KR20210062442A - 밀 의존성 운동 유발성 과민증을 유발하는 신규한 항원 단백질 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 항원 단백질에 관한 것으로, 상기 항원 단백질은 밀 의존성 운동 유발성 과민증을 유발하는 바, 이를 이용하여 밀 의존성 운동 유발성 과민증을 진단할 수 있다.
구체적으로, 상기 항원 단백질은 오메가-5 글리아딘이 일부 결실된 오프리 밀가루 단백질과 WDEIA 환자의 혈청을 사용한 2차원 면역블롯 분석을 통해 반응하는 단백질로 확인되었으며, 또한, WEDIA의 중심항원인 오메가-5 글리아딘에 대한 단일클론 항체와도 반응하는 것을 확인하였다. 상기 항원 단백질을 질량 분석법에 의해 분석한 결과, 염색체 1D 상에 암호화된 신규한 오메가-5 글리아딘 유전자에 해당하는 것으로 확인되었다.
따라서, 상기 항원 단백질이 WDEIA 환자의 혈청 또는 WEDIA의 중심항원인 오메가-5 글리아딘에 대한 단일클론 항체와도 반응하는 것을 확인하였는 바, 밀 의존성 운동 유발성 과민증을 유발하는 상기 항원 단백질을 이용하여 밀 의존성 운동 유발성 과민증을 진단할 수 있다.
구체적으로, 상기 항원 단백질은 오메가-5 글리아딘이 일부 결실된 오프리 밀가루 단백질과 WDEIA 환자의 혈청을 사용한 2차원 면역블롯 분석을 통해 반응하는 단백질로 확인되었으며, 또한, WEDIA의 중심항원인 오메가-5 글리아딘에 대한 단일클론 항체와도 반응하는 것을 확인하였다. 상기 항원 단백질을 질량 분석법에 의해 분석한 결과, 염색체 1D 상에 암호화된 신규한 오메가-5 글리아딘 유전자에 해당하는 것으로 확인되었다.
따라서, 상기 항원 단백질이 WDEIA 환자의 혈청 또는 WEDIA의 중심항원인 오메가-5 글리아딘에 대한 단일클론 항체와도 반응하는 것을 확인하였는 바, 밀 의존성 운동 유발성 과민증을 유발하는 상기 항원 단백질을 이용하여 밀 의존성 운동 유발성 과민증을 진단할 수 있다.
Description
본 발명은 밀 의존성 운동 유발성 과민증을 유발하는 신규한 항원 단백질 및 이의 용도에 관한 것이다.
글루텐 단백질은 밀가루에 고유한 점탄성을 부여하는 70-100 개의 풍부한 단백질로 구성된 복잡한 그룹이다. 동시에, 이러한 단백질 중 일부는 음식 알레르기 및 셀리악병(celiac disease)을 포함한 인간 건강 문제에 관여한다. 글루텐 단백질 중에서 오메가 글리아딘은 특히 면역원성이 있다. 상기 단백질은 품종과 식물의 생장 조건에 따라 다르지만, 총 밀가루 단백질의 5-10 %를 차지한다. 상기 오메가 글리아딘은 비정상적으로 높은 비율의 글루타민과 프롤린(약 68-73%)이 반복된 서열로 구성되며 일반적으로 시스테인이 부족하다. 상기 단백질은 오메가-5 및 오메가-1,2 글리아딘으로 지칭되는 두 그룹으로 나뉘며, 이 두 그룹은 N-말단 서열 및 반복 모티브가 상이하다. 오메가-5 글리아딘은 일반적으로 SRL로 시작하고 반복적인 모티브 FPQQQ 및 QQIPQQQ가 여러 카피로 포함하고, 오메가-1,2 글리아딘은 ARE, ARQ 또는 KEL로 시작하고 반복적인 모티브 PQQPFP를 포함한다. 상기 오메가-5 글리아딘은 육배체 밀에서 염색체 1B의 짧은 팔(short arm)에 있는 Gli-1 locus(유전자자리)에서 암호화되며 밀 섭취 후 운동을 할 때 심각한 음식 알러지인 밀 의존성 운동 유발성 과민증(WDEIA)의 주요 민감성 알레르기 항원이다. 상기 오메가-1,2 글리아딘은 염색체 1A와 1D에서 암호화되며 셀리악병(celiac disease)에 관여하는 면역 우성 T-세포 자극 항원결정기(immunodominant T-cell stimulatory epitopes)를 함유한다. 상기 오메가 글리아딘은 곡물 개발 과정에서 비료로의 적용 또는 고온 반응시 글루텐 단백질 중에서 가장 큰 변화를 나타내는데, 이는 밀가루의 면역원성 잠재력에 영향을 줄 수 있다.
이러한 점으로 인해, 오메가 글리아딘에 대한 연구는 도전적이었다. 특히 오메가-5 글리아딘은 제한된 수의 단백질 분해 절단부위(proteolytic cleavage sites)를 함유하기 때문에 tandem mass spectrometry (MS/MS)으로 확인하기가 어렵다. 더욱이, 품종간에 이들 단백질의 상당한 대립 유전자 다양성에도 불구하고 데이터 베이스에서 오메가-5 글리아딘에 대한 완전한 단백질 서열이 밝혀져 있지 않다는 것이다. 실제로, 최근까지, NCBI의 100개 이상의 오메가 글리아딘 단백질 서열 중 BAE20328(오메가-5 글리아딘) 하나만이 질량 분석법에 의해 48.9-51.5 kDa 범위의 분자량을 가지는 것으로 확인되었다. 다른 4개의 단백질, AJG03093, AJG03080, AJG03079 및 CAR82267은 반복 영역의 일부가 없고(missing), 분자량이 36에서 42 kDa일 것으로 예측되나, NCBI의 다른 많은 오메가-5 글리아딘 단백질은 중앙 반복 영역의 상당한 부분이 결여되어 있다(missing). 전장(full length) 단백질 서열의 결여는 고도로 반복적인 유전자 복제에 어려움이 있다. 최근에, reference wheat인 Chinese Spring으로부터 프롤라민 유전자를 보유하는 영역의 게놈 서열이 모아졌고, 2개의 추가 전장 오메가-5 글리아딘 단백질 서열 각각 47.7 및 51.5 kDa에 해당하는 오메가-B3(AWK59777) 및 오메가-B6(AWK59773)이 NCBI에 추가되었다.
상기 BAE20328의 전장 서열에 기초한 중첩 펩티드를 어레이를 사용하여 WDEIA에 대한 IgE 결합 항원결정기를 확인하였다. 펩티드 QQFPQQQ, QQIPQQQ, QQSPQQQ 및 QQSPEQQ는 IgE 결합에 중요한 1, 4, 5, 6 및 7 위치에 아미노산을 갖는 우세한 항원결정기인 것으로 밝혀졌다. 흥미롭게도, BAE20328에는 23개의 QQFPQQQ, 4개의 QQIPQQQ가 포함되며, 이 중 일부는 중첩되어 단백질의 면역원성에 기여한다.
최근, 밀가루의 면역원성 잠재력을 감소시키기 위해 밀가루의 오메가-5 글리아딘의 수준을 감소시키기 위한 다수의 전략이 시도되어 왔다. 한 가지 접근법은 이러한 단백질 수준이 감소된 유전자형(genotype)을 선택하는 것이다. 이를 위하여, WEDIA 환자의 IgE와의 반응성에 대해 13개의 상이한 오메가-5 글리아딘 대립 유전자를 발현하는 품종 모음에서 밀가루 단백질을 조사하는 시도가 있었다. 밀/호밀 전좌(translocation)를 함유하는 하나의 품종 만이 낮은 수준의 반응성을 나타냈다. 그러나, 이러한 전좌 라인(translocation lines)은 호밀의 병 저항성 유전자인 세칼린(secaline) 유전자가 오메가-5 글리아딘으로 대체함으로써 제빵 특성이 나빠졌다. 또 다른 시도는 스펠트(spelt) 품종과 폴란드 육종 라인 사이의 교차 라인에서 자발적인 돌연변이를 확인하였는데, 이는 Gli-B1 locus(유전자자리)에서 비활성 오메가-5 글리아딘 유전자에 의한 것이었다. 상기 라인을 Gli-A1 및 Gli-D1 유전자 자리(loci)에서 불활성 유전자를 함유하는 다른 라인으로 교차시킨 후, ELISA를 이용하여 면역 반응성이 약 30% 감소하는 것을 확인했다. RNA 간섭을 이용한 생명공학 접근법으로는, 오메가-5 글리아딘의 수준을 감소시키는 데 사용되어 밀가루의 최종사용 기능적 특성에 악영향을 주지 않으면서 WDEIA 환자의 혈청에 대한 IgE 반응성이 감소된 유전자 도입 밀 식물의 제조가 있었다.
최근, B 게놈에 의해 암호화된 LMW-GS가 결여된 밀 돌연변이 오프리 (O-free, DH20)는 2개의 한국 밀 품종인 경백(hard white wheat) 밀 '금강'과 부드러운 붉은 밀(soft red wheat) '올그루' 사이의 교차로부터 유도된 이중 반수체 집단으로부터의 글루테닌을 스크리닝하여 개발되었다. 2년에 걸쳐 현장에서 평가했을 때, 오프리는 모종 품종보다 우수한 농업 특성과 약간 높은 수확량을 보여주었다. 또한 단백질 함량, SDS 침전 부피량 및 오프리 밀가루의 혼합 내성(mixing tolerance)은 좋은 밀링 품질과 중간 반죽 강도를 가진 한국 최고의 빵 밀 품종인 금강과 유사하였다.
본 발명의 목적은 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 항원 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항원 단백질을 포함하는 밀 의존성 운동 유발성 과민증 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항원 단백질을 포함하는 오메가-5 글리아딘 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 밀 의존성 운동 유발성 과민증 진단용 조성물을 포함하는 키트를 제공하는 것이다.
본 발명자는 탠덤 질량 분석법과 2차원 겔 전기영동(2-DE)에 의해 돌연변이 라인인 오프리의 밀가루 분석을 실시하였다. 그 결과, 상기 돌연변이 라인(mutant line)에서 염색체 1B의 적어도 5.8Mb가 결실되어 Gli-B1 locus(유전자 자리)에 의해 암호화된 오메가-5 글리아딘 및 몇몇 감마 글리아딘이 없는 것을 확인하였다. 또한, WDEIA 환자의 혈청을 사용한 밀가루 단백질의 2차원 면역블롯 분석을 통해, 주요 오메가-5 글리아딘의 부재로 인해 부모 라인에 비해 돌연변이에서 IgE 반응성이 감소된 것을 확인하였다. 그러나, 2개의 작은(minor) 단백질은 부모 및 돌연변이 라인 모두에서 WDEIA 환자 혈청에 대해 강한 반응성을 보였으며 또한 WEDIA의 중심항원인 오메가-5 글리아딘에 대한 단일클론 항체와도 반응하는 것을 확인하였다. 질량 분석법에 의한 2개의 작은 반응성 단백질의 분석결과 염색체 1D 상에 암호화된 오메가-5 글리아딘 유전자에 해당하는 것으로 확인하였다. 따라서, 상기 항원 단백질이 WDEIA 환자의 혈청 또는 WEDIA의 중심항원인 오메가-5 글리아딘에 대한 단일클론 항체와도 반응하는 것을 확인하였는 바, 상기 항원 단백질이 밀 의존성 운동 유발성 과민증을 유발하는 것으로, 이를 검출하여 밀 의존성 운동 유발성 과민증을 진단할 수 있는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 항원 단백질을 제공한다.
본 발명에서 상기 항원 단백질은 WDEIA 환자의 혈청 또는 WEDIA의 중심항원인 오메가-5 글리아딘에 대한 단일클론 항체와도 반응하는 것으로, 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어져 있다.
상기 항원 단백질은 2-D 면역블롯 분석에 의해 minor spot으로 확인된 것으로, 오프리 돌연변이 라인에 존재하는 신규한 항원 단백질로 오메가-5 글리아딘 유전자에 속한다.
상기 항원 단백질은 밀 의존성 운동 유발성 과민증을 유발하는 것을 특징으로 한다. 상기 "밀 의존성 운동 유발성 과민증(wheat-dependent exercise-induced anaphylaxis; WEDIA)"는 밀이 들어간 음식을 섭취 후 물리적인 운동을 했을 때 발생하며, 주로 성인들에서 발병한다고 알려져 있다.
상기 WDEIA 환자들의 혈청 immunoglobulin E (IgE)와 결합하는 주된 항원결정기(predominant epitope)는 오메가-5 글리아딘으로 알려져 있다.
본 발명에서 상기 단백질은 첨부한 서열목록에 기재된 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 단백질에 한정되지 않으며, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 항원 단백질과 기능적 동등물일 수 있다. 상기 "기능적 동등물"이란, 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 보다 바람직하게는 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로서 본 발명의 항원 단백질과 실질적으로 동질의 활성을 나타내는 단백질을 의미한다.
상기 기능적 동등물에는, 예를 들어, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 중 일부가 치환되거나, 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체가 포함된다. 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산 (Asp, Glu), 염기성 아미노산(His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황 함유 아미노산(Cys, Met). 아미노산의 결실은 바람직하게는 본 발명의 항원 단백질의 활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치한다. 또한 상기 기능적 동등물의 범위에는 항원 단백질의 기본 골격 및 이의 생리활성을 유지하면서 단백질의 일부 화학 구조가 변형된 단백질 유도체도 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 단백질의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경 및 생리활성을 유지하면서 GFP(Green Fluorescent Protein)와 같은 다른 단백질과 융합으로 만들어진 융합단백질 등이 이에 포함된다.
상기 오프리 라인에 존재하는 minor spot에 해당하는 신규한 오메가-5 글리아딘 항원 단백질은 WDEIA에 대한 IgE 결합 항원결정기로 알려진 QQFPQQQ와 QQIPQQQ를 포함하는 바, 상기 항원 단백질은 QQFPQQQ 또는 QQIPQQQ 펩티드의 항원결정기를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산은 서열번호 3으로 표시되는 염기서열에 의해 코딩될 수 있으며, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산은 서열번호 4로 표시되는 염기서열에 의해 코딩될 수 있다.
다른 하나의 양태로 본 발명은 상기 항원 단백질을 포함하는 밀 의존성 운동 유발성 과민증 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명에서, 항원 단백질, 밀 의존성 운동 유발성 과민증에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
상기 항원 단백질에 대한 항체를 이용하여, 분리된 생물학적 시료의 항원 단백질을 항원-항체 반응을 통해 밀 의존성 운동 유발성 과민증 여부를 진단할 수 있다.
상기 항원 단백질에 대한 항체를 생물학적 시료와 반응시키고 항원-항체 복합체 형성을 검출함으로써 항원 단백질을 검출할 수 있으며, 이를 통해 밀 의존성 운동 유발성 과민증 여부에 대한 정보의 제공을 할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "생물학적 시료"란 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 조직 부검 시료(뇌, 피부, 림프절, 척수 등), 세포 배양 상등액, 파열된 진핵세포 및 세균 발현계 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들 생물학적 시료를 조작하거나 조작하지 않은 상태로 상기 항원 단백질에 대한 항체와 반응시켜 상기 항원 단백질의 존재를 확인하고, 항원 단백질의 발현이 검출될 경우, 밀 의존성 운동 유발성 과민증 여부의 진단이 가능하다.
본 발명에서 사용되는 용어 "항원-항체 복합체"란 시료 중의 항원 단백질과 이를 인지하는 항체의 결합물을 의미하며, 이러한 항원-항체 복합체의 형성은 비색법(colormetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment) 및 섬광계수법(scintillation counting method)으로 이루어진 군에서 선택되는 임의의 방법으로 검출할 수 있다. 그러나 반드시 이들로만 제한되지 않고 다양한 응용과 적용이 가능하다.
본 발명에서는 항원-항체 복합체를 검출하기 위한 것으로 여러 가지 표지체를 사용할 수 있다. 구체적인 예로는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자, 방사성 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있으며, 반드시 이들로만 한정되는 것은 아니다.
검출 표지체로서 사용되는 효소로는 아세틸콜린에스테라제, 알칼라인 포스파타제, β-D-갈락토시다제, 호스래디쉬 퍼옥시다제, β-라타마제 등을 포함하며, 형광물로는 플루오레세인, Eu3+, Eu3+ 킬레이트 또는 크립테이트 등을 포함하며, 리간드로는 바이오틴 유도체 등을 포함하며, 발광물로는 아크리디늄 에스테르, 이소루미놀 유도체 등을 포함하며, 미소입자로는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등을 포함하며, 방사성 동위원소로는 57Co, 3H, 125I, 125I-볼톤(Bonton) 헌터(Hunter) 시약 등을 포함한다.
또한, 항원-항체 복합체를 효소면역흡착법(ELISA)을 이용하여 검출할 수 있다. 효소면역흡착법(ELISA)에는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 이차 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 상기 항체는 검출 표지를 가질 수 있으며, 검출표지를 가지지 않을 경우는 이들 항체를 포획할 수 있고 검출 표지를 가지는 또 다른 항체를 처리하여 확인할 수 있다.
또 다른 하나의 양태로 본 발명은 상기 항원 단백질을 포함하는 오메가-5 글리아딘 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명에서, 항원 단백질, 밀 의존성 운동 유발성 과민증에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
상기 항원 단백질은 밀 의존성 운동 유발성 과민증의 주요 항원인 오메가-5 글리아딘에 속하며, WDEIA 환자 혈청에 대해 강한 반응성을 보였으며 또한 WEDIA의 중심항원인 오메가-5 글리아딘에 대한 단일클론 항체와도 반응하는 것을 확인하였는 바, 상기 항원 단백질을 이용하여 밀 의존성 운동 유발성 과민증을 유발하는 오메가-5 글리아딘을 검출하는 것도 가능하다.
상기 검출시에는 전술한 바와 같이, 항원-항체 복합체를 검출하는 방법에 의해 검출이 가능하다.
또 다른 하나의 양태로 본 발명은 상기 항원 단백질을 포함하는 밀 의존성 운동 유발성 과민증 진단용 조성물을 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명에서, 항원 단백질, 밀 의존성 운동 유발성 과민증에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
본 발명의 키트는 진단, 검출 및 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 포함한다.
본 발명의 키트는 효소면역측정법(ELISA)을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트일 수 있다. 상기 ELISA 키트는 항원 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함하며, 상기 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함한다. 상기 ELISA 키트는 "항원-항체 복합체"를 형성한 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면 표지된 2차 항체, 발색단(chromopores), 효소(예:항체와 접합) 및 그의 기질을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조구 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다.
본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 항원 단백질에 관한 것으로, 상기 항원 단백질은 밀 의존성 운동 유발성 과민증을 유발하는 바, 이를 이용하여 밀 의존성 운동 유발성 과민증을 진단할 수 있다.
구체적으로, 상기 항원 단백질은 오메가-5 글리아딘이 일부 결실된 오프리 밀가루 단백질과 WDEIA 환자의 혈청을 사용한 2차원 면역블롯 분석을 통해 반응하는 단백질로 확인되었으며, 또한, WEDIA의 중심항원인 오메가-5 글리아딘에 대한 단일클론 항체와도 반응하는 것을 확인하였다. 상기 항원 단백질을 질량 분석법에 의해 분석한 결과, 염색체 1D 상에 암호화된 신규한 오메가-5 글리아딘 유전자에 해당하는 것으로 확인되었다.
따라서, 상기 항원 단백질이 WDEIA 환자의 혈청 또는 WEDIA의 중심항원인 오메가-5 글리아딘에 대한 단일클론 항체와도 반응하는 것을 확인하였는 바, 밀 의존성 운동 유발성 과민증을 유발하는 상기 항원 단백질을 이용하여 밀 의존성 운동 유발성 과민증을 진단할 수 있다.
도 1은 부모 라인 금강(a,d) 및 올그루(b,e) 및 돌연변이 라인 오프리(c,f)의 총 밀가루 단백질을 나타낸다. 패널(a, b 및 c)의 블랙 박스 내의 단백질 spot은 MS/MS에 의해 확인되었다. 패널(d, e 및 f)에서 빨강, 파랑, 노랑, 보라, 녹색 및 흑색으로 동그라미 표시된 단백질은 각각 오메가-5 글리아딘, s-형 LMW-GS, i-형 LMW-GS, m-형 LMW-GS, 감마 글리아딘 및 트리티신(triticin)을 나타낸다. 점선 동그마리는 단백질이 부모 라인 중 적어도 하나에서 확인되고, 돌연변이 라인에는 없다는 것을 나타낸다. MS/MS 데이터는 표 1에 요약되어 있다.
도 2는 Glu-B3 locus(유전자자리)(a), 오메가-5 글리아딘(b), Chinese Spring 의 염색체 1B의 5.8 Mb 영역의 끝에 위치한 반복 접합 프라이머 19S-1.3-2(c) 및 143E-1-600(d)에서 암호화되는 LMW-GS에 특이적인 프라이머를 이용한 PCR 분석 결과를 나타낸다. 각 패널에서, 금강(1), 올그루(2), 오프리(3), Chinese Spring의 nullisomic tetrasomic lines N1BT1A(4) 및 N1BT1D(5), Chinese Spring(6)으로부터의 게놈 DNA가 증폭되었다. kb 단위의 분자량 마커의 크기는 각 패널에서 레인 M으로 표시된다. 프라이머 서열은 표 2에 표시되었다.
도 3은 WDEIA 환자의 혈청과 부모 품종 금강(a,d), 올그루(b,e) 또는 돌연변이 오프리(c,f)의 전체 밀가루 단백질의 반응성을 나타낸다. 혈청은 J Agric Food Chem. 2015;63:9323-32.에 보고된 환자 #4(a-c) 및 환자 #5(d-f)의 것이었다. 부모 라인에서 오메가-5 글리아딘으로 확인된 단백질 spot은 패널 (a, b 및 d, e)에서 타원형으로 표시된다. 패널(c 및 f)의 화살표는 돌연변이 및 부모 라인 모두에서 반응성이 확인된 단백질 spot을 가리킨다.
도 4는 (a)금강, (b)올그루 또는 (c)오프리로부터의 전체 밀가루 단백질에 대한 오메가-5 글리아딘의 N-말단 서열에 대해 제조된 단일클론 항체의 반응성을 나타낸다. 부모 라인에서 존재하는 오메가-5 글리아딘으로 확인된 단백질 spot 위치는 패널 (a, b)에서 타원형으로 표시했다. 패널(c)에서 돌연변이 라인의 화살표는 돌연변이 및 부모 라인 모두에서 반응성이 있는 미확인 단백질 spot을 가리킨다.
도 5는 Chinese Spring의 염색체 1A(a), 1B(b) 및 1D(c)에서 오메가 글리아딘 유전자의 게놈 배열을 나타낸다. 3개 염색체에서 발견되는 조상 유전자의 위치는 검은 점으로 표시된다. 오메가-5 및 오메가-1,2 글리아딘의 반복적인 모티프 특징을 갖는 유전자는 각각 적색 및 청색 타원으로 나타냈다. 암호화된 단백질의 예측된 N-말단 서열이 유전자의 각 그룹 위에 도시되어 있다. 전장 오메가 글리아딘을 암호화하는 유전자는 속이 찬 타원(solid ovals), 유사유전자(pseudogenes)는 열린 타원(open ovals), 절단된 유전자는 평행선 무늬가 있는 타원(hatched oval)으로 표시되어 있다. 발현되면, 절단된 유전자는 COOH 말단의 일부가 결여된 단백질을 암호화하게 된다. 염색체 1A에서 절단된 유전자는 5.3 Mb 영역 외부에 위치한다.
도 6은 전장 오메가-5 글리아딘 BAE20328를 가지는 Chinese Spring의 B 및 D 게놈에 의해 암호화된 오메가-5 글리아딘의 서열 비교를 나타낸다. N-및 C-말단 서열은 각각 흑색 및 청색 박스로 표시되어 있다. 각 단백질 서열 내에서, WDEIA의 우성 항원결정기 QQFPQQQ 및 QQIPQQQ는 각각 적색 및 청색으로 표시되어 있다. 단백질 서열 위의 라인은 WDEIA 환자의 혈청과 반응하는 오프리의 단백질 spot에서 MS/MS에 의해 확인된 오메가-D4에 고유한 펩티드를 강조한 것이다. 적색 선은 보다 염기성 단백질에서 확인된 펩티드를 강조적으로 표시하는 반면, 청색 선은 보다 산성 단백질에서 확인된 펩티드를 강조적으로 표시한다.
도 7은 Chinese Spring으로부터 오메가-D4 유전자에 특이적인 프라이머를 이용한 PCR 분석 결과를 나타낸다. 금강(1), 올그루(2), 오프리(3), Chinese Spring (4) 및 Chinese Spring nullisomic tetrasomic lines N1AT1B(5), N1AT1D(6), N1BT1A(7), N1BT1D(8), N1DT1A(9) 및 N1DT1B(10) 게놈 DNA가 증폭되었다. kb 단위의 분자량 마커의 크기는 레인 M으로 표시되어 있다.
도 8은 minor spot 2개의 염기서열과 아미노산 서열을 나타낸다.
도 2는 Glu-B3 locus(유전자자리)(a), 오메가-5 글리아딘(b), Chinese Spring 의 염색체 1B의 5.8 Mb 영역의 끝에 위치한 반복 접합 프라이머 19S-1.3-2(c) 및 143E-1-600(d)에서 암호화되는 LMW-GS에 특이적인 프라이머를 이용한 PCR 분석 결과를 나타낸다. 각 패널에서, 금강(1), 올그루(2), 오프리(3), Chinese Spring의 nullisomic tetrasomic lines N1BT1A(4) 및 N1BT1D(5), Chinese Spring(6)으로부터의 게놈 DNA가 증폭되었다. kb 단위의 분자량 마커의 크기는 각 패널에서 레인 M으로 표시된다. 프라이머 서열은 표 2에 표시되었다.
도 3은 WDEIA 환자의 혈청과 부모 품종 금강(a,d), 올그루(b,e) 또는 돌연변이 오프리(c,f)의 전체 밀가루 단백질의 반응성을 나타낸다. 혈청은 J Agric Food Chem. 2015;63:9323-32.에 보고된 환자 #4(a-c) 및 환자 #5(d-f)의 것이었다. 부모 라인에서 오메가-5 글리아딘으로 확인된 단백질 spot은 패널 (a, b 및 d, e)에서 타원형으로 표시된다. 패널(c 및 f)의 화살표는 돌연변이 및 부모 라인 모두에서 반응성이 확인된 단백질 spot을 가리킨다.
도 4는 (a)금강, (b)올그루 또는 (c)오프리로부터의 전체 밀가루 단백질에 대한 오메가-5 글리아딘의 N-말단 서열에 대해 제조된 단일클론 항체의 반응성을 나타낸다. 부모 라인에서 존재하는 오메가-5 글리아딘으로 확인된 단백질 spot 위치는 패널 (a, b)에서 타원형으로 표시했다. 패널(c)에서 돌연변이 라인의 화살표는 돌연변이 및 부모 라인 모두에서 반응성이 있는 미확인 단백질 spot을 가리킨다.
도 5는 Chinese Spring의 염색체 1A(a), 1B(b) 및 1D(c)에서 오메가 글리아딘 유전자의 게놈 배열을 나타낸다. 3개 염색체에서 발견되는 조상 유전자의 위치는 검은 점으로 표시된다. 오메가-5 및 오메가-1,2 글리아딘의 반복적인 모티프 특징을 갖는 유전자는 각각 적색 및 청색 타원으로 나타냈다. 암호화된 단백질의 예측된 N-말단 서열이 유전자의 각 그룹 위에 도시되어 있다. 전장 오메가 글리아딘을 암호화하는 유전자는 속이 찬 타원(solid ovals), 유사유전자(pseudogenes)는 열린 타원(open ovals), 절단된 유전자는 평행선 무늬가 있는 타원(hatched oval)으로 표시되어 있다. 발현되면, 절단된 유전자는 COOH 말단의 일부가 결여된 단백질을 암호화하게 된다. 염색체 1A에서 절단된 유전자는 5.3 Mb 영역 외부에 위치한다.
도 6은 전장 오메가-5 글리아딘 BAE20328를 가지는 Chinese Spring의 B 및 D 게놈에 의해 암호화된 오메가-5 글리아딘의 서열 비교를 나타낸다. N-및 C-말단 서열은 각각 흑색 및 청색 박스로 표시되어 있다. 각 단백질 서열 내에서, WDEIA의 우성 항원결정기 QQFPQQQ 및 QQIPQQQ는 각각 적색 및 청색으로 표시되어 있다. 단백질 서열 위의 라인은 WDEIA 환자의 혈청과 반응하는 오프리의 단백질 spot에서 MS/MS에 의해 확인된 오메가-D4에 고유한 펩티드를 강조한 것이다. 적색 선은 보다 염기성 단백질에서 확인된 펩티드를 강조적으로 표시하는 반면, 청색 선은 보다 산성 단백질에서 확인된 펩티드를 강조적으로 표시한다.
도 7은 Chinese Spring으로부터 오메가-D4 유전자에 특이적인 프라이머를 이용한 PCR 분석 결과를 나타낸다. 금강(1), 올그루(2), 오프리(3), Chinese Spring (4) 및 Chinese Spring nullisomic tetrasomic lines N1AT1B(5), N1AT1D(6), N1BT1A(7), N1BT1D(8), N1DT1A(9) 및 N1DT1B(10) 게놈 DNA가 증폭되었다. kb 단위의 분자량 마커의 크기는 레인 M으로 표시되어 있다.
도 8은 minor spot 2개의 염기서열과 아미노산 서열을 나타낸다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 첨부한 도면을 참고로 하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
실시예 1: 식물 재료
제빵과 국수 생산 모두에 사용되는 국내 최고의 경질 밀 품종인 금강 (Triticum aestivum L.)과 국수 제조에 사용되는 연질 밀인 품종 올그루를 돌연변이 라인 오프리 반수체 집단을 생산하기 위하여 부모 라인으로 사용되었다. 금강은 Glu-A3c, Glu-B3h 및 Glu-D3a 대립 유전자를 포함하고, 올그루는 Glu-A3d, Glu-B3d 및 Glu-D3a 대립 유전자를 포함한다. Glu-A3a, Glu-B3a 및 Glu-D3a 대립 유전자를 포함하는 기준 품종 Chinese Spring과 National BioResource Project-Wheat (Kyoto, Japan)가 제공한 Chinese Spring의 nullisomic tetrasomic 라인은 PCR 분석을 위한 대조군으로 사용되었다. 식물 재료는 포장(field)에서 재배하여 얻었다.
실시예 2: 단백질 추출, 2-DE 분석 및 질량 분석
금강, 올그루 및 오프리로부터의 전체 밀가루 단백질을 SDS 완충액(2% SDS, 10% 글리세롤, 50 mM DTT, 40 mM Tris-Cl, pH 6.8)으로 추출하고, 2-DE로 정량하고 분석하였다. 쿠마시-염색된 겔로부터 개별 단백질 spot을 절제하고, DigestPro (Intavis, Koeln, Germany)를 사용하여 써모리신, 키모트립신 또는 트립신으로 분해하기 위해 96-웰 플레이트로 옮겼다. 펩티드를 함유하는 플레이트를 Orbitrap Elite mass spectrometer (Thermo Scientific, San Jose, CA)에 연결된 나노 플로우 HPLC의 오토 샘플러에 넣었다. MS/MS 스펙트럼은 2016년 11월 1일 NCBI에서 다운로드한 트리티세아에(Triticeae) 단백질 서열을 포함하는 데이터 베이스, Butte 86(Triticum aestivum)으로부터의 품종-특이적 서열, 그리고 2015년 1월 30일에 다운로드된 일반적인 contaminants의 데이터베이스에 대해 조사하였다. 2개의 검색 엔진인 Mascot와 X!Tandem이 분석에 사용되었으며 그 결과는 스캐폴드(Scaffold) 버전 4.7.5(Proteome Software, Inc., 포틀랜드, OR)에서 편집되었다.
업데이트된 데이터베이스는 오프리에서 마이너(minor) IgE 반응성 단백질의 식별을 위해 사용되었다. 이 데이터베이스에는 2018년 2월 7일 NCBI에서 다운로드한 트리티세아에(Triticeae) 단백질 서열, Butte 86(Triticum aestivum)로부터의 품종-특이적 글루텐 단백질 서열, Chinese Spring 품종으로부터의 글리아딘 및 LMW-GS의 서열, 및 2015년 1월 30일에 다운로드된 일반적인 contaminants 데이터베이스가 포함되어 있다.
실시예 3: PCR 분석
제조사가 제공한 프로토콜에 따라 DNeasy Plant mini kit(Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 금강 및 올그루 부모 라인, 오프리 돌연변이 라인, Chinese Spring 및 Chinese Spring의 nullisomic tetrasomic 라인으로부터 게놈 DNA를 분리하였다. Extaq 중합효소(Takara Bio Inc., 교토, 일본)를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 프라이머 및 증폭 조건은 표 2에 나타나 있다. 금강, 올그루, Chinese Spring에서 발견되는 LMW-GS GluB3-4 유전자에 특이적인 프라이머는 공지된 것을 사용하였다. 오메가-5 글리아딘에 대한 정방향 및 역방향 프라이머는 AB181300의 서열을 기초로 하고 1212 bp 단편을 증폭시킨다. 반복 접합(repeat junction) 프라이머의 설계는 공지된 방법을 따랐다. 이들 프라이머는 기존에 보고된 Chinese Spring, NCBI 수탁 번호 MG560141으로부터의 염색체 1B의 6.5Mb 영역의 어셈블드(assembled) 서열을 기초로 하였다. 반복 접합 프라이머 19S-1.3-2는 418bp 영역을 증폭한다. 정방향 프라이머는 NCBI Accession Number MG560141의 위치 700,904 내지 700,923 사이의 서열에 해당하고, 그리고 역방향 프라이머는 701,298 내지 710,321 사이의 서열에 해당한다. 반복 접합 프라이머 143E-1-600은 482bp 영역을 증폭한다. 정방향 프라이머는 NCBI Accession Number MG560141의 6,512,265 내지 6,512,288 사이의 서열에 해당하고 역방향 프라이머는 6,512,722 내지 6,512,746 사이의 서열에 해당한다.
오메가-D4 프라이머는 Chinese Spring 품종의 오메가-D4 유전자를 증폭하도록 설계되었다. 정방향 프라이머는 개시 코돈으로부터 하류의 58 내지 78 bp의 서열에 해당하고 역방향 프라이머는 개시 코돈으로부터 하류의 1074 내지 1094의 서열에 해당한다. 상기 정방향 및 역방향 프라이머는 오메가-5 글리아딘 BAE20328을 암호화하는 유전자 서열인 AB181300과 3개 및 7 개의 염기 불일치를 갖는다.
실시예 4: 면역블롯 분석
부모 및 돌연변이 라인의 면역블롯 분석을 위해, 7.5 μg의 총 SDS-추출된 단백질을 2-DE에 의해 분리하고 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 옮겼다. 환자의 사전 동의와 Ile de France III의 윤리위원회와 건강제품 안전기관(AFSSAPS)의 승인을 얻은 WDEIA 환자의 혈청(승인 번호 2008-A01565-50)을 사용하여 면역블롯 분석을 수행하였다. IgE-결합 단백질은 제조업체의 지침에 따라 1:500,000으로 희석된 퍼옥시다제-표지 토끼 항-인간 IgE(9160-05 SouthernBiotech) 및 화학발광 기질(WesternBright Quantum, Advansta K-120420D20)을 사용하여 시각화되었다.
또한, 멤브레인은 1/80으로 희석된 펩티드 SRLLSPRGKELG(mono ONT 18A5)에 대한 단일클론 항체로 반응되었고, 1:50,000으로 희석된 퍼옥시다제-표지된 염소 항 마우스 IgG(H, L)-HRP 콘주게이트(170-6516 Biorad)를 사용하여 시각화되었다.
실시예 5: 오프리에서 신규한 항원 단백질 서열분석
상기 염기서열 서열번호 3, 서열번호 4의 분석은 오프리의 게놈 DNA를 추출하여서 분석하였다. 염기서열 분석은 exome capture array와 PacBio long-read sequencing 시스템을 이용 분석하였다.
실험예 1: 총 밀가루 단백질의 2-DE 분석
2차원 겔 전기영동(2-DE)에 의한 부모 라인 금강, 올그루와 돌연변이 라인 오프리의 총 밀가루 단백질의 분석을 통해, 약 34 내지 55 kDa의 다수의 글루텐 단백질이 돌연변이에서 없어진(missing) 것을 확인했다(도 1, 표 1). 앞에서 설명한 바와 같이, 이들은 Glu-B3 locus(유전자 자리)에 의해 암호화된 많은 LMW-GS를 포함한다. 도 1d에 나타난 바와 같이, MS/MS에 의해 spot 7-11이 s-형 LMW-GS ACA63869 및 ACA63865로 확인되었으며, 도 1e에 나타난 바와 같이, MS/MS에 의해 spot 8-10이 s-형 LMW-GS ACA63864 및 ACA63868로 확인되었는데, 이러한 spot들이 돌연변이 라인 오프리에서 결여되어 있다(도 1f). 이들 단백질은 N-말단 서열 SHIPGLERP을 가지며 몇몇의 아미노산만이 달랐다.
또한, 오프리에는 Glu-B3 locus(유전자 자리)에 의해 암호화된 m-형 LMW-GS가 결여(missing)되어 있다. LMW-GS ACA63871은 금강의 spot 17에서 확인되었으며(도 1d), LMW-GS ACP27643은 올그루에서 spot 16에서 확인되었다(도 1e). 이 두 단백질은 N-말단 서열 METSHIP으로 시작하고 5개의 아미노산만이 달랐다.
오프리 돌연변이는 금강 모체(도 1d의 spot 6)에 의해 기여된 i-형 LMW-GS AAS10189(도 1f의 spot 1)를 함유하는 것을 확인하여, 돌연변이 라인에서 Glu-A3c 대립 유전자의 존재를 확인하였다. 또한, AAS10189는 오프리의 spot 2에서 확인되었으며 금강에서 spot 7의 작은(minor) 성분이었다(도 1d).
3개의 라인 모두 Glu-D3a 대립 유전자[금강의 spot 16(도 1d), 올그루의 spot 15(도 1e) 및 오프리의 spot 5(도 1f)]에 의해 기여된 N-말단 서열 METSRV로 시작하는 동일한 m-형 LMW-GS ABC84361을 함유하였다. 이 spot들은 겔들 사이에서 기준(reference)이 된다.
가장 주목할만한 것은, 오메가-5 글리아딘이 돌연변이 라인 오프리에서 결여되었다는 것이다. 금강에서, spot 1-5은 오메가-5 글리아딘 CAR82267 또는 BAE20328로 확인되었으며(도 1d, 표 1), 반면 올그루에서 spot 1-6은 CAR82267, BAE20328이거나 AIU64835 또는 AII26682의 일부 서열로 확인되었다(도 1e, 표 1). 2-D 겔의 이들 영역에 있는 단백질 모두가 오프리에서 결여되었다(도 1f).
또한 금강의 spot 13 및 14(도 1d)와 올그루의 spot 13과 14를 포함하여 오프리에서 여러 감마 글리아딘이 결여되었다(도 1e). 금강의 상기 두 spot은 미국 품종 Butte 86으로부터 감마 글리아딘 Bu-5로 확인되었으며, 올그루의 두 spot은 AGO17716으로 확인되었으며, 두 단백질은 8개의 아미노산만이 달랐다. 감마 글리아딘 AGJ50340으로 확인된 금강의 spot 15 및 오프리의 spot 4, 이와 함께 트리티신(triticin)으로 확인된 금강과 올그루의 spot 12 및 오프리의 spot 3은 겔에서 기준(reference) spot이다.
실험예 2: 부모 및 돌연변이 라인의 PCR 분석
PCR 분석 결과 오프리에서 많은 유전자가 결실되었음을 확인하였다(도 2). Glu-B3-4 LMW-GS 유전자에 특이적인 프라이머를 사용한 PCR을 통해 금강, 올그루 및 레퍼런스로 사용한 밀 Chinese Spring의 게놈 DNA에서 약 1600 bp의 단편을 얻었지만, 돌연변이 라인 오프리와 Chinese Spring의 nullisomic tetrasomic 라인인 N1BT1A, N1BT1D에서는 얻지 못했다(도 2a). 마찬가지로, 오메가-5 글리아딘 유전자에 특이적인 프라이머를 사용하여 약 1200 bp 단편을 금강, 올그루, Chinese Spring에서 얻었지만(표 2), 오프리 또는 Chinese Spring의 nullisomic tetrasomic 라인인 N1BT1A, N1BT1D에서는 얻지 못했다(도 2b). 이러한 결과를 통해, 오프리에서 염색체 1B에 위치하는 오메가-5 글리아딘 유전자와 Glu-B3-4 LMW-GS 유전자의 결여를 알 수 있었다.
오프리에서 결여 정도를 결정하기 위해서, LMW-GS, 오메가-5 글리아딘 및 감마 글리아딘 유전자를 포함하는 Chinese Spring으로부터의 염색체 1B의 6.5Mb 영역의 최근 공개된 게놈 서열에 기초하여 반복 접합(repeat junction) 프라이머가 선택되었다(표 2). 이들 프라이머는 부모 라인인 금강 및 올그루 뿐만 아니라 Chinese Spring으로부터 예상되는 크기의 단편을 증폭시켰지만, 오프리 또는 Chinese Spring의 nullisomic tetrasomic 라인인 N1BT1A, N1BT1D에서는 증폭시키지 못했다. 이는 적어도 1B 염색체의 5.8Mb 영역이 오프리에서 결여되었다는 것을 의미한다.
실험예 3: 부모 및 돌연변이 라인의 면역원성 잠재력
오메가-5 글리아딘은 심각한 식품 알레르기 WDEIA에서 주요 감작 단백질이므로, 오프리의 면역원성 잠재력을 평가하기 위하여 WDEIA로 확인된 환자의 혈청을 사용하여 2-D 면역블롯 분석을 실시하였다. 환자 혈청은 개별 글루텐 단백질 분획을 사용한 ELISA와 2D 면역블롯 분석에 의해 이전에 특성이 파악되었다. 두 부모 라인에서, 오메가-5 글리아딘으로 확인된 단백질은 IgE와 가장 큰 반응성을 나타냈다(도 3a, b, d, e). 또한, 2D 겔의 LMW-GS 및 알파 글리아딘 영역의 몇몇 단백질뿐만 아니라 오메가-5 글리아딘보다 약간 적은 분자량을 갖는 2개의 단백질 spot과 약간의 반응성이 있었으나, 오프리에서 IgE와 반응성이 현저하게 감소되었다(도 3c,f). 오메가-5 글리아딘 영역에는 IgE와 반응성이 없었다. 그러나, 도 3에 화살표로 표시된 오메가-5 글리아딘 영역 바로 아래의 2개의 단백질 spot은 두 WDEIA 환자의 혈청과 반응성을 나타냈다. 이 spot은 쿠마시(Coomassie)-염색 겔의 매우 작은(minor) 단백질에 해당한다(도 1).
면역블롯 결과, 오메가-5 글리아딘의 N-말단 서열에 대해 제조된 단일클론 항체와도 반응하였다(도 4). 예상한 바와 같이, 항체는 금강에서 오메가-5 글리아딘(도 1d에서 spot 1-5) 및 올그루(도 1e에서 spot 1-6)로 확인된 단백질과 강하게 반응하였다. 또한, 돌연변이 라인 오프리에서 오메가-5 글리아딘의 항체에 반응하는 2개의 spot을 발견하였다(도 4c). 이 결과를 통해, 오프리의 2개의 spot 또한 오메가-5 글리아딘에 해당한다는 것을 알 수 있었다. 모든 라인에서 약 35 kDa의 베이직(basic) 단백질과 작은 반응성이 관찰되었지만 (도 4), 쿠마시 염색된 겔상의 특정 spot과 정렬(align)하기는 어려웠다.
실험예 4: 품종 Chinese Spring에서 오메가 글리아딘 유전자의 배열
오프리에서 작은(minor) 반응성 단백질의 기원을 조사하기 위해, 기준(reference) 밀 Chinese Spring에서 오메가 글리아딘 유전자의 배열을 상세하게 조사하였다.
Chinese Spring의 19개의 오메가 글리아딘 유전자 중 4개는 염색체 1A에, 8개는 1B에, 그리고 7개는 1D에 위치해 있다(도 5). 7개의 유전자의 반복적인 모티브는 오메가-1,2 글리아딘(blue)의 특징인 반면, 12개 유전자의 반복적인 모티브는 오메가-5 글리아딘(red)의 특징이다. 8개의 오메가-5 글리아딘 유전자의 클러스터는 염색체 1B의 162kb 영역 내에 위치하며, 3개 게놈 모두에 공통인 2개의 조상 유전자가 있다. 이들 중 6개는 다양한 돌연변이를 갖는 유사유전자(pseudogene)로, 코딩 영역으로 프레임 시프트 및/또는 조기 정지 코돈을 도입한다. 유사유전자 사이에 완전한 오메가-5 글리아딘을 암호화하는 오메가-B3 및 오메가-B6이 산재되어 있다. 흥미롭게도, 4개의 다른 오메가-5 글리아딘 유전자가 염색체 1D의 이종 조상 유전자 사이의 51kb 영역에 위치한다(도 5). 이들 중 3개는 명백한 유사유전자 이며, 1개의 오메가-D4는 정지 코돈으로부터 50bp 상류의 단일 염기 결손(deletion)을 포함한다. C-말단이 변성된 오메가-D4는 44.4 kDa의 단백질을 암호화할 것이다.
Chinese Spring의 염색체 1B(오메가-B3 및 오메가-B6)에 의해 암호화된 오메가-5 글리아딘 단백질의 아미노산 서열을 오메가-D4의 아미노산 서열과 비교하였다(도 6). NCBI에서 유일한 다른 전장 오메가-5 글리아딘 서열인 BAE20328도 분석에 포함시켰다. 오메가-B3은 2개의 아미노산 치환 및 28개의 아미노산 결손에 의해 BAE20328과 상이하지만, 오메가-B6은 6개의 아미노산 치환 및 5개의 아미노산 삽입을 갖는다. 이에 비해, 오메가-D4의 서열은 BAE20328과는 상당히 다르다. B 염색체에서 암호화된 단백질인 BAE20328의 N-말단 서열은 SRL이고, 반면 오메가-D4의 N-말단 서열은 TRQ이다. 또한, 오메가-B3, 오메가-B6 및 BAE20328의 C-말단에서 마지막 16개 아미노산은 동일하지만, 마지막 16개 아미노산 중 9개가 오메가-D4에서 변경되고 마지막 6개 아미노산이 결여되어 있다. 크기가 더 작은 오메가-D4에도 불구하고, 단백질은 BAE20328 또는 Chinese Spring B-암호화된 오메가-5 글리아딘보다 6 내지 8개의 우세한 WDEIA 항원결정기를 함유한다(표 3). 오메가-D4에는 27개의 QQFPQQQ, 6개의 QQIPQQQ 반복 모티브가 존재한다. 특히, 이들 항원결정기의 90% 이상이 다른 항원결정기와 중복된다. 실제로, 2개의 항원결정기가 중첩되는 단백질 2개의 영역, 4개의 항원결정기가 중첩되는 3개의 영역, 5개의 항원결정기가 중첩되는 1개의 영역 및 9개의 항원결정기가 중첩되는 1개의 영역이 있다. 이에 비해, B-암호화된 오메가-5 글리아딘에서 항원결정기의 52-56%만이 중첩되고 중첩영역은 더 짧다. BAE20328과 오메가-B3에는 각각 2개의 항원결정기가 중첩되는 2개의 영역, 3개의 항원결정기가 중첩되는 2개의 영역, 4개의 항원결정기가 중첩되는 1개의 영역이 있고, 반면 오메가-B6에는 2개의 항원결정기가 중첩되는 4개의 영역, 3개의 항원결정기가 중첩되는 1개의 영역, 4개의 항원결정기가 중첩되는 1개의 영역이 있다(도 6, 표 3).
실험예 5. 오프리에서 작은 면역원성 단백질의 동정
오프리에서 WDEIA 혈청과 반응된 2개의 작은(minor) 미확인 단백질을 2-D 겔로부터 절제하고, 키모트립신, 써모리신 또는 트립신으로 분해하고, MS/MS에 의해 분석하였다. 스펙트럼 데이터의 분석을 위해, Chinese Spring의 글루텐 단백질 유전자 서열을 정보를 얻기 위해 데이터베이스에 추가하였다. 오메가-D4에 대한 고유한 펩티드는 반응성 단백질 둘 모두에 상응하는 spot에서 확인되었다(도 6). 이는 이들 단백질이 염색체 1D 게놈에 의해 암호화됨을 의미한다.
Chinese Spring 오메가-D4 유전자에 특이적인 프라이머를 사용한 게놈 DNA의 PCR 분석을 통해서, 부모 라인과 돌연변이 오프리 모두에서 오메가-D4의 존재를 입증하였다(표 2 및 도 7). Chinese Spring의 홀배수체(이수체) 라인의 증폭을 통해서, 1D 염색체에서 오메가-D4의 위치를 추가로 확인하였다. OD4-F1, OD4-R1 및 3개의 내부 프라이머(OD4-F3, CAATTCCCCGAACAACAATTC; OD4-F4, AACAGCAATTCCCTCAACAGC; OD4-F5, CAACAACACCAGTTACCG)를 사용하여 오프리에서 PCR 생성물의 직접적인 서열분석을 통해, 개시 코돈으로부터 986 bp에서 A에서 C로의 전이에 의해 오메가-D4와 다른 단일 서열이 생성되는 것을 확인하였다. 이 서열은 6.84의 pI를 갖는 단백질을 암호화하였다. 오프리에서는 산성단백질에 해당하는 다른 오메가-5 글리아딘 유전자가 발현하는지 알려져 있지 않다.
실험예 6. 오프리에서 작은 면역원성 단백질의 서열분석
앞서 도 3과 도 4에서 확인된 돌연변이 라인 오프리의 minor 단백질 spot의 아미노산 서열과 염기 서열을 분석하였다. 그 결과 상기 도 3과 4에서 확인된 minor spot은 서열번호 1의 아미노산 서열과 서열번호 3의 염기서열을 가지는 것을 확인하였다. 또한 서열번호 2의 아미노산 서열과 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 것을 확인하였다.
서열분석 결과, 상기 minor spot들은 신규한 오메가-5 글리아딘으로, 오프리 돌연변이 라인에서 신규하게 발견된 것으로, WDEIA에 대한 IgE 결합 항원결정기로 알려진 QQFPQQQ와 QQIPQQQ 반복 모티브를 포함하는 것으로 확인되었다.
이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.
<110> Republic of Korea
<120> Novel antigenic proteins and their use to detect wheat-dependent
exercise-induced anaphylaxis
<130> DP2019125
<160> 4
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 387
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1 5 10 15
Ala Ser Ala Thr Arg Gln Leu Ser Pro Arg Gly Lys Glu Leu Gln Thr
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35 40 45
Leu Gln Gln Gln Phe Pro Gln Arg Gln Gln Ile Pro Gln Gln Pro Gln
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Gln Gln Gln Gln Ile Pro Gln Gln Pro Gln Gln Phe Pro Gln Gln Gln
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Gln Phe Pro Gln Gln Gln Gln Phe Pro Gln Gln Gln Phe Pro Gln Gln
145 150 155 160
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245 250 255
Gln Phe Pro Gln Gln Gln Gln Phe Pro Gln Gln His Gln Leu Pro Gln
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Pro Gln Gln Gln Gln Phe Pro Gln Gln Gln Phe Pro Gln Gln Gln Phe
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Pro Gln Gln Gln Gln Phe Pro Gln Gln Gln Gln Phe Pro Gln Gln Gln
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Gln Phe Pro Gln Gln Gln Gln Phe Pro Gln Gln Gln Gln Phe Pro Gln
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Pro Ile Pro Tyr Pro Pro Gln Gln Gln Ser Gln Glu Ala Ser Pro Tyr
355 360 365
Gln Gln Tyr His Asn Asn Asn Tyr Leu Gly Ala Thr Leu *** Val Ser
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<400> 3
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caattccctc aaccacaaca aatcctccaa caacaattcc cccaacgaca acaaatcccc 180
cagcaaccgc aacaattccc ccaacagcaa ttcccgcaac agcaaatccc acaacagcaa 240
atcccgcaac aacaattccc ccaaccacaa caaatccccc aacaacaatt cccccaacaa 300
caacaaatcc cccaacaaca attcccccaa caacaacaaa tcccccagca accacaacaa 360
ttcccccaac aacagcaatt cccccaacaa caacaaatcc cccagcaacc acaacaattt 420
ccccaacaac agcaattccc ccaacaacaa caattccccc aacagcaatt cccgcaacaa 480
caattccccg aacaacaatt ctcacaacaa caatcccccc aaccacaaca aatcccccaa 540
caacaattac tccaacaaca acaaatcccc cagcaagaat tcccccaaca acagcaattc 600
ccgcaacaac aattccccca acagcaattc cctcaacagc aattcccaca acaacaacaa 660
atcccccagc aacaaccaca acaacatccc caacaacaac aacaatttcc ccaacaacaa 720
caaatccccc aacaaaaata cccccaacaa caacaattcc cccaacagca attcccccaa 780
caacaacaat ttccccaaca acaccagtta ccgcaacaac aattccccca acaacaacaa 840
atctccgagc aacaacaaca attcccccaa caacaacaat tcccccaaca gcaattcccg 900
caacaacaat ttccccaaca acaacaattc ccacaacaac aacagttccc ccaacaacaa 960
caattccccc aacaacaaca gttcccccaa caacaacaat tcccgcaaca acaattcccc 1020
cagcaaccac aacaacaatt cccaaaacaa caatttccca taccataccc accccaacaa 1080
caatcgcaag aagcttcccc ataccaacaa taccacaaca acaactatct gggagcgaca 1140
ttataagtat cagtggccga tga 1163
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acgttataag tatcagtggc cgatga 1166
Claims (8)
- 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 항원 단백질.
- 제1항에 있어서, 상기 항원 단백질은 밀 의존성 운동 유발성 과민증을 유발하는 것인, 항원 단백질.
- 제1항에 있어서, 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산은 서열번호 3으로 표시되는 염기서열에 의해 코딩되는 것인, 항원 단백질.
- 제1항에 있어서, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산은 서열번호 4로 표시되는 염기서열에 의해 코딩되는 것인, 항원 단백질.
- 제1항에 있어서, 상기 항원 단백질은 QQFPQQQ 또는 QQIPQQQ 펩티드의 항원결정기를 포함하는 것인, 항원 단백질.
- 제1항의 항원 단백질을 포함하는 밀 의존성 운동 유발성 과민증 진단용 조성물.
- 제1항의 항원 단백질을 포함하는 오메가-5 글리아딘 검출용 조성물.
- 제6항 또는 제7항의 조성물을 포함하는 키트.
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ID=76150326
Family Applications (1)
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| KR20190074222A (ko) * | 2017-12-19 | 2019-06-27 | 호유 가부시키가이샤 | 에피토프 |
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2019
- 2019-11-21 KR KR1020190150665A patent/KR102265785B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| KR20110026953A (ko) | 2009-09-09 | 2011-03-16 | 덕성여자대학교 산학협력단 | 기능성 밀가루, 그 제조방법 및 이를 이용하여 제조된 기능성 식품 |
| KR20190074222A (ko) * | 2017-12-19 | 2019-06-27 | 호유 가부시키가이샤 | 에피토프 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| FEBS JOURNAL, VOL. 272 (2005) P.4431-4438 * |
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| GENBANK: MG560142.1 * |
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| KR102265785B1 (ko) | 2021-06-16 |
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|---|---|---|---|
| GRNT | Written decision to grant |