | Monocarboxylic acid transporter 4 (MCT4) antisense oligonucleotide (ASO) inhibitor for use as a therapeutic agent in the treatment of cancer | |
Chang et al. | Inhibitory effects of glucosamine on endotoxin-induced uveitis in Lewis rats | |
EP2608812B1 (en) | Nucleic acids targeting mir-33 micrornas for regulating lipid metabolism | |
KR20210119176A (en) | Composition for preventing or treating systemic scleroderma | |
JP2017145222A (en) | Preventive/therapeutic agent for liver fibrosis | |
CN112294787B (en) | Combined medicine for treating liver cancer | |
US11464750B2 (en) | Anticancer agent and use thereof | |
CN116685333A (en) | siRNA for treating hepatic fibrosis and delivery preparation thereof | |
Zhao et al. | High expression of hexokinase 2 promotes lung cancer proliferation and metastasis | |
CN111419832A (en) | Pharmaceutical composition and application thereof in preparing medicines for treating tumors | |
KR20220104653A (en) | Composition comprising inhibitors of miR 145 for preventing and treating myocardial infarction | |
EP3785768A1 (en) | Target for drug treatment of tumor metastasis and use thereof | |
Yan | CD38 Inhibition Attenuates Monosodium Urate Crystal-induced Inflammation in Macrophages | |
JP2022549741A (en) | Application of peginterferon and proto-oncogene product targeted inhibitors in synergistic treatment of renal cancer | |
EP3101133B1 (en) | Sirna in tandem expression and uses thereof in treating chronic lymphocytic leukemia | |
WO2020246717A1 (en) | Pharmaceutical composition containing heres expression inhibitor for preventing or treating squamous cell carcinomamodulator | |
WO2019023344A1 (en) | Methods and compositions for treating and preventing metastatic tumors | |
WO2022127788A1 (en) | Application of lenvatinib and aurora-a kinase inhibitor in preparing cancer-inhibiting drugs | |
KR102182081B1 (en) | Pharmaceutical composition for preventing or treating leukemia containing expression inhibitor of CA5A and CA5B | |
CN109700807B (en) | Application of compound RH-1402 in preparation of acute kidney injury resistant medicine | |
CN116549631A (en) | Therapeutic use of targeted IL-17A as anti-leukemia | |
CN114306594A (en) | Application of desulzumab ozogamicin in preparation of medicine for treating knee osteoarthritis |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
E902 | Notification of reason for refusal | ||
E601 | Decision to refuse application |