KR20210095972A - Cd206 발현 세포-관련 장애를 진단 및 치료하기 위한 조성물, 방법 및 키트 - Google Patents

Cd206 발현 세포-관련 장애를 진단 및 치료하기 위한 조성물, 방법 및 키트 Download PDF

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KR20210095972A
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프레드릭 코프
마이클 블루
웬디 메츠
래리 슐레진저
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나비디아 바이오파마슈티컬즈, 인크.
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Abstract

본 발명은 검출가능한 잔기가 거기에 부착되어 있는 운반체 분자를 포함하는 제약 조성물을 대상체에게 투여하는 것에 의한, CD206 발현 세포-관련 장애의 진단 방법에 관한 것이다. 상기 운반체 분자는 덱스트란 백본, 및 상기 덱스트란 백본에 직접 또는 간접적으로 접합되며, CD206에 특이적으로 결합하도록 선택되는 1종 이상의 수용체 기질을 포함한다. 또한, CD206 발현 세포-관련 장애의 치료 방법은 물론, 체액에서 CD206 발현 세포의 수를 정량하기 위한 생체외 방법 및 키트도 제공된다.

Description

CD206 발현 세포-관련 장애를 진단 및 치료하기 위한 조성물, 방법 및 키트{COMPOSITIONS, METHODS AND KITS FOR DIAGNOSING AND TREATING CD206 EXPRESSING CELL-RELATED DISORDERS}
[관련 출원의 상호 참조]
본 출원은 발명의 명칭이 "COMPOSITIONS AND METHODS FOR DIAGNOSING AND TREATING MACROPHAGE-RELATED DISORDERS"인 2013년 7월 22일자 U.S. 특허 가출원 제61/857,232호 및 발명의 명칭이 "COMPOSITIONS AND METHODS FOR DIAGNOSING AND TREATING MACROPHAGE-RELATED DISORDERS"인 2013년 9월 18일자 61/879,649호의 우선권을 주장하는 바이다. 전기 특허 가출원들의 전체 개시내용은 본원에 참조로써 포함된다.
다양한 수용체-결합 화합물들이 다양한 의학적 이상들의 진단 또는 치료에서의 용도로 개발되어 있다. 그와 같은 수용체-결합 화합물들은 통상적으로 1종 이상 특정 단백질상의 하나 이상 수용체 부위에 결합하도록 설계된다. 수용체-결합 화합물은 특정 표적 세포로 치료 또는 진단용 작용제를 전달하는 데에, 또는 심지어는 치료상의 이유로 특정 수용체를 차단하는 데에 사용될 수 있다.
예를 들자면, 2002년 6월 25일에 공고되었으며 본원에 참조로써 포함되는 발명의 명칭 "Macromolecular Carrier for Drug and Diagnostic Agent Delivery"의 U.S. 특허 제6,409,990호 ("'990 특허")는 유방암 및 흑색종을 단계지정하기 위한 감시 림프절 영상화에 사용하기 위한 방사성동위원소 전달용 운반체 분자로서 유용한 것으로 드러난 수용체-결합 거대분자에 대해 개시하고 있다. '990호 특허에 기술되어 있는 운반체 분자는 감시 림프절에 의한 상당하면서도 지속적인 흡수를 나타냄으로써, 운반체 분자에 부착되어 있는 방사성동위원소의 전달을 가능케 한다.
더 구체적인 예를 들자면, '990 특허에 따라 제조되는 현재 시판되고 있는 한 가지 진단제로써, 림포시크(LYMPHOSEEK)® 주사 키트라는 명칭하에 오하이오 더블린 소재 나비데아 바이오파마슈티칼스(Navidea Biopharmaceuticals Inc.) 사에 의해 시판되고 있는 테크네튬 Tc 99m 틸마노셉트(technetium Tc 99m tilmanocept)가 있다. 상기 림포시크 키트는 틸마노셉트 분말이 들어 있는 바이알의 형태로 배포되고 있다. 틸마노셉트 분말은 사용 전에 테크네튬 Tc 99m 틸마노셉트 진단제를 제조하기 위하여 테크네튬 Tc 99m을 사용하여 방사성표지된다. 이와 같은 진단제는 틸마노셉트 분말 및 환원제가 들어 있는 바이알에 테크네튬 Tc 99m 퍼테크네테이트 용액이 첨가됨으로써 테크네튬 Tc 99m이 틸마노셉트 분자의 디에틸렌트리아민펜타아세트산 ("DTPA") 잔기에 킬레이팅되도록 하는 경우에 형성된다. 생성되는 방사성 진단제는 유방암, 흑색종 또는 편평 세포 암종 (SCC)에 걸린 환자에서의 원발성 종양 부위를 배액하는 림프절 (즉 감시 림프절)의 위치지정을 돕기 위하여 단일-광자 방출 컴퓨터화 단층촬영 (SPECT: 컴퓨터화 단층촬영 CT 동반 또는 비동반) 및/또는 감마-방출-기반 섬광조영술을 사용하고/거나, 휴대용 감마 계수기를 사용하는 림프 매핑(mapping)에 사용하도록 승인되어 있다.
림포시크® 진단제의 비-방사성표지 전구체인 틸마노셉트는 다수의 아미노-종결 연결사슬(leash) (--O(CH2)3S(CH2)2NH2)이 코어 글루코스 요소에 부착되어 있는 덱스트란 백본을 가지고 있다. 또한, 만노스 잔기가 수많은 연결사슬의 아미노 기에 접합되어 있으며, 킬레이터(chelator)인 디에틸렌트리아민 펜타아세트산 (DTPA)이 만노스를 함유하지 않는 다른 연결사슬의 아미노 기에 접합되어 있다. 틸마노셉트는 일반적으로 덱스트란 3-[(2-아미노에틸)티오]프로필 17-카르복시-10,13,16-트리스(카르복시메틸)-8-옥소-4-티아-7,10,13,16-테트라아자헵타데크-1-일 3-[[2-[[1-이미노-2-(D-만노피라노실티오)에틸]아미노]에틸]티오]프로필 에테르 복합체로 구성되며, 일반적으로 하기의 구조를 가진다:
Figure pat00001
일부 경우에서는, 글루코스 잔기들 중 어느 것에 부착된 아미노티올 연결사슬이 없을 수 있다는 것에 유의해야 한다.
틸마노셉트의 DTPA 킬레이터 부분은 운반체 분자에의 방사성 동윈원소 Tc 99m의 부착에 사용된다. 방사성표지 (예컨대 '990 특허에 기술되어 있는 바와 같음) 후, 테크네튬 Tc 99m, 덱스트란 3-[(2-아미노에틸)티오]프로필 17-카르복시-10,13,16-트리스(카르복시메틸)-8-옥소-4-티아-7,10,13,16-테트라아자헵타데크-1-일 3-[[2-[[1-이미노-2-(D-만노피라노실티오)에틸]아미노]에틸]티오]프로필 에테르 복합체인 테크네튬 틸마노셉트가 형성된다. 테크네튬 Tc 99m 틸마노셉트는 하기의 구조를 가진다:
Figure pat00002
테크네튬 Tc 99m 틸마노셉트의 분자 화학식은 [C6H10O5]nㆍ(C19H28N4O9S99mTc)aㆍ(C13H24N2O5S2)bㆍ(C5H11NS)c이며, 여기서 n은 약 35 내지 약 58 사이이고, n ≥ (a+b+c)이다. 시중에서 시판되고 있는 버젼에서는, 그것이 3-8개의 접합된 DTPA (디에틸렌트리아민 펜타아세트산) 잔기 (a); 12-20개의 접합된 만노스 잔기 (b); 및 0-17개의 비접합 아민 측쇄 (c)를 함유한다.
유방암, 흑색종 또는 SCC를 단계지정하는 데에 사용될 때, 테크네튬 Tc 99m 표지된 틸마노셉트 (즉 림포시크)는 주사 부위로부터의 빠른 클리어런스, 감시 림프절(들)에 의한 빠르고 지속적인 흡수, 및 원거리 또는 제2 단계 림프절(second-echelon lymph node)에 의한 낮은 흡수를 나타낸다. 틸마노셉트상의 만노스 잔기가 수용체 결합을 담당하는 것으로 알려져 있기는 하지만, 그와 같은 결합의 특성 및 범위에 대해서는 알려져 있지 않다.
다양한 장치 및 기술들이 대식세포 관련 장애 진단 및/또는 치료용으로 존재할 수 있기는 하지만, 본 발명자(들) 이전의 누구도 본원에서 기술되는 바와 같은 발명을 이룩하거나 사용한 바는 없는 것으로 여겨진다.
본 명세서가 본 발명을 특정하게 지적하고 구별되게 청구하는 청구범위로 종결되기는 하지만, 첨부 도면과 함께 소정 예들에 대한 하기의 상세한 설명으로부터 본 발명이 더 잘 이해될 것으로 생각된다.
소정 예들에 대한 하기의 상세한 설명이 본 발명의 영역을 제한하는 데에 사용되어서는 아니 된다. 본원에서 개시되는 버젼의 다른 특징, 측면 및 장점들은 하기의 상세한 설명으로부터 통상의 기술자에게 드러나게 될 것이다. 알게 될 바와 같이, 본원에서 기술되는 버젼은 본 발명에서 전혀 벗어나지 않고도 다른 상이하며 자명한 측면이 될 수 있다. 따라서, 도면 및 상세한 설명은 제한적인 것이 아니라 특성상 예시적인 것으로 간주되어야 한다.
본 발명은 합성 거대분자 (예컨대 약 2-30 kDa)를 사용한 CD206 발현 세포-관련 장애의 진단 및/또는 치료를 위한 조성물, 방법 및 키트에 관한 것이다. CD-206 발현 세포-관련 장애에는 대식세포, 수지상 세포 또는 다른 CD206 발현 세포가 연관되어 있거나 동원되는 임의의 질환, 장애 또는 이상, 예컨대 대식세포 또는 다른 CD206 발현 세포의 수가 증가되고/거나 그와 같은 세포들이 비정상적으로 국소재되는 것들 (예컨대 종양, 병에 걸린 관절, 혈관 내피 등에서의 것들)이 포함된다. 그와 같은 장애에는 면역 질환, 면역-매개 면역 질환, 자가면역 질환, 염증성 질환, 자가-염증성 질환 및 감염성 질환이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
하기에서 추가적으로 논의되는 바와 같이, 본원에서 기술되는 조성물은 합성 거대분자인 운반체 분자 및, 1종 이상의 검출가능한 잔기 및/또는 치료제가 거기에 부착되어 있는 합성 거대분자 운반체 분자를 포함한다. 본원에서 기술되는 실시양태는 또한 임의적으로 운반체 분자를 포유동물 대상체에 투여하는 데에 적합한 제약상 허용되는 담체 (예컨대 제약상 허용되는 비히클을 포함한 것) 내에, 또는 생체외 진단 시험을 용이하게 하는 용액 내에 그와 같은 운반체 분자를 함유하는 진단용 및/또는 치료용 키트도 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 키트는 1종 이상의 검출가능한 잔기 및/또는 1종 이상의 치료제를 운반체 분자에 부착시키는 데에 적합한 형태의 운반체 분자를 포함하는 반면, 다른 실시양태에서, 키트는 이미 1종 이상의 검출가능한 잔기 및/또는 1종 이상의 치료제가 거기에 부착되어 있는 운반체 분자를 포함한다. 구체적인 일 실시양태에서, 키트는 대상체에의 투여 전의 1종 이상 방사성 동위원소의 부착을 용이하게 하기 위한 1종 이상의 아주반트와 함께, 용기 내에 운반체 분자 (예컨대 동결건조된 분말 형태)를 포함한다.
또 다른 실시양태에서는, 진단 및/또는 치료 방법이 제공되며, 상기 방법은 대상체에 대한 운반체 분자의 투여를 포함한다. 치료 방법의 경우, 1종 이상의 치료제가 운반체 분자에 부착되어 있다. 진단 방법에서는, 1종 이상의 검출가능한 잔기가 운반체 분자에 부착된다. 추가적인 실시양태에서는, 운반체 분자가 진단 방법 및 치료 모두에 사용될 수 있도록, 1종 이상의 치료제 및 1종 이상의 검출가능한 잔기 모두가 운반체 분자에 부착되는, 조합된 진단 및 치료 방법이 제공된다. 또 다른 실시양태에서는, 치료제와 검출가능한 진단용 잔기가 동일한 화합물 또는 물질로써 - 다시 말하자면 부착되는 잔기가 검출가능할 뿐만 아니라, 치료용이기도 하다 (예컨대 갈륨-68). 다른 실시양태는 체액 또는 조직 샘플이 대상체로부터 수집된 다음, 1종 이상의 검출가능한 잔기가 거기에 부착되어 있는 운반체 분자와 접촉되는, 생체외 진단 방법을 제공한다.
본원에서 사용될 때, "진단하는 것"이라는 용어에는 장애의 존재 또는 부재를 측정하는 것, 특정 장애가 미래에 발생될 가능성을 측정하는 것, 및/또는 대상체에서 이전에 확인된 장애의 상태를 측정하는 것이 포함된다. 예를 들어, 암의 경우, 진단하는 것이라는 용어는 암의 존재 또는 부재, 암의 단계를 측정하는 것, 및/또는 환자에서의 전암성 상태의 존재, 부재 또는 단계의 검출을 포괄한다. 이전에 확인된 장애의 상태를 측정하는 것에는 또한 장애 (예컨대 대식세포-관련 장애)의 진행, 진행의 부재, 감소 또는 경감을 측정하는 것도 포함된다. 또한 "치료" (및 "치료하는 것")이라는 용어는 장애 (예컨대 질환 또는 의학적 이상)를 치유하거나 제거하는 것뿐만 아니라 장애의 하나 이상의 영향을 감소시키거나, 그의 진행을 느리게 하거나, 개선하는 것도 포함한 가장 넓은 정의를 의미하고자 하는 것이다.
본원의 조성물 및 방법이 사용될 수 있는 대식세포-관련 및 기타 CD206 발현 세포-관련 장애에는 하기가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다: 후천성 면역 결핍 증후군 (AIDS), 급성 파종성 뇌척수염 (ADEM), 애디슨병, 무감마글로불린혈증, 알레르기 질환, 원형 탈모증, 알츠하이머병, 근위축성 측삭 경화증, 강직성 척추염, 항인지질 증후군, 항신테타제 증후군, 동맥 플라크 장애, 천식, 죽상동맥경화증, 아토피성 알레르기, 아토피성 피부염, 자가면역 재생불량성 빈혈, 자가면역성 심근병증, 자가면역성 장병증, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역성 간염, 자가면역성 갑상선저하증, 자가면역성 내이 질환, 자가면역 림프구증식 증후군, 자가면역성 말초 신경병증, 자가면역성 췌장염, 자가면역성 다내분비선 증후군, 자가면역성 프로게스테론 피부염, 자가면역 혈소판감소성 자색반, 자가면역성 두드러기, 자가면역성 포도막염, 발로병/발로 동심성 경화증, 베체트병, 버거병, 비커스태프 뇌염, 블라우 증후군, 수포성 유천포창, 심혈관 취약성 플라크, 캐슬맨병, 복강병, 샤가스병, 만성 염증성 탈수초 다발신경병증, 만성 재발성 다초점 골수염, 만성 폐쇄성 폐 질환, 만성 정맥 울혈성 궤양, 처그-스트라우스 증후군, 반흔성 유천포창, 코간 증후군, 한랭 응집소병, 보체 성분 2 결핍, 접촉성 피부염, 두개 동맥염, CREST 증후군, 크론병, 쿠싱 증후군, 피부 백혈구파괴성 혈관염, 데고병, 더컴병, 포진성 피부염, 피부근염, 당뇨병 유형 I, 당뇨병 유형 II, 확산 피부 전신성 경화증, 드레슬러 증후군, 약물-유도 루푸스, 원반상 홍반 루푸스, 습진, 폐기종, 자궁내막증, 골근부착부염-관련 관절염, 호산구성 근막염, 호산구성 위장염, 호산구성 폐렴, 후천성 수포성 표피박리증, 결절성 홍반, 태아 적모구증, 원발성 혼합 한랭글로불린혈증, 에반스 증후군, 진행성 골화 섬유형성이상, 섬유화 폐포염 (또는 특발성 폐 섬유증), 위염, 위장 유천포창, 고셰병, 사구체신염, 굿파스처 증후군, 그레이브병, 길랑-바레 증후군 (GBS), 하시모토 뇌병증, 하시모토 갑상선염, 심장 질환, 헤노흐-쇤라인 자색반, 임신성 포진 (임신성 유천포창으로도 알려져 있음), 화농성 한선염, HIV 감염, 휴-스토빈 증후군, 저감마글로불린혈증, 감염성 질환 (세균 감염 질환 포함), 특발 염증성 탈수초 질환, 특발성 폐 섬유증, 특발성 혈소판감소 자색반, IgA 신장병증, 봉입체 근염, 염증성 관절염, 염증성 장병, 염증성 치매, 간질성 방광염, 간질성 폐렴, 소아 특발성 관절염 (소아 류마티스 관절염으로도 알려져 있음), 카와사키병, 램버트-이튼 근무력 증후군, 백혈구파괴성 혈관염, 편평 태선, 경화성 태선, 선상 IgA 질환 (LAD), 루포이드 간염 (자가면역성 간염으로도 알려져 있음), 홍반성 루푸스, 림프종양 육아종증, 마지드 증후군, 암을 포함한 악성종양 (예컨대 육종, 카포시 육종, 림프종, 백혈병, 암종 및 흑색종), 메니에르병, 현미경적 다발혈관염, 밀러-피셔 증후군, 혼합 결합 조직 질환, 반상경피증, 무카-하베르만병 (급성 두창양 태선양 비강진으로도 알려져 있음), 다발성 경화증, 중증 근무력증, 근육염, 기면증, 시각 신경척수염 (데빅병으로도 알려져 있음), 신경근긴장증, 안구 반흔성 유천포창, 안간대 근경련 증후군, 오드 갑상선염, 재발성 류마티스, PANDAS (스트렙토코쿠스와 연관된 소아과 자가면역 신경정신 장애), 부신생물성 소뇌 변성, 파킨슨 장애, 발작성 야간 혈색뇨증 (PNH), 패리 롬베르그 증후군, 파서니지-터너 증후군, 주변 포도막염, 심상성 천포창, 말초 동맥 질환, 악성 빈혈, 정맥주위성 뇌척수염, POEMS 증후군, 결절다발성 동맥염, 류마티스성 다발근육통, 다발근육염, 원발성 담즙성 간경변증, 원발성 경화성 담관염, 진행성 염증 신경병증, 건선, 건선성 관절염, 괴저성 농피증, 진정 적혈구계 무형성증, 라스무센 뇌염, 레이노 현상, 재발성 다발연골염, 라이터 증후군, 재협착, 하지 불편 증후군, 후복막 섬유증, 류마티스 관절염, 류마티스열, 사르코이드증, 정신분열증, 슈미트 증후군, 슈니츨러 증후군, 공막염, 피부경화증, 패혈증, 혈청병, 쇠그렌 증후군, 척추관절병증, 스틸병 (성인 발병), 강직 인간 증후군, 뇌졸중, 아급성 세균성 심내막염 (SBE), 수삭 증후군, 스위트 증후군, 시덴함 무도병, 교감성 안염, 전신성 홍반 루푸스, 전신성 류마티스 질환, 타카야수 동맥염, 측두 동맥염 ("거대 세포 동맥염"으로도 알려져 있음), 취약성 섬유-죽종, 저혈소판증, 톨로사-헌트 증후군, 이식 (예컨대 심장/폐 이식) 거부 반응, 횡단성 척수염, 결핵, 궤양성 결장염, 미분화 결합 조직 질환, 미분화 척추관절병증, 두드러기 혈관염, 혈관염, 백반증 및 베게너 육아종증.
본 출원인은 틸마노셉트 및 '990 특허에 기술되어 있는 다른 관련 운반체 분자들뿐만 아니라, 덱스트란 백본을 기반으로 하는 다른 운반체 분자들이 포유동물에게 투여되거나 생체 외에서 CD206 발현 세포와 접촉되는 경우 배제적으로 대식세포 및 소정의 다른 세포들 (예컨대 카포시 육종 방추 세포 및 수지상 세포)의 표면에서 발견되는 만노스 수용체 단백질 CD206에 결합한다는 것을 발견하였다. 포유동물에서 발견되는 수많은 다른 탄수화물-결합 수용체들이 존재하기는 하지만, 이러한 운반체 분자에 특이적으로 결합하거나 그것을 변환시키는 다른 수용체는 없는 것으로 여겨진다. CD206은 대식세포 및 소정의 다른 유형 세포 표면에서 발견되는 C-유형 렉틴 단백질이다. 예를 들면 대식세포의 표면에서 발견되는 CD206 단백질이 포유동물 환자에서의 틸마노셉트 결합의 유일한 관문인 것으로 보인다는 발견은 틸마노셉트 운반체 분자 (및 관련 운반체 분자들)가 대식세포 관련 장애 및 다른 CD206 발현 세포-관련 장애의 진단 및/또는 치료에 사용하기 위한 다양한 치료 및 진단용으로 효과적인 분자 종들을 제조하는 데에 기초로 사용될 수 있다는 것을 의미한다.
본원에서 기술되는 조성물, 키트, 그리고 치료 및 진단 방법에서 사용되는 운반체 분자는 검출가능한 잔기 및/또는 치료제 (예컨대 세포독성 작용제)를 세포로 전달하는 데에 사용된다. 이러한 운반체 분자는 검출가능한 잔기 및/또는 치료제 및, 운반체 분자가 CD206에만 결합하도록 유도하는 1종 이상의 수용체 리간드 (수용체 기질로도 지칭됨)가 운반체 분자에 부착되는 것을 가능케 하는 1종 이상의 특징을 포함한다. 이와 같은 방식으로, 검출가능한 잔기 또는 치료제는 차후의 검출 목적 (즉 진단 목적) 및/또는 치료 목적 (예컨대 세포독성 작용제를 CD206을 발현하는 세포 또는 CD206-발현 세포에 이웃하는 세포로 표적화하는 것)을 위하여 CD206을 발현하는 세포로 전달된다.
본원에서 기술되는 운반체 분자가 세포 표면상의 CD206에 결합할 뿐만 아니라, 세포로 내재화되기도 한다는 것 역시 발견되었다. 일단 대식세포 내부로 들어가고 나면, 운반체 분자는 안정한 비-분해성 소포인 것으로 보이는 것 내에서 존속한다. 이와 같은 추가적인 발견은 생체 내에서 세포에 결합하는 운반체 분자의 양이 세포 표면상 CD206 수용체의 수로 제한되지는 않는다는 것을 의미하는 것으로써, 일단 운반체 분자가 내재화되고 나면, 재활용을 통하여 그 운반체 분자가 부착되었던 CD206 단백질이 추가적인 운반체 분자에 결합하는 데에 이용가능하게 될 것이기 때문이다. 이와 같은 측면은 더 많은 수의 운반체 분자, 및 부착되어 있는 검출가능 및/또는 치료용 잔기가 표적 세포에 (내부의 것 포함) 결합하는 것을 가능케 함으로써, 표적화된 세포로 전달되는 진단 검출제 및/또는 치료제의 양을 향상시킨다. 문맥상 다르게 표시되지 않는 한, CD206 발현 세포에 결합된 운반체 분자에 대하여 언급하는 어떠한 경우에도, 그것은 CD206에 부착된 다음 세포로 내재화된 운반체 분자를 포함하는 것으로 이해될 것임에 유의해야 한다.
본원에서 추가적으로 기술될 바와 같은 생체외 진단 시험의 경우, 일부 실시양태에서는, 운반체 분자의 내재화를 방지하거나 제한하는 것이 바람직할 수 있다. 그 이유는 본원의 생체외 진단 방법들 중 일부가 세포에 결합된 운반체 분자의 수를 대식세포 또는 다른 CD206 발현 세포의 수에 상관시키는 것에 기초하고 있다는 것이다. 운반체 분자가 세포로 내재화되는 경우, 더 많은 운반체 분자가 CD206 수용체에 부착할 수 있으며, 그에 따라 일부 경우에서는 부착된 운반체 분자의 수를 CD206 발현 세포의 수에 상관시키는 것을 더 어렵게 만든다. 하기할 바와 같이, 운반체 분자의 내재화를 방지하거나 제한하는 한 가지 수단은 인큐베이션 기간 동안 체액과 운반체 분자 혼합물의 온도를 포유동물 대상체의 정상적인 생리학적 온도 (즉 정상 체온) 미만으로 저하시키는 것이다. 최고 수준의 운반체 분자 내재화 억제는 0 ℃를 약간 초과하는 온도에서 이루어진다 (하기에서 논의되는 바와 같음).
본원에서 사용되는 운반체 분자는 일반적으로 '990 특허에 기술되어 있는 유형의 덱스트란 백본을 포함한다. 따라서, 상기 백본은 주로 α-1,6 글리코시드 결합에 의해 연결되어 있는 다수의 글루코스 모이어티 (즉 잔기)를 포함한다. α-1,4 및/또는 α-1,3 결합과 같은 다른 연결들도 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 덱스트란 백본은 약 1 kDa 내지 약 50 kDa 사이의 MW를 가지는 반면, 다른 실시양태에서, 덱스트란 백본은 약 5 내지 약 25 kDa 사이의 MW를 가진다. 또 다른 실시양태에서, 덱스트란 백본은 약 8 내지 약 15 kDa 사이, 예컨대 약 10 kDa의 MW를 가진다. 반면, 다른 실시양태에서, 덱스트란 백본은 약 1 내지 약 5 kDa 사이, 예컨대 약 2 kDa의 MW를 가진다. 덱스트란 백본의 MW는 진단, 평가 또는 치료될 구체적인 장애 및, 거대분자 구성체가 치료, 진단 또는 평가 중 어디에 사용되어야 하는지를 기준으로 선택될 수 있다.
예를 들자면, 더 작은 MW의 덱스트란 백본을 가지는 운반체 분자는 예컨대 분자가 혈액-뇌 장벽을 건너기를 원하는 경우, 또는 감소된 체류 시간이 바람직한 경우에 (즉 CD206에 결합하는 기간이 감소됨) 적절할 수 있다. 더 큰 MW의 덱스트란 백본을 가지는 운반체 분자는 예컨대 증가된 체류 시간이 바람직한 경우에 (즉 CD206에 결합하는 기간이 증가됨) 적절할 수 있다. 또 다른 실시양태에서는, 더 효율적인 수용체 기질이 덱스트란 백본에 부착되는 경우 (예컨대 하기하는 바와 같은 분지된 만노스 잔기), 더 작은 MW의 덱스트란 백본 (예컨대 약 1 내지 약 5 kDa)을 가지는 운반체 분자가 사용될 수 있다. 더 효율적인 수용체 기질은 더 긴 기간 동안 및/또는 더 효과적으로 CD206에 결합하게 됨으로써, 더 작은 덱스트란 백본의 사용을 가능케 한다.
덱스트란 백본 이외에, 운반체 분자는 CD206에 결합하는 1종 이상의 수용체 기질을 추가적으로 포함하는데, 상기 수용체 기질은 덱스트란 백본에 접합되어 있다. 덱스트란 백본에 부착되는 각 수용체 기질은 덱스트란 백본의 글루코스 잔기들 중 하나 이상에 부착된 만노스, 푸코스, n-아세틸글루코스아민, D-갈락토스, n-아세틸갈락토스아민, 시알산 및 뉴라민산으로 구성되는 군에서 선택되는 1종 이상의 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 수용체 기질은 덱스트란 백본의 글루코스 잔기들 중 약 10 % 내지 약 50 % 사이, 또는 글루코스 잔기들 중 약 20 % 내지 약 45 % 사이, 또는 글루코스 잔기들 중 약 25 % 내지 약 40 % 사이에 부착되어 있다. (합성 기술이 어느 정도의 변동을 초래하게 되기 때문에, 덱스트란 백본에 부착되는 수용체 기질, 연결사슬 및 진단용/치료용 잔기에 관하여 본원에서 언급되는 MW 및, 수 및 접합도는 주어진 양의 운반체 분자에 있어서의 평균 양을 지칭한다는 것에 유의해야 함).
일부 실시양태에서, 각 수용체 기질은 개별 글루코스 잔기에 부착된 만노스, 푸코스, n-아세틸글루코스아민, D-갈락토스, n-아세틸갈락토스아민, 시알산 및 뉴라민산 단일 잔기를 포함한다 (즉 각 수용체 기질은 단당류임). 다른 실시양태에서는, 2개 이상의 수용체 기질 (동일하거나 상이할 수 있음)이 서로 접합되어, 덱스트란 백본의 단일 글루코스 잔기에 부착된다. 따라서, 이러한 실시양태에서, 각 수용체 기질은 이당류, 올리고당류 또는 다당류를 포함한다. 다당류 수용체 기질의 경우, 일 실시양태는 만난, 특히 분지된 만난을 포함한다.
구체적인 일 실시양태에서, 운반체 분자는 임의적으로 하나 이상의 푸코스, n-아세틸글루코스아민, D-갈락토스, n-아세틸갈락토스아민, 시알산 및 뉴라민산 잔기와 함께 하나 이상의 만노스 잔기가 부착되어 있는 덱스트란 백본 (예컨대 약 1 내지 약 50 kDa 사이의 MW를 가짐)을 포함한다. 또 다른 실시양태에서는, 1종 이상의 분지된 만노스 잔기가 덱스트란 백본의 일 글루코스 잔기에 부착된다. 분지된 만노스 잔기는 선형 또는 하나 이상의 분지 중 어느 하나로서 하나의 추가적인 만노스, 푸코스, n-아세틸글루코스아민, D-갈락토스, n-아세틸갈락토스아민, 시알산 또는 뉴라민산 잔기가 개별적으로 또는 조합되어 부착되어 있는 만노스 잔기를 포함하는 이당류, 올리고당류 또는 다당류를 의미한다. 예를 들면, 운반체 분자의 일부 실시양태는 1종 이상의 수용체 기질이 덱스트란의 글루코스 잔기에 부착되어 있는 덱스트란 백본을 포함하며, 여기서 상기 수용체 기질은 3개 이상의 만노스 잔기 (선형 또는 분지형)를 포함한다. 그와 같은 추가적인 만노스 잔기는 CD206에 대한 증가된 결합을 제공함으로써, 예를 들면 더 작은 MW의 덱스트란 백본 사용을 가능케 한다.
수용체 기질은 덱스트란 백본의 글루코스 잔기에 직접 또는 간접적으로 부착된다. 일부 실시양태에서, 수용체 기질은 먼저 덱스트란 백본의 글루코스 잔기들 중 적어도 일부에 부착되는 (예컨대 연결사슬은 글루코스 잔기 중 약 50 % 내지 100 % 사이, 또는 약 70 % 내지 약 95 % 사이, 또는 심지어는 약 80 % 내지 90 % 사이에 부착됨) 연결사슬을 통하여 부착된다. 동일한 연결사슬이 모든 위치에 부착될 수 있거나, 또는 2종 이상의 상이한 연결사슬들이 사용될 수도 있다.
'990 특허에 기술되어 있는 바와 같이, 일부 실시양태에서는, 다수의 아미노-종결 연결사슬들이 대부분의 글루코스 잔기에 부착되어 있는데, 여기서 아미노-종결 연결사슬은 덱스트란 백본 글루코스 잔기의 히드록실 기가 아미노-종결 연결사슬로 대체되도록 하는 --O(CH2)3S(CH2)2NH2를 포함한다. 상기 연결사슬은 알릴 브로마이드를 사용하여 덱스트란 백본상 히드록실 기들 중 적어도 일부를 알릴화하는 것에 의해 덱스트란 백본에 부착될 수 있다. 다음에, 알릴 기는 아미노에탄티올 히드로클로라이드와 반응됨으로써, 다수의 -O(CH2)3S(CH2)2NH2 연결사슬을 가지는 덱스트란 백본을 산출한다. CD206 결합을 제공하기 위해서는, 수용체 기질 (상기한 바와 같음)이 연결사슬들 중 적어도 일부의 아미노 기에 접합된다. 이는 '990 특허에 기술되어 있는 방법에 의해, 또는 통상의 기술자에게 알려져 있는 다른 방식으로 수행될 수 있다. 예를 들자면, 만노스 및/또는 갈락토스가 연결사슬들 중 일부의 아미노 기에 접합된다. 상기에서 논의된 바와 같이, 부착된 수용체 기질은 단일 잔기, 또는 2개 이상 수용체 기질의 선형 또는 분지형 사슬일 수 있다.
통상의 기술자에게 알려져 있거나 차후에 발견된 다양한 다른 연결사슬들이 --O(CH2)3S(CH2)2NH2 대신 (또는 그에 더하여) 사용될 수 있다. 여기에는 예를 들면 2관능성 연결사슬 기 예컨대 알킬렌 디아민 (H2N-(CH2)r-NH2) (식 중 r은 2 내지 12임); 아미노알콜 (HO-(CH2)r-NH2) (식 중 r은 2 내지 12임); 아미노티올 (HS-(CH2)r-NH2) (식 중 r은 2 내지 12임); 임의적으로 카르복시-보호된 아미노산; 에틸렌 및 폴리에틸렌 글리콜 (H-(O-CH2-CH2)n-OH) (식 중 n은 1-4임)이 포함된다. 적합한 2관능성 디아민에는 에틸렌디아민, 1,3-프로판디아민, 1,4-부탄디아민, 스퍼미딘, 2,4-디아미노부티르산, 리신, 3,3'-디아미노디프로필아민, 디아미노프로피온산, N-(2-아미노에틸)-1,3-프로판디아민, 2-(4-아미노페닐)에틸아민 및 유사 화합물들이 포함된다. β-알라닌, γ-아미노부티르산 또는 시스테인, 또는 올리고펩티드 예컨대 디- 또는 트리-알라닌과 같은 1종 이상의 아미노산 역시 2관능성 연결사슬 분자로 사용될 수 있다.
다른 2관능성 연결사슬에는 하기가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다:
-NH-(CH2)r-NH- (식 중 r은 2-5임),
-O-(CH2)r-NH- (식 중 r은 2-5임),
-NH-CH2-C(O)-,
-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-,
-NH-NH-C(O)-CH2-,
-NH-C(CH3)2C(O)-,
-S-(CH2)r-C(O)- (식 중 r은 1-5임),
-S-(CH2)r-NH- (식 중 r은 2-5임),
-S-(CH2)r-O- (식 중 r은 1-5임),
-S-(CH2)-CH(NH2)-C(O)-,
-S-(CH2)-CH(COOH)-NH-,
-O-CH2-CH(OH)-CH2-S-CH(CO2H)-NH-,
-O-CH2-CH(OH)-CH2-S-CH(NH2)-C(O)-,
-O-CH2-CH(OH)-CH2-S-CH2-CH2-NH-,
-S-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-, 및
-NH-O-C(O)-CH2-CH2-O-P(O2H)-.
본원에서 기술되는 치료 및 진단 방법 및 조성물에서 사용되는 거대분자는 추가적으로 운반체 분자에 부착되어 있는 검출가능한 잔기 및/또는 치료제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 검출가능한 잔기 및/또는 치료제는 운반체 분자의 글루코스 잔기에 직접 부착되는 반면 (예컨대 공유 결합 화학 및 합성 기술을 통함), 다른 실시양태에서, 검출가능한 잔기 및/또는 치료제는 하기되는 바와 같은 1종 이상의 연결사슬 (수용체 기질을 부착시키는 데에 사용되는 것과 동일하거나 상이한 연결사슬일 수 있음)을 사용하여 부착된다.
또 다른 실시양태에서는, 검출가능한 잔기 및/또는 치료제를 부착시키는 데에 사용하기 위하여, 킬레이터가 운반체 분자에 부착된다. 운반체 백본에 부착된 연결사슬을 사용하며 '990 특허에 기술되어 있는 바와 같은 일부 실시양태에서, 킬레이터는 연결사슬들 중 일부의 아미노 기에 접합되어, 검출가능한 잔기를 거기에 결합시키는 데에 사용된다. 적합한 킬레이터에는 예를 들면 테트라아자시클로도데칸테트라아세트산 (DOTA), 메르캅토아세틸글리실글리실-글리신 (MAG3), 디에틸렌트리아민 펜타아세트산 (DTPA), 디메르캅토숙신산, 디페닐에틸렌 디아민, 포르피린, 이미노디아세트산 및 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)과 같은 통상의 기술자에게 알려져 있거나 차후에 개발된 것들이 포함된다.
구체적인 일 실시양태에서, 운반체 분자는 글루코스 잔기 약 10 내지 약 15개 사이, 또는 글루코스 잔기 약 11 내지 약 12개, 또는 글루코스 잔기 약 13개의 덱스트란 백본을 포함한다. 수용체 기질은 약 2 내지 약 4개 사이의 글루코스 잔기, 또는 다른 실시양태에서는 2개의 글루코스 잔기에 접합된다. 수용체 기질은 글루코스 잔기에 직접, 또는 연결사슬 (예컨대 본원에서 이전에 기술된 것들 중 1종, 예컨대 --O(CH2)3S(CH2)2NH2)을 사용하여 간접적으로 부착된다. 상기 수용체 기질은 각각 만노스, 푸코스, n-아세틸글루코스아민, D-갈락토스, n-아세틸갈락토스아민, 시알산 및 뉴라민산으로 구성되는 군에서 선택되는 3개 이상의 부착된 잔기들을 포함하는 분지된 올리고당류 잔기를 포함한다. 일부 경우에서는, 덱스트란 백본의 글루코스 잔기들 중 하나에 부착되어 있는 각 수용체 기질이 만노스, 푸코스, n-아세틸글루코스아민, D-갈락토스, n-아세틸갈락토스아민, 시알산 및 뉴라민산으로 구성되는 군에서 선택되는 4개 이상의 부착된 잔기들을 포함하는 분지된 올리고당류를 포함한다. 다른 실시양태에서, 덱스트란 백본의 글루코스 잔기들 중 하나에 부착되어 있는 각 수용체 기질은 만노스, 푸코스, n-아세틸글루코스아민, D-갈락토스, n-아세틸갈락토스아민, 시알산 및 뉴라민산으로 구성되는 군에서 선택되는 5개 이상 또는 심지어는 6개 이상의 결합된 잔기들을 포함하는 분지된 올리고당류를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 덱스트란 백본의 글루코스 잔기들 중 하나에 부착되어 있는 각 수용체 기질은 4개 이상, 또는 일부 경우에는 5개 이상의 만노스 잔기를 포함하는 분지된 올리고당류를 포함한다. 약 10-15, 11-12 또는 13개 글루코스 잔기의 덱스트란 백본을 포함하는 운반체 분자의 이러한 실시양태들에서, DTPA 및/또는 DOTA와 같은 킬레이터는 검출가능한 잔기 및/또는 치료제의 부착 지점을 제공하기 위하여, 간접적이거나 연결사슬을 통하는 것 중 어느 하나로 수용체 기질을 가지지 않는 글루코스 잔기들 중 하나 이상에 접합된다.
다른 실시양태에서, 특히 검출가능한 잔기 및/또는 치료제가 덱스트란 백본의 글루코스 잔기들 중 하나에, 또는 덱스트란 백본의 글루코스 잔기에 부착되어 있는 연결사슬들 중 하나에 직접 부착될 수 있는 경우, 킬레이터는 필요하지 않다. 예를 들자면, 다양한 입수가능한 형광단들과 같은 아민 반응성 염료는 연결사슬 --O(CH2)3S(CH2)2NH2의 아미노 기와 용이하게 반응한다. 이러한 염료는 통상적으로 N-히드록시숙신이미드 (NHS) 에스테르의 형태로써, 간단하게 공동용매 (예컨대 DMSO 또는 DMF) 중에서 운반체 분자와 염료의 NHS 에스테르를 혼합하는 것에 의해 운반체 분자 연결사슬상 아미노 기와 반응될 수 있다. 따라서, 일부 적용분야의 경우, 킬레이터는 운반체 분자에 필요하지 않다.
구체적인 일 실시양태에서, 운반체 분자는 틸마노셉트 (본원의 배경기술 부문에 그 구조가 기술되어 있음)를 포함한다. 아민 반응성 염료와 같은 검출가능한 잔기는 간단하게 염료를 비접합 아민 측쇄 (즉 만노스 잔기 또는 DTPA에 결합되지 않은 연결사슬)상 아미노 기와 반응시키는 것에 의해 용이하게 틸마노셉트에 부착될 수 있다. 방사성 동위원소 역시 검출가능한 잔기 및/또는 치료제를 제공하기 위하여 용이하게 틸마노셉트에 부착될 수 있다.
구체적인 일 실시양태에서, 운반체 분자는 전기한 바와 같이 연결사슬들 중 일부의 아미노 기에 부착된 킬레이터 DTPA를 포함하는 틸마노셉트이다. 99mTc와 같은 방사성 동위원소가 진단 목적으로 (즉 검출가능한 잔기로 작용함) 사용 직전에 DTPA에 결합된다. 구체적인 예를 들자면, 본원에 참조로써 포함되는 U.S. 특허 제8,545,808호에 기술되어 있는 바와 같이, 바이알 내에 틸마노셉트 분말을 포함하는 키트가 제공되는데, 여기서 상기 바이알에는 250 mcg의 틸마노셉트, 20 mg의 트레할로스 2수화물, 0.5 mg의 글리신, 0.5 mg의 나트륨 아스코르베이트 및 0.075 mg의 제일주석 클로라이드 2수화물의 혼합물이 들어 있다. 바이알의 내용물은 동결건조되어 있으며, 질소하에 존재한다. Tc 99m을 사용하여 틸마노셉트를 방사성표지하기 위하여, 대상체에의 투여 전에, 나트륨 퍼테크네테이트 Tc 99m 용액이 무균으로 틸마노셉트 분말의 바이알에 첨가된다. 이후, 희석제 예컨대 멸균 식염수, 또는 약 6.8-7.2의 pH를 가지는 0.04 % (w/v)의 칼륨 포스페이트, 0.11 % (w/v)의 나트륨 포스페이트 (7수화물), 0.5 % (w/v)의 나트륨 클로라이드 및 0.4 % (w/v)의 페놀을 포함하는 멸균 완충 희석 용액이 바이알에 첨가된다. 이렇게 하면, 생성되는 방사성표지 틸마노셉트는 환자에 대한 (예컨대 정맥내로의) 투여를 위한 준비가 된다. 본원에서 기술되는 다른 운반체 분자들은 유사한 방식으로 99mTc 또는 다양한 다른 방사성 동위원소에 의해 방사성표지될 수 있다. 원할 경우, 방사성 치료제가 - 1종 이상의 검출가능한 잔기 또는 다른 치료제와의 조합 또는 단독 중 어느 하나로써 - 유사하게 운반체 분자에 부착될 수도 있다.
본원에서 사용될 때, "검출가능한 잔기(detectable moiety)"라는 용어는 하기인 원자, 동위원소 또는 화학 구조를 의미한다: (1) 운반체 분자에 부착될 수 있으며; (2) 인간 또는 다른 포유동물 대상체에 대하여 비-독성이고; (3) 직접 또는 간접적으로 검출가능한 신호, 특히 측정될 수 있을 뿐만 아니라 그의 강도가 검출가능한 잔기의 양과 관련되는 (예컨대 비례하는) 신호를 제공함. 상기 신호는 분광법, 전기, 광학, 자성, 청각, 전파 신호 또는 촉진 검출 수단을 포함한 임의의 적합한 수단에 의해 검출될 수 있다.
적합한 검출가능한 잔기에는 방사성동위원소 (방사성핵종), 형광단, 화학발광제, 생물발광제, 자성 잔기 (상자성 잔기 포함), 금속 (예컨대 조영제로 사용하기 위한 것), RFID 잔기, 효소 시약, 비색 방출제, 염료 및 미립자-형성제가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적인 예를 들자면, 적합한 검출가능한 잔기에는 하기가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다:
- 자기 공명 영상화 (MRI)에 적합한 조영제, 예컨대 가돌리늄 (Gd3+), 상자성 및 초상자성 물질 예컨대 초상자성 산화 철;
- 컴퓨터화 단층촬영 (CT) 영상화에 적합한 조영제, 예컨대 요오드화 분자, 이테르븀 및 디스프로슘;
- 섬광조영 영상화 (또는 섬광조영술)에 적합한 방사성동위원소 예컨대 테크네튬-99m, 210/212/213/214Bi, 131/140Ba, 11/14C, 51Cr, 67/68Ga, 153Gd, 88/90/91Y, 123/124/125/131I, 111/115mIn, 18F, 105Rh, 153Sm, 67Cu, 166Ho, 177Lu, 186Re 및 188Re, 32/33P, 46/47Sc, 72/75Se, 35S, 182Ta, 123m/127/129/132Te, 65Zn 및 89/95Zr;
- 단일-광자 방출 컴퓨터화 단층촬영 (SPECT)에 적합한 감마-방출제, 예컨대 99mTc, 111In, 117mSn 및 123I;
- 비제한적으로 염료 예컨대 시아닌 형광단 (예컨대 Cy3. Cy5, Cy5.5, Cy7), 알렉사 플루오르(Alexa Fluor)® 염료 (몰큘라 프로브스(Molecular Probes, Inc.) 사로부터 구입가능함), 안트라센, 쿠마린, 플루오레세인, 로다민, pH로도(pHrodo)™, 녹색 형광 단백질, 2비소-테트라시스테인, 2-(4)-데히드록시코엘렌테라진, 5-FAM-디아세테이트, 이소시아닌 그린 및 이들의 유도체를 포함한, 광학 영상화에 적합한 염료 및 형광제, ; 및
- 양전자 방출 단층촬영 (PET)에 적합한 작용제 예컨대 18F.
구체적인 일 실시양태에서, 본원에서 기술되는 치료 및 진단 방법 및 조성물에서 사용되는 운반체 분자는 시아닌 염료 Cy3을 포함한다. Cy3-틸마노셉트는 예를 들면 문헌 [Vera et al JNM 2001, 42:951-9]에 기술되어 있는 방법을 사용하여 제조된 만노실-덱스트란의 디메틸술폭시드 (DMSO) 용액을 Cy3 N-히드록시 숙신이미드 에스테르의 DMSO 용액으로 적가 처리하는 것에 의해 제조될 수 있다. 실온에서 1시간 방치 후, 반응 혼합물이 정제됨으로써, Cy3-틸마노셉트가 제공되었다.
또 다른 구체적인 실시양태에서는, 형광제인 알렉사 플루오르® 488 (알렉사 플루오르® 488 카르복실산, 숙신이미딜 에스테르)이 Cy3과 유사한 방식으로 운반체 분자에 부착된다.
일부 실시양태에서, 본원에서 기술되는 치료 및 진단 방법 및 조성물에서 사용되는 운반체 분자는 - 검출가능한 잔기 대신, 또는 그와 함께 중 어느 하나로 - 운반체 분자에 부착되는 치료제를 포함한다. 본원에서 사용될 때, "치료제"라는 용어는 질환 또는 다른 이상을 치유 또는 제거하는 데에 효과적인 원자, 동위원소 또는 화학 구조 및, 질환 또는 다른 이상의 부정적인 효과를 감소시키거나, 그의 진행을 느리게 하거나, 또는 개선하는 데에 효과적인 것들을 의미한다.
일부 실시양태에서, 치료제는 둘러싸고 있는 대식세포 환경 중 대식세포 및 조직을 사멸시키는 능력을 가지고 있는 고에너지 사멸 동위원소를 포함한다. 적합한 방사성동위원소에는 하기가 포함된다: 210/212/213/214Bi, 131/140Ba, 11/14C, 51Cr, 67/68Ga, 153Gd, 99mTc, 88/90/91Y, 123/124/125/131I, 111/115mIn, 18F, 105Rh, 153Sm, 67Cu, 166Ho, 177Lu, 186Re 및 188Re, 32/33P, 46/47Sc, 72/75Se, 35S, 182Ta, 123m/127/129/132Te, 65Zn 및 89/95Zr.
다른 실시양태에서, 치료제는 비제한적으로 하기로 구성되는 군에서 선택되는 비-방사성 종을 포함한다: Bi, Ba, Mg, Ni, Au, Ag, V, Co, Pt, W, Ti, Al, Si, Os, Sn, Br, Mn, Mo, Li, Sb, F, Cr, Ga, Gd, I, Rh, Cu, Fe, P, Se, S, Zn 및 Zr.
또 다른 실시양태에서, 치료제는 세포증식억제제, 알킬화제, 항대사제, 항-증식제, 튜불린 결합제, 호르몬 및 호르몬 길항제, 안트라사이클린 약물, 빈카 약물, 미토마이신, 블레오마이신, 세포독성 뉴클레오시드, 프테리딘 약물, 다이넨, 포도필로톡신, 독성 효소 및 방사선증감화 약물로 구성되는 군에서 선택된다. 더 구체적인 예를 들자면, 치료제는 메클로레타민, 트리에틸렌포스포르아미드, 시클로포스파미드, 이포스파미드, 클로람부실, 부술판, 멜팔란, 트리아지큐온, 니트로소우레아 화합물, 아드리아마이신, 카르미노마이신, 다우노루비신 (다우노마이신), 독소루비신, 이소니아지드, 인도메타신, 갈륨(III), 68갈륨(III), 아미노프테린, 메토트렉세이트, 메토프테린, 미트라마이신, 스트렙토니그린, 디클로로메토트렉세이트, 미토마이신 C, 악티노마이신-D, 포르피로마이신, 5-플루오로우라실, 플록수리딘, 프토라푸르, 6-메르캅토퓨린, 시타라빈, 시토신 아라비노시드, 포도필로톡신, 에토포시드, 에토포시드 포스페이트, 멜팔란, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 류로시딘, 빈데신, 류로신, 탁솔, 탁산, 시토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 테노포시드, 콜히친, 디히드록시 안트라신 디온, 미톡산트론, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀올, 퓨로마이신, 리신 서브유닛 A, 아브린, 디프테리아 톡신, 보툴리눔, 시앙기노신, 삭시톡신, 시가톡신, 테타누스, 테트로도톡신, 트리코테센, 베루콜로겐, 코르티로스테로이드, 프로게스틴, 에스트로겐, 항에스트로겐, 안드로겐, 아로마타제 억제제, 칼리케아미신, 에스페라미신 및 디네미신으로 구성되는 군에서 선택된다.
치료제가 호르몬 또는 호르몬 길항제인 실시양태에서, 치료제는 프레드니손, 히드록시프로게스테론, 메드로프로게스테론, 디에틸스틸베스트롤, 타목시펜, 테스토스테론 및 아미노글루테티미드로 구성되는 군에서 선택될 수 있다.
치료제가 전구약물인 실시양태에서, 치료제는 더 활성인 세포독성 유리 약물로 전환될 수 있는 포스페이트-함유 전구약물, 티오포스페이트-함유 전구약물, 술페이트 함유 전구약물, 펩티드 함유 전구약물, 락탐-함유 전구약물, 임의 치환된 페녹시아세트아미드-함유 전구약물, 임의 치환된 페닐아세트아미드-함유 전구약물, 5-플루오로시토시넴 및 5-플루오로우리딘 전구약물로 구성되는 군에서 선택될 수 있다.
치료제는 다양한 방식으로 운반체 분자에 부착된다. 일부 실시양태에서는, '990 특허에 기술되어 있는 바와 같이, 킬레이터가 연결사슬들 중 일부의 아미노 기에 접합되어, 거기에 치료제를 결합시키는 데에 사용된다. 적합한 킬레이터에는 예를 들면 테트라아자시클로도데칸테트라아세트산 (DOTA), 메르캅토아세틸글리실글리실-글리신 (MAG3), 디에틸렌트리아민 펜타아세트산 (DTPA), 디메르캅토숙신산, 디페닐에틸렌 디아민, 포르피린, 이미노디아세트산 및 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)과 같은 통상의 기술자에게 알려져 있거나 차후에 개발된 것들이 포함된다.
본원에서 기술되는 거대분자 화합물은 다양한 제약상 허용되는 담체 및 비히클들 중 어느 것을 사용하여 다양한 방식으로 투여될 수 있다. 예를 들면, 1종 이상의 검출가능한 잔기 및/또는 치료제가 거기에 부착되어 있는 운반체 분자를 포함하는 제약 제제는, 제약상 허용되는 담체와의 조합으로써, 정맥내 주사, 피하 주사, 피내 주사, 실질 도입, 흡입, 폐 세척, 좌약, 또는 경구, 설하, 두개내, 안내, 비내 또는 이내 도입을 통하여 투여된다. 본 발명의 진단 방법에는 장애의 존재 또는 부재를 검출하는 것뿐만 아니라, 예정된 표적 위치에서 첫 번째로 CD206 발현 세포를 검출하는 것, 치료를 실시하는 것 (본원에서 기술되는 치료 방법 또는 다른 치료 방법에 의함), 및 예정된 표적 위치에서 나중에 두 번째로 CD206 발현 세포를 검출하는 것과 같은 것에 의해 장애 치료의 진행을 추적하는 것도 포함된다. 충분히 유의성이 있는 경우, CD206 발현 세포의 차이는 치료의 효능 또는 효능 부재를 입증하는 데에 사용될 수 있다. 진단하는 것에는 또한 장애의 성향이 있는 대상체를 식별하는 것, 또는 미래에 장애가 증상화되거나 발생될 가능성이 있음을 표시하는 마커를 진단하는 것이 포함된다.
다양한 장애들을 진단하고 치료하는 생체내 방법 이외에도, 특히 1종 이상의 검출가능한 잔기가 운반체 분자에 부착되는 경우, 상기 운반체 분자는 생체외 진단 방법 및 진단 키트에 사용될 수 있다. 이러한 방법 및 키트는 체액 샘플에서 CD206을 발현하는 세포의 수를 정량하는 데에 사용되며, 그것은 이후 진단 목적으로 사용된다. 예를 들면, 주어진 양의 체액 중 CD206을 발현하는 세포의 측정된 수는 의학적 이상의 존재 또는 부재를 진단하는 데에 사용되거나, 또는 이전에 획득되거나 축적된 데이터에 CD206 발현 세포의 수를 비교하는 것에 의해 환자에서 이전에 확인된 의학적 이상의 상태를 판정하는 데에 사용된다.
구체적인 일 예에서, 이러한 생체외 진단 방법 및 키트는 포유동물 대상체에서 류마티스 관절염 ("RA")의 존재를 진단하는 데에, 그리고 이전에 RA에 걸린 것으로 확인된 포유동물 대상체에서 류마티스 관절염의 단계 또는 치료 진행을 평가하는 데에 사용된다. RA의 경우, 대상체로부터 수집되는 체액은 RA에 걸린 것으로 의심되거나 알려져 있는 관절로부터 추출되는 활액이다.
운반체 분자가 체액에 존재하는 CD206을 발현하는 세포에 결합하도록, 상기 체액은 1종 이상의 검출가능한 잔기가 거기에 부착되어 있는 운반체 분자와 접촉된다. 이와 같은 접촉 단계는 유체와 운반체 분자의 철저한 혼합을 가능케 하도록 캡핑되어 있을 수 있는 적합한 크기의 바이알과 같은 어떠한 적합한 용기 내에서도 수행될 수 있다. 일 실시양태에서, 유체와 운반체 분자는 원심분리 바이알 (원심분리 튜브로도 알려져 있음) 내에서 조합된다. 유체와 운반체 분자의 혼합 후, 생성 혼합물은 운반체 분자가 체액 중 세포 표면상의 CD206에 결합하는 것을 가능케 하기에 충분한 예정 시간 기간 동안 인큐베이팅된다.
일부 실시양태에서, 인큐베이션은 운반체 분자가 세포로 내재화되는 것을 억제하기 위하여 대상체의 생리학적 온도 미만인 온도에서 수행된다. 운반체 분자가 세포로 내재화되는 경우, 상기 분자가 부착되어 있던 CD206 수용체는 다시 한번 추가적인 운반체 분자의 부착에 이용가능하게 된다. 그러나, 인큐베이션 온도를 감소시키는 것에 의해, 운반체 분자의 내재화는 억제되거나 방지된다. 일부 실시양태에서, 혼합물은 약 0 ℃ 내지 약 25 ℃ 사이; 다른 실시양태에서는 약 1 ℃ 내지 약 10 ℃ 사이; 또 다른 실시양태에서는 약 1 ℃ 내지 약 4 ℃ 사이의 온도에서 인큐베이팅된다. 구체적인 일 실시양태에서, 혼합물은 약 4 ℃의 온도에서 인큐베이팅된다.
일부 실시양태에서, 상기 혼합물은 약 1분 내지 약 1일 사이의 기간 동안 인큐베이팅된다. 일부 실시양태에서, 혼합물은 약 1분 내지 약 1시간 사이의 기간 동안 인큐베이팅된다. 다른 실시양태에서, 혼합물은 약 1분 내지 약 5분 사이의 기간 동안 인큐베이팅된다.
인큐베이션 후, 체액 중 세포는 비결합 운반체 분자로부터 분리된다. 세포는 불용성이며 운반체 분자는 수용성이기 때문에, 분리는 원심분리에 의해 수행될 수 있다. 비결합 운반체 분자는 액체 상 중에 남게 되며, 그에 따라 용이하게 제거될 수 있다 (예컨대 경사분리 또는 피펫을 사용하는 것에 의함). 이후, 세포 부분 (즉 원심분리 후의 고체 상)에서의 검출가능한 잔기의 농도가 측정된다. 측정 방법은 검출가능한 잔기의 특성에 따라 달라지게 된다.
예를 들자면, 검출가능한 잔기가 형광단과 같은 염료인 경우, 세포 분획 중 검출가능한 잔기의 농도를 측정하는 것은 분광법에 의해 세포 분획 중 형광의 농도를 측정하는 것을 포함한다.
본 발명의 실시양태에는 또한 차후 진단 목적으로 사용되는 체액 샘플 중 CD206 발현 세포의 수를 정량하기 위한 진단 키트가 포함된다. 상기 키트는 일반적으로 하기를 포함한다:
(a) 1종 이상의 분광법에 의해 검출가능한 잔기 (예컨대 형광단)가 거기에 부착되어 있는 본원에서 이전에 기술된 바와 같은 운반체 분자가 들어 있는 제1 밀봉 용기;
(b) 희석제가 들어 있는 제2 밀봉 용기;
(c) 하나 이상의 원심분리 바이알; 및
(d) 분광 측정 장치에서 사용하기 위한 하나 이상의 큐벳.
구체적인 일 실시양태에서, 상기 희석제는 식염수, 멸균수 또는 완충제 용액, 예컨대 포스페이트 완충제이다.
상기 진단 키트는 예를 들면 의사의 연구실 또는 소형 실험실에서 사용하기에 적합한 형광측정기와 연계되어 사용될 수 있다. 어떠한 적합한 형광측정기도 사용될 수 있다. 형광측정기의 예에는 콴투스(Quantus)™ 플루오로미터(Fluorometer) (프로메가 코포레이션(Promega Corporation) 사) 단일-튜브 형광측정기 및 글로맥스(GloMax)®-멀티+(Multi+) 다중모드 미세플레이트 해독기가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
마찬가지로, 상기 키트는 예를 들면 의사의 연구실 또는 소형 실험실에서 사용하기에 적합한 원심분리기와 연계되어 사용될 수 있다. 일 실시양태에서, 상기 원심분리기는 미니 원심분리기이다. 또 다른 실시양태에서, 원심분리기는 미세-원심분리기이다. 원심분리기의 예에는 알칼리 사이언티픽(Alkali Scientific) 사의 마이퓨즈(MyFuge)™ 미니 원심분리기가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 실시양태에서, 원심분리기 튜브는 원심분리 필터이다. 또 다른 실시양태에서, 원심분리 튜브는 미세-원심분리 필터이다. 구체적인 일 실시양태에서, 상기 미세-원심분리 필터는 약 50 μL 내지 약 750 μL 사이의 부피를 가진다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 미세-원심분리 필터는 서모 사이언티픽(Thermo Scientific) 사의 테이퍼형인 2 mL 캡핑 수용기 튜브가 구비된 폴리프로필렌 필터 하우징을 포함한다.
다음 부문에서는, 운반체 분자가 CD206에 결합하는 것을 입증하는 실시예를 제공함은 물론, 본원에서 기술되는 운반체 분자를 사용하여 진단 및/또는 치료될 수 있는 다양한 CD206 발현 세포-관련 장애에 대해 기술한다 (데이터 및 진단/치료 방법 포함). 그러나, 하기 실시예에서 기술되는 구체적인 운반체 분자는 단순히 하기에서 논의되는 장애들을 진단하거나 치료하는 데에 사용될 수 있는 것들의 예시라는 것이 이해될 것이다. 따라서, 이전에 기술된 운반체 분자들 중 어느 것도 하기 구체적인 실시예의 것들 대신 사용될 수 있다. 또한, 본 발명이 하기에서 논의되는 구체적인 장애들의 진단 및/또는 치료로 제한되지는 않는다는 것 역시 이해될 것인 바, 이들이 단순히 구체적인 실시양태의 예시로 예정된 것이기 때문이다.
인간 대식세포에 결합하는 틸마노셉트-Cy3
인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 사용하여, 틸마노셉트가 림프구 또는 대식세포에 결합하는지 여부를 측정하였다. 림프구 및 대식세포로 구성되는 일정량의 PBMC를 5일 동안 배양함으로써 혈액 단핵구가 대식세포 (인간 단핵구-유래 대식세포 또는 "MDM")로 분화되도록 한 다음, 비표지 (저온) 틸마노셉트를 사용하여, 또는 그것 없이 예비-처리하였다. 다음에, 상기 세포를 다양한 농도 (1.25, 2.5, 5.0, 10 및 20 ㎍/mL)의 Cy3-표지된 틸마노셉트 (Cy3-틸마노셉트)와 함께 인큐베이팅하였다. 대식세포와 림프구에 대하여 각각 게이팅(gating)하는 것에 의한 유동 세포측정법에 의해, PBMC 세포 군집에 결합하는 틸마노셉트를 분석하였다. 도 1a에 나타낸 바와 같이, 결과적인 데이터는 틸마노셉트가 용량-의존성인 방식으로 대식세포 군집에 특이적으로 결합한다는 것을 보여주었다. 도 1a는 대식세포 및 림프구에 초점을 맞춘, PBMC의 형광-활성화 세포 분류 ("FACS") 분석을 도시한다. 저온 틸마노셉트 (100-배 과량)를 사용하여 예비-처리된 대식세포의 경우, 도 1b (비표지 틸마노셉트 존재하에서의 대식세포에 대한 틸마노셉트-Cy3 결합의 억제를 보여주는 FACS 분석, **P < 0.005)에 나타낸 바와 같이, Cy3-틸마노셉트의 결합이 최고 농도에서도 거의 없었다.
이러한 발견을 확증하기 위하여, MDM을 유사한 방식으로 단층 배양에서 처리하고, 형광 공초점 현미경법 실험을 수행하였다. 대식세포에 대한 Cy3-틸마노셉트의 결합이 쉽게 드러났는데, 도 1c에 나타낸 바와 같이, 저온 틸마노셉트를 사용하여 예비-처리된 대식세포에 대해서는 이와 같은 결합이 거의 없었다. 도시된 데이터는 각각 2반복으로 수행된 2회 개별 실험의 대표로써, 대식세포에 대한 틸마노셉트의 수용체-매개 결합과 결과가 일치하였다. 도 1c의 상부 및 하부 좌측 영상은 각각 형광단이 없는 틸마노셉트 부재 또는 존재하에서의 대식세포에 대한 틸마노셉트-Cy3의 결합 (상부 좌측) 및 결합 억제 (하부 좌측)를 보여주는 공초점 현미경법 대표 영상 (배율: 120×)를 도시한다. 회색 영역은 대식세포 핵을 표시하며, 백색 부분은 틸마노셉트-Cy3을 표시한다. 도 1c에서의 상부 및 하부 우측 영상은 인접 형광 영상 (각 DIC 영상의 좌측)의 개별 세포 구조를 보여주는 DIC 영상이다. "DIC"는 시차 간섭 대조(Differential Interference Contrast) (위상차 현미경법)이다.
인간 대식세포상에서의 틸마노셉트의 CD206과의 공동-국재화
MDM 단층을 Cy3-틸마노셉트와 함께 10분 동안 인큐베이팅하고, 파라포름알데히드로 고정한 후, 항-MR 일차 Ab와 함께 인큐베이팅하고, 알렉사 플루오르 488-결합 이차 Ab를 사용하여 염색하였다. 다음에, 공초점 현미경법에 의해 상기 단층을 분석하였다. 도 2는 CD206의 발현 (도 2a), 대식세포에 의한 틸마노셉트 결합 (도 2b), 및 공초점 및 위상차 영상 양자에서의 CD206과 틸마노셉트 사이의 공동-국재화 (도 2c 및 2d)을 보여주는 대표적인 공초점 영상 (배율: 160×)을 예시한다. 나타낸 결과는 3회 개별 실험의 대표이다.
대식세포는 몇 가지 질환 상태, 예컨대 카포시 육종 (KS), 류마티스 관절염 (RA) 및 결핵 (TB)과 연관되어 있는 것으로 알려져 있는데, 높은 CD206 발현을 나타내는 대식세포가 질환 병변에 국재됨으로써, CD206 바이오마커 기술을 사용하는 영상화를 위하여 표적화될 수 있다.
카포시 육종의 진단 및 치료
염증은 종양 발현을 포함한 수많은 질환 상태에 대한 필연적인 반응이다. 현재, 이와 같은 염증 과정의 주 구성요소는 종양 개시, 촉진 및 진행에 영향을 주는 대식세포에 의해 유도되는 것으로 알려져 있다. 암 조직의 경우, 종양 침습, 암 세포 증식 및 전이에서 중요한 역할을 하는 종양-연관 대식세포 (TAM)가 확인되어 있다. 이러한 M2-유형 대식세포는 통상적으로 높은 수준의 CD206을 발현한다. 대식세포-의존성 진행의 모델 종양은 카포시 육종 (KS)으로써, KS가 TAM에 의해 유도되기 때문이다. KS 전이가 대식세포 마커를 공동-발현하는 종양 세포와 연관되어 있다는 강력한 증거도 존재한다. 따라서, 대식세포는 잠재적으로 KS 발병기전에서 활용하기 위한 중요한 표적이다.
HIV-연관 KS는 헤르페스 바이러스 (HHV8/KSHV) 감염과 연관되어 있는 공격적이고 다-초점인 신생물이다. KS는 피부 및 내장 조직과 연관되는데, 후자의 질환은 기관 병변과 연관되어 있다. KS는 염증이 종양 발생에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 보이는 암의 형태이다. 다양한 대식세포 마커들을 공동-발현하는 KS 종양 세포는 KS 및 AIDS의 치료를 위한 현행 항-바이러스 접근법들에 대하여 내성이 되고 있다. 본 출원인은 종양 실질에서 상기한 틸마노셉트 및 관련 운반체 분자가 CD206에 결합하기 때문에, 이와 같은 CD206 발현이 TAM 및 전이성 종양 세포에 대하여 지시되는 새로운 항종양제의 개발, 및 그의 전이 패턴, 진단 및 치료에 대한 반응을 추적하는 데에 중요한 경로가 될 수 있다는 것을 발견하였다.
KS 대식세포는 표준 항-레트로바이러스 치료법에 대하여 내성인 감염된 세포의 중요한 HIV 저장소일 수 있다. 진행성 질환에 걸린 AIDS 환자 조직 내의 모든 형태의 HIV가 대식세포 반응성(macrophage tropic)이기는 하지만, 종양 연관 형태는 KS 발병기전에 직접적으로 기여할 수 있다.
리포솜 독소루비신 (독실(Doxil)® (독소루비신 HCl 리포솜 주사), 얀센 프라덕츠(Janssen Products), LP 사)이 항레트로바이러스 치료법 (ART)에 내성인 KS를 치료하는 데에 가장 효과적이기는 하지만, 그것은 일반적으로는 이용가능하지 않다. 일반적으로 치료 반응을 모니터링하는 데에 특히 중요한 카포시 육종의 면역 구성을 더 잘 이해하게 된다면, 치료에 유익할 것이다.
역사적으로, KS에 걸린 환자에서 KS 특이적 병변 또는 전이 초점을 식별할 수 있는 영상화 플랫폼은 존재한 바 없다. 이는 임상 케어를 전달하는데에 문제가 되어 왔는데, 피부 병변의 추적 이외에는 의사가 KS에 걸린 환자를 적절하게 단계지정할 수 없기 때문이다. KS는 림프절 및 기관과 연관되는 것으로 알려져 있지만, 오늘날까지 어떠한 접근법도 피부를 넘어선 종양 병변을 확인할 수 없었다.
일 실시양태에서는, CD206에 결합하는 수용체 기질을 가지는 상기한 운반체 분자가 KS 연관 림프절 및 기타 내장 질환 부위의 효과적인 영상화를 위한 방법을 제공하는 데에 사용된다. 또 다른 실시양태에서는, 본 발명의 조성물이 점증하고 있는 수의 전 세계 KS 환자에서 비효과적인 것으로 입증되어 있는 현행 항-레트로바이러스 치료법 단독의 사용을 능가하여 조기 종양 특이적 치료를 가능케 하는 종양 부하(tumor burden)의 규정 방법을 제공한다. 또 다른 실시양태에서는, 본 발명의 조성물이 비제한적으로 섬광조영술, SPECT, SPECT/CT, 감마 브로빙(probing) (생체내 또는 생체외), 외부 (생체외) 또는 내부 (생체내) 형광을 포함한 몇 가지 외부 영상화 방법들 중 하나에 의한 종양 전이 패턴의 추적 방법을 제공한다. 또 다른 실시양태에서는, 본 발명의 조성물이 직전 방법에서 표시된 바와 같은, 또는 실험실 환경에서 사용되는 생검 조직 및 동일 진단제를 시험관 내에서 이용하는 것과 같은 종양 치료법에 대한 반응의 추적 방법을 제공한다.
상기에 대한 훌륭한 정밀 진단 접근법은 핵심 수용체인 CD206을 통하여 매개되는 대식세포-표적화 영상화이다. CD206은, 틸마노셉트 분자상 만노스 잔기의 상호작용에 의해 CD206에 결합하며 대식세포에 흡수된 후 거기에서 안정한 비-분해성 소포 내에 존속하는 틸마노셉트를 사용한 정밀 영상화에 표적으로서 성공적으로 활용되었다. Cy3 또는 Tc99m과 같은 검출가능한 잔기는 표적화된 영상화를 가능케 한다. 이와 같은 정밀 표적화 기작은 KS 및 기타 대식세포-매개 질환 및 장애에서와 같은 대식세포-유도 질환 과정의 핵심적인 기능들을 영상화하기 위한 신규한 경로를 제공한다. CD206의 존재는 본 발명의 조성물이 KS에 걸린 환자에서 종양 세포 및 TAM 모두를 식별할 수 있는 종양 특이적 영상화제로서 사용되는 것을 가능케 한다.
하기에 개괄한 연구에서는, AIDS 환자로부터 유래하는 카포시 육종 (KS)에서 CD206-표적화 틸마노셉트 플랫폼 영상화 접근법을 평가하였다. 이러한 연구에서는, 대부분의 TAM 및 KS 세포 양자가 틸마노셉트와 같은 본원에서 기술되는 운반체 분자를 사용하여 특이적으로 표적화될 수 있는 대식세포 마커 CD206을 발현한다는 것을 입증한다. 이는 예를 들면 검출가능한 잔기가 진단 목적으로 KS 병변에 표적화되는 것을 가능케 한다. 이는 또한 본원에서 기술되는 운반체 분자를 사용한 치료 조성물 및 방법을 제공한다. CD206이 KS 종양 세포 및 TAM 모두에 존재할 것인지를 확인하기 위하여, 본 출원인은 KS의 피부 및 내장 형태 모두의 대형 수집군을 시험하였다. 본 출원인은 HHV8/KSHV 감염 KS 종양 세포에서의 대식세포 항원의 빈도 및 KS 병변 세포 하위군집 내에서의 CD206+ 틸마노셉트 결합 세포의 빈도를 시험하였다.
96 %를 초과하는 KS 병변 세포가 인간 만노스 수용체 (MR, CD206)를 발현한다.
KS 병변 세포의 면역표현형 분석은 96 %를 초과하는 종양 연관 대식세포 (TAM) 및 KS 세포 양자가 KS 병변을 규정하거나 KS의 표적화된 치료를 제공하기 위하여 본원에서 기술되는 운반체 분자에 의해 특이적으로 표적화될 수 있는 CD206을 발현한다는 것을 확인해 주었다. AIDS 및 암 시편 공급처(AIDS and Cancer Specimen Resource) (ACSR)로부터, 66개 사례의 AIDS KS 및 대조물이 들어 있는 조직 현미경 어레이(tissue microscopic array) (TMA)을 입수하였다. MO 항원은 IHC 연구에 의해 식별하였으며, 결과는 KSHV LANA+ 세포 (KS 종양 특이적 마커)의 비율에 따라 표준화하였다. TMA를 HHV8/KSHV 잠재성 항원 (LANA), 그리고 대식세포 마커인 MAC387 (M1), CD163 (M2), CD68 (범 대식세포(pan macrophage)) 및 CD206 (대식세포 만노스 수용체, M2)의 존재에 대하여 염색함으로써, KS 사례에서의 이들 항원의 분포를 시험하였다. TMA에 포함된 것은 피부 및 내장 병변이었다. 66개 KS 사례의 면역-조직화학 분석 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
<표 1>
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Mac387, CD163 및 CD68은 대식세포 특이적 마커들임
표 1은 TAM 및 HHV8/KSHV LANA+ 종양 세포상에 대식세포 항원을 발현하는 KS 사례의 비율을 요약하고 있다. 면역-조직화학 분석은 대식세포 항원이 KS 종양 연관 세포 내에 고도로 연관되어 있다는 것을 보여준다. KS 병변 내에서의 CD68 대식세포 항원 염색의 빈도는 KS가 집중적인 TAM 침윤을 가지는 종양이라는 것과 고도로 부합하였다. 또한, 제한된 수의 사례에서 보고되었던 바와 같이, 이와 같은 집중적인 분석은 KS 방추 세포 역시 CD206을 포함한 대식세포 항원들을 공동 발현한다는 것을 확인해 주었다.
KS 조직 중 대부분의 TAM은 M2 특이적 항-CD163 항체를 사용하여 식별된 반면, M1 및 MAC387 항체는 더 작은 세포 하위세트를 식별하였다. CD68 항체 역시 90 %를 초과하는 종양에서 많은 수의 TAM을 식별하였다. KS 종양 방추체 세포는 일반적으로 대식세포 항원을 발현하였으나; KS 종양 세포 (LANA+) 및 TAM 모두에 대하여 가장 보편적인 항원은 CD206 분자였다. 종양 조직 내에서의 LANA의 농도와 관련된 MO 항원들 및 CD206의 발현은 모든 KS 조직 형태들 (플라크, 구강, 내장)에 걸쳐 유사하였다. 아프리카로부터의 KS 조직의 파일럿 연구는 유사한 결과를 나타내었다. 대부분의 LANA+ KS 종양 세포는 CD206을 공동-발현하였다. CD68+ 조직 대식세포는 또한 아프리카인 KS 조직에서 CD206 항원과 연관되어 있다. 결과는 TAM 및 KS 종양 세포 모두가 CD206 대식세포 만노스 수용체 (문헌 [Uccini et al. AJP March 1997, 150: 929 938])를 발현한다는 것을 확인해 주었다.
도 3은 핵 (청색), KS 종양 세포 (적색) 및 CD206 (녹색)의 마커들을 보여주는 KS 종양 세포의 현미경사진을 도시하는 것으로써, 본원에서 기술되는 운반체 분자에 결합하는 CD206 인간 만노스 수용체의 범-세포적 발현을 입증하고 있다.
CD206을 발현하는 KS 종양 세포 및 대식세포는 틸마노셉트-Cy3에 결합하여 그것을 내재화한다.
도 4에 나타낸 바와 같이, KS 종양 세포 및 대식세포 양자는 CD206을 발현하며, 표면상에서 틸마노셉트-Cy3 (적색)에 결합하고 (도 4a), 이후 세포질 소포로 틸마노셉트-Cy3을 내재화한다 (도 4b). 내재화는 안정한 틸마노셉트-Cy3의 축적 및 잠재적인 특이적 KS 병변 영상화를 제공할 것으로 예상된다. 따라서, 본원에서 기술되는 틸마노셉트 및 다른 운반체들은 KS에 걸린 환자에서 예를 들면 치료에 대한 종양 특이적 반응을 단계지정하고 정량 영상화하는 데에 유용한 진단 및 치료 조성물이다. 나아가, 다른 종류의 종양들이 유사한 하이브리드-형 세포를 함유할 수 있어서, 틸마노셉트-기재 작용제를 사용하여 영상화되고 대식세포-표적화된 치료법을 사용하여 임상 처리될 수 있다.
면역형광 염색 및 공초점 현미경법
면역형광 염색 및 공초점 현미경법 연구로써 조직 대식세포 및 LANA 발현 KS 종양 세포 양자에서 CD206의 공동-발현 속도를 측정하였다. 상기 면역형광 염색 및 공초점 현미경법 연구는 AIDS 및 암 시편 공급처 (ACSR)로부터 입수한 66개 사례의 AIDS KS 및 대조물이 들어 있는 조직 현미경 어레이 (TMA)에서 수행되었다. 결과는 도 5에 나타내었는데, LANA 발현 종양 세포 및 조직 대식세포 양자에서의 대식세포 만노스 수용체 CD206의 공동-국재화를 보여주는 공초점 현미경법 대표 영상을 도시하고 있다: A, DAPI (청색); B, CD206 (녹색); C, LANA (적색); D, CD68 (황색); E, 모두 병합 (63×). HHV8+ KS 종양 세포에 의한 Cy3-틸마노셉트 흡수도 조사하였는데, 도 6은 Cy3 틸마노셉트를 사용한 KS 생검 조직 배양물의 예시적인 공초점 영상을 도시한다. HHV8+ KS 종양 세포 생검물의 공초점 영상: 25× (CD68, 황색; Cy3-틸마노셉트, 적색; HHV8, 녹색; DAPI, 청색).
CD206-발현 대식세포로의 Cy3-틸마노셉트 흡수도 조사하였다. 3-일 CD206+ 대식세포 배양물을 Cy3-틸마노셉트 (100 ㎍/mL)와 함께 37 ℃에서 4, 24 및 48시간 동안 인큐베이팅하였다. Cy3 형광의 바탕 농도는 동일 시간 기간 동안 실온에서 접합물(conjugate)에 노출된 배양물에서 측정하였다. CD206+ 대식세포로의 Cy3-틸마노셉트 흡수를 표시하는 모든 시점에 Cy3 및 CD206의 유동 세포측정 평가를 수행하였다. 도 7은 Cy3-틸마노셉트와 함께 인큐베이팅된 3일 CD206+ 대식세포 배양물에서의 Cy3 및 CD206의 유동 세포측정 평가를 나타낸다.
상기에 비추어, 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에서 기술되는 운반체 분자는 KS (및 유사한 유형의 암 및 종양)를 진단 및/또는 치료하는 데에 사용된다. 진단 목적으로는, 99mTc 또는 68Ga과 같은 검출가능한 잔기가 운반체 분자 (예컨대 DTPA 또는 DOTA 킬레이터)에 부착된 후, 방사성표지된 조성물이 종양 또는 의심 병변에 근접한 (즉 인접한) 피하 또는 피내 주사, 종양 또는 병변에의 직접 종양-내/병변-내 주사, 또는 정맥내 주사와 같은 것에 의해 대상체에게 투여된다. 본원에서 기술되거나, 통상의 기술자에게 알려져 있거나, 또는 차후에 개발된 다른 검출가능한 잔기, 예컨대 다양한 형광단들 중 어느 것이 KS를 진단하는 데에 사용하기 위하여 운반체 분자에 부착될 수도 있다는 것은 이해될 것이다. 환자에의 투여 후에는, 섬광조영술 (예컨대 감마 카메라 사용), 단일-광자 방출 컴퓨터화 단층촬영 (SPECT), 양전자 방출 단층촬영 (PET) 또는 광학 영상화 (예컨대 검출가능한 잔기가 시안이민과 같은 형광 염료인 경우)와 같은 것에 의하여, 종양 또는 병변 부위 (또는 의심 종양 또는 병변 부위)가 영상화된다. 그러나, 상기에서 언급된 것들이 아닌 다른 진단용 잔기 및, KS 종양 또는 병변에서 표지된 운반체 분자의 존재를 검출하기 위한 다양한 다른 영상화 또는 진단 방법들이 사용될 수도 있다는 것은 이해될 것이다.
KS 진단 영상화를 위한 구체적인 일 실시양태에서, 운반체 분자는 덱스트란 3-[(2-아미노에틸)티오]프로필 17-카르복시-10,13,16-트리스(카르복시메틸)-8-옥소-4-티아-7,10,13,16-테트라아자헵타데크-1-일 3-[[2-[[1-이미노-2-(D-만노피라노실티오)에틸]아미노]에틸]티오]프로필 에테르 복합체인 틸마노셉트이다. 이와 같은 구체적인 실시양태에서, 검출가능한 잔기는 99mTc 또는 68Ga로써, 상기 검출가능한 잔기는 통상의 기술자에게 알려져 있는 바와 같이 운반체 분자를 99mTc 생성기 또는 갈륨-68 생성기로부터의 용출물과 혼합하는 것에 의해 사용 직전에 DTPA 킬레이터에 부착된다. 다른 실시양태에서, 검출가능한 잔기는 Cy-3이며, 통상의 기술자에게 알려져 있는 바와 같이 틸마노셉트의 연결사슬에 부착된다. 99mTc-틸마노셉트 또는 68Ga-틸마노셉트를 사용한 KS 진단 영상화의 경우, 일부 실시양태에서, 방사성표지된 운반체 분자는 국소적으로 (예컨대 피하로) 대상체에게 투여되었을 때 약 0.3 내지 약 5.0 밀리퀴리, 또는 약 0.5 내지 약 2.0 밀리퀴리 사이, 또는 약 0.5 또는 약 1 밀리퀴리의 선량을 제공하기에 충분한 방사성동위원소를 가진다. 99mTc-틸마노셉트 또는 68Ga-틸마노셉트를 사용한 KS 진단 영상화의 경우와 같은 다른 실시양태에서, 방사성표지된 운반체 분자는 전신성으로 (예컨대 정맥내로) 대상체에게 투여되었을 때 약 2 mCi 내지 약 30 mCi, 약 5 mCi 내지 약 30 mCi, 약 10 mCi 내지 약 25 mCi 사이의 선량을 제공하기에 충분한 방사성동위원소를 가진다. 주사에 의해 대상체에게 투여되는 경우, 일부 실시양태에서, 방사성표지된 운반체는 1종 이상의 부형제, 희석제 등 (예컨대 멸균 식염수)을 함유하는 제약상 허용되는 담체와 조합된다. 1종 이상의 검출가능한 잔기가 거기에 부착되어 있는 틸마노셉트를 사용한 KS 진단 영상화의 경우, 약 50 내지 약 500 마이크로그램 사이의 틸마노셉트가 투여된다.
KS를 치료하는 데에 있어서의 본원에서 기술되는 운반체 분자의 치료 용도의 경우, 적합한 치료제가 운반체에 부착되며, 생성되는 조성물은 1종 이상의 부형제, 희석제 등을 함유하는 제약상 허용되는 담체와 조합된다. 진단 영상화에서와 마찬가지로, 치료제가 부착되어 있는 운반체 분자가 주사와 같은 것에 의해, 또는 심지어는 종양 또는 병변에 국소적으로 환자에게 투여된다. KS를 치료하기 위한 적합한 치료제에는 독소루비신, 다우노루비신, 파클리탁셀 (탁솔(Taxol)®), 젬시타빈 (젬자르(Gemzar)®), 비노렐빈 (나벨빈(Navelbine)®), 블레오마이신, 빈블라스틴 (벨반(Velban)®), 빈크리스틴 (온코빈(Oncovin)®) 및 엑토포시드 (VP-16)와 같은 기능성 화학치료제들이 포함된다. 구체적인 일 실시양태에서, 치료 조성물은 독소루비신-틸마노셉트를 포함하며, 그것은 국소적으로 (예컨대 10 ㎍ 용량으로) 또는 정맥내로 (예컨대 5 mg 용량으로) 투여된다.
KS 영상화 실시예 1
림포시크® 주사 키트라는 명칭하에 나비데아 바이오파마슈티칼스 사에 의해 시판되고 있는 틸마노셉트 동결건조 분말을 입수한다. 상기 틸마노셉트 분말은 약 7 nm의 평균 직경을 가지며, 0.250 mg의 틸마노셉트, 20 mg의 트레할로스 2수화물, 0.5 mg의 글리신, 0.5 mg의 나트륨 아스코르베이트 및 0.075 mg의 제일주석 클로라이드 2수화물의 혼합물로서 0.5 mL 바이알에 들어 있다. 이후 테크네튬-99m 생성기로부터 용출된 나트륨 99mTc-퍼테크네테이트를 사용하여 Tc 99m으로 틸마노셉트 분말을 방사성표지한다. 멸균 주사기를 사용하여, 약 0.35 mL 중 대략 92.5 MBq (2.5 mCi)의 나트륨 99mTc-퍼테크네테이트를 무균으로 바이알에 첨가한다. 바이알을 약하게 진탕하고, 실온에서 10-15분 이상 동안 방사성표지 반응을 진행시킨다. 다음에, 표준 식염수를 바이알에 첨가함으로써, 내용물이 2.5 cc가 되도록 한다. 임의적으로, 본원에 참조로써 포함되는 2010년 8월 5일자 공개 U.S. 특허 공개 제2010/0196272 A1호에 기술되어 있는 바와 같이, 완충제를 첨가한다.
상기와 같이 제조되는 경우, 단일 환자 용량은 틸마노셉트 50 mcg 및 테크네튬 99m 0.5 mCi로써, 총 0.5 cc이다. 방사성표지된 틸마노셉트는 방사성표지 6시간 이내에 피하 또는 피내 주사에 의해 투여된다. 대안적인 실시양태에서는, 틸마노셉트 100 mcg 및 테크네튬 1.0 mCi로써 총 1 cc가 방사성표지 6시간 이내에 정맥내로 주사된다.
주사 30 내지 180분 이내에, 단일 광자 방출 컴퓨터화 단층촬영 (SPECT)을 사용하여 환자를 영상화한다. 피부 병변(들) 내에 국재화되는 방사능의 발견은 카포시 육종의 존재에 부합하는 만노스 결합 수용체 및/또는 대식세포 활성의 추정 증거가 되며, 그와 같은 활성의 부재는 카포시 육종을 본질적으로 배제하게 된다.
KS 영상화 실시예 2
하기는 수지상 세포 및 대식세포 표면상에 존재하는 만노스 결합 수용체 (CD206)에 결합하는 방사성약제인 림포시크® (테크네튬 99mTc-틸마노셉트 주사제로도 알려져 있음)을 사용한 SPECT 및 SPECT/CT 영상화에 의한 원발성 피부 카포시 육종 (KS) 평가의 또 다른 실시예를 예시한다. 결과는 원발성 피부 카포시 육종에 걸린 환자에서, 림포시크가 단일 광자 방출 컴퓨터화 단층촬영 (SPECT) 및 SPECT 컴퓨터화 단층촬영 (SPECT/CT)을 사용한 카포시 육종 병변(들)의 검출을 돕는다는 것을 나타낸다.
18세-연령의 남성 환자에게 피하 주사에 의해 2.0 mCi 99mTc로 방사성표지된 틸마노셉트 50 ㎍의 단일 용량을 투여한다. 99mTc-밀마노셉트 주사의 총 부피는 0.3 내지 0.5 mL이다.
환자는 펀치 생검(punch biopsy)을 통하여 KS (CD206-발현 피부 KS) 진단이 확인된 마커 병변 (직경 ≥ 1 cm)을 가진다. 마커 KS 병변의 위치는 사지상의 어깨로부터 중수골 영역까지 또는 서혜부로부터 중족골 영역까지이다.
용량은 5/8 인치 25- 또는 27-게이지의 고정된 바늘이 구비된 주사기, 또는 피하 주사용으로 허용가능한 다른 주사기/바늘 조합에 의해 투여된다. 주사는 마커 병변으로부터 1.5 ± 0.25 cm 원위, 마커 병변에 대해 4-8 cm 원위, 또는 마커 병변에 대해 4-8 cm 근위에서 이루어진다.
환자에게 주사-직후에 30분의 기간 동안 국소 동적 SPECT 스캔을 적용한다. 최초 스캔 후, 환자에게 주사 후 1시간에는 전신 SPECT/CT 영상화를, 4-6 시간에는 전신 SPECT 영상화를 적용한다. 환자는 SPECT 스캔 4-6시간 후에 영상화 센터를 떠나도록 허용된다.
동적 SPECT/CT (제한된 CT 노출; GE 인피니아 호크아이(Infinia Hawkeye) 4) 영상화는 주사 직후에 30분 동안 (~3분/회전) 이루어진다. 각 이중 헤드 스핀(dual head spin)을 32개 (5.625 °) 각도로 분절화한다. 전방, 45 °전방 경사, 및 측방 위치에서 SPECT 영상을 포착하는데, 각 포착은 기간이 3-5분으로써 총 30-45분 동안이다.
SPECT/CT 시스템에서의 포착은 순차적인 방식으로 수행된다. 저-선량 CT 부품이 구비된 장치의 경우, 데이터는 통상적으로 X선 검출기를 환자 주위로 220 ° 회전시키는 것에 의해 포착되며, X선 튜브는 140 kV 및 2.5 mA로 작동된다. 수득되는 CT 영상은 2.5 mm의 평면상 공간 해상도 및 10 mm의 축 방향 해상도를 가진다. 스캔 시간은 CT의 경우 총 30-45분의 기간 동안 슬라이스 당 대략 16초이다. 진단용 CT 부품을 사용하는 SPECT/CT 시스템은 더 높은 공간 해상도 및 더 빠른 스캐닝 시간 (전체 시야에 대하여 대략 30초)을 특징으로 하나, 더 높은 방사선 선량과 연관된다. CT 포착 시간 종료시 감쇠 맵(attenuation map)이 생성된다.
결핵의 진단 및 치료
결핵은 세균인 마이코박테리움 투베르쿨로시스(mycobacterium tuberculosis)에 의해 야기되는 호흡기 감염이다. TB 감염에 반응하여, 환자의 면역 시스템은 육아종을 형성하는데, 이는 TB 세균이 눈에 띄는 TB의 임상적 증상 없이 오래 시간 기간 동안 육아종 내에서 유지되는 것을 가능케 한다. 치료로써 환자가 활성 TB 감염을 발생시킬 위험성을 감소시킬 수는 있지만, 육아종은 진단제 및 치료제에 대한 장벽으로 작용한다. 대식세포는 육아종 형성 및 유지 과정의 일부이다. 이때문에, 본 출원인은 본원에서 기술되는 운반체 분자가 TB 육아종과 연관되어 있는 대식세포 표면상의 CD206을 표적화하는 데에 사용될 수 있을 것으로 추론하였다.
TB에 의해 감염된 대식세포에 대한 틸마노셉트의 결합
TB에 의해 감염된 대식세포에 결합하고 TB 세균이 위치하는 대식세포 내부로 진단제 및/또는 치료제를 전달하는 본원에서 기술되는 운반체 분자의 능력을 입증하기 위하여, TB 육아종의 구성요소들로 이루어진 단층 배양물 중 인간 단핵구-유래 대식세포를 대식세포에 의재 내재화된 GFP-발현 엠. 투베르쿨로시스로 감염시켰다 (GFP = 녹색 형광 단백질). 다음에, 감염된 세포를 시아닌 (Cy3) 염료로 표지된 틸마노셉트에 노출시키고, 공초점 현미경법에 의해 분석하였다. 도 5는 TB-감염된 대식세포의 공초점 현미경법을 도시한다. 적색은 Cy3-틸마노셉트를 표시하며, 녹색은 GFP 엠. 투베르쿨로시스를 표시하고, 황색은 Cy3-틸마노셉트와 GFP 엠. 투베르쿨로시스의 공동-국재화를 표시한다. 따라서, 도 8은 Cy3-틸마노셉트가 대식세포에 결합하며 그에 의해 내재화된다는 것을 입증하고 있다.
상기에 비추어, 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에서 기술되는 운반체 분자는 결핵을 진단 및/또는 치료하는 데에 사용된다. 진단 목적으로는, 99mTc 또는 68Ga과 같은 검출가능한 잔기가 운반체 분자 (예컨대 DTPA 또는 DOTA 킬레이터)에 부착된 후, 방사성표지된 조성물이 흡입, 정맥내 주사 또는 폐 세척과 같은 것에 의해 대상체에게 투여된다. 본원에서 기술되거나, 통상의 기술자에게 알려져 있거나, 또는 차후에 개발된 다른 검출가능한 잔기가 결핵을 진단하는 데에 사용하기 위하여 운반체 분자에 부착될 수도 있다는 것은 이해될 것이다. 환자에의 투여 후에는, 섬광조영술 (예컨대 감마 카메라 사용), 단일-광자 방출 컴퓨터화 단층촬영 (SPECT) 또는 양전자 방출 단층촬영 (PET)과 같은 것에 의하여, 대상체의 폐가 영상화된다. 그러나, 상기에서 언급된 것들이 아닌 다른 진단용 잔기 및, 대상체의 폐 조직에서 표지된 운반체 분자의 존재를 검출하기 위한 다양한 다른 영상화 또는 진단 방법들이 사용될 수도 있다는 것은 이해될 것이다.
결핵 진단 영상화를 위한 구체적인 일 실시양태에서, 운반체 분자는 덱스트란 3-[(2-아미노에틸)티오]프로필 17-카르복시-10,13,16-트리스(카르복시메틸)-8-옥소-4-티아-7,10,13,16-테트라아자헵타데크-1-일 3-[[2-[[1-이미노-2-(D-만노피라노실티오)에틸]아미노]에틸]티오]프로필 에테르 복합체인 틸마노셉트이다. 이와 같은 구체적인 실시양태에서, 검출가능한 잔기는 99mTc 또는 68Ga로써, 상기 검출가능한 잔기는 통상의 기술자에게 알려져 있는 바와 같이 운반체 분자를 99mTc 생성기 또는 갈륨-68 생성기로부터의 용출물과 혼합하는 것에 의해 사용 직전에 DTPA 킬레이터에 부착된다. 99mTc-틸마노셉트 또는 68Ga-틸마노셉트를 사용한 결핵 진단 영상화의 경우, 일부 실시양태에서, 방사성표지된 운반체 분자는 대상체에게 투여되었을 때 약 0.3 내지 약 5.0 밀리퀴리, 또는 약 0.5 내지 약 2.0 밀리퀴리 사이, 또는 약 1 밀리퀴리의 선량을 제공하기에 충분한 방사성동위원소를 가진다.
흡입에 의해 대상체에게 투여되는 경우, 일부 실시양태에서, 방사성표지된 운반체는 제약상 허용되는 비히클과 조합된다. 구체적인 예를 들자면, 방사성표지된 운반체는 흡입 장치 - 예컨대 고정 용량 흡입기, 흡입기 중 건조 분말, 계량 용량 흡입기 또는 분무기 -에 의해 인간 대상체의 폐로 전달된다. 일 실시양태에서, 방사성표지된 운반체는 제약상 허용되는 불활성 액체 추진제 예컨대 클로로플루오로탄소, 플루오로탄소 또는 히드로플루로알칸을 포함하는 비히클 중 방사성표지된 운반체의 현탁액이 들어 있는 계량 용량 흡입기를 사용하여 투여된다. 더 구체적인 예를 들자면, 상기 계량 용량 흡입기는 모금 당 약 10 내지 약 5000 마이크로그램, 또는 약 10 내지 약 500 마이크로그램의 방사성표지된 운반체를 전달하도록 구성된다. 또 다른 실시양태에서, 방사성표지된 운반체는 멸균수 또는 식염수를 포함하는 제약상 허용되는 비히클 중에 현탁된 후, 분무에 의해 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 방사성표지된 운반체는 분말로 건조된 다음, 파우치 또는 다른 용기로부터 투여된다.
TB를 치료하는 데에 있어서의 본원에서 기술되는 운반체 분자의 치료 용도의 경우, 적합한 치료제가 운반체에 부착되며, 생성되는 조성물은 1종 이상의 부형제, 희석제 등을 함유하는 제약상 허용되는 비히클과 조합된다. 진단 영상화에서와 마찬가지로, 치료제가 부착되어 있는 운반체 분자가 TB (잠복성 또는 활성 감염)를 치료하기 위한 흡입, 정맥내 주사 또는 폐 세척과 같은 것에 의해 환자에게 투여된다.
흡입에 의해 대상체에게 투여되는 경우, 일부 실시양태에서, 치료제+운반체는 제약상 허용되는 비히클과 조합된다. 구체적인 예를 들자면, 치료제+운반체는 흡입 장치 - 예컨대 고정 용량 흡입기, 흡입기 중 건조 분말, 계량 용량 흡입기 또는 분무기 -에 의해 인간 대상체의 폐로 전달된다. 일 실시양태에서, 치료제+운반체는 제약상 허용되는 불활성 액체 추진제 예컨대 클로로플루오로탄소, 플루오로탄소 또는 히드로플루로알칸을 포함하는 비히클 중 치료제+운반체의 현탁액이 들어 있는 계량 용량 흡입기를 사용하여 투여된다. 더 구체적인 예를 들자면, 상기 계량 용량 흡입기는 모금 당 약 10 내지 약 5000 마이크로그램, 또는 약 10 내지 약 500 마이크로그램의 치료제+운반체를 전달하도록 구성된다. 또 다른 실시양태에서, 치료제+운반체는 멸균수 또는 식염수를 포함하는 제약상 허용되는 비히클 중에 현탁된 후, 분무에 의해 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 치료제+운반체는 분말로 건조된 다음, 파우치 또는 다른 용기로부터 투여된다. 그리고 또 다른 실시양태에서, 치료제+운반체는 제약상 허용되는 비히클 중에 현탁된 후, 치료제+운반체 분자 10 mg 이하의 투약량으로 정맥내 투여된다.
TB를 치료하기 위하여 운반체 분자에 부착되는 적합한 치료제에는 인도메타신, 이소니아지드 및/또는 Ga (임의적으로 진단 및 치료 조성물 모두로 조성물이 사용되도록 68Ga로서)이 포함된다. 또 다른 실시양태에서는, 결핵을 진단 및 치료하는 것 모두를 위한 조성물이 제공되는데, 이 경우에서는 68Ga 및 Ga (즉 비-방사성 Ga) 모두가 운반체 분자에 접합된다. 다른 실시양태에서는, 인도메타신, 이소니아지드 및 Ga (임의적으로 68Ga로서) 중 2종 이상이 운반체 분자에 접합된다. 인도메타신, 이소니아지드 및 Ga는 공지의 TB 치료제이지만, 본원에서 기술되는 운반체 분자에 이러한 작용제 1종 이상을 부착시키는 것에 의하면, 이들은 TB와 연관되어 있는 육아종의 대식세포에 더 잘 진입할 수 있으며, 거기에서 치료제가 해당 대식세포 내 TB 세균을 표적으로 하게 된다.
하기에서 제공되는 것은 TB를 진단하거나 치료하는 데에 효과적인 조성물 및 방법의 실시예이다.
결핵 영상화 실시예
림포시크® 주사 키트라는 명칭하에 나비데아 바이오파마슈티칼스 사에 의해 시판되고 있는 틸마노셉트 동결건조 분말을 입수한다. 상기 틸마노셉트 분말은 0.250 mg의 틸마노셉트, 20 mg의 트레할로스 2수화물, 0.5 mg의 글리신, 0.5 mg의 나트륨 아스코르베이트 및 0.075 mg의 제일주석 클로라이드 2수화물의 혼합물로서 0.5 mL 바이알에 들어 있다. 이후 테크네튬-99m 생성기로부터 용출된 나트륨 99mTc-퍼테크네테이트를 사용하여 Tc 99m으로 틸마노셉트 분말을 방사성표지한다. 멸균 주사기를 사용하여, 약 0.35 mL 중 대략 92.5 MBq (2.5 mCi)의 나트륨 99mTc-퍼테크네테이트를 무균으로 바이알에 첨가한다. 바이알을 약하게 진탕하고, 실온에서 10-15분 이상 동안 방사성표지 반응을 진행시킨다. 다음에, 투여 직전에 표준 식염수를 바이알에 첨가함으로써, 내용물이 5 cc가 되도록 한다.
방사성표지된 조성물의 단일 환자 투여분은 투여량이 100 mcg의 99mTc-틸마노셉트 1 mCi, 총 2 cc가 되도록 제조된다. 방사성표지된 틸마노셉트는 방사성표지 6시간 이내에 흡입에 의해 투여된다. 조성물이 에어로졸 기계에 적재된 다음, 환자가 조성물을 흡입한다. 흡입 후 약 30 내지 180분 이내에, 단일 광자 방출 컴퓨터화 단층촬영 (SPECT)을 사용하여 환자의 폐를 영상화한다. 흉강의 폐문 및 종격 영역에 국재화되는 방사능의 발견은 결핵의 특징인 육아종 형성의 추정 증거가 될 것이다.
결핵 치료 실시예
림포시크® 주사 키트라는 명칭하에 나비데아 바이오파마슈티칼스 사에 의해 시판되고 있는 틸마노셉트 동결건조 분말을 입수한다. 상기 틸마노셉트 분말은 약 7 nm의 평균 직경을 가지며, 0.250 mg의 틸마노셉트, 20 mg의 트레할로스 2수화물, 0.5 mg의 글리신, 0.5 mg의 나트륨 아스코르베이트 및 0.075 mg의 제일주석 클로라이드 2수화물의 혼합물로서 0.5 mL 바이알에 들어 있다. 다음에, 틸마노셉트 분말을 이소니아지드 분자에 결합시킨다. 다음에, 표준 식염수를 바이알에 첨가함으로써, 내용물이 2.5 cc가 되도록 한다. 임의적으로, 본원에 참조로써 포함되는 2010년 8월 5일자 공개 U.S. 특허 공개 제2010/0196272 A1호에 기술되어 있는 바와 같이, 완충제를 첨가한다.
상기한 바와 같이 제조되는 조성물의 단일 환자 투여량은 환자의 연령 및 체중에 따라 틸마노셉트 약 100 내지 약 500 mcg로써, 총 1 cc이다. 상기 이소니아지드-틸마노셉트 조성물은 정맥내 주사에 의해 환자에게 투여된다. 이와 같은 방식으로 투여되는 경우, 이소니아지드-틸마네셉트 조성물은 세포내 결핵 바실루스를 함유하는 육아종에 국재화되어, TB가 위치하는 대식세포 내 세포내 공간에 이소니아지드를 전달할 것으로 예상될 수 있다. 이는 TB 치료에서 빈번하게 당면하는 일반적인 약물 전달 장벽을 우회하여, 농축된 투여량의 이소니아지드가 결핵 바실루스에 직접 전달되는 것을 가능케 할 것이다.
상기 TB 치료 조성물 및 방법의 변형에서는, Ga-이소니아지드-틸마노셉트, 인도메타신-이소니아지드-틸마노셉트 및/또는 인도메타신-Ga-이소니아지드-틸마노셉트를 제공하기 위하여, 인도메타신 및/또는 Ga (임의적으로 68Ga로서) 역시 이전에 기술된 방식으로 틸마노셉트에 부착되며, 그것은 이후 적합한 조성물로 제제화되어, 이전에 기술된 다양한 방식으로 투여된다. 또 다른 변형으로서, Ga-틸마노셉트, 인도메타신-틸마노셉트 및/또는 Ga-인도메타신-틸마노셉트를 제공하기 위하여, Ga (임의적으로 68Ga로서) 및/또는 Ga-이소니아지드-틸마노셉트가 이전에 기술된 방식으로 이소니아지드 대신 틸마노셉트에 부착되며, 그것은 이후 적합한 조성물로 제제화되어, 이전에 기술된 다양한 방식으로 투여된다.
동맥 염증 증가의 진단
급성 심장사를 겪은 환자로부터의 고-위험성 관상 죽상동맥경화증 플라크 샘플 중 대식세포는 - CD163과 함께 - CD206을 발현한다. 이러한 고-위험성 플라크는 얇은-캡 섬유죽종(thin-cap fibroatheroma) (TCFA)이 형태구조적 특징으로 되어 있으며, 괴사성 플라크 코어와 얇은 섬유성 플라크 캡 전체에 걸쳐 활성화된 대식세포에 의해 침윤되어 있다. 따라서, 대식세포의 존재로 입증되는 바와 같이, 동맥 염증 증가는 고위험성 형태구조 관상 플라크 부하를 발생시킬 위험성 증가의 지표가 된다.
도 9는 붉은털원숭이 (rhesus macaque) 유래 좌심실 및 대동맥의 면역형광 염색 영상을 도시한다. 영상은 CD163/알렉사-플루오르 488, CD206/알렉사-플루오르 568 및 Cy3 틸마노셉트의 공동-국재화를 예시하고 있다. 알렉사-플루오르 568은 이전에 기술된 방식으로 용이하게 틸마노셉트에 부착가능한 형광 염료이다.
활성화된 대식세포를 표지하는 그의 독특한 특성을 바탕으로, 본 발명의 조성물은 동맥 염증을 영상화하여 동맥 대식세포-특이적 염증 및 높아진 면역-매개 심혈관 질환 (CVD) 위험성을 가지는 개체를 식별하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시양태는 단일 광자 방출 컴퓨터화 단층촬영 (SPECT/CT)을 사용하여 전신성으로 주사된 본 발명 CD206 표적화 조성물의 측정가능한 대동맥 흡수를 정량하는 방법을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 동맥 죽상동맥경화증 플라크에서의 침윤성 활성화 대식세포의 밀도 측정 방법을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 개별 관상 플라크의 파열 경향을 특성화하기 위한 기능성 동맥 영상화 방법을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 그들이 임상적으로 중대한 사례를 겪기 전에 CVD의 위험성이 있는 환자를 식별하는 방법을 제공한다. 구체적인 일 실시양태에서, 상기 방법은 HIV-감염 환자와 같은 특정 고-위험성 환자에 적용된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 방법은 일반 군집 중 파열의 위험성이 있는 취약 플라크를 가지는 환자에게 적용된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 본 발명은 가속된 죽종형성을 조절하는 항-염증 전략의 효능을 모니터링하기 위한 기능성 동맥 영상화를 제공한다.
동맥 염증 영상화 실시예
하기의 실시예는 SPECT 및 SPECT/CT 영상화를 사용한 대동맥 및 관상 동맥 99mTc-틸마노셉트 흡수의 평가를 예시한다.
CCTA에서의 무증상 대동맥 플라크 및 고-위험성 형태구조 관상 플라크 이력을 동반한 입증된 HIV 감염에 걸린 18세-연령 남성 환자에게, 카테터를 통하여 99mTc-틸마노셉트 ~10 mCi의 정맥내 주사를 투여한다. 카테터는 주사-후 대략 10 mL의 식염수 용액을 사용하여 세척한다.
대상체를 지멘스(Siemens) SPECT/CT 스캐너 (지멘스 메디칼 솔루션즈(Siemens Medical Solutions) 사, 일리노이 호프만 에스테이트 소재)의 스캐너 테이블에 위치시킨다. 대략 60분의 지연 시간 후, SPECT에 앞서 수행되는 정찰 CT를 바탕으로 스텝(step) 및 슈트(shoot) 양식의 뷰(view) 당 1분으로 가슴과 목 2×60 뷰를 사용하여, SPECT 포착을 수행하게 된다. 심장을 영상화하는 경우에는 게이트 포착을 수행한다. 흉부 영상에는 폐 전체가 포함된다. SPECT 및 CT의 데이터 포착은 대략 70분이 걸린다. 모든 영상은 2개의 에너지 윈도우, 즉 [90-120 keV] 및 [126-154 keV]에서 포착되며, 산란 윈도우(scatter window)를 사용하여 콤프톤(Compton) 산란에 대하여, 그리고 CTAC를 사용하여 감쇠에 대하여 보정되고, 반복 순차 하위세트 기대값 최대화 알고리즘(ordered subsets expectation maximization algorithm) (OSEM)을 사용하여 재구성된다. 결과적인 재구성 부피는 해당 참조 영역에 대하여 표준화된 해당 99mTc-틸마노셉트 흡수의 영역에서 작도된 해당 영역 (ROI)을 사용하여, 표적 대 바탕 할당량을 정량하는 데에 사용된다.
류마티스 관절염의 진단
류마티스 관절염 ("RA") 역시 진단 및 치료하기가 어려운 자가면역 질환이다. 본원에서 기술되는 운반체 분자 (예컨대 틸마노셉트)는 관절의 RA와 연관되어 존재하고/거나 내장과 연관되어 있는 것과 같은 국소성 RA 조직에 대하여 침습성인 세망내피 세포의 CD206에 결합하도록 설계된다. 따라서, 이러한 운반체 분자는 RA의 진단 영상화는 물론 치료에 사용될 수 있다. 예를 들어 틸마노셉트의 경우, 만노스가 CD206에 대한 리간드 잔기로 작용하며, DTPA가 예컨대 Tc 99m에 의한 방사성표지용 킬레이팅 잔기로 작용한다. Tc 99m-틸마노셉트가 의심 질환 위치 (즉 RA가 존재하거나 의심되는 관절)에 근접하여 주사될 경우, 고정식 감마 카메라와 연계되고/거나 수술중 휴대용 감마 검출 프로브와 연계된 섬광조영술 영상화가 RA를 진단할 목적으로 연관된 조직을 국재화하는 데에 사용될 수 있다. 틸마노셉트는 약 7 nm의 평균 직경을 가지는데, 이와 같은 작은 직경은 조직 채널 및 혈액 모세관으로의 강화된 확산을 가능케 함으로써, 빠른 주사 부위 클리어런스 및 인플라마솜(inflammasome)에서의 CD206 결합을 초래한다. 예를 들자면, 형광 및/또는 방사성 틸마노셉트 및 이전에 기술된 다른 운반체 분자가 초기 형태의 RA에 걸린 관절의 진단 및 비-침습성 영상화에 사용될 수 있다.
틸마노셉트가 RA에 걸린 대상체의 활액 중 대식세포에서 발견되는 CD206 수용체에 결합한다는 것을 입증하기 위하여, 명백한 RA로 진단된 환자로부터 활액 및 조직을 입수하였다. 마노셉트-Cy3, DAPI 핵 플루오르 및 항 CD206-시아닌 그린을 사용하여 조직을 프로빙하였다. 미세-형광에 의해 상기 조직 및 액을 영상화한 후, 골관절염 (OA)에 걸린 환자로부터 입수한 정상 냉동 저장 조직 및 윤활 조직과 비교하였다. 디지털 영상 분석에 의해 MP 국재화 및 형광도를 비교하였다. 구체적으로, 스캐닝 정량 형광 현미경법을 사용하여 미세-형광 영상을 분석하였는데, 조직 및 활액 영상에서 Cy3 형광 염료의 픽셀 계수를 정량 및 대조하는 데에는 적분 알고리즘을 사용하였다.
결과는 RA에 걸린 대상체로부터의 윤활 조직 및 활액이 고도 수준의 CD206을 발현하는 대형 대식세포 군집을 함유한다는 것을 나타내었다. 또한, 이러한 MP는 강하게 Cy3-틸마노셉트를 CD206상에 국재화한다. 또한, 도 10에 나타낸 바와 같이, 정상 및 OA 조직에서의 대식세포 침습 및 CD206 존재의 정도는 RA 조직에서에 비해 상당히 더 낮다. 따라서, 형광단과 같은 검출가능한 잔기가 제공될 경우, 본 발명의 운반체 분자는 활액으로부터 (생체내 또는 생체외 중 어느 하나로) RA를 진단할 수 있을 뿐만 아니라, OA와 RA를 구별할 수도 있다.
Cy3-틸마노셉트를 사용한 마우스에서의 연골 항체-유도 관절염의 대식세포 영상화
Cy3-틸마노셉트를 사용하고, Dba1 마우스에서 형광 발광을 사용하여, 초기 면역-매개 관절염 및 연골 항체-유도 관절염의 마우스 모델 중 대식세포를 영상화하였다. 5회의 단일클론 항체 항-연골 칵테일의 주사 후 이어지는 3일 이내의 이. 콜리(E. coli) 지질다당류 주사에 의해 마우스에서 관절염을 유도하였다. 마우스는 7-11일 이내에 발, 손목, 발목, 팔꿈치 및 무릎에서 다양한 정도의 종창성 및 적색성 관절이 발생됨으로써, 관절염을 입증하였다.
7 또는 8일차에 마우스를 생체내 영상화한 후, 9 또는 11일차에 마우스를 안락사시켰다. 안락사 후, 사지를 절제하고, 피부를 제거한 후, 샘플을 재영상화 (낙사형광(epifluorescent) 영상화)하여, 방사선사진촬영한 (팍시트론(Faxitron) MX20) 다음, 탈회시키고, 매립한 후, H&E로 염색하였다.
낙사형광 영상화를 위하여, 마우스에 정맥내로 Cy3-틸마노셉트를 주사한 후, IVIS 루미나(Lumina) II 기계 (칼리퍼 라이프 사이언시즈(Caliper Life Sciences) 사, 매사추세츠 홉킨튼 소재)를 사용하여, 1-2시간에 생체내 및 생체외로 낙사형광 영상화를 수행하였다. 리빙 영상 소프트웨어를 사용하여 가시적인 형광 영상을 가시화하고, 해당 영역 ("ROI") 및 바탕 형광의 차감을 사용하여 광자의 수를 정량하였다. 안락사 후, 사지를 절제하고, 피부를 제거한 (손발가락 제외) 후, 재-영상화하였다. 도 11에 나타낸 바와 같이, 관절염 무릎 및 팔꿈치에서 특이적 형광을 검출하였다. 도 12는 면역매개 관절염에 걸린 마우스 (상부) 및 대조 마우스 (하부) 팔꿈치 및 발의 생체내 형광을 도시한다. 관절염에 걸린 마우스는 대조 마우스에 비해 팔꿈치에서 Cy3-틸마노셉트로 인하여 증가된 형광을 나타내었다. 피부로부터의 바탕 형광이 존재하였는데, 발에서 두드러졌다. 도 13은 생체외 형광 데이터를 나타내며, 도 14는 대조 마우스 및 면역-매개 관절염에 걸린 마우스 무릎의 생체외 형광을 도시한다. 치료되는 마우스 (하부 영상)의 양 무릎이 관절염을 나타내었지만, 우측의 무릎이 더 심각하게 영향을 받았으며, Cy3-틸마노셉트 표지로 인하여 더 큰 형광을 나타내었다.
RA 진단 영상화에 대한 구체적인 실시양태에서, 운반체 분자는 틸마노셉트이며, 검출가능한 잔기는 사용 전에 DTPA 킬레이터에 부착되는 99mTc 또는 68Ga, 또는 아미노-종결 연결사슬에 부착되어 있는 형광 염료 (예컨대 Cy3)이다. Cy3-틸마노셉트의 경우, RA의 존재 및/또는 정도를 측정하는 데에 광학 영상화가 사용된다. 상기한 마우스 연구는 표지된 틸마노셉트 (예컨대 Cy-3-틸마노셉트)가 RA를 진단하는 데에 유용하다는 것을 확인해 주었다.
RA 치료를 위한 구체적인 실시양태에서, 운반체 분자는 틸마노셉트이며, 치료제는 치료용 동위원소이다. 구체적인 일 실시양태에서, 상기 치료용 동위원소는 117mSn이다. RA치료를 위한 다른 구체적인 실시양태에서, 운반체 분자는 틸마노셉트이며, 치료제는 독소이다. 구체적인 일 실시양태에서, 상기 독소는 보툴리눔 또는 콜레라 독소이다. RA치료를 위한 다른 구체적인 실시양태에서, 운반체 분자는 틸마노셉트이며, 치료제는 메토트렉세이트이다.
RA 영상화 실시예
림포시크® 주사 키트라는 명칭하에 나비데아 바이오파마슈티칼스 사에 의해 시판되고 있는 틸마노셉트 동결건조 분말을 입수한다. 상기 틸마노셉트 분말은 약 7 nm의 평균 직경을 가지며, 0.250 mg의 틸마노셉트, 20 mg의 트레할로스 2수화물, 0.5 mg의 글리신, 0.5 mg의 나트륨 아스코르베이트 및 0.075 mg의 제일주석 클로라이드 2수화물의 혼합물로서 0.5 mL 바이알에 들어 있다. 이후 테크네튬-99m 생성기로부터 용출된 나트륨 99mTc-퍼테크네테이트를 사용하여 Tc 99m으로 틸마노셉트 분말을 방사성표지한다. 멸균 주사기를 사용하여, 약 0.35 mL 중 대략 92.5 MBq (2.5 mCi)의 나트륨 99mTc-퍼테크네테이트를 무균으로 바이알에 첨가한다. 바이알을 약하게 진탕하고, 실온에서 10-15분 이상 동안 방사성표지 반응을 진행시킨다. 다음에, 표준 식염수를 바이알에 첨가함으로써 내용물이 5 cc가 되도록 하는데, 임의적으로 이전에 기술된 바와 같이 완충제가 첨가될 수 있다.
단일 환자 투여분은 틸마노셉트 100 mcg 및 테크네튬 99m 1 mCi로써, 총 2 cc이다. 방사성표지된 틸마노셉트는 방사성표지 6시간 이내에 정맥내 주사에 의해 투여된다. 주사 30 내지 180분 이내에, 단일 광자 방출 컴퓨터화 단층촬영 (SPECT)을 사용하여 환자를 영상화한다. 관절에 국재화된 방사능의 발견은 류마티스 관절염 (RA)의 특징인 관절내 영역에서의 염증 과정의 추정 증거가 됨으로써, 그것이 부재하는 경우 RA를 배제하고 그것이 존재하는 경우 초기 또는 진행중인 RA의 진단을 돕는다.
대식세포-관련 장애의 진단 및/또는 치료를 위한 몇 가지 조성물 및 방법이 상기에서 상세하게 논의되기는 하였지만, 상기 조성물, 특징, 구성, 및 논의된 조성물의 사용 방법이 상기에서 제공된 문맥으로 제한되는 것은 아니라는 것이 이해되어야 한다.

Claims (1)

  1. CD206 발현 세포-관련 장애를 진단하기 위한 제약 조성물로서,
    상기 조성물은 검출가능한 잔기가 거기에 부착되어 있는 운반체 분자를 포함하고, 상기 운반체 분자는 하기를 포함하고,
    i. 덱스트란 백본; 및
    ii. 상기 덱스트란 백본에 직접 또는 간접적으로 접합되며, CD206에 특이적으로 결합하도록 선택되는 1종 이상의 수용체 기질,
    상기 운반체 분자는 수용성이고,
    상기 CD206 발현 세포-관련 장애를 진단하는 것은 감시 림프절이 아닌 다른 대상체의 위치에서 상기 검출가능한 잔기의 존재를 검출하기 위한 정보를 제공하는 것을 포함하는, 제약 조성물.
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