KR20210065703A - 두 단계 pcr을 이용한 해양 병원성 박테리아 검출 방법, 및 이를 위한 프라이머 세트, 조성물 및 키트 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 두 단계 PCR을 이용한 해양 병원성 박테리아 검출 방법, 및 이를 위한 프라이머 세트, 조성물 및 키트에 관한 것으로, 구체적으로 a) 시료로부터 DNA를 분리하는 단계; b) 상기 분리된 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1의 서열로 이루어지는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 서열로 이루어지는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트; 서열번호 3의 서열로 이루어지는 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 서열로 이루어지는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트; 및 서열번호 5의 서열로 이루어지는 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 서열로 이루어지는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트; 중에서 선택된 프라이머 세트를 사용하여 두 단계 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계; 및 c) 상기 중합효소연쇄반응으로 생성된 증폭산물 중 상기 정방향 프라이머 및 상기 역방향 프라이머가 포함된 증폭산물을 검출하는 단계;를 포함하는 해양 병원성 박테리아 검출 방법, 및 이를 위한 프라이머 세트, 조성물 및 키트에 관한 것이다.

Description

두 단계 PCR을 이용한 해양 병원성 박테리아 검출 방법, 및 이를 위한 프라이머 세트, 조성물 및 키트{Method for detecting maritime pathogenic bacteria using two-step PCR, and primer set, composition and kit for the same}
본 발명은 두 단계 PCR을 이용한 해양 병원성 박테리아 검출 방법, 및 이를 위한 프라이머 세트, 조성물 및 키트에 관한 것이다.
해양 환경에는 동물 및 인간의 오물에서 발견되는 많은 병원성 박테리아, 원생 동물 및 바이러스가 포함되어있을 수 있다. 이러한 병원성 미생물은 해산물 소비를 통해 인간 건강에 잠재적인 위험을 초래할 수 있다. 대장균은 흔한 박테리아로, 오염된 음식이나 대변 등의 오염된 표면을 통해 쉽게 퍼질 수 있다. 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium)은 엔테로코키(Enterococci) 속(장구균)에 속한다. 이 속의 구성원은 인간 또는 동물의 장내 미생물의 일부이다. 장구균은 높은 염도를 견딜 수 있는 능력을 가지고 있어 해양 환경에서 더 오래 생존할 수 있으며, 일반적으로 수생 환경에서의 분변 지표로 사용된다. 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae)는 해양 환경 내에서의 자연 미생물 군집의 일부이며 인간에게는 병원성을 나타낸다. 이 박테리아는 개별적인 경우로, 또는 설사병의 유행성 발병 형태로 위장병을 유발할 수 있다. 비브리오 콜레라는 많은 개발 도상국에서 수백만 명의 사람들에게 영향을 미친다. 이러한 병원성 박테리아의 확산을 탐지하고 예방하는 것이 해양 연구의 최우선 과제이다.
최근까지 DNA 프로브 또는 PCR에 기초한 효소-결합 면역 흡수 분석법 및 분자생물학적인 방법들이 미생물의 검출을 위해 사용되어왔다. 어류 양식장에서 박테리아 병원체의 확인을 위해 많은 PCR 방법이 개발되었다. 일반적인 PCR 반응은 변성(denaturing), 어닐링(annealing) 그리고 연장(extending)의 세 단계로 이루어진다. 하지만 두 단계 PCR(two-step PCR) 반응은 어닐링 단계와 연장 단계를 통합하여 민감성 및 특이성은 보존하면서도 PCR 시간을 줄이는데 사용된다.
측면흐름분석(lateral flow assay, LFA)은 스트립 상에 배치된 복합 혼합물에서 분석물의 검출 및 정량화를 위한 종이 플랫폼에 기초한 기술이다. 결과는 5 ~ 30분 내에 표시된다. PCR은 표지된 유전자-특이적 프로브와 혼성화되어 표지된 결과물을 형성한다. 이 표지된 결과물은 측면흐름 스트립의 테스트 라인 표면에 의해 포획되어 감지가 가능하다. PCR-LFA 방법의 장점 중 하나는 단순함이며, 이 방법을 이용하는데에 높은 실험적 기술을 갖춘 연구원이 필요하지 않다는 특징을 가진다.
본 발명자는 두 단계 PCR을 이용하여 IMO-규제 해양 병원성 박테리아인 대장균 O157:H7, 엔테로코커스 패시움 및 비브리오 콜레라를 검출할 수 있는 방법, 특히 측면흐름분석을 적용할 수 있는 방법을 개발함으로써 현지에서 누구나 쉽고 빠르게 이들 박테리아의 오염 여부를 확인할 수 있도록 하여 이들 박테리아에 의한 해양 오염 및 확산을 보다 용이하게 관리할 수 있도록 하고자 하였다.
S. Toze, PCR and the detection of microbial pathogens in water and wastewater, Water Research 33(17) (1999) 3545-3556.
따라서 본 발명의 주된 목적은 두 단계 PCR, 특히 측면흐름분석법이 함께 적용되는 방법을 사용하여 간단하고 빠르게 IMO-규제 해양 병원성 박테리아인 대장균 O157:H7, 엔테로코커스 패시움 및 비브리오 콜레라를 검출할 수 있는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기와 같은 검출 방법에 적용하기 위한 프라이머 세트, 조성물 및 키트를 제공하는데 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 a) 시료로부터 DNA를 분리하는 단계; b) 상기 분리된 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1의 서열로 이루어지는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 서열로 이루어지는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트; 서열번호 3의 서열로 이루어지는 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 서열로 이루어지는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트; 및 서열번호 5의 서열로 이루어지는 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 서열로 이루어지는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트; 중에서 선택된 프라이머 세트를 사용하여 두 단계 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계; 및 c) 상기 중합효소연쇄반응으로 생성된 증폭산물 중 상기 정방향 프라이머 및 상기 역방향 프라이머가 포함된 증폭산물을 검출하는 단계;를 포함하는 해양 병원성 박테리아 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 검출 방법에 있어서, 상기 두 단계 중합효소연쇄반응의 어닐링-연장 단계를 64 내지 66℃에서 15 내지 25초간 수행하는 것이 바람직하다.
본 발명의 검출 방법에 있어서, 상기 b)단계에서 서로 다른 표지물질로 표지된 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 사용하고, 상기 c)단계에서 상기 정방향 프라이머의 표지물질 및 역방향 프라이머의 표지물질이 모두 포함된 증폭산물을 검출하는 것이 바람직하다.
본 발명의 검출 방법에 있어서, 측면흐름검출법을 사용하여 상기 c)단계의 검출을 수행하는 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 서열로 이루어지는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 서열로 이루어지는 역방향 프라이머를 포함하는 두 단계 중합효소연쇄반응을 이용한 해양 병원성 박테리아 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 3의 서열로 이루어지는 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 서열로 이루어지는 역방향 프라이머를 포함하는 두 단계 중합효소연쇄반응을 이용한 해양 병원성 박테리아 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 5의 서열로 이루어지는 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 서열로 이루어지는 역방향 프라이머를 포함하는 두 단계 중합효소연쇄반응을 이용한 해양 병원성 박테리아 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 프라이머 세트에 있어서, 상기 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머는 서로 다른 표지물질로 표지된 것이 바람직하다.
본 발명의 프라이머 세트는 측면흐름검출법을 적용하기 위한 것임이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 서열로 이루어지는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 서열로 이루어지는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트; 서열번호 3의 서열로 이루어지는 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 서열로 이루어지는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트; 및 서열번호 5의 서열로 이루어지는 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 서열로 이루어지는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트; 중에서 선택된 프라이머 세트를 포함하는 두 단계 중합효소연쇄반응을 이용한 해양 병원성 박테리아 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머는 서로 다른 표지물질로 표지된 것이 바람직하다.
본 발명의 조성물은 측면흐름검출법을 적용하기 위한 것임이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 서열로 이루어지는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 서열로 이루어지는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트; 서열번호 3의 서열로 이루어지는 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 서열로 이루어지는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트; 및 서열번호 5의 서열로 이루어지는 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 서열로 이루어지는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트; 중에서 선택된 프라이머 세트를 포함하는 두 단계 중합효소연쇄반응을 이용한 해양 병원성 박테리아 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트에 있어서, 상기 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머는 서로 다른 표지물질로 표지된 것이 바람직하다.
본 발명의 키트는 측면흐름검출법을 적용하기 위한 것임이 바람직하다.
본 발명에 따르면 두 단계 PCR을 사용하여 간단하고 신속하며 높은 정확도로 IMO-규제 해양 병원성 박테리아인 대장균 O157:H7, 엔테로코커스 패시움 및 비브리오 콜레라를 검출할 수 있다. 특히, 본 발명의 검출 방법, 프라이머 세트, 조성물, 키트는 측면흐름분석법에 적용할 수 있어 검출의 편의성을 더욱 높일 수 있다. 이에 따라 본 발명의 검출 방법, 프라이머 세트, 조성물 및 키트는 IMO-규제 해양 병원성 박테리아의 해양 오염 및 확산을 방지하는데 크게 기여할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 적용된 두 단계 PCR 및 측면흐름분석의 원리를 나타낸 것이다. A: 두 단계 PCR의 원리, B: 측면흐름분석의 원리.
도 2는 표적 박테리아의 유전자에서 본 발명 프라이머의 위치를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 두 단계 PCR 이후 아가로스 겔 전기영동에 의한 결과를 나타낸 것이다. EC: Escherichia coli, VC: Vibrio cholerae, EF: Enterococcus faecium, M: DNA 100bp ladder, N: 주형 DNA가 없는 대조군, P: 주형 DNA가 있는 실험군.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 반응온도(A) 및 반응시간(B)별 두 단계 PCR 이후 아가로스 겔 전기영동에 의한 결과를 나타낸 것이다. EC: E. coli, VC: V. cholerae, EF: E. faecium, M: DNA 100bp ladder, N: 주형 DNA가 없는 대조군, P: 주형 DNA가 있는 실험군.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 주형 DNA 농도별 두 단계 PCR 이후 아가로스 겔 전기영동에 의한 결과를 나타낸 것이다. N: 주형 DNA가 없는 대조군.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 PCR-LFA의 교차반응성 실험 결과를 나타낸 것이다. (A) E.4 coli 프라이머 사용, (B) V. cholerae 프라이머 사용, (C) E. faecium 프라이머 사용, N: 주형 DNA가 없는 대조군, EC: E. coli, EF: E. faecium, VC: V. cholerae.
도 7은 국내 어류 3종의 조직을 대상으로 한 본 발명의 일실시예에 따른 PCR-LFA 실험 결과를 나타낸 것이다. (A) E. coli 프라이머 사용, (B) V. cholerae 프라이머 사용, (C) E. faecium 프라이머 사용, N: 주형 DNA가 없는 대조군, P: 해당 표적 플라스미드 DNA를 주형으로 사용한 대조군, 1: 넙치(Paralichthys olivaceus) 조직으로부터 추출한 DNA를 주형으로 사용한 실험군, 2: 농어(Lateolabrax japonicas) 조직으로부터 추출한 DNA를 주형으로 사용한 실험군, 3: 조피볼락(우럭, Sebastes schelegelii) 조직으로부터 추출한 DNA를 주형으로 사용한 실험군.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시 예를 가질 수 있는 바, 특정 실시 예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에서 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다.
본 발명은 IMO-규제 해양 병원성 박테리아의 검출을 위해 서열번호 1의 서열로 이루어지는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 서열로 이루어지는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트(제1프라이머 세트); 서열번호 3의 서열로 이루어지는 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 서열로 이루어지는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트(제2프라이머 세트); 및 서열번호 5의 서열로 이루어지는 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 서열로 이루어지는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트(제3프라이머 세트); 중에서 선택된 프라이머 세트를 사용하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 프라이머는 두 단계(two-step) 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)에 적합하도록 설계된 것이며, 특히 측면흐름분석법(lateral flow assay, LFA)에 적용될 수 있어, 매우 간단하고 신속한 검출을 가능하게 한다.
본 발명의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머는 표적 해양 병원성 박테리아의 DNA에 특이적으로 결합하여 이들 프라이머의 결합 부위 사이를 중합효소가 증폭하도록 유도할 수 있다.
본 발명의 제1프라이머 세트는 IMO-규제 해양 병원성 박테리아인 대장균(Escherichia coli) O157:H7을 검출하기 위한 프라이머 세트이고, 제2프라이머 세트는 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium)을 검출하기 위한 프라이머 세트이고, 제3프라이머 세트는 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae)를 검출하기 위한 프라이머 세트로 설계된 것이다.
본 발명에서 상기 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머는 서로 다른 종류의 표지물질로 표지되는 것이 바람직하다. 이러한 표지물질을 이용하면 상기와 같은 표적 증폭산물의 존재 여부를 보다 용이하게 확인할 수 있다. 이때 상기 표지물질은 올리고뉴클레오티드의 표지에 사용되는 통상의 표지물질일 수 있으며, 예를 들어 비오틴(biotin) 및 FAM(fluorescein amidites)일 수 있다.
상기와 같은 표지물질을 이용할 경우, 특히 측면흐름분석법에 용이하게 적용할 수 있다. 예를 들어, 상기 정방향 프라이머의 표지물질을 검출할 수 있는 검출물질 및 상기 역방향 프라이머의 표지물질을 검출할 수 있는 검출물질을 함유하여 각각의 표지물질의 검출을 가시적으로 확인할 수 있는 측면흐름 딥스틱을 사용할 수 있다. 이때 상기 검출물질은 예를 들어 표지물질에 대한 항체일 수 있다.
본 발명의 검출 방법은 a) 시료로부터 DNA를 분리하는 단계; b) 상기 분리된 DNA를 주형으로 하고 본 발명의 프라이머를 사용하여 두 단계 PCR을 수행하는 단계; 및 c) 상기 PCR로 생성된 증폭산물 중 상기 정방향 프라이머 및 상기 역방향 프라이머가 포함된 증폭산물을 검출하는 단계;를 포함하여 이루어진다.
상기 a)단계는 해양 병원성 박테리아의 감염이 의심되는 시료로부터 상기 박테리아의 유전체인 DNA를 분리하기 위한 단계로 시료로부터 DNA를 분리하기 위해 사용되는 통상의 방법을 적용할 수 있다.
상기 b)단계는 상기 a)단계에서 분리된 DNA로부터 해양 병원성 박테리아 유래의 DNA를 증폭하기 위한 단계로 본 발명의 프라이머와 함께 중합효소(polymerase)를 사용하는 통상의 두 단계 PCR을 사용하여 수행할 수 있다. 두 단계 PCR은 변성-어닐링-연장의 세 단계를 반복하는 통상의 PCR과는 달리 어닐링과 연장을 하나의 단계로 하는 PCR 방법으로, 통상의 세 단계 PCR에 비해 전체 반응시간을 줄일 수 있다는 장점이 있으나, 이를 위한 정밀한 프라이머의 설계가 요구된다.
이때 보다 효율적인 증폭을 위하여 어닐링-연장 단계의 온도를 64 ~ 66℃로 하여 수행하는 것이 바람직하며, 어닐링-연장 단계의 시간을 15 ~ 25초로 하여 수행하는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 64.5 ~ 65.5℃로 18 ~ 22초로 하여 수행하는 것이 좋다. 변성 단계의 조건은 크게 제한되는 것은 아니나 94 ~ 96℃의 온도로 15 ~ 25초로 하는 것이 바람직하다.
상기의 조건을 바탕으로 본 발명의 두 단계 PCR은 94 ~ 96℃로 2 ~ 4분간 변성 개시; 94 ~ 96℃로 15 ~ 25초간 변성 및 64 ~ 66℃로 15 ~ 25초간 어닐링-연장의 30 ~ 40사이클 반복; 71 ~ 73℃로 4 ~ 6분간 최종 연장;의 순서로 수행될 수 있다. 보다 바람직하게는 94.5 ~ 95.5℃로 18 ~ 22초간 변성 및 64.5 ~ 65.5℃로 18 ~ 22초간 어닐링-연장을 32 ~ 36사이클 반복하는 것이 좋다.
상기 c)단계는 상기 b)단계에서 증폭되는 표적 증폭산물을 검출하는 단계로 중합효소에 의해 증폭된 증폭산물을 검출하기 위한 통상의 방법을 사용하여 수행할 수 있으며, 예를 들어 아가로스 겔 전기영동 등을 사용할 수 있으나, 보다 간단하고 신속한 검출을 위해 측면흐름분석법을 사용하는 것이 바람직하다. 이때 표적 증폭산물은 본 발명의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머가 포함된 형태이므로, 이를 이용하여 검출할 수 있다.
본 발명은 상기 프라이머를 포함하여 상기와 같은 해양 병원성 박테리아 검출 방법에 적용할 수 있는 프라이머 세트, 조성물 및 키트를 제공한다.
본 발명의 해양 병원성 박테리아 검출용 조성물은 본 발명의 프라이머 이외에도 이들을 안정화시키기 위한 완충액, 상기와 같은 두 단계 PCR에 사용되는 시약 등이 더 포함될 수 있으며, 다른 표적의 증폭을 위한 프라이머 또는 프로브도 포함될 수 있다.
본 발명의 해양 병원성 박테리아 검출용 키트는 본 발명의 프라이머 이외에 두 단계 PCR에 사용되는 시약, 기구 등이 더 포함될 수 있으며, 다른 표적의 증폭을 위한 프라이머 또는 프로브도 포함될 수 있다. 특히, 측면흐름 딥스틱과 같이 표적 증폭산물을 간단한 방법으로 신속하게 검출할 수 있는 기구가 포함되는 것이 바람직하다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
[실시예]
1. 방법
1-1. 주형 DNA
NCBI GenBank를 활용하여 3종의 해양 박테리아에 대하여 각각 E. coli의 stx 유전자, E. faecium의 ddl 유전자, V. cholerae의 ctxB 유전자를 선정하고, 바이오니아에 의뢰하여 각 유전자를 합성하였다. 합성된 유전자는 pBHA 벡터에 삽입하여 플라스미드 DNA 형태로 유지하였다.
각 플라스미드 DNA를 E. coli DH5α에 형질전환하고 -80℃에서 보관하였다. 이후 개별 콜로니를 분리하기 위해 항생제 암피실린(ampicillin)을 추가한 LB 한천 플레이트에서 배양하였다.
박테리아 3종에 대한 콜로니를 각각 1% 항생제(암피실린)를 함유하는 LB 액체배지에 넣고 진탕 배양기에서 37℃로 밤새 배양하였다. 배양 후 AccuPrep® Nano-Plus Plasmid Mini Extraction Kit(Bioneer)를 사용하여 플라스미드를 추출했다.
세포를 250㎕의 resuspension buffer와 250㎕의 lysis buffer, 350㎕ neutralization buffer를 차례로 추가하고 13,000rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 상층액을 분리하여 새로운 튜브로 옮긴 다음 13,000rpm에서 3분 동안 원심분리하고 상층액을 버린 후 펠렛을 얻었다. 95% 에탄올을 함유하는 700㎕의 세척 용액으로 세척한 후, 펠렛을 건조시키고 50㎕의 elution buffer에 재현탁시켜 각 박테리아 3종의 주형으로 사용할 플라스미드 DNA를 확보하였다.
1-2. 프라이머 및 두 단계 PCR-LFA
각 박테리아 독성 유전자의 유전자 서열 정보를 기반으로 표 1과 같은 프라이머를 설계하였다.
각 유전자에서 이들 프라이머의 위치는 도 2와 같다.
표적 박테리아 프라이머명 프라이머 서열
Escherichia coli
O157: H7 strain TR01		 EC-F 5’ (FAM)-CTTCTGTTAATGCAATGGCG-3’
EC-R 5’ (Biotin)-GCACTTCAGCAAATCCGG-3’
Enterococcus faecium
strain CFSAN059071		 EF-F 5’ (FAM)-GTTTTACATGGGCCAAAYGG-3’
EF-R 5’ (Biotin)-CCGACACTAGAACCCATATT-3’
Vibrio cholerae
strain E4		 VC-F 5’ (FAM)-TAGGTGTAAAATTCCTTGACG-3’
VC-R 5’ (Biotin)-TTCTACTTGAAAAGTTGCACC-3’
두 단계 PCR 반응 혼합물은 10㎕의 PCR Mastermix(Bioneer), 1㎕의 주형 DNA, 1㎕의 정방향 프라이머(10pM), 1㎕의 역방향 프라이머(10pM)를 포함하며 증류수를 추가하여 총 부피가 20㎕가 되도록 하였다. 두 단계 PCR 반응 조건은 95℃ 3분 이후, 95℃ 20초간 변성 및 65℃ 20초 동안 어닐링 및 연장을 34사이클 진행한 후, 72℃ 5분간 최종 합성하는 조건으로 수행하였다. 증폭된 DNA의 크기를 확인하기 위하여 EtBr를 함유하는 1% 아가로스 겔을 사용하여 PCR 생성물을 전기 영동하였다.
측면흐름분석(lateral flow assay, LFA)은 Genline HybriDetect 제품을 사용하여 수행하였다. 5㎕의 상기 PCR 반응산물을 80㎕의 딥스틱 분석 완충액에 첨가하고 피펫으로 혼합한 후 이 용액에 측면흐름 스트립을 침지하고 실온에서 5분간 반응시켰다. 육안으로 5분 이내에 결과를 확인할 수 있었다.
2. 결과
2-1. 3가지 해양 박테리아 검출
본 발명의 프라이머를 사용한 두 단계 PCR 방법에 따른 3종의 해양 박테리아 검출을 확인한 결과, E. coli 검출 밴드는 216bp, V. cholerae 검출 밴드는 319 bp, E. faecium 검출 밴드는 302bp에서 나타났다(도 3 참조).
이는 본 발명의 프라이머를 사용한 두 단계 PCR로 상기 3종의 해양 병원성 박테리아를 정확하게 검출할 수 있으며, 이에 따라 통상의 세 단계 PCR을 사용하는 방법에 비해 정확도의 손실없이 검출에 필요한 시간을 줄일 수 있다는 것을 의미한다.
2-2. 반응조건의 최적화
검출 한계를 개선하고 반응의 비특이적 결과를 최소화하는 최적의 검출 결과를 얻기 위해 어닐링 온도, 연장 시간 및 박테리아 주형의 농도를 포함한 몇 가지 조건을 시험하였다.
먼저 어닐링 및 연장 온도 조건에 대해 60, 62, 65 및 68℃의 4가지로 온도를 다르게 하여 두 단계 PCR을 수행한 결과, 65℃에서 가장 선명한 결과를 확인할 수 있었다(도 4의 A 참조). 그리고, 68℃에서는 V. cholerae를 검출할 수 없었고, E. coli와 E. faecium 검출 밴드는 약하고 명확하지 않았다.
따라서 두 단계 PCR을 위한 최적의 어닐링 및 연장 온도를 65℃로 설정하였다.
이후 어닐링 및 연장 시간을 10, 20 및 30초로 다르게 하여 두 단계 PCR을 수행한 결과, 20초에서 최상의 결과를 얻을 수 있었다. 10초로 수행한 경우에도 3종 박테리아가 모두 검출되었지만, V. cholerae 밴드는 밝기가 약했다(도 4의 B 참조).
따라서 두 단계 PCR을 위한 최적의 어닐링 및 연장 시간을 20초로 설정하였다.
검출 한계 확인을 위해, 각 3종의 박테리아에 대한 주형 DNA를 연속 10배 희석하여 샘플을 제조하였다. 반응액 중 희석된 주형 DNA는 2㎍ ~ 200pg 범위였다. 이러한 조건으로 두 단계 PCR을 수행한 결과, E. coli와 E. faecium은 200pg까지 검출되었으며 V. cholerae는 2㎍까지만 검출할 수 있었다(도 5 참조).
2-3. 3가지 해양 박테리아 간의 교차 활성 테스트
두 단계 PCR-LFA 결과의 특이성을 평가하기 위해, 각각의 프라이머에 대해 상기 최적 조건에서 3종의 박테리아 주형으로 PCR을 수행하고, PCR 반응산물을 LFA 분석에 사용하였다. 음성대조군으로는 증류수를 사용하였다.
이의 결과 본 발명의 프라이머는 해당 표적 박테리아에 대해 높은 특이성을 나타냈다. 비 표적 박테리아에서는 교차 반응이 발견되지 않았으며, LFA에서도 같은 결과를 확인할 수 있었다(도 6 참조).
이는 본 발명의 프라이머를 사용한 두 단계 PCR이 해당 표적 박테리아에 대해 매우 높은 검출 특이성을 갖는다는 것을 의미한다.
3-4. 한국산 생선 3종을 대상으로 한 테스트
상기 3종의 박테리아를 보유할 수 있는 주요 어류 조직에서 검출 오류를 시험하기 위해 상기와 같은 PCR-LFA 방법을 이용하여 한국의 어류 중 넙치(Paralichthys olivaceus), 농어(Lateolabrax japonicas) 및 조피볼락(우럭, Sebastes schelegelii) 3종의 어류를 대상으로 실험하였다. 이 실험에서 3종의 어류 샘플이 가지는 게놈 DNA로부터 3종의 표적 박테리아 검출을 시도하였다. 3종의 어류 샘플은 한국해양과학기술원 남해환경연구부에서 제공하였으며, 이 어류 샘플들은 3종의 표적 박테리아를 보유하지 않은 것으로 확인되었다.
실험 결과, 농어 조직의 LFA에서 굉장히 약한 대장균 밴드가 나타났기는 하였지만 대조군 밴드에 비교하여 상대적으로 매우 약한 강도였고, 다른 어류 샘플에서는 모두 표적 박테리아 검출 반응이 나타나지 않았다(도 7 참조).
이는 본 발명의 프라이머를 사용한 두 단계 PCR이 어류 조직으로부터 분리된 게놈 DNA와 비특이적인 반응을 거의 나타내지 않는다는 것을 의미한다.
상기에서는 본 발명을 특정의 바람직한 실시예에 관련하여 도시하고 설명하였지만, 이하의 특허청구범위에 의해 마련되는 본 발명의 기술적 특징이나 분야를 이탈하지 않는 한도 내에서 본 발명이 다양하게 개조 및 변화될 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백한 것이다.
<110> Korea Institute of Ocean Science and Technology Research and Business Foundation SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY <120> Method for detecting maritime pathogenic bacteria using two-step PCR, and primer set, composition and kit for the same <130> 03 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 1 cttctgttaa tgcaatggcg 20 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 2 gcacttcagc aaatccgg 18 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 3 gttttacatg ggccaaaygg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 4 ccgacactag aacccatatt 20 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 5 taggtgtaaa attccttgac g 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 6 ttctacttga aaagttgcac c 21

Claims (19)

  1. a) 시료로부터 DNA를 분리하는 단계;
    b) 상기 분리된 DNA를 주형으로 하고,
    서열번호 1의 서열로 이루어지는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 서열로 이루어지는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트;
    서열번호 3의 서열로 이루어지는 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 서열로 이루어지는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트; 및
    서열번호 5의 서열로 이루어지는 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 서열로 이루어지는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트; 중에서 선택된 프라이머 세트를 사용하여 두 단계 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계; 및
    c) 상기 중합효소연쇄반응으로 생성된 증폭산물 중 상기 정방향 프라이머 및 상기 역방향 프라이머가 포함된 증폭산물을 검출하는 단계;를 포함하는 해양 병원성 박테리아 검출 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 두 단계 중합효소연쇄반응의 어닐링-연장 단계를 64 내지 66℃에서 15 내지 25초간 수행하는 것을 특징으로 하는 검출 방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 b)단계에서 서로 다른 표지물질로 표지된 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 사용하고,
    상기 c)단계에서 상기 정방향 프라이머의 표지물질 및 역방향 프라이머의 표지물질이 모두 포함된 증폭산물을 검출하는 것을 특징으로 하는 검출 방법.
  4. 제 3항에 있어서,
    측면흐름검출법을 사용하여 상기 c)단계의 검출을 수행하는 것을 특징으로 하는 검출 방법.
  5. 서열번호 1의 서열로 이루어지는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 서열로 이루어지는 역방향 프라이머를 포함하는 두 단계 중합효소연쇄반응을 이용한 해양 병원성 박테리아 검출용 프라이머 세트.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머는 서로 다른 표지물질로 표지된 것을 특징으로 하는 프라이머 세트.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 프라이머 세트는 측면흐름검출법을 적용하기 위한 것임을 특징으로 하는 프라이머 세트.
  8. 서열번호 3의 서열로 이루어지는 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 서열로 이루어지는 역방향 프라이머를 포함하는 두 단계 중합효소연쇄반응을 이용한 해양 병원성 박테리아 검출용 프라이머 세트.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머는 서로 다른 표지물질로 표지된 것을 특징으로 하는 프라이머 세트.
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 프라이머 세트는 측면흐름검출법을 적용하기 위한 것임을 특징으로 하는 프라이머 세트.
  11. 서열번호 5의 서열로 이루어지는 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 서열로 이루어지는 역방향 프라이머를 포함하는 두 단계 중합효소연쇄반응을 이용한 해양 병원성 박테리아 검출용 프라이머 세트.
  12. 제 11항에 있어서,
    상기 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머는 서로 다른 표지물질로 표지된 것을 특징으로 하는 프라이머 세트.
  13. 제 12항에 있어서,
    상기 프라이머 세트는 측면흐름검출법을 적용하기 위한 것임을 특징으로 하는 프라이머 세트.
  14. 서열번호 1의 서열로 이루어지는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 서열로 이루어지는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트;
    서열번호 3의 서열로 이루어지는 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 서열로 이루어지는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트; 및
    서열번호 5의 서열로 이루어지는 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 서열로 이루어지는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트; 중에서 선택된 프라이머 세트를 포함하는 두 단계 중합효소연쇄반응을 이용한 해양 병원성 박테리아 검출용 조성물.
  15. 제 14항에 있어서,
    상기 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머는 서로 다른 표지물질로 표지된 것을 특징으로 하는 조성물.
  16. 제 15항에 있어서,
    상기 조성물은 측면흐름검출법을 적용하기 위한 것임을 특징으로 하는 조성물.
  17. 서열번호 1의 서열로 이루어지는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 서열로 이루어지는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트;
    서열번호 3의 서열로 이루어지는 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 서열로 이루어지는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트; 및
    서열번호 5의 서열로 이루어지는 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 서열로 이루어지는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트; 중에서 선택된 프라이머 세트를 포함하는 두 단계 중합효소연쇄반응을 이용한 해양 병원성 박테리아 검출용 키트.
  18. 제 17항에 있어서,
    상기 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머는 서로 다른 표지물질로 표지된 것을 특징으로 하는 키트.
  19. 제 18항에 있어서,
    상기 키트는 측면흐름검출법을 적용하기 위한 것임을 특징으로 하는 키트.
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