KR20210075099A - 인간 망막 전구 세포 단리 및 배양 방법 - Google Patents

인간 망막 전구 세포 단리 및 배양 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20210075099A
KR20210075099A KR1020217011727A KR20217011727A KR20210075099A KR 20210075099 A KR20210075099 A KR 20210075099A KR 1020217011727 A KR1020217011727 A KR 1020217011727A KR 20217011727 A KR20217011727 A KR 20217011727A KR 20210075099 A KR20210075099 A KR 20210075099A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cells
retinal
cell
human
isolated
Prior art date
Application number
KR1020217011727A
Other languages
English (en)
Inventor
징 양
헨리 클라센
Original Assignee
더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 filed Critical 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
Publication of KR20210075099A publication Critical patent/KR20210075099A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0278—Physical preservation processes
    • A01N1/0284—Temperature processes, i.e. using a designated change in temperature over time
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/30—Nerves; Brain; Eyes; Corneal cells; Cerebrospinal fluid; Neuronal stem cells; Neuronal precursor cells; Glial cells; Oligodendrocytes; Schwann cells; Astroglia; Astrocytes; Choroid plexus; Spinal cord tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/02—Separating microorganisms from their culture media
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0621—Eye cells, e.g. cornea, iris pigmented cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2523/00—Culture process characterised by temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/30—Synthetic polymers
    • C12N2533/32—Polylysine, polyornithine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/52—Fibronectin; Laminin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 명세서에서는 망막 전구 세포의 투여에 의해 망막 질병 또는 병태의 치료, 완화 또는 예방; 광순응 (주간) 시력의 개선; 시력 교정 개선, 황반 기능 개선, 시야 개선, 또는 암순응 (야간) 시력 개선을 위한 조성물 및 방법이 개시된다.

Description

인간 망막 전구 세포 단리 및 배양 방법
관련 출원
본 출원은 2018년 9월 27일에 출원된 미국 가출원 제 62/737,622호에 대한 우선권을 주장하며, 상기 문헌의 내용은 그 전문이 참조로 포함된다.
본 명세서에 기재된 발명은 일반적으로 줄기세포 생물학 및 재생 의학 분야에 관한 것이다. 대안적 실시형태에서, 인간 샘플로부터 획득되거나 단리된 1차 망막 세포(primary retinal cell)를 단리하는 방법이 본 명세서에 제공된다. 대안적 실시형태에서, 망막 전구 세포(retinal progenitor cell)의 투여에 의한 망막 질병 또는 병태의 치료, 완화 또는 예방; 광순응 (주간) 시력의 개선; 시력 개선, 황반 기능 개선, 시야 개선, 또는 암순응 (야간) 시력 개선 또는 황반 및/또는 암순응 시각 기능의 재생을 위한 조성물 및 방법이 제공된다.
망막 변성(retinal degeneration)은 망막에서 광수용체 세포의 점진적이고 비가역적인 쇠퇴 및 사멸로 인한 퇴화 또는 변성을 지칭한다. 광수용체 세포의 사멸은 실명을 초래할 수 있다. 따라서, 손상되거나 손실된 광수용체 세포를 복원하고 시각 기능을 복원하기 위한 효과적인 치료가 당업계에 필요하다.
본 개시내용은 (a) 약 12주 내지 약 28주 재태 기간(gestational age)의 인간으로부터의 인간 망막 조직의 획득 샘플을 처리하거나 처리하였거나 처리하는 단계, (b) 획득한 샘플을 기계적으로 분리하는 단계, (c) 샘플로부터 획득한 1차 망막 세포의 생존율 및 양을 결정하는 단계, (d) 획득한 1차 망막 세포의 형태(morphology)를 확인하였거나 확인하여 세포 및 세포 덩어리(cluster)의 분리된 현탁액을 생성하는 단계 의해 인간 샘플로부터 획득되었거나 획득되는 1차 망막 세포를 단리하는 방법을 제공한다.
본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, 인간 망막 조직은 하나 또는 한 쌍의 인간 안구로부터 획득된다. 본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, 안구(들)는 온전한 구체(들), 투명한 각막, 및/또는 정상 모양(normal shape)을 포함하는 정상 형태를 갖는다. 일부 실시형태에서, 태아 안구 (인간 망막 조직 포함)는 L-글루타민이 포함된 RPMI-1640 배지에 저장되고 공여체로부터 기관 수확 직후 빙냉 저장된다. 이러한 방법 중 임의의 것에서 저장된 인간 망막 조직은 수확 후 소정의 기간 내에 전달 및 사용된다. 다양한 실시형태에서, 인간 망막 조직은 빙냉 수송되고 수송 기간 내에 전달된다. 비 제한적인 예로서, 수송 기간은 약 1 내지 약 26시간 이상 (예를 들어, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 19.5, 20, 20.5, 21, 21.5, 22, 22.5, 23, 23.5, 24, 24.5, 25, 25.5, 또는 26시간), 예를 들어 약 4.5 내지 약 21.5시간 (예를 들어, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 19.5, 20, 20.5, 21, 또는 21.5) 또는 약 7 내지 약 26시간 (예를 들어, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 19.5, 20, 20.5, 21, 21.5, 22, 22.5, 23, 23.5, 24, 24.5, 25, 25.5, 또는 26시간)일 수 있다.
본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, 단계 (a)에서 획득된 샘플을 처리하는 단계는 (i) 기관 수확 후, RPMI-1640 배지로부터 안구(들)를 제거하고 항생제가 보충된 빙냉 인산염 완충 식염수 (PBS)에 의해 1 내지 5회 (예를 들어 1, 2, 3, 4 또는 5회) 세정하는 단계, (ii) 안구로부터 시신경과 중간엽 조직을 제거하여 모든 안구외 세포를 제거하는 단계, (iii) 항생제가 보충된 빙냉 PBS로 안구를 세척하는 단계, (iv) 바늘을 사용하여 윤부(limbus)에서 구체를 천공(puncturing)하는 단계, (v) 미세 수술 가위로 윤부를 따라 원주 방향으로 절단하는 단계, (vi) 수정체(lens), 각막 및 결합 유리체를 제거하는 단계, (vii) 망막 색소 상피 (RPE) 층으로부터 망막(들)을 분리하여 단리된 망막을 생성하는 단계, (viii) 단리된 망막(들)을 항생제가 보충된 빙냉 배지 또는 PBS를 포함하는 페트리 접시 (Petri-dish)에 배치하는 단계를 포함한다.
본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, 단계 (b)에서 기계적으로 분리하는 단계는 (i) 망막(들)을 원뿔형 튜브로 옮기는 단계, (ii) 망막(들)을 기계적으로 분리하여 분리된 망막을 생성하는 단계, (iii) 항생제가 보충된 무 혈청 배지로 페트리 접시를 세척하고, 임의의 잔여 분리 망막을 포함하는 배지를 분리된 망막(들)을 포함하는 원뿔형 튜브에 옮기는 단계, (iv) 원심분리를 통해 분리된 망막(들)을 펠릿화(pelleting)하는 단계, (v) 상청액을 제거하는 단계에 의해 단계 (a)에서 획득된 망막(들)을 기계적으로 분리하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 망막의 기계적 분리는 멸균 피펫에 의한 분쇄를 통해 수행된다. 일부 실시형태에서, 분리된 망막은 1 내지 50℃에서 약 0 내지 약 30분 동안 약 10 내지 약 1000 xg에서 원심분리를 통해 펠릿화된다.
본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, (c)에서 1차 망막 세포의 생존율 및 양을 결정하는 단계는 (i) 빙냉 항생제가 보충된 무 혈청 배지에서 단계 (b)로부터 펠릿화된 망막 조직을 재현탁하는 단계, (ii) 망막 조직의 기계적 분리로부터 획득된 망막 세포 및 망막 세포 덩어리의 양 및 생존율을 결정하는 단계, (iii) 항생제가 보충된 무 혈청 배지를 포함하는 피브로넥틴 (fibronectin) 코팅 세포 배양 플라스크 또는 플레이트에 세포를 시딩(seeding)하는 단계, (iv) 망막 세포 포함 플라스크 또는 플레이트를 10 내지 50℃에서 인큐베이션(incubation)하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포의 양 및 생존율은 NC-200 세포 계수기(cell counter)에 의해 측정된다. 일부 실시형태에서, 계수된 세포 수는 약 1 내지 약 1,000,000,000개의 세포이다. 일부 실시형태에서, 계수된 생존가능한(viable) 세포의 백분율은 약 10 내지 약 100이다. 일부 실시형태에서, 플라스크 또는 플레이트는 약 1 내지 약 1,000,000,000개의 세포가 시딩된다. 일부 실시형태에서, 망막 세포 포함 플라스크 또는 플레이트의 인큐베이션은 37℃에서 0 내지 30% CO2 및 0 내지 50% O2 하에 이루어진다.
본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, 단계 (d)는 세포 배양 플라스크 또는 플레이트에 시딩된 망막 세포가 약 1 내지 약 100개의 세포를 포함하는 망막 세포 덩어리로 구성되었는지를 확인하는 단계를 포함한다.
본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, PBS 또는 무혈청 배지를 보충하는데 사용되는 항생제는 젠타마이신 (Gentamicin)이다. 일부 실시형태에서, 항생제는 약 0 내지 약 10,000 μg/mL의 농도로 사용된다.
본 개시내용은 인간 샘플로부터 1차 망막 세포를 단리하는 방법으로서, (a) 인간 샘플로부터 다수의 1차 망막 세포를 포함하는 망막 샘플을 단리하는 단계로서, 인간 샘플은 약 12주 내지 약 28주의 재태 기간의 인간 공여체로부터 유래된 것인 단계, (b) 다수의 1차 망막 세포를 프로테아제로 분해하지 않고 단계 (a)에서 단리된 망막 샘플 중 다수의 1차 망막 세포를 기계적으로 분리함으로써, 분리된 세포 및 세포 덩어리의 현탁액을 생성하는 단계, 및 (c) 망막 샘플로부터 획득된 1차 망막 세포의 생존율, 양 및 형태를 결정하는 단계로서, 적어도 30 x 106개의 생존가능한 1차 망막 세포가 생성되는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, 인간 샘플은 하나 또는 한 쌍의 인간 안구이다. 일부 실시형태에서, 안구(들)는 온전한 구체(들), 투명한 각막, 정상 모양, 또는 이의 임의의 조합을 포함하는 정상 형태를 갖는다. 일부 실시형태에서, 인간 샘플은 단계 (a) 전에 인간 공여체로부터 수확한 후 수송 세포 배양 배지에 배치된다. 일부 실시형태에서, 수송 세포 배양 배지는 L-글루타민 또는 고급 DMEM/F12를 갖는 RPMI-1640을 포함한다. 일부 실시형태에서, 수송 세포 배양 배지는 약 0.5 내지 50 마이크로그램/밀리리터 (mL)의 젠타마이신을 포함하고, 선택적으로 수송 세포 배양 배지는 약 50 마이크로그램/밀리리터 젠타마이신을 포함한다. 일부 실시형태에서, 인간 샘플은 수송 세포 배양 배지에 배치 직후, 예를 들어 빙냉 배치되어 약 1 내지 8℃에 저장된다.
본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, 인간 샘플은 인간 공여체로부터 수확한 후 약 7 내지 약 26시간 내에 사용된다.
본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, 단계 (a)에서 인간 샘플로부터 망막 샘플을 단리하는 방법은 (i) 수송 배양 배지로부터 하나 또는 한 쌍의 인간 안구를 제거하는 단계, (ii) 항생제가 보충된 약 1 내지 8℃ 인산염 완충 식염수 (PBS)로 하나 또는 한 쌍의 인간 안구를 세정하는 단계, (iii) 하나 또는 한 쌍의 인간 안구로부터 시신경 및 중간엽 조직을 제거하는 단계, (iv) 항생제가 보충된 약 1 내지 8℃ PBS로 하나 또는 한 쌍의 인간 안구를 세척하는 단계, (v) 바늘을 사용하여 윤부에서 하나 또는 한 쌍의 인간 안구 각각의 구체를 천공하는 단계, (vi) 하나 또는 한 쌍의 인간 안구의 윤부를 따라 원주 방향으로 절단하는 단계, (vii) 하나 또는 한 쌍의 인간 안구로부터 수정체, 각막 및 관련 유리체를 제거하는 단계, (viii) 망막(들)을 망막 색소 상피 (RPE) 층으로부터 분리하여 단리된 망막 또는 단리된 망막 쌍을 생성하는 단계, 및 (ix) 약 1 내지 8℃ 배양 배지 또는 PBS에 단리된 망막 또는 단리된 망막 쌍을 배치하는 단계로서, 배양 배지 또는 PBS에 항생제가 보충된 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단계 (ii)는 1 내지 5회 또는 3회 반복된다. 일부 실시형태에서, 단계 (iii)는 일부 또는 전체 안구외 세포를 제거한다.
본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, 단계 (b)에서 다수의 1차 망막 세포를 기계적으로 분리하는 단계는 (i) 망막 샘플을 튜브로 옮기는 단계, (ii) 망막 샘플을 기계적으로 분리하여 분리된 다수의 1차 망막 세포를 생성하는 단계, (iii) 원심분리를 통해 분리된 다수의 1차 망막 세포를 펠릿화하는 단계, 및 (iv) 상청액을 제거하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 망막의 기계적 분리는 멸균 피펫에 의한 분쇄를 통해 수행된다. 일부 실시형태에서, 분쇄는 2 내지 50회, 2 내지 10회, 또는 4 내지 8회 수행된다. 일부 실시형태에서, 분리된 다수의 1차 망막 세포는 4℃에서 약 3분의 기간 동안 약 140 xg에서의 원심분리를 통해 펠릿화된다. 일부 실시형태에서, 본 방법은 단계 (ii) 후 및 단계 (iii) 전에 항생제가 보충된 배양 배지 또는 PBS로 분리된 다수의 1차 망막 세포를 세척하는 단계를 포함한다.
본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, 분리된 다수의 1차 망막 세포는 단일 세포 및 세포 덩어리를 포함한다.
본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, 단계 (c)에서 1차 망막 세포의 생존율, 양 및 형태를 결정하는 단계는 (i) 약 1 내지 8℃ 항생제 보충 배양 배지에서 단계 (b)로부터의 펠릿화된 1차 망막 세포를 재현탁하는 단계, (ii) 다수의 분리된 망막 세포를 배양 배지를 포함하는 하나 이상의 코팅된 세포 배양 플라스크 또는 플레이트에 시딩하는 단계로서, 선택적으로 세포 배양 배지에 항생제가 보충된 단계, (iii) 다수의 분리된 망막 세포를 10 내지 50℃에서 인큐베이션하는 단계로서, 선택적으로 인큐베이션은 37℃에서 이루어지는 단계, 및 (iv) 1차 망막 세포 및 망막 세포 덩어리의 양 및 생존율을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 1차 망막 세포의 양 및 생존율은 응집 세포 계수 방법, 혈구계 또는 트리판 블루(Trypan Blue)를 사용하여 NC-200 세포 계수기에 의해 측정된다. 일부 실시형태에서, 생존가능한 1차 망막 세포의 수는 약 20 x 106 내지 약 1 x 109개의 생존가능한 1차 망막 세포, 또는 약 73 내지 147 x 106개의 생존가능한 1차 망막 세포이다. 일부 실시형태에서, 계수된 생존가능한 세포의 백분율은 약 10% 내지 약 100%, 또는 약 68% 내지 약 85%이다.
본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, 플라스크 또는 플레이트는 단계 (ii)에서 약 1 내지 약 1,000,000,000개의 세포로 시딩된다.
본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, 다수의 분리된 망막 세포는 (1) 약 37℃, 0 내지 30% CO2 및 0 내지 50% O2; (2) 약 37℃, 5% 이하의 CO2 및 20% 이하의 O2 하; 또는 (3) 약 37℃, 5% 이하의 CO2 및 3% 이하의 O2에서 인큐베이션된다. 일부 실시형태에서, 다수의 분리된 망막 세포는 37℃에서, 5% 이하의 CO2 및 3% 이하의 O2에서 인큐베이션된다.
본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, 단계 (c)에서 1차 망막 세포의 생존율, 양 및 형태를 결정하는 단계는 (i) 다수의 분리된 망막 세포를 현미경으로 시각적으로 검사하는 단계, 및 (ii) 세포 배양 플라스크 또는 플레이트에 시딩된 다수의 망막 세포가 약 2 내지 약 1000개의 세포로 구성되는 망막 세포 덩어리의 덩어리를 포함하는지를 확인하는 단계를 포함한다.
본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, 무혈청 배지는 (a) 고급 DMEM/F12, (b) N-2 보충제(supplement), (c) EGF (재조합 인간 상피 성장 인자), (d) bFGF (염기성 섬유아세포 성장 인자), 및/또는 (e) GlutaMAX I를 포함한다.
본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, 배양 배지는 혈청을 무함유한다. 일부 실시형태에서, 배양 배지는 완전 배지를 포함한다. 일부 실시형태에서, 배지는 둘베코 변형 이글 배지 DMEM/F12, 고급 DMEM/F12, Knockout DMEM/F12, Neurobasal 배지, ReNcell 또는 Ultraculture 배지를 포함한다. 일부 실시형태에서, 배양 배지는 고급 DMEM/F12를 포함한다. 일부 실시형태에서 배양 배지는 N-2 보충제 및 GlutaMAX-I를 포함한다. 일부 실시형태에서 배양 배지는 B27, B27 이종 무함유(xeno-free), 또는 Stempro를 포함한다. 일부 실시형태에서 배양 배지는 세포 생존 또는 성장을 지원하는 보충제 또는 첨가제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 생존 또는 성장을 지원하는 보충제 또는 첨가제는 L-글루타민, 재조합 인간 상피 성장 인자 (EGF), 염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF), 다른 성장 인자, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 항생제는 약 0.5 내지 약 50 μg/mL의 농도의 젠타마이신을 포함하고, 선택적으로 젠타마이신의 농도는 약 30 μg/mL이다.
본 개시내용은 단리된 1차 인간 망막 세포를 배양하여 비-불멸(non-immortal) 인간 망막 전구 세포 집단을 생성하는 방법으로서, (a) 약 4 내지 6회의 계대배양 동안 표준 산소 수준에서 이종 무함유 피브로넥틴, 오르니틴 (ornithine), 폴리리신, 또는 라미닌 (laminin)으로 코팅된 무혈청 배지 배양 플라스크 또는 플레이트에 단리된 1차 망막 세포의 현탁액을 배양하는 단계, (b) 그 후 추가의 3 내지 6회의 계대배양 동안 저산소 수준에서 무혈청 배지에 현탁액을 배양하는 단계로서, 세포는 40% 내지 90% 컨플루언스 (confluence)에서 계대배양되고, 각각의 계대배양 시 효소로 처리하여, 세포를 분리하고, 새로운 배양 배지를 첨가하는 단계, 및 (c) 그 후 세포를 저온보존하여, 비-불멸 인간 망막 전구 세포의 집단을 제조하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, 저산소 수준에서 현탁액의 후속 배양 후에, 세포를 표준 산소 수준에서 일정 시간 동안 계대배양 없이 성장시킨다. 일부 실시형태에서, 계대배양 사이의 기간은 3 내지 5일 (예를 들어, 3, 4, 또는 5일)이다.
본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, 세포를 분리하는데 사용되는 효소 용액은 트립신 또는 균등물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포는 제1 계대배양 시 약 1:4 비율의 트립신 또는 균등물, 및 EDTA를 포함하는 효소 용액을 사용하여 분리된다. 일부 실시형태에서, 트립신 또는 균등물 및 EDTA는 제1 계대배양 시 약 1:3, 1:3.1, 1:3.2, 1:3.3, 1:3.4, 1:3.5, 1:3.6, 1:3.7, 1:3.8, 1:3.9, 1:4.0, 1:4.1, 1:4.2, 1:4.3, 1:4.4, 1:4.5, 1:4.6, 1:4.7, 1:4.8, 1:4.9 또는 1:5.0의 비율로 존재한다. 일부 실시형태에서, 세포는 제1 계대배양 시 약 1:1:3 비율의 트립신 또는 균등물, EDTA 및 DPBS를 포함하는 효소 용액을 사용하여 분리된다. 일부 실시형태에서, 트립신 또는 균등물, EDTA 및 DPBS는 제1 계대배양 시 약 1:1:2, 1:1:2.1, 1:1:2.2, 1:1:2.3, 1:1:2.4, 1:1:2.5, 1:1:2.6, 1:1:2.7, 1:1:2.8, 1:1:2.9, 1:1:3.0, 1:1:3.1, 1:1:3.2, 1:1:3.3, 1:1:3.4, 1:1:3.5, 1:1:3.6, 1:1:3.7, 1:1:3.8, 1:1:3.9 또는 1:1:4.0의 비율로 존재한다. 일부 실시형태에서, 세포는 제1 계대배양 시 6 내지 10분 동안 약 37℃에서 분리된다. 일부 실시형태에서, 세포는 제2 계대배양 시 약 1:1:3 비율의 트립신 또는 균등물, EDTA 및 DPBS를 포함하는 효소 용액을 사용하여 분리된다. 일부 실시형태에서, 트립신 또는 균등물, EDTA 및 DPBS는 제2 계대배양 시 약 1:1:2, 1:1:2.1, 1:1:2.2, 1:1:2.3, 1:1:2.4, 1:1:2.5, 1:1:2.6, 1:1:2.7, 1:1:2.8, 1:1:2.9, 1:1:3.0, 1:1:3.1, 1:1:3.2, 1:1:3.3, 1:1:3.4, 1:1:3.5, 1:1:3.6, 1:1:3.7, 1:1:3.8, 1:1:3.9 또는 1:1:4.0의 비율로 존재한다. 일부 실시형태에서, 세포는 제2 계대배양 시 약 1:1의 비율의 트립신 또는 균등물, 및 EDTA를 포함하는 효소 용액을 사용하여 분리된다. 일부 실시형태에서, 트립신 또는 균등물 및 EDTA는 제2 계대배양 시 약 1:0.5, 1:0.6, 1:0.7, 1:0.8, 1:0.9, 1:1, 1:1.1, 1:1.2, 1:1.3, 1:1.4, 또는 1:1.5의 비율로 존재한다. 일부 실시형태에서, 세포는 제2 계대배양 시 4 내지 8분 동안 약 37℃에서 분리된다. 일부 실시형태에서, 세포는 제3 계대배양 및 모든 추가 계대배양 시 약 1:1의 비율의 트립신 또는 균등물, 및 EDTA를 포함하는 효소 용액을 사용하여 분리된다. 일부 실시형태에서, 트립신 또는 균등물 및 EDTA는 제3 및 모든 추가 계대배양 시 약 1:0.5, 1:0.6, 1:0.7, 1:0.8, 1:0.9, 1:1, 1:1.1, 1:1.2, 1:1.3, 1:1.4, 또는 1:1.5의 비율로 존재한다. 일부 실시형태에서, 세포는 제3 및 모든 추가 계대배양 시 4 내지 8분 동안 37℃에서 분리된다. 일부 실시형태에서, 트립신 또는 균등물은 TrypLE, 예를 들어 TrypLE Express 또는 TrypLE Select를 포함한다. 일부 실시형태에서, 분리는 과량의 DMEM 또는 PBS의 첨가에 의해 중지된다. 일부 실시형태에서, 세포 수(cell count) 및 생존율은 분리 후 결정된다. 일부 실시형태에서, 세포 수 및 생존율은 NC-200 세포 계수기에 의해 결정된다.
본 개시내용은 단리된 1차 인간 망막 세포를 배양하여 비-불멸 인간 망막 전구 세포 집단을 생성하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 (a) 다수의 배양 망막 세포를 생성하기 위해 제1 계대배양 시 배양 배지를 포함하는 하나 이상의 코팅된 배양 플라스크 또는 플레이트에 본 명세서에 기재된 방법에 의해 생성된 다수의 1차 망막 세포를 시딩하는 단계; (b) 제2 계대배양 시 배양 배지를 포함하는 하나 이상의 코팅된 배양 플라스크 또는 플레이트에 제1 계대배양에 의해 생성된 다수의 배양 망막 세포를 시딩하는 단계; (c) 제3에서 배양 배지를 포함하는 하나 이상의 코팅된 배양 플라스크 또는 플레이트에 제2 계대배양에 의해 생성된 다수의 배양 망막 세포를 시딩하는 단계; 및 (d) 다수의 배양 망막 세포를 저온보존하여, 비-불멸 인간 망막 전구 세포 집단을 생성하는 단계를 포함하고; 하나 이상의 코팅된 배양 플라스크를 약 1x 104 세포/제곱 센티미터 (cm2) 내지 약 2 x 106 세포/cm2의 밀도로 시딩하고, 제1 계대배양 시의 시딩 밀도는 제2 계대배양 시의 시딩 밀도보다 더 크고, 제2 계대배양 시의 시딩 밀도는 제3 계대배양 시의 시딩 밀도보다 더 크다.
본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, 본 방법은 하나 이상의 추가 계대배양 시 배양 배지를 포함하는 하나 이상의 코팅된 배양 플라스크 또는 플레이트에 직전 계대배양에 의해 생성된 다수의 배양 망막 세포를 시딩하는 단계를 추가로 포함한다.
본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, 배양 플라스크 또는 플레이트는 이종 무함유 피브로넥틴, 오르니틴, 폴리-리신, 라미닌, 또는 이의 조합으로 코팅된다.
본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, 다수의 1차 또는 배양 망막 세포는 (1) 약 37℃, 0 내지 30% CO2 및 0 내지 50% O2 하, (2) 약 37℃, 5% 이하의 CO2 및 20% 이하의 O2; 또는 (3) 약 37℃, 5% 이하의 CO2 및 3% 이하의 O2 하에 배양된다. 일부 실시형태에서, 다수의 1차 또는 배양 망막 세포는 약 37℃에서, 5% 이하의 CO2 및 3% 이하의 O2 하에 배양된다. 일부 실시형태에서, 바로 연속하는 2회의 계대배양 사이의 기간은 2 내지 8일, 3 내지 6일, 4 내지 5일, 또는 3 내지 4일이다. 일부 실시형태에서, 바로 연속하는 2회의 계대배양 사이의 기간은 3 내지 4일이다.
본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, 다수의 1차 망막 세포는 제1 계대배양 시 (1) 트립신 또는 균등물, 및 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), 또는 (2) 트립신 또는 균등물, EDTA, 및 DPBS를 포함하는 제1 효소 용액으로 분리된다. 일부 실시형태에서, 트립신 균등물은 TrypLE이다. 일부 실시형태에서, (1) TrypLE 및 EDTA는 제1 효소 용액 중 1:4의 비율로 존재하거나, (2) TrypLE, EDTA 및 DPBS는 1:1:3의 비율로 존재한다. 일부 실시형태에서, 다수의 1차 망막 세포는 약 5 내지 20분, 약 6 내지 10분, 또는 약 7 내지 8분 동안 약 37℃에서 분리된다. 일부 실시형태에서, 다수의 1차 망막 세포는 약 7 내지 8분 동안 약 37℃에서 이루어진다.
본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, 다수의 배양 망막 세포는 제2 계대배양 시 (1) 트립신 또는 균등물, EDTA 및 DPBS, 또는 (2) 트립신 또는 균등물, 및 DPBS를 포함하는 제2 효소 용액으로 분리된다. 일부 실시형태에서, 트립신 균등물은 TrypLE이다. 일부 실시형태에서, (1) TrypLE, EDTA, 및 DPBS는 제2 효소 용액 중 1:1:3 비율로 존재하거나, (2) TrypLE 및 DPBS는 제2 효소 용액 중 1:1의 비율로 존재한다. 일부 실시형태에서, 다수의 배양 망막 세포는 약 5 내지 20분, 약 6 내지 10분, 또는 약 7 내지 8분 동안 약 37℃에서 분리된다. 일부 실시형태에서, 다수의 배양 망막 세포는 약 5 내지 6분 동안 약 37℃에서 분리된다.
본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, 다수의 배양 망막 세포는 적어도 제3 또는 추가 계대배양 시 트립신 또는 균등물, 및 DPBS를 포함하는 제3 효소 용액으로 분리된다. 일부 실시형태에서, 트립신 균등물은 TrypLE를 포함한다. 일부 실시형태에서, TrypLE 및 DPBS는 제3 효소 용액 중 1:1의 비율로 존재한다. 일부 실시형태에서, 다수의 배양 망막 세포는 적어도 제3 또는 추가 계대배양 시 약 5 내지 10분 또는 약 5 내지 7분 동안 약 37℃에서 분리된다. 일부 실시형태에서, 적어도 제3 또는 추가 계대배양은 3 내지 5회의 계대배양을 포함한다.
본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, 본 방법은 제2 계대배양 후 다수의 배양 망막 세포의 분리 후 세포 수 및 생존율을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90%의 세포가 생존가능하다.
본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, c 세포는 배양 플라스크 또는 플레이트에 제1 계대배양 시 약 0.5 x 106 내지 약 3.0 x 106 세포/cm2, 제2 계대배양 시약 0.1 x 106 내지 약 0.5 x 106 세포/cm2, 제3 계대배양 시 약 0.03 x 106 내지 약 0.2 x 106 세포/cm2, 및 제4 및 추가 계대배양 시 약 10,000 내지 약 60,000 세포/cm2의 밀도로 시딩된다.
본 개시내용은 본 개시내용의 방법을 사용하여 생성된 망막 전구 세포를 저온보존하는 방법으로서, (i) 트립신을 사용하여 세포를 효소에 의해 분리하는 단계, (ii) 과량의 배양 배지 또는 고급 DMEM/F12에 의해 분리를 중지시키는 단계, (iii) 10xg 내지 10,000xg에서 1 내지 30분 동안 원심분리를 통해 세포를 원심분리하는 단계, (iv) 배양 배지에서 세포를 재현탁하고 총 세포 수 및 생존율을 결정하는 단계, (v) 저온보존 배지를 첨가하여 최종 디메틸술폭사이드 (DMSO) 농도가 5 내지 30%가 되도록 하는 단계, (vi) 다수의 세포를 각각의 저온 바이알(cryovial)로 분취(aliquoting)하는 단계, (vii) Control Rate Freezer를 사용하여 각 바이알을 동결하는 단계, 및 (viii) 각각의 세포 바이알을 액체 N2 중에 배치하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, 저온보존 단계는 (a) 1:1 트립신 또는 균등물, 및 DPBS를 사용하여 세포를 효소에 의해 분리하는 단계, (b) 과량의 DMEM 또는 PBS로 분리를 중지시키는 단계, (c) 1 내지 30분 동안 10 내지 10,000 g에서의 원심분리를 통해 세포를 펠릿화하는 단계, (d) 무혈청 배지 중에 세포를 재현탁하고, 총 세포 수 및 생존율을 결정하는 단계, (e) 저온보존 배지를 첨가하여, 5 내지 30%의 최종 DMSO 농도를 획득하는 단계, (f) 0.2 내지 100x106개의 세포를 각각의 저온 바이알에 분취하는 단계, (g) -80℃에서 6 내지 72시간 동안 각 바이알을 동결하는 단계, 및 (h) 액체 N2 중에 각 바이알의 세포를 배치하는 단계에 의해 수행된다.
본 개시내용의 저온보존 방법의 일부 실시형태에서, 단계 (i)에서 트립신 균등물은 TrypLE를 포함한다. 일부 실시형태에서, 저온보존 배지는 배양 배지 및 10% DMSO를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단계 (vi)에서 다수의 세포는 약 0.5 x 106 내지 50 x 106 세포/저온 바이알, 또는 약 0.5 x 106 내지 약 20 x 106 세포/mL 배양 배지 및 DMSO로 존재한다.
본 개시내용의 방법의 일부 실시형태에서, 세포 및/또는 세포 덩어리는 세포 생존 또는 성장을 지원하는 보충제 또는 첨가제와 함께 배양된다. 일부 실시형태에서, 세포 생존 또는 성장을 지원하는 보충제 또는 첨가제는 L-글루타민, EGF 및 bFGF (Invitrogen)로 이루어진 인간 재조합 성장 인자, 및 다른 성장 인자로 이루어진 군으로부터 선택된다.
대안적 실시형태에서, 상기 청구범위 중 어느 한 항의 방법에 의해 단리된 망막 전구 세포, 또는 하나의 집단 또는 다수의 비-불멸 인간 망막 전구 세포를 포함하고, 선택적으로 또한 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물이 제공된다.
대안적 실시형태에서, 본 명세서에서는 전술한 청구범위 중 어느 한 항의 방법에 의해 단리된 망막 전구 세포, 또는 하나의 집단 또는 다수의 비-불멸 인간 망막 전구 세포를 포함하는 키트가 제공된다.
대안적 실시형태에서, 망막 질병 또는 병태의 치료, 완화 또는 예방, 광순응 (주간) 시력의 개선, 교정 시력 개선, 황반 기능 개선, 시야 개선, 또는 암순응 (야간) 시력 개선을 위한 방법이 제공되고, 본 방법은 (a) 상기 청구범위의 어느 한 항의 방법에 의해 단리된 망막 전구 세포 또는 하나의 집단 또는 다수의 비-불멸 인간 망막 전구 세포를 필요한 개체에 투여하였거나 투여하는 단계; 또는 (b) (i) 상기 청구범위의 어느 한 항의 방법에 의해 단리된 망막 전구 세포 또는 하나의 집단 또는 다수의 비-불멸 인간 망막 전구 세포를 제공하였거나 제공하는 단계; 및 (ii) 망막 전구 세포 또는 하나의 집단 또는 다수의 비-불멸 인간 망막 전구 세포를 필요한 개체에 투여하였거나 투여하는 단계를 포함한다.
대안적 실시형태에서, 망막 질병 또는 병태의 치료, 완화 또는 예방, 광순응 (주간) 시력 개선, 교정 시력 개선, 황반 기능 개선, 시야 개선, 또는 암순응 (야간) 시력 개선을 위한 의약의 제조에서 상기 청구범위의 어느 한 항의 방법에 의해 단리된 망막 전구 세포 또는 하나의 집단 또는 다수의 비-불멸 인간 망막 전구 세포의 용도가 제공된다.
대안적 실시형태에서, 망막 질병 또는 병태의 치료, 완화 또는 예방, 광순응 (주간) 시력 개선, 교정 시력 개선, 황반 기능 개선, 시야 개선, 또는 암순응 (야간) 시력 개선에 사용하기 위한 상기 청구범위의 어느 한 항의 방법에 의해 단리된 망막 전구 세포 또는 하나의 집단 또는 다수의 비-불멸 인간 망막 전구 세포가 제공된다.
상기 양상들 중 임의의 것은 본 개시내용의 임의의 다른 양상과 조합될 수 있다.
도 1은 각 횟수의 계대배양에서 망막 전구 세포의 평균 수를 나타내는 선 그래프이다. 프로토콜 A 또는 프로토콜 B를 사용하여 안구 샘플로부터 망막 전구 세포를 단리하고 같은 날 (7시간, 8시간) 또는 밤새 수송 (24시간) 후 처리하였다. P는 계대배양 횟수를 의미하고; d는 일수를 의미한다. 데이터 포인트는 동일한 프로토콜을 사용하여 단리되고 동일한 조건에서 배양된 모든 망막 전구 세포의 평균 수에 대한 이론적 계산치를 나타낸다.
도 2는 프로토콜 B를 사용한 실험 조건 및 계대배양 조건을 설명하고 이를 이전 배양 방법 (프로토콜 A)과 비교한 표이다. P는 계대배양 횟수를 의미하고; d는 일수를 의미하고; T는 TrypLE Select (Invitrogen)를 의미하고; E는 EDTA (Invitrogen)를 의미하며; P는 둘베코 인산염 완충 식염수 또는 DPBS (Invitrogen)를 의미한다.
태아의 안구 (및 결합 망막 조직)가 장거리 동안 빙냉 수송될 때, 수송시간이 매우 상당할 수 있다. 그 시간 동안 망막 조직은 점차 더 손상되기 쉬워지고 구성 세포의 잠재적 생존율은 점차 감소한다. 최종 산물 수율 (배양에서 설정된 임의의 시간 동안)이 망막당 획득되는 생존가능한 세포의 수에 영향을 받기 때문에 조직이 멀리서 공급되야하는 경우 세포 제조에 문제가 된다. 그러나, 증가된 조직 손상가능성을 이용하고 그렇지 않으면, 망막 세포를 단리하는데 사용되는 특정 단계를 제거하는 것이 가능하다. 특히, 망막 조직을 분해하기 위해 트립신을 사용하지 않아도 되는데, 그 이유는 조직이 부드러운 분쇄만으로 분해될 수 있기 때문이다. 이는 수행하기 쉽고 조직으로부터 인큐베이터까지의 시간을 단축시킨다. 또한 초기 계대배양 동안 EDTA를 사용하면 배양에서 회복되는 이 중요한 기간 동안 세포에 대한 스트레스가 또한 감소한다. 연속 계대배양에 걸쳐 망막을 점차적으로 더 작은 덩어리로 분해하고, 과정의 후반까지 단일 세포로 분리하려고 시도하지 않음으로써 생존율이 더욱 향상되고 과정 수행의 위험성이 감소한다. 세포 생존율이 개선됨에 따라 트립신은 수율에 부정적인 영향을 주지 않고 계대배양 과정에 체계적으로 도입될 수 있다.
특히, 출발 조직에 이전의 경우보다 실질적으로 더 긴 수송 시간이 적용될 때 예상 세포 수율은 부정적인 영향을 받을 수 있다. 조직의 변화는 직접 해결하기 어려울 수 있지만, 단리 및 초기 세포 배양 프로토콜을 변형하여 세포 손실의 원인을 제거하고 최종 수율을 향상시킬 수 있다.
본 명세서에 기재된 망막 세포를 단리하는 방법은 조직 조달과 조직 배양 개시 사이에 긴 시간 간격이 있을 때 이전 방법에 비해 다수의 이점을 갖는다. 본 명세서에 기재된 방법은 (1) 수율 개선, (2) 효소 단계가 제거되기 때문에 수행하기 쉬움, (3) 관련 세포 손실과 함께 세포 용해 및 DNA의 추출 위험 감소, (4) 조직 단리로부터 인큐베이터까지의 더 빠른 과정, 및 (5) 초기 계대배양 동안 세포 생존율의 향상을 포함하지만 이에 제한되지 않는 이점을 가지고 있다.
정의
본 개시내용의 이해를 용이하게하기 위해, 다수의 용어가 아래에 규정된다. 본 명세서의 용어는 본 명세서에 기재된 발명의 특정 실시형태를 설명하기 위해 사용되지만, 이의 사용은 청구범위에 요약된 것을 제외하고는 발명을 한정하지 않는다.
본 명세서에 설명된 임의의 양상 및 실시형태는 본 명세서에 개시된 바와 같은 임의의 다른 양상 또는 실시형태와 조합될 수 있다.
달리 규정되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 균등한 다른 프로브, 조성물, 방법 및 키트가 본 개시내용의 실시에 사용될 수 있지만, 예시적인 물질 및 방법이 본 명세서에 기재된다. 본 명세서에서 사용된 용어는 단지 특정 양상을 설명하기 위한 것이며 제한하려는 의도가 아님을 이해해야 한다.
본 명세서에서, "~를 포함하다", "~를 포함하는", "~를 함유하는", "~를 갖는" 등은 미국 특허법에 규정된 의미를 가질 수 있고 "~를 포함하다", "~를 포함하는" 등을 의미할 수 있고; "~로 필수적으로 이루어진" 또는 "~로 필수적으로 이루어지다"라는 용어는 마찬가지로 미국 특허법에 규정된 의미를 가지며 이러한 용어는 개방형이며, 열거된 것 이상의 존재에 의해 열거된 것의 기본 또는 신규 특성이 변하지 않는 한 열거된 것 이상의 존재가 허용되지만 종래기술의 실시형태를 배제하지 않는다.
구체적으로 언급되거나 문맥상 명백하지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 단수형 용어 ("a", "an" 및 "the")는 단수형 또는 복수형으로 이해된다.
구체적으로 언급되거나 문맥상 명백하지 않는 한, 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "또는"은 포괄적인 것으로 이해된다.
다른 맥락에서 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 달리 지시되지 않는 한, 열거된 값, 예를 들어 양, 투여량, 온도, 시간, 백분율 등 +/-10%, +/-9%, +/-8%, +/-7%, +/-6%, +/-5%, +/-4%, +/-3%, +/-2%, 또는 +/-1%를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "환자" 또는 "대상체" 등은 인간, 가축 및 농장 동물, 및 동물원, 스포츠 및 개, 말, 고양이와 같은 애완 동물 및 소, 양, 돼지 및 염소를 포함한 농업용 동물을 포함한 임의의 포유류를 지칭하기 위해 본 명세서에서 상호 혼용된다. 한 가지 예시적인 포유류는 성인, 소아 및 고령자를 포함한 인간이다. 또한 대상체는 개, 고양이 및 말을 포함한 애완 동물일 수 있다. 예시적인 농업용 동물은 소 및 염소를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "치료하다", "치료하는", "치료" 등은 달리 지시되지 않는 한, 이러한 용어가 적용되는 질병, 장애 또는 병태 또는 이러한 질병, 장애 또는 병태의 하나 이상의 (즉, 반드시 전부는 아닌) 증상의 치유, 역전, 약화, 완화, 최소화, 과정 억제, 저해, 중지 및/또는 예방을 지칭하고, 증상 또는 합병증의 발병의 예방, 증상 또는 합병증의 개선, 질병, 병태 또는 장애의 진행의 완화 및/또는 제거를 위해 본 명세서에 기재된 조성물, 약제학적 조성물 또는 투여량 형태 중 임의의 것의 투여를 포함한다. 대안적 실시형태에서, 치료는 치유적이거나 완화적이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "예방하는" 또는 "예방"은 예방할 대상 또는 사건, 예를 들어 질병, 장애 또는 병태의 전체 또는 일부의 예방 또는 생성 또는 발생의 완화 또는 제어, 또는 감소 또는 중지를 의미한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "정제된" 또는 "농축된" 등은 세포 또는 세포 집단이 정상 조직 환경에서 제거되고 정상 조직 환경에 비해 더 높은 농도로 존재함을 나타낸다. 따라서, "정제된" 또는 "농축된" 세포 집단은 망막 전구 세포 외에 세포 유형을 추가로 포함할 수 있고 추가 조직 성분을 포함할 수 있으며, "정제된" 또는 "농축된"이라는 용어는 반드시 전구 세포의 존재만을 나타내는 것은 아니거나, 다른 세포 유형의 존재를 배제하지 않는다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 망막 전구 세포 집단은 적어도 5% 순수, 적어도 10% 순수, 적어도 15% 순수, 적어도 20% 순수, 적어도 25% 순수, 적어도 30% 순수, 적어도 35% 순수, 적어도 40% 순수, 적어도 45% 순수, 적어도 50% 순수, 적어도 55% 순수, 적어도 60% 순수, 적어도 65% 순수, 적어도 70% 순수, 적어도 75% 순수, 적어도 80% 순수, 적어도 85% 순수, 적어도 90% 순수, 적어도 95% 순수, 적어도 96% 순수, 적어도 97% 순수, 적어도 98% 순수, 적어도 99% 순수 또는 5% 내지 99% 순수의 임의의 증분 (예를 들어, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 망막 전구 세포)일 수 있다.
"마커"는 관찰되거나 검출될 수 있는 임의의 분자를 지칭한다. 예를 들어, 마커는 다음에 제한되는 것은 아니나, 핵산, 예컨대 특정 유전자의 전사체, 유전자의 폴리펩타이드 산물, 비유전자 산물 폴리펩타이드, 당단백질, 탄수화물, 당지질, 지질, 지단백질 또는 소분자 (예를 들어, 분자량이 10,000 달톤 미만인 분자)를 포함할 수 있다. 대안적 실시형태에서, 망막 전구 세포는 세포 집단 내의 세포 표면 ("세포 표면 마커"), 세포 집단 내의 세포 내부 (즉, 세포의 핵 또는 세포질)에 발현되고/거나, "유전자" 마커로서 RNA 또는 단백질 수준에서 발현될 수 있는 하나 이상의 마커의 존재를 특징으로할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "발현하다" 및 "발현"은 숙주 세포 내에서 핵산 서열의 전사 및/또는 번역을 지칭한다. 숙주 세포에서 적절한 대상 산물/단백질, 예를 들어 마커의 발현 수준은 세포에 존재하는 해당 mRNA의 양 또는 본 예에서와 같이 선택된 서열에 의해 인코딩되는 적절한 대상 폴리펩타이드/단백질의 양에 기초하여 결정되거나 "스크리닝"될 수 있다. 예를 들어, 선택된 서열로부터 전사된 mRNA는 노던 블롯 혼성화 (Northern blot hybridization), 리보뉴클레아제 RNA 보호, 세포 RNA에 대한 인시투 혼성화 (in situ hybridization), 마이크로어레이 분석 (microarray analysis) 또는 역전사 중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR)에 의해 정량화되거나 검출될 수 있다. 선택된 서열에 의해 인코딩된 단백질은 다양한 항체 기반 방법, 예를 들어, ELISA, 웨스턴 블롯팅, 방사면역분석, 면역침강법, 단백질의 생물학적 활성 분석, 단백질의 면역염색법 (예를 들어, 면역조직화학 및 면역세포화학 포함), 유세포 분석 또는 형광 활성화 세포 분류 ("FACS") 분석 또는 균질 시간 분해 형광 (HTRF) 분석에 의해 검출되거나 정량화될 수 있다.
망막 전구 세포 (RPC)
포유류 망막 전구 세포의 단리, 특성화 및 사용은 WO 2012/158910에 상세하게 설명되어 있으며, 상기 문헌의 내용은 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다.
척추동물 배아 발달에서, 망막과 시신경은 발달하는 뇌의 파생물로서 유래하므로 망막은 중추신경계 (CNS)의 일부로 고려되며 실제로는 뇌 조직이다. 망막은 시냅스로 연결된 여러 층의 뉴런이 있는 층 구조이다. 유리체에서 가장 가까운 곳에서 가장 먼 곳, 즉 머리 앞쪽 바깥 쪽의 가장 가까운 곳에서 머리 안쪽과 뒤쪽으로 향하는 망막 층은 (1) 뮬러 (Muller) 세포 등골저 (footplate)를 포함한 내부 한계 막, (2) 신경절 세포 핵의 축삭을 포함하는 신경 섬유층, (3) 신경절 세포의 핵을 포함하고 축삭이 시신경 섬유가 되는 신경절 세포층, (4) 양극성 세포 축삭 돌기와 신경절 및 무축삭 세포의 수상 돌기 사이의 시냅스를 포함하는 내부 망상 층, (5) 양극성 세포의 핵과 주변 세포체 (주핵체)를 포함하는 내부 핵층, (6) 각각 간상체 소구와 원추체 뿌리로 끝나는 원추체 및 간상체의 돌출부를 포함하는 외부 망상 층, (7) 간상체와 원추체의 세포체를 포함하는 외부 핵층, (8) 광수용체의 내부 절편 부분을 세포 핵으로부터 분리하는 외부 한계 막, (9) 광수용체 층, 및 (10) 입방체 세포의 단일 층인 망막 색소 상피 (RPE)를 포함한다. 빛에 직접적으로 감응성인 뉴런은 주로 간상체와 원추체의 두 가지 유형으로 구성된 광수용체 세포이다. 간상체는 주로 희미한 빛에서 기능하고 흑백 시력을 제공하며 원추체는 주간 시력과 색상 인식을 지원한다. 세 번째 유형의 광수용체인 감광성 신경절 세포는 밝은 일광에 대한 반사 반응에 중요하다.
공여체 태아 망막 세포 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 망막 전구 세포)는 특히 숙주 원추체를 포함하는 숙주 망막에 영양 효과를 제공할 수 있다. 이 영양 효과는 신경 보호적일뿐만 아니라 잔여 숙주 망막 세포에 대한 빠른 재생 효과도 있으며, 이는 개선된 시각 기능에 의해 결정되는 바와 같다. 공여체 세포는 망막으로 혼입될 수 있으며 세포 분화를 통해 광수용체 (제한된 수일 수 있음)를 대체할 수 있다. 전반적인 효과는 그렇지 않으면 필연적으로 완전히 치료 불가능하여, 환자가 완전히 실명하게 될 망막에서 임상적으로 유의한 정도의 시각 기능을 빠르고 지속적으로 복원 및 보존한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 임의의 조성물 및 방법을 사용하여 포유류, 예를 들어 인간의 망막에서 임상적으로 유의한 시각 기능을 빠르고 지속적으로 복원 및 보존할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 조성물 및 방법은 발병 망막에 임상적으로 유의한 영양 효과를 제공하거나 황반 및/또는 암순응 시각 기능에 재생 효과를 제공할 수 있다.
본 명세서에 기재된 조성물 및 집단의 세포는 단리된 단일 세포 유형이 아니라 밀접하게 결합된 세포 집단이다.
이들 세포는 그 자체로 줄기세포는 아니지만 (진정한 줄기세포에 대한 정의를 충족하지 않기 때문임), 미성숙 및/또는 가소성이다. 그러나 이러한 세포는 (추가 조작이 없는 경우) 생식 층을 생성할 수 없고/거나 (추가 조작이 없는 경우) 세 (3)개의 모든 생식 층을 생성할 수 없다.
추가로, 이들 세포는 망막 조직 또는 세포를 형성하도록 미리 특정된다. 따라서 이러한 세포는 전구 마커 및 망막 마커를 발현할 수 있다.
망막 전구 세포는 전능성이 아니며 다능성인 것처럼 보일 수 있다. 그러나 세포가 전능성 상태에서 배양되지 않았기 때문에 더 안전한다. 일부 실시형태에서, 포유류 태아 망막 세포 또는 RPC 세포는 전능성 세포주로부터 인위적으로 유도될 수 있지만, 이는 선택적으로 잔여 전능성 세포 유형의 집단을 포함하지 않는다.
본 명세서에 기재된 세포는 신경 전구 세포 및/또는 신경 줄기세포 (NSC)와 구별될 수 있는 망막 전구 세포 (RPC)이다. 구체적으로, 이러한 포유류 태아 망막 또는 RPC 세포는 다능성이지만 NSC와 동등하지는 않다. 예를 들어, 포유류의 태아 망막 또는 RPC 세포는 뇌가 아니라 망막으로부터 유래된다. 또한, 포유류의 태아 망막 또는 RPC 세포는 광수용체를 생성하며, 뇌 유래 전구 세포는 광수용체를 생성하는데 부족하다. 마찬가지로, NSC와 달리 포유류 태아 망막 또는 RPC 세포는 다능성이지만 (추가 조작이 없는 경우) 희돌기교세포를 생성하지 못한다. 예를 들어, 포유류의 태아 망막 세포 또는 RPC 세포는 광수용체를 포함하는 망막 세포를 생성(로 분화)하지만 희소돌기 세포는 생성하지 않는다.
포유류 태아 망막 또는 RPC 세포는 섬모 가장자리, 섬모 상피 또는 RPE가 아닌 포유류 태아 신경 망막으로부터 획득된다 (또는 획득 가능함). 추가로, 포유류 태아 망막 또는 RPC 세포는 분화된 뮬러 아교의 후세대가 아니고, 유사 분열 후 전구체 그 자체가 아니며, 줄기세포 그 자체가 아니고/거나 단리된 단일 세포 유형 그 자체가 아니다.
포유류 태아 망막 세포 또는 RPC 세포는 초기 배아 (예를 들어, 배반포)에 존재하지 않는다. 추가로, 포유류 태아 망막 세포 또는 RPC 세포는 정상적인 성숙한 포유류 (예를 들어, 인간)에서 임의의 경우 유용하게 다량 존재하지 않는다.
또한, 망막 전구 세포는 유기체의 수명 동안 지속되지 않는다. 그러나, 이러한 포유류 태아 망막 세포 또는 RPC 세포는 발달 (태아) 포유류 (예를 들어, 인간) 망막에서 본래 다량 존재한다.
포유류 태아 망막 세포 또는 RPC는 증식 조건 하에서 성장할 때 대부분 유사분열이지만, 유사분열 후 세포의 소수 혼합물은 또한 본 명세서에 기재된 임의의 조성물 및 집단에 포함될 수 있다.
포유류 태아 망막 세포 또는 RPC 세포는 관련이 없는 포유류, 예를 들어 인간에서 안구 동종 이식편으로서 면역적으로 내성이 있다. 따라서 RPC는 안구에 배치되었을 때 면역원성이 낮다. 비 제한적인 예로서, 이러한 포유류 태아 망막 세포 또는 RPC 세포는 포유류, 또는 인간 시력 또는 망막 질병 치료 및/또는 예방 요법을 위해 유리체강 또는 망막 하 공간에 이식될 수 있다.
대안적 실시형태에서, 포유류 태아 망막 세포 또는 RPC 세포는 종양 형성 또는 다른 부적절한 세포 성장의 임의의 위험을 갖지 않는다 (또는 실질적인 위험이 없음).
포유류 태아 망막 세포 또는 RPC 세포는 구체 또는 부착성 단일 층으로, 또는 구체 및 이후 단일 층으로, 및/또는 구체 및 단일 층의 조합으로 배양될 수 있다. 그러나, 구체는 필요하지 않으며, 일부 실시형태에서, 세포는 구체가 아닌 분리된 세포로서, 또는 분리된 세포와 구체의 혼합물로서 이식된다. 포유류 태아 망막 세포 또는 RPC 세포는 이식 세포를 포함하고, 이는 유리체에서 합쳐지고 선택적으로 구체가 될 수 있다.
대안적 실시형태에서, 망막 전구 세포 및 이를 포함하는 세포 집단은 불멸화되지 않고 불멸화가 가능하거나 강제로 불멸화될 수 없다. 세포가 무한정 증식하지는 않지만, 본 명세서에 기재된 예시적인 세포 배양 방법은 증식 속도 및 기간을 개선할 수 있고/거나 소정의 조직 제공에 대해 공여체 세포 수율을 상당히 개선할 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이 "불멸" 세포주는 무기한 분열할 수 있는 세포주이며, "비불멸" 세포주는 제한된 수의 계대배양 동안 분열할 수 있다. 예를 들어, 비불멸 망막 전구 세포는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 이상의 계대배양을 통해 분열할 수 있다.
RPC는 비유전자 변형된 세포일 수 있거나, 당업계에 공지된 임의의 방법(들)을 사용하여 유전자 변형될 수 있다 (예를 들어, 안정적으로 또는 일시적으로 또는 유도적으로 형질전환됨). 예를 들어, 망막 전구 세포는 하나 이상의 이종 또는 외인성 대상 핵산 서열을 발현하도록 유전자 변형될 수 있다. 핵산 서열은 "외인성"일 수 있는데, 이는 벡터가 도입되는 세포에 대해 외래의 것이거나 서열이 세포의 서열과 상동성이지만 서열이 본래 존재하지 않는 숙주 세포 핵산 내 위치에 존재함을 의미한다. 핵산 서열은 플라스미드, 앰플리콘, cDNA, mRNA, 안티센스 RNA, siRNA를 포함하지만 이러한 예에 제한되지는 않는다. 용어 "유전자"는 기능성 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드 인코딩 핵산 단위를 지칭한다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 이 기능적 용어는 게놈 서열, cDNA 서열, 및 단백질, 폴리펩타이드, 도메인, 펩타이드, 융합 단백질 및 돌연변이를 발현하거나 발현하도록 조작될 수 있는 조작된 더 작은 유전자 절편을 포함한다.
당업계에 공지된 임의의 방법론이 세포를 유전자 변이시키는데 사용될 수 있다. 한 가지 예시적인 방법은 재조합 바이러스 벡터를 사용하여 유전자를 조직의 세포에 삽입하는 것이다. 당업계에 공지된 바와 같이 바이러스 벡터, 플라스미드 벡터, 선형 DNA 등과 같은 다수의 상이한 벡터 중 임의의 하나를 사용하여 치료제를 인코딩하는 외인성 핵산 단편을 표적 세포 및/또는 조직에 도입시킬 수 있다. 이러한 벡터는 예를 들어 감염, 형질도입, 형질감염, 칼슘-포스페이트 매개 형질감염, DEAE-덱스트란 매개 형질감염, 전기천공, 리포솜 매개 형질감염, 생물학적 유전자 전달, 융합성 음이온성 리포솜을 사용한 리포솜 유전자 전달 (이는 양이온성 리포솜의 사용에 대한 대안임), 직접 주입, 수용체 매개 흡수, 자기화, 초음파 및당업계에 공지된 기타의 것 중 임의의 것을 사용하여 삽입될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "벡터"는 핵산 서열이 복제될 수 있는 세포로의 도입을 위해 삽입될 수 있는 전달체 핵산 분자를 지칭한다. 벡터에는 플라스미드, 코스미드, 바이러스 (박테리오파지, 동물 바이러스 및 식물 바이러스) 및 인공 염색체 (예를 들어, YAC)가 포함된다. 당업자는 문헌[Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y.; Ausubel et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc. & Wiley-Intersciences]에 설명된 표준 재조합 기술을 통해 벡터를 작제할 수 있는 장비를 잘 갖추고 있을 것이다. 변형된 폴리펩타이드를 인코딩하는 것 외에도 벡터는 태그 또는 표적화 분자와 같은 변형되지 않은 폴리펩타이드 서열을 인코딩할 수 있다. 이러한 융합 단백질을 인코딩하는 유용한 벡터에는 추후 정제 및 분리 또는 절단을 위해 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (GST) 가용성 융합 단백질을 생성하는데 사용하기 위한 pIN 벡터, 히스티딘 가닥을 인코딩하는 벡터 및 pGEX 벡터가 포함된다.
벡터는 주로 "작동 가능하게 연결된" 유전자 또는 하나 이상의 제어 서열의 제어하에 있는 유전자와 같은 이종성 핵산 분자를 세포에 도입하기 위해 설계될 수 있다. "프로모터"는 RNA 중합효소 II 및 다른 전사 활성화제 단백질에 대한 개시 부위 주위에 집합된 하나 이상의 전사 조절 모듈을 지칭한다. 임의의 프로모터/인핸서 조합 (진핵 프로모터 데이터베이스 EPDB에 따름)은 대상 핵산 분자의 발현을 유도하는데 사용될 수도 있다 (즉, 항시적, 유도성, 억제성, 조직 특이적). 또한, 벡터는 시험관내 또는 생체외 조작을 용이하게하기 위해 선택 가능한 마커를 포함할 수 있다. 벡터는 또한 인간 성장 호르몬 (hGH) 유전자, 소 성장 호르몬 (BGH) 유전자 또는 SV40으로부터 획득될 수 있는 폴리아데닐화 신호를 포함할 수 있다. 또한 벡터는 내부 리보솜 결합 부위 (IRES) 요소를 포함할 수 있으며 다중 유전자 또는 폴리시스트론 메시지를 생성하는데 사용된다. IRES 요소는 5-메틸화 캡 의존 번역의 리보솜 스캐닝 모델을 우회하고 내부 부위에서 번역을 개시할 수 있다 (문헌[Pelletier, J. and Sonenberg, N. (1988) Nature 334(6180): 320-325]). IRES 요소는 이종 오픈 리딩 프레임에 연결될 수 있다. 다수의 오픈 리딩 프레임을 함께 전사할 수 있으며, 각 프레임은 IRES로 분리되어 폴리시스트로닉 메시지를 생성한다. IRES 요소로 인해 각 오픈 리딩 프레임은 효율적인 번역을 위해 리보솜에 접근할 수 있다. 단일 프로모터/인핸서를 사용하여 다수의 유전자를 효율적으로 발현하여 단일 메시지를 전사할 수 있다.
일부 실시형태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 당업계에 공지된 바이러스 벡터에는 제한 없이 아데노바이러스 벡터 (adenoviral vector), 레트로바이러스 벡터 (retroviral vector), 우두 바이러스 벡터 (vaccinia viral vector), 아데노 연관 바이러스 (AAV) 벡터, 폴리오마 바이러스 벡터 (polyoma viral vector), 알파바이러스 벡터, 랍도바이러스 벡터 (rhabdoviral vector), 렌티바이러스 벡터 (lentiviral vector), 엡스타인-바르 바이러스 벡터 (Epstein-Barr viral vector), 피코나비바이러스 벡터 (picornaviral vector) 또는 헤르페스바이러스 벡터 (herpesviral vector)가 포함된다. 바이러스 벡터가 AAV 벡터인 실시형태에서, 당업계에 공지된 임의의 혈청형의 AAV 벡터가 사용될 수 있다. 예를 들어, AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV8 또는 AAV9일 수 있다. AAV는 다른 바이러스 혈청형으로부터 캡시드 단백질과 바이러스 게놈을 혼합하여 위형화 (pseudotyping)될 수 있다 (예를 들어, 하나의 AAV 혈청형으로부터의 역위 말단 반복 및 다른 혈청형으로부터의 캡시드).
다른 실시형태에서, 핵산 서열은 리포솜 또는 지질 제형에 포획될 수 있다. 리포솜은 인지질 이중층 막과 내부 수성 매질을 특징으로 하는 소포 구조이다. 다중층 리포솜은 수성 매질로 분리된 다수의 지질층을 가지고 있다. 이는 인지질이 과량의 수용액에 현탁될 때 자발적으로 형성된다. 지질 성분은 폐쇄 구조의 형성 전에 자가 재배열을 거쳐 지질 이중층 사이에 물과 용해된 용질을 포획한다 (문헌[Ghosh, P. C. and Bachhawat, B. K. (1991) Targeted Diagn. Ther. 4: 87-103]). 상업적으로 이용 가능한 리포솜 또는 지질 제형의 한 가지 예는 Lipofectamine (Invitrogen)이다. 다른 산물로는 FuGENE (Promega), PromoFectin (PromoKine), Affectene (Qiagen), Polyfect (Qiagen), Superfect (Qiagen) 및 TransMessenger (Qiagen)가 포함된다.
1차 망막 세포의 단리
본 명세서에서는 샘플로부터 태아 망막 세포, 예를 들어 인간 1차 망막 세포의 분리된 현탁액을 단리, 배양 및/또는 사용하는 방법을 제공한다. 다양한 실시형태에서, 태아 망막 세포의 현탁액은 조직 또는 스캐폴드를 포함하지 않는다. 또한, 공여체 조직으로부터 수확되고, 배양물에서 성장하고, 대상체 또는 환자에게 투여하기 위해 제형화된 그러한 세포를 포함하는 망막 전구 세포 및 조성물의 단리 및 특성화를 위한 방법이 제공된다.
인간 샘플로부터 1차 망막 세포를 단리하기 위해 본 명세서에 기재된 방법은 다수의 1차 망막 세포를 분해하기 위해 프로테아제를 사용할 필요가 없으며, 이는 프로테아제, 또는 기계적 분리와 프로테아제 분해의 조합을 사용하는 방법에 비해 더 많은 수의 생존가능한 1차 망막 세포를 생성한다.
일 양상에서, 본 개시내용은 인간 샘플로부터 1차 망막 세포를 단리하는 방법으로서, (a) 인간 샘플로부터 다수의 1차 망막 세포를 포함하는 망막 샘플을 단리하는 단계로서, (b) 단계 (a)에서 단리된 망막 샘플 중 다수의 1차 망막 세포를 기계적으로 분리함으로써, 분리된 세포 및 세포 덩어리의 현탁액을 생성하는 단계, 및 (c) 망막 샘플로부터 1차 망막 세포의 생존율, 양, 형태 또는 이의 조합을 결정하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 인간 샘플은 인간 공여체로부터 단리된다. 공여체는 생후 17 내지 약 20주 연령일 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 1차 망막 세포를 단리하는 방법은 적어도 30 x 106개의 생존가능한 1차 망막 세포를 생성하고, 이어서 이를 배양하여 망막 전구 세포를 생성한다.
일부 실시형태에서, 샘플은 포유류, 예를 들어 마우스, 랫트, 토끼, 고양이, 개, 원숭이, 비인간 영장류, 또는 인간으로부터 단리된 안구 또는 한 쌍의 안구이다. 일부 실시형태에서, 샘플은 농업용 동물, 예를 들어 말, 소 또는 양으로부터 유래된다.
세포 집단을 단리 및/또는 배양하는데 사용되는 샘플은 건강한 개체 (즉, 망막 질병을 앓지 않는 개체), 발병 개체로부터 수확할 수 있으며, 새로운 망막 세포 집단뿐만 아니라 동결 망막 세포 집단을 또한 포함할 수 있다. 공급원에는 제한 없이 배아, 태아, 소아 또는 성인 조직으로부터 획득된 안구 전체, 또는 망막 조직 또는 기타 공급원이 포함된다. 본 명세서에 기재된 방법은 다른 망막 전구 세포 특이적 마커에 대한 양성 선택에 의한 세포 단리를 위한 추가 농축 또는 정제 절차 또는 단계를 포함할 수 있다. 망막 전구 세포 및 세포 집단은 임의의 포유류 종 또는 대상체, 예를 들어, 인간, 영장류, 말, 소, 돼지, 개, 고양이, 페럿 (ferret), 토끼, 설치류, 예를 들어, 마우스, 랫트 햄스터 등으로부터 획득되거나 수확될 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포는 망막이 형성되지만, 광수용체 외부 절편이 망막 전체에 걸쳐 완전히 형성되기 전과 망막 혈관화가 완료되거나 실질적으로 완료되기 전의 단계에서 포유류 태아 망막으로부터 수확된다. 이 단계는 통상적으로 인간 태아에서 약 12주 내지 약 28주 (예를 들어, 약 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 또는 28주)의 태아 재태 기간이다. 일부 실시형태에서, 이 단계는 17주 내지 약 20주 재태 기간일 수 있다. 고양이 또는 돼지 망막 전구 세포와 같은 더 큰 포유류의 비인간 세포의 경우, 이 단계는 일반적으로 약 3주 내지 약 11주 (예를 들어, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11주)의 태아 재태 기간이다. 예를 들어, 문헌[Anand-Apte, B. and Hollyfield, J. G. "Developmental Anatomy of the Retinal and Choroidal Vasculature." In The Retina and Its Disorders, Besharse, J. and Bok, D., Academic Press, (2001)]을 참조한다. 그러나 세포는 또한 출생 후 또는 신생아 포유류 조직으로부터 수확할 수 있다.
일부 실시형태에서, 샘플은 인간 샘플이다. 일부 실시형태에서, 인간 샘플은 인간 공여체로부터의 하나 또는 한 쌍의 안구이다. 일부 실시형태에서, 인간 공여체는 약 12주 내지 약 28주 재태 기간이다. 일부 실시형태에서, 인간 공여체는 약 17주 내지 약 20주 재태 기간이다. 일부 실시형태에서, 더 좁은 공여체 연령 범위의 사용은 제조 동안 망막 전구 세포의 최종 수율의 일관성을 개선시킨다.
일부 실시형태에서, 샘플은 하나 또는 한 쌍의 인간 태아 안구이다. 일부 실시형태에서, 안구는 정상 형태를 갖는다. 정상 형태는 온전한 구체(들), 투명한 각막, 정상 모양, 또는 이러한 특징의 임의의 조합과 같은 특징에 대한 시각적 검사로 결정할 수 있다.
일부 실시형태에서, 인간 망막 조직은 빙냉 수송되고 수송 기간 내에서 전달될 수 있다. 수송 기간은 예를 들어 약 1 내지 8℃ 또는 약 4℃의 온도에서 빙냉 또는 냉장고에 일정 기간 동안 목적지 또는 출발 지점에 세포를 저장하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 수송 기간은 약 1 내지 40시간, 약 7 내지 40시간, 약 1 내지 34시간, 약 7 내지 34시간, 약 1 내지 26시간, 약 4 내지 26시간, 약 7 내지 26시간, 약 8 내지 26시간, 약 4 내지 18시간, 약 7 내지 18시간, 또는 약 8 내지 18시간이다. 일부 실시형태에서, 수송 기간은 약 1시간, 약 2시간, 약 2.5시간, 약 3시간, 약 3.5시간, 약 4시간, 약 4.5시간, 약 5시간, 약 5.5시간, 약 6시간, 약 6.5시간, 약 7시간, 약 7.5시간, 약 8시간, 약 8.5시간, 약 9시간, 약 10시간, 약 11시간, 약 12시간, 약 13,시간, 약 14시간, 약 15시간, 약 16시간, 약 17시간, 약 18시간, 약 19시간, 약 20시간, 약 21시간, 약 22시간, 약 23시간, 약 24시간, 약 25시간 또는 약 26시간이다. 비제한적인 예로서, 수송 기간은 약 1 내지 약 26 (예를 들어, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 19.5, 20, 20.5, 21, 21.5, 22, 22.5, 23, 23.5, 24, 24.5, 25, 25.5, 또는 26), 예를 들어 약 4.5 내지 약 21.5시간 (예를 들어, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 19.5, 20, 20.5, 21, 또는 21.5) 또는 약 7 내지 약 26시간 (예를 들어, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 19.5, 20, 20.5, 21, 21.5, 22, 22.5, 23, 23.5, 24, 24.5, 25, 25.5, 또는 26시간)일 수 있다.
일부 실시형태에서, 샘플은 공여체로부터 수확한 후 포유류 세포 배양 배지에 배치된다. 샘플 수송 중에 사용할 수 있는 포유류 세포 배양 배지에는 기초 세포 배양 배지와 복합 세포 배양 배지가 모두 포함된다. 수송 중에 사용되는 기초 세포 배양 배지의 비 제한적인 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, 특히, 배지 199, CMRL 1415, CMRL 1969, CMRL 1066, NCTC 135, MB 75261, MAB 8713, DM 145, Williams' G, Neuman & Tytell, Higuchi, MCDB 301, MCDB 202, MCDB 501, MCDB 401, MCDB 411, MDBC 153, 및 Ultraculture를 포함하여 최소 필수 배지 이글, ADC 내지 1, LPM (소 혈청 알부민 무함유), F10 (Ham), F12 (Ham), DCCM1, DCCM2, RPMI 1640, BGJ 배지 (Fitton-Jackson 변형 존재 및 부재), 기초 배지 이글 (BME--Earle 염 베이스 첨가), 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM--무혈청), 고급 DMEM/F-12, Yamane, IMEM-20, Glasgow 변형 이글 배지 (GMEM), Leibovitz L-15 배지, McCoy's 5A 배지, 배지 M199 (M199E--Earle 염 베이스 포함), 배지 M199 (M199H--Hank 염 베이스 포함), 최소 필수 배지 이글 (MEM-E--Earle 염 베이스 포함), 최소 필수 배지 이글 (MEM-H--Hank 염 베이스 포함) 및 최소 필수 배지 이글 (MEM-NAA 비필수 아미노산 포함)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 수송에 사용되는 세포 배양 배지는 RPMI-1640을 포함한다. 일부 실시형태에서, 수송에 사용되는 세포 배양 배지는 L-글루타민이 보충된 RPMI 1640을 포함한다. 일부 실시형태에서, 수송에 사용되는 세포 배양 배지는 고급 DMEM/F-12를 포함한다. 일부 실시형태에서, 수송에 사용되는 세포 배양 배지는 완전 배지를 포함한다. 예를 들어, 수송에 사용되는 세포 배양 배지는 N-2 보충제, B27 이종 무함유, B27, Stempro, 상피 성장 인자 (EGF), 염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF), 또는 GlutaMAX I 중 하나 이상이 보충된 설명서 배지를 포함한다. 일부 실시형태에서, 수송에 사용되는 세포 배양 배지는 하나 이상의 항생제를 포함한다. 예를 들어, 수송에 사용되는 세포 배양 배지는 약 30 내지 100 마이크로그램 (μg)/밀리리터 (mL), 또는 약 0.5 내지 약 50 μg/mL의 젠타마이신을 포함한다. 일부 실시형태에서, 수송에 사용되는 세포 배양 배지는 약 50 μg/mL의 젠타마이신을 포함한다.
일부 실시형태에서, 인간 샘플은 수송 세포 배양 배지에 배치 직후 약 1 내지 8℃에 저장된다. 일부 실시형태에서, 인간 샘플은 수송 세포 배양 배지에 배치 직후 약 4℃에 저장된다. 예를 들어, 인간 샘플은 수송 세포 배양 배지에 배치 직후 빙냉 저장된다.
본 개시내용은 인간 샘플로부터 다수의 1차 망막 세포를 포함하는 망막 샘플 예를 들어 약 12 내지 28주 재태 기간의 인간 공여체로부터의 하나 또는 한 쌍의 안구를 포함하는 샘플을 단리하는 방법을 제공한다.
망막 전구 세포는 조직 샘플 처리 후 또는 그와 동시에 다른 조직 성분으로부터 정제될 수 있다. 예를 들어, 세포 성장에 적합한 조건 하에서 세포가 배양 접시에 부착될 수 있도록 충분한 시간 동안 조직 샘플을 배양한 후 다른 세포 및 조직 성분으로부터 전구 세포를 정제할 수 있다. 특정 실시형태에서, 세포의 정제는 배양 동안 조직 샘플로부터 이동하고 배양 배지에 존재하거나 피브로넥틴 또는 다른 기질, 또는 영양 세포층에 느슨하게 부착되는 세포를 획득하는 단계를 포함한다. 이러한 세포는 배지를 제거하고 원심분리하여 그 안의 세포를 펠릿화하고 배양 접시에 남아있는 세포를 인산염 완충 식염수 (PBS) 또는 Hanks 균형 염 용액과 같은 용액으로 세척하여 부착 세포층으로서 느슨하게 부착된 세포를 제거하는 등의 통상적인 방법으로 획득할 수 있다. 그 후 이 세척 용액은 또한 세포를 획득하기 위해 원심분리될 수 있다. 망막 전구 세포 및 세포 집단의 정제는 지질과 같은 잔여 조직 물질을 포함하는 특정 불용성 조직 성분으로부터 세포를 분리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 세포는 예를 들어 밀도 구배, 원심분리, 유세포 분석 또는 자기 세포 분리 (MACS)에 의한 분류, 및 여과 또는 이의 조합을 포함하는 당업계에 공지되고 이용 가능한 임의의 수단에 의해 다른 조직 성분으로부터 분리될 수 있다. 세포를 정제하는 특정 방법의 예는 공지되어 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제 6,777,231호에 기재되어있다. 또한 음성 분리 방법을 사용하여 하나 이상의 특정 유형의 세포를 제거할 수 있다.
조직은 또한 처리되거나 "분리"될 수 있다. 예를 들어, 하나 또는 한 쌍의 안구와 같은 조직을 처리하거나 절제하여 망막을 단리하고 망막을 분리하여 다수의 1차 망막 세포 및 세포 덩어리를 생성할 수 있다. 이들 1차 망막 세포 및 세포 덩어리는 다수의 망막 전구 세포를 생성하기 위해 본 명세서에 기재된 바와 같이 배양된다.
따라서, 본 개시내용은 인간 샘플로부터 다수의 1차 망막 세포를 포함하는 망막 샘플을 단리하는 방법을 제공한다. 인간 샘플은, 예를 들어, 약 12 및 28주 재태 기간의 인간 공여체의 하나 또는 한 쌍의 안구를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 방법은 (i) 수송 배양 배지로부터 하나 또는 한 쌍의 인간 안구를 제거하는 단계, (ii) 항생제가 보충된 약 1 내지 8℃ 인산염 완충 식염수 (PBS)로 하나 또는 한 쌍의 인간 안구를 세정하는 단계, (iii) 하나 또는 한 쌍의 인간 안구로부터 시신경 및 중간엽 조직을 제거하는 단계, (iv) 항생제가 보충된 약 1 내지 8℃ PBS로 하나 또는 한 쌍의 인간 안구를 세척하는 단계, (v) 바늘을 사용하여 윤부에서 하나 또는 한 쌍의 인간 안구 각각의 구체를 천공하는 단계, (vi) 예를 들어 한 쌍의 마이크로가위를 사용하여, 하나 또는 한 쌍의 인간 안구의 윤부를 따라 원주 방향으로 절단하는 단계, (vii) 하나 또는 한 쌍의 인간 안구로부터 수정체, 각막 및 관련 유리체를 제거하는 단계, (viii) 망막(들)을 망막 색소 상피 (RPE) 층으로부터 분리하여 단리된 망막 또는 단리된 망막 쌍을 생성하는 단계, 및 (ix) 약 1 내지 8℃ 배양 배지 또는 PBS에 단리된 망막 또는 단리된 망막 쌍을 배치하는 단계로서, 배양 배지 또는 PBS에 항생제가 보충된 단계를 포함한다. 다양한 단계에서 샘플 세정 (또는 세척)을 1 내지 5회 이상 반복할 수 있다. 예를 들어 샘플을 1, 2, 3, 4 또는 5회 세정할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 의해 생성된 망막 샘플은 안구외 세포가 부재하거나 실질적으로 부재한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 단리된 망막 샘플은 분리되어 단리된 망막 세포 및 망막 세포 덩어리를 생성하고 망막 전구 세포를 생성하기 위해 배양한다. 일부 실시형태에서, 망막 샘플의 분리는 기계적이다. 일부 실시형태에서, 분리는 (i) 망막 샘플을 튜브로 옮기는 단계, (ii) 망막 샘플을 기계적으로 분리하여 분리된 다수의 1차 망막 세포를 생성하는 단계, (iii) 원심분리를 통해 분리된 다수의 1차 망막 세포를 펠릿화하는 단계, 및 (iv) 상청액을 제거하는 단계를 포함한다. 기계적 분리는 멸균 피펫을 사용한 분쇄를 포함하나 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 달성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 분쇄는 다회, 예를 들어 2 내지 50회, 2 내지 10회, 또는 2 내지 8회 또는 망막 샘플이 적절한 크기의 세포 덩어리로 분해될 때까지 수행된다. 일부 실시형태에서, 분쇄는 4 내지 8회 수행된다.
일부 실시형태에서, 망막 샘플의 분리는 프로테아제에 의한 분해를 포함한다. 일부 실시형태에서, 망막 샘플의 분리는 프로테아제에 의한 분해 및 기계적 분리를 포함한다. 일부 실시형태에서, 프로테아제는 트립신이다. 적합한 트립신 조성물은 당업자에게 공지될 것이며, 다음에 제한되는 것은 아니나 TrypLE (Thermo Fisher Scientific), TrypLE Select (Invitrogen) 및 TrypLE Express (Invitrogen)를 포함한다. 예를 들어, 단리된 망막은 희석되지 않은 TrypLE Express에서 피펫팅할 수 있다. 트립신과 같은 활성 또는 프로테아제는 과량의 프로테아제 무함유 배지를 첨가하여 중화시켜 반응을 중지시킬 수 있다. 예를 들어, 분리된 망막을 포함하는 혼합물에 5x, 10x, 15x 또는 20x 과량의 배양 배지를 첨가할 수 있다.
분리는 물리적 분리 및/또는 다른 조직 성분으로부터 세포의 방출을 촉진하는 효소 제조물에의 노출에 의해 세포 및/또는 세포 덩어리의 "분리된 현탁액"을 생성함으로써 수행될 수 있다. 이러한 효소의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, 매트릭스 메탈로프로테이나제, 클로스트리파인, 파파인, 트립신, 트립신-유사, 펩신, 펩신-유사, 중성 프로테아제-유형 및 콜라게나제를 포함한다. 적합한 단백질 분해 효소는 미국 특허 제 5,079,160호; 제 6,589,728호; 제 5,422,261호; 제 5,424,208호; 및 제 5,322,790호에 기재되어 있다. 예를 들어, 효소 제조물은 트립신을 단독으로 또는 하나 이상의 추가 효소와 조합하여 포함할 수 있다. 예를 들어, 다지기, 피펫팅, 자르기, 균질화, 분쇄, 동결-해동, 삼투 충격에 의한 물리적 분리와 함께 효소 분리를 수행하여 부적절한 세포 또는 결합 조직을 제거하고 궁극적으로 단일 세포 배양을 생성하거나 크기별, 즉 "소형", "중형" 및 "대형"으로 규정될 수 있는 세포 덩어리를 포함할 수 있다. 세포 덩어리 크기는 주관적이며 본 명세서에 개시된 발명의 실행에 따라 달라질 수 있다. 본 명세서에 기재된 단리된 1차 망막 세포는 단리된 세포 및 세포 덩어리를 포함한다. 단리된 1차 망막 세포의 덩어리는 약 2 내지 5000개의 세포, 2 내지 4000개의 세포, 2 내지 3000개의 세포, 2 내지 2000개의 세포, 2 내지 1000개의 세포, 2 내지 100개의 세포, 50 내지 5000개의 세포, 50 내지 4000개의 세포, 50 내지 3000개의 세포, 50 내지 2000개의 세포, 50 내지 1000개의 세포, 50 내지 100개의 세포, 500 내지 5000개의 세포, 또는 500 내지 1000개의 세포일 수 있다
단리된 다수의 1차 망막 세포를 포함하는 조성물은 세포를 농축하거나, 세포를 세척 또는 세정하거나, 세포 배양 배지를 교체하기 위해 원심분리를 통해 펠릿화될 수 있다. 예를 들어, 분리된 다수의 1차 망막 세포는 선택적으로 항생제로 보충된 배양 배지 또는 PBS로 세척될 수 있다. 분리된 다수의 1차 망막 세포는 약 100xg (원심력) 내지 약 1000xg, 약 100xg 내지 약 500xg, 약 140xg 내지 약 300xg의 원심분리를 통해 펠릿화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 분리된 다수의 1차 망막 세포는 약 140xg에서 원심분리를 통해 펠릿화된다. 일부 실시형태에서, 분리된 다수의 1차 망막 세포는 약 300xg에서 원심분리를 통해 펠릿화된다. 원심분리는 약 1분 내지 30분 동안 이루어질 수 있다. 예를 들어, 분리된 다수의 1차 망막 세포를 포함하는 조성물은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 또는 30분 동안 원심분리될 수 있다. 원심분리는 세포 생존율을 유지하는데 필요한 임의의 온도에서 이루어질 수 있다. 일부 실시형태에서, 단리된 다수의 1차 망막 세포를 포함하는 조성물은 약 0℃ 내지 50℃에서 원심분리된다. 일부 실시형태에서, 단리된 다수의 1차 망막 세포를 포함하는 조성물은 약 4℃에서 원심분리된다. 일부 실시형태에서, 단리된 다수의 1차 망막 세포를 포함하는 조성물은 약 18 내지 24℃에서 원심분리된다. 일부 실시형태에서, 단리된 다수의 1차 망막 세포를 포함하는 조성물은 약 37℃에서 원심분리된다.
본 명세서에 기재된 방법의 일부 실시형태에서, 본 방법은 (i) 약 1 내지 8℃의 항생제-보충 배양 배지에서 분리되어 펠릿화된 1차 망막 세포를 재현탁시키는 단계, (ii) 다수의 분리된 망막 세포를 배양 배지를 포함하는 하나 이상의 코팅된 세포 배양 플라스크 또는 플레이트에 시딩하는 단계로서, 선택적으로 세포 배양 배지에 항생제가 보충된 단계, (iii) 다수의 분리된 망막 세포를 약 10 내지 50℃에서 인큐베이션하는 단계로서, 선택적으로 인큐베이션은 약 37℃에서 이루어지는 단계, 및 (iv) 1차 망막 세포 및 망막 세포 덩어리의 양 및 생존율을 결정하는 단계를 포함한다. 플라스크 또는 플레이트는 적절한 밀도로 시딩될 수 있다. 예를 들어, 플라스크 또는 플레이트에는 약 1 내지 약 1,000,000,000개의 세포가 시딩될 수 있다. 대안적으로, 플라스크 또는 플레이트는 약 10,000 내지 약 5 x 106 세포/제곱 센티미터 (cm2)로 시딩될 수 있다. 추가의 대안으로서, 플라스크 또는 플레이트는 약 0.50 x 106 내지 약 2.5 x 106 세포/제곱 센티미터 (cm2)에서 시딩될 수 있다. 추가의 대안으로서, 플라스크 또는 플레이트는 약 0.82 x 106 내지 약 2.06 x 106 세포/제곱 센티미터 (cm2)에서 시딩될 수 있다. 추가의 대안으로서, 플라스크 또는 플레이트는 약 0.1 x 106 내지 약 20 x 106 세포/cm2, 약 1 x 106 내지 약 20 x 106 세포/cm2, 약 2 x 106 내지 약 20 x 106 세포/cm2, 약 3 x 106 내지 약 20 x 106 세포/cm2, 약 4 x 106 내지 약 20 x 106 세포/cm2, 약 5 x 106 내지 약 20 x 106 세포/cm2, 약 6 x 106 내지 약 20 x 106 세포/cm2, 약 7 x 106 내지 약 20 x 106 세포/cm2, 약 8 x 106 내지 약 20 x 106 세포/cm2, 약 9 x 106 내지 약 20 x 106 세포/cm2, 약 10 x 106 내지 약 20 x 106 세포/cm2, 약 0.2 x 106 내지 약 10 x 106 세포/cm2, 약 0.2 x 106 내지 약 5 x 106 세포/cm2, 약 0.2 x 106 내지 약 4 x 106 세포/cm2, 약 0.2 x 106 내지 약 3 x 106 세포/cm2, 약 0.2 x 106 내지 약 2 x 106 세포/cm2, 약 0.5 x 106 내지 약 10 x 106 세포/cm2, 약 0.5 x 106 내지 약 5 x 106 세포/cm2, 약 0.5 x 106 내지 약 4 x 106 세포/cm2, 약 0.5 x 106 내지 약 3 x 106 세포/cm2, 또는 약 0.5 x 106 내지 약 2.5 x 106 세포/cm2에서 시딩될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 약 20 x 106 내지 약 1 x 109개의 생존가능한 1차 망막 세포, 약 20 x 106 내지 약 1 x 108개의 생존가능한 1차 망막 세포, 약 20 x 106 내지 약 1 x 107개의 생존가능한 1차 망막 세포, 약 30 x 106 내지 약 1 x 109개의 생존가능한 1차 망막 세포, 약 30 x 106 내지 약 1 x 108개의 생존가능한 1차 망막 세포, 약 30 x 106 내지 약 1 x 107개의 생존가능한 1차 망막 세포, 약 20 x 106 내지 약 147 x 106개의 생존가능한 1차 망막 세포, 약 20 x 106 내지 약 100 x 106개의 생존가능한 1차 망막 세포, 또는 약 73 x 106 내지 약 147 x 106개의 생존가능한 1차 망막 세포를 생성한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 적어도 약 20 x 106개의 생존가능한 1차 망막 세포를 생성한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 적어도 약 30 x 106개의 생존가능한 1차 망막 세포를 생성한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 적어도 약 35 x 106개의 생존가능한 1차 망막 세포를 생성한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 적어도 약 30 x 106개의 생존가능한 1차 망막 세포를 생성한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 적어도 약 45 x 106개의 생존가능한 1차 망막 세포를 생성한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 적어도 약 50 x 106개의 생존가능한 1차 망막 세포를 생성한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 적어도 약 20 x 106개의 생존가능한 1차 망막 세포, 적어도 약 30 x 106개의 생존가능한 1차 망막 세포, 적어도 약 40 x 106개의 생존가능한 1차 망막 세포, 적어도 약 50 x 106개의 생존가능한 1차 망막 세포, 적어도 약 60 x 106개의 생존가능한 1차 망막 세포, 적어도 약 70 x 106개의 생존가능한 1차 망막 세포, 적어도 약 80 x 106개의 생존가능한 1차 망막 세포, 적어도 약 90 x 106개의 생존가능한 1차 망막 세포, 적어도 약 100 x 106개의 생존가능한 1차 망막 세포, 적어도 약 120 x 106개의 생존가능한 1차 망막 세포, 적어도 약 140 x 106개의 생존가능한 1차 망막 세포, 적어도 약 145 x 106개의 생존가능한 1차 망막 세포, 적어도 약 147 x 106개의 생존가능한 1차 망막 세포, 적어도 약 150 x 106개의 생존가능한 1차 망막 세포, 적어도 약 170 x 106개의 생존가능한 1차 망막 세포, 적어도 약 190 x 106개의 생존가능한 1차 망막 세포 또는 적어도 약 200 x 106개의 생존가능한 1차 망막 세포를 생성한다.
세포 형태, 수 및 생존율
망막 샘플로부터 획득된 1차 망막 세포 및 1차 망막 세포로부터 생성된 망막 전구 세포의 생존율, 양 및 형태를 결정하기 위한 방법이 본 명세서에서 제공된다.
세포의 형태는 임의의 적절한 방법을 사용하여 광학 현미경을 통해 결정될 수 있다. 적합한 광학 현미경 방법은 당업자에게 공지될 것이며, 다음에 제한되는 것은 아니나 차동 간섭 콘트라스트, Nomarski, Hoffman 변조 콘트라스트 및 이의 변형, 형광 현미경 및 공초점 현미경을 포함한다. 선택적으로, 단리된 1차 망막 세포의 하나 이상의 마커에 대한 조직화학적 염색이 사용될 수 있다.
세포 수 및 생존율은 NC200 자동 세포 계수기 (Chemometec) 및 응집 세포 계수 방법을 사용하여 측정할 수 있다. 대안으로 또는 추가로, 세포 수와 생존율은 트리판 블루 (Trypan Blue) 또는 혈구계를 사용하여 측정할 수 있다.
일부 실시형태에서, 계수된 생존가능한 세포의 백분율은 약 10% 내지 약 100%, 또는 약 68% 내지 약 85%이다.
포유류 태아 망막 또는 RPC 세포는 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같이 정량적으로 상이한 유전자 특성을 발현하거나; 양적으로 상이한 용해성 인자 특성을 발현하거나; 이는 양적으로 상이한 표면 마커 특성을 발현한다. 더욱이, 포유류 태아 망막 세포 또는 RPC 세포는 고정되거나 일정하거나 불변하지 않는 유전자 특성을 가지고 있다. 오히려 이는 배양 기간에 따라 동적으로 정량적으로 변화하는 유전자 특성을 가지고 있다.
본 명세서에 개시된 발명은 소정의 세포 배양 방법에 따라 단리되고 특징적인 마커를 발현하는 포유류 망막 전구 세포를 포함하는 세포 집단에 관한 것이다. 상기 세포 집단은 포유류로부터 단리되고 시험관내에서 성장한 세포의 배양물일 수 있다. 예를 들어, 배양은 배양 플레이트, 접시, 플라스크 또는 생물반응기에서 배양된 세포 또는 부착 세포의 현탁액을 포함할 수 있다. 샘플은 균질하거나 불균질적일 수 있으며, 이는 본 명세서에 규정된 하나 이상의 마커의 발현에 의해 결정될 수 있다. 본 명세서에 개시된 세포 집단은 혼합된 세포 집단이며 미분화 및 분화 세포의 혼합물을 포함할 수 있다. 본 명세서에 규정된 망막 전구 세포의 특징적인 마커의 상대적 발현 수준은 집단 내 세포 사이에서 달라질 수 있다.
망막 전구 세포는 세포 표면 마커 및 비 표면 ("유전자") 마커를 포함하는 분자 마커의 발현에 의해 특성화될 할 수 있다. 특정 마커에 대해 세포를 "양성" 또는 "음성"으로 지칭하는 것이 당업계에서 일반적이며, 실제 발현 수준은 정량적으로 결정된다. 세포 표면 (또는 다른 곳에 위치) 상의 분자의 수는 다수의 로그에 따라 다를 수 있지만 여전히 "양성"으로 특성화된다. 또한, 염색에 대해 음성인, 즉 마커 특이적 시약의 결합 수준이 대조군, 예를 들어, 이소형 매칭 대조군과 검출 가능하게 다르지 않은 세포가 소량의 마커를 발현할 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해된다. 표지 ("염색") 수준의 특성화는 세포 집단 간의 미묘한 구별을 가능하게 한다. 세포의 염색 강도는 유세포 분석으로 모니터링할 수 있으며, 레이저는 형광 색소의 정량 수준 (예를 들어, 항체와 같은 특정 시약에 결합된 세포 표면 마커의 양에 비례함)을 검출한다. 또한 유세포 분석 또는 FACS는 특정 시약에 대한 결합 강도뿐만 아니라 세포 크기 및 광 산란과 같은 기타 매개변수에 따라 세포 집단을 분리하는데에 사용할 수 있다. 염색의 절대 수준은 특정 형광 색소 및 시약 제조물에 따라 다를 수 있지만 데이터를 대조군으로 정규화할 수 있다.
대조군에 대한 분포를 정규화하기 위해, 각 세포는 특정 염색 강도를 갖는 데이터 포인트로 기록된다. 이러한 데이터 포인트는 측정 단위가 임의의 염색 강도인 로그 스케일에 따라 표시될 수 있다. 예를 들어, 샘플에서 가장 밝게 염색된 세포는 염색되지 않은 세포보다 최대 4 로그 더 강할 수 있다. 이러한 방식으로 표시되면 염색 강도의 가장 높은 로그에 속하는 세포는 밝고 가장 낮은 강도의 세포는 음수이다. "낮은" 양성 염색 세포는 이소형 매칭 대조군의 밝기보다 높은 염색 수준을 나타내지만 일반적으로 집단에서 발견되는 가장 밝은 염색 세포만큼 강하지는 않다. 낮은 양성 세포는 샘플의 음성 및 밝게 염색된 양성 세포와 다른 고유한 특성을 가질 수 있다. 대안적인 대조군은 예를 들어 제조된 비드 또는 세포주와 같이 표면에 소정의 마커 밀도를 갖는 기질을 사용할 수 있으며, 이는 강도에 대한 양성 대조군을 제공한다.
마커의 발현은 망막 전구 세포 및 세포 집단이 유래된 망막 조직의 배양 동안 변화될 수 있다. 예를 들어, 마커 발현의 차이는 산소 수준 (예를 들어, 대기 중 산소 조건 또는 "정상 산소" 조건 또는 "산소 감소" 조건으로도 공지된 저산소 조건)과 같은 배양 조건에 의해 영향을 받을 수 있다. 비 제한적인 예로서, 저산소 조건은 약 0.5% 내지 10% 산소 (예를 들어, 약 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 또는 10%)를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 저산소 조건은 약 0.5% 내지 5%, 약 1% 내지 5%, 또는 약 1% 내지 3%를 포함할 수 있다. 당업자는 망막 전구 세포 및 세포 집단의 마커 발현이 정지 상태가 아니고 하나 이상의 배양 조건, 예를 들어, 배양 배지, 산소 수준, 계대배양 횟수, 배양 시간의 함수로서 변할 수 있음을 인식할 것이다.
망막 전구 세포 및 세포 집단은 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상, 11 이상, 12 이상, 13 이상, 15 이상, 16 이상, 17 이상, 18 이상, 19 이상, 20 이상, 25 이상, 30개 이상의 본 명세서에 규정된 마커 또는 최대 50개 이상의 마커 사이의 임의의 증분을 발현할 수 있다.
1차 망막 세포 및 망막 전구 세포 (RPC) 배양
본 명세서에서는 이식 및 치료 적용을 위한 망막 전구 세포 집단을 생성하기 위해 1차 망막 세포 및 망막 전구 세포를 배양하는 방법이 제공된다.
본 명세서에 기재된 방법은 다량의 생존가능한 세포를 생성할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 방법은 수확시 약 10억개 이상의 망막 전구 세포를 생성할 수 있다. 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90%의 세포는 생존가능하다.
일부 실시형태에서, 공여체 세포는 세포 변이를 방지하기 위해 항생제없이 배양될 수 있다. 또한 항생제 부재 하에 잠복 미생물 오염을 배제할 수 있기 때문에 매우 낮은 계대배양 세포의 사용이 가능하다. 대안적 실시형태에서, 낮은 계대배양 세포의 사용은 형질전환 및/또는 종양 형성의 위험이 낮다. 또한 낮은 계대배양 세포의 사용은 발달 망막에 존재하는 자연 세포에 가장 가깝다.
일부 실시형태에서, 1차 망막 세포 및 망막 전구 세포는 항생제를 사용하여 배양된다. 적합한 항생제에는 다음에 제한되는 것은 아니나 페니실린, 스트렙토마이신 및 젠타마이신이 포함된다. 일부 실시형태에서, 항생제는 젠타마이신을 포함한다. 일부 실시형태에서, 젠타마이신은 약 0.5 내지 50 μg/mL, 예를 들어, 약 0.5 내지 40 μg/mL, 약 5 내지 50 μg/mL, 또는 약 5 내지 35 μg/mL의 농도이다. 일부 실시형태에서, 젠타마이신은 약 50 μg/mL의 농도이다. 일부 실시형태에서, 젠타마이신은 약 30 μg/mL의 농도이다.
RPC의 성장 및 배양을 위해 임의의 적합한 기초 배지를 사용할 수 있다. 세포 배양은 일반적으로 자연 환경 외부에서 제어된 조건에서 세포가 성장하는 과정을 말한다. 세포 집단은 당업계에 공지된 임의의 세포 배양 배지에서 성장 또는 배양된다. 용어 "기초 배지"는 세포 성장을 지원할 수 있는 임의의 배지를 지칭한다. 기초 배지는 표준 무기 염, 예컨대 아연, 철, 마그네슘, 칼슘 및 칼륨, 비타민, 글루코스, 완충 시스템 및 주요 아미노산을 제공한다. 본 발명에서 사용될 수 있는 배지는 다음에 제한되는 것은 아니나, 특히, 배지 199, CMRL 1415, CMRL 1969, CMRL 1066, NCTC 135, MB 75261, MAB 8713, DM 145, Williams' G, Neuman & Tytell, Higuchi, MCDB 301, MCDB 202, MCDB 501, MCDB 401, MCDB 411, MDBC 153, 및 Ultraculture를 포함하여, 최소 필수 배지 이글, ADC 내지 1, LPM (소 혈청 알부민 무함유), F10 (Ham), F12 (Ham), DCCM1, DCCM2, RPMI 1640, BGJ 배지 (Fitton-Jackson 변형 존재 및 부재), 기초 배지 이글 (BME--Earle 염 베이스 첨가), 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM--무혈청), Yamane, IMEM-20, Glasgow 변형 이글 배지 (GMEM), Leibovitz L-15 배지, McCoy's 5A 배지, 배지 M199 (M199E--Earle 염 베이스 포함), 배지 M199 (M199H--Hank 염 베이스 포함), 최소 필수 배지 이글 (MEM-E--Earle 염 베이스 포함), 최소 필수 배지 이글 (MEM-H--Hank 염 베이스 포함) 및 최소 필수 배지 이글 (MEM-NAA 비필수 아미노산 포함)을 포함한다. 대안적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 망막 전구 세포를 배양하는데 사용하기 위한 배지는 고급 DMEM/F12 및 Ultraculture이다. 이러한 배지의 수는 문헌[Methods in Enzymology, Volume LVIII, "Cell Culture," pp. 62-72]에 요약되어 있다.
일부 실시형태에서, 배지는 둘베코 변형 이글 배지 DMEM/F12, 고급 DMEM/F12, Knockout DMEM/F12, Neurobasal 배지, ReNcell 또는 Ultraculture 배지를 포함한다. 일부 실시형태에서, 배지는 DMEM/F12를 포함한다.
"조건화된 배지"는 기본 또는 기초 배지와 비교하여 변경된 배지를 지칭한다. 예를 들어, 배지의 조건화에 의해 영양분 및/또는 성장 인자와 같은 분자를 기초 배지에 존재하는 원래 수준에 추가하거나 고갈시킬 수 있다. 배지는 특정 유형의 세포가 특정 기간 동안 특정 조건 하 배지에서 성장 또는 유지되도록 조건화될 수 있다. 예를 들어, 배지는 소정의 시간 동안 소정의 온도에서 소정의 조성의 배지 조성물에서 망막 전구 세포가 확장, 분화 또는 유지되도록 조건화될 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 세포, 배지 유형, 기간 및 환경 조건의 수많은 조합을 사용하여 거의 무한대의 조건화된 배지를 생성할 수 있다.
세포 배양 보충제 또는 첨가제의 예는 제한 없이 세포 생존 또는 성장을 지원하는 혈청의 역할을 부분적으로 또는 전체적으로 대체하는 구성성분을 포함한다. 예를 들어 보충제는 인슐린, 트랜스금속단백질 (transmetalloprotein), 미량 원소, 비타민 또는 기타 인자를 포함할 수 있다. 이러한 인자는 일반적으로 기초 배지에 포함되지 않지만 일반적으로 세포 배양에 사용되는 혈청에 의해 제공된다. 보충제 또는 첨가제는 세포 성장을 지원하는 다음 성분 중 적어도 하나 이상을 포함할 수 있다: 하나 이상의 인슐린 또는 이의 대체물, 하나 이상의 트랜스금속단백질 또는 이의 대체물, 하나 이상의 미량 원소 (예를 들어, 셀레늄, 철, 아연, 구리, 코발트, 크롬, 요오드, 플루오르, 망간, 몰리브덴, 바나듐, 니켈, 주석), 하나 이상의 비타민 (예를 들어, 비타민 C, 비타민 E, 비타민 A, 비타민 B 그룹), 하나 이상의 염 (예를 들어, 나트륨염, 마그네슘염, 칼슘염 또는 인산염), 하나 이상의 완충액 (예를 들어, 인산염 완충 식염수, HEPES 완충액), 하나 이상의 아미노산 (예를 들어, L-글루타민), 하나 이상의 호르몬, 호르몬 유사 화합물 또는 성장 인자 (예를 들어, 트랜스페린, EGF, NGF, ECGF, PDGF, FGF, IGF, LIF, 인터루킨, 인터페론, TGF 및/또는 VEGF, 글루카곤, 코르티코스테로이드, 바소프레신, 프로스타글란딘 및 기타 성장 인자), 혈청 알부민 또는 이의 대체물, 하나 이상의 탄수화물 (글루코스, 갈락토스, 프룩토스, 만노스, 리보스, 해당 대사산물), 하나 이상의 항생제 및/또는 항진균제 (예를 들어, 페니실린, 스트렙토마이신, 훈기존 (Fungizone)) 및 하나 이상의 지질 (예를 들어, 유리 및 단백질 결합 지방산, 트리글리세라이드, 인지질, 콜레스테롤, 에탄올아민). 예시적인 보충제는 N-2 (N2) 보충제를 포함한다. KnockOut 혈청 대체물 (KOSR), N2, B27, StemPro (본 명세서에서 Stempro라고도 함), 인슐린-트랜스페린-셀레늄 보충제 (ITS) 및 G5와 같은 많은 시판되는 혈청 대체 첨가제는 당업자에 잘 알려져 있으며 쉽게 사용할 수 있다. 이러한 첨가제는 잘 규정된 구성성분이 특징이므로 성분의 농도는 배지에서의 비율에 따라 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 배양 배지는 인간 상피 성장 인자 (EGF) 및 염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF)를 포함한다.
비 제한적인 예로서, 세포 및/또는 소세포 덩어리는 최대 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10회 이상의 계대배양 동안 무 혈청 배지 또는 혈청 포함 배지, 항생제 및 항진균제를 포함하거나 항생제 또는 항진균제를 포함하지 않는 멸균 환경에서 배양된다. 세포 및/또는 소세포 덩어리는 선택적으로 N2 보충제 (Invitrogen) 또는 B27 또는 B27 이종 무함유 (Invitrogen), L-글루타민 또는 GlutaMax 또는 GlutaMAX-I (Invitrogen), 및 예를 들어 EGF 및 bFGF (Invitrogen), 또는 다른 성장 인자를 포함하는 인간 재조합 성장 인자와 함께 기초 배양 배지 (예를 들어, 둘베코 변형 이글 배지: Nutrient Mixture F-12™ (DMEM/F12™) 배지 또는 고급 DMEM/F12™ 배지 (Gibco-Invitrogen-Life Technologies, Carlsbad Calif.)) 또는 Ultraculture™ 배지 (BioWhittaker-Lonza Walkersville, Inc., Walkersville, Md.)에서 배양된다. 예를 들어, DMEM/F12™ 배지는 인간 세포에 사용되며, Ultraculture™ 배지는 고양이 또는 개 세포에 사용된다.
일부 실시형태에서, 세포 및/또는 세포 덩어리는 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5회의 계대배양 동안 배양된다. 일부 실시형태에서, 세포 및/또는 세포 덩어리는 5회 초과의 계대배양 동안 배양된다. 일부 실시형태에서, 배양 배지는 둘베코 변형 이글 배지 DMEM/F12, 고급 DMEM/F12, Knockout DMEM/F12, Neurobasal 배지, ReNcell 및 Ultraculture 배지를 포함한다. 일부 실시형태에서, 배양 배지는 고급 DMEM/F12를 포함한다.
일부 실시형태에서, 배양 배지는 고급 DMEM/F12, N-2 보충제, GlutaMAX I, 재조합 인간 상피 성장 인자 (EGF), 및 염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 배양 배지는 B27, B27 이종 무함유, 또는 Stempro를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 배양 배지는 약 30 μg/mL의 농도의 젠타마이신을 포함한다.
배양 배지는 또한 선택적으로 알부민, 또는 인간 또는 고양이 또는 개 알부민, 또는 재조합 알부민 또는 알부민으로 보충될 수 있다. 비 제한적인 예로서, 알부민은 약 1.0 mg/ml의 초기 농도를 갖는 양으로 첨가될 수 있다.
포유류 망막 전구 세포의 배양은 감소된 혈청을 포함하거나 혈청을 포함하지 않는 배지에서 생성될 수 있다. 혈청의 예로는 소 태아 혈청, 송아지 혈청, 신생 송아지 혈청, 염소 혈청, 말 혈청, 인간 혈청, 토끼 혈청, 랫트 혈청, 마우스 혈청 등을 포함한다. 특정 배양 조건 하에서, 혈청 농도는 약 0.05% v/v 내지 약 20% v/v (예를 들어, 0.05, 0.10, 0.15, 0.20, 0.25, 0.30, 0.35, 0.40, 0.45, 0.50, 0.55, 0.60, 0.65, 0.70, 0.75, 0.80, 0.85, 0.90, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 5, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 19.5, 또는 20%)의 범위일 수 있다. 예를 들어, 일부 분화 과정에서 배지의 혈청 농도는 약 0.05% 미만 (v/v), 약 0.1% 미만 (v/v), 약 0.2% 미만 (v/v), 약 0.3% 미만 (v/v), 약 0.4% 미만 (v/v), 약 0.5% 미만 (v/v), 약 0.6% 미만 (v/v), 약 0.7% 미만 (v/v), 약 0.8% 미만 (v/v), 약 0.9% 미만 (v/v), 약 1% 미만 (v/v), 약 2% 미만 (v/v), 약 3% 미만 (v/v), 약 4% 미만 (v/v), 약 5% 미만 (v/v), 약 6% 미만 (v/v), 약 7% 미만 (v/v), 약 8% 미만 (v/v), 약 9% 미만 (v/v), 약 10% 미만 (v/v), 약 15% 미만 (v/v) 또는 약 20% 미만 (v/v)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 망막 전구 세포 및 망막 전구 세포를 포함하는 세포 집단은 혈청 부재하 ("무혈청"), 혈청 대체물 부재하 및/또는 임의의 보충제에서 성장한다.
망막 전구 세포 또는 망막 전구 세포를 포함하는 세포 집단은 "이종 무함유" 조건 하에서 배양된다. "이종 무함유" 또는 "이종원 (xenogen) 무함유"는 특정 종의 세포 (예를 들어, 인간 세포)가 단지 인간 산물 또는 보충제 (예를 들어, 인간 혈청 알부민, 인간 혈청)의 존재 하 그러나 다른 종으로부터의 산물의 부재 하에서 성장 또는 배양되는 조건을 지칭한다. 이는 인간에게 이식하는데 사용되는 세포에 특히 중요하다. 다양한 불특정 동물 유래 산물에 노출된 세포는 이식 거부, 면역 반응, 바이러스 또는 박테리아 감염, 프리온 및 미확인 동물원성 감염의 위험이 증가하기 때문에 임상 적용에 바람직하지 않다. 더욱이, 인간 사용 또는 비인간 포유류 사용 (예를 들어, 수의과 사용)을 포함한 모든 포유류 사용을 위해, 세포는 정상적인 핵형 또는 감염 또는 오염의 존재에 대해 예를 들어, 마이코플라스마, 그람 음성 박테리아 (예를 들어, 내독소 검사), 진균 등에 의해 스크리닝된다. 세포는 또한 누드 마우스에서의 텔로머라제 활성 분석, hTERT 유전자 발현 및 연한천에서의 성장 또는 종양 형성에 의해 종양원성 또는 암성 표현형으로의 형질전환에 대해 스크리닝될 수 있다. 이러한 분석은 당업계에 공지되어 있으며 당업자의 범위 내에 있다.
망막 전구 세포 또는 망막 전구 세포를 포함하는 세포 집단은 영양 세포층 (예를 들어, 배아 또는 성체 섬유아세포)에서, 또는 세포외 지지체 스캐폴드 또는 기질, 예컨대 콜라겐, 엔탁틴, 헤파린 술페이트 프로테오글리칸, 피브로넥틴, 라미닌, 젤라틴 또는 마트리겔(Matrigel)의 존재 하에 배양될 수 있다. 예를 들어, PURECOL® 콜라겐은 순도 (99.9% 초과의 콜라겐 함량), 기능성 및 이용 가능한 가장 천연 유사 콜라겐에 대한 모든 콜라겐의 표준으로 공지되어 있다. PURECOL® 콜라겐은 약 97% 유형 I 콜라겐이고 나머지는 유형 III 콜라겐으로 구성되어 있으며 표면 코팅, 세포 배양을 위한 얇은 층 제조물 제공 또는 고체 겔로의 사용에 이상적이다. 당업계에 공지된 스캐폴드 또는 기질의 다른 예는 CELLstart (Invitrogen)이다.
일부 실시형태에서, 세포 배양 조건은 37℃, 5% CO2로 설정된 인큐베이터에서 세포의 성장을 포함할 수 있다. 1차 망막 세포, 망막 전구 세포 또는 이를 포함하는 세포 집단은 정상 산소 또는 대기 조건 (약 20% O2)에서 배양될 수 있고, 또한 수태 중 발생 태아 망막의 산소 수준, 즉 "저산소 " 또는 "산소 감소" 상태, 예를 들어 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5%, 5.5%, 6%, 6.5%, 7%, 7.5%, 8%, 8.5%, 9%, 9.5%, 또는 10% 산소, 또는 그 사이의 임의의 증분에 가까운 조건 하에 성장될 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포 배양 조건은 (1) 37℃, 0 내지 30% CO2, 및 0 내지 50% O2 하, (2) 37℃, 5% 이하의 CO2 및 20% 이하의 O2; 또는 (3) 37℃, 5% 이하의 CO2 및 3% 이하의 O2로 설정된 인큐베이터에서 세포의 성장을 포함할 수 있다.
플레이팅 밀도는 배양 배지 부피당 세포 수 또는 부착 배양에서 cm2당 세포 수를 지칭한다. 이와 관련하여 유사한 용어는 "컨플루언스"로, 일반적으로 세포 배양 접시 또는 플라스크에 있는 세포 수의 척도로 사용되며 세포가 접시 또는 플라스크를 도포하는 범위를 나타낸다. 예를 들어 100% 컨플루언스는 접시가 세포로 완전히 도포되어 있으므로 세포가 성장할 공간이 더 이상 남지 않음을 의미하며; 50% 컨플루언스는 접시의 약 절반이 도포되고 세포가 성장할 공간이 남아 있음을 의미한다.
일부 실시형태에서, 본 방법은 제1 계대배양을 포함하고, 제1 계대배양은 약 0.5 x 106 내지 약 3.0 x 106 세포/제곱 센티미터 (cm2), 약 0.5 x 106 내지 약 5.0 x 106 세포/cm2, 약 0.55 x 106 내지 약 4.0 x 106 세포/cm2, 약 0.55 x 106 내지 약 3.0 x 106 세포/cm2, 약 0.55 x 106 내지 약 2.5 x 106 세포/cm2 또는 약 0.55 x 106 내지 약 2.1 x 106 세포/cm2의 밀도로 세포를 배양 플라스크 또는 플레이트에 시딩하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 계대배양은 배양 플라스크 또는 플레이트에 약 0.5 x 106 내지 약 3.0 x 106 세포/cm2의 밀도로 세포를 시딩하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 계대배양은 배양 플라스크 또는 플레이트에 약 0.59 x 106 내지 약 2.29 x 106 세포/cm2의 밀도로 세포를 시딩하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 방법은 제2 계대배양을 포함하고, 제2 계대배양은 약 0.05 x 106 내지 약 1 x 106 세포/cm2, 약 0.07 x 106 내지 약 0.80 x 106 세포/cm2, 약 0.10 x 106 내지 약 0.5 x 106 세포/cm2, 약 0.10 x 106 내지 약 0.4 x 106 세포/cm2, 약 0.13 x 106 내지 약 0.35 x 106 세포/cm2, 또는 약 0.14 x 106 내지 약 0.32 x 106 세포/cm2의 밀도로 세포를 배양 플라스크 또는 플레이트에 시딩하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 계대배양은 배양 플라스크 또는 플레이트에 약 0.1 x 106 내지 약 0.5 x 106 세포/cm2의 밀도로 세포를 시딩하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 계대배양은 배양 플라스크 또는 플레이트에 약 0.14 x 106 내지 약 0.43 x 106 세포/cm2의 밀도로 세포를 시딩하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 방법은 제3 계대배양을 포함하고, 제3 계대배양은 약 0.01 x 106 내지 약 0.5 x 106 세포/cm2, 약 0.02 x 106 내지 약 0.45 x 106 세포/cm2, 약 0.03 x 106 내지 약 0.40 x 106 세포/cm2, 약 0.04 x 106 내지 약 0.30 x 106 세포/cm2, 약 0.05 x 106 내지 약 0.20 x 106 세포/cm2 또는 약 0.05 x 106 내지 약 0.10 x 106 세포/cm2의 밀도로 세포를 배양 플라스크 또는 플레이트에 시딩하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제3 계대배양은 배양 플라스크 또는 플레이트에 약 0.03 x 106 내지 약 0.2 x 106 세포/cm2의 밀도로 세포를 시딩하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제3 계대배양은 배양 플라스크 또는 플레이트에 약 0.05 x 106 내지 약 0.1 x 106 세포/cm2의 밀도로 세포를 시딩하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 방법은 제4 및 선택적으로 추가 계대배양을 포함하고, 제4 및 추가 계대배양은 약 10,000 내지 약 60,000 세포/cm2, 약 10,000 내지 약 50,000 세포/cm2, 약 10,000 내지 약 40,000 세포/cm2, 약 20,000 내지 약 60,000 세포/cm2, 약 20,000 내지 약 50,000 세포/cm2, 또는 약 20,000 내지 약 40,000 세포/cm2의 밀도로 세포를 배양 플라스크 또는 플레이트에 시딩하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제4 계대배양은 배양 플라스크 또는 플레이트에 약 10,000 내지 약 60,000 세포/cm2의 밀도로 세포를 시딩하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제4 계대배양은 배양 플라스크 또는 플레이트에 약 20,000 내지 약 40,000 세포/cm2의 밀도로 세포를 시딩하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 방법은 초기 계대배양 시 더 높은 밀도로 이후 계대배양 시 더 낮은 밀도로 세포를 배양 플라스크에 시딩하는 단계를 포함한다. 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니나, 처음 몇 회의 계대배양 동안 세포는 세포 덩어리로부터 단일 세포로 변형되고, 덩어리로부터 세포로의 이러한 점진적인 변형은 본 명세서에 기재된 방법의 증가된 세포 생존율에 기여한다고 생각된다. 이후 계대배양은 단일 세포로 시딩하고 시딩 밀도를 급격히 감소시킨 후 일정하게 유지시킨다. 비 제한적인 예로서, 세포는 제1 계대배양 시 약 0.5x106 내지 약 3.0x106 세포/cm2, 제2 계대배양 시 약 0.1x106 내지 약 0.5x106 세포/cm2의, 제3 계대배양 시 약 0.03 x 106 내지 약 0.2 x 106 세포/cm2, 및 제4 및 추가 계대배양 시 약 10,000 내지 약 60,000 세포/cm2의 밀도로 배양 플라스크 또는 플레이트에 시딩된다. 추가의 비 제한적인 예로서, 세포는 제1 계대배양 시 약 0.59 x 106 내지 약 2.29 x 106 세포/cm2, 제2 계대배양 시 약 0.14 x 106 내지 약 0.32 x 106 세포/cm2, 제3 계대배양 시 약 0.05 x 106 내지 약 0.1 x 106 세포/cm2, 및 제4 및 추가 계대배양 시 약 20,000 내지 약 40,000 세포/cm2의 밀도로 배양 플라스크 또는 플레이트에 시딩된다.
일부 실시형태에서, 바로 연속 계대배양 사이의 기간은 2 내지 8일, 3 내지 6일, 4 내지 5일 또는 3 내지 4일이다. 일부 실시형태에서, 계대배양 사이의 기간은 4일이다. 일부 실시형태에서, 바로 연속 계대배양 사이의 기간은 3일이다.
일부 실시형태에서, 계대배양 프로토콜은 생존가능한 세포의 수에 대한 표적 임계값을 포함하고, 이러한 표적 임계값이 충족되지 않으면 세포 배양이 종료된다. 예를 들어, 90x106, 100x106, 110x106, 120x106, 130x106, 140x106 또는 150x106개의 생존가능한 세포가 생성되는 경우, 계대배양 3 (P3) 종료시 세포 배양이 종료될 수 있다. 추가 예로서, 200x106 미만, 250x106 미만, 300x106 미만, 350x106 미만, 400x106 미만, 450x106 미만 또는 500x106개 미만의 생존가능한 세포가 생성되는 경우, 계대배양 4 (P4)의 종료시 세포 배양이 종료될 수 있다.
계대배양 (하위 배양 또는 세포 분할이라고도 함)는 적은 수의 세포를 새로운 용기로 옮기는 단계를 포함한다. 세포는 장기간 높은 세포 밀도로 결합되어 노화를 방지하기 때문에 정기적으로 분할하면 더 오랜시간 동안 배양할 수 있다. 현탁 배양은 더 많은 양의 새로운 배지에 희석된 소수의 세포를 포함하는 소량의 배양으로 쉽게 계대배양된다. 부착 배양의 경우 먼저 세포를 분리해야 한다. 이는 일반적으로 효소 예컨대 트립신-EDTA 또는 트립신 균등물 및 EDTA, 또는 비-효소 용액 유사 세포 분리 완충액의 혼합물로 수행되지만; 이러한 목적을 위해 다양한 효소 또는 비 효소 혼합물 또는 제조물을 사용할 수 있다. 그런 다음 소수의 분리된 세포를 사용하여 새로운 배양을 시딩할 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포는 제1, 제2 및 제3 계대배양 시 상이한 트립신 또는 균등물을 포함하는 용액으로 처리된다. 예시적인 프로토콜에서, 세포는 제1 계대배양에서 1:4의 비율로 TrypLE 및 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA)을 포함하는 제1 효소 용액, 제2 계대배양 시 1:1:3의 비율의 TrypLE, EDTA 및 둘베코 인산염 완충 식염수 (DPBS)를 포함하는 제2 효소 용액 및 제3 및 모든 이후 계대배양 시 1:1의 비율의 TrypLE 및 DPBS를 포함하는 제3 효소 용액으로 처리된다. 추가의 예시적인 프로토콜에서, 세포는 제1 계대배양 시 1:1:3의 비율의 TrypLE, EDTA 및 PBS를 포함하는 제1 효소 용액, 제2 계대배양 시 1:1의 비율의 TrypLE 및 DPBS를 포함하는 제2 효소 용액 및 제3 및 모든 이후 계대배양 시 1:1의 비율의 TrypLE 및 DPBS를 포함하는 제3 효소 용액으로 처리된다. 세포는 약 5 내지 20분, 약 6 내지 10분, 약 5 내지 10분, 약 7 내지 8분, 또는 약 5 내지 7분 동안 트립신 또는 균등한 용액으로 처리될 수 있다. 세포 생존율, 수 및/또는 형태는 임의의 계대배양 시 결정될 수 있다. 예를 들어, 세포 생존율 및 수는 세포 배양을 종결할지를 결정하거나 세포 시딩 밀도를 결정하기 위해 계대배양 3 및 4에서 결정될 수 있다. 대부분의 1차 세포 배양은 수명이 제한되어 있으며 무기한 증식하지 않는다. 특정 수의 집단 배가(population doubling) (Hayflick 한계라고 함) 후에 세포는 노화 과정을 거치고 분열을 중지하며, 일반적으로 생존율을 유지한다. 일부 실시형태에서, 망막 전구 세포 및 세포 집단은 10회 이하의 계대배양 동안 배양될 수 있으며, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10회의 계대배양 동안 계대배양된다. 일부 실시형태에서, RPC는 표준 산소 조건 하에서 약 4 내지 6회 (예를 들어, 4, 5, 또는 6회) 계대배양되고, 선택적으로 후속적으로 저산소 조건에서 약 1 내지 10 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10)회 계대배양 동안 배양된다.
대안적 실시형태에서, 세포는 5회 초과, 예를 들어, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상의 계대배양 동안(표준 산소 조건, 저산소 조건 및/또는 이의 임의의 조합으로) 계대배양될 수 있다. 특정 실시형태에서, 망막 전구 세포 및 세포 집단은 약 5 내지 32 (예를 들어, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 또는 32)회의 계대배양 동안 배양된다. 당업자는 당업계에 공지된 다른 방법이 32회의 계대배양 (즉, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50회 이상의 계대배양) 동안 세포를 배양하는데 사용될 수 있음을 인식할 것이다.
플라스크, 플레이트 또는 세포 스택과 같은 임의의 적합한 용기를 사용하여 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 세포를 계대배양할 수 있다. 예시적인 플라스크는 T25 및 T75 플라스크를 포함한다. CellStacks (CS)는 예를 들어 Corning으로부터 이용 가능한 스택 배양 챔버이다. 일부 실시형태에서, 플라스크, 플레이트 또는 세포 스택은 코팅될 수 있다. 플라스크, 플레이트 및 세포 스택은 둘베코 인산염 완충 식염수 (DPBS)에 희석된 피브로넥틴, 오르니틴, 폴리-리신 또는 라미닌으로 코팅할 수 있다. 일부 실시형태에서, 플라스크, 플레이트 또는 세포 스택은 피브로넥틴으로 코팅된다. 일부 실시형태에서, 피브로넥틴은 이종 무함유이다. 선택적으로, 플라스크, 플레이트 또는 세포 스택은 세포를 그 안에 배치하기 전에 배양 배지로 세정할 수 있다.
다양한 실시형태에서, 세포 샘플은 병원체, 박테리아, 내독소, 진균, 마이코플라스마, 바이러스, 간염 바이러스 또는 HIV 바이러스의 존재에 대해 스크리닝된다. 세포 샘플은 또한 정상 핵형의 존재; 생존율; 및/또는 종양원성에 대해 스크리닝될 수 있다. 선택적으로, 세포 샘플은 상승된 텔로머라제 활성을 나타내지 않는다.
임의의 이러한 방법에서, 망막 세포 및/또는 망막 조직은 단리, 선택 및/또는 배양 전 또는 후에 동결될 수 있다. 세포 동결은 당업계에서 통상적으로 사용되는 임의의 저온보존제 및/또는 기술을 사용하여 달성될 수 있다. 동결된 세포는 당업계에 공지된 임의의 프로토콜을 사용하여 사용 전에 해동될 수 있다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법에서 세포를 사용하기 전에 세포의 생존율을 조사할 수 있다. 대안적 실시형태에서, 비 제한적인 예로서, 저온보존 전에, 적어도 70% (예를 들어, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100%)의 세포가 생존가능하다. 해동 후, 대안적 실시형태에서, 적어도 70% (예를 들어, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100%)의 세포가 생존가능하다. 유사하게, 세포 배양 회수시, 대안적 실시형태에서 적어도 70% (예를 들어, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100%)의 세포가 생존가능하다. 임의의 단계에서 생존가능한 세포의 수를 결정하는 단계는 당업계의 통상적인 수준 내에 있다.
따라서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 단리 및 배양 방법을 사용하여 생성된 다수의 망막 전구 세포를 저온보존하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 방법은 (i) 트립신 또는 균등물을 사용하여 세포를 효소에 의해 분리하는 단계, (ii) 과량의 배양 배지 또는 고급 DMEM/F12에 의해 분리를 중지시키는 단계, (iii) 10xg 내지 10,000xg에서 1 내지 30분 동안 원심분리를 통해 세포를 원심분리하는 단계, (iv) 배양 배지에서 세포를 재현탁하고 총 세포 수 및 생존율을 결정하는 단계, (v) 저온보존 배지를 첨가하여 최종 디메틸술폭사이드 (DMSO) 농도가 5 내지 30%가 되도록 하는 단계, (vi) 다수의 세포를 각각의 저온 바이알로 분취하는 단계, (vii) Control Rate Freezer를 사용하여 각 바이알을 동결하는 단계, 및 (viii) 각각의 세포 바이알을 액체 N2 중에 배치하는 단계를 포함한다. 당업계에 알려진 임의의 적합한 동결 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 세포는 -80℃ 냉동고에 배치된 Cryo 1C 동결 용기를 사용하여 동결할 수 있다. 일부 실시형태에서, 트립신 균등물은 TrypLE Express 또는 TrypLE Select (예를 들어, ThermoFisher 또는 Invitrogen)와 같은 TrypLE이다. 일부 실시형태에서, 저온보존 배지는 배양 배지 및 20% DMSO를 포함한다. 일부 실시형태에서, 저온보존 배지는 10% DMSO의 최종 농도를 달성하기 위해 1:1의 비율로 세포 및 세포 배양 배지에 첨가된다. 일부 실시형태에서, 다수의 망막 전구 세포를 분취하고 약 0.5 x 106 내지 50x106 세포/저온 바이알로 동결시킨다. 일부 실시형태에서, 다수의 망막 전구 세포를 분취하고, 약 0.5 x 106 내지 약 40 x 106 세포/mL 배지 (예를 들어 배양 배지 플러스 10% DMSO), 약 0.5 x 106 내지 약 20 x 106 세포/mL 배지, 약 0.5 x 106 내지 약 10 x 106 세포/mL 배지, 약 1 x 106 내지 약 40 x 106 세포/mL 배지, 약 1 x 106 내지 약 20 x 106 세포/mL 배지, 약 1 x 106 내지 약 10 x 106 세포/mL 배지, 약 10 x 106 내지 약 30 x 106 세포/mL 배지, 약 10 x 106 내지 약 20 x 106 세포/mL 배지, 약 2 x 106 내지 약 10 x 106 세포/mL 배지, 약 2 x 106 내지 약 8 x 106 세포/mL 배지, 또는 약 2 x 106 내지 약 5 x 106 세포/mL 배지로 동결시킨다. 일부 실시형태에서, 다수의 망막 전구 세포를 분취하고, 약 0.5 x 106 내지 약 20 x 106 세포/mL 배지로 동결시킨다. 일부 실시형태에서, 다수의 망막 전구 세포를 분취하고, 약 2 x 106 내지 약 8 x 106 세포/mL 배지로 동결시킨다. 일부 실시형태에서, 다수의 망막 전구 세포를 분취하고, 약 10 x 106 세포/mL 배지로 동결시킨다. 일부 실시형태에서, 저온 바이알은 약 1 mL, 약 2 mL, 약 3 mL, 약 4 mL, 약 5 mL, 약 6 mL, 약 7 mL, 약 8 mL, 약 9 mL 또는 약 10 mL의 저온보존 배지 (예를 들어, 배양 배지 플러스 DMSO) 및 망막 전구 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 저온 바이알은 약 1 mL의 배지 및 망막 전구 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 저온 바이알은 약 5 mL의 배지 및 망막 전구 세포를 포함한다.
특정 실시형태에서, 최종 산물 제형은 얼음 상 (예를 들어, 0 내지 4℃)에서 유지되는 경우 최대 4시간 이상 (예를 들어, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 이상) 동안 최적의 생존율 (예를 들어, 적어도 85%)을 유지하는 것으로 나타났다. 이는 결과적으로 세포 제조물을 지역 임상 현장으로 현지 수송할 수 있게 한다.
저산소 조건 하에서 세포의 추가 확장을 사용하여 계대당 세포 수율을 크게 향상시킬 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 세포는 총 5 내지 12 (즉, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12)회 이상 계대배양될 수 있다. 비 제한적인 예로서, 일 실시형태에서, 이는 표준 산소 조건에서 4 내지 6회 계대배양 (즉, 4, 5, 또는 6회) 후에 이루어지는 3 내지 6회 계대배양 (즉, 3, 4, 5, 또는 6)의 제2 저산소 확장을 포함할 수 있다. 그러나, 당업자는 총 계대배양 수가 약 1 내지 32회 이상의 계대배양 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32회 이상)일 수 있으며, 이는 1 내지 20회 이상의 계대배양 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20회 이상)의 제2 저산소 확장을 포함할 수 있음을 인식할 것이다. 저산소 계대배양의 수뿐만 아니라 적절한 총 계대배양 수의 결정은 당업계의 통상적인 수준 내에 있다. 이러한 제2 저산소 배양 계대배양을 사용하면 hRPC의 작업 뱅크 (예를 들어, 표준 산소 조건에서 배양하여 유래된 것)의 수율이 크게 확장된다. 예를 들어, 표준 정상 산소 뱅크의 세포를 해동하고 추가로 저산소 조건에서 1 내지 20 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20)회의 계대배양 동안 추가로 확장될 수 있다.
더 낮은 저산소 세포 계대배양의 사용이 가능하지만, 결과 수율은 더 낮을 수 있다. 더욱이, 더 낮은 저산소 세포 계대배양을 사용하는 것이 또한 가능하지만, 이에 의해 효능 상실 및/또는 부적절한 유전적 이상 축적의 잠재적인 표현형 변화로 인해 결과 산물에 결함이 있을 위험이 증가할 수 있다.
제2 저산소 배양 계대배양 후, 일부 실시형태에서, 망막 전구 세포는 1시간 내지 최대 5일 (즉, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 108, 또는 120시간)의 짧은 기간 동안 표준 산소 조건 하에서 성장하도록 하는 "회복 기간"이 진행된다. 대안적 실시형태에서, 이 회복 기간 동안, 추가의 임의의 계대배양을 진행시키지 않고 세포를 성장하도록 한다.
따라서, 하나의 비 제한적 예에서, 본 명세서에 기재된 임의의 조성물 및 방법에 사용하기 위한 망막 전구 세포는 (a) 다수의 계대배양 동안 표준 산소 조건 하에서의 배양 후 (b) 다수의 계대배양 동안 저산소 조건 하에서의 배양 후, 선택적으로 (c) 임의의 추가 계대배양 없이 소정의 기간 동안 표준 산소 조건 하에서의 배양을 포함하는 "혼성" 접근법을 사용하여 생성될 수 있다. 표준 산소 조건 및/또는 저산소 조건 하에서 적절한 수의 계대배양뿐만 아니라 회복 기간의 적절한 기간을 결정하는 단계는 당업계의 통상적인 수준 내에 있다.
이러한 신규한 배양 방법을 사용하여 생성된 결과적인 세포 산물을 시험관내 및 동물에서 시험하였으며, 2차 저산소 배양이 진행되지 않은 세포 산물과 유사한 결과를 관찰하였다.
당업자는 이러한 제2 저산소 성분을 전체 과정에 첨가하는 것이 초기 해부 및 플레이팅과 같은 복잡한 절차가 필요하지 않고 강하게 증식하는 세포에 의해 수행되는 계대배양이 상당히 표준화된다는 점에서 자동화된 제조 방법에 도움이 된다는 것을 인식할 것이다.
RPC를 기존 RPC의 유도된 전능성 줄기세포 (iPS) 전환을 통해 추가로 생성한 후 더 원시적인 증식 상태로 확장시킬 수 있다. 그런 다음 iPS를 당업계에 공지된 임의의 방법(들)을 사용하여 RPC로 다시 재분화시킬 수 있다. 이 시나리오에서 RPC로 부여된 이전의 후성 유전학적 각인은 세포를 원래 상태로 되 유도하는데 도움을 주어 RPC 수율을 높이고/거나, 고 수율 동종이계 산물의 안전성을 촉진한다 (즉, 전능성 세포로의 오염 방지에 의함). 이러한 확장 방법은 반복적인 태아 조직 조달 없이도 임상적으로 입증된 RPC 샘플로부터 유래된 매우 크고 잠재적으로 무한한 (비 노화) RPC 공급원을 제공할 수 있다.
RPC는 상기와 같이 RPC로부터 유래된 이러한 세포주 중 하나인 전능성 세포주로부터 추가로 제조될 수 있거나 그렇지 않을 수 있다. 이러한 유도는 RPC가 수확되고, 정제되고, 추가로 확장될 수 있는 원시 망막 구조를 포함하는 "배아체 (embryoid body)", 즉, 안구 컵 유도체로의 부분적인 분화를 포함할 수 있다.
유사한 방법은 iPS의 공여체 세포가 섬모체 상피 또는 홍채로부터 획득되는 자가 세포를 사용하여 수행될 수 있으며, 이는 두 조직 모두 외과의가 접근할 수 있고 망막과 중첩되는 (정확히 동일하지는 않지만) 발생 각인을 갖기 때문이다.
조성물 및 제형
본 명세서에 기재된 망막 전구 세포 및 세포 집단은 경구, 비경구, 흡입 스프레이, 비강, 국소, 척수강내, 척수강내, 뇌내, 경막상, 두개내 또는 직장을 포함하는 임의의 또는 다양한 수단에 의한 투여를 위한 조성물로서 제형화될 수 있다. 본 명세서에 개시된 조성물 및 제형은 약제학적 또는 수의학적으로 허용 가능한 액체, 담체, 애주번트 및 비히클을 포함할 수 있으며 액체, 정제, 캡슐, 이식체, 에어로졸, 겔, 리포솜, 나노입자 등의 형태일 수 있다.
망막 전구 세포 및 세포 집단은 약제학적 또는 수의학적 조성물의 형태로 대상체에게 투여될 수 있다. "약제학적으로 허용 가능한"이라는 어구는 동물 또는 인간에게 투여될 때 부작용, 알레르기 또는 기타 비정상적인 반응을 일으키지 않는 분자 물질 및 조성물을 지칭한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "약제학적으로 허용 가능한 담체"는 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이의 적합한 혼합물, 식물성 오일, 예컨대 올리브 오일 및 에틸 올레이트와 같은 주사 가능한 유기 에스테르를 포함하는 임의의 및 모든 수성 및 비 수성 담체를 포함한다.
약제학적으로 허용 가능한 담체는 선택적으로 제조물 내에서 세포 생존율을 향상시킬 수 있는 단백질인 알부민 (예를 들어, 인간 알부민)을 포함할 수 있다.
마찬가지로, 본 명세서에 개시된 임의의 조성물 또는 제조물은 또한 부형제 HypoThermosol®-FRS (HTS-FRS) (BioLife Solutions, Inc.)를 포함할 수 있으며, 이는 장기간 저온 (2℃ 내지 10℃) 보존 기간에 적용된 세포의 저장 후 괴사 및 세포자멸사의 수준을 매개하도록 설계된 시판용 저온 저장 용액/제형이다. (예를 들어, 미국 특허 제 6,921,633호; 미국 특허 제 6,632,666호; 및 WO 2005/009766 참조).
알부민 및/또는 HTS의 첨가를 사용하여 본 명세서에 개시된 임의의 제조물 내에서 망막 전구 세포에 대한 생존 시간을 최대 약 24시간 (즉, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24시간)까지 연장할 수 있다.
예를 들어, 레시틴과 같은 코팅 물질의 사용, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지 및 계면 활성제의 사용에 의해 적절한 유동성이 유지될 수 있다. 이들 조성물은 또한 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제와 같은 애주번트를 포함할 수 있다. 미생물 존재의 예방은 살균 절차와 파라벤, 클로로부탄올, 소르브산 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 포함시켜 보장될 수 있다. 또한 당, 염화나트륨 등과 같은 등장제를 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수를 지연시키는 제제를 포함시킴으로써 주사 가능한 약제 형태의 흡수를 연장시킬 수 있다. 이는 제조 및 저장 조건에서 안정해야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 약제학적 활성 물질에 대한 이러한 매질 및 제제의 사용은 당업계에 잘 알려져 있다.
유효량의 망막 전구 세포 또는 세포 집단이 대상체에게 투여되어야 한다. "유효량" 또는 "치료적 유효량"은 적절한 효과를 생성하는 조성물의 양을 지칭한다. 유효량은 예를 들어 부분적으로 전달되는 분자 또는 제제 (본 명세서에서는 망막 전구 세포 또는 세포 집단), 치료제가 사용되는 적응증, 투여 경로 및 크기 (체중, 신체 표면 또는 기관 크기) 및 대상체 또는 환자의 상태 (연령 및 일반적인 건강)에 따라 상이할 것이다. 따라서, 임상의 또는 의사는 최적의 치료 효과를 획득하기 위해 투여량을 적정하고 투여 경로를 변형시킬 수 있다. 특정 목적을 위한 특정 제제의 유효량은 당업자에게 잘 알려진 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 본 명세서에 규정된 임의의 조성물에 대해 유효량은 초기에 세포 배양 분석 또는 마우스, 랫트, 토끼, 개, 돼지 또는 원숭이와 같은 동물 모델에서 추정될 수 있다. 또한 적절한 농도 범위와 투여 경로를 결정하기 위해 동물 모델을 사용할 수 있다. 그런 다음 이러한 정보를 사용하여 인간에게 투여하기 위한 유용한 투여량 및 경로를 결정할 수 있다.
본 명세서에 기재된 조성물의 유효량의 예는 5 μl, 10 μl, 15 μl, 20 μl, 25 μl, 50 μl, 100 μl, 150 μl, 200 μl, 250 μl, 300 μl, 350 μl, 400 μl, 450 μl, 500 μl 또는 그 사이의 임의의 증분 내지 최대 5000 μl (5 ml) (예를 들어, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 1950, 2000, 2050, 2100, 2150, 2200, 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500, 2550, 2600, 2650, 2700, 2750, 2800, 2850, 2900, 2950, 3000, 3050, 3100, 3150, 3200, 3250, 3300, 3350, 3400, 3450, 3500, 3550, 3600, 3650, 3700, 3750, 3800, 3850, 3900, 3950, 4000, 4050, 4100, 4150, 4200, 4250, 4300, 4350, 4400, 4450, 4500, 4550, 4600, 4650, 4700, 4750, 4800, 4850, 4900, 4950, 또는 5000 μl)의 부피의 세포 현탁액을 포함한다.
하한 및 상한은 전달 시스템 및/또는 방법에 의해 제한된다. 예를 들어, 문헌[Kayikcuiglu, O. R. et al, (2006) Retina 26(9): 1089-90]을 참조한다. 예를 들어, 유리체 절제술없이 투여했을 때 투여량 상한은 안압 상승으로 인해 약 200 μl이다. 유리체강 내로 유리체 절제술과 함께 투여되는 경우의 부피 상한은 유리체강의 부피에 의해 제한되며 최대 5 ml 이상을 포함할 수 있다. 망막 분리로 인해 망막 하 주사의 상한은 최대 200 μl일 수 있다. 대안적 실시형태에서, 이러한 부피는 어느 경우에나 1000 내지 10x106 세포/투여량, 또는 1000 내지 2000 세포/투여량, 2000 내지 3000 세포/투여량, 3000 내지 4000 세포/투여량, 400 내지 5000 세포/투여량, 5000 내지 6000 세포/투여량, 6000 내지 7000 세포/투여량, 7000 내지 8000 세포/투여량, 8000 내지 9000 세포/투여량, 9000 내지 10,000 세포/투여량, 10,000 내지 15,000 세포/투여량, 15,000 내지 20,000 세포/투여량, 20,000 내지 25,000 세포/투여량, 25,000 내지 30,000 세포/투여량, 30,000 내지 35,000 세포/투여량, 35,000 내지 40,000 세포/투여량, 40,000 내지 45,000 세포/투여량, 45,000 내지 50,000 세포/투여량, 50,000 내지 55,000 세포/투여량, 55,000 내지 60,000 세포/투여량, 60,000 내지 65,000 세포/투여량, 65,000 내지 70,000 세포/투여량, 70,000 내지 75,000 세포/투여량, 75,000 내지 80,000 세포/투여량, 80,000 내지 85,000 세포/투여량, 85,000 내지 90,000 세포/투여량, 90,000 내지 95,000 세포/투여량, 95,000 내지 100,000 세포/투여량, 100,000 내지 125,000 세포/투여량, 125,000 내지 150,000 세포/투여량, 150,000 내지 200,000 세포/투여량, 200,000 내지 250,000 세포/투여량, 250,000 내지 300,000 세포/투여량, 300,000 내지 350,000 세포/투여량, 350,000 내지 400,000 세포/투여량, 400,000 내지 450,000 세포/투여량, 450,000 내지 500,000 세포/투여량, 500,000 내지 550,000 세포/투여량, 550,000 내지 600,000 세포/투여량, 600,000 내지 650,000 세포/투여량, 650,000 내지 700,000 세포/투여량, 700,000 내지 750,000 세포/투여량, 750,000 내지 800,000 세포/투여량, 800,000 내지 850,000 세포/투여량, 850,000 내지 900,000 세포/투여량, 900,000 내지 950,000 세포/투여량, 950,000 내지 1,000,000 세포/투여량 또는 1000개의 세포 내지 최대 10x106개 세포/투여량 사이의 임의의 증분을 포함한다. 투여량은 물론 투여 빈도와 기간에 따라 달라질 수 있다. 대안적 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물의 세포 투여량은 예를 들어 0.5x106 세포/100 μl와 같은 작은 부피 중 다수의 세포를 포함한다. 세포 수는 혈구계, 분광광도계, Coulter 계수기, 유세포분석 등과 같은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 계수될 수 있다. 투여는 1회 투여될 수 있거나 다수의 치료 과정 동안 투여될 수 있다.
조성물은 또한 예를 들어, 미국 특허 제 7,585,517호에 기재된 바와 같은 경공막 전달을 포함하여 경공막 전달 또는 당업계에 공지된 임의의 방법 또는 프로토콜에 의하거나; 미국 특허 제 7,883,717호에 기재된 바와 같은 환자 안구 내부에 전달하기 위한 지연 방출 전달 장치에 의하거나; 미국 특허 제 5,378,475호 또는 제 5,466,233호에 기재된 바와 같은 안구의 유리체 영역 내 삽입을 위한 장치에 의하거나; 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제 20110112470호 또는 제 20100256597호 (환자의 안구로의 표적 투여를 위한 마이크로바늘 기재)에 기재된 바와 같은 피하 주사기 또는 경사 삽입 경로의 사용에 의하거나; 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제 20100209478호에 기재된 바와 같은 눈물샘을 통과하는 치수를 가진 친수성 중합체 하이드로겔에 의하거나; 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제 20100191176호에 기재된 바와 같은 인간 안구 내의 망막 하 공간에의 접근을 제공하는 장치에 의해 안구 (특히 유리체강 또는 망막 하 공간), 유리체강 또는 망막 하 공간, 망막, 뇌, 신경 또는 CNS로의 비경구 투여용으로 제형화 될 수 있다. 전방 천자를 또한 당업자에 의해 결정된 바와 같이 수행할 수 있다. 본 방법은 특히 유리체내 배치를 위해 절차 중 및/또는 후에 구체를 봉합할 필요가 없다. 그러나 이는 예를 들어 망막 하 공간에 세포를 배치하는 경우 유리체 절제술 절차를 이용하는 방법에 필요할 수 있다.
본 명세서에 개시된 조성물은 또한 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제 200500480021호에 기재된 바와 같이 다양한 주입 기술을 포함하고 또한 주입 경로에 의해 척수강내, 뇌내 경막외, 피하, 정맥내, 근육내 및/또는 동맥내 투여를 위해 제형화될 수 있다. 투여는 카테터 또는 펌프, 예를 들어 척수강내 펌프 또는 이식형 의료 장치를 사용하여 수행할 수 있다. 대안적 실시형태에서 방법은 또한 미국 특허 제 7,388,042호; 제 7,381,418호; 제 7,379,765호; 제7,361,332호; 제 7,351,423호; 제 6,886,568호; 제 5,270,192호; 및 미국 특허 출원 공개 제 20040127987호; 제20080119909호; 제 20080118549호; 제 20080020015호; 제 20070254005호; 제 20070059335호; 제 20060128015호에 기재된 것과 같이 본 명세서에 개시된 망막 전구 세포, 세포 집단 또는 조성물을 포함하는 이식체 및 인공 기관, 생물 반응기 시스템, 세포 배양 시스템, 플레이트, 접시, 튜브, 병 및 플라스크 등의 투여 또는 이식을 포함할 수 있다.
망막 전구 세포 또는 세포 집단을 포함하는 조성물은 선택적으로 하나 이상의 약물과 공동 투여될 수 있다. 약물의 비 제한적인 예는 항-혈관신생 제제 예컨대 안지오스타틴 (angiostatin), 아네코타브 아세테이트 (anecortave acetate), 트롬보스폰딘 (thrombospondin), VEGF 수용체 티로신 키나제 억제제 및 항-혈관 내피 성장 인자 (항-VEGF) 약물 예컨대 라니비주맙 (ranibizumab) 및 베바시주맙 (bevacizumab), 페갑타닙 (pegaptanib), 수니티닙 (sunitinib) 및 소라페닙 (sorafenib) 및 공지된 다양한 임의의 소분자 및 항-혈관신생 효과를 갖는 전사 억제제; 예컨대 아세트부톨롤 (acetbutolol), 아테놀롤 (atenolol), 비소프롤롤 (bisoprolol), 카베딜롤 (carvedilol), 아스몰롤 (asmolol), 라베탈롤 (labetalol), 나돌롤 (nadolol), 펜부톨롤 (penbutolol), 핀돌롤 (pindolol), 프로프라놀롤 (propranolol), 메티프로놀롤 (metipranolol), 베탁솔롤 (betaxolol), 카테올롤 (carteolol), 레보베탁솔롤 (levobetaxolol), 레보부놀롤 (levobunolol) 및 티몰롤 (timolol)과 같은 베타-차단제를 포함하여 아드레날린 길항제와 같은 녹내장 제제를 포함하는 공지된 안과 약물 종류; 에피네프린 (epinephrine), 디피베프린 (dipivefrin), 클로니딘 (clonidine), 아파클로니딘 (aparclonidine), 및 브리모니딘 (brimonidine)과 같은 아드레날린 작용제 또는 교감신경 흥분제; 피로카핀 (pilocarpine), 카바콜 (carbachol), 포스폴린 요오딘 (phospholine iodine), 및 피소스티그민 (physostigmine), 살리실레이트 (salicylate), 아세틸콜린 클로라이드 (acetylcholine chloride), 에세린 (eserine), 디이소프로필 플루오로포스페이트 (diisopropyl fluorophosphate), 데메카륨 브로마이드 (demecarium bromide)와 같은 부교감신경 흥분 또는 콜린성 작용제; 무스카린제 (muscarinics); 국소 및/또는 전신 제제를 포함하는 탄산무수화효소 억제제, 예를 들어 아세토졸라미드 (acetozolamide), 브린졸라미드 (brinzolamide), 도졸라미드 (dorzolamide) 및 메타졸라미드 (methazolamide), 에톡스졸라미드 (ethoxzolamide), 디아목스 (diamox), 및 디클로르펜아미드 (dichlorphenamide); 아트로핀 (atropine), 사이클로펜톨레이트 (cyclopentolate), 숙시닐콜린 (succinylcholine), 호마트로핀 (homatropine), 페닐레프린 (phenylephrine), 스코폴라민 (scopolamine) 및 트로피카미드 (tropicamide)와 같은 동공 확대 조절마비제; 프로스타글란딘 예컨대 프로스타글란딘 F2 알파, 항프로스타글란딘, 프로스타글란딘 전구체, 또는 프로스타글란딘 유사 제제 예컨대 비마토프로스트 (bimatoprost), 라타노프로스트 (latanoprost), 트라보프로스트 (travoprost) 및/또는 우노프로스톤 (unoprostone)을 포함할 수 있다.
또한 약물의 다른 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, 예를 들어 글루코코르티코이드 (glucocorticoid) 및 코르티코스테로이드 (corticosteroid) 예컨대 베타메타손 (betamethasone), 코르티손 (cortisone), 덱사메타손 (dexamethasone), 덱사메타손 21-포스페이트 (dexamethasone 21-phosphate), 메틸프레드니솔론 (methylprednisolone), 프레드니솔론 21-포스페이트 (prednisolone 21-phosphate), 프레드니솔론 아세테이트 (prednisolone acetate), 프레드니솔론 (prednisolone), 플루로오메톨론 (fluroometholone), 로테프레드놀 (loteprednol), 메드리손 (medrysone), 플루오시놀론 아세토니드 (fluocinolone acetonide), 트리암시놀론 아세토니드 (triamcinolone acetonide), 트리암시놀론 (triamcinolone), 트리암시놀론 아세토니드 (triamcinolone acetonide), 베클로메타손 (beclomethasone), 부데소니드 (budesonide), 플루니솔리드 (flunisolide), 플루오로메톨론 (fluorometholone), 플루티카손 (fluticasone), 플루드로코르티손 (fludrocortisone), 하이드로코르티손 (hydrocortisone), 하이드로코르티손 아세테이트 (hydrocortisone acetate), 로테프레드놀 (loteprednol), 리멕솔론 (rimexolone)을 포함하는 항염증제 및 예를 들어, 아스피린 (aspirin), 디클로페낙 (diclofenac), 플루르비프로펜 (flurbiprofen), 이부프로펜 (ibuprofen), 브롬페낙 (bromfenac), 네파페낙 (nepafenac), 및 케토롤락 (ketorolac), 살리실레이트 (salicylate), 인도메타신 (indomethacin), 낙소프렌 (naxopren), 피록시캄 (piroxicam) 및 나부메톤 디플루니살 (nabumetone diflunisal), 에토돌락 (etodolac), 페노프로펜 (fenoprofen), 플루르비프로펜 (flurbiprofen), 인도메타신 (indomethacine), 케토프로펜 (ketoprofen), 메클로페나메이트 (meclofenamate), 메페남산 (mefenamic acid), 멜록시캄 (meloxicam), 나부메톤 (nabumetone), 옥사프로진 (oxaprozin), 피록시캄 (piroxicam), 살살레이트 (salsalate), 술린닥 (sulindac) 및 톨메틴 (tolmetin)을 포함한 비스테로이드 항염증제; 셀레콕십 (celecoxib), 로페콕십 (rofecoxib) 및 발데콕십 (Valdecoxib)과 같은 COX-2 억제제; 예를 들어, 테트라시클린 (tetracycline), 클로르테트라시클린 (chlortetracycline), 바시트라신 (bacitracin), 네오마이신 (neomycin), 폴리믹신 (polymyxin), 그라미시딘 (gramicidin), 세팔렉신 (cephalexin), 옥시테트라시클린 (oxytetracycline), 클로람페니콜 (chloramphenicol), 리팜피신 (rifampicin), 시프로플록사신 (ciprofloxacin), 토브라마이신 (tobramycin), 젠타마이신, 에리트로마이신 (erythromycin), 페니실린 (penicillin), 술폰아미드 (sulfonamide), 술파디아진 (sulfadiazine), 술파세타미드 (sulfacetamide), 술파메티졸 (sulfamethizole), 술피속사졸 (sulfisoxazole), 니트로푸라존 (nitrofurazone), 소듐 프로피오네이트 (sodium propionate), 아미노글리코시드 (aminoglycoside) 예컨대 젠타마이신, 토브라마이신 (tobramycin), 아미카신 (amikacin) 및 스트렙토마이신 (streptomycin)을 포함한 항생제와 같은 항감염 또는 항미생물제; 플루오로퀴놀론 (fluoroquinolone) 예컨대 시프로플록사신 (ciprofloxacin), 가티플록사신 (gatifloxacin), 레보플록사신 (levofloxacin), 목시플록사신 (moxifloxacin), 노르플록사신 (norfloxacin), 오플록사신 (ofloxacin); 바시트라신 (bacitracin), 에리트로마이신 (erythromycin), 푸시드산 (fusidic acid), 네오마이신 (neomycin), 폴리믹신 B (polymyxin B), 그라미시딘 (gramicidin), 트리메토프림 (trimethoprim) 및 술파세타미드 (sulfacetamide); 항진균제 예컨대 암포테리신 B (amphotericin B), 카스포푼진 (caspofungin), 클로트리마졸 (clotrimazole), 플루코나졸 (fluconazole), 이트라코나졸 (itraconazole), 케토코나졸 (ketoconazole), 보리코나졸 (voriconazole), 테르비나핀 (terbinafine), 니스타틴 (nystatin) 및 미코나졸 (miconazole); 항-말라리아제 예컨대 클로로퀸 (chloroquine), 아토바쿠온 (atovaquone), 메플로퀸 (mefloquine), 프리마퀸 (primaquine), 퀴니딘 (quinidine) 및 퀴닌 (quinine); 항-미코박테리아제 예컨대 에탐부톨 (ethambutol), 이소니아지드 (isoniazid), 피라지나미드 (pyrazinamide), 리팜핀 (rifampin) 및 리파부틴 (rifabutin); 및/또는 항-기생충제 예컨대 알벤다졸 (albendazole), 메벤다졸 (mebendazole), 티오벤다졸 (thiobendazole), 메트로니다졸 (metronidazole), 피란텔 (pyrantel), 아토바쿠온 (atovaquone), 요오도퀴나올 (iodoquinaol), 이베멕틴 (ivermectin), 파로마이신 (paromycin), 프라지쿠안텔 (praziquantel), 및 트리마트렉세이트 (trimatrexate)를 포함할 수 있다.
약물의 다른 예는 또한 다음에 제한되는 것은 아니나, 항바이러스제 예컨대 이독수리딘 트리플루오로티미딘 (idoxuridine trifluorothymidine), 아사이클로비르 (acyclovir), 시도포비르 (cidofovir), 팜시클로비르 (famciclovir), 간사이클로비르 (gancyclovir), 발라사이클로비르 (valacyclovir), 발간시클로비르 (valganciclovir), 비다라빈 (vidarabine), 트리플루리딘 (trifluridine) 및 포스카르네트 (foscarnet); 프로테아제 억제제 예컨대 리토나비르 (ritonavir), 사퀴나비르 (saquinavir), 로피나비르 (lopinavir), 인디나비르 (indinavir), 아타자나비르 (atazanavir), 암프레나비르 (amprenavir) 및 넬피나비르 (nelfinavir); 뉴클레오타이드/뉴클레오사이드/비-뉴클레오사이드 역전사효소 억제제 예컨대 아바카비르 (abacavir), ddl, 3TC, d4T, ddC, 테노포비르 (tenofovir) 및 엠트리시타빈 (emtricitabine), 델라비르딘 (delavirdine), 에파비렌즈 (efavirenz) 및 네비라핀 (nevirapine); 다른 항바이러스 제제 예컨대 인터페론 (interferon), 리바비린 (ribavirin) 및 트리플루리디엔 (trifluridiene); 카바페넴 (cabapenem) 유사 에르타페넴 (ertapenem), 이미페넴 (imipenem) 및 메로페넴 (meropenem)을 포함하는 항-박테리아 제제; 세팔로스포린 (cephalosporin) 예컨대 세파드록실 (cefadroxil), 세파졸린 (cefazolin), 세프디니르 (cefdinir), 세프디토렌 (cefditoren), 세팔렉신 (cephalexin), 세파클로르 (cefaclor), 세페핌 (cefepime), 세포페라존 (cefoperazone), 세포탁심 (cefotaxime), 세포테탄 (cefotetan), 세폭시틴 (cefoxitin), 세프포독심 (cefpodoxime), 세프프로질 (cefprozil), 세프탁시딤 (ceftaxidime), 세프티부텐 (ceftibuten), 세프티족심 (ceftizoxime), 세프트리악손 (ceftriaxone), 세푸록심 (cefuroxime) 및 로라카르베프 (loracarbef); 다른 마크로라이드 (macrolide) 및 케토라이드 (ketolide) 예컨대 아지트로마이신 (azithromycin), 클라리트로마이신 (clarithromycin), 디리트로마이신 (dirithromycin) 및 텔리트로마이신 (telithromycin); 암목시크르린 (amoxicillin), 암피실린 (ampicillin), 피밤피클린 (pivampicillin), 디클록사실린 (dicloxacillin), 나프실린 (nafcillin), 옥사실린 (oxacillin), 피페라실린 (piperacillin), 및 티카실린 (ticarcillin)을 포함하는 페니실린 (penicillin) (클라불라네이트 (clavulanate) 함유 및 무함유); 테트라사이클린 (tetracycline) 예컨대 독시사이클린 (doxycycline), 미노사이클린 (minocycline) 및 테트라사이클린 (tetracycline); 및/또는 다른 항-박테리아제 예컨대 아즈트레오남 (aztreonam), 클로람페니콜 (chloramphenicol), 클린다마이신 (clindamycin), 리네졸리드 (linezolid), 니트로푸란토인 (nitrofurantoin) 및 반코마이신 (vancomycin)을 포함할 수 있다.
약물의 다른 예는 또한 다음에 제한되는 것은 아니나, 예를 들어, 소듐 크로모글리케이트 (sodium chromoglycate), 안타졸린 (antazoline), 메타피릴린 (methapyriline), 클로르페니라민 (chlorpheniramine), 세트리진 (cetrizine), 피릴라민 (pyrilamine), 프로펜피리다민 (prophenpyridamine); 알데슬레우킨 (aldesleukin), 아달리무맙 (adalimumab), 아자티오프린 (azathioprine), 바실릭시맙 (basiliximab), 다클리주맙 (daclizumab), 에타네르셉트 (etanercept), 하이드록시클로로퀸 (hydroxychloroquine), 인플릭시맙 (infliximab), 레플루노마이드 (leflunomide), 메토트렉세이트 (methotrexate), 마이코페놀레이트 모페틸 (mycophenolate mofetil), 및 술파살라진 (sulfasalazine)을 포함하는 면역 조절제, 예컨대 항알레르기제; 항-히스타민제 예컨대 아젤라스틴 (azelastine), 에메다스틴 (emedastine), 로라타딘 (loratadine), 데슬로라타딘 (desloratadine), 세티리진 (cetirizine), 디펜하이드라민 (diphenhydramine), 클로르페니라민 (chlorpheniramine), 덱스클로르페니라민 (dexchlorpheniramine), 클레마스틴 (clemastine), 사이프로헵타딘 (cyproheptadine), 펙소페나딘 (fexofenadine), 하이드록시진 (hydroxyzine), 프로메타진 (promethazine) 및 레보카바스틴 (levocabastine); 면역학적 약물 (예컨대 백신 및 면역 자극제); MAST 세포 안정화제 예컨대 크로몰린 소듐 (cromolyn sodium), 케토티펜 (ketotifen), 로독사미드 (lodoxamide), 네도크리밀 (nedocrimil), 올로파타딘 (olopatadine) 및 페미롤라스트실리아리체 절제제 (pemirolastciliary body ablative agent), 예컨대 젠티마이신 (gentimicin) 및 시도포비르 (cidofovir); 및 다른 안과 제제 예컨대 베르테포르핀 (verteporfin), 프로파라카인 (proparacaine), 테트라카인 (tetracaine), 사이클로스포린 (cyclosporine) 및 필로카르핀 (pilocarpine); 세포 표면 당단백질 수용체의 억제제; 데콘제스탄트 (decongestant) 예컨대 페닐레프린 (phenylephrine), 나파졸린 (naphazoline), 테트라하이드라졸린 (tetrahydrazoline); 지질 또는 혈압 강하 지질; 도파민성 작용제 및/또는 길항제 예컨대 퀸피롤 (quinpirole), 페놀도팜 (fenoldopam), 및 이보파민 (ibopamine); 혈관경련 억제제; 혈관확장제; 항고혈압제; 안지오텐신 (angiotensin) 포함 효소 (ACE) 억제제; 안지오텐신-1 수용체 길항제 예컨대 올메사르탄 (olmesartan); 미세소관 억제제; 분자 이동 (다이네인 (dynein) 및/또는 키네신 (kinesin)) 억제제; 액틴 (actin) 세포골격 조절제 예컨대 사익찰라신 (cyctchalasin), 라트룬쿨린 (latrunculin), 스윈홀라이드 A (swinholide A), 에타크린산 (ethacrynic acid), H-7, 및 Rho-키나제 (ROCK) 억제제; 리모델링 억제제; 세포외 매트릭스 조절제 예컨대 tert-부틸하이드로-퀴놀론 및 AL-3037A; 아데노신 수용체 작용제 및/또는 길항제 예컨대 N-6-사이클로펙실아데노신 및 (R)-페닐이소프로필아데노신; 세로토닌 (serotonin) 작용제; 호르몬제 예컨대 에스트로겐 (estrogen), 에스트라디올 (estradiol), 임신 전 호르몬, 프로게스테론 (progesterone), 인슐린, 칼시토닌 (calcitonin), 파라티로이드 호르몬 (parathyroid hormone), 펩타이드 및 바소프레신 (vasopressin) 시상하부 방출 인자; 예를 들어, 상피 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자, 전환 성장 인자 베타, 소마토트라핀 (somatotrapin), 피브로넥틴, 결합 조직 성장 인자, 골 형성 단백질 (BMP), 뇌 유래 신경영양 인자 (BDNF), 섬모 신경영양 인자 (CNTF), 신경교 세포주-유래 신경영양 인자 (GDNF), 인슐린-유사 성장 인자 (IGF), 및 신경 성장 인자 (NGF)를 포함하는 성장 인자 길항제 또는 성장 인자; 및/또는 사이토카인 (cytokine) 예컨대 인터루킨 (interleukin), CD44, 코클린 (cochlin), 오스테오폰틴 (osteopontin), 플레오트로핀 (pleotrophin), 미드카인, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 및 혈청 아밀로이드 (amyloid), 예컨대 혈청 아밀로이드 A를 포함할 수 있다.
다른 치료제는 다음에 제한되는 것은 아니나, 신경보호제 예컨대 루베졸 (lubezole), 니모디핀 (nimodipine) 및 관련 화합물, 및 혈류 강화제, 나트륨 채널 차단제, 글루타메이트 억제제 예컨대 메만틴 (memantine), 신경영양 인자, 산화질소 합성효소 억제제를 포함하는 관련 화합물; 유리 라디칼 스캐빈저 (scavenger) 또는 항산화제; 킬레이트화 화합물; 세포자멸사-관련 프로테아제 억제제; 새로운 단백질 합성을 감소시키는 화합물 ; 방사선요법제; 광영학 요법 제제; 유전자 요법 제제; 유전자 조절제; 및 안구 건조증 의약 예컨대 사이클로스포린 A, 완화제, 및 히알루론산나트륨; 알파 차단제 예컨대 독사조신 (doxazosin), 프라조신 (prazosin) 및 테라조신 (terazosin); 칼슘 채널 차단제 예컨대 암로디핀 (amlodipine), 베프리딜 (bepridil), 딜티아젬 (diltiazem), 펠로디핀 (felodipine), 이스라디핀 (isradipine), 니카르디핀 (nicardipine), 니페디핀 (nifedipine), 니솔디핀 (nisoldipine) 및 베라파밀 (verapamil); 다른 항고혈압제 예컨대 클로니딘 (clonidine), 디아족사이드 (diazoxide), 페놀도판 (fenoldopan), 하이드랄라진 (hydralazine), 미녹시딜 (minoxidil), 니트로프루사이드 (nitroprusside), 페녹시벤자민 (phenoxybenzamine), 에폽로스테놀 (epoprostenol), 톨라졸린 (tolazoline), 트렙로스티닐 (treprostinil) 및 니트레이트 기반 제제; 헤파린 (heparin) 및 헤파리노이드 (heparinoid) 예컨대 헤파린 (heparin), 달테파린 (dalteparin), 에녹사파린 (enoxaparin), 틴자파린 (tinzaparin) 및 폰다파리눅스 (fondaparinux)를 포함하는 항응고제; 다른 항-응고제 예컨대 히루딘 (hirudin), 아프로티닌 (aprotinin), 아르가트로반 (argatroban), 비발리루딘 (bivalirudin), 데시루딘 (desirudin), 레피루딘 (lepirudin), 와파린 (warfarin) 및 엑시멜라가트란 (ximelagatran); 및/또는 항-혈소판제 예컨대 아브식시맙 (abciximab), 클로피도그렐 (clopidogrel), 디피리다몰 (dipyridamole), 옵티피바타이드 (optifibatide), 티클로피딘 (ticlopidine) 및 티로피반 (tirofiban)을 포함할 수 있다.
다른 치료제는 다음에 제한되는 것은 아니나, 프로스타글란딘 PDE-5 억제제 및 다른 프로스타글란딘 제제 예컨대 알프로스타딜 (alprostadil), 카보프로스트 (carboprost), 실데나필 (sildenafil), 타달라필 (tadalafil) 및 바데나필 (vardenafil); 트롬빈 (thrombin) 억제제; 항혈전제; 항-혈소판 응집제; 혈전용해제 및/또는 피브린용해제 예컨대 알테플라제 (alteplase), 아니스트렙라제 (anistreplase), 레테플라제 (reteplase), 스트렙토키나제 (streptokinase), 테넥테플라제 (tenecteplase) 및 우로키나제 (urokinase); 항-증식제 예컨대 시롤리무스 (sirolimus), 타크롤리무스 (tacrolimus), 에베롤리무스 (everolimus), 조타롤리무스 (zotarolimus), 파클리탁셀 (paclitaxel) 및 미코페놀산 (mycophenolic acid); 레보티록신 (levothyroxine), 플루옥시메스트론 (fluoxymestrone), 메틸테스토스테론 (methyltestosterone), 난드롤론 (nandrolone), 옥산드롤론 (oxandrolone), 테스토스테론 (testosterone), 에스트라디올 (estradiol), 에스트론 (estrone), 에스트로피페이트 (estropipate), 클로미펜 (clomiphene), 고나도트로핀 (gonadotropin), 하이드록시프로게스테론 (hydroxyprogesterone), 레보노게스트렐 (levonorgestrel), 메드록시프로게스테론 (medroxyprogesterone), 메게스트롤 (megestrol), 미페프리스톤 (mifepristone), 노레틴드론 (norethindrone), 옥시토신 (oxytocin), 프로게스테론 (progesterone), 랄록시펜 (raloxifene) 및 타목시펜 (tamoxifen)을 포함하는 호르몬 관련 제제; 알킬화제 예컨대 카무스틴 로무스틴 (carmustine lomustine), 멜팔란 (melphalan), 시스플라틴 (cisplatin), 플루오로우라실3 (fluorouracil3), 및 프로카바진 (procarbazine) 항생제-유사 제제 예컨대 블레오마이신 (bleomycin), 다우노루비신 (daunorubicin), 독소루비신 (doxorubicin), 이다루비신 (idarubicin), 미토마이신 (mitomycin) 및 플리카마이신 (plicamycin); 항증식제 (예컨대 1,3-cis 레토노산 (retinoic acid), 5-플루오로우라실 (fluorouracil), 탁솔 (taxol), 라파마이신 (rapamycin), 미토마이신 C (mitomycin C) 및 시스플라틴 (cisplatin)을 포함하는 항-종양 제제; 대사길항제 예컨대 시타라빈 (cytarabine), 플루다라빈 (fludarabine), 하이드록시우레아 (hydroxyurea), 머캅토퓨린 (mercaptopurine) 및 5-플루로우라실 (5-FU); 면역 조절제 예컨대 알데슬레우킨 (aldesleukin), 이마티닙 (imatinib), 리툭시맙 (rituximab) 및 토시투모맙 (tositumomab); 유사분열 억제제 도세탁셀 (docetaxel), 에토포시드 (etoposide), 빈블라스틴 (vinblastine) 및 빈크리스틴 (vincristine); 방사성활성제 예컨대 스트론튬-89 (strontium-89); 및/또는 다른 항-종양 제제 예컨대 이리노테칸 (irinotecan), 토포테칸 (topotecan) 및 미토탄 (mitotane)을 포함할 수 있다.
RPC의 투여 및 치료 방법
또한, 세포 현탁액으로 제조되고 망막 질병 환자의 치료를 위한 동종이계 이식편으로 사용되는 배양 망막 전구 세포의 방법 및 용도가 본 명세서에서 제공된다. 예를 들어, 미성숙 포유류, 예를 들어 인간 망막으로부터의 배양된 이종 세포 집단의 사용을 포함하거나 이로 구성된 세포 기반 요법이 본 명세서에서 제공된다.
본 명세서에 기재된 세포 집단 및 관련 조성물은 다양한 상이한 수단에 의해 대상체 또는 환자에게 제공될 수 있다. 비 제한적인 예로서, 이는 예를 들어 실제 또는 잠재적 손상 또는 질병의 부위에 국소적으로 제공될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이는 가능한 또는 실제 손상 또는 질병 부위에 조성물을 주사하기 위해 주사기 또는 바늘을 사용하여 제공된다. 다른 실시형태에서, 이는 전신적으로, 예를 들어 정맥내 또는 동맥내로 혈류에 투여된다. 특정 투여 경로는 대부분 치료 또는 예방할 질병 또는 손상의 위치 및 특성에 따라 달라진다. 따라서, 본 명세서에 기재된 방법은 다음에 제한되는 것은 아니나, 안구내, 경구, 비경구, 정맥내, 동맥내, 비강내 및 근육내 투여를 포함하는 공지되고 이용 가능한 임의의 방법 또는 경로를 통해 세포 집단 또는 조성물을 제공하는 단계를 포함한다.
적절한 투여량 및 치료 요법의 결정은 당업계에 일반적으로 공지되고 의사에 의해 획득된 정보에 기초하여 쉽게 달성될 수 있다.
비제한적인 예로서, 세포 투여량은 약 0.3 내지 약 0.5x106개의 세포 (예를 들어, 0.3, 0.31, 0.32, 0.33, 0.34, 0.35, 0.36, 0.37, 0.38, 0.39, 0.4, 0.41, 0.42, 0.43, 0.44, 0.45, 0.46, 0.47, 0.48, 0.49, 또는 0.5x106개의 세포) 또는 0.5 내지 3x106개의 세포 (예를 들어, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 또는 3x106개의 세포)일 수 있다.
두 투여량 범위 사이에서 관찰된 효능 결과는 거의 유사하다. 그러나, 환자의 눈의 모양 소대(zonules)가 약해진 경우, 시력 축에서 지속되고 후방 수정체 캡슐에 달라붙고/거나 전방 (위-전방축농 (pseudo-hypopyon))으로 유입되는 세포의 더 많은 투여량 (예를 들어, 2 내지 9x106개의 세포)의 위험이 증가할 수 있다. 더욱이, 당업자는 이식편 생존 기간이 투여량 및 따라서 원래 이식편 크기에 비례할 수 있다는 것을 인식할 것이다.
유리체강에서 동종이계 hRPC의 투여 빈도가 중요할 것이다. 다양한 실시형태에서, 후속 투여 (즉, "재투여")는 환자의 동일한 안구 또는 다른쪽 안구에 이루어질 수 있다. 다수의 환자뿐만 아니라, 두 동물 모델에서 다른쪽 안구에 재투여하는 단계는 후속 면역 후유증 없이 수행되었으므로 (및, 예상컨대 동물에서 최대 3회 수행한 바와 같이 동일한 안구에서) 재투여가 양측에 잘 용인될 수 있음을 시사한다.
이식편은 RP 환자에서 1년 이상 생존할 수 있다. 그러나 약 1 내지 1.5년 후에 유리체에서 사라지는 경향이 있으므로 약 1 내지 2년의 기간 내에 재투여가 너무 공격적이지 않을 수 있으며 실제로 대부분의 경우에 미래 표준이 될 수 있음을 시사한다.
본 명세서에 개시된 임의의 방법에서, 치료는 단일 치료 또는 다회 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6회 이상) 치료를 포함할 수 있다. 특히, 예방 목적을 위해, 망막 손상을 잠재적으로 야기할 수 있는 스트레스 후에 정제된 세포 집단이 투여되는 것이 특정 실시형태에서 고려된다.
일 실시형태에서, 세포 집단 및 조성물은 대상체의 유리체강 또는 망막 하 공간에 단일 주사로서 국소 투여될 수 있다.
본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은 임의의 특정 작용 메커니즘에 의해 제한되지 않지만, 예시적인 작용 메커니즘은 확산 및/또는 영양 메커니즘이다. 증거는 발병 숙주 원추체의 영양 재프로그래밍 개념과 일치하며, 결과적으로 세포 세포자멸사 궤적에서 광 처리 능력의 재생으로 전환된다. 이는 직접적이거나 간접적일 수 있다. 다른 안구 조직의 관여는 배제되지 않는다. 이 메커니즘에 의해 유리체 또는 망막 하 공간에 태아 신경 망막 세포의 이종 혼합물 이식편이 배치될 수 있다.
유리체 배치는 확산 기반 치료 효과를 향상시킨다. 이 메커니즘은 태아 신경 망막 세포의 이종 혼합물의 이식편을 시각 축 외부에 배치하면서도 환자의 황반을 치료할 수 있다. 더욱이, 유리체 배치는 치료를 크게 단순화하는데 사용되며, 이는 이러한 예시적인 치료가 전 세계적으로 도움이 필요한 환자의 이용가용성을 증가시킬 수 있기 때문이다. 또한 유리체 배치는 혈관계에 멀리 떨어져 있어 면역 내성에 도움이 될 수 있다. 당업자는 유리체 배치가 망막 하 수술의 잠재적 합병증을 방지하고, 전신 마취의 위험을 방지하고, 망막에 천공 (망막절제) (망막 분리, 출혈의 위험을 높임)을 생성할 필요가 없고/거나, 환자의 망막에 초점 분리가 진행될 필요가 없음을 (초점 분리는 광수용체 손상 또는 손실, 망막 파열, 출혈, 전체 망막 분리로 이어질 수 있으며, RP에서 얇고 위축되고 부착된 망막의 분리가 어렵고/위험한 절차일 수 있음) 인식할 것이다.
일부 실시형태에서, 세포는 적합한 바늘 크기 및 길이를 사용하여 유리체강에 배치된다. 이상적으로, 주사기는 전달 효율을 높이고 주사기의 유지로 인한 산물 손실을 방지하기 위해 최소 (예를 들어, 1 마이크로리터)의 비사용 공간을 갖는다. 짧은 바늘 (예를 들어, 길이가 5/16 인치인 31G (게이지) 또는 길이가 ½ 인치인 30G)을 사용하면 최대한의 편리함을 획득할 수 있다 (즉, 임상 또는 사무실 환경에서 사용하기에 적합함). 그러나 더 긴 바늘 길이 (예를 들어, 5/8 인치 길이의 27G 또는 25G)를 사용하면 황반에 더 가까운 유리체의 추가 뒤쪽 (후면)에 최적의 배치 (작동 범위에서 사용됨)가 가능하다. 적절한 바늘 크기 및 길이의 결정은 당업자의 통상적인 수준 내에 있다. 적절한 바늘 크기 및 길이를 선택할 때 세포가 바늘을 통과한 후 세포 생존율이 필수 임계값 이상으로 유지되는 것이 중요하다.
전방 유리체 내에 세포를 배치하면 간단하며 최대의 안전과 편리함이 가능하다. 이와 달리, 후부 유리체 (후극부 근처)에 배치하려면 망막의 관통 손상을 방지하기 위해 바늘 끝을 직접 관찰할 수 있어야 한다. 그러나 이는 전반적인 치료 효과를 향상시킬 수 있으며 최적의 배치 및 효능을 나타낼 수 있다.
망막 세포 대체가 가능하지만 임상 효능을 위해 필요하지 않다. 마찬가지로, 공여체 세포가 망막으로 이동하는 것은 가능하지만 임상적 효능을 위해 필요하지는 않고; 망막 회로에 공여체 세포 혼입이 가능하지만 효능을 위해 필요하지 않고; 숙주 망막의 외부 핵층/황반으로의 공여체 세포 혼입이 가능하지만 효능을 위해 필요하지는 않고/거나; 망막으로의 공여체 세포 혼입이 가능하지만 지속적인 이식편 생존을 위해 필요하지 않다.
일부 실시형태에서, RPC 세포는 유리체강에 주사될 수 있으며, 선택적으로 유리체 절제술 또는 망막 하 수술이 필요하지 않다. 그러나, 일부 실시형태는 유리체 겔을 제거하고 후방 유리체 (예를 들어, 안구의 후극부에 근접한 최적의 위치)로의 주입 세포의 이동성 및 침투를 최적화하기 위해 유리체 절제술, 코어 유리체 절제술 및/또는 유리체 용해제 중 하나 이상의 선택적인 사용을 포함할 수 있다. 일부 경우에는 외과적 유리체 절제술을 사용하면 안구의 세포 배치가 향상될 수 있다.
세포는 또한 망막 하 공간에 이식 (예를 들어, 주사)될 수 있거나, 임의의 표준 안내 주사 절차를 사용하여, 예를 들어, 피하 또는 경사 삽입 경로를 사용하여 안구에 이식 (예를 들어, 주사)될 수 있다. 일부 실시형태에서, 망막 절제술 또는 안구내 가스 또는 실리콘 오일이 필요하지 않다.
대안적으로, 당업자에 의해 결정된 바와 같이, 상황에 따라 전방 천자를 선택적으로 수행할 수 있다. 일부 실시형태에서, 절차 동안 및/또는 후에 구체의 봉합이 필요하지 않다.
본 명세서에 개시된 임의의 방법은 대상체의 전신 면역 억제가 필요하지 않고 국소 마취 하에 조성물을 유리체강에 직접 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 추가로, 이식편의 조직 타이핑 및 환자 또는 대상체에 대한 매칭은 필요하지 않지만, 적절한 경우, 예를 들어 당업자에게 알려진 임의의 조직 타이핑 및 매칭 기술을 사용하여 수행될 수 있다.
주지된 바와 같이, 본 명세서에 기재된 임의의 방법에서, 국소 마취만이 사용될 수 있으며, 예를 들어 부위, 영역, 전신 마취가 사용되지 않는다. 그러나 일부 경우에는 부위, 영역 또는 전신 마취가 추가로 또는 대안적으로 투여 중에 사용될 수 있다. 본 명세서에 개시된 방법에 사용하기에 적합한 적합한 부위 마취제의 예는 제한 없이, 메프리카인 (mepricaine), 프로파라카인 (proparacaine), 프릴로카인 (prilocaine), 로피바카인 (ropivacaine), 벤조카인 (benzocaine), 부피바카인 (bupivacaine), 부탐벤 피크레이트 (butamben picrate), 클로르프로카인 (chlorprocaine), 코카인 (cocaine), 디부카인 (dibucaine), 디메티소퀸 (dimethisoquin), 디클로닌 (dyclonine), 에티도카인 (etidocaine), 헥실카인 켑타민 (hexylcaine, ketamine), 리도카인 (lidocaine), 메피바카인 (mepivacaine), 프라목신 (pramoxine), 프로카인 (procaine), 테트라카인 (tetracaine), 살리실레이트 및 이의 유도체, 에스테르, 염 및 혼합물을 포함한다.
특정 실시형태에서, 항염증 및/또는 면역 억제 (즉, 전신 면역 억제)가 필요하지 않다. 또한 임상 경험은 일부 경우에는 예를 들어 1년 이상을 포함하여 수개월에 걸쳐 이식편 생존이 관찰될 수 있기 때문에 필요하지 않다는 것을 뒷받침한다.
그러나, 필요한 경우, 수술 후 점적액으로서 항염증 및/또는 면역 억제 요법이 포함될 수 있다. 예를 들어, 환자는 주사 후 국소 스테로이드 점안액으로 치료할 수 있으며, 치료 후 지속적인 염증의 증거가 임상적으로 나타나는 경우 투여를 1주 동안, 대안적으로 최대 2주 후에 감소시킬 수 있다.
대안적인 실시형태에서, 수술 후 필수 침상 휴식(mandatory bed rest) 및/또는 "안면 숙이기" 자세 잡기가 필요하지 않다. 이러한 방법은 외래 환자 절차를 수행할 수 있으며 하룻밤 입원할 필요가 없다.
일부 실시형태에서, 투여 동안, 유리체 겔 내에 주사된 세포가 시력을 위한 망막의 가장 중요한 부분인 안구의 후극부쪽으로 침강되는 것을 최대화하기 위해 환자의 머리를 가능한 한 수평에 가깝게 기대어 앉은 자세로부터 뒤로 기울인다. 환자는 환자가 견딜 수 있는대로 약 30분 이상 동안 이러한 자세를 유지해야 한다. 또한 투여 후 환자는 집에서 등을 대고 올려다 보는 시간을 가져야 한다.
망막 질병 또는 병태, 예를 들어 어셔병 (Usher's disease), 색소성 망막염 (RP), 퇴행성 망막 질병, 연령 관련 황반 변성 (AMD), 습성 AMD 또는 건성 AMD, 지도모양 위축 (geographic atrophy), 망막 광수용체 질병, 당뇨병성 망막증, 낭포성 황반 부종, 포도막염, 망막 분리, 망막 손상, 황반원공, 황반 모세혈관확장증, 외상성 또는 의원성 망막 손상, 신경절 세포 또는 시신경 세포 질병, 녹내장 또는 시신경 병증, 허혈성 망막 질병, 예컨대 미숙아 망막 병증, 망막 혈관 폐색 또는 허혈성 시신경 병증의 치료, 완화 또는 예방; 또는 광순응 (주간) 시력 개선; 또는 시력 교정 개선, 또는 황반 기능 개선, 또는 시야 개선, 또는 암순응 (야간) 시력 개선을 위한 태아 신경 망막 세포 (예를 들어, 망막 전구 세포)의 이종 혼합물을 포함하거나 사용하는 임의의 조성물 및 방법이 본 명세서에 기재된다.
마찬가지로, 본 명세서에 기재된 임의의 조성물 또는 방법은 신속한 효과, 증가된 최상의 교정 시력, 개선된 황반 기능 및/또는 중심 주시를 보존 또는 회복할 가능성을 제공하기 위해 사용될 수 있다.
본 명세서에 개시된 임의의 조성물 및 방법을 사용하거나 실시하면 다양한 전신적 이점, 예를 들어, 일주기 리듬, 뇌하수체 기능, 호르몬 방출, 혈관 긴장 등에 대한 빛의 효과와 관련될 수 있는 신체 개선으로 인한 치료 개체의 외모 변화; 개선된 시각 능력; 개선된 보행 독립성; 개선된 웰빙 감각; 및/또는 개선된 일상 생활 활동이 발생한다.
대안적 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 임의의 조성물 및 방법을 사용하거나 실시하면 부적절한 세포 성장, 예를 들어 종양; 감염, 예를 들어 무 안구내염-임의의 안구내 절차의 위험; 질병 전파 (그러나 프리온 또는 광우병은 배제하기 어려울 수 있음); 포도막염 및/또는 급성 이식 거부; 안압 상승; 우각 폐색; 저안압; 망막 분리; 및/또는 혈관 신생의 발생을 초래하지 않는다.
본 명세서에 기재된 용도 및 방법은 다음에 제한되는 것은 아니나, 개선된 광순응 (주간) 시력, 증가된 최적 교정 시력, 개선된 황반 기능, 중심 주시의 보존 또는 회복, 개선된 시야, 암순응 (야간) 시력의 개선, 증가되거나 개선된 청각 감수성 및 다른쪽 안구의 시력 개선을 포함하여, 포유류 대상체에서 망막에서의 임상적으로 유의한 정도의 시각 기능을 빠르고 지속적으로 회복 및/또는 보존시킬 수 있다. 다른 변화에는 다양한 전신적 이점, 예를 들어, 일주기 리듬, 뇌하수체 기능, 호르몬 방출, 혈관 긴장에 대한 빛의 효과와 관련될 수 있는 체세포 개선으로 인한 외모의 변화; 개선된 시각 능력; 개선된 보행 독립성; 개선된 웰빙 감각; 및/또는 개선된 일상 생활 활동이 포함될 수 있다. 이러한 시력 변화는 당업계에 공지된 방법으로 측정할 수 있다.
시각적 이점은 빠를 수 있고 치료 후 첫 주 내에 발생할 수 있지만, 장기간에 걸쳐 점진적인 이점으로 발생할 수도 있다. 망막, 망막 회로, 또는 외부 핵층 또는 황반으로의 망막 세포 대체 및/또는 공여체 세포 이동이 발생할 수 있지만 임상 효능을 위해서는 필요하지 않고; 망막으로의 공여체 세포 이동이 가능하지만 임상적 효능을 위해 필요하지는 않다.
본 명세서에 개시된 망막 전구 세포 조성물을 사용한 치료로 인한 시력 개선을 포함한 시력 변화 측정은 다음에 제한되는 것은 아니나, 안저 검사, 최적 교정 시력 (BCVA), IOP, 세극등 검사, 플루오레세인 혈관 조영술 (FA), 광학 일관성 단층 촬영 (OCT), 입체 안저 사진, 망막 전위 촬영 (ERG), 원추체 깜빡임 망막 전위 촬영, 주변 측정법 (시야), 미세 주변 측정법, 암순응, 미로 탐색 기술, 안운동/안이동 반응, 동공 반응, 시각 유발 잠재력 (VIP), 및 적응 광학 스캐닝 레이저 검안경 검사 (AOSLO)를 포함하는 표준 안과 검사 기술을 사용하여 달성할 수 있다.
생체내 동물 데이터는 또한 유리체내 RPC가 다음에 제한되는 것은 아니나, 뮬러 세포 (망막 변성에서의 활성화 향상 및/또는 글루타민 합성효소의 증가된 국소 발현 (GS)); 당뇨병성 망막 병증의 혈관 구획 (혈관 투과성 (누출) 감소 및/또는 감소된 망막내 VEGF 수준에 기초한 허혈 감소); 망막 변성에서 대식세포의 강화된 집단; 망막 변성에서 bFGF (신경영양 인자)의 국소 발현 증가를 포함하는 발병 망막의 다수의 세포 유형에 영향을 미치는 수단이며; 카스파제3의 발현 감소는 감소함 (망막 세포 사멸 감소를 나타냄)을 시사하였다. 따라서 RPC의 투여는 다양한 다른 망막 질병, 장애 및 병태에서도 유용할 수 있다.
또한, 주사되지 않은 다른쪽 눈에서 효능의 표시와 관련하여 교차 치료 효과의 예비 증거가 관찰되었다. 특히, 이는 RCS 랫트 (광수용체의 조직학적 구조 및 ERG 기록) 및 또한 환자의 하위세트 (시력 검사)에서 관찰되었으며, 이는 주사된 안구의 경계 이상으로 확장할 수 있는 "체액" 치료 효과의 증거인 것으로 보인다. 이 효과는 혈액 순환, 면역 조절 또는 둘 모두를 통한 사이토카인 및/또는 엑소좀의 확산의 결과일 수 있다.
마찬가지로, 동물의 생체내 데이터는 오스테오폰틴 단백질 (OPN)의 단일 유리체내 주사가 단독으로 hRPC에 의해 제공되는 치료 효과의 전부는 아니지만 일부를 반복한다는 것을 시사한다. 그러나 단일 투여량의 플레이오트로핀 (pleiotrophin) (PTN) 및/또는 미드카인 (midkine)의 효과는 망막 세포 집단의 시점 및 특정 반응과 관련하여 OPN으로 관찰된 것과 상이하다.
동물에서의 생체내 데이터는 또한 RPC-유래 엑소좀의 단일 유리체내 주사가 hRPC에 의해 제공되는 치료 효과를 어느 정도 반복한다는 것을 시사한다.
키트 및 지침
또한, 본 명세서에 개시된 임의의 방법 (예를 들어, 망막 질병 또는 병태의 치료, 태아 신경 망막 세포의 이종 혼합물의 생성 또는 단리)에 사용하기에 적합한 본 명세서에 기재된 임의의 조성물 (예를 들어, 태아 신경 망막 세포의 이종 혼합물)을 포함하고 이를 사용하기 위한 지침을 포함하는 키트가 제공된다. 또한, 조성물, 제조 산물, 또는 세포의 혼합물 또는 배양물 (예를 들어, 태아 신경 망막 세포의 이종 혼합물)을 포함하는 키트가 제공되며, 선택적으로 키트는 본 명세서에 기재된 임의의 방법을 실시하기 위한 지침을 추가로 포함한다.
키트는 또한 배양되거나 새로 제조되거나 동결된 세포로 제공되거나, 대상체에게 투여하기 위한 조성물로 제형화되었는지에 관계없이 본 명세서에 기재된 포유류 망막 전구 세포를 포함하는 세포 집단을 포함할 수 있다. 마찬가지로, 키트는 본 명세서에 기재된 임의의 방법을 실시하기 위한 지침을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 키트는 본 명세서에 기재된 망막 전구 세포의 하나 이상의 마커 (예를 들어, 항체 또는 올리고뉴클레오타이드 프라이머)에 결합하는 제제 및/또는 기초 또는 조건화된 배지를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 적합한 키트는 다음을 포함할 수 있다: 하나 이상의 마커에 특이적인 항체를 포함하는 제1 용기로서, 상기 항체는 예를 들어 형광 마커 또는 자기 비드에 접합됨으로써 단리 또는 검출에 적합한 것인 용기; 및 기초 또는 조건화된 배지를 포함하는 제2 용기. 키트는 세포 배양 배지, 세포외 매트릭스-코팅된 세포 배양 접시 및/또는 조직 처리에 적합한 효소와 같은 본 명세서에 제공된 세포 집단의 제조에 유용한 하나 이상의 추가 시약을 추가로 포함할 수 있다. 키트는 또한 조직 샘플로부터 획득된 망막 전구 세포 또는 세포 집단을 단리, 정제 및/또는 확장하기 위한 사용에 관한 지침을 포함할 수 있다. 마찬가지로, 키트는 환자 또는 공여체로부터 조직 샘플을 획득하기 위한 수단 및/또는 획득된 조직 샘플을 저장하기 위한 용기를 추가로 포함할 수 있다.
수의학적 적용
본 명세서에 기재된 임의의 조성물 및 방법은 또한 수의학 적용을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 고양이 RPC의 성장, 영양 장애 고양이 및 기타 동물, 예를 들어, 임의의 포유류 애완동물, 일반적인 가축 및 희귀 야생 포유류 종, 동물원 동물, 농장 동물, 스포츠 (예를 들어, 경주용 개 또는 말) 동물 등의 망막에 대한 치료적 적용.
광범위한 근친 교배의 결과로 실명을 유발하는 유전자를 보유한 가축이 많이 있다. 여기에는 고양이, 개, 및 말, 및 예상컨대 다른 종들이 포함되었다.
마찬가지로, 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법을 사용한 치료로부터 이익을 얻을 야생 동물 및 가축에서 발생하는 망막 질병 및 손상이 존재한다.
제조, 이식체 및 인공 기관 산물
또한 태아 신경 망막 세포의 이종 혼합물을 포함하는 본 명세서에 기재된 조성물 중 하나 초과를 포함하는 이식체 및 인공 기관, 생물반응기 시스템, 세포 배양 시스템, 플레이트, 접시, 튜브, 병 및 플라스크 등이 제공된다.
비 제한적인 예로서, 태아 신경 망막 세포의 이종 혼합물을 포함하는 생물반응기, 이식체, 스텐트, 인공 기관 또는 유사한 장치; 예를 들어, 미국 특허 제 7,388,042호; 제 7,381,418호; 제 7,379,765호; 제 7,361,332호; 제 7,351,423호; 제 6,886,568호; 제 5,270,192호; 및 미국 특허 출원 공개 제 20040127987호; 제 20080119909호 (청각 이식체 기재); 제 20080118549호 (안구 이식체 기재); 제 20080020015호 (생활성 상처 드레싱 기재); 제 20070254005호 (심장 판막 생체 보철물, 혈관 이식편, 반월판 이식체 기재); 제 20070059335호; 제 20060128015호 (간 이식체 기재)에 기재된 바와 같거나 이와 유사한 이식체가 추가로 제공된다.
열거된 실시형태
본 발명은 다음의 열거된 예시적인 실시형태를 참조하여 규정될 수 있다:
1. a) 약 12주 내지 약 28주 재태 기간의 인간 공여체로부터 인간 망막 조직의 획득된 샘플을 처리하는 단계,
b) 획득된 샘플을 기계적으로 분리하는 단계,
c) 샘플로부터 획득된 1차 망막 세포의 생존율 및 양을 결정하는 단계, 및
d) 획득된 1차 망막 세포의 형태를 확인하여 세포 및 세포 덩어리의 분리된 현탁액을 생성하는 단계
에 의해 인간 샘플로부터 획득된 1차 망막 세포를 단리하는 방법.
2. 실시형태 1에 있어서, 인간 망막 조직은 하나 또는 한 쌍의 인간 안구로부터 획득되는, 방법.
3. 실시형태 2에 있어서, 안구(들)는 온전한 구체, 투명한 각막, 정상 모양, 또는 이의 임의의 조합을 포함한 정상 형태를 갖는, 방법.
4. 실시형태 1에 있어서, 인간 망막 조직은 L-글루타민이 포함된 RPMI-1640 배지에 저장되고, 인간 공여체로부터의 조직 수확 직후 빙냉 저장되는, 방법.
5. 실시형태 1 내지 4 중 어느 한 실시형태에 있어서, 저장된 인간 망막 조직은 수확 후 소정의 기간 내에 전달 및 사용되는, 방법.
6. 실시형태 5에 있어서, 소정의 기간은 약 7 내지 약 26시간을 포함하는, 방법.
7. 실시형태 1에 있어서, 단계 (a)는
a) 조직 수확 후, RPMI-1640 배지로부터 안구(들)를 제거하고, 항생제가 보충된 빙냉 인산염 완충 식염수 (PBS)로 1 내지 5회 세정되는 단계,
b) 모든 안구외 세포를 제거하기 위해 안구로부터 시신경 및 중간엽 조직을 제거하는 단계,
c) 항생제가 보충된 빙냉 PBS로 안구를 세척하는 단계,
d) 바늘을 사용하여 윤부에서 구체를 천공하는 단계,
e) 미세 수술 가위로 윤부를 따라 원주 방향으로 절단하는 단계,
f) 수정체, 각막 및 결합 유리체를 제거하는 단계,
g) 망막 색소 상피 (RPE) 층으로부터 망막(들)을 분리하여 단리된 망막을 생성하는 단계,
h) 단리된 망막(들)을 항생제가 보충된 빙냉 배지 또는 PBS를 포함하는 페트리 접시에 배치하는 단계
를 포함하는, 방법.
8. 실시형태 1에 있어서, 단계 (b)는
a) 망막(들)을 원뿔형 튜브로 옮기는 단계,
b) 망막(들)을 기계적으로 분리하여 분리된 망막을 생성하는 단계,
c) 항생제가 보충된 무 혈청 배지로 페트리 접시를 세척하고, 임의의 잔여 분리 망막을 포함하는 배지를 분리된 망막(들)을 포함하는 원뿔형 튜브에 옮기는 단계,
d) 원심분리를 통해 분리된 망막(들)을 펠릿화하는 단계, 및
e) 상청액을 제거하는 단계
에 의해 단계 (a)에서 획득된 망막(들)을 기계적으로 분리하는 단계를 포함하는, 방법.
9. 실시형태 8에 있어서, 망막의 기계적 분리는 멸균 피펫에 의한 분쇄를 통해 수행되는, 방법.
10. 실시형태 8에 있어서, 분리된 망막은 0 내지 30분 동안 1 내지 50℃에서 10 내지 1000 g의 원심분리를 통해 펠릿화되는, 방법.
11. 실시형태 1에 있어서, 단계 (c)는
a) 빙냉 항생제가 보충된 무 혈청 배지에서 단계 (b)로부터 펠릿화된 망막 조직을 재현탁하는 단계,
b) 망막 조직의 기계적 분리로부터 획득된 망막 세포 및 망막 세포 덩어리의 양 및 생존율을 결정하는 단계,
c) 항생제가 보충된 무 혈청 배지를 포함하는 피브로넥틴 코팅 세포 배양 플라스크에 세포를 시딩하는 단계,
d) 망막 세포 포함 플라스크를 10 내지 50℃에서 인큐베이션하는 단계
를 포함하는, 방법.
12. 실시형태 11에 있어서, 세포의 양 및 생존율은 NC-200 세포 계수기에 의해 측정되는, 방법.
13. 실시형태 11에 있어서, 계수된 세포 수는 약 1 내지 약 1,000,000,000개인, 방법.
14. 실시형태 11에 있어서, 계수된 생존가능한 세포의 백분율은 약 10 내지 약 100인, 방법.
15. 실시형태 11에 있어서, 플라스크는 약 1 내지 약 1,000,000,000개의 세포로 시딩되는, 방법.
16. 실시형태 11에 있어서, 망막 세포 포함 플라스크의 인큐베이션은 37℃에서 0 내지 30% CO2 및 0 내지 50% O2 하에 이루어지는, 방법.
17. 실시형태 1에 있어서, 단계 (d)는 세포 배양 플라스크에 시딩된 망막 세포가 약 1 내지 약 100개의 세포를 포함하는 망막 세포 덩어리로 구성되었는지를 확인하는 단계를 포함하는, 방법.
18. 실시형태 1 내지 17 중 어느 한 실시형태에 있어서, PBS 또는 무혈청 배지를 보충하는데 사용되는 항생제는 젠타마이신인, 방법.
19. 실시형태 1 내지 18 중 어느 한 실시형태에 있어서, 항생제는 약 0 내지 약 10,000 μg/mL의 농도에서 사용되는, 방법.
20. 실시형태 1 내지 19 중 어느 한 실시형태에 있어서, 무혈청 배지는
a) 고급 DMEM/F12,
b) N-2 보충제,
c) EGF (재조합 인간 상피 성장 인자),
d) bFGF (염기성 섬유아세포 성장 인자), 및
e) GlutaMAX I
을 포함하는, 방법.
21. 단리된 1차 인간 망막 세포를 배양하여 비-불멸 인간 망막 전구 세포 집단을 생성하는 방법으로서,
a) 약 4 내지 6회의 계대배양 동안 표준 산소 수준에서 이종 무함유 피브로넥틴, 오르니틴, 폴리리신, 또는 라미닌으로 코팅된 배양 플라스크 또는 플레이트 내 무혈청 배지에 단리된 1차 망막 세포의 현탁액을 배양하는 단계,
b) 그 후 추가의 3 내지 6회의 계대배양 동안 저산소 수준에서 무혈청 배지에 현탁액을 배양하는 단계로서, 세포는 40% 내지 90% 컨플루언스에서 계대배양되고, 각각의 계대배양 시 효소로 처리하여, 세포를 분리하고, 새로운 배양 배지를 첨가하는 단계, 및
c) 그 후 세포를 저온보존하여, 비-불멸 인간 망막 전구 세포의 집단을 제조하는 단계를 포함하는, 방법.
22. 실시형태 21에 있어서, 저산소 수준에서 현탁액의 후속 배양 후에, 세포를 표준 산소 수준에서 일정 시간 동안 계대배양 없이 성장시키는, 방법.
23. 실시형태 21에 있어서, 계대배양 사이의 기간은 3 내지 5일인, 방법.
24. 실시형태 21에 있어서, 세포를 분리하는데 사용되는 효소 용액은 트립신 또는 균등물을 포함하는, 방법.
25. 실시형태 21에 있어서, 세포는 제1 계대배양 시 6 내지 10분 동안 37℃에서 약 1:4 비율의 트립신 또는 균등물, 및 EDTA를 포함하는 효소 용액을 사용하여 분리되는, 방법.
26. 실시형태 21에 있어서, 세포는 계대배양 2에서 4 내지 8분 동안 37℃에서 1:1:3 비율의 트립신 또는 균등물, 및 DPBS를 포함하는 효소 용액을 사용하여 분리되는, 방법.
27. 실시형태 21에 있어서, 세포는 계대배양 3 및 모든 추가 계대배양에서 4 내지 8분 동안 37℃에서 1:1 비율의 트립신 또는 균등물, EDTA, 및 DPBS를 포함하는 효소 용액을 사용하여 분리되는, 방법.
28. 실시형태 21에 있어서, 분리는 과량의 DMEM 또는 PBS의 첨가에 의해 중지되는, 방법.
29. 실시형태 21에 있어서, 세포 수 및 생존율은 분리 후 결정되는, 방법.
30. 실시형태 21에 있어서, 세포 수 및 생존율은 NC-200 세포 계수기에 의해 결정되는, 방법.
31. 실시형태 21에 있어서, 단계 (c)의 저온보존은
a) 1:1 트립신 또는 균등물, 및 DPBS를 사용하여 세포를 효소에 의해 분리하는 단계,
b) 과량의 DMEM 또는 PBS로 분리를 중지시키는 단계,
c) 10 내지 10,000 g에서 1 내지 30분 동안 원심분리를 통해 세포를 펠릿화하는 단계,
d) 무혈청 배지에서 세포를 재현탁하고 총 세포 수 및 생존율을 결정하는 단계,
e) 저온보존 배지를 첨가하여 최종 DMSO 농도가 5 내지 30%가 되도록 하는 단계,
f) 0.2 내지 100 x 106개의 세포를 각각의 저온 바이알로 분취하는 단계,
g) -80℃에서 6 내지 72시간 동안 각 바이알을 동결하는 단계, 및
h) 액체 N2 중에 각 바이알의 세포를 배치하는 단계
에 의해 수행되는, 방법.
32. 실시형태 21에 있어서, 세포 및/또는 세포 덩어리는 세포 생존 또는 성장을 지원하는 보충제 또는 첨가제와 함께 배양되는, 방법.
33. 실시형태 32에 있어서, 세포 생존 또는 성장을 지원하는 보충제 또는 첨가제는 L-글루타민, EGF 및 bFGF (Invitrogen)로 이루어진 인간 재조합 성장 인자, 및 다른 성장 인자로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
실시예
실시예 1: 1차 망막 세포의 단리: 프로토콜 A
1차 인간 망막 세포의 단리를 조직 수확 시점으로부터 공여체 조직이 수령된 시점까지의 수송 간격을 측정하는 경우 4.5 내지 21.5시간 수송 간격에 대해 특별히 최적화된 프로토콜에 따라 수행하였다.
1. 17 내지 18주 재태 기간 사이의 태아로부터, L 글루타민 (BioWhittaker)이 포함된 RPMI-1640 배지가 포함된 15 ml 튜브에 하나 또는 한 쌍의 안구를 4.5 내지 21.5시간 이내에 빙냉 수송 및 전달한다. 수령시 안구(들)에 중대한 이상이 있는지 검사한다: 구체는 온전하고, 각막은 투명하고, 안구는 정상 모양이어야 한다.
단계 2 내지 8은 멸균 기술을 사용하여 층류 후드에서 수행한다.
2. 항생제를 포함하는 40 ml 저온 PBS (50 ml 튜브)로 안구 전체를 3회 (3개의 다른 튜브) 세정한다.
3. 시신경 및 잔여 중간엽 조직을 제거하였다. 이 접근법은 뇌 유래 세포로 망막 단리물의 가능한 오염을 방지하기 위해 적용된다. 항생제를 포함하는 저온 PBS로 1회 추가로 세정한다.
4. 해부 현미경 하에서 255/8 바늘이 달린 1 ml 주사기를 사용하여 윤부 전체에 천공을 생성하고, 미세 수술 가위를 사용하여 윤부를 따라 절단하여 안구를 원주 방향으로 개방하고, 각막, 수정체 및 결합 유리체를 제거한다. 망막을 RPE로부터 조심스럽게 분리하여 약 2 ml 저온 DMEM/F12를 포함하는 작은 페트리 접시로 수확한다.
5. 페트리 접시에 1 mL 팁을 사용하여 망막을 작은 조각으로 힘껏 파괴하고 (2 내지 5회), 15 mL 저온 원뿔형 바닥 튜브로 옮기고, 페트리 접시를 1 mL 저온 PBS로 2 내지 3회 세정하고 15 mL 튜브에 첨가하고, 1000 rpm (179 xg)에서 5분 동안 스핀 다운시키고, 10 mL 피펫 및 광택 유리 피펫으로 상청액을 완전히 제거한다.
6. 0.8 mL의 희석되지 않은 TrypLE Express (Invitrogen)를 실온에서 40초 동안 첨가하고, 1 mL 팁을 사용하여 부드럽게 서서히 피펫팅하고 (약 10회), 중화된 TrypLE Express에 10 mL의 저온의 새로운 배지 (무혈청)를 첨가하고 1000 rpm (179 g) x 4분 동안 스핀 다운하고, 상청액을 제거하고, 1.5 ml의 저온의 새로운 배지 (SM)를 사용하여 펠릿을 재현탁하고, 광택 유리 피펫을 사용하여 약 10회 피펫팅하고, 추가로 6.5 mL의 배지를 첨가하고, 세포 생존율 및 세포 수를 트리판 블루 (Trypan Blue) (Invitrogen) 염색에 의해 결정하고, Countess (Invitrogen) 또는 수동으로 계산하고, 약 1.3 x 106 세포/ml, 약 92%가 생존하고, 약 10 x 106 세포 덩어리/전체, 약 80%는 소형/중형 덩어리이다. 세포를 피브로넥틴 (실시예 5 참조)으로 코팅된 2 T75에 시딩한 후 37℃에서 5% CO2, 3% 또는 20% O2 하에서 인큐베이션한다 (선택적으로 37℃, 5% 내지 10% CO2, 1% 내지 20% O2 인큐베이션).
참고: 규정된 세포 수.
· 단일 세포: 약 6 내지 8um, 1개의 세포 포함.
· 작은 덩어리: 약 15 내지 40 um, 약 2 내지 30개의 세포 포함.
· 중간 덩어리: 약 40 내지 100 um, 약 30 내지 80개의 세포 포함.
· 대형 덩어리: 약 100 내지 150 um, 80개 초과의 세포 포함.
생성된 세포 집단에서: 약 80 내지 90%는 소형 또는 중형 덩어리이고, 약 9 내지 18%는 단일 세포이고, 약 1 내지 2%는 대형 덩어리이다.
소형/중형 덩어리를 "1"로 계산하면 경우 총 세포 수는 약 10 x 106이다.
단일 세포를 "1"로 계산하면 총 세포 수는 약 240 x 106이다.
7. 전체 절차: 45분 내지 1시간 10분. (선택적으로 2시간 이내).
8. 약 1.5시간 후, 90% 세포가 바닥에 침강되었고 (조직이 새로운 것, 예컨대 4.5시간 빙냉 수송되는 경우, 그렇지 않은 경우, 예컨대 21.5시간 빙냉 수송되는 경우, 약 6시간째에 바닥에 침강됨), 90%는 소형 덩어리이고 10%는 단일 세포이다. 일반적으로 90%는 생존하고 (양호), 세포 밀도는 10% 초과의 컨플루언스이고 (약 20%가 더 우수함), 이는 IncuCyte에 의해 평가된 바와 같다. 사진을 촬영한다.
실시예 2: 1차 망막 세포의 단리: 프로토콜 B
1차 인간 망막 세포의 단리를 조직 수확 시점으로부터 공여체 조직이 수령된 시점까지의 수송 간격을 측정하는 경우 7 내지 26시간 수송 간격에 대해 특별히 최적화된 프로토콜에 따라 수행하였다.
1. 17 내지 20주 재태 기간 태아 조직 제공으로부터, L 글루타민 (BioWhittaker)이 포함된 RPMI-1640 배지가 포함된 15 ml 튜브에 하나 또는 한 쌍의 안구를 7 내지 26시간 이내에 빙냉 수송 및 전달한다. 이 프로토콜은 더 광범위한 수송 기간에서도 작동할 수 있다. 수령시 안구(들)에 중대한 이상이 있는지 검사한다: 구체는 온전하고, 각막은 투명하고, 안구는 정상 모양이어야 한다. 잠재적 조직 오염을 방지하기 위해 50 μg/mL의 젠타마이신을 RPMI-1640 및 L 글루타민 수송 배지에 첨가한다.
단계 2 내지 8은 멸균 기술을 사용하여 층류 생물안전 캐비닛에서 수행한다.
2. 항생제를 포함하는 40 ml 저온 PBS (50 ml 튜브)로 안구 전체를 3회 (3개의 다른 튜브) 세정한다. 30 μg/mL의 젠타마이신을 사용한다. 항생제 알레르기가 있는 환자가 배제되는 것을 방지하기 위해 페니실린 또는 스트렙토마이신 대신 젠타마이신을 사용한다.
3. 시신경 및 잔여 중간엽 조직을 안구(들)로부터 제거하여 망막 단리물이 안구외 세포로 오염될 가능성을 방지한다. 항생제를 포함하는 저온 PBS로 1회 추가로 세정한다.
4. 해부 현미경 하에서 255/8 바늘이 달린 1 ml 주사기를 사용하여 윤부 구체에 천공을 생성하고, 미세 수술 가위를 사용하여 윤부를 따라 절단하여 안구를 원주 방향으로 개방하고, 각막, 수정체 및 결합 유리체를 제거하여 폐기한다. 망막을 RPE 층으로부터 조심스럽게 분리하여 젠타마이신 (젠타마이신 30μg/ml)이 포함된 약 2 ml 저온 완전 배지를 포함하는 작은 페트리 접시로 옮긴다.
5. 망막을 15 mL 원뿔형 튜브로 옮긴다. 1 mL 팁에 의해 부드러운 분쇄를 사용하여 망막을 작은 조각으로 파괴한다 (4 내지 8회). 페트리 접시에 잔여 망막 조직이 있는 경우 젠타마이신이 포함된 저온 완전 배지 1 mL를 사용하여 접시를 1 내지 2회 세정하고 망막 조직이 포함된 15 ml 튜브에 첨가한다. 15 mL 튜브를 원심분리기로 옮기고, 140 xg에서 4℃에서 3분 동안 스핀 다운하고, 흡인하고 상청액을 완전히 제거한다.
6. 1 mL 팁, 피펫을 사용하여 젠타마이신이 포함된 1.0 mL 저온의 새로운 배지에 펠릿을 다시 재현탁하고, 현탁액을 4 내지 5회 부드럽게 피펫팅하고 추가로 15 mL 배지를 첨가한다. 세포 생존율과 세포 수를 응집 세포 계수 방법을 사용하여 NC-200을 통해 결정한다. 이 방법은 초기 세포 배양에 중요할 수 있는 세포 덩어리를 유지하고 조직을 세포로 형질전환시키면서 정확한 세포 수를 획득할 수 있다. 세포 생존율은 68 내지 85% 범위 내일 것으로 예상되며, 생존 세포 수는 약 73 내지 147 x 106일 것으로 예상된다. 세포를 이전에 피브로넥틴으로 코팅된 3 x T25 (또는 1 내지 2 T75) 플라스크에 시딩한 후 (실시예 5 참조), 37℃에서 5% CO2, 20% O2 하에 인큐베이션한다. (참고: 20%는 1 단계: 조직에서 시딩 은행까지를 위한 것이다: 저산소 조건에서도 수행할 수 있다. 그러나 여기서 목적은 새로운 산물을 20% 산소 미만에서 성장시킨 이전 산물에 최대한 가깝게 유지하는 것이었다. 세포 증식을 연장시키기 위해 2 단계: 시딩 은행에서 생성 은행까지는 저산소 3% 배양을 사용함).
7. 현미경으로 세포를 확인한다: 배양물은 주로 소형 내지 중형 크기의 덩어리와 일부 단일 세포로 구성될 것으로 예상된다 (후자는 생존 불가능할 가능성이 더 높음).
8. 전체 단리 절차 기간: 약 30 내지 60분 (이 프로토콜은 특히 효소를 생략하는 것이 효소 기반 단리 프로토콜보다 수행하기가 훨씬 빠르고 더 간단함).
실시예 3: 세포 배양: 프로토콜 A
실시예 1에 기재된 방법으로부터 단리된 망막 세포로부터 인간 망막 전구 세포를 배양하였다:
1. 배지 교체: 2일마다 90% 배지 교체.
2. 계대배양: 세포를 TrypLE Express (Invitrogen), 선택적으로 트립신 또는 균등물, 또는 TRYP-LE EXPRESS 또는 균등물, 2배 희석 (0.125% 균등물)에 의해 60 내지 80%, 선택적으로 40 내지 90% 컨플루언스에서 계대배양하고, 5 내지 6분 동안 37℃에서 인큐베이션한다. 오래된 배지 또는 저온 PBS 10 ml를 첨가하여 분리를 중지시킨다. 세포 생존율 및 세포 수를 트리판 블루 (Invitrogen) 염색에 의해 결정하고 Countess (Invitrogen) 또는 수동으로 계산하고, 세포 생존율은 90% 초과이다. 밀도 1 내지 6.7x104/cm2 (초기 계대배양 6.7x104 덩어리/cm2), 후기 계대배양: 2x104/cm2)에서 새로운 피브로넥틴 코팅 플라스크/플레이트에 세포를 시딩한다.
3. 세포 동결: 세포를 TrypLE Express (Invitrogen), 선택적으로 트립신 또는 균등물, 또는 TRYP-LE EXPRESS 또는 균등물, 2배 희석 (0.125% 균등물)에 의해 수확하고, 5 내지 6분 동안 37℃에서 인큐베이션한다. 오래된 배지 또는 저온 PBS 10ml를 첨가하여 분리를 중지시킨다. 1000 rpm (179xg) 5분 동안 스핀 다운하고 새로운 배지 또는 저온 PBS에 세포를 재현탁한다. 세포 생존율 및 세포 수를 트리판 블루 (Invitrogen) 염색에 의해 결정하고 Countess (Invitrogen) 또는 수동으로 계산한다. 1000 rpm (179 xg), 5분 동안 스핀 다운하고 세포 동결 배지에 세포를 재현탁하고 각 저온 바이알 (Greiner)에 0.5-5 x 106개의 세포를 분취한다. 1℃ 저온 동결 용기 (NALGENE)에 배치하고 -80℃ 냉동고에 밤새 (또는 그 이상, 2주 미만) 배치하고 액체 질소 탱크로 옮긴다.
4. 세포 해동: 세포를 액체 질소에서 꺼내어 결정이 사라질 때까지 2 내지 3분 동안 37C 수조에 방치하고, 1 ml 팁으로 즉시 저온 15 ml 원뿔형 바닥 튜브 1개로 옮기고, 저온의 새로운 배지로 바이알을 2회 세정하고 저온의 새로운 배지 12 ml를 15 ml 튜브에 서서히 첨가하고 첫 번째 1 ml를 적가하고 서서히 흔든다. 800 rpm (115 g)에서 3분 동안 스핀 다운한다. 상청액을 따라 내고, 새로운 배지에서 세포 펠릿을 재현탁하고, 상기에 기재된 바와 같이 세포 수와 생존율을 결정한다. 새로운 코팅된 플라스크에 시딩하고 상기에 기재된 조건에서 인큐베이션한다.
5. 이식을 위한 세포 제조: 세포를 TrypLE Express (Invitrogen), 선택적으로 트립신 또는 균등물, 또는 TRYP-LE EXPRESS 또는 균등물, 2배 희석 (0.125% 균등물)로 수확하고, 5 내지 6분 동안 37℃에서 인큐베이션한다. 오래된 배지 또는 저온 PBS 10 ml를 첨가하여 분리를 중지시킨다. 1000 rpm (179 xg) 5분 동안 스핀 다운하고, 10 ml 저온 HBSS에 세포를 재현탁하고, 세포 생존율 및 세포 수를 트리판 블루 (Invitrogen) 염색에 의해 결정하고 Countess (Invitrogen) 또는 수동으로 계산한다. 5분 동안 1000 rpm (179 xg)에서 스핀 다운하고, 저온 HBSS에 세포를 재현탁하고, 이식을 위한 세포 현탁액으로서 환자의 경우 100 ul HBSS 중 0.5 x 106개의 세포, 랫트의 경우 2 ul HBSS 중 30,000개의 세포를 제조한다.
실시예 4: 세포 배양: 프로토콜 B
실시예 2에 기재된 방법으로부터 단리된 망막 세포로부터 인간 망막 전구 세포를 배양하였다:
1. 배지 교체: 0일째 내지 3일째를 제외하고 2일마다 100% 배지 교체. 개방 시스템, 폐쇄 시스템 및 반 폐쇄 시스템은 모두 배지 교체 및 세포 계대배양 시 사용할 수 있다. 선택적으로 배지를 매일 교체할 수 있다.
2. 계대배양: 세포를 15 내지 95% 컨플루언스, 선택적으로 40 내지 95% 컨플루언스에서 4 내지 5일마다 계대배양한다. 방법은 계대배양 횟수에 따라 다르다. 세포를 또한 3 내지 4일마다 또는 3 내지 5일마다 계대배양할 수 있다.
계대배양 1: TrypLE Select (Invitrogen) + EDTA (Invitrogen), 1:4, 7 내지 8 분 37℃ 인큐베이션.
계대배양 2: TrypLE Select (Invitrogen) + EDTA (Invitrogen) + DPBS (Invitrogen), 1:1:3, 5 내지 6분 37℃ 인큐베이션. T
계대배양 3 및 이후: TrypLE select (Invitrogen) + DPBS, 1:1, 5 내지 7 분 37℃ 인큐베이션.
선택적으로 TrypLE Express, 트립신 또는 균등물, 또는 TRYP-LE EXPRESS 또는 균등물, 2배 희석 (0.125% 균등물)을 사용할 수 있다. 덩어리의 분리를 DMEM 또는 PBS (10 ml)를 첨가하여 중지시킨다. 세포 생존율과 세포 수를 NC-200을 통해 결정한다. 예상 세포 생존율은 70% 초과이다. 밀도 3 내지 67x104/cm2 (초기 계대배양 67x104 /cm2, 후기 계대배양: 3x104/cm2)로 새로운 피브로넥틴 코팅 플라스크/플레이트에 세포를 시딩한다.
3. 저온보존: 세포를 TrypLE Select/Express (Invitrogen), 선택적으로 트립신 또는 균등물, 또는 TRYP-LE EXPRESS 또는 균등물, 2배 희석 (0.125% 균등물)을 사용하여 수확하고 5 내지 7분 동안 37℃에서 인큐베이션한다. DMEM 또는 PBS를 첨가하여 분리를 중지하였다. 그 후 50 ml 튜브의 경우: 490 xg 7분, 500 ml 원뿔형 병의 경우, 700 xg 8분 동안 스핀 다운하고, 새로운 배지에 세포를 재현탁한다. 세포 생존율과 세포 수를 NC200을 사용하여 결정한다. 세포 현탁액에 대한 최종 10% DMSO를 달성하기 위해 동일한 양의 2x 저온보존 배지 (20% DMSO)를 첨가한다. 0.5 내지 10 x 106개의 세포를 각 저온 바이알 (Themofisher 또는 유사품)에 분취한다. 1℃ 저온 동결 용기 (NALGENE)에 배치하고 -80℃ 냉동고에 밤새 (또는 그 이상, 2주 미만) 배치한 다음 액체 질소 탱크로 옮긴다.
4. 세포 해동: 세포를 액체 질소에서 꺼내어 결정이 사라질 때까지 37℃ 수조에 2 내지 3분 동안 방치한 다음 1 ml 팁을 사용하여 즉시 저온 15 ml 원뿔형 바닥 튜브 1개로 옮기고 저온의 새로운 배지로 바이알을 1 내지 2회 세정하고, 15 ml 튜브에 9 내지 12 ml의 저온의 새로운 배지를 서서히 첨가하고 1200 rpm (300 g)에서 5분 동안 스핀 다운한다. 상청액을 따라내고, 새로운 배지에 세포 펠릿을 재현탁하고, 상기에 기재된 바와 같이 세포 수와 생존율을 결정하였다. 새로운 코팅 플라스크에 시딩하고 상기에 기재된 조건에서 인큐베이션한다.
5. 이식을 위한 세포 제조: 세포를 TrypLE Express (Invitrogen), 선택적으로 트립신 또는 균등물, 또는 TRYP-LE EXPRESS 또는 균등물, 2배 희석 (0.125% 균등물)에 의해 수확하고, 5 내지 6분 동안 37℃에서 인큐베이션한다. DMEM을 첨가하면 분리를 중지시킨다. 세포 현탁액을 300 g x 5분으로 스핀 다운시킨 다음 0.5 내지 3 ml 저온 BSS 플러스 (또는 BSS/DPBS/HBSS)에 세포를 재현탁한다. 세포 생존율 및 세포 수를 트리판 블루 (Invitrogen)를 사용하여 결정하고 Countess (Invitrogen) 또는 수동으로 또는 NC200을 사용하여 계산한다. 5분 동안 300 g에서 스핀 다운하고, 저온 BSS 플러스 (또는 BSS/DPBS/HBSS)에 세포를 재현탁하여 이식을 위한 적절한 투여량을 생성한다.
실시예 5: 시약 및 세포 산물 제조
완전 배지 제조 (무혈청)
인간 망막 전구 세포 배양용 배지를 다음 성분으로 제조하였다:
·고급 DMEM/F12 (Invitrogen),
o 선택적으로 DMEM/F12 (Invitrogen 또는 다른 브랜드), 또는 KnockOut DMEM/F12 (Invitrogen 또는 다른 브랜드), 또는 neurobasal (Invitrogen), 또는 Ultraculture (Lonza), 또는 ReNcell (Chemicon), 또는 다른 균등한 배지.
·N-2 보충제 (Invitrogen),
o 선택적으로 B27 (Invitrogen 또는 다른 브랜드) 이종 무함유, 또는 B27 비 이종 무함유, 또는 Stempro (Invitrogen), 또는 다른 균등물.
·EGF (재조합 인간 상피 성장 인자): Invitrogen, 선택적으로 다른 브랜드
·bFGF (염기성 섬유아세포 성장 인자): Invitrogen, 선택적으로 다른 브랜드
·GlutaMAX I: Invitrogen, 선택적으로 L-글루타민 (Invitrogen 또는 다른 브랜드)
·젠타마이신 (Invitrogen), 단리 및 제1 계대배양 (약 4 내지 5일)
계대배양 효소:
·Versene 용액: Thermo Fisher (Life tech), 계대배양 1 및 2시 상기 기재된 바와 같이 사용한다. Versene은 부드러운 비-효소 세포 분리 시약으로서 사용하기 위한 EDTA 용액이다. Gibco® Versene 용액 (0.48 mM)을 0.2 g EDTA(Na4)/리터의 인산염 완충 식염수 (PBS)로 제형화하였다.
저온보존 배지 제조
다음을 포함하는 배양된 인간 망막 전구 세포의 조온보존용 배지를 제조하였다:
·90% 완전 배지
·10% DMSO
코팅 플라스크
인간 혈장 피브로넥틴 (Invitrogen), 선택적으로 오르니틴, 폴리-리신, 라미닌 또는 마트리겔, DPBS 희석, 농도: 1 내지 5 μg/cm2, 코팅을 위해 실온에서 후드에 1 내지 3시간 방치, 4℃에서 밤새 또는 최대 2주 저장. 사용하기 전에 고급 DMEM/F12로 세정한다.
실시예 6: 세포 배양 프로토콜 B의 추가 버전
실시예 2에 기재된 방법으로부터 단리된 망막 세포로부터 인간 망막 전구 세포를 배양하였다:
1. 배지 교체: 100% 배지 교체, 2일마다 교체. 개방 시스템, 폐쇄 시스템 및 반 폐쇄 시스템은 모두 배지 교체 및 세포 계대배양 시 사용할 수 있다. 선택적으로 배지를 매일 교체할 수 있다.
2. 계대배양: 세포를 15 내지 95% 컨플루언스, 선택적으로 40 내지 95% 컨플루언스에서 4 내지 5일마다 계대배양한다. 방법은 계대배양 횟수에 따라 다르다. 세포를 또한 3 내지 4일마다 또는 3 내지 5일마다 계대배양할 수 있다.
계대배양 1: TrypLE Select (Invitrogen) + EDTA (Invitrogen) 1:4, 37℃ 7 내지 8분 인큐베이션.
계대배양 2: TrypLE Select (Invitrogen) + EDTA (Invitrogen) + DPBS (Invitrogen), 1:1:3, 37℃ 5 내지 6분 인큐베이션. T
계대배양 3 및 이후: TrypLE select (Invitrogen) + DPBS 1:1 5 내지 7분 37℃ 인큐베이션.
선택적으로 trypLE Express, 트립신 또는 균등물 또는 TRYP-LE EXPRESS 또는 균등물, 2배 희석 (0.125% 균등물)을 사용할 수 있다. 덩어리의 분리를 DMEM 또는 PBS (10 ml)를 첨가하여 중지시킨다.
3. 분리: 고급 DMEM 또는 PBS (10 ml)를 첨가하여 세포 덩어리의 분리를 중지한다. 세포 생존율과 세포 수를 NC-200을 통해 결정한다. 예상 세포 생존율은 70% 초과이다. 세포를 새로운 피브로넥틴 코팅 플라스크 또는 세포 스택 (CS)에 1 내지 200 x 104/cm2 (초기 계대배양 2 x 106/cm2, 이후 계대배양: 1x104/cm2)의 밀도로 시딩한다.
4. 저온보존: 세포를 TrypLE Select/Express (Invitrogen), 선택적으로 트립신 또는 균등물, 또는 TRYP-LE EXPRESS 또는 균등물 2배 희석 (0.125% 균등물)을 사용하여 수확하고 5 내지 7분 동안 37℃에서 인큐베이션한다. DEME 또는 PBS를 첨가하여 분리를 중지한 다음 세포를 스핀 다운하였다. 50 ml 튜브의 경우: 490 xg에서 7분 동안 세포를 원심분리한다. 500 ml 원뿔형 병의 경우: 세포를 700 xg에서 8분 동안 원심분리한다. 새로운 배지에 세포를 재현탁한다. 세포 생존율과 세포 수를 NC200을 사용하여 결정한다. 동일한 양의 2x 저온보존 배지 (20% 디메틸술폭사이드 (DMSO))를 첨가하여 세포 현탁액에 대한 최종 10% DMSO를 달성한다. 0.5 내지 10 x 106개의 세포를 각 저온 바이알 (Themofisher 또는 유사품)에 분취한다. 이는 약 10 x 106 내지 약 40 x 106 세포/mL 배양 배지 +10% DMSO이다. 세포를 1℃ 저온 동결 용기 (NALGENE)에 배치하고 용기를 -80℃ 냉동고에 밤새 (또는 그 이상, 2주 미만) 배치한 다음 액체 질소 탱크로 옮긴다. 대안적으로 Control Rate 냉동고를 사용하여 액체 질소로 옮기기 전에 세포를 동결시킬 수 있다.
5. 세포 해동: 세포를 액체 질소에서 꺼내어 결정이 사라질 때까지 2 내지 3분 동안 37℃ 수조에 방치하였다가 즉시 1 mL 팁을 사용하여 저온의 15 ml 원뿔형 바닥 튜브에 옮긴다. 바이알을 저온의 새로운 배지로 1 내지 2회 세정하고, 9 내지 12 mL의 저온의 새로운 배지를 15 ml 튜브에 첨가한다. 1200 rpm (300 g)에서 5분 동안 스핀 다운한다. 상청액을 따라 내고, 새로운 배지에 세포 펠릿을 재현탁하고, 실시예 2에 대해 상기에 기재된 바와 같이 세포 수와 생존율을 결정한다. 세포를 새로운 코팅 플라스크 또는 세포 스택에 시딩하고 상기에 기재된 조건 하에서 인큐베이션한다.
6. 이식을 위한 세포 제조: 세포를 TrypLE Express (Invitrogen), 선택적으로 트립신 또는 균등물, 또는 TRYP-LE EXPRESS 또는 균등물, 2배 희석 (균등한 0.125%)에 의해 수확하고, 5 내지 6분 동안 37℃에서 인큐베이션한다. 완전 배지, DMEM 또는 PBS를 첨가하여 분리를 중지한다. 세포 현탁액을 300 g에서 5분 동안 스핀 다운한 다음 세포를 0.5 내지 3 ml 저온 BSS 플러스 (또는 BSS/DPBS/HBSS)에 재현탁한다. 세포 생존율과 세포 수를 트리판 블루 (Invitrogen)를 사용하여 결정하고 Countess (Invitrogen) 또는 수동으로 또는 NC200을 사용하여 계산한다. 세포를 300 g에서 5분 동안 스핀 다운하고 저온 BSS 플러스 (또는 BSS/DPBS/HBSS)에 세포를 재현탁하여 이식을 위한 적절한 투여량을 생성한다.
시약/세포 산물 제조:
완전 배지 제조 (무혈청):
·고급 DMEM/F12 (Invitrogen)를 이 프로토콜에 사용하였다. 선택적으로, DMEM/F12 (Invitrogen 또는 다른 브랜드), KnockOut DEMEM/F12 (Invitrogen 또는 다른 브랜드), 또는 neurobasal (Invitrogen), Ultraculture (Lonza), ReNcell (Chemicon), 또는 다른 균등한 배지를 사용할 수 있다.
·N-2 보충제 (Invitrogen), 선택적으로 B27 (Invitrogen 또는 다른 브랜드) 이종 무함유, B27 비 이종 무함유, 또는 Stempro (Invitrogen), 또는 다른 균등물.
·EGF (재조합 인간 상피 성장 인자): Invitrogen, 선택적으로 다른 브랜드.
·bFGF (염기성 섬유아세포 성장 인자): Invitrogen, 선택적으로 다른 브랜드.
·GlutaMAX I: Invitrogen, 선택적으로 L-글루타민 (Invitrogen 또는 다른 브랜드)
·젠타마이신 (Invitrogen), 단리 및 제1 계대배양 (대략 4일, 젠타마이신은 더 장기간 사용할 수 있음).
계대배양 효소:
·Versene 용액: Thermo Fisher (Life tech), 계대배양 1 및 2에서 상기 기재된 바와 같이 사용한다. Versene은 부드러운 비-효소 세포 분리 시약으로 사용하기 위한 EDTA 용액이다. Gibco® Versene 용액 (0.48 mM)을 0.2 g EDTA (Na4)/리터의 인산염 완충 식염수 (PBS)로서 제형화하였다.
저온보존 배지 제조:
·90% 새로운 완전 배지.
·10% DMSO (디메틸 술폭사이드) (Sigma, 선택적으로 다른 브랜드).
코팅 플라스크:
·인간 혈장 피브로넥틴 (Invitrogen)을 사용하였다. 선택적으로, 오르니틴, 폴리-리신, 라미닌 또는 마트리겔을 대안으로 사용할 수 있다.
· 피브로넥틴을 DPBS에 희석한다.
o 농도: 1 내지 5μg/cm2, 4C에서 밤새 최대 2주 코팅, 실온에서 후드 코팅시 1 내지 3시간 방치, 4C에서 밤새 또는 최대 2주 저장.
o 사용하기 전에 고급 DMEM/F12로 세정한다.
o 플라스크를 고급 DMEM/F12로 세정하지 않고 사용할 수 있다.
균등물
본 발명의 하나 이상의 실시형태의 세부 사항은 상기 첨부된 설명에서 기재된다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 균등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 예시적인 방법 및 물질이 이제 기재된다.
전술한 설명은 단지 예시의 목적으로 제시되었으며 본 발명을 개시된 정확한 형태로 제한하려는 것이 아니라 이는 본 명세서에 첨부된 청구범위에 의해 제한된다.
본 발명의 기본 양상에서 벗어나지 않고 전술한 내용에 대한 변형이 이루어질 수 있다. 본 발명이 하나 이상의 특정 실시형태를 참조하여 실질적으로 상세하게 기재되었지만, 당업자는 본 출원에 구체적으로 개시된 실시형태에 대한 변경이 이루어질 수 있고, 이러한 변형 및 개선은 본 발명의 범위와 사상 내에 있음을 인식할 것이다. 본 명세서에 예시적으로 기재된 본 발명은 본 명세서에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소(들)의 부재 하에 적절하게 실시될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 본 명세서의 각각의 경우에서 "~를 포함하는", "~으로 필수적으로 이루어진" 및 "~로 이루어진"이라는 용어 중 임의의 것은 다른 두 용어 중 하나로 대체될 수 있다. 따라서, 사용된 용어 및 표현은 제한이 아닌 설명의 용어로 사용되며, 도시 및 기재된 특징의 균등물 또는 그 일부는 배제되지 않으며, 본 발명의 범위 내에서 다양한 변형이 가능함이 인식된다. 본 발명의 실시형태는 다음의 청구범위에 제시된다.

Claims (58)

  1. 인간 샘플로부터 1차 망막 세포를 단리하는 방법으로서,
    (a) 인간 샘플로부터 다수의 1차 망막 세포를 포함하는 망막 샘플을 단리하는 단계로서, 인간 샘플은 약 12주 내지 약 28주의 재태 기간(gestational age)의 인간 공여체로부터 유래된 것인 단계,
    (b) 다수의 1차 망막 세포를 프로테아제로 분해하지 않고 단계 (a)에서 단리된 망막 샘플 중 다수의 1차 망막 세포를 기계적으로 분리함으로써, 분리된 세포 및 세포 덩어리의 현탁액을 생성하는 단계, 및
    (c) 망막 샘플로부터 획득된 1차 망막 세포의 생존율, 양 및 형태(morphology)를 결정하는 단계로서, 적어도 30 x 106개의 생존가능한(viable) 1차 망막 세포가 생성되는 단계
    를 포함하는, 인간 샘플로부터 1차 망막 세포를 단리하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 인간 샘플은 하나 또는 한 쌍의 인간 안구인, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 안구(들)는 온전한 구체(들), 투명한 각막, 정상 모양(normal shape), 또는 이의 임의의 조합을 포함하는 정상 형태를 갖는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a) 전에 인간 샘플은 인간 공여체로부터 수확한 후 수송 세포 배양 배지에 배치되는, 방법.
  5. 제4항에 있어서, 수송 세포 배양 배지는 L-글루타민 또는 고급 DMEM/F12를 갖는 RPMI-1640을 포함하는, 방법.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 수송 세포 배양 배지는 약 0.5 내지 50 마이크로그램/밀리리터의 젠타마이신 (Gentamicin)을 포함하고, 선택적으로 수송 세포 배양 배지는 50 마이크로그램/밀리리터의 젠타마이신을 포함하는, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 샘플은 수송 세포 배양 배지에 배치 직후 약 1 내지 8℃에 저장되는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 샘플은 인간 공여체로부터 수확한 후 약 7 내지 약 26시간 내에 사용되는, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)에서 인간 샘플로부터 망막 샘플을 단리하는 방법으로서,
    (i) 수송 배양 배지로부터 하나 또는 한 쌍의 인간 안구를 제거하는 단계,
    (ii) 항생제가 보충된 약 1 내지 8℃ 인산염 완충 식염수 (PBS)로 하나 또는 한 쌍의 인간 안구를 세정하는 단계,
    (iii) 하나 또는 한 쌍의 인간 안구로부터 시신경 및 중간엽 조직을 제거하는 단계,
    (iv) 항생제가 보충된 약 1 내지 8℃ PBS로 하나 또는 한 쌍의 인간 안구를 세척하는 단계,
    (v) 바늘을 사용하여 윤부(limbus)에서 하나 또는 한 쌍의 인간 안구 각각의 구체를 천공(puncturing)하는 단계,
    (vi) 하나 또는 한 쌍의 인간 안구의 윤부를 따라 원주 방향으로 절단하는 단계,
    (vii) 하나 또는 한 쌍의 인간 안구로부터 수정체(lens), 각막 및 관련 유리체를 제거하는 단계,
    (viii) 망막(들)을 망막 색소 상피 (RPE) 층으로부터 분리하여 단리된 망막 또는 단리된 망막 쌍을 생성하는 단계, 및
    (ix) 약 1 내지 8℃ 배양 배지 또는 PBS에 단리된 망막 또는 단리된 망막 쌍을 배치하는 단계로서, 배양 배지 또는 PBS에 항생제가 보충된 단계를 포함하는, 방법.
  10. 제9항에 있어서, 단계 (ii)는 1 내지 5회 또는 3회 반복되는, 방법.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 단계 (iii)은 일부 또는 모든 안구외 조직 및 세포를 제거하는, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는
    (i) 망막 샘플을 튜브로 옮기는 단계,
    (ii) 망막 샘플을 기계적으로 분리하여 분리된 다수의 1차 망막 세포를 생성하는 단계,
    (iii) 원심분리를 통해 분리된 다수의 1차 망막 세포를 펠릿화(pelleting)하는 단계, 및
    (iv) 상청액을 제거하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  13. 제12항에 있어서, 망막의 기계적 분리는 멸균 피펫에 의한 분쇄를 통해 수행되는, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 분쇄는 2 내지 50회, 2 내지 10회, 또는 4 내지 8회 수행되는, 방법.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 분리된 다수의 1차 망막 세포는 4℃에서 약 3분의 기간 동안 약 140xg에서의 원심분리를 통해 펠릿화되는, 방법.
  16. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 분리된 다수의 1차 망막 세포를 단계 (ii) 후 및 단계 (iii) 전에 항생제가 보충된 배양 배지 또는 PBS로 세척하는 단계를 포함하는, 방법.
  17. 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 분리된 다수의 1차 망막 세포는 단일 세포 및 세포 덩어리(cluster)를 포함하는, 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)는
    (i) 약 1 내지 8℃ 항생제 보충 배양 배지에서 단계 (b)로부터의 펠릿화된 1차 망막 세포를 재현탁하는 단계,
    (ii) 다수의 분리된 망막 세포를 배양 배지를 포함하는 하나 이상의 코팅된 세포 배양 플라스크 또는 플레이트에 시딩(seeding)하는 단계로서, 선택적으로 세포 배양 배지에 항생제가 보충된 단계,
    (iii) 다수의 분리된 망막 세포를 10 내지 50℃에서 인큐베이션하는 단계로서, 선택적으로 인큐베이션은 37℃에서 이루어지는 단계, 및
    (iv) 1차 망막 세포 및 망막 세포 덩어리의 양 및 생존율을 결정하는 단계
    를 포함하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 1차 망막 세포의 양 및 생존율은 응집 세포 계수 방법, 혈구계 또는 트리판 블루(Trypan Blue)를 사용하여 NC-200 세포 계수기에 의해 측정되는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 생존가능한 1차 망막 세포의 수는 약 20 x 106 내지 약 1 x 109개의 생존가능한 1차 망막 세포, 또는 약 73 내지 147 x 106개의 생존가능한 1차 망막 세포인, 방법.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 계수된 생존가능한 세포의 백분율은 약 10% 내지 약 100%, 또는 약 68% 내지 약 85%인, 방법.
  22. 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (ii)에서 플라스크에 약 1 내지 약 1,000,000,000개의 세포가 시딩되는, 방법.
  23. 제18항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 다수의 분리된 망막 세포는
    (1) 37℃, 0 내지 30% CO2 및 0 내지 50% O2 하,
    (2) 37℃, 5% 이하의 CO2 및 20% 이하의 O2; 또는
    (3) 37℃, 5% 이하의 CO2 및 3% 이하의 O2
    에서 인큐베이션되는, 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)는
    (i) 다수의 분리된 망막 세포를 현미경으로 시각적으로 검사하는 단계, 및
    (ii) 세포 배양 플라스크 또는 플레이트에 시딩된 다수의 망막 세포가 약 2 내지 약 1000개의 세포로 구성되는 망막 세포 덩어리를 포함함을 확인하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  25. 단리된 1차 인간 망막 세포를 배양하여 비-불멸(non-immortal) 인간 망막 전구 세포의 집단(population)을 생성하는 방법으로서,
    (a) 다수의 배양 망막 세포를 생성하기 위해 제1 계대배양 시 배양 배지를 포함하는 하나 이상의 코팅된 배양 플라스크 또는 플레이트에 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된 다수의 1차 망막 세포를 시딩하는 단계;
    (b) 제2 계대배양 시 배양 배지를 포함하는 하나 이상의 코팅된 배양 플라스크 또는 플레이트에 제1 계대배양에 의해 생성된 다수의 배양 망막 세포를 시딩하는 단계;
    (c) 제3에서 배양 배지를 포함하는 하나 이상의 코팅된 배양 플라스크 또는 플레이트에 제2 계대배양에 의해 생성된 다수의 배양 망막 세포를 시딩하는 단계; 및
    (d) 다수의 배양 망막 세포를 저온보존하여, 비-불멸 인간 망막 전구 세포 집단을 생성하는 단계를 포함하고;
    하나 이상의 코팅된 배양 플라스크를 약 0.5 x 104 세포/제곱 센티미터 (cm2) 내지 약 5 x 106 세포/cm2의 밀도로 시딩하고,
    제1 계대배양 시의 시딩 밀도는 제2 계대배양 시의 시딩 밀도보다 더 크고,
    제2 계대배양 시의 시딩 밀도는 제3 계대배양 시의 시딩 밀도보다 더 큰, 방법.
  26. 제25항에 있어서, 하나 이상의 추가 계대배양 시 배양 배지를 포함하는 하나 이상의 코팅된 배양 플라스크 또는 플레이트에 직전 계대배양에 의해 생성된 다수의 배양 망막 세포를 시딩하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  27. 제18항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 플라스크 또는 플레이트는 이종 무함유 피브로넥틴 (xeno free fibronectin), 오르니틴 (ornithine), 폴리-리신, 라미닌 (laminin) 또는 이의 조합으로 코팅되는 방법.
  28. 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 다수의 1차 또는 배양 망막 세포는
    (1) 37℃, 0 내지 30% CO2 및 0 내지 50% O2 하,
    (2) 37℃, 5% 이하의 CO2 및 20% 이하의 O2; 또는
    (3) 37℃, 5% 이하의 CO2 및 3% 이하의 O2
    에서 배양되는, 방법.
  29. 제25항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 계대배양 사이의 기간은 2 내지 8일, 3 내지 6일, 4 내지 5일 또는 3 내지 4일인, 방법.
  30. 제25항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 다수의 1차 망막 세포는 제1 계대배양 시
    (1) 트립신 또는 균등물, 및 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), 또는
    (2) 트립신 또는 균등물, EDTA 및 DPBS
    를 포함하는 제1 효소 용액에 의해 분리되는, 방법.
  31. 제30항에 있어서, 트립신 균등물은 TrypLE인, 방법.
  32. 제31항에 있어서, (1) TrypLE 및 EDTA는 제1 효소 용액 중 1:4의 비율이거나, (2) TrypLE, EDTA 및 DPBS는 1:1:3의 비율인, 방법.
  33. 제25항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 다수의 1차 망막 세포는 약 5 내지 20분, 약 6 내지 10분, 또는 약 7 내지 8분 동안 37℃에서 분리되는, 방법.
  34. 제25항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 다수의 배양 망막 세포는 제2 계대배양 시
    (1) 트립신 또는 균등물, EDTA 및 DPBS, 또는
    (2) 트립신 균등물, 및 DPBS
    를 포함하는 제2 효소 용액에 의해 분리되는, 방법.
  35. 제34항에 있어서, 트립신 균등물은 TrypLE인, 방법.
  36. 제35항에 있어서, (1) TrypLE, EDTA 및 DPBS는 제2 효소 용액 중 1:1:3 비율이거나, (2) TrypLE 및 DPBS는 제2 효소 용액 중 1:1의 비율인, 방법.
  37. 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 다수의 배양 망막 세포는 약 5 내지 20분, 약 6 내지 10분, 또는 약 7 내지 8분 동안 37℃에서 분리되는, 방법.
  38. 제26항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 다수의 배양 망막 세포는 제3 또는 추가 계대배양 시 트립신 또는 균등물, 및 DPBS를 포함하는 제3 효소 용액에 의해 분리되는, 방법.
  39. 제38항에 있어서, 트립신 균등물은 TrypLE를 포함하는, 방법.
  40. 제39항에 있어서, TrypLE 및 DPBS는 제3 효소 용액 중 1:1의 비율인, 방법.
  41. 제38항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 다수의 배양 망막 세포는 약 5 내지 10분 또는 약 5 내지 7분 동안 37℃에서 적어도 제3 또는 추가 계대배양 시 분리되는, 방법.
  42. 제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 추가 계대배양은 2회의 계대배양을 포함하는, 방법.
  43. 제25항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 계대배양 후 다수의 망막 세포의 분리 후 세포 수(cell count) 및 생존율을 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  44. 제43항에 있어서, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90%의 세포가 생존가능한, 방법.
  45. 제25항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 배양 플라스크 또는 플레이트에 제1 계대배양 시 약 0.5 x 106 내지 약 3.0 x 106 세포/cm2, 제2 계대배양 시 약 0.1 x 106 내지 약 0.5 x 106 세포/cm2, 제3 계대배양 시 약 0.03 x 106 내지 약 0.2 x 106 세포/cm2, 및 제4 및 추가 계대배양 시 약 10,000 내지 약 60,000 세포/cm2의 밀도로 시딩되는, 방법.
  46. 제25항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (d)의 저온보존은
    (i) 트립신 또는 균등물을 사용하여 세포를 효소에 의해 분리하는 단계,
    (ii) 과량의 배양 배지 또는 고급 DMEM/F12에 의해 분리를 중지시키는 단계,
    (iii) 10xg 내지 10,000xg에서 1 내지 30분 동안 원심분리를 통해 세포를 원심분리하는 단계,
    (iv) 배양 배지에서 세포를 재현탁하고 총 세포 수 및 생존율을 결정하는 단계,
    (v) 저온보존 배지를 첨가하여 최종 디메틸술폭사이드 (DMSO) 농도가 5 내지 30%가 되도록 하는 단계,
    (vi) 다수의 세포를 각각의 저온 바이알(cryovial)로 분취(aliquoting)하는 단계,
    (vii) Control Rate Freezer를 사용하여 각 바이알을 동결하는 단계, 및
    (viii) 각각의 세포 바이알을 액체 N2 중에 배치하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  47. 제8항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 배지는 혈청 무함유인, 방법.
  48. 제8항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 배지는 완전 배지를 포함하는, 방법.
  49. 제8항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 배지는 둘베코 변형 이글 배지 (Dulbecco's Modified Eagle medium) DMEM/F12, 고급 DMEM/F12, Knockout DMEM/F12, Neurobasal 배지, ReNcell 또는 Ultraculture 배지를 포함하는, 방법.
  50. 제8항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 배지는 고급 DMEM/F12를 포함하는, 방법.
  51. 제49항 또는 제50항에 있어서, 배양 배지는 N-2 보충제(Supplement) 및 GlutaMAX-I를 포함하는, 방법.
  52. 제49항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 배지는 B27, B27 이종 무함유, 또는 Stempro를 포함하는, 방법.
  53. 제49항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 배지는 세포 생존가능한 또는 성장을 지원하는 보충제 또는 첨가제를 포함하는, 방법.
  54. 제53항에 있어서, 세포 생존가능한 또는 성장을 지원하는 보충제 또는 첨가제는 L-글루타민, 재조합 인간 상피 성장 인자 (EGF), 염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF), 다른 성장 인자, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  55. 제8항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 항생제는 약 0.5 내지 약 50 μg/mL의 농도의 젠타마이신을 포함하고, 선택적으로 젠타마이신의 농도는 약 30 μg/mL인, 방법.
  56. 제46항에 있어서, 단계 (i)에서 트립신 균등물은 TrypLE를 포함하는, 방법.
  57. 제46항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 저온보존 배지는 배양 배지 및 10% DMSO를 포함하는, 방법.
  58. 제46항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (vi)에서 다수의 세포는 약 0.5 x 106 내지 약 20 x 106 세포/mL 배양 배지 및 DMSO를 포함하는, 방법.
KR1020217011727A 2018-09-27 2019-09-27 인간 망막 전구 세포 단리 및 배양 방법 KR20210075099A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862737622P 2018-09-27 2018-09-27
US62/737,622 2018-09-27
PCT/US2019/053520 WO2020069360A1 (en) 2018-09-27 2019-09-27 Methods of human retinal progenitor cell isolation and culture

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20210075099A true KR20210075099A (ko) 2021-06-22

Family

ID=69952348

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020217011727A KR20210075099A (ko) 2018-09-27 2019-09-27 인간 망막 전구 세포 단리 및 배양 방법

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20210380939A1 (ko)
EP (1) EP3856211A4 (ko)
JP (1) JP2022502047A (ko)
KR (1) KR20210075099A (ko)
CN (1) CN113348243A (ko)
AU (1) AU2019351134A1 (ko)
BR (1) BR112021006067A2 (ko)
CA (1) CA3113675A1 (ko)
TW (1) TWI835871B (ko)
WO (1) WO2020069360A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102313858B1 (ko) 2021-08-25 2021-10-18 하이에어코리아 주식회사 선박용 배기가스 정화장치와 정화방법 및 이를 구비하는 선박

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115216445B (zh) * 2022-08-04 2023-11-14 辽宁何氏医学院 培养基及其在培养视网膜祖细胞中的应用
WO2024036094A2 (en) * 2022-08-06 2024-02-15 Purdue Research Foundation Compounds and methods of use thereof for the treatment of photoreceptor rod degenerations and generation of photoreceptors

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6045791A (en) * 1992-03-06 2000-04-04 Photogenesis, Inc. Retinal pigment epithelium transplantation
EP1261357B1 (en) * 2000-02-11 2010-07-14 The Schepens Eye Research Institute, Inc. Isolation and transplantation of retinal stem cells
US9061017B2 (en) * 2006-05-03 2015-06-23 The Schepens Eye Research Institute, Inc. Isolation and therapeutic application of adult retinal stem cells collected from extra-retinal tissues
CN105349492B (zh) * 2011-05-18 2019-04-16 加利福尼亚大学董事会 用于治疗视网膜疾病的组合物及方法
US20130189341A1 (en) * 2012-01-23 2013-07-25 Caio Regatieri Generation of photoreceptors from human retinal progenitor cells using polycaprolactone substrates
JP6682446B2 (ja) * 2014-10-24 2020-04-15 大日本住友製薬株式会社 網膜組織の製造方法
JP6758625B2 (ja) * 2014-10-31 2020-09-23 国立大学法人京都大学 生分解性ポリマーを用いた３次元培養方法、及び細胞移植を可能にする培養基材
GB201421094D0 (en) * 2014-11-27 2015-01-14 Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen Culture medium

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102313858B1 (ko) 2021-08-25 2021-10-18 하이에어코리아 주식회사 선박용 배기가스 정화장치와 정화방법 및 이를 구비하는 선박

Also Published As

Publication number Publication date
CA3113675A1 (en) 2020-04-02
TW202027764A (zh) 2020-08-01
US20210380939A1 (en) 2021-12-09
EP3856211A4 (en) 2022-08-03
TWI835871B (zh) 2024-03-21
BR112021006067A2 (pt) 2021-07-20
CN113348243A (zh) 2021-09-03
WO2020069360A1 (en) 2020-04-02
EP3856211A1 (en) 2021-08-04
JP2022502047A (ja) 2022-01-11
AU2019351134A1 (en) 2021-04-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11739294B2 (en) Compositions and methods for treating retinal diseases
TWI835871B (zh) 人類視網膜先驅細胞分離及培養方法
US11753623B2 (en) Compositions for treating retinal diseases and methods for making and using them
RU2809003C2 (ru) Способы выделения и культивирования человеческих ретинальных клеток-предшественников