KR20210114976A - 암의 치료 및 예방을 위한 pd-1을 표적으로 하는 dna 단클론성 항체 - Google Patents

암의 치료 및 예방을 위한 pd-1을 표적으로 하는 dna 단클론성 항체 Download PDF

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더 위스타 인스티튜트 오브 아나토미 앤드 바이올로지
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Abstract

세포예정사 단백질 1 (PD-1)을 표적으로 하는 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 재조합 핵산 서열을 포함하는 조성물이 본원에 개시된다. 본 발명은 또한 본 발명의 조성물을 사용하여 대상체에서 암과 같은 질병을 예방 및/또는 치료하는 방법을 제공한다.

Description

암의 치료 및 예방을 위한 PD-1을 표적으로 하는 DNA 단클론성 항체
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은 2019 년 1 월 11 일에 출원된 미국 가출원 No. 62/791,146에 우선권을 주장하며 그 전체 내용은 여기에 참조로 포함된다.
기술 분야
본 발명은 생체 내에서 하나 이상의 면역 관문 분자 (예컨대, 세포예정사 단백질 1 (PD-1) 및 이의 기능적 단편)를 표적으로 하는 항체를 포함하는 하나 이상의 합성 항체를 생성하기위한 재조합 핵산 서열을 포함하는 조성물 및 상기 조성물을 투여함으로써 대상체에서 암 및 기타 상태를 예방 및/또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
배경기술
PD-1-PD-L1 신호 전달 경로를 표적으로 하는 단클론성 항체는 2006 년에 임상 시험을 시작했으며 그 이후로 흑색종, 비소세포폐암, 신세포암종, 고 미세부수체 불안정성 암, 호지킨 병, 간세포암종, 요로상피암, 방광암, 머켈세포암종 및 위식도 접합부를 포함한 다양한 종양 유형에 대한 FDA 승인을 받았다 (Ribas 및 Wolchok, 2018, Science, 359(6382):1350-5).
관문 봉쇄 요법은 많은 고형 종양 치료에 혁명을 일으켰다. 이러한 치료법은 면역 체계의 '브레이크 해제'를 통해 암 장기 생존자의 비율을 높이고 그 환자에게 항종양 효과를 강화하였다 (Ribas 및 Wolchok, 2018, Science, 359(6382):1350-5). 그러나 단백질 합성의 어려움, 안정성 및 빈번한 고용량의 항체 투여 요구로 인해 이 획기적인 요법으로 치료할 수 있는 환자 수가 제한된다 (Ecker 등, 2015, MAbs, 7(1):9-14). 예컨대, 미국에서 관문 저해제 치료 비용은 연간 100,000-200,000 달러이며, 시너지 효과를 보여주는 복합 요법으로 이 가격은 상승할 것으로 예상된다 (Andrews, 2015, Am Health Drug Benefits, 8(Spec Issue):9).
따라서, 암 및 기타 상태의 치료를 위해 PD-1과 같은 면역 관문 분자를 표적으로 하는 개선되고 비용 효율적인 조성물 및 방법이 당업계에 필요하다. 본 발명은 이러한 미충족 요구를 충족시킨다.
발명의 간단한 요약
일 구체예에서, 본 발명은 대상체에서 하나 이상의 항-PD-1 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는, 하나 이상의 항-세포예정사 단백질 1 (PD-1) 또는 이의 단편을 생성하기 위한 조성물에 관한 것이다. 일 구체예에서, 상기 조성물은 절단 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산 분자를 포함한다. 일 구체예에서, 상기 조성물은 상기 항체의 가변 중쇄 영역 및 가변 경쇄 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산 분자를 포함한다. 일 구체예에서, 상기 조성물은 불변 중쇄 영역을 포함하는 폴리펩타이드 및 불변 경쇄 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산 분자를 포함한다. 일 구체예에서, 상기 조성물은 가변 중쇄 영역; 불변 중쇄 영역; 절단 도메인; 가변 경쇄 영역; 및 불변 경쇄 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산 분자를 포함한다.
일 구체예에서, 상기 조성물은 리더 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하는 하나 이상의 핵산 분자를 포함한다.
일 구체예에서, 상기 조성물은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 적어도 하나의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일 구체예에서, 상기 조성물은 서열번호 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12의 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 80% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일 구체예에서, 상기 하나 이상의 핵산 분자는 발현 백터 내에 존재하도록 조작된다.
일 구체예에서, 상기 조성물은 항원을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 더 포함한다. 일 구체예에서, 상기 항원은 암 항원이다.
일 구체예에서, 상기 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 더 포함한다.
일 구체예에서, 본 발명은 대상체에서 질환을 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 대상체에서 하나 이상의 항-PD-1 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는, 하나 이상의 항-세포예정사 단백질 1 (PD-1) 또는 이의 단편을 생성하기 위한 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일 구체예에서, 상기 조성물은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 적어도 하나의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일 구체예에서, 상기 조성물은 서열번호 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12의 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 80% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일 구체예에서, 상기 하나 이상의 핵산 분자는 발현 백터 내에 존재하도록 조작된다.
일 구체예에서, 상기 조성물은 항원을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 더 포함한다. 일 구체예에서, 상기 항원은 암 항원이다. 일 구체예에서, 상기 질환은 암이다.
일 구체예에서, 본 발명은 면역 반응의 증가를 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 증가시키는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 대상체에서 하나 이상의 항-PD-1 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는, 하나 이상의 항-세포예정사 단백질 1 (PD-1) 또는 이의 단편을 생성하기 위한 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일 구체예에서, 상기 조성물은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 적어도 하나의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일 구체예에서, 상기 조성물은 서열번호 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12의 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 80% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일 구체예에서, 상기 하나 이상의 핵산 분자는 발현 백터 내에 존재하도록 조작된다.
일 구체예에서, 상기 조성물을 투여하는 방법은 전기천공 단계를 포함한다.
일 구체예에서, 상기 방법은 항원을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 후속 단계를 추가로 포함한다. 일 구체예에서, 상기 항원은 암 항원이다.
도 1. 인간 IgG의 혈청 농도: 항-PD1DMAb-1 (니볼루맙 기반) 및 IM-EP에 의해 표시된 DMAb 100 ug를 주사한 Balb/c 마우스에서 시간에 따른 최적화된 서열. (군 당 n=5 마우스).
도 2. ELISA에 의해 마우스 혈청에서 인간 PD-1 단백질로 정제된 항- PD1DMAb-1의 결합 및 이의 변형. (군 당 n=2 마우스). Mean ±SEM.
도 3. 인간 IgG의 혈청 농도: 항-PD1DMAb-2 (펨브롤리주맙 기반) 및 IM-EP에 의해 표시된 DMAb 100ug를 주사한 Balb/c 마우스에서 시간에 따른 최적화된 서열. (군 당 n=5 마우스).
도 4. ELISA에 의해 마우스 혈청에서 인간 PD-1 단백질로 정제된 항-PD1DMAb-2의 결합 및 이의 변형. (군 당 n=2 마우스). Mean ±SEM.
도 5. 5 일 동안 항-CD3/항-CD28 비드로 자극한 후 CD8 및 CD4 T 세포에 대한 유세포 분석법에 의해 항-PD1DMAb-1 또는 항-PD1DMAb-2 원본 및 변형, 미처리 마우스 (음성 혈청) 및 항-PD-1 항체 EH12.2H7 (양성 대조군) 주사된 마우스에서 혈청의 결합.
상세한 설명
본 발명은 항체, 이의 단편, 이의 변이체 또는 이의 조합을 암호화하는 재조합 핵산 서열을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 생체 내 발현 및 합성 항체의 형성을 용이하게 하기 위해 이를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다.
특히, 재조합 핵산 서열로부터 발현된 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드는 합성 항체로 조립될 수 있다. 중쇄 폴리펩타이드 및 경쇄 폴리펩타이드는 조립 결과 합성 항체가 항원에 결합할 수 있도록 서로 상호 작용할 수 있으며, 본원에 기술된 바와 같이 조립되지 않은 항체에 비해 더 면역원성이고 항원에 대한 면역 반응을 유도하거나 유도할 수 있다.
또한 이러한 합성 항체는 항원 유도 면역 반응에 반응하여 생성되는 항체보다 대상체에서 더 빠르게 생성된다. 상기 합성 항체는 다양한 항원에 효과적으로 결합하고 중화할 수 있다. 상기 합성 항체는 또한 질병으로부터 효과적으로 보호 및/또는 생존을 촉진할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 PD-1에 대한 조작된 항체 또는 합성 항체와 같은 관문 저해제를 투여함으로써 면역 반응을 증가시키거나 향상시키는, 즉, 보다 효과적인 면역 반응을 생성하는데 사용될 수 있는 조성물에 관한 것이다. (예컨대, 합성 DNA 플라스미드 형태의 조작된 MAb; "DMAb").
합성 DNA 플라스미드 형태의 조작된 MAb와 관련하여, 본 발명은 항체, 이의 단편, 이의 변이체 또는 이의 조합을 암호화하는 재조합 핵산 서열을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 생체 내 발현 및 합성 항체의 형성을 용이하게 하기 위해 이를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 본원에 기재된 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일 구체예에서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6의 폴리펩타이드 서열, 또는 이의 변이체 또는 이의 단편을 암호화히는 서열을 포함한다. 일 구체예에서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 본원에 기재된 DNA 서열로부터 전사된 RNA 서열을 포함한다. 예컨대, 일 구체예에서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6의 폴리펩타이드 서열을 암호화하는 DNA 서열에 의해 전사된 RNA 서열, 또는 이의 변이체 또는 이의 단편을 포함한다.
일 구체예에서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화한다. 일 구체예에서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열의 단편을 암호화한다.
일 구체예에서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6 중 하나 이상을 암호화하는 상기 뉴클레오타이드 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95% 동일성을 갖는다. 일 구체예에서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6 중 하나 이상을 암호화하는 상기 뉴클레오타이드 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열의 단편이다.
일 구체예에서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 7, 8, 9, 10, 11, 및 12의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 80% 동일성을 갖는다. 일부 사례에서, 본 발명의 상기 항체는 적어도 면역글로불린의 가변 영역을 포함하는 이러한 항체를 암호화하는 DNA 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 상기 항체는 상승 효과를 생성하기 위해 관문 분자 (예컨대, 항-CTLA4 항체)를 표적화하는 하나 이상의 추가 항체와 조합하여 투여될 수 있으며; 반면, 다른 경우에는 상기 항체를 단독으로 투여할 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 상기 항체는 상승 효과를 생성하기 위해 TERT와 같은 항원을 포함하는 원하는 조성물과 조합하여 투여될 수 있으며; 반면, 다른 경우에 항체는 항원을 포함하는 조성물과 별도로 투여될 수 있다.
본 발명의 상기 조성물은 관문 저해제를 포함하지 않는 백신에 비해 CD8+ T 세포 반응을 증가시킴으로써 대상체에서 백신의 항원에 대한 면역 반응을 증가시킬 수 있다. 이 증가된 CD8+ T 세포 반응은 세포 용해 활성을 가지며 사이토카인 인터페론 감마 (IFN-γ)를 분비한다.
본 발명의 상기 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 또한 포함할 수 있다.
본 발명의 측면은 또한 본원에 제공된 임의의 조성물을 대상체에게 투여함으로써 이를 필요로 하는 대상체에게 면역 반응을 증가시키는 방법을 포함한다. 면역 반응을 증가시키는 상기 방법은 또한 전기천공 단계를 포함할 수도 있다.
1. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 이용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 상충될 때, 정의를 포함하여 본 문서가 우선시될 것이다. 바람직한 방법 및 물질이 하기에 기재되어 있지만, 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 평가에서 이용될 수 있다. 본 명세서에서 언급된 모든 공보, 특허출원, 특허 및 다른 참고문헌은 이들의 전문이 참고로 포함된다. 본 명세서에 개시된 물질, 방법, 및 실시예는 단지 예시적인 것으로서, 제한하려는 것은 아니다.
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"항체"는 Fab, F(ab')2, Fd, 및 단일쇄 항체, 및 이들의 유도체를 포함하는 클래스 IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE의 항체, 또는 단편, 이의 단편 또는 유도체를 의미할 수 있다. 항체는 원하는 에피토프 또는 이로부터 유래된 서열에 충분한 결합 특이성을 나타내는 포유류 혈청 샘플에서 단리된 항체, 다클론성 항체, 친화도 정제된 항체, 또는 이들의 혼합물일 수 있다.
"항원"은 숙주에서 면역 반응을 생성하는 능력이 있는 단백질을 의미한다. 항원은 항체에 의해 인식되고 결합될 수 있다. 항원은 신체 내부 또는 외부 환경에서 발생할 수 있다.
"CDR"은 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 초가변 영역인 항체의 상보성 결정 영역 아미노산 서열로 정의된다. 예컨대, Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987) 참조. 면역글로불린의 가변 부분에는 3 개의 중쇄 및 3 개의 경쇄 CDR (또는 CDR 영역)이 있다. 따라서, 본원에 사용된 바와 같은 "CDR"은 모두 3개의 중쇄 CDR, 또는 모두 3개의 경쇄 CDR (또는 적절한 경우, 모두 중쇄 및 모두 경쇄 CDR 둘 모두)을 나타낸다. 항체의 구조 및 단백질 폴딩은 다른 잔기가 항 원 결합 영역의 일부로 간주되며, 당업자에 의해 이렇게 이해될 것임을 의미할 수 있다. 예컨대, Chothia 등, (1989) Conformations of immunoglobulin hypervariable regions; Nature 342, p 877-883 참조.
본 명세서에서 상호 교환적으로 이용되는 "항체 단편" 또는 "항체의 단편"은 항원-결합 부위 또는 가변 영역을 포함하는 온전한 항체의 일부를 나타낸다. 이 일부에는 온전한 항체의 Fc 영역의 불변 중쇄 도메인 (즉, 항체 아이소형에 따라 CH2, CH3, 또는 CH4)이 포함되지 않는다. 항체 단편의 예에는 비제한적으로 Fab 단편, Fab' 단편, Fab'-SH 단편, F(ab')2 단편, Fd 단편, Fv 단편, 디아바디 (diabody), 단일쇄 Fv(scFv) 분자, 하나의 경쇄 가변 도메인만 함유하는 단일쇄 폴리펩타이드, 경쇄 가변 도메인의 세개의 CDR을 함유하는 단일쇄 폴리펩타이드, 하나의 중쇄 가변 영역만 함유하는 단일쇄 폴리펩타이드, 및 중쇄 가변 영역의 세 개의 CDR을 함유하는 단일쇄 폴리펩타이드가 포함된다.
본 명세서에서 이용되는 "보강제"는 항원의 면역원성을 향상시키기 위해서 본 명세서에 기술된 백신에 첨가되는 임의의 분자를 의미하고, 특히, 관문 저해제 항체를 지칭한다.
본 명세서에서 이용되는 "관문 저해제"는 암 면역요법 분야에서 일반적으로 이해되는 바와 같이 면역 관문을 차단하는 저해제 또는 분자를 의미한다. 보다 일반적으로 관문 저해제는 이러한 면역 관문을 차단하는 항체이다.
본 명세서에서 이용되는 "암호 서열" 또는 "암호화 핵산"은 본 명세서에 나타낸 바와 같은, 단백질, 예컨대 항체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 (RNA 또는 DNA 분자)을 의미한다. 암호 서열은 또한 RNA 서열을 암호화하는 DNA 서열을 포함할 수 있다. 암호 서열은 핵산이 투여되는 개인 또는 포유류의 세포에서 발현을 지시할 수 있는 프로모터 및 폴리아데닐화 신호를 포함하는 조절 요소에 작동 가능하게 연결된 개시 및 종결 신호를 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 "상보체" 또는 "상보적인"은 핵산이 핵산 분자의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체 간 왓슨-크릭 (예컨대, A-T/U 및 C-G) 또는 후그스틴 염기쌍 형성을 의미할 수 있음을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 "정전류"는 동일한 조직에 전달된 전기 펄스의 지속기간에 걸쳐 조직, 또는 상기 조직을 정하는 세포에 의해 수용되거나 또는 경험되는 전류를 의미한다. 상기 전기 펄스는 본 명세서에 기재된 전기천공 장치로부터 전달된다. 이 전류는 전기 펄스의 수명에 걸쳐 상기 조직에서 일정한 암페어 수로 남아있는데 본 명세서에 제공된 전기천공 장치가 바람직하게 즉각적인 피드백을 갖는 피드백 요소를 갖기 때문이다. 상기 피드백 요소는 펄스의 지속기간 전체적으로 조직 (또는 세포)의 저항을 측정하고 전기천공 장치가 그의 전기 에너지 출력을 변경하도록 (예컨대, 전압을 증가시키도록) 야기할 수 있으며, 따라서 동일한 조직 내 전류는 전기 펄스 전체적으로 (대략 마이크로초), 그리고 펄스 간에 일정하게 남아있다. 일부 구체예에서, 상기 피드백 요소는 제어기를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 "전류 피드백" 또는 "피드백"은 상호 호환적으로 사용될 수 있고, 전극 사이에서 조직 내 전류를 측정하는 것 및 따라서 불변 수준에서 전류를 유지하기 위해 EP 장치에 의해 전달되는 에너지 출력을 변경하는 것을 포함하는, 제공된 전기천공 장치의 활성 반응을 의미할 수 있다. 이 불변 수준은 펄스 서열 또는 전기적 처리의 개시 전에 사용자에 의한 프리셋이다. 상기 피드백은 전기천공 구성성분, 예컨대, 전기천공 장치의 제어기에 의해 달성될 수 있는데, 그의 전기 회로가 전극 사이의 조직 내 전류를 지속적으로 모니터링할 수 있고 해당 모니터링 전류 (또는 조직 내의 전류)를 프리셋 전류와 비교하며 프리셋 수준에서 모니터링 전류를 유지하기 위해 에너지 출력 조절을 지족적으로 만들기 때문이다. 상기 피드백 루프는 아날로그 폐고리 피드백이기 때문에 순간적일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 "분산 전류"는 본 명세서에 기재된 전기천공 장치의 다양한 바늘 전극 어레이로부터 전달된 전기 전류의 패턴을 의미할 수 있되, 패턴은 전기천공되는 조직의 임의의 영역 상에서 전기천공 관련 열 스트레스의 발생을 최소화하거나, 또는 바람직하게 제거한다.
본 명세서에서 상호 교환적으로 이용되는 "전기천공", "전기-투과화", 또는 "전기-역학 증강" ("EP")은 생체막에서 미시적 경로 (구멍)를 유도하기 위한 막관통 전기장 자극의 이용을 의미한다; 이들의 존재는 생체분자, 예컨대, 플라스미드, 올리고뉴클레오타이드, siRNA, 약물, 이온, 및 물이 세포막의 한쪽에서 다른 쪽으로 이동할 수 있게 한다.
본 명세서에서 이용되는 "내인성 항체"는 체액성 면역 반응의 유도를 위해 유효 용량의 항원이 투여되는 대상체에서 생성되는 항체를 나타낼 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "피드백 메커니즘"은 소프트웨어 또는 하드웨어 (또는 펌웨어) 중 하나에 의해 수행되는 공정을 지칭할 수 있으며, 이 공정은 수신하고, 목적하는 조직의 임피던스 (에너지 펄스의 전달 전에, 동안에 그 리고/또는 후에)를 현재의 값, 바람직하게는 전류와 비교하며, 그리고 프리셋 값을 달성하기 위해 전달된 에너지의 펄스를 조절한다. 피드백 메커니즘은 아날로그 폐고리 회로에 의해 수행될 수 있다.
"단편"은 작용하는 항체의 폴리펩타이드 단편을 의미할 수 있으며, 즉, 목적하는 표적에 결합하고, 전장 항체와 동일한 의도적 효과를 가질 수 있다. 항체 단편은 위치 1에서 신호 펩타이드 및/또는 메티오닌이 있는 또는 없는 각각의 경우에 N 및/또는 C 말단으로부터 적어도 하나의 아미노산이 상실된 것을 제외하고 전장과 100% 동일할 수 있다. 단편은 임의의 이종성 신호 펩타이드가 더해진 것을 제외하고 특정 전장 항체 길이의 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 백분율을 포함할 수 있다. 단편은 항체와 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 폴리펩타이드의 단편을 포함할 수 있고, 백분율 동일성을 계산할 때 포함되지 않은 N 말단의 메티오닌 또는 이종성 신호 펩타이드를 추가로 포함한다. 단편은 N 말단의 메티오닌 및/또는 신호 펩타이드, 예컨대 면역글로불린 신호 펩타이드, 예컨대 IgE 또는 IgG 신호 펩타이드를 추가로 포함할 수 있다. N 말단의 메티오닌 및/또는 신호 펩타이드는 항체의 단편에 연결될 수 있다.
항체를 암호화하는 핵산 서열의 단편은 위치 1에서 신호 펩타이드 및/또는 메티오닌을 암호화하는 서열이 있는 또는 없는 각각의 경우에 5' 및/또는 3' 말단으로부터 적어도 하나의 뉴클레오타이드가 상실된 것을 제외하고 전장과 100% 동일할 수 있다. 단편은 임의의 이종성 신호 펩타이드가 더해진 것을 제외하고 특정 전장 암호 서열 길이의 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이 상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 백분율을 포함할 수 있다. 단편은 항체와 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 폴리펩타이드를 암호화하는 단편을 포함할 수 있고, 추가적으로 백분 율 동일성을 계산할 때 포함되지 않은 N 말단의 메티오닌 또는 이종성 신호 펩타이드를 선택적으로 포함한다. 단편은 N 말단의 메티오닌 및/또는 신호 펩타이드, 예컨대 면역글로불린 신호 펩타이드, 예컨대 IgE 또는 IgG 신호 펩타이드에 대한 암호 서열을 추가로 포함할 수 있다. N 말단의 메티오닌 및/또는 신호 펩타이드를 암호화하는 암호 서열은 암호 서열의 단편에 연결될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "유전자 작제물"은 항체와 같은 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 또는 RNA 분자를 지칭한다. 상기 암호 서열은 핵산 분자가 투여되는 개체의 세포에서 발현을 지시할 수 있는 프로모터 및 폴리아데닐화 신호를 포함하는 조절 요소에 작동 가능하게 연결된 개시 및 종결 신호를 포함한다. 본 명세서에 사용되는 용어 "발현 가능한 형태"는 개체의 세포에 존재할 때 암호 서열이 발현되도록 단백질을 암호 화하는 암호 서열에 작동 가능하게 연결된 필수 조절 요소를 함유하는 유전자 작제물을 지칭한다.
2 이상의 핵산 또는 폴리펩타이드 서열과 관련하여 본 명세서에 사용된 "동일한" 또는 "동일성"은 서열이 구체화된 영역에 걸쳐 동일한 잔기의 구체화된 백분율을 가진다는 것을 의미할 수 있다. 백분율은 두 서열을 최적으로 정렬하는 것, 구체화된 영역에 걸쳐 두 서열을 비교하는 것, 매칭되는 위치의 수를 얻기 위해 동일한 잔기가 서열 둘 다에서 생기는 위치 수를 결정하는 것, 매칭된 위치의 수를 구체화된 영역 내 위치의 총 수로 나누는 것, 및 결과에 100을 곱해서 서열 동일성의 백분율을 얻는 것에 의해 계산될 수 있다. 두 서열이 상이한 길이를 갖거나 또는 정렬이 하나 이상의 엇갈린 말단을 생성하고 비교의 구체화된 영역이 단일 서열만을 포함하는 경우에, 단일 서열의 잔기는 계산의 분모에 포함되며 분자에는 포함되지 않는다. DNA와 RNA를 비교할 때, 티민 (T)과 유라실 (U)은 동등물로 고려될 수 있다. 동일성은 수동으로 또는 BLAST 또는 BLAST 2.0과 같은 컴퓨터 서열 알고리즘을 이용함으로써 수행될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "임피던스"는 피드백 메커니즘을 논의할 때 사용될 수 있고, 옴의 법칙에 따라 전류값으로 전환될 수 있으며, 따라서 프리셋 전류와의 비교를 가능하게 한다.
본 명세서에 사용되는 "면역 반응"은 하나 이상의 핵산 및/또는 펩타이드의 도입에 반응하여, 숙주의 면역계, 예컨대, 포유류의 면역계의 활성화를 의미할 수 있다. 면역 반응은 세포성 반응 또는 체액성 반응, 또는 둘 다의 형태일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "핵산" 또는 "올리고뉴클레오타이드" 또는 "폴리뉴클레오타이드"는 함께 공유 결합된 적어도 2개의 뉴클레오타이드를 의미할 수 있다. 단일 가닥의 도시는 또한 상보성 가닥의 서열을 정한다. 따라서, 핵산은 또한 도시된 단일 가닥의 상보성 가닥을 포함한다. 핵산의 다수 변이체는 주어진 핵산과 동일한 목적을 위해 사용될 수 있다. 따라서, 핵산은 또한 실질적으로 동일한 핵산 및 이의 상보체를 포함한다. 단일 가닥은 엄격한 혼성화 조건 하에 표적 서열에 혼성화될 수 있는 프로브를 제공한다. 따라서, 핵산은 또한 엄격한 혼성화 조건 하에 혼성화하는 프로브를 포함한다.
핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있거나, 또는 이중 가닥과 단일 가닥 서열 둘 다의 일부를 함유할 수 있다. 핵산은 DNA, 게놈과 cDNA 둘 다, RNA, 또는 혼성체일 수 있으며, 핵산은 데옥시리보- 와 리보-뉴클레오타이드의 조합물, 및 유라실, 아데닌, 티민, 사이토신, 구아닌, 이노신, 잔틴 하이포크산틴, 아이소사이토신 및 아이소구아닌을 포함하는 염기의 조합물을 함유할 수 있다. 핵산은 화학적 합성 방법에 의해 또는 재조합 방법에 의해 얻을 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "작동 가능하게 연결된"은 유전자의 발현이 그와 공간적으로 연결된 프로모터의 제어 하에 있다는 것을 의미할 수 있다. 프로모터는 그의 제어 하에서 유전자의 5' (상류) 또는 3' (하류)에 위치될 수 있다. 프로모터와 유전자 사이의 거리는 프로모터로부터 전달되는 유전자에서 제어하는 유전자와 프로모터 사이의 거리와 거의 동일할 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 이 거리의 변형은 프로모터 기능의 상실 없이 제공될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "펩타이드", "단백질" 또는 "폴리펩타이드"는 아미노산의 연결된 서열을 의미할 수 있으며, 천연, 합성 또는 천연과 합성의 변형 또는 조합일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "프로모터"는 세포 내 핵산의 발현을 부여하거나, 활성화시키거나 또는 향상시킬 수 있는 합성 또는 천연 유래 분자를 의미한다. 프로모터는 추가로 발현을 향상시키기 위해 그리고/또는 이의 공간적 발현 및/또는 시간적 발현을 변경시키기 위해 하나 이상의 특정 전사 조절 서열을 포함할 수 있다. 프로모터는 또한 원위의 인핸서 또는 리프레서 요소를 포함할 수 있는데, 이는 전사의 시작 부위로부터 몇천개의 염기쌍만큼 위치될 수 있다. 프로모터는 바이러스, 박테리아, 진균, 식물, 곤충 및 동물을 포함하는 공급원으로부터 유래될 수 있다. 프로모터는 발현이 일어나는 세포, 조직 또는 기관에 대해, 또는 외부 자극, 예컨대 생리적 스트레스, 병원균, 금속 이온 또는 유도체에 반응하여, 구성적으로 또는 분화적으로 유전자 성분의 발현을 조절할 수 있다. 프로모터의 대표적 예는 박테리오파지 T7 프로모터, 박테리오파지 T3 프로모터, SP6 프로모터, lac 오퍼레이터-프로모터, tac 프로모터, SV40 후기 프로모터, SV40 초기 프로모터, RSV-LTR 프로모터, CMV IE 프로모터, SV40 초기 프로모터 또는 SV 40 후기 프로모터 및 CMV IE 프로모터를 포함한다.
"신호 펩타이드" 및 "리더 서열"은 본 명세서에서 상호 호환적으로 사용되며, 본 명세서에 제시된 단백질의 아미노 말단에 연결될 수 있다. 신호 펩타이드/리더 서열은 전형적으로 단백질의 국소화를 지시한다. 본 명세서에 사용되는 신호 펩타이드/리더 서열은 바람직하게는 그것이 생성되는 세포로부터 단백질의 분비를 용이하게 한다. 신호 펩타이드/리더 서열은, 세포로부터 분비시, 종종 성숙 단백질로서 지칭되는 단백질의 나머지로부터 절단된다. 신호 펩타이드/리더 서열은 단백질의 N 말단에 연결된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "엄격한 혼성화 조건"은, 예컨대 핵산의 복합체 혼합물에서 제1 핵산 서열 (예컨대, 프로브)이 제2 핵산 서열 (예컨대, 표적)에 혼성화되는 조건을 의미할 수 있다. 엄격한 조건은 서열 의존적이며, 상이한 환경에서 상이할 것이다. 엄격한 조건은 정해진 이온 강도 pH에서 특정 서열에 대해 열 융점 (Tm)보다 약 5 내지 10℃ 더 낮아지도록 선택될 수 있다. Tm은 표적에 상보성인 프로브의 50%가 평형상태에서 표적 서열에 혼성화하는 (정해진 이온 강도, pH 및 핵산 농도 하에서의) 온도일 수 있다 (표적 서열이 과량으로 존재함에 따라, Tm에서, 프로브의 50%는 평형상태에서 점유된다). 엄격한 조건은 염 농도가 pH 7.0 내지 8.3에서 약 1.0 M 미만인 나트륨 이온, 예컨대 약 0.01 내지 1.0 M 나트륨 이온 농도 (또는 다른 염)이고, 온도는 짧은 프로브 (예컨대, 약 10 내지 50개의 뉴클레오타이드)에 대해 적어도 약 30℃ 및 긴 프로브 (예컨대, 약 50 개 초과의 뉴클레오타이드)에 대해 적어도 약 60℃ 인 것일 수 있다. 엄격한 조건은 또한 폼아마이드와 같은 탈 안정제의 첨가에 의해 달성될 수 있다. 선택적 또는 특이적 혼성화를 위해, 양의 신호는 적어도 2 내지 10배의 배경 혼성화일 수 있다. 예시적인 엄격한 혼성화 조건은 다음을 포함한다: 50% 폼아마이드, 5x SSC, 및 1% SDS, 42℃에서 인큐베이션, 또는 5x SSC, 1% SDS, 65℃에서 인큐베이션, 65℃에서 0.2x SSC, 및 0.1% SDS에서 세척.
본 명세서에 호환적으로 사용되는 "대상체" 및 "환자"는 포유류 (예컨대, 소, 돼지, 낙타, 라마, 말, 염 소, 토끼, 양, 햄스터, 기니픽, 고양이, 개, 래트 및 마우스, 비인간 영장류 (예컨대, 원숭이, 예컨대 사이노몰거스 또는 레서스 원숭이, 침팬지 등) 및 인간)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 임의의 척추동물을 지칭한다. 일부 구체예에서, 대상체는 인간 또는 비인간일 수 있다. 대상체 또는 환자는 다른 치료 형태를 겪을 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "실질적으로 상보성"은 제1 서열이 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100개 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 영역에 대해 제2 서열의 상보체에 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나, 또는 두 서열이 엄격한 혼성화 조건 하에서 혼성화하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 "실질적으로 동일한"은 제1 서열이 제2 서열의 상보체에 대해 실질적으로 동일하다면, 제1 및 제2 서열이 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100개 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 영역에 대해, 또는 핵산에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 것을 의미한다.
본 명세서에 사용되는 "합성 항체"는 본 명세서에 기재된 재조합 핵산 서열에 의해 암호화되고 대상체에서 생성되는 항체를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 "치료" 또는 "치료하는"은 질환을 예방하거나, 억제하거나, 억압하거나 또는 완전히 제 거하는 수단을 통한 질환으로부터의 대상체의 보호를 의미할 수 있다. 질환의 예방은 질환의 개시 전에 대상체에 본 발명의 백신을 투여하는 것을 수반한다. 질환의 억제는 질환의 유도 후에 그러나 그의 임상 출현 전에 대상체에 본 발명의 백신을 투여하는 것을 수반한다. 질환의 억압은 질환의 임상 출현 후에 대상체에 본 발명의 백신을 투여하는 것을 수반한다.
핵산에 대해 본 명세서에 사용되는 "변이체"는 (i) 언급된 뉴클레오타이드 서열의 일부 또는 단편; (ii) 언급된 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 일부의 상보체; (iii) 언급된 핵산 또는 이의 상보체와 실질적으로 동일한 핵산; 또는 (iv) 언급된 핵산, 이의 상보체 또는 이와 실질적으로 동일한 서열에 대해 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 핵산을 의미할 수 있다.
펩타이드 또는 폴리펩타이드에 대한 "변이체"는 아미노산의 삽입, 결실 또는 보존적 치환에 의해 아미노산 서열과 상이하지만, 적어도 하나의 생물학적 활성을 보유한다. 변이체는 또한 적어도 하나의 생물학적 활성을 보유하는 아미노산 서열을 갖는 언급된 단백질에 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 의미한다. 아미노산의 보존적 치환, 즉, 유사한 특성 (예컨대, 친수성, 하전 영역의 정도 및 분포)의 상이한 아미노산으로 아미노산의 대체는 전형적으로 부수적 변화를 수반하는 것으로 당업계에서 인식된다. 이들 부수적 변화는 당업계에서 이해되는 바와 같이 소수성 지표를 고려함으로써 부분적으로 동정될 수 있다. Kyte 등, J. Mol. Biol. 157:105-132 (1982). 아미노산의 소수성 지표는 그의 소수성 및 전하의 고려에 기반한다. 유사한 소수성 지표의 아미노산은 치환될 수 있고, 또한 단백질 기능을 여전히 보유한다는 것은 당업계에 공지되어 있다. 일 측면에서, ±2의 소수성 지표를 갖는 아미노산은 치환된다. 아미노산의 친수성은 또한 생물학적 기능을 보유하는 단백질을 초래하는 치환을 나타내기 위해 사용될 수 있다. 펩타이드와 관련하여 아미노산의 친수성의 고려는 항원성 및 면역원성과 상당히 상관관계가 있는 것으로 보고된 유용한 측정인 해당 펩타이드의 가장 큰 국소 평균 친수성의 계산을 허용한다. 미국 특허 제4,554,101호는 본 명세서에 참고로 포함된다. 유사한 친수성 값을 갖는 아미노산의 치환은 당업계에 이해되는 바와 같이 생물학적 활성, 예컨대 면역원성을 보유하는 펩타이드를 초래할 수 있다. 서로 ±2 내인 친수성 값을 갖는 아미노산에 의한 치환이 수행될 수 있다. 아미노산의 소수성 지표와 친수성 값은 둘 다 해당 아미노산의 특정 측쇄에 의해 영향받는다. 관찰과 일치되게, 생물학적 기능에 적합한 아미노산 치환은 소수성, 친수성, 전하, 크기 및 다른 특성에 의해 나타나는 바와 같이 아미노산 및 특히 해당 아미노산의 측쇄의 상대적 유사성에 의존하는 것으로 이해된다.
변이체는 전체 유전자 서열 또는 이의 단편의 전장에 걸쳐 실질적으로 동일한 핵산 서열일 수 있다. 핵산 서열 은 유전자 서열의 전장 또는 이의 단편에 대해 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일할 수 있다. 변이체는 아미노산 서열 또는 이의 단편의 전장에 걸쳐 실질적으로 동일한 아미노산 서열일 수 있다. 아미노산 서열은 아미노산 서열의 전장 또는 이의 단편에 대해 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "벡터"는 복제기점을 함유하는 핵산 서열을 의미할 수 있다. 벡터는 플라스미드, 박테리오파지, 박테리아 인공 염색체 또는 효모 인공 염색체일 수 있다. 벡터는 DNA 또는 RNA 벡터일 수 있다. 벡터는 자기 복제 염색체외 벡터 또는 숙주 게놈 내로 통합되는 벡터 중 하나일 수 있다.
본 명세서의 수많은 범위의 열거에 대해, 동일한 정도의 정확도 사이에 있는 각각의 사이에 있는 숫자는 명확하 게 상정된다. 예컨대, 6 내지 9의 범위에 대해, 6과 9에 추가로 숫자 7 및 8이 상정되고, 범위 6.0 내지 7.0에 대해, 숫자 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9 및 7.0이 명확하게 상정된다. 이것은 범위의 폭에 관계없이 적용된다.
2. 조성물
본 발명은 또한 항체 생산에 사용하기 위한 신규 서열을 포함한다. 일 구체예에서, 본 발명의 항체는 포유동물 세포에서 생성되거나 박테리아, 효모 및 바이러스 벡터를 포함하는 DNA 또는 RNA 벡터에서의 전달을 위해 생성될 수 있다.
본 발명은 항체, 그의 단편, 이의 변이체, 또는 이의 조합을 암호화하는 재조합 핵산 서열을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 이를 필요로 하는 대상체에 투여되는 경우, 조성물은 대상체에서 합성 항체의 생성을 일으킬 수 있다. 합성 항체는 대상체에 존재하는 표적 분자 (즉, 항원, 예컨대, PD-1)에 결합할 수 있다. 이러한 결합은 항원을 중화시키거나, 다른 분자, 예컨대, 단백질 또는 핵산에 의한 항원의 인식을 차단하거나, 항원에 대한 면역 반응을 야기 또는 유도할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 조성물은 합성 항체를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일 구체예에서, 상기 조성물은 제1 합성 항체를 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 제2 합성 항체를 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 일 구체예에서, 상기 핵산 분자는 절단 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일 구체예에서, 상기 핵산 분자는 하나 이상의 항-PD-1 항체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일 구체예에서, 상기 항-PD-1 항체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6에서 제시된 바와 같이 하나 이상의 아미노산 서열, 또는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6에서 제시된 바와 같이 하나 이상의 아미노산 서열의 단편을 암호화하는 하나 이상의 코돈 최적화된 핵산 서열을 포함한다.
일 구체예에서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 7, 8, 9, 10, 11, 및 12의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 80% 동일성을 갖는다.
일 구체예에서, 항-PD-1 항체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6의 하나 이상에 적어도 90% 동종성인 아미노산 서열, 또는 서열번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6의 하나 이상에 적어도 90% 동종성인 아미노산 서열의 단편을 암호화하는 하나 이상의 DNA 서열로부터 전사된 하나 이상의 RNA 서열을 포함한다. 일 구체예에서, 항-PD-1 항체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6에서 제시된 바와 같이 아미노산 서열, 또는 서열번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6에서 제시된 바와 같이 아미노산 서열의 단편을 암호화하는 하나 이상의 DNA 서열로부터 전사된 하나 이상의 RNA 서열을 포함한다.
일 구체예에서, 항-PD-1 항체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6의 하나 이상을 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열에 적어도 90% 동종성인 하나 이상의 코돈 최적화된 핵산 서열, 또는 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6의 하나 이상을 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열에 적어도 90% 동종성인 핵산 서열의 단편을 포함한다.
본 발명의 조성물은 PD-1 활성과 연관된 임의의 질환, 장애, 또는 병태를 치료, 예방, 및/또는 이로부터 보호할 수 있다. 특정 구체예에서, 상기 조성물은 암을 치료, 예방, 및/또는 이로부터 보호할 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 조성물은 적어도 하나의 다른 제제, 예컨대 항원과 조합으로 제공된다. 일 구체예에서, 조합은 단일 제형일 수 있거나 별도 제형일 수 있고 순서대로 (어느 한쪽 항원 먼저 그리고 그 다음 항-PD-1 항체, 또는 항-PD-1 항체 먼저 그리고 그 다음 항원) 투여될 수 있다. 조성물은 대상체에서 항원에 항원 제시 및 전체적인 면역 반응을 증가시킬 수 있다. 항원 및 항-PD-1 항체의 조합은 항원 단독을 포함하는 조성물보다 더욱 효율적으로 면역 시스템을 유도한다. 이러한 더욱 효율적인 면역 반응은 질환, 예컨대 암의 치료 및/또는 예방에서 증가된 효능을 제공한다.
본 발명의 조성물은 관문 저해제를 포함할 수 있다. 상기 관문 저해제는 하나 이상의 항-PD-1 항체일 수 있다. 상기 항원은 hTERT, mTERT, PSA, PSMA, STEAP, PSCA, 및 PAP, WT1, 티로시나제, NYESO1, PRAME, 및 MAGE 중 하나 이상일 수 있다. 조성물의 관문 저해제(들) 및 항원(들)은 필요로 하는 대상체에게 함께 또는 별도로, 핵산 또는 폴리펩타이드 형태로 투여될 수 있다. 일부 사례에서, 관문 저해제(들)은 조성물의 항원(들)과 별도로 투여될 수 있다.
상기 조성물은 적어도 약 1 시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 5 시간, 6 시간, 7 시간, 8 시간, 9 시간, 10 시간, 11 시간, 12 시간, 13 시간, 14 시간, 15 시간, 16 시간, 17 시간, 18 시간, 19 시간, 20 시간, 21 시간, 22 시간, 23 시간, 24 시간, 36 시간, 48 시간, 60 시간, 72 시간, 84 시간, 또는 96 시간 이내 대상체에서 합성 항체의 생성을 초래할 수 있다. 상기 조성물은 대상체에게 항원(들)의 투여 전 또는 후 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 관문 저해제(들)은 대상체에게 항원(들)의 투여 전 또는 후 적어도 1 일, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 8 일, 9 일, 10 일, 11 일, 12 일, 13 일, 14 일, 15 일, 16 일, 17 일, 18 일, 19 일, 20 일, 21 일, 22 일, 23 일, 24 일, 25 일, 26 일, 27 일, 28 일, 29 일, 30 일, 60 일, 또는 90 일 투여될 수 있다.
더욱 다른 구체예에서, 상기 관문 저해제(들)은 대상체에게 항원(들)의 투여 전 또는 후 적어도 1 주, 2 주, 3 주, 4 주, 5 주, 6 주, 7 주, 8 주, 9 주, 10 주, 11 주, 12 주, 13 주, 14 주, 또는 15 주 투여될 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 관문 저해제(들)은 대상체에게 항원(들)의 투여 전 또는 후 약 12 시간 내지 약 15 주, 약 12 시간 내지 약 10 주, 약 12 시간 내지 약 5 주, 약 12 시간 내지 약 1 주, 약 12 시간 내지 약 60 시간, 약 12 시간 내지 약 48 시간, 약 24 시간 내지 약 15 주, 약 60 시간 내지 약 15 주, 약 96 시간 내지 약 15 주, 약 1 일 내지 약 15 주, 약 5 일 내지 약 15 주, 약 10 일 내지 약 15 주, 약 15 일 내지 약 15 주, 약 20 일 내지 약 15 주, 약 25 일 내지 약 15 주, 약 30 일 내지 약 15 주, 약 1 주 내지 약 15 주, 약 5 주 내지 약 15 주, 또 는 약 10 주 내지 약 15 주 투여될 수 있다.
상기 조성물은, 필요로 하는 대상체에게 투여된 경우, 체액 면역 반응을 유도하기 위해 항원이 투여되는 대상체에서 내인성 항체의 생성보다 더욱 빠르게 대상체에서 합성 항체의 생성을 초래할 수 있다. 상기 조성물은 체액 면역 반응을 유도하기 위해 항원이 투여된 대상체에서 내인성 항체의 생성 적어도 약 1 일, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 8 일, 9 일, 또는 10 일 합성 전 항체의 생성을 초래할 수 있다.
본 발명의 조성물은 효과적인 조성물의 필요한 특성 예컨대 조성물이 병 또는 사망을 야기시키지 않도록 안전함; 병에 대한 보호됨; 및 투여의 용이성, 극소수의 부작용, 생물학적 안정성, 및 용량당 저비용 제공함을 가질 수 있다. 조성물은 관문 저해제(들), 예컨대 본 명세서에 논의된 바와 같은 항-PD-1 항체와 항원(들)을 조합시킴으로써 이들 특성의 일부 또는 전부를 달성할 수 있다.
a. 관문 저해제
관문 저해제는 다양한 면역 관문에 대한 임의의 길항제일 수 있고, 면역 관문을 차단하는 항체일 수 있다. 항체는 단클론성 또는 다클론성 Fab를 포함하는 단백질일 수 있다. 항체는 또한 기능적 항체를 발현시킬 수 있고 암호화하는 DNA 발현 작제물일 수 있다. 하나 이상의 항원에 더하여, 백신은 PD-1 항체를 추가로 포함할 수 있다. 상기 항체는 적어도 면역글로불린의 가변 영역을 암호화하는 DNA 서열로 구성된 합성 항체일 수 있다. 그와 같은 항체는, 본 명세서에 기재된 항원을 결합시키는 또는 상기에 반응성인, 본 명세서에 기재된 항체를 확인 또는 스크리닝함으로써 생성될 수 있다. 항체 확인 또는 스크리닝의 방법은 항체를 확인 또는 스크리닝하기 위해 종래 기술에서 숙련가에 공지된 방법론에서 항원을 사용할 수 있다. 그와 같은 방법론은, 비제한적으로, 라이브러리 (예컨대, 파아지 디스플레이)로부터 항체의 선택 및 동물의 면역화 이어서 항체의 단리 및/또는 정제를 포함할 수 있다. 본 명세서에 전체적으로 편입된 예컨대 Rajan, S., 및 Sidhu, S., Methods in Enzymology. vol 502, Chapter One "Simplified Synthetic Antibody Libraries (2012)에서 이용가능한 방법 참고.
본 발명의 임의의 항체는 또한, 하나 이상의 PD-L1, CTLA-4, LAG-3, GITR, CD40, OX40, TIM-3, 4-1BB, 및 기타에 대해 항체를 포함하는, 하나 이상의 다른 관문 저해제 항체와 조합될 수 있다. 관문 저해제는 공지된 생성물 예컨대, 예컨대, 이필리무맙, 트레멜리무맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 피딜리주맙, BMS-936559 (참고 ClinicalTrials.gov Identifier NCT02028403), MPDL3280A (Roche, 참고 ClinicalTrials.gov Identifier NCT02008227), MDX1105-01 (Bristol Myers Squibb, 참고 ClinicalTrials.gov Identifier NCT00729664), MEDI4736 (Medlmmune, 참고 ClinicalTrials.gov Identifier NCT01693562), 및 MK-3475 (Merck, 참고 ClinicalTrials.gov Identifier NCT02129556)일 수 있다.
b. 재조합 핵산 서열
상기 기재된 바와 같이, 상기 조성물은 재조합 핵산 서열을 포함할 수 있다. 상기 재조합 핵산 서열은 항체, 이의 단편, 이의 변이체, 또는 이의 조합을 암호화할 수 있다. 상기 항체는 본 명세서에 다른 곳에서 더욱 상세히 기재된다.
상기 재조합 핵산 서열은 이종성 핵산 서열일 수 있다. 상기 재조합 핵산 서열은 하나 이상의 이종성 핵산 서열을 포함할 수 있다.
상기 재조합 핵산 서열은 최적화된 핵산 서열일 수 있다. 그와 같은 최적화는 항체의 면역원성을 증가 또는 변경시킬 수 있다. 최적화는 또한 전사 및/또는 번역을 개선할 수 있다. 최적화는 하나 이상의 하기를 포함할 수 있다: 전사를 증가시키기 위한 저 GC 함량 리더 서열; mRNA 안정성 및 코돈 최적화; 증가된 번역을 위한 코작 (kozak) 서열 (예컨대, GCC ACC)의 부가; 신호 펩타이드를 암호화하는 면역글로불린 (Ig) 리더 서열의 부가; 내부 IRES 서열의 부가 및 시스-작용 서열 모티프 (즉, 내부 TATA 박스) 가능한 정도로 제거.
c. 재조합 핵산 서열 작제물
상기 재조합 핵산 서열은 하나 이상의 재조합 핵산 서열 작제물을 포함할 수 있다. 상기 재조합 핵산 서열 작제물은, 본 명세서에 더욱 상세히 기재되는, 하나 이상의 성분을 포함할 수 있다.
상기 재조합 핵산 서열 작제물은 중쇄 폴리펩타이드, 이의 단편, 이의 변이체, 또는 이의 조합을 암호화하는 이종성 핵산 서열을 포함할 수 있다. 상기 재조합 핵산 서열 작제물은 경쇄 폴리펩타이드, 이의 단편, 이의 변이체, 또는 이의 조합을 암호화하는 이종성 핵산 서열을 포함할 수 있다. 상기 재조합 핵산 서열 작제물은 또한 프로테아제 또는 펩티다제 절단 부위를 암호화하는 이종성 핵산 서열을 포함할 수 있다. 상기 재조합 핵산 서열 작제물은 또한 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)를 암호화하는 이종성 핵산 서열을 포함할 수 있다. IRES는 바이러스성 IRES 또는 진핵 IRES 어느 한쪽일 수 있다. 상기 재조합 핵산 서열 작제물은 하나 이상의 리더 서열을 포함할 수 있고, 여기에서 각각의 리더 서열은 신호 펩타이드를 암호화한다. 재조합 핵산 서열 작제물은 하나 이상의 프로모터, 하나 이상의 인트론, 하나 이상의 전사 종결 영역, 하나 이상의 개시 코돈, 하나 이상의 종결 또는 중단 코돈, 및/또는 하나 이상의 폴리아데닐화 신호를 포함할 수 있다. 상기 재조합 핵산 서열 작제물은 또한 하나 이상의 링커 또는 태그 서열을 포함할 수 있다. 상기 태그 서열은 혈구응집소 (HA) 태그를 암호화할 수 있다.
(1) 중쇄 폴리펩타이드
상기 재조합 핵산 서열 작제물은 중쇄 폴리펩타이드, 이의 단편, 이의 변이체, 또는 이의 조합을 암호화하는 이종성 핵산을 포함할 수 있다. 상기 중쇄 폴리펩타이드는 가변 중쇄 (VH) 영역 및/또는 적어도 하나의 불변 중쇄 (CH) 영역을 포함할 수 있다. 적어도 하나의 불변 중쇄 영역은 불변 중쇄 영역 1 (CH1), 불변 중쇄 영역 2 (CH2), 및 불변 중쇄 영역 3 (CH3), 및/또는 힌지 영역을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 중쇄 폴리펩타이드는 VH 영역 및 CH1 영역을 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 중쇄 폴리펩타이드는 VH 영역, CH1 영역, 힌지 영역, CH2 영역, 및 CH3 영역을 포함할 수 있다.
상기 중쇄 폴리펩타이드는 상보성 결정 영역 ("CDR") 세트를 포함할 수 있다. CDR 세트는 VH 영역의 3개 초가변 영역을 함유할 수 있다. 상기 중쇄 폴리펩타이드의 N-말단으로부터 기인하여, 이들 CDR는 "CDR1", "CDR2", 및 "CDR3", 각 각으로 언급된다. 상기 중쇄 폴리펩타이드의 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 항원의 결합 또는 인식에 기여할 수 있다.
(2) 경쇄 폴리펩타이드
상기 재조합 핵산 서열 작제물은 경쇄 폴리펩타이드, 이의 단편, 이의 변이체, 또는 이의 조합을 암호화하는 이종성 핵산 서열을 포함할 수 있다. 상기 경쇄 폴리펩타이드는 가변 경쇄 (VL) 영역 및/또는 불변 경쇄 (CL) 영역을 포함할 수 있다.
상기 경쇄 폴리펩타이드는 상보성 결정 영역 ("CDR") 세트를 포함할 수 있다. CDR 세트는 VL 영역의 3개 초가변 영역을 함유할 수 있다. 상기 경쇄 폴리펩타이드의 N-말단으로부터 기인하여, 이들 CDR는 "CDR1", "CDR2", 및 "CDR3", 각 각으로 언급된다. 상기 경쇄 폴리펩타이드의 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 항원의 결합 또는 인식에 기여할 수 있다.
(3) 프로테아제 절단 부위
상기 재조합 핵산 서열 작제물에는 프로테아제 절단 부위를 암호화하는 이종성 핵산 서열이 포함될 수 있다. 상기 프로테아제 절단 부위는 프로테아제 또는 펩티다제에 의해 인식될 수 있다. 상기 프로테아제는 엔도펩티다제 또는 엔도프로테아제, 예컨대, 비제한적으로, 퓨린, 엘라스타제, HtrA, 칼파인, 트립신, 키모트립신, 트립신, 및 펩신일 수 있다. 상기 프로테아제는 퓨린일 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 프로테아제는 세린 프로테아제, 트레오닌 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 아스파르테이트 프로테아제, 메탈로프로테아제, 글루탐산 프로테아제, 또는 내부 펩타이드 결합을 절단하는 (즉, N-말단 또는 C-말단 펩타이드 결합을 절단하지 않는) 임의의 프로테아제일 수 있다.
상기 프로테아제 절단 부위에는 절단 효율을 촉진시키거나 증가시키는 하나 이상의 아미노산 서열이 포함될 수 있다. 상기 하나 이상의 아미노산 서열은 별도의 폴리펩타이드를 형성 또는 생성하는 효율을 촉진하거나 증가시킬 수 있다. 하나 이상의 아미노산 서열에는 2A 펩타이드 서열이 포함될 수 있다.
(4) 링커 서열
상기 재조합 핵산 서열 작제물에는 하나 이상의 링커 서열이 포함될 수 있다. 상기 링커 서열은 본 명세서에 기재된 하나 이상의 성분을 공간적으로 분리하거나 연결할 수 있다. 다른 구체예에서, 링커 서열은 두 개 이상의 폴리펩타이드를 공간적으로 분리하거나 연결하는 아미노산 서열을 암호화할 수 있다.
(5) 프로모터
상기 재조합 핵산 서열 작제물에는 하나 이상의 프로모터가 포함될 수 있다. 상기 하나 이상의 프로모터는 유전자 발현을 유도하고 유전자 발현을 조절할 수 있는 임의의 프로모터일 수 있다. 이러한 프로모터는 DNA 의존적 RNA 폴리머라제를 통해 전사에 필요한 시스-작용 서열 요소이다. 유전자 발현을 지시하기 위해 이용된 프로모터의 선택은 구체적 용도에 의존한다. 상기 프로모터는 이것이 그 천연 설정에서 전사 개시 부위로부터 유래됨으로, 재조합 핵산 서열 작제물에서 전사 개시로부터 대략 동일한 거리에 배치될 수 있다. 그러나 상기 거리의 변동이 프로모터의 기능의 손실 없이 수용될 수 있다.
상기 프로모터는 중쇄 폴리펩타이드 및/또는 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 이종성 핵산 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 상기 프로모터는 진핵 세포에서 발현에 효과적으로 나타난 프로모터일 수 있다. 암호 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터는 CMV 프로모터, 원숭이 바이러스 40 (SV40)에서 유래된 프로모터, 예컨대, SV40 조기 프로모터 및 SV40 후기 프로모터, 마우스 유방암 바이러스 (MMTV) 프로모터, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 프로모터, 예컨대, 소 면역결핍 바이러스 (BIV) 긴 말단 반복서열 (LTR) 프로모터, 몰로니 바이러스 프로모터, 조류 백혈증 바이러스 (ALV) 프로모터, 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터, 예컨대, CMV 최조기 프로모터, 엡스타인 바 바이러스 (EBV) 프로모터, 또는 라우스 육종 바이러스 (RSV) 프로모터일 수 있다. 프로모터는 또한 인간 유전자, 예컨대, 인간 액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아틴, 인간 폴리헤드린, 또는 인간 메탈로티오나인에서 유래된 프로모터일 수 있다.
상기 프로모터는 구성적 프로모터 또는 숙주 세포가 일부 특정 외부 자극에 노출되는 경우에만 전사를 개시하는 유도 가능한 프로모터일 수 있다. 다세포 개체의 경우, 프로모터는 또한 특정 조직 또는 기관 또는 발달 단계에 특이적일 수 있다. 상기 프로모터는 또한 천연 또는 합성의 조직 특이적 프로모터, 예컨대, 근육 또는 피부 특이적 프로모터일 수 있다. 이러한 프로모터의 예는 미국 특허출원 공개 번호 US20040175727호에 기재되며, 그 내용은 전문이 본 명세서에 포함된다.
상기 프로모터는 인핸서와 연관될 수 있다. 상기 인핸서는 암호 서열의 업스트림에 배치될 수 있다. 상기 인핸서는 인간 액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아틴 또는 바이러스 인핸서, 예컨대, CMV, FMDV, RSV 또는 EBV 유래의 인핸서일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 기능 증강은 미국 특허 번호 제5,593,972호, 제5,962,428호, 및 WO94/016737호에 기재되며, 각각의 내용은 전체가 참고로 포함된다.
(6) 인트론
상기 재조합 핵산 서열 작제물에는 하나 이상의 인트론이 포함될 수 있다. 각각의 인트론에는 기능적 스플라이스 공여체 및 수신체 부위가 포함될 수 있다. 상기 인트론에는 스플라이싱 인핸서가 포함될 수 있다. 상기 인트론에는 효율적인 스플라이싱을 위해 필요한 하나 이상의 신호가 포함될 수 있다.
(7) 전사 종결 영역
상기 재조합 핵산 서열 작제물에는 하나 이상의 전사 종결 영역이 포함될 수 있다. 상기 전사 종결 영역은 효율적인 종결을 제공하기 위해 암호 서열의 다운스트림일 수 있다. 상기 전사 종결 영역은 전술한 프로모터와 동일한 유전자에서 수득될 수도 있고, 또는 하나 이상의 상이한 유전자에서 수득될 수도 있다.
(8) 개시 코돈
상기 재조합 핵산 서열 작제물에는 하나 이상의 개시 코돈이 포함될 수 있다. 상기 개시 코돈은 암호 서열의 업스트림에 배치될 수 있다. 상기 개시 코돈은 암호 서열과 같은 틀에 있을 수 있다. 상기 개시 코돈은 효율적인 번역 개시를 위해 필요한 하나 이상의 신호, 예컨대, 비제한적으로, 리보솜 결합 부위에 연합될 수 있다.
(9) 종결 코돈
상기 재조합 핵산 서열 작제물에는 하나 이상의 종결 또는 정지 코돈이 포함될 수 있다. 상기 종결 코돈은 암호 서열의 다운스트림일 수 있다. 상기 종결 코돈은 암호 서열과 같은 틀에 있을 수 있다. 상기 종결 코돈은 효율적인 번역 종결을 위해 필요한 하나 이상의 신호에 연합될 수 있다.
(10) 폴리아데닐화 신호
상기 재조합 핵산 서열 작제물에는 하나 이상의 폴리아데닐화 신호가 포함될 수 있다. 상기 폴리아데닐화 신호에는 전사체의 효율적인 폴리아데닐화를 위해 필요한 하나 이상의 신호가 포함될 수 있다. 상기 폴리아데닐화 신호는 암호 서열의 다운스트림에 배치될 수 있다. 상기 폴리아데닐화 신호는 SV40 폴리아데닐화 신호, LTR 폴리아데닐화 신호, 소 성장 호르몬 (bGH) 폴리아데닐화 신호, 인간 성장 호르몬 (hGH) 폴리아데닐화 신호, 또는 인간 β-글로빈 폴리아데닐화 신호일 수 있다. 상기 SV40 폴리아데닐화 신호는 pCEP4 플라스미드 (Invitrogen, San Diego, CA)로부터의 폴리아데닐화 신호일 수 있다.
(11) 리더 서열
상기 재조합 핵산 서열 작제물에는 하나 이상의 리더 서열이 포함될 수 있다. 상기 리더 서열은 신호 펩타이드를 암호화할 수 있다. 상기 신호 펩타이드는 면역글로불린 (Ig) 신호 펩타이드, 예컨대, 비제한적으로, IgG 신호 펩타이드 및 IgE 신호 펩타이드일 수 있다.
d. 재조합 핵산 서열 작제물의 배열
전술한 바와 같이, 상기 재조합 핵산 서열에는 하나 이상의 재조합 핵산 서열 작제물이 포함될 수 있으며, 여기서 각각의 재조합 핵산 서열 작제물에는 하나 이상의 성분이 포함될 수 있다. 상기 하나 이상의 성분이 상기에 상세히 기재된다. 재조합 핵산 서열 작제물에 포함되는 경우, 상기 하나 이상의 성분은 서로에 대해 임의의 순서로 배열될 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 하나 이상의 성분은 아래 기재된 바와 같이 재조합 핵산 서열 작제물에 배열될 수 있다.
(1) 배열 1
하나의 배열에서, 제1 재조합 핵산 서열 작제물에는 중쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 이종성 핵산 서열이 포함될 수 있고, 제2 재조합 핵산 서열 작제물에는 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 이종성 핵산 서열이 포함될 수 있다.
상기 제1 재조합 핵산 서열 작제물은 벡터에 배치될 수 있다. 상기 제2 재조합 핵산 서열 작제물은 제2 또는 별도의 벡터에 배치될 수 있다. 상기 재조합 핵산 서열 작제물의 벡터 내로의 배치는 하기에서 보다 상세히 기재된다.
상기 제1 재조합 핵산 서열 작제물에는 또한 프로모터, 인트론, 전사 종결 영역, 개시 코돈, 종결 코돈, 및/또는 폴리아데닐화 신호가 포함될 수 있다. 상기 제1 재조합 핵산 서열 작제물에는 추가로 리더 서열이 포함될 수 있고, 여기서 리더 서열은 중쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 이종성 핵산 서열의 업스트림 (또는 5')에 배치된다. 따라서 리더 서열에 의해 암호화된 신호 펩타이드는 중쇄 폴리펩타이드에 펩타이드 결합에 의해 연결될 수 있다.
상기 제2 재조합 핵산 서열 작제물에는 또한 프로모터, 개시 코돈, 종결 코돈, 및 폴리아데닐화 신호가 포함될 수 있다. 상기 제2 재조합 핵산 서열 작제물에는 추가로 리더 서열이 포함될 수 있고, 여기서 리더 서열은 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 이종성 핵산 서열의 업스트림 (또는 5')에 배치된다. 따라서 리더 서열에 의해 암호화된 신호 펩타이드는 경쇄 폴리펩타이드에 펩타이드 결합에 의해 연결될 수 있다.
따라서 배열 1의 하나의 예에는 VH 및 CH1이 포함되는 중쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 벡터 (및 이에 따른 제1 재조합 핵산 서열 작제물), 및 VL 및 CL이 포함되는 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 벡터 (및 이에 따른 제2 재조합 핵산 서열 작제물)가 포함될 수 있다. 배열 1의 제2 예에는 VH, CH1, 힌지 영역, CH2, 및 CH3이 포함되는 중쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 벡터 (및 이에 따른 제1 재조합 핵산 서열 작제물), 및 VL 및 CL이 포함되는 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 벡터 (및 이에 따른 제2 재조합 핵산 서열 작제물)가 포함될 수 있다.
(2) 배열 2
제2 배열에서, 상기 재조합 핵산 서열 작제물에는 중쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 이종성 핵산 서열 및 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 이종성 핵산 서열이 포함될 수 있다. 중쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 이종성 핵산 서열은 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 이종성 핵산 서열의 업스트림 (또는 5')에 배치될 수 있다. 대안적으로, 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 이종성 핵산 서열은 중쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 이종성 핵산 서열의 업스트림 (또는 5')에 배치될 수 있다.
상기 재조합 핵산 서열 작제물은 하기에서 보다 상세히 기재된 바와 같이 벡터에 배치될 수 있다.
상기 재조합 핵산 서열 작제물에는 프로테아제 절단 부위 및/또는 링커 서열을 암호화하는 이종성 핵산 서열이 포함될 수 있다. 재조합 핵산 서열 작제물에 포함되는 경우, 프로테아제 절단 부위를 암호화하는 이종성 핵산 서열은 중쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 이종성 핵산 서열 및 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 이종성 핵산 서열 간에 배치될 수 있다. 따라서 상기 프로테아제 절단 부위는 발현 시 중쇄 폴리펩타이드 및 경쇄 폴리펩타이드의 다른 폴리펩타이드로의 분리를 허용한다. 다른 구체예에서, 링커 서열이 재조합 핵산 서열 작제물에 포함되는 경우, 링커 서열은 중쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 이종성 핵산 서열 및 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 이종성 핵산 서열 간에 배치될 수 있다.
상기 재조합 핵산 서열 작제물에는 또한 프로모터, 인트론, 전사 종결 영역, 개시 코돈, 종결 코돈, 및/또는 폴리아데닐화 신호가 포함될 수 있다. 상기 재조합 핵산 서열 작제물에는 하나 이상의 프로모터가 포함될 수 있다. 상기 재조합 핵산 서열 작제물에는 하나의 프로모터가 중쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 이종성 핵산 서열에 연관될 수 있고 제2 프로모터가 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 이종성 핵산 서열에 연관될 수 있도록 두 프로모터가 포함될 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 재조합 핵산 서열 작제물에는 중쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 이종성 핵산 서열 및 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 이종성 핵산 서열에 연관된 하나의 프로모터가 포함될 수 있다.
상기 재조합 핵산 서열 작제물에는 2개의 리더 서열이 추가로 포함될 수 있고, 여기서 제1 리더 서열은 중쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 이종성 핵산 서열의 업스트림 (또는 5')에 배치되고 제2 리더 서열은 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 이종성 핵산 서열의 업스트림 (또는 5')에 배치된다. 따라서 제1 리더 서열에 의해 암호화된 제1 신호 펩타이드가 중쇄 폴리펩타이드에 펩타이드 결합에 의해 연결될 수 있고, 제2 리더 서열에 의해 암호화된 제2 신호 펩타이드가 경쇄 폴리펩타이드에 펩타이드 결합에 의해 연결될 수 있다.
따라서 배열 2의 하나의 예에는 VH 및 CH1이 포함되는 중쇄 폴리펩타이드 및 VL 및 CL이 포함되는 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 벡터 (및 이에 따른 재조합 핵산 서열 작제물)가 포함될 수 있고, 여기서 링커 서열은 중쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 이종성 핵산 서열 및 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 이종성 핵산 서열 간에 배치된다.
배열 2의 제2 예에는 VH 및 CH1이 포함되는 중쇄 폴리펩타이드 및 VL 및 CL이 포함되는 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 벡터 (및 이에 따른 재조합 핵산 서열 작제물)가 포함될 수 있고, 여기서 프로테아제 절단 부위를 암호화하는 이종성 핵산 서열은 중쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 이종성 핵산 서열 및 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 이종성 핵산 서열 간에 배치된다.
배열 2의 제3 예에는 VH, CH1, 힌지 영역, CH2, 및 CH3이 포함되는 중쇄 폴리펩타이드 및 VL 및 CL이 포함되는 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 벡터 (및 이에 따른 재조합 핵산 서열 작제물)가 포함될 수 있고, 여기서 링커 서열은 중쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 이종성 핵산 서열 및 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 이종성 핵산 서열 간에 배치된다.
배열 2의 제4 예에는 VH, CH1, 힌지 영역, CH2, 및 CH3이 포함되는 중쇄 폴리펩타이드 및 VL 및 CL이 포함되는 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 벡터 (및 이에 따른 재조합 핵산 서열 작제물)가 포함될 수 있고, 여기서 프로테아제 절단 부위를 암호화하는 이종성 핵산 서열은 중쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 이종성 핵산 서열 및 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 이종성 핵산 서열 간에 배치된다.
e. 재조합 핵산 서열 작제물로부터의 발현
전술한 바와 같이, 상기 재조합 핵산 서열 작제물에는 하나 이상의 성분 가운데, 중쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 이종성 핵산 서열 및/또는 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 이종성 핵산 서열이 포함될 수 있다. 따라서, 상기 재조합 핵산 서열 작제물은 중쇄 폴리펩타이드 및/또는 경쇄 폴리펩타이드의 발현을 촉진할 수 있다.
전술한 바와 같은 배열 1이 이용되는 경우, 제1 재조합 핵산 서열 작제물은 중쇄 폴리펩타이드의 발현을 촉진할 수 있고, 제2 재조합 핵산 서열 작제물은 경쇄 폴리펩타이드의 발현을 촉진할 수 있다. 전술한 바와 같은 배열 2가 이용되는 경우, 재조합 핵산 서열 작제물은 중쇄 폴리펩타이드 및 경쇄 폴리펩타이드의 발현을 촉진할 수 있다.
예컨대, 비제한적으로, 세포, 개체 또는 포유류에서의 발현 시, 중쇄 폴리펩타이드 및 경쇄 폴리펩타이드는 합성 항체로 조립될 수 있다. 특히, 중쇄 폴리펩타이드 및 경쇄 폴리펩타이드는 조립으로 항원에 결합할 수 있는 합성 항체가 생성되도록 서로 상호작용할 수 있다. 다른 구체예에서, 중쇄 폴리펩타이드 및 경쇄 폴리펩타이드는 조립으로 본 명세서에 기재된 바와 같이 조립되지 않은 항체에 비해 더 면역원성이 높은 합성 항체를 생성하도록 서로 상호작용할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 중쇄 폴리펩타이드 및 경쇄 폴리펩타이드는 조립으로 항원에 대해 면역 반응을 야기하거나 유도할 수 있는 합성 항체를 생성하도록 서로 상호작용할 수 있다.
f. 벡터
전술한 상기 재조합 핵산 서열 작제물은 하나 이상의 벡터에 배치될 수 있다. 하나 이상의 벡터는 복제 기원을 함유할 수 있다. 하나 이상의 벡터는 플라스미드, 박테리오파지, 박테리아 인공 염색체 또는 효모 인공 염색체일 수 있다. 하나 이상의 벡터는 자가 복제 염색체외 벡터, 또는 숙주 게놈 내로 통합되는 벡터일 수 있다.
벡터는 플라스미드, 발현 벡터, 재조합 바이러스, 임의의 형태의 재조합 "네이키드 DNA" 벡터, 등을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. "벡터"는 세포를 감염, 형질주입, 일시적으로 또는 영구적으로 형질도입할 수 있는 핵산을 포함한다. 벡터가 네이키드 핵산, 또는 단백질 또는 지질과 복합화된 핵산일 수 있다는 것이 인지될 것이다. 벡터는 선택적으로, 바이러스 또는 박테리아 핵산 및/또는 단백질, 및/또는 막 (예컨대, 세포막, 바이러스 지질 엔벨로프 등)을 포함한다. 벡터는 레플리콘 (예컨대, RNA 레플리콘, 박테리오파지)를 포함하지만, 이로 제한되지 않으며, 여기에 DNA의 단편이 부착되고 복제될 수 있다. 이에 따라, 벡터는 RNA, 자율 자가-복제 원형 또는 선형 DNA 또는 RNA (예컨대, 플라스미드, 바이러스, 등, 미국 특허 제5,217,879호 참조)를 포함하지만, 이로 제한되지 않고, 발현 및 비-발현 플라스미드 둘 모두를 포함한다. 일부 구체예에서, 벡터는 선형 DNA, 효소 DNA 또는 합성 DNA를 포함한다. 재조합 미생물 또는 세포 배양물이 "발현 벡터"를 숙주화하는 것으로 기술되는 경우에, 이는 염색체외 원형 및 선형 DNA 및 숙주 염색체(들) 내에 도입된 DNA 둘 모두를 포함한다. 벡터가 숙주 세포에 의해 유지되는 경우에, 벡터는 자율 구조로서 유사분열 동안 세포에 의해 안정적으로 복제될 수 있거나 숙주 게놈 내에 도입된다.
하나 이상의 벡터는 이종성 발현 작제물일 수 있고, 이는 일반적으로 표적 세포 내로 특정 유전자를 도입하기 위해 이용되는 플라스미드이다. 일단 발현 벡터가 세포 내로 들어가면, 재조합 핵산 서열 작제물에 의해 암호화되는 중쇄 폴리펩타이드 및/또는 경쇄 폴리펩타이드가 세포-전사 및 번역 기전 리보솜 복합체에 의해 생성된다. 하나 이상의 벡터는 다량의 안정한 메신저 RNA, 그리고 이에 따라 단백질을 발현할 수 있다.
(1) 발현 벡터
상기 하나 이상의 벡터는 원형 플라스미드 또는 선행 핵산일 수 있다. 상기 원형 플라스미드 및 선형 핵산은 적절한 대상체 세포에서 특정 뉴클레오타이드 서열의 발현을 지시할 수 있다. 재조합 핵산 서열 작제물을 포함하는 하나 이상의 벡터는 키메라일 수 있으며, 이는 그 성분의 적어도 하나가 그 다른 성분의 적어도 하나에 대해 이종성이다.
(2) 플라스미드
상기 하나 이상의 벡터는 플라스미드일 수 있다. 플라스미드는 재조합 핵산 서열 작제물로 세포를 형질주입하기 위해 유용할 수 있다. 플라스미드는 대상체 내로 재조합 핵산 서열 작제물을 도입하기 위해 유용할 수 있다. 플라스미드는 또한 조절 서열을 포함할 수 있고, 이는 플라스미드가 투여되는 세포에서 유전자 발현에 매우 적합할 수 있다.
상기 플라스미드는 또한 염색체외로 플라스미드를 유지하고 세포에서 복수의 플라스미드 사본을 생산하기 위해 포유류 복제 기원을 포함할 수 있다. 상기 플라스미드는 Invitrogen (San Diego, CA)의 pVAX, pCEP4 또는 pREP4일 수 있고, 이는 엡스타인 바 바이러스 복제 기원 및 핵 항원 EBNA-1 암호 영역을 포함할 수 있고, 이는 통합 없이 고사본 에피솜 복제를 생산할 수 있다. 플라스미드 골격은 pAV0242일 수 있다. 플라스미드는 복제 결함 아데노바이러스 유형 5 (Ad5) 플라스미드일 수 있다.
상기 플라스미드는 pSE420 (Invitrogen, San Diego, Calif.)일 수 있고, 이는 대장균 (E.coli)에서 단백질 생산을 위해 이용될 수 있다. 플라스미드는 또한 pYES2 (Invitrogen, San Diego, Calif.)일 수 있으며, 이는 효모의 사카로마이세스 세레비시애 균주에서 단백질 생산을 위해 이용될 수 있다. 상기 플라스미드는 또한 MAXBAC™ 완전 배큘로바이러스 발현 시스템 (Invitrogen, San Diego, Calif.)일 수 있고, 이는 곤충 세포에서 단백질 생산을 위해 이용될 수 있다. 상기 플라스미드는 또한 pcDNAI 또는 pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, Calif.)일 수 있고, 이는 포유류 세포, 예컨대, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포에서 단백질 생산을 위해 이용될 수 있다.
(3) RNA
일 구체예에서, 상기 핵산은 RNA 분자이다. 일 구체예에서, 상기 RNA 분자는 본 명세서에 기술된 DNA 서열로부터 전사된다. 예컨대, 일부 구체예에서, RNA 분자는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 이의 변이체 또는 이의 단편 중 하나에 의해서 암호화된다. 따라서, 일 구체예에서, 본 발명은 MAb 또는 DMAb 중 하나 이상을 암호화하는 RNA 분자를 제공한다. 상기 RNA는 플러스 가닥일 수 있다. 따라서, 일부 구체예에서, 상기 RNA 분자는 역전사와 같은 임의의 개재 복제 단계를 필요로 하지 않고 세포에 의해 번역될 수 있다. 본 발명에 유용한 RNA 분자는 5' 캡 (예컨대, 7-메틸구아노신)을 가질 수 있다. 이 캡은 RNA의 생체 내 번역을 향상시킬 수 있다. 본 발명에 유용한 RNA 분자의 5' 뉴클레오타이드는 5' 삼인산기를 가질 수 있다. 캡핑된 RNA에서 이것은 5'-대-5' 브릿지를 통해 7-메틸구아노신에 연결될 수 있다. 상기 RNA 분자는 3' 폴리-A 테일을 가질 수 있다. 이는 또한 3' 단부 부근에 폴리-A 폴리머라제 인식 서열 (예: AAUAAA)을 포함할 수 있다. 본 발명에 유용한 RNA 분자는 단일 가닥일 수 있다. 본 발명에 유용한 RNA 분자는 합성 RNA를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 RNA 분자는 네이키드 RNA 분자이다. 일 구체예에서, 상기 RNA 분자는 벡터 내에 포함된다.
일 구체예에서, 상기 RNA는 5' 및 3' UTR을 갖는다. 일 구체예에서, 상기 5' UTR은 길이가 0 내지 3000개 뉴클레오타이드다. 암호 영역에 추가될 5' 및 3' UTR 서열의 길이는 UTR의 상이한 영역에 어닐링하는 PCR용 프라이머를 설계하는 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는 상이한 방법에 의해 변경될 수 있다. 이 접근법을 사용하여, 당업자는 전사된 RNA의 형질감염 후 최적의 번역 효율을 달성하는 데 필요한 5' 및 3' UTR 길이를 수정할 수 있다.
상기 5' 및 3' UTR은 관심 유전자에 대한 자연 발생, 내인성 5' 및 3' UTR일 수 있다. 대안적으로, 관심 유전자에 내인성이 아닌 UTR 서열은 UTR 서열을 정방향 및 역방향 프라이머에 통합함으로써 또는 주형의 임의의 다른 변형에 의해 추가될 수 있다. 관심 유전자에 내인성이 아닌 UTR 서열의 사용은 RNA의 안정성 및/또는 번역 효율을 수정하는 데 유용할 수 있다. 예컨대, 3' UTR 서열의 AU가 풍부한 요소는 RNA의 안정성을 감소시킬 수 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 3' UTR은 당업계에 잘 알려진 UTR의 특성에 기초하여 전사된 RNA의 안정성을 증가시키도록 선택되거나 설계될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 5' UTR은 내인성 유전자의 코작 서열을 함유할 수 있다. 대안적으로, 관심 유전자에 내인성이 아닌 5' UTR이 상기 기재된 바와 같이 PCR에 의해 추가되는 경우, 5' UTR 서열을 추가함으로써 공통 코작 서열을 재설계할 수 있다. 코작 서열은 일부 RNA 전사체의 번역 효율을 증가시킬 수 있지만 모든 RNA가 효율적인 번역을 가능하게 하는 데 필요한 것으로 보이지는 않다. 많은 RNA에 대한 코작 서열에 대한 요건은 당업계에 공지되어 있다. 다른 구체예에서, 상기 5' UTR은 RNA 게놈이 세포에서 안정한 RNA 바이러스로부터 유래될 수 있다. 다른 구체예에서, RNA의 엑소뉴클레아제 분해를 방해하기 위해 다양한 뉴클레오타이드 유사체가 3' 또는 5' UTR에 사용될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 RNA는 리보솜 결합, 번역 개시 및 세포 내 RNA의 안정성을 결정하는 5' 말단에 캡 및 3' 폴리(A) 테일을 모두 갖는다.
일 구체예에서, 상기 RNA는 뉴클레오사이드-변형된 RNA이다. 뉴클레오사이드-변형된 RNA는 예컨대, 증가된 안정성, 낮거나 없는 선천성 면역원성, 및 강화된 번역을 포함하는 비변형된 RNA에 비해 특정한 장점을 갖는다.
(4) 원형 및 선형 벡터
하나 이상의 벡터는 하나 이상의 원형 플라스미드일 수 있고, 이는 세포 게놈 내로의 통합에 의해 표적 세포를 형질전환시키거나 염색체외 (예컨대, 복제 기원이 있는 자가 복제 플라스미드)로 존재할 수 있다. 상기 벡터는 pVAX, pcDNA3.0, 또는 provax, 또는 재조합 핵산 서열 작제물에 의해 암호화된 중쇄 폴리펩타이드 및/또는 경쇄 폴리펩타이드를 발현할 수 있는 임의의 다른 발현 벡터일 수 있다.
또한 선형 핵산, 또는 선형 발현 카세트 ("LEC")가 본 명세서에 제공되며, 이는 전기천공을 통해 대상체에 효율적으로 전달되고 핵산 서열 작제물에 의해 암호화된 중쇄 폴리펩타이드 및/또는 경쇄 폴리펩타이드를 발현할 수 있다. 상기 LEC는 임의의 인산염 골격이 없는 임의의 선형 DNA일 수 있다. 상기 LEC는 항생제 내성 유전자 및/또는 인산염 골격을 포함하지 않을 수 있다. 상기 LEC는 원하는 유전자 발현과 관련이 없는 다른 핵산 서열을 포함하지 않을 수 있다.
상기 LEC는 선형화될 수 있는 임의의 플라스미드로부터 유래될 수 있다. 상기 플라스미드는 재조합 핵산 서열 작제물에 의해 암호화된 중쇄 폴리펩타이드 및/또는 경쇄 폴리펩타이드를 발현할 수 있다. 상기 플라스미드는 pNP (Puerto Rico/34) 또는 pM2 (New Caledonia/99)일 수 있다. 상기 플라스미드는 WLV009, pVAX, pcDNA3.0, 또는 provax, 또는 재조합 핵산 서열 작제물에 의해 암호화된 중쇄 폴리펩타이드 및/또는 경쇄 폴리펩타이드를 발현할 수 있는 임의의 다른 발현 벡터일 수 있다.
상기 LEC는 pcrM2일 수 있다. 상기 LEC는 pcrNP일 수 있다. pcrNP 및 pcrMR은 각각 pNP (Puerto Rico/34) 및 pM2 (New Caledonia/99)에서 유래될 수 있다.
(5) 바이러스 벡터
일 구체예에서, 세포에 본 발명의 핵산을 전달할 수 있는 바이러스 벡터가 본 명세서에서 제공된다. 발현 벡터는 바이러스 벡터의 형태로 세포에 제공될 수 있다. 바이러스 벡터 기술은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 예컨대, Sambrook 등 (2001), 및 Ausubel 등 (1997)에, 그리고 다른 바이러스학 및 분자 생물학 매뉴얼에 기술되어 있다. 벡터로서 유용한 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스 바이러스 및 렌티바이러스를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 일반적으로, 적합한 벡터는 적어도 하나의 유기체에서 복제 기능의 기원, 프로모터 서열, 편리한 제한 엔도뉴클레아제 부위, 및 하나 이상의 선택 가능한 마커를 포함한다 (예컨대, WO 01/96584호; WO 01/29058호; 및 미국 특허 제6,326,193호). 바이러스 벡터, 및 특히 레트로바이러스 벡터는 포유동물, 예컨대 인간 세포에 유전자를 삽입하기 위한 가장 널리 사용된 방법이 된다. 다른 바이러스 벡터는 렌티바이러스, 폭스바이러스, 단순 헤르페스 바이러스 I, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스, 등으로부터 유도될 수 있다 (예컨대, 미국 특허 제5,350,674호 및 제5,585,362호 참조).
(6) 벡터의 제조방법
재조합 핵산 서열 작제물이 배치된 하나 이상의 벡터의 제조 방법이 본 명세서에서 제공된다. 최종 서브클로닝 단계 후, 벡터는 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 대규모 발효 탱크에서 세포 배양에 접종하기 위해 이용될 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 최종 서브클로닝 단계 후, 벡터는 하나 이상의 전기천공 (EP) 장치와 함께 이용될 수 있다. 상기 EP 장치는 하기에서 보다 상세히 기재된다.
하나 이상의 벡터는 공지된 장치 및 기법의 조합을 이용하여 제형화되거나 제조될 수 있지만, 바람직하게는 2007년 5월 23일자로 출원된, 라이센스 받고 공동 계류중인 미국 가출원 제60/939,792호에 기재된 플라스미드 제조 기법을 이용하여 제조된다. 일부 예에서, 본 명세서에 기재된 DNA 플라스미드는 10 mg/mL 이상의 농도로 제형화될 수 있다. 제조 기법에는 또한 미국 출원 제60/939792호에 기재된 것에 더하여, 2007년 7월 3일자로 허여된 라이센스 받은 특허, 미국 특허 제7,238,522호에 기재된 것들을 포함하는 당업자에게 일반적으로 공지된 다양한 장치 및 프로토콜이 포함되거나 도입된다. 상기 인용된 출원 및 특허인, 미국 출원 제60/939,792호 및 미국 특허 제7,238,522호는 각각 이들의 전문이 본 명세서에 포함된다.
3. 항체
전술한 바와 같이, 상기 재조합 핵산 서열은 항체, 이의 단편, 이들의 변이체, 또는 이들의 조합을 암호화할 수 있다. 상기 항체는 항원에 결합하거나 이와 반응할 수 있고, 이는 하기에서 보다 상세히 기재된다.
상기 항체는 CDR에 대한 지지를 제공하고 서로에 대해 CDR의 공간적 관계를 정의하는 중쇄 및 경쇄틀 ("FR") 세트 사이에 각각 배치된 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역 ("CDR") 세트를 포함할 수 있다. 상기 CDR 세트는 중쇄 또는 경쇄 V 영역의 세 고가변 영역을 함유할 수 있다. 중쇄 또는 경쇄의 N-말단에서 시작하여, 이들 영역은 각각 "CDR1", "CDR2" 및 "CDR3"으로 표시된다. 따라서 항원-결합 부위에는 중쇄 또는 경쇄 V 영역 각각으로부터의 CDR 세트를 포함하는 6개의 CDR이 포함될 수 있다.
상기 항체는 본 발명의 조성물이 투여된 대상체에서 질환을 치료, 예방 및/또는 방어할 수 있다. 상기 항원에 결합함으로써 항체는 조성물이 투여된 대상체에서 질환을 치료, 예방 및/또는 방어할 수 있다. 상기 항체는 조성물이 투여된 대상체에서 질환에 대한 생존을 촉진시킬 수 있다. 일 구체예에서, 상기 항체는 항체가 투여되지 않은 질환을 갖는 대상체의 예측된 생존보다 대상체에서 증가된 질환에 대한 생존을 제공할 수 있다. 다양한 구체예에서, 상기 항체는 조성물의 부재 하에서의 예상된 생존보다 조성물이 투여된 대상체에서 질환에 대한 생존에서 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 증가를 제공할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 항체는 항체가 투여되지 않은 대상체의 예상된 방어보다 대상체에서 질환에 대해서 증가된 방어를 제공할 수 있다. 다양한 구체예에서, 상기 항체는 조성물의 부재 하에서의 예상된 방어보다 조성물이 투여된 대상체의 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%에서 질환에 대해서 방어할 수 있다.
상기 단백분해 효소 파파인은 우선적으로 IgG 분자를 절단하여 몇몇 단편을 생성하며, 그 중 둘 (F(ab) 단편)은 각각 온전한 항원-결합 부위가 포함되는 공유 이종이량체를 포함한다. 상기 효소 펩신은 IgG 분자를 절단하여 F(ab')2 단편을 포함하는 몇몇 단편을 제공할 수 있고, 이는 두 항원-결합 부위를 모두 포함한다. 따라서 상기 항체는 Fab 또는 F(ab')2일 수 있다. 상기 Fab에는 중쇄 폴리펩타이드 및 경쇄 폴리펩타이드가 포함될 수 있다. 상기 Fab의 중쇄 폴리펩타이드에는 VH 영역 및 CH1 영역이 포함될 수 있다. Fab의 경쇄에는 VL 영역 및 CL 영역이 포함될 수 있다.
상기 항체는 면역글로불린 (Ig)일 수 있다. 상기 Ig는, 예컨대, IgA, IgM, IgD, IgE, 및 IgG일 수 있다. 상기 면역글로불린에는 중쇄 폴리펩타이드 및 경쇄 폴리펩타이드가 포함될 수 있다. 상기 면역글로불린의 중쇄 폴리펩타이드에는 VH 영역, CH1 영역, 힌지 영역, CH2 영역, 및 CH3 영역이 포함될 수 있다. 상기 면역글로불린의 경쇄 폴리펩타이드에는 VL 영역 및 CL 영역이 포함될 수 있다.
상기 항체는 다클론성 또는 단클론성 항체일 수 있다. 상기 항체는 키메라 항체, 단일쇄 항체, 친화도 성숙된 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 또는 완전 인간 항체일 수 있다. 상기 인간화된 항체는 비인간 종으로부터의 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR) 및 인간 면역글로불린 분자로부터의 틀 영역을 갖고 원하는 항원에 결합하는 비인간 종으로부터의 항체일 수 있다.
상기 항체는 하기에서 더욱 상세히 기술되는 바와 같은 이중특이적 항체일 수 있다. 상기 항체는 또한 하기에 더욱 상세히 기술되는 바와 같은 이중기능성 항체일 수 있다.
전술한 바와 같이, 상기 항체는 대상체에 조성물의 투여 시에 대상체에서 생성될 수 있다. 상기 항체는 대상체 내에 반감기를 가질 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 항체는 대상체 내에서 이의 반감기를 연장하거나 단축시키기 위해 변형될 수 있다. 이러한 변형은 하기에서 더욱 상세히 기술된다.
상기 항체는 하기에서 더욱 상세히 기술되는 바와 같이 탈푸코실화될 수 있다.
상기 항체는 하기에서 더욱 상세히 기술되는 바와 같이 항원과 관련된 질환의 항체-의존 향상 (ADE)을 감소 또는 예방하기 위해 변형될 수 있다.
a. 이중특이적 항체
상기 재조합 핵산 서열은 이중특이적 항체, 이의 단편, 이의 변이체, 또는 이들의 조합을 암호화할 수 있다. 상기 이중특이적 항체는 2개의 항원, 예컨대, 하기에서 더욱 상세히 기술되는 항원들 중 2개와 결합 또는 반응할 수 있다. 상기 이중특이적 항체는 본 명세서에 기술된 항체 중 2개의 단편으로 이루어질 수 있으며, 이에 의해, 이중 특이적 항체를 2개의 요망되는 표적 분자와 결합 또는 반응시킬 수 있으며, 이는 하기에서 더욱 상세히 기술되는 항원, 수용체를 위한 리간드를 포함하는 리간드, 수용체 상의 리간드-결합 부위를 포함하는 수용체, 리간드-수용체 복합물, 및 마커를 포함할 수 있다.
b. 이중기능성 항체
상기 재조합 핵산 서열은 이중기능성 항체, 이의 단편, 이의 변이체, 또는 이들의 조합을 암호화할 수 있다. 상기 이중기능성 항체는 하기에 기술된 항체와 결합 또는 반응할 수 있다. 상기 이중기능성 항체는 또한, 항원의 인식 및 항원에 대한 결합을 넘어서 항체에 대한 추가적인 기능성을 부여하기 위해 변형될 수 있다. 이러한 변형은 인자 H 또는 이의 단편에 대한 커플링을 포함할 수 있지만, 이로 제한되지 않는다. 인자 H는 보체 활성화의 가용성 조절제이고, 이에 따라, 보체-매개 용해 (CML)를 통해 면역 반응에 기여할 수 있다.
c. 항체 반감기의 연장
위에서 기술된 바와 같이, 상기 항체는 대상체에서 항체의 반감기를 연장하거나 단축시키기 위해 변형될 수 있다. 상기 변형은 대상체의 혈청에서 항체의 반감기를 연장하거나 단축시킬 수 있다.
상기 변형은 항체의 불변 영역에 존재할 수 있다. 상기 변형은 하나 이상의 아미노산 치환을 함유하지 않는 항체의 반감기와 비교하여 항체의 반감기를 연장하는 항체의 불변 영역에서의 하나 이상의 아미노산 치환일 수 있다. 상기 변형은 하나 이상의 아미노산 치환을 함유하지 않는 항체의 반감기와 비교하여 항체의 반감기를 연장하는 항체의 CH2 도메인에서의 하나 이상의 아미노산 치환일 수 있다.
일부 구체예에서, 상기 불변 영역에서의 하나 이상의 아미노산 치환은 불변 영역에서의 메티오닌 잔부를 티로신 잔부로, 불변 영역에서의 세린 잔부를 트레오닌 잔부로, 불변 영역에서의 트레오닌 잔부를 글루타메이트 잔부로, 또는 이들의 임의의 조합으로 대체하는 것을 포함할 수 있으며, 이에 의해 항체의 반감기를 연장할 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 불변 영역에서의 하나 이상의 아미노산 치환은 CH2 도메인에서의 메티오닌을 티로신 잔부로, CH2 도메인에서의 세린 잔부를 트레오닌 잔부로, CH2 도메인에서의 트레오닌 잔부를 글루타메이트 잔부로, 또는 이들의 임의의 조합으로 대체하는 것을 포함할 수 있으며, 이에 의해, 항체의 반감기를 연장할 수 있다.
d. 탈푸코실화
상기 재조합 핵산 서열은 푸코실화되지 않은 항체 (즉, 탈푸코실화 항체 또는 비-푸코실화 항체), 이의 단편, 이의 변이체, 또는 이들의 조합을 암호화할 수 있다. 푸코실화는 분자에 당 푸코스의 첨가, 예컨대, N-글리칸, O-글리칸 및 인지질에 푸코스의 부착을 포함한다. 이에 따라, 탈푸코실화된 항체에서, 푸코스는 불변 영역의 탄수화물 사슬에 부착되지 않는다. 또한, 이러한 푸코실화의 결여는 푸코실화된 항체와 비교하여 항체에 의해 FcγRIIIa 결합 및 항체 지향 세포 독성 (ADCC) 활성을 개선시킬 수 있다. 이에 따라, 비-푸코실화된 항체는 푸코실화된 항체와 비교하여 증가된 ADCC 활성을 나타낼 수 있다.
상기 항체는 항체의 푸코실화를 예방 또는 억제하기 위해 변형될 수 있다. 일부 구체예에서, 이러한 변형된 항체는 비변형된 항체와 비교하여 증가된 ADCC 활성을 나타낼 수 있다. 상기 변형은 중쇄, 경쇄, 또는 이들의 조합에서 이루어질 수 있다. 상기 변형은 중쇄에서의 하나 이상의 아미노산 치환, 경쇄에서의 하나 이상의 아미노산 치환, 또는 이들의 조합일 수 있다.
e. 감소된 ADE 반응
상기 항체는 항원과 관련된 질환의 항체-의존 향상 (ADE)을 감소 또는 예방하기 위해 변형될 수 있지만, 여전히 항원을 중화시킨다.
일부 구체예에서, 상기 항체는 FcyR1a에 대한 항체의 결합을 감소 또는 예방하는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하기 위해 변형될 수 있다. 상기 하나 이상의 아미노산 치환은 항체의 불변 영역에 존재할 수 있다. 상기 하나 이상의 아미노산 치환은 항체의 불변 영역에서 류신 잔부를 알라닌 잔부로 대체하는 것을 포함할 수 있으며, 본 명세서에서 LA, LA 돌연변이 또는 LA 치환으로도 알려져 있다. 하나 이상의 아미노산 치환은 항체의 불변 영역에서, 2개의 류신 잔부를 각각 알라닌 잔부로 대체하는 것을 포함할 수 있고, 이는 또한, 본 명세서에서 LALA, LALA 돌연변이, 또는 LALA 치환으로서 알려져 있다. LALA 치환의 존재는 FcyR1a에 대한 결합으로부터 항체를 예방 또는 차단할 수 있으며, 이에 따라, 변형된 항체는 항원과 관련된 질환의 ADE를 향상 또는 야기시키지 않지만, 여전히 항원을 중화시킨다.
4. 단클론성 항체
일 구체예에서, 본 발명은 항-PD-1 항체를 제공한다. 상기 항체는 온전한 단클론성 항체, 및 면역학적 활성 단편 (예컨대, Fab 또는 (Fab)2 단편), 단클론성 항체 중쇄, 또는 단클론성 항체 경쇄일 수 있다.
상기 항체는 CDR에 대한 지지를 제공하고 서로에 대해 CDR의 공간적 관계를 정의하는 중쇄 및 경쇄틀 ("FR") 세트 사이에 각각 배치된 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역 ("CDR") 세트를 포함할 수 있다. 상기 CDR 세트는 중쇄 또는 경쇄 V 영역의 세 고가변 영역을 함유할 수 있다. 중쇄 또는 경쇄의 N-말단에서 시작하여, 이들 영역은 각각 "CDR1", "CDR2" 및 "CDR3"으로 표시된다. 따라서 항원-결합 부위에는 중쇄 또는 경쇄 V 영역 각각으로부터의 CDR 세트를 포함하는 6개의 CDR이 포함될 수 있다.
상기 항체는 면역글로불린 (Ig)일 수 있다. Ig는, 예컨대 IgA, IgM, IgD, IgE, 및 IgG일 수 있다. 상기 면역글로불린에는 중쇄 폴리펩타이드 및 경쇄 폴리펩타이드가 포함될 수 있다. 면역글로불린의 중쇄 폴리펩타이드에는 VH 영역, CH1 영역, 힌지 영역, CH2 영역, 및 CH3 영역이 포함될 수 있다. 상기 면역글로불린의 경쇄 폴리펩타이드에는 VL 영역 및 CL 영역이 포함될 수 있다.
5. 합성 항체를 생성하는 방법
본 발명은 또한 상기 합성 항체의 생성 방법에 대한 것이다. 상기 방법에는 하기에서 보다 상세히 기재된 전달 방법을 이용함으로써 이를 필요로 하는 대상체에게 조성물을 투여하는 단계가 포함될 수 있다. 따라서 상기 합성 항체는 대상체에 대한 조성물의 투여 시 생체 내 또는 대상체에서 생성된다.
상기 방법에는 또한 하나 이상의 세포 내로 조성물을 투여하는 단계가 포함될 수 있고, 이에 따라 합성 항체는 하나 이상의 세포에서 생성되거나 생산될 수 있다. 상기 방법에는 하나 이상의 조직, 예컨대, 비제한적으로, 피부 및 근육 내로 조성물을 도입하는 단계를 추가로 포함할 수 있고, 이에 따라 합성 항체는 하나 이상의 조직에서 생성되거나 생산될 수 있다.
6. 암 항원
본 발명의 조성물 및 방법은 항원, 이의 단편 또는 변이체와 조합하여 사용될 수 있다.
마커는 특정 암 세포에 대해서 존재하거나 또는 상향조절된 공지된 단백질이다. 자신에 대한 관용을 파손시키는 방식으로 이러한 마커를 나타내는 항원을 생성시키는 방법론에 의해서, 암 백신이 생성될 수 있다. 이러한 암 백신은 면역 반응을 향상시키기 위해서 관문 저해제(들)를 포함할 수 있다.
본 발명의 양상은 항원에 대한 면역 반응을 향상시키는 것을 필요로 하는 대상체에서 항원에 대한 면역 반응을 향상시키기 위한 조성물을 포함하며, 이것은 대상체에서 면역 반응을 생성시킬 수 있는 합성 항원과 조합하여 합성 항체, 또는 생물학적으로 기능성인 단편 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 항원은 mTERT를 포함한다. 일부 구체예에에서, 상기 항원은 hTERT를 포함한다.
상기 합성 항원은 항원을 암호화하는 단리된 DNA일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 항원은 종양 관련 표면 항원이다. 종 양 관련 표면 항원의 예시적인 예에는 CD10, CD19, CD20, CD22, CD33, Fms-유사 티로신 카이나제 3 (FLT-3, CD135), 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 4 (CSPG4, 흑색종-관련 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸), 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), Her2neu, Her3, IGFR, CD133, IL3R, 섬유모세포 활성 단백질 (FAP), CDCP1, Derlin1, 테나신, 프리즐드 1-10, 혈관 항원 VEGFR2 (KDR/FLK1), VEGFR3 (FLT4, CD309), PDGFR-알파. (CD140a), PDGFR-베타 (CD140b) 엔도글린, CLEC14, Tem1-8, 및 Tie2가 있다. 추가 예는 A33, CAMPATH-1 (CDw52), 암배아 항원 (CEA), 카보언하이드라제 IX (MN/CA IX), CD21, CD25, CD30, CD34, CD37, CD44v6, CD45, CD133, de2-7 EGFR, EGFRvIII, EpCAM, Ep-CAM, 폴레이트-결합 단백질, G250, Fms-유사 티로신 카이나제 3 (FLT-3, CD135), cKit (CD117), CSF1R (CD115), HLA-DR, IGFR, IL-2 수용체, IL3R, MCSP (흑색종-관련 세포 표면 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸), Muc-1, 전립선-특이적 막 항원 (PSMA), 전립선 줄기세포 항원 (PSCA), 전립선 특이적 항원 (PSA), 및 TAG-72를 포함할 수 있다. 종양의 세포외 기질 상에서 발현되는 항원의 예에는 테나신 및 섬유모세포 활성 단백질 (FAP)이 있다.
일 구체예에서, 상기 합성 항원은 하기로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다: hTERT, PSA, PSMA, STEAP, PSCA, 및 PAP, WT1, 티로시아제, NYES01, PRAME, 및 MAGE. 하기가 일부 암 항원이다:
a. hTERT
hTERT는 염색체 단축으로 인해서 세포사를 예방하도록 텔로머의 단부 상에 TTAGGG 태그를 합성하는 인간 텔로머라제 역전사효소이다. hTERT의 비정상적으로 높은 발현을 갖는 과증식성 세포가 면역요법에 의해서 표적이될 수 있다. 최근 연구는, hTERT 유전자로 형질주입된 수지상 세포에서 hTERT 발현이 CD8+ 세포독성 T 세포를 유도하고, 항원-특이적 방식으로 CD4+ T 세포를 도출할 수 있다는 것을 입증한다.
hTERT는 본 명세서에 기술된 벡터로 투여될 수 있고, 하기 실시예에서의 것을 비롯한, 다양한 백신접종 스케줄로 관문 저해제와 조합될 수 있다.
b. 전립선 항원
하기는 전립선 항원에 대해서 포유류에서 면역 반응을 도출할 수 있는 항원이다. 컨센서스 항원은 전립선암 세포에 대한 면역원이 유도될 수 있기 때문에 그것을 특히 효과적인 것으로 만드는 에피토프를 포함할 수 있다. 컨센서스 전립선 항원은 전장 번역 산물, 이의 변이체, 이의 단편 또는 이의 조합물을 포함할 수 있다.
상기 전립선 항원은 PSA 항원, PSMA 항원, STEAP 항원, PSCA 항원, 전립선산 포스파타제 (PAP) 항원, 다른 공지된 전립선암 마커 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 단백질은 전립선 항원에 상동성인 서열, 전립선암 항원의 분절 및 전립선 항원의 분절에 상동성인 서열을 갖는 단백질일 포함할 수 있다.
상기 전립선 항원은 본 명세서에 기술된 벡터로 투여될 수 있고, 하기 실시예에서의 것을 비롯한, 다양한 백신접종 스케줄에서 관문 저해제와 조합될 수 있다.
c. WT1
상기 항원은 빌름스 종양 억제인자 유전자 (WT1), 이의 단편, 이의 변이체, 또는 이의 조합물일 수 있다. WT1은 N-말단에서, 프롤린/글루타민-풍부 DNA-결합 도메인을 함유하고, C-말단에서, 4개의 아연 핑거 모티프를 함유하는 전사 인자이다. WT1은 비뇨생식계의 정상적인 발달에서 역할을 하고, 다수의 인자, 예컨대, 공지된 종양 억제인자인 p53 및 세린 프로테아제 HtrA2 (이것은 세포독성 약물로의 치료 이후에 다수의 부위에서 WT1을 절단함)와 상호작용한다.
WT1의 돌연변이는 종양 또는 암 형성, 예컨대, 빌름스 종양 또는 WT1을 발현하는 종양으로 이어질 수 있다. 빌름스 종양은 종종 예컨대, 비제한적으로 간 조직, 비뇨계 조직, 림프 조직, 및 폐 조직으로 전이되기 이전에 신장 중 하나 또는 둘 모두에서 형성된다. 따라서, 빌름스 종양은 전이성 종양이라고 간주될 수 있다. 빌름스 종양은 통상적으로 소아 (예컨대, 5세 미만)에서 그리고 특발성 또는 유전적 형태로 발생한다. 따라서, 백신은 빌름스 종양을 앓고 있는 대상체를 치료하기 위해서 사용될 수 있다. 백신은 또한 대상체에서 이러한 종양의 발달을 예방하기 위해서 WT1을 발현하는 암 또는 종양을 갖는 대상체를 치료하기 위해서 사용될 수 있다. WT1 항원은 네이티브, "정상" WT1 유전자와 상이할 수 있기 때문에, WT1 항원-발현 종양에 대한 요법 또는 예방법을 제공한다. 단백질은 WT1 항원에 상동성인 서열, WT1 항원의 단편, WT1 항원의 단편에 상동성인 서열을 갖는 단백질을 포함할 수 있다.
상기 WT1 항원은 본 명세서에 기술된 벡터로 투여될 수 있고, 하기 실시예에서의 것을 비롯한, 다양한 백신접종물 스케줄에서 관문 저해제와 조합될 수 있다.
d. 티로시나제 항원
항원 티로시나제 (Tyr) 항원은 (1) B 세포 반응을 통해서 체액 면역을 유도하여 단핵구 주화성 단백질-1 (MCP-1) 생산을 차단하는 항체를 생성하고, 이에 의해서 골수 유래 억제인자 세포 (MDSCs)를 지연시키고, 종양 성장을 억제함으로써; (2) T 림프구, 예컨대, CD8+ (CTL)를 증가시켜 종양 세포를 공격하고 사멸시킴으로써; (3) T 헬퍼 세포 반응을 증가시킴으로써; (4) 그리고 IFN-γ 및 TFN-α 또는 전술한 모든 것을 통해 염증 반응을 유도하고 증가시킴으로써 면역 매개된 클리어런스에 대한 중요한 표적이다.
티로시나제는 식물 및 동물 조직에서 발견될 수 있는 구리-함유 효소이다. 티로시나제는 페놀, 예컨대 티로신의 산화에 의해서 멜라닌 및 다른 안료의 생산을 촉매작용한다. 흑색종에서, 티로시나제는 조절되지 않아서, 증가된 멜라닌 합성을 초래할 수 있다. 티로시나제는 또한 흑색종을 앓고 있는 대상체에서 세포독성 T 세포 인식의 표적이다. 따라서, 티로시나제는 흑색종과 연관된 항원일 수 있다.
상기 항원은 그것을 항-Tyr 면역 반응이 유도될 수 있는 면역원으로서 특히 효과적으로 만드는 단백질 에피토프를 포함할 수 있다. 상기 Tyr 항원은 전장 번역 산물, 이의 변이체, 이의 단편 또는 이의 조합물을 포함할 수 있다.
상기 Tyr 항원은 컨센세스 단백질을 포함할 수 있다. 상기 Tyr 항원은 모든 암 및 종양 관련 세포에 대해서 항원-특이적 T-세포 및 높은 역가 항체 반응 모두를 전신적으로 유도한다. 이와 같이, 방어적 면역 반응은 Tyr 컨센세스 항원을 포함하는 백신에 의해서 종양 형성에 대해서 제공된다. 따라서, 임의의 사용자는 Tyr 항원을 포함하도록 본 발명의 백신을 설계하여 종양 형성, 종양의 전이 및 종양 성장에 대해서 광범위한 면역을 제공할 수 있다. 단백질은 Tyr 항원에 상동성인 서열, Tyr 항원의 단편 및 Tyr 항원의 단편에 상동성인 서열을 갖는 단백질을 포함할 수 있다.
상기 Tyr 항원은 본 명세서에 기술된 벡터로 투여될 수 있고, 하기 실시예에서의 것을 비롯한, 다양한 백신접종물 스케줄에서 관문 저해제와 조합될 수 있다.
e. NYES01
NY-ESO-1은 다양한 암에서 발현되는 암-고환 항원이며, 여기서 그것은 세포 및 체액 면역 둘 모두를 유도할 수 있다. 유전자 발현 연구는 점액성 및 원형 세포 지방육종에서, NY-ESO-1에 대한 유전자인, CTAG1B의 상향조절을 밝혀내었다. 단백질은 NYES01 항원에 상동성인 서열, NYES01 항원의 단편 및 NYES01 항원의 단편에 상동성인 서열을 갖는 단백질을 포함할 수 있다.
상기 NYES01 항원은 본 명세서에 기술된 벡터로 투여될 수 있고, 하기 실시예에서의 것을 비롯한, 다양한 백신접종물 스케줄에서 관문 저해제와 조합될 수 있다.
f. PRAME
종양에서 우세하게 발현되는 흑색종 항원 (PRAME 항원)은 인간에서 PRAME 유전자에 의해서 암호화된 단백질이다. 이러한 유전자는 인간 흑색종에서 주로 발현되고, 세포용해 T 림프구에 의해서 인식되는 항원을 암호화한다. 그것은 고환을 제외한 정상 세포에서 발현되지 않는다. 이 유전자는 또한 급성 백혈병에서 발현된다. 동일한 단백질을 암호화하는 5종의 대안적으로 스플라이싱된 전사체 변이체가 이러한 유전자에 대해서 관찰되었다. 단백질은 PRAME 항원에 상동성인 서열, PRAME 항원의 단편 및 PRAME 항원의 단편에 상동성인 서열을 갖는 단백질을 포함할 수 있다.
상기 PRAME 항원은 본 명세서에 기술된 벡터로 투여될 수 있고, 하기 실시예에서의 것을 비롯한, 다양한 백신접종물 스케줄에서 관문 저해제와 조합될 수 있다.
g. MAGE
MAGE는 흑색종-연관 항원, 특히 흑색종 연관 항원 4 (MAGEA4)를 대표한다. MAGE-A4는 남성 생식 세포 및 다양한 조직학적 유형, 예컨대 위장, 식도 및 폐 암종의 종양 세포에서 발현된다. MAGE-A4는 온코단백질, 갠키린에 결합한다. MAGE-A4 특이적 결합은 이의 C-말단에 의해서 매개된다. 연구는, 외인성 MAGE-A4가 시험관 내에서 갠키린-과발현 세포의 접착-의존성 성장을 부분적으로 저해하고, 누드 마우스에서 이들 세포로부터 이동된 종양의 형성을 억제할 수 있다는 것을 보여주었다. 이러한 저해는 MAGE-A4와 갠키린 간의 결합에 좌우되는데, 이는 갠키린과 MAGE-A4 간의 상호작용이 갠키린-매개된 발암을 저해한다는 것을 시사한다. 종양 조직에서 MAGE 발현은 종양 발생의 원인이 아니라 결과이며, MAGE 유전자는 파괴에 대해서 초기 종양 세포를 표적으로 함으로써 면역 과정에 참여하는 것 같다.
흑색종-연관된 항원 4 단백질 (MAGEA4)은 배아 발달 및 종양 형질전환 및/또는 진행에 관여될 수 있다. MAGEA4는 일반적으로 고환 및 태반에서 발현된다. 그러나, MAGEA4는 다수의 상이한 유형의 종양, 예컨대, 흑색종, 두경부 편평 세포 암종, 폐 암종, 및 유방 암종에서 발현될 수 있다. 따라서, MAGEA4는 다양한 종양과 연관된 항원일 수 있다.
상기 MAGEA4 항원은 항원-특이적 T 세포 및/또는 고 역가 항체 반응을 유도함으로써, 그 항원을 발현하는 암 또는 종양에 대해서 지시되거나 반응성인 면역 반응을 유도 또는 도출할 수 있다. 일부 구체예에서, 유도 또는 도출된 면역 반응은 세포, 체액, 또는 세포와 체액 면역 반응 둘 모두일 수 있다. 일부 구체예에서, 유도 또는 도출된 세포 면역 반응은 인터페론-감마 (IFN-γ) 및/또는 종양 괴사 인자 알파 (TNF-α)의 유도 또는 분피를 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 유도 또는 도출된 면역 반응은 항원을 발현하는 종양 또는 암의 성장을 촉진시키는 하나 이상의 면역 억제 인자, 예컨대, 비제한적으로, MHC 제시를 하향 조절하는 인자, 항원-특이적 조절 T 세포 (Treg), PD-L1, FasL, 사이토카인, 예컨대, IL-10 및 TFG-β, 종양 관련 대식세포, 종양 관련 섬유모세포를 감소 또는 저해할 수 있다.
상기 MAGEA4 항원은 그것을 항-MAGEA4 면역 반응이 유도될 수 있는 면역원으로서 특히 효과적으로 만드는 단백질 에피토프를 포함할 수 있다. 상기 MAGEA4 항원은 전장 번역 산물, 이의 변이체, 이의 단편 또는 이의 조합물을 포함할 수 있다. 상기 MAGEA4 항원은 컨센세스 단백질을 포함할 수 있다.
컨센세스 MAGEA4 항원을 암호화하는 핵산 서열은 코돈 사용 및 상응하는 RNA 전사체에 관련하여 최적화될 수 있다. 컨센세스 MAGEA4 항원을 암호화하는 핵산은 발현에 대해서 최적화된 코돈 및 RNA일 수 있다. 일부 구체예에서, 컨센세스 MAGEA4 항원을 암호화하는 핵산 서열은 번역의 효율을 증가시키기 위해서 코작 서열 (예컨대, GCC ACC)을 포함할 수 있다. 컨센세스 MAGEA4 항원을 암호화하는 핵산은 번역 종결의 효율성을 증가시키기 위해서 다수의 정지 코돈 (예컨대, TGA TGA)을 포함할 수 있다.
상기 MAGE 항원은 본 명세서에 기술된 벡터로 투여될 수 있고, 하기 실시예에서의 것을 비롯한, 다양한 백신접종물 스케줄에서 관문 저해제와 조합될 수 있다.
h. 종양 항원
본 발명과 관련하여, "종양 항원" 또는 "과증식성 장애 항원" 또는 "과증식성 장애와 연관된 항원"은 특정 과증식성 장애, 예컨대, 암에 공통적인 항원을 지칭한다. 본 명세서에 논의된 항원은 예의 방식으로 단지 포함된다. 그 목록은 배타적임이 의도되지 않으며, 추가 예는 당업자에게 쉽게 자명할 것이다.
상기 종양 항원은 면역 반응, 특히 T-세포 매개된 면역 반응을 도출하는 종양 세포에 의해서 생산된 단백질이다. 본 발명의 항원 결합 모이어티의 선택은 치료하고자 하는 암의 특정 유형에 좌우될 것이다. 종양 항원은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 예컨대, 신경교종-연관 항원, 종양태아 항원 (CEA), β-인간 융모성 생식선 자극호르몬, 알파태아단백질 (AFP), 렉틴-반응성 AFP, 티로글로불린, RAGE-1, MN-CA IX, 인간 텔로머라제 역전사효소, RU1, RU2 (AS), 장 카복실 에스터라제, mut hsp70-2, M-CSF, 프로스타제, 전립선-특이적 항원 (PSA), PAP, NY-ESO-1, LAGE-1a, p53, 프로스테인, PSMA, Her2/neu, 서바이빈 및 텔로머라제, 전립선-암종 종양 항원-1 (PCTA-1), MAGE, ELF2M, 호중구 엘라스타제, 에프린B2, CD22, 인슐린 성장 인자 (IGF)-I, IGF-II, IGF-I 수용체 및 메소텔린을 포함한다.
일 구체예에서, 상기 종양 항원은 악성 종양과 연관된 하나 이상의 항원성 암 에피토프를 포함한다. 악성 종양은 면역 공격에 대한 표적 항원으로서 작용할 수 있는 다수의 단백질을 발현한다. 이들 분자는 조직-특이적 항원, 예컨대, 흑색종에서의 MART-1, 티로시나제 및 GP 100 및 전립선암에서의 전립선산 포스파타제 (PAP) 및 전립선-특이적 항원 (PSA)을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 다른 표적 분자는 형질전환-관련 분자, 예컨대, 종양유전자 HER-2/Neu/ErbB-2의 군에 속한다. 표적 항원의 추가의 또 다른 군은 태아 종양, 예컨대, 종양태아 항원 (CEA)이다. B-세포 림프종에서 종양-특이적 이디오타입 면역글로불린은 개별 종양에 독특한 정확히 종양-특이적 면역글로불린 항원을 구성한다. B-세포 분화 항원, 예컨대, CD19, CD20 및 CD37은 B-세포 림프종에서 표적 항원에 대한 다른 후보자이다. 이들 항원 중 일부 (CEA, HER-2, CD19, CD20, 이디오타입)는 제한된 성공으로 단클론성 항체를 사용한 수동 면역요법에 표적으로서 사용되어 왔다.
본 발명에서 지칭된 종양 항원의 유형은 또한 종양-특이적 항원 (TSA) 또는 종양-연관 항원 (TAA)일 수 있다. TSA는 종양 세포에 대해서 독특하며, 신체에서 다른 세포 상에서 발생하지 않는다. TAA 연관 항원은 종양 세포에 대해서 독특하지 않고, 대신에 항원에 대한 면역 관용의 상태를 유도하는 데 실패한 조건 하에서 정상 세포 상에서 또한 발현된다. 종양 상에서의 항원의 발현은 면역계가 항원에 반응할 수 있는 조건 하에서 일어날 수 있다. TAA는 면역계가 미숙하고, 반응할 수 없는 경우 태아 발달 동안 정상 세포 상에서 발현되는 항원일 수 있거나 또는 이것은 정상 세포 상에서 상당히 낮은 수준으로 일반적으로 존재하지만 종양 세포 상에서 훨씬 더 높은 수준으로 발현되는 항원일 수 있다.
TSA 또는 TAA 항원의 비제한적인 예는 하기를 포함한다: 분화 항원, 예컨대, MART-1/MelanA (MART-I), gp100 (Pmel 17), 티로시나제, TRP-1, TRP-2 및 종양-특이적 다계통 항원, 예컨대, MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, p15; 과발현된 배아 항원, 예컨대, CEA; 과발현된 종양유전자 및 돌연변이된 종양-억제인자 유전자, 예컨대, p53, Ras, HER-2/neu; 염색체 전좌로부터 유발된 독특한 종양 항원; 예컨대, BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR; 및 바이러스 항원, 예컨대, 엡스타인 바르 바이러스 항원 EBVA 및 인간 유두종 바이러스 (HPV) 항원 E6 및 E7. 다른 큰 단백질-기반 항원은 TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, RAGE, NY-ESO, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, nm-23H1, PSA, TAG-72, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, 베타-카테닌, CDK4, Mum-1, p 15, p 16, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, 알파-태아단백질, 베타-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3＼CA 27.29＼BCAA, CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68＼P1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733＼EpCAM, HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90＼Mac-2 결합 단백질＼사이클로필린 C-연관 단백질, TAAL6, TAG72, TLP, 및 TPS를 포함한다.
7. 조성물의 부형제 및 다른 성분
상기 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 기능적 분자, 예컨대, 운반체, 보강제, 담체, 또는 희석제일 수 있다. 상기 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 형질주입 촉진제일 수 있고, 여기에는 표면 활성제, 예컨대 면역 자극 복합체 (ISCOMS), 프로인트 불완전 보강제, LPS 유사체, 예컨대, 모노포스포릴 지질 A, 무라밀 펩타이드, 퀴논 유사체, 소포체, 예컨대, 스쿠알렌 및 스쿠알렌, 히알루론산, 지질, 리포좀, 칼슘 이온, 바이러스 단백질, 다중 음이온, 다중 양이온, 또는 나노입자, 또는 다른 공지된 형질주입 촉진제가 포함될 수 있다.
상기 형질주입 촉진제는 다중 음이온, 다중 양이온, 예컨대, 폴리-L-글루타메이트 (LGS), 또는 지질이다. 상기 형질주입 촉진제는 폴리-L-글루타메이트이고, 폴리-L-글루타메이트는 6 mg/ml 미만의 농도로 백신에 존재할 수 있다. 상기 형질 주입 촉진제에는 또한 표면 활성제, 예컨대, 면역-자극 복합체 (ISCOMS), 프로인트 불완전 보강제, LPS 유사체, 예컨대, 모노포스포릴 지질 A, 무라밀 펩타이드, 퀴논 유사체 및 소포체, 예컨대, 스쿠알렌 및 스쿠알렌이 포함될 수 있고, 히알루론산이 또한 유전적 구조와 함께 투여되어 이용될 수 있다. DNA 플라스미드 백신에는 또한 형질주입 촉진제, 예컨대, 지질, 리포좀, 예컨대, 레시틴 리포좀 또는 당해 분야에 공지된 다른 리포좀, 예컨대, DNA-리포좀 혼합물 (예컨대 WO9324640 참고), 칼슘 이온, 바이러스 단백질, 다중 음이온, 다중 양이온, 또는 나노입자, 또는 다른 공지된 형질주입 촉진제가 포함될 수 있다. 상기 형질주입 촉진제는 다중 음이온, 다중 양이온, 예컨대, 폴리-L-글루타메이트 (LGS), 또는 지질이다. 백신 중 형질주입 제제의 농도는 4 mg/ml 미만, 2 mg/ml 미만, 1 mg/ml 미만, 0.750 mg/ml 미만, 0.500 mg/ml 미만, 0.250 mg/ml 미만, 0.100 mg/ml 미만, 0.050 mg/ml 미만, 또는 0.010 mg/ml 미만이다.
상기 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 본 발명의 관문 저해제 항체에 더하여 보강제일 수 있다. 추가적인 보강제는 대안적인 플라스미드에서 발현되거나 또는 백신에서 상기 플라스미드와 조합하여 단백질로서 전달되는 다른 유전자일 수 있다. 상기 보강제는 하기로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다: α-인터페론 (IFN-α), β-인터페론 (IFN-β), γ-인터페론, 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), TNFα, TNFβ, GM-CSF, 표피 성장 인자 (EGF), 각질 T 세포-유인 케모카인 (CTACK), 상피 흉선-발현 케모카인 (TECK), 점막-연관 상피 케모카인 (MEC), IL-12, IL-15, MHC, CD80, CD86, 예컨대, 신호 서열이 결실되고, 임의로 IgE로부터의 신호 펩타이드를 포함하는 IL-15. 상기 보강제는 IL-12, IL-15, IL-28, CTACK, TECK, 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), TNFα, TNFβ, GM-CSF, 표피 성장 인자 (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, PD-1, IL-10, IL-12, IL-18, 또는 이의 조합물일 수 있다.
본 발명의 항체에 더하여 보강제로서 유용할 수 있는 다른 유전자는 하기를 암호화하는 것을 포함한다: MCP-1, MIP-la, MIP-1p, IL-8, RANTES, L-셀렉틴, P-셀렉틴, E-셀렉틴, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-4, IL-18의 돌연변이체 형태, CD40, CD40L, 혈관 성장 인자, 섬유모세포 성장 인자, IL-7, IL-22, 신경 성장 인자, 혈관 내피 성장 인자, Fas, TNF 수용체, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, 카파제 ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, 비반응성 NIK, SAP K, SAP-1, JNK, 인터페론 반응 유전자, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAILR3, TRAIL-R4, RANK, RANK 리간드, Ox40, Ox40 리간드, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAP1, TAP2 및 이들의 기능성 단편.
상기 조성물은 전문이 참고로 도입되는 1994년 4월 1일자로 출원된 미국 일련번호 제021,579호에 기재된 바와 같은 유전적 백신 촉진제를 추가로 포함할 수 있다.
상기 조성물은 약 1 나노그램 내지 100 밀리그램; 약 1 마이크로그램 내지 약 10 밀리그램; 또는 바람직하게는 약 0.1 마이크로그램 내지 약 10 밀리그램; 또는 더 바람직하게는 약 1 밀리그램 내지 약 2 밀리그램의 양으로 DNA를 포함할 수 있다. 일부 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 조성물은 약 5 나노그램 내지 약 1000 마이크로그램의 DNA를 포함한다. 일부 바람직한 구체예에서, 상기 조성물은 약 10 나노그램 내지 약 800 마이크로그램의 DNA를 함유할 수 있다. 일부 바람직한 구체예에서, 상기 조성물은 약 0.1 내지 약 500 마이크로그램의 DNA를 함유할 수 있다. 일부 바람직한 구체예에서, 상기 조성물은 약 1 내지 약 350 마이크로그램의 DNA를 함유할 수 있다. 일부 바람직한 구체예에서, 상기 조성물은 약 25 내지 약 250 마이크로그램, 약 100 내지 약 200 마이크로그램, 약 1 나노그램 내지 100 밀리그램; 약 1 마이크로그램 내지 약 10 밀리그램; 약 0.1 마이크로그램 내지 약 10 밀리그램; 약 1 밀리그램 내지 약 2 밀리그램, 약 5 나노그램 내지 약 1000 마이크로그램, 약 10 나노그램 내지 약 800 마이크로그램, 약 0.1 내지 약 500 마이크로그램, 약 1 내지 약 350 마이크로그램, 약 25 내지 약 250 마이크로그램, 약 100 내지 약 200 마이크로그램의 DNA를 함유할 수 있다.
상기 조성물은 사용될 투여 방식에 따라 제형화될 수 있다. 주사 가능한 약제학적 조성물은 멸균, 무 발열원 및 무 미립자일 수 있다. 등장성 제형 또는 용액이 사용될 수 있다. 등장성을 위한 첨가제는 염화나트륨, 덱스트로스, 만니톨, 솔비톨 및 락토스를 포함할 수 있다. 상기 조성물은 혈관수축제를 포함할 수 있다. 상기 등장성 용액은 인산염 완충 식염수를 포함할 수 있다. 상기 조성물은 젤라틴 및 알부민을 포함하는 안정제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 안정제는 LGS 또는 다양이온 또는 다음이온을 포함하는, 장기간의 시간 동안 제형이 실온 또는 주위 온도에서 안정하게 되도록 허용할 수 있다.
8. 백신접종 방법
본 발명은 또한 대상체에서 면역 반응을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 면역 반응의 증가를 사용하여 대상체에서 질환을 치료 및/또는 예방할 수 있다. 방법은 대상체에게 본 명세서에 개시된 백신을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 백신이 투여된 대상체는 항원 단독이 투여된 대상체와 비교할 때 증가 또는 부스팅된 면역 반응을 가질 수 있다. 일부 구체예에서, 면역 반응은 약 0.5배 내지 약 15배, 약 0.5배 내지 약 10배, 또는 약 0.5배 내지 약 8배만큼 증가될 수 있다. 대안적으로, 백신이 투여된 대상체에서 면역 반응은 적어도 약 0.5배, 적어도 약 1.0배, 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2.0배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 3.0배, 적어도 약 3.5배, 적어도 약 4.0배, 적어도 약 4.5배, 적어도 약 5.0배, 적어도 약 5.5배, 적어도 약 6.0배, 적어도 약 6.5배, 적어도 약 7.0배, 적어도 약 7.5배, 적어도 약 8.0배, 적어도 약 8.5배, 적어도 약 9.0배, 적어도 약 9.5배, 적어도 약 10.0배, 적어도 약 10.5배, 적어도 약 11.0배, 적어도 약 11.5배, 적어도 약 12.0배, 적어도 약 12.5배, 적어도 약 13.0배, 적어도 약 13.5배, 적어도 약 14.0배, 적어도 약 14.5배, 또는 적어도 약 15.0배만큼 증가될 수 있다.
추가의 다른 대안적인 실시형태에서, 백신이 투여된 대상체에서 면역 반응은 약 50% 내지 약 1500%, 약 50% 내지 약 1000%, 또는 약 50% 내지 약 800% 증가될 수 있다. 다른 실시형태에서, 백신이 투여된 대상체에서 면역 반응은 적어도 약 50%, 적어도 약 100%, 적어도 약 150%, 적어도 약 200%, 적어도 약 250%, 적어도 약 300%, 적어도 약 350%, 적어도 약 400%, 적어도 약 450%, 적어도 약 500%, 적어도 약 550%, 적어도 약 600%, 적어도 약 650%, 적어도 약 700%, 적어도 약 750%, 적어도 약 800%, 적어도 약 850%, 적어도 약 900%, 적어도 약 950%, 적어도 약 1000%, 적어도 약 1050%, 적어도 약 1100%, 적어도 약 1150%, 적어도 약 1200%, 적어도 약 1250%, 적어도 약 1300%, 적어도 약 1350%, 적어도 약 1450%, 또는 적어도 약 1500%만큼 증가될 수 있다.
백신 용량은 1 μg 내지 10 mg 활성 성분/kg 체중/시간일 수 있고, 20 μg 내지 10 mg 성분/kg 체중/시간일 수 있다. 상기 백신은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 또는 31일마다 투여될 수 있다. 효과적인 치료 위한 백신 용량의 수는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10회일 수 있다.
9. 조성물의 전달 방법
본 발명은 또한 조성물이 필요한 대상체에게 조성물을 전달하는 방법에 관한 것이다. 전달 방법은 대상체에 조성물을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 투여는 생체 내 전기천공법에 의한 그리고 이를 사용하지 않는 DNA 주사, 리포좀 매개 전달, 및 나노입자 촉진된 전달을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다.
조성물의 포유류 수용 전달은 인간, 영장류, 비인간 영장류, 젖소, 소, 양, 염소, 영양, 들소, 물소, 들소, 솟과, 사슴, 고슴도치, 코끼리, 라마, 알파카, 마우스, 래트 및 닭일 수 있다.
상기 조성물은 경구로, 비경구로, 설하로, 경피로, 직장으로, 경점막으로, 국소로, 흡입을 통해, 협측 투여를 통해, 흉막내, 정맥내, 복강내, 피하, 근육내, 비강내, 비강내, 척추강내, 및 관절내 또는 이들의 조합을 포함하는 상이한 경로에 의해 투여될 수 있다. 수의학적 용도를 위해, 조성물은 정상 수의과적 실행에 따라 적합하게 허용 가능한 제형으로서 투여될 수 있다. 수의사는 특정 동물에 가장 적절한 투약 섭생 및 투여 경로를 용이하게 결정할 수 있다. 상기 조성물은 전통적인 주사기, 무바늘 주사 장치, "미립자 가속장치 유전자총" 또는 다른 물리적 방법, 예컨대 전기천공법 ("EP"), "유체 역학 방법" 또는 초음파에 의해 투여될 수 있다.
a. 전기천공법
전기천공법을 통한 조성물의 투여는 포유류의 목적하는 조직에 전달하도록 구성될 수 있는 전기천공장치를 이용하여 수행될 수 있으며, 세포막에서 가역적 기공이 형성되도록 야기하는 데 효과적인 에너지의 펄스 및 에너지의 선호되는 펄스는 사용자에 의한 프리셋 전류 입력과 유사한 정전류이다. 상기 전기천공 장치는 전기천공 구성성분 및 전극 어셈블리 또는 핸들 어셈블리를 포함할 수 있다. 상기 전기천공 구성성분은 제어기, 전류파형 생성기, 임피던스 시험기, 파형 자동 기록기, 입력 요소, 상태 기록 요소, 통신 포트, 메모리 컴포넌트, 전원 및 파워 스위치를 포함하는 상기 전기천공 장치의 다양한 구성요소 중 하나 이상을 포함하고, 부가할 수 있다. 상기 전기천공법은 플라스미드에 의한 세포의 형질감염을 용이하게 하기 위해 생체 내 전기천공 장치, 예컨대 셀렉트라 EP (CELLECTRA EP) 시스템 (Inovio Pharmaceuticals, Plymouth Meeting, PA) 또는 엘젠 (Elgen) 전기천공기 (Inovio Pharmaceuticals, Plymouth Meeting, PA)를 이용하여 달성될 수 있다.
상기 전기천공 구성성분은 전기천공 장치 중 하나의 구성요소로서 작용할 수 있고, 그리고 다른 구성요소는 전기천공 구성성분과 통신하는 별개의 구성요소 (또는 부품)이다. 상기 전기천공 구성성분은 전기천공 구성성분과 별개의 전기천공장치의 또 다른 구성요소와 통신할 수 있는 전기천공장치의 하나 초과의 구성요소로서 작용할 수 있다. 하나의 전기기계적 또는 기계적 장치의 부분으로서 존재하는 전기천공 장치의 구성요소는 서로 통신하는 하나의 장치로서 또는 별개의 구성요소로서 작용할 수 있는 구성요소로서 제한되지 않을 수도 있다. 상기 전기천공 구성성분은 목적하는 조직에서 정전류를 생성하는 에너지 펄스를 전달할 수 있고, 피드백 메커니즘을 포함한다. 전극 어셈블리는 공간적 배열에서 복수의 전극을 갖는 전극 어레이를 포함할 수 있되, 전극 어셈블리는 전기천공 구성성분으로부터의 에너지 펄스를 수신하고 전극을 통해 이를 목적하는 조직에 전달한다. 복수의 전극 중 적어도 하나는 에너지 펄스의 전달 동안 중성이고, 목적하는 조직에서 임피던스를 측정하고, 전기천공 구성성분에 대한 임피던스를 전달한다. 피드백 메커니즘은 측정된 임피던스를 수신할 수 있고, 정전류를 유지하기 위해 전기천공 부품에 의해 전달되는 에너지 펄스를 조절할 수 있다.
복수의 전극은 분산 패턴으로 에너지 펄스를 전달할 수 있다. 상기 복수의 전극은 프로그래밍된 서열 하에 전극의 제어를 통해 분산 패턴으로 에너지 펄스를 전달할 수 있고, 프로그래밍된 서열은 전기천공 구성성분에 사용자에 의해 입력된다. 상기 프로그래밍된 서열은 서열에서 전달되는 복수의 펄스를 포함할 수 있되, 복수의 펄스의 각각의 펄스는 임피던스를 측정하는 하나의 중성 전극을 갖는 적어도 2개의 활성 전극에 의해 전달되고, 그리고 복수의 펄스의 후속적 펄스는 임피던스를 측정하는 하나의 전극을 갖는 적어도 2개의 활성 전극 중 상이한 하나에 의해 전달된다.
상기 피드백 메커니즘은 하드웨어 또는 소프트웨어에 의해 수행될 수 있다. 상기 피드백 메커니즘은 아날로그 폐고리 회로에 의해 수행될 수 있다. 상기 피드백은 50 μs, 20 μs, 10 μs 또는 1 μs마다 일어나지만, 바람직하게는 실시간 피드백 또는 즉각적 (즉, 반응 시간을 결정하기 위한 이용 가능한 기법에 의해 결정하여 실질적으로 즉각적)이다. 상기 중성 전극은 목적하는 조직에서 임피던스를 측정할 수 있고 피드백 메커니즘에 임피던스를 통신하며, 피드백 메커니즘은 임피던스에 반응하고, 프리셋 전류와 유사한 값으로 정전류를 유지하기 위해 에너지 펄스를 조절한다. 상기 피드백 메커니즘은 에너지 펄스의 전달 동안 지속적으로 그리고 즉각적으로 정전류를 유지할 수 있다.
본 발명의 조성물의 전달을 용이하게 할 수 있는 전기천공 장치 및 전기천공법의 예는 드라기아-아클리 등에 의한 미국 특허 제7,245,963호, 스미스에 의해 제출된 미국 특허 공개 제2005/0052630호에 기재된 것을 포함하며, 이의 내용은 본 명세서에 그의 전문이 참고로 포함된다. 조성물의 전달을 용이하게 하기 위해 사용될 수 있는 다른 전기천공 장치 및 전기천공법은 2006년 10월 17일자로 출원된 미국 가출원 특허 제60/852,149호 및 2007년 10월 10일자로 출원된 제60/978,982호에 대해 미국 특허법 (35 USC 119(e)) 하에 유익을 주장하는 2007년 10월 17일자로 출원된 공동 계류 중이고 공동 소유된 미국 특허 출원 제11/874072호에 대해 사용될 수 있으며, 이들 모두는 그들의 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다.
Draghia-Alki 등에 의한 미국 특허 제7,245,963호는 신체 또는 식물 내 선택 조직의 세포 내로 생체 분자의 도입을 용이하게 하기 위한 모듈 전극 시스템 및 그들의 용도를 기재한다. 모듈 전극 시스템은 복수의 바늘 전극; 피하주사기 바늘; 프로그램 가능한 정전류 펄스 제어기로부터 복수의 바늘 전극까지의 전도성 연결을 제공하는 전기 커넥터; 및 전원을 포함할 수 있다. 오퍼레이터는 지지체 구조 상에 장착된 복수의 바늘 전극을 붙잡을 수 있고, 신체 또는 식물 내 선택 조직 내로 그들을 단단히 삽입할 수 있다. 이어서, 생체분자는 피하 바늘을 통해 선택된 조직 내로 전달된다. 프로그램 가능한 정전류 펄스 제어기는 활성화되며, 정전류 전기 펄스는 복수의 바늘 전극에 적용된다. 적용된 정전류 전기 펄스는 복수의 전극 사이의 세포 내로 생체분자의 도입을 용이하게 한다. 미국 특허 제7,245,963호의 전체 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.
Smith 등에 의해 제출된 미국 특허 공개 제2005/0052630호는 신체 또는 식물의 선택된 조직의 세포 내로 생체분자의 도입을 효과적으로 용이하게 하기 위해 사용될 수 있는 전기천공 장치를 기재한다. 전기천공 장치는 소프트웨어 또는 펌웨어에 의해 구체화되는 동전기적 장치 ("EKD 장치")를 포함한다. EKD 장치는 사용자 제어에 기반한 어레이 내 전극과 펄스 매개변수의 입력 사이의 일련의 프로그램 가능한 정전류 펄스 패턴을 생성하며, 전류 파형 데이터의 저장 및 획득을 허용한다. 전기천공 장치는 또한 바늘 전극의 어레이를 갖는 대체 가능한 전극 디스크, 주사 바늘에 대한 중심 주사 통로 및 제거 가능한 가이드 디스크를 포함한다. 미국 특허 공개 제2005/0052630호의 전체 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.
미국 특허 제7,245,963호 및 미국 특허 공개 제2005/0052630호에 기재된 전극 어레이 및 방법은 근육과 같은 조직뿐만 아니라 다른 조직 또는 기관 내로의 깊은 침투에 적합할 수 있다. 전극 어레이의 구성 때문에, 주사 바늘 (선택 생체분자를 전달하기 위함)은 또한 표적 기관 내로 완전히 삽입되며, 그리고 주사는 전극에 의해 이미 묘사된 면적에서 표적 사안에 수직으로 투여된다. 미국 특허 제7,245,963호 및 미국 특허 공개 제2005/005263호에 기재된 전극은 바람직하게는 20 ㎜ 길이 및 21 게이지이다.
추가적으로, 전기천공 장치 및 이의 용도를 포함하는 일부 구체예가 상정되며, 다음의 특허에 기재된 것인 전기천공 장치가 있다: 1993년 12월 28일자로 발행된 미국 특허 제5,273,525호, 2000년 8월 29일자로 발행된 미국 특허 제6,110,161호, 2001년 7월 17일자로 발행된 미국 특허 제6,261,281호, 및 2005년 10월 25일자로 발행된 제6,958,060호, 및 2005년 9월 6일자로 발행된 미국 특허 제6,939,862호. 더 나아가, 임의의 다양한 장치를 이용하는 DNA의 전달에 관한 2004년 2월 24일자로 발행된 미국 특허 제6,697,669호에 제공된 대상을 아우르는 특허, 및 DNA의 주사 방법을 도출한 2008년 2월 5일자로 발행된 미국 특허 제7,328,064호는 본 명세서에 상정된다. 상기 특허는 그들의 전문이 참고로 포함된다.
10. 암 요법
본 발명은 암의 치료 또는 예방 방법, 또는 종양의 전이의 치료 및 예방 방법을 제공한다. 본 발명의 관련된 양상은 개인에서 과다형성(hyperplastic) 또는 종양 세포의 전이를 예방, 예방의 보조 및/또는 감소시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 양상은 전이의 저해를 필요로 하는 개인에서 전이를 저해하는 방법을 제공하며, 이 방법은 개인에게 유효량의 본 발명의 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명은 전이의 저해를 필요로 하는 대상체에서 전이를 저해하는 방법을 추가로 제공하며, 이 방법은 개인에게 전이-저해 유효량의 본 명세서에 기술된 조성물 중 임의의 하나를 투여하는 단계를 포함한다.
암의 치료 또는 예방, 또는 종양의 전이의 치료 및 예방을 필요로 하는 개인에서 암의 치료 또는 예방, 또는 종양의 전이의 치료 및 예방의 일부 구체예에서, 제2 작용제, 예컨대, 항신생물제가 개인에게 투여된다. 일부 구체예에서, 제2 작용제는 제2 전이-저해제, 예컨대, 플라스미노겐 길항제 또는 아데노신 데아미나제 길항제를 포함한다. 다른 실시형태에서, 제2 작용제는 혈관신생 저해제이다.
본 발명의 조성물은 인간 및 동물에서 암을 예방, 약화, 최소화, 제어 및/또는 경감시키는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한 원발성 종양 성장 속도를 둔화시키는 데 사용될 수 있다. 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여되는 경우 본 발명의 조성물은 암 세포의 확산을 중단시키는 데 사용될 수 있다. 이와 같이, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 약물 또는 다른 약제와의 병용 요법의 부분으로서 투여될 수 있다. 병용 요법의 부분으로서 사용되는 경우, 본 발명의 조성물에 의해서 제공되는 전이의 감소 및 원발성 종양 성장의 감소는 환자를 치료하는 데 사용될 임의의 약제 또는 약물 요법의 보다 효과적이고 효율적인 사용을 가능하게 한다. 또한, 본 발명의 조성물에 의한 전이의 제어는 대상체에게 질환을 하나의 위치에 집중시키는 더 큰 능력을 제공한다.
일 구체예에서, 본 발명은 악성 종양 또는 다른 암성 세포의 전이를 예방할 뿐만 아니라 종양 성장의 속도를 감소시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 악성 종양 또는 암성 세포로 진단된 대상체에게 또는 종양 또는 암성 세포를 갖는 대상체에게 유효량의 본 발명의 조성물 중 하나 이상을 투여하는 단계를 포함한다.
하기는 본 발명의 방법 및 조성물로 치료될 수 있는 암의 비제한적인 예이다: 급성 림프모세포성; 급성 골수성 백혈병; 부신 피질 암종; 부신 피질 암종, 아동기; 충수암; 기저세포 암종; 담관암, 간외부; 방광암; 골암; 골육종 및 악성 섬유성 조직구종; 뇌간 신경교종, 아동기; 뇌종양, 성인; 뇌종양, 뇌간 신경교종, 아동기; 뇌종양, 중추신경계 비전형 기형종/간상 종양, 아동기; 중추신경계 배아 종양; 소뇌성상세포종; 소뇌성상세포종/악성 신경교종; 두개 인두종; 뇌실상의아세포종; 뇌실막종; 수모세포종; 수질상피종; 중간 분화의 송과체 실질 종양; 천막상 원시성 신경외배엽성 종양 및 송과체모세포종; 시교차 및 시상하부 신경교종; 뇌 및 척수 종양; 유방암; 기관지 종양; 버킷 림프종; 카시노이드 종양; 카시노이드 종양, 위장; 중추신경계 비전형 기형종/간상 종양; 중추신경계 배아 종양; 중추신경계 림프종; 소뇌 성상세포종 소뇌 성상세포종/악성 신경교종, 아동기; 자궁경부암; 척삭종, 아동기; 만성 림프구 백혈병; 만성 골수성 백혈병; 만성 골수증식성 장애; 대장암; 결장암; 두개 인두종; 피부의 T-세포 림프종; 식도암; 종양의 유잉 집단; 성선외 생식세포 종양; 간외 담관암; 안암, 안내 흑색종; 안암, 망막모세포종; 담낭암; 위 (복부) 암; 위장 유암종; 위장 간질 종양 (GIST); 생식 세포 종양, 두개 외; 생식 세포 종양, 고환 외; 생식 세포 종양, 난소; 임신성 영양모세포성 종양; 신경교종; 신경교종, 아동기 뇌간; 신경교종, 아동기 뇌 성상세포종; 신경교종, 아동기 시교차 및 시상하부; 겸상 세포 백혈병; 두경부암; 간세포 (간) 암; 조직구증, 랑게르한스 세포; 호지킨 림프종; 하인두암; 시상하부 및 시교차 신경교종; 안내 흑색종; 섬세포 종양; 신장 (신장세포) 암; 랑게르한스 세포 조직구증; 후두암; 백혈병, 급성 림프모세포성; 백혈병, 급성 골수성; 백혈병, 만성 림프구성; 백혈병, 만성 골수성; 백혈병, 겸상 세포; 입술 및 구강암; 간암; 폐암, 비-소세포성; 폐암, 소세포성; 림프종, AIDS-관련; 림프종, 버킷; 림프종, 피부 T-세포; 림프종, 호지킨성; 림프종, 비-호지킨성; 림프종, 원발성 중추신경계; 마크로글로불린혈증, 발덴스트롬; 뼈의 악성 섬유조직구종 및 골육종; 수모세포종; 흑색종; 흑색종, 안내 (눈); 메르켈 세포 암종; 중피종; 잠복성 원발성 전이성 편평세포 경부암; 구강암; 다발성 내분비 신생물형성 증후군, (아동기); 다발성 골수종/원형질 세포 신생물형성; 사상균증; 진균증; 골수이형성 증후군; 골수이형성성/골수증식성 질환; 골수성 백혈병, 만성; 골수성 백혈병, 성인기 급성; 골수성 백혈병, 아동기 급성; 골수종, 다발성; 골수증식성 장애, 만성; 비강 및 부비동암; 비인두암; 신경모세포종; 비-소세포 폐암; 구강암; 구강암; 구인두암; 골육종 및 뼈의 악성 섬유조직구종; 난소암; 난소 상피암; 난소 생식세포 종양; 난소 저악성 잠재성 종양; 췌장암; 췌장암, 섬세포 종양; 유도종증; 부갑상선암; 음경암; 인두암; 크롬친화성세포종; 중등도 분화형의 송과체 실질 종양; 송과체모세포종 및 천막상 원시 신경외배엽 종양; 뇌하수체 종양; 원형질 세포 신생물형성/다발성 골수종; 흉막과 폐의 모세포종; 원발성 중추신경계 림프종; 전립선암; 직장암; 신장 세포 (신장) 암; 신우뇨관, 이행세포암; 염색체 15번 상의 NUT 유전자에 관여된 기도 암종; 망막모세포종; 횡문근육종; 침샘암; 육종, 종양의 유잉 집단; 육종, 카포시; 육종, 연조직; 육종, 자궁; 시자리 증후군; 피부암 (비흑색종); 피부암 (흑색종); 피부 암종, 메르켈 세포; 소세포 폐암; 소장암; 연조직 육종; 편평세포 암종, 잠복성 원발성 편평세포 경부암, 전이성; 복부 (위) 암; 천막상 원시 신경외배엽 종양; T-세포 림프종, 피부; 고환암; 인후암; 흉선종 및 흉선 암종; 갑상선암; 신우뇨관의 이행세포암; 융모성 종양, 임신성; 요도암; 자궁암, 자궁내막; 자궁 육종; 질암; 외음부암; 발덴스트롬 마크로글로불린혈증; 및 빌름스 종양.
일 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 조성물로 치료하기 전에, 치료와 동시에, 또는 치료한 후에 암에 대한 보완 요법, 예컨대, 수술, 화학요법, 화학치료제, 방사선 요법, 또는 호르몬 요법 또는 이의 조합으로 대상체를 치료하는 단계를 포함하는 암 전이를 치료하는 방법을 제공한다.
화학치료제는 세포독성제 (예컨대, 5-플루오로우라실, 시스플라틴, 카보플라틴, 메토트렉세이트, 다우노루비신, 독소루비신, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 옥소루비신, 카르무스틴 (BCNU), 로무스틴 (CCNU), 시타라빈 USP, 사이클로포스파미드, 에스트라뮤신 포스페이트 나트륨, 알트레타민, 하이드록시우레아, 이포스파미드, 프로카바진, 미토마이신, 부술판, 사이클로포스파미드, 미토크산트론, 카르보플라틴, 시스플라틴, 인터페론알파-2a 재조합체, 파클리탁셀, 테니포시드 및 스트렙토조신), 세포독성 알킬화제 (예컨대, 부술판, 클로르암부실, 사이클로포스파미드, 멜팔란 또는 에틸설폰산), 알킬화제 (예컨대, 아살레이, AZQ, BCNU, 부술판, 바이설판, 카복시프탈라토플라티늄, CBDCA, CCNU, CHIP, 클로르암부실, 클로로조토신, 시스-플라티늄, 클로메손, 시아노모르폴리노독소루비신, 사이클로디손, 사이클로포스파미드, 다이안하이드로갈락티톨, 플루오로도판, 헵설팜, 하이칸톤, 이포스파미드, 멜팔란, 메틸 CCNU, 미토마이신 C, 미토졸라미드, 니트로겐 머스타드, PCNU, 피페라진, 피페라진다이온, 피포브로만, 포르피로마이신, 스피로히단토인 머스타드, 스트렙토조토신, 테록시론, 테트라플라틴, 티오테파, 트라이에틸렌멜라민, 우라신 니트로겐 머스타드 및 Yoshi-864), 항유사분열제 (예컨대, 알로콜키신, 할리콘드린 M, 콜키신, 콜키신 유도체, 돌라스타틴 10, 마이탄신, 리족신, 파클리탁셀 유도체, 파클리탁셀, 티오콜키신, 트라이틸 시스테인, 빈블라스틴 설페이트 및 빈크리스틴 설페이트), 식물 알카로이드 (예컨대, 악티노마이신 D, 블레오마이신, L-아스파라기나제, 이다루비신, 빈블라스틴 설페이트, 빈크리스틴 설페이트, 미트라마이신, 미토마이신, 다우노루비신, VP-16-213, VM-26, 나벨빈 및 탁소테어), 생물학적 제제 (예컨대, 알파 인터페론, BCG, G-CSF, GM-CSF 및 인터류킨-2), 토포아이소메라제 I 저해제 (예컨대, 캄프토테신, 캄프토테신 유도체 및 모르폴리노독소루비신), 토포아이소메라제 II 저해제 (예컨대, 미토크산트론, 아모나피드, m-AMSA, 안트라피라졸 유도체, 피라졸로아크리딘, 비스안트렌 HCL, 다우노루비신, 데옥시독소루비신, 메노가릴, N,N-다이벤질 다우노마이신, 옥산트라졸, 루비다존, VM-26 및 VP-16), 및 합성물질 (예컨대, 하이드록시우레아, 프로카바진, o,p'-DDD, 다카바진, CCNU, BCNU, 시스-다이아민다이클로로플라티늄, 미토크산트론, CBDCA, 레바미솔, 헥사메틸멜라민, 올-트랜스 (all-trans) 레틴산, 글리아델 및 포르피머 소듐)을 포함한다.
항증식제는 세포의 증식을 감소시키는 화합물이다. 항증식제는 알킬화제, 대사길항물질, 효소, 생물학적 반응 변형제, 기타 제제, 호르몬 및 길항제, 안드로겐 저해제 (예컨대, 플루타미드 및 류프롤리드 아세테이트), 항에스트로겐 (예컨대, 타목시펜 시트레이트 및 이의 유사체, 토레미펜, 드롤록시펜 및 롤록시펜)을 포함한다. 구체적인 항증식제의 추가 예는 레바미솔, 갈륨 니트레이트, 그라니세트론, 사르그라모스팀 스트론튬-89 클로라이드, 필그라스팀, 필로카르핀, 덱스라족산 및 온단세트론을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
본 발명의 화합물은 단독으로 또는 세포독성제/항신생물제 및 항혈관신생제를 비롯한 다른 항종양제와 조합하여 투여될 수 있다. 세포독성제/항신생물제는 암세포를 공격하여 사멸시키는 작용제로서 정의된다. 일부 세포독성제/항신생물제는 종양 세포에서 유전자 물질을 알킬화하는 알킬화제, 예컨대 시스-플라틴, 사이클로포스파미드, 니트로겐 머스타드, 트라이메틸렌 티오포스포라미드, 카르무스틴, 부술판, 클로르암부실, 벨루스틴, 우라실 머스타드, 클로마파진 및 다카바진이다. 다른 세포독성제/항신생물제는 종양 세포에 대한 대사길항물질, 예컨대 시토신 아라비노시드, 플루오로우라실, 메토트렉세이트 메르캅토푸린, 아자티오프림 및 프로카바진이다. 다른 세포독성제/항신생물제는 항생물질, 예컨대 독소루비신, 블레오마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 미트라마이신, 미토마이신, 마이토마이신 C 및 다우노마이신이다. 이들 화합물에 대해 상업적으로 입수 가능한 다수의 리포솜 제형이 존재한다. 또 다른 세포독성제/항신생물제는 유사분열 저해제 (빈카알카로이드)이다. 이것은 빈크리스틴, 빈블라스틴 및 에토포시드를 포함한다. 기타의 세포독성제/항신생물제는 탁솔 및 이의 유도체, L-아스파라기나제, 항-종양 항체, 다카바진, 아자시티딘, 암사크린, 멜팔란, VM-26, 이포스파미드, 미토크산트론 및 빈데신을 포함한다.
항혈관신생제는 당업자에게 널리 공지되어 있다. 본 발명의 방법 및 조성물에 사용하기에 적합한 항혈관신생제는 항-VEGF 항체, 예컨대, 인간화된 및 키메라 항체, 항-VEGF 압타머 및 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 다른 공지된 혈관신생의 저해제는 안지오스타틴, 엔도스타틴, 인터페론, 인터류킨 1 (알파 및 베타 포함), 인터류킨 12, 레티노산 및 메탈로프로테이나제-1 및 -2의 조직 저해제 (TIMP-1 및 -2)를 포함한다. 소분자, 예컨대, 토포아이소머라제, 예를 들어, 항혈관신생 활성을 갖는 라족산, 토포아이소머라제 II 저해제가 또한 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물과 조합하여 사용될 수 있는 다른 항암제는 하기를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다: 아시비신; 아클라루비신; 아코다졸 염산염; 아크로닌; 아도젤레신; 알데스류킨; 알트레타민; 암보마이신; 아메탄트론 아세테이트; 아미노글루테티미드; 암사크린; 아나스트로졸; 안트라마이신; 아스파라기나제; 아스페를린; 아자시티딘; 아제테파; 아조토마이신; 바티마스타트; 벤조데파; 바이칼루타미드; 바이산트렌 염산염; 비스나피드 다이메실레이트; 바이젤레신; 블레오마이신 설페이트; 브레퀴나르 나트륨; 브로피리민; 부술판; 칵티노마이신; 칼루스테론; 카라세미드; 카르베티머; 카르보플라틴; 카르무스틴; 카루비신 염산염; 카르젤레신; 세데핑골; 클로람부실; 시롤레마이신; 시스플라틴; 클라드리빈; 크리스나톨 메실레이트; 사이클로포스파미드; 시타라빈; 다카바진; 닥티노마이신; 다우노루비신 염산염; 데시타빈; 덱소르마플라틴; 데자구아닌; 데자구아닌 메실레이트; 다이아지쿠온; 도세탁셀; 독소루비신; 독소루비신 염산염; 드롤록시펜; 드롤록시펜 시트레이트; 드로모스타놀론 프로피오네이트; 두아조마이신; 에다트렉세이트; 에플로르니틴 염산염; 엘사미트루신; 엔로플라틴; 엔프로메이트; 에피프로피딘; 에피루비신 염산염; 에르불로졸; 에소루비신 염산염; 에스트라무스틴; 에스트라무스틴 포스페이트 나트륨; 에타니다졸; 에토포시드; 에토포시드 포스페이트; 에토프린; 파드로졸 염산염; 파자라빈; 펜레티나이드; 플록스우리딘; 플루다라빈 포스페이트; 플루오로우라실; 플루오로시타빈; 포스퀴돈; 포스트리신 나트륨; 겜시타빈; 겜시타빈 염산염; 하이드록시우레아; 이다루비신 염산염; 이포스파미드; 일모포신; 인터류킨 II (재조합 인터류킨 II 또는 rIL2 포함), 인터페론 알파-2a; 인터페론 알파-2b; 인터페론 알파-n1; 인터페론 알파-n3; 인터페론 베타-I a; 인터페론 감마-I b; 이프로플라틴; 이리노테칸 염산염; 란레오티드 아세테이트; 레트로졸; 류프롤리드 아세테이트; 리아로졸 염산염; 로메트렉솔 나트륨; 로무스틴; 로소크산트론 염산염; 마소프로콜; 마이탄신; 메클로레타민 염산염; 메게스트롤 아세테이트; 말렌게스트롤 아세테이트; 멜팔란; 메노가릴; 메르캅토푸린; 메토트렉세이트; 메토트렉세이트 나트륨; 메토프린; 메투레데파; 미틴도미드; 미토카르신; 미토크로민; 미토길린; 미토말신; 미토마이신; 미토스퍼; 미토탄; 미토크산트론 염산염; 미코페놀산; 노코다졸; 노갈라마이신; 오르마플라틴; 옥시수란; 파클리탁셀; 페가스파르가제; 펠리오마이신; 펜타무스틴; 페플로마이신 설페이트; 퍼포스파미드; 피포브로만; 피포설판; 피로크산트론 염산염; 플라카마이신; 플로메스탄; 포르피머 나트륨; 포르피로마이신; 프레드니무스틴; 프로카바진 염산염; 푸로마이신; 푸로마이신 염산염; 피라조퓨린; 리보프린; 로글레티미드; 사핑골; 사핑골 염산염; 세무스틴; 심트라젠; 스파르포세이트 나트륨; 스파르소마이신; 스피로게르마늄 염산염; 스피로무스틴; 스피로플라틴; 스트렙토니그린; 스트렙토조신; 술로페누르; 탈리소마이신; 테코갈란 나트륨; 테가푸어; 텔로크산트론 염산염; 테모포르핀; 테니포시드; 테록시론; 테스톨락톤; 티아미프린; 티오구아닌; 티오테파; 티아조퓨린; 티라파자민; 토레미펜 시트레이트; 트레스톨론 아세테이트; 트라이시리빈 포스페이트; 트라이메트렉세이트; 트라이메트렉세이트 글루쿠로네이트; 트립토렐린; 투불로졸 염산염; 우라실 머스타드; 우레데파; 바프레오티드; 베르테포르핀; 빈블라스틴 설페이트; 빈크리스틴 설페이트; 빈데신; 빈데신 설페이트; 비네피딘 설페이트; 빈글리시네이트 설페이트; 빈류로신 설페이트; 비노렐빈 타르트레이트; 빈로시딘 설페이트; 빈졸리딘 설페이트; 보로졸; 제니플라틴; 지노스타틴; 조루비신 염산염. 다른 항암제는 하기를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다: 20-에피-1,25-다이하이드록시비타민 D3; 5-에티닐우라실; 아비라테론; 아클라루비신; 아실푹벤; 아데시페놀; 아도젤레신; 알데스류킨; ALL-TK 길항제; 알트레타민; 암바무스틴; 아미독스; 아미포스틴; 아미노레불린산; 암루비신; 암사크린; 아나그렐리드; 아나스트로졸; 안드로그라폴리드; 혈관형성 저해제; 길항제 D; 길항제 G; 안타렐릭스; 등지느러미 형성 방지 형태발생 단백질-1; 항안드로겐, 전립선 암종; 항에스트로겐; 항네오플라스톤; 안티센스 올리고뉴클레오타이드; 아피디콜린 글리시네이트; 아폽토시스 유전자 조절제; 아폽토시스 조절제; 아푸린산; 아라-CDP-DL-PTBA; 아르기닌 탈아민효소; 아술라크린; 아타메스탄; 아트리무스틴; 악시나스타틴 1; 악시나스타틴 2; 악시나스타틴 3; 아자세트론; 아자톡신; 아자티로신; 바카틴 III 유도체; 발라놀; 바티마스타트; BCR/ABL 길항제; 벤조클로린스; 벤조일스타우로스포린; 베타 락탐 유도체; 베타-알레틴; 베타클라마이신 B; 베툴린산; bFGF 저해제; 바이칼루타미드; 비스안트렌; 비스아지리디닐스퍼민; 비스나피드; 비스트라텐 A; 바이젤레신; 브레플레이트; 브로피리민; 부도티탄; 부티오닌 설폭스이민; 칼시포트라이올; 칼포스틴 C; 캄프토테신 유도체; 카나리폭스 IL-2; 카페시타빈; 카르복스아마이드-아미노-트라이아졸; 카르복시아미도트라이아졸; CaRest M3; CARN 700; 연골 유도 저해제; 카르젤레신; 카제인 카이나제 저해제 (ICOS); 카스타노스퍼민; 세크로핀 B; 세트로렐릭스; 클로린스; 클로로퀴녹살린 설폰아마이드; 시카프로스트; 시스-포르피린; 클라드리빈; 클로미펜 유사체; 클로트리마졸; 콜리스마이신 A; 콜리스마이신 B; 콤브레타스타틴 A4; 콤브레타스타틴 유사체; 코나게닌; 크람베시딘 816; 크리스나톨; 크립토피신 8; 크립토피신 A 유도체; 쿠라신 A; 사이클로펜타아트라퀴논; 사이클로플라탐; 사이페마이신; 시타라빈 옥포스페이트; 세포용해 인자; 사이토스타틴; 다클릭시맙; 데시타빈; 데하이드로다이데민 B; 데스로렐린; 덱사메타손; 덱시포스파미드; 덱스라족산; 덱스베라파밀; 다이아지쿠온; 다이뎀닌 B; 다이독스; 다이에틸노르스퍼민; 다이하이드로-5-아자시티딘; 다이하이드로탁솔, 9-; 다이옥사마이신; 다이페닐 스피로무스틴; 도세탁셀; 도코산올; 돌라스테론; 독시플루리딘; 드롤록시펜; 드로나비놀; 두오카르마이신 SA; 엡셀렌; 에코무스틴; 에델포신; 에드레콜로맙; 에플로르니틴; 엘레멘; 에미테푸르; 에피루비신; 에프리스테리드; 에스타르무스틴 유사체; 에스트로겐 효능제; 에스트로겐 길항제; 에타니다졸; 에토포시드 포스페이트; 엑세메스탄; 파드로졸; 파자라빈; 펜레티니드; 필그라스팀; 피나스테리드; 플라보피리돌; 플레젤라스틴; 플루아스테론; 플루다라빈; 플루오로다우노루니신 염산염; 포르페니멕스; 포르메스탄; 포스트라이에신; 포테무스틴; 가돌리늄 텍사피린; 갈륨 니트레이트; 갈로시타빈; 가니렐릭스; 젤라티나제 저해제; 겜시타빈; 글루타티온 저해제; 헵설팜; 헤레굴린; 헥사메틸렌 비스아세타미드; 하이페리신; 이반드론산; 이다루비신; 이독시펜; 이드라만톤; 일모포신; 일롬스타트; 이미다조아크리돈; 이미퀴모드; 면역자극 펩타이드; 인슐린-유사 성장 인자-1 수용체 저해제; 인터페론 효능제; 인터페론; 인터류킨; 이오벵구안; 요오도옥소루비신; 이포메안올, 4-; 이로플락트; 이르소글라딘; 아이소벵가졸; 아이소호모할리콘드린 B; 이타세트론; 자스플라키놀리드; 카할라라이드 F; 라멜라린-N 트라이아세테이트; 란레오티드; 레이나마이신; 레노그라스팀; 렌티난 설페이트; 렙톨스타틴; 레트로졸; 백혈병 저해 인자; 백혈구 알파 인터페론; 류프롤리드+에스트로겐+프로게스테론; 류프로렐린; 레바미솔; 리알로졸; 선형 폴리아민 유사체; 친유성 이당 펩타이드; 친유성 백금 화합물; 리소클린아마이드 7; 로바플라틴; 롬브리신; 로메트렉솔; 로니다민; 로소크산트론; 로바스타틴;록소리빈; 루르토테칸; 류테튬 텍사피린; 리소필린; 용해성 펩타이드; 마이탄신; 만노스타틴 A; 마리마스타트; 마소프로콜; 마스핀; 마트릴신 저해제; 매트릭스 메탈로프로테이나제 저해제; 메노가릴; 메르바론; 메테렐린; 메티오니나제; 메토클로프라미드; MIF 저해제; 미페프리스톤; 밀테포신; 미리모스팀; 미스매치된 이중 가닥 RNA; 미토구아존; 미토락톨; 미토마이신 유사체; 미토나피드; 미토톡신 섬유모세포 성장 인자-사포린; 미토크산트론; 모파로텐; 몰그라모스팀; 단클론성 항체, 인간 융모성 고나도트로핀; 모노포스포릴 지질 A+미오박테리움 세포벽 sk; 모피다몰; 다제 내성 유전자 저해제; 다발성 종양 저해제 1-기저 요법; 머스타드 항암제; 미카퍼옥사이드 B; 미코박테리아 세포벽 추출물; 미리아포론; N-아세틸다이날린; N-치환된 벤즈아마이드; 나파렐린; 나그레스팁; 날록손+펜타조신; 나파빈; 나프테르핀; 나르토그라스팀; 네다플라틴; 네모루비신; 네리드론산; 중성 엔도펩티다제; 닐루타미드; 니사마이신; 질소 산화물 조절제; 니트록시드 항산화제; 니트룰린; O6-벤질구아닌; 옥트레오티드; 오키세논; 올리고뉴클레오타이드; 오나프리스톤; 온단세트론; 온단세트론; 오라신; 경구용 사이토카인유도제; 오르마플라틴; 오사테론; 옥살리플라틴; 옥사우노마이신; 파클리탁셀; 파클리탁셀 유사체; 파클리탁셀유도체; 팔라우아민; 팔미토일리족신; 파미드론산; 파낙시트라이올; 파노미펜; 파라박틴; 파젤립틴; 페가스파르가제; 펠데신; 펜토산 폴리설페이트 나트륨; 펜토스타틴; 펜트로졸; 퍼플루브론; 퍼포스파미드; 페릴릴 알코올; 페나지노마이신; 페닐아세테이트; 포스파타제 저해제; 피시반일; 필로카르핀 염산염; 피라루비신; 피리트렉심; 플라세틴 A; 플라세틴 B; 플라스미노겜 활성화제 저해제; 백금 복합체; 백금 화합물; 백금-트라이아민 복합체; 포르피머 나트륨; 포르피로마이신; 프레드니손; 프로필 비스-아크리돈; 프로스타글란딘 J2; 프로테아좀 저해제;단백질 A-기저 면역 조절제; 단백질 카이나제 C 저해제; 단백질 카이나제 C 저해제; 마이크로알갈; 단백질 티로신 포스파타제 저해제; 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라제 저해제; 푸르푸린; 피라졸로아크리딘; 피리독실화된 헤모글로빈 폴리옥시에틸렌 콘쥬게이트; raf 길항제; 랄티트렉세드; 라모세트론; ras 파르네실 단백질 트랜스퍼라제 저해제; ras 저해제; ras-GAP 저해제; 탈메틸화된 레텔리프틴; 레늄 Re 186 에티드로네이트; 리족신; 리보자임; RII 레틴아마이드; 로글레티미드; 로히투킨; 로무르티드; 로퀴니멕스; 루비기논 B1; 루복실; 사핑골; 사인토핀; SarCNU; 사르코피톨 A; 사르그라모스팀; Sdi 1 모방체; 세무스틴; 세네센 유도된 저해제 1; 센스 올리고뉴클레오타이드; 신호 변환 저해제; 신호 변환 조절제; 단일 사슬 항원 결합 단백질; 시조푸란; 소부족산; 나트륨보로캅테이트; 나트륨 페닐아세테이트; 솔베롤; 소마토메딘 결합 단백질; 소네르민; 스파르포스산; 스피카마이신 D; 스피로무스틴; 스플레노펜틴; 스폰지스타틴 1; 스쿠알라민; 줄기세포 저해제; 줄기세포 분할 저해제; 스티피아마이드; 스트로멜리신 저해제; 설피노신; 과활성 혈관작용성 장 펩타이드 길항제; 수라디스타; 수라민; 스와인소닌; 합성 글리코사미노글리칸; 탈리무스틴; 타목시펜 메티오다이드; 타우로무스틴; 타자로텐; 테코갈란 나트륨; 테가푸어; 텔루라피릴륨; 텔로머라제 저해제; 테모포르핀; 테모졸로미드; 테니포시드; 테트라클로로데카옥사이드; 테트라조민; 탈리블라스틴; 티오코랄린; 트롬보포이에틴; 트롬보포이에틴 모방체; 티말파신; 티모포이에틴 수용체 효능제; 티모트리난; 갑상선 자극 호르몬; 주석 에틸 에티오푸르푸린; 티라파자민; 티타노센 바이클로라이드; 토프센틴; 토레미펜; 분화전능성 줄기세포 인자; 번역 저해제; 트레티노인; 트라이아세틸우리딘; 트라이시리빈; 트라이메트렉세이트; 트라이프토렐린; 트로피세트론; 투로스테리드; 티로신 카이나제 저해제; 티르포스틴; UBC 저해제; 우베니멕스; 비뇨생식기 공동-유도된 성장 억제 인자; 유로카이나제 수용체 길항제; 바프레오티드; 바리올린 B; 벡터 시스템, 적혈구 유전자요법; 벨라레솔; 베라민; 베르딘스; 베르테포르핀; 비노렐빈; 빈크살틴; 비탁신; 보로졸; 자노테론; 제니플라틴; 질라스코브; 및 지노스타틴 스티말라머. 일 구체예에서, 항암 약물은 5-플루오로우라실, 탁솔 또는 류코보린이다.
본 발명은 다음의 실시예에서 추가로 예시된다. 이들 실시예는 본 발명의 바람직한 실시형태를 나타내지만, 당지 예시의 방법으로 제공된다는 것이 이해되어야 한다. 상기 논의 및 이들 실시예로부터, 당업자는 본 발명의 필수적 특징을 확인할 수 있고, 그리고 이의 정신과 범주로부터 벗어나는 일 없이, 본 발명의 다양한 변화 및 변형이 다양한 용법 및 조건에 적합하게 되도록 만들 수 있다. 따라서, 본 명세서에 나타내고 기재된 것에 추가로 본 발명의 다양한 변형은 앞서 언급한 설명으로부터 당업자에게 명확하게 될 것이다. 이러한 변형은 또한 첨부하는 청구범위의 범주 내에 속하는 것으로 의도된다.
11. 실시예
실시예 1
DNA로 암호화된 항체를 사용하여 관문 봉쇄 전달 간소화
CTLA-4 차단 및 PD-1 차단은 전임상 마우스 모델과 환자에서 시너지 효과 및 비-중복성을 입증하였다. 이러한 면역 관문 경로의 중복성이 없기 때문에 니볼루맙과 이필리무맙의 병용 요법은 단독 요법과 비교하여 전체 생존 및 무진행 생존을 포함한 개선된 효능을 가져왔고 2015년 진행성 흑색종에 대한 이 병용 요법에 대한 FDA 승인을 받았다.
DMAb 전달은 관문 봉쇄를 포함한 항체 요법 및 조합을 단순화하고 훨씬 더 많은 인구가 사용할 수 있도록 한다. 암 치료를 위한 DMAb의 임상 개발이 필요하다.
다양한 항-PD-1 항체 (펨브롤리주맙 및 니볼루맙)의 서열을 수정하여 결합 능력과 기능을 유지하면서 발현을 최적화하였다 (도 1 및 표 1). 항-PD-1 및 항-CTLA4 항체를 암호화하는 최적화된 DMAb 플라스미드는 관문 봉쇄 요법의 투여 및 체제를 단순화할 뿐만 아니라 3 주마다 투여되는 90분 정맥 주사를 단일 근육 주사로 전환한다. DMAb는 또한 단일 근육내 주사로 항-CTLA4 및 항-PD-1 조합을 투여하거나 DNA 백신으로서 다른 요법과의 조합을 허용하여 조합 요법을 단순화할 것이다.
Figure pct00001
여기에 인용된 각각의 모든 특허, 특허 출원 및 간행물의 개시 내용은 그 전체가 참고로 여기에 포함된다.
본 발명이 특정 구체예를 참조하여 개시되었지만, 본 발명의 진정한 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 본 발명의 다른 실시예 및 변형이 당업자에 의해 고안될 수 있음이 명백하다. 첨부된 청구범위는 이러한 모든 실시예 및 등가 변형을 포함하는 것으로 해석되도록 의도된다.
<110> The Wistar Institute of Anatomy and Biology <120> DNA MONOCLONAL ANTIBODIES TARGETING PD-1 FOR THE TREATMENT AND PREVENTION OF CANCER <130> MPI21-014 <150> US 62/791,146 <151> 2019-01-11 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 733 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically Synthesized, Pembro hIgG4 DMAb original <400> 1 Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Thr His Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asn Tyr Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn 65 70 75 80 Glu Lys Phe Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr 115 120 125 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 130 135 140 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser 145 150 155 160 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 165 170 175 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 180 185 190 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 195 200 205 Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val 210 215 220 Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys 225 230 235 240 Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly 245 250 255 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 260 265 270 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu 275 280 285 Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 290 295 300 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg 305 310 315 320 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 325 330 335 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu 340 345 350 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 355 360 365 Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 370 375 380 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 385 390 395 400 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 405 410 415 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp 420 425 430 Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 435 440 445 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu 450 455 460 Gly Lys Arg Gly Arg Lys Arg Arg Ser Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe 465 470 475 480 Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met 485 490 495 Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser Gly 500 505 510 Ala Tyr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu 515 520 525 Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val 530 535 540 Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 545 550 555 560 Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly 565 570 575 Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 580 585 590 Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln 595 600 605 His Ser Arg Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu 610 615 620 Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser 625 630 635 640 Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn 645 650 655 Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala 660 665 670 Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys 675 680 685 Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp 690 695 700 Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu 705 710 715 720 Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 725 730 <210> 2 <211> 733 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically Synthesized, Pembro hIgG4 DMAb mod 1 <400> 2 Met Asp Trp Thr Trp Arg 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cgcgaggcca aggtgcagtg gaaggtggac aacgccctgc agagcggcaa ttcccaggag 2040 tctgtgaccg agcaggacag caaggattcc acatattctc tgagctccac cctgacactg 2100 agcaaggccg actacgagaa gcacaaggtg tatgcctgcg aggtgaccca tcaggggctg 2160 tccagtccag tgaccaagtc cttcaataga ggcgaatgct gataa 2205 <210> 9 <211> 2205 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically Synthesized, Pembro hIgG4 DMAb mod 2 <400> 9 atggactgga catggagaat cctgttcctg gtcgccgccg caaccgggac tcacgccgaa 60 gtgcagctgg tgcagagtgg ggtcgaagtg aagaagcccg gcgccagcgt gaaggtgtcc 120 tgcaaggcct ctggctacac attcaccaac tactatatgt attgggtgcg gcaggcacca 180 ggacagggcc tggagtggat gggcggcatc aaccccagca atggcggaac caacttcaat 240 gagaagttta agggccgcgt gacactgacc acagatagct ccaccacaac cgcctacatg 300 gagctgaagt ccctgaggtt cgacgatacc gccgtgtact attgtgccag gagagactac 360 agattcgata tgggctttga ctattggggc cagggcacaa ccgtgaccgt gtctagcgcc 420 agcacaaagg gcccttccgt gtttcctctg gccccatgct ctcggagcac ctccgagtct 480 acagccgccc tgggctgtct ggtgaaggac tacttccctg agccagtgac cgtgtcttgg 540 aatagcggcg ccctgacctc tggcgtgcac acatttccag ccgtgctgca gtcctctggc 600 ctgtactccc tgagctccgt ggtgaccgtg ccttctagct ccctgggcac aaagacctat 660 acatgcaacg tggatcacaa gccaagcaat acaaaggtgg acaagagggt ggagtccaag 720 tacggccctc cctgcccttc ttgtccagca cctgagttcc tgggcggccc atccgtgttc 780 ctgtttccac ccaagcctaa ggatacactg atgatctcca gaacccccga ggtgacatgc 840 gtggtggtgg acgtgagcca ggaggaccct gaggtgcagt tcaactggta cgtggacggc 900 gtggaggtgc acaatgccaa gaccaagcca cgggaggagc agtttaactc tacctaccgc 960 gtggtgagcg tgctgacagt gctgcaccag gattggctga acggcaagga gtataagtgc 1020 aaggtgagca ataagggcct gccctctagc atcgagaaga ccatctccaa ggcaaaggga 1080 cagccccgcg agcctcaggt gtacacactg cctccatctc aggaggagat gaccaagaac 1140 caggtgagcc tgacatgtct ggtgaagggc ttctatccta gcgatatcgc cgtggagtgg 1200 gagtccaatg gccagccaga gaacaattac aagacaaccc ctcccgtgct ggactccgat 1260 ggctctttct ttctgtatag caggctgacc gtggacaagt ccagatggca ggagggcaac 1320 gtgtttagct gctccgtgat gcacgaggcc ctgcacaatc actacaccca 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tggataaatc tagatggcag gagggaaacg tctttagctg ctccgtgatg 1320 cacgaagccc tgcacaatca ttacacccag aagtctctga gtctgtcact gggaaagcga 1380 ggacgaaaaa ggagaagcgg ctccggagcc acaaacttca gcctgctgaa gcaggctggc 1440 gacgtggagg aaaatccagg acccatggtc ctgcagactc aggtgtttat ctctctgctg 1500 ctgtggatta gtggcgccta cggagagatc gtgctgactc agtcccctgc taccctgtct 1560 ctgagtccag gcgaacgcgc aaccctgtct tgtcgagcct cacagagcgt gtcctcttac 1620 ctggcatggt atcagcagaa gccaggacag gcccccaggc tgctgatcta tgatgccagc 1680 aaccgggcta cagggattcc tgcacgcttc tccgggtctg gcagtggaac tgactttact 1740 ctgaccatta gttcactgga gcccgaagat ttcgccgtgt actattgcca gcagagctcc 1800 aattggccta gaacatttgg gcagggcact aaggtggaga tcaaacggac tgtcgcagcc 1860 cccagcgtgt tcatctttcc accctcagac gaacagctga agtccggaac cgcctctgtg 1920 gtgtgcctgc tgaacaattt ctaccctaga gaggctaagg tccagtggaa agtggataac 1980 gcactgcaga gtgggaattc acaggagagc gtgaccgaac aggactccaa ggattctaca 2040 tatagtctgt ctagtacact gactctgagc aaagccgact acgagaagca taaagtgtat 2100 gcttgcgagg tcacccacca ggggctgtca agtccagtca caaagtcctt caatagggga 2160 gaatgttgat aa 2172

Claims (17)

  1. 하나 이상의 항-PD-1 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는, 대상체에서 하나 이상의 항-세포예정사 단백질 1 (PD-1) 항체 또는 이의 단편을 생성하기 위한 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 절단 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항체의 가변 중쇄 영역 및 가변 경쇄 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 불변 중쇄 영역을 포함하는 폴리펩타이드 및 불변 경쇄 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 가변 중쇄 영역; 불변 중쇄 영역; 절단 도메인; 가변 경쇄 영역; 및 불변 경쇄 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 리더 서열을 암호화하는, 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 및 6의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 서열번호 7, 8, 9, 10, 11, 및 12의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 80% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 핵산 분자는 발현 백터 내에 존재하도록 조작된, 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 항원을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 더 포함하는, 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 항원은 암 항원인, 조성물.
  12. 제9항에 있어서, 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 더 포함하는, 조성물.
  13. 대상체에서 질환을 치료하는 방법으로서, 상기 대상체에게 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 질환을 치료하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 질환은 암인, 방법.
  15. 면역 반응의 증가를 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 증가시키는 방법으로서, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 면역 반응을 증가시키는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 조성물을 투여하는 단계는 전기천공 단계를 포함하는, 방법.
  17. 제15항에 있어서, 상기 항원을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 후속 단계를 더 포함하는, 방법.
KR1020217025378A 2019-01-11 2020-01-13 암의 치료 및 예방을 위한 pd-1을 표적으로 하는 dna 단클론성 항체 KR20210114976A (ko)

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