KR20210105921A - 보체 인자 i 및 보체 인자 i 보조인자, 이를 인코딩하는 벡터 및 치료 용도 - Google Patents
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Abstract
치료법에서 동시, 개별 또는 순차적 사용을 위한 조합 제제로서, (i) 보체 인자 I(CFI) 보조인자; 및 (ii) 보체 인자 I(CFI), 또는 이를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제품.
Description
본 발명은 유전자 치료법에 사용하기 위한 작용제에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 보체 인자 I(Complement Factor I: CFI) 및 CFI 보조인자(cofactor), 예컨대, 보체 인자 H-유사 단백질 1(Complement Factor H-like Protein 1: FHL1)의 조합, 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 보체-매개 안질환, 예컨대, 연령-관련 황반 변성(AMD)을 포함하여 보체-매개 및 보체-연관 장애의 치료 또는 예방에 있어서 이들의 용도에 관한 것이다.
황반은 시신경에 인접한 크기가 대략 3 내지 5 밀리미터인 눈의 망막에 있는 작은 영역이다. 이는 망막의 가장 민감한 영역으로 높은 시력을 가능하게 하고, 색각을 담당하는 광수용체인 원추세포를 밀집 농도로 포함하는 움푹 패인 영역인 중심와를 포함한다.
연령-관련 황반 변성(AMD)은 나이가 50세를 넘는 사람에 대하여 선진국에서 기능적 실명의 가장 흔한 원인이다(Seddon, J.M., Epidemiology of age-related macular degeneration. In: Ogden, T.E., et al., eds. Ryan S.J., ed-in-chief. Retina Vol II. 3rd ed. St. Louis, Mo.: Mosby; 2001: 1039-1050). AMD는 맥락막 맥관구조로부터 비롯되어 망막하 공간으로 확장되는 신생혈관과 연관이 있다. 추가적으로, AMD는 망막, 망막색소상피(RPE), 및 기저 맥락막(망막과 공막 사이에서, RPE 아래에 있는 고도의 혈관 조직)의 진행성 퇴행을 특징으로 한다.
산화 스트레스, 가능한 자가면역 성분이 있는 염증, 유전적 배경(예를 들어, 돌연변이), 및 흡연 및 식이와 같은 환경적 또는 행동적 요인을 포함한 다양한 요인이 AMD의 발병에 기여할 수 있다.
AMD의 임상적 진행은 황반의 변화에 따라 단계적으로 특징지어진다. 초기 AMD의 특징은 드루젠의 출현으로서, 상기 드루젠은 망막 아래에 세포외 파편의 축적물이며 임상 검사 동안 및 안저 사진 상에서 망막에 황색 반점으로 보인다. 드루젠은 크기에 따라 소형(< 63㎛), 중형(63 내지 124㎛) 및 대형(> 124㎛)으로 분류된다. 또한 드루젠은 안 검사시 가장자리의 외관에 따라서 경성 또는 연성으로 간주된다. 경성 드루젠은 명확하게 한정된 가장자리를 갖는 반면, 연성 드루젠은 덜 한정된 유동적인 가장자리를 갖는다. 연령-관련 안질환 연구(Age-related Eye Disease Study; AREDS) 안저 촬영 중증도 척도는 이 병태에서 사용되는 주요 분류 시스템 중 하나이다.
중기 AMD는 대형 드루젠 및/또는 임의의 망막 색소 이상에 의해 진단된다. 중기 AMD는 약간의 시야 손실을 유발할 수 있지만, 초기 AMD와 마찬가지로, 보통 증상이 없다.
후기 AMD는 "건성"과 "습성"(삼출성 또는 신생혈관) 형태로 분류되었다. 건성 AMD는 습성 AMD보다 더 흔하지만, 건성 형태는 습성 형태로 진행될 수 있으며, 상기 2갖는 상당수의 경우에 동시에 일어난다. 건성 AMD는 전형적으로 RPE 층의 세포와 그 위에 있는 광수용체 세포, 그리고 또한 종종 맥락막 모세혈관 층의 기저 세포의 점진적인 아포토시스를 특징으로 한다. 위에 있는 광수용체 위축을 동반하는 RPE 세포 사멸의 합류 영역은 지도모양 위축(GA)으로 지칭된다. 이러한 형태의 AMD(진행된 건조 형태)가 있는 환자는 중심시에서 느리고 점진적인 악화를 경험한다.
습성 AMD는 RPE와 황반 아래의 맥락막 혈관(맥락막모세혈관층(choriocapillaris))으로부터 성장한 비정상적인 혈관으로부터의 출혈 및/또는 체액 누출을 특징으로 하며, 이는 갑작스럽고 장애를 입히는 시야 손실의 원인이 될 수 있다. 환자가 경험하는 시야 손실의 많은 부분은 이와 같은 맥락막 신생혈관(CNV) 및 이의 2차 합병증으로 인한 것으로 추정된다. 신생혈관 AMD의 아형은 망막 혈관종성 증식(RAP)이라 한다. 여기서, 혈관종성 증식은 망막에서 비롯되어, 망막하 공간으로 뒤쪽으로 확장되고, 궁극적으로 일부 경우에 맥락막의 새로운 혈관과 연통된다.
보체 시스템(CS)은 AMD 환자의 눈 유래의 드루젠에서 CS 성분의 식별을 기반으로 초기 AMD 발병기전에 연루되어 있다. AMD에서, 다양한 아포지질단백질 유형(E, B 또는 A-I), 여러 가지 아밀로이드 펩타이드(P, Aβ 또는 SA-1), TIMP-3, 혈청 알부민, 및 세포 기능과 연관된 특정 단백질(예를 들어, ATP 합성효소 β 서브유닛, 스캐빈저 수용체 B2 및 레티놀 탈수소효소)을 포함하여 적어도 129가지 유형의 드루젠-침착 단백질이 식별되었다. AMD-유래 드루젠은 또한 조절 단백질(CFH, 보체 수용체 1(CR1), 비트로넥틴 및 클루스테린), CS 활성화 및 분해 생성물(C1q, C3, C3a, C3b 및 C5a), 및 MAC 성분을 포함하는 말단 CS 경로의 구성원(즉, 5, 6, 8(α, β 및 γ) 및 9)을 포함한 거의 모든 보체 단백질을 분리 및 복합체 형태로 포함한다. 드루젠의 축적은 CS를 활성화시키고, 염증 매개체의 국소 생성을 촉발하며, 백혈구를 끌어당겨 결국 AMD에 존재하는 국소 염증 상태를 증가시킬 수 있다.
AMD에 대한 현재 치료 옵션은 벤조포르피린을 이용하는 광역동 치료법(photodynamic therapy)(Arch Ophthalmol (1999) 117: 1329-1345) 및 혈관내피성장인자(VEGF) 경로를 표적으로 하는 다수의 치료법을 포함한다. 이와 같은 VEGF-표적화 치료법의 예는 라니비주맙(ranibizumab)(Lucentis™로서 시판됨, Genentech, Inc.) 및 베바시주맙(bevacizumab)(Avastin™, Genentech, Inc.) 및 애플리버셉트(aflibercept)(Eylea™, Bayer)와 같은 항체를 포함한다. 그러나, 이들 항-VEGF 항체 치료법은 매우 효과적이었지만, 모든 AMD 환자의 대략 10 내지 15%를 차지하는 AMD의 습성 또는 신생혈관 형태의 치료에 대해서만 승인을 받았다. 항체 치료법은 수술실 또는 무균실에서 매달 유리체내 주사로 투여되며, 이는 전형적으로 노인인 환자에게 부담을 준다.
현재 AMD의 초기 단계 또는 진행된 (건성) 형태에 대해 승인된 치료법은 없다.
보체 시스템은 다수의 염증성 질환의 치료에 대해 충분히 입증된 표적이다. 과민성 또는 부적절하게 기능하는 보체 시스템은 AMD를 포함한 다수의 만성 염증성 병태의 병리에 연루되어 있다(Nature Reviews (2015) 14: 857-877). 그 결과, C3b 피드백을 감소시키거나 C3b 분해를 증가시키는 수단으로 대체 경로 증폭 루프/C3b 피드백 사이클을 표적으로 하는 몇 가지 보체-표적화 치료법이 제안되었거나, 현재 개발 중에 있다(도 1).
람팔리주맙(Lampalizumab)(Genentech/Roche)은 보체 인자 D를 억제하는 인간화 단클론성 항체로, 지도모양 위축의 진행 속도를 정지시키기 위해 매달 유리체내 주사로 투여된다. 람팔리주맙은 2상 임상 시험에서 지도모양 위축 확대 속도의 일부 감소를 나타내었다. 그러나, 906명의 참가자를 포함하는 III상 무작위 임상 시험에서, 람팔리주맙은 48주에 걸친 허위군과 비교할 때 GA 확대를 감소시키지 못하였다. 결과는 연간 평균 대략 2 ㎟로 GA의 실질적이고 일관된 확대를 나타내었다.
그러나, 보체 매개 또는 보체 연관 질환, 특히 안질환, 예컨대, AMD의 치료, 특히 광범위한 AMD 집단에서 효과적이며 개인을 AMD 및 다른 보체-관련 장애에 취약하게 만들 수 있는 특정 유전자형에 제한되지 않는 치료를 위하여 대체 요법에 대한 필요성이 여전히 남아 있다.
본 출원인은 과민성 보체 C3b 피드백 사이클의 복원 또는 재조정을 위해 환자에게 전달하기 위한 보체 인자 I(CFI) 및 CFI 보조인자(C3b의 CFI-매개 절단에서 보조인자 활성을 갖는 단백질, 예컨대, 보체 인자 H 유사 단백질 1(FHL1), 보체 인자 H(CFH), 보체 수용체 유형 1(CR1) 및 막 보조인자 단백질(Membrane Cofactor Protein: MCP))의 치료 조합을 확인하였다. 조합은 C3b 분해(및 과민성 보체 시스템의 하향조절)에서 CFI의 최대 활성을 보장하기 위해 보조인자가 CFI에 대한 화학량론적 과량으로 제공되는 것을 보장하는 몰비로 CFI 및 CFI 보조인자를 제공한다. 이는 특정 보체 시스템 단백질에 유전적 결함이 있을 수 있는 환자, 및/또는 예를 들어, 눈 또는 신장에서, 전신 수준과 비교하여 보조인자 수준이 감소될 수 있는 조직 또는 기관에 투여되는 치료법에 대하여 중요하다.
추가적으로, 본 출원인은 환자에게 CFI 및 CFI 보조인자(예를 들어, FHL1)의 전달 및 공동발현에 사용될 수 있는 바이시스트로닉(bicistronic) 벡터를 제공하였다. 특히, 본 출원인은 우수한 역가로 생산될 수 있고 CFI 및 보조인자를 둘 다 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있는 기능성 AAV 벡터를 성공적으로 설계하여, AAV의 제한된 용량으로 인해 제기된 문제를 극복하였다. 본 발명의 바이시스트로닉 벡터는 또한 유리하게는 CFI 및 보조인자 둘 다의 우수한 발현; 및 본 명세서에서 유익한 것으로 확인된 비율로 CFI 및 보조인자의 공동발현을 가능하게 한다.
일 양태에서, 본 발명은 치료법에서 동시, 개별 또는 순차적 사용을 위한 조합 제제로서, (i) 보체 인자 I(CFI) 보조인자; 및 (ii) 보체 인자 I(CFI), 또는 이를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제품을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 치료법에서 동시, 개별 또는 순차적 사용을 위한 조합 제제로서, (i) 보체 인자 H 유사 단백질 1(FHL1) 또는 보체 인자 H(CFH); 및 (ii) 보체 인자 I(CFI), 또는 이를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제품을 제공한다.
특정 실시형태에서, 제품은 보체-매개 장애, 특히 만성 염증성 병태, 훨씬 더 특히 보체 C3b 피드백 사이클의 과다활동과 연관된 것의 치료에 사용된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 보체-매개 장애, 바람직하게는 눈의 보체-매개 장애를 치료 또는 예방함에 있어서 동시, 개별 또는 순차적 사용을 위한 조합 제제로서, (i) 보체 인자 I(CFI) 보조인자; 및 (ii) 보체 인자 I(CFI), 또는 이를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제품을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 눈의 보체-매개 장애를 치료 또는 예방함에 있어서 동시, 개별 또는 순차적 사용을 위한 조합 제제로서, (i) 보체 인자 H 유사 단백질 1(FHL1) 또는 보체 인자 H(CFH); 및 (ii) 보체 인자 I(CFI), 또는 이를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제품을 제공한다.
일부 실시형태에서, 보체 인자 I(CFI) 보조인자는 보체 인자 H 유사 단백질 1(FHL1); 보체 인자 H(CFH); 보체 수용체 1(CR1) 또는 이의 단편; 및 막 보조인자 단백질(MCP) 또는 이의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 보체 인자 I(CFI) 보조인자는 보체 인자 H(CFH)이다. 일부 실시형태에서, 보체 인자 I(CFI) 보조인자는 보체 수용체 1(CR1) 또는 이의 단편이다. 일부 실시형태에서, 보체 인자 I(CFI) 보조인자는 막 보조인자 단백질(MCP) 또는 이의 단편이다.
바람직한 실시형태에서, 보체 인자 I(CFI) 보조인자는 보체 인자 H 유사 단백질 1(FHL1)이다.
바람직한 실시형태에서, 제품은 (i) 보체 인자 H 유사 단백질 1(FHL1); 및 (ii) 보체 인자 I(CFI), 또는 이를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, 제품은 (i) 보체 인자 H(CFH); 및 (ii) 보체 인자 I(CFI), 또는 이를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, 제품은 (i) 보체 수용체 1(CR1) 또는 이의 단편; 및 (ii) 보체 인자 I(CFI), 또는 이를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, 제품은 (i) 막 보조인자 단백질(MCP) 또는 이의 단편; 및 (ii) 보체 인자 I(CFI), 또는 이를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 장애는 보체 C3b 피드백 사이클의 과다활동 및/또는 C3b 분해 사이클의 과소활동과 연관된다(도 1 참조).
일부 실시형태에서, 장애는 눈의 만성 보체-매개 염증성 병태이다.
일부 실시형태에서, 장애는 연령-관련 황반 변성(AMD) 또는 당뇨망막병증이다. 다른 실시형태에서, 장애는 녹내장, 스타르가르트병, 중심성장액맥락망막병증 또는 망막색소변성증이다.
바람직한 실시형태에서, 장애는 AMD이다. 일부 실시형태에서, AMD는 건성 AMD이다.
일부 실시형태에서, 제품은 (i) 및 (ii)를 대상체에게 적어도 2:1, 적어도 3:1, 적어도 4:1, 적어도 5:1, 적어도 6:1, 적어도 7:1, 적어도 8:1, 적어도 9:1, 적어도 10:1, 적어도 15:1, 적어도 20:1, 적어도 25:1, 적어도 30:1, 적어도 40:1, 적어도 50:1 또는 적어도 60:1의 (i):(ii) 몰비로 제공한다.
일부 실시형태에서, 제품은 (i) 및 (ii)를 대상체에게 적어도 2:1의 (i):(ii) 몰비로 제공한다. 일부 실시형태에서, 제품은 (i) 및 (ii)를 대상체에게 적어도 3:1의 (i):(ii) 몰비로 제공한다. 바람직한 실시형태에서, 제품은 (i) 및 (ii)를 대상체에게 적어도 8:1의 (i):(ii) 몰비로 제공한다.
일부 실시형태에서, 제품은 (i) 및 (ii)를 대상체에게 2:1 내지 34:1, 2:1 내지 25:1, 2:1 내지 15:1, 2:1 내지 12:1, 3:1 내지 10:1의 (i):(ii) 몰비로 제공한다.
바람직한 실시형태에서, 제품은 (i) 및 (ii)를 대상체에게 3:1 내지 10:1의 (i):(ii) 몰비로 제공한다.
제공되는 몰비는, 예를 들어, 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터를 대상체에게 전달함으로써 달성될 수 있다. 단백질 수준은 당업계에 알려진 기법, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은, 예컨대, ELISA를 사용하여 당업자에 의해 용이하게 측정될 수 있다. 마찬가지로, 폴리뉴클레오타이드 또는 이를 인코딩하는 벡터로부터 발현되는 단백질의 양은 유사한 접근법을 사용하여 측정될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 (i) 보체 인자 I(CFI) 보조인자; 및 (ii) 보체 인자 I(CFI)를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 (i) 보체 인자 H 유사 단백질 1(FHL1) 또는 보체 인자 H(CFH); 및 (ii) 보체 인자 I(CFI)를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
일부 실시형태에서, 보체 인자 I(CFI) 보조인자는 보체 인자 H 유사 단백질 1(FHL1); 보체 인자 H(CFH); 보체 수용체 1(CR1) 또는 이의 단편; 및 막 보조인자 단백질(MCP) 또는 이의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 보체 인자 I(CFI) 보조인자는 보체 인자 H(CFH)이다. 일부 실시형태에서, 보체 인자 I(CFI) 보조인자는 보체 수용체 1(CR1) 또는 이의 단편이다. 일부 실시형태에서, 보체 인자 I(CFI) 보조인자는 막 보조인자 단백질(MCP) 또는 이의 단편이다.
바람직한 실시형태에서, 보체 인자 I(CFI) 보조인자는 보체 인자 H 유사 단백질 1(FHL1)이다.
바람직한 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 (i) 보체 인자 H 유사 단백질 1(FHL1); 및 (ii) 보체 인자 I(CFI)를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 (i) 보체 인자 H(CFH); 및 (ii) 보체 인자 I(CFI)를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 (i) 보체 수용체 1(CR1) 또는 이의 단편; 및 (ii) 보체 인자 I(CFI)를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 (i) 막 보조인자 단백질(MCP) 또는 이의 단편; 및 (ii) 보체 인자 I(CFI)를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 CMV 프로모터를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 더 포함한다. 바람직하게는, CMV 프로모터는 (i) 및 (ii)를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 상류에 있다.
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 WPRE 조절 요소를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 더 포함한다. 바람직하게는, WPRE 조절 요소는 (i) 및 (ii)를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 하류에 있다.
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 폴리-A 신호를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 더 포함한다. 바람직하게는, 여기서 폴리-A 신호는 (i) 및 (ii)를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 하류에 있다.
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 소 성장 호르몬 폴리-A 신호를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 더 포함한다. 바람직하게는, 여기서 소 성장 호르몬 폴리-A 신호는 (i) 및 (ii)를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 하류에 있다.
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는,
(a)
(i) 및 (ii)를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 상류에 있는 CMV 프로모터; 및
(b)
(i) 및 (ii)를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 하류에 있는 소 성장 호르몬 폴리-A 신호
를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 더 포함한다.
다른 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는,
(a)
(i) 및 (ii)를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 상류에 있는 CMV 프로모터;
(b)
(i) 및 (ii)를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 하류에 있는 WPRE 조절 요소; 및
(c)
(i) 및 (ii)를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 하류에 있는 소 성장 호르몬 폴리-A 신호
를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 더 포함한다.
바람직한 실시형태에서, WPRE 조절 요소는 WPRE3 조절 요소이다.
바람직한 실시형태에서, (i)을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 (ii)를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 상류에 있다.
다른 실시형태에서, (ii)를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 (i)을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 상류에 있다.
일부 실시형태에서, (i) 및 (ii)를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 링커에 의해 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시형태에서, 링커는 퓨린(Furin), GSG, 11aa1D 또는 F2A 링커이다. 바람직한 실시형태에서, 링커는 자가-절단 2A 펩타이드 서열, 예를 들어, P2A 또는 퓨린 절단 부위, GSG, 11a1D 및 F2A 서열을 포함하거나 이에 의해 한정되는 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 아데노-연관 바이러스(AAV) 반전 말단 반복부(ITR)를 더 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 2개의 AAV ITR을 더 포함한다.
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 이의 5' 말단에 AAV ITR 및 이의 3' 말단에 AAV ITR을 포함한다.
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는,
(a)
5' AAV ITR;
(b)
CMV 프로모터;
(c)
보체 인자 I(CFI) 보조인자, 바람직하게는 FHL1을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(d)
링커(선택적으로, 링커는 퓨린 절단 부위, GSG, 11a1D 및 F2A 서열을 포함함);
(e)
CFI를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(f)
폴리-A 신호, 바람직하게는 소 성장 호르몬 폴리-A 신호; 및
(g)
3' AAV ITR
을 포함한다.
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는,
(a)
5' AAV ITR;
(b)
CMV 프로모터;
(c)
보체 인자 I(CFI) 보조인자, 바람직하게는 FHL1을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(d)
링커(선택적으로, 링커는 퓨린 절단 부위, GSG, 11a1D 및 F2A 서열을 포함함);
(e)
CFI를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(f)
WPRE 조절 요소(바람직하게는, WPRE 조절 요소는 WPRE3 조절 요소임);
(g)
폴리-A 신호, 바람직하게는 소 성장 호르몬 폴리-A 신호; 및
(h)
3' AAV ITR
을 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는,
(a)
5' AAV ITR;
(b)
CMV 프로모터;
(c)
FHL1을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(d)
퓨린 절단 부위, GSG, 11a1D 및 F2A 서열을 포함하는 링커;
(e)
CFI를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(f)
WPRE3 조절 요소;
(g)
폴리-A 신호, 바람직하게는 소 성장 호르몬 폴리-A 신호; 및
(h)
3' AAV ITR
을 포함한다.
일부 실시형태에서, 보체 인자 I(CFI) 보조인자는 보체 인자 H 유사 단백질 1(FHL1); 보체 인자 H(CFH); 보체 수용체 1(CR1) 또는 이의 단편; 및 막 보조인자 단백질(MCP) 또는 이의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 보체 인자 I(CFI) 보조인자는 보체 인자 H(CFH)이다. 일부 실시형태에서, 보체 인자 I(CFI) 보조인자는 보체 수용체 1(CR1) 또는 이의 단편이다. 일부 실시형태에서, 보체 인자 I(CFI) 보조인자는 막 보조인자 단백질(MCP) 또는 이의 단편이다.
바람직한 실시형태에서, 보체 인자 I(CFI) 보조인자는 보체 인자 H 유사 단백질 1(FHL1)이다.
일부 실시형태에서, AAV ITR은 AAV2 또는 AAV8 ITR이다. 바람직한 실시형태에서, AAV ITR은 AAV2 ITR이다.
일부 실시형태에서, 보체 인자 I(CFI) 보조인자, 예컨대, FHL1 또는 CFH를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 코돈 최적화되어 있다. 일부 실시형태에서, CFI를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 코돈 최적화되어 있다. 바람직한 실시형태에서, 보체 인자 I(CFI) 보조인자, 예컨대, FHL1 또는 CFH, 및 CFI를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 코돈 최적화되어 있다.
일부 실시형태에서, FHL1을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 12와 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는다.
바람직한 실시형태에서, FHL1을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 12이다.
일부 실시형태에서, CFI를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 10과 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는다.
바람직한 실시형태에서, CFI를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 10이다.
바람직한 실시형태에서, FHL1을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 12이고 CFI를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 10이다.
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 22의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 23의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 5.2, 5.1, 5.0, 4.9, 4.8 또는 4.7 kb 이하이다. 바람직한 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 4.7 kb 이하이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 제공한다.
일부 실시형태에서, 벡터는 아데노-연관 바이러스(AAV), 레트로바이러스, 렌티바이러스 또는 아데노바이러스 벡터이다.
바람직한 실시형태에서, 벡터는 AAV 벡터이다.
일부 실시형태에서, 벡터는 바이러스 벡터 입자의 형태이다.
일부 실시형태에서, AAV 벡터 입자는 AAV2 또는 AAV8 게놈을 포함한다.
일부 실시형태에서, AAV 벡터 입자는 AAV2 또는 AAV8 캡시드 단백질을 포함한다.
일부 실시형태에서, AAV 벡터 입자는 AAV2 게놈 및 AAV2 캡시드 단백질을 포함한다(AAV2/2). 다른 실시형태에서, AAV 벡터 입자는 AAV2 게놈 및 AAV8 캡시드 단백질을 포함한다(AAV2/8). 다른 실시형태에서, AAV 벡터 입자는 AAV8 게놈 및 AAV8 캡시드 단백질을 포함한다(AAV8/8).
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 벡터로 형질도입된 세포를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 세포를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
바람직한 실시형태에서, 약제학적 조성물은 안내 투여용이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 치료법에 사용하기 위한 본 발명의 폴리펩타이드, 벡터 또는 세포를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 안구 장애를 치료 또는 예방하는 데 사용하기 위한 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 세포를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 보체-매개 또는 보체-연관 장애를 치료 또는 예방하는 데 사용하기 위한 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 세포를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 눈의 보체-매개 장애를 치료 또는 예방하는 데 사용하기 위한 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 세포를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 보체-매개 또는 보체-연관 신장 장애 또는 중추신경계(CNS)의 보체-매개 또는 보체-연관 장애를 치료 또는 예방하는 데 사용하기 위한 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 세포를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 눈의 보체-매개 또는 보체-연관 장애를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 세포를 대상체에게, 바람직하게는 대상체의 눈에 전달하는 단계를 포함하는, (i) 보체 인자 I(CFI) 보조인자; 및 (ii) 보체 인자 I(CFI)를 대상체에게 제공하는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 세포를 대상체의 눈에 전달하는 단계를 포함하는, (i) 보체 인자 H 유사 단백질 1(FHL1) 또는 보체 인자 H(CFH); 및 (ii) 보체 인자 I(CFI)를 대상체에게 제공하는 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 장애는 보체 C3b 피드백 사이클의 과다활동 및/또는 C3b 분해 사이클의 과소활동과 연관된다(도 1 참조).
일부 실시형태에서, 장애는 만성 보체-매개 또는 만성 보체-연관 염증성 병태이다.
일부 실시형태에서, 장애는 눈의 만성 보체-매개 염증성 병태이다.
일부 실시형태에서, 장애는 연령-관련 황반 변성(AMD) 또는 당뇨망막병증이다. 다른 실시형태에서, 장애는 녹내장, 스타르가르트병, 중심성장액맥락망막병증, 망막색소변성증 또는 포도막염이다. 바람직하게는 포도막염은 후방 포도막염이다.
바람직한 실시형태에서, 장애는 AMD이다. 일부 실시형태에서, AMD는 건성 AMD이다.
일부 실시형태에서, 대상체는 AMD로 진단받았거나 AMD에 걸릴 위험에 있다.
일부 실시형태에서, 용도는
(a)
눈 및/또는 혈청에서 정상보다 낮은 보체 인자 I 활성 또는 농도를 가지고, 바람직하게는 혈청에서 농도 또는 활성이 0 내지 30, 0 내지 20 또는 0 내지 10㎍/㎖의 농도 또는 이와 동등한 활성을 갖는 대상체; 및/또는
(b)
연령-관련 황반 변성(AMD)-연관 SNP, 바람직하게는 희귀 보체 인자 I 변이체에 대해 이형접합체 또는 동형접합체인 대상체
에서 장애를 치료 또는 예방하기 위한 것이다.
일부 실시형태에서, 용도는,
(a)
눈 및/또는 혈청에서 정상 수준의 보체 인자 I 활성 또는 농도, 바람직하게는 혈청에서 적어도 30㎍/㎖, 예컨대, 30 내지 40㎍/㎖를 갖는 대상체; 및/또는
(b)
희귀 보체 인자 I 변이 대립유전자를 보유하고 있지 않은 대상체
에서 장애를 치료 또는 예방하기 위한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 연령-관련 황반 변성(AMD)을 치료 또는 예방하는 데 사용하기 위한 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 세포를 제공한다. 바람직한 실시형태에서, AMD는 건성 AMD이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 당뇨망막병증을 치료 또는 예방하는 데 사용하기 위한 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 세포를 제공한다.
일부 실시형태에서, 지도모양 위축의 형성이 예방 또는 감소되고/되거나, 지도모양 위축의 양이 감소된다.
일부 실시형태에서, 지도모양 위축의 진행이 느려진다.
일부 실시형태에서, 동일한 기간 동안 치료되지 않은 눈에 비해, 대상체의 치료된 눈에 투여한 후 12개월에 걸쳐 지도모양 위축 영역의 증가가 적어도 10% 감소한다. 다른 실시형태에서, 동일한 기간 동안 치료되지 않은 눈에 비해, 대상체의 치료된 눈에 투여한 후 12개월에 걸쳐 지도모양 위축 영역의 증가가 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 감소한다.
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 세포의 투여는 대상체, 또는 대상체의 눈, 예컨대, 망막색소상피(RPE)에서, 선택적으로 대상체, 또는 이의 눈 또는 RPE의 정상 수준을 초과하는 수준으로 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 수준을 증가시킨다.
또 다른 양태에서, 본 발명은, 예를 들어, 안 장애, 예컨대, 본 명세서에 개시된 안 장애를 앓고 있는 대상체에서 시야 또는 시력을 개선 또는 복원시키는 데 사용하기 위한 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 세포를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은, 시야 또는 시력 손실, 예를 들어, 안 장애, 예컨대, 본 명세서에 개시된 안 장애와 연관된 시야 또는 시력 손실을 완화시키는 데 사용하기 위한 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 세포를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 대상체, 예를 들어, 안 장애, 예컨대, 본 명세서에 개시된 안 장애를 앓고 있는 대상체에서 읽기 속도를 개선 또는 복원시키는 데 사용하기 위한 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 세포를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 대상체에서 읽기 속도의 감소, 예를 들어, 안 장애, 예컨대, 본 명세서에 개시된 안 장애와 연관된 읽기 속도의 감소를 완화시키는 데 사용하기 위한 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 세포를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 광수용체 및/또는 망막색소상피(RPE)의 손실, 예를 들어, 안 장애, 예컨대, 본 명세서에 개시된 안 장애와 연관된 광수용체 및/또는 RPE의 손실을 감소 또는 예방하는 데 사용하기 위한 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 세포를 제공한다.
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 세포는 안내 투여된다.
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 세포는 망막하, 망막에 직접, 맥락막위 또는 유리체내 주사에 의해 대상체의 눈에 투여된다.
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 세포는 망막하 주사에 의해 대상체의 눈에 투여된다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터는 hAAT 프로모터를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터는 ApoR 인핸서를 포함하지 않는다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터는 2개의 ApoR 인핸서를 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 벡터는 AAV2 게놈 및 AAV8 캡시드 단백질을 포함하지 않으며, 즉, 본 발명의 벡터는 AAV2/8 벡터가 아니다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 세포는 전신으로 투여되지 않는다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 세포는 정맥내로 투여되지 않는다.
AMD의 치료에 관한 상기 설명은 (과민성 C3b 피드백 사이클 및/또는 과소활동 C3b 분해 사이클의 결과로서) 과잉활동 보체 시스템을 조절하는 이론을 기반으로 하며, 따라서 (안내 투여와 구체적으로 관련된 문서를 제외하고) 설명은 보체 시스템이 관련된 다른 만성 염증성 병태에 동등하게 적용됨을 당업자는 이해할 것이다. 이와 같은 장애는 전신 투여(예를 들어, 말초 정맥 주입을 통해), 국소 투여(예를 들어, 척추강내) 또는 표적화 조직 또는 기관(예를 들어, 간, 신장)에의 직접 전달에 의한 본 명세서에 기재된 제품, 단백질, 벡터, 세포 및 조성물의 투여에 의해 치료될 수 있다.
도 1
척추동물 보체의 대체 경로의 C3b 피드백(증폭) 및 분해(하향조절) 사이클("I" = 보체 인자 I; "H" = 보체 인자 H; "B" = 보체 인자 B; 및 "D" = 보체 인자 D).
도 2
(A) C3b에서 iC3b로의 절단에 대한 ELISA-기반 측정을 기반으로 하는 보조인자 검정. CFI 및 C3b의 농도를 고정하고, 명시된 비율(또는 비)로 CFH 또는 FHL1의 적정을 수행하였다.
(B) 보체 인자 I(FI), 보체 인자 H(FH) 또는 보체 인자 H-유사 단백질 1(FHL1)을 이용한 정상 혈청의 보충을 기반으로 하는 LPS 침착 검정.
도 3
HEK293 세포의 벡터 형질도입으로부터의 상청액의 웨스턴 블롯 분석(RC001, 야생형 FHL1을 포함하는 대조군 벡터; GT005, 야생형 CFI를 포함하는 대조군 벡터).
도 4
HEK293 세포의 벡터 형질도입으로부터의 상청액의 ELISA 분석(RC001, 야생형 FHL1을 포함하는 대조군 벡터; GT005, 야생형 CFI를 포함하는 대조군 벡터).
도 5
벡터 게놈 패키징의 알칼리 겔 분석(상단 패널). qPCR 및 캡시드 ELISA에 의해 결정된 가득찬 바이러스 입자:빈 바이러스 입자의 비의 비교(하단 패널). (RC001, 야생형 FHL1을 포함하는 대조군 벡터; GT005, 야생형 CFI를 포함하는 대조군 벡터).
도 6
웨스턴 블롯 분석(상단 패널) 및 ELISA(하단 패널)를 사용하는 C3b 절단 검정. (RC001, 야생형 FHL1을 포함하는 대조군 벡터; GT005, 야생형 CFI를 포함하는 대조군 벡터).
도 7
혈장(n=80) 및 유리체액(n=29)에서 보체 인자 I(FI):보체 인자 H(FH) 비의 비교.
도 8
C3 증착을 측정하기 위한 LPS 침착 검정. FI = 보체 인자 I, sCR1 = 가용성 보체 수용체 1, FH = 보체 인자 H, FHL1 = 인자 H-유사 단백질 1. 각각의 막대 위의 숫자는 혈청 단독과 비교하여 C3 증착의 감소 %를 나타낸다.
도 9
시험관내에서 형질도입된 HEK-293 세포의 상청액의 웨스턴 블롯 분석. UTC = 형질도입되지 않은 세포, GT005 = CFI를 발현하는 AAV, GT007 = CFI 및 FHL1을 발현하는 AAV, RC001 = FHL1을 발현하는 AAV.
도 10
작제물의 기능적 활성을 테스트하기 위한 보조인자 검정의 C3b 웨스턴 블롯 및 iC3b ELISA. (A) C3b 보조인자 검정의 웨스턴 블롯. (B) C3b 보조인자 검정의 iC3b ELISA. C3b = 보체 C3b, CFI = 보체 인자 I, FHL1 = 보체 인자 H-유사 단백질 1, UTD = 형질도입되지 않은 세포.
도 11
맥락막의 평면 표본 고정물(choroidal flatmount)에서 아이소렉틴-염색 영역. 콜모고로프-스미르노프(Kolmogorov-Smirnov) 분석에 의해 평가될 때 아이소렉틴 염색 영역 데이터는 비정규 분포를 이루었고 일반화 선형 모델 분석을 사용하여 관찰된 차이의 통계적 유의성을 결정하였다. * = P<0.05; *** = P<0.0001, **** = P<0.00001. 점은 개별 레이저 화상의 결과를 나타내고, 선은 평균값을 나타낸다.
척추동물 보체의 대체 경로의 C3b 피드백(증폭) 및 분해(하향조절) 사이클("I" = 보체 인자 I; "H" = 보체 인자 H; "B" = 보체 인자 B; 및 "D" = 보체 인자 D).
도 2
(A) C3b에서 iC3b로의 절단에 대한 ELISA-기반 측정을 기반으로 하는 보조인자 검정. CFI 및 C3b의 농도를 고정하고, 명시된 비율(또는 비)로 CFH 또는 FHL1의 적정을 수행하였다.
(B) 보체 인자 I(FI), 보체 인자 H(FH) 또는 보체 인자 H-유사 단백질 1(FHL1)을 이용한 정상 혈청의 보충을 기반으로 하는 LPS 침착 검정.
도 3
HEK293 세포의 벡터 형질도입으로부터의 상청액의 웨스턴 블롯 분석(RC001, 야생형 FHL1을 포함하는 대조군 벡터; GT005, 야생형 CFI를 포함하는 대조군 벡터).
도 4
HEK293 세포의 벡터 형질도입으로부터의 상청액의 ELISA 분석(RC001, 야생형 FHL1을 포함하는 대조군 벡터; GT005, 야생형 CFI를 포함하는 대조군 벡터).
도 5
벡터 게놈 패키징의 알칼리 겔 분석(상단 패널). qPCR 및 캡시드 ELISA에 의해 결정된 가득찬 바이러스 입자:빈 바이러스 입자의 비의 비교(하단 패널). (RC001, 야생형 FHL1을 포함하는 대조군 벡터; GT005, 야생형 CFI를 포함하는 대조군 벡터).
도 6
웨스턴 블롯 분석(상단 패널) 및 ELISA(하단 패널)를 사용하는 C3b 절단 검정. (RC001, 야생형 FHL1을 포함하는 대조군 벡터; GT005, 야생형 CFI를 포함하는 대조군 벡터).
도 7
혈장(n=80) 및 유리체액(n=29)에서 보체 인자 I(FI):보체 인자 H(FH) 비의 비교.
도 8
C3 증착을 측정하기 위한 LPS 침착 검정. FI = 보체 인자 I, sCR1 = 가용성 보체 수용체 1, FH = 보체 인자 H, FHL1 = 인자 H-유사 단백질 1. 각각의 막대 위의 숫자는 혈청 단독과 비교하여 C3 증착의 감소 %를 나타낸다.
도 9
시험관내에서 형질도입된 HEK-293 세포의 상청액의 웨스턴 블롯 분석. UTC = 형질도입되지 않은 세포, GT005 = CFI를 발현하는 AAV, GT007 = CFI 및 FHL1을 발현하는 AAV, RC001 = FHL1을 발현하는 AAV.
도 10
작제물의 기능적 활성을 테스트하기 위한 보조인자 검정의 C3b 웨스턴 블롯 및 iC3b ELISA. (A) C3b 보조인자 검정의 웨스턴 블롯. (B) C3b 보조인자 검정의 iC3b ELISA. C3b = 보체 C3b, CFI = 보체 인자 I, FHL1 = 보체 인자 H-유사 단백질 1, UTD = 형질도입되지 않은 세포.
도 11
맥락막의 평면 표본 고정물(choroidal flatmount)에서 아이소렉틴-염색 영역. 콜모고로프-스미르노프(Kolmogorov-Smirnov) 분석에 의해 평가될 때 아이소렉틴 염색 영역 데이터는 비정규 분포를 이루었고 일반화 선형 모델 분석을 사용하여 관찰된 차이의 통계적 유의성을 결정하였다. * = P<0.05; *** = P<0.0001, **** = P<0.00001. 점은 개별 레이저 화상의 결과를 나타내고, 선은 평균값을 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "포함하는(comprising)", "포함한다(comprises)" 및 "~로 이루어진(comprised of)"은 "포함하는(including)" 또는 "포함한다(includes)"; 또는 "함유하는(containing)" 또는 "함유한다(contain)"와 동의어이고, 포괄적이거나 개방형이며 추가적인 비언급된 구성원, 요소 또는 단계를 배제하지 않는다. 용어 "포함하는(comprising)", 포함하다(comprises)" 및 "~로 이루어진(comprised of)"은 용어 "~로 이루어지는(consisting of)"을 포함한다.
보체
시스템
보체 시스템은 체액성 면역계의 필수적인 부분이며 조직 염증, 세포 옵소닌화, 및 세포용해에 관여한다. 이는 미생물에 대한 보호를 제공하고 숙주 조직으로부터 외인성 및 내인성 세포 파편의 소거를 매개한다.
보체 시스템 캐스케이드는 3가지 활성화 경로로 구성된다. 모든 경로는 궁극적으로 C3 인자의 중심 절단 및 이의 활성 단편인 C3a 및 C3b의 생성으로 끝난다. C3a는 다양한 화학주성 및 전염증 반응, 예컨대, 염증 세포의 동원 및 미세혈관 투과성 증가를 촉발시키는 아나필라톡신인 반면, C3b는 C3b에 공유적으로 부착된 외래 표면의 옵소닌화를 담당한다. 활성화된 C3 단편(C3b 및 iC3b)을 이용한 옵소닌화는 3가지 주요 기능을 수행한다: (i) 식세포(예를 들어, 대식세포 또는 미세아교세포)에 의한 세포 파편 제거 및 적응 면역계(B 및 T 세포)의 자극; (ii) 표면-결합 C3 전환효소의 형성을 통한 보체 활성화의 증폭; 및 (iii) C5 전환효소의 집합.
C5 전환효소의 집합은 C5 절단을 담당하며, 이는 세포막에 천공을 생성할 수 있는 세포용해 막 공격 복합체(MAC)의 형성을 초래하여, 세포 용해 및 불필요한 세포의 제거를 촉진시킨다. 이러한 모든 활성을 통해, 선천적인 보체 캐스케이드는 숙주 조직의 온전함을 보호하는 면역계의 하류 메커니즘의 기능을 지원하고 촉진시킨다. 전반적으로, 보체 시스템 경로 활성화는, 세포 용해를 매개하는 MAC 생성, 염증 세포를 손상 부위로 유인하는 케모카인의 방출, 및 침윤성 백혈구의 혈관외유출을 촉진시키는 모세혈관 투과성의 향상을 포함하여, 전염증 반응을 초래한다. 생리학적 조건 하에서, 보체 활성화는 가용성 및 막-연관 보체 조절 분자(CRM)의 조정된 작용에 의해 효과적으로 제어된다. 가용성 보체 조절제, 예컨대, C1-억제제, 아나필라톡신 억제제, C4b 결합 단백질(C4BP), 보체 인자 H(CFH), 보체 인자 I(CFI), 클루스테린 및 비트로넥틴은 캐스케이드 반응의 여러 부위에서 인간 조직에서의 보체 작용을 제한한다. 추가적으로, 각각의 개별 세포는 표면 단백질, 예컨대, 보체 수용체 1(CR1, CD35), 막 보조인자 단백질(CD46), 및 글라이실코포스파티딜이노시톨-앵커 단백질, 예컨대, 분해 가속 인자(CD55) 또는 CD59 분자에 의해 상동성 보체의 공격으로부터 보호된다. 중요한 점은, 보체 공격으로부터 부적절하게 보호되는 숙주 세포 및 조직은 방관자 세포 용해의 대상이 될 수 있다.
본 발명은 보체-매개 장애, 예를 들어, 눈의 보체-매개 장애의 치료 또는 예방에 관한 것이다. 예를 들어, 보체-매개 장애는 대체 경로 조절의 결함, 구체적으로 보체 C3b 피드백 사이클의 과다활동 및/또는 C3b 분해 사이클의 과소활동과 연관된 장애일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 제품, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 세포 또는 약제학적 조성물의 투여 전에, 대상체는 낮은 수준(예를 들어, 정상 수준보다 낮은 수준)의 보체 인자 I 활성, 예를 들어, 눈에서 낮은 수준의 보체 인자 I 활성 및/또는 낮은 혈청 수준의 보체 인자 I 활성을 갖는다. 정상 이하 수준의 보체 인자 I 활성은 정상적으로 기능하는 보체 인자 I의 정상 이하 발현, 또는 보체 인자 I의 비-기능적 또는 하위-기능적 변이체의 적어도 부분적(예를 들어, 이형접합체) 발현(정상 또는 정상 이하 수준)에 기인할 수 있다. (이와 같은 대상체는 AMD-연관 SNP의 하나 이상의 복제물을 보유할 수 있으며, 예를 들어, 대상체는 하기에서 추가로 논의되는 희귀 보체 인자 I 변이체 중 하나에 대해 동형- 또는 이형접합체일 수 있다). 따라서, 대상체는 눈 및/또는 혈청에서 낮은 농도(예를 들어, 정상보다 낮은 농도)의 보체 인자 I를 가질 수 있다. 인간 대상체의 경우, 보체 인자 I 활성(C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성)의 정상 수준은 대상체의 혈청에서 30 내지 40㎍/㎖의 보체 인자 I에 의해 제공되는 것과 동일할 수 있다. 따라서, 보체 인자 I 활성이 낮은 대상체에서, 혈청 중 보체 인자 I 활성은 30㎍/㎖ 미만 및 0㎍/㎖ 초과, 예컨대, 0 내지 20 또는 0 내지 10㎍/㎖(이는 보체 인자 I 농도가 낮은 대상체를 포함할 수 있는 보체 인자 I 혈청 농도의 범위임)에 해당할 수 있다.
따라서, 본 발명에 의해 치료될 대상체는 눈의 보체-매개 장애, 예컨대, AMD, 더욱 특히 건성 AMD(예를 들어, 지도모양 위축을 특징으로 함)를 앓을 수 있거나, 이와 같은 장애가 발병할 위험에 있을 수 있다. 예를 들어, 대상체는 보체-매개 장애와 연관된 하나 이상의 SNP에 민감한 동형접합체 또는 이형접합체일 수 있다.
일부 실시형태에서, 대상체는 AMD가 발병할 위험에 있다. 예를 들어, 대상체는 AMD와 연관된 하나 이상의 SNP에 민감한 동형접합체 또는 이형접합체, 예를 들어, 일반적으로 혈청 보체 인자 I 수준의 감소를 초래하는 진행된 AMD와 연관된 보체 인자 I에서의 희귀 돌연변이일 수 있다(Kavanagh et al. (2015) Hum Mol Genet 24: 3861-3870). 특히, 대상체는 다음 희귀 보체 인자 I 변이체 중 하나 이상의 하나 또는 2개의 복사체를 보유할 수 있다: rs144082872(P50A를 인코딩함); 4:110687847(P64L을 인코딩함); rs141853578(G119R을 인코딩함); 4:110685721(V152M을 인코딩함); 4:110682846(G162D를 인코딩함); 4:110682801(N177I를 인코딩함); rs146444258(A240G를 인코딩함); rs182078921(G287R을 인코딩함); rs41278047(K441R을 인코딩함); 및 rs121964913(R474를 인코딩함).
본 발명은, 예를 들어, 대상체가 보체-매개 장애와 연관된 하나 이상의 SNP에 민감한 동형접합체 또는 이형접합체인지 여부를 결정함으로써(예를 들어, 대상체가 상기 열거한 AMD와 연관된 희귀 보체 인자 I 변이체 중 하나 이상에 민감한 동형접합체 또는 이형접합체인지 여부를 결정함으로써), 보체-매개 장애(예를 들어, AMD)가 발병할 위험에 있는지 여부를 결정하는 것을 더 포함할 수 있다.
대안적으로, 대상체는, 예를 들어, 눈 및/또는 혈청에서 정상적인 수준의 내인성 보체 인자 I 활성 또는 농도를 가질 수 있고/있거나 희귀 변이 보체 인자 I 대립유전자를 보유하지 않을 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 제품, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 세포 또는 약제학적 조성물의 투여는 이에 의해 대상체의 눈에서 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 수준을 증가시킨다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 제품, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 세포 또는 약제학적 조성물의 투여는 이에 의해 대상체의 눈에서 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 수준을 눈에서 정상 수준을 초과하는 수준으로 증가시킨다. 더욱 특히, C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 수준은 눈의 RPE에서 증가된다.
본 발명의 제품의 제공 및/또는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터로부터 보체 인자 I 및 CFI 보조인자, 예컨대, 보체 인자 H-유사 단백질 1의 발현 후 대상체에서 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성은, 대상체에서 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 총 수준이 정상 수준을 초과하도록, 대상체의 내인성 보체 인자 I(즉, 제품에 의해 제공되지 않거나 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터로부터의 발현에 의해 생성되지 않는 대상체의 보체 인자 I)로부터의 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성, 및 본 발명의 제품에 의해 제공되거나 본 발명의 폴리펩타이드 또는 벡터로부터의 발현에 의해 생성되는 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성을 포함할 수 있음이 이해될 것이다.
일부 실시형태에서, 대상체에서, 예를 들어, 눈에서 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 수준은 정상 수준을 적어도 5%, 10%, 15%, 20% 또는 25% 초과하는 수준으로 증가된다.
다른 실시형태에서, 대상체, 예를 들어, 눈에서 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 수준은 정상 수준의 최대 2배, 또는 정상 수준을 최대 80%, 60%, 40% 또는 20% 초과하는 수준으로 증가된다.
예를 들어, 대상체, 예를 들어, 눈에서 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 수준은 정상 수준을 5 내지 100%, 5 내지 80%, 5 내지 60%, 5 내지 40%, 5 내지 20%, 10 내지 100%, 10 내지 80%, 10 내지 60%, 10 내지 40%, 10 내지 20%, 15 내지 100%, 15 내지 80%, 15 내지 60%, 15 내지 40%, 15 내지 20%, 20 내지 100%, 20 내지 80%, 20 내지 60%, 20 내지 40%, 25 내지 100%, 25 내지 80%, 25 내지 60% 또는 25 내지 40% 초과하는 수준으로 증가될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 제품, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 세포 또는 약제학적 조성물의 투여는 대상체의 혈장/혈청에서 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 수준을 검출 가능하게 증가시키지 않는다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 제품, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 세포 또는 약제학적 조성물의 투여는 대상체의 혈장/혈청에서 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 수준을 정상 수준보다 높은 수준으로 검출 가능하게 증가시키지 않는다.
상기 섹션에서, 명백하게 적용할 수 없는 경우를 제외하고, 보체 인자 I 및 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성에 대한 언급은 CFI 보조인자, 바람직하게는 보체 인자 H 또는 보체 인자 H-유사 단백질 1, 및 C3b의 보체 인자 I 매개 절단에 대한 보조인자로서 작용하고 각각 C3 전환효소 및 C5 전환효소의 해리 속도를 증가시키는 능력으로 대체될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 제품, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 세포 또는 약제학적 조성물의 투여 전에, 대상체는 낮은 수준(예를 들어, 정상 수준보다 낮은 수준)의 보체 인자 H, 예를 들어, 눈에서 낮은 수준의 보체 인자 H 및/또는 낮은 혈청 수준의 보체 인자 H를 갖는다. 인간 대상체의 경우, 보체 인자 H의 정상 수준은 대상체의 혈청에서 약 200 내지 500㎍/㎖일 수 있다. 따라서, 보체 인자 H의 수준이 낮은 대상체에서, 혈청 중 수준은 200㎍/㎖ 미만 및 0㎍/㎖ 초과, 예컨대, 0 내지 100㎍/㎖일 수 있다. 대안적으로, 대상체는, 예를 들어, 눈 및/또는 혈청에서 정상 수준의 내인성 보체 인자 H를 가질 수 있다.
보체
인자 I(
CFI
)
C3b/C4b 불활성화제로도 알려진 보체 인자 I(인자 I, CFI)는 인간에서 CFI 유전자에 의해 인코딩되는 단백질이다.
보체 인자 I은 약 35㎍/㎖의 농도로 치모겐-유사 상태로 순환하는(Roversi et al. (2011) PNAS 108: 12839-12844) 세린 프로테아제이다(Nilsson et al. (2011) Mol Immunol 48: 1611-1620). 보체 인자 I 단백질은 단일 이황화 결합에 의해 연결된 2개의 폴리펩타이드 사슬로 이루어진 고도로 N-글라이코실화된 이종이량체이다. 중쇄(50 kDa)는 N-말단 영역; FI 막 공격 복합체(FIMAC) 도메인; CD5 유사-도메인 또는 스캐빈저 수용체 시스테인-풍부(SRCR) 도메인; 2개의 저밀도 지방단백질 수용체(LDLr) 도메인; 및 종에 걸친 서열 가변성의 부위인 기능이 알려지지 않은 C-말단 영역을 포함한다(Roversi et al. (2011) PNAS 108: 12839-12844). 경쇄(38 kDa)는 촉매 잔기가 보존된 세린 프로테아제(SP) 도메인을 포함한다(Goldberger et al. (1987) J Biol Chem 262: 10065-10071).
보체 인자 I는 C3b를 iC3b, C3d 및 C3d,g로 절단함으로써 불활성화시키고, 유사한 방식으로 C4b를 C4c 및 C4d로 절단함으로써 불활성화시킨다. 보체 인자 I의 기능을 적절하게 수행하기 위해, 보체 인자 I는 C4b-결합 단백질(C4BP), 보체 인자 H(CFH), 보체 수용체 1(CR1/CD35) 및 막 보조인자 단백질(MCP/CD46)과 같은 보조인자 단백질의 존재를 필요로 한다(Degn et al. (2011) Am J Hum Genet 88: 689-705).
iC3b는 인자 B와 회합할 수 없으므로, 보체 캐스케이드의 증폭 또는 대체 경로를 통한 활성화를 영속시킬 수 없다. 따라서, 일단 C3b가 iC3b로 절단되면, 대체 경로 개시도 말단 보체 캐스케이드 활성화도 일어나지 않는다.
iC3b는 다형핵 백혈구(주로 호중구), NK 세포 및 단핵 식세포, 예컨대, 대식세포 상에서 보체 수용체 3(CR3)(CD11b/CD18)에 결합하고 이를 활성화시킴으로써 전염증 작용을 제공할 수 있다.
보체 인자 I는 보조인자, 즉, CR1을 필요로 하는 프로테아제 활성을 통해 iC3b를 C3dg로 가공할 수 있다. C3dg는 CR3에 결합할 수 없다. 보체 수용체 CR3과 iC3b가 반응하는 것은 보체 활성화가 염증을 일으키는 주요 메커니즘이므로, iC3b의 C3dg로의 분해는 보체-유도 염증을 감소시키는 데 필수적이다(Lachmann (2009) Adv. Immunol. 104: 115-149).
C3b의 iC3b로의 절단을 촉진할 뿐만 아니라 iC3b의 분해를 가속화하는 보체 인자 I의 고유한 능력(인간 혈청에서 상대적으로 낮은 농도와 결합하여 치료 효능을 위해 전달되는 데 필요한 양에 대한 영향)은 이를 특히 유리한 표적으로 만든다.
일부 실시형태에서, 보체 인자 I 폴리펩타이드는 C3b를 불활성 분해 생성물로 절단할 수 있다. 예를 들어, 보체 인자 I 폴리펩타이드는 C3b를 iC3b로 절단할 수 있다.
일부 실시형태에서, 보체 인자 I 폴리펩타이드는 iC3b를 불활성 분해 생성물로 가공할 수 있다. 예를 들어, 보체 인자 I 폴리펩타이드는 iC3b를 C3dg로 가공할 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 보체 인자 I 폴리펩타이드는 C3b를 iC3b로 절단하고 iC3b를 C3dg로 가공할 수 있다.
적합하게는, 보체 인자 I의 단편 또는 유도체는 천연 보체 인자 I의 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100%를 유지할 수 있다.
보체 인자 I, 또는 이의 단편 또는 유도체의 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성은 당업자에게 알려진 임의의 적합한 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 보체 인자 I 단백질분해 활성의 측정은 문헌[Hsiung et al. Biochem. J. (1982) 203: 293-298]에 기재되어 있다. CFI 활성에 대한 용혈 및 교착 검정은 둘 다 문헌[Lachmann PJ & Hobart MJ (1978) "Complement Technology", Handbook of Experimental Immunology 3rd edition Ed DM Weir Blackwells Scientific Publications Chapter 5A p17]에 기재되어 있다. 또한 단백질분해 검정을 포함하여 보다 상세한 설명은 문헌[Harrison RA (1996), "Weir's Handbook of Experimental Immunology" 5th Edition Eds; Herzenberg Leonore A'Weir DM, Herzenberg Leonard A & Blackwell C Blackwells Scientific Publications Chapter 75 36-37]에서 제공된다. 교착 검정은 매우 민감하며 고정된 C3b를 iC3b로 전환시키는 제1(이중) 클립을 검출하고 교착소와의 반응성을 획득하며; 고정된 iC3b로 시작하여 교착소와의 반응성 손실을 찾음으로써 C3dg에 대한 최종 클립을 검출하는 데 사용될 수 있다. 용혈 검정은 C3b의 iC3b로의 전환에 사용되며, 단백질분해 검정은 모든 클립을 검출한다.
일부 실시형태에서, 보체 인자 I는 인간 보체 인자 I이다.
인간 보체 인자 I 단백질의 예는 UniProtKB 수탁 번호가 P05156인 인간 보체 인자 I 단백질이다. 이 예시된 서열은 길이가 583개인 아미노산(서열번호 1에 개시됨)이며, 상기 서열의 아미노산 1번 내지 18번은 신호 서열을 형성한다.
일부 실시형태에서, 보체 인자 I의 아미노산 서열은 서열번호 1이다.
다른 실시형태에서, 보체 인자 I의 아미노산 서열은 서열번호 1의 19 내지 583번 위치로 개시된 서열이다.
일부 실시형태에서, 보체 인자 I의 아미노산 서열은 서열번호 9이며, 이는 NCBI 수탁 번호 NP_000195에 해당한다. 다른 실시형태에서, 보체 인자 I의 아미노산 서열은 서열번호 9의 19 내지 583번 위치로 개시된 서열이다.
보체 인자 I를 인코딩하는 야생형 뉴클레오타이드 서열의 예는 NCBI 수탁 번호가 NM_000204인 뉴클레오타이드 서열이며, 상기 서열은 본 명세서에서 서열번호 2로 개시되어 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명에서 사용되는 보체 인자 I의 뉴클레오타이드 서열은 코돈 최적화되어 있다. 상이한 세포는 특정 코돈의 사용빈도가 상이하다. 이러한 코돈 편향은 세포 유형에서 특정 tRNA의 상대적인 풍부도의 편향에 해당한다. 서열의 코돈을 변경하여 상응하는 tRNA의 상대적인 풍부도와 일치하도록 맞춤으로써 발현을 증가시킬 수 있다. 같은 이유로, 특정 세포 유형에서 상응하는 tRNA가 희귀한 것으로 알려진 코돈을 고의적으로 선택함으로써 발현을 감소시킬 수 있다. 따라서, 추가 수준의 번역 제어가 이용 가능하다.
보체 인자 I를 인코딩하는 바람직한 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 10에 개시된 뉴클레오타이드 서열이다.
보체 인자 I를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열의 추가 예는 서열번호 8이다.
일부 실시형태에서, 보체 인자 I를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 10, 8 또는 2, 바람직하게는 10과 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는다. 바람직하게는, 상기 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩되는 단백질은 서열번호 1 또는 9에 의해 표시되는 단백질의 기능적 활성을 실질적으로 보유한다.
다른 실시형태에서, 보체 인자 I를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 10, 8 또는 2, 바람직하게는 서열번호 10이다.
다른 실시형태에서, 보체 인자 I를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 10, 8 또는 2, 바람직하게는 서열번호 10의 55 내지 1752번 위치와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는다. 바람직하게는, 상기 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩되는 단백질은 서열번호 1 또는 9에 의해 표시되는 단백질의 기능적 활성을 실질적으로 보유한다.
다른 실시형태에서, 보체 인자 I를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 10, 8 또는 2, 바람직하게는 서열번호 10의 55 내지 1752번 위치이다.
다른 실시형태에서, 보체 인자 I를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1 또는 9와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩한다. 바람직하게는, 여기서 상기 아미노산 서열은 서열번호 1 또는 9에 의해 표시되는 단백질의 기능적 활성을 실질적으로 보유한다.
다른 실시형태에서, 보체 인자 I를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1 또는 9의 아미노산 서열을 인코딩한다.
다른 실시형태에서, 보체 인자 I를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1 또는 9의 19 내지 583번 위치와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩한다. 바람직하게는, 여기서 상기 아미노산 서열은 서열번호 1 또는 9에 의해 표시되는 단백질의 기능적 활성을 실질적으로 보유한다.
다른 실시형태에서, 보체 인자 I를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1 또는 9의 19 내지 583번 위치의 아미노산 서열을 인코딩한다.
본 발명의 장점은 보체 인자 I가 정제된 단백질 형태로 제조하기가 특히 어렵다는 점이다. 따라서, 본 발명자들은, 보체 인자 I-인코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 AAV 벡터의 형태로 보체 인자 I를 투여함으로써, 보체 시스템을 조절하여, 예를 들어, 연령-관련 황반 변성(AMD)의 치료를 가능하게 하는 방법을 고안하였다. AAV 벡터는 관심 부위, 예를 들어, 눈에 투여되어 보체 인자 I 폴리펩타이드의 동일계내(in situ) 번역을 가능하게 할 수 있다.
보체
인자 I(
CFI
)
보조인자
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "보체 인자 I(CFI) 보조인자"는 C3b의 CFI-매개 절단을 위한 보조인자로서 작용할 수 있는 단백질을 지칭할 수 있다.
일부 실시형태에서, 보체 인자 I(CFI) 보조인자는 보체 인자 H 유사 단백질 1(FHL1); 보체 인자 H(CFH); 보체 수용체 1(CR1) 또는 이의 단편; 및 막 보조인자 단백질(MCP) 또는 이의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 보체 인자 I(CFI) 보조인자는 보체 인자 H(CFH)이다. 일부 실시형태에서, 보체 인자 I(CFI) 보조인자는 보체 수용체 1(CR1) 또는 이의 단편이다. 일부 실시형태에서, 보체 인자 I(CFI) 보조인자는 막 보조인자 단백질(MCP) 또는 이의 단편이다.
바람직한 실시형태에서, 보체 인자 I(CFI) 보조인자는 보체 인자 H 유사 단백질 1(FHL1)이다.
보체
인자 H(
CFH
)
보체 인자 H(인자 H, CFH)는 보체 제어 단백질이다.
보체 인자 H는 200 내지 300㎍/㎖의 전형적인 농도로 인간 혈장에 존재하는 대형(155 kDa)의 가용성 당단백질이다(Hakobyan et al. (2008) 49(5): 1983- 90). 보체 인자 H의 주요 기능은 보체 시스템의 대체 경로를 조절하는 것이다.
보체 인자 H는 C3b의 보체 인자 I-매개 절단을 위한 보조인자 활성을 제공한다. 보체 인자 H는 또한 C3bBb 복합체(C3 전환효소) 및 (C3b)NBb 복합체(C5 전환효소)의 해리 속도를 증가시키고, 이에 의해 대체 보체 경로의 활성을 감소시킨다.
보체 인자 H는 (3 내지 8개 아미노산 잔기의) 짧은 링커에 의해 서로 연결되고 확장된 머리에서 꼬리 방식으로 배열되는 최대 20개 보체 제어 단백질(CCP) 모듈(또한 짧은 컨센서스 반복부(Short Consensus Repeat) 또는 스시 도메인(sushi domain)으로도 지칭됨)로 구성된다. CCP 모듈의 각각은 1-3 2-4 배열로 이황화 결합된 4개의 시스테인 잔기가 있고, 거의 변하지 않는 트립토판 잔기 주위에 소수성 코어가 구축된 약 60개의 아미노산으로 이루어진다. CCP 모듈은 (단백질의 N-말단으로부터) 1부터 20까지 번호가 매겨진다. CCP 1 내지 4 및 CCP 19 내지 20은 C3b와 결합하는 한편, CCP 6 내지 8 및 CCP 19 내지 20은 GAG 및 시알산에 결합한다(Schmidt et al. (2008) Journal of Immunology 181: 2610-2619).
보체 인자 H를 사용하는 유전자 치료법이 마우스에서 유도된 AMD-유사 병리를 개선할 수 있다는 것이 밝혀졌다(Cashman et al. (2015) J. Gene Med. 17: 229-243). 마우스에, (i) 보체 성분 C3을 발현하는 아데노바이러스 벡터(이는 이전에 인간 AMD의 많은 병리학적 특징을 재현하는 것으로 밝혀짐); 및 (ii) 보체 인자 H를 발현하는 아데노바이러스 벡터를 망막하로 공동주사하였다. 보체 인자 H 대신에 GFP를 투여받은 대조군 동물에 비하여, 보체 인자 H-형질도입 마우스는 내피 세포 증식에서 91%의 감소 및 RPE 위축의 69% 감쇠를 나타내었다. 망막전위도검사는 보체 인자 H를 투여받은 마우스에서 망막 기능의 개선을 나타내었으며, 로돕신 및 RPE65의 면역세포화학은 이와 같은 동물에서 광수용체 및 RPE의 구제와 일치하였다.
일부 실시형태에서, 보체 인자 H 폴리펩타이드 또는 이의 단편 또는 유도체는 C3b의 보체 인자 I-매개 절단을 위한 보조인자로서 작용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 보체 인자 H 폴리펩타이드 또는 이의 단편 또는 유도체는 C3 전환효소 및 C5 전환효소의 해리 속도를 증가시킬 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 보체 인자 H 폴리펩타이드 또는 이의 단편 또는 유도체는 C3b의 보체 인자 I-매개 절단을 위한 보조인자로서 작용할 수 있고 C3 전환효소 및 C5 전환효소의 해리 속도를 증가시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 보체 인자 H는 인간 보체 인자 H이다.
인간 보체 인자 H 단백질의 예는 UniProtKB 수탁 번호가 P08603인 인간 보체 인자 H 단백질이다. 이 예시된 서열은 길이가 1231개인 아미노산(서열번호 3으로 개시됨)이며, 상기 서열의 아미노산 1번 내지 18번은 신호 서열을 형성한다.
일부 실시형태에서, 보체 인자 H의 아미노산 서열은 서열번호 3이다. 다른 실시형태에서, 보체 인자 H의 아미노산 서열은 서열번호 3의 19 내지 1231번 위치이다.
보체 인자 H를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 예는 NCBI 수탁 번호가 NM_000186인 뉴클레오타이드 서열이다.
일부 실시형태에서, 보체 인자 H를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 4이다.
일부 실시형태에서, 보체 인자 H를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 4와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는다. 바람직하게는, 상기 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩되는 단백질은 서열번호 3에 의해 표시되는 단백질의 기능적 활성을 실질적으로 보유한다.
다른 실시형태에서, 보체 인자 H를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 4이다.
다른 실시형태에서, 보체 인자 H를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 4의 55 내지 3696번 위치와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는다. 바람직하게는, 여기서 상기 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩되는 단백질은 서열번호 3에 의해 표시되는 단백질의 기능적 활성을 실질적으로 보유한다.
다른 실시형태에서, 보체 인자 H를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 4의 55 내지 3696번 위치이다.
다른 실시형태에서, 보체 인자 H를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 3과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩한다. 바람직하게는, 여기서 상기 아미노산 서열은 서열번호 3에 의해 표시되는 단백질의 기능적 활성을 실질적으로 보유한다.
다른 실시형태에서, 보체 인자 H를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 3의 아미노산 서열을 인코딩한다.
다른 실시형태에서, 보체 인자 H를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 3의 19 내지 1231번 위치와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩한다. 바람직하게는, 여기서 상기 아미노산 서열은 서열번호 3에 의해 표시되는 단백질의 기능적 활성을 실질적으로 보유한다.
다른 실시형태에서, 보체 인자 H를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 3의 19 내지 1231번 위치의 아미노산 서열을 인코딩한다.
보체
인자 H-유사 단백질 1(
FHL1
)
보체 인자 H-유사 단백질 1(FHL1)은 보체 인자 H의 처음 7개 CCP에 이어 4개의 아미노산 카복시-말단 꼬리를 포함하는 보체 인자 H의 스플라이스 변이체이다(Clark, S.J. et al. (2015) J Clin Med 4: 18-31).
일부 실시형태에서, FHL1은 인간 FHL1이다.
일부 실시형태에서, FHL1의 아미노산 서열은 서열번호 11이다.
FHL1을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 예는 다음과 같다:
본 발명에서 사용되는 FHL1의 뉴클레오타이드 서열은 바람직하게는 코돈 최적화되어 있다.
FHL1을 인코딩하는 바람직한 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 12이다.
일부 실시형태에서, FHL1을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 12 또는 16, 바람직하게는 서열번호 12와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는다. 바람직하게는, 상기 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩되는 단백질은 서열번호 11에 의해 표시되는 단백질의 기능적 활성을 실질적으로 보유한다.
다른 실시형태에서, FHL1을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 12 또는 16, 바람직하게는 서열번호 12이다.
보체
수용체 1(CR1)
CD35로도 알려진 보체 수용체 1(CR1)은 보체 활성의 조절제(RCA) 패밀리에 속하는 I형 막-결합 당단백질이다. CR1은 적혈구, 호산구, 단핵구, 대식세포, B-림프구, CD4+ T 세포의 하위집단, 수지상세포, 피부의 랑게르한스 세포 및 사구체 족세포의 원형질막에서 발견될 수 있다.
CR1은 약 200 kDa의 단일 사슬 당단백질이며, 이의 세포외 부분은 30개의 보체-제어-단백질 반복부(CCP) 또는 짧은 컨센서스 반복부를 포함한다. CR1의 막에 결합하지 않은 가용성 형태는 혈장에서 발견된다. 이는 CR1의 표면 형태의 절단에 의해 백혈구로부터의 방출에 의해 생성될 수 있다. CR1 및 sCR1의 구조는, 예를 들어, 문헌[Liu, D. et al. (2009) Immunopharmacology and Immunotoxicology 31: 524-535]에 기재되어 있다.
일부 실시형태에서, CR1 또는 이의 단편은 인간 CR1 또는 이의 단편이다.
CR1 서열의 예는 다음과 같다:
CR1을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 예는 다음과 같다:
일부 실시형태에서, CR1 또는 이의 단편은 가용성 CR1(sCR1)이다.
CR1 단편은 바람직하게는 C3b의 CFI-매개 절단을 위한 보조인자로서 작용할 수 있다. 당업자는 당업계에 알려진 임의의 적합한 방법, 예를 들어, 본 명세서에 개시된 바와 같은 방법을 사용하여 이와 같은 CFI 활성을 용이하게 결정할 수 있을 것이다.
CR1은 C3b에 대한 2개의 알려진 결합 부위를 포함한다(문헌[Liu, D. et al. (2009) Immunopharmacology and Immunotoxicology 31: 524-535] 참조). 바람직한 실시형태에서, CR1 단편은 1 또는 2개의 C3b 결합 부위를 포함한다.
바람직하게는, CR1의 단편은, 예를 들어, 전장 CR1로부터 막관통 및 세포질 도메인을 제거함으로써 및/또는 특정 CCP를 포함하거나 이로 이루어진 CR1 절단부를 선택함으로써 생성되는, CR1의 가용성 단편이다.
CR1 단편의 예는 당업계에 알려져 있다(예를 들어, WO2019138137 참조). 예를 들어, CR1 단편은 CCP 8 내지 10(예를 들어, 서열번호 24의 491 내지 684번 아미노산에 해당함) 및/또는 CCP 15 내지 17(예를 들어, 서열번호 24의 941 내지 1134번 아미노산에 해당함)을 포함하거나 이루어질 수 있다.
일부 실시형태에서, CR1 단편은 CCP 8 내지 10을 포함한다. 일부 실시형태에서, CR1 단편은 CCP 15 내지 17을 포함한다. 일부 실시형태에서, CR1 단편은 CCP 8 내지 10 및 CCP 15 내지 17을 포함한다.
다른 실시형태에서, CR1을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 24와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩한다. 바람직하게는, 여기서 상기 아미노산 서열은 서열번호 24에 의해 표시되는 단백질의 기능적 활성을 실질적으로 보유한다.
다른 실시형태에서, CR1을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 24의 아미노산 서열을 인코딩한다.
다른 실시형태에서, CR1을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 24의 491 내지 684번 위치와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩한다. 바람직하게는, 여기서 상기 아미노산 서열은 서열번호 24에 의해 표시되는 단백질의 기능적 활성을 실질적으로 보유한다.
다른 실시형태에서, CR1을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 24의 491 내지 684번 위치의 아미노산 서열을 인코딩한다.
다른 실시형태에서, CR1을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 24의 941 내지 1134번 위치와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩한다. 바람직하게는, 여기서 상기 아미노산 서열은 서열번호 24에 의해 표시되는 단백질의 기능적 활성을 실질적으로 보유한다.
다른 실시형태에서, CR1을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 24의 941 내지 1134번 위치의 아미노산 서열을 인코딩한다.
막
보조인자
단백질(
MCP
)
CD46으로도 알려진 막 보조인자 단백질(MCP)은 보체 시스템의 조절 부분으로 기능하고 CFI를 위한 보조인자로서 작용하는 I형 막 단백질이다.
MCP의 세포외 영역은 4개의 짧은 컨센서스 반복부(SCR)를 포함한다.
일부 실시형태에서, MCP 또는 이의 단편은 인간 MCP 또는 이의 단편이다.
MCP 서열의 예는 다음과 같다:
MCP를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 예는 다음과 같다:
일부 실시형태에서, MCP 또는 이의 단편은 가용성 MCP이다.
MCP 단편은 바람직하게는 C3b의 CFI-매개 절단을 위한 보조인자로서 작용할 수 있다. 당업자는 당업계에 알려진 임의의 적합한 방법, 예를 들어, 본 명세서에 개시된 바와 같은 방법을 사용하여 이와 같은 CFI 활성을 용이하게 결정할 수 있을 것이다.
바람직하게는, MCP의 단편은, 예를 들어, 전장 MCP로부터 막관통 도메인을 제거함으로써 및/또는 특정 SCR을 포함하거나 이로 이루어진 MCP 절단부를 선택함으로써 생성되는, MCP의 가용성 단편이다. 일부 실시형태에서, MCP 단편은 SCR 2 및 3을 포함한다. 일부 실시형태에서, MCP 단편은 SCR 2, 3 및 4를 포함한다.
다른 실시형태에서, MCP를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 26과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩한다. 바람직하게는, 여기서 상기 아미노산 서열은 서열번호 26에 의해 표시되는 단백질의 기능적 활성을 실질적으로 보유한다.
다른 실시형태에서, MCP를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 26의 아미노산 서열을 인코딩한다.
링커
바람직한 실시형태에서, (i)을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 (ii)를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 상류에 있다. 다른 실시형태에서, (ii)를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 (i)을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 상류에 있다.
일부 실시형태에서, (i) 및 (ii)를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 링커에 의해 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시형태에서, 링커는 자가-절단 2A 펩타이드 서열, 예컨대, 퓨린 절단 부위, GSG, 11a1D 및 F2A 서열을 포함하거나 이에 의해 한정되는 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 링커는 서열번호 17이다.
(서열번호 17)
다른 실시형태에서, 링커는 서열번호 17과 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는다. 바람직하게는, 링커는 서열번호 17의 기능적 활성을 실질적으로 보유한다.
"작동 가능하게 연결된"이란, 개별 구성요소가 실질적으로 방해받지 않으면서 이들의 기능을 수행할 수 있게 하는 방식으로 함께 연결되는 것으로 이해하여야 한다.
제품
본 발명의 제품은, 예를 들어, (i) 보체 인자 I(CFI) 보조인자; 및 (ii) 보체 인자 I(CFI), 또는 이를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 혼합물로 포함하는 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)일 수 있다. 대안적으로, 제품은, 예를 들어, (i) 보체 인자 I(CFI) 보조인자; 및 (ii) 보체 인자 I(CFI), 또는 이를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 제제, 및 선택적으로 이를 필요로 하는 대상체에 대한 상기 제제의 동시, 순차적 또는 개별 투여를 위한 지침을 포함하는 키트일 수 있다.
본 발명의 제품은, 예를 들어, (i) 보체 인자 H 유사 단백질 1(FHL1) 또는 보체 인자 H(CFH); 및 (ii) 보체 인자 I(CFI), 또는 이를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 혼합물로 포함하는 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)일 수 있다. 대안적으로, 제품은, 예를 들어, (i) 보체 인자 H 유사 단백질 1(FHL1) 또는 보체 인자 H(CFH); 및 (ii) 보체 인자 I(CFI), 또는 이를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 제제, 및 선택적으로 이를 필요로 하는 대상체에 대한 상기 제제의 동시, 순차적 또는 개별 투여를 위한 지침을 포함하는 키트일 수 있다.
단백질 형질도입
폴리뉴클레오타이드를 세포로 전달하는 것에 대한 대안으로서, 본 발명의 제품 및 작용제는 단백질 형질도입에 의해 세포로 전달될 수 있다.
단백질 형질도입은 벡터 전달을 통해 이루어질 수 있다(Cai, Y. et al. (2014) Elife 3: e01911; Maetzig, T. et al. (2012) Curr. Gene Ther. 12: 389-409). 벡터 전달은 세포로 전달될 단백질을 포함하도록 바이러스 입자(예를 들어, 렌티바이러스 입자)를 조작하는 것을 포함한다. 따라서, 조작된 바이러스 입자가 자연적인 생활 주기의 일부로 세포에 들어가면, 입자에 포함된 단백질이 세포로 운반된다.
단백질 형질도입은 단백질 전달을 통해 이루어질 수 있다(Gaj, T. et al. (2012) Nat. Methods 9: 805-7). 단백질 전달은, 예를 들어, 비히클(예를 들어, 리포솜)을 이용하거나 심지어 세포로 단백질 자체를 직접 투여함으로써 달성될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드
본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 DNA 또는 RNA, 바람직하게는 DNA를 포함할 수 있다. 이는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 다수의 상이한 폴리뉴클레오타이드가 유전 코드의 축퇴의 결과로 동일한 폴리펩타이드를 인코딩할 수 있음을 당업자는 이해할 것이다. 추가적으로, 당업자는 일상적인 기법을 사용하여, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드 서열에 영향을 미치지 않는 뉴클레오타이드 치환이 본 발명의 폴리펩타이드가 발현될 임의의 특정 숙주 유기체의 코돈 사용빈도를 반영하게 할 수 있음을 이해하여야 한다.
본 명세서에 개시된 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은, 예를 들어, 바이시스트로닉 벡터에서의 위치에 따라, 서열의 3' 말단에 정지 코돈을 포함할 수 있거나 정지 코돈이 없을 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 정지 코돈이 존재하거나 존재하지 않는 본 명세서에 개시된 서열번호를 포함한다.
폴리뉴클레오타이드는 당업계에서 이용 가능한 임의의 방법에 의해 변형될 수 있다. 이와 같은 변형은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 생체내 활성 또는 수명을 향상시키기 위해 수행될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드, 예컨대, DNA 폴리뉴클레오타이드는 재조합적으로, 합성적으로 또는 당업자에게 이용 가능한 임의의 수단에 의해 생성될 수 있다. 이는 또한 표준 기법에 의해 클로닝될 수 있다.
더 긴 폴리뉴클레오타이드는 일반적으로, 재조합 수단을 사용하여, 예를 들어, 중합효소 연쇄 반응(PCR) 클로닝 기법을 사용하여, 생성될 것이다. 이는 클로닝하고자 하는 표적 서열에 측접하는 한 쌍의 (예를 들어, 약 15 내지 30개 뉴클레오타이드의) 프라이머를 제조하는 단계, 프라이머를 동물 또는 인간 세포로부터 수득한 mRNA 또는 cDNA와 접촉시키는 단계, 원하는 영역의 증폭을 야기하는 조건 하에서 중합효소 연쇄 반응을 수행하는 단계, (예를 들어, 아가로스 겔을 이용하여 반응 혼합물을 정제함으로써) 증폭된 단편을 단리하는 단계 및 증폭된 DNA를 회수하는 단계를 포함할 것이다. 프라이머는 증폭된 DNA가 적합한 벡터로 클로닝될 수 있도록 적합한 제한 효소 인지 부위를 포함하도록 설계될 수 있다.
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 22의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
(서열번호 22)
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 23의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
(서열번호 23)
눈의 구조
본 명세서에 개시된 약제는 안질환, 예컨대, 연령-관련 황반 변성(AMD)의 치료 또는 예방과 관련하여 포유동물, 바람직하게는 인간 눈에 전달될 수 있다.
눈 질환의 치료에 있어서 당업자는 눈의 구조에 대해 상세하고 철저하게 이해할 것이다. 그러나, 본 발명과 특히 관련이 있는 다음 구조를 기재한다.
망막
망막은 다층 막으로, 이는 눈의 내부 후안방의 안쪽에 대어져 있고 시신경을 통해 뇌로 전달되는 시각적 세계의 이미지를 감지한다. 눈의 내부에서 외부의 순서로, 망막은 신경망막 망막 및 망막색소상피의 층을 포함하며, 이 때 맥락막은 망막색소상피의 외부에 놓여 있다.
신경감각
망막 및
광수용체
세포
신경감각 망막에는 빛을 직접 감지하는 광수용체 세포가 있다. 신경감각 망막은, 내경계막(ILM); 신경 섬유층; 신경절 세포층; 내망상층; 내과립층; 외망상층; 외과립층(광수용체의 핵); 외경계막(ELM); 및 광수용체(간상세포 및 원추세포의 내부 및 외부 단편)를 포함한다.
당업자는 광수용체 세포에 대한 상세한 이해를 가질 것이다. 간단히 말해서, 광수용체 세포는 빛을 생물학적 신호로 변환하는 망막에 위치한 특수 뉴런이다. 광수용체 세포는 간상 및 원추 세포를 포함하며, 망막 전체에 걸쳐 상이하게 분포되어 있다.
간상 세포는 주로 망막의 바깥 부분에 걸쳐 분포되어 있다. 이는 매우 민감하고 저조도에서 시야를 제공한다. 정상적인 인간 망막에는 평균 약 1억 2,500만개의 간상 세포가 있다.
원추 세포는 망막 전체에서 발견되지만, 특히 중심 고해상 시야를 담당하는 신경감각 망막의 패인 곳인, 중심와에 고도로 집중되어 있다. 원추 세포는 간상 세포보다 덜 민감하다. 정상 인간 망막에는 평균 약 6 내지 7백만개의 원추 세포가 있다.
망막색소상피
망막색소상피(RPE)는 신경감각 망막의 외부에 바로 위치한 세포의 색소 층이다. RPE는 광수용체 세포로 영양소 및 다른 물질을 수송하고, 산란광을 흡수하여 시야를 개선하는 것을 포함하여 다수의 기능을 수행한다.
맥락막
맥락막은 RPE와 눈의 외부 공막 사이에 위치한 혈관층이다. 맥락막의 맥관구조는 망막으로 산소 및 영양소의 제공을 가능하게 한다.
연령-관련 황반 변성(AMD)
연령-관련 황반 변성(AMD)의 임상적 진행은 황반의 변화에 따라 단계적으로 특징지어진다. 초기 AMD의 특징은 드루젠의 출현으로서, 상기 드루젠은 망막 아래에 세포외 파편의 축적물이며 임상 검사 동안 및 안저 사진 상에서 망막에 황색 반점으로 보인다. 드루젠은 크기에 따라 소형(< 63㎛), 중형(63 내지 124㎛) 및 대형(> 124㎛)으로 분류된다. 또한 드루젠은 안 검사시 가장자리의 외관에 따라서 경성 또는 연성으로 간주된다. 경성 드루젠은 명확하게 한정된 가장자리를 갖는 반면, 연성 드루젠은 덜 한정된 유동적인 가장자리를 갖는다. 연령-관련 안질환 연구(AREDS) 안저 촬영 중증도 척도는 이 병태에서 사용되는 주요 분류 시스템 중 하나이다.
AMD는 "건성"과 "습성"(삼출성 또는 신생혈관) 형태로 분류된다. 건성 AMD는 습성 AMD보다 더 흔하지만, 건성 형태는 습성 형태로 진행될 수 있으며, 상기 2갖는 상당수의 경우에 동시에 일어난다. 건성 AMD는 전형적으로 RPE 층의 세포, 그 위에 있는 광수용체 세포, 그리고 또한 종종 맥락막 모세혈관 층의 기저 세포의 점진적인 아포토시스를 특징으로 한다. 위에 있는 광수용체 위축을 동반하는 RPE 세포 사멸의 합류 영역은 지도모양 위축(GA)으로 지칭된다. 이러한 형태의 AMD가 있는 환자는 중심시에서 느리고 점진적인 악화를 경험한다.
습성 AMD는 RPE와 황반 아래의 맥락막 혈관(맥락막모세혈관층)으로부터 성장한 비정상적인 혈관으로부터의 출혈 및/또는 체액 누출로 특징지어지며, 이는 갑작스럽고 장애를 입히는 시야 손실의 원인이 될 수 있다. 환자가 경험하는 시야 손실의 많은 부분은 이와 같은 맥락막 신생혈관(CNV) 및 이의 2차 합병증으로 인한 것으로 추정된다.
본 명세서에 기재된 AMD의 치료 또는 예방은 상기 기재된 AMD 표현형의 출현을 감소 또는 예방할 수 있다. 바람직하게는 AMD의 치료는 시기능의 유지 또는 개선을 가능하게 한다.
일부 실시형태에서, AMD의 치료 또는 예방은 지도모양 위축 형성의 예방 또는 감소를 초래한다. 다른 실시형태에서, AMD의 치료 또는 예방은 지도모양 위축의 진행을 늦추게 한다. 예를 들어, 이는 동일한 기간 동안 치료되지 않은 눈에 비해, 대상체의 치료된 눈에 투여한 후 12개월에 걸쳐 GA 영역의 증가에서 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%의 감소를 초래한다. 다른 실시형태에서, AMD의 치료 또는 예방은 지도모양 위축의 치료, 예를 들어, 지도모양 위축의 양의 감소를 초래한다.
일부 실시형태에서, AMD의 치료 또는 예방은 드루젠 형성의 예방 또는 감소를 초래한다. 다른 실시형태에서, AMD의 치료 또는 예방은 기존 드루젠의 감소, 예를 들어, 기존 드루젠의 크기 및/또는 수의 감소를 초래한다.
일부 실시형태에서, AMD의 치료 또는 예방은 보체 침착의 예방 또는 감소를 초래한다. 다른 실시형태에서, AMD의 치료 또는 예방은 기존 보체 침착의 감소를 초래한다.
일부 실시형태에서, AMD의 치료 또는 예방은 시야 또는 시력의 개선 또는 복원을 초래한다. 다른 실시형태에서, AMD의 치료 또는 예방은 시야 또는 시력 손실을 완화시킨다.
일부 실시형태에서, AMD의 치료 또는 예방은 대상체에서 읽기 속도의 개선 또는 복원을 초래한다. 다른 실시형태에서, AMD의 치료 또는 예방은 대상체에서 읽기 속도의 감소를 완화시킨다.
일부 실시형태에서, AMD의 치료 또는 예방은 광수용체 및/또는 망막색소상피(RPE)의 손실의 감소 또는 예방을 초래한다.
당뇨망막병증
당뇨망막병증은 망막의 혈관 손상을 특징으로 하는 병태로서, 이는 당뇨병과 연관된 고혈당 수준으로 유발된다. 치료하지 않고 방치하면, 당뇨망막병증은 실명을 유발할 수 있다.
경증 당뇨망막병증이 있는 대상체는 양호한 시야를 가질 수 있지만, 특정 유형의 당뇨망막병증, 즉, 당뇨병성 황반 부종(DMO) 및 증식성 당뇨망막병증(PDR)은 대상체의 시력을 위협할 수 있다.
당뇨병성 황반 부종은 눈 뒤쪽의 손상된 혈관으로부터의 체액 누출을 특징으로 한다. 누출된 체액은 황반에 축적되어, 종창 및 시야 흐려짐을 야기한다. 이는 결국 중심시가 나빠지게 하고 독서 또는 운전을 불가능하게 할 수 있다. 측면 시야는 보통 정상으로 유지된다.
증식성 당뇨망막병증은 망막 혈관이 폐쇄되어 망막 표면에 비정상적인 약한 혈관의 성장을 야기하는 것을 특징으로 한다. 이는 눈으로의 출혈, 흉터 및 망막 박리로 인한 영구적인 시야 손실을 초래할 수 있다. 비-증식성 망막병증은 치료하지 않고 방치하면 증식성 망막병증을 야기할 수 있는 당뇨망막병증의 초기 단계이다. 따라서, 당뇨망막병증의 모든 단계 및 유형에 대한 치료가 고려된다.
벡터
벡터는 하나의 환경에서 다른 환경으로 실체의 이동을 가능하게 하거나 용이하게 하는 도구이다.
아데노
-연관 바이러스(
AAV
) 벡터
일 양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 AAV 벡터를 제공한다.
바람직하게는, AAV 벡터는 AAV 벡터 입자의 형태이다.
바이러스 벡터 및 바이러스 벡터 입자, 예컨대, AAV로부터 유래된 것을 제조하고 변형하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
AAV 벡터는 AAV 게놈 또는 이의 단편 또는 유도체를 포함할 수 있다.
AAV는 크기가 최대 5.2 kb인 게놈을 패키징할 수 있는 것으로 알려져 있다(Dong, J.-Y. et al. (1996) Human Gene Therapy 7: 2101-2112).
AAV 게놈은, AAV 입자의 생성에 필요한 기능을 인코딩할 수 있는 폴리뉴클레오타이드 서열이다. 이러한 기능은 AAV 게놈을 AAV 입자로 캡슐화하는 것을 포함하여, 숙주 세포에서 AAV의 복제 및 패키징 사이클에서 작동하는 것을 포함한다. 자연적으로 발생하는 AAV는 복제-결핍성이고, 복제 및 패키징 사이클의 완료를 위해 트랜스(trans)로 헬퍼 기능의 제공에 의존한다. 따라서, 본 발명의 AAV 벡터의 AAV 게놈은 전형적으로 복제-결핍성이다.
AAV 게놈은 포지티브 또는 네거티브-센스의 단일 가닥 형태, 또는 대안적으로 이중 가닥 형태일 수 있다. 이중 가닥 형태의 사용은 표적 세포에서 DNA 복제 단계를 우회할 수 있게 하므로 이식유전자(transgene) 발현을 가속화할 수 있다.
AAV 게놈은 AAV의 임의의 자연 유래 혈청형, 분리물 또는 클레이드(clade)로부터 유래될 수 있다. 따라서, AAV 게놈은 자연적으로 발생하는 AAV의 전체 게놈일 수 있다. 당업자에게 알려진 바와 같이, 자연에서 발생하는 AAV는 다양한 생물학적 시스템에 따라 분류될 수 있다.
일반적으로, AAV는 이의 혈청형의 관점에서 지칭된다. 혈청형은 캡시드 표면 항원의 발현 프로파일로 인해 다른 변이 아종과 구별하는 데 사용될 수 있는 독특한 반응성을 갖는 AAV의 변이 아종에 해당한다. 전형적으로, 특정 AAV 혈청형을 갖는 바이러스는 임의의 다른 AAV 혈청형에 특이적인 중화 항체와 효율적으로 교차반응하지 않는다.
AAV 혈청형은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 및 AAV11, 및 또는 최근에 영장류 뇌에서 식별된 재조합 혈청형, 예컨대, Rec2 및 Rec3을 포함한다. 이들 AAV 혈청형 중 임의의 것이 본 발명에서 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, AAV 벡터 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rec2 또는 Rec3 AAV 벡터 입자이다.
일부 실시형태에서, AAV는 AAV1, AAV2, AAV5, AAV7 또는 AAV8 혈청형일 수 있다.
일부 실시형태에서, AAV는 AAV2 또는 AAV8 혈청형일 수 있다.
일부 실시형태에서, AAV는 AAV2 혈청형일 수 있다. 다른 실시형태에서, AAV는 AAV8 혈청형일 수 있다.
캡시드 단백질은, 예컨대, WO 2008/124724에 개시된 돌연변이체 캡시드 단백질일 수 있으며, 상기 출원은 본 명세서에 참고로 포함된다.
일부 실시형태에서, AAV 벡터는 Y733F 돌연변이가 있는 AAV8 캡시드를 포함한다.
AAV 혈청형에 대한 검토는 문헌[Choi et al. (2005) Curr. Gene Ther. 5: 299-310 및 Wu et al. (2006) Molecular Therapy 14: 316-27]에서 찾을 수 있다. 본 발명에서 사용하기 위한 ITR 서열, rep 또는 cap 유전자를 포함하는 AAV 게놈의 서열 또는 AAV 게놈의 요소의 서열은 AAV 전체 게놈 서열에 대한 다음 수탁 번호로부터 유래될 수 있다: 아데노-연관 바이러스 1 NC_002077, AF063497; 아데노-연관 바이러스 2 NC_001401; 아데노-연관 바이러스 3 NC_001729; 아데노-연관 바이러스 3B NC_001863; 아데노-연관 바이러스 4 NC_001829; 아데노-연관 바이러스 5 Y18065, AF085716; 아데노-연관 바이러스 6 NC_001862; 조류 AAV ATCC VR-865 AY186198, AY629583, NC_004828; 조류 AAV 균주 DA-1 NC_006263, AY629583; 소 AAV NC_005889, AY388617.
AAV는 또한 클레이드 또는 클론의 관점에서 지칭될 수 있다. 이는 자연적으로 유래된 AAV의 계통발생 관례, 및 전형적으로 공통 조상으로 거슬러 올라갈 수 있는 AAV의 계통발생 그룹을 지칭하고, 이의 모든 후손을 포함한다. 추가적으로, AAV는 특정 단리체, 즉, 자연에서 발견되는 특정 AAV의 유전적 단리체의 관점에서 지칭될 수 있다. 용어 유전적 단리체는 다른 자연적으로 발생하는 AAV와 제한된 유전적 혼합을 겪고, 이에 의해 유전적 수준에서 인식 가능하게 구별되는 집단을 한정하는 AAV의 집단을 기재한다.
당업자는 공통되는 일반 상식을 기초로 하여 본 발명에서 사용하기 위한 AAV의 적절한 혈청형, 클레이드, 클론 또는 단리체를 선택할 수 있다. 예를 들어, AAV5 캡시드는 유전된 색각 결함의 성공적인 교정에 의해 입증된 바와 같이 영장류 원추 광수용체를 효율적으로 형질도입하는 것으로 나타났다(Mancuso et al. (2009) Nature 461: 784-7).
AAV 혈청형은 AAV의 감염의 조직 특이성(또는 향성)을 결정한다. 따라서, 본 발명에 따라 환자에게 투여되는 AAV에서 사용하기 위한 바람직한 AAV 혈청형은 눈 내 표적 세포에 대한 자연적 향성 또는 상기 표적 세포의 감염에 대한 높은 효율을 갖는 것이다. 일부 실시형태에서, 본 발명에서 사용하기 위한 AAV 혈청형은 신경감각 망막, 망막색소상피 및/또는 맥락막의 세포를 형질도입하는 것이다.
전형적으로, AAV의 자연적으로 유래된 혈청형, 단리체 또는 클레이드의 AAV 게놈은 적어도 하나의 반전 말단 반복부 서열(ITR)을 포함한다. ITR 서열은 시스(cis)로 작용하여 기능적인 복제 기점을 제공하고 세포의 게놈으로부터 벡터의 통합 및 절제를 가능하게 한다. 바람직한 실시형태에서, 하나 이상의 ITR 서열은 보체 인자 I, 및/또는 보체 인자 H 또는 FHL1을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 측접한다. AAV 게놈은 전형적으로 또한 패키징 유전자, 예컨대, AAV 입자에 대한 피키징 기능을 인코딩하는 rep 및/또는 cap 유전자를 포함한다. rep 유전자는 단백질 Rep78, Rep68, Rep52 및 Rep40 또는 이들의 변이체 중 하나 이상을 인코딩한다. cap 유전자는 하나 이상의 캡시드 단백질, 예컨대, VP1, VP2 및 VP3 또는 이들의 변이체를 인코딩한다. 이들 단백질은 AAV 입자의 캡시드를 구성한다. 캡시드 변이체는 하기에 논의되어 있다.
프로모터는 패키징 유전자의 각각에 작동 가능하게 연결될 것이다. 이와 같은 프로모터의 구체적인 예는 p5, p19 및 p40 프로모터를 포함한다(Laughlin et al. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 5567-5571). 예를 들어, p5 및 p19 프로모터는 일반적으로 rep 유전자를 발현하는 데 사용되는 한편, p40 프로모터는 일반적으로 cap 유전자를 발현하는 데 사용된다.
상기 논의된 바와 같이, 따라서 본 발명의 AAV 벡터에서 사용되는 AAV 게놈은 자연적으로 발생하는 AAV의 전체 게놈일 수 있다. 예를 들어, 전체 AAV 게놈을 포함하는 벡터는 AAV 벡터 또는 벡터 입자를 시험관내에서 제조하는 데 사용될 수 있다. 그러나, 이와 같은 벡터는 원칙적으로 환자에게 투여될 수 있지만, 실제로는 거의 수행되지 않을 것이다. 바람직하게는, AAV 게놈은 환자에게 투여할 목적으로 유도체화될 것이다. 이와 같은 유도체화는 당업계의 표준이며 본 발명은 AAV 게놈의 임의의 알려진 유도체의 사용, 및 당업계에 알려진 기법을 적용함으로써 생성될 수 있는 유도체를 포함한다. AAV 게놈 및 AAV 캡시드의 유도체화는 문헌[Coura and Nardi (2007) Virology Journal 4: 99], 및 상기 언급한 문헌[Choi et al. 및 Wu et al.]에서 검토된다.
AAV 게놈의 유도체는 생체내에서 본 발명의 AAV 벡터로부터 이식유전자의 발현을 가능하게 하는 AAV 게놈의 임의의 절단 또는 변형된 형태를 포함한다. 전형적으로, 최소한의 바이러스 서열을 포함하면서도 상기 기능을 보유하도록 AAV 게놈을 상당히 절단하는 것이 가능하다. 이는 야생형 바이러스에 의한 벡터의 재조합 위험을 감소시키고, 또한 표적 세포에서 바이러스 유전자 단백질의 존재에 의한 세포 면역 반응의 촉발을 회피하기 위한 안전상의 이유로 바람직하다.
전형적으로, 유도체는 적어도 하나의 반전 말단 반복부 서열(ITR), 바람직하게는 하나 초과의 ITR, 예컨대, 2개 이상의 ITR을 포함할 것이다. ITR 중 하나 이상은 상이한 혈청형을 갖는 AAV 게놈으로부터 유래될 수 있거나, 키메라 또는 돌연변이 ITR일 수 있다. 바람직한 돌연변이 ITR은 trs(terminal resolution site; 말단 분해 부위)의 결실이 있는 것이다. 이러한 결실은 코딩 및 상보적 서열을 둘 다 포함하는 단일 가닥 게놈, 즉, 자가-상보적 AAV 게놈을 생성하기 위해 게놈의 지속적인 복제를 가능하게 한다. 이는 표적 세포에서 DNA 복제의 우회를 가능하게 하므로, 이식유전자 발현을 가속화할 수 있다.
하나 이상의 ITR은 바람직하게는 양쪽 말단에서 보체 인자 I, 및/또는 CFI 보조인자(예를 들어, 보체 인자 H 또는 FHL1)를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 측접할 것이다. 하나 이상의 ITR의 포함은, 예를 들어, 숙주 세포 DNA 중합효소의 작용에 의해 단일 가닥 벡터 DNA를 이중 가닥 DNA로 전환시킨 후, 숙주 세포의 핵에서 본 발명의 벡터의 연쇄체(concatamer) 형성을 돕는 데 바람직하다. 이와 같은 에피솜 연쇄체의 형성은 숙주 세포의 수명 동안 벡터 작제물을 보호하여, 생체내 이식유전자의 장기간 발현을 가능하게 한다.
바람직한 실시형태에서, ITR 요소는 유도체에서 천연 AAV 게놈으로부터 보유되는 유일한 서열일 것이다. 따라서, 유도체는 바람직하게는 천연 게놈의 rep 및/또는 cap 유전자 및 천연 게놈의 임의의 다른 서열을 포함하지 않을 것이다. 이는 상기 기재된 이유로, 또한 벡터가 숙주 세포 게놈으로 통합할 가능성을 감소시킨다는 이유로 바람직하다. 추가적으로, AAV 게놈의 크기를 감소시키는 것은 이식유전자에 추가적으로 벡터 내에서 다른 서열 요소(예컨대, 조절 요소)를 통합할 때 유연성의 증가를 가능하게 한다.
따라서, 다음 부분은 본 발명의 유도체에서 제거될 수 있다: 하나의 반전 말단 반복부(ITR) 서열, 복제(rep) 및 캡시드(cap) 유전자. 그러나, 일부 실시형태에서, 유도체는 추가적으로 하나 이상의 rep 및/또는 cap 유전자 또는 AAV 게놈의 다른 바이러스 서열을 포함할 수 있다. 자연적으로 발생하는 AAV는 인간 염색체 19번의 특정 위치에서 높은 빈도로 통합하고, 매우 적은 빈도의 무작위 통합을 나타내므로, 벡터에서 통합 능력의 유지가 치료 환경에서 용인될 수 있다.
유도체가 캡시드 단백질, 즉, VP1, VP2 및/또는 VP3을 포함하는 경우, 유도체는 하나 이상의 자연적으로 발생하는 AAV의 키메라, 셔플 또는 캡시드-변형 유도체일 수 있다. 특히, 본 발명은 동일한 벡터(즉, 위형(pseudotyped) 벡터) 내에서 AAV의 상이한 혈청형, 클레이드, 콜론, 또는 단리체 유래의 캡시드 단백질 서열의 제공을 포함한다.
키메라, 셔플 또는 캡시드-변형 유도체는 전형적으로 AAV 벡터에 대한 하나 이상의 원하는 기능을 제공하기 위해 선택될 것이다. 따라서, 이러한 유도체는 자연적으로 발생하는 AAV 게놈을 포함하는 AAV 벡터, 예컨대, AAV2와 비교하여 유전자 전달의 효율 증가, 면역원성 감소(체액성 또는 세포성), 향성 범위의 변경 및/또는 특정 세포 유형의 표적화 개선을 나타낼 수 있다. 유전자 전달의 효율 증가는 세포 표면에서 수용체 또는 공동수용체 결합의 개선, 내재화 개선, 세포 내 및 핵으로의 전달(trafficking) 개선, 바이러스 입자의 탈외피 개선 및 단일 가닥 게놈의 이중 가닥 형태로의 전환 개선에 의해 영향을 받을 수 있다. 효율 증가는 또한 특정 세포 집단의 향성 범위 또는 표적화의 변경과 관련될 수 있어, 벡터 용량은 필요하지 않은 조직에 투여함으로써 희석되지 않는다.
키메라 캡시드 단백질은 자연적으로 발생하는 AAV 혈청형의 2개 이상의 캡시드 코딩 서열 사이의 재조합에 의해 생성된 것을 포함한다. 이는, 예를 들어, 하나의 혈청형의 비-감염성 캡시드 서열이 상이한 혈청형의 캡시드 서열과 공동형질감염되고 유도된 선택이 원하는 특성을 갖는 캡시드 서열을 선택하는 데 사용되는 마커 구제 접근법에 의해 수행될 수 있다. 상이한 혈청형의 캡시드 서열은 세포 내에서 상동성 재조합에 의해 변경되어 신규 키메라 캡시드 단백질을 생성할 수 있다.
키메라 캡시드 단백질은 또한 캡시드 단백질 서열을 조작하여 2개 이상의 캡시드 단백질 사이, 예를 들어, 상이한 혈청형의 2개 이상의 캡시드 단백질 사이의 특정 캡시드 단백질 도메인, 표면 루프 또는 특정 아미노산 잔기를 전달함으로써 생성되는 것을 포함한다.
셔플 또는 키메라 캡시드 단백질은 또한 DNA 셔플링 또는 오류 발생이 쉬운(error-prone) PCR에 의해 생성될 수 있다. 하이브리드 AAV 캡시드 유전자는 관련 AAV 유전자의 서열, 예를 들어, 다수의 상이한 혈청형의 캡시드 단백질을 인코딩하는 것을 무작위로 단편화한 다음 이후 자가-프라이밍 중합효소 반응에서 단편을 재조립함으로써 생성될 수 있으며, 이는 또한 서열 상동성 영역에서 교차를 유발할 수 있다. 여러 혈청형의 캡시드 유전자를 셔플링함으로써 이러한 방식으로 생성된 하이브리드 AAV 유전자의 라이브러리를 스크리닝하여 원하는 기능성을 갖는 바이러스 클론을 식별할 수 있다. 유사하게, 오류 발생이 쉬운 PCR을 AAV 캡시드 유전자를 무작위로 돌연변이시키는 데 사용하여 그 다음 원하는 특성에 대해 선택될 수 있는 다양한 변이체 라이브러리를 형성할 수 있다.
캡시드 유전자의 서열은 또한 천연 야생형 서열에 대하여 특정 결실, 치환 또는 삽입을 도입하도록 유전적으로 변형될 수 있다. 특히, 캡시드 유전자는 캡시드 코딩 서열의 오픈 리딩 프레임 내에서, 또는 캡시드 코딩 서열의 N- 및/또는 C-말단에서 관련되지 않은 단백질 또는 펩타이드의 서열의 삽입에 의해 변형될 수 있다.
관련되지 않은 단백질 또는 펩타이드는 유리하게는 특정 세포 유형에 대한 리간드로서 작용하는 것일 수 있으며, 이에 의해 표적 세포에 대한 결합의 개선 또는 특정 세포 집단에 대한 벡터의 표적화 특이성의 개선을 부여할 수 있다. 예는 망막색소상피에서 흡수를 차단하여 주변 망막 조직의 형질도입을 향상시키기 위해 RGD 펩타이드의 사용을 포함할 수 있다(Cronin et al. (2008) ARVO Abstract: D1048). 관련되지 않은 단백질은 또한 생성 과정의 일부로서 바이러스 입자의 정제를 돕는 것, 즉, 에피토프 또는 친화성 태그일 수 있다. 삽입 부위는 전형적으로 바이러스 입자의 다른 기능, 예를 들어, 바이러스 입자의 내재화, 전달을 방해하지 않도록 선택될 것이다. 당업자는 공통되는 일반 상식을 기초로 하여 삽입에 적합한 부위를 식별할 수 있다. 특정 부위는 상기 언급한 문헌 [Choi et al.]에 개시되어 있다.
본 발명은 추가적으로 천연 AAV 게놈의 서열과 상이한 순서 및 구성으로 AAV 게놈의 서열을 제공하는 것을 포함한다. 본 발명은 또한 하나 이상의 AAV 서열 또는 유전자를 다른 바이러스 유래의 서열 또는 하나 초과의 바이러스 유래의 서열로 구성된 키메라 유전자로 대체하는 것을 포함한다. 이와 같은 키메라 유전자는 상이한 바이러스 종의 2가지 이상의 관련된 바이러스 단백질 유래의 서열로 구성될 수 있다.
본 발명의 AAV 벡터는 AAV 게놈 또는 이의 유도체를 포함하는 뉴클레오타이드 서열 및 보체 인자 I, 및/또는 보체 인자 H 또는 FHL1 이식유전자를 인코딩하는 서열 또는 이의 유도체의 형태를 취할 수 있다.
본 발명의 AAV 입자는 하나의 혈청형의 ITR을 갖는 AAV 게놈 또는 유도체가 상이한 혈청형의 캡시드에 패키징된 트랜스캡시드화(transcapsidated) 형태를 포함한다. 본 발명의 AAV 입자는 또한 2가지 이상의 상이한 혈청형 유래의 변형되지 않은 캡시드 단백질의 혼합물이 바이러스 캡시드를 구성하는 모자이크 형태를 포함한다. AAV 입자는 또한 캡시드 표면에 흡착된 리간드를 보유하는 화학적으로 변형된 형태를 포함한다. 예를 들어, 이와 같은 리간드는 특정 세포 표면 수용체를 표적으로 하기 위한 항체를 포함할 수 있다.
따라서, 예를 들어, 본 발명의 AAV 입자는 AAV2 게놈 및 AAV2 캡시드 단백질(AAV2/2)이 있는 것, AAV2 게놈 및 AAV5 캡시드 단백질(AAV2/5)이 있는 것 및 AAV2 게놈 및 AAV8 캡시드 단백질(AAV2/8)이 있는 것뿐만 아니라, AAV2 게놈 및 하나 초과 혈청형의 캡시드 단백질이 있는 것을 포함한다.
AAV 벡터는 본 명세서에서 언급된 뉴클레오타이드 서열의 복수 복제물(예를 들어, 2, 3개 등)을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 AAV ITR을 더 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 2개의 AAV ITR을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 이의 5' 말단에 AAV ITR 및 이의 3' 말단에 AAV ITR을 포함한다. 일부 실시형태에서, AAV ITR은 AAV2 또는 AAV8 ITR이다. 바람직한 실시형태에서, AAV ITR은 AAV2 ITR이다.
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 18의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열이 있는 5' AAV ITR을 포함한다.
(서열번호 18)
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 20의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가지고, 5' ITR의 3' 말단에 바로 인접한 뉴클레오타이드 서열을 더 포함한다.
(서열번호 20)
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 19의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열이 있는 3' AAV ITR을 포함한다.
(서열번호 19)
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 21의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가지고, 3' ITR의 5' 말단에 바로 인접한 뉴클레오타이드 서열을 더 포함한다.
(서열번호 21)
프로모터 및 조절 서열
본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터는 또한 시험관내 또는 생체내에서 보체 인자 I 및 CFI 보조인자, 예컨대, 보체 인자 H 및/또는 FHL1 이식유전자의 발현을 가능하게 하는 요소를 포함할 수 있다. 이는 발현 제어 서열로 지칭될 수 있다. 따라서, 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터는 전형적으로 이식유전자를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된 발현 제어 서열(예를 들어, 프로모터 서열을 포함함)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터는, (a) 보체 인자 I 및/또는 보체 인자 I(CFI) 보조인자, 예컨대, 보체 인자 H 및/또는 FHL1을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 상류에 있는 CMV 프로모터; (b) 보체 인자 I 및/또는 보체 인자 I(CFI) 보조인자, 예컨대, 보체 인자 H 및/또는 FHL1을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 하류에 있는 WPRE 조절 요소; 및/또는 (c) 폴리-A 신호, 예컨대, 소 성장 호르몬 폴리-A 신호(선택적으로, 폴리-A 신호는 보체 인자 I 및/또는 보체 인자 I(CFI) 보조인자, 예컨대, 보체 인자 H 및/또는 FHL1을 인코딩하는 뉴클레오타이드의 하류에 있음)를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터는,
(a)
5' AAV ITR;
(b)
CMV 프로모터;
(c)
보체 인자 I(CFI) 보조인자, 바람직하게는 FHL1을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(d)
링커(선택적으로, 링커는 퓨린 절단 부위, GSG, 11a1D 및 F2A 서열을 포함하거나 이에 의해 한정됨);
(e)
CFI를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(f)
WPRE 조절 요소(바람직하게는, WPRE 조절 요소는 WPRE3 조절 요소임);
(g)
소 성장 호르몬 폴리-A 신호; 및
(h)
3' AAV ITR
을 포함한다.
임의의 적합한 프로모터가 사용될 수 있으며, 이의 선택은 당업자에 의해 용이하게 이루어질 수 있다. 프로모터 서열은 구성적으로 활성적일 수 있거나(즉, 임의의 숙주 세포 배경에서 작동 가능함), 또는 대안적으로 특정 숙주 세포 환경에서만 활성적일 수 있어서, 특정 세포 유형에서 이식유전자의 표적화된 발현을 가능하게 할 수 있다(예를 들어, 조직-특이적 프로모터). 프로모터는 또 다른 인자, 예를 들어, 숙주 세포에 존재하는 인자의 존재에 반응하여 유도성 발현을 나타낼 수 있다. 아무튼, 벡터가 치료를 위해 투여되는 경우, 프로모터는 표적 세포 배경에서 기능적이어야 하는 것이 바람직하다.
일부 실시형태에서, 프로모터는 이식유전자가 망막 세포 집단에서만 발현될 수 있도록 망막-세포 특이적 발현을 나타내는 것이 바람직하다. 따라서, 프로모터로부터의 발현은 망막-세포 특이적일 수 있으며, 예를 들어, 신경감각 망막 및 망막색소상피의 세포에만 국한될 수 있다.
망막-세포 특이적이 아닌 바람직한 프로모터는, 선택적으로 사이토메갈로바이러스(CMV) 인핸서 요소와 조합된 닭 베타-액틴(CBA) 프로모터를 포함한다. 본 발명에서 사용하기 위한 프로모터의 예는 CAG 프로모터, 예를 들어, rAVE 발현 카세트에서 사용되는 프로모터(GeneDetect.com)이다.
바람직한 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터는 CMV 프로모터를 포함한다.
CMV 프로모터 서열의 예는 다음과 같다:
(서열번호 13)
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터는 서열번호 13과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열이 있는 프로모터를 포함한다. 바람직하게는, 여기서 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 13에 의해 표시되는 프로모터의 기능적 활성을 실질적으로 보유한다.
다른 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터는 서열번호 13의 뉴클레오타이드 서열이 있는 프로모터를 포함한다.
프로모터 서열의 추가 예는 다음과 같다:
(서열번호 5)
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터는 서열번호 5와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열이 있는 프로모터를 포함한다. 바람직하게는, 여기서 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 5에 의해 표시되는 프로모터의 기능적 활성을 실질적으로 보유한다.
다른 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터는 서열번호 5의 뉴클레오타이드 서열이 있는 프로모터를 포함한다.
망막-특이적 유전자 발현을 유도할 인간 서열에 기반한 프로모터의 예는 간상세포 및 원추세포에 대한 로돕신 키나제(Allocca et al. (2007) J. Virol. 81: 11372-80), 원추세포 단독에 대한 PR2.1(Mancuso et al. (2009) Nature 461: 784-7) 및/또는 망막색소상피에 대한 RPE65(Bainbridge et al. (2008) N. Engl. J. Med. 358: 2231-9) 또는 VMD2(Esumi et al. (2004) J. Biol. Chem. 279: 19064-73)를 포함한다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터는 또한 전사 전 또는 전사 후에 작용할 수 있는 하나 이상의 추가적인 조절 서열을 포함할 수 있다. 조절 서열은 천연 이식유전자 유전자좌의 일부일 수 있거나 이종성 조절 서열일 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터는 천연 이식유전자 전사체 유래의 5'-UTR 또는 3'-UTR의 일부를 포함할 수 있다.
조절 서열은 이식유전자의 발현을 용이하게 하는, 즉, 전사체의 발현을 증가시키거나, mRNA의 핵외수송을 개선시키거나 이의 안정성을 향상시키는 작용을 하는 임의의 서열이다. 이와 같은 조절 서열은, 예를 들어, 인핸서 요소, 전사 후 조절 요소 및 폴리아데닐화 부위를 포함한다.
바람직한 폴리아데닐화 부위는 소 성장 호르몬 폴리-A(bGH 폴리-A) 신호이다.
소 성장 호르몬 폴리-A(bGH 폴리-A) 신호의 예는 다음과 같다:
(서열번호 14)
소 성장 호르몬 폴리-A(bGH 폴리-A) 신호의 추가 예는 다음과 같다:
(서열번호 6)
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터는 서열번호 14 또는 6, 바람직하게는 서열번호 14와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열이 있는 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 바람직하게는, 여기서 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 14 또는 6에 의해 표시되는 폴리아데닐화 서열의 기능적 활성을 실질적으로 보유한다.
다른 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터는 서열번호 14 또는 6, 바람직하게는 서열번호 14의 뉴클레오타이드 서열이 있는 폴리아데닐화 신호를 포함한다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터의 맥락에서, 이와 같은 조절 서열은 시스-작용성일 것이다. 그러나, 본 발명은 또한 추가적인 유전자 작제물에 위치한 트랜스-작용 조절 서열의 사용을 포함한다.
본 발명의 AAV 벡터에서 사용하기 위한 바람직한 전사 후 조절 요소는 우드척 간염(woodchuck hepatitis) 전사 후 조절 요소(WPRE) 또는 이의 변이체이다.
WPRE의 예는 다음과 같다:
(서열번호 7)
WPRE는 감마, 알파 및 베타 요소를 주어진 순서로 포함하는 3부(tripartite) 요소이다. 최소한의 감마 및 알파 요소만을 포함하는 WPRE의 단축 형태(WPRE3으로 지칭됨; Choi, J.-H. et al. (2014) Molecular Brain 7: 17)가 또한 본 발명에서 사용될 수 있다.
WPRE3 서열의 예는 다음과 같다:
(서열번호 15)
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터는 서열번호 15 또는 7, 바람직하게는 서열번호 15와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열이 있는 전사 후 조절 요소를 포함한다. 바람직하게는, 여기서 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 15 또는 7에 의해 표시되는 전사 후 조절 요소의 기능적 활성을 실질적으로 보유한다.
다른 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터는 서열번호 15 또는 7, 바람직하게는 서열번호 15의 뉴클레오타이드 서열이 있는 전사 후 조절 요소를 포함한다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터에서 사용될 수 있는 또 다른 조절 서열은 스캐폴드-부착 영역(SAR)이다. 추가적인 조절 서열은 당업자에 의해 용이하게 선택될 수 있다.
투여 방법
본 발명의 제품, 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터는 전신으로(예를 들어, 말초 정맥 주입에 의해) 투여될 수 있고 국소적으로 또는 국지적으로(예를 들어, 척추강내 주사에 의해 CNS 시스템에) 투여될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 제품, 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터는 안내 투여된다.
용어 "안내(intraocular)"는 눈의 내부를 지칭하므로, 안내 투여는 대상체의 눈의 내부로의 투여와 관련된다.
일부 실시형태에서, 제품, 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터는 망막하, 망막에 직접, 맥락막위 또는 유리체내 주사에 의해 대상체의 눈에 투여된다. 일부 실시형태에서, 상기 투여는 로봇에 의해 수행된다.
주사되는 약제 조성물의 부피는, 예를 들어, 약 10 내지 500 ㎕, 예를 들어, 약 50 내지 500, 100 내지 500, 200 내지 500, 300 내지 500, 400 내지 500, 50 내지 250, 100 내지 250, 200 내지 250 또는 50 내지 150 ㎕일 수 있다. 부피는, 예를 들어, 약 10, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 또는 500 ㎕일 수 있다. 바람직하게는, 주사되는 약제 조성물의 부피는 100 ㎕이다.
당업자는 개별적인 망막하, 망막에 직접, 맥락막위 또는 유리체내 주사에 익숙하고 잘 수행할 수 있을 것이다.
바람직하게는, 제품, 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터는 망막하 주사에 의해 투여된다.
일부 실시형태에서, 제품, 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 대상체의 일생 동안 1회 이하, 또는 2회 이하로 투여된다.
망막하
주사
망막하 주사는 망막하 공간에, 즉, 신경감각 망막 아래에 주사하는 것이다. 망막하 주사 동안, 주사된 물질은 광수용체 세포 및 망막색소상피(RPE) 층으로 유도되고, 이들 사이에 공간을 형성한다.
작은 망막절개를 통해 주사가 수행될 때, 망막박리가 생길 수 있다. 주사된 물질에 의해 생성된 망막의 박리되고 돌출된 층은 "수포(bleb)"라고 지칭된다.
망막하 주사에 의해 생성된 구멍은 주사된 용액이 투여 후 유리체강으로 상당히 역류하지 않도록 충분히 작아야 한다. 이와 같은 역류는 약제가 주사될 때 특히 문제가 될 수 있는데, 그 이유는 약제의 효과가 표적 영역에서 멀어질 것이기 때문이다. 바람직하게는, 주사는 신경감각 망막에서 자가-밀봉 진입점을 생성하며, 즉, 일단 주사 바늘이 제거되면, 바늘에 의해 생성된 구멍은 재밀봉되어 주사된 물질이 구멍을 통해 아주 적게 방출되거나 실질적으로 방출되지 않도록 한다.
이러한 과정을 용이하게 하기 위해, 전문가용 망막하 주사 바늘이 상업적으로 시판되고 있다(예를 들어, DORC 41G 테플론(Teflon) 망막하 주사 바늘, 네덜란드 안과 국제 연구소 BV(Dutch Ophthalmic Research Center International BV), 네덜란드 쥐드랜드 소재). 이들은 망막하 주사를 수행하도록 설계된 바늘이다.
주사 동안 망막에 대한 손상이 일어나지 않고, 충분히 작은 바늘을 사용하는 한, 망막하로 주사된 모든 물질은 박리된 신경감각 망막과 국소화된 망막 박리 부위의 RPE 사이에 국한된 상태로 남아있다(즉, 유리체강으로 역류하지 않음). 실제로, 짧은 시간 프레임에 걸친 수포의 전형적인 지속성은 보통 주입된 물질이 유리체내로 빠져나가는 것이 거의 없음을 나타낸다. 수포는 주입된 물질이 흡수됨에 따라 더 긴 시간 프레임에 걸쳐 소실될 수 있다.
예를 들어, 광간섭단층촬영을 사용하여, 눈, 특히 망막의 시각화가 수술 전에 이루어질 수 있다.
주사되는 약제 조성물의 부피는, 예를 들어, 약 10 내지 500 ㎕, 예를 들어, 약 50 내지 500, 100 내지 500, 200 내지 500, 300 내지 500, 400 내지 500, 50 내지 250, 100 내지 250, 200 내지 250 또는 50 내지 150 ㎕일 수 있다. 부피는, 예를 들어, 약 10, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 또는 500 ㎕일 수 있다. 바람직하게는, 주사되는 약제 조성물의 부피는 100 ㎕이다. 더 많은 부피는 망막이 늘어지는 위험을 증가시킬 수 있는 한편, 더 적은 부피는 보기 어려울 수 있다.
2 단계
망막하
주사
본 발명의 제품, 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터는, 제1 용액의 망막하 주사에 의해 국소화된 망막 박리가 생성되는 2 단계 방법을 사용함으로써 증가된 정확성 및 안전성으로 전달될 수 있다. 제1 용액은 제품, 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터를 포함하지 않는다. 그 다음 제2 망막하 주사가 제품, 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터를 포함하는 약제를 제1 망막하 주사에 의해 생성된 수포의 망막하액으로 전달하는 데 사용된다. 약제를 전달하는 주사는 망막을 박리하는 데 사용되는 것이 아니기 때문에, 특정 부피의 용액이 이러한 제2 단계에서 주사될 수 있다.
일부 실시형태에서, 벡터의 망막하 주사는
(a)
망막을 적어도 부분적으로 박리하여 망막하 수포를 형성하는 데 효과적인 양으로 망막하 주사에 의해 대상체에 용액을 투여하되, 상기 용액은 제품, 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터를 포함하지 않는 것인 단계; 및
(b)
단계 (a)에 의해 형성된 수포에 망막하 주사에 의해 약제 조성물을 투여하되, 상기 약제는 제품, 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터를 포함하는 것인 단계
를 포함한다.
망막을 적어도 부분적으로 박리하기 위해 단계 (a)에서 주사되는 용액의 부피는, 예를 들어, 약 10 내지 1000 ㎕, 예를 들어, 약 50 내지 1000, 100 내지 1000, 250 내지 1000, 500 내지 1000, 10 내지 500, 50 내지 500, 100 내지 500, 250 내지 500 ㎕일 수 있다. 부피는, 예를 들어, 약 10, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000 ㎕일 수 있다.
단계 (b)에서 주사되는 약제 조성물의 부피는, 예를 들어, 약 10 내지 500 ㎕, 예를 들어, 약 50 내지 500, 100 내지 500, 200 내지 500, 300 내지 500, 400 내지 500, 50 내지 250, 100 내지 250, 200 내지 250 또는 50 내지 150 ㎕일 수 있다. 부피는, 예를 들어, 약 10, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 또는 500 ㎕일 수 있다. 바람직하게는, 단계 (b)에서 주사되는 약제 조성물의 부피는 100 ㎕이다. 더 많은 부피는 망막이 늘어지는 위험을 증가시킬 수 있는 한편, 더 적은 부피는 보기 어려울 수 있다.
약제를 포함하지 않는 용액(즉, 단계 (a)의 "용액")은 하기 기재되는 바와 같이, 약제를 포함하는 용액과 유사하게 제형화될 수 있다.
약제를 포함하지 않는 바람직한 용액은 균형잡힌 식염수 용액(BSS) 또는 망막하 공간의 pH 및 삼투압몰농도와 일치하는 유사한 완충액이다.
수술 동안 망막의 시각화
특정 상황 하에서, 예를 들어, 말기 망막 변성 동안, 망막은 얇고 투명하며 망막이 놓여있는 파괴되고 심하게 착색된 상피에 대해 보기가 어렵기 때문에 망막을 식별하는 것은 어렵다. 청색 생염료(vital dye)(예를 들어, Brilliant Peel®, Geuder; MembraneBlue-Dua®, Dorc)의 사용은 망막 박리 절차(즉, 본 발명의 2 단계 망막하 주사 방법에서 단계 (a))를 위해 만들어진 망막 구멍의 식별을 용이하게 할 수 있어, 약제는 유리체강으로 역류할 위험없이 동일한 구멍을 통해 투여될 수 있다.
청색 생염료의 사용으로 또한 비후화된 내경계막 또는 망막전막이 있는 망막의 임의의 영역을 식별하는데, 이는 이들 구조 중 어떤 것을 통한 주사가 망막하 공간으로의 깔끔한 접근을 방해할 것이기 때문이다. 또한, 수술 직후 기간에 이러한 구조 중 어떤 것의 수축은 망막 입구 구멍의 늘어짐을 야기할 수 있으며, 이는 유리체강으로 약제의 역류를 야기할 수 있다.
맥락막위
주사
본 발명의 제품, 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터는 마이크로카테터를 이용하는 눈 바깥쪽(ab externo) 접근법을 사용하여 맥락막위 공간으로 전달될 수 있다(예를 들어, 문헌[Peden et al. (2011) PLoS One 6(2): e17140] 참조). 이러한 방법에서, 윤부 결막 절제술을 수행하여 공막을 노출시킨 다음, 공막 절제술로 맥락막을 노출시킨다. 마이크로카테터(예컨대, iScience Interventional의 iTrack 250A, 선택적으로 조명 시스템, 예컨대, iLumin 레이저-다이오드 기반 마이크로-조명 시스템(iScience Interventional)에 연결됨)를 맥락막위 공간으로 도입하고 시신경 유도쪽으로 뒤쪽으로 진행한다. 마이크로카테터 팁을 원하는 위치로 조작한 다음, 제품, 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터의 주사는 망막 및 맥락막 내에서 수포를 형성한다.
따라서, 일부 실시형태에서, 제품, 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터는 (i) 마이크로카테터를 맥락막위 공간으로 도입하는 단계; (ii) 팁이 망막의 이환된 영역에 근접할 때까지 상기 공간 내에서 마이크로카테터를 전진시키는 단계; 및 (iii) 마이크로카테터 팁으로부터 제품, 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터를 주사하여 수포를 생성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 맥락막위로 전달된다.
일부 실시형태에서, 상기 투여 절차는 로봇에 의해 직접 수행된다.
약제학적 조성물 및 주사 용액
본 발명의 약제, 예를 들어, 제품, 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터는 약제학적 조성물로 제형화될 수 있다. 이들 조성물은 약제에 추가적으로 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 부형제, 완충제, 안정화제 또는 당업계에 잘 알려진 다른 물질을 포함할 수 있다. 이와 같은 물질은 무독성이어야 하고 활성 성분의 효능을 방해하지 않아야 한다. 담체 또는 다른 물질의 정확한 특성은 투여 경로, 예를 들어, 망막하, 망막에 직접, 맥락막위 또는 유리체내 주사에 따라 당업자에 의해 결정될 수 있다.
약제학적 조성물은 전형적으로 액체 형태이다. 액체 약제학적 조성물은 일반적으로 액체 담체, 예컨대, 물, 석유, 동물성 또는 식물성 오일, 미네랄 오일 또는 합성 오일을 포함한다. 생리 식염수, 염화마그네슘, 덱스트로스 또는 다른 당류 용액, 또는 글라이콜, 예컨대, 에틸렌 글라이콜, 프로필렌 글라이콜 또는 폴리에틸렌 글라이콜이 포함될 수 있다. 일부 경우에, 계면활성제, 예컨대, 플루론산(PF68) 0.001%가 사용될 수 있다.
이환 부위에 주사하기 위해, 활성 성분은 발열원이 없고 적합한 pH, 등장성 및 안정성을 갖는 수용액의 형태일 수 있다. 당업자는, 예를 들어, 등장성 비히클, 예컨대, 염화나트륨 주사액, 링거 주사액 또는 락트산 링거 주사액을 사용하여 적합한 용액을 잘 제조할 수 있다. 방부제, 안정화제, 완충제, 항산화제 및/또는 다른 첨가제가 필요에 따라 포함될 수 있다.
지연 방출의 경우, 약제는, 생체적합성 중합체로부터 형성된 마이크로캡슐 또는 당업계에 알려진 방법에 따른 리포솜 담체 시스템과 같이 서방형으로 제형화되는 약제학적 조성물에 포함될 수 있다.
치료 방법
본 발명의 맥락에서 예방에 대한 언급이 예방적 치료와 보다 일반적으로 연관되지만; 본 명세서에서 치료에 대한 모든 언급은 치유적, 완화적 및 예방적 치료를 포함하는 것이 이해되어야 한다. 치료는 또한 질환의 중증도 진행을 저지하는 것을 포함할 수 있다.
동물, 특히 인간의 치료가 바람직하다. 그러나, 인간 및 수의학적 치료는 둘 다 본 발명의 범주 내에 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "조합", 또는 용어 "조합으로", "조합으로 사용되는" 또는 "조합 제제"는 2가지 이상 작용제를 동시에, 순차적으로 또는 개별적으로 조합 투여하는 것을 지칭할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "동시(simultaneous)"는 작용제가 병행하여(concurrently), 즉, 동일한 시간에(at the same time) 투여되는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "순차적"은 작용제가 번갈아 투여됨을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "개별"은 작용제가 서로 독립적으로 투여되지만, 작용제가 조합된, 바람직하게는 상승 효과를 나타낼 수 있도록 하는 시간 간격 내에 투여되는 것을 의미한다. 따라서, "개별적" 투여는 하나의 작용제가 다른 작용제의 투여 후, 예를 들어, 1분, 5분 또는 10분 이내에 투여되는 것을 허용할 수 있다.
변이체
, 유도체, 유사체, 동족체 및 단편
본 명세서에 언급된 구체적인 단백질 및 뉴클레오타이드에 추가적으로, 본 발명은 또한 이의 변이체, 유도체, 유사체, 동족체 및 단편의 사용을 포함한다.
본 발명의 맥락에서, 임의의 주어진 서열의 변이체는 당해 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드가 이의 기능을 실질적으로 보유하는 방식으로 잔기의 특정 서열(아미노산인지 또는 핵산 잔기인지는 상관없음)이 변형된 서열이다. 변이체 서열은 자연적으로 발생하는 단백질에 존재하는 적어도 하나의 잔기의 추가, 결실, 치환, 변형, 대체 및/또는 변이에 의해 얻을 수 있다.
본 발명의 단백질 또는 폴리펩타이드와 관련하여, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "유도체"는 생성된 단백질 또는 폴리펩타이드가 이의 내인성 기능 중 적어도 하나를 실질적으로 보유하는 것을 제공하는 서열로부터 또는 이러한 서열로 하나(또는 하나 이상의) 아미노산 잔기의 임의의 치환, 변이, 변형, 대체, 결실 및/또는 첨가를 포함한다.
폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드와 관련하여, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "유사체"는 임의의 모방체, 즉, 모방하는 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 내인성 기능 중 적어도 하나를 갖는 화학적 화합물을 포함한다.
전형적으로, 아미노산 치환은, 예를 들어, 1, 2 또는 3개 내지 10 또는 20개 치환으로 이루어질 수 있으며, 단 변형된 서열은 필요한 활성 또는 능력을 실질적으로 보유한다. 아미노산 치환은 비-자연적으로 발생하는 유사체의 사용을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 단백질은 또한 침묵 변화를 생성하고 기능적으로 동등한 단백질을 생성하는 아미노산 잔기의 결실, 삽입 또는 치환을 가질 수 있다. 의도적인 아미노산 치환은 내인성 기능이 보유되는 한, 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성 특성의 유사성을 기반으로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 음으로 하전된 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함하고; 양으로 하전된 아미노산은 리신 및 아르기닌을 포함하며; 유사한 친수성값을 갖는 비하전 극성 헤드기가 있는 아미노산은 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌 및 타이로신을 포함한다.
보존적 치환은, 예를 들어, 하기 표에 따라 이루어질 수 있다. 두 번째 칼럼에서 동일한 블록, 바람직하게는 세 번째 칼럼에서 동일한 줄에 있는 아미노산은 서로 치환될 수 있다:
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "동족체"는 야생형 아미노산 서열 및 야생형 뉴클레오타이드 서열과 특정 상동성을 갖는 실체를 의미한다. 용어 "상동성"은 "동일성"과 동일시될 수 있다.
상동성 서열은 대상체 서열과 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% 또는 90% 동일할 수 있고, 바람직하게는 적어도 95% 또는 97% 또는 99% 동일할 수 있는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 전형적으로, 동족체는 대상체 아미노산 서열과 동일한 활성 부위 등을 포함할 것이다. 상동성은 또한 유사성(즉, 유사한 화학적 특성/기능을 갖는 아미노산 잔기)의 관점에서 고려될 수 있지만, 본 발명의 맥락에서 서열 동일성의 관점에서 상동성을 표현하는 것이 바람직하다.
상동성 서열은 대상체 서열과 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% 또는 90% 동일할 수 있고, 바람직하게는 적어도 95% 또는 97% 또는 99% 동일할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 상동성은 또한 유사성의 관점에서 고려될 수 있지만, 본 발명의 맥락에서 서열 동일성의 관점에서 상동성을 표현하는 것이 바람직하다.
바람직하게는, 본 명세서에 상술된 서열번호 중 어느 하나와 동일성 백분율을 갖는 서열에 대한 언급은 언급된 서열번호의 전체 길이에 걸쳐 명시된 동일성 백분율을 갖는 서열을 지칭한다.
상동성 비교는 눈으로, 또는 보다 일반적으로 용이하게 입수 가능한 서열 비교 프로그램의 도움으로 수행될 수 있다. 이러한 상업적으로 입수 가능한 컴퓨터 프로그램은 2개 이상 서열 사이의 상동성 또는 동일성 백분율을 계산할 수 있다.
상동성 백분율은 인접한 서열에 대해 계산될 수 있으며, 즉, 하나의 서열이 다른 서열과 같이 정렬되고 하나의 서열의 각각의 아미노산이 한 번에 하나의 잔기씩 다른 서열의 상응하는 아미노산과 직접 비교된다. 이를 "갭이 없는(ungapped)" 정렬이라 한다. 전형적으로, 이와 같은 갭이 없는 정렬은 비교적 적은 수의 잔기에 대해서만 수행된다.
이는 매우 간단하고 일관된 방법이지만, 예를 들어, 다른 동일한 서열 쌍에서 뉴클레오타이드 서열에 하나의 삽입 또는 결실로 다음 코돈이 정렬되지 않게 할 수 있고, 따라서 전체 정렬이 수행될 때 잠재적으로 상동성 백분율의 큰 감소를 초래할 수 있다는 점을 고려하지 못하였다. 결과적으로, 대부분의 서열 비교 방법은 전체 상동성 점수에 과도하게 불이익을 주지 않으면서 가능한 삽입 및 결실을 고려하는 최적의 정렬을 생성하도록 설계되어 있다. 이는 국소 상동성을 최대화하기 위해 서열 정렬에 "갭"을 삽입함으로써 달성된다.
그러나, 이러한 보다 복잡한 방법은 정렬에서 발생하는 각각의 갭에 "갭 페널티"를 할당하여, 동일한 수의 동일한 아미노산에 대해, 가능한 한 적은 갭을 갖는 서열 정렬이, 2개의 비교 서열 사이의 더 높은 관련성을 반영하여, 많은 갭을 갖는 것보다 더 높은 점수를 획득할 것이다. 갭의 존재에 상대적으로 높은 비용을 부과하고 갭의 각각의 후속 잔기에 대해 더 작은 페널티를 부과하는 "아핀 갭 비용(affine gap cost)"이 전형적으로 사용된다. 이는 가장 일반적으로 사용되는 갭 스코어링 시스템이다. 높은 갭 페널티는 물론 더 적은 갭이 있는 되적화된 정렬을 생성할 것이다. 대부분의 정렬 프로그램은 갭 페널티가 변형될 수 있게 한다. 그러나, 서열 비교를 위해 이와 같은 소프트웨어를 사용할 때 디폴트 값을 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들어, GCG Wisconsin Bestfit 패키지를 사용할 때, 아미노산 서열에 대한 디폴트 갭 페널티는 갭에 대해 -12이고 각각의 확장에 대해 -4이다.
따라서 최대 상동성 백분율의 계산은 먼저 갭 페널티를 고려하여 최적의 정렬을 생성하는 것을 필요로 한다. 이와 같은 정렬을 수행하는 데 적합한 컴퓨터 프로그램은 GCG Wisconsin Bestfit 패키지(위스콘신 대학교, 미국 소재; Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12: 387)이다. 서열 비교를 수행할 수 있는 다른 소프트웨어의 예는 BLAST 패키지(문헌[Ausubel et al. (1999) 위의 논문 - Ch. 18] 참조), FASTA(Atschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 403-410) 및 GENEWORKS 비교 도구 제품군을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. BLAST와 FASTA는 둘 다 오프라인 및 온라인 검색에 이용 가능하다(문헌[Ausubel et al. (1999) 위의 논문, 페이지 7-58 내지 7-60] 참조). 그러나, 일부 적용에 있어서, GCG Bestfit 프로그램을 사용하는 것이 바람직하다. BLAST 2 Sequences라고 하는 또 다른 도구가 또한 단백질 및 뉴클레오타이드 서열을 비교하는 데 이용 가능하다(문헌[FEMS Microbiol. Lett. (1999) 174: 247-50; FEMS Microbiol. Lett. (1999) 177: 187-8] 참조).
최종 상동성 백분율은 동일성의 관점에서 측정될 수 있지만, 정렬 과정 자체는 전형적으로 전부-또는 전무 쌍 비교를 기반으로 하지 않는다. 대신에, 화학적 유사성 또는 진화적 거리를 기반으로 각각의 쌍별 비교에 점수를 할당하는 척도화된 유사성 점수 매트릭스가 일반적으로 사용된다. 일반적으로 사용되는 이와 같은 매트릭스의 예는 BLOSUM62 매트릭스(BLAST 프로그램 제품군에 대한 디폴트 매트릭스)이다. GCG Wisconsin 프로그램은 일반적으로 공개 디폴트 값 또는 제공되는 경우 사용자 정의 기호 비교 표(보다 상세한 내용에 대해서는 사용자 매뉴얼 참조)를 사용한다. 일부 적용에 있어서, GCG 패키지에 대한 공개 디폴트 값, 또는 다른 소프트웨어의 경우에 BLOSUM62와 같은 디폴트 매트릭스를 사용하는 것이 바람직하다.
소프트웨어가 최적의 정렬을 생성하면, 상동성 백분율, 바람직하게는 서열 동일성 백분율을 계산하는 것이 가능하다. 소프트웨어는 전형적으로 이를 서열 비교의 일부로서 수행하고 수치 결과를 생성한다.
전장 보체 인자 I 또는 보체 인자 I(CFI) 보조인자, 예컨대, 보체 인자 H 또는 FHL1의 "단편"은 또한 변이체이고, 이 용어는 전형적으로 기능적으로, 또는 예를 들어, 검정에서 관심 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 선택된 영역을 지칭한다. 따라서 "단편"은 전장 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 일부분인 아미노산 또는 핵산 서열을 지칭한다.
이와 같은 변이체는 표준 재조합 DNA 기법, 예컨대, 부위-지정 돌연변이유발을 사용하여 제조될 수 있다. 삽입이 이루어지는 경우, 삽입 부위의 양측에 자연적으로 발생하는 서열에 해당하는 5' 및 3' 측접 영역과 함께 삽입을 인코딩하는 합성 DNA가 제조될 수 있다. 측접 영역은 자연적으로 발생하는 서열의 부위에 해당하는 편리한 제한 부위를 포함하여 서열이 적절한 효소(들)로 절단되고 합성 DNA가 절단부에 결찰될 수 있게 할 것이다. 그 다음 DNA는 본 발명에 따라 발현되어 인코딩된 단백질을 제조한다. 이들 방법은 DNA 서열의 조작을 위해 당업계에 알려진 다수의 표준 기법을 예시할 뿐이며 다른 알려진 기법이 또한 사용될 수 있다.
당업자는 개시된 바와 같은 본 발명의 범주를 벗어나지 않으면서 본 명세서에 개시된 본 발명의 모든 특징을 조합할 수 있음을 이해할 것이다.
이제 본 발명의 바람직한 특징 및 실시형태가 비제한적인 실시예로서 기재될 것이다.
본 발명의 실시는 달리 지시되지 않는 한, 당업자의 능력 내에 있는 화학, 생화학, 분자 생물학, 미생물학 및 면역학의 통상적인 기법을 이용할 것이다. 이와 같은 기법은 문헌에 설명되어 있다. 예를 들어, 문헌[Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F.M. et al. (1995 and periodic supplements) Current Protocols in Molecular Biology, Ch. 9, 13 and 16, John Wiley & Sons; Roe, B., Crabtree, J. and Kahn, A. (1996) DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; Polak, J.M. and McGee, J.O'D. (1990) In Situ Hybridization: Principles and Practice, Oxford University Press; Gait, M.J. (1984) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; 및 Lilley, D.M. and Dahlberg, J.E. (1992) Methods in Enzymology: DNA Structures Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA, Academic Press]을 참조한다. 이들 일반 텍스트 각각은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
실시예
실시예
1
보조인자
검정
재조합 보체 인자 I(CFI), 보조인자(보체 인자 H(CFH) 또는 보체 인자 H-유사 단백질 1 (FHL1)) 및 C3b을 37℃에서 20분 동안 함께 인큐베이션하였다.
CFI 및 C3b의 농도를 고정시키고, 명시된 비율로 CFH 또는 FHL1의 적정을 수행하였다.
C3b에서 iC3b로의 절단을 ELISA에 의해 정량화하였다.
이들 연구의 결과는 도 2A에 도시되어 있다.
이들 결과로부터, 최소 기능성 CFI:CFH/FHL1 몰비가 1:2이라는 결론을 내릴 수 있다.
정상 혈청 CFI:보조인자 비의 측정
보체 인자 I(CFI), 보체 인자 H(CFH) 및 보체 인자 H-유사 단백질 1(FHL1) 농도는 ELISA를 이용해서 정상 인간 혈청에서 측정하였다.
정상 혈청에서의 CFI:보조인자의 몰비는 1:8.3인 것으로 확인되었다.
혈장 및 안구 유체 CFI:보조인자 비의 비교
본 발명자들은 이어서 혈장 및 안구 유체 둘 다에서 CFI 및 CFH의 레벨을 비교하였다. 데이터는, 보조인자가 CFI 효소에 대해서 수 배 몰 과잉량으로 존재하는 혈장과 대조적으로, 이 비는 유리체액 및 수양액에서 역전되는 것을 나타내었다(도 7).
리포다당류(LPS)에 대한 보체 침착 검정
미세정량 플레이트를 1 ㎍/웰의 LPS로 코팅하고, 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다.
이어서, 플레이트를 세척하고, 상이한 양의 재조합 보체 인자 I(CFI), 보체 인자 H(CFH) 또는 보체 인자 H-유사 단백질 1(FHL1)이 보충된 정상 인간 혈청으로 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 플레이트를 철저하게 세척하고, 보체 침착량을 2차 항체로서 사용되는 마우스 항-C3d 항체(Abeam) 및 당나귀 항-마우스(Jackson ImmunoResearch)로 측정하였다.
도 2B는 LPS 상의 보체 침착에 대한 CFI, CFH 및 FHL1 보충의 효과를 나타낸다.
x-축은 보체 인자 I(CFI) 대 보체 인자 H + 보체 인자 H 유사 1(CFH 및 FHL1, "보조인자")의 비를 나타낸다. 비율의 변화는 오로지 재조합 CFI, CFH 또는 FHL1의 첨가에 의해서만 달성되었다.
1:8.3(정상 혈청의 자연 비율)의 시작 몰비는 이미 효소와 비교하여 과량의 보조인자를 가지고 있지만, 보체 침착의 감소에 대한 추가 이점이 있으므로 활성화는 비율이 추가로 상승될 때 달성된다. 이러한 추가적인 이점은 CFH 및 FHL1의 추가적인 기능(분해 가속화 활성(decay-accelerating activity), DAA)과 관련될 수 있다. CFH 및 FHL1은 둘 다 C3b 결합에 대해 보체 인자 B(FB)와 경쟁하고, C3b로부터 FB의 위치를 바꾸며, 이에 의해 대체 경로 전환효소를 "분해(decay)"시킨다는 점에서 DAA를 갖는다.
이러한 실험으로부터, 1:2의 CFI:CFH/FHL1 최소 몰비 미만에서, 보조인자는 제한적이 된다는 결론을 내릴 수 있다.
실시예
2
바이시스트로닉
플라스미드의 생성
표 1에 기재된 카세트에 측접하는 AAV2 5' 및 3' 반전 말단 반복부(ITR)를 포함하는 재조합 AAV 이식유전자 플라스미드(RC204, RC206 내지 210 및 RC212 내지 218이라 함)를 구축하였다.
사용된 5' ITR 인접 서열은 서열번호 20이었다.
사용된 CMV 프로모터 서열은 서열번호 13이었다.
사용된 FHL1 서열은 서열번호 16이었다. 사용된 코돈 최적화 FHL1(FHL1-CO) 서열은 서열번호 12였다.
사용된 퓨린-F2A 링커 서열은 서열번호 17이었다.
사용된 CFI 서열은 서열번호 2였다. 사용된 코돈 최적화 CFI(CFI-CO) 서열은 서열번호 10이었다.
사용된 WPRE3 서열은 서열번호 15였다.
사용된 소 성장 호르몬 폴리-A(BGHpA) 서열은 서열번호 14이었다.
사용된 3' ITR 인접 서열은 서열번호 21이었다.
RC212 및 RC218의 전체 서열은 각각 서열번호 22 및 23이다.
형질도입에 의한 벡터의 비교
부착성 HEK293에서 벡터 생성
12가지의 플라스미드(RC204, RC206 내지 RC210 및 RC212 내지 RC217)를 이용하여 HEK293 세포의 개별 형질감염을 다음 프로토콜을 사용하여 수행하였다:
제1일: HEK293 세포를 분리하고 ViCell을 사용하여 계수하였다. 플레이트당 10 ㎖ DMEM/Glutamax + 10% FBS에서 ㎠당 6×105개 세포로 10㎝ 플레이트에 세포를 시딩하였다.
제2일: 컨플루언시를 확인하였고 70 내지 80%임을 발견하였다.
DMEM/Glutamax + 5% FBS로 배지를 교체하였다.
4시간 후, 1:3의 DNA:PEI 비로 PEI를 사용하여 플레이트당 5㎍ 총 플라스미드 DNA(1.25㎍ 작제물 DNA, 1.25㎍ RepCap 플라스미드, 2.5㎍ Helper 플라스미드)로 세포를 중복하여 형질감염시켰다:
1. 2×5㎍ DNA를 2×1㎖ PBS에 희석하였다.
2. 2×15㎕ PEI를 첨가하고 20분 동안 인큐베이션하였다.
3. 1 ㎖의 DNA/PEI를 세포에 적가하였다.
제3일: 15 mM의 부티르산나트륨을 첨가하였다.
제5일: 복제물을 모음으로써 배지를 수확하고, 1000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 세포 파편을 제거하였다.
상청액을 새로운 튜브로 옮기고 AAVanced(AAV110A-1, Cambridge Bioscience)를 부피의 1/5로 첨가하였다.
혼합물을 4℃에서 72시간 동안 인큐베이션하였다.
제5일: 혼합물을 4℃에서 30분 동안 1000 rpm으로 원심분리하였다. 그 후, 상청액을 버리고, 펠릿을 500㎕의 PBS에 재현탁시켰다. 펠릿을 1500g으로 3분 동안 원심분리한 다음 상청액을 다시 버렸다. 펠릿을 원래 상청액 부피의 1/100에 재현탁하고 적정할 때까지 -80℃에서 보관하였다.
벡터를 사용한 HEK293 세포의 형질도입
12가지의 바이러스 벡터(RC204, RC206 내지 RC210 및 RC212 내지 RC217)를 이용하여 별도의 HEK293 세포의 개별 형질도입을 다음 프로토콜을 사용하여 수행하였다:
제1일: HEK293 세포를 분리하고 ViCell을 사용하여 계수하였다. 웰당 400㎕ DMEM/Glutamax + 10% FBS에서 1×105개 세포로 24웰 플레이트에 세포를 시딩하였다.
제2일: 2×102의 감염다중도(MOI)를 달성하기 위해 필요한 양의 바이러스 벡터를 첨가하였다.
제3일: 배지를 제거하고 300㎕의 무혈청 DMEM/Glutamax로 교체하였다.
제5일: 상청액을 수확하고 4℃에서 14000 rpm으로 원심분리하였다. 정화된 상청액을 분석을 위해 준비된 새로운 튜브로 옮겼다.
웨스턴 블롯
형질도입으로부터의 상청액을 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다(CFI 및 FHL-1에 대한 1차 항체; 및 ECL 프라임 웨스턴 블롯팅 검출 시약(ECL Prime Western blotting detection reagent)을 사용함).
웨스턴 블롯 분석 결과는 도 3에 도시되어 있다.
CFI
ELISA
형질도입으로부터의 상청액을 다음 절차를 사용하여 CFI에 대한 ELISA에 의해 분석하였다:
제1일: ELISA 플레이트를 웰당 1×코팅 완충액에서 1/4000으로 희석된 50㎕의 양 항-CFI 다클론성 항체로 코팅하였다. 플레이트를 4℃에서 밤새 보관하였다.
제2일: 플레이트를 웰당 200㎕의 PBS-Tween(0.05%)으로 3회 세척한 다음 조직 상에 블롯팅하였다.
PBS-Tween(0.05%) 중 200㎕ 1% BSA 분획 V를 각각의 웰에 적용하고 실온에서 2시간 동안 차단되도록 하였다.
차단 인큐베이션 동안 샘플 및 표준물 곡선을 준비하였다. DMEM 2% FBS에 희석된 정제된 CFI 단백질(Sigma C5938-1MG)을 사용하여 표준물 곡선을 준비하였다. DMEM 2% FBS에서 샘플을 1:5 및 1:10으로 희석하였다.
2시간 차단 후, 상기 기재된 바와 같이, 플레이트를 3회 세척한 다음, 각각의 웰에 50㎕의 샘플 또는 표준물을 로딩하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.
1시간 후, 상기한 바와 같이 플레이트를 세척한 다음, DMEM 5% FBS에 1/2000으로 항-CFI(0x21) 항체를 희석하고 각각의 웰에 이를 50㎕ 적용한 다음 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.
1시간 후, 상기한 바와 같이 플레이트를 세척한 다음, DMEM 5% FBS에 1/5000으로 당나귀 항-마우스-HRP 항체를 희석하고 각각의 웰에 이를 50㎕ 적용한 다음 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.
1시간 후, 상기한 바와 같이 플레이트를 세척한 다음, 각각의 웰에 100㎕ TMB 시약을 적용하고 어두운 곳의 실온에서 대략 15분 동안 인큐베이션하였다. 충분한 청색이 얻어지면, 각각의 웰에 100㎕의 1 M 황산을 첨가하여 반응을 정지시켰다.
그 다음 A450을 기록하고 데이터를 처리한 다음 분석을 위해 마이크로소프트 엑셀(Microsoft Excel)로 옮겼다.
FHL1 ELISA
형질감염으로부터의 상청액을 다음 절차를 사용하여 FHL1에 대한 ELISA에 의해 분석하였다:
제1일: ELISA 플레이트를 웰당 100mM 카보네이트/바이카보네이트 완충액(pH 9.6) 중 3㎍/㎖ 항-FHL-1 항체(Biorad, AbD33594.1) 50㎕로 코팅하였다. 플레이트를 4℃에서 밤새 보관하였다.
제2일: 플레이트를 웰당 200㎕의 TBS-Tween(0.05%)으로 3회 세척한 다음 조직 상에 블롯팅하였다.
PBS-Tween(0.05%) 중 200㎕ 1% BSA 분획 V를 각각의 웰에 적용하고 실온에서 2시간 동안 차단되도록 하였다.
차단 인큐베이션 동안 샘플 및 표준물 곡선을 준비하였다. DMEM 2% FBS에 희석된 FHL1 정제된 단백질을 사용하여 표준물 곡선을 준비하였다. 차단 완충액에서 샘플을 1:5 및 1:10으로 희석하였다.
2시간 차단 후, 상기 기재된 바와 같이, 플레이트를 3회 세척한 다음, 각각의 웰에 50㎕의 샘플 또는 표준물을 로딩하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.
1시간 후, 상기한 바와 같이 플레이트를 세척한 다음, 차단 완충액에 0.33㎍/㎖로 항-CFH 항체(0x24, Santa Cruz Biotechnologies, sc-53067)를 첨가하고 각각의 웰에 이를 50㎕ 적용한 다음 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.
1시간 후, 상기한 바와 같이 플레이트를 세척한 다음, 차단 완충액에 0.2㎍/㎖로 당나귀 항-마우스-HRP 항체를 첨가하고 각각의 웰에 이를 50㎕ 적용한 다음 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.
1시간 후, 상기한 바와 같이 플레이트를 세척한 다음, 각각의 웰에 100㎕ TMB 시약을 적용하고 어두운 곳의 실온에서 대략 15분 동안 인큐베이션하였다. 충분한 청색이 얻어지면, 각각의 웰에 50㎕의 1 M 황산을 첨가하여 반응을 정지시켰다.
그 다음 A450을 기록하고 데이터를 처리한 다음 분석을 위해 마이크로소프트 엑셀로 옮겼다.
결론
웨스턴 블롯 및 ELISA 연구의 결과는 도 3 및 4에 각각 도시되어 있다.
웨스턴 블롯 및 ELISA 분석으로부터, 다음과 같은 결론을 내릴 수 있다:
모든 후보는 형질도입 후 CFI 및 FHL1을 둘 다 생성한다.
CFI 및 FHL1 코돈 최적화는 단백질 수준을 증가시킨다.
RC206 및 RC212는 CFI 발현에 대해 최적이지만, RC212는 최적의 CFI:FHL1 몰비(>1:2)를 달성한다.
RC212는 CFI/FHL1 발현을 기반으로 한 최상의 후보이다.
벡터 패키징
알칼리성 겔 분석
24㎕의 각각의 희석되지 않은 샘플 및 SRM 대조군(2.45×1011 vg/㎖; SRM #16-048)을 0.8% 알칼리성 겔에 로딩한 다음, 냉장실에서 20 V로 19시간 동안 알칼리성 실행 완충액(40㎖ 50×알칼리성 완충액 + 1960㎖ MilliQ수)으로 실행하였다.
그 다음 겔을 실온에서 1시간 동안 3 겔 부피의 0.1 M 트리스(Tris)(pH 8.0)에서 인큐베이션한 다음, 실온에서 2시간 동안 4× SYBR골드(SYBRGold) 핵산 착색제를 포함하는 1 겔 부피의 0.1 M NaCl에서 인큐베이션한 후(광 노출로부터 보호됨), MilliQ수로 2회 헹구었다.
그 다음 10초 노출 시간으로 Chemidoc에서 SYBR골드 UV 투과조명기 설정을 사용하여 겔을 시각화하였다.
결과는 도 5(상단 패널)에 도시되어 있다.
가득찬 바이러스 입자:빈 바이러스 입자 비
qPCR(DNA 역가) 및 캡시드 ELISA로부터 계산된 역가를 비교함으로써 가득찬 바이러스 입자 대 빈 바이러스 입자의 비를 분석하였다.
결과는 도 5(하단 패널)에 도시되어 있다.
결론
이들 분석으로부터, 다음과 같은 결론을 내릴 수 있다:
RC212만을 이용한 효율적인 패키징.
4.7kb를 초과하는 게놈의 불완전한 패키징이 있는 것으로 보인다.
RC212의 가득찬 입자-빈-입자의 비는 대조군의 모노시스트로닉 벡터와 비슷하다.
RC212는 패키징 분석을 기반으로 한 최상의 후보이다.
C3b 절단 검정
C3b 절단 검정에서, 1㎎의 혈정 정제된 C3b를 형질도입된 HEK293 상청액 샘플과 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
ELISA, 또는 웨스턴 블롯 분석(하기와 같이 기재됨)을 사용하여 분석을 수행하였다. β-머캅토에탄올이 있는 4×Laemmli 완충액을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 샘플을 희석하고 10% 프리캐스트 폴리아크릴아마이드 SDS PAGE 겔(Bio-Rad) 상에 로딩하였다. PVDF 막(Bio-Rad) 막으로 옮기고 차단 완충액(1×TBS pH 8 [Sigma]/0.05% Tween-20 및 5% 탈지분유[Marvel)])에서 차단한 후, 염소 항-인간 C3 항체(Biorad)를 사용하여 C3b 절단을 검출하였다.
결과는 도 6에 나타내어져 있으며, 이로부터 RC212가 가장 강력하다는 결론을 내릴 수 있다.
실시예
3 - 다수의
보체
조절제의 첨가에 대한 추가적인
보체
하향조절
방법
보체 조절제의 기능적 활성을 측정하기 위해, LPS 침착 검정을 수행하였다. 눙크 Maxisorb 플레이트를 희석된 ELISA 코팅 완충액(Biorad, BUF030B)에서 1㎍/㎖ LPS(Sigma, 대장균 O26:B6)로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 플레이트를 PBS-0.05% Tween 20으로 세척하였다. 대체 경로 완충액(PBS, 2mM MgCl2 및 10mM EGTA, pH 7.2) 중 25% 혈청을 준비하고 보체 조절제로 보충하였다. 희석액을 LPS-코팅 플레이트에 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 10mM EDTA를 혈청이 있는 별도의 튜브에 첨가하여 보체 활성화를 방지하고 이 샘플을 사용하여 검정에서의 배경 신호를 결정하였다. 플레이트를 이전과 같이 세척하고 플레이트에서 C3 침착을 검출함으로써 보체 활성화를 측정하였다(염소-항-C3d Abeam, ab17453; 1:20,000). 주위 온도에서 1시간 인큐베이션 후, 플레이트를 세척하고 당나귀 항-마우스 HRP 접합 항체(Jackson ImmunoResearch, 715-035-150; 1:1,000)와 함께 추가 1시간 동안 인큐베이션하였다. 4회 세척 후, 플레이트를 1-단계 울트라 TMB - ELISA Substrate(Life Technologies)와 함께 인큐베이션하고 반응을 1M H2SO4로 퀀칭하였다. Varioskan 플레이트 판독기(Thermo Fisher)를 사용하여 450 ㎚에서의 OD를 측정하고 GraphPad Prism을 사용하여 4PL 적합 곡선으로부터 IC50을 결정하였다. 보체 보존 여성 인간 혈청을 이 실험에 사용하였다.
결과
동일한 검정 플랫폼을 사용하여 별개의 실험에서 보체 조절제 단백질인 보체 인자 I, 가용성 보체 수용체 1, 보체 인자 H 또는 인자 H-유사 1의 IC50 농도를 결정하였다. 여기서, 결과(도 8)는 조절제 단백질의 IC50 농도가 첨가될 때, 대체 경로(C3 침착의 감소로 측정함)가 퀀칭됨(음영 칼럼)을 나타낸다. 보체 인자 I이 이의 보조인자(가용성 보체 수용체 1, 보체 인자 H 또는 인자 H-유사 1) 중 하나와 함께 공동보충되면, 추가적인 퀀칭이 관찰되며(백색 칼럼), 이는 2가지 보체 조절제의 농도를 증가시키는 것이 둘 중 하나를 단독으로 추가하는 것보다 우수하다는 것을 입증한다. 이러한 결과는 과민한 보체 시스템에 의해 유발된 병태가 다중 보체 조절제의 이중 투여로부터 이익을 얻을 수 있음을 나타낸다.
개별 조절제의 IC50 농도는 테스트된 조절제뿐만 아니라(sCR1은 FHL1보다 약 10배 더 강력하고 CFH 및 CFI보다 약 50배 더 강력함) 분자량(sCR1 = 213 kDa, CFI = 88 kDa, CFH = 155 kDa 및 FHL1 = 49 kDa)에서도 크게 상이하지만, 몰 농도를 직접 비교에 사용하였다. 단백질의 내인성 수준은 또한 효능의 관찰된 차이에 기여할 것이며; 인자 H는 FHL1 또는 sCR1보다 훨씬 더 높은 혈장 농도를 갖는다. 대체 경로를 퀀칭시키는 IC50 농도에서 조절제의 능력을 비교함으로써, sCR1은, IC50을 달성하기 위해 가장 낮은 몰 농도를 필요로 하기 때문에 가장 강력한 조절제임을 입증하였다. CR1은 혈액에는 풍부하지만 혈청/혈장에는 없는 적혈구 상의 막 결합 수용체이고, 혈청 또는 혈장에는 단지 소량의 유체 CR1(즉, sCR1)이 존재하기 때문에, 이것으로 sCR1은 적혈구가 혈장에서 분리된 부위, 예컨대, 맥락막 공간, 부르크막(Bruch's membrane) 망막하 공간 및 사구체에서 매우 강력한 보체 조절제 및 CFI 보조인자일 것으로 추론한다.
실시예
4 -
보체
인자 I의 발현 및 인자 H-유사 1
시험관내
발현
방법
HEK-293 세포를 CFI를 발현하는 AAV(GT005); FHL1을 발현하는 AAV(RC001); 또는 CFI 및 FHL1을 발현하는 AAV(GT007)의 rAAV 벡터 중 하나를 이용하여 형질도입하였다. 비-환원 웨스턴 블롯에 의해 상청액을 분석하고 상대적인 단백질 발현을 결정하였다. 1차 항체로서 염소 항 인간 CFI(Comptech) 및 염소 항 인간 FH(Quidel, A312)을 사용하여 CFI 및 FHL1 단백질을 검출하였다.
결과
웨스턴 블롯 분석은 CFI 및 FHL1 단백질이 3가지 모든 작제물로부터 발현되고 배양 배지로 분비되었음을 나타내었다(도 9A 및 B). 이러한 발현 패턴을 확인하기 위해, CFI 단백질을 시각화하기 위해 면역블롯에 의해 상청액을 분석하여 상청액에서의 정확한 가공 및 분비를 결정하였다. 도 9B에서 입증된 바와 같이, 중쇄 및 경쇄 CFI뿐만 아니라, 프로-CFI가 GT007로 형질도입된 후 HEK-293 세포에서 분비되며, 이는 CFI 단백질이 번역되었고, 단백질분해 가공이 일어났음을 확인시켜준다. CFI cDNA를 인코딩하는 플라스미드로 형질감염된 포유동물 세포에서 모든 재조합 프로-CFI 단백질이 절단을 겪지는 않으며, 이는 프로-CFI(88 kDa)뿐만 아니라, 50 kDa의 중쇄 및 38 kDa의 경쇄로 이루어진 성숙한 가공된 CFI의 분비를 초래한다.
실시예
5 -
보체
인자 I 및 인자 H-유사 1
시험관내
발현의 기능성
방법
형질도입된 세포로부터 분비된 CFI 및 FHL1의 기능적 활성을 분석하기 위해, CFI를 발현하는 AAV(GT005) 단독으로 형질도입; FHL1을 발현하는 AAV2(RC001) 단독으로 형질도입; GT005 및 RC001 둘 다로 공동형질도입; 또는 CFI 및 FHL1을 발현하는 AAV(GT007)로 형질도입된 HEK-293 세포 유래의 컨디셔닝된 상청액을 C3b 절단 검정에서 테스트하였다(도 10). 이 검정에서, C3b를 CFI 및 FHL1의 공급원과 함께 혼합하고 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 이 인큐베이션 시간을 형질도입된 세포로부터 발현된 이식유전자의 농도에 대해 최적화하였다. 이 검정의 원리는 FHL1의 존재하에 C3b를 iC3b 및 C3f로 절단하는 CFI의 능력을 기반으로 한다. 검정을 C3b 웨스턴 블롯, C3b 절단 생성물의 염색, 및 C3b 분해 생성물인 iC3b의 양을 정량화하는 iC3b ELISA에 의해 분석하였다.
결과
C3 웨스턴 블롯 및 iC3b ELISA 둘 다의 결과는 시험관 내에서 발현된 CFI 및 FHL1의 기능적 활성과 상관관계가 있고 이를 입증한다. C3b 웨스턴 블롯(도 10A)에서, 레인 1은 C3b 단독을 나타내고, 레인 2는 CFI 및 FHL1과 혼합한 C3b(양성 대조군)를 나타내며, 레인 3은 형질도입되지 않은 세포 유래의 컨디셔닝된 상청액과 혼합한 C3b를 나타낸다(UTD, 음성 대조군). 레인 4는 세포의 컨디셔닝된 상청액이 GT005(CFI) 및 RC001(FHL1)로 공동형질도입될 때 C3b 분해를 나타낸다. 레인 5는 GT007(CFI 및 FHL1을 발현함)로 형질도입된 세포의 컨디셔닝된 상청액을 나타낸다. 이러한 검정은 GT007-형질도입된 세포의 컨디셔닝된 상청액이 C3b를 iC3b로 분해시키는 활성 CFI 및 FHL1을 포함함을 확인시켜 준다.
C3b 웨스턴 블롯에 사용한 동일한 상청액을 사용하여 iC3b ELISA(도 10B)를 수행하였고 단백질 기능성의 직접적인 함수로서 iC3b의 양을 정량화하였다. 이전과 같이, CFI 및 FHL1과 함께 인큐베이션된 C3b는 GT005 및 RC001 공동 형질도입된 세포의 컨디셔닝된 상청액과 같이 양성 대조군으로 작용한다. GT007-형질도입된 세포의 상청액은 C3b 절단 활성을 나타내며, 이는 활성 CFI 및 FHL1의 존재를 확인시켜 준다.
실시예
6 - 맥락막 신생혈관(
CNV
)의 마우스 모델에서
생체내
효능
방법
마우스에서 레이저-유도 맥락막 신생혈관 모델을 수행하였다. 마우스(그룹당 n = 12 내지 14)에 CNV 유도 4주 전 AAV 벡터, 또는 CNV 유도 직후 애플리버셉트(양성 대조군)를 일측 망막하 주사로 투여하였다. 반대측 눈은 대조군으로 사용하였다. 생체내 영상화, 플루오레세인 혈관조영술(FA) 및 스펙트럼 영역 광간섭단층촬영(SD-OCT)을 제4일 및 제7일에 사용하여 마우스를 추적하였다. CNV 유도 7일 후 추적일에 연구 기간 종료시, 마취제 과다투약에 의해 마우스를 희생시키고, 혈청을 수집한 다음 눈을 적출하였다. 신경 망막을 절제하고 액체 질소에서 신선하게 냉동시켰다. 맥락막을 사전 고정시키고 맥락막의 평면 표본 고정물을 준비하였다. 맥락막의 평면 표본 고정물의 조직학적 분석을 사용하여 CNV 병변에서 아이소렉틴 B4 염색 영역을 정량화하였다.
결과
애플리버셉트 그룹은 CNV 유도 후 제4일에 널(Null) 벡터 대조군과 비교하여 CNV 누출 정도에 유의하게 영향을 미쳤지만(다른 모든 그룹과 비교하여 P<0.0001), 이는 제7일에 손실되었으며, 이는 아마도 시간 경과에 따라 약물 워시아웃(washout)에 기인한 것이다. CNV 누출 영역은 제4일(모든 그룹 비교에 있어서 P<0.0001) 및 제7일(널 벡터 그룹에 대해 P=0.019) 둘 다에 애플리버셉트-처리 눈에서 유의하게 감소하였다.
맥락막 평면 표본 고정물을 플루오레세인-표지 아이소렉틴으로 공동염색하였다. 아이소렉틴 B4는 내피 세포를 염색하고 CNV 병변을 시각화하는 데 사용된다. 콜모고로프-스미르노프 분석에 의해 평가될 때 데이터는 비정규 분포를 이루었으므로(P<0.05), 일반화 선형 모델(GLM) 분석을 사용하여 관찰된 차이의 통계적 유의성을 결정하였다. 모든 처리 그룹은 널 처리 그룹(GLM, 모두에 대해 P<0.05)과 비교하여 아이소렉틴 B4-염색 영역에서 통계적으로 유의한 감소를 나타내었다. CFI 및 FHL1-발현 벡터(GT005:RC001)의 공동투여는 가장 현저한 감소를 제공하였다.
상기 명세서에서 언급된 모든 간행물은 본 명세서에서 참조에 의해 원용된다. 본 발명의 개시된 작용제, 조성물, 용도 및 방법의 다양한 변형 및 변화가 본 발명의 범주 및 사상을 벗어나지 않으면서 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명은 특정 바람직한 실시형태와 관련되어 개시되었지만, 청구된 발명이 이와 같은 특정 실시형태로 과도하게 제한되어서는 안 된다는 것을 이해하여야 한다. 실제로, 당업자에게 자명한, 본 발명을 수행하기 위한 개시된 방식의 다양한 변형이, 하기 청구항의 범주 내에 있는 것으로 의도된다.
본 발명을 하기 번호가 매겨진 단락에 의해 추가로 기재한다:
1.
치료법에서 동시, 개별 또는 순차적 사용을 위한 조합 제제로서, (i) 보체 인자 H 유사 단백질 1(FHL1) 또는 보체 인자 H(CFH); 및 (ii) 보체 인자 I(CFI), 또는 이를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제품.
2.
눈의 보체-매개 장애를 치료 또는 예방함에 있어서 동시, 개별 또는 순차적 사용을 위한 조합 제제로서, (i) 보체 인자 H 유사 단백질 1(FHL1) 또는 보체 인자 H(CFH); 및 (ii) 보체 인자 I(CFI), 또는 이를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제품.
3.
단락 2에 있어서, 상기 보체-매개 장애는 연령-관련 황반 변성(AMD) 또는 당뇨망막병증, 바람직하게는 AMD인, 제품.
4.
단락 3에 있어서, 상기 AMD는 건성 AMD인, 제품.
5.
임의의 선행하는 단락에 있어서, 상기 제품은 (i) 및 (ii)를 대상체에게 적어도 2:1, 바람직하게는 적어도 3:1, 더 바람직하게는 적어도 8:1, 더 바람직하게는 적어도 15:1의 (i):(ii) 몰비로 제공하는, 제품.
6.
임의의 선행하는 단락에 있어서, 상기 제품은 (i) 및 (ii)를 대상체에게 2:1 내지 12:1, 바람직하게는 3:1 내지 10:1의 (i):(ii) 몰비로 제공하는, 제품.
7.
(i) 보체 인자 H 유사 단백질 1(FHL1) 또는 보체 인자 H(CFH); 및 (ii) 보체 인자 I(CFI)를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드.
8.
단락 7에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는,
(a) (i) 및 (ii)를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 상류에 있는 CMV 프로모터;
(b)
(i) 및 (ii)를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 하류에 있는 WPRE 조절 요소; 및/또는
(c)
선택적으로 (i) 및 (ii)를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 하류에 있는 폴리-A 신호, 선택적으로 소 성장 호르몬 폴리-A 신호
를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 더 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
9.
단락 7 또는 8에 있어서, 상기 (i)을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 (ii)를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 상류에 있는, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
10.
단락 7 내지 9 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 아데노-연관 바이러스(AAV) 반전 말단 반복부(ITR)를 더 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
11.
단락 7 내지 10 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 이의 5' 말단에 AAV ITR 및 이의 3' 말단에 AAV ITR을 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
12.
단락 7 내지 11 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는,
(a)
5' AAV ITR;
(b)
CMV 프로모터;
(c)
FHL1 또는 CFH, 바람직하게는 FHL1을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(d)
링커(선택적으로, 링커는 퓨린 절단 부위, GSG, 11a1D 서열 및 F2A 서열을 포함하거나 이에 의해 한정됨);
(e)
CFI를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(f)
WPRE 조절 요소(선택적으로, WPRE 조절 요소는 WPRE3 조절 요소임);
(g)
소 성장 호르몬 폴리-A 신호; 및
(h)
3' AAV ITR
을 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
13.
단락 7 내지 12 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 AAV ITR은 AAV2 또는 AAV8 ITR인, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
14.
단락 7 내지 13 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 FHL1 또는 CFH, 및 CFI를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 코돈 최적화된, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
15.
단락 7 내지 14 중 어느 한 단락에 있어서, (a) FHL1을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 12와 적어도 75% 서열 동일성을 갖고/갖거나; (b) CFI를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 10과 적어도 75% 서열 동일성을 갖는, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
16.
단락 7 내지 15 중 어느 한 단락에 있어서, (a) FHL1을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 12이고/이거나; (b) CFI를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 10인, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
17.
단락 7 내지 16 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 22 또는 23의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
18.
단락 7 내지 17 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 4.7 kb 이하인, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
19.
단락 7 내지 18 중 어느 한 단락의 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
20.
단락 19에 있어서, 상기 벡터는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터인, 벡터.
21.
단락 19 또는 20에 있어서, 상기 벡터는 바이러스 벡터 입자의 형태인, 벡터.
22.
단락 21에 있어서, 상기 AAV 벡터 입자는 AAV2 또는 AAV8 게놈, 및 AAV2 또는 AAV8 캡시드 단백질을 포함하는, 벡터.
23.
단락 7 내지 18 중 어느 한 단락의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포.
24.
단락 19 내지 22 중 어느 한 단락의 벡터로 형질도입된 세포.
25.
약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 단락 7 내지 24 중 어느 한 단락의 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 세포를 포함하는 약제학적 조성물.
26.
치료법에 사용하기 위한 단락 7 내지 24 중 어느 한 단락의 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 세포.
27.
눈의 보체-매개 장애를 치료 또는 예방하는 데 사용하기 위한 단락 7 내지 24 중 어느 한 단락의 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 세포.
28.
단락 27에 있어서, 상기 보체-매개 장애는 연령-관련 황반 변성(AMD) 또는 당뇨망막병증, 바람직하게는 AMD인, 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 세포.
29.
단락 28에 있어서, 상기 AMD는 건성 AMD인, 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 세포.
30.
단락 26 내지 29 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 지도모양 위축의 형성이 예방 또는 감소되고/되거나, 지도모양 위축의 양이 감소되는, 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 세포.
31.
단락 26 내지 30 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 지도모양 위축의 진행이 느려지는, 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 세포.
32.
단락 26 내지 31 중 어느 한 단락에 있어서, 동일한 기간 동안 치료되지 않은 눈에 비해, 대상체의 치료된 눈에 투여한 후 12개월에 걸쳐 지도모양 위축 영역의 증가가 적어도 10% 감소하는, 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 세포.
33.
단락 26 내지 32 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 세포의 투여는 대상체, 또는 대상체의 눈, 예컨대, 망막색소상피(RPE)에서, 선택적으로 대상체, 또는 대상체의 눈 또는 RPE의 정상 수준을 초과하는 수준으로 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 수준을 증가시키는, 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 세포.
34.
단락 26 내지 33 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 세포는 안내 투여되는, 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 세포.
35.
단락 26 내지 34 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 세포는 망막하, 망막에 직접, 맥락막위 또는 유리체내 주사에 의해 대상체의 눈에 투여되는, 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 세포.
36.
단락 26 내지 35 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 세포는 망막하 주사에 의해 대상체의 눈에 투여되는, 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 세포.
37.
단락 7 내지 24 중 어느 한 단락의 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 눈의 보체-매개 장애를 치료 또는 예방하는 방법.
38.
단락 7 내지 24 중 어느 한 단락의 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 세포를 대상체의 눈에 전달하는 단계를 포함하는, (i) 보체 인자 H 유사 단백질 1(FHL1) 또는 보체 인자 H(CFH); 및 (ii) 보체 인자 I(CFI)를 대상체에게 제공하는 방법.
Claims (40)
- 제품으로서,
치료법에서 동시, 개별 또는 순차적 사용을 위한 조합 제제로서, (i) 보체 인자 I(CFI) 보조인자; 및 (ii) 보체 인자 I(CFI), 또는 이를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 제품. - 제품으로서,
보체-매개 장애, 바람직하게는 눈의 보체-매개 장애를 치료 또는 예방함에 있어서 동시, 개별 또는 순차적 사용을 위한 조합 제제로서, (i) 보체 인자 I(CFI) 보조인자; 및 (ii) 보체 인자 I(CFI), 또는 이를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 제품. - 제2항에 있어서, 상기 보체-매개 장애는 연령-관련 황반 변성(AMD) 또는 당뇨망막병증, 바람직하게는 AMD인, 제품.
- 제3항에 있어서, 상기 AMD는 건성 AMD인, 제품.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 보체 인자 I(CFI) 보조인자는 보체 인자 H 유사 단백질 1(FHL1); 보체 인자 H(CFH); 보체 수용체 1(CR1) 또는 이의 단편; 및 막 보조인자 단백질(MCP) 또는 이의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 제품.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제품은 (i) 및 (ii)를 대상체에게 적어도 2:1, 바람직하게는 적어도 3:1, 더 바람직하게는 적어도 8:1, 더 바람직하게는 적어도 15:1의 (i):(ii) 몰비로 제공하는, 제품.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제품은 (i) 및 (ii)를 대상체에게 2:1 내지 12:1, 바람직하게는 3:1 내지 10:1의 (i):(ii) 몰비로 제공하는, 제품.
- (i) 보체 인자 I(CFI) 보조인자; 및 (ii) 보체 인자 I(CFI)를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
- 제8항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는,
(a) (i) 및 (ii)를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 상류에 있는 CMV 프로모터;
(b) (i) 및 (ii)를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 하류에 있는 WPRE 조절 요소; 및/또는
(c) 선택적으로 (i) 및 (ii)를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 하류에 있는 폴리-A 신호, 선택적으로 소 성장 호르몬 폴리-A 신호
를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 더 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오타이드. - 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 (i)을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 (ii)를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 상류에 있는, 단리된 폴리뉴클레오타이드
- 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 아데노-연관 바이러스(AAV) 반전 말단 반복부(ITR)를 더 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
- 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 이의 5' 말단에 AAV ITR 및 이의 3' 말단에 AAV ITR을 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
- 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는,
(a) 5' AAV ITR;
(b) CMV 프로모터;
(c) 보체 인자 I(CFI) 보조인자를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(d) 링커로서, 선택적으로, 퓨린 절단 부위, GSG, 11a1D 서열 및 F2A 서열이거나 이에 의해 한정되는, 상기 링커;
(e) CFI를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
(f) WPRE 조절 요소로서, 선택적으로, WPRE3 조절 요소인, 상기 WPRE 조절 요소;
(g) 소 성장 호르몬 폴리-A 신호; 및
(h) 3' AAV ITR
을 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오타이드. - 제8항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 보체 인자 I(CFI) 보조인자는 보체 인자 H 유사 단백질 1(FHL1); 보체 인자 H(CFH); 보체 수용체 1(CR1) 또는 이의 단편; 및 막 보조인자 단백질(MCP) 또는 이의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
- 제8항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV ITR은 AAV2 또는 AAV8 ITR인, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
- 제8항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CFI 보조인자, 및 CFI를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 코돈 최적화된, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
- 제8항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, (a) FHL1을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 12와 적어도 75% 서열 동일성을 갖고/갖거나; (b) CFI를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 10과 적어도 75% 서열 동일성을 갖는, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
- 제8항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, (a) FHL1을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 12이고/이거나; (b) CFI를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 10인, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
- 제8항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 22 또는 23의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
- 제8항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 4.7 kb 이하인, 단리된 폴리뉴클레오타이드.
- 제8항 내지 제20항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
- 제21항에 있어서, 상기 벡터는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터인, 벡터.
- 제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 벡터는 바이러스 벡터 입자의 형태인, 벡터.
- 제23항에 있어서, 상기 AAV 벡터 입자는 AAV2 또는 AAV8 게놈, 및 AAV2 또는 AAV8 캡시드 단백질을 포함하는, 벡터.
- 제8항 내지 제20항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포.
- 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항의 벡터로 형질도입된 세포.
- 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 제8항 내지 제26항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 세포를 포함하는 약제학적 조성물.
- 치료법에 사용하기 위한, 제8항 내지 제26항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 세포.
- 보체-매개 장애, 바람직하게는 눈의 보체-매개 장애를 치료 또는 예방하는 데 사용하기 위한, 제8항 내지 제26항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 세포.
- 제29항에 있어서, 상기 보체-매개 장애는 연령-관련 황반 변성(AMD) 또는 당뇨망막병증, 바람직하게는 AMD인, 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 세포.
- 제30항에 있어서, 상기 AMD는 건성 AMD인, 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 세포.
- 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지도모양 위축의 형성이 예방 또는 감소되고/되거나, 지도모양 위축의 양이 감소되는, 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 세포.
- 제28항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지도모양 위축의 진행이 느려지는, 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 세포.
- 제28항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 동일한 기간 동안 치료되지 않은 눈에 비해, 대상체의 치료된 눈에 투여한 후 12개월에 걸쳐 지도모양 위축 영역의 증가가 적어도 10% 감소되는, 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 세포.
- 제28항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 세포의 투여는 대상체, 또는 대상체의 눈, 예컨대, 망막색소상피(RPE)에서, 선택적으로 대상체, 또는 대상체의 눈 또는 RPE의 정상 수준을 초과하는 수준으로 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 수준을 증가시키는, 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 세포.
- 제28항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 세포는 안내 투여되는, 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 세포.
- 제28항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 세포는 망막하, 망막에 직접, 맥락막위 또는 유리체내 주사에 의해 대상체의 눈에 투여되는, 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 세포.
- 제28항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 세포는 망막하 주사에 의해 대상체의 눈에 투여되는, 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 세포.
- 보체-매개 장애, 바람직하게는 눈의 보체-매개 장애를 치료 또는 예방하는 방법으로서,
제8항 내지 제26항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 세포를 상기 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법. - (i) 보체 인자 I(CFI) 보조인자; 및 (ii) 보체 인자 I(CFI)를 대상체에게 제공하는 방법으로서,
제8항 내지 제26항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 세포를 상기 대상체에게, 바람직하게는, 상기 대상체의 눈에 전달하는 단계를 포함하는, 방법.
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