KR20210070687A - Infectious clone of Faba bean necrotic yellows virus DNA-R and DNA-S and uses thereof - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은, 잠두괴저황화바이러스(Faba bean necrotic yellows virus) DNA-R 및 DNA-S를 접종할 수 있는 감염성 클론 및 이의 용도관한 것이다.The present invention relates to an infectious clone capable of inoculating Faba bean necrotic yellows virus DNA-R and DNA-S and uses thereof.
나노바이러스(Nanovirus)는 여섯 개 내지 여덟 개의 단일가닥 원형 DNA(ssDNA)를 게놈(genome)으로 갖는 식물바이러스로 전 세계적으로 콩과 식물의 주요 경제작물에 피해를 입힌다고 알려져 있다. 감염되는 기주의 특성 상 주로 열대와 아열대 지역에서 보고되었으며 국내의 경우 2017년 자운영위축바이러스(Milk vetch dwarf virus) 발생이 보고되기 전까지 나노바이러스 감염에 의한 피해 사례가 보고된 바는 없었다.Nanovirus is a plant virus having six to eight single-stranded circular DNA (ssDNA) as a genome, and is known to damage major economic crops of legumes worldwide. Due to the nature of the infected host, it was mainly reported in tropical and subtropical regions. In Korea, no cases of damage due to nanovirus infection were reported until the outbreak of milk vetch dwarf virus in 2017.
2000년대에 들어서면서 국가 간 자유무역 협정이 체결되고 농산물의 교역이 활발해짐에 따라 수입 농산물과 함께 이에 감염될 수 있는 다양한 병원체 및 해충들이 유입되고 있는 상황이며 지구 온난화에 따른 기온 상승으로 유입된 바이러스가 확산되기 쉬운 환경이 만들어지고 있다. 따라서 국내에 유입되었을 시 큰 피해를 일으킬 수 있는 식물바이러스, 그 중에서도 최근 세계적으로 피해가 증가하고 있는 나노바이러스에 대해 사전에 연구하여 유입과 발생을 예방하는 시스템을 확립할 필요가 있다. In the 2000s, as free trade agreements were concluded between countries and trade in agricultural products became active, various pathogens and pests that could infect them along with imported agricultural products were introduced. An environment is being created that is easy to spread. Therefore, it is necessary to establish a system to prevent the introduction and occurrence of plant viruses that can cause great damage when introduced into Korea, especially nanoviruses, which have recently increased worldwide damage.
나노바이러스는 기계적인 전염이 불가능하며 오로지 특정 매개충(insect vector)과 감염된 종자에 의해서만 전염된다고 알려져 있다. 현재 국내에 서식하고 있는 나노바이러스 매개충으로는 진딧물(Acyrthosiphon pisum 및 Aphis craccivora)이 있는데 그 자체로도 작물에 피해를 끼치는 해충인데다 크기가 작고 방제가 어려워 접종 실험 등에 이용하기 까다롭다는 단점이 존재한다. 이를 극복하고 비교적 손쉽게 나노바이러스를 접종하는 방법이 바로 아그로박테리움 튜머페이션스(Agrobacterium tumefaciens)를 이용해 감염성 클론을 식물 세포에 직접 집어넣는 것이 알려져 있다. It is known that nanoviruses cannot be transmitted mechanically and can only be transmitted by specific insect vectors and infected seeds. Aphids ( Acyrthosiphon pisum and Aphis craccivora ) are currently inhabiting Korea as a vector of nanoviruses, but they are pests that damage crops by themselves, and are difficult to use for inoculation experiments due to their small size and difficult control. . A method to overcome this and to inoculate nanoviruses relatively easily is known to directly insert an infectious clone into plant cells using Agrobacterium tumefaciens.
나노바이러스는 다양한 지역에서 현재 산발적으로 발생이 계속 보고되고 있다. 그 중 잠두괴저황화바이러스는 시리아, 터키, 요르단, 레바논 등 중동 지역 국가들에서 처음 보고가 되기 시작하였으며, 콩과식물에 감염되어 식물의 괴사 및 황화현상을 유발해 식물의 성장을 저해하고 수확량을 감소시키는 나노바이러스로, 잠두괴저황화바이러스의 DNA-R 및 DNA-S(Faba bean necrotic yellows virus DNA-R and DNA-S, FBNYV DNA-R and DNA-S)가 주요 감염인자로 알려져 있다. 해당 바이러스는 현재 이집트, 모로코, 알제리 등 아프리카 북부 지역 국가들과 스페인 등 지중해연안 국가로도 확산되어 잠두, 렌틸콩 등과 같은 콩과작물에 감염되어 수확량 감소 등의 경제적 피해를 주고 있다. 이에 대한 연구를 위해선 해당 바이러스에 대한 감염성 클론 제작 및 이를 통한 인위적 감염시스템의 개발이 필요한 실정이다.Nanoviruses continue to be reported as sporadic outbreaks in various regions. Among them, broad head gangrene sulfide virus was first reported in countries in the Middle East such as Syria, Turkey, Jordan, and Lebanon. It infects legumes and causes necrosis and yellowing of plants, inhibiting plant growth and reducing yields. As a reducing nanovirus, DNA-R and DNA-S (Faba bean necrotic yellows virus DNA-R and DNA-S, FBNYV DNA-R and DNA-S) are known as major infectious agents. The virus is currently spreading to countries in northern Africa such as Egypt, Morocco, and Algeria, as well as countries along the Mediterranean coast such as Spain, infecting legumes such as broad beans and lentils, causing economic damage such as reduced yields. In order to study this, it is necessary to produce an infectious clone for the virus and to develop an artificial infection system through it.
이에 본 발명자들은 FBNYV DNA-R 및 DNA-S(FBNYV DNA-R and DNA-S)의 감염성 클론을 바이너리 벡터(binary vector)에 담아 식물체에 아그로-인오큘레이션으로 도입하여, 식물체에 감염성 활성을 재현시키는 효과를 확인하여 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors put the infectious clones of FBNYV DNA-R and DNA-S (FBNYV DNA-R and DNA-S) in a binary vector and introduced into the plant by agro-inoculation, thereby increasing the infective activity in the plant. The present invention was completed by confirming the effect of reproducing.
본 발명의 목적은 서열번호 1로 표시되는 잠두괴저황화바이러스 DNA-R(Faba bean necrotic yellows virus, FBNYV DNA-R)의 염기서열을 포함하는 재조합 플라스미드를 제공하는 것이다.An object of the present invention is to provide a recombinant plasmid comprising the nucleotide sequence of Faba bean necrotic yellows virus (FBNYV DNA-R) represented by SEQ ID NO: 1.
본 발명의 다른 목적은 상기의 재조합 플라스미드로 형질전환된 아그로박테리움 튜머페이션스(Agrobacterium tumefaciens)를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide Agrobacterium tumefaciens transformed with the above recombinant plasmid.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 2로 표시되는 FBNYV DNA-S의 염기서열을 포함하는 재조합 플라스미드를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a recombinant plasmid comprising the nucleotide sequence of FBNYV DNA-S represented by SEQ ID NO: 2.
본 발명의 또 다른 목적은 상기의 재조합 플라스미드로 형질전환된 아그로박테리움 튜머페이션스(Agrobacterium tumefaciens)를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide Agrobacterium tumefaciens transformed with the above recombinant plasmid.
본 발명의 또 다른 목적은 상기의 재조합 플라스미드로 형질전환된 벡터를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a vector transformed with the above recombinant plasmid.
본 발명의 또 다른 목적은 상기의 재조합 플라스미드로 형질전환된 FBNYV 감염 식물체를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide an FBNYV-infected plant transformed with the above recombinant plasmid.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 FBNYV DNA-R 또는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 FBNYV DNA-S를 검출하는 제제를 포함하는 잠두괴저황화바이러스의 감염 진단용 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a composition for diagnosis of FBNYV DNA-R containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or FBNYV DNA-S containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 for diagnosing infection with FB gangrene sulfide virus will provide
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 FBNYV DNA-R 또는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 FBNYV DNA-S를 검출하는 단계;를 포함하는 식물체 내 FBNYV의 감염 진단 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to detect FBNYV DNA-R containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or FBNYV DNA-S containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2; FBNYV infection diagnosis method in plants comprising a will provide
본 발명의 또 다른 목적은 상기의 재조합 플라스미드를 식물체 내에 감염시키는 단계;를 포함하는 식물체에 FBNYV를 감염시켜 병증을 유도하는 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for inducing disease by infecting a plant with FBNYV, comprising the step of infecting the recombinant plasmid into the plant.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 잠두괴저황화바이러스 DNA-R(Faba bean necrotic yellows virus, FBNYV DNA-R)의 염기서열을 포함하는 재조합 플라스미드를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a recombinant plasmid comprising the nucleotide sequence of Faba bean necrotic yellows virus (FBNYV DNA-R) represented by SEQ ID NO: 1.
또한, 본 발명은 상기의 재조합 플라스미드로 형질전환된 아그로박테리움 튜머페이션스(Agrobacterium tumefaciens)를 제공한다.The present invention also provides a tyumeo Patience Agrobacterium (Agrobacterium tumefaciens) transformed with the recombinant plasmid.
또한, 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 FBNYV DNA-S의 염기서열을 포함하는 재조합 플라스미드를 제공한다.In addition, the present invention provides a recombinant plasmid comprising the nucleotide sequence of FBNYV DNA-S represented by SEQ ID NO: 2.
또한, 본 발명은 상기의 재조합 플라스미드로 형질전환된 아그로박테리움 튜머페이션스(Agrobacterium tumefaciens)를 제공한다.The present invention also provides a tyumeo Patience Agrobacterium (Agrobacterium tumefaciens) transformed with the recombinant plasmid.
또한, 본 발명은 상기의 재조합 플라스미드로 형질전환된 벡터를 제공한다.In addition, the present invention provides a vector transformed with the above recombinant plasmid.
또한, 본 발명은 상기의 재조합 플라스미드로 형질전환된 FBNYV 감염 식물체를 제공한다.In addition, the present invention provides an FBNYV-infected plant transformed with the above recombinant plasmid.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 FBNYV DNA-R 또는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 FBNYV DNA-S를 검출하는 제제를 포함하는 FBNYV의 감염 진단용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a composition for diagnosing FBNYV infection comprising an agent for detecting FBNYV DNA-R containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or FBNYV DNA-S containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 FBNYV DNA-R 또는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 잠두괴저황화바이러스 DNA-S를 검출하는 단계;를 포함하는 식물체 내 FBNYV의 감염 진단 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for diagnosing FBNYV infection in plants, comprising: detecting FBNYV DNA-R comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or FBNYV DNA-R comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2; provides
또한, 본 발명은 상기의 재조합 플라스미드를 식물체 내에 감염시키는 단계;를 포함하는 식물체에 FBNYV를 감염시켜 병증을 유도하는 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for inducing disease by infecting a plant with FBNYV, comprising the step of infecting the recombinant plasmid into the plant.
본 발명의 FBNYV DNA-R 및 DNA-S의 염기서열을 포함하는 재조합 플라스미드 및 이를 포함하는 대장균 및 아그로박테리움 튜머페이션스를 이용 시, 매개충(insect vector) 없이도 효과적으로 작물에 잠두괴저황화바이러스 DNA-R 및 DNA-S(FBNYV DNA-R 및 DNA-S)의 감염을 유발시킬 수 있다. 따라서, 본 발명을 이용하여 FBNYV DNA-R 및 DNA-S의 기주 범위 및 기주와의 상관관계 등 다양한 연구에 응용할 수 있으며, 이를 통해 바이러스 감염으로 인한 경제적 손실을 사전에 방지할 수 있어, 관련 분야에 유용하게 이용할 수 있다.When using the recombinant plasmid containing the FBNYV DNA-R and DNA-S nucleotide sequence of the present invention and E. coli and Agrobacterium tumefaciens containing the same, the FBNYV gangrene sulfide virus DNA-R effectively in crops without an insect vector and DNA-S (FBNYV DNA-R and DNA-S). Therefore, by using the present invention, it can be applied to various studies such as the host range of FBNYV DNA-R and DNA-S and the correlation with the host, and through this, economic loss due to virus infection can be prevented in advance, and related fields can be useful for
도 1은 FBNYV DNA-R의 감염성 클론으로 이용할 수 있는 재조합 플라스미드의 제조 과정을 나타낸 것이다.
도 2는 FBNYV DNA-S의 감염성 클론으로 이용할 수 있는 재조합 플라스미드의 제조 과정을 나타낸 것이다. 1 shows a process for preparing a recombinant plasmid that can be used as an infectious clone of FBNYV DNA-R.
2 shows a process for preparing a recombinant plasmid that can be used as an infectious clone of FBNYV DNA-S.
본 발명은 서열번호 1로 표시되는 잠두괴저황화바이러스 DNA-R(Faba bean necrotic yellows virus, FBNYV DNA-R)의 염기서열을 포함하는 재조합 플라스미드를 제공한다.The present invention provides a recombinant plasmid comprising the nucleotide sequence of Faba bean necrotic yellows virus (FBNYV DNA-R) represented by SEQ ID NO: 1.
또한, 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 FBNYV DNA-S의 염기서열을 포함하는 재조합 플라스미드를 제공한다.In addition, the present invention provides a recombinant plasmid comprising the nucleotide sequence of FBNYV DNA-S represented by SEQ ID NO: 2.
FBNYV는 DNA-R과 DNA-S 라는 두 개의 분리된 게놈을 포함하여 최소 8개의 게놈을 갖는 멀티파타이트(multipartite) 나노바이러스로 8 개의 게놈이 모두 존재할 때 정상적인 바이러스의 복제 및 병징 발현이 유도되는 것으로 알려져 있다. DNA-R 상에는 DNA 복제 등과 관련된 Rep 단백질이 암호화되어 있으며, DNA-S에는 외피 단백질이 암호화되어 있다.FBNYV is a multipartite nanovirus having at least eight genomes, including two separate genomes, DNA-R and DNA-S. When all eight genomes are present, normal virus replication and symptomatic expression are induced. it is known DNA-R encodes a Rep protein related to DNA replication and the like, and DNA-S encodes an envelope protein.
상기 염기서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 본 발명의 서열번호 1 및 2의 염기서열은 이를 구성하는 핵산 분자의 작용성 등가물, 예를 들어, 서열번호 1 및 2의 일부 염기서열이 결실(deletion), 치환(substitution) 또는 삽입(insertion)에 의해 변형되었지만, 서열번호 1 및 2의 염기서열과 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체(variants)를 포함하는 개념이다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1 및 2의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 염기서열 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 염기 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.Variants of the nucleotide sequence are included within the scope of the present invention. The nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 and 2 of the present invention are functional equivalents of nucleic acid molecules constituting them, for example, some nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 and 2 are deleted, substituted or inserted. Although modified by , it is a concept including variants that can function the same as the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 and 2. Specifically, the gene is a base having at least 70%, more preferably at least 80%, even more preferably at least 90%, most preferably at least 95% sequence homology to the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 and 2, respectively. sequence may be included. The "% of sequence homology" for a nucleotide sequence is determined by comparing two optimally aligned sequences with a comparison region, and a portion of the nucleotide sequence in the comparison region is a reference sequence (including additions or deletions) for the optimal alignment of the two sequences. additions or deletions (ie, gaps) compared to not).
본 발명은 서열번호 1로 표시되는 FBNYV DNA-R 및 서열번호 2로 표시되는 FBNYV DNA-S의 염기서열을 포함하는 재조합 플라스미드를 제조하였다. 본 발명의 발명자들은 상기 재조합 플라스미드를 사용하여 형질전환된 아그로박테리아를 제조하였으며, 이러한 형질전환된 아그로박테리아 균주를 식물체에 감염시키면, 식물체에 FBNYV DNA-R 및 DNA-S의 병증이 현저하게 나타나는 놀라운 발견을 하여 본 발명을 완성하였다.In the present invention, a recombinant plasmid comprising the nucleotide sequence of FBNYV DNA-R represented by SEQ ID NO: 1 and FBNYV DNA-S represented by SEQ ID NO: 2 was prepared. The inventors of the present invention prepared a transformed Agrobacterium using the recombinant plasmid, and when the transformed Agrobacterium strain is infected with a plant, the disease of FBNYV DNA-R and DNA-S is remarkably displayed in the plant. The present invention was completed by the discovery.
본 발명의 재조합 플라스미드는 FBNYV DNA-R 및 DNA-S의 유전자를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 FBNYV DNA-R 및 DNA-S의 유전자는 이량체로 구성될 수 있으며, 이는 각기 다른 제한효소를 사용하여 분리된 단량체를 재조합 플라스미드에서 연결하여 제조될 수 있다. The recombinant plasmid of the present invention may contain genes of FBNYV DNA-R and DNA-S. Preferably, the genes of the FBNYV DNA-R and DNA-S may be composed of a dimer, which may be prepared by linking the isolated monomers using different restriction enzymes in a recombinant plasmid.
본 발명에서 용어, '형질전환'은 외래 DNA 또는 RNA가 세포에 흡수되어 세포의 유전형이 변화되는 것을 의미할 수 있다. 숙주세포는 이에 제한되는 것은 아니나, 식물세포, 원핵세포, 효모세포 또는 곤충세포 등이 포함될 수 있다.As used herein, the term 'transformation' may mean that foreign DNA or RNA is absorbed into a cell to change the genotype of the cell. Host cells are not limited thereto, but may include plant cells, prokaryotic cells, yeast cells or insect cells.
또한 본 발명은 상기 재조합 플라스미드로 형질전환된 아그로박테리움 튜머In addition, the present invention is an Agrobacterium tumer transformed with the recombinant plasmid.
페이션스를 제공한다. provides pasences.
본 발명에서 용어, "아그로박테리움"은 흙 속에 사는 운동성을 가진 토양미생물의 하나로, 암을 유발하는 플라스미드(Ti(Tumer induced) plasmid)를 가지고 있어 식물체의 상처 따위를 통하여 감염하여 조직 세포의 이상 증식을 유발한다.As used herein, the term "Agrobacterium" is one of the soil microorganisms with motility living in the soil, and has a cancer-causing plasmid (Ti (Tumer induced) plasmid), so that it is infected through a wound on a plant and causes abnormalities in tissue cells. causes proliferation.
본 발명에 있어서, 상기 FBNYV DNA-R을 발현하는 아그로박테리움 튜머페이션스는 기탁번호 (KACC 95148P)로 기탁된 것이 사용될 수 있으며, 이는 농업생명공학연구원(Korean Agricultural Culture Collection, KACC)에 2019년 12월 4일자로 기탁되었다.In the present invention, the Agrobacterium tumefaciens expressing the FBNYV DNA-R may be used that has been deposited with an accession number (KACC 95148P), which was published in the Korean Agricultural Culture Collection (KACC) in December 2019. It was deposited on the 4th of the month.
또한, 상기 FBNYV DNA-S을 발현하는 아그로박테리움 튜머페이션스는 기탁번호 (KACC 95149P)로 기탁된 것이 사용될 수 있으며, 이는 농업생명공학연구원(Korean Agricultural Culture Collection, KACC)에 2019년 12월 4일자로 기탁되었다.In addition, the Agrobacterium tumefaciens expressing the FBNYV DNA-S may be used that has been deposited with an accession number (KACC 95149P), which is dated December 4, 2019 to the Korean Agricultural Culture Collection (KACC). was deposited with
또한, 본 발명은 상기의 재조합 플라스미드로 형질전환된 벡터를 제공한다.In addition, the present invention provides a vector transformed with the above recombinant plasmid.
본 발명에서 용어 "벡터"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로 플라스미드 벡터; 대장균 벡터; 아그로박테리움 벡터; 그리고 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터 같은 세균 또는 바이러스 벡터 등을 포함될 수 있으며, 바람직하게는 대장균이다.As used herein, the term "vector" refers to a means for expressing a target gene in a host cell, including a plasmid vector; E. coli vector; Agrobacterium vectors; And it may include bacterial or viral vectors such as bacteriophage vectors, adenoviral vectors, retroviral vectors and adeno-associated viral vectors, etc., preferably Escherichia coli.
또한, 본 발명은 상기의 재조합 플라스미드로 형질전환된 FBNYV 감염 식물체를 제공한다.In addition, the present invention provides an FBNYV-infected plant transformed with the above recombinant plasmid.
본 발명의 재조합 플라스미드가 도입되는 식물 세포는 세포가 식물로 재생될The plant cell into which the recombinant plasmid of the present invention is introduced is the cell to be regenerated into a plant.
수 있는 한 특정한 형태로 특별히 제한되는 것은 아니다. 이들 세포는, 예를 들면, 배양된 세포 부유물, 원형질체(protoplast), 잎 절편(leaf section) 또는 캘러스(callus) 등을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 대상 식물체로는 잠두, 렌틸콩, 강낭콩, 등을 포함하는 콩과 등을 포함할 수 있으며, FBNYV DNA-R 및 DNA-S가 감염되는 식물이라면, 이에 제한되지 않는다.It is not particularly limited to a specific form as long as possible. These cells may include, for example, cultured cell suspensions, protoplasts, leaf sections or callus, and the like. Target plants according to the present invention may include legumes including broad beans, lentils, kidney beans, and the like, and are not limited thereto, as long as they are plants infected with FBNYV DNA-R and DNA-S.
상기 재조합 플라스미드의 식물체로의 도입은 당분야에 공지된 방법을 사용 할 수 있다. 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 아그로박테리움 매개에 의한 방법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 히트 쇼크법(heat shock), 전기천공법(electroporation) 또는 PEG(Polyethylenglycol)에 의한 침전법 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. Introduction of the recombinant plasmid into a plant may be performed using a method known in the art. For example, but not limited to, Agrobacterium mediated methods, particle gun bombardment, silicon carbide whiskers, sonication, heat shock, Electroporation or precipitation by PEG (Polyethylenglycol) may be used, but is not limited thereto.
바람직하게, 본 발명에 있어서 식물체에 FBNYV DNA-R 및 DNA-S의 DNA의 병증을 유도하기 위해 아그로박테리움 튜머페이션스를 이용하는 방법이 사용될 수 있다. 이러한 아그로-인오큘레이션 (Agro-inoculation) 방법은 식물체 내로 유전자를 도입하여 발현시키거나 식물체 내에서 원하는 단백질을 생산하기 위한 방법을 의미할 수 있다. 아그로-인오큘레이션은 접종하고자 하는 식물의 정단부에 곤충핀을 이용하여 상처를 낸 후 이동시키고자 하는 유전자를 가진 아그로박테리움의 현탁액을 주입하여주는 방법이다. Preferably, in the present invention, a method using Agrobacterium tumefaciens to induce pathology of FBNYV DNA-R and DNA-S DNA in plants may be used. Such agro-inoculation (Agro-inoculation) method may refer to a method for introducing and expressing a gene into a plant or for producing a desired protein in a plant. Agro-inoculation is a method of injecting a suspension of Agrobacterium having a gene to be moved after making a wound using an insect pin at the tip of the plant to be inoculated.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 FBNYV DNA-R 또는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 FBNYV DNA-S를 검출하는 제제를 포함하는 FBNYV의 감염 진단용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a composition for diagnosing FBNYV infection comprising an agent for detecting FBNYV DNA-R containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or FBNYV DNA-S containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
본 발명에서 사용되는 용어 “조성물”은 목적하는 병증의 원인균을 검출하기 위한 프라이머, DNA 폴리머라제, dNTP 및 버퍼와 같은 DNA검출 및 증폭용 시약을 포함하는 것을 의미한다. As used herein, the term “composition” means including reagents for DNA detection and amplification, such as primers, DNA polymerase, dNTPs, and buffers for detecting the causative agent of a desired disease.
본 발명의 바이러스를 검출하는 제제는 FBNYV에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있다. 또한 상기 조성물은 반응 증폭 혼합물을 더 포함할 수 있으며, 반응 증폭 혼합물은 증폭 반응을 수행하기에 필요한 시약, 열 안정성 DNA 중합 효소, 데옥시뉴클레오티드, 뉴클레아제가 없는 멸균수 및 2가 금속 양이온을 함유하는 용액 등을 지칭하며, 바람직하게는 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드, DNA 중합효소를 포함할 수 있다.The agent for detecting the virus of the present invention may include a primer or probe that specifically binds to FBNYV. In addition, the composition may further comprise a reaction amplification mixture, wherein the reaction amplification mixture contains reagents necessary for performing the amplification reaction, a thermostable DNA polymerase, deoxynucleotides, nuclease-free sterile water and a divalent metal cation. It refers to a solution and the like, and preferably may include a reaction buffer, deoxynucleotides, and DNA polymerase.
상기 프로브의 말단에는 형광 물질 등의 리포터를 표지(labeling)할 수 있다.A reporter such as a fluorescent material may be labeled at the end of the probe.
본 발명에서 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 핵산의 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 핵산 주형의 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.In the present invention, the term "primer" refers to a nucleic acid sequence having a short free 3' hydroxyl group, capable of forming a base pair with a template of a complementary nucleic acid and preventing strand copying of the nucleic acid template. It refers to a short nucleic acid sequence that serves as a starting point for Primers are capable of initiating DNA synthesis in the presence of reagents for polymerization (ie, DNA polymerase or reverse transcriptase) and four different nucleoside triphosphates in appropriate buffers and temperatures.
상기 프라이머 설계 시, 프라이머의 A, G, C, T 함량비, 프라이머 결합체(dimer) 형성 방지, 같은 염기 서열의 3회 이상 반복금지 등 여러 가지 제약이 따르며, 그 외에 단독 PCR 반응조건에 있어서 주형(template) DNA의 양, 프라이머의 농도, dNTP의 농도, Mg2+의 농도, 반응온도, 반응시간 등의 조건이 적정해야 한다.When designing the primer, there are various restrictions such as the A, G, C, T content ratio of the primer, prevention of primer dimer formation, and prohibition of repeating the same nucleotide sequence more than 3 times. (template) Conditions such as DNA amount, primer concentration, dNTP concentration, Mg2+ concentration, reaction temperature, and reaction time should be appropriate.
상기의 프라이머는 기본 성질을 변화시키지 않은 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 즉 핵산 서열이 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형될 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 뉴클레오타이드의 하나 이상의 동족체로의 치환 및 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트 또는 카바메이트 등의 하전되지 않은 연결체나 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 등의 하전된 연결체로의 뉴클레오타이드의 변형이 가능하다. 또한 핵산은 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리 L 리신 등의 단백질, 아크리딘 또는 프소랄렌 등의 삽입제, 금속, 방사성 금속, 철 산화성 금속 등의 킬레이트화제 및 알킬화제 등의 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기를 가질 수 있다.The above primers may incorporate additional features that do not change the basic properties. That is, the nucleic acid sequence can be modified using a number of means known in the art. Examples of such modifications include methylation, encapsulation, substitution of a nucleotide with one or more homologues and uncharged linkages such as phosphonates, phosphotriesters, phosphoroamidates or carbamates or phosphorothioates or phosphorodithioates. Modification of nucleotides into charged linkages such as In addition, the nucleic acid may include one or more of nucleases, toxins, antibodies, signal peptides, proteins such as poly L lysine, intercalating agents such as acridine or psoralen, chelating agents such as metals, radioactive metals, iron oxidizing metals, and alkylating agents. It may have additional covalently attached residues.
또한 본 발명의 프라이머 서열은 검출 가능한 시그날을 직접적 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 프라이머는 분광학, 광화학, 생화학, 면역화학 또는 화학적 수단을 이용하여 검출 될 수 있는 표지를 포함할 수 있다. 유용한 표지는 32P, 형광 염료, 전자 밀집 시약, 효소(일반적으로 ELISA 에 이용되는 것), 바이오틴 또는 합텐 및 항혈청 또는 단일클론성 항체가 이용가능한 단백질을 포함한다.In addition, the primer sequence of the present invention can be modified using a label capable of directly or indirectly providing a detectable signal. The primer may include a label that can be detected using spectroscopy, photochemical, biochemical, immunochemical or chemical means. Useful labels include proteins for which 32P, fluorescent dyes, electron-dense reagents, enzymes (commonly used in ELISAs), biotin or haptens and antisera or monoclonal antibodies are available.
본 발명의 프라이머는 적절한 서열의 클로닝 및 제한효소 분해 및 나랭(Narang)등의 포스포트리에스테르 방법(1979, Meth, Enzymol. 68:90-99), 보카지(Beaucage)등의 디에틸포스포라미다이트 방법(1981, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862), 및 미국 특허 제 4458066호의 고형물 지지 방법과 같은 직접적인 화학적 합성법을 포함하는 임의의 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다.The primers of the present invention are suitable for cloning and restriction enzyme digestion, phosphotriester methods such as Narang (1979, Meth, Enzymol. 68:90-99), and diethylphosphoramidi such as Beaucage. Chemical synthesis may be accomplished using any other well-known method, including direct chemical synthesis methods, such as the method for supporting solids in U.S. Pat. No. 4458066 (1981, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862), and U.S. Patent No. 4458066.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 FBNYV DNA-R 또는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 FBNYV DNA-S를 검출하는 단계;를 포함하는 식물체 내 FBNYV의 감염 진단 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for diagnosing infection of FBNYV in a plant comprising the step of detecting FBNYV DNA-R comprising the base sequence of SEQ ID NO: 1 or FBNYV DNA-S comprising the base sequence of SEQ ID NO: 2 .
본 발명의 FBNYV 감염 진단 방법은 식물체 내 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 FBNYV DNA-R 또는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 바이러스 유전자의 존재를 확인함으로써 FBNYV 감염 여부를 진단하는 방법을 말한다. 더욱 구체적으로 본 발명의 FBNYV를 진단하기 위한 프라이머를 이용한 증폭 반응을 수행하여 FBNYV의 FBNYV DNA-R 또는 DNA-S를 특이적으로 검출할 수 있는 방법일 수 있다.The method for diagnosing FBNYV infection of the present invention refers to a method of diagnosing FBNYV infection by confirming the presence of FBNYV DNA-R containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or a viral gene containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 in a plant. More specifically, it may be a method capable of specifically detecting FBNYV DNA-R or DNA-S of FBNYV by performing an amplification reaction using a primer for diagnosing FBNYV of the present invention.
상기 “증폭 반응”은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미하며, 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)으로, 역전사-중합효소 연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR), 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭 (transcription-mediatedamplification; TMA) (WO88/10315), 자가유지염기서열복제(self sustained sequence replication) (WO90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR), 핵산염기서열 기반 증폭 (nucleic acid sequence based amplification; NASBA), 가닥 치환 증폭 (strand displacement amplification) 및 고리-중재 항온성 증폭 (loop-mediated isothermal amplification; LAMP) 등의 증폭 방법일 수 있으며, 이에 한정되지는 않는다.The “amplification reaction” refers to a reaction that amplifies a nucleic acid molecule, and is a polymerase chain reaction (PCR), reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR), a ligase chain ligase chain reaction (LCR), Gap-LCR (WO 90/01069), repair chain reaction (EP 439,182), transcription-mediated amplification (TMA) (WO88/10315), self-maintenance Self sustained sequence replication (WO90/06995), selective amplification of target polynucleotide sequences, consensus sequence primed polymerase chain reaction (CP-PCR) ), arbitrarily primed polymerase chain reaction (AP-PCR), nucleic acid sequence based amplification (NASBA), strand displacement amplification and loop-mediated thermostatic amplification It may be an amplification method such as (loop-mediated isothermal amplification; LAMP), but is not limited thereto.
또한, 본 발명은 상기의 재조합 플라스미드를 식물체 내에 감염시키는 단계;를 포함하는 식물체에 FBNYV를 감염시켜 병증을 유도하는 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for inducing a disease by infecting a plant with FBNYV, comprising the step of infecting the recombinant plasmid into the plant.
이하 본 발명을, 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 기술적 특징을 명확하게 예시하기 위한 것 일뿐, 본 발명의 보호범위를 한정하는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. However, the following examples are only for clearly illustrating the technical features of the present invention, and do not limit the protection scope of the present invention.
<실시예 1> FBNYV DNA-R 및 DNA-S 유전자 확보<Example 1> Securing FBNYV DNA-R and DNA-S genes
이란에서 미국 국립생물정보센터(National Center for Biotechnology Information; NCBI) GenBank에 등록한 FBNYV DNA-R 및 DNA-S(MG827061, MG827062)을 바탕으로 유전자 코딩 부분이 아닌 intergenic region을 포함하는 non-coding region이 앞뒤로 반복된 형태가 되도록 재배열한 후 이를 Genewiz사의 유전자 합성 서비스를 통해 합성하였다(서열번호 1 및 서열번호 2). 이때 클로닝을 위해 앞뒤로 제한효소 인식부위를 추가하고자, DNA-R에는 KpnI(GGTACC) 및 SpeI(ACTAGT)를 추가하였고, DNA-S에는 BamHI(GGATCC), SpeI(ACTAGT)을 추가하였다.Based on FBNYV DNA-R and DNA-S (MG827061, MG827062) registered with the US National Center for Biotechnology Information (NCBI) GenBank in Iran, a non-coding region containing an intergenic region rather than a gene coding region was identified. After rearranging to form a repeating form, it was synthesized through Genewiz's gene synthesis service (SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2). At this time, to back and forth, additional restriction enzyme recognition sites for cloning, DNA-R there was added a Kpn I (GGTACC) and Spe I (ACTAGT), DNA- S has added a Bam HI (GGATCC), Spe I (ACTAGT) .
<실시예 2> FBNYV DNA-R 및 DNA-S 감염성 클론 제작<Example 2> Preparation of FBNYV DNA-R and DNA-S infectious clones
앞서 합성한 유전자를 pGEM T-easy vector에 클로닝하여 DH5α에서 양을 늘린 뒤 플라스미드를 추출하였다. DNA-R에 대해 제한효소 KpnI, SpeI을 처리하여 FBNYV DNA-R DNA 절편을 분리하고 마찬가지의 방법으로 제한효소 KpeI과 SpeI을 처리한 pCAMBIA1303 vector를 얻어 낸 뒤 2개의 유전자를 T4 ligase로 이어 붙였다. DNA-S의 경우, 제한효소 BamHI, SpeI을 처리하여 FBNYV DNA-R DNA 절편을 분리하고 마찬가지의 방법으로 제한효소 BamHI과 SpeI을 처리한 pCMBIA1303 vector를 얻어낸 뒤 2개의 유전자를 T4 ligase로 이어 붙였다. 이렇게 만들어진 FBNYV-DNA-R-pCAMBIA1303 및 FBNYV-DNA-S-pCAMBIA1303 플라스미드를 다시 대장균 DH5α strain에서 양을 늘린 뒤 추출하고, 제한효소 처리를 통해 정상적으로 플라스미드가 만들어 졌는지 확인했다. 마지막으로 확인된 플라스미드를 각각 아그로박테리움 튜머페이션스(Agrobacterium tumafaciens) GV3101 strain에 형질전환하여 감염성 클론을 완성했다.The previously synthesized gene was cloned into pGEM T-easy vector, the amount was increased in DH5α, and the plasmid was extracted. Treatment with restriction enzymes Kpn I, Spe I for the DNA-R by FBNYV DNA-R separating the DNA fragments and the back 2 of gene embellish obtained the pCAMBIA1303 vector treated with restriction enzymes Kpe I and Spe I in a manner similar T4 ligase connected with For DNA-S, a restriction enzyme Bam HI, treated with Spe I FBNYV DNA-R separating the DNA fragments and a restriction enzyme Bam HI and rear two genes eoteonaen the pCMBIA1303 vector treated with Spe I as the same method as T4 ligase connected with The thus-made FBNYV-DNA-R-pCAMBIA1303 and FBNYV-DNA-S-pCAMBIA1303 plasmids were again extracted from E. coli DH5α strain after increasing the amount, and it was confirmed that the plasmid was normally created through restriction enzyme treatment. Finally, each of the identified plasmids was transformed into Agrobacterium tumafaciens GV3101 strain to complete an infectious clone.
<실시예 3> FBNYV DNA-R 및 DNA-S 감염성 클론의 감염성 확인<Example 3> Confirmation of infectivity of FBNYV DNA-R and DNA-S infectious clones
실시예 2에서 제작된 FBNYV DNA-R 감염성 클론 및 FBNYV DNA-S 감염성 클론의 감염성을 확인하기 위해 기주식물로 알려진 잠두(누에콩)를 발아 후 2주간 재배하여 준비하였다. 준비된 잠두의 정단부에 핀으로 찔러서 상처를 낸 후 FBNYV DNA-R 감염성 클론 및 FBNYV DNA-S 감염성 클론을 포함하는 아그로박테리움 배양액을 주입시켜 FBNYV DNA-R 및 FBNYV DNA-S를 감염시켰으며, 이후 3주간 재배하면서 감염성 여부를 확인하였다. 3주 후 식물의 어린잎으로부터 게놈 DNA를 추출하여 PCR을 수행함으로써 바이러스가 식물체 내에 제대로 감염되었는지 확인하였다.In order to confirm the infectivity of the FBNYV DNA-R infectious clone and the FBNYV DNA-S infectious clone prepared in Example 2, broad bean (silk bean), known as a host plant, was prepared by culturing for 2 weeks after germination. After making a wound by pricking the tip of the prepared broad bean, Agrobacterium culture medium containing the FBNYV DNA-R infectious clone and the FBNYV DNA-S infectious clone was injected to infect FBNYV DNA-R and FBNYV DNA-S, and then The infectivity was checked during cultivation for 3 weeks. After 3 weeks, genomic DNA was extracted from the young leaves of the plant and PCR was performed to confirm whether the virus was properly infected in the plant.
그 결과, 감염된 식물에서는 건전 식물과 달리 잎의 괴사 및 황화 현상이 일어나고, 성장이 위축되는 병증이 확인되었으며, 병증이 유발된 식물체 내에 FBNYV DNA-R 및 FBNYV DNA-S가 제대로 감염되었다는 것을 확인하였다.As a result, unlike healthy plants, in infected plants, leaf necrosis and yellowing occurred, and growth atrophy was confirmed, and it was confirmed that FBNYV DNA-R and FBNYV DNA-S were properly infected in the disease-induced plant. .
<110> Research and Business Foundation SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY <120> Infectious clone of Faba bean necrotic yellows virus DNA-R and DNA-S and uses thereof <130> PN1911-670 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1157 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> FBNYV DNA-R <400> 1 ggtacccgtc atgtgatccc ttgctgagct ggggcggggc ttagtattac ccccgcccca 60 ggttcagcgg agtcatcacg tggattgcac gtgctattag tctatatata gcccaagttg 120 taatatttta tcattcattg aataaaatat ggctcggcaa gttatatgct ggtgctttac 180 attaaataat cctctctctc ctctttctct tcatgattca atgaagtacc ttgtttatca 240 aactgaacaa ggtgaagctg gaaatattca tttccagggt tatattgaaa tgaagaagcg 300 tacatctctt gcaggtatga agaagttaat tcctggtgct catttcgaaa agaggagagg 360 tactcaagga gaagccagag cttatgcaat gaaggaagat acaaggattg aaggtccatg 420 ggagtatgga gagttcattc caactattga agataagctc agagaagtta tgaatgatat 480 gaagactaca ggtaagagac ctattgagta tatagaagag tgttgtaata catatgataa 540 gtctgcaagt actttaagag agttcagagg tgaattgaag aagaagaagg ctatttccag 600 ttgggagttg cagaggaagc 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