KR20210063169A - Composition for inhibiting Myeloid-Derived Suppressor Cells comprising Ginsenoside Rg3 - Google Patents

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KR20210063169A
KR20210063169A KR1020190151749A KR20190151749A KR20210063169A KR 20210063169 A KR20210063169 A KR 20210063169A KR 1020190151749 A KR1020190151749 A KR 1020190151749A KR 20190151749 A KR20190151749 A KR 20190151749A KR 20210063169 A KR20210063169 A KR 20210063169A
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최유진
송중현
허규
박성준
엄다영
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한국원자력의학원
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Abstract

The present invention relates to a composition for inhibiting myeloid-derived suppressor cells containing ginsenoside Rg3, and more specifically, to an immunological anti-tumor therapy applying ginsenoside Rg3 as a method for identifying a role of myeloid-derived suppressor cells in the treatment of breast cancer and inhibiting the same. Administration of ginsenoside Rg3 in breast cancer patients according to the present invention not only suppresses myeloid-derived suppressor cells, but also regulates tumor stem cell ability and epithelial mesenchymal transition which are activated through the myeloid-derived suppressor cells, thereby preventing the progression of breast cancer per se. Thus, it is expected that the composition can be applied as a direct anti-tumor substance to breast cancer or as an adjuvant method to increase the effect of other anti-cancer or immunotherapies and to reduce an amount used and resistance.

Description

진세노사이드 Ｒｇ３를 함유하는 골수-유래 억제세포 저해용 조성물 {Composition for inhibiting Myeloid-Derived Suppressor Cells comprising Ginsenoside Rg3}Composition for inhibiting Myeloid-Derived Suppressor Cells comprising Ginsenoside Rg3

본 발명은 진세노사이드 Rg3를 함유하는 골수-유래 억제세포 저해용 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 진세노사이드 Rg3의 골수 유래 억제 세포 조절 효과를 통한 유방암 종양 줄기 세포능과 중간엽 이행의 억제하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for inhibiting bone marrow-derived suppressor cells containing ginsenoside Rg3, and more specifically, inhibiting breast cancer tumor stem cell ability and mesenchymal migration through the regulating effect of bone marrow-derived suppressor cells of ginsenoside Rg3. it's about how

유방암은 전세계적으로 가장 많이 진단되고 있는 여성 암으로서, 2019년도에는 새로이 진단되는 여성 암 전체의 3분의 1 가량이 유방암일 것으로 추측되고 있으며, 전체 암 사망률의 15%를 차지하는 무서운 암으로 알려져 있다. 이러한 사망률은 최근 들어 유방암의 조기 진단과 다양한 중재술의 발전으로 빠르게 감소되고 있으나, 여전히 많은 수의 진행된 암을 지닌 환자들은 종합적이고 공격적인 유방암 치료에도 매우 불량한 예후를 가지고 있다. 더욱이, 몇몇 화학 항암 요법을 통한 치료가 객관적인 효과를 갖고 있음이 입증되었음에도 불구하고, 이러한 항암 요법에 대해 부작용이 나타나거나 치료에 대한 저항성을 보이는 경우가 많아 치료에 여러 한계를 갖고 있다. 따라서, 약물의 독성과 저항성을 낮추며, 종양 진행을 저해하고, 이로써 환자의 수명과 삶의 질을 늘릴 수 있는 새롭고 유망한 치료 전략이 필요한 상황이다.Breast cancer is the most diagnosed female cancer worldwide, and it is estimated that about one-third of all newly diagnosed female cancers in 2019 will be breast cancer, and it is known as a dreadful cancer that accounts for 15% of all cancer deaths. . Although this mortality rate has recently been rapidly decreasing due to the development of early diagnosis and various interventions for breast cancer, patients with a large number of advanced cancers still have a very poor prognosis even with comprehensive and aggressive breast cancer treatment. Moreover, despite the fact that treatment through some chemotherapy has been proven to have an objective effect, there are many cases where side effects appear or resistance to treatment appears to these anticancer therapies, so there are several limitations in treatment. Therefore, there is a need for new and promising therapeutic strategies that can lower the toxicity and resistance of drugs, inhibit tumor progression, and thereby increase the lifespan and quality of life of patients.

다양한 악성 종양의 종양 미세환경 (Tumor microenvironment)에서 종양 유래의 면역 억제와 면역 반응 회피는 종양의 악성 진행과 면역 치료 반응 저해에 중요한 요소로 알려져 있다. 골수 유래 억제 세포 (Myeloid-derived suppressor cell, MDSC)는 골수 유래의 세포들이 정상적으로 분화되지 못하고 미성숙한 단계에 있는 세포들로, 정상적으로 분화된 성숙 골수계 세포들과 다른 기능을 나타내는 골수계 세포들을 일컫는다. 이들은 악성 종양이나 만성 염증 등의 병리적 상황에서 미성숙 골수 세포의 정상 분화가 저해됨으로써 나타나게 되고, 점차 그 수가 증가하여 체내에 영향을 미치게 된다. 골수 유래 억제 세포들은 대표적으로 종양 유래의 면역 억제에 작용하며, 직접적으로 종양 진행에도 영향을 미쳐, 종양의 혈관 신생, 침습 및 전이 등을 촉진하는 것으로 알려져 있다. 골수 유래 억제 세포의 주된 면역 억압 기작은 T-세포와 밀접한 관련이 있으며, 이외에도 전반적인 면역 세포에 모두 영향을 미친다고 밝혀져 있다. 이들의 T-세포 관련 면역 억압은 아르기네이즈-1 (Arginase-1, ARG1), 유도성 산화 질소 합성효소 (inducible nitric oxide synthase, iNOS), 활성 산소 (reactive oxygen species, ROS) 생성 및 증가에 기인하며, 이에 따라 T-세포의 기능 장애와 자가 사멸 (Apoptosis)이 유발된다. 또한 골수 유래 억제 세포는 TGF-β나 IL-10과 같은 면역 억제 사이토카인들을 분비함으로써 조절 T-세포 (Regulatory T-cell) 활성화를 유도한다. In the tumor microenvironment of various malignancies, tumor-derived immune suppression and immune response evasion are known to be important factors for tumor malignant progression and inhibition of immunotherapy response. Myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) are cells in an immature stage without normal differentiation of bone marrow-derived cells, and refer to myeloid-derived cells that exhibit different functions from normally differentiated mature myeloid cells. . They appear by inhibiting the normal differentiation of immature bone marrow cells in pathological conditions such as malignant tumors or chronic inflammation, and gradually increase in number and affect the body. Bone marrow-derived suppressor cells are known to typically act on tumor-derived immune suppression and directly affect tumor progression, promoting tumor angiogenesis, invasion, and metastasis. The main immunosuppressive mechanism of bone marrow-derived suppressor cells is closely related to T-cells, and in addition, it has been shown to affect all immune cells in general. Their T-cell-related immune suppression is related to the production and increase of arginase-1 (Arginase-1, ARG1), inducible nitric oxide synthase (iNOS), and reactive oxygen species (ROS). As a result, T-cell dysfunction and apoptosis are induced. In addition, bone marrow-derived suppressor cells induce regulatory T-cell activation by secreting immunosuppressive cytokines such as TGF-β and IL-10.

마우스의 골수 유래 억제 세포는 골수계 세포 마커인 CD11b와 과립구 마커인 Gr1을 특징적으로 발현하며, 이러한 표현형적 특징을 통해 혈구 세포 중 골수 유래 억제 세포를 분리할 수 있다. 이들 중 Gr1은 Ly6C와 Ly6G의 두 가지의 구분되는 항원 결정 부위 (Epitope)를 지니고 있으며, 이들을 통하여 단핵구성 골수 유래 억제 세포 (Monocytic MDSC, M-MDSC)와 과립구성 다형핵성 골수 유래 억제 세포 (Polymorphonuclear MDSC, PMN-MDSC) 두 가지로 하위 분류하고 있다.Bone marrow-derived suppressor cells from mice characteristically express CD11b, a myeloid cell marker, and Gr1, a granulocyte marker, and through these phenotypic characteristics, bone marrow-derived suppressor cells can be isolated from blood cells. Among them, Gr1 has two distinct epitope, Ly6C and Ly6G, through which, monocytic bone marrow-derived suppressor cells (Monocytic MDSC, M-MDSC) and granulocytic polymorphonuclear bone marrow-derived suppressor cells (Polymorphonuclear) are present. MDSC and PMN-MDSC) are subdivided into two categories.

최근 들어, 다른 악성 종양들과 함께 유방암 환자의 순환계와 종양 조직에서 골수 유래 억제 세포의 증가에 대해 활발히 연구가 이루어지고 있다. 이러한 연구들은 골수 유래 억제 세포의 증가가 종양 부담 (Tumor burden) 증가와 유의적인 연관 관계가 있을 것으로 보고 있으며, 또한 골수 유래 억제 세포와 종양간의 상호작용을 조절하는 것이 유방암 환자에게 유망한 치료 전략으로 적용될 수 있을 것으로 예상하고 있다.Recently, along with other malignant tumors, studies have been actively conducted on the increase of bone marrow-derived suppressor cells in the circulatory system and tumor tissues of breast cancer patients. These studies suggest that an increase in bone marrow-derived suppressor cells has a significant relationship with an increase in tumor burden, and modulating the interaction between bone marrow-derived suppressor cells and tumors can be applied as a promising therapeutic strategy for breast cancer patients. expect to be able to.

종양 줄기 세포 (Cancer stem cell)는 종양에서 발견되는 종양 세포들 중 한 종류의 세포로, 줄기 세포와 같은 기능 (Stem cell-like properties)을 특징으로 갖는다 하여 종양 줄기 세포라 불린다. 이러한 종양 줄기 세포의 기능을 종양 줄기능 (Cancer stemness)라고 표현하며, 자가 재생 (Self-renewal)과 분화 (Differentiation) 및 그로 인한 종양 형성을 대표적인 특징으로 한다. 종양 줄기 세포의 이러한 기능은 종양을 유발시키고 전이시키며, 종양의 제거나 치료 후에도 다시 재발시키는 중요한 역할을 한다. 또한 종양 치료에 있어 여러 항종양 약물에 대한 저항성을 유발하는 대표적인 인자로도 알려져 있다. 따라서 이미 형성된 종양을 저해하거나 치료하는 종양 치료 방법보다, 종양 줄기 세포를 선택적으로 저해하는 치료 방법이 더욱 효과적으로 악성 종양 환자의 생존 기간을 늘리고 삶의 질을 높일 수 있을 것으로 여겨지고 있다.A tumor stem cell is a type of cell among tumor cells found in tumors, and is called a tumor stem cell because it has stem cell-like properties. This function of tumor stem cells is expressed as tumor stemness, and is characterized by self-renewal and differentiation and tumor formation resulting therefrom. These functions of tumor stem cells play an important role in inducing and metastasizing tumors, and recurring tumors even after removal or treatment. It is also known as a representative factor inducing resistance to various anti-tumor drugs in tumor treatment. Therefore, it is believed that a treatment method that selectively inhibits tumor stem cells can more effectively increase the survival period and quality of life of malignant tumor patients than a tumor treatment method that inhibits or treats an already formed tumor.

종양 세포의 상피 중간엽 이행(EMT, Epithelial Mesenchymal Transition)은 종양 상피 세포 간의 부착성과 상피 극성을 상실하고 이동성과 침습성을 갖게 되는 세포 현상으로, 이들은 종양 줄기 세포들의 발생을 촉진하는 기능을 갖고 종양 세포의 혈관 침입 및 전이에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 따라서 종양 세포의 상피 중간엽 이행 억제를 통해 항종양 효과를 기대해 볼 수 있다.Epithelial Mesenchymal Transition (EMT) of tumor cells is a cellular phenomenon in which adhesion and epithelial polarity between tumor epithelial cells are lost, and they become mobile and invasive. They have the function of promoting the development of tumor stem cells and tumor cells It is known to play an important role in vascular invasion and metastasis of Therefore, anti-tumor effect can be expected through inhibition of epithelial mesenchymal migration of tumor cells.

Panax ginseng C.A라는 식물의 뿌리인 인삼은 전세계적으로 널리 알려진 전통 약물로, 강장 등의 목적으로 아시아에서 약 2000년이 넘는 긴 시간 동안 사용되어 왔다. 이러한 인삼과 인삼 추출물의 효과에 대해 객관적인 정보를 얻고자 이미 오랜 기간 많은 연구가 진행되어 왔고, 다양한 약리적 효능들이 확인되었다. 진세노사이드 Rg3 (Ginsenoside Rg3)는 인삼으로부터 추출된 물질 중 하나로 인삼의 주된 활성물질로 알려져 있으며, 특히 항종양 효과를 보이는 것으로 밝혀져, 다양한 종양에서 이를 치료에 적용하고자 많은 노력이 이루어지고 있다. 대표적으로 유방암, 소화기암, 폐암, 난소암, 전립선암 등의 악성 종양에서 연구를 통해 그 항종양 효과를 확인할 수 있었으며, 진세노사이드 Rg3의 항종양 효과에 대한 기작 연구 또한 활발히 이루어지고 있다. 진세노사이드 Rg3의 알려진 항암 기작으로는 종양 세포의 자가 사멸 유도, 증식과 전이, 신생혈관 생성 억제, 항암 화학요법 민감성 증가와 화학요법 부작용 감소 등이 있다. 또한 이전 한 연구에서는 진세노사이드 Rg3가 면역 조절 효과를 나타내어 간접적으로 잠재적인 항종양 효과를 나타낸다고 보고하기도 하였다. 그러나 아직까지도 종양에서의 진세노사이드 Rg3의 정확한 효과 및 기작에 대해서는 더욱 많은 연구가 필요한 실정이다. Ginseng, the root of a plant called Panax ginseng CA, is a traditional drug widely known around the world and has been used in Asia for over 2000 years for tonic purposes. In order to obtain objective information about the effects of ginseng and ginseng extract, many studies have already been conducted for a long time, and various pharmacological effects have been confirmed. Ginsenoside Rg3 (Ginsenoside Rg3) is one of the substances extracted from ginseng, and is known as the main active substance of ginseng, and it has been found to have an anti-tumor effect in particular, and many efforts are being made to apply it to treatment in various tumors. Representatively, the antitumor effect could be confirmed through research on malignant tumors such as breast cancer, digestive cancer, lung cancer, ovarian cancer, and prostate cancer, and mechanistic studies on the antitumor effect of ginsenoside Rg3 are also being actively conducted. Known anticancer mechanisms of ginsenoside Rg3 include induction of apoptosis of tumor cells, proliferation and metastasis, inhibition of angiogenesis, increased sensitivity to chemotherapy and reduced side effects of chemotherapy. In addition, a previous study reported that ginsenoside Rg3 exhibits immunomodulatory effects and indirectly exhibits potential antitumor effects. However, more research is still needed on the exact effect and mechanism of ginsenoside Rg3 in tumors.

본 발명자들은 마우스의 유방암 세포주 FM3A 및 유방암 동물 모델에서 진세노사이드 Rg3 적용을 통해 종양 세포에 미치는 영향을 확인하던 중, 진세노사이드 Rg3가 골수 유래 억제 세포를 조절하는 것을 확인할 수 있었으며, 골수 유래 억제 세포 조절을 통하여 유방암 종양 줄기 세포를 저해함으로써 항종양 효과를 보이는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.The present inventors were able to confirm that ginsenoside Rg3 regulates bone marrow-derived suppressor cells while confirming the effect on tumor cells through the application of ginsenoside Rg3 in mouse breast cancer cell line FM3A and breast cancer animal model, and bone marrow-derived suppression By inhibiting breast cancer tumor stem cells through cell regulation, it was discovered that an antitumor effect was achieved, and the present invention was completed.

KR 1004859360000 BKR 1004859360000 B KR 1019023550000 BKR 1019023550000 B

따라서, 본 발명의 목적은 유방암에서 진세노사이드 Rg3 적용을 통하여 골수 유래 억제 세포 조절 효과를 제공하는데 있다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a regulating effect of bone marrow-derived suppressor cells through application of ginsenoside Rg3 in breast cancer.

본 발명의 또 다른 목적은 진세노사이드 Rg3 적용을 통하여 골수 유래 억제 세포를 조절함으로써, 골수 유래 억제 세포에 의해 활성화되는 유방암 종양 줄기 세포를 억제하여 최종적으로 종양의 진행을 막는데 있으며, 이를 바탕으로 진세노사이드 Rg3를 유방암 치료의 새로운 항종양 물질로 제공하는데 있다.Another object of the present invention is to inhibit breast cancer tumor stem cells activated by bone marrow-derived suppressor cells by regulating bone marrow-derived suppressor cells through application of ginsenoside Rg3, thereby ultimately preventing tumor progression. The goal is to provide ginsenoside Rg3 as a novel anti-tumor agent for the treatment of breast cancer.

본 발명의 또 다른 목적은 진세노사이드 Rg3 치료가 유방암과 골수 유래 억제 세포 간의 상호 작용에 어떠한 영향을 미치는가에 대해 기전 관계를 이해하여 기존 항암 치료나 면역 치료의 한계를 극복하고 보조하는 물질로 진세노사이드 Rg3를 제공하는데 있다.Another object of the present invention is to overcome the limitations of conventional anti-cancer or immunotherapy by understanding the mechanism and relationship of how ginsenoside Rg3 treatment affects the interaction between breast cancer and bone marrow-derived suppressor cells It is to provide the senoside Rg3.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 진세노사이드 Rg3를 유효성분으로 함유하는 골수-유래 억제세포(myeloid-derived suppressor cells) 저해용 조성물을 제공한다.According to one aspect of the present invention, the present invention provides a composition for inhibiting myeloid-derived suppressor cells containing ginsenoside Rg3 as an active ingredient.

본 발명에 있어서, "골수-유래 억제세포"는 세포독성 T 림프구 (cytotoxic T lymphocyte)의 활성을 저해함으로써 면역을 억제하는 기능을 한다. 자가면역과 같이 불필요한 과도한 면역 반응을 억제하는 순기능이 있지만, 면역 반응이 필요한 상황에서 면역을 억제하여 질병을 발생시키거나 악화시키거나 또는 적절한 치료를 방해하는 역기능도 있다. 예컨대, 골수-유래 억제세포는 종양 또는 암 환자에서 많이 증가되어 있는데, 이는 암 백신 투여의 효과를 현저히 감소시킴으로써 암 백신의 효능을 무력화시킨다. 이러한 상황에서 골수-유래 억제세포의 수를 효과적으로 감소시킨다면 암 치료를 원활하고 효과적으로 수행할 수 있게 될 것이다.In the present invention, the "bone marrow-derived suppressor cells" function to suppress immunity by inhibiting the activity of cytotoxic T lymphocytes. It has a positive function of suppressing an unnecessary excessive immune response, such as autoimmunity, but it also has a negative function of suppressing immunity in situations where an immune response is required to cause or aggravate a disease or prevent an appropriate treatment. For example, bone marrow-derived suppressor cells are greatly increased in tumor or cancer patients, which significantly reduces the effectiveness of cancer vaccine administration, thereby neutralizing the efficacy of cancer vaccines. In this situation, if the number of bone marrow-derived suppressor cells is effectively reduced, cancer treatment can be performed smoothly and effectively.

본 발명에 있어서, "골수-유래 억제세포 저해"는 골수-유래 억제세포의 수를 감소시키는 것뿐만 아니라, 골수-유래 억제세포의 활성을 억제시키는 것까지도 포함한다. 수를 감소시키는 것은 세포의 생성을 억제하는 것뿐만 아니라, 이미 생성된 세포를 사멸시키거나 다른 세포로 분화시키는 것도 포함한다. 그 외에도 생물학적 관점에서 "저해"라고 지칭되고 있는 모든 매커니즘이 포함된다.In the present invention, "inhibition of bone marrow-derived suppressor cells" includes not only reducing the number of bone marrow-derived suppressor cells, but also inhibiting the activity of bone marrow-derived suppressor cells. Reducing the number includes not only inhibiting the production of cells, but also killing or differentiating cells that have already been produced. In addition, all mechanisms that are referred to as "inhibition" from a biological point of view are included.

본 발명에 있어서, 바람직하게는 유방암을 갖는 개체의 골수-유래 억제세포에 의한 면역 반응 저하의 완화, 치료 또는 예방용으로 사용되는 것을 특징으로 하는 골수-유래 억제세포 저해용 조성물을 제공한다.In the present invention, preferably, there is provided a composition for inhibiting bone marrow-derived suppressor cells, characterized in that it is used for alleviation, treatment or prevention of decreased immune response by bone marrow-derived suppressor cells of an individual having breast cancer.

본 발명에 있어서, 바람직하게는 진세노사이드 Rg3는 골수-유래 억제 세포의 저해 효과를 통해 유방암 세포의 종양 줄기 세포능과 중간엽 이행을 억제하는 것을 특징으로 하는 골수-유래 억제세포 저해용 조성물을 제공한다.In the present invention, preferably, ginsenoside Rg3 is a composition for inhibiting bone marrow-derived suppressor cells, characterized in that it inhibits tumor stem cell ability and mesenchymal migration of breast cancer cells through the inhibitory effect of bone marrow-derived suppressor cells. to provide.

본 발명에 있어서, 바람직하게는 진세노사이드 Rg3는 골수-유래 억제 세포에 의해 유방암 세포에서 분비되는 종양 유래 사이토카인들(CXCL1, CCL3, CXCL2, TIMP-1, TNF-α)을 감소시키고, 골수-유래 억제 세포에 의해 증가된 G-CSF 생성 증가와 이에 따른 STAT3의 활성화 증가를 감소시키고, 골수-유래 억제 세포에 의해 증가된 NO 생성 증가와 NOTCH 신호 경로 연관 유전자들의 활성화 증가를 감소시키는 것을 특징으로 하는 골수-유래 억제세포 저해용 조성물을 제공한다.In the present invention, preferably, ginsenoside Rg3 reduces tumor-derived cytokines (CXCL1, CCL3, CXCL2, TIMP-1, TNF-α) secreted from breast cancer cells by bone marrow-derived suppressor cells, and the bone marrow -Characterized by reducing the increase in G-CSF production increased by the derived suppressor cells and thus the increase in the activation of STAT3, and by decreasing the increased NO production increased by the bone marrow-derived suppressor cells and the increased activation of the NOTCH signaling pathway related genes It provides a composition for inhibiting bone marrow-derived suppressor cells.

본 발명에 있어서, 바람직하게는 유방암의 항암제 또는 항암보조제로 사용되는 것을 특징으로 하는 골수-유래 억제세포 저해용 조성물을 제공한다.In the present invention, it provides a composition for inhibiting bone marrow-derived suppressor cells, characterized in that it is preferably used as an anticancer agent or an anticancer adjuvant for breast cancer.

본 발명에 따른 조성물은 제제화할 경우, 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다.The composition according to the present invention is prepared using diluents or excipients, such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, surfactants, and the like, commonly used when formulating.

경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환자, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 본 발명의 데시타빈에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.Solid preparations for oral administration include tablets, patients, powders, granules, capsules, troches, and the like, and such solid preparations include one or more decitabine of the present invention and at least one excipient, for example, starch, calcium carbonate, It is prepared by mixing sucrose or lactose or gelatin. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate talc are also used. Liquid formulations for oral administration include suspensions, solutions, emulsions, or syrups. In addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin, various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives may be included. can

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다.Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspension solutions, emulsions, lyophilized formulations, suppositories, and the like.

비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.Non-aqueous solvents and suspensions may include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate. As the base of the suppository, witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin, glycerol, gelatin, etc. may be used.

본 발명에 따른 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.The composition according to the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount. In the present invention, "pharmaceutically effective amount" means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level is the type, severity, and drug activity of the patient. , sensitivity to drugs, administration time, administration route and excretion rate, duration of treatment, factors including concurrent drugs, and other factors well known in the medical field. The composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be administered single or multiple. In consideration of all of the above factors, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect with a minimum amount without side effects, which can be easily determined by those skilled in the art.

구체적으로, 본 발명에 따른 조성물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 kg 당 0.1 mg 내지 100 mg, 바람직하게는 0.5 mg 내지 10 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.Specifically, the effective amount of the composition according to the present invention may vary depending on the patient's age, sex, and weight, and generally 0.1 mg to 100 mg, preferably 0.5 mg to 10 mg per kg of body weight, is administered daily or every other day. Or it can be administered in divided doses 1 to 3 times a day. However, since it may increase or decrease depending on the route of administration, the severity of obesity, sex, weight, age, etc., the dosage is not intended to limit the scope of the present invention in any way.

본 발명의 진세노사이드 Rg3를 포함하는 골수-유래 억제 세포 저해제는 항암 보조제로 사용될 수도 있다. 상기 보조제는 항암제와 병용 투여하는 것이 바람직하며, 골수-유래 억제세포를 억제하여 항암제의 효과를 유의적으로 상승시키는 항암 보조효과를 나타낼 수 있다.The bone marrow-derived suppressor cell inhibitor comprising the ginsenoside Rg3 of the present invention may also be used as an anticancer adjuvant. The adjuvant is preferably administered in combination with an anticancer agent, and may exhibit an anticancer adjuvant effect that significantly increases the effect of the anticancer agent by inhibiting bone marrow-derived suppressor cells.

상기 항암제는 화학치료제, 타겟화된 치료제, 항체 치료제, 면역치료제 및 호르몬 치료제로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.The anticancer agent is preferably at least one selected from the group consisting of a chemotherapeutic agent, a targeted therapeutic agent, an antibody therapeutic agent, an immunotherapeutic agent, and a hormonal therapeutic agent, but is not limited thereto.

상기 화학치료제는 예를 들어, 대사길항물질(예를 들어, 폴산, 푸린, 및 피리미딘 유도체), 알킬화제(예를 들어, 질소 머스타드, 니트로소우레아, 백금, 알킬 설포네이트, 히드라진, 트리아젠, 아지리딘, 방추체 저해제, 세포독성제, 토포이소머라제 억제제 및 기타), 및 저메틸화제(예를 들어, 제불라린, 이소티오시아네이트, 아자시티딘(5-아자시티딘), 5-플루오로-2'-데옥시시티딘, 5,6-디하이드로-5-아자시티딘 및 기타)가 있으나 이에 한정되지 않는다.Such chemotherapeutic agents include, for example, antimetabolites (eg, folic acid, purine, and pyrimidine derivatives), alkylating agents (eg, nitrogen mustards, nitrosoureas, platinum, alkyl sulfonates, hydrazine, triazines, aziridine, spindle inhibitors, cytotoxic agents, topoisomerase inhibitors and others), and hypomethylating agents (eg, zebularine, isothiocyanate, azacitidine (5-azacytidine), 5- fluoro-2'-deoxycytidine, 5,6-dihydro-5-azacytidine and others).

상기 타겟화된 치료제는 암 세포의 조절되지 않는 단백질에 대해 특이적인 제제로 예를 들어, 티로신 키나제 억제제, 예를 들어 악시티니브(Axitinib), 보수티니브(Bosutinib), 세디라니브(Cediranib), 다사티니브(dasatinib), 에르로티니브(erlotinib), 이마티니브(imatinib), 게피티니브(gefitinib), 라파티니브(lapatinib), 레스타우르티니브(Lestaurtinib), 닐로티니브(Nilotinib), 세막사니브(Semaxanib), 소라페니브(Sorafenib), 수니티니브(Sunitinib), 및 반데타니브(Vandetanib), 및 또한, 시클린-의존성 키나제 억제제, 예를 들어 알보시디브(Alvocidib) 및 셀리시크리브(Seliciclib)가 있으나 이에 한정되지 않는다.The targeted therapeutic agent is an agent specific for a protein that is not regulated in cancer cells, for example, a tyrosine kinase inhibitor, such as Axitinib, Bosutinib, Cediranib. , dasatinib, erlotinib, imatinib, gefitinib, lapatinib, restaurtinib, nilotinib , Semaxanib, Sorafenib, Sunitinib, and Vandetanib, and also cyclin-dependent kinase inhibitors such as Alvocidib and Seliciclib, but is not limited thereto.

상기 항체 치료제는 암 세포의 표면 상에서 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 제제로 예를 들어, 트라스투주맙(trastuzumab), 리툭시맙(rituximab), 토시투모맙(Tositumomab), 세툭시맙(Cetuximab), 파니투무맙(Panitumumab), 알렘투주맙(Alemtuzumab), 베바시주맙(Bevacizumab), 에드레콜로맙(Edrecolomab), 및 겜투주맙(Gemtuzumab)이 있으나 이에 한정되지 않는다.The antibody therapeutic agent is an antibody preparation that specifically binds to a protein on the surface of cancer cells, for example, trastuzumab, rituximab, tositumomab, cetuximab) , Panitumumab, Alemtuzumab, Bevacizumab, Edrecolomab, and Gemtuzumab.

상기 면역 치료제는 종양을 공격하기 위해 피검체의 자체 면역계를 유도하도록 설계된 제제로 예를 들어, 이필리루맙(ipilimumab), 아벨루맙(avelumab), 니볼루맙(nivolumab), 및 펨브롤리주맙(pembrolizumab)이 있으나 이에 한정되지 않는다.The immunotherapeutic agent is an agent designed to induce the subject's own immune system to attack a tumor, for example, ipilimumab, avelumab, nivolumab, and pembrolizumab. but is not limited thereto.

상기 호르몬 치료제는 특정 암에서 호르몬을 제공하거나 차단함으로써 암의 성장을 억제하는 제제로 예를 들어, 타목시펜(tamoxifen), 및 디에틸스틸베스테롤(diethylstilbestrol)이 있으나 이에 한정되지 않는다.The hormone therapeutic agent is an agent that inhibits cancer growth by providing or blocking hormones in a specific cancer, for example, tamoxifen, and diethylstilbestrol, but is not limited thereto.

상기 항암제의 적절한 투여량은 이미 당업계에 널리 알려져 있으므로, 각 환자의 상태에 따라 당업계에 알려진 기준에 의해 투여할 수 있다. 구체적인 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 이의 1일 투여 용량은 예를 들어 구체적으로는 1 mg/kg/일 내지 10 g/kg/일, 더 구체적으로는 10 mg/kg/일 내지 100 mg/kg/일이 될 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 투여하고자 하는 대상의 연령, 건강 상태, 합병증 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있다.Since the appropriate dosage of the anticancer agent is already widely known in the art, it may be administered according to the standards known in the art according to the condition of each patient. Specific dosage determinations are within the level of one of ordinary skill in the art, and the daily dosage thereof is, for example, specifically 1 mg/kg/day to 10 g/kg/day, more specifically 10 mg/kg/day to 100 mg It may be /kg/day, but is not limited thereto, and may vary depending on various factors such as the age, health condition, and complications of the subject to be administered.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 골수 유래 억제 세포 (Myeloid-derived suppressor cell)조절을 특징으로 하는 유방암 억제 물질인 진세노사이드 Rg3를 제공한다.According to one aspect of the present invention, the present invention provides a ginsenoside Rg3, a breast cancer suppressor substance characterized by the regulation of myeloid-derived suppressor cells.

본 발명에 있어서, 상기 골수 유래 억제 세포는 종양 동물에서 유래한 미성숙 골수 세포로서, 종양 유래 면역 억제를 심화시키고, 종양 심화에 직접적으로 관여하는 세포로 알려져 있다.In the present invention, the bone marrow-derived suppressor cells are immature bone marrow cells derived from tumor animals, and are known as cells that deepen tumor-derived immune suppression and are directly involved in tumor deepening.

본 발명에 있어서, 상기 골수 유래 억제 세포는 유방암을 지닌 마우스의 비장에서 분리한 골수 유래 억제 세포를 의미하며, 단핵구성 골수 유래 억제 세포와 과립구성 다형핵성 골수 유래 억제 세포 모두를 포함한다. 본 발명자들은 비장 유래의 다양한 세포들에 대하여 CD11b와 Gr1 표현형으로 갖는 세포들을 선별하여 골수 유래 억제 세포들을 얻을 수 있었다.In the present invention, the bone marrow-derived suppressor cells refer to bone marrow-derived suppressor cells isolated from the spleen of a mouse with breast cancer, and include both monocytic bone marrow-derived suppressor cells and granulocytic polymorphic bone marrow-derived suppressor cells. The present inventors were able to obtain bone marrow-derived suppressor cells by selecting cells having CD11b and Gr1 phenotypes against various cells derived from the spleen.

본 발명에 있어서, 상기 골수 유래 억제 세포는 유방암 세포의 상피 중간엽 이행을 활성화시키는 능력을 가지며, 이는 결국 유방암을 진행시키는데 중요한 역할을 하고 종양 세포에서 상피 중간엽 이행 관련 인자들을 확인함으로써 종양의 기능적 상태 및 예후를 가늠할 수 있다. In the present invention, the bone marrow-derived suppressor cells have the ability to activate the epithelial mesenchymal migration of breast cancer cells, which in turn plays an important role in the progression of breast cancer, and by identifying factors related to the epithelial mesenchymal transition in the tumor cells, the function of the tumor condition and prognosis.

본 발명에 있어서, 상기 골수 유래 억제 세포는 유방암 종양 줄기 세포를 활성화시키는 능력을 가지며, 이는 역시 유방암을 진행시키는데 중요한 역할을 하므로, 종양 세포에서 종양 줄기 세포의 생존 및 성장 관련 인자들을 확인함으로써 종양의 기능적 상태 및 예후를 가늠할 수 있다. In the present invention, the bone marrow-derived suppressor cells have the ability to activate breast cancer tumor stem cells, which also play an important role in breast cancer progression. Functional status and prognosis can be assessed.

본 발명에 있어서, 상기 진세노사이드 Rg3는 인삼에서 추출한 인삼의 주된 활성 물질로, 진세노사이드 Rg3를 이용한 유방암 치료는 골수 유래 억제 세포의 조절을 통해 유방암 종양 줄기 세포를 억제하여 직접적인 종양의 진행을 억제시키는 방법이다.In the present invention, the ginsenoside Rg3 is the main active substance of ginseng extracted from ginseng, and breast cancer treatment using ginsenoside Rg3 inhibits breast cancer tumor stem cells through the regulation of bone marrow-derived suppressor cells to directly inhibit tumor progression. way to suppress it.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 진세노사이드 Rg3를 유효성분으로 포함하는 유방암 치료용 항종양 물질을 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides an anti-tumor substance for the treatment of breast cancer comprising the ginsenoside Rg3 according to the present invention as an active ingredient.

본 발명의 실시 예에서는 골수 유래 억제 세포로 활성화 된 유방암 세포의 줄기능 (Cancer stemness) 증가와 상피 중간엽 이행 (Epithelial to mesenchymal transition)의 증가를 진세노사이드 Rg3가 유의적으로 저해할 수 있음을 확인하였다. 특히, 유방암 세포주 FM3A를 주사하여 만든 종양 동물 모델에서 진세노사이드 Rg3가 유의하게 유방암의 성장을 억제하는 것을 증명하였다.In an embodiment of the present invention, it was found that ginsenoside Rg3 can significantly inhibit the increase in stemness and epithelial to mesenchymal transition of breast cancer cells activated with bone marrow-derived suppressor cells. Confirmed. In particular, it was demonstrated that ginsenoside Rg3 significantly inhibited the growth of breast cancer in a tumor animal model made by injection of the breast cancer cell line FM3A.

본 발명에 따라 제조된 진세노사이드 Rg3를 이용한 유방암 치료용 약물은 항암제와 같은 직접적인 세포 독성 작용이 아닌 골수 유래 억제 세포 조절을 통하여 효과를 나타내며, 본 효과는 진세노사이드 Rg3가 종양 유도 골수 유래 억제 세포를 억압함으로써, 골수 유래 억제 세포가 활성화 시키는 종양 줄기 세포 및 상피 중간엽 이행 매개 유방암의 진행을 직접적으로 억제할 수 있으므로 안전하게 유방암의 진행을 저해하는데 도움이 될 수 있는 장점이 있다. 따라서 본 발명에 따른 유방암 환자에서의 진세노사이드 Rg3 투여는, 종양에 의한 골수 유래 억제세포의 활성화 억제를 기대해 볼 수 있으며 종양 자체의 진행을 막아 항종양 물질로 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 보조적으로 적용하여 기존에 적용되던 항암 치료나 면역 치료에 대한 효과를 늘리고 그 부작용 및 내성을 줄일 수 있기 때문에 유방암 치료에 효과적으로 적용될 수 있을 것으로 기대된다.The drug for breast cancer treatment using ginsenoside Rg3 prepared according to the present invention exhibits an effect through the regulation of bone marrow-derived suppressor cells rather than a direct cytotoxic action like an anticancer agent, and this effect is that ginsenoside Rg3 inhibits tumor-induced bone marrow-derived By suppressing cells, it is possible to directly inhibit the progression of tumor stem cells and epithelial mesenchymal transition-mediated breast cancer that are activated by bone marrow-derived suppressor cells, so it has the advantage of being able to safely help inhibit the progression of breast cancer. Therefore, the administration of ginsenoside Rg3 in breast cancer patients according to the present invention can be expected to inhibit the activation of bone marrow-derived suppressor cells by the tumor, and can be used as an anti-tumor substance by preventing the progression of the tumor itself, as well as being applied as an adjuvant Therefore, it is expected to be effectively applied to the treatment of breast cancer because it can increase the effectiveness of the previously applied chemotherapy or immunotherapy and reduce its side effects and resistance.

도 1은 FM3A 마우스 유방암 세포주에 의한 마우스 비장의 골수 유래 억제 세포 증가 및 이에 대한 진세노사이드 Rg3의 골수 유래 억제 세포 억제 효과를 비교하여 나타낸다.
도 2는 진세노사이드 Rg3의 적정 적용 농도를 설정하기 위해 실시한 세포 생존율 검사 결과를 나타낸다.
도 3은 골수 유래 억제 세포와 진세노사이드 Rg3에 의한 유방암 세포의 이동 및 침습 변화를 나타낸다.
도 4는 골수 유래 억제 세포와 진세노사이드 Rg3에 의한 유방암 세포의 상피 중간엽 이행 변화를 나타낸다.
도 5는 골수 유래 억제 세포와 진세노사이드 Rg3에 의한 유방암 세포의 줄기 세포능 변화를 나타낸다.
도 6는 골수 유래 억제 세포와 진세노사이드 Rg3에 의한 암 유래 Cytokine과 Chemokine들의 변화를 나타낸다.
도 7은 유방암 세포에서 골수 유래 억제 세포와 진세노사이드 Rg3에 의한 STAT3 전사인자 활성화 조절을 나타낸다.
도 8은 유방암 세포에서 골수 유래 억제 세포와 진세노사이드 Rg3에 의한 NOTCH 신호 전달 활성화 조절을 나타낸다.
도 9는 유방암 동물 모델에서 골수 유래 억제 세포와 진세노사이드 Rg3투여에 의한 종양 성장 비교를 나타낸다.
도 10은 유방암 동물 모델에서 진세노사이드 Rg3투여에 의한 골수 유래 억제 세포의 발현 비교를 나타낸다.
도 11은 유방암 동물 모델에서 진세노사이드 Rg3투여에 의한 종양 조직에서의 암 줄기능, 상피 중간엽 이행 관련 단백질 발현 비교를 나타낸다.
도 12는 유방암 동물 모델에서 진세노사이드 Rg3투여에 의한 혈청 내 G-CSF 농도 비교를 나타낸다.
도 13은 유방암 동물 모델에서 진세노사이드 Rg3투여에 의한 종양 조직에서의 NOTCH 신호 전달 활성화 조절을 나타낸다.1 shows the increase in bone marrow-derived suppressor cells of the mouse spleen by the FM3A mouse breast cancer cell line and the inhibitory effect of the ginsenoside Rg3 on the bone marrow-derived suppressor cells.
Figure 2 shows the results of the cell viability test performed to set the appropriate application concentration of ginsenoside Rg3.
3 shows the migration and invasion changes of breast cancer cells by bone marrow-derived suppressor cells and ginsenoside Rg3.
4 shows changes in the epithelial mesenchymal transition of breast cancer cells by bone marrow-derived suppressor cells and ginsenoside Rg3.
Figure 5 shows the changes in the stem cell capacity of breast cancer cells by bone marrow-derived suppressor cells and ginsenoside Rg3.
6 shows changes in cancer-derived cytokines and chemokines by bone marrow-derived suppressor cells and ginsenoside Rg3.
7 shows the regulation of STAT3 transcription factor activation by bone marrow-derived suppressor cells and ginsenoside Rg3 in breast cancer cells.
8 shows the regulation of NOTCH signaling activation by bone marrow-derived suppressor cells and ginsenoside Rg3 in breast cancer cells.
9 shows a comparison of tumor growth by administration of bone marrow-derived suppressor cells and ginsenoside Rg3 in an animal model of breast cancer.
10 shows a comparison of the expression of bone marrow-derived suppressor cells by administration of ginsenoside Rg3 in an animal model of breast cancer.
11 shows a comparison of expression of cancer stem function and epithelial mesenchymal transition-related protein in tumor tissues by administration of ginsenoside Rg3 in an animal model of breast cancer.
12 shows a comparison of G-CSF concentrations in serum by administration of ginsenoside Rg3 in an animal model of breast cancer.
13 shows the regulation of NOTCH signaling activation in tumor tissues by administration of ginsenoside Rg3 in an animal model of breast cancer.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are only for illustrating the present invention, and therefore, the scope of the present invention should not be construed as being limited by these examples.

실험 예 1: 유방암 세포에 의한 골수 유래 억제 세포 발현 변화 확인Experimental Example 1: Confirmation of changes in the expression of bone marrow-derived suppressor cells by breast cancer cells

FM3A 유방암을 지닌 C3H/He 마우스의 비장 세포를 분리하여 ACK lysis buffer (NH4CL, KHCO3, Na2EDTA)를 처리하여 적혈구를 제거하고 난 뒤 남은 비장 세포를 분리하였다. 비장 세포들은 1% FBS/PBS solution에 혼합한 뒤, 골수 유래 억제 세포만을 분리하기 위해 그 표현형인 CD11b 항체와 Gr1 항체 (Miltenyi Biotec.)로 처리되었다. 이후 유세포 분석기 (FACS Aria Cell Sorter, BD Biosciences)를 사용하여 전체 비장 세포 중 골수 유래 억제 세포 발현 분석을 진행하였다. 또한 분리한 비장 세포를 FM3A 마우스 유방암 세포와 3일간 공동 배양하여 유방암 세포에 의한 골수 유래 억제 세포의 발현 변화를 확인하였다.Splenocytes from C3H/He mice bearing FM3A breast cancer were isolated and treated with ACK lysis buffer (NH 4 CL, KHCO 3 , Na 2 EDTA) to remove red blood cells, and the remaining splenocytes were isolated. Splenocytes were mixed with 1% FBS/PBS solution, and then treated with CD11b antibody and Gr1 antibody (Miltenyi Biotec.) of the phenotype to isolate only bone marrow-derived suppressor cells. Then, using a flow cytometer (FACS Aria Cell Sorter, BD Biosciences), bone marrow-derived suppressor cell expression analysis was performed among all spleen cells. In addition, the isolated spleen cells were co-cultured with FM3A mouse breast cancer cells for 3 days to confirm the expression change of bone marrow-derived suppressor cells by the breast cancer cells.

도 1A에서 보는 바와 같이, 유방암 세포에 의해 배양 3일째의 골수 유래 억제 세포의 발현 비율이 확연히 증가하였다.As shown in FIG. 1A , the expression rate of bone marrow-derived suppressor cells on the third day of culture was significantly increased by breast cancer cells.

실험 예 2: 진세노사이드 Rg3 적정 농도 설정Experimental Example 2: Ginsenoside Rg3 titration setting

본 연구에서는 98% 순도의 진세노사이드 Rg3 (Sigma-Aldrich Chemical Co., USA)를 준비하여 목적에 맞는 방법으로 용매와 농도를 설정하여 사용하였다. 진세노사이드 Rg3를 적용하기 앞서 진세노사이드 Rg3가 세포에 세포 독성을 일으키지 않으며 유의적인 효과를 나타낼 수 있는 적정 농도를 설정하기 위해 세포 생존율 테스트 (Cell viability test)를 진행하였다.In this study, 98% purity of ginsenoside Rg3 (Sigma-Aldrich Chemical Co., USA) was prepared and the solvent and concentration were set according to the purpose and used. Prior to applying ginsenoside Rg3, a cell viability test was performed in order to establish an appropriate concentration that ginsenoside Rg3 does not cause cytotoxicity to cells and can have a significant effect.

연구에 적용할 세포로 마우스 유래 FM3A 유방암 세포와 비장 세포 중 CD11b와 Gr1 표현형에 대해 유세포 분석기를 이용하여 분리한 골수 유래 억제 세포를 준비하였고, 동일한 배양 조건에서 진세노사이드 Rg3를 각기 다른 농도 (0, 3, 6, 12.5, 25 μg/ml)와 배양 시간 (24, 48, 72 hours)으로 적용한 뒤 그 결과를 비교하였다 (도 2).Bone marrow-derived suppressor cells isolated by flow cytometry for CD11b and Gr1 phenotypes among mouse-derived FM3A breast cancer cells and spleen cells were prepared as cells to be used for the study, and ginsenoside Rg3 at different concentrations (0 , 3, 6, 12.5, 25 μg/ml) and incubation time (24, 48, 72 hours) were applied and the results were compared (FIG. 2).

이에 따라 세포 생존율을 비교한 결과, 두 세포 모두에서 12.5 μg/ml까지의 진세노사이드 Rg3 농도에서는 명확한 세포 독성을 보이지 않았으나, 25 μg/ml는 FM3A 세포에 명확한 세포 독성이 유발되어 12 μg/ml까지의 농도를 적용 가능한 가장 높은 농도로 설정하였다.Accordingly, as a result of comparing cell viability, ginsenoside Rg3 concentrations up to 12.5 μg/ml in both cells did not show clear cytotoxicity, but 25 μg/ml induced clear cytotoxicity in FM3A cells and 12 μg/ml The concentration up to was set as the highest applicable concentration.

실험 예 3: 진세노사이드 Rg3에 의한 골수 유래 억제 세포의 조절Experimental Example 3: Regulation of bone marrow-derived suppressor cells by ginsenoside Rg3

계대 배양한 FM3A 세포를 회수하여 1X105 세포에 2 ml의 배지 (RPMI 1640, 10% FBS, 1% Penicillin/Streptomycin)를 첨가하여 각각 6-well plate에 분주하고, 1.0 μm pore insert (Cat. #353102, Falcon, USA)를 이용하여 세포가 섞이지 않도록 한 뒤, 유방암 마우스의 비장에서 회수한 비장 세포를 각 1X106 개씩 3 ml의 동일 배지에 혼합하여 넣어주었다. 이때, 각 well에 각기 다른 농도의 Rg3 (0, 3, 6 and 12 μg/ml)를 처리한 뒤 3일간 배양을 실시하였으며, 3일 뒤 각 well에 있는 비장 세포들을 대상으로 골수 유래 억제 세포의 발현 비율을 확인하기 위해 유세포 분석기를 이용하여 분석을 실시하였다.The subcultured FM3A cells were recovered , 2 ml of medium (RPMI 1640, 10% FBS, 1% Penicillin/Streptomycin) was added to 1X10 5 cells, and each was dispensed in a 6-well plate, and 1.0 μm pore insert (Cat. # 353102, Falcon, USA) was used to prevent cell mixing, and then 1X10 6 spleen cells recovered from the spleen of breast cancer mice were mixed in 3 ml of the same medium and put. At this time, each well was treated with different concentrations of Rg3 (0, 3, 6 and 12 μg/ml) and cultured for 3 days. After 3 days, spleen cells in each well were treated with bone marrow-derived suppressor cells. Analysis was performed using a flow cytometer to confirm the expression rate.

도 1B와 1C에서 확인할 수 있듯이, FM3A 유방암 세포에 의해 증가된 골수 유래 억제 세포가 다시 진세노사이드 Rg3에 의해 농도 의존적으로 감소하였다. ****P< 0.0001. As can be seen in Figures 1B and 1C, bone marrow-derived suppressor cells increased by FM3A breast cancer cells were again reduced in a concentration-dependent manner by ginsenoside Rg3. **** P < 0.0001.

실험 예 4: 진세노사이드 Rg3에 의한 유방암 세포의 세포 이동 조절 효과Experimental Example 4: Cell Migration Control Effect of Breast Cancer Cells by Ginsenoside Rg3

세포 수준에서의 FM3A 세포의 이동과 침습 정도를 확인하기 위해 스크래치 분석 (Scratch assay)을 실시하였다.Scratch assay was performed to confirm the degree of migration and invasion of FM3A cells at the cellular level.

계대 배양한 FM3A 세포를 회수하여 1X105 세포 당 2 ml의 배지 (RPMI 1640, 10% FBS, 1% Penicillin/Streptomycin)를 첨가하여 각각 6-well plate에 분주하고, 1.0 μm pore insert (Falcon, USA)를 이용하여 세포가 섞이지 않도록 한 뒤, 골수 유래 억제 세포를 각 1X106 개씩 3 ml의 동일 배지에 혼합하여 넣어주었다. 이때, 각 well에 각기 다른 농도의 Rg3 (0, 3, 6 and 12 μg/ml)를 처리한 뒤 3일간 배양을 실시하였으며, 3일 뒤 각 well에 있는 FM3A 세포를 회수하였다.Subcultured FM3A cells were recovered, and 2 ml of medium (RPMI 1640, 10% FBS, 1% Penicillin/Streptomycin) was added per 1X10 5 cells, and each was dispensed in a 6-well plate, and 1.0 μm pore insert (Falcon, USA). ) was used to prevent the cells from mixing, and then, 1X10 6 each of the bone marrow-derived suppressor cells were mixed and put in 3 ml of the same medium. At this time, each well was treated with different concentrations of Rg3 (0, 3, 6 and 12 μg/ml) and cultured for 3 days, and FM3A cells in each well were recovered after 3 days.

회수한 FM3A 세포를 3X105 세포 당 2 ml의 배지를 첨가하여 6-well plate에 분주하고 24시간 배양하였다. 세포 단층면에는 멸균된 Pipette 팁을 이용하여 일정한 세포가 없는 부분을 인위적으로 만든 뒤 24 시간을 배양하였고, 이후 세포가 없는 부분을 대상으로 주변의 FM3A 세포들의 이동과 침습 정도를 현미경을 통해 확인하였다.The recovered FM3A cells were aliquoted in a 6-well plate by adding 2 ml of medium per 3X10 5 cells, and cultured for 24 hours. The cell monolayer was artificially made without a certain cell using a sterile pipette tip and cultured for 24 hours. Afterwards, the degree of movement and invasion of the surrounding FM3A cells was confirmed through a microscope in the cell-free area.

도 3에서 보는 바와 같이, 골수 유래 억제 세포에 의해 세포 이동과 침습이 확연하게 증가하였으며, 진세노사이드 Rg3에 의해 이러한 세포 이동이 농도 의존적으로 유의하게 감소하였다.As shown in FIG. 3 , cell migration and invasion were significantly increased by bone marrow-derived suppressor cells, and this cell migration was significantly reduced in a concentration-dependent manner by ginsenoside Rg3.

실험 예 5: 진세노사이드 Rg3에 의한 유방암 세포의 상피 중간엽 세포 이행 조절 효과Experimental Example 5: Effect of ginsenoside Rg3 on epithelial mesenchymal cell migration of breast cancer cells

상피 중간엽 세포 이행 (Epithelial-mesenchymal transition, EMT)은 상피 세포가 극성과 세포간 부착을 잃고 이동하며 침습하는 중간엽 세포의 특성을 갖게 되는 과정을 말한다. 이러한 상피 중간엽 세포 이행은 다양한 발달 과정이나 상처 치유 과정에서 필수적인 과정으로 특히 종양에서 종양의 침습이나 전이에 매우 중요한 역할을 한다. 이에 따라 상피 중간엽 세포 이행 관련 단백질 발현을 웨스턴 블롯법 (Westen blot)을 통하여 확인하였다.Epithelial-mesenchymal transition (EMT) refers to a process in which epithelial cells lose polarity and intercellular adhesion, migrate and have the characteristics of invading mesenchymal cells. This epithelial mesenchymal cell migration is an essential process in various developmental processes and wound healing processes, and plays a very important role in tumor invasion and metastasis, especially in tumors. Accordingly, the expression of epithelial mesenchymal cell migration-related proteins was confirmed by Western blot.

계대 배양한 FM3A 세포를 회수하여 1X105 세포 당 2 ml의 배지 (RPMI 1640, 10% FBS, 1% Penicillin/Streptomycin)를 첨가하여 각각 6-well plate에 분주하고, 1.0 μm pore insert (Falcon, USA)를 이용하여 세포가 섞이지 않도록 한 뒤, 골수 유래 억제 세포를 각 1X106 개씩 3 ml의 동일 배지에 혼합하여 넣어주었다. 이때, 각 well에 각기 다른 농도의 Rg3 (0, 3, 6 and 12 μg/ml)를 처리한 뒤 3일간 배양을 실시하였으며, 3일 뒤 각 well에 있는 FM3A 세포를 회수하였다.Subcultured FM3A cells were recovered, and 2 ml of medium (RPMI 1640, 10% FBS, 1% Penicillin/Streptomycin) was added per 1X10 5 cells, and each was dispensed in a 6-well plate, and 1.0 μm pore insert (Falcon, USA). ) was used to prevent the cells from mixing, and then, 1X10 6 each of the bone marrow-derived suppressor cells were mixed and put in 3 ml of the same medium. At this time, each well was treated with different concentrations of Rg3 (0, 3, 6 and 12 μg/ml) and cultured for 3 days, and FM3A cells in each well were recovered after 3 days.

각 well의 FM3A 세포를 PBS로 1회 씻어낸 후 원심 분리하여 세포 Pellet만 얻어내고, 이에 다시 Lysis buffer (MENTOS Biotechnology)를 넣은 뒤 ICE에서 60분 동안 반응시킨 다음 원심 분리하여 상층액을 추출하였다. 이렇게 얻어진 상층액에서 Bradford protein assay reagent (Bio-Rad)를 이용하여 각 샘플의 단백질량을 정량 하였다. 정량 된 각 단백질 샘플을 SDS-polyacrylamide gel 전기영동을 이용해 분리하고 polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes으로 transfer하고 TBST (TBS with Tween-20, Biosesang)로 희석한 5% 탈지유에 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 다음으로 상피 중간엽 세포 이행과 관련된 단백질 마커인 NOTCH (Santa Cruz Biotechnology), β-catenin (BD biosciences), Vimentin (BD biosciences)에 대한 항체를 사용하여 4℃에서 24시간 동안 반응시켰고, 이 때 β-actin (Santa Cruz Biotechnology)을 대조군으로 사용하였다. 이후 각 항체에 알맞은 horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit and anti-mouse 2차 항체(Invitrogen)를 사용하여 상온에서 1시간 반응 시켜준 뒤 ECLTM Western Blotting Detection Reagents (GE Healthcare) 처리 후 Fusion FX5 image analyzer (Vilber Lourmat)를 이용하여 그 발현 정도를 확인하였다. FM3A cells in each well were washed once with PBS and centrifuged to obtain only cell pellets. Lysis buffer (MENTOS Biotechnology) was added thereto, reacted in ICE for 60 minutes, and then centrifuged to extract the supernatant. In the supernatant thus obtained, the amount of protein in each sample was quantified using Bradford protein assay reagent (Bio-Rad). Each quantified protein sample was separated using SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, transferred to polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes, and reacted in 5% skim milk diluted with TBST (TBS with Tween-20, Biosesang) at room temperature for 1 hour. Next, an antibody against NOTCH (Santa Cruz Biotechnology), β-catenin (BD biosciences), and Vimentin (BD biosciences), which are protein markers related to epithelial mesenchymal cell migration, were used to react at 4° C. for 24 hours, at which time β -actin (Santa Cruz Biotechnology) was used as a control. After that, the appropriate horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit and anti-mouse secondary antibody (Invitrogen) for each antibody was used to react at room temperature for 1 hour, and after treatment with ECL TM Western Blotting Detection Reagents (GE Healthcare), Fusion FX5 image analyzer ( The expression level was confirmed using Vilber Lourmat).

도 4에서 나타난 바와 같이, 골수 유래 억제 세포에 의해 상피 중간엽 세포 이행 관련 마커들이 확연하게 증가하였으며, 진세노사이드 Rg3에 의해 이러한 마커들의 발현이 농도 의존적으로 감소하였다.As shown in FIG. 4 , markers related to epithelial mesenchymal cell migration were significantly increased by bone marrow-derived suppressor cells, and the expression of these markers was decreased in a concentration-dependent manner by ginsenoside Rg3.

실험 예 6: 진세노사이드 Rg3에 의한 유방암 세포의 줄기세포화 조절 효과Experimental Example 6: Stem cellization control effect of breast cancer cells by ginsenoside Rg3

악성 종양 세포 (Malignant cancer)의 종양 세포 줄기 세포능 (Cancer stemness)은 암을 진행시키고 치료에 대한 저항을 유발하는 대표적인 원인 중 하나로, 종양 줄기 세포의 조절은 종양 자체의 조절에 큰 연관을 갖는다. 이에 따라 골수 유래 억제 세포와 진세노사이드 Rg3에 의한 유방암 세포의 종양 세포 줄기능의 변화를 확인하기 위하여 관련 단백질 발현을 웨스턴 블롯법(Westen blot)을 통하여 확인하였다.The tumor cell stemness of malignant cancer cells is one of the representative causes of cancer progression and resistance to treatment, and the regulation of tumor stem cells is highly related to the regulation of the tumor itself. Accordingly, the expression of related proteins was confirmed by Western blot to confirm changes in tumor cell line function of breast cancer cells caused by bone marrow-derived suppressor cells and ginsenoside Rg3.

실험 예 5와 동일한 실험 조건을 통하여 얻어진 단백질 샘플을 대상으로 동일한 실험 과정을 통하여 암 줄기능 관련 단백질 마커인 Glut1 (Santa Cruz Biotechnology), ALDH1 (Santa Cruz Biotechnology), SOX2 (Santa Cruz Biotechnology), OCT4 (BD biosciences), KLF4 (OriGene)의 발현 정도를 비교하였다.Cancer stem function-related protein markers Glut1 (Santa Cruz Biotechnology), ALDH1 (Santa Cruz Biotechnology), SOX2 (Santa Cruz Biotechnology), OCT4 ( BD biosciences) and KLF4 (OriGene) were compared.

도 5에서 나타난 바와 같이, 골수 유래 억제 세포에 의해 종양줄기세포 발현 관련 마커들이 확연하게 증가하였으며, 진세노사이드 Rg3에 의해 이러한 마커들의 발현이 농도 의존적으로 감소하였다.As shown in Figure 5, tumor stem cell expression-related markers were significantly increased by the bone marrow-derived suppressor cells, and the expression of these markers was decreased in a concentration-dependent manner by the ginsenoside Rg3.

실험 예 7: 종양 유래 Cytokine과 Chemokine 변화 분석Experimental Example 7: Analysis of Tumor-derived Cytokine and Chemokine Changes

종양과 골수 유래 억제 세포는 밀접하게 상호작용하며, 간단하게 종양 세포가 분비하는 여러 가지 인자들에 의해 골수 유래 억제 세포가 생성, 증가 되고 활성화 되게 되며, 이는 다시 종양을 진행 시킴으로써 질병 심화의 악순환을 반복 지속하게 된다. 이러한 상호작용에 관여하는 종양 유래 Cytokine들이 다양하게 알려져 있으며, 이들의 조절을 통하여 종양과 골수 유래 억제 세포간의 악순환 고리를 차단할 수 있다.The tumor and bone marrow-derived suppressor cells interact closely, and bone marrow-derived suppressor cells are generated, increased, and activated simply by various factors secreted by the tumor cells, which in turn lead to the progression of the tumor, thereby reducing the vicious cycle of disease aggravation. repeat will continue. Various tumor-derived cytokines involved in this interaction are known, and through their regulation, the vicious cycle between tumor and bone marrow-derived suppressor cells can be blocked.

실험 예 5와 동일한 실험 조건을 통하여 얻어진 각 Well의 배양 상등액을 대상으로 유방암에서 골수 유래 억제 세포와 진세노사이드 Rg3의 효과에 관여하는 Cytokine과 Chemokine들을 분석하고자 mouse cytokine Protein Proteomic Profiler?? Array KIT (Mouse Cytokine Array Panel A, ARY006, R&D Systems)를 사용하여 Cytokine array를 실시한 뒤 Fusion FX5 image analyzer (Vilber Lourmat)를 이용하여 각 Cytokine들의 발현 정도를 확인하였다.To analyze the cytokines and chemokines involved in the effects of bone marrow-derived suppressor cells and ginsenoside Rg3 in breast cancer from the culture supernatant of each well obtained through the same experimental conditions as in Experimental Example 5, mouse cytokine Protein Proteomic Profiler?? After performing the Cytokine array using Array KIT (Mouse Cytokine Array Panel A, ARY006, R&D Systems), the expression level of each Cytokine was confirmed using Fusion FX5 image analyzer (Vilber Lourmat).

Cytokine array 결과 골수 유래 억제 세포에 의해 FM3A 세포에서 분비되는 CXCL1, CCL3, CXCL2, TIMP-1, TNF-α가 증가하고, 진세노사이드 Rg3에 의해 다시 감소하였다 (도 6). 본 결과를 통하여, 다음과 같은 종양 유래 cytokine들이 진세노사이드 Rg3의 골수 유래 억제 세포 관련 종양 심화 억제에 높이 관여하고 있음을 알 수 있었다. As a result of the cytokine array, CXCL1, CCL3, CXCL2, TIMP-1, and TNF-α secreted from FM3A cells by bone marrow-derived suppressor cells increased, and decreased again by ginsenoside Rg3 ( FIG. 6 ). Through this result, it was found that the following tumor-derived cytokines are highly involved in the deep suppression of bone marrow-derived suppressor cell-related tumors of ginsenoside Rg3.

실험 예 8: 골수 유래 억제 세포와 진세노사이드 Rg3의 유방암 조절 효과 기작 분석Experimental Example 8: Mechanism analysis of the breast cancer regulatory effect of bone marrow-derived suppressor cells and ginsenoside Rg3

STAT3와 NOTCH signaling pathway는 암 줄기 세포 (Cancer stem cell)와 골수 유래 억제 세포의 상호작용을 매개하며 유방암의 암 줄기능을 증가시켜 암을 심화시키는 주요 신호 전달 경로로, 골수 유래 억제 세포에 의해 활성화 되는 것으로 알려져 있다. 따라서 골수 유래 억제 세포와 진세노사이드 Rg3에 의한 STAT3와 NOTCH 활성화의 변화를 확인하기 위하여, phosphorylated- STAT3와 NOTCH 활성화 관련 유전자를 측정하기 위한 실험을 진행하였고 또한 관련 경로에 작용하는 다른 인자들의 변화를 비교 확인하고자 하였다.The STAT3 and NOTCH signaling pathways are major signaling pathways that mediate the interaction between cancer stem cells and bone marrow-derived suppressor cells and deepen cancer by increasing the cancer stem function of breast cancer, and are activated by bone marrow-derived suppressor cells. is known to be Therefore, in order to confirm the changes in STAT3 and NOTCH activation by bone marrow-derived suppressor cells and ginsenoside Rg3, an experiment was conducted to measure phosphorylated-STAT3 and NOTCH activation-related genes, and changes in other factors acting on related pathways were also investigated. I wanted to check the comparison.

먼저 STAT3 활성화에 관여하는 주된 Cytokine인 G-CSF를 측정하기 위해, 실험 예 5와 동일한 조건에서 얻어진 배양 상등액을 대상으로 Mouse G-CSF DuoSet ELISA kit (R&D Systems)를 이용하여 ELISA를 진행하였다. G-CSF 사이토카인 Capture 항체로 2 μg/ml로 PBS에 희석한 뒤 사이토카인 측정용 96-well plate에 100 μl씩 분주하고 상온에서 24시간 방치하였다. Capture 항체를 제거하고 Wash buffer (Quantikine ELISA Wash Buffer 1, R&D Systems)로 3번 씻어낸 뒤 200 μl의 Reagent diluent (Reagent Diluent Concentrate 2, R&D Systems)를 첨가하고 1시간 반응하였다. 다시 각 well을 Wash buffer로 3번 씻어낸 뒤 사이토카인 표준물질 (2000 pg/ml)과 배양 상등액을 처리하고 상온에서 2시간 동안 반응하였다. Wash buffer로 3회 세척 후 Detection antibody를 0.2 μg/ml이 되도록 Reagent diluent로 희석한 뒤 각 Well에 100 μL씩 넣어 2시간 동안 반응하였다. Wash buffer로 3회 세척 후 Streptavidin-HRP를 각 Well에 100 μL씩 넣어 20분 동안 반응하였다. Wash buffer로 3회 세척 후 Substrate solution (TMB Substrate Solution, Thermo scientific)을 각 Well에 100 μL씩 넣어 20분 동안 반응시키고 발색이 되면 Stop solution (BD OptEIA?? Reagent Set B, BD Biosciences)으로 반응을 중지시켜 450 nm의 분광감도계 (SpectraMax® Paradigm microplate spectrophotometer, Molecular Devices)로 발색 정도를 측정하였다.First, in order to measure G-CSF, the main cytokine involved in STAT3 activation, ELISA was performed using the Mouse G-CSF DuoSet ELISA kit (R&D Systems) for the culture supernatant obtained under the same conditions as in Experimental Example 5. After diluting in PBS to 2 μg/ml with G-CSF cytokine Capture antibody, 100 μl of each was dispensed into a 96-well plate for cytokine measurement and left at room temperature for 24 hours. After removing the Capture antibody and washing three times with Wash buffer (Quantikine ELISA Wash Buffer 1, R&D Systems), 200 μl of Reagent diluent (Reagent Diluent Concentrate 2, R&D Systems) was added and reacted for 1 hour. Again, each well was washed 3 times with Wash buffer, and then treated with cytokine standards (2000 pg/ml) and culture supernatant, and reacted at room temperature for 2 hours. After washing 3 times with wash buffer, the detection antibody was diluted with reagent diluent to 0.2 μg/ml, and 100 μL was put into each well and reacted for 2 hours. After washing 3 times with wash buffer, 100 μL of Streptavidin-HRP was put into each well and reacted for 20 minutes. After washing 3 times with Wash buffer, add 100 μL of Substrate solution (TMB Substrate Solution, Thermo scientific) to each well and react for 20 minutes. When the color develops, the reaction is performed with Stop solution (BD OptEIA?? Reagent Set B, BD Biosciences). After stopping, the degree of color development was measured with a 450 nm spectrophotometer (SpectraMax® Paradigm microplate spectrophotometer, Molecular Devices).

동일 배양 조건에서 얻어진 유방암 세포를 대상으로 STAT3 (Phosphorylated-STAT3)의 활성화 양상을 pSTAT3 항체(Cell signaling technology)를 이용하여 웨스턴 블롯법 (실험 예 5와 동일)을 통해 확인하였으며, β-actin (Santa Cruz Biotechnology)을 대조군으로 사용하였다.The activation pattern of STAT3 (Phosphorylated-STAT3) in breast cancer cells obtained under the same culture conditions was confirmed by Western blot method (same as Experimental Example 5) using pSTAT3 antibody (Cell signaling technology), and β-actin (Santa Cruz Biotechnology) was used as a control.

도 7A와 7B에서 나타난 바와 같이, 골수 유래 억제 세포에 의해 증가된 G-CSF 생성 증가와 이에 따른 STAT3의 활성화 증가가 진세노사이드 Rg3에 의해 모두 유의하게 감소하였다. *P< 0.05, ****P< 0.0001.As shown in Figures 7A and 7B, the increase in G-CSF production increased by the bone marrow-derived suppressor cells and the increase in the activation of STAT3 were both significantly reduced by the ginsenoside Rg3. * P < 0.05, **** P < 0.0001.

다음으로 NOTCH signaling pathway를 활성화시키는 물질인 NO (Nitric oxide)를 측정하기 위해 동일 배양 조건에서 얻어진 배양 상등액을 Total NO and Nitrate/Nitrite Parameter Assay Kit (R&D Systems)를 이용하여 96-well plate에서 반응 시킨 뒤 540 nm의 분광감도계 (SpectraMax® Paradigm microplate spectrophotometer, Molecular Devices)로 발색 정도를 측정하였다Next, to measure NO (Nitric oxide), a substance that activates the NOTCH signaling pathway, the culture supernatant obtained under the same culture conditions was reacted in a 96-well plate using Total NO and Nitrate/Nitrite Parameter Assay Kit (R&D Systems). The degree of color development was measured with a 540 nm spectrophotometer (SpectraMax® Paradigm microplate spectrophotometer, Molecular Devices).

동일 배양 조건에서 얻어진 유방암 세포를 대상으로 NOTCH signaling pathway 활성화와 관련된 유전자들을 역전사 중합효소 연쇄반응 (RT-PCR)을 통해 확인하였다. 회수된 유방암 세포에서 Ribospin kit (GeneAll Biothechnology)를 통해 RNA를 추출하고, RNA를 cDNA로 역전사 (Reverse transcription) 시키기 위해 iScript cDNA synthesis kit (Bio-Rad Laboratories)를 사용하였다. 합성된 cDNA는 FastStart Essential DNA Green Master (Roche Diagnostics)와 각 유전자에 알맞은 forward primer, reverse primer를 혼합한 뒤, Light Cycler 96 System (Roche Diagnostics) 장비로 실시간 중합효소 연쇄반응을 실시하였다. 이때 GAPDH로 유전자의 발현 량을 보정하였으며, 표1은 각 유전자들의 Primer 정보를 나타낸다.In breast cancer cells obtained under the same culture conditions, genes related to the activation of the NOTCH signaling pathway were identified through reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). RNA was extracted from the recovered breast cancer cells through the Ribospin kit (GeneAll Biothechnology), and the iScript cDNA synthesis kit (Bio-Rad Laboratories) was used to reverse transcribe the RNA into cDNA. The synthesized cDNA was mixed with FastStart Essential DNA Green Master (Roche Diagnostics) and forward and reverse primers suitable for each gene, followed by real-time polymerase chain reaction using Light Cycler 96 System (Roche Diagnostics) equipment. At this time, the expression level of the gene was corrected with GAPDH, and Table 1 shows the Primer information of each gene.

Target GeneTarget Gene Forward primerforward primer Reverse primerReverse primer mGAPDHmGAPDH GAC GGC CGC ATC TTC TTG TGAC GGC CGC ATC TTC TTG T CAC ACC GAC CTT CAC CAT TTTCAC ACC GAC CTT CAC CAT TTT mNotch2mNotch2 CGG ACC AGC CTG AGA ACC TCGG ACC AGC CTG AGA ACC T CCT CAA GAA GCT TCG CGA ATCCT CAA GAA GCT TCG CGA AT mNotch3mNotch3 TTG TCT GGA TGG AAG CCC ATG TTTG TCT GGA TGG AAG CCC ATG T ACT GAA CTC TGG CAA ACG CCTACT GAA CTC TGG CAA ACG CCT mHey1mHey1 CAC GCC ACT ATG CTC AAT GTCAC GCC ACT ATG CTC AAT GT TCT CCC TTC ACC TCA CTG CTTCT CCC TTC ACC TCA CTG CT mHey2mHey2 TTC TGT CTC TTT CGG CCA CTTTC TGT CTC TTT CGG CCA CT TTT GTC CCA GTG CTT GTC TGTTT GTC CCA GTG CTT GTC TG

도 8A와 8B에서 확인할 수 있듯이, 골수 유래 억제 세포에 의해 증가된 NO 생성 증가와 NOTCH signaling pathway 연관 유전자들의 활성화 증가가 진세노사이드 Rg3에 의해 모두 유의하게 감소하였다. *P< 0.05, **P< 0.01, ***P< 0.001, ****P< 0.0001.As can be seen in FIGS. 8A and 8B , both the increased NO production increased by the bone marrow-derived suppressor cells and the increased activation of the NOTCH signaling pathway-related genes were significantly decreased by the ginsenoside Rg3. * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001, **** P < 0.0001.

본 결과들을 통하여 골수 유래 억제 세포와 진세노사이드 Rg3에 의한 유방암 활성화 및 조절에 STAT3와 NOTCH signaling pathway가 밀접히 관여하고 있음을 확인할 수 있었다.Through these results, it was confirmed that STAT3 and NOTCH signaling pathway are closely involved in breast cancer activation and regulation by bone marrow-derived suppressor cells and ginsenoside Rg3.

실험 예 9: 종양 동물 모델에서 골수 유래 억제 세포와 진세노사이드 Rg3에 의한 종양 성장 속도의 차이 확인Experimental Example 9: Confirmation of difference in tumor growth rate by bone marrow-derived suppressor cells and ginsenoside Rg3 in tumor animal model

FM3A 세포와 골수 유래 억제 세포를 진세노사이드 Rg3를 처리하여 각각 3개의 조건 (FM3A, FM3A + 골수 유래 억제 세포, FM3A + 골수 유래 억제 세포 + Rg3)으로 3일 동안 공동 배양하였다. 이후 FM3A 세포를 각각 회수하여 2x106 cells/50 μl 농도로 PBS에 희석해준 뒤 임의로 선정된 6 주령 암컷 C3H/He 마우스 대퇴부에 피하 주사하여 종양 동물 모델을 형성하였다. FM3A 세포 접종 후 21일째에 그룹 간 종양 크기를 육안상으로 비교하였다.FM3A cells and bone marrow-derived suppressor cells were treated with ginsenoside Rg3 and co-cultured for 3 days under three conditions (FM3A, FM3A + bone marrow-derived suppressor cells, FM3A + bone marrow-derived suppressor cells + Rg3), respectively. Thereafter, each FM3A cell was recovered , diluted in PBS to a concentration of 2x10 6 cells/50 μl, and then subcutaneously injected into the thigh of a randomly selected 6-week-old female C3H/He mouse to form a tumor animal model. On day 21 after FM3A cell inoculation, tumor sizes between groups were visually compared.

도 9A에서 보는 바와 같이, 골수 유래 억제 세포와 공동 배양한 FM3A 세포를 접종한 군에서의 종양 성장이 대조군에 비해 확연히 빨랐으며, 진세노사이드 Rg3를 함께 처리한 군에서 다시 종양 성장 속도가 지연되었다.As shown in Figure 9A, tumor growth in the group inoculated with FM3A cells co-cultured with bone marrow-derived suppressor cells was significantly faster than that of the control group, and the tumor growth rate was delayed again in the group treated with ginsenoside Rg3. .

실험 예 10: 종양 동물 모델에서 진세노사이드 Rg3에 의한 종양 성장 지연 효과 확인Experimental Example 10: Confirmation of tumor growth retardation effect by ginsenoside Rg3 in tumor animal model

진세노사이드 Rg3의 종양 동물에서 종양 억제 효과와 농도 차이에 따른 효과 차이를 비교하기 위해 다른 집단에서 동물 모델 실험을 진행하였다. 계대 배양한 FM3A 세포를 회수하여 2x106 cells/50 μl 농도로 PBS에 희석해준 뒤 임의로 선정된 6 주령 암컷 C3H/He 마우스 대퇴부에 피하 주사하여 종양 동물 모델을 형성하였다. 종양이 약 40 mm3 정도의 부피로 형성된 후에 마우스들을 임의로 나누어 대조군과 Rg3 2.5 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg 치료 그룹을 각각 형성하였다. 진세노사이드 Rg3는 Saline에 적정 농도로 희석하여 일주일에 5회씩 3주 동안 입 위관 영양법(Orogastric gavage)으로 투약하였다. 투약과 동시에 캘리퍼스를 이용하여 주기적으로 종양의 가로와 세로를 측정하고 종양 부피를 계산하였으며, 이때 가로는 종양의 단축을, 세로는 종양의 장축으로 정하였다. 종양 부피 (mm3) = 가로 x 가로 x 세로 x 0.52In order to compare the tumor suppression effect of ginsenoside Rg3 in tumor animals and the difference in the effect according to the concentration difference, an animal model experiment was conducted in another group. The subcultured FM3A cells were recovered , diluted in PBS to a concentration of 2x10 6 cells/50 μl, and then subcutaneously injected into the thigh of a randomly selected 6-week-old female C3H/He mouse to form a tumor animal model. After the tumor was formed in a volume of about 40 mm 3 , the mice were randomly divided to form a control group and Rg3 2.5 mg/kg, 5 mg/kg, and 10 mg/kg treatment groups, respectively. Ginsenoside Rg3 was diluted to an appropriate concentration in Saline and administered 5 times a week for 3 weeks by oral gavage. Simultaneously with administration, the width and length of the tumor were periodically measured using a caliper and the tumor volume was calculated. Tumor volume (mm 3 ) = Width x Width x Length x 0.52

도 9B에서 보는 바와 같이, 유방암 동물 모델에서 Rg3경구 투여에 의해 농도 의존적으로 종양의 성장이 지연되는 것을 확인할 수 있었다. **P< 0.01, ***P< 0.001.As shown in FIG. 9B , it was confirmed that tumor growth was delayed in a concentration-dependent manner by oral administration of Rg3 in an animal model of breast cancer. ** P < 0.01, *** P < 0.001.

실험 예 11: 종양 동물 모델에서 진세노사이드 Rg3 투여에 의한 골수 유래 억제 세포 조절 효과 비교Experimental Example 11: Comparison of bone marrow-derived suppressor cell regulatory effect by ginsenoside Rg3 administration in tumor animal model

실험 예 10의 유방암 모델 마우스의 실험 종료 후 각 군을 대상으로 하여 부검이 진행되었다. 부검 시 떼어낸 비장에서 비장 세포를 분리하여 ACK lysis buffer (NH4CL, KHCO3, Na2EDTA)를 사용하여 적혈구를 제거하고 나머지 세포를 분리하였다. 비장 세포들은 1% FBS/PBS solution에 혼합한 뒤, 골수 유래 억제 세포만을 분리하기 위해 그 표현형인 CD11b 항체와 Gr1 항체 (Miltenyi Biotec.)로 처리되었다. 이후 유세포 분석기 (FACS Aria Cell Sorter, BD Biosciences)를 사용하여 전체 비장 세포 중 골수 유래 억제 세포 발현 분석을 진행하였다.After the end of the experiment of the breast cancer model mouse of Experimental Example 10, an autopsy was performed for each group. Splenocytes were separated from the spleen removed at autopsy, and red blood cells were removed using ACK lysis buffer (NH 4 CL, KHCO 3 , Na 2 EDTA), and the remaining cells were isolated. Splenocytes were mixed with 1% FBS/PBS solution, and then treated with CD11b antibody and Gr1 antibody (Miltenyi Biotec.) of the phenotype to isolate only bone marrow-derived suppressor cells. Then, using a flow cytometer (FACS Aria Cell Sorter, BD Biosciences), bone marrow-derived suppressor cell expression analysis was performed among all spleen cells.

도 10에서 나타난 바와 같이, 유방암 동물 모델의 비장 세포 중 골수 유래 억제 세포의 비율이 진세노사이드 Rg3 치료 군에서 확연히 감소하였다. **P< 0.01, ****P< 0.0001.As shown in FIG. 10 , the ratio of bone marrow-derived suppressor cells among spleen cells of the breast cancer animal model was significantly reduced in the ginsenoside Rg3 treatment group. ** P < 0.01, **** P < 0.0001.

실험 예 12: 진세노사이드 Rg3 투여에 의한 종양 조직의 암세포 줄기능, 상피 중간엽 이행 관련 단백질 발현 비교Experimental Example 12: Comparison of protein expression related to cancer cell stem function and epithelial mesenchymal transition in tumor tissues by administration of ginsenoside Rg3

실험 예 10의 유방암 모델 마우스의 부검 시 종양 조직을 적출하여 동일한 크기로 절개 (약 1 mm3) 하고 Tissue lysis buffer (PRO-PREP™ protein extraction solution) 800 μL에 넣은 뒤 음파 처리 (Sonication)를 통하여 조직으로부터 단백질을 추출 하였다. 이렇게 얻어진 단백질 샘플에서 Bradford protein assay reagent (Bio-Rad)를 이용하여 각 샘플의 단백질량을 정량 하였다. 정량 된 각 단백질 샘플을 SDS-polyacrylamide gel 전기영동을 이용해 분리하고 polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes으로 Transfer한 뒤 TBST (TBS with Tween-20, Biosesang)로 희석한 5% 탈지유에 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 다음으로 ALDH1 (Santa Cruz Biotechnology), OCT4 (BD biosciences), KLF4 (OriGene), Vimentin (BD biosciences)에 대한 항체를 사용하여 4℃에서 24시간 동안 반응시켰고, 이 때

Figure pat00001
-actin (Santa Cruz Biotechnology)을 대조군으로 사용하였다. 이후 각 항체에 알맞은 horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit and anti-mouse 2차 항체(Invitrogen)를 사용하여 상온에서 1시간 반응 시켜준 뒤 ECL?? Western Blotting Detection Reagents (GE Healthcare) 처리 후 Fusion FX5 image analyzer (Vilber Lourmat)를 이용하여 그 발현 정도를 확인하였다. At the time of autopsy of the breast cancer model mouse of Experimental Example 10, the tumor tissue was excised, cut in the same size (about 1 mm 3 ), put in 800 μL of Tissue lysis buffer (PRO-PREP™ protein extraction solution), and then through sonication. Proteins were extracted from the tissues. In the protein samples thus obtained, the amount of protein in each sample was quantified using Bradford protein assay reagent (Bio-Rad). Each quantified protein sample was separated using SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, transferred to polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes, and reacted in 5% skim milk diluted with TBST (TBS with Tween-20, Biosesang) for 1 hour at room temperature. . Next, antibodies against ALDH1 (Santa Cruz Biotechnology), OCT4 (BD biosciences), KLF4 (OriGene), and Vimentin (BD biosciences) were used to react at 4° C. for 24 hours, at this time
Figure pat00001
-actin (Santa Cruz Biotechnology) was used as a control. After that, the horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit and anti-mouse secondary antibody (Invitrogen) suitable for each antibody was used for reaction at room temperature for 1 hour and then ECL?? After treatment with Western Blotting Detection Reagents (GE Healthcare), the expression level was confirmed using Fusion FX5 image analyzer (Vilber Lourmat).

도 11에서 나타난 바와 같이, 종양 조직에서도 암 줄기능과 상피 중간엽 세포 이행 관련 마커들의 발현이 진세노사이드 Rg3 투여에 의해 농도 의존적으로 감소하였다.As shown in FIG. 11 , the expression of markers related to cancer stem function and epithelial mesenchymal cell migration in tumor tissues was decreased in a concentration-dependent manner by administration of ginsenoside Rg3.

실험 예 13: 종양 동물 모델에서 골수 유래 억제 세포와 진세노사이드 Rg3의 유방암 조절 효과 기작 분석Experimental Example 13: Mechanism analysis of the breast cancer regulatory effect of bone marrow-derived suppressor cells and ginsenoside Rg3 in a tumor animal model

실험 예 10의 유방암 모델 마우스의 부검 시 하대정맥에서 혈액을 채취하여 혈청을 분리하였고, 실험 예 8과 동일한 ELISA 측정 방법으로 혈청 내 G-CSF수치를 측정하였다. At the time of autopsy of the breast cancer model mouse of Experimental Example 10, blood was collected from the inferior vena cava and serum was separated, and the G-CSF level in the serum was measured by the same ELISA measurement method as in Experimental Example 8.

도 12에서와 같이 종양 동물의 혈청에서 증가된G-CSF가 진세노사이드 Rg3에 의해 농도 의존적으로 유의하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다. *P< 0.05, ***P< 0.001, ****P< 0.0001.As shown in FIG. 12 , it was confirmed that the increased G-CSF in the serum of tumor animals was significantly decreased in a concentration-dependent manner by the ginsenoside Rg3. * P < 0.05, *** P < 0.001, **** P < 0.0001.

또한 동일 마우스의 종양에서 NOTCH 활성화 관련 유전자들을 분석하고자, 실험 예 8과 동일한 방법으로 종양 조직에서 RNA를 추출하여 역전사 중합효소 연쇄반응 (RT-PCR)을 시행하였다.In addition, to analyze the NOTCH activation-related genes in the tumor of the same mouse, RNA was extracted from the tumor tissue in the same manner as in Experimental Example 8 and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) was performed.

도 13에서와 같이 유방암 종양 조직에서 증가된 NOTCH 활성화 관련 유전자들이 진세노사이드 Rg3치료에 의해 유의하게 감소하였다. *P< 0.05.As shown in FIG. 13 , the increased NOTCH activation-related genes in breast cancer tumor tissue were significantly reduced by treatment with ginsenoside Rg3. * P < 0.05.

본 발명에 대해 상기 실시예를 참조하고 설명하였으나, 이는 예시적인 것에 불과하며, 본 발명에 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 타 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호범위는 첨부된 특허 청구 범위의 기술적 사항에 의해 정해져야 할 것이다.Although the present invention has been described with reference to the above embodiment, it will be understood that this is merely exemplary, and that various modifications and equivalent other embodiments are possible therefrom by those skilled in the art to which the present invention pertains. . Therefore, the true technical protection scope of the present invention will have to be determined by the technical matters of the appended claims.

Claims (5)

진세노사이드 Rg3를 유효성분으로 함유하는 골수-유래 억제세포(myeloid-derived suppressor cells) 저해용 조성물.A composition for inhibiting myeloid-derived suppressor cells containing ginsenoside Rg3 as an active ingredient. 제 1항에 있어서, 유방암을 갖는 개체의 골수-유래 억제세포에 의한 면역 반응 저하의 완화, 치료 또는 예방용으로 사용되는 것을 특징으로 하는 골수-유래 억제세포 저해용 조성물.[Claim 2] The composition for inhibiting bone marrow-derived suppressor cells according to claim 1, wherein the composition is used for alleviating, treating, or preventing a decrease in immune response caused by bone marrow-derived suppressor cells of an individual having breast cancer. 제 1항에 있어서, 진세노사이드 Rg3는 골수-유래 억제 세포의 저해 효과를 통해 유방암 세포의 종양 줄기 세포능과 중간엽 이행을 억제하는 것을 특징으로 하는 골수-유래 억제세포 저해용 조성물.The composition for inhibiting bone marrow-derived suppressor cells according to claim 1, wherein the ginsenoside Rg3 inhibits tumor stem cell ability and mesenchymal migration of breast cancer cells through the inhibitory effect of bone marrow-derived suppressor cells. 제 1항에 있어서, 진세노사이드 Rg3는 골수-유래 억제 세포에 의해 유방암 세포에서 분비되는 종양 유래 사이토카인들(CXCL1, CCL3, CXCL2, TIMP-1, TNF-α)을 감소시키고, 골수-유래 억제 세포에 의해 증가된 G-CSF 생성 증가와 이에 따른 STAT3의 활성화 증가를 감소시키고, 골수-유래 억제 세포에 의해 증가된 NO 생성 증가와 NOTCH 신호 경로 연관 유전자들의 활성화 증가를 감소시키는 것을 특징으로 하는 골수-유래 억제세포 저해용 조성물.The method of claim 1, wherein the ginsenoside Rg3 reduces tumor-derived cytokines (CXCL1, CCL3, CXCL2, TIMP-1, TNF-α) secreted from breast cancer cells by bone marrow-derived suppressor cells, and bone marrow-derived Characterized in that it reduces the increase in G-CSF production increased by suppressor cells and thus the increase in activation of STAT3, and decreases the increase in NO production increased by the bone marrow-derived suppressor cells and the increase in activation of NOTCH signaling pathway related genes. A composition for inhibiting bone marrow-derived suppressor cells. 제 1항에 있어서, 유방암의 항암제 또는 항암보조제로 사용되는 것을 특징으로 하는 골수-유래 억제세포 저해용 조성물.
The composition for inhibiting bone marrow-derived suppressor cells according to claim 1, which is used as an anticancer agent or an anticancer adjuvant for breast cancer.
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