KR20210077684A - 브라시카 이벤트 mon94100 및 이의 사용 방법 - Google Patents

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KR20210077684A
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dna
plant
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크리스틴 엘리스
셜리 엑스. 구오
셰리 르끌레르
밍성 펑
자니스 알. 웨이헤
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몬산토 테크놀로지 엘엘씨
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Abstract

본 발명은 브라시카 이벤트(Brassica Event) MON94100에 고유한 재조합 DNA 분자 및 브라시카 이벤트 MON94100을 함유하는 트랜스제닉 브라시카 식물, 브라시카 식물 부분, 브라시카 종자, 브라시카 세포 및 농산물뿐만 아니라, 브라시카 이벤트 MON94100을 사용 및 검출하는 방법을 제공한다. 브라시카 이벤트 MON94100을 함유하는 트랜스제닉 브라시카 식물은 디캄바에 대해 내성을 나타낸다.

Description

브라시카 이벤트 MON94100 및 이의 사용 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2018년 10월 16일자로 출원된 미국 가출원 제62/746,158호의 우선권 혜택을 주장하며, 그 개시내용은 그 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
서열 목록의 통합
서열 목록은 16,483 바이트(MS-Windows에서 측정)인 파일명 "MONS450WO_ST25"에 포함되고 2019년 9월 12일자로 생성되어, 전자 제출에 의해 본 명세서와 함께 제출되고 본 명세서에 참조에 의해 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 브라시카 이벤트(Brassica Event) MON94100의 재조합 DNA 분자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 브라시카 이벤트 MON94100을 함유하는 트랜스제닉 브라시카 식물, 부분, 종자, 세포 및 농산물뿐만 아니라, 이를 사용하는 방법 및 브라시카 이벤트 MON94100을 검출하는 방법에 관한 것이다. 브라시카 이벤트 MON94100을 함유하는 트랜스제닉 브라시카 식물, 부품, 종자 및 세포는 디캄바(dicamba)에 대한 내성을 나타낸다.
브라시카(Brassica) 작물은 세계 많은 지역에서 중요하며, 작물 생산에서 잡초 방제를 위한 제초제 사용은 잘 확립된 도구이다. 잡초는 공간, 영양소, 물, 및 빛에 대해 작물과 경쟁하며 수확물을 오염시킬 수 있으므로, 농업에서 잡초 방제는 필수적이다. 생명공학의 방법은 전이유전자(transgene)라고도 알려진 이종 유전자의 발현으로 인해 특정 제초제에 대한 내성의 형질을 갖는 트랜스제닉(transgenic) 브라시카를 생산하는 데 사용되고 있다. 트랜스제닉 제초제 내성은 작물 재배 환경에서 작물 상해 없이 제초제를 사용할 수 있게 하여 잡초 방제를 개선하고 작물 수확량을 지원한다. 글리포세이트(glyphosate) 내성 및 글루포시네이트(glufosinate) 내성에 대한 브라시카의 트랜스제닉 형질은 잡초 방제를 위해 상업적 브라시카 생산에서 널리 사용되고 있는 제초제 내성 형질의 예이다. 제초제 내성 형질은 단독으로 사용되거나 다른 형질과 조합될 수 있으며, 제초제 내성 형질의 조합은 재배자 유연성 및 선택을 증대시키고 공격적인 잡초 방제를 위해 다중 제초제 작용 방식의 사용을 가능하게 하는 잡초 방제 옵션을 제공하는데 바람직할 수 있다. 형질의 조합은 각 개별 형질을 함께 육종함으로써 달성될 수 있다.
트랜스제닉 형질은 염색체의 고정된 위치에 있는 고유한 DNA 서열인 트랜스제닉 이벤트의 게놈 내 존재에 의해 부여된다. 이벤트(event)는 식물 게놈의 단일 특정 위치에 트랜스제닉 발현 카세트의 1회 무작위 삽입에 의해 생성된다. 각 이벤트는 고유하며, 각 이벤트마다 트랜스제닉 식물, 부분, 종자 또는 세포에서 전이유전자의 발현, 및 이에 따른 전이유전자의 유효성은 트랜스제닉 발현 카세트에 사용된 요소들(elements), 이들 요소의 상호작용, 트랜스제닉 삽입체(insert)의 게놈 위치, 및 트랜스제닉 삽입체의 염색체 전후관계(context)와 같은 많은 다른 요인에 의해 영향을 받을 수 있다. 예를 들어, 유사하게 생산된 이벤트들 사이에서 전이유전자 발현의 총 수치 또는 전이유전자 발현의 공간적 또는 시간적 패턴에는 광범위한 변동이 있을 수 있다는 것이 관찰되었다. 이러한 이유로, 상업적인 농업 목적에 유용한 하나의 이벤트를 최종적으로 식별하기 위해 수백 개의 개별 이벤트를 생산하고 시험할 필요가 있다. 상업적 작물 생산에 필요한 품질을 가진 이벤트의 생성 및 선택은 수년 간의 식물 시험, 분자 특성화, 현장 실험 및 데이터 분석을 수반하는 과학적 과정이다. 첫째, 트랜스제닉 발현 카세트는 특정 작물에서 특정 전이유전자를 발현하기 위해 설계되고, 시험되고 최적화되어야 한다. 그 다음, 다양한 현장 조건 및 유전자 배경에서 식물의 여러 세대를 통해 수천 개의 고유한 이벤트를 생산하고 분석하여, 상업적 사용을 위한 고유하고 우수한 이벤트를 선택해야 한다. 이러한 이벤트는 일단 원하는 전이유전자 발현 및 분자 특성을 갖는 것으로 확인되면, 식물 육종 방법을 사용하여 그 형질을 다른 브라시카 유전자 배경 내로 도입시켜, 다른 바람직한 품질, 예를 들면, 천연 형질, 높은 수확량의 생식질, 질병 내성, 잡종 종자 생산을 위한 형질, 및 다른 트랜스제닉 제초제 내성 형질(들)과 조합된 새로운 형질을 함유하는 다양한 브라시카 품종을 생산하는 데 사용될 수 있다.
본 발명은 서열번호 10, 서열번호 9, 서열번호 8, 서열번호 7, 서열번호 6, 서열번호 5, 서열번호 4, 서열번호 3, 서열번호 2 및 서열번호 1로 이루어진 군에서 선택되는 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 제공한다. 일 실시형태에서, 재조합 DNA 분자는 브라시카 이벤트 MON94100을 포함하는 식물, 종자 또는 세포로부터 유래되며, 이벤트를 포함하는 종자의 대표적인 샘플은 ATCC 수탁 번호 PTA-125182로서 기탁되어 있다. 다른 실시형태에서, 재조합 DNA 분자는 브라시카 이벤트 MON94100을 포함하는 식물, 세포, 종자 또는 식물 부분(part)에 존재하며, 이벤트를 포함하는 종자의 대표적인 샘플은 ATCC PTA-125182로 기탁되어 있다. 다른 실시형태에서, 재조합 DNA 분자는 브라시카 이벤트 MON94100의 존재를 진단하는 앰플리콘(amplicon)이다.
본 발명은 브라시카 식물, 브라시카 종자 또는 브라시카 세포로부터 유래되는 DNA 샘플에서 서열번호 10에 특이적인 DNA 프로브(probe)로서 기능하기에 충분한 길이의 서열번호 10의 인접 뉴클레오타이드를 갖는 DNA 분자를 제공한다. 일 실시형태에서, DNA 프로브는 서열번호 13을 포함한다.
본 발명은 제1 DNA 분자 및 제2 DNA 분자를 포함하는 DNA 분자 쌍을 제공하며, 여기서 제1 및 제2 DNA 분자는 각각 서열번호 10의 단편을 포함하고, 브라시카 이벤트 MON94100을 함유하는 DNA와 증폭 반응에 함께 사용될 때 DNA 프라이머(primer)로서 기능하여 샘플 중 브라시카 이벤트 MON94100에 대해 진단을 하는 앰플리콘을 생성한다. 일 실시형태에서, DNA 프라이머는 서열번호 11 및 서열번호 12를 포함한다.
본 발명은 브라시카 식물, 브라시카 종자 또는 브라시카 세포로부터 유래되는 DNA 샘플에서 브라시카 이벤트 MON94100의 존재를 검출하는 방법을 제공하며, 이 방법은 샘플을 DNA 프로브와 접촉시키는 단계; 샘플 및 DNA 프로브를 엄격한 혼성화 조건으로 처리하는 단계; 및 샘플 내의 DNA 분자에 대한 DNA 프로브의 혼성화를 검출하는 단계를 포함하되, 여기서 DNA 분자에 대한 DNA 프로브의 혼성화는 DNA 샘플에 브라시카 이벤트 MON94100의 존재를 나타낸다.
본 발명은 브라시카 식물, 브라시카 종자 또는 브라시카 세포로부터 유래된 DNA 샘플에서 브라시카 이벤트 MON94100의 존재를 검출하는 방법을 제공하며, 이 방법은 샘플을 DNA 프라이머로서 기능하는 DNA 분자 쌍과 접촉시키는 단계; 서열번호 10, 서열번호 9, 서열번호 8, 서열번호 7, 서열번호 6, 서열번호 5, 서열번호 4, 서열번호 3, 서열번호 2 및 서열번호 1로 이루어진 군에서 선택되는 서열을 포함하는 DNA 앰플리콘을 생산하기에 충분한 증폭 반응을 수행하는 단계; 및 DNA 앰플리콘의 존재를 검출하는 단계를 포함하되, 여기서 DNA 앰플리콘의 존재는 샘플 내 브라시카 이벤트 MON94100의 존재를 나타낸다.
본 발명은 브라시카 식물, 브라시카 종자 또는 브라시카 세포로부터 유래된 샘플에서 브라시카 이벤트 MON94100의 존재를 검출하는 방법을 제공하며, 이 방법은 브라시카 이벤트 MON94100에 의해 암호화된 단백질에 특이적인 적어도 하나의 항체와 샘플을 접촉시키는 단계; 및 샘플 내 그 단백질에 대한 항체의 결합을 검출하는 단계를 포함하되, 여기서 단백질에 대한 항체의 결합은 샘플 내 브라시카 이벤트 MON94100의 존재를 나타낸다.
본 발명은 서열번호 10에 특이적인 DNA 프로브, 브라시카 이벤트 MON94100을 진단하는 앰플리콘을 생산하는 DNA 프라이머 쌍, 또는 브라시카 이벤트 MON94100에 의해 암호화된 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 브라시카 이벤트 MON94100의 존재를 검출하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 및 서열번호 10으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 DNA 분자를 포함하는 식물, 종자, 세포, 식물 부분 또는 상품(commodity product)을 제공한다. 일 실시형태에서, 식물, 종자, 세포 또는 식물 부분은 디캄바(dicamba)에 내성인 것이다.
본 발명은 지역의 잡초를 방제하는 방법을 제공하며, 이 방법은 브라시카 이벤트 MON94100을 포함하는 브라시카를 식재하는 단계 및 브라시카에 상해를 입힘이 없이 지역의 잡초를 방제하는 유효량의 디캄바를 적용하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 디캄바의 유효량은 재배 기간(growing season) 동안 약 0.1 lb ae/acre 내지 약 16 lb ae/acre이다. 일 실시형태에서, 디캄바의 유효량은 재배 기간 동안 약 0.5 lb ae/acre 내지 약 2 lb ae/acre이다.
본 발명은 지역 내의 브라시카 이벤트 MON94100을 포함하는 자생(volunteer) 브라시카를 방제하는 방법을 제공하며, 이 방법은 디캄바가 아닌 적어도 하나의 제초제를 제초 유효량으로 적용하는 단계를 포함하되, 여기서 제초제 적용은 브라시카 이벤트 MON94100을 포함하는 브라시카의 성장을 방지한다. 일 실시형태에서, 제초제는 2,4-D (2,4-디클로로페녹시아세트산), 브로목시닐(3,5-디브로모-4-하이드록시벤조나이트릴) 및 MCPA 아민(4-클로로-2-메틸페녹시 아세트산)으로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명은 디캄바에 내성인 식물을 생산하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 브라시카 이벤트 MON94100을 포함하는 식물을 그 자체 또는 제2 식물과 함께 육종하여 종자를 생산하는 단계; 및 브라시카 이벤트 MON94100을 포함하는 자손 종자를 식별하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 브라시카 이벤트 MON94100을 포함하는 자손 종자를 식별하는 것은 자손 종자를 재배하여 자손 식물을 생산하고; 자손 식물을 유효량의 디캄바로 처리하고; 그리고 디캄바에 내성인 자손 식물을 선택하는 것에 의한다. 일 실시형태에서, 브라시카 이벤트 MON94100을 포함하는 자손 종자를 식별하는 것은 자손 종자로부터 유래된 샘플에서 브라시카 이벤트 MON94100의 존재를 검출하는 것에 의한다. 일 실시형태에서, 브라시카 이벤트 MON94100을 포함하는 자손 종자를 식별하는 것은 자손 종자로부터 유래된 샘플에서 브라시카 이벤트 MON94100에 의해 암호화된 적어도 하나의 단백질의 존재를 검출하는 것에 의한다.
본 발명은 브라시카 이벤트 MON94100에 대해 식물의 접합성을 결정하는 방법으로서, 식물로부터 유래된 DNA를 포함하는 샘플을, 브라시카 이벤트 MON94100의 존재를 진단하는 제1 앰플리콘 및 브라시카 이벤트 MON94100을 포함하지 않는 야생형 브라시카 게놈 DNA를 진단하는 제2 앰플리콘을 생산할 수 있는 프라이머 세트와 접촉시키는 단계; 핵산 증폭 반응을 수행하는 단계; 제1 앰플리콘 및/또는 제2 앰플리콘을 검출하는 단계를 포함하며, 여기서 두 앰플리콘의 존재는 샘플이 브라시카 이벤트 MON94100에 대해 이형접합성임을 나타내고, 제1 앰플리콘만의 존재는 샘플이 브라시카 이벤트 MON94100에 대해 동형접합성임을 나타내는, 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 프라이머 세트는 서열번호 11 및 서열번호 12를 포함한다.
본 발명은 브라시카 식물의 디캄바에 대한 내성을 개선시키는 방법으로서, 작동가능한 결합으로 (a) 땅콩 퇴록 줄무늬 바이러스(Peanut chlorotic streak virus)로부터의 프로모터, (b) 담배 식각 바이러스(Tobacco etch virus)로부터의 리더(leader), (c) 완두(Pisum sativum)로부터의 리불로스 1,5-비스포스페이트 카복실라제 엽록체 수송 펩타이드, (d) 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia)로부터의 디캄바 모노옥시게나제 암호 서열, 및 (e) 메디카고 트룬카툴라(Medicago truncatula)로부터의 3' UTR을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 DNA 작제물을 수득하는 단계; 및 이 DNA 작제물을 브라시카 세포의 게놈에 삽입하는 단계; 브라시카 세포를 브라시카 식물로 재생시키는 단계; 및 DNA 작제물을 포함하는 브라시카 식물을 선택하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 선택은 브라시카 식물을 유효량의 디캄바로 처리하는 것에 의한다. 본 발명은 상기 방법에 의해 수득가능한 디캄바 내성인 브라시카 식물, 브라시카 종자 또는 브라시카 세포를 제공하며, 여기서 브라시카 식물, 브라시카 종자 또는 브라시카 세포는 DNA 작제물을 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 방법에 의해 생산된 브라시카 식물, 브라시카 종자 또는 브라시카 세포는 서열번호 10을 포함한다.
도 1은 브라시카 이벤트 MON94100의 서열을 나타낸다. 수평선은 서열번호 10에 상대적인 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 및 서열번호 9의 위치들에 상응하고; SQ51321 (서열번호 11) 및 SQ13805(서열번호 12)로 표지된 수평 화살표는 브라시카 이벤트 MON94100을 검출하는 데 사용될 수 있는 프라이머 쌍의 대략적인 위치를 나타내고; PB4832(서열번호 13)로 표지된 수평선은 브라시카 이벤트 MON94100을 검출하는데 사용될 수 있는 DNA 프로브의 대략적인 위치를 나타낸다.
도 2는 표 1에 기재된 바와 같이 표지된 유전자 요소를 갖는 서열번호 9에 관한 브라시카 이벤트 MON94100의 발현 카세트를 나타낸다.
서열의 간단한 설명
서열번호 1은 브라시카 게놈 DNA와 전이유전자 삽입체의 5' 접합부(junction)를 나타내는 30개 뉴클레오타이드 DNA 서열이다. 서열번호 1은 서열번호 10의 뉴클레오타이드 위치 986 내지 1015에 상응한다.
서열번호 2는 브라시카 게놈 DNA와 전이유전자 삽입체의 3' 접합부를 나타내는 30개 뉴클레오타이드 DNA 서열이다. 서열번호 2는 서열번호 10의 뉴클레오타이드 위치 3899 내지 3928에 상응한다.
서열번호 3은 브라시카 게놈 DNA와 전이유전자 삽입체의 5' 접합부를 나타내는 60개 뉴클레오타이드 DNA 서열이다. 서열번호 3은 서열번호 10의 뉴클레오타이드 위치 971 내지 1030에 상응한다.
서열번호 4는 브라시카 게놈 DNA와 전이유전자 삽입체의 3' 접합부를 나타내는 60개 뉴클레오타이드 DNA 서열이다. 서열번호 4는 서열번호 10의 뉴클레오타이드 위치 3884 내지 3943에 상응한다.
서열번호 5는 브라시카 게놈 DNA와 전이유전자 삽입체의 5' 접합부를 나타내는 100개 뉴클레오타이드 DNA 서열이다. 서열번호 5는 서열번호 10의 뉴클레오타이드 위치 951 내지 1050에 상응한다.
서열번호 6은 브라시카 게놈 DNA와 전이유전자 삽입체의 3' 접합부를 나타내는 100개 뉴클레오타이드 DNA 서열이다. 서열번호 6은 서열번호 10의 뉴클레오타이드 위치 3864 내지 3963에 상응한다.
서열번호 7은 5' 측면성(flanking) 브라시카 게놈 DNA의 1000개 뉴클레오타이드 및 전이유전자 삽입체의 5' 말단의 104개 뉴클레오타이드를 나타내는 1104개 뉴클레오타이드 DNA 서열이다.
서열번호 8은 전이유전자 삽입체의 3' 말단의 281개 뉴클레오타이드 및 3' 측면성 브라시카 게놈 DNA의 1000개 뉴클레오타이드를 나타내는 1281개 뉴클레오타이드 DNA 서열이다.
서열번호 9는 브라시카 이벤트 MON94100의 전이유전자 삽입체에 상응하는 2913개 뉴클레오타이드 DNA 서열이다.
서열번호 10은 브라시카 이벤트 MON94100에 상응하는 4913개 뉴클레오타이드 DNA 서열이며; 이 서열은 위치 1에서 1000까지 5' 측면성 게놈 DNA 서열, 위치 1001에서 3913까지 트랜스제닉 DNA 삽입체 및 위치 3914에서 4913까지 3' 측면성 게놈 DNA 서열을 함유한다.
서열번호 11은 SQ51321이라 지칭되고 샘플 중 브라시카 이벤트 MON94100 DNA를 식별하는데 사용되는 프라이머에 상응하는 23개 뉴클레오타이드 DNA 서열이다; 이것은 서열번호 10의 위치 3953 내지 3931에 상응한다.
서열번호 12는 SQ13805라고 지칭되고 샘플 중 브라시카 이벤트 MON94100 DNA를 식별하는데 사용되는 프라이머에 상응하는 26개 뉴클레오타이드 DNA 서열이다; 이것은 서열번호 10의 위치 3839 내지 3864에 상응한다.
서열번호 13은 PB4832라고 지칭되고 샘플 중 브라시카 이벤트 MON94100 DNA를 식별하는데 사용되는 프로브에 상응하는 16개 뉴클레오타이드 DNA 서열이다; 이것은 서열번호 10의 위치 3869 내지 3881에 상응한다.
이하의 정의 및 방법은 본 발명을 더 잘 정의하고 본 발명의 실시에서 본 기술분야의 기술자를 안내하기 위해 제공된다. 달리 언급되지 않는 한, 용어는 관련 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 통상적인 사용법에 따라 이해되는 것이다.
식물 형질전환 기술은 세포 게놈의 염색체 내로 외래 DNA(또한 트랜스제닉 DNA라고도 함)를 무작위로 삽입하여 "트랜스제닉" 또는 "재조합" 세포라고도 지칭되는 유전자 조작된 세포를 생산하는데 사용된다. 이 기술을 사용하면 많은 개별 세포가 형질전환됨으로써, 각각 게놈 내 외래 DNA의 무작위 삽입으로 인하여 고유 트랜스제닉 이벤트가 초래된다. 그 다음, 각각의 개별 트랜스제닉 세포로부터 트랜스제닉 식물이 재생된다. 이로 인해 고유하게 삽입된 트랜스제닉 이벤트를 게놈의 안정적인 부분으로서 함유하는 트랜스제닉 식물의 모든 세포가 초래된다. 이 트랜스제닉 식물은 그 다음 각각 고유한 트랜스제닉 이벤트를 함유하는 자손 식물을 생산하는데 사용될 수 있다. 브라시카 이벤트 MON94100은 다음과 같이 생성 및 선택되었다: (i) 트랜스제닉 발현 카세트(많은 상이한 발현 카세트를 설계 및 시험한 후 선택됨)를 포함하는 DNA 작제물을 이용한 수천 개의 브라시카 세포의 형질전환, (ii) 각각 고유한 트랜스제닉 이벤트를 함유하는 트랜스제닉 식물 집단의 재생, 및 (iii) 다양한 유전자 배경에서 수천 개의 이벤트에 대한 분자 특성, 제초제 내성 효능, 및 작물학적 성질을 수만 개의 식물을 통해 시험 및 분석하는 것을 수반하는 엄격한 다년간의 이벤트 선택. 브라시카 이벤트 MON94100은 이와 같이 생산되어, 대량의 작물학적 상업 목적에 유용한 고유하게 우수한 이벤트로서 선택되었다.
브라시카 식물의 게놈에 트랜스제닉 DNA를 삽입하는 행위는 본 기술분야에 공지된 식물 형질전환 방법에 의해 달성되며, "트랜스제닉 이벤트" 또는 "이벤트"로 알려진 새로운 트랜스제닉 게놈 DNA 서열을 생성한다. 이벤트의 DNA 서열은 삽입된 외래 DNA("트랜스제닉 삽입체"라고도 지칭됨) 및 이 삽입 위치의 어느 한쪽에서 트랜스제닉 삽입체에 바로 인접하거나 또는 "측면"인 게놈 DNA("측면 DNA"라고도 지칭됨)로 구성된다. 이벤트의 DNA 서열은 그 이벤트에 고유하고 특이적이며 다른 DNA 서열, 예컨대, 다른 이벤트 또는 형질전환되지 않은 브라시카 게놈 DNA의 서열과 비교했을 때 쉽게 식별될 수 있다. 브라시카 이벤트 MON94100은 서열번호 9로서 제공되는 트랜스제닉 삽입체 서열 및 서열번호 7 및 서열번호 8에 각각 제공된 5' 및 3' 측면 DNA 서열을 함유하는, 서열번호 10으로서 제공되는 신규의 고유 DNA 서열을 갖는다. 따라서, 브라시카 이벤트 MON94100은 상기 이벤트를 포함하는 트랜스제닉 브라시카 세포 및 식물의 염색체의 필수 부분인 DNA 분자이며, 이와 같이 고정적이고 자손 세포 및 식물로 전달될 수 있다.
본 발명은 또한 브라시카 이벤트 MON94100을 포함하는 원래(original) 형질전환된 세포 및 식물의 자손을 제공한다. 이러한 자손은 세포 조직 배양에 의해, 브라시카 이벤트 MON94100을 포함하는 브라시카 식물의 자가수정에 의해, 또는 브라시카 이벤트 MON94100을 포함하는 브라시카 식물과 상기 이벤트를 포함하거나 포함하지 않는 다른 식물 사이의 유성 이종교배에 의해 생산될 수 있다. 이러한 다른 식물은 동일하거나 상이한 이벤트(들)를 포함하는 트랜스제닉 식물 또는 비-트랜스제닉 식물, 예컨대 상이한 품종의 식물일 수 있다. 브라시카 이벤트 MON94100은 원래 부모로부터 각 세대를 거쳐 자손에게 전달된다.
본 명세서에 사용된, 용어 "브라시카"는 브라시카 속의 구성원인 식물을 의미하며, 브라시카와 교배될 수 있는 모든 식물 품종을 포함한다. 본 발명의 방법을 실시하는데 유용한 브라시카는 브라시카 나푸스(Brassica napus)(일반적으로 유채씨로 알려져 있고, 특정 품종은 카놀라로 지칭되기도 함), 브라시카 준세아(Brassica juncea), 브라시카 나포브라시카(Brassica napobrassica), 브라시카 올레라세아(Brassica oleracea), 브라시카 카리나타(Brassica carinata), 브라시카 나푸스, 브라시카 라파(Brassica rapa), 및 브라시카 캄페스트리스(Brassica campestris), 뿐만 아니라 브라시카 종 사이의 육종을 허용하는 브라시카(Brassica) 속에 속하는 임의의 다른 식물을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 브라시카 나푸스는 브라시카 라파[이전의 브라시카 캄페스트리스(Brassica campestris)]와 브라시카 올레라세아(Brassica oleracea)의 두 게놈의 교차 및 보유로부터 발생하는 이질사배체(allotetraploid)이기 때문에, 브라시카 이벤트 MON94100을 포함하는 브라시카 나푸스 식물은 브라시카 이벤트 MON94100, 및 이에 따라 디캄바 내성 형질을 브라시카 속의 다른 구성원 내로 도입시키기 위한 육종 방법과 함께 사용될 수 있다. 본 명세서에 사용된 용어 "카놀라" 또는 "카놀라 식물"은 카놀라유(즉, 2% 미만의 에루스산을 함유하는 특정 품질 지정을 만족시키는 오일)를 생산하는데 사용될 수 있는 브라시카 식물을 의미한다.
본 발명은 디캄바에 대한 내성 이벤트를 포함하는 브라시카 세포, 식물, 및 종자에 제공하는 브라시카 이벤트 MON94100을 제공한다. 브라시카 이벤트 MON94100은 DMO 단백질을 발현하기 위한 발현 카세트를 함유한다. 본 명세서에 사용된, "발현 카세트" 또는 "카세트"는 형질전환된 세포에 의해 발현되어야 하는 별개의 구성요소들의 조합을 포함하는 재조합 DNA 분자이다. 표 1은 서열번호 9에 함유되고 도 2에 예시된 바와 같은 요소의 목록을 제공한다.
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본 명세서에 사용된, 용어 "재조합체"는 일반적으로 자연에서 발견되지 않으며 인간의 개입에 의해 생성된 비천연 DNA, 단백질 또는 유기체를 지칭한다. 본 명세서에 사용된 "재조합 DNA 분자"는 당연히 함께 발생하지 않고 인간 개입의 결과 인 DNA 분자의 조합을 포함하는 DNA 분자, 예를 들어, 서로에게 이종인 적어도 2개의 DNA 분자의 조합으로 구성된 DNA 분자, 예컨대, 전이유전자 및 이 전이유전자에 인접한 식물 게놈 DNA를 포함하는 DNA 분자이다. 재조합 DNA 분자의 예는 서열번호 1-10에서 선택되는 적어도 하나의 서열을 포함하는 DNA 분자이다. 본 명세서에 사용된 "재조합 식물"은 자연에서 정상적으로 존재하지 않을 수 있는 식물이고, 인간 개입의 결과이고, 트랜스제닉 DNA 분자를 함유한다. 이러한 게놈 변경의 결과로서, 재조합 식물은 관련 야생형 식물과는 완전히 다른 새로운 것이다. 재조합 식물의 예는 브라시카 이벤트 MON94100을 함유하는 브라시카 식물이다.
본 명세서에 사용된, 용어 "전이유전자"는 식물 형질전환 방법과 같은 인간 개입의 결과로서 유기체의 게놈에 인공적으로 통합된 DNA 분자를 지칭한다. 전이유전자는 상기 유기체에 대해 이종성일 수 있다. 본 명세서에 사용된 용어 "트랜스제닉 삽입체"는 식물 형질전환 기술에 의해 브라시카 게놈 내로 삽입되어 브라시카 이벤트 MON94100을 생산하는 외래 DNA를 지칭한다. 브라시카 이벤트 MON94100의 트랜스제닉 삽입체의 서열은 서열번호 9로서 제공된다. 용어 "트랜스제닉"은 전이유전자를 포함하는 것을 지칭하고, 예를 들어 "트랜스제닉 식물"은 전이유전자를 포함하는 식물을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 용어 "이종"은 자연의 유기체 또는 제2 분자와 일반적으로 연관되지 않은 제1 분자를 지칭한다. 예를 들어, DNA 분자는 제1 종에서 유래되어 제2 종의 게놈에 삽입될 수 있다. 따라서, DNA 분자는 게놈 및 유기체에 대해 이종성일 것이다.
본 명세서에 사용된 용어 "키메라"는 제1 DNA 분자를 제2 DNA 분자에 융합시킴으로써 생성된 단일 DNA 분자를 지칭하며, 여기서 제1 또는 제2 DNA 분자는 다른 분자에 융합된 상기 배열로는 정상적으로 발견되지 않는 것이다. 따라서, 키메라 DNA 분자는 자연에서 정상적으로 발견되지 않는 새로운 DNA 분자이다. 키메라 DNA 분자의 예는 서열번호 1 내지 10으로부터 선택되는 적어도 하나의 서열을 포함하는 DNA 분자이다.
본 명세서에 사용된 용어 "DMO" 또는 "디캄바 모노옥시게나제(dicamba monooxygenase)"는 비제초성 화합물인 3,5-다이클로로살리실산에 대한 O-탈메틸화 반응을 통해 디캄바의 비활성화를 촉매하는 단백질을 지칭한다. 디캄바 모노옥시게나제는 원래 토양 근권에서 흔히 발견되는 미생물인 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia)에서 단리되었다. 디캄바 모노옥시게나제를 암호화하는 핵산 분자의 예시적인 서열 및 이들 핵산 분자에 의해 암호화된 단백질 서열은 본 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 미국 특허 제7,884,262호에 기재되어 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "단리된"은 천연 또는 자연 상태에서 정상적으로 연관되어 있는 다른 분자로부터 분자를 분리하는 것을 지칭한다. 따라서, 용어 "단리된"은 천연 또는 자연 상태에서 연관되어 있는 다른 DNA 분자(들)로부터 분리된 DNA 분자를 지칭할 수 있다. 이러한 DNA 분자는 재조합 DNA 분자와 같은 재조합 상태로 존재할 수 있다. 따라서, 자연 상태로부터 제거되어, 정상적으로 연관되어 있지 않는 다른 DNA 분자에 융합된 DNA 분자는 단리된 DNA 분자일 것이다. 이러한 단리된 DNA 분자는 재조합 DNA의 제조 또는 세포, 식물 또는 종자의 염색체에 외래 DNA 분자의 통합과 같은 생명공학 기술의 사용으로부터 초래될 수 있을 것이다.
본 발명은 DNA 분자 및 이의 상응하는 DNA 서열을 제공한다. 본 명세서에 사용된 용어 "DNA" 및 "DNA 분자"는 데옥시리보핵산(deoxyribonucleic acid, DNA) 분자를 지칭한다. DNA 분자는 게놈 또는 합성 기원일 수 있고 관례적으로 5'(상류) 말단부터 3'(하류) 말단까지이다. 본 명세서에서 사용된 용어 "DNA 서열"은 DNA 분자의 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 사용된 명명법은 미국 연방 규정집 §1.822의 제목 37에 의해 요구되고 문헌[WIPO Standard ST.25(1998), Appendix 2, Tables 1 and 3]에서의 표들에 명시된 것이다. 관례상, 본 발명의 DNA 서열 및 이의 단편은 2개의 상보적 DNA 서열 가닥 중 한 가닥만을 참조하여 개시한다. 함축 및 의도적으로, 본 기술분야에서 역상보성 서열로 지칭되기도 하는 본 명세서에 제공된 서열의 상보성 서열(상보성 가닥의 서열)은 본 발명의 범위 내에 있고 권리를 주장하는 주제의 범위 내에 있는 것으로 분명히 의도된 것이다. 따라서, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 서열번호 1 내지 10 및 이의 단편에 대한 언급은 상보성 가닥 및 이의 단편의 서열을 포함하고 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "단편"은 전체 중 더 작은 조각을 지칭한다. 예를 들어, 서열번호 10의 단편은 서열번호 10의 전체 서열 중 적어도 약 10개의 연속 뉴클레오타이드, 적어도 약 11개의 연속 뉴클레오타이드, 적어도 약 12개의 연속 뉴클레오타이드, 적어도 약 13개의 연속 뉴클레오타이드, 적어도 약 14개의 연속 뉴클레오타이드, 적어도 약 15개의 연속 뉴클레오타이드, 적어도 약 16개의 연속 뉴클레오타이드, 적어도 약 17개의 연속 뉴클레오타이드, 적어도 약 18개의 연속 뉴클레오타이드, 적어도 약 19개의 연속 뉴클레오타이드, 적어도 약 20개의 연속 뉴클레오타이드, 적어도 약 25개의 연속 뉴클레오타이드, 적어도 약 30개의 연속 뉴클레오타이드, 적어도 약 35개의 연속 뉴클레오타이드, 적어도 약 40개의 연속 뉴클레오타이드, 적어도 약 45개의 연속 뉴클레오타이드, 적어도 약 50개의 연속 뉴클레오타이드, 적어도 약 60개의 연속 뉴클레오타이드, 적어도 약 70개의 연속 뉴클레오타이드, 적어도 약 80개의 연속 뉴클레오타이드, 적어도 약 90개의 연속 뉴클레오타이드, 또는 적어도 약 100개의 연속 뉴클레오타이드인 서열을 포함할 것이다.
브라시아 이벤트 MON94100의 트랜스제닉 삽입체에 대한 DNA 서열은 서열번호 9로서 제공된다. 트랜스제닉 삽입체 및 이 트랜스제닉 삽입체의 양쪽 측면에 있는 브라시카 게놈 DNA의 DNA 서열은 서열번호 10으로서 제공된다. 측면 DNA의 일부 및 트랜스제닉 삽입체의 5 '말단의 DNA 서열은 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5 및 서열번호 7로서 제공된다. 측면 DNA 부분의 일부 및 트랜스제닉 삽입체의 3' 말단의 DNA 서열은 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6 및 서열번호 8로서 제공된다.
측면 브라시카 게놈 DNA에 대한 트랜스제닉 삽입체 한쪽 말단의 포스포다이에스터 결합 연결에 의하여 접속부에 걸쳐 있는 영역의 DNA 서열은 본 명세서에서 "접합부(junction)"라 지칭된다. 접합부는 하나의 인접(contiguous) 분자처럼 트랜스제닉 삽입체와 측면 DNA의 접속점이다. 하나의 접합부는 트랜스제닉 삽입체의 5' 말단에서 발견되고, 다른 접합부는 트랜스제닉 삽입체의 3' 말단에서 발견되며, 각각 5' 및 3' 접합부로서 본 명세서에 지칭된다. "접합부 서열"은 이벤트의 5' 또는 3' 접합부에 걸쳐 있는 임의의 길이의 DNA 서열을 지칭한다. 브라시카 이벤트 MON94100의 접합부 서열은 서열번호 10을 사용하는 본 기술분야의 기술자에게는 명백한 것이다. 브라시카 이벤트 MON94100의 접합부 서열의 예는 서열번호 1 내지 8로서 제공된다. 도 1은 5'에서 3'로 배열된 서열번호 1 내지 10의 물리적 배열을 예시한다. 브라시카 이벤트 MON94100의 접합부 서열은 브라시카 이벤트 MON94100을 함유하는 식물, 종자 또는 세포의 게놈의 일부로서 존재할 수 있다. 식물, 식물 부분, 종자 또는 세포로부터의 샘플에서 서열번호 1 내지 8 또는 10 중 어느 하나 이상의 식별은 DNA가 브라시카 이벤트 MON94100을 함유하는 브라시카로부터 수득되었음을 나타내며, 브라시카 이벤트 MON94100의 존재에 대해 진단성이다.
본 발명의 식물, 종자, 세포, 식물 부분, 및 상품은 브라시카 이벤트 MON94100의 존재를 나타내는 DNA 또는 단백질 분자의 검출에 사용될 수 있다. 샘플 중 브라시카 이벤트 MON94100의 존재를 검출하기 위한 프라이머 또는 프로브로서 사용될 수 있는 예시적인 DNA 분자가 제공된다. 이러한 프라이머 또는 프로브는 표적 핵산 서열에 특이적이며, 그 결과 여기에 기재된 방법에 의해 브라시카 이벤트 MON94100을 식별하는데 유용하다. 브라시카 이벤트 MON94100의 존재에 대한 검출은 본 기술분야에 공지된 방법, 예컨대 핵산의 열적 증폭 또는 핵산 혼성화 기술(예컨대, 노던 블로팅 및 서던 분석)을 사용하여 수행할 수 있다.
"프라이머"는 증폭 반응을 수반하는 어닐링(annealing) 또는 혼성화 방법에 사용하기 위해 설계된 DNA 분자이다. 증폭 반응은 주형 DNA를 증폭시켜 앰플리콘을 생산하는 시험관내 반응이다. 본 명세서에 사용된, "앰플리콘"은 증폭 기술을 사용하여 합성한 DNA 분자이다. 본 발명의 앰플리콘은 서열번호 1 내지 10 중 하나 이상, 또는 이의 단편을 포함하는 DNA 서열을 갖는다. 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)과 같은 증폭 반응에는 브라시카 게놈 DNA의 샘플과 같은 주형 DNA와 함께 프라이머 쌍이 사용되어 앰플리콘을 생산할 수 있고, 여기서 생산된 앰플리콘은 프라이머들이 주형에 혼성화된 두 부위 사이에 위치한 주형 DNA의 서열에 상응하는 DNA 서열을 가질 것이다. 프라이머는 전형적으로 상보성 표적 DNA 가닥에 혼성화하여 프라이머와 표적 DNA 가닥 사이에 혼성체(hybrid)를 형성하도록 설계된다. 프라이머의 존재는 표적 DNA 가닥을 주형으로서 사용하는 프라이머의 연장(extension)을 시작하는 폴리머라제에 의한 인식 지점이다. 프라이머 쌍은 이들 사이의 뉴클레오타이드 분절을 증폭시키기 위해 이중 가닥 뉴클레오타이드 분절의 대향 가닥에 결합하는 두 프라이머의 사용을 지칭한다. 프라이머 서열의 예는 서열번호 11(SQ51321) 및 서열번호 12(SQ13805)로서 제공된다. 서열번호 11 및 서열번호 12로서 제공된 프라이머 쌍은 제1 DNA 및 제2 DNA 분자로서 유용하고, 여기서 제1 DNA 분자는 서열번호 10의 트랜스제닉 삽입 DNA 서열의 단편이고 제2 DNA 서열은 서열번호 10의 측면 DNA 서열의 단편이며, 각각 브라시카 이벤트 MON94100을 함유하는 DNA와 증폭 반응에 함께 사용된 경우 DNA 프라이머로서 기능하여, 샘플 중 브라시카 이벤트 MON94100에 대해 진단성인 앰플리콘을 생산하기에 충분한 길이인 것이다. 본 발명의 프라이머 쌍은 특정 실시형태에서 제1 및 제2 DNA 분자를 포함하는 것으로서 정의될 수도 있으며, 여기서 제1 DNA 분자는 서열번호 10의 브라시카 게놈 부분의 단편이고, 제2 DNA 분자는 서열번호 10의 전이유전자 부분의 단편이며, 각각 브라시카 이벤트 MON94100을 함유하는 DNA와 증폭 반응에 함께 사용된 경우 DNA 프라이머로서 기능하여, 샘플 중 브라시카 이벤트 MON94100에 대해 진단성인 앰플리콘을 생산하기에 충분한 길이인 것이다.
"프로브"는 표적 핵산의 가닥에 상보적이고 혼성화 검출 방법에 유용한 핵산 분자이다. 본 발명에 따른 프로브는 표적 DNA 서열에 특이적으로 결합하는 데옥시리보핵산 또는 리보핵산뿐만 아니라 폴리아미드 및 다른 프로브 물질도 포함하며, 이러한 결합의 검출은 표적 DNA 서열의 존재 또는 부재를 검출하는데 유용할 수 있다. 프로브는 통상적인 검출가능한 표지 또는 리포터(reporter) 분자, 예컨대 방사능 동위원소, 리간드, 화학발광 제제, 또는 효소에 부착될 수 있다. 브라시카 이벤트 MON94100을 검출하기 위한 프로브로서 유용한 예시적인 DNA 서열은 서열번호 13(PB4832)으로서 제공된다.
프라이머 및 프로브를 설계 및 사용하는 방법은 본 기술분야에 잘 알려져 있다. 서열번호 1 내지 10의 단편을 포함하는 DNA 분자는 브라시카 이벤트 MON94100을 검출하기 위한 프라이머 및 프로브로서 유용하고, 본 명세서에 제공된 서열을 사용하여 본 기술분야의 기술자에 의해 쉽게 설계될 수 있다.
본 발명에 따른 프로브 및 프라이머는 표적 서열과 완전한 서열 동일성을 가질 수 있지만, 표적 서열에 우선적으로 혼성화하는 능력을 보유하는 표적 서열과 상이한 프라이머 및 프로브도 통상적인 방법에 의해 설계될 수 있다. 핵산 분자는 프라이머 또는 프로브로서 작용하도록 하기 위해, 서열이 충분히 상보적이어서 사용된 특별한 용매 및 염 농도 하에서 안정한 이중 가닥 구조를 형성할 수 있도록 하기만 하면 된다. 임의의 통상적인 핵산 혼성화 또는 증폭 방법은 샘플 중 브라시카 이벤트 MON94100으로부터 트랜스제닉 DNA의 존재를 식별하는데 사용될 수 있다. 프로브 및 프라이머는 일반적으로 길이가 적어도 약 11개 뉴클레오타이드, 적어도 약 18개 뉴클레오타이드, 적어도 약 24개 뉴클레오타이드, 또는 적어도 약 30개 뉴클레오타이드 또는 그 이상이다. 이러한 프로브 및 프라이머는 엄격한 혼성화 조건 하에서 표적 DNA 서열에 특이적으로 혼성화한다. 엄격한 혼성화 조건은 본 기술분야에 알려져 있고, 예를 들어 MR Green and J Sambrook, Molecular cloning: a lab manual, 4th Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2012)에 기술되어 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 2개의 핵산 분자는 이 두 분자가 역평행 이중 가닥 핵산 구조를 형성할 수 있다면 서로 특이적으로 혼성화할 수 있다. 핵산 분자는 완전한 상보성을 나타낸다면 다른 핵산 분자의 "보체"이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 두 분자는 정렬된 경우 제1 분자의 모든 뉴클레오타이드가 제2 분자의 모든 뉴클레오타이드에 상보적이라면 "완전한 상보성"을 나타낸다. 두 분자가 적어도 통상적인 "낮은 엄격성" 조건 하에서 서로 어닐링된 상태를 유지하도록 하기에 충분한 안정성을 갖고 서로에게 혼성화할 수 있다면 두 분자는 "최소 상보성"이다. 이와 유사하게, 분자는 통상적인 "높은 엄격성" 조건 하에서 서로 어닐링된 상태를 유지하도록 하기에 충분한 안정성을 갖고 서로에게 혼성화할 수 있다면 "상보성"이다. 따라서, 완전한 상보성으로부터의 일탈이 이중 가닥 구조를 형성하는 분자의 능력을 완전히 불가능하게 하지 않는 한, 상기 일탈은 허용될 수 있다.
DNA 혼성화를 촉진하는 적절한 엄격성 조건, 예를 들어, 약 45℃에서 6.0 x 염화나트륨/시트르산 나트륨(SSC)에 이어 50℃에서 2.0 x SSC의 세척은 본 기술분야의 기술자에게 공지되어 있거나, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y.(1989), 6.3.1-6.3.6에서 찾아볼 수 있다. 예를 들어, 세척 단계에서 염 농도는 50℃에서 약 2.0 x SSC의 낮은 엄격성에서부터 50℃에서 약 0.2 x SSC의 높은 엄격성 중에서 선택될 수 있다. 또한, 세척 단계의 온도는 실온, 약 22℃에서의 낮은 엄격성 조건으로부터 약 65℃의 높은 엄격성 조건으로 증가될 수 있다. 온도 및 염은 모두 변동될 수 있거나, 또는 다른 변수가 변경되는 동안 온도 또는 염 농도는 일정하게 유지될 수 있다.
샘플 중 브라시카 이벤트 MON94100의 존재를 검출하기 위한 항체를 생산하는 데 사용될 수 있는 단백질이 제공된다. 이러한 항체는 브라시카 이벤트 MON94100에 의해 암호화된 하나 이상의 단백질에 특이적이다. 이러한 단백질을 암호화하는 DNA 서열은 서열번호 10에 제공되며 암호 서열의 시작 위치 및 종결 위치는 표 1에 표시된다. 각 단백질을 암호화하는 DNA 서열 및 이 서열에 의해 암호화된 단백질은 여기에 기재된 방법에 의해 브라시카 이벤트 MON94100의 존재를 검출하기 위한 항체를 생산하는데 유용하다. 브라시카 이벤트 MON94100의 존재의 검출은 본 기술분야에 공지된 임의의 단백질 검출 기술, 예컨대 웨스턴 블롯팅, 면역 침전, 효소 면역흡착 검정(ELISA), 검출가능한 표지 또는 리포터 분자(예컨대, 방사능 동위원소, 리간드, 화학발광 제제, 또는 효소)에 대한 항체 부착, 또는 리포터 분자에 대한 효소 작용을 사용하여 수행될 수 있다. 한 가지 방법은 브라시카 이벤트 MON94100에 의해 암호화된 DMO 단백질에 결합하는 항체와 샘플을 접촉시킨 다음, 항체 결합의 존재 또는 부재를 검출하는 방법에 대해 대비한다. 이러한 항체의 결합은 브라시카 이벤트 MON94100에 의해 암호화된 하나 이상의 단백질의 존재에 대해 진단성이다.
브라시카 이벤트 MON94100의 존재를 검출하기 위한 단백질 및 핵산 검출 키트가 제공된다. 이러한 키트에 대한 변형은 또한 본 명세서에 개시된 조성물 및 방법과 단백질 및 핵산 검출 분야에 잘 알려진 방법을 사용하여 개발될 수 있다. 단백질 및 핵산 검출 키트는 브라시카 이벤트 MON94100을 함유하는 식물과 육종하기 위한 방법에 적용될 수 있다. 이러한 키트는 서열번호 1 내지 10의 단편을 함유하는 프라이머 또는 프로브, 또는 브라시카 이벤트 MON94100에 의해 암호화된 단백질에 특이적인 항체를 함유하고, 하나 이상의 반응 시약(예컨대, 뉴클레오타이드, 폴리머라제, 완충 용액)과 같은 다른 요소를 함유할 수 있다. 키트는 또한 양성 대조군, 음성 대조군 및 사용에 대한 프로토콜도 포함할 수 있다.
검출 키트의 일 예는 샘플 중 브라시카 이벤트 MON94100의 존재 또는 부재를 검출하는데 유용한 DNA 프로브로서 기능하기에 충분한 길이의 서열번호 10의 인접 뉴클레오타이드의 적어도 하나의 DNA 분자를 포함한다. 프로브로서 사용하기에 충분한 예시적인 DNA 분자는 서열번호 13으로서 제공된 서열을 포함하는 것이다. 다른 프로브는 본 기술분야의 기술자에 의해 쉽게 설계될 수 있다. 검출 키트의 다른 예는 샘플 중 브라시카 이벤트 MON94100의 존재 또는 부재를 검출하는 데 유용한 앰플리콘의 생성에 유용한 적어도 하나의 프라이머 쌍을 포함한다. 이러한 방법은 또한 앰플리콘 또는 이의 단편을 서열결정하는 것을 포함할 수 있다. 프라이머 쌍으로서 사용하기에 충분한 예시적인 DNA 분자는 각각 서열번호 11 및 서열번호 12로서 제공된 서열을 포함하는 것이다. 다른 프라이머 쌍은 본 기술분야의 기술자에 의해 쉽게 설계될 수 있다. 본 발명의 키트는 또한 본 명세서에 기재된 검출 또는 진단 반응을 수행하기 위한 시약을 선택적으로 포함할 수 있다. 검출 키트의 다른 예는 브라시카 이벤트 MON94100에 의해 암호화된 적어도 하나의 단백질에 특이적인 적어도 하나의 항체를 포함한다. 예를 들어, 이러한 키트는 스트립의 끝(tip)이 수용액과 접촉할 때 활성화되는 시약을 포함하는 측류식 스트립(lateral flow strip)을 활용할 수 있다. 항체 생산에 사용하기에 충분한 예시적인 단백질은 서열번호 10으로서 제공된 서열 또는 이의 임의의 단편에 의해 암호화된 것이다.
본 발명은 브라시카 이벤트 MON94100을 함유하는 브라시카 식물, 자손, 종자, 세포 및 식물 부분, 및 이를 사용하여 생산한 상품을 제공한다. 본 발명의 식물, 자손, 종자, 세포, 식물 부분 및 상품은 서열번호 1 내지 8 및 서열번호 10으로서 제공된 서열 중 적어도 하나를 갖는 검출가능한 양의 DNA를 함유한다.
본 발명의 식물, 자손, 종자, 세포 및 식물 부분은 또한 하나 이상의 추가 바람직한 형질(들)을 함유할 수 있다. 이러한 바람직한 형질은 트랜스제닉 형질, 천연 형질, 또는 게놈 편집 또는 다른 종래의 돌연변이유발 방법과 같은 다른 방법에 의해 생성된 형질일 수 있다. 바람직한 형질은, 예를 들어, 브라시카 이벤트 MON94100을 함유하는 브라시카 식물을 추가 형질(들)을 함유하는 다른 브라시카 식물과 교배함으로써, 브라시카 이벤트 MON94100과 조합될 수 있다. 이러한 형질로는 곤충 저항성 증가, 꼬투리 또는 종자 탈립 개선, 기름 품질 향상, 용수 효율 증가, 수확량 증가, 가뭄 저항성 증가, 종자 품질 증가, 영양소 품질 개선, 잡종 종자 생산 및 제초제 내성 증가를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않으며, 여기서 형질은 상기 트랜스제닉 형질이 없는 브라시카 식물에 대비하여 측정된다.
본 발명의 식물은 브라시카 이벤트 MON94100을 함유하는 자손을 생산하는데 사용될 수 있다. 본 명세서에 사용된 "자손"은 서열번호 1 내지 8 및 서열번호 10으로부터 선택되는 적어도 하나의 서열을 갖는 DNA 분자를 포함하는 식물에 의해 나타나는, 조상 식물에서 유전되는 브라시카 이벤트 MON94100을 포함하는 임의의 식물, 종자, 및 세포를 포함한다. 식물, 종자 및 세포는 브라시카 이벤트 MON94100에 대해 동형접합성 또는 이형접합성일 수 있다. 자손 식물은 브라시카 이벤트 MON94100을 함유하는 브라시카 식물에 의해 생산된 종자 또는 브라시카 이벤트 MON94100을 함유하는 화분에 의해 수정된 브라시카 식물에 의해 생산된 종자로부터 재배될 수 있다.
본 명세서에 사용된, 본 발명의 "식물 부분"은 브라시카 이벤트 MON94100을 함유하는 식물의 임의의 부분이다. 식물 부분은 조직 샘플, 화분, 배주, 꼬투리, 종자, 꽃, 뿌리, 줄기, 섬유 및 잎 전체 또는 일부를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 식물 부분은 생존가능하거나 생존불가능할 수 있다.
본 발명은 브라시카 이벤트 MON94100을 함유하는 식물로부터 생산되는 상품을 제공한다. 본 발명의 상품은 서열번호 1 내지 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 DNA 서열을 포함하는 검출가능한 양의 DNA를 함유한다. 본 명세서에 사용된 "상품"은 브라시카 이벤트 MON94100을 포함하는 식물, 종자, 세포 또는 식물 부분으로부터의 물질을 포함하는 임의의 조성물 또는 산물을 지칭한다. 상품은 가공된 종자, 낟알, 식물 부분, 으깬 곡물 및 기름을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 상품은 무생물 식물 물질, 즉 생존성이 아니고 브라시카 이벤트 MON94100을 포함하는 식물, 종자, 세포 또는 식물 부분에서 유래되는 물질일 수 있다. 본 발명의 상품은 브라시카 이벤트 MON94100에 상응하는 DNA의 검출가능한 양을 함유할 것이다. 샘플 중 이러한 DNA 중 하나 이상의 검출은 상품의 함량 또는 출처를 결정하는데 사용될 수 있다. 본 명세서에 개시된 검출 방법을 포함하여, DNA 분자에 대한 임의의 표준 검출 방법이 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용된, 디캄바는 화학물질명이 3,6-다이클로로-2-메톡시벤조산 및 디캄바의 임의의 염 또는 에스터, 예를 들어 비제한적으로 디캄바-Na 염, 디캄바-부토틸, 디캄바-다이글리콜아민 염, 디캄바-다이메틸아민 염, 디캄바-다이메틸암모늄 염, 디캄바-다이에탄올암모늄, N,N-비스-(아미노프로필) 메틸아민 염, 디캄바-아이소프로필암모늄, 디캄바-칼륨, 디캄바-나트륨 및 디캄바-트롤아민인 제초 활성 성분을 의미한다. 디캄바는 하나 이상의 추가 제초제(들)를 포함하는 제형에 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용된, "제초제 내성(herbicidal tolerant)" 또는 "제초제 내성(herbicidal tolerance)" 또는 "내성"은 하나 이상의 제초제(들)의 존재 또는 적용에 의해 전체적으로 또는 부분적으로 영향을 받지 않는 능력, 예를 들어 적용되었을 때 제초제의 독성 효과에 저항하는 능력을 의미한다. 세포, 종자 또는 식물은 하나 이상의 제초제(들)의 존재 하에 적어도 일부 정상 성장 또는 표현형을 유지할 수 있는 경우, "제초제 내성"이거나, 또는 "개선된 내성"을 갖는다. 형질은 그 존재가 야생형 또는 대조군 세포, 식물 또는 종자에 비해 세포, 식물 또는 종자에 제초제에 대한 개선된 내성을 부여할 수 있는 경우 제초제 내성 형질이다. 제초제 내성 형질을 포함하는 작물은 계속 성장할 수 있으며 제초제의 존재에 의해 최소한의 영향을 받는다. 단백질은 이 단백질의 발현이 야생형 또는 대조군 세포, 식물 또는 종자에 비해 세포, 식물 또는 종자에 대해 제초제에 대한 개선된 내성을 부여할 수 있다면, "제초제 내성"을 부여한다. 제초제 내성 단백질의 예는 디캄바 모노옥시게나제이다. 제초제 내성은 특정 제초제에 대해 완전 또는 부분 불감성(insensitivity)일 수 있으며 특정 제초제에 대한 내성 또는 불감성 백분율(%)로서 표현될 수 있다.
본 명세서에 사용된 "제초제 상해" 또는 "상해"는 제초제의 적용으로 인한 식물 상해를 지칭한다. "상해율" 또는 "상해 백분율"은 제초제로 인한 상해의 육안 평가를 지칭한다. 브라시카 이벤트 MON94100을 함유하는 브라시카 식물의 경우, 이 식물은 디캄바 적용 후 감소된 상해를 가질 것이다. 디캄바는 인돌-3-아세트산과 같은 천연 옥신과 유사하게 식물 성장에 영향을 미칠 수 있지만, 그 식물에 의해 대사적으로 조절되지 않는 합성 옥신이다. 결과적으로, 디캄바 처리된 식물 조직은 성장이 식물에 부정적인 영향을 미치는 경우에도 계속 성장할 것이다. 잎 상편생장은 잎들이 성장 장애의 결과로서 뚜렷이 아래로 구부러지거나 말리는 현상이며 제초제 상해의 육안 평가에 유용한 디캄바의 하나의 효과이다.
본 명세서에 사용된 "잡초"는 임의의 원치 않는 식물이다. 식물은 일반적으로 농업 또는 원예 목적에 바람직하지 않은 것[예컨대, 아마란투스(Amaranthus) 종]으로 간주될 수 있거나, 또는 특정 상황에서 바람직하지 않은 것(예를 들어, 자생 식물이라고도 알려진, 다른 종의 현장에 있는 한 종의 작물)으로 간주될 수 있다. 잡초는 본 기술분야에 일반적으로 알려져 있고 지역, 계절, 재배 환경 및 시간에 따라 다르다. 잡초 종의 목록은 농업 및 과학 학회(예컨대, 미국 잡초 과학 학회 및 캐나다 잡초 과학 학회), 정부 기관(예컨대, 미국 농무부), 및 산업 및 농민 협회(예컨대, 캐나다 카놀라 위원회)에서 입수가능하다.
본 발명은 디캄바를 적용하여 브라시카 재배용 지역 내 잡초를 방제하기 위한 방법을 제공하며, 여기서 브라시카 이벤트 MON94100을 포함하는 종자 또는 식물은 제초제를 적용하기 전, 적용하는 시점 또는 적용한 후에 식재되며, 제초제 적용은 잡초 성장을 방지하거나 억제하고 브라시카 식물에 상해를 입히지 않는다. 식물 성장 지역은 제초제 적용 시점에 잡초 종자 또는 식물을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 본 발명의 방법에 사용되는 디캄바는 재배 기간 동안 단독으로 또는 하나 이상의 제초제(들)와 조합으로 적용될 수 있다. 본 발명의 방법에 사용되는 제초제(들)는 하나 이상의 제초제(들)와 조합하여, 시간적(예를 들어, 탱크 혼합물로서 또는 순차적 적용으로), 공간적(예를 들어, 브라시카 종자를 식재하기 전 및 후를 포함한 재배 기간 동안 다른 시기에), 또는 시공간적으로 적용될 수 있다. 예를 들어, 브라시카 이벤트 MON94100을 함유하는 식물에 상해를 입힘이 없이 지역 내의 잡초를 방제하기 위한 목적으로, 지역에 브라시카 이벤트 MON94100을 포함하는 종자를 식재하고, 그 재배 기간 동안 디캄바를 단독으로 또는 다른 제초제와 임의의 조합으로 제초 유효량으로 적용하는 것으로 이루어지는 잡초를 방제하기 위한 방법이 제공된다. 이러한 적용은 식재 전(브라시카 이벤트 MON94100을 함유하는 종자를 식재하기 전 임의의 시기, 예를 들어 소멸 목적으로, 즉 종자 식물 이전의 신생 또는 기존 잡초에 대한 적용), 발아(emergence) 전(브라시카 이벤트 MON94100을 함유하는 종자가 식재된 후 및 브라시카 이벤트 MON94100을 함유하는 식물이 발아하기 전의 임의의 시기), 또는 발아 후(브라시카 이벤트 MON94100을 함유하는 식물이 발아한 후 임의의 시기)일 수 있다. 디캄바, 또는 디캄바와 하나 이상의 다른 제초제(들)의 조합을 함께 또는 개별적으로, 재배 기간 동안 수 회 적용할 수 있고, 예를 들어, 2회 적용(예컨대, 식재 전 적용 및 발아 후 적용, 또는 발아 전 적용 및 발아 후 적용), 또는 3회 이상 적용(예컨대, 식재 전 적용 및 2회의 발아 후 적용)이 사용될 수 있다.
본 발명의 방법을 실시하는 데 있어서 제초제 적용은 권장되는 상업적 비율 또는 이의 임의의 분획 또는 수배 적용, 예컨대 권장되는 상업적 비율의 2배일 수 있다. 제초제 비율은 제초제 및 제형에 따라, 산 당량/파운드/에이커(lb ae/acre)로서, 또는 활성 성분/파운드/에이커(lb ai/acre)로서 표현될 수 있다. 잡초 방제 지역에 사용하기 위한 디캄바의 제초 유효량은 재배 기간 동안 약 0.1 lb ae/ac 내지 최대 약 16 lb ae/ac의 범위로 이루어져야 한다(예컨대, 디캄바는 약 0.5 lb ae/acre 내지 약 2.0 lb ae/acre의 비율로 적용될 수 있다).
본 발명은 2,4-D(2,4-다이클로로페녹시아세트산), 브로목시닐(3,5-다이브로모-4-하이드록시벤조나이트릴), 및 MCPA 아민(4-클로로-2-메틸페녹시아세트산)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 합성 옥신과 같은 다른 제초제의 제초 유효량을 적용하여 작물 재배 지역에서 브라시카 이벤트 MON94100을 포함하는 자생 브라시카를 방제하는 방법을 제공하며, 여기서 제초제 적용은 브라시카 이벤트 MON94100을 포함하는 브라시카의 성장을 방해한다. 자생 브라시카를 방제하기 위해 지역에 사용하기 위한 2,4-D 제초제의 제초 유효량은 재배 기간 동안 약 0.1 lb ae/ac 내지 최대 약 16 lb ae/ac의 비율로 적용될 수 있다(예를 들어, 2,4-D는 재배 기간 동안 약 0.5 lb ae/acre 내지 약 2.0 lb ae/acre의 비율로 적용될 수 있다). 자생 브라시카를 방제하기 위한 지역에 사용하기 위한 브로목시닐 제초제의 제초 유효량은 재배 기간 동안 약 0.1 lb ae/ac 내지 최대 약 16 lb ae/ac의 비율로 적용될 수 있다(예를 들어, 브로목시닐은 재배 기간 동안 약 0.5 lb ae/acre 내지 약 2.0 lb ae/acre의 비율로 적용될 수 있다). 자생 브라시카를 방제하기 위한 지역에 사용하기 위한 MCPA 아민 제초제의 제초 유효량은 재배 기간 동안 약 0.1 lb ae/ac 내지 최대 약 16 lb ae/ac의 비율로 적용될 수 있다(예를 들어, MCPA 아민은 재배 기간 동안 약 0.5 lb ae/acre 내지 약 2.0 lb ae/acre의 비율로 적용될 수 있다).
브라시카 이벤트 MON94100을 함유하는 식물 및 종자를 생산하는 방법이 제공된다. 식물은 본 기술분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 육종될 수 있고, 예를 들어, 일반적으로 사용되는 육종 방법에 대한 설명은 문헌[WR Fehr, in Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed., American Society of Agronomy, Madison WI(1987)]에서 찾아볼 수 있다. 식물은 자가수분("자가수정"이라고도 함) 또는 교차수분("교배"라고도 함)될 수 있다. 브라시카 이벤트 MON94100을 함유하는 식물은 자가수분되어 브라시카 이벤트 MON94100에 대해 동형접합성인 식물의 진정한 육종 계통을 생성할 수 있다. 자가수정은 "동계교배"로 알려진 자손을 초래하고 유전적으로 균일한 동계 계통을 생산하는 데 사용될 수 있다. 대안적으로, 브라시카 이벤트 MON94100을 함유하는 식물은 교차수분(트랜스제닉 또는 비-트랜스제닉인 다른 식물과 교배)되어 변종 또는 잡종 종자를 생산할 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 제조된 종자 및 자손 식물은 브라시카 이벤트 MON94100을 함유한다. 브라시카 이벤트 MON94100이 내성을 부여하는 하나 이상의 제초제의 적용은 브라시카 이벤트 MON94100을 함유하는 자손을 선택하는 데 사용될 수 있다. 대안적으로, 자손은 브라시카 이벤트 MON94100을 함유하는 식물 또는 종자에 대해 선택하는 진단 방법을 사용하여 분석할 수 있다. 자손은 변종 또는 잡종 식물일 수 있고; 브라시카 이벤트 MON94100을 함유하는 식물에 의해 생산된 종자 또는 브라시카 이벤트 MON94100을 함유하는 식물의 화분으로 수정된 식물에 의해 생산된 종자로부터 재배될 수 있고; 브라시카 이벤트 MON94100에 대해 동형접합성 또는 이형접합성일 수 있다.
본 발명의 식물, 자손, 종자, 세포, 및 식물 부분은 또한 하나 이상의 추가 브라시카 형질(들) 또는 트랜스제닉 이벤트(들)를 함유할 수 있다. 이러한 추가 형질(들) 또는 트랜스제닉 이벤트(들)는 곤충 저항성 증가, 용수 효율 증가, 수확량 증가, 가뭄 저항성 증가, 종자 품질 증가, 영양소 품질 개선, 잡종 종자 생산, 수 임성(male fertility), 및 제초제 내성을 포함하지만, 이에 제한되지는 않고, 여기서, 이러한 형질은 이러한 트랜스제닉 형질이 없는 브라시카 식물에 대비하여 측정된다. 브라시카 트랜스제닉 이벤트는 본 기술분야의 기술자에게 공지되어 있고; 예를 들어 이러한 형질의 목록은 미국 농무부(United States Department of Agriculture: USDA)의 동식물 건강 검역소(Animal and Plant Health Inspection Service: APHIS)에서 제공된다. 2개 이상의 트랜스제닉 이벤트는 각각 하나 이상의 트랜스제닉 이벤트(들)를 포함하는 2개의 부모 식물을 교배하고, 자손 종자를 수집하고, 2개 이상의 트랜스제닉 이벤트를 함유하는 자손 종자 또는 식물을 선택함으로써 자손 종자 또는 식물에서 조합될 수 있고; 그 다음, 이러한 단계들은 자손 중에서 원하는 트랜스제닉 이벤트의 조합이 달성될 때까지 반복될 수 있다. 부모 식물에 대한 역교배 및 비-트랜스제닉 식물과의 이종교배도 식물 번식과 마찬가지로 고려된다.
브라시카 이벤트 MON94100을 포함하는 종자의 대표적인 샘플의 기탁은 미국 버지니아주 20110 마나사스 유니버시티 부울러바드 10801에 주소를 갖고 있는 미국모식균 배양수집소(ATCC®) 특허 기탁소에 부다페스트 협약에 따라 이루어졌다. 브라시카 이벤트 MON94100을 포함하는 종자에 대한 ATCC 특허 기탁 명칭(수탁번호)은 PTA-125182이며 기탁일은 2018년 8월 21일이다. 기탁은 30년, 마지막 요청 후 5년, 또는 특허의 유효 기간 중 더 긴 기간 동안 기탁소에 유지될 것이다.
본 명세서에 사용된 용어 "포함하는"은 "포함하지만, 이에 제한되지 않는"을 의미한다.
실시예
이하 실시예는 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 포함된다. 6가지 다른 발현 작제물의 작제 및 시험, 2,775개의 고유 형질전환 이벤트의 생산, 및 브라시카 이벤트 MON94100의 생성 및 최종 선택에 필요한 엄격한 분자적, 작물학적 및 현장 시험을 통한 5년 간에 걸친 수백만 개의 개별 식물에 대한 분석이 요약된다.
개시된 특정 실시예에서 많은 변형이 이루어질 수 있고 여전히 유사한 결과가 수득된다는 것을 당업자라면 인식할 수 있을 것이다. 화학적 및 생리적으로 관련이 있는 특정 제제는 동일하거나 유사한 결과를 달성하면서 본 명세서에 기재된 제제 대신에 치환될 수 있다. 본 기술분야의 기술자에게 명백한 이러한 모든 치환 및 변형은 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주된다.
실시예 1: 발현 작제물 설계, 이벤트 생산, 및 R0 및 R1 식물 시험
본 실시예는 디캄바 내성을 위한 6개의 다른 발현 작제물의 설계, 이러한 작제물을 함유하는 식물 벡터를 사용한 수천 개의 고유 브라시카 이벤트의 생산, 및 생성된 트랜스제닉 브라시카 식물을 2 세대(R0 및 R1)에 걸쳐 분석 및 시험한 것을 설명한다.
6개의 발현 작제물을 설계하고 식물 형질전환 벡터에 클로닝하였다. 4개의 단일 발현 카세트 작제물(DT-1, DT-2, DT-3 및 DT-4)은 각각 고유 조합의 발현 요소 및 DMO 전이유전자를 작동가능하게 연결시켜 3개의 다른 프로모터, 3개의 다른 CTP 및 2개의 다른 DMO 변이체를 브라시카 식물에서 시험할 수 있도록 설계하였다. 2개의 이중 발현 카세트 작제물(DT-5 및 DT-6)은 각각 고유 조합의 발현 요소 및 DMO 전이유전자를 작동가능하게 연결시켜 2개의 다른 프로모터, 2개의 다른 CTP 및 2개의 다른 DMO 변이체 전이유전자를 동일한 CP4-EPSPS 발현 카세트와 조합하여 시험할 수 있도록 설계하였다. 작제물들은 표 2에 제시된다. 6개의 발현 작제물은 그 다음 식물 형질전환 벡터에 클로닝하였다.
Figure pct00002
6개의 식물 형질전환 벡터를 본 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 브라시카 나푸스 품종 65037 Restorer 계통(캐나다 식물 품종 보호권 출원 06-5517)의 아그로박테리움-매개의 형질전환에 사용하여 2,775개의 고유 형질전환 이벤트를 생산하였다. 각 형질전환 이벤트는 전이유전자 삽입체를 고유 위치에서 브라시카 게놈 내에 무작위 삽입하여 제조하였다. 그 다음, 트랜스제닉 세포로부터 R0 식물을 재생시켰고, 정상 표현형 특성을 가진 뿌리 내린 식물을 성장 및 추가 평가를 위해 토양으로 이전하였다.
2,775개 R0 식물을 트랜스제닉 삽입체의 단일 온전한 카피의 존재 및 벡터 백본 서열의 부재에 대해 분석하였다. 이러한 초기 분자 분석으로부터 201개의 고유 이벤트가 진행(advancement)에 대한 최고 품질의 이벤트로서 식별되었다.
DT-1, DT-2 및 DT-3 작제물을 나타내는 식물의 선택은 온실에서 R0 형질 효능(디캄바 내성) 시험을 위해 사용되었다. 디캄바는 V3 성장 단계에서 1.0 lb ae/acre의 Clarity® 제초제(2X 비율) 또는 2.0 lb ae/acre의 Clarity 제초제(4X 비율) 중 어느 하나의 살포 비율로 적용하였다. 디캄바로 인한 식물 상해는 식물 상편생장(잎의 구부러짐 또는 비틀림), 성장 감소, 퇴록, 및 괴사의 평가를 기반으로 하여 육안으로 평가하였다. 20% 초과의 상해를 나타낸 식물은 폐기하였다. DT-1 및 DT-3 작제물에 대한 R0 식물은 온실 살포에서 2X 비율에 대해 내성(20% 미만의 상해)을 나타내었지만, DT-2 작제물에 대한 R0 식물은 모두 2X 비율에 대해 20% 초과의 디캄바 상해를 나타내었다. 이 데이터의 분석 결과, DT-2 작제물을 사용하여 생산된 임의의 이벤트는 진행하지 않기로 결정하였다.
6개의 형질전환 벡터를 사용하여 생산한 초기 2,775개 고유 형질전환 이벤트로부터 분자 분석 데이터와 R0 디캄바 내성 시험을 조합한 결과, 진행에 대해 206개의 고유 이벤트를 선택하였다. 선택된 이벤트에 대한 R0 식물은 자가수분하여 R1 시험을 위한 동형접합성 종자를 생산하였다.
디캄바 내성에 대한 온실 시험은 169개의 고유 이벤트에 대해 R1 식물에서 수행하였다. 디캄바는 V3 성장기에서 Clarity 제초제(2X 비율)를 1120g ae/ha의 살포 비율로 적용하였다. 이중 카세트 이벤트(DT-5 또는 DT-6를 사용하여 생성된 이벤트)의 경우, 디캄바는 글리포세이트의 탱크 믹스로서 3600g ae/ha의 Roundup®(2X 비율)의 살포 비율로 적용하였다. 디캄바로 인한 식물 상해는 위에서 설명한 바와 같이 평가하였다. 식물은 낮은 디캄바 증상을 기반으로 하여 진행에 대한 우선순위를 지정하였다.
R1 식물은 DT-1 작제물에 대해 7.48%; DT-3 작제물에 대해 72.66%; DT-5 작제물에 대해 20.7%; 및 DT-6 작제물에 대해 33.4%의 평균 상해율을 나타내었다. 그러나, 20% 미만의 상해를 가진 개별 이벤트는 그 상해가 상편생장이 아닌 한, 진행되었다. 그 결과, DT-1 작제물로부터 9개의 이벤트, DT-5 작제물로부터 17개의 이벤트, 및 DT-6 작제물로부터 9개의 이벤트 외에도 DT-4 작제물로부터 하나의 이벤트가 선택되었다.
F1 현장 실험으로의 진행에는, 초기 분자 분석(카피 수, 온전한 삽입체 및 벡터 백본의 부재에 대한)으로부터 데이터의 분석 및 제초제 내성에 대한 R0 및 R1 온실 평가를 기반으로 하여 삼십육(36)개의 고유 이벤트를 선택하였다. 이에 대한 데이터는 표 3에 요약하였다. 선택된 이벤트에 대한 R1 식물은 종자를 생산하기 위해 통상적인 식물과 교차수분하였다.
Figure pct00003
실시예 2: 1차 시즌 현장 실험
본 실시예는 R1 분석으로부터 진행된 36개 고유 이벤트를 각각 함유하는 식물에 대해 1차 시즌(first-season) 현장 실험을 설명한다. 각 고유 이벤트마다 1차 시즌 현장 실험에서는 수천개의 식물이 8 내지 13개의 다른 위치에서 2년 과정에 걸쳐 형질 효능(디캄바 내성), 작물학적 성능, 및 수확량에 대해 현장에서 시험되었다. 이 데이터를 분석하여 모든 식물 및 모든 위치에 따라 현장 조건에서 각 이벤트의 성능을 비교하였다. 1차 시즌 현장 실험에서 수득된 데이터는 그 다음 2차 시즌 현장 실험으로 진행할 우수한 이벤트를 선택하는데 사용하였다.
현장 실험을 위한 잡종 F1 식물은 잡종 F1 종자[이벤트에 대해 반접합성(hemizygous)]를 생산하기 위해 선택된 이벤트에 대한 R1 또는 R2 식물과 자성 부모(female parental) 브라시카 나푸스 계통을 교차수분하여 생산하였다. 1차 시즌 현장 실험이 수행된 2년 동안 각각 F1 잡종 종자를 생산하기 위해 선택된 이벤트에 대한 R1 식물로 다른 자성 부모 브라시카 나푸스 계통을 교차수분하였다. 자성 부모 계통도 대조군으로서 사용하기 위한 R1 계통과 동일한 유전자 배경의 비-트랜스제닉 식물과 교차수분하였다. 이 전략은 다양한 자성 부모 계통에서 이벤트의 시험 및 비교를 위한 적절한 대조군의 사용을 보장해주었다.
1차 시즌 시험에서는 원래 2,775개 이벤트 중 36개 고유 이벤트가 현장 시험을 위해 선택되었다. 이 36개 이벤트는 4가지 다른 발현 작제물로부터의 최상의 이벤트를 나타냈다: 작제물 DT-1에 대한 9개 이벤트, 작제물 DT-4에 대한 하나의 이벤트, 작제물 DT-5에 대한 17개 이벤트, 작제물 DT-6에 대한 9개 이벤트. 1차 시즌 실험은 2년 넘게 수행하였고, 단 각 이벤트에 대해 1차 시즌 작물학적 성능 현장 실험을 1차 시즌 형질 효능 현장 실험과 동시에(동일 시즌 동안) 수행하였다. 모든 현장 실험은 무작위 완전 블록 설계(randomized complete block design)를 사용했으며 북미의 8 내지 13개 다른 위치에서 수행하였다.
1차 시즌 형질 효능 실험에서 F1 잡종 식물은 디캄바에 대한 내성에 대해 평가하였다. 두 가지 디캄바 적용을 모든 이벤트에 대해 시험하였다: 처리 1(TRT1)은 2.4kg ae/ha(상업적 비율의 2배)의 BANVEL® II의 발아 전 처리 및 3개 잎 성장단계(3 leaf growth stage, V3)에서 1.2kg ae/ha(상업적 비율의 2배)의 BANVEL® II의 발아 후 처리를 포함하였고; 처리 2(TRT2)는 2.4kg ae/ha(상업적 비율의 2배)의 BANVEL® II의 발아 전 처리, V3에서 1.2kg ae/ha(상업적 비율의 2배)의 BANVEL® II의 발아 후 처리, 및 첫 번째 꽃에 1.2 kg ae/ha(상업적 비율의 2배)의 BANVEL® II의 발아 후 처리를 포함하였다. 각 적용(V3 또는 첫 번째 꽃 각각) 후 7일째, 제초제로 인한 식물 상해의 백분율을 식물 상편생장(잎의 구부러짐 또는 뒤틀림), 성장 감소, 퇴록, 및 괴사의 추정을 기반으로 하여 육안으로 평가하였다. 작물학적 점수는 현장 실험 시즌 내내 수집하였다. 시즌 종료 시, 수확량을 파운드/에이커(lb/ac)로서 결정하였다.
1차 시즌 현장 실험의 형질 효능 데이터를 편집하였다. 각각의 고유 이벤트에 대해, 1차 시즌 형질 효능 현장 실험의 모든 위치 및 모든 개별 식물에 따른 총 데이터의 메타 분석을 잡종 상해 등급의 비교를 위해 분석하였다. 표 4는 모든 위치에서 두 가지 디캄바 처리 요법에 대한 각 이벤트의 평균 상해 등급을 제공한다(NA는 사용할 수 없는 처리 데이터를 나타낸다). 각 시즌에 걸쳐 수행된 형질 효능 현장 실험의 메타 분석은 평균적으로 모든 이벤트로부터의 식물이 낮은 디캄바 상해를 갖지만, DT-1 및 DT-4 작제물에서의 이벤트가 더 낮은 상해 등급으로서, 특히 우수하게 수행되었다.
Figure pct00004
1차 시즌 형질 효능 현장 실험에서 얻어진 수확량 데이터를 편집하였다. 각각의 고유 이벤트에 대해, 1차 시즌 형질 효능 현장 실험에 대한 모든 위치 및 모든 개별 식물에 따른 총 수확량 데이터의 메타 분석을 비교하기 위해 분석하였다. 표 5는 모든 위치를 따라 두 가지 디캄바 처리 요법에 대한 각 이벤트의 평균 수확량을 파운드/에이커(lbs/ac)로서 제공한다(NA는 사용할 수 없는 처리 데이터를 나타냄). 각 시즌에 걸친 형질 효능 현장 실험에 대한 수확량의 메타 분석은 평균적으로 모든 이벤트로부터의 식물이 미살포된 대조 식물과 비슷한 수확량을 가졌음을 보여주었다. DT-6 작제물로부터의 이벤트를 포함하는 식물에 대한 편집된 데이터의 메타 분석은 DT-5 작제물로부터의 이벤트를 포함하는 식물보다 평균적으로 현저하게 낮은 수확량을 나타내었다.
Figure pct00005
1차 시즌 작물학적 성능 실험에서, F1 잡종 식물을 작물학적 성능 및 수확량에 대해 평가하였다. 플롯들은 잡초 없이 유지되었고 시험 제초제(디캄바 또는 디캄바와 글리포세이트)는 재배 기간 동안 적용하지 않았다. 모든 이벤트마다 작물학적 점수를 수집하였다: 조기 활력(Early Vigor), 발아 균일성(Emergence Uniformity), 첫 꽃 날짜(Date of First Flower), 꽃 끝 날짜(Date of End of Flower), 식물 높이(Plant Height), 성숙기 날짜(Maturity Date), 수확된 실제 곡물 중량(Actual Grain Weight Harvested), 곡물 수분 백분율(Percent Grain Moisture), 수확 날짜(Harvest Date), 및 해당되는 경우, 서 있는 정도(Standability), 꼬투리 탈립(Pod Shattering), 스클레로티니아 발생(Sclerotinia Incidence), 및 질병 및 곤충 압박(Disease and Insect Pressure). 작물학적 점수는 현장 실험 시즌 내내 수집하였다. 시즌 종료 시, 작물 수확량을 파운드/에이커(lb/ac)로서 결정하였다.
1차 시즌 작물학적 성능 현장 실험에서 얻어진 수확량 데이터를 편집하였다. 각 고유 이벤트에 대해 1차 시즌 작물학적 현장 실험 동안 모든 위치 및 모든 개별 식물에 따른 총 수확량 데이터의 메타 분석을 비교하기 위해 분석하였다. 표 6은 모든 위치 전역에서 각 이벤트에 대한 평균 수확량을 파운드/에이커(lbs/ac)로서 제공한다. 각 시즌에 걸친 작물학적 현장 실험에서 수확량에 대한 메타 분석 결과는 현저히 낮은 수확량을 가진 DT-4 작제물의 68403 이벤트 및 DT-5 작제물로부터의 43166 및 43237 이벤트를 제외하고는, 평균적으로 모든 이벤트로부터의 식물이 미살포된 대조 식물과 비슷한 수확량을 가진 것을 나타내었다. DT-1 작제물로부터의 4개 이벤트는 DT-1 작제물로부터의 다른 5개 이벤트보다 현저하게 낮은 작물학적 수확량을 나타내었다.
Figure pct00006
(1) 디캄바 내성의 상업적 비율에 대한 형질 효능 및 (2) 작물학적 성능을 평가한 잡종 식물을 이용하여 현장 실험으로부터 축적된 데이터를 작제물 DT-1, DT-4, DT-5, 및 DT-6에 대해 시험된 36개 이벤트에 대해 분석하였다. 각 이벤트에 대한 이 분석을 실시예 3에 설명된 심층 분자 특성화 결과와 조합하여 2차 시즌 현장 실험으로 진행할 이벤트를 선택하였다.
실시예 3: 분자 특성화
본 실시예는 현장 실험과 동시에 수행한 선택된 이벤트의 광범위한 분자 특성화를 설명한다. 각 이벤트의 분자 특성화는 이벤트가 진행을 위해 선택되어야 하는지 여부를 결정하는 데 사용되었다.
이벤트의 DNA 및 RNA 분석은 본 기술분야에 알려진 다양한 기술을 사용하여 수행하였다. 트랜스제닉 식물이 임의의 벡터 백본없이 전체 전이유전자 삽입체의 단일 카피를 함유하였음을 확인하기 위해 게놈 DNA에 대해 서던 블롯 분석을 수행하였다. DNA 증폭 및 서열결정을 사용하여 각 이벤트에 대한 트랜스제닉 삽입체의 삽입 서열의 조성 및 온전성을 확인하였다. 트랜스제닉 삽입체의 각 말단(5' 및 3' 말단) 측면에 있는 DNA를 서열결정하였고, 각 접합부를 결정하였다. 각 이벤트에 대한 트랜스제닉 식물에서 dmo 유전자 및 cp4 유전자(해당되는 경우)의 mRNA 전사체를 검출하고 측정하기 위해 노던 분석을 수행하였다.
각 이벤트를 포함하는 식물의 단백질 분석은 본 기술분야에 알려진 기술을 사용하여 수행하였다. 각 이벤트를 함유하는 트랜스제닉 식물에서 정제된 DMO 단백질의 N-말단 단백질 서열결정을 수행하여 재조합 단백질 서열을 확인하였다. DMO 단백질이 생산되고 있는지 확인하기 위해 각 이벤트를 함유한 식물의 단백질 추출물에 대해 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 효소 면역흡착 분석(ELISA)을 사용하여 식물의 잎, 종자, 뿌리 및 꽃가루에서 DMO 단백질에 대한 단백질 수치를 결정하였다.
게놈에서 각 이벤트의 삽입 부위를 분석하였다. 측면 서열은 이벤트의 염색체 위치의 생물정보학적 분석에 사용하였고, 각 이벤트의 삽입 부위는 공개적으로 이용가능한 브라시카 나푸스 게놈[Boulos Chalhoub, et al. "Early allopolyploid evolution in the post-Neolithic Brassica napus oilseed genome", Science, Vol 345 Issue 6199(22 August 2014)]에 대해 매핑하였다. 게놈의 야생형 대립유전자를 따른 DNA 증폭은 각 이벤트의 측면 영역에 특이적인 프라이머를 사용하여 수행하였다. 야생형 삽입 부위 서열을 사용하여 브라시카 나푸스 참조 게놈에 대하여 이벤트에 대한 전이유전자 통합의 고유 부위를 매핑하였다.
각 이벤트에 대한 심층 분자 특성화 분석은 각 이벤트에 대한 1차 시즌 현장 실험에서 얻어진 형질 효능 및 작물학적 성능 데이터와 조합하였다. 이 조합된 정보를 사용하여 1차 시즌 현장 실험에서 시험된 36개 중 13개의 고유 이벤트를 선택하였다. 분석 후, 작제물 DT-6에 대한 9개 이벤트는 전부 진행에 대해 선택하지 않았고; DT-5로부터의 17개 이벤트 중 10개는 진행하지 않았으며; 작제물 DT-1에 대한 5개 이벤트, 작제물 DT-4에 대한 1개의 이벤트, 및 작제물 DT-5에 대한 7개의 이벤트인 13개의 고유 이벤트를 진행을 위해 선택하였다.
실시예 4: 2차 시즌 현장 실험
본 실시예는 1차 시즌 현장 실험으로부터 진행된 13개 고유 이벤트를 각각 함유하는 식물의 2차 시즌 현장 실험을 설명한다. 각각의 고유 이벤트에 대해, 2차 시즌 현장 실험에서는 수천 개의 식물을 여러 위치에서 2년 과정 넘게 형질 효능(디캄바 및 글리포세이트 내성), 작물학적 성능 및 수확량에 대해 현장에서 시험하였다. 이 데이터는 모든 식물 및 모든 위치에 따라 현장 조건에서 각 이벤트의 성능을 비교하기 위해 분석하였다. 그 다음, 2차 시즌 현장 실험의 데이터를 사용하여 3차 시즌 현장 실험으로의 진행을 위한 우수한 이벤트를 선택하였다.
2차 시즌 현장 실험을 위한 잡종 F1 식물은 잡종 F1 종자(이벤트에 대해 반접합성)를 생산하기 위해 선택된 이벤트에 대한 R2 식물과 자성 부모 브라시카 나푸스 계통을 교차수분하여 생산하였다. 상업적 글리포세이트 내성 이벤트(RR로 표시)를 함유하는 자성 부모 계통을 사용하여 DT-1 및 DT-4 작제물을 포함하는 R2 식물과 교배하여, 디캄바 및 글리포세이트 모두에 내성인 F1 식물을 생산하였다. 2차 시즌 현장 실험이 수행된 2년 동안 각각, F1 잡종 종자를 생산하기 위해 선택된 이벤트에 대한 R2 식물과 1 내지 3개의 다른 자성 부모 브라시카 나푸스 계통을 교차수분하였다. 또한, 대조군으로서 사용하기 위해 R2 계통과 동일한 유전자 배경의 비-트랜스제닉 식물로 자성 부모 계통을 교차수분하였다. 이 전략은 다양한 자성 부모 계통에서 이벤트의 시험 및 비교를 위한 적절한 대조군의 사용을 보장해주었다.
2차 시즌 시험에서, 시험을 위해 선택된 13개 고유 이벤트는 작제물 DT-1에 대한 5개 이벤트, 작제물 DT-4에 대한 하나의 이벤트, 및 작제물 DT-5에 대한 7개의 이벤트를 나타내었다. 2차 시즌 실험은 2년 넘게 수행하였지만, 각 이벤트마다 2차 시즌 작물학적 성능 현장 실험은 2차 시즌 형질 효능 현장 실험과 동시에(동일한 시즌 동안) 수행하였다. 모든 현장 실험은 무작위 완전 블록 설계를 사용하였고 북미에 있는 4 내지 9개의 다른 위치에서 수행하였다.
2차 시즌 형질 효능 실험에서, F1 잡종 식물을 디캄바 및 글리포세이트에 대한 내성에 대해 평가하였다. 식물을 V3에서 1.2kg ae/ha(상업적 비율의 2배)의 디캄바(BANVEL II) 및 1.8kg ae/ha의 글리포세이트(Roundup)의 발아 후 적용(탱크 혼합물로서)으로 처리한 뒤, 첫 번째 꽃에 1.2kg ae/ha(상업적 비율의 2배)의 디캄바(BANVEL II) 및 1.8kg ae/ha의 글리포세이트(Roundup)로 처리하였다. 각 적용(V3 또는 첫 번째 꽃에 각각) 후 7일째, 제초제로 인한 식물 상해의 백분율을 식물 상편생장(잎의 구부러짐 또는 뒤틀림), 성장 감소, 퇴록, 및 괴사의 추정을 기반으로 하여 육안으로 평가하였다. 작물학적 점수는 현장 실험 시즌 내내 수집하였다. 시즌 종료 시, 수확량을 파운드/에이커(lb/ac)로서 결정하였다.
2차 시즌 현장 실험으로부터 형질 효능 데이터를 편집하였다. 각각의 고유 이벤트에 대해, 형질 효능 현장 실험에서 모든 위치 및 모든 개별 식물을 따라 총 데이터의 메타 분석으로 잡종 상해 등급을 비교하기 위해 분석하였다. 표 7은 모든 위치에 따른 처리 요법에 대한 각 이벤트의 평균 상해 등급을 제공한다. 각 시즌에 걸쳐 수행된 형질 효능 현장 실험의 메타 분석은 평균적으로 DT-1 및 DT-4 작제물로부터의 식물이 더 낮은 상해 등급을 가져, 특히 우수하게 수행되었음을 보여주었다.
Figure pct00007
2차 시즌 형질 효능 현장 실험에서 얻어진 수확량 데이터를 편집하였다. 각각의 고유 이벤트에 대해, 2차 시즌 형질 효능 현장 실험 동안 모든 위치 및 모든 개별 식물에 따른 총 수확량 데이터의 메타 분석을 비교하기 위해 분석하였다. 표 8는 모든 위치를 따라 처리 요법에 대해 각 이벤트에 대해 살포된 식물 및 미살포된 식물(대조군)에 대한 평균 수확량 파운드/에이커(lbs/ac)를 제공한다. 각 시즌에 걸친 형질 효능 현장 실험에 대한 수확량의 메타 분석은 디캄바 및 글리포세이트가 살포된 경우 평균적으로 브라시카 이벤트 MON94100을 함유하는 식물이 다른 12개의 이벤트에 대한 식물에 비해 가장 높은 수확량을 가졌음을 보여주었다.
Figure pct00008
2차 시즌 작물학적 성능 실험에서, F1 잡종 식물을 실시예 2에 기술된 작물학적 성능 및 수확량에 대해 평가하였다. 시즌 종료 시, 작물학적 수확량을 파운드/에이커(lb/ac)로서 결정하였다. 2차 시즌 작물학적 성능 현장 실험으로부터의 수확량 데이터를 편집하였다. 각 고유 이벤트마다, 2차 시즌 작물학적 현장 실험 동안 모든 위치 및 모든 개별 식물 전반에서 얻어진 총 수확량 데이터의 메타 분석을 비교하기 위해 분석하였다. 표 9는 모든 위치 전역에서 각 이벤트에 대한 평균 수확량을 파운드/에이커(lbs/ac)로서 제공한다. 각 시즌에 걸친 작물학적 현장 실험에 대한 수확량의 메타 분석은 평균적으로 모든 이벤트로부터의 식물이, DT-5 작제물에 대한 이벤트 40819의 현저히 낮은 수확량을 제외하고는, 대조 식물과 비슷한 수확량을 가졌음을 보여주었다.
Figure pct00009
분자 분석 및 (1) 디캄바 및 글리포세이트 내성의 상업적 비율에 대한 형질 효능 및 (2) 작물학적 성능을 평가한 잡종 식물을 이용한 현장 실험으로부터 축적된 데이터를 작제물 DT-1, DT-4, 및 DT-5에 대해 시험된 13개 이벤트에 대해 분석하였다. 각 이벤트에 대해 2차 시즌 현장 실험으로부터 얻어진 형질 효능, 작물학적 성능, 및 수확량 데이터의 분석을 실시예 3에 설명된 심층 분자 특성화의 결과와 조합하여 3차 시즌 현장 실험으로 시험하기 위한 4개의 고유 이벤트를 선택하였다. 4개의 고유 이벤트는 작제물 DT-1에 대한 2개의 이벤트 및 작제물 DT-5에 대한 2개의 이벤트를 나타내었다.
실시예 5: 3차 시즌 현장 실험
본 실시예는 2차 시즌 현장 실험으로부터 진행된 4개의 고유 이벤트를 각각 함유하는 식물의 3차 시즌 현장 실험을 설명한다. 각 고유 이벤트에 대해, 3차 시즌 현장 실험에서는 수천 개의 식물을 다수의 위치에서 2년 과정 넘게 현장에서 형질 효능(디캄바 내성), 작물학적 성능, 및 수확량에 대해 시험하였다. 이들 데이터를 분석하여 모든 식물 및 모든 위치들에 따라 현장 조건에서 얻어진 각 이벤트의 성능과 비교한다. 그 다음, 3차 시즌 현장 실험으로부터의 데이터를 사용하여 상업화에 우수한 이벤트를 선택하였다.
2차 시즌 현장 실험을 위한 잡종 F1 식물은 잡종 F1 종자(이벤트에 대해 반접합성)를 생산하기 위해 선택된 이벤트에 대한 R2 또는 R3 식물과 자성 부모 브라시카 나푸스 계통을 교차수분하여 생산하였다. 3차 시즌 현장 실험이 수행된 2년 동안 각각, 선택된 이벤트에 대한 R1 식물과 2 내지 3개의 다른 자성 부모 브라시카 나푸스 계통을 교차수분하여 F1 잡종 종자를 생산하였다. 자성 부모 계통은 또한 대조군으로서 사용하기 위한 R2 또는 R3 계통과 동일한 유전자 배경의 비-트랜스제닉 식물과 교차수분하였다. 이 전략은 다양한 자성 부모 계통에서 이벤트의 시험 및 비교를 위한 적절한 대조군의 사용을 보장해주었다.
3차 시즌 실험은 2년 넘게 수행하였지만, 각 이벤트마다 3차 시즌 작물학적 성능 현장 실험은 3차 시즌 형질 효능 현장 실험과 동시에(동일한 시즌 동안) 수행하였다. 모든 현장 실험에는 무작위 완전 블록 설계를 사용하였고 북미에 있는 5 내지 10개의 다른 위치에서 수행하였다.
3차 시즌 형질 효능 실험에서, F1 잡종 식물을 디캄바에 대한 내성에 대해 XtendiMax® 제초제를 사용하여 실시예 2에 기재된 바와 같이 평가하였고, 시즌 종료 시, 수확량을 파운드/에이커(lb/ac)로서 결정하였다. 3차 시즌 현장 실험으로부터 형질 효능 데이터를 편집하였다. 각 고유 이벤트마다, 형질 효능 현장 실험에서 모든 위치 및 모든 개별 식물에 따라 모은 총 데이터의 메타 분석을 잡종 상해 등급의 비교를 위해 분석하였다. 표 10은 모든 위치에서 처리 요법에 대한 각 이벤트의 평균 상해 등급을 제공한다. 각 시즌에 걸쳐 수행된 형질 효능 현장 실험의 메타 분석은 평균적으로 DT-1 작제물로부터의 식물이 더 낮은 제초제 상해 등급을 가져, 특히 우수하게 수행되었음을 보여주었다.
Figure pct00010
3차 시즌 형질 효능 현장 실험에서 얻어진 수확량 데이터를 편집하였다. 각각의 고유 이벤트에 대해, 3차 시즌 형질 효능 현장 실험에서 모든 위치 및 모든 개별 식물에 따라 모은 총 수확량 데이터의 메타 분석을 비교하기 위해 분석하였다. 표 11은 모든 위치를 따라 2가지 디캄바 처리 요법에 대해 각 이벤트의 평균 수확량을 파운드/에이커(lbs/ac)로서 제공한다(NA는 사용가능하지 않은 처리 데이터를 나타낸다). 형질 효능 현장 실험에 대한 수확량의 메타 분석은 평균적으로 모든 이벤트로부터의 식물이 미살포된 대조 식물과 비슷한 수확량을 가졌음을 보여주었다.
Figure pct00011
3차 시즌 작물학적 성능 실험에서, F1 잡종 식물을 실시예 2에 기술된 작물학적 성능 및 수확량에 대해 평가하였고, 시즌 종료 시, 작물학적 수확량을 파운드/에이커(lb/ac)로서 결정하였다. 3차 시즌 작물학적 성능 현장 실험으로부터의 수확량 데이터를 편집하였다. 각 고유 이벤트에 대해, 3차 시즌 작물학적 현장 실험에서 모든 위치 및 모든 개별 식물에 따라 얻어진 총 수확량 데이터의 메타 분석을 비교용으로 분석하였다. 표 12는 모든 위치 전역에서 각 이벤트에 대한 평균 수확량을 파운드/에이커(lbs/ac)로서 제공한다. 작물학적 현장 실험에 대한 수확량의 메타 분석은 평균적으로 모든 이벤트로부터의 식물이 통계적으로 유의적인 차이 없이, 미살포된 대조 식물과 비슷한 수확량을 가졌음을 보여주었다.
Figure pct00012
분자 분석 및 3차 시즌 현장 실험으로부터 축적된 데이터를 4가지 이벤트에 대해 분석하였다. 각 이벤트에 대한 3차 시즌 현장 실험으로부터 얻어진 형질 효능, 작물학적 성능, 및 수확량 데이터의 분석을 실시예 3에 설명된 심층 분자 특성화의 결과와 조합하여 이벤트를 평가하였다. 또한, 다른 제초제 내성 형질과 분자적 연관이 없는 디캄바 내성 형질의 바람직함도 고려되었다. 단일 디캄바 내성 발현 카세트의 구성은 자생식물 방제, 잡초 방제, 작물학, 및 작물 회전에 있어서 농민에게 증가된 유연성 및 선택을 허용한다. 3차 시즌의 현장 실험으로부터 얻어진 복합 데이터의 메타 분석을 위해 DT-1 작제물을 나타내는 2개의 이벤트를 진행시켰다.
실시예 6: 복합 현장 실험 데이터의 메타 분석
본 실시예는 두 개의 최종 이벤트에 대한 모든 현장 실험 데이터의 메타 분석을 설명한다. 이를 통해 수년 동안, 수십 개의 위치에서, 수십만 개의 식물에 걸쳐 잡종 식물의 현장 조건 하에서 형질 성능과 수확량 영향을 더 크게 비교할 수 있었다.
형질 효능에 대한 메타 분석은 작제물 DT-1로부터 선택된 두 이벤트에 대해 모든 위치에서 1차 및 3차 시즌에 대한 데이터를 편집하여 수행하였다. 이것은 잡종 상해 등급을 더 크게 비교할 수 있도록 허용하였다. 표 13은 각 처리에 대한 각 이벤트의 평균 상해 등급을 제공한다. 형질 효능 현장 실험의 메타 분석은 DT-1 작제물에 대한 두 이벤트가 두 처리 모두에서 특히 낮은 제초제 상해 등급을 가졌음을 보여주었다.
Figure pct00013
형질 효능 현장 실험에서의 모든 수율 데이터에 대한 메타 분석은 작제물 DT-1으로부터 선택된 두 이벤트에 대해 모든 위치에서 1차 및 3차 시즌 동안 얻어진 데이터를 편집하여 수행하였다. 표 14는 각 처리 동안 각 이벤트에 대해 얻어진 평균 수확량 변화(동일한 이벤트를 함유하는 살포된 식물과 미살포된 식물 간의 수확량 차이로 계산됨)를 파운드/에이커(lb/ac)로서 제공한다. 형질 효능 현장 실험으로부터의 수확량에 대한 메타 분석은 MON94100 이벤트가 특히 우수하게 수행되어 170060 이벤트보다 두 처리 모두에서 평균적으로 더 높은 수확량을 초래하였음을 보여주었다. 이 데이터는 유망한 상업적 이벤트를 선택하는 데 중요하며, 디캄바 적용 하에 현장 조건에서 브라시카 이벤트 MON94100을 함유하는 식물의 뛰어난 성능을 입증하였다.
Figure pct00014
작물학적 현장 실험에서 얻어진 모든 수확량 데이터에 대한 메타 분석은 작제물 DT-1과 대조 식물로부터의 선택된 두 가지 이벤트에 대해 모든 위치에서 얻어진 3가지 시즌 모두에 대한 데이터를 편집하여 수행하였다. 이를 통해 디캄바 적용 없이 수확량 데이터를 더 크게 비교할 수 있었다. 표 15는 각 처리 동안 각 이벤트에 대한 평균 수확량을 파운드/에이커로서 제공한다. 작물학적 현장 실험으로부터의 수확량 데이터의 메타 분석은 MON94100 및 170060이 미살포된 조건에서 대조 식물과 비슷한 수확량을 제공했으며, 대조 식물과 비교했을 때 이러한 이벤트 중 어느 하나를 함유하는 식물의 수확량에는 통계적 차이가 없음을 보여주었다.
Figure pct00015
누적 데이터 분석은 제초제 적용 조건 하에서 디캄바 내성 및 작물 수확량에 대하여 170060 이벤트에 비해 브라시카 이벤트 MON94100의 우월성을 입증하였고, 결과적으로 상업적 목적에 유용한 우수한 이벤트로서 상기 이벤트를 선택하였다.
실시예 7: 브라시카 이벤트 MON94100의 검출
본 실시예는 브라시카 이벤트 MON94100의 검출을 설명한다. 샘플에서 브라시카 이벤트 MON94100의 검출은 DNA, RNA 또는 단백질 검출 기술을 사용하여 수행할 수 있다. 예시적인 검출 방법 및 재료가 아래에 제공된다. 브라시카 이벤트 MON94100에 대한 DNA 서열 정보는 서열번호 1 내지 10으로서 본 명세서에 제공된다. 브라시카 이벤트 MON94100의 트랜스제닉 삽입체는 표 1에 기술된 요소를 함유한다.
검출은 샘플에서 브라시카 이벤트 MON94100의 존재 또는 부재를 결정하는 데 사용될 수 있으며 게놈 DNA 샘플에서 브라시카 이벤트 MON94100(즉, 반접합성, 동형접합성 또는 이형접합성)의 게놈 카피 수를 나타낼 수 있다. 샘플에서 브라시카 이벤트 MON94100을 식별하기 위해 이벤트 특이적 종점 Applied Biosystems™ TAQMAN® 열 증폭 방법(Thermo Fisher Scientific)을 개발하였다. 종점 분석에 사용된 DNA 프라이머 및 프로브는 프라이머 SQ51321(서열번호 11), SQ13805(서열번호 12) 및 6-FAM™ 표지된 프로브 PB4832(서열번호 13)이다. 6-FAM(6-카복시플루오레세인)은 DNA 프로브에 부착된 Applied Biosystems(캘리포니아주 포스터시)의 형광 염료 제품이다. TAQMAN MGB™ 프로브의 경우, Taq DNA 폴리머라제의 5' 엑소뉴클레아제 활성은 형광단과 퀀처(quencher) 사이에 있는, 프로브를 5'말단으로부터 절단한다. 표적 DNA 가닥에 혼성화되면, 퀀처와 형광단은 형광 신호를 생성하기에 충분하게 분리되어 형광을 방출한다. 이러한 반응 방법을 사용했을 때 SQ51321 및 SQ13805, 및 PB4832는 브라시카 이벤트 MON94100에 대해 진단적인 DNA 앰플리콘을 생성한다. 이 분석을 위한 대조군은 브라시카 이벤트 MON94100을 함유하는 양성 대조군, 비-트랜스제닉 브라시카의 음성 대조군, 및 주형 DNA를 함유하지 않는 음성 대조군을 포함해야 한다. 또한 PCR 반응에 대한 대조군은 브라시카 게놈 내의 단일 카피 유전자에 특이적인, 내부 대조군 프라이머(Internal Control Primer) 및 내부 대조군 프로브(Internal Control Probe)를 최적으로 포함해야 한다. 이들 검정은 최대 속도로 실행되는 Applied Biosystems GeneAmp® PCR System 9700(Thermo Fisher Scientific)과 함께 사용하기 위해 최적화되어 있지만, 다른 장비를 사용할 수도 있다.
브라시카 이벤트 MON94100의 검출을 위해 TAQMAN 방법에 유용한 조건의 예는 다음과 같다. 단계 1: 5μl의 최종 부피로 조정된 18 메그옴(megohm) 물. 단계 2: 1X 최종 농도로 만들기 위한 2.28μl의 2X Universal Master Mix(dNTP, 효소, 완충액). 단계 3: 0.9μM의 최종 농도로 만들기 위한 0.05μl Event Primer-1(SQ51321) 및 Event Primer-2(SQ13805)(각 프라이머에 대해 100μM의 농도를 만들기 위해 18 메그옴 물에 재현탁됨). 단계 4: 0.2μM 최종 농도를 만들기 위한 0.01μl Event 6-FAM MGB Probe PB4832(100μM 농도로 만들기 위해 18 메그옴 물에 재현탁됨). 단계 5: 0.9μM 최종 농도로 만들기 위한 0.05μl의 Internal Control Primer-1 및 Internal Control Primer-2 Mix(각 프라이머에 대해 100μM의 농도로 만들기 위해 18 메그옴 물에 재현탁됨). 단계 6: 0.2μM 최종 농도로 만들기 위한 0.01μl Internal Control VIC™ Probe(100μM 농도로 만들기 위해 18 메그옴 물에 재현탁됨). 단계 7: 각각의 샘플에 대해 2.5μl의 추출된 DNA(주형)와 다음 중 하나: (a) 분석할 잎 샘플; (b) 음성 대조군(비-트랜스제닉 DNA); (c) 음성 물 대조군(주형 없음); 및 (d) 브라시카 이벤트 MON94100 DNA를 함유하는 양성 대조군 브라시카. 단계 8: Thermocycler 조건은 다음과 같다: 95℃에서 20초 동안 1 사이클; 95℃에서 3초, 그 다음 60℃에서 20초 동안 40 사이클; 그리고 10℃의 최종 사이클.
접합성 검정은 브라시카 이벤트 MON94100을 포함하는 식물이 그 이벤트 또는 야생형 대립유전자에 대해 이형접합성인지 또는 동형접합성인지를 결정하기 위해 개발하였다. 증폭 반응 검정은 본 명세서에 제공된 서열 정보를 사용하여 설계할 수 있다. 예를 들어, 이러한 PCR 검정은 프라이머-1, 프라이머-2 및 프라이머-3인 적어도 3개의 프라이머 설계를 포함할 것이며, 여기서 프라이머-1은 브라시카 이벤트 MON94100의 3' 측면 DNA에 있는 브라시카 게놈 DNA에 특이적이고; 프라이머-2는 브라시카 이벤트 MON94100 트랜스제닉 삽입체에 특이적이며; 프라이머-3은 야생형 대립유전자에 특이적이다. 증폭 반응에서 프라이머 쌍으로서 사용되는 경우, 프라이머-1과 프라이머-2는 브라시카 이벤트 MON94100에 특이적인 PCR 앰플리콘을 생성할 것이다. 증폭 반응에서 프라이머 쌍으로서 사용될 때, 프라이머-1과 프라이머-3은 야생형 대립 유전자에 특이적인 PCR 앰플리콘을 생성할 것이다. 브라시카 게놈 DNA에 대해 수행된 PCR 반응에서 프라이머-1 + 프라이머-2에서 생성된 각 PCR 앰플리콘 및 프라이머-1 + 프라이머-3에서 생성된 각 PCR 앰플리콘은 앰플리콘의 서열 및 크기가 상이할 것이다. 3개의 프라이머가 브라시카 이벤트 MON94100에 대해 동형접합성인 식물로부터 추출한 DNA와 함께 PCR 반응에 포함되는 경우에는 프라이머-1 + 프라이머-2 앰플리콘(Brassica MON94100 삽입에 특이적)만이 생성될 것이다. 3개의 프라이머가 브라시카 이벤트 MON94100에 대해 이형접합성인 식물로부터 추출된 DNA와 함께 PCR 반응에 포함되는 경우, 프라이머-1 + 프라이머-2 앰플리콘(브라시카 MON94100 삽입에 특이적) 및 프라이머-1 + 프라이머-3 앰플리콘(야생형 대립유전자에 특이적 또는 브라시카 MON94100 삽입의 부재에 특이적)이 모두 생성될 것이다. 3개의 프라이머가 브라시카 이벤트 MON94100가 없는 식물(즉, 야생형)로부터 추출된 DNA와 함께 PCR 반응에서 함께 혼합되면, 프라이머-1 + 프라이머-3 앰플리콘(야생형 대립유전자에 특이적)만이 생성될 것이다. PCR 반응을 사용하여 생성된 앰플리콘은 본 기술분야에 알려진 임의의 방법을 사용하여 식별하거나 구별할 수 있다.
브라시카 이벤트 MON94100에 대한 다른 접합성 검정은 TAQMAN 열 증폭 반응이다. 이러한 유형의 검정의 경우, 전술한 프라이머 외에도 이 검정은 2개의 형광 표지된 프로브를 포함할 것이다. 프로브-1은 브라시카 이벤트 MON94100에 대해 특이적일 것이고 프로브-2는 브라시카 이벤트 MON94100이 없는 브라시카 식물(야생형)에 대해 특이적일 것이며, 여기서 두 프로브는 상이한 형광 표지, 예를 들어 6-FAM-표지 또는 VIC™-표지를 함유한다. TAQMAN 반응에 사용될 때, 프라이머-1 + 프라이머-2 + 프로브-1은 브라시카 이벤트 MON94100에 특이적인 제1 형광 신호를 생성할 것이고, 프라이머-1 + 프라이머-3 + 프로브-2는 야생형 브라시카에 특이적인 제2 형광 신호를 생성할 것이다. 3개의 프라이머와 2개의 프로브가 브라시카 이벤트 MON94100에 대해 동형접합성인 식물로부터 추출된 DNA와 함께 TAQMAN 반응에 포함되는 경우, 제1 형광 신호(프라이머-1 + 프라이머-2 + 프로브-1에 특이적)만이 생성될 것이다. 3개의 프라이머가 브라시카 이벤트 MON94100에 대해 이형접합성인 식물로부터 추출된 DNA와 함께 TAQMAN 반응에 포함되는 경우에는, 제1 형광 신호(프라이머-1 + 프라이머-2 + 프로브-1에 특이적)와 제2 형광 신호(프라이머-1 + 프라이머-3 + 프로브-2)가 모두 생성될 것이다. 3개의 프라이머가 브라시카 이벤트 MON94100이 없는 식물(야생형)로부터 추출된 DNA와 함께 TAQMAN 반응에서 함께 혼합되는 경우, 제2 형광 신호(프라이머-1 + 프라이머-3 + 프로브-2에 특이적)만이 생성될 것이다.
식물 샘플에서 브라시카 이벤트 MON94100의 존재를 검출하는 다른 방법은 서던(Southern) 분석일 수 있다. 본 기술분야의 기술자는 브라시카 이벤트 MON94100에 특이적인 서던 혼성화 프로브(들) 및 브라시카 이벤트 MON94100이 없는 브라시카 식물(야생형)에 특이적인 제2 서던 혼성화 프로브를 설계하는 방법을 알고 있을 것이다. 서던 분석을 사용하는 경우, 제1 서던 혼성화 프로브로부터만 검출되는 신호는 브라시카 이벤트 MON94100에 대해 동형접합성인 식물을 나타낼 것이고; 제1 서던 혼성화 프로브 및 제2 서던 혼성화 프로브 둘 다로부터 검출되는 신호는 브라시카 이벤트 MON94100에 대해 이형접합성인 식물을 나타낼 것이며; 제2 서던 혼성화 프로브로부터만 검출되는 신호는 DNA가 브라시카 이벤트 MON94100이 없는 식물(야생형)로부터 추출되었음을 나타낼 것이다.
검출 키트의 다른 예는 브라시카 이벤트 MON94100에 의해 암호화된 적어도 하나의 단백질에 특이적인 적어도 하나의 항체를 포함한다. 예를 들어, 이러한 키트는 스트립의 끝이 수용액과 접촉될 때 활성화되는 시약을 포함하는 측류식 스트립을 활용할 수 있다. 항체 생산에 사용하기에 충분한 예시적인 단백질은 서열번호 10으로 제공된 서열 또는 이의 임의의 단편에 의해 암호화된 단백질이다.
단백질 검출 방법은 샘플이 브라시카 이벤트 MON94100을 포함하는 식물, 종자, 세포, 또는 식물 부분에서 추출되었는지를 결정하기 위해 개발되었다. 브라시카 이벤트 MON94100에 의해 암호화된 적어도 하나의 단백질에 특이적인 적어도 하나의 항체는 샘플 중 브라시카 이벤트 MON94100에 의해 암호화된 단백질을 검출하는데 사용된다. 브라시카 이벤트 MON94100에 의해 암호화된 하나 이상의 단백질에 특이적인 하나 이상의 항체를 포함하는 검출 키트는 스트립의 끝이 수용액과 접촉할 때 활성화되는 시약을 포함하는 측류식 스트립을 사용할 수 있다. 브라시카 조직의 샘플은 분쇄되고 물 또는 수성 완충액(예컨대, 계면활성제 및 소 혈청 알부민을 함유하는 인산염 완충 식염수)을 사용하여 분석용 단백질을 추출할 수 있다. 원심분리 후, 수성 상청액은 흡수 패드를 포함하는 측류식 스트립 상에서 샌드위치 형식으로 ELISA 방법을 사용하여 분석한다. 검출은 스트립의 끝을 시험할 샘플을 함유한 수용액에 담가서 활성화시킨다. 수용액은 모세관 작용에 의해 스트립 위로 운반되고 스트립 상의 금(gold) 표지된 항체를 가용화한다. 금 표지된 항체는 브라시카 이벤트 MON94100에 의해 암호화된 적어도 하나의 단백질에 특이적이며 샘플 중 단백질 상의 에피토프에 결합하여 항체-항원 복합체를 형성할 것이다. 금으로 표지된 항체-항원 복합체는 그 다음 스트립 상으로 운반되어 나이트로셀룰로스 막으로 전달된다. 이 막은 브라시카 이벤트 MON94100에 의해 암호화된 단백질 상의 제2의 별개의 에피토프에 결합하는 고정화된 항체의 시험 라인을 포함하여, 브라시카 이벤트 MON94100에 의해 암호화된 단백질이 샘플에 존재하는 경우 시험 스트립을 따라 가시적인 라인이 나타나도록 한다.
실시예 8: 자생 식물 방제
본 실시예는 브라시카 이벤트 MON94100을 포함하는 식물을 방제하는 방법을 설명한다. 자생 식물 방제를 위해, 브라시카 이벤트 MON94100을 포함하는 식물이 민감성인 임의의 제초제가 유용할 것이다.
자생 식물 방제를 위한 예시적인 제초제는 디캄바 외에 다른 합성 옥신 제초제를 포함할 것이다. 디캄바 외에 다른 합성 옥신 제초제에 대한 브라시카 이벤트 MON94100을 포함하는 식물의 민감도는 농민에게 환경 유래의 원하지 않는 디캄바 내성 브라시카(즉, 브라시카 이벤트 MON94100을 포함하는 식물)를 제거할 수 있는 능력을 제공한다. 이러한 환경은 브라시카 이벤트 MON94100을 함유하지 않는 다른 바람직한 작물 또는 브라시카를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
브라시카 이벤트 MON94100을 포함하는 식물 및 대조군과 동일한 생식질의 비-트랜스제닉 식물을 온실에서 무작위 완전 블록 설계로 성장시켰다. 식물에 V3 단계에서 4가지 합성 옥신 제초제: 디캄바(XtendiMax®), 2,4-D 아민 4(2,4-다이클로로페녹시아세트산의 다이메틸 아민염), 브로목시닐(3,5-다이브로모-4-하이드록시벤조나이트릴, Buctril®로서) 및 MCPA 아민(4-클로로-2-메틸페녹시 아세트산) 중 하나를 무작위 패턴으로 살포하였다. 식물 상해 비율은 처리 후 9일째 측정하였다.
디캄바를 상업적 비율(1X)로 살포한 후, 브라시카 이벤트 MON94100을 포함하는 식물은 상해가 없었고 대조 식물은 21.3% 상해를 가졌다. 그러나, 다른 3가지 합성 옥신 제초제(2,4-D 아민, 브로목시닐 및 MCPA)를 1X 또는 2X 비율로 살포한 경우에는 브라시카 이벤트 MON94100을 포함하는 식물 및 대조 식물 모두 70% 내지 90%의 상해 비율을 나타내었다. 이로써, 브라시카 이벤트 MON94100을 포함하는 식물과 대조 식물은 3가지 옥신 제초제에 유사하게 반응함을 확인하였다. 데이터는 표 16에 제시된다.
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브라시카 이벤트 MON94100을 포함하는 종자의 대표적인 샘플은 미국 버지니아주 20110 마나사스 유니버시티 부울러바드 10801에 주소를 갖고 있는 미국모식균 배양수집소(ATCC®) 특허 기탁소에 부다페스트 협약에 따라 기탁되었다. 브라시카 이벤트 MON94100을 포함하는 종자에 대한 ATCC 특허 기탁 명칭(수탁번호)은 PTA-125182이며 기탁일은 2018년 8월 21일이었다. 기탁은 30년, 마지막 요청 후 5년, 또는 특허의 유효 기간 중에서 더 긴 기간 동안 기탁소에 유지될 것이다.
기탁기관명 : The American Type Culture Collection
수탁번호 : PTA-125182
수탁일자 : 20180821
SEQUENCE LISTING <110> Monsanto Technology LLC <120> Brassica Event MON94100 and Methods of Use Thereof <130> MONS:450WO <150> PCT/US2019/056141 <151> 2019-10-14 <150> US 62/746,158 <151> 2018-10-16 <160> 13 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric DNA molecule of Brassica genomic DNA and transgene DNA <400> 1 tcacttgttt tgacaccagt cagcatcatc 30 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric DNA molecule of Brassica genomic DNA and transgene DNA <400> 2 acaattgaat atatcctagc aagcattatt 30 <210> 3 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric DNA molecule of Brassica genomic DNA and transgene DNA <400> 3 ccaaaataac gacagtcact tgttttgaca ccagtcagca tcatcacacc aaaagttagg 60 <210> 4 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric DNA molecule of Brassica genomic DNA and transgene DNA <400> 4 gacatgaagc catttacaat tgaatatatc ctagcaagca ttattaacct atctctcaac 60 <210> 5 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cttatgctgc 1980 acgggcgggg cggggcggtt tcgatcggct cgcctgtccc ggcgatattc tagcttaatc 2040 atctgaaact gttcaccatg catgcaatct tgtgaaatat atggttttaa ttagacttca 2100 atcttatgtt ggctattgta ctaataaaag catgtcatgt tattttcatt tgattttatc 2160 tgtactttgg tttgtttgaa gaataaagat gagcttgcta tgcatgcatg catgccatcg 2220 attatcaggg tttccttttt tcttttctgg cttcccatca atttggtgtg aattagtgtg 2280 tgtgatatat tatattatgc tatttatgaa ataaattgtt ggttatattt gatctacaat 2340 ctacatacat gtgattttta tcaacaaaat atctcgggaa acaatacctt tttggtagca 2400 aaattcaaat aatactattt taaataaatc aaagttaacc aataccttat tcaagttgga 2460 ggggtctcaa acaagcaaaa gaattcaagt tgttaatgaa cttcggttaa tgataaaaga 2520 attcgcattt aaaagcggcc gcacgtcctg cttggcctac taggccaacg caggcgctgg 2580 ccgtgacggc cacgagcgaa ctaggccttg ggccgcatcg atcgtgaagt ttctcatcta 2640 agcccccatt tggacgtgaa tgtagacacg tcgaaataaa gatttccgaa ttagaataat 2700 ttgtttattg ctttcgccta taaatacgac ggatcgtaat ttgtcgtttt atcaaaatgt 2760 actttcattt tataataacg ctgcggacat ctacattttt gaattgaaaa aaaattggta 2820 attactcttt ctttttctcc atattgacca tcatactcat tgctgatcca tgtagatttc 2880 ccggacatga agccatttac aattgaatat atc 2913 <210> 10 <211> 4913 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric DNA molecule of Brassica genomic DNA and transgene DNA <400> 10 acgagcccta cgcaaagtta tttatattca gtcattcccc ttaggtatta tcttccaaac 60 aatctaagtt ttatgaaaaa tcgcatacta tacgaagaat acctcttagg gatgcaaaat 120 gttcctcctc cgttacactt ccatccaaat atttaacgtc accgatattg aaaggacttc 180 tacagaggaa ctggtattta gccacattcc gagccccgta tgtgatacaa agttggacta 240 cgtttgtcca ttcttgcaca ctcatcacga ccaccacgtc atcagaagtt actatgtttg 300 atggttgaga agttgattga atcccatgca acattccgtc aggcagttga tatgtcaaag 360 caacggggca ttcaggtcca ataaccagct cttcgcgtat gagagacgta aaggagtcga 420 tatttttgtt ggtgcgtgca actatatact gctccactat gccaggatct ccctcgaatt 480 gccaacaacc ggccgcactt ttattccact ttccaattct aattcgtaca agctgaccca 540 tctgcagaca aagtaaacga tgatgaccat taatatagaa attatgaaac ttaattaatg 600 ttcctctgtt ctccgaataa attttcctac tatcatgtca tacccagata catgggtagc 660 attaaatgac taaagtggag cactcaccta tattttgtag cctccttccc cagccctcac 720 aattgattac tatattaaag cgatacctgc agatttcttg aaaatatgtt gtgtctaatc 780 tatggaacac ctttactcct tatttatagt gcattttaga ctgaggactc tacataaaac 840 gtatgtatct cattaaggaa gcgtgtcttc tccccctcct ttaattaccc aagactttcg 900 cttggattga aagcacagat ttgataagtc tccaatgaat agttacatat caccatctaa 960 tgaatagtca ccaaaataac gacagtcact tgttttgaca ccagtcagca tcatcacacc 1020 aaaagttagg cccgaatagt ttgaaattag aaagctcgca attgaggtct gtcgaccctg 1080 caggtacact ggcgcgccgg ccgcagatct tgagccaatc aaagaggagt gatgtagacc 1140 taaagcaata atggagccat gacgtaaggg cttacgccca tacgaaataa ttaaaggctg 1200 atgtgacctg tcggtctctc agaaccttta ctttttatgt ttggcgtgta tttttaaatt 1260 tccacggcaa tgacgatgtg acccaacgag atcttgagcc aatcaaagag gagtgatgta 1320 gacctaaagc aataatggag ccatgacgta agggcttacg cccatacgaa ataattaaag 1380 gctgatgtga cctgtcggtc tctcagaacc tttacttttt atatttggcg tgtattttta 1440 aatttccacg gcaatgacga tgtgacctgt gcatccgctt tgcctataaa taagttttag 1500 tttgtattga tcgacacggt cgagaagaca cggccataag cttggatcct cgagaattct 1560 caacacaaca tatacaaaac aaacgaatct caagcaatca agcattctac ttctattgca 1620 gcaatttaaa tcatttcttt taaagcaaaa gcaattttct gaaaattttc accatttacg 1680 aacgatagcc atggcttcta tgatatcctc ttccgctgtg acaacagtca gccgtgcctc 1740 tagggggcaa tccgccgcaa tggctccatt cggcggcctc aaatccatga ctggattccc 1800 agtgaggaag gtcaacactg acattacttc cattacaagc aatggtggaa gagtaaagtg 1860 catgcaggtg tggcctccaa ttggaaagaa gaagtttgag actctttcct atttgccacc 1920 attgacgaga gattcccggg ccatggccac cttcgtccgc aatgcctggt atgtggcggc 1980 gctgcccgag gaactgtccg aaaagccgct cggccggacg attctcgaca caccgctcgc 2040 gctctaccgc cagcccgacg gtgtggtcgc ggcgctgctc gacatctgtc cgcaccgctt 2100 cgcgccgctg agcgacggca tcctcgtcaa cggccatctc caatgcccct atcacgggct 2160 ggaattcgat ggcggcgggc agtgcgtcca taacccgcac ggcaatggcg cccgcccggc 2220 ttcgctcaac gtccgctcct tcccggtggt ggagcgcgac gcgctgatct ggatctgtcc 2280 cggcgatccg gcgctggccg atcctggggc gatccccgac ttcggctgcc gcgtcgatcc 2340 cgcctatcgg accgtcggcg gctatgggca tgtcgactgc aactacaagc tgctggtcga 2400 caacctgatg gacctcggcc acgcccaata tgtccatcgc gccaacgccc agaccgacgc 2460 cttcgaccgg ctggagcgcg aggtgatcgt cggcgacggt gagatacagg cgctgatgaa 2520 gattcccggc ggcacgccga gcgtgctgat ggccaagttc ctgcgcggcg ccaatacccc 2580 cgtcgacgct tggaacgaca tccgctggaa caaggtgagc gcgatgctca acttcatcgc 2640 ggtggcgccg gaaggcaccc cgaaggagca gagcatccac tcgcgcggta cccatatcct 2700 gacccccgag acggaggcga gctgccatta tttcttcggc tcctcgcgca atttcggcat 2760 cgacgatccg gagatggacg gcgtgctgcg cagctggcag gctcaggcgc tggtcaagga 2820 ggacaaggtc gtcgtcgagg cgatcgagcg ccgccgcgcc tatgtcgagg cgaatggcat 2880 ccgcccggcg atgctgtcgt gcgacgaagc cgcagtccgt gtcagccgcg agatcgagaa 2940 gcttgagcag ctcgaagccg cctgaaccgg cttatgctgc acgggcgggg cggggcggtt 3000 tcgatcggct cgcctgtccc ggcgatattc tagcttaatc atctgaaact gttcaccatg 3060 catgcaatct tgtgaaatat atggttttaa ttagacttca atcttatgtt ggctattgta 3120 ctaataaaag catgtcatgt tattttcatt tgattttatc tgtactttgg tttgtttgaa 3180 gaataaagat gagcttgcta tgcatgcatg catgccatcg attatcaggg tttccttttt 3240 tcttttctgg cttcccatca atttggtgtg aattagtgtg tgtgatatat tatattatgc 3300 tatttatgaa ataaattgtt ggttatattt gatctacaat ctacatacat gtgattttta 3360 tcaacaaaat atctcgggaa acaatacctt tttggtagca aaattcaaat aatactattt 3420 taaataaatc aaagttaacc aataccttat tcaagttgga ggggtctcaa acaagcaaaa 3480 gaattcaagt tgttaatgaa cttcggttaa tgataaaaga attcgcattt aaaagcggcc 3540 gcacgtcctg cttggcctac taggccaacg caggcgctgg ccgtgacggc cacgagcgaa 3600 ctaggccttg ggccgcatcg atcgtgaagt ttctcatcta agcccccatt tggacgtgaa 3660 tgtagacacg tcgaaataaa gatttccgaa ttagaataat ttgtttattg ctttcgccta 3720 taaatacgac ggatcgtaat ttgtcgtttt atcaaaatgt actttcattt tataataacg 3780 ctgcggacat ctacattttt gaattgaaaa aaaattggta attactcttt ctttttctcc 3840 atattgacca tcatactcat tgctgatcca tgtagatttc ccggacatga agccatttac 3900 aattgaatat atcctagcaa gcattattaa cctatctctc aacgctgtcg tttagagatg 3960 tacttatcga atctgaaatc tatttatcat ccatcattca attcagtctt cgctattatt 4020 tacacctcca tctaaattta tatcgaatat ctcgtcaaca aaaataaagt aacgtcacaa 4080 gatttaactc gatacgttag tctcgtttta taaataaacc agaaattaat ctcttaatgc 4140 taatcacgac gtctgagact catttttagt agcaccaatg tttgaattcc atgctgcacg 4200 ttccttccta gacacttaaa tgggatagcg ggaatactca ctactacctt tcacatttca 4260 ccatttgcat atgtacggcg tagctgccaa gagatatggc ggaacatgca tatgggtgat 4320 aatgagtaac cctttatccc atttcagtga cttttacaag tttccttgta aaaaggaata 4380 tgaccacggc gcatctttca gatttactta aacttcactc gatatgttgt atgtaatagt 4440 gtatgatgac aatgggtttc tcctctatat atagccggtc gtgcttgcac ccacacccct 4500 agattatact gaaaacaaat cctattttat atgtggtgtt atataccacc acgtctccac 4560 cttcatggaa cacgtattgt ctcgtcaaac tttaaactga attttgcaag ttcaagtgta 4620 accggttgca ggttttttgg gaattagata agacttatgg ttaagaggtc aaatcagtca 4680 ttccaccttg gtagaactac aagttctcca attattaaaa aataagctta gtcctgtaat 4740 ttcgaaattt gctatgtata ttcagtataa tgagccttat tcaaataata attcgagcga 4800 ataataataa aaatggattt aaaaataata ttgataaact gagaaaaatg acaatgcatg 4860 gctttttctg tagatgtctt tttccgcaca agttattcaa ataataattc gat 4913 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically Synthesized Oligonucleotide PCR Primer <400> 11 aaacgacagc gttgagagat agg 23 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically Synthesized Oligonucleotide PCR Primer <400> 12 ccatattgac catcatactc attgct 26 <210> 13 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically Synthesized Oligonucleotide PCR Probe <400> 13 atccatgtag atttcc 16

Claims (27)

  1. 서열번호 10, 서열번호 9, 서열번호 8, 서열번호 7, 서열번호 6, 서열번호 5, 서열번호 4, 서열번호 3, 서열번호 2 및 서열번호 1로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는, 재조합 DNA 분자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 재조합 DNA 분자는 브라시카 이벤트(Brassica Event) MON94100을 포함하는 식물, 종자 또는 세포로부터 유래되고, 상기 이벤트를 포함하는 종자의 대표적인 샘플은 ATCC 수탁 번호 PTA-125182로서 기탁되어 있는, 재조합 DNA 분자.
  3. 제1항에 있어서, 상기 재조합 DNA 분자는 브라시카 이벤트 MON94100을 포함하는 식물, 세포, 종자 또는 식물 부분(part)에 있고, 상기 이벤트를 포함하는 종자의 대표적인 샘플은 ATCC 수탁 번호 PTA-125182로서 기탁되어 있는, 재조합 DNA 분자.
  4. 제1항에 있어서, 상기 재조합 DNA 분자는 브라시카 이벤트 MON94100의 존재를 진단하는 앰플리콘인, 재조합 DNA 분자.
  5. 브라시카 식물, 브라시카 종자 또는 브라시카 세포로부터 유래된 DNA 샘플에서 서열번호 10에 특이적인 DNA 프로브로서 기능하기에 충분한 길이의 서열번호 10의 인접 뉴클레오타이드를 갖는, DNA 분자.
  6. 제5항에 있어서, 상기 DNA 프로브가 서열번호 13을 포함하는, DNA 분자.
  7. 제1 DNA 분자와 제2 DNA 분자를 포함하는 DNA 분자 쌍으로서, 상기 제1 및 제2 DNA 분자는 각각 서열번호 10의 단편을 포함하고 브라시카 이벤트 MON94100을 함유하는 DNA와 증폭 반응에 함께 사용되는 경우, DNA 프라이머로서 기능하여 샘플 중 브라시카 이벤트 MON94100을 진단하는 앰플리콘을 생산하는, DNA 분자 쌍.
  8. 제7항에 있어서, 상기 DNA 프라이머가 서열번호 11 및 서열번호 12를 포함하는 DNA 분자 쌍.
  9. 브라시카 식물, 브라시카 종자, 또는 브라시카 세포로부터 유래된 DNA 샘플에서 브라시카 이벤트 MON94100의 존재를 검출하는 방법으로서,
    a) 상기 샘플을 제5항의 DNA 프로브와 접촉시키는 단계;
    b) 상기 샘플 및 상기 DNA 프로브를 엄격한 혼성화 조건으로 처리하는 단계; 및
    c) 상기 샘플 내 DNA 분자에 대한 상기 DNA 프로브의 혼성화를 검출하는 단계
    를 포함하되, 상기 DNA 분자에 대한 상기 DNA 프로브의 혼성화가 DNA 샘플 중 브라시카 이벤트 MON94100의 존재를 나타내는, 방법.
  10. 브라시카 식물, 브라시카 종자 또는 브라시카 세포로부터 유래된 DNA 샘플에서 브라시카 이벤트 MON94100의 존재를 검출하는 방법으로서,
    a) 상기 샘플을 제7항의 DNA 분자 쌍과 접촉시키는 단계;
    b) 서열번호 10, 서열번호 9, 서열번호 8, 서열번호 7, 서열번호 6, 서열번호 5, 서열번호 4, 서열번호 3, 서열번호 2 및 서열번호 1로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 DNA 앰플리콘을 생산하기에 충분한 증폭 반응을 수행하는 단계; 및
    c) 상기 DNA 앰플리콘의 존재를 검출하는 단계
    를 포함하되, 상기 DNA 앰플리콘의 존재가 상기 샘플 중 브라시카 이벤트 MON94100의 존재를 나타내는, 방법.
  11. 브라시카 식물, 브라시카 종자 또는 브라시카 세포로부터 유래된 샘플에서 브라시카 이벤트 MON94100의 존재를 검출하는 방법으로서,
    a) 상기 샘플을 브라시카 이벤트 MON94100에 의해 암호화된 적어도 하나의 단백질에 특이적인 적어도 하나의 항체와 접촉시키는 단계; 및
    b) 상기 샘플에 있는 상기 단백질에 대한 상기 항체의 결합을 검출하는 단계
    를 포함하되, 상기 단백질에 대한 상기 항체의 결합이 상기 샘플 중 브라시카 이벤트 MON94100의 존재를 나타내는, 방법.
  12. 브라시카 이벤트 MON94100의 존재를 검출하기 위한 키트로서, 서열번호 10에 특이적인 DNA 프로브, 브라시카 이벤트 MON94100을 진단하는 앰플리콘을 생산하는 DNA 프라이머 쌍, 또는 브라시카 이벤트 MON94100에 의해 암호화된 적어도 하나의 단백질에 특이적인 항체를 포함하는, 키트.
  13. 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 및 서열번호 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 DNA 분자를 포함하는, 브라시카 식물, 종자, 세포, 식물 부분 또는 상품(commodity product).
  14. 제13항에 있어서, 상기 식물, 종자, 세포 또는 식물 부분이 디캄바(dicamba)에 내성인, 브라시카 식물, 종자, 세포 또는 식물 부분.
  15. 지역 내 잡초를 방제하는 방법으로서, 브라시카 이벤트 MON94100을 포함하는 브라시카를 식재하는 단계 및 상기 브라시카에 상해를 입힘이 없이 상기 지역 내의 잡초를 방제하기 위해 유효량의 디캄바를 적용하는 단계를 포함하는, 방법.
  16. 제14항에 있어서, 상기 디캄바의 유효량은 재배 기간 동안 약 0.5 lb ae/acre 내지 약 2 lb ae/acre의 디캄바인, 방법.
  17. 지역 내 브라시카 이벤트 MON94100을 포함하는 자생(volunteer) 브라시카를 방제하는 방법으로서, 디캄바 이외의 적어도 하나의 제초제를 제초 유효량으로 적용하는 단계를 포함하되, 상기 제초제의 적용이 브라시카 이벤트 MON94100을 포함하는 브라시카의 성장을 방지하는, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 디캄바 이외의 제초제가 2,4-D (2,4-다이클로로페녹시아세트산), 브로목시닐(3,5-다이브로모-4-하이드록시벤조나이트릴), 및 MCPA 아민( 4-클로로-2-메틸페녹시 아세트산)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  19. 디캄바에 내성인 브라시카 식물을 생산하는 방법으로서,
    a) 브라시카 이벤트 MON94100을 포함하는 식물을 그 자체 또는 제2 식물과 함께 육종하여 종자를 생산하는 단계; 및
    b) 브라시카 이벤트 MON94100을 포함하는 자손 종자를 식별하는 단계
    를 포함하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 브라시카 이벤트 MON94100을 포함하는 자손 종자를 식별하는 단계가,
    i. 상기 자손 종자를 재배하여 자손 식물을 생산하고;
    ii. 상기 자손 식물을 유효량의 디캄바로 처리하고; 그리고
    iii. 디캄바에 내성인 자손 식물을 선택함으로써 이루어지는, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 브라시카 이벤트 MON94100을 포함하는 자손 종자를 식별하는 단계가 상기 자손 종자로부터 유래된 샘플에서 브라시카 이벤트 MON94100의 존재를 검출함으로써 이루어지는, 방법.
  22. 제20항에 있어서, 상기 브라시카 이벤트 MON94100을 포함하는 자손 종자를 식별하는 단계가 상기 자손 종자로부터 유래된 샘플에서 브라시카 이벤트 MON94100에 의해 암호화된 적어도 하나의 단백질의 존재를 검출함으로써 이루어지는 방법.
  23. 브라시카 이벤트 MON94100에 대한 식물의 접합성을 결정하는 방법으로서,
    a) 상기 식물에서 유래된 DNA를 포함하는 샘플을 브라시카 이벤트 MON94100의 존재를 진단하는 제1 앰플리콘 및 브라시카 이벤트 MON94100을 포함하지 않는 야생형 브라시카 게놈 DNA를 진단하는 제2 앰플리콘을 생성할 수 있는 프라이머 세트와 접촉시키는 단계;
    b) 핵산 증폭 반응을 수행하는 단계;
    c) 상기 제1 앰플리콘과 상기 제2 앰플리콘을 검출하는 단계
    를 포함하되, 여기서 두 앰플리콘의 존재는 상기 샘플이 브라시카 이벤트 MON94100에 대해 이형접합성임을 나타내고, 상기 제1 앰플리콘만의 존재는 상기 샘플이 브라시카 이벤트 MON94100에 대해 동형접합성임을 나타내는, 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 프라이머 세트가 서열번호 11 및 서열번호 12를 포함하는, 방법.
  25. 브라시카 식물에서 디캄바에 대한 내성을 개선시키는 방법으로서,
    a) 작동가능한 연결로, (a) 땅콩 퇴록 줄무늬 바이러스(Peanut chlorotic streak virus)로부터의 프로모터, (b) 담배 식각 바이러스(Tobacco etch virus)로부터의 리더(leader), (c) 완두(Pisum sativum)로부터의 리불로스 1,5-비스포스페이트 카복실라제 엽록체 수송 펩타이드, (d) 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia)로부터의 디캄바 모노옥시게나제 암호 서열, 및 (e) 메디카고 트룬카툴라(Medicago truncatula)로부터의 3' UTR을 포함하는 DNA 작제물을 수득하는 단계;
    b) 상기 DNA 작제물을 브라시카 세포의 게놈 내에 삽입하는 단계;
    c) 상기 브라시카 세포를 브라시카 식물로 재생하는 단계; 및
    d) 상기 DNA 작제물을 포함하는 브라시카 식물을 선택하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 선택하는 단계는 상기 브라시카 식물을 유효량의 디캄바로 처리함으로써 이루어지는, 방법.
  27. 제25항의 방법에 의해 수득 가능한 디캄바 내성인 브라시카 식물, 브라시카 종자 또는 브라시카 세포로서, DNA 작제물을 포함하는, 브라시카 식물, 브라시카 종자 또는 브라시카 세포.
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