KR20210078430A - Cpf1 및 키메릭 DNA-RNA 가이드를 포함하는 유전체 교정 또는 발현 억제용 조성물 - Google Patents

Cpf1 및 키메릭 DNA-RNA 가이드를 포함하는 유전체 교정 또는 발현 억제용 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR20210078430A
KR20210078430A KR1020200177636A KR20200177636A KR20210078430A KR 20210078430 A KR20210078430 A KR 20210078430A KR 1020200177636 A KR1020200177636 A KR 1020200177636A KR 20200177636 A KR20200177636 A KR 20200177636A KR 20210078430 A KR20210078430 A KR 20210078430A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
dna
target
guide
chimeric
rna
Prior art date
Application number
KR1020200177636A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102551876B1 (ko
Inventor
이승환
김선욱
김한섭
이위재
박영호
진영배
Original Assignee
한국생명공학연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국생명공학연구원 filed Critical 한국생명공학연구원
Publication of KR20210078430A publication Critical patent/KR20210078430A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102551876B1 publication Critical patent/KR102551876B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 Cpf1 및 키메릭 DNA-RNA 가이드를 포함하는 유전체 교정 또는 발현 억제용 조성물에 관한 것으로, 기존의 RNA 가이드 대비 인델 효율은 유사하면서도, RNA 가이드 대비 표적 특이성이 우수하므로, 안정성 및 높은 치료 효과를 요구하는 유전자 치료 등에 효과적으로 적용될 수 있다.

Description

Cpf1 및 키메릭 DNA-RNA 가이드를 포함하는 유전체 교정 또는 발현 억제용 조성물{Composition for Genome Editing or Inhibiting Gene Expression comprising Cpf1 and Chimeric DNA-RNA Guide}
본 발명은 Cpf1 및 키메릭 DNA-RNA 가이드를 포함하는 유전체 교정 또는 발현 억제용 조성물에 관한 것이다.
CRISPR-Cas12a(이하, Cpf1)는 class II, type V에 속하는 CRISPR 시스템으로, Cas9 유전자 가위와 마찬가지로 뉴클레아제 도메인과 인식(recognition) 도메인의 bi-lobed 형식의 구조로 이루어져 있으며, 단일 가닥의 crRNA를 이용하여 표적 DNA 이중 나선에 DNA-RNA 하이브리드 듀플렉스(hybrid duplex)를 이루어 바인딩 하는 것으로 알려져 있다. 이러한 Cpf1은 Cas9의 발견 이후 PAM의 제한적인 부분을 보완할 우수한 유전자 가위로 주목 받아 왔다. 또한, Cpf1 유전자 가위는 세포 내 유전자 좌의 구아닌(guanine, G)이 많은 영역 이외에 티미딘(thymine, T)이 많은 부분을 PAM(TTTN 또는 TTN)으로 인식하여 특이적으로 DNA 이중나선 절단을 유도할 수 있기 때문에, 표적 특이적 유전자 가위로서도 널리 사용되고 있다. 가장 최근에는 Cpf1 단백질을 엔지니어링 하여 PAM을 확장함으로써 표적화할 수 있는 유전자의 범위를 넓히거나, 가이드 RNA의 변형을 통하여 DNA 이중나선 절단 효율성을 높임으로써 유전자 치료제로서의 가능성을 제고해 가는 추세이다.
현재까지 Cpf1은 구조적으로 24개 염기의 프로토스페이서(protospacer)를 인식하며, 이중 내부의 seed region이 대략 PAM 염기서열로부터 5 내지 10개 정도인 것으로 알려져 있다. 표적 DNA를 인식하는 과정에서 CRISPR-Cas9보다 미스매치(mismatch)에 민감하여 프로토스페이서 영역의 seed 부분에 미스매치 도입시, 그 활성이 현저히 저하되는 효과를 보임으로써 표적 특이성이 우수한 유전자 가위로 알려져 왔다. 다만, seed 부분 이외에 생기는 미스매치에 대한 절단 가능성이 여전히 존재하기 때문에, 추후 활성이 더 증가된 Cpf1의 타겟 염기서열을 포함한 DNA 절단 과정에서, 이와 같은 오프-타겟(off-target) 절단(cleavage) 비검측 이슈가 더욱 부각될 수 있다.
이에, 본 발명자들은 표적 특이성이 우수하면서도 인델 효율이 개선된 CRISPR-Cpf1 유전자 가위를 개발하기 위한 연구를 수행하여 본 발명을 완성하였다.
대한민국 특허공개 제10-2018-0028996호
본 발명의 하나의 목적은 Cpf1 단백질 또는 이를 암호화하는 DNA; 및 표적 뉴클레오티드(target nucleotide) 서열과 혼성화 가능한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 키메릭(chimeric) DNA-RNA 가이드 또는 이를 암호화하는 DNA를 포함하는 유전체 교정용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 유전체 교정용 조성물을 분리된 세포 또는 유기체에 도입하는 단계를 포함하는 형질 전환체의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전체 교정용 조성물을 표적 서열을 갖고 유전자 산물을 암호화하는 DNA 분자를 함유하고 발현하는 세포에 도입하는 단계를 포함하여, 유전자 산물의 발현을 변경시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 비활성 Cpf1(dCpf1) 단백질 또는 이를 암호화하는 DNA; 및 표적 뉴클레오티드(target nucleotide) 서열과 혼성화 가능한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 키메릭 DNA-RNA 가이드 또는 이를 암호화하는 DNA를 포함하는 유전자 발현 억제용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전체 교정용 조성물을 표적 서열을 갖고 유전자 산물을 암호화하는 DNA 분자를 함유하고 발현하는 세포에 도입하는 단계를 포함하여 유전자 산물의 발현을 변경시킴(여기서, DNA 분자는 돌연변이 서열을 포함한다)으로써, 대상체에서 돌연변이 또는 단일-뉴클레오티드 다형태(SNP)와 관련된 질환을 예방, 개선 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 Cpf1 단백질 또는 이를 암호화하는 DNA; 및 표적 뉴클레오티드(target nucleotide) 서열과 혼성화 가능한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 키메릭(chimeric) DNA-RNA 가이드 또는 이를 암호화하는 DNA를 포함하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 Cpf1 단백질 또는 이를 암호화하는 DNA; 및 표적 뉴클레오티드(target nucleotide) 서열과 혼성화 가능한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 키메릭(chimeric) DNA-RNA 가이드 또는 이를 암호화하는 DNA를 포함하는 약학적 조성물을 이용한 의약 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 Cpf1 단백질 또는 이를 암호화하는 DNA; 및 표적 뉴클레오티드(target nucleotide) 서열과 혼성화 가능한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 키메릭(chimeric) DNA-RNA 가이드 또는 이를 암호화하는 DNA를 포함하는 유전자 진단용 조성물을 이용한 진단 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양상은 Cpf1 단백질 또는 이를 암호화하는 DNA; 및 표적 뉴클레오티드(target nucleotide) 서열과 혼성화 가능한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 키메릭(chimeric) DNA-RNA 가이드 또는 이를 암호화하는 DNA를 포함하는 유전체 교정용 조성물을 제공한다.
“Cpf1”은 type V CRISPR 시스템 단백질로서 단일 단백질이 crRNA과 결합하여 표적 유전자를 절단한다는 점은 type II CRISPR 시스템 단백질인 Cas9과 유사하지만 그 작동 방식에는 차이가 크다. 특히 Cpf1 단백질은 하나의 crRNA로 작동하기 때문에 Cas9의 경우와 같이 crRNA와 trans-activating crRNA (tracrRNA)를 동시에 사용하거나 인위적으로 tracrRNA와 crRNA를 합친 single guide RNA (sgRNA)를 제작할 필요가 없다. 또한 Cpf1 시스템은 Cas9과 다르게 PAM이 표적 서열의 5' 위치에 존재하고, 표적을 결정하는 guide RNA 의 길이도 Cas9 에 비해 짧다. 이러한 특징을 활용하면, Cpf1은 Cas9이 사용될 수 없는 표적 염기서열에도 유전체 교정이 가능하고, 가이드 RNA인 crRNA를 제작하는 Cas9와 비교하여 것도 상대적으로 쉽다는 이점을 갖는다. 또한, Cpf1은 표적 DNA가 절단된 위치에 blunt-end가 아닌 5' overhang (sticky end)이 발생시키므로, 보다 정확하고 다양한 유전자 교정이 가능하다는 이점을 갖는다. 본 명세서에서는 Cpf1 시스템을 이용한 보다 편리하면서 정확하고 효과적으로 표적 유전체를 교정하는 기술이 제공된다.
예컨대, 상기 Cpf1 단백질은 캔디다투스 (Candidatus) 속, 라치노스피라 (Lachnospira) 속, 뷰티리비브리오 (Butyrivibrio) 속, 페레그리니박테리아 (Peregrinibacteria), 액시도미노코쿠스 (Acidominococcus) 속, 포르파이로모나스 (Porphyromonas) 속, 프레보텔라 (Prevotella) 속, 프란시셀라 (Francisella) 속, 캔디다투스 메타노플라스마 (Candidatus Methanoplasma), 또는 유박테리움 (Eubacterium) 속 유래의 것일 수 있고, 예컨대, Parcubacteria bacterium (GWC2011_GWC2_44_17), Lachnospiraceae bacterium (MC2017), Butyrivibrio proteoclasiicus, Peregrinibacteria bacterium (GW2011_GWA_33_10), Acidaminococcus sp. (BV3L6), Porphyromonas macacae, Lachnospiraceae bacterium (ND2006), Porphyromonas crevioricanis, Prevotella disiens, Moraxella bovoculi (237), Smiihella sp. (SC_KO8D17), Leptospira inadai, Lachnospiraceae bacterium (MA2020), Francisella novicida (U112), Candidatus Methanoplasma termitum, Candidatus Paceibacter, Eubacterium eligens 등의 미생물 유래의 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다 . 일 예에서, 상기 Cpf1 단백질은 Parcubacteria bacterium (GWC2011_GWC2_44_17), Peregrinibacteria bacterium (GW2011_GWA_33_10), Acidaminococcus sp. (BV3L6), Porphyromonas macacae, Lachnospiraceae bacterium (ND2006), Porphyromonas crevioricanis, Prevotella disiens, Moraxella bovoculi (237), Leptospira inadai, Lachnospiraceae bacterium (MA2020), Francisella novicida (U112), Candidatus Methanoplasma termitum, 또는 Eubacterium eligens 유래의 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기와 같은 Cpf1 단백질의 예를 유래 미생물 별로 아래의 표 1에 정리하였다:
Cpf1 단백질 유래 미생물 Genbank protein ID NCBI protein GI from NR Database or local GI (for proteins originated from WGS database) Contig ID in WGS database
PbCpf1 Parcubacteria bacteriumGWC2011_GWC2_44_17 KKT48220.1 818703647 LCIC01000001.1
PeCpf1 Peregrinibacteriabacterium
GW2011_GWA_33_10 		KKP36646.1 818249855 LBOR01000010.1
AsCpf1 Acidaminococcus sp. BVBLG WP_021736722.1 545612232 AWUR01000016.1
PmCpf1 Porphyromonas macacae WP_018359861.1 517171043 BAKQ01000001.1
LbCpi1 Lachnospiraceae bacterium ND2006 WP_035635841.1 737666241 JNKS01000011.1
PcCpf1 Porphyromonas crevioricanis WP_036890108.1 739008549 JQJC01000021.1
PdCpf1 Prevotella disiens WP_004356401.1 490490171 AEDO01000031.1
MbCpf1 Moraxella bovoculi 237 KDN25524.1 639140168 AOMT01000011.1
LiCpf1 Leptospira inadai WP_020988726.1 537834683 AHMM02000017.1
Lb2Cpf1 Lachnospiraceae bacteriumMA2020 WP_044919442.1 769142322 JQKK01000008.1
FnCpf1 Francisella novicida U112 WP_003040289.1 489130501 CP000439.1
CMtCpf1 Candidatus Methanoplasmatermitum AIZ56868.1 851218172 CP010070.1
EeCpf1 Eubacterium eligens WP_012739647.1 502240446 CP001104.1
상기 Cpf1 단백질은 미생물에서 분리된 것 또는 재조합적 방법 또는 합성적 방법으로 비자연적 생산된 것(non-naturally occurring)일 수 있다. 상기 Cpf1 단백질은 진핵세포의 핵 내 전달을 위하여 통상적으로 사용되는 요소 (예컨대, 핵위치신호 (nuclear localization signal; NLS) 등)를 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 Cpf1 단백질은 정제된 단백질 형태로 사용되거나, 이를 암호화하는 핵산(DNA/ RNA), 또는 상기 DNA를 포함하는 재조합 벡터의 형태로 사용될 수 있다.
구체적으로, Cpf1 단백질은 진핵 세포의 핵 내 전달을 위하여 통상적으로 사용되는 요소(예를 들어, 핵위치신호(nuclear localization signal; NLS; 예를 들어, PKKKRKV, KRPAATKKAGQAKKKK, 또는 이를 암호화하는 핵산 분자) 등)를 N-말단 또는 C-말단(또는 이를 암호화하는 핵산 분자의 5' 말단 또는 3' 말단)에 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 Cpf1 단백질은 정제된 단백질 형태로 사용되거나, 이를 암호화하는 핵산(DNA/ RNA), 또는 상기 DNA를 포함하는 재조합 벡터의 형태로 사용될 수 있다.
Cpf1 단백질은 분리 및/또는 정제에 유리한 태그와 연결될 수 있다. 예를 들어, His 태그, Flag 태그, S 태그 등과 같은 작은 펩타이드 태그, 또는 GST(Glutathione S-transferase) 태그, MBP(Maltose binding protein) 태그 등이 목적에 따라 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 가이드 RNA는 복합체를 형성할 Cpf1 단백질 종류 및/또는 그 유래 미생물에 따라서 적절히 선택될 수 있다.
본 명세서에서, 용어 '유전체 교정 (genome editing)'은, 특별한 언급이 없는 한, 표적 유전자의 표적 부위에서의 절단에 의한 핵산 분자 (하나 이상, 예컨대, 1-100,000bp, 1-10,000bp, 1-1000, 1-100bp, 1-70bp, 1-50bp, 1-30bp, 1-20bp, 또는 1-10bp)의 결실, 삽입, 치환 등에 의하여 유전자 기능을 상실, 변경, 및/또는 회복 (수정) 시키는 것을 의미하기 위하여 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "키메릭 DNA-RNA 가이드"는 표적 DNA에 특이적인 crRNA(crispr RNA)의 RNA 중 일부 RNA가 DNA로 치환된 것으로, 키메릭 DNA-RNA 가이드는 Cpf1 단백질과 복합체를 형성할 수 있고, Cpf1 단백질을 표적 DNA에 가져올 수 있다. 가이드 RNA의 DNA 치환은 가이드와 표적 DNA의 결합 에너지에 변화를 주어 오프-타겟(off-target) DNA 염기서열 절단을 줄일 수 있다. 그 외에도, 값싸게 합성할 수 있음은 물론, 실험실 자체 제작시 필연적으로 생기는 5' 포스페이트(phosphate)의 이슈로부터 벗어날 수 있고, 면역 반응의 유도를 피할 수 있다는 점에서 고등동물 세포 내 유전체 교정을 위한 Cpf1 도입시 보다 안전하게 사용될 수 있다. 또한, 수용액 내 화학적으로 불안정한 RNA 대비, DNA 형태의 가이드는 화학적 개질이 용이하고, 응용적인 접근이 쉽다는 장점이 있다.
이러한 키메릭 DNA-RNA 가이드에 있어서 상기 DNA는 상기 가이드의 3' 말단에서의 치환일 수 있다. 구체적으로, 상기 DNA는 3' 말단에서 약 6 내지 10개의 치환인 것이 바람직하다.
예를 들어, 상기 확인되는 서열에서의 3' 말단으로부터 약 6 내지 10개의 RNA가 바람직하게 DNA로 치환된 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 약 6, 7, 8, 9, 또는 10 개의 RNA가 DNA로 치환된 것일 수 있다. crRNA의 3' 말단부터 6 내지 10개의 RNA가 DNA로 치환된 키메릭 DNA-RNA 가이드는 높은 특이성 및 절단 활성을 나타내므로, crRNA의 치환은 crRNA의 3' 말단에서 이루어지는 것이 바람직하다.
crRNA의 3' 말단부터 6 내지 10개의 RNA가 DNA로 치환된 키메릭 DNA-RNA 가이드는 높은 특이성 및 절단 활성을 나타내므로, crRNA의 치환은 crRNA의 3' 말단에서 이루어지는 것이 바람직하다.
본 발명에서 사용되는 용어, "혼성화"는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 반응하여, 복합체를 형성하고, 이 복합체는 뉴클레오티드 잔기의 염기 사이의 수소 결합을 통해 안정화되는 반응을 지칭한다.
본 명세서에서, 유전자 표적 부위와 혼성화 가능한 뉴클레오타이드 서열은 유전자 표적 부위의 뉴클레오타이드 서열 (표적 서열)과 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 서열 상보성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다 (이하, 특별한 언급이 없는 한 동일한 의미로 사용되며, 상기 서열 상동성은 통상적인 서열 비교 수단 (예컨대 BLAST)를 사용하여 확인될 수 있다).
본 발명의 유전자 교정용 조성물은 Cpf1을 암호화하는 뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터 및 키메릭 DNA-RNA 가이드를 암호화하는 뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터, 또는 Cpf1을 암호화하는 뉴클레오티드 및 키메릭 DNA-RNA 가이드를 암호화하는 뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터의 형태로 세포 또는 유기체에 도입되거나, Cpf1 단백질 및 키메릭 DNA-RNA를 포함하는 혼합물 또는 이들이 복합체를 이루는 리보핵산단백질 형태로 세포 또는 유기체에 도입될 수 있다.
본 발명의 키메릭 DNA-RNA 가이드는 표적 DNA와 혼성화될 수 있다.
본 발명의 유전자 교정용 조성물은 진핵 유기체에 적용될 수 있다. 상기 진핵 유기체는 진핵 세포(예를 들어, 효모 등의 균류, 진핵 동물 및/또는 진핵 식물 유래 세포(예를 들어, 배아세포, 줄기세포, 체세포, 생식세포 등) 등), 진핵 동물(예를 들어, 척추동물 또는 무척추동물, 보다 구체적으로, 인간, 원숭이 등의 영장류, 개, 돼지, 소, 양, 염소, 마우스, 래트 등을 포함하는 포유류 등), 및 진핵 식물(예를 들어, 녹조류 등의 조류, 옥수수, 콩, 밀, 벼 등의 단자엽 또는 쌍자엽 식물 등)로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 유전자 교정용 조성물은 Cpf1을 암호화하는 뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터 및 키메릭 DNA-RNA 가이드를 암호화하는 뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터, 또는 Cpf1을 암호화하는 뉴클레오티드 및 키메릭 DNA-RNA 가이드를 암호화하는 뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터의 형태로 사용될 경우, 상기 재조합 벡터는 상기 뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "프로모터"는 폴리머라아제와 결합되고, 다운스트림(3' 방향) 코딩 또는 비-코딩 서열의 전사를 개시할 수 있는 DNA 조절 영역이다.
본 발명에서 사용되는 용어, "작동가능하게 연결된"은 유전자 발현 조절 서열과 다른 뉴클레오티드 서열사이의 기능적인 결합(cis)을 의미한다. 상기 유전자 발현 조절 서열은 복제원점(replication origin), 프로모터, 전사 종결 서열(terminator) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 프로모터는 특정 유전자의 전사 개시를 조절하는 전사 조절 서열 중 하나로, 통상적으로 약 100bp 내지 약 2500bp 길이의 폴리뉴클레오티드 단편일 수 있다.
상기 프로모터는 세포, 예를 들어, 진핵 세포(예를 들어, 식물 세포, 또는 동물 세포(예를 들어, 인간, 마우스 등의 포유류 세포 등) 등)에서 전사 개시를 조절할 수 있으면, 제한 없이 사용 가능하다. 예를 들어, 상기 프로모터는 CMV 프로모터(cytomegalovirus promoter;예를 들어, 인간 또는 마우스 CMV immediate-early 프로모터), U6 프로모터, EF1-alpha(elongation factor 1-a) 프로모터, EF1-alpha short(EFS) 프로모터, SV40 프로모터, 아데노바이러스 프로모터(major late promoter), pL λ 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, HSV의 tk 프로모터, SV40E1 프로모터, 호흡기 세포융합 바이러스(Respiratory syncytial virus; RSV) 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터(metallothionin promoter), β-액틴 프로모터, 유비퀴틴 C 프로모터, 인간 IL-2(human interleukin-2) 유전자 프로모터, 인간 림포톡신(human lymphotoxin) 유전자 프로모터, 인간 GM-CSF(human granulocyte-macrophage colony stimulating factor) 유전자 프로모터 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 일 예에서, 상기 프로모터는 CMV immediate-early 프로모터, U6 프로모터, EF1-alpha(elongation factor 1-a) 프로모터, EF1-alpha short(EFS) 프로모터 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다. 상기 전사 종결 서열은 폴리아데닐화 서열(pA) 등일 수 있다. 상기 복제 원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점, BBV 복제원점 등일 수 있다.
본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다. 상기 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 사용되는 플라스미드(예를 들면, pcDNA 시리즈, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈, pUC19 등), 파지(예를 들면, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1, M13 등) 또는 바이러스 벡터(예를 들면, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터 등) 등을 기본으로 하여 제작될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 재조합 발현벡터의 제작은 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용하여 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 가이드는 3'-말단이 개질된 것일 수 있다. 본 발명의 키메릭 DNA-RNA 가이드는 3'-말단이 개질됨으로써, 세포 내에서 DNA 엑소뉴클레아제(exonuclease)에 의한 영향 없이 높은 표적 특이성 및 우수한 인델 효율을 나타낼 수 있다.
구체적으로, 포스포네이트, 포스포로티오에이트 또는 포스포트리에스테르인 포스페이트로의 개질을 포함할 수 있다. 또한, LNA, HNA, CeNA, 2'-메톡시에틸, 2'-O-알킬, 2'-O-알릴, 2'-C-알릴, 2'-플루오로, 2'-데옥시, 2'-히드록실 및 그들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 개질일 수 있다. 또한, 비오틴화 등을 통해 개질될 수 있다.
구체적으로, 포스포로티오에이트(phosphorothioate)로 개질(modification)된 것일 수 있다.
본 발명의 키메릭 DNA-RNA 가이드는 3'-말단이 포스포로티오에이트로 개질됨으로써, 세포내에서 3' DNA 엑소뉴클레아제(exonuclease)에 의한 영향 없이 높은 표적 특이성 및 우수한 인델 효율을 나타낼 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 DNA는 상기 가이드의 3' 말단에 치환된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 DNA는 6 내지 10개인 것일 수 있다.
crRNA의 5' 말단 또는 seed region의 RNA가 DNA로 치환된 키메릭 DNA-RNA 가이드의 경우, 절단 활성이 낮다. 반면, crRNA의 3' 말단부터 6 내지 10개의 RNA가 DNA로 치환된 키메릭 DNA-RNA 가이드는 높은 특이성 및 절단 활성을 나타내므로, crRNA의 치환은 crRNA의 3' 말단에서 이루어지는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 조성물은 SpCas9 닉카아제(nickase)(D10A) 또는 비활성(Dead) SpCas9 닉카아제(nickase)(D10A 또는 H840A)을 더 포함할 수 있다. SpCas9 닉카아제(nickase)(D10A)는 D10A 돌연변이를 갖는 S. 피오게네스 Cas9 nickase를 의미한다. 비활성 SpCas9 (dead SpCas9)(D10A, 또는 H840A)는 D10A, H840A 돌연변이를 갖는 S. 피오게네스 Cas9 을 의미한다.
SpCas9 닉카아제(D10A)은 세포내 존재하는 DNA 이중나선의 negative supercoil을 제거할 수 있으므로, 세포내에서 키메릭 DNA-RNA 가이드의 유전체 교정 효율을 제고할 수 있다.
본 발명의 다른 양상은 상기 유전체 교정용 조성물을 분리된 세포 또는 유기체에 도입하는 단계를 포함하는 형질 전환체의 제조 방법을 제공한다. 여기서 상기 유기체는 인간을 제외할 수 있다.
본 발명의 유전체 교정용 조성물은 핵산 분자를 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 당 분야에서 공지된 방법에 의해 세포 또는 유기체에 도입될 수 있으며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 예를 들어, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온성 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전체 교정용 조성물을 표적 서열을 갖고 유전자 산물을 암호화하는 DNA 분자를 함유하고 발현하는 세포에 도입하는 단계를 포함하여, 유전자 산물의 발현을 변경시키는 방법을 제공하는 것이다.
핵산 변경 이벤트를 겪은 세포(즉, "변경된" 세포)는 임의의 적합한 방법을 사용하여 단리될 수 있다. 수선 뉴클레오티드 분자는 선별 마커(selectable marker)를 암호화하는 핵산을 추가로 포함한다. 이러한 선별 마커는 당업계에 널리 공지되어 있으며 이들 마커를 암호화하는 핵산 서열은 상업적으로 이용 가능하다(예를 들면, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989] 참조). 형광에 의해 시각화될 수 있는 선별마커를 사용하는 방법은 형광 활성화 세포 분류(FACS) 기법을 사용하여 추가로 분류될 수 있다. 단리된 조작된 세포가 이식을 위한 세포주를 확립하는데 사용될 수 있다. 단리된 변경된 세포는 안정한 세포주를 생산하기 위해 임의의 적합한 방법을 사용하여 배양할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전체 교정용 조성물을 표적 서열을 갖고 유전자 산물을 암호화하는 DNA 분자를 함유하고 발현하는 세포에 도입하는 단계를 포함하여 유전자 산물의 발현을 변경시킴으로써, 대상체에서 돌연변이 또는 단일-뉴클레오티드 다형태(SNP)와 관련된 질환을 예방, 개선 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다. 여기서 DNA 분자는 돌연변이 또는 SNP 돌연변이 서열을 포함한다.
DNA 분자는 적어도 하나, 둘, 셋, 넷 또는 그 이상의 SNP 또는 돌연변이 부위를 포함할 수 있고, 본원에 기술된 방법은 적어도 하나, 둘, 셋, 넷 또는 그 이상의 SNP 또는 돌연변이 부위와 관련된 유전자 산물의 발현을 변경시킨다. 즉, 다수의 SNP 부위 또는 선조 SNP에서 돌연변이 서열을 변경시킬 수 있다.
이러한 대상체에서 돌연변이 또는 단일-뉴클레오티드 다형태(SNP)와 관련된 질환을 예방, 개선 또는 치료를 위한 질환은 예를 들어 유전 질환, 비유전 질환, 바이러스 감염, 박테리아 감염, 암, 또는 자가 면역 질환을 포함한다.
여기서, 유전 질환"은 게놈에서 하나 이상의 이상, 특히 출생시 존재하는 상태에 의해 부분적으로 또는 전적으로, 직접적으로 또는 간접적으로 유발되는 질환을 지칭한다. 이상은 돌연변이, 삽입 또는 결실일 수 있다. 이상은 유전자의 코딩 서열 또는 이의 조절 서열에 영향을 줄 수 있다. 유전 질환은 DMD, 혈우병, 낭포성 섬유증, 헌팅턴 무도병, 가족성 고콜레스테롤혈증 (LDL 수용체 결함), 간모세포종, 윌슨병(Wilson's disease), 선천성 간성 포르피린증, 간 대사의 유전성 장애, 레쉬 니한 증후군(Lesch Nyhan syndrome), 겸상 적혈구 빈혈, 지중해빈혈, 색소피부건조증, 판코니 빈혈(Fanconi's anemia), 망막색소변성증, 모세혈관확장성 실조증, 블룸 증후군(Bloom's syndrome), 망막모세포종 및 테이-삭스병(Tay-Sachs disease)일 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
비유전 질환 타겟은 Cpf1을 이용, 변이된 유전자 이외 정상 유전자를 조절하여 질병을 치료하는 것으로, 대표적으로 노인성 황반 변성(AMD)일 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
여기서, 바이러스, 박테리아 감염, 또는 이들에 의한 질환은 에이즈, 조류독감, 독감, CMV 감염질환, 결핵 또는 나병 등을 포함하며, 이에 제한되지 않는다.
여기서, 암은 방광암, 골암, 혈액암, 유방암, 흑색종양, 갑상선암, 부갑상선암, 골수암, 직장암, 인후암, 후두암, 폐암, 식도암, 췌장암, 대장암, 위암, 설암, 피부암, 뇌종양, 자궁암, 두부 또는 경부암, 담낭암, 구강암, 결장암, 항문 부근암, 중추신경계 종양, 간암 및 대장암으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 포함하며, 이에 제한되지 않는다.
여기서, 자가 면역 질환은 제1형 당뇨병, 류마티스 관절염, 셀리악 병(Celiac disease-sprue), IgA 결핍(IgA deficiency), 크론병(Crohn's disease), 다발성 경화증, 전신성 홍반성 낭창, 쇼그렌 증후군, 피부 경화증, 다발성 근염, 만성 활동성간염, 혼합 결체 조직 질환, 원발성 담즙성 간경변, 악성 빈혈, 자가면역 갑상선염, 특발성 에디슨 병, 백반, 글루텐 감수성 장병증, 그레이브병, 중증 근무력증, 자가면역성 호중구 감소증, 특발성 혈소판 감소 자반증, 간경변증, 심상성천포창, 자가면역 불임증, 구드패스츄어 증후군, 수포성 유천포창, 원판상 홍반 루푸스, 궤양성 대장염 또는 고밀도 침착병 등을 포함하며, 이에 제한되지 않는다.
상기 내용에 있어서, 치료는 질환 또는 병태에 대해 양성 치료 반응을 제공한다. "양성 치료 반응"이란 질환 또는 병태의 개선, 및/또는 질환 또는 병태와 관련된 증상의 개선으로 의도된다.
상기 증상의 개선은 유효량, 또는 치료학적 유효량의 유전체 교정용 조성물의 투여를 포함한다. "유효량" 또는 "치료학적 유효량"은 유리하거나 목적하는 결과를 가져오기에 충분한 제제의 양을 가리킨다. 치료학적 유효량은 다음 중의 하나 이상에 따라 달라질 수 있다: 대상체 및 치료되는 질환 상태, 대상체의 체중 및 연령, 질환 상태의 중증도, 투여 방식 등, 이것은 당업계의 통상의 숙련가에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 Cpf1 단백질 또는 이를 암호화하는 DNA; 및 표적 뉴클레오티드(target nucleotide) 서열과 혼성화 가능한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 키메릭(chimeric) DNA-RNA 가이드 또는 이를 암호화하는 DNA를 포함하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
발명의 약학적 조성물의 제형은 비경구용일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 특히, 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제 및 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 비경구로 투여될 수 있으며, 종양내 투여, 정맥내, 근육내, 피내, 피하, 복강내, 소동맥내, 심실내, 병변내, 척추강내, 국소, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 경로로 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하며, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 약학적 조성물을 1일 0.01 ug/kg 내지 100 mg/kg으로, 구체적으로는 1 ug/kg 내지 1 mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 목적은 Cpf1 단백질 또는 이를 암호화하는 DNA; 및 표적 뉴클레오티드(target nucleotide) 서열과 혼성화 가능한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 키메릭(chimeric) DNA-RNA 가이드 또는 이를 암호화하는 DNA를 포함하는 약학적 조성물을 이용한 의약 용도를 제공하는 것이다.
여기서 상기 의약 용도는 대상체에서 돌연변이 또는 단일-뉴클레오티드 다형태(SNP)와 관련된 질환을 예방, 개선 또는 치료하기 위한 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 유전 질환, 비유전 질환, 바이러스 감염, 박테리아 감염, 암, 또는 자가 면역 질환을 포함하는, 돌연변이 또는 단일-뉴클레오티드 다형태(SNP)와 관련된 질환에 대한 예방, 개선 또는 치료하기 위한 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 유전체 교정에 사용하기 위한, Cpf1 단백질 또는 이를 암호화하는 DNA; 및 표적 뉴클레오티드(target nucleotide) 서열과 혼성화 가능한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 키메릭(chimeric) DNA-RNA 가이드 또는 이를 암호화하는 DNA를 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 유전 질환, 비유전 질환, 바이러스 감염, 박테리아 감염, 암, 또는 자가 면역 질환을 포함하는, 돌연변이 또는 단일-뉴클레오티드 다형태(SNP)와 관련된 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, Cpf1 단백질 또는 이를 암호화하는 DNA; 및 표적 뉴클레오티드(target nucleotide) 서열과 혼성화 가능한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 키메릭(chimeric) DNA-RNA 가이드 또는 이를 암호화하는 DNA를 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 암이나 유전 질병, 바이러스에 의한 감염을 특정 DNA 혹은 RNA 상의 돌연변이를 표적하여 검출하는데 사용되는 것이다. 정상 유전자와 변이 유전자를 정확하게 구분하는 데 있어서 Cpf1 단백질 또는 이를 암호화하는 DNA; 및 표적 뉴클레오티드(target nucleotide) 서열과 혼성화 가능한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 키메릭(chimeric) DNA-RNA 가이드 또는 이를 암호화하는 DNA를 포함하는 유전자 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명에 따른 유전자 진단용 조성물은 우수한 표적 특이성 및 신속성을 통하여 빠르고 정확하게 표적 유전자를 검출할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 Cpf1 단백질 또는 이를 암호화하는 DNA; 및
표적 뉴클레오티드(target nucleotide) 서열과 혼성화 가능한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 키메릭(chimeric) DNA-RNA 가이드 또는 이를 암호화하는 DNA를 포함하는 조성물의 유전체 교정 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 돌연변이 또는 단일-뉴클레오티드 다형태(SNP)와 관련된 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 약제의 제조에 있어서,
Cpf1 단백질 또는 이를 암호화하는 DNA; 및 표적 뉴클레오티드(target nucleotide) 서열과 혼성화 가능한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 키메릭(chimeric) DNA-RNA 가이드 또는 이를 암호화하는 DNA를 포함하는 조성물의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 양상은 비활성 Cpf1(dCpf1) 단백질 또는 이를 암호화하는 DNA; 및 표적 뉴클레오티드(target nucleotide) 서열과 혼성화 가능한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 키메릭 DNA-RNA 가이드 또는 이를 암호화하는 DNA를 포함하는 유전자 발현 억제용 조성물을 제공한다.
본 발명의 유전자 발현 억제용 조성물에 있어서, 전술한 내용과 중복되는 부분은 전술한 의미와 동일한 의미로 사용될 수 있다.
비활성(deactivated) Cpf1 단백질은 키메릭 DNA-RNA 가이드에 의해 표적 유전자에 바인딩할 수 있으나, 뉴클레아제 활성을 나타내지 않으므로, 표적 유전자의 전사가 억제 또는 감소될 수 있으므로, 표적 유전자의 발현을 조절하는데 효과적으로 활용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 비활성 Cpf1 단백질은 당업계에서 알려진 Cpf1 단백질의 활성을 제거 또는 감소시키는 방법에 의해 제조된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 가이드는 3'-말단이 포스포로티오에이트로 개질된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 DNA는 상기 가이드의 3' 말단에 치환된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 조성물은 SpCas9 닉카아제(nickase)(D10A)를 더 포함할 수 있다.
Cpf1 및 키메릭 DNA-RNA 가이드를 포함하는 유전체 교정 또는 발현 억제용 조성물에 따르면, 기존의 RNA 가이드 대비 인델 효율은 유사하면서도, RNA 가이드 대비 표적 특이성이 우수하므로, 안정성 및 높은 치료 효과를 요구하는 유전자 치료 등에 효과적으로 적용될 수 있다.
도 1은 AsCpf1 단백질내 crRNA와 표적 DNA 단일가닥의 상호작용을 나타낸 모식도이다. crRNA의 부분적인 DNA 치환에 따른 성능을 확인하기 위하여 3' 말단, 5' 말단부터 또는 seed 영역을 DNA로 치환하였으며, crRNA의 RNA부분은 파란색으로, DNA 부분은 붉은색(밑줄 표시)(숫자는 치환된 DNA 개수)으로 표시하였다.
도 2는 키메릭 DNA-RNA 가이드(crRNA의 3' 말단부터 4bp 단위의 DNA 치환)를 사용한 AsCpf1의 표적 유전자(DNMT1: 오렌지색, CCR5: 녹색) 절단 효율을 나타낸 그래프이다. Cr1, Cr2, Cr3, Cr4, Cr5, Cr6, Cr7 및 Cr8은 각각 표 2에 해당하는 crRNA1, crRNA2, crRNA3, crRNA4, crRNA5, crRNA6, crRNA7 및 crRNA8의 키메릭 가이드 염기서열을 나타내고, CrS1, CrS2, CrS3, CrS4, CrS5, CrS6, CrS7 및 CrS8은 각각 표 3에 해당하는 crRNA51, crRNA52, crRNA53, crRNA54, crRNA55, crRNA56, crRNA57 및 crRNA58의 키메릭 가이드 염기서열을 나타낸다.
도 3은 키메릭 DNA-RNA 가이드(crRNA의 5' 말단부터 4bp 단위의 DNA 치환)를 사용한 AsCpf1의 표적 유전자((DNMT1: 표적(오렌지색, CCR5: 표적(녹색)) 절단 효율을 나타낸 그래프이다.
도 4는 AsCpf1의 crRNA 부분과 표적 유전자 DNA의 결합부분에서 PAM(TTTN) 염기서열에 가까운 seed 영역에 해당하는 crRNA를 DNA로 치환한 여러 종류의 crRNA를 사용하여, 표적 유전자(DNMT1: 오렌지색, CCR5: 녹색)의 절단 효율을 나타낸 그래프이다.
도 5는 키메릭 DNA-RNA 가이드(crRNA의 3' 말단부터 4bp 단위의 DNA 치환)를 사용한 AsCpf1의 표적 특이성을 확인하기 위한 표적 유전자(DNMT1: 표적(오렌지색), 비표적(파란색, 회색, 노란색)) 절단 효율을 나타낸 그래프이다.
도 6은 키메릭 DNA-RNA 가이드(crRNA의 seed 영역을 DNA로 치환)를 사용한 AsCpf1의 표적 특이성을 확인하기 위한 표적 유전자(DNMT1: 표적(오렌지색), 비표적(파란색, 회색, 노란색)) 절단 효율을 나타낸 그래프이다.
도 7은 키메릭 DNA-RNA 가이드(crRNA의 3'말단부터 4bp 단위의 DNA 치환)를 사용한 AsCpf1의 표적 특이성을 확인하기 위한 표적 유전자(CCR5: 표적(녹색), 비표적(오렌지색, 회색)) 절단 효율을 나타낸 그래프이다.
도 8은 키메릭 DNA-RNA 가이드(crRNA의 seed 영역을 DNA로 치환)를 사용한 AsCpf1의 표적 특이성을 확인하기 위한 표적 유전자(CCR5: 표적(녹색), 비표적(오렌지색, 회색)) 절단 효율을 나타낸 그래프이다.
도 9는 키메릭 DNA-RNA 가이드(crRNA의 3' 말단 4bp, 8bp DNA 치환) 사용한 표적 유전자 및 비표적 유전자(FANCF: 표적(파란색), 비표적(오렌지색, 회색)) 절단 효율을 나타낸 그래프이다.
도 10은 키메릭 DNA-RNA 가이드(crRNA의 3' 말단 4bp, 8bp DNA 치환) 사용한 표적 유전자 및 비표적 유전자(GRIN2B: 표적(파란색), 비표적(오렌지색, 회색))) 절단 효율을 나타낸 그래프이다.
도 11은 키메릭 DNA-RNA 가이드(crRNA의 3' 말단 4bp, 8bp DNA 치환) 사용한 표적 유전자 및 비표적 유전자(EMX1: 표적(파란색), 비표적(오렌지색, 회색)) 절단 효율을 나타낸 그래프이다.
도 12는 (A) 키메릭 DNA-RNA 가이드(crRNA의 3' 말단부터 4bp 단위의 DNA 치환, 숫자는 치환된 DNA 개수)를 사용한 AsCpf1의 DNMT1 표적 특이성 및 (B) 키메릭 DNA-RNA 가이드(crRNA의 seed 영역 DNA 치환)를 사용한 AsCpf1의 DNMT1 표적 특이성을 나타낸 그래프이다.
도 13은 (A) 키메릭 DNA-RNA 가이드(crRNA의 3' 말단부터 4bp 단위의 DNA 치환)를 사용한 AsCpf1의 CCR5 표적 특이성 및 (B) 키메릭 DNA-RNA 가이드(crRNA의 seed 영역 DNA 치환)를 사용한 AsCpf1의 CCR5 표적 특이성을 나타낸 그래프이다.
도 14는 키메릭 DNA-RNA 가이드(crRNA의 3' 말단부터 4bp 단위의 DNA 치환)를 사용한 AsCpf1의 (A) FANCF, (B) GRIN2B 및 (C) EMX1 표적 특이성을 나타낸 그래프이다.
도 15는 키메릭 DNA-RNA 가이드를 사용한 유전자 교정 패턴을 나타낸 그림이다.
도 16은 키메릭 DNA-RNA 가이드(crRNA의 3' 말단부터 4bp 단위의 DNA 치환을 기반으로, 3' 말단 포스포로티오에이트(phosphorothioate, PS) 개량)를 사용한 DNMT1 유전자 및 비표적 절단 효율을 나타낸 그래프이다.
도 17은 3' 말단이 PS로 개량된 키메릭 DNA-RNA 가이드의 표적 특이성을 나타낸 그래프이다.
도 18은 3' 말단 PS 개량된 키메릭 DNA-RNA 가이드(crRNA의 5' 말단부터 4bp 단위의 DNA 치환)를 사용한 세포내 DNMT1 유전자 교정 결과를 나타낸 그림이다.
도 19는 3' 말단 PS 개량된 키메릭 DNA-RNA 가이드(crRNA의 5' 말단부터 4bp 단위의 DNA 치환)를 사용한 세포내 DNMT1 유전자 교정 효율을 나타낸 그림이다. 4T 는 키메릭 가이드 3'끝에 PS를 직접 개질한 것에 비해 활성을 저해하지 않기 위한, 4개의 티미딘(thymine) 염기의 연장을 나타낸다. 4T-PS는 키메릭 가이드 3'끝에 4개의 티미딘 염기를 연장하여 PS로 개질한 것을 나타낸다.
도 20은 DNA 앰플리콘을 이용한 키메릭 DNA-RNA 가이드 기반 AsCpf1, LbCpf1 및 FnCpf1 유전자 가위들의 DNMT1 유전자내 표적 염기서열 절단 효율을 비교한 그래프이다. Cr1, Cr2, Cr3, Cr D+9, Cr D+10, Cr D+11, Cr4, Cr5, Cr6, Cr7 및 Cr8은 각각 표 2의 CrRNA1, CrRNA2, CrRNA3, CrRNA-2, CrRNA3-3, CrRNA3-4, CrRNA4, CrRNA5, CrRNA6, CrRNA7 및 CrRNA8을 나타낸다.
도 21은 키메릭 DNA-RNA 가이드 기반의 FnCpf1 유전자 가위의 DNMT1 표적 유전자와 비표적 유전자의 절단 효율을 나타낸 그래프이다.
도 22는 SpCas9 닉카아제에 의해 생긴 틈(nick)과 CRISPR-Cpf1에 의해 유도된 이중나선 절단 위치를 나타낸 그림이다.
도 23은 DNMT1, GRIN2B, HPRT1, RPL32P3 (각각 A, B, C, D)에 대하여 키메릭 DNA-RNA 가이드(crRNA의 3'말단 4nt, 8nt 길이의 연속된 DNA 치환, +4, +8은 치환된 DNA 갯수)를 이용한 AsCpf1의 유전자 염기서열 타겟 표적 특이성 비교 결과를 나타낸다(On/Off1 비율(specificity)).
도 24는 키메릭 DNA-RNA 가이드 사용한 플라스미드 상 유전자 염기서열에 대한 표적 특이성 조사 결과를 나타낸다. 도 24의 A는 고등동물 세포내 (HEK293FT) 키메릭 DNA-RNA 기반 AsCpf1 전달시, 플라스미드상 표적/비표적 염기서열 교정 효율 비교 결과를 나타내며, 도 24의 B는 플라스미드상 DNMT1 염기서열에 대한 표적/비표적 염기서열 교정 효율 비교 결과를 나타내며, 도 24의 C는 차세대 염기서열 분석에 의한 DNMT1 염기서열에 대한 표적 특이성 비교 결과를 나타내며, 도 24의 D는 플라스미드상 GRIN2B 염기서열에 대한 표적/비표적 염기서열 교정 효율 비교 결과를 나타내며, 도 24의 E는 차세대 염기서열 분석에 의한 GRIN2B 염기서열에 대한 표적 특이성 비교 결과를 나타낸다.
도 25는 CCR5 유전자 표적 3' 말단 PS(phosphorothioate) 개량된 키메릭 가이드와 nickase SpCas9 복합사용에 의한 Cas12a(Cpf1) 유전자 교정 활성도 조사 결과를 나타낸다. 도 25의 A는 HEK293FT 세포내 키메릭 DNA-RNA 기반 Cas12a 와 dead/nickase SpCas9 동시전달에 의한 유전체 교정을 나타내며(표: CCR5 표적 유전자 염기서열과 in-silico 예측된 비표적 염기서열 정보), 도 25의 B는 키메릭 DNA-RNA 기반 Cas12a 와 nickase SpCas9 동시전달에 의한 NGS 유전체 교정 효율 분석 결과를 나타내며(+4DNA: crRNA 3' 말단 4nt DNA 치환, +8DNA: crRNA 3' 말단 8nt DNA 치환, PS: phosphorothioate 를 각각 나타냄), 도 25의 C는 dead/nickase SpCas9 복합 처리에 의한 유전체 교정 특이성 증가를 나타낸다.
도 26은 Affinity column (Ni-NTA resin)을 이용한 유전자 가위 CRISPR-Cas12a(Cpf1) 재조합 단백질의 정제결과. N-terminus에 (6X)His-tag이 결합된 AsCpf1(Acidaminococcus sp. Cpf1) 과 LbCpf1(Cpf1)을 각각 박테리아 세포 안에서 분리/정제하여 순도 90% 이상을 가진 활성화된 유전자 가위 단백질을 확보한 결과를 나타낸다.
도 27의 A는 CCR5 유전자의 표적 특이적 제거를 위한 Cpf1 표적 염기서열. 붉은색은 PAM(TTTN)염기서열, 노란색은 표적 염기서열을 나타내며, 도 27의 B는 CCR5 표적 염기서열(on-target)과 이와 유사한 비표적 염기서열(off-target) 정보를 나타낸다 (비표적 염기서열(Off-target)내 가이드 RNA와 mismatch가 생기는 부분은 붉은색으로 표시됨).
도 28은 키메릭 DNA-RNA 가이드를 사용한 AsCpf1의 동물 세포(HEK293FT)내 비표적 대비 CCR5 유전자 표적 특이성 제고 결과를 나타낸다(NC: negative control, 유전자 가위가 처리되지 않은 대조 실험군, Only Cas12a: Cas12a 단백질만 처리된 대조 실험군, WT crRNA: 기존에 사용되던 RNA 형태의 가이드를 사용한 Cas12a 를 처리함, +8DNA crRNA: 기존 RNA 형태의 가이드에서 3' 말단에 8개 nt를 DNA로 치환한 Cas12a를 처리함)
도 29는 키메릭 DNA-RNA 가이드를 사용한 LbCpf1의 동물 세포(HEK293FT)내 비표적 대비 CCR5 유전자 표적 특이성 증진을 나타낸다(NC: negative control, 유전자 가위가 처리되지 않은 대조 실험군, Only Cas12a: Cas12a 단백질만 처리된 대조 실험군, WT crRNA: 기존에 사용되던 RNA 형태의 가이드를 사용한 Cas12a 를 처리함, +8DNA crRNA: 기존 RNA 형태의 가이드에서 3' 말단에 8개 nt를 DNA로 치환한 Cas12a를 처리함).
도 30은 표적 특이적 발암 유전자 제거 원리로써, 정상유전자BRAF는 자르지 않고 발암유전자 BRAF(1799T>A)만 자를 수 있는 표적 특이성이 제고된 Cpf1유전자 가위를 적용하여 암세포 근원인 발암유전자를 제거하여 암세포를 사멸시키는 모식도를 나타낸다.
도 31은 발암성 BRAF 변이 유전자의 표적 특이적 제거를 위한 Cpf1표적 염기서열을 나타낸다. 도 31의 A는 오랜지색: CRISPR-Cpf1 유전자 가위의 표적 24nt 염기서열, 파란색: CRISPR-Cpf1 유전자 가위가 표적 인식에 필요한 PAM(TTTN) 염기서열, 붉은색: 정상 유전자(1799T) 내에서 발암성 유전자(1799T>A)로 변이가 일어남을 나타내며, 31의 B는 BRAF 유전자내 일어난 점 돌연변이 (MT: 변이 유전자(oncogene), WT: 정상 유전자(proto-oncogene))를 나타낸다.
도 32는 키메릭 DNA-RNA 가이드를 이용한 Cpf1의 정상유전자 대비 발암성 BRAF 변이 유전자 특이성 실험을 나타낸다 (NC: negative control, 유전자 가위가 처리되지 않은 대조 실험군, WT: 기존에 사용되던 RNA 형태의 가이드를 사용한 Cas12a 를 처리, D+8: 기존 RNA 형태의 가이드에서 3' 말단에 8개 nt를 DNA로 치환한 Cas12a를 처리함. Asterisk: 절단된 DNA표시. BRAF MT: 발암 유전자 BRAF(1799T>A), BRAF WT: 정상 유전자 BRAF(1799T)
도 33은 키메릭 DNA-RNA 가이드를 이용한 Cpf1의 정상 유전자 대비 발암 유전자 표적 특이성 증진을 나타낸다. 도 33의 A는 정상 유전자 BRAF(1799T)와 발암 유전자 BRAF(1799T>A)에 대한 기존 wt-crRNA와 DNA 8개 치환된 키메릭 DNA-RNA의 절단 비교 실험을 나타내며, 도 33의 B는 A로부터 계산되어진 값을 표적 특이성(BRAF(1799T>A)에 대한 절단 효율/ BRAF(1799T)에 대한 절단 효율) 으로 나타낸다 (BRAF MT: 발암 유전자 BRAF(1799T>A), BRAF WT: 정상 유전자 BRAF(1799T). NC: negative control, 유전자 가위가 처리되지 않은 대조 실험군, WT-crRNA: 기존에 사용되던 RNA 형태의 가이드를 사용한 Cas12a 를 처리, D+8-crRNA: 기존 RNA 형태의 가이드에서 3' 말단에 8개 nt를 DNA로 치환한 Cas12a를 처리함. BRAF MT/WT ratio: 정상 유전자 BRAF(1799T) 대비 발암 유전자 BRAF(1799T>A)에 대한 절단 표적 특이성).
도 34는 VEGFA 유전자의 표적 특이적 제거를 위한 Cpf1 표적 염기서열을 나타낸다. 구체적으로, 도 34의 A는 혈관생성내피인자(VEGFA)내 표적 염기서열을 나타낸다(파란색: CRISPR-Cpf1 유전자 가위의 표적 24nt 염기서열, 붉은색: CRISPR-Cpf1 유전자 가위가 표적 인식에 필요한 PAM(TTTN) 염기서열). 도 34의 B는 VEGFA 표적 염기서열과 유사한 비표적 염기서열, 염기서열내 붉은색으로 표시된 염기서열들은 Cpf1 가이드 염기서열과 다른 mismatch된 염기들을 나타낸다.
도 35는 키메릭 DNA-RNA 가이드를 이용한 Cpf1의 비표적 대비 VEGFA 유전자 특이성 실험을 나타낸다 (NC: negative control, 유전자 가위가 처리되지 않은 대조 실험군, WT: 기존에 사용되던 RNA 형태의 가이드를 사용한 Cas12a 를 처리, D+8: 기존 RNA 형태의 가이드에서 3' 말단에 8개 nt를 DNA로 치환한 Cas12a를 처리함. Asterisk: 절단된 DNA표시. VEGFA on-target: 혈관생성내피인자(VEGFA)내 표적 염기서열, VEGFA off-target: VEGFA 표적 염기서열과 유사한 비표적 염기서열).
도 36은 키메릭 DNA-RNA 가이드를 이용한 Cpf1의 비표적 대비 VEGFA 유전자 표적 특이성 증진을 나타낸다. 도 36의 A는 VEGFA on-target과 VEGFA off-target에 대한 기존 WT-crRNA와 DNA 8개 치환된 키메릭 DNA-RNA의 절단 비교 실험을 나타내며, 도 36의 B는 A로부터 계산되어진 값을 표적 특이성(VEGFA on-target에 대한 절단 효율/ VEGFA off-target에 대한 절단 효율) 으로 나타낸다(NC: negative control, 유전자 가위가 처리되지 않은 대조 실험군, WT-crRNA: 기존에 사용되던 RNA 형태의 가이드를 사용한 Cas12a 를 처리, D+8-crRNA: 기존 RNA 형태의 가이드에서 3' 말단에 8개 nt를 DNA로 치환한 Cas12a를 처리함. VEGFA on-target: 혈관생성내피인자(VEGFA)내 표적 염기서열, VEGFA off-target: VEGFA 표적 염기서열과 유사한 비표적 염기서열).
이하 본 발명을 하나 이상의 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. Cpf1 재조합 단백질의 정제와 키메릭 DNA-RNA 가이드의 합성
키메릭(chimeric) DNA-RNA 가이드를 합성하기 위하여, 먼저 알려진 Cpf1 단백질 중에서 구조적으로 가이드 RNA와 상호작용이 잘 규명된 AsCpf1(Acidaminococcus sp. Cpf1) 재조합 단백질을 정제하였다.
구체적으로, pET28a-Cas12a(AsCpf1) 박테리아 발현 벡터를 E.coli BL21(DE3)종에 형질전환 진행한 후, OD=0.6까지 37℃에서 배양하였다. IPTG를 접종하고 48시간 후에 박테리아 세포들을 침전하여 배양액을 제거하고, 남은 침전물을 bufferA[20mM Tris-HCl(pH8.0), 300mM NaCl, 10mM β-mercaptoethanol, 1% TritonX-100, 1mM PMSF]로 재용해하였다. 이후, 얼음상에서 3분 동안 초음파파쇄(sonication)하여 박테리아 세포막을 부수고, 원심분리(5000rpm, 10min)후 세포 용해물(lysate)을 수득(harvest)하였다. 그 다음, bufferB[20mM Tris-HCl(pH8.0), 300nM NaCl]로 전-세척(pre-washing)된 Ni-NTA resin과 초음파 파쇄된 세포내 용액을 혼합하고, 4℃에서 1시간 30분 동안 교반하였다. 박테리아 세포 침전 이후 bufferB[20mM Tris-HCl(pH8.0), 300nM NaCl]를 사용, 10배 volume으로 세척하여 비-특이적 결합 성분(non-specific binding component)을 제거하고, bufferC[20mM Tris-HCl(pH8.0), 300nM NaCl, 200mM Imidazole]를 사용하여 AsCpf1 단백질을 용출하여 고순도의 DNA 절단 활성이 있는 단백질을 정제하였다. 용출된 단백질은 bufferE[200mM NaCl, 50mM HEPES(pH7.5), 1mM DTT, 40% glycerol]로 centricon(Amicon Ultra,)를 사용하여 교환해주고 -80℃에 분주하여 보관하였다.
키메릭 DNA-RNA 가이드는 각 목표 유전자 내 타겟으로 하는 염기서열(표 2 내지 표 4)에 맞추어 일괄 합성 주문 제작하였다(bioneer). 표 4의 hDNMT1 crRNA2-2, hDNMT1 crRNA2-4, hDNMT1 crRNA3-2 및 hDNMT1 crRNA3-4 키메릭 가이드의 3' 말단은 포스포로티오에이트(phosphorothioate, PS)로 개량되었다. 표 2 내지 4에서 볼드체로 표시된 염기는 DNA 염기서열에 해당한다.
도면상에서, 표 2 내지 표 4의 키메릭 가이드를 'Cr + nunber'로 간략히 표기하였다. 예를 들어, 'hDNMT1 crRNA1'은 'Cr1'으로, 'hFANCF crRNA82-2'은 'Cr82-2'로 표기하였다.
표적 유전자 위치 구분 염기서열(5'→3') 서열번호
hDNMT1
crRNA1		 AsCpf1 표적 TTTCCTGATGGTCCATGTCTGTTACTCG 서열번호 1
키메릭 가이드 AAUUUCUACUCUUGUAGAUCUGAUGGUCCAUGUCUGUUACUCG 서열번호 2
hDNMT1
crRNA2		 AsCpf1 표적 TTTCCTGATGGTCCATGTCTGTTACTCG 서열번호 3
키메릭 가이드 AAUUUCUACUCUUGUAGAUCUGAUGGUCCAUGUCUGUUACTCG 서열번호 4
hDNMT1
crRNA3		 AsCpf1 표적 TTTCCTGATGGTCCATGTCTGTTACTCG 서열번호 5
키메릭 가이드 AAUUUCUACUCUUGUAGAUCUGAUGGUCCAUGUCUGTTACTCG 서열번호 6
hDNMT1
crRNA3-2		 AsCpf1 표적 TTTCCTGATGGTCCATGTCTGTTACTCG 서열번호 7
키메릭 가이드 AAUUUCUACUCUUGUAGAUCUGAUGGUCCAUGUCUGTTACTCG 서열번호 8
hDNMT1
crRNA3-3		 AsCpf1 표적 TTTCCTGATGGTCCATGTCTGTTACTCG 서열번호 9
키메릭 가이드 AAUUUCUACUCUUGUAGAUCUGAUGGUCCAUGUCUGTTACTCG 서열번호 10
hDNMT1
crRNA3-4		 AsCpf1 표적 TTTCCTGATGGTCCATGTCTGTTACTCG 서열번호 11
키메릭 가이드 AAUUUCUACUCUUGUAGAUCUGAUGGUCCAUGUCUGTTACTCG 서열번호 12
hDNMT1
crRNA4		 AsCpf1 표적 TTTCCTGATGGTCCATGTCTGTTACTCG 서열번호 13
키메릭 가이드 AAUUUCUACUCUUGUAGAUCUGAUGGUCCAUGTCTGTTACTCG 서열번호 14
hDNMT1
crRNA5		 AsCpf1 표적 TTTCCTGATGGTCCATGTCTGTTACTCG 서열번호 15
키메릭 가이드 AAUUUCUACUCUUGUAGAUCUGAUGGUCCATGTCTGTTACTCG 서열번호 16
hDNMT1
crRNA6		 AsCpf1 표적 TTTCCTGATGGTCCATGTCTGTTACTCG 서열번호 17
키메릭 가이드 AAUUUCUACUCUUGUAGAUCUGATGGTCCATGTCTGTTACTCG 서열번호 18
hDNMT1
crRNA7		 AsCpf1 표적 TTTCCTGATGGTCCATGTCTGTTACTCG 서열번호 19
키메릭 가이드 AAUUUCUACUCUUGUAGAUCTGATGGTCCATGTCTGTTACTCG 서열번호 20
hDNMT1
crRNA8		 AsCpf1 표적 TTTCCTGATGGTCCATGTCTGTTACTCG 서열번호 21
키메릭 가이드 AATTTCTACTCTTGTAGATCTGATGGTCCATGTCTGTTACTCG 서열번호 22
hDNMT1
crRNA9		 AsCpf1 표적 TTTCCTGATGGTCCATGTCTGTTACTCG 서열번호 23
키메릭 가이드 AATTUCUACUCUUGUAGAUCUGAUGGUCCAUGUCUGUUACUCG 서열번호 24
hDNMT1
crRNA10		 AsCpf1 표적 TTTCCTGATGGTCCATGTCTGTTACTCG 서열번호 25
키메릭 가이드 AATTTCTACUCUUGUAGAUCUGAUGGUCCAUGUCUGUUACUCG 서열번호 26
hDNMT1
crRNA11		 AsCpf1 표적 TTTCCTGATGGTCCATGTCTGTTACTCG 서열번호 27
키메릭 가이드 AATTTCTACTCTUGUAGAUCUGAUGGUCCAUGUCUGUUACUCG 서열번호 28
hDNMT1
crRNA12		 AsCpf1 표적 TTTCCTGATGGTCCATGTCTGTTACTCG 서열번호 29
키메릭 가이드 AATTTCTACTCTTGTAGAUCUGAUGGUCCAUGUCUGUUACUCG 서열번호 30
hDNMT1
crRNA13		 AsCpf1 표적 TTTCCTGATGGTCCATGTCTGTTACTCG 서열번호 31
키메릭 가이드 AATTTCTACTCTTGTAGATCUGAUGGUCCAUGUCUGUUACUCG 서열번호 32
hDNMT1
crRNA14		 AsCpf1 표적 TTTCCTGATGGTCCATGTCTGTTACTCG 서열번호 33
키메릭 가이드 AAUUUCUACUCUUGUAGAUCTGAUGGUCCAUGUCUGUUACUCG 서열번호 34
hDNMT1
crRNA15		 AsCpf1 표적 TTTCCTGATGGTCCATGTCTGTTACTCG 서열번호 35
키메릭 가이드 AAUUUCUACUCUUGUAGAUCTGATGGTCCAUGUCUGUUACUCG 서열번호 36
hDNMT1
crRNA16		 AsCpf1 표적 TTTCCTGATGGTCCATGTCTGTTACTCG 서열번호 37
키메릭 가이드 AAUUUCUACUCUUGUAGAUCTGATGGTCCATGUCUGUUACUCG 서열번호 38
hDNMT1
crRNA17		 AsCpf1 표적 TTTCCTGATGGTCCATGTCTGTTACTCG 서열번호 39
키메릭 가이드 AAUUUCUACUCUUGUAGAUCUGAUGGUCCAUGUCUGUUACUCG 서열번호 40
hDNMT1
crRNA18		 AsCpf1 표적 TTTCCTGATGGTCCATGTCTGTTACTCG 서열번호 41
키메릭 가이드 AAUUUCUACUCUUGUAGAUCTGAUGGUCCAUGUCUGUUACUCG 서열번호 42
hDNMT1
crRNA19		 AsCpf1 표적 TTTCCTGATGGTCCATGTCTGTTACTCG 서열번호 43
키메릭 가이드 AAUUUCUACUCUUGUAGAUCUGAUGGUCCAUGUCUGUUACUCG 서열번호 44
hDNMT1
crRNA20		 AsCpf1 표적 TTTCCTGATGGTCCATGTCTGTTACTCG 서열번호 45
키메릭 가이드 AAUUUCUACUCUUGUAGAUCUGAUGGUCCAUGUCUGUUACUCG 서열번호 46
hDNMT1
crRNA21		 AsCpf1 표적 TTTCCTGATGGTCCATGTCTGTTACTCG 서열번호 47
키메릭 가이드 AAUUUCUACUCUUGUAGAUCUGATGGUCCAUGUCUGUUACUCG 서열번호 48
hDNMT1
crRNA22		 AsCpf1 표적 TTTCCTGATGGTCCATGTCTGTTACTCG 서열번호 49
키메릭 가이드 AAUUUCUACUCUUGUAGAUCUGAUGGUCCAUGUCUGUUACUCG 서열번호 50
hDNMT1
crRNA23		 AsCpf1 표적 TTTCCTGATGGTCCATGTCTGTTACTCG 서열번호 51
키메릭 가이드 AAUUUCUACUCUUGUAGAUCUGAUGGUCCAUGUCUGUUACUCG 서열번호 52
hDNMT1
crRNA24		 AsCpf1 표적 TTTCCTGATGGTCCATGTCTGTTACTCG 서열번호 53
키메릭 가이드 AAUUUCUACUCUUGUAGAUCUGAUGGTCCAUGUCUGUUACUCG 서열번호 54
hDNMT1
crRNA25		 AsCpf1 표적 TTTCCTGATGGTCCATGTCTGTTACTCG 서열번호 55
키메릭 가이드 AAUUUCUACUCUUGUAGAUCUGAUGGUCCAUGUCUGUUACUCG 서열번호 56
hDNMT1
crRNA26		 AsCpf1 표적 TTTCCTGATGGTCCATGTCTGTTACTCG 서열번호 57
키메릭 가이드 AAUUUCUACUCUUGUAGAUCUGAUGGUCCAUGUCUGUUACUCG 서열번호 58
hDNMT1
crRNA27		 AsCpf1 표적 TTTCCTGATGGTCCATGTCTGTTACTCG 서열번호 59
키메릭 가이드 AAUUUCUACUCUUGUAGAUCUGAUGGUCCAUGUCUGUUACUCG 서열번호 60
표적 유전자 위치 구분 염기서열(5'→3') 서열번호
hCCR5
crRNA51		 AsCpf1 표적 TTTGTGCACAGGGTGGAACAAGATGGAT 서열번호 61
키메릭 가이드 AAUUUCUACUCUUGUAGAUUGCACAGGGUGGAACAAGAUGGAU 서열번호 62
hCCR5
crRNA52		 AsCpf1 표적 TTTGTGCACAGGGTGGAACAAGATGGAT 서열번호 63
키메릭 가이드 AAUUUCUACUCUUGUAGAUUGCACAGGGUGGAACAAGAUGGAT 서열번호 64
hCCR5
crRNA53		 AsCpf1 표적 TTTGTGCACAGGGTGGAACAAGATGGAT 서열번호 65
키메릭 가이드 AAUUUCUACUCUUGUAGAUUGCACAGGGUGGAACAAGATGGAT 서열번호 66
hCCR5
crRNA54		 AsCpf1 표적 TTTGTGCACAGGGTGGAACAAGATGGAT 서열번호 67
키메릭 가이드 AAUUUCUACUCUUGUAGAUUGCACAGGGUGGAACAAGATGGAT 서열번호 68
hCCR5
crRNA55		 AsCpf1 표적 TTTGTGCACAGGGTGGAACAAGATGGAT 서열번호 69
키메릭 가이드 AAUUUCUACUCUUGUAGAUUGCACAGGGTGGAACAAGATGGAT 서열번호 70
hCCR5
crRNA56		 AsCpf1 표적 TTTGTGCACAGGGTGGAACAAGATGGAT 서열번호 71
키메릭 가이드 AAUUUCUACUCUUGUAGAUUGCACAGGGTGGAACAAGATGGAT 서열번호 72
hCCR5
crRNA57		 AsCpf1 표적 TTTGTGCACAGGGTGGAACAAGATGGAT 서열번호 73
키메릭 가이드 AAUUUCUACUCUUGUAGAUTGCACAGGGTGGAACAAGATGGAT 서열번호 74
hCCR5
crRNA58		 AsCpf1 표적 TTTGTGCACAGGGTGGAACAAGATGGAT 서열번호 75
키메릭 가이드 AATTTCTACTCTTGTAGATTGCACAGGGTGGAACAAGATGGAT 서열번호 76
hCCR5
crRNA61		 AsCpf1 표적 TTTGTGCACAGGGTGGAACAAGATGGAT 서열번호 77
키메릭 가이드 AAUUUCUACUCUUGUAGAUTGCACAGGGUGGAACAAGAUGGAU 서열번호 78
hCCR5
crRNA62		 AsCpf1 표적 TTTGTGCACAGGGTGGAACAAGATGGAT 서열번호 79
키메릭 가이드 AAUUUCUACUCUUGUAGAUUGCACAGGGUGGAACAAGAUGGAU 서열번호 80
hCCR5
crRNA63		 AsCpf1 표적 TTTGTGCACAGGGTGGAACAAGATGGAT 서열번호 81
키메릭 가이드 AAUUUCUACUCUUGUAGAUUGCACAGGGUGGAACAAGAUGGAU 서열번호 82
hCCR5
crRNA64		 AsCpf1 표적 TTTGTGCACAGGGTGGAACAAGATGGAT 서열번호 83
키메릭 가이드 AAUUUCUACUCUUGUAGAUUGCACAGGGUGGAACAAGAUGGAU 서열번호 84
hCCR5
crRNA65		 AsCpf1 표적 TTTGTGCACAGGGTGGAACAAGATGGAT 서열번호 85
키메릭 가이드 AAUUUCUACUCUUGUAGAUUGCACAGGGUGGAACAAGAUGGAU 서열번호 86
hCCR5
crRNA66		 AsCpf1 표적 TTTGTGCACAGGGTGGAACAAGATGGAT 서열번호 87
키메릭 가이드 AAUUUCUACUCUUGUAGAUUGCACAGGGUGGAACAAGAUGGAU 서열번호 88
hCCR5
crRNA67		 AsCpf1 표적 TTTGTGCACAGGGTGGAACAAGATGGAT 서열번호 89
키메릭 가이드 AAUUUCUACUCUUGUAGAUUGCACAGGGUGGAACAAGAUGGAU 서열번호 90
hCCR5
crRNA68		 AsCpf1 표적 TTTGTGCACAGGGTGGAACAAGATGGAT 서열번호 91
키메릭 가이드 AAUUUCUACUCUUGUAGAUUGCACAGGGUGGAACAAGAUGGAU 서열번호 92
hCCR5
crRNA69		 AsCpf1 표적 TTTGTGCACAGGGTGGAACAAGATGGAT 서열번호 93
키메릭 가이드 AAUUUCUACUCUUGUAGAUUGCACAGGGUGGAACAAGAUGGAU 서열번호 94
hCCR5
crRNA70		 AsCpf1 표적 TTTGTGCACAGGGTGGAACAAGATGGAT 서열번호 95
키메릭 가이드 AAUUUCUACUCUUGUAGAUUGCACAGGGTGGAACAAGAUGGAU 서열번호 96
hFANCF
crRNA81		 AsCpf1 표적 TTTGGTCGGCATGGCCCCATTCGCACGG 서열번호 97
키메릭 가이드 AAUUUCUACUCUUGUAGAUGUCGGCAUGGCCCCAUUCGCACGG 서열번호 98
hFANCF
crRNA82		 AsCpf1 표적 TTTGGTCGGCATGGCCCCATTCGCACGG 서열번호 99
키메릭 가이드 AAUUUCUACUCUUGUAGAUGUCGGCAUGGCCCCAUUCGCACGG 서열번호 100
hFANCF
crRNA82-2		 AsCpf1 표적 TTTGGTCGGCATGGCCCCATTCGCACGG 서열번호 101
키메릭 가이드 AAUUUCUACUCUUGUAGAUGUCGGCAUGGCCCCAUTCGCACGG 서열번호 102
hFANCF
crRNA83		 AsCpf1 표적 TTTGGTGCTCAATGAAAGGAGATAAGGT 서열번호 103
키메릭 가이드 AAUUUCUACUCUUGUAGAUGUGCUCAAUGAAAGGAGAUAAGGU 서열번호 104
hFANCF
crRNA84		 AsCpf1 표적 TTTGGTGCTCAATGAAAGGAGATAAGGT 서열번호 105
키메릭 가이드 AAUUUCUACUCUUGUAGAUGUGCUCAAUGAAAGGAGAUAAGGT 서열번호 106
hFANCF
crRNA84-2		 AsCpf1 표적 TTTGGTGCTCAATGAAAGGAGATAAGGT 서열번호 107
키메릭 가이드 AAUUUCUACUCUUGUAGAUGUGCUCAAUGAAAGGAGATAAGGT 서열번호 108
hEMX1
crRNA85		 AsCpf1 표적 TTTGTCCTCCGGTTCTGGAACCACACCT 서열번호 109
키메릭 가이드 AAUUUCUACUCUUGUAGAUUCCUCCGGUUCUGGAACCACACCU 서열번호 110
hEMX1
crRNA86		 AsCpf1 표적 TTTGTCCTCCGGTTCTGGAACCACACCT 서열번호 111
키메릭 가이드 AAUUUCUACUCUUGUAGAUUCCUCCGGUUCUGGAACCACACCT 서열번호 112
hEMX1
crRNA86-2		 AsCpf1 표적 TTTGTCCTCCGGTTCTGGAACCACACCT 서열번호 113
키메릭 가이드 AAUUUCUACUCUUGUAGAUUCCUCCGGUUCUGGAACCACACCT 서열번호 114
표적 유전자 위치 구분 염기서열(5'→3') 서열번호
hDNMT1
crRNA2-2		 AsCpf1 표적 TTTCCTGATGGTCCATGTCTGTTACTCG 서열번호 115
키메릭 가이드 AAUUUCUACUCUUGUAGAUCUGAUGGUCCAUGUCUGUUACTCG 서열번호 116
hDNMT1
crRNA2-3		 AsCpf1 표적 TTTCCTGATGGTCCATGTCTGTTACTCG 서열번호 117
키메릭 가이드 AAUUUCUACUCUUGUAGAUCUGAUGGUCCAUGUCUGUUACTCGTTTT 서열번호 118
hDNMT1
crRNA2-4		 AsCpf1 표적 TTTCCTGATGGTCCATGTCTGTTACTCG 서열번호 119
키메릭 가이드 AAUUUCUACUCUUGUAGAUCUGAUGGUCCAUGUCUGUUACTCGTTT 서열번호 120
hDNMT1
crRNA3-2		 AsCpf1 표적 TTTCCTGATGGTCCATGTCTGTTACTCG 서열번호 121
키메릭 가이드 AAUUUCUACUCUUGUAGAUCUGAUGGUCCAUGUCUGTTACTCG 서열번호 122
hDNMT1
crRNA3-3		 AsCpf1 표적 TTTCCTGATGGTCCATGTCTGTTACTCG 서열번호 123
키메릭 가이드 AAUUUCUACUCUUGUAGAUCUGAUGGUCCAUGUCUGTTACTCGTTTT 서열번호 124
hDNMT1
crRNA3-4		 AsCpf1 표적 TTTCCTGATGGTCCATGTCTGTTACTCG 서열번호 125
키메릭 가이드 AAUUUCUACUCUUGUAGAUCUGAUGGUCCAUGUCUGTTACTCGTTT 서열번호 126
실시예 2. Cpf1 가이드 RNA의 부분적인 DNA 치환에 따른 유전체 절단 효율 분석
Cpf1 단백질과 가이드의 상호작용이 제시된 구조 모델을 바탕으로 표적 DNA 염기서열과 가이드 RNA의 결합 에너지를 줄이기 위하여 DNA-RNA 접합에 의해 형성되는 proto-spacer로 인식되는 부분을 DNA 염기서열로 교체하였다(도 1). 또한, 이러한 proto-spacer 영역을 포함, 전체적인 DNA 구조로써 가이드를 인식할 수 있는지 여부도 확인하였다. 3' 말단 쪽에서부터 시작하여 4개씩 가이드 시퀀스를 DNA로 순차적으로 치환하였을 때, 목표 유전자 DNA(DNMT1, CCR5)에 대하여 절단 효율을 비교분석 하였다.
구체적으로, 각 유전자위(DNMT1, CCR5)에 해당하는 DNA 프라이머(표 5)를 이용하여 게놈 DNA(HEK293FT)로부터 PCR 앰프리콘(amplicon)(DNMT1, CCR5, FANCF, GRIN2B, EMX1)을 얻었다. 차세대 염기서열 분석(NGS)에 사용된 정방향 어답터(forward adaptor) 및 역방향 어답터(reverse adaptor) 프라이머의 염기서열은 각각 볼드체로 나타내었다.
프라이머 프라이머 염기서열(5'→3') 서열번호
hDNMT1 on-target F1 GTTGCACGTGTCAAGTGCTTA 서열번호 127
hDNMT1 on-target R1 TTAAAATCCAGAATGCACAAAGTACT 서열번호 128
hDNMT1 on-target F2 GTGAATTTGGCTCAGCAGGCA 서열번호 129
hDNMT1 on-target R2 AAGCGAACCTCACACAACAGC 서열번호 130
hDNMT1 off-target1 F1 TTGACGGCAGTATTACAGGTAG 서열번호 131
hDNMT1 off-target1 R1 AAGGTCAAATGCCGTTTAACCA 서열번호 132
hDNMT1 off-target1 F2 GTAGTCAGGCATGAGTGGCA 서열번호 133
hDNMT1 off-target1 R2 TGCCTCTTTCCCAGGATTCT 서열번호 134
hDNMT1 off-target2 F1 TCTCAGGCAAGTCACAACTCT 서열번호 135
hDNMT1 off-target2 R1 TAGGCACATGAAGGTCAAATGC 서열번호 136
hDNMT1 off-target2 F2 GTTACAGGTAGTTAAGCAGGCA 서열번호 137
hDNMT1 off-target2 R2 AAATGCCATATTTAACCGTGATCCT 서열번호 138
hDNMT1 off-target3 F1 TCATGCCTTTCTGGGTCTCAT 서열번호 139
hDNMT1 off-target3 R1 CACCTGACCTCTGTCACTTTA 서열번호 140
hDNMT1 off-target3 F2 CTGTTCAGGGAATGGAAAGTGA 서열번호 141
hDNMT1 off-target3 R2 CTACATCTACGCTCTCCCCA 서열번호 142
hCCR5 on-target F1 AAGGCTGAGCTGCACCATGC 서열번호 143
hCCR5 on-target R1 AGGATGATGAAGAAGATTCCA 서열번호 144
hCCR5 on-target F2 CATTCACTCCATGGTGCTATA 서열번호 145
hCCR5 on-target R2 ATAGAGCCCTGTCAAGAGTTGA 서열번호 146
hCCR5 off-target1 F1 AGAAATAGGAGTCTTCATGCCC 서열번호 147
hCCR5 off-target1 R1 TGGGGTCAATGAGAGGAGTATT 서열번호 148
hCCR5 off-target1 F2 TAGCAAGGAACCTCAAAGTGC 서열번호 149
hCCR5 off-target1 R2 CTGCTTCCAATACAATCCACAC 서열번호 150
hCCR5 off-target2 F1 TAGTGCTGAAAGCTCAGAGAG 서열번호 151
hCCR5 off-target2 R1 TTCGAGAGCCACACATGAAG 서열번호 152
hCCR5 off-target2 F2 AGAGAGGGGGTCATAGACTTT 서열번호 153
hCCR5 off-target2 R2 ACCTTCCAGCCGGTATATTAAT 서열번호 154
hFANCF on-target F1 TGAAAGCGGAAGTAGGGCCT 서열번호 155
hFANCF on-target R1 CTCCGCCTGGGTCTTCATCA 서열번호 156
hFANCF on-target F2 GGAAGTAGGGCCTTCGCGCA 서열번호 157
hFANCF on-target R2 CCTCCTGGAGATTTGGGTTC 서열번호 158
hFANCF off-target1 F1 CCTGTAAGCCCTAAGCAAGTC 서열번호 159
hFANCF off-target1 R1 GTCAAGTTCTACTCAAGGCCAT 서열번호 160
hFANCF off-target1 F2 CTGTCCTGTAGAGACTTCTGG 서열번호 161
hFANCF off-target1 R2 GTGGTGGAGGGAAGCTTATTTT 서열번호 162
hFANCF off-target2 F1 TGGGGTAGGTCTTCAGGAAA 서열번호 163
hFANCF off-target2 R1 CGTTCTAAATTCTCTACAGTCAAC 서열번호 164
hFANCF off-target2 F2 TCGTGCTAAGTTACCGAGTT 서열번호 165
hFANCF off-target2 R2 GCAATAGTTTTGAGCCAGTGA 서열번호 166
hGRIN2B on-target F1 ACCTCTGCTGAGCACGTTTT 서열번호 167
hGRIN2B on-target R1 GACAGCAATGCCAATGCTGG 서열번호 168
hGRIN2B on-target F2 CTCACTTTGTCTGGCCTTGC 서열번호 169
hGRIN2B on-target R2 CTTCTGAGAACGAGCTCTGC 서열번호 170
hGRIN2B off-target1 F1 TGACTGCAATTTTGGGTTCCATC 서열번호 171
hGRIN2B off-target1 R1 GCCACTGCCATTTATTATGTAAC 서열번호 172
hGRIN2B off-target1 F2 GTCTAATTACACTTGCCATACCT 서열번호 173
hGRIN2B off-target1 R2 GAAATCCAGCTGTGACTAAATATG 서열번호 174
hGRIN2B off-target2 F1 GGAGCACAATGAGTGTTTTT 서열번호 175
hGRIN2B off-target2 R1 GTCTTTTCCTGGTCACATGG 서열번호 176
hGRIN2B off-target2 F2 GCCAGAAATGTTATTCCATAGTAG 서열번호 177
hGRIN2B off-target2 R2 CAGTGTTCTTACATATCAGACAC 서열번호 178
hEMX1 on-target F1 ACTACTCACATCCACTCTGTGAAG 서열번호 179
hEMX1 on-target R1 GAGTGGCCAGAGTCCAGCTT 서열번호 180
hEMX1 on-target F2 TAGAGGAGCTAGGATGCACAGCA 서열번호 181
hEMX1 on-target R2 GCAGCAAGCAGCACTCTGCC 서열번호 182
hEMX1 off-target1 F1 CAGAGCCTGGAGAATTGATAG 서열번호 183
hEMX1 off-target1 R1 CTGGGGAGCAGAATAAATTATTG 서열번호 184
hEMX1 off-target1 F2 GAATAGACCTGGGATGTGCAG 서열번호 185
hEMX1 off-target1 R2 GGAACCTGAAGAATGGGATTG 서열번호 186
hEMX1 off-target2 F1 AGATTGAGATCATCCACCCT 서열번호 187
hEMX1 off-target2 R1 AAAACAGAGAGGTTGAGTCTC 서열번호 188
hEMX1 off-target2 F2 TGTCCACCATGTCCCAGAAG 서열번호 189
hEMX1 off-target2 R2 ACAAAGAAGGGCATCTCCAG 서열번호 190
hDNMT1_Adaptor_F ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAGTGTTCAGTCTCCGTGAACGTTC 서열번호 191
hDNMT1_Adaptor_R GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTCCTTAGCAGCTTCCTCCTCCTT 서열번호 192
hCCR5_Adaptor_F ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAACAGTTTGCATTCATGGAGGGC 서열번호 193
hCCR5_Adaptor_R GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGTTTATCAGGATGAGGATGACC 서열번호 194
hFANCF_Adaptor_F ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCACTACCTACGTCAGCACCTGGGACC 서열번호 195
hFANCF_Adaptor_R GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGAAGTTCGCTAATCCCGGAACTGGA 서열번호 196
hGRIN2B_Adaptor_F ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCTCTCATTCTGCAGAGCAAATACCAGAGAT 서열번호 197
hGRIN2B_Adaptor_R GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCTGCAAACACAAAGAAAGAGCATGTTAAA 서열번호 198
hEMX1_Adaptor_F ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGGCCTCCTGAGTTTCTCATCTGTGC 서열번호 199
hEMX1_Adaptor_R GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCTGCTTCGTGGCAATGCGCCAC 서열번호 200
정제된 재조합 AsCpf1 및 실시예 1에서 합성한 각 유전자위에 해당하는 키메릭 RNA-DNA 가이드(Bioneer) 또는 정제된 crRNA를 premix하고, 절단 버퍼(cleavage buffer)(NEB3, 10㎕ volumn) 조건에서, 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 반응 이후, 정지 버퍼(stop buffer)(100mM EDTA, 1.2% SDS)를 넣어 반응을 중지시키고, 2% 아가로스 젤 전기영동으로 DNA 절단 여부를 확인하였다.
DNA 절단 효율은, 절단된 이미지 패턴을 imageJ 프로그램을 사용하여 측정된 벤드 강도 프로파일(band intensity profile) 값을 하기의 식에 따라 계산하였다.
[절단된 단편의 강도(intensity of the cleaved fragment)/단편 강도의 총 합(total sum of the fragment intensity)]×100 = DNA 절단 효율(%)
그 결과, 대체로 3' 말단에서부터 대략 +10개까지의 DNA 치환은 목표 유전자 염기서열 절단 효율에 크게 영향을 주지 않은 것으로 확인되었다(도 2). 그러나, 가이드에서 12개 이상의 연속된 DNA 치환은 심각한 온-타겟(on-target) 절단 효율 저하를 유도한 것으로 확인되었다. 즉, Cpf1이 인식하는 가이드의 2'-OH 민감도가 seed 부분에서 먼 영역에서 가까운 영역으로 갈수록 더 커진다는 것으로 확인되었다. 반면, proto-spacer 이외의 영역인 5' 말단의 pseudoknot 구조에서 끝으로부터 순차적으로 4nt씩 바꾸어 나갔을 때의 표적 DNA 절단 효율의 경우, wild-type 가이드 대비 키메릭 DNA-RNA 형태의 가이드에서 절단 효율이 현저하게 감소한 것으로 확인되었다(도 3).
실시예 3. Cpf1 RNA 가이드 Seed 부분의 DNA 치환에 따른 유전체 절단 효율 분석
연속적인 DNA 치환에 따른 타겟 DNA 절단실험에 이어, 구체적으로 타겟 DNA와 가이드의 seed 영역 2'-OH의 어느 부분이 Cpf1의 아미노산에 의하여 인식되는지 확인하였다.
두 개의 유전자(DNMT1, CCR5)에 대하여, PAM(TTTN) 염기서열로부터 가까운 seed 부분에서의 RNA 가이드 단일 염기 DNA 치환에 따라 유전체 절단 효율을 실시예 2의 방법과 동일한 방법으로 수행하였다.
그 결과, PAM 염기서열 위치부터 7 내지 10개까지의 부분에서 DNA 절단 효율이 감소된 것으로 확인되었다(도 4). 즉, DNMT1 유전자와 CCR5 유전자의 염기서열 종류에 따라 2'-OH의 인식이 바뀔 수 있는 것으로 확인되었다.
한편, PAM 염기서열에 가까운 부분에 상보 접합하는 RNA 가이드에서 4개의 염기를 DNA로 치환한 결과, 단일 염기의 DNA 치환 대비 절단 효율이 현저히 저하된 것으로 확인되었다(도 4).
실시예 2 및 실시예 3의 결과를 통하여, 가이드의 seed 또는 5'영역의 DNA 치환 대비 가이드내 3' 영역(대략 +10까지)의 DNA 치환이 표적 DNA의 절단 활성의 유지에 효과적인 것으로 확인되었다. 따라서, off-target 절단 효율에 대한 정확성 실험에서, 3' 영역이 DNA 치환된 가이드를 스크리닝 실험군으로 사용하였다.
실시예 4. 키메릭 DNA-RNA 가이드를 사용한 표적 유전자별 절단 특이성 분석
DNA의 치환에 따른 효과적인 가이드를 스크리닝하기 위하여, 비표적 절단 성질을 확인하기 위해 다양한 유전자(DNMT1, CCR5, FANCF, GRIN2B, EMX1)에서 온-타겟 및 오프-타겟 절단 효율을 각각 측정하였다.
구체적으로, in silico(Cas-offinder) 방식으로 각각의 유전자 표적 염기서열(on-target)에 대한 유사 염기서열(off-target)을 선정하여 온-타겟 및 오프-타겟 절단 효율을 실시예 2의 방법으로 각각 계산하였고(도 5 내지 도 11), 이에 대한 비율을 산출하였다(도 12 내지 도 14).
표 2 내지 4의 키메릭 가이드를 사용하여 DNMT1 타겟에 대하여 절단 효율을 측정한 결과, 가이드의 3' 말단 DNA 치환의 경우 온-타겟 절단 보상(compensation) 없이 대략 10개 치환, 구체적으로 8개 치환까지 특이성(specificity)이 증가한 것으로 확인되었다(도 12A). Seed region의 단일 염기 DNA 치환의 경우, PAM으로부터 10개까지의 변화는 표적 DNA 절단 특이성이 감소하는 경향을 나타냈으며, 특히 seed region 안에서 연속적인 변화는 온-타겟 보상이 크게 증가하여 오프-타겟 절단 대비 특이성이 급격하게 줄어드는 경향을 나타낸 것으로 확인되었다(도 12B).
CCR5 유전자 염기서열을 표적한 경우, 가이드의 순차적인 3' 말단 DNA 치환시 온-타겟 절단은 DNMT1 타겟의 경우와 유사하였고, 비특이적 절단이 측정되지 않아 특이성은 비슷한 경향을 나타내는 것으로 확인되었다(도 7). Seed region의 가이드 단일 염기 DNA 치환을 적용하여 CCR5 유전자를 절단한 경우, PAM으로부터 2, 4, 5 및 7 번째에서 특이성이 감소되었고 나머지는 wild-type RNA 가이드와 유사한 수준으로 측정되었다(도 8).
즉, 가이드의 3' 말단으로부터 대략 8번째까지의 연속된 DNA 치환이 연속된 seed region의 DNA 치환보다 온-타겟 보상이 적고 특이성이 높은 것으로 확인되었다. 따라서, 3' 말단 영역이 치환된 키메릭 DNA-RNA 가이드를 사용하여 보다 다양한 유전자 염기서열을 타겟하여 on/off 절단 비율을 확인하였다(도 9 내지 도 11, 및 도 14).
In vitro 절단을 유도한 결과, 다른 3개 유전자의 염기서열 상에서도 가이드의 3' 말단(대략 8개까지) DNA 치환에서 on/off 절단 비율이 증가하는 유사한 결과가 확인되었다(도 14).
이와 같은 결과를 통하여, 가이드의 3' 말단 DNA 치환의 경우, 염기서열의 종류에 크게 영향을 받지 않고 광범위하게 표적 DNA 절단 특이성이 향상되는 것으로 확인되었다.
실시예 5. Cpf1 키메릭 DNA-RNA 가이드 3' 말단의 포스포로티오에이트 개량에 의한 세포내 유전체 교정 효율 복원 확인
키메릭 DNA-RNA 가이드의 3' 말단 DNA 치환시, 3' 말단 DNA 엑소뉴클레아제에 의한 키메릭 DNA-RNA 가이드의 열화(degradation)가 발생할 가능성이 존재한다.
따라서, 3' 말단 DNA 치환된 키메릭 DNA-RNA 가이드의 유전체 교정 효율을 개선하기 위하여, 키메릭 DNA-RNA 가이드의 3' 말단을 포스포로티오에이트(phosphorothioate, PS)로 개량함으로써, 세포내 유전체 교정 효율이 증진될 수 있는지 확인하였다.
먼저, 3' 말단에 PS로 개량된 키메릭 DNA-RNA 가이드(표 4)를 사용하여 in vitro에서 DNMT1 유전자내 염기서열 절단을 유도하였다.
그 결과, 3' 말단에 PS로 개량된 가이드를 사용하여도 wild-type RNA 형태의 가이드와 비슷하거나 더 좋은 효율의 절단 활성이 유도된 것으로 확인되었다(도 16). 반면, 비표적 특이적인 절단은 줄어들어 상대적으로 특이성이 증가된 것으로 확인되었다(도 17).
따라서, 3' 말단에 PS로 개량된 키메릭 DNA-RNA 가이드(표 4)를 사용하여, 동일 유전자내 염기서열에 인델을 유도하였다. 구체적으로, HEK293FT 세포주(ATCC)를 DMEM 배지(10% FBS (Gibco)의 DMEM(Gibco))에서 48시간마다 37℃의 5% CO2 조건에서 계대 배양하면서 컨플루언시(confluency) 70%를 유지하였고, 키메릭 세포 형질주입(transfection)시 전기천공(electroporation) 키트(amaxa, V4XC-2032)을 사용하였다. 105 개의 세포를 사용하여 Cpf1-키메릭 가이드 사전 혼합된 복합물과 혼합한 후, 전기천공 버퍼(Cpf1: 60pmol, crRNA: 240pmol) 조건에서 전기 충격(program: CM-130)을 가하였다. 이후, 37℃의 5% CO2 조건에서, 30분간 사전 인큐베이션된 24 웰 플레이트의 DMEM 배지 용액 500㎕에 형질주입된 세포들을 옮기고, 동일한 조건(37℃ 및 5% CO2)에서 배양하였다. 키메릭 RNA-DNA 가이드 및 재조합 AsCpf1 복합체를 세포(HEK293FT) 내부로 전달하고 48시간이 지난 다음, 게놈 DNA 정제(purification) 키트(Qiagen, DNeasy Blood & Tissue Kit)를 사용하여 게놈 DNA를 분리하였다.
게놈 DNA의 유전체 교정 여부를 확인하기 위하여, 각 유전자위에 해당하는 표 5의 DNA 프라이머를 이용하여 PCR 앰플리콘(DNMT1, CCR5, FANCF, GRIN2B, EMX1)을 얻고, PCR 기기로 변성(denature)-재어닐링(reannealing)(98℃에서 25℃까지 1℃씩 점진적인 감소, 20분)을 진행하였다. 정제된 재조합 T7E1 효소(NEB, M0302S)를 이용하여 절단 버퍼(50mM NaCl, 10mM Tris-HCl(pH7.9), 10mM MgCl2, 1mM DTT) 조건에서, 25분 동안 37℃에서 10㎕ 부피로 인큐베이션하였다. 반응 이후, 정지 버퍼(100mM EDTA, 1.2% SDS)를 혼합하여 반응을 중지시키고, 2% 아가로스 젤 전기영동으로 DNA 절단 여부를 확인하여 ImageJ 프로그램으로 교정 효율을 측정하였다.
또한, 표적 유전자의 교정 부위의 정확한 염기서열을 확인하기 위하여 표적 유전자위에 해당하는 표 5의 DNA 프라이머를 이용하여 얻은 PCR 앰플리콘(DNMT1, CCR5, FANCF, GRIN2B, EMX1)에서 nested PCR(변성: 98℃에서 30초, 프라이머 어닐링: 58℃에서 30초, 신장(elongation): 72℃에서 30초, 35 사이클)을 반복하여 adaptor와 index 시퀀스를 앰플리콘 양단에 삽입하였다(변성: 98℃에서 30초, 프라이머 어닐링: 62℃에서 15초, 신장 72℃에서 15초, 35 사이클). 이후 태깅(tagging)된 앰플리콘 혼합물을 제조사의 지침에 따라 mini-SEQ analyzer(illumina MiniSeq system, SY-420-1001)에 로딩하고 targeted deep sequencing을 진행하였다. 저장된 Fastq file은 Cas-Analyzer 코드로 분석되었고 교정 효율(%)을 계산하였다.
그 결과, 온-타겟 보상 효과가 크게 회복되는 것을 확인하여(도 18 및 도 19), 3' 말단에 개질을 통해 효과를 증진 시킬 수 있음을 확인하였다. 특히, PS 개량된 키메릭 DNA-RNA 가이드의 사용에 의하여 표적 특이성이 향상된 Cpf1 유전자 가위를 세포내에서 효과적으로 작동시킬 수 있는 것으로 확인되었다.
실시예 6. 플라스미드를 이용한 키메릭 DNA-RNA 가이드 기반 AsCpf1, LbCpf1 및 FnCpf1의 유전자내 DNMT1 표적 염기서열 인델 유도 효율 비교
AsCpf1 이외에 다른 미생물종 유래 Cpf1에서도 키메릭 DNA-RNA 가이드가 적용될 수 있는지 확인하였다.
구체적으로, LbCpf1, FnCpf1은 AsCpf1과 동일하게 실시예 2의 방법으로, 자체 제작한 발현 플라스미드를 박테리아내에서 발현시켜 단백질 상태로 정제하였다. 또한, 표적 DNMT1 서열을 포함하는 플라스미드는 게놈 DNA상의 염기서열을 그대로 모방하여 준비하였고, 이를 정제한 Cpf1 유전자 가위 단백질과 같이 전기천공법으로 세포내 전달하였으며, 세포내에서 플라스미드에 포함된 표적 DNMT1 서열의 교정을 실시예 2의 차세대 염기서열 분석 방법으로 분석하였다.
그 결과, 표적 염기서열과 비표적 염기서열에 대하여 유사한 절단 패턴이 나타나며(도 20), 표적 특이성 역시 향상된 것으로 확인되었다(도 21).
실시예 7. SpCas9 닉카아제(D10A) 혼합 사용에 의한 키메릭 DNA-RNA 가이드 기반 Cpf1 유전자 가위의 세포내 유전체 교정 효율 제고 확인
세포내 실제 유전체에서 DNA 이중나선이 히스톤 단백질에 감긴 negative supercoil 형태에 기인하는 것인지 확인하기 위하여, negative supercoil을 제거하고, 유전체 교정 효율을 분석하였다.
구체적으로, SpCas9 닉카아제(D10A)를 발현하는 플라스미드를 박테리아에 전달해 단백질 형태로 정제한 다음, 표적 서열인 negative supercoil에 해당하는 정제된 가이드 RNA와 혼합하였다. 이를 3' 말단이 개량되지 않은 키메릭 DNA-RNA 가이드 및 3' 말단이 PS 개량된 키메릭 DNA-RNA 가이드와 함께 사용하여, 실시예 5의 방법과 동일한 방법으로 세포내 유전체 교정 효율을 측정하였다(도 22).
실시예 8. 키메릭 DNA-RNA 가이드의 표적 특이성 비교
앞서 살핀 방식과 동일하게, 키메릭 DNA-RNA 가이드(crRNA의 3'말단 4nt, 8nt 길이의 연속된 DNA 치환, +4, +8은 치환된 DNA 갯수)를 이용하여 AsCpf1의 DNMT1, GRIN2B, HPRT1, RPL32P3 유전자 염기서열 타겟 표적 특이성을 확인하여, 그 결과를 도 23에 나타내었다.
도 23의 A 내지 D는 각각 DNMT1, GRIN2B, HPRT1, RPL32P3 유전자 염기서열 타겟 표적 특이성을 확인한 결과를 나타낸다(On/Off1 비율(파란색).
도 23에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 키메릭 DNA-RNA 가이드를 이용하는 경우 우수한 on-target 효율을 나타내었으며, 특히 8개의 DNA 서열을 3'말단에 포함할 때 가장 우수한 효과를 나타내었다.
실시예 9. 키메릭 DNA-RNA 가이드 사용 플라스미드상 유전자 염기서열에 대한 표적 특이성 조사
본 발명에 따른 키메릭 DNA-RNA 가이드를 이용하는 시스템의 다양한 형태로의 작용 가능성을 확인하기 위하여, 도 24의 A에서와 같이 고등동물 세포내 (예를 들어, HEK293FT) 키메릭 DNA-RNA 기반 AsCpf1 전달시, 플라스미드상 표적/비표적 염기서열 교정 효율 비교할 수 있도록 실험을 수행하였다.
구체적으로, DNMT1 및 GRIN2B에 대하여 표적/비표적 염기서열 교정 효율과 표적 특이성에 대한 실험을 위 실시예와 유사하게 수행하였으며, 그 결과를 도 24의 B 내지 E에 나타내었다.
상기 도면에서 확인할 수 있는 바와 같이, DNMT1 및 GRIN2B 각각에 대하여 대략 +8의 DNA 개수를 중심으로 우수한 교정 효율 및 특이도를 나타내었다.
실시예 10. CCR5 유전자 표적 3' 말단 PS(phosphorothioate) 개량된 키메릭 가이드와 nickase SpCas9 복합사용에 의한 Cas12a(Cpf1) 유전자 교정 활성도
도 25의 A에서와 같이 고등동물 세포내 (예를 들어, HEK293FT) 키메릭 DNA- 키메릭 DNA-RNA 기반 Cas12a 와 dead/nickase SpCas9 동시전달에 의한 유전체 교정 효율을 확인하기 위하여, 실험을 수행하였다.
구체적으로, 도 25의 A와 같이 CCR56 표적 유전자 염기 서열과 in-silico 예측된 비표적 염기서열 정보를 이용하여 실험을 수행하였다.
상기 실험결과를 도 25의 B 내지 C에 나타내었다. 도 25의 B는 키메릭 DNA-RNA 기반 Cas12a 와 nickase SpCas9 동시전달에 의한 NGS 유전체 교정 효율 분석한 결과를 나타낸다( +4DNA: crRNA 3' 말단 4nt DNA 치환, +8DNA: crRNA 3' 말단 8nt DNA 치환, PS: phosphorothioate 를 각각 나타냄). 위 결과에서 확인할 수 있는 바와 같이, 이들을 모두 포함하였을 때 우수한 효율이 나타남을 확인할 수 있었다.
또한, dead/nickase SpCas9 복합 처리에 의한 유전체 교정 효율 증가 및 dead/nickase SpCas9 복합 처리에 의한 유전체 교정 특이성 증가 확인 결과를 도 25의 C 에 나타내었다. 해당 도면에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 8개의 DNA 3'말단 서열을 포함하여 표적 3' 말단 PS(phosphorothioate) 개량된 키메릭 가이드와 nickase SpCas9 복합사용에 의할 때, 가장 우수한 효과가 나타남을 확인하였다.
실시예 11. 바이러스(예를 들어, HIV) 감염병 표적 치료를 위한 유전자 치료제 적용
HIV는 레트로 바이러스라는 특성상 이 단백질의 변형 가능성이 높아 제대로 타겟을 잡을 수 없기 때문에 아직까지 완벽한 치료제가 없다. 이에 따라, CRISPR-Cas12a(Cpf1) 유전자 가위를 이용하여 T세포내 CCR5 유전자를 선택적으로 제거, 향후 인체대상 자가 T 세포 교정에 의한 ex-vivo 주입 형태의 효과적인 유전자 치료제의 이용이 가능한지 여부를 확인하였다.
구체적으로, 알려진 Cpf1 단백질 중에서 구조적으로 가이드 RNA와 상호작용이 잘 규명된 AsCpf1(Acidaminococcus sp. Cpf1) 재조합 단백질 정제를 위하여 pET28a-Cas12a(AsCpf1) 박테리아 발현 벡터를 E.coli BL21(DE3)종에 형질전환 진행한 후, OD=0.6까지 37˚C에서 배양하였다. IPTG 접종뒤 48시간 후에 박테리아 세포들을 침전하여 배양액을 제거하고, 남은 침전물을 bufferA[20mM Tris-HCl(pH8.0), 300mM NaCl, 10mM β-mercaptoethanol, 1% TritonX-100, 1mM PMSF] 로 재 용해하였다. 이후 sonication을 통하여(ice, 3min) 박테리아 세포막을 부수고, 원심분리(5000rpm, 10min)후 세포 lysate를 harvest하였다. 먼저 bufferB[20mM Tris-HCl(pH8.0), 300nM NaCl] 로 pre-washing 된 Ni-NTA resin과 초음파 파쇄된 세포내 용액을 섞어서 cold room(4C)에서 1시간 30분 동안 교반하였다. 박테리아 세포 침전 이후 bufferB[20mM Tris-HCl(pH8.0), 300nM NaCl]를 사용, 10배 volume으로 washing을 통해 non-specific binding component 들을 제거하고, bufferC[20mM Tris-HCl(pH8.0), 300nM NaCl, 200mM Imidazole]를 사용해 AsCpf1 단백질을 용출하였다. 용출된 단백질은 bufferE[200mM NaCl, 50mM HEPES(pH7.5), 1mM DTT, 40% glycerol]로 centricon(Amicon Ultra,)을 사용하여 교환해주고 -80˚C에 분주하여 보관하였다. 결과적으로 고순도의 DNA 절단 활성이 있는 단백질을 정제하였으며, 그 결과를 도 26에 나타내었다.
도 26에서 확인할 수 있는 바와 같이, Affinity column (Ni-NTA resin)을 이용한 유전자 가위 CRISPR-Cas12a(Cpf1) 재조합 단백질의 정제결과. N-terminus에 (6X)His-tag이 결합된 AsCpf1(Acidaminococcus sp. Cpf1) 과 LbCpf1(Cpf1)을 각각 박테리아 세포 안에서 분리/정제 하여 순도 90% 이상을 가진 활성화된 유전자 가위 단백질을 확보하였다.
CCR5 유전자 표적 실험에 필요한 Chimeric DNA-RNA 가이드는 목표 CCR5 유전자 내 타겟으로 하는 염기서열에 맞추어 일괄 합성 주문 제작하였으며 (bioneer), 해당 서열을 아래와 같이 표 6 및 도 27에 나타내었다.
Figure pat00001
위 표 6 내용에서, 타겟 DNA 유전자 내의 PAM 염기서열(TTTN)은 밑줄로 표시하고, 키메릭 가이드의 DNA 염기서열은 굵은 글씨로 표시하였다.
또한, 도 27의 A에서 확인할 수 있는 바와 같이, CCR5 유전자의 표적 특이적 제거를 위한 Cpf1 표적 염기서열을 나타내었으며, 붉은색은 PAM(TTTN)염기서열, 노란색은 표적 염기서열을 나타낸다 도 27의 B에서는 CCR5 표적 염기서열(on-target)과 이와 유사한 비표적 염기서열(off-target) 정보를 나타내며, 비표적 염기서열(Off-target)내 가이드 RNA와 mismatch가 생기는 부분은 붉은색으로 표시하였다.
상기 내용을 기초로 키메릭 DNA-RNA 가이드를 사용한 Cpf1의 동물세포내 CCR5 유전자 표적실험을 수행하였다. 타겟 DNA의 절단 특이성이 높은 특정 chimeric DNA-RNA 가이드를 이용한 Cpf1의 생체내 적용을 위해 세포단계에서 표적 특이적인 유전체 교정이 가능한지 확인해 보았다. 동물세포에서의 키메릭 DNA-RNA 를 이용한 표적특이적 유전체 교정 효율을 확인하기 위해서, HEK293FT (ATCC) 세포주를 배양하였다. 세포주는 DMEM (Gibco) 에 10% FBS (Gibco) 를 첨가한 배양액이 사용되었으며, 37°C, 5% CO2 의 환경에서 매 48시간마다 계대 배양을 통해 배양 플레이트의 70% 밀집도를 유지하였다. 효율적인 핵 내 유전자 가위 벡터의 전달을 위해, 전기천공법 (Electroporation (Lonza, V4XC-2032)) 을 사용하였으며, As/LbCp1 (500ng), nCas9 (D10A (100ng)), crRNA (150 pmol), sgRNA (15 pmol) 로 이루어진 벡터 및 가이드 RNA 를 전달하였다. 전기천공12시간 뒤, 동일한 양의 crRNA와 sgRNA를 2.8 ul의 Lipofectamine 3000 (ThermoFisher) 과 2.0 μl의 P3000 시약을 이용하여 세포 내로 전달하였으며, 동일한 방법과 시간 간격으로 다시 전달하여, 총 2회의 추가적인 가이드 RNA 전달을 진행하였다. 전기천공 후, 72시간 뒤, HEK293FT 세포주의 genomic DNA 를 추출하였음. 추출된 genomic DNA를 이용하여 표적 유전자와 예상된 오프-타겟 (off-target) 유전자 위치를 targeted amplicon sequencing 을 통하여 분석하였다. 저장된 Fastq file은 Cas-Analyzer 코드로 분석되었고 교정 효율(%)이 계산되었다.
상기 실험 결과를 도 28 및 도 29에 나타내었다. 상기 결과는 키메릭 DNA-RNA 가이드 사용에 의한 Cpf1 유전자 가위의 동물세포내 CCR5 유전자 표적 특이성을 보여준다.
구체적으로, 인체 유래 세포주 (HEK293FT) 내에서 CCR5 유전자내 특정 염기서열(표)을 Cpf1 유전자 가위를 사용하여 표적한 결과 WT crRNA 보다 guide RNA 3' 말단을 DNA 로 치환한 +8DNA crRNA 사용시 nickase를 동시에 처리해 줌으로써 효율을 극대화 하였다 (도 28 A 및 29 A]. 반면 비표적에 절단을 유도하여 Indel을 형성하는 비율은 감소하였다(도 28 B 및 29 B).
또한, 인체 유래 세포주 (HEK293FT) 내에서 CCR5 유전자내 특정 염기서열(표)을 AsCpf1 유전자 가위를 사용하여 표적한 결과 WT crRNA 보다 guide RNA 3' 말단을 DNA 로 치환한 +8DNA crRNA 사용시 표적 특이성이 2배 이상 증가함을 확인하였다(도 28 C).
동일 실험을 LbCpf1 유전자 가위를 사용하여 표적한 경우에도 WT crRNA 보다 guide RNA 3' 말단을 DNA 로 치환한 +8DNA crRNA 사용시 표적 특이성이 2배 이상 증가함을 확인하였다(도 29 C).
실시예 12. 발암 유전자 표적 치료를 위한 유전자 치료제 적용
인체 내에서 암으로의 진행을 일으킬 수 있는 근원성을 가진 유전자는 발암유전자 (oncogene)로 알려져 있다. 이러한, 원암유전자는 활성산소나 방사선 등에 의하여 돌연변이를 일으켜 발암유전자 (oncogene)로서 성질이 전환되면 제어시스템에 의해 통제되지 않고 끊임없는 세포분열을 일으키며, 이러한 세포분열이 제어불능 상태가 되면서 비정상적으로 세포증식이 이루어져 암을 형성하게 된다. 이에 따라, 비표적 타겟팅이 줄어들어 표적 특이성이 향상된 CRISPR-Cpf1유전자 가위를 사용하여 인간에 암을 유발시키는 발암유전자 (oncogene)를 타겟하여 인체내 필요한 원암 유전자(proto-oncogene) 대비 선택적으로 제거할 수 있음을 확인하기 위해 실험을 수행하였다.
구체적으로, 도 30에 나타낸 바와 같이, 정상유전자BRAF 는 자르지 않고 발암유전자 BRAF(1799T>A)만 자를수 있는 표적 특이성이 제고된 Cpf1유전자 가위를 적용하여 암세포 근원인 발암유전자를 제거하여 암세포를 사멸시킬 수 있는지 여부를 확인하였다.
BRAF 변이 유전자(1799T>A) 표적 실험에 필요한 Chimeric DNA-RNA 가이드는 목표 BRAF 유전자 내 점 돌연변이(1799T>A)를 타겟으로 하는 염기서열에 맞추어 일괄 합성 주문 제작하였으며 (bioneer), 이를 표 7 및 도 31에 나타내었다.
Figure pat00002
위 표 7 내용에서, 타겟 DNA 유전자 내의 PAM 염기서열(TTTN)은 밑줄로 표시하고, 키메릭 가이드의 DNA 염기서열은 굵은 글씨로 표시하였다.
도 31에서는 발암성 BRAF 변이 유전자의 표적 특이적 제거를 위한 Cpf1표적 염기서열을 구체적으로 기재하였다. 도 31의 A에서 확인할 수 있는 바와 같이, 오랜지색: CRISPR-Cpf1 유전자 가위의 표적 24nt 염기서열, 파란색: CRISPR-Cpf1 유전자 가위가 표적 인식에 필요한 PAM(TTTN) 염기서열, 붉은색: 정상 유전자(1799T) 내에서 발암성 유전자(1799T>A)로 변이가 일어남에 대해 구체적으로 기재하였다. 또한, 도 31의 B에서 확인할 수 있는 바와 같이, BRAF 유전자내 일어난 점 돌연변이. MT: 변이 유전자(oncogene), WT: 정상 유전자(proto-oncogene)를 기재하였다.
in-vitro 수준 발암 유전자 특이적 절단 실험을 수행하였다.
정상 BRAF 유전자(1799T)와 발암 유전자 BRAF(1799T>A)에 대하여 wild-type 과 키메릭 DNA-RNA 가이드 (D+8)를 각각 사용한 Cpf1의 절단 효율을 비교분석하기 위하여 in-vitro cleavage assay를 진행하였다. 정상 BRAF 유전자(1799T)와 발암 유전자 BRAF(1799T>A) 각각의 염기서열을 합성하여 T-vector에 삽입하고, 표적 염기서열이 포함된 각각에 대한 PCR 을 진행하여 amplicon을 얻었다. 이후 hBRAF_Mutation_amplicon 2㎍, hBRAF_wild-type_amplicon 2㎍, AsCpf1 혹은 LbCpf1 protein 2.8㎍, crRNA(WT) 600ng 혹은 chimeric DNA-RNA(D+8) 600ng을 cleavage buffer(NEB3.1 buffer, deionized Water up to 10㎕)와 mix하여 37℃incubator에서 1hour incubation 한 이후 agarose 2% gel에서 200V-20min으로 전기영동하여 밴드 양상을 확인하였다. 그리고 나서, ImageJ software로 DNA 절단 효율(cleavage efficiency= cleaved band intensity/ total intensity X100)을 계산 하였다.
그 결과를 도 32 및 도 33에 나타내었다.
정상 BRAF 유전자(1799T) 대비 발암 유전자 BRAF(1799T>A)의 표적 특이성을 확인하기 위하여 도 32와 같이 발암 유전자 BRAF(1799T>A)와 정상 BRAF 유전자(1799T)에 대하여 wild-type 과 키메릭 DNA-RNA 가이드 (D+8)를 각각 사용한 Cpf1의 절단 효율을 비교분석하였다.
발암 유전자 BRAF(1799T>A)에 대하여 wild-type 과 키메릭 DNA-RNA 가이드 (D+8)를 사용한 Cpf1 유전자 가위의 DNA 절단 효율은 비슷한 정도를 나타내었고, 정상 BRAF 유전자(1799T)에 대해서는 키메릭 DNA-RNA 가이드 (D+8)를 사용하였을 때 DNA 절단 효율이 확연히 줄어듦으로써(도 33 A) 키메릭 DNA-RNA 가이드 (D+8)를 사용한 Cpf1 유전자 가위가 정상 BRAF 유전자(1799T) 대비 발암 유전자 BRAF(1799T>A) 특이성이 증가함을 보여주었다(도 33 B).
실시예 13. 퇴행성 안구 질환 표적 치료를 위한 유전자 치료제 적용
표적 특이성이 제고된 CRISPR-Cpf1 유전자 가위를 사용하여 혈관생성을 DNA 수준에서 근원적, 국소적으로 억제하는 치료법을 개발하고자, 혈관내피생성인자(VEGFA) 유전자를 직접적으로 타겟하여 DNA 수준에서 근원적으로 제거할 수 있음을 확인하였다.
VEGFA 유전자 표적 실험에 필요한 Chimeric DNA-RNA 가이드는 목표 VEGFA 유전자 내 타겟으로 하는 염기서열에 맞추어 일괄 합성 주문 제작하였으며, 이를 이를 표 8 및 도 34에 나타내었다.
Figure pat00003
위 표 8 내용에서, 타겟 DNA 유전자 내의 PAM 염기서열(TTTN)은 밑줄로 표시하고, 키메릭 가이드의 DNA 염기서열은 굵은 글씨로 표시하였다.
또한, 도 34에 VEGFA 유전자의 표적 특이적 제거를 위한 Cpf1 표적 염기서열을 나타내었다. 도 34의 A는 각각 혈관생성내피인자(VEGFA)내 표적 염기서열, 파란색: CRISPR-Cpf1 유전자 가위의 표적 24nt 염기서열, 붉은색: CRISPR-Cpf1 유전자 가위가 표적 인식에 필요한 PAM(TTTN) 염기서열을 나타낸다. 도 34의 B는 각각 VEGFA 표적 염기서열과 유사한 비표적 염기서열, 염기서열내 붉은색으로 표시된 염기서열들은 Cpf1 가이드 염기서열과 다른 mismatch된 염기들을 나타낸다.
in-vitro 수준 VEGFA 유전자 특이적 절단 실험을 수행하였다.
hVEGFA 표적 염기서열(on-target)와 비표적 염기서열(off-target)에 대하여 wild-type 과 키메릭 DNA-RNA 가이드 (D+8)를 각각 사용한 Cpf1의 절단 효율을 비교분석하기 위하여 in-vitro cleavage assay를 진행하였다. hVEGFA 표적 유전자(on-target)와 비표적 유전자(off-target) 각각의 염기서열을 합성하여 T-vector에 삽입하고, 표적 염기서열이 포함된 각각에 대한 PCR 을 진행하여 amplicon을 얻었다. 이후 hVEGFA_on-target amplicon 600ng, hVEGFA_off-target amplicon 600ng, AsCpf1-FLAG protein 2.8㎍, crRNA(WT) 600ng, crRNA(D+8) 600ng을 cleavage buffer(NEB3.1 buffer, DeIonized Water up to 10㎕)와 mix하여 37℃ incubator에서 1hour incubation 한 이후 agarose 2% gel에서 200V-20min으로 전기영동하여 밴드 양상을 확인하였다. 또한 ImageJ software로 DNA 절단 효율(cleavage efficiency= cleaved band intensity/ total intensity X100)을 계산 하였다.
표적 VEGFA 유전자에 대한 비표적 특이성을 확인하기 위하여 도 35과 같이 표적 유전자내 염기서열(on-target)과 비표적 염기서열(off-target)에 대하여 wild-type 과 키메릭 DNA-RNA 가이드 (D+8)를 각각 사용한 Cpf1의 절단 효율을 비교분석하였다.
표적 유전자내 염기서열(on-target)에 대하여 wild-type 과 키메릭 DNA-RNA 가이드 (D+8)를 사용한 Cpf1 유전자 가위의 DNA 절단 효율은 비슷한 정도를 나타내었고, 비표적 염기서열(off-target)에 대해서는 키메릭 DNA-RNA 가이드 (D+8)를 사용하였을 때 DNA 절단 효율이 확연히 줄어듦으로써(도 36 A), 키메릭 DNA-RNA 가이드 (D+8)를 사용한 Cpf1 유전자 가위가 비표적 염기서열(off-target) 대비 표적 유전자내 염기서열(on-target) 특이성이 증가함을 보여주었다(도 36 B).
이제까지 본 발명에 대하여 그 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Composition for Genome Editing or Inhibiting Gene Expression comprising Cpf1 and Chimeric DNA-RNA Guide <130> PN190345 <150> KR 10-2019-0170035 <151> 2019-12-18 <160> 212 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_crRNA1_AsCpf1_target DNA <400> 1 tttcctgatg gtccatgtct gttactcg 28 <210> 2 <211> 43 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_crRNA1_AsCpf1_guide <400> 2 aauuucuacu cuuguagauc ugauggucca ugucuguuac ucg 43 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_crRNA2_AsCpf1_target DNA <400> 3 tttcctgatg gtccatgtct gttactcg 28 <210> 4 <211> 43 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_crRNA2_AsCpf1_chimeric guide <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 4 aauuucuacu cuuguagauc ugauggucca ugucuguuac tcg 43 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_crRNA3_AsCpf1_target DNA <400> 5 tttcctgatg gtccatgtct gttactcg 28 <210> 6 <211> 43 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_crRNA3_AsCpf1_chimeric guide <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 6 aauuucuacu cuuguagauc ugauggucca ugucugttac tcg 43 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_crRNA3-2_AsCpf1_target DNA <400> 7 tttcctgatg gtccatgtct gttactcg 28 <210> 8 <211> 43 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_crRNA3-2_AsCpf1_chimeric guide <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 8 aauuucuacu cuuguagauc ugauggucca ugucugttac tcg 43 <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_crRNA3-3_AsCpf1_target DNA <400> 9 tttcctgatg gtccatgtct gttactcg 28 <210> 10 <211> 43 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_crRNA3-3_AsCpf1_chimeric guide <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 10 aauuucuacu cuuguagauc ugauggucca ugucugttac tcg 43 <210> 11 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_crRNA3-4_AsCpf1_target DNA <400> 11 tttcctgatg gtccatgtct gttactcg 28 <210> 12 <211> 43 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_crRNA3-4_AsCpf1_chimeric guide <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 12 aauuucuacu cuuguagauc ugauggucca ugucugttac tcg 43 <210> 13 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_crRNA4_AsCpf1_target DNA <400> 13 tttcctgatg gtccatgtct gttactcg 28 <210> 14 <211> 43 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_crRNA4_AsCpf1_chimeric guide <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 14 aauuucuacu cuuguagauc ugauggucca ugtctgttac tcg 43 <210> 15 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_crRNA5_AsCpf1_target DNA <400> 15 tttcctgatg gtccatgtct gttactcg 28 <210> 16 <211> 43 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_crRNA5_AsCpf1_chimeric guide <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 16 aauuucuacu cuuguagauc ugauggucca tgtctgttac tcg 43 <210> 17 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_crRNA6_AsCpf1_target DNA <400> 17 tttcctgatg gtccatgtct gttactcg 28 <210> 18 <211> 43 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_crRNA6_AsCpf1_chimeric guide <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 18 aauuucuacu cuuguagauc ugatggtcca tgtctgttac tcg 43 <210> 19 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_crRNA7_AsCpf1_target DNA <400> 19 tttcctgatg gtccatgtct gttactcg 28 <210> 20 <211> 43 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_crRNA7_AsCpf1_chimeric guide <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 20 aauuucuacu cuuguagauc tgatggtcca tgtctgttac tcg 43 <210> 21 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_crRNA8_AsCpf1_target DNA <400> 21 tttcctgatg gtccatgtct gttactcg 28 <210> 22 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_crRNA8_AsCpf1_guide <400> 22 aatttctact cttgtagatc tgatggtcca tgtctgttac tcg 43 <210> 23 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_crRNA9_AsCpf1_target DNA <400> 23 tttcctgatg gtccatgtct gttactcg 28 <210> 24 <211> 43 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_crRNA9_AsCpf1_chimeric guide <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 24 aattucuacu cuuguagauc ugauggucca ugucuguuac ucg 43 <210> 25 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_crRNA10_AsCpf1_target DNA <400> 25 tttcctgatg gtccatgtct gttactcg 28 <210> 26 <211> 43 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_crRNA10_AsCpf1_chimeric guide <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 26 aatttctacu cuuguagauc ugauggucca ugucuguuac ucg 43 <210> 27 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_crRNA11_AsCpf1_target DNA <400> 27 tttcctgatg gtccatgtct gttactcg 28 <210> 28 <211> 43 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_crRNA11_AsCpf1_chimeric guide <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 28 aatttctact ctuguagauc ugauggucca ugucuguuac ucg 43 <210> 29 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_crRNA12_AsCpf1_target DNA <400> 29 tttcctgatg gtccatgtct gttactcg 28 <210> 30 <211> 43 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_crRNA12_AsCpf1_chimeric guide <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 30 aatttctact cttgtagauc ugauggucca ugucuguuac ucg 43 <210> 31 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_crRNA13_AsCpf1_target DNA <400> 31 tttcctgatg gtccatgtct gttactcg 28 <210> 32 <211> 43 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_crRNA13_AsCpf1_chimeric guide <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 32 aatttctact cttgtagatc ugauggucca ugucuguuac ucg 43 <210> 33 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_crRNA14_AsCpf1_target DNA <400> 33 tttcctgatg gtccatgtct gttactcg 28 <210> 34 <211> 43 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_crRNA14_AsCpf1_chimeric guide <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 34 aauuucuacu cuuguagauc tgauggucca ugucuguuac ucg 43 <210> 35 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_crRNA15_AsCpf1_target DNA <400> 35 tttcctgatg gtccatgtct gttactcg 28 <210> 36 <211> 43 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_crRNA15_AsCpf1_chimeric guide <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 36 aauuucuacu cuuguagauc tgatggtcca ugucuguuac ucg 43 <210> 37 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_crRNA16_AsCpf1_target DNA <400> 37 tttcctgatg gtccatgtct gttactcg 28 <210> 38 <211> 43 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_crRNA16_AsCpf1_chimeric guide <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 38 aauuucuacu cuuguagauc tgatggtcca tgucuguuac ucg 43 <210> 39 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_crRNA17_AsCpf1_target DNA <400> 39 tttcctgatg gtccatgtct gttactcg 28 <210> 40 <211> 43 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_crRNA17_AsCpf1_chimeric guide <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 40 aauuucuacu cuuguagauc ugauggucca ugucuguuac ucg 43 <210> 41 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_crRNA18_AsCpf1_target DNA <400> 41 tttcctgatg gtccatgtct gttactcg 28 <210> 42 <211> 43 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_crRNA18_AsCpf1_chimeric guide <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 42 aauuucuacu cuuguagauc tgauggucca ugucuguuac ucg 43 <210> 43 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_crRNA19_AsCpf1_target DNA <400> 43 tttcctgatg gtccatgtct gttactcg 28 <210> 44 <211> 43 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_crRNA19_AsCpf1_chimeric guide <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 44 aauuucuacu cuuguagauc ugauggucca ugucuguuac ucg 43 <210> 45 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_crRNA20_AsCpf1_target DNA <400> 45 tttcctgatg gtccatgtct gttactcg 28 <210> 46 <211> 43 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_crRNA20_AsCpf1_chimeric guide <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 46 aauuucuacu cuuguagauc ugauggucca ugucuguuac ucg 43 <210> 47 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_crRNA21_AsCpf1_target DNA <400> 47 tttcctgatg gtccatgtct gttactcg 28 <210> 48 <211> 43 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_crRNA21_AsCpf1_chimeric guide <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 48 aauuucuacu cuuguagauc ugatggucca ugucuguuac ucg 43 <210> 49 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_crRNA22_AsCpf1_target DNA <400> 49 tttcctgatg gtccatgtct gttactcg 28 <210> 50 <211> 43 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_crRNA22_AsCpf1_chimeric guide <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 50 aauuucuacu cuuguagauc ugauggucca ugucuguuac ucg 43 <210> 51 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_crRNA23_AsCpf1_target DNA <400> 51 tttcctgatg gtccatgtct gttactcg 28 <210> 52 <211> 43 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_crRNA23_AsCpf1_chimeric guide <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 52 aauuucuacu cuuguagauc ugauggucca ugucuguuac ucg 43 <210> 53 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_crRNA24_AsCpf1_target DNA <400> 53 tttcctgatg gtccatgtct gttactcg 28 <210> 54 <211> 43 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_crRNA24_AsCpf1_chimeric guide <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 54 aauuucuacu cuuguagauc ugauggtcca ugucuguuac ucg 43 <210> 55 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_crRNA25_AsCpf1_target DNA <400> 55 tttcctgatg gtccatgtct gttactcg 28 <210> 56 <211> 43 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_crRNA25_AsCpf1_chimeric guide <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 56 aauuucuacu cuuguagauc ugauggucca ugucuguuac ucg 43 <210> 57 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_crRNA26_AsCpf1_target DNA <400> 57 tttcctgatg gtccatgtct gttactcg 28 <210> 58 <211> 43 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_crRNA26_AsCpf1_chimeric guide <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 58 aauuucuacu cuuguagauc ugauggucca ugucuguuac ucg 43 <210> 59 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_crRNA27_AsCpf1_target DNA <400> 59 tttcctgatg gtccatgtct gttactcg 28 <210> 60 <211> 43 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_crRNA27_AsCpf1_chimeric guide <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 60 aauuucuacu cuuguagauc ugauggucca ugucuguuac ucg 43 <210> 61 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCCR5_crRNA51_AsCpf1_target DNA <400> 61 tttgtgcaca gggtggaaca agatggat 28 <210> 62 <211> 43 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCCR5_crRNA51_AsCpf1_guide <400> 62 aauuucuacu cuuguagauu gcacagggug gaacaagaug gau 43 <210> 63 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCCR5_crRNA52_AsCpf1_target DNA <400> 63 tttgtgcaca gggtggaaca agatggat 28 <210> 64 <211> 43 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCCR5_crRNA52_AsCpf1_chimeric guide <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 64 aauuucuacu cuuguagauu gcacagggug gaacaagaug gat 43 <210> 65 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCCR5_crRNA53_AsCpf1_target DNA <400> 65 tttgtgcaca gggtggaaca agatggat 28 <210> 66 <211> 43 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCCR5_crRNA53_AsCpf1_chimeric guide <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 66 aauuucuacu cuuguagauu gcacagggug gaacaagatg gat 43 <210> 67 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCCR5_crRNA54_AsCpf1_target DNA <400> 67 tttgtgcaca gggtggaaca agatggat 28 <210> 68 <211> 43 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCCR5_crRNA54_AsCpf1_chimeric guide <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 68 aauuucuacu cuuguagauu gcacagggug gaacaagatg gat 43 <210> 69 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCCR5_crRNA55_AsCpf1_target DNA <400> 69 tttgtgcaca gggtggaaca agatggat 28 <210> 70 <211> 43 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCCR5_crRNA55_AsCpf1_chimeric guide <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 70 aauuucuacu cuuguagauu gcacagggtg gaacaagatg gat 43 <210> 71 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCCR5_crRNA56_AsCpf1_target DNA <400> 71 tttgtgcaca gggtggaaca agatggat 28 <210> 72 <211> 43 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCCR5_crRNA56_AsCpf1_chimeric guide <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 72 aauuucuacu cuuguagauu gcacagggtg gaacaagatg gat 43 <210> 73 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCCR5_crRNA57_AsCpf1_target DNA <400> 73 tttgtgcaca gggtggaaca agatggat 28 <210> 74 <211> 43 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCCR5_crRNA57_AsCpf1_chimeric guide <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 74 aauuucuacu cuuguagaut gcacagggtg gaacaagatg gat 43 <210> 75 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCCR5_crRNA58_AsCpf1_target DNA <400> 75 tttgtgcaca gggtggaaca agatggat 28 <210> 76 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCCR5_crRNA58_AsCpf1_guide <400> 76 aatttctact cttgtagatt gcacagggtg gaacaagatg gat 43 <210> 77 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCCR5_crRNA61_AsCpf1_target DNA <400> 77 tttgtgcaca gggtggaaca agatggat 28 <210> 78 <211> 43 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCCR5_crRNA61_AsCpf1_chimeric guide <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 78 aauuucuacu cuuguagaut gcacagggug gaacaagaug gau 43 <210> 79 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCCR5_crRNA62_AsCpf1_target DNA <400> 79 tttgtgcaca gggtggaaca agatggat 28 <210> 80 <211> 43 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCCR5_crRNA62_AsCpf1_chimeric guide <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 80 aauuucuacu cuuguagauu gcacagggug gaacaagaug gau 43 <210> 81 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCCR5_crRNA63_AsCpf1_target DNA <400> 81 tttgtgcaca gggtggaaca agatggat 28 <210> 82 <211> 43 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCCR5_crRNA63_AsCpf1_chimeric guide <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 82 aauuucuacu cuuguagauu gcacagggug gaacaagaug gau 43 <210> 83 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCCR5_crRNA64_AsCpf1_target DNA <400> 83 tttgtgcaca gggtggaaca agatggat 28 <210> 84 <211> 43 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCCR5_crRNA64_AsCpf1_chimeric guide <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 84 aauuucuacu cuuguagauu gcacagggug gaacaagaug gau 43 <210> 85 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCCR5_crRNA65_AsCpf1_target DNA <400> 85 tttgtgcaca gggtggaaca agatggat 28 <210> 86 <211> 43 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCCR5_crRNA65_AsCpf1_chimeric guide <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 86 aauuucuacu cuuguagauu gcacagggug gaacaagaug gau 43 <210> 87 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCCR5_crRNA66_AsCpf1_target DNA <400> 87 tttgtgcaca gggtggaaca agatggat 28 <210> 88 <211> 43 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCCR5_crRNA66_AsCpf1_chimeric guide <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 88 aauuucuacu cuuguagauu gcacagggug gaacaagaug gau 43 <210> 89 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCCR5_crRNA67_AsCpf1_target DNA <400> 89 tttgtgcaca gggtggaaca agatggat 28 <210> 90 <211> 43 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCCR5_crRNA67_AsCpf1_chimeric guide <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 90 aauuucuacu cuuguagauu gcacagggug gaacaagaug gau 43 <210> 91 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCCR5_crRNA68_AsCpf1_target DNA <400> 91 tttgtgcaca gggtggaaca agatggat 28 <210> 92 <211> 43 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCCR5_crRNA68_AsCpf1_chimeric guide <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 92 aauuucuacu cuuguagauu gcacagggug gaacaagaug gau 43 <210> 93 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCCR5_crRNA69_AsCpf1_target DNA <400> 93 tttgtgcaca gggtggaaca agatggat 28 <210> 94 <211> 43 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCCR5_crRNA69_AsCpf1_chimeric guide <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 94 aauuucuacu cuuguagauu gcacagggug gaacaagaug gau 43 <210> 95 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCCR5_crRNA70_AsCpf1_target DNA <400> 95 tttgtgcaca gggtggaaca agatggat 28 <210> 96 <211> 43 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCCR5_crRNA70_AsCpf1_chimeric guide <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 96 aauuucuacu cuuguagauu gcacagggtg gaacaagaug gau 43 <210> 97 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hFANCF_crRNA81_AsCpf1_target DNA <400> 97 tttggtcggc atggccccat tcgcacgg 28 <210> 98 <211> 43 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hFANCF_crRNA81_AsCpf1_chimeric guide <400> 98 aauuucuacu cuuguagaug ucggcauggc cccauucgca cgg 43 <210> 99 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hFANCF_crRNA82_AsCpf1_target DNA <400> 99 tttggtcggc atggccccat tcgcacgg 28 <210> 100 <211> 43 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hFANCF_crRNA82_AsCpf1_chimeric guide <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 100 aauuucuacu cuuguagaug ucggcauggc cccauucgca cgg 43 <210> 101 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hFANCF_crRNA82-2_AsCpf1_target DNA <400> 101 tttggtcggc atggccccat tcgcacgg 28 <210> 102 <211> 43 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hFANCF_crRNA82-2_AsCpf1_chimeric guide <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 102 aauuucuacu cuuguagaug ucggcauggc cccautcgca cgg 43 <210> 103 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hFANCF_crRNA83_AsCpf1_target DNA <400> 103 tttggtgctc aatgaaagga gataaggt 28 <210> 104 <211> 43 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hFANCF_crRNA83_AsCpf1_guide <400> 104 aauuucuacu cuuguagaug ugcucaauga aaggagauaa ggu 43 <210> 105 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hFANCF_crRNA84_AsCpf1_target DNA <400> 105 tttggtgctc aatgaaagga gataaggt 28 <210> 106 <211> 43 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hFANCF_crRNA84_AsCpf1_chimeric guide <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 106 aauuucuacu cuuguagaug ugcucaauga aaggagauaa ggt 43 <210> 107 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hFANCF_crRNA84-2_AsCpf1_target DNA <400> 107 tttggtgctc aatgaaagga gataaggt 28 <210> 108 <211> 43 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hFANCF_crRNA84-2_AsCpf1_chimeric guide <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 108 aauuucuacu cuuguagaug ugcucaauga aaggagataa ggt 43 <210> 109 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hEMX1_crRNA85_AsCpf1_target DNA <400> 109 tttgtcctcc ggttctggaa ccacacct 28 <210> 110 <211> 43 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hEMX1_crRNA85_AsCpf1_guide <400> 110 aauuucuacu cuuguagauu ccuccgguuc uggaaccaca ccu 43 <210> 111 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hEMX1_crRNA86_AsCpf1_target DNA <400> 111 tttgtcctcc ggttctggaa ccacacct 28 <210> 112 <211> 43 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hEMX1_crRNA86_AsCpf1_chimeric guide <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 112 aauuucuacu cuuguagauu ccuccgguuc uggaaccaca cct 43 <210> 113 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hEMX1_crRNA86-2_AsCpf1_target DNA <400> 113 tttgtcctcc ggttctggaa ccacacct 28 <210> 114 <211> 43 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hEMX1_crRNA86-2_AsCpf1_chimeric guide <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 114 aauuucuacu cuuguagauu ccuccgguuc uggaaccaca cct 43 <210> 115 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_crRNA2-2_AsCpf1_target DNA <400> 115 tttcctgatg gtccatgtct gttactcg 28 <210> 116 <211> 43 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_crRNA2-2_AsCpf1_chimeric guide <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 116 aauuucuacu cuuguagauc ugauggucca ugucuguuac tcg 43 <210> 117 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_crRNA2-3_AsCpf1_target DNA <400> 117 tttcctgatg gtccatgtct gttactcg 28 <210> 118 <211> 47 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_crRNA2-3_AsCpf1_chimeric guide <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 118 aauuucuacu cuuguagauc ugauggucca ugucuguuac tcgtttt 47 <210> 119 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_crRNA2-4_AsCpf1_target DNA <400> 119 tttcctgatg gtccatgtct gttactcg 28 <210> 120 <211> 46 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_crRNA2-4_AsCpf1_chimeric guide <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 120 aauuucuacu cuuguagauc ugauggucca ugucuguuac tcgttt 46 <210> 121 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_crRNA3-2_AsCpf1_target DNA <400> 121 tttcctgatg gtccatgtct gttactcg 28 <210> 122 <211> 43 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_crRNA3-2_AsCpf1_chimeric guide <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 122 aauuucuacu cuuguagauc ugauggucca ugucugttac tcg 43 <210> 123 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_crRNA3-3_AsCpf1_target DNA <400> 123 tttcctgatg gtccatgtct gttactcg 28 <210> 124 <211> 47 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_crRNA3-3_AsCpf1_chimeric guide <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 124 aauuucuacu cuuguagauc ugauggucca ugucugttac tcgtttt 47 <210> 125 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_crRNA3-4_AsCpf1_target DNA <400> 125 tttcctgatg gtccatgtct gttactcg 28 <210> 126 <211> 46 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_crRNA3-4_AsCpf1_chimeric guide <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 126 aauuucuacu cuuguagauc ugauggucca ugucugttac tcgttt 46 <210> 127 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1 on-target F1 <400> 127 gttgcacgtg tcaagtgctt a 21 <210> 128 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1 on-target R1 <400> 128 ttaaaatcca gaatgcacaa agtact 26 <210> 129 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1 on-target F2 <400> 129 gtgaatttgg ctcagcaggc a 21 <210> 130 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1 on-target R2 <400> 130 aagcgaacct cacacaacag c 21 <210> 131 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1 off-target1 F1 <400> 131 ttgacggcag tattacaggt ag 22 <210> 132 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1 off-target1 R1 <400> 132 aaggtcaaat gccgtttaac ca 22 <210> 133 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1 off-target1 F2 <400> 133 gtagtcaggc atgagtggca 20 <210> 134 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1 off-target1 R2 <400> 134 tgcctctttc ccaggattct 20 <210> 135 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1 off-target2 F1 <400> 135 tctcaggcaa gtcacaactc t 21 <210> 136 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1 off-target2 R1 <400> 136 taggcacatg aaggtcaaat gc 22 <210> 137 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1 off-target2 F2 <400> 137 gttacaggta gttaagcagg ca 22 <210> 138 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1 off-target2 R2 <400> 138 aaatgccata tttaaccgtg atcct 25 <210> 139 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1 off-target3 F1 <400> 139 tcatgccttt ctgggtctca t 21 <210> 140 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1 off-target3 R1 <400> 140 cacctgacct ctgtcacttt a 21 <210> 141 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1 off-target3 F2 <400> 141 ctgttcaggg aatggaaagt ga 22 <210> 142 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1 off-target3 R2 <400> 142 ctacatctac gctctcccca 20 <210> 143 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCCR5 on-target F1 <400> 143 aaggctgagc tgcaccatgc 20 <210> 144 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCCR5 on-target R1 <400> 144 aggatgatga agaagattcc a 21 <210> 145 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCCR5 on-target F2 <400> 145 cattcactcc atggtgctat a 21 <210> 146 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCCR5 on-target R2 <400> 146 atagagccct gtcaagagtt ga 22 <210> 147 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCCR5 off-target1 F1 <400> 147 agaaatagga gtcttcatgc cc 22 <210> 148 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCCR5 off-target1 R1 <400> 148 tggggtcaat gagaggagta tt 22 <210> 149 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCCR5 off-target1 F2 <400> 149 tagcaaggaa cctcaaagtg c 21 <210> 150 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCCR5 off-target1 R2 <400> 150 ctgcttccaa tacaatccac ac 22 <210> 151 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCCR5 off-target2 F1 <400> 151 tagtgctgaa agctcagaga g 21 <210> 152 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCCR5 off-target2 R1 <400> 152 ttcgagagcc acacatgaag 20 <210> 153 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCCR5 off-target2 F2 <400> 153 agagaggggg tcatagactt t 21 <210> 154 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCCR5 off-target2 R2 <400> 154 accttccagc cggtatatta at 22 <210> 155 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hFANCF on-target F1 <400> 155 tgaaagcgga agtagggcct 20 <210> 156 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hFANCF on-target R1 <400> 156 ctccgcctgg gtcttcatca 20 <210> 157 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hFANCF on-target F2 <400> 157 ggaagtaggg ccttcgcgca 20 <210> 158 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hFANCF on-target R2 <400> 158 cctcctggag atttgggttc 20 <210> 159 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hFANCF off-target1 F1 <400> 159 cctgtaagcc ctaagcaagt c 21 <210> 160 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hFANCF off-target1 R1 <400> 160 gtcaagttct actcaaggcc at 22 <210> 161 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hFANCF off-target1 F2 <400> 161 ctgtcctgta gagacttctg g 21 <210> 162 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hFANCF off-target1 R2 <400> 162 gtggtggagg gaagcttatt tt 22 <210> 163 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hFANCF off-target2 F1 <400> 163 tggggtaggt cttcaggaaa 20 <210> 164 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hFANCF off-target2 R1 <400> 164 cgttctaaat tctctacagt caac 24 <210> 165 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hFANCF off-target2 F2 <400> 165 tcgtgctaag ttaccgagtt 20 <210> 166 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hFANCF off-target2 R2 <400> 166 gcaatagttt tgagccagtg a 21 <210> 167 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hGRIN2B on-target F1 <400> 167 acctctgctg agcacgtttt 20 <210> 168 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hGRIN2B on-target R1 <400> 168 gacagcaatg ccaatgctgg 20 <210> 169 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hGRIN2B on-target F2 <400> 169 ctcactttgt ctggccttgc 20 <210> 170 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hGRIN2B on-target R2 <400> 170 cttctgagaa cgagctctgc 20 <210> 171 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hGRIN2B off-target1 F1 <400> 171 tgactgcaat tttgggttcc atc 23 <210> 172 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hGRIN2B off-target1 R1 <400> 172 gccactgcca tttattatgt aac 23 <210> 173 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hGRIN2B off-target1 F2 <400> 173 gtctaattac acttgccata cct 23 <210> 174 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hGRIN2B off-target1 R2 <400> 174 gaaatccagc tgtgactaaa tatg 24 <210> 175 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hGRIN2B off-target2 F1 <400> 175 ggagcacaat gagtgttttt 20 <210> 176 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hGRIN2B off-target2 R1 <400> 176 gtcttttcct ggtcacatgg 20 <210> 177 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hGRIN2B off-target2 F2 <400> 177 gccagaaatg ttattccata gtag 24 <210> 178 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hGRIN2B off-target2 R2 <400> 178 cagtgttctt acatatcaga cac 23 <210> 179 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hEMX1 on-target F1 <400> 179 actactcaca tccactctgt gaag 24 <210> 180 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hEMX1 on-target R1 <400> 180 gagtggccag agtccagctt 20 <210> 181 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hEMX1 on-target F2 <400> 181 tagaggagct aggatgcaca gca 23 <210> 182 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hEMX1 on-target R2 <400> 182 gcagcaagca gcactctgcc 20 <210> 183 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hEMX1 off-target1 F1 <400> 183 cagagcctgg agaattgata g 21 <210> 184 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hEMX1 off-target1 R1 <400> 184 ctggggagca gaataaatta ttg 23 <210> 185 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hEMX1 off-target1 F2 <400> 185 gaatagacct gggatgtgca g 21 <210> 186 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hEMX1 off-target1 R2 <400> 186 ggaacctgaa gaatgggatt g 21 <210> 187 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hEMX1 off-target2 F1 <400> 187 agattgagat catccaccct 20 <210> 188 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hEMX1 off-target2 R1 <400> 188 aaaacagaga ggttgagtct c 21 <210> 189 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hEMX1 off-target2 F2 <400> 189 tgtccaccat gtcccagaag 20 <210> 190 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hEMX1 off-target2 R2 <400> 190 acaaagaagg gcatctccag 20 <210> 191 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_Adaptor_F <400> 191 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctagtgttc agtctccgtg aacgttc 57 <210> 192 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hDNMT1_Adaptor_R <400> 192 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttcctta gcagcttcct cctcctt 57 <210> 193 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCCR5_Adaptor_F <400> 193 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctaacagtt tgcattcatg gagggc 56 <210> 194 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCCR5_Adaptor_R <400> 194 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctagttta tcaggatgag gatgacc 57 <210> 195 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hFANCF_Adaptor_F <400> 195 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctcactacc tacgtcagca cctgggacc 59 <210> 196 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hFANCF_Adaptor_R <400> 196 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctggaagt tcgctaatcc cggaactgga 60 60 <210> 197 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hGRIN2B_Adaptor_F <400> 197 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctctctcat tctgcagagc aaataccaga 60 gat 63 <210> 198 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hGRIN2B_Adaptor_R <400> 198 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcctgca aacacaaaga aagagcatgt 60 taaa 64 <210> 199 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hEMX1_Adaptor_F <400> 199 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctggcctcc tgagtttctc atctgtgc 58 <210> 200 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hEMX1_Adaptor_R <400> 200 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcctgct tcgtggcaat gcgccac 57 <210> 201 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCCR5(wt-crRNA)CRISPR-Cas12a(AsCpf1)Target DNA <400> 201 ttttgtgggc aacatgctgg tcatcctc 28 <210> 202 <211> 43 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCCR5(wt-crRNA)CRISPR-Cas12a(AsCpf1)Guide RNA <400> 202 aauuucuacu cuuguagaug ugggcaacau gcuggucauc cuc 43 <210> 203 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCCR5 (chimeric DNA-RNA)CRISPR-Cas12a(AsCpf1)Target DNA <400> 203 ttttgtgggc aacatgctgg tcatcctc 28 <210> 204 <211> 43 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCCR5 (chimeric DNA-RNA)CRISPR-Cas12a(AsCpf1) Guide Chimeric DNA-RNA <220> <223> Chimeric DNA-RNA(TCATCCTC) <400> 204 aauuucuacu cuuguagaug ugggcaacau gcuggtcatc ctc 43 <210> 205 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hBRAF (wt-crRNA)CRISPR-Cas12a(AsCpf1) Target DNA <400> 205 ttttttttgg tctagctaca gagaaatctc ga 32 <210> 206 <211> 43 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hBRAF (wt-crRNA)CRISPR-Cas12a(AsCpf1) Guid RNA <400> 206 aauuucuacu cuuguagaug gucuagcuac agagaaaucu cga 43 <210> 207 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hBRAF (chimeric DNA-RNACRISPR-Cas12a(AsCpf1) Target DNA <400> 207 ttttttttgg tctagctaca gagaaatctc ga 32 <210> 208 <211> 43 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hBRAF (chimeric DNA-RNACRISPR-Cas12a(AsCpf1) Chimeric DNA-RNA <220> <223> Chimeric DNA-RNA(AATCTCGA) <400> 208 aauuucuacu cuuguagaug gucuagcuac agagaaatct cga 43 <210> 209 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hVEGFA (wt-crRNA)CRISPR-Cas12a(AsCpf1) Target DNA <400> 209 tttctgtcct cagtggtccc aggctgca 28 <210> 210 <211> 43 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hVEGFA (wt-crRNA)CRISPR-Cas12a(AsCpf1) Guide RNA <400> 210 aauuucuacu cuuguagauu guccucagug gucccaggcu gca 43 <210> 211 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hVEGFA (chimeric DNA-RNA)CRISPR-Cas12a(AsCpf1) Target DNA <400> 211 tttctgtcct cagtggtccc aggctgca 28 <210> 212 <211> 43 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hVEGFA (chimeric DNA-RNA)CRISPR-Cas12a(AsCpf1) Guide Chimeric DNA-RNA <220> <223> Chimeric DNA-RNA(AGGCTGCA) <400> 212 aauuucuacu cuuguagauu guccucagug gucccaggct gca 43

Claims (14)

  1. Cpf1 단백질 또는 이를 암호화하는 DNA; 및
    표적 뉴클레오티드(target nucleotide) 서열과 혼성화 가능한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 키메릭(chimeric) DNA-RNA 가이드 또는 이를 암호화하는 DNA
    를 포함하는 유전체 교정용 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 가이드는 3'-말단이 포스포네이트, 포스포로티오에이트 또는 포스포트리에스테르인 포스페이트로 개질; 비오틴화에 의해 개질; 또는 LNA, HNA, CeNA, 2'-메톡시에틸, 2'-O-알킬, 2'-O-알릴, 2'-C-알릴, 2'-플루오로, 2'-데옥시, 2'-히드록실 및 그들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 어느 하나에 의해 개질된 것인 유전체 교정용 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 키메릭(chimeric) DNA-RNA 가이드의 DNA는 상기 가이드의 3' 말단에 치환된 것인 유전체 교정용 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 DNA는 6 내지 10개인 것인 유전체 교정용 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 SpCas9 닉카아제(nickase)(D10A) 또는 비활성(Dead) SpCas9 닉카아제(nickase)(D10A 또는 H840A)를 더 포함하는 것인 유전체 교정용 조성물.
  6. 제 1 항의 유전체 교정용 조성물을 분리된 세포 또는 인간을 제외한 유기체에 도입하는 단계를 포함하는 형질 전환체의 제조 방법.
  7. 비활성 Cpf1(dCpf1) 단백질 또는 이를 암호화하는 DNA; 및
    표적 뉴클레오티드(target nucleotide) 서열과 혼성화 가능한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 키메릭 DNA-RNA 가이드 또는 이를 암호화하는 DNA
    를 포함하는 유전자 발현 억제용 조성물.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 가이드는 3'-말단이 포스포로티오에이트로 개질된 것인 유전자 발현 억제용 조성물.
  9. 제 7 항에 있어서, 상기 키메릭 DNA-RNA 가이드의 DNA는 상기 가이드의 3' 말단에 치환된 것인 유전자 발현 억제용 조성물.
  10. 제 7 항에 있어서, 상기 조성물은 SpCas9 닉카아제(nickase)(D10A)를 더 포함하는 것인 유전자 발현 억제용 조성물.
  11. Cpf1 단백질 또는 이를 암호화하는 DNA; 및 표적 뉴클레오티드(target nucleotide) 서열과 혼성화 가능한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 키메릭(chimeric) DNA-RNA 가이드 또는 이를 암호화하는 DNA를 포함하는 약학적 조성물.
  12. Cpf1 단백질 또는 이를 암호화하는 DNA; 및 표적 뉴클레오티드(target nucleotide) 서열과 혼성화 가능한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 키메릭(chimeric) DNA-RNA 가이드 또는 이를 암호화하는 DNA를 포함하는 유전 질환, 비유전 질환, 바이러스 감염, 박테리아 감염, 암, 또는 자가 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  13. Cpf1 단백질 또는 이를 암호화하는 DNA; 및 표적 뉴클레오티드(target nucleotide) 서열과 혼성화 가능한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 키메릭(chimeric) DNA-RNA 가이드 또는 이를 암호화하는 DNA를 포함하는 유전체 교정용 조성물을,
    표적 서열을 갖고 유전자 산물을 암호화하는 DNA 분자를 함유하고 발현하는 세포에 도입하는 단계를 포함하여, 유전자 산물의 발현을 변경시키는 방법.
  14. Cpf1 단백질 또는 이를 암호화하는 DNA; 및
    표적 뉴클레오티드(target nucleotide) 서열과 혼성화 가능한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 키메릭(chimeric) DNA-RNA 가이드 또는 이를 암호화하는 DNA를 포함하는 유전자 진단용 조성물.
KR1020200177636A 2019-12-18 2020-12-17 Cpf1 및 키메릭 DNA-RNA 가이드를 포함하는 유전체 교정 또는 발현 억제용 조성물 KR102551876B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020190170035 2019-12-18
KR20190170035 2019-12-18

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20210078430A true KR20210078430A (ko) 2021-06-28
KR102551876B1 KR102551876B1 (ko) 2023-07-05

Family

ID=76477841

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020200177636A KR102551876B1 (ko) 2019-12-18 2020-12-17 Cpf1 및 키메릭 DNA-RNA 가이드를 포함하는 유전체 교정 또는 발현 억제용 조성물

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR102551876B1 (ko)
WO (1) WO2021125840A1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024031058A2 (en) * 2022-08-05 2024-02-08 The Regents Of The University Of California Compositions and methods to treat neurological diseases

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20180028996A (ko) 2015-12-08 2018-03-19 기초과학연구원 Cpf1을 포함하는 유전체 교정용 조성물 및 그 용도
US20180187176A1 (en) * 2016-11-22 2018-07-05 Integrated Dna Technologies, Inc. Crispr/cpf1 systems and methods
KR20190058358A (ko) * 2017-11-21 2019-05-29 한국생명공학연구원 CRISPR/Cpf1 시스템을 이용한 유전체 편집용 조성물 및 이의 용도

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20180282722A1 (en) * 2016-11-21 2018-10-04 Massachusetts Institute Of Technology Chimeric DNA:RNA Guide for High Accuracy Cas9 Genome Editing
KR101896847B1 (ko) * 2017-09-22 2018-09-07 한국생명공학연구원 DNA 절단 활성이 불활성화된 Cpf1을 포함하는 유전자 발현 억제용 조성물 및 그 용도

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20180028996A (ko) 2015-12-08 2018-03-19 기초과학연구원 Cpf1을 포함하는 유전체 교정용 조성물 및 그 용도
US20180187176A1 (en) * 2016-11-22 2018-07-05 Integrated Dna Technologies, Inc. Crispr/cpf1 systems and methods
KR20190058358A (ko) * 2017-11-21 2019-05-29 한국생명공학연구원 CRISPR/Cpf1 시스템을 이용한 유전체 편집용 조성물 및 이의 용도

Also Published As

Publication number Publication date
KR102551876B1 (ko) 2023-07-05
WO2021125840A1 (ko) 2021-06-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11667917B2 (en) Composition for genome editing using CRISPR/CPF1 system and use thereof
AU2022203146B2 (en) Engineered CRISPR-Cas9 nucleases
US10633642B2 (en) Engineered CRISPR-Cas9 nucleases
US20210355465A1 (en) Engineered CRISPR-Cas9 Nucleases
CN107130000B (zh) 一种同时敲除KRAS基因和EGFR基因的CRISPR-Cas9系统及其应用
US6211351B1 (en) Chimeric mutational vectors
US11702643B2 (en) System and method for genome editing
AU2003298574B2 (en) Use of chimeric nucleases to stimulate gene targeting
EP2539445B1 (en) Use of endonucleases for inserting transgenes into safe harbor loci
KR20180069898A (ko) 핵염기 편집제 및 그의 용도
CA3204158A1 (en) Mad nucleases
KR102551876B1 (ko) Cpf1 및 키메릭 DNA-RNA 가이드를 포함하는 유전체 교정 또는 발현 억제용 조성물
JP2024125308A (ja) バクテロイデスにおけるゲノム編集
CN117925585A (zh) 腺苷脱氨酶、碱基编辑器融合蛋白、碱基编辑器系统及用途
CN111051509A (zh) 用于电介质校准的含有c2cl核酸内切酶的组合物以及使用其进行电介质校准的方法
CN112585266A (zh) 新型转录激活物
KR20220106079A (ko) Francisella novicida Cas9 모듈 기반의 역전사 효소를 사용한 유전체 치환 및 삽입 기술
KR20180128864A (ko) 매칭된 5&#39; 뉴클레오타이드를 포함하는 가이드 rna를 포함하는 유전자 교정용 조성물 및 이를 이용한 유전자 교정 방법
JP2024513087A (ja) 部位特異的改変のための組成物及び方法
KR20220039564A (ko) 신규의 개량된 염기 편집 또는 교정용 융합단백질 및 이의 용도
KR20220168554A (ko) enCpf1 및 키메릭 DNA-RNA 가이드를 포함하는 유전체 교정 또는 발현 억제용 조성물
KR20230120366A (ko) CRISPR-Cas12a 기반의 닉카아제를 포함하는 유전체 편집용 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right