KR20210060350A

KR20210060350A - 표면 개질된 비오염성 세포 검정 미세유체칩 및 이를 포함하는 미세유체소자

Info

Publication number: KR20210060350A
Application number: KR1020200153587A
Authority: KR
Inventors: 양성윤; 이수진; 김다름
Original assignee: 충남대학교산학협력단
Priority date: 2019-11-18
Filing date: 2020-11-17
Publication date: 2021-05-26
Also published as: KR102507834B1

Abstract

본 발명은 장기적 항박테리아성과 항오염성 및 세포흡착성 필름을 갖는 미세유체소자에 관한 것으로, 소형화된 미세유체칩에서도 국소부위별로 다르면서도 세포 또는 미생물 배양과 약효 모니터링에 필수적인 조건을 충족하는 기능성 고분자 복합소재를 구현한 것이고, 상기 소재로 제조한 미세유체소자는 세포배양 및 약물 효과 모니터링을 효과적으로 수행할 수 있다.

Description

표면 개질된 비오염성 세포 검정 미세유체칩 및 이를 포함하는 미세유체소자{Surface modified noncontaminating cell test microfluidic chip and microfluidic device containing the same}

본 발명은 표면 개질된 비오염성 세포 검정 미세유체칩 및 이를 포함하는 미세유체소자에 관한 것이다.

의학적 진단칩, 센서 칩은 일반적으로 액상 생체시료를 진단시약이 고정된 미세유체칩에 도입하여 확인하는 방식으로 이루어진다. 오늘날 진단칩은 임신진단키트처럼 단순히 O, X 방식으로 운용되는 것에서 벗어나 약물 스크리닝, 세포배양 칩의 제조로 의학적 진단칩으로서 그 기능이 확대하면서 미세유체칩 안에서 미생물을 배양하며 장시간 모니터링 해야 할 필요성이 생겨났다. 그러나, 약물 효과를 테스트하는 기존의 방식 중 동물 임상시험 전단계로 체외임상 즉, 세포 수준에서의 독성실험을 하는 in vitro 실험에서는 생체적 환경과는 다르게 약물을 미리 배양해 놓은 세포층에 도포하여 직접적으로 세포와 접촉하게 하여 테스트함에 따라 고농도 및 물리적 접촉이 야기되는 효과를 구분할 수 없었다. 또한, 기존의 미세유체시스템 개발 기술은 물리적, 기하학적으로 복잡한 구조 구현에 초점이 맞춰져 있으나 생물을 다루는 의공학에서는 소재의 화학적, 생화학적 기능을 조절하는 것이 중요하다. 이에 미세유체소자에 사용 가능한 약물전달시스템의 개발 및 이를 장시간 오염없이 유지할 수 있는 기능성 소재의 개발이 필요하다.

본 발명은 표면 개질된 미세유체칩을 포함하는 미세유체소자의 오염을 방지하고 세포배양시 세포흡착을 유도하여 세포배양이 우수한 미세유체소자를 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 측면에 따른 표면을 개질한 미세유체칩은 친수성 단일 중합체의 적층과 폴리아크릴아마이드(polyacrylamide) 적층을 교대로 반복하여 형성된 비접착부(non-adhesive); 및 친수성 단일 중합체의 적층과 초분자 구조 화합물의 적층을 교대로 반복하여 형성된 세포접착부(cell-adhesive)를 포함한다.

또한, 폴리알릴아민 하이드로클로라이드(polyallylamine hydrochloride)로 사전 처리된 미세유체칩일 수 있다.

또한, 은 나노입자(silver nanoparticle)로 사후 처리된 미세유체칩일 수 있다.

또한, 약물 도입부, 약물입자 고정부, 약물효능 모니터부 및 세포배양부가 연결된 채널을 포함하는 미세유체칩일 수 있다.

또한, 폴리-L-리신(poly-L-Lysine) 및 탄닌산(tannic acid)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상으로 사후 처리된 미세유체칩일 수 있다.

또한, 적층은 2 내지 100회 교대로 반복하여 형성된 미세유체칩일 수 있다.

또한, 친수성 단일 중합체는 폴리에틸렌옥사이드, 폴리에틸렌글리콜, 폴리아크릴산 및 폴리비닐 알코올로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상인 미세유체칩일 수 있다.

또한, 초분자 구조 화합물은 크라운 에테르(crown ether), 사이클로덱스트린(cyclodextrin), 로텍산(rotaxan), 제올라이트(zeolite), 포르피린(porphyrin), 쿠커비투릴(cucurbituril)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상인 미세유체칩일 수 있다.

또한, 미세유체칩은 폴리디메틸 실록산(polydimethyl siloxane), 폴리메틸 메타크릴레이트(polymethyl methacrylate) 및 사이클로-올레핀 공중합체(cyclo-olefin copolymer)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상인 미세유체칩일 수 있다.

다른 구현 예에서, 친수성 단일 중합체의 적층과 폴리아크릴아마이드(polyacrylamide) 적층을 교대로 반복하여 형성된 비접착부; 및 친수성 단일 중합체의 적층과 초분자 구조 화합물의 적층을 교대로 반복하여 형성된 세포접착부; 로 표면을 개질한 미세유체칩을 포함하는 미세유체소자를 제공한다.

또한, 미세유체칩의 하면에 유리, 폴리디메틸 실록산(polydimethyl siloxane), 폴리메틸 메타크릴레이트(polymethyl methacrylate) 및 사이클로-올레핀 공중합체(cyclo-olefin copolymer)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상인 하판을 포함하는 미세유체소자일 수 있다.

또 다른 구현 예에서, 친수성 단일 중합체의 적층과 폴리아크릴아마이드(polyacrylamide) 적층을 교대로 반복하여 형성된 비접착부를 적층하는 단계; 및 친수성 단일 중합체의 적층과 초분자 구조 화합물의 적층을 교대로 반복하여 형성된 세포접착부를 적층하는 단계; 로 표면을 개질한 미세유체칩의 제조방법을 제공한다.

이상과 같이, 본 발명에 따른 표면 개질된 미세유체칩을 포함하는 미세유체소자는 장기적 항박테리아성과 비오염성 및 세포흡착성으로 코팅되어 약물도입부와 세포배양부가 잘 분리됨에 따라 기타 미생물의 오염없이 세포배양과 약물방출이 이루어질 수 있어 독성 테스트 및 약물방출 효과를 실시간으로 효과적으로 모니터링할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 비오염성 코팅소재는 국소부위별로 다르면서도 세포 또는 미생물 배양과 약효 모니터링에 필수적인 조건을 충족하는 기능성 고분자 복합소재를 구현하여 제약, 의공학 산업에 적용 가능하며, 미세유체소자는 약물전달시스템과 의학적 진단칩으로 사용되거나, 기타 미생물 오염을 방지해야하는 다양한 분야에 응용이 가능하다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 (a) 미세유체소자의 조립구성도 및 (b) 미세유체칩의 파트별 구성도를 나타낸 것이다. 상판(top plate)은 미세유체칩을 나타내는 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 (a) 약물 탑재 젤 입자 사진 및 (b) 미세유체소자에서의 약물 방출 거동 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 미세유체칩의 표면 개질에 사용된 고분자화합물 구조를 나타낸 것이다. (a): Non-adhesive 코팅막에 사용된 고분자화합물, (b): Cell adhesive 코팅막에 사용된 고분자 화합물.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 미세유체소자의 contact angle 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 미세유체소자의 cell adhesive 표면 이미지를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 미세유체소자에서의 세포배양 결과를 나타낸 이미지이다. (a): 일반 PDMS 미세유체칩, (b) 비오염성 필름(PAA/PAAm)이 선택적으로 코팅된 미세유체칩, (c) 비오염성 필름(PAA/PAAm)과 세포흡착성 필름(PAA/Cat-CyD)이 부위별로 선택적으로 코팅된 미세유체칩.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 미세유체소자의 약물입자 고정부 안에 도입된 약물함유 sodium alginate (SA) 겔 입자의 형상을 나타낸 이미지이다. (a): 일반 PDMS 유체칩, (b): 비오염성 표면처리 된 PDMS 유체칩.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 은 나노입자의 도입유무에 따른 비오염성 코팅된 미세유체소자의 장시간 세포배양 결과를 나타낸 이미지이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 기능성 코팅막으로 처리된 미세유체소자에서 젤 입자에서의 항암 약물 방출에 따른 결과를 나타낸 이미지이다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 본 발명을 설명함에 있어, 관련된 공지 구성 또는 기능에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명은 생략한다. 본 발명에서 인용되는 모든 문헌은 본 발명의 일부로 포함된 것이다.

본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 달리 언급하지 않는 한, 하기 용어의 의미는 하기와 같다:

본 명세서에서 사용된 용어 "poly(dimethylsiloxane)"은 이하 "PDMS"와 동일한 것으로 이해되어야 한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "Sodium alginate"는 이하 "SA"와 동일한 것으로 이해되어야 한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "polyallylamine hydrochloride"는 이하 "PAH"와 동일한 것으로 이해되어야 한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "polyacrylic acid"는 이하 "PAA"와 동일한 것으로 이해되어야 한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "polyacrylamide"는 이하 "PAAm"와 동일한 것으로 이해되어야 한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "사이클로덱스트린" 또는 "cyclodextrin"은 이하 "CyD"와 동일한 것으로 이해되어야 한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "베타사이클로덱스트린" 또는 "β-cyclodextrin"은 이하 "β-CyD"와 동일한 것으로 이해되어야 한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "Cationic cyclodextrin oligomer"는 이하 "Cat-CyD"와 동일한 것으로 이해되어야 한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "poly-L-Lysine"은 이하 "PLL"과 동일한 것으로 이해되어야 한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "tannic acid"는 이하 "TA"와 동일한 것으로 이해되어야 한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "Non-adhesive 코팅"은 친수성 및 항오염성(미생물 부착방지)을 갖는 코팅을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "cell-adhesive 코팅"은 세포접착성이 있는 코팅을 의미한다.

본 발명의 표면을 개질한 미세유체칩은 친수성 단일 중합체의 적층과 폴리아크릴아마이드(polyacrylamide) 적층을 교대로 반복하여 형성된 비접착부; 및 친수성 단일 중합체의 적층과 초분자 구조 화합물의 적층을 교대로 반복하여 형성된 세포접착부를 포함한다.

본 발명에 포함된 구성의 일부는, 대한민국 등록특허 제1928048호의 내용을 포함하고 있고, 상기 등록특허에 기재된 내용의 일부는 본 발명에 구체적으로 기재되어 있지 않더라도, 본 발명의 일부로 포함될 수 있다.

본 발명의 미세유체칩은 후술하는 고분자 다층막과의 접착성 향상을 위하여 플라즈마 처리 및/또는 프라이머 처리와 같은 공지의 방법으로 그 표면이 사전처리된 것일 수 있다. 다만, 미세유체칩의 재료가 소수성인 경우 세포배양액과 같은 수용액의 도입이 용이하도록 친수성으로의 표면개질이 필요하다. 바람직하게는, 폴리알릴아민 하이드로클로라이드(polyallylamine hydrochloride)로 고분자 다층막을 형성하기 전 단계에 사전 처리하여 친수성으로의 표면개질을 유도할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 미세유체칩은 약물 도입부, 약물입자 고정부, 약물효능 모니터부 및 세포배양부가 연결된 채널을 포함할 수 있다.

상기 세포배양부는 세포접착부와 실질적으로 동일한 부위일 수 있고, 세포의 접착은 본 발명이 속하는 분야에서 사용하는 모든 세포 접착 효율을 향상시키는 물질을 사용할 수 있고, 바람직하게는 세포의 전하 성질에 따라 양전하 물질을 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 폴리-L-리신(poly-L-Lysine) 및 탄닌산(tannic acid)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상으로 사후 처리한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 미세유체칩은 세포의 검정을 위해 제조된 것이므로, 전 과정이 무균상태에서 이루어져야 다양한 오염요인을 배제할 수 있다. 비오염성 효과를 달성하기 위하여, 본 발명에서는 친수성 단일 중합체의 적층과 폴리아크릴아마이드(polyacrylamide) 적층을 교대로 반복하여 형성된 비접착부를 사용하였으나, 추가적인 오염방지를 위하여 본 발명이 속하는 분야에서 사용하는 모든 오염방지 물질을 포함할 수 있고, 바람직하게는 은 나노입자(silver nanoparticle)로 사후 처리할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 은 나노입자는 미세유체칩의 모든 부위에 사용할 수 있고, 바람직하게는 세포배양부에 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 적층은 미세유체칩의 친수성 및 항오염성(미생물 부착방지)를 나타내는 적층횟수를 포함하는 것이고, 바람직하게는 2 내지 100회, 2 내지 50회, 2 내지 10회, 2 내지 5회 교대로 반복하여 형성되는 것이며, 더욱 바람직하게는 3 내지 4회 교대로 반복하는 것이나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 친수성 고분자는 고분자 사슬의 주쇄 또는 측쇄에 극성 또는 하전된 관능기를 가짐으로써 물 등의 극성 용매에 용해되는 고분자를 말한다. 친수성 고분자는 결정성이거나 또는 비정질의 고분자일 수 있다. 한편 단일 중합체(homo-polymer)라 함은 하나의 단량체를 중합하여 얻어지는 고분자를 말한다.

본 발명에서 친수성 단일 중합체는 폴리에틸렌옥사이드(polyethyleneoxide, PEO), 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol, PEG), 폴리아크릴산(polyacrylic acid, PAA) 및 폴리비닐 알코올(polyvinyl alcohol, PVA)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있고, 바람직하게는 PAA이나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 초분자 구조의 화합물은 기존의 유기 저분자 기반의 초분자 형성에 비해 본 발명의 고분자 형태의 초분자 화합물은 쉽게 코팅막으로 제조할 수 있어 고체 표면에서 다양한 분자의 손님(guest)분자와의 결합을 활용할 수 있는 새로운 기능성 재료가 될 수 있다. 손님분자와 결합하는 분자는 공동을 가진 화합물로 이들의 결합 현상은 초분자 화학으로 연구되어 왔다. 초분자는 수소결합, 정전기적 상호작용 또는 반데르발스 인력과 같은 비공유 결합을 통해 분자나 이온이 모여 형성된 분자복합체를 의미한다. 초분자의 구조를 형성하는 대표적인 비공유 결합들은 공유결합에 비해 매우 약하기 때문에 초분자 물질은 주변의 환경에 따라 구조가 쉽게 변할 수 있어 이러한 특징을 이용하면 물질의 모양을 임의적으로 조절할 수 있다. 초분자 구조를 형성하는 대표적인 원리는 분자인식(molecular recognitio

n)과 자기조립(self-assembly)이다. 분자인식은 항원-항체 반응처럼 분자가 구조적으로 들어맞아 나타나는 결과로 자물쇠와 열쇠의 관계로 볼 수 있다. 반면 자기조립은 자발적인 상호작용으로 분자들이 조립되는 현상으로서, 이렇게 형성되는 초분자체는 분자의 특성에 기인한다. 생태계의 초분자가 분자인식에 더 기반한다고 보면, 합성을 기반으로 하는 초분자 화학은 자기조립으로 조절되는 경우가 더 다양하다고 볼 수 있다. 초분자체의 범위가 상당히 넓을 수 있기 때문에 우선 가장 간단하고 작은 단위부터 살펴보자면, 단위체기반의 분자들을 언급할 수 있다.

초분자 구조 화합물은 크라운 에테르(crwon ether), 사이클로덱스트린(cyclodextrin, CyD), 로텍산(rotaxan), 제올라이트(zeolite), 포르피린(porphyrin), 쿠커비투릴(cucurbituril)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있고, 바람직하게는 알파, 베타 또는 감마 CyD일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 발명자가 선행연구(S. Y. Yang et al. , Bull. Korean Chem. Soc. 2013, Vol. 34, No. 7. 2016-2022)에서 개발한 양이온성 사이클로덱스트린 올리고머(cationic cyclodextrin oligomer, Cat-CyD)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 미세유체칩은 폴리디메틸 실록산(polydimethyl siloxane), 폴리메틸 메타크릴레이트(polymethyl methacrylate) 및 사이클로-올레핀 공중합체(cyclo-olefin copolymer) 등 광학적 투명도가 높은 고분자들로 구성된 군으로부터 선택된 재료를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 친수성 단일 중합체의 적층과 폴리아크릴아마이드(polyacrylamide) 적층을 교대로 반복하여 형성된 제1 적층부; 및 친수성 단일 중합체의 적층과 초분자 구조 화합물의 적층을 교대로 반복하여 형성된 제2 적층부; 로 표면을 개질한 미세유체칩을 포함하는 미세유체소자를 제공한다.

본 발명에서 미세유체칩의 하면(하판)은 유리, 폴리디메틸 실록산(polydimethyl siloxane), 폴리메틸 메타크릴레이트(polymethyl methacrylate) 및 사이클로-올레핀 공중합체(cyclo-olefin copolymer) 등 광학적 투명도가 높은 고분자들 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또 다른 구현 예에서, 친수성 단일 중합체의 적층과 폴리아크릴아마이드(polyacrylamide) 적층을 교대로 반복하여 형성된 제1 적층부를 적층하는 단계; 및 제1 코팅부의 표면에, 친수성 단일 중합체의 적층과 초분자 구조 화합물의 적층을 교대로 반복하여 형성된 제2 적층부를 적층하는 단계; 로 표면을 개질한 기판의 제조방법을 제공한다.

이하에서, 본 발명의 실시예를 들어 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 하기 실시예로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 약물 함유 하이드로겔 입자 제조

암 치료제인 6-mercaptopurine (이하, 6-MP로 약기함)은 체액과 같은 수용액에 녹기 힘든 난용성 약물로서, 6-MP를 효과적으로 담지 및 방출할 수 있는 하이드로겔 입자를 합성하였다. 먼저, 6-MP를 0.05% (w/v)의 농도로 2차 증류수에 넣어 70℃에서 녹여주었다. Sodium alginate (이하, SA로 약기함)를 4% (w/v) 농도로 2차 증류수에 넣어 상온에서 녹여주었다. 6-MP가 완전히 녹은 후 SA 용액과 혼합하여 40℃로 유지하며 4시간 동안 교반하였다. 2차 증류수에 실온에서 녹인 1 M calcium chloride 용액을 준비하고, 상기 6-MP와 SA의 혼합용액을 주사기에 넣어 상기 calcium chloride 용액에 drop by drop으로 떨어뜨려 약 20분 동안 300 rpm으로 교반하여 가교시켰다. 생성된 입자(6-MP를 함유한 SA beads)들을 필터로 거르고 2차 증류수로 3회 이상 세척한 후, 70℃에서 24시간 동안 건조하였다.

실시예 2. 미세유체칩 및 미세유체소자 제조

전구물질인 sylgard 184A와 가교제인 sylgard 184B를 무게비 9:1로 vortex mixer를 이용하여 5분 동안 균일하게 섞어 poly(dimethylsiloxane) (이하, PDMS로 약기함)을 제조하였다. 리소그래피를 이용하여 양각의 유체소자 구조가 다수로 새겨진(multiple microfluidic chips embedded) 실리콘 마스터 몰드 위에 상기 배합한 PDMS를 부은 후, 진공 오븐에서 1시간 이상 60 mmHg의 압력으로 PDMS 내에 존재하는 기포를 제거하였다. 그 후 60℃에서 3시간 동안 PDMS를 경화시켰다. 경화된 PDMS를 마스터 몰드에서 분리시키고 각각의 미세유체칩 단위로 절단하였다.

미세유체소자는 채널이 형성된 PDMS 미세유체칩(상판, top plate)과 유리(슬라이드 글라스) 또는 PDMS를 하판(bottom plate)으로 하여 서로 접착시켜 제조한다. 미세유체소자를 제작하기 전, PDMS 미세유체칩 및 슬라이드 글라스를 2차 증류수와 마이크로 세제가 희석된 수용액 상에서 15분 동안 sonicator를 이용하여 세척하였다. 그 후 세제를 충분히 제거하기 위해 2차 증류수로 여러 번 헹궈준 뒤, 다시 2차 증류수에 넣고 15분씩 2~3회 세척을 반복하였다. Isopropanol 및 NaOH를 2차 증류수에 희석한 용액에 기질을 넣고 15분 동안 세척한 후, 마지막으로 2차 증류수로 15분간 세척하였다.

미세유체소자의 상판과 하판을 접합하기 전, PDMS 미세유체칩의 약물도입부 위치에 SA 입자를 넣고 접착시켰다. 상판과 하판을 플라즈마 처리기로 30-90초 동안 처리한 후 결합시켰다. 접합부위를 잘 고정화하기 위해 상판과 하판을 결합한 미세유소자를 일정한 압력하에 48시간 정도 둔 후 사용하였다.

실시예 3. 세포흡착을 유도하는 사이클로덱스트린 ( CyD ) 고분자 합성

사이클로덱스트린(cyclodextrin; 이하, CyD로 약기함) 기반 고분자는 당 유사체로서의 특성과 공동(cavity)을 가져 생화학적 신호물질 또는 활성물질을 함침할 수 있는 특성이 있어 세포의 흡착이나 성장을 돕는 효과가 있다. CyD 고분자를 기능성 코팅막의 재료로 사용하기 위해서는 이온성 작용기를 갖는 oligomer 형태의 물질이 필요하기 때문에 Cationic cyclodextrin oligomer(이하, Cat-CyD로 약기함) 합성을 진행하였다. CyD은 선행연구에서 가장 높은 수득율과 이온화그룹이 잘 도입되는 성질을 나타낸 베타사이클로덱스트린(β-cyclodextrin; 이하, β-CyD로 약기함)을 사용하였다(S. Y. Yang et al. , Bull. Korean Chem. Soc. 2013, Vol. 34, No. 7. 2016-2022).

실시예 4. 미세유체소자 내부 표면개질

미세유체소자는 소수성 표면을 가지고 있기 때문에 세포배양액 같은 수용액의 도입이 용이하도록 친수성으로의 표면개질이 필요하며, 또한 박테리아 등의 오염을 방지하는 것이 요구된다. 이러한 표면개질을 위해 고분자 전해질 다층막을 이용하였으며, 표면개질을 위한 고분자 전해질로는 polyallylamine hydrochloride (이하, PAH로 약기함), polyacrylic acid (이하, PAA로 약기함), polyacrylamide (이하, PAAm로 약기함), Cat-CyD, 그리고 자연계 고분자(natural polymer)인 poly-L-Lysine (이하, PLL로 약기함), tannic acid(이하, TA로 약기함)를 사용하였다. 각 고분자 전해질은 2차 증류수를 사용하여 0.01 M의 농도로 맞추고, pH는 3.0으로 유지하였다.

먼저, 미리 접착된 미세유체소자에 syringe pump를 이용하여 PAH를 주입하고 15분간 채널을 채워 흡착을 유도한 후 2차 증류수를 이용하여 두 번씩 세척하여 잔류 PAH를 제거하였다. 이때 PAH는 PDMS에 잘 흡착하여 이후에 도입되는 PAA/PAAm 코팅이 잘 이루어지도록 한다. PAH와 동일한 방법으로 PAA와 PAAm을 유체 채널 내부에 교대로 주입하여 적층하였다. 여기서 PAA/PAAm 코팅은 세포 또는 타 미생물 흡착을 방지하는 비오염성 특성을 나타낸다. 코팅막의 두께는 미세유체채널의 친수성 및 항오염성(미생물 부착방지)을 나타내는 최소 두께인 PAH(3.0)/[PAA(3.0)/PAAm(3.0)]₃으로 적층하였다. 여기서, PAA와 PAAm 같이 서로 다른 고분자 한 쌍이 결합 및 적층된 층을 1 bilayer라 하여 적층횟수를 나타내며, 즉, PAA와 PAAm이 1 bilayer 적층되었으면 [PAA/PAAm]₁이라고 나타낸다. PAA/PAAm 코팅의 안정성을 위해 적층 후 오븐을 이용하여 80℃에서 10시간 동안 열적 가교를 시켜주었다. 또한, 세포 성장 관찰 부분인 세포배양부는 세포흡착성을 나타내는 고분자인 Cat-CyD를 PAA와 함께 적층한 [Cat-CyD/PAA]_3.5코팅막을 추가로 적층하였다. Cell-adhesive 코팅막으로 자연계 고분자인 PLL과 TA도 사용하여 좋은 결과를 얻었고 미세유체시스템을 체내 또는 인체부착형으로 사용할 경우에 적용할 수 있다.

실시예 5. 은 나노입자 합성

Layer-by-Layer (LbL) 기술을 이용하여 고분자 다층박막에 이온교환 반응 및 환원반응을 통해 은 나노입자를 합성하였다. 먼저, 고분자 다층막을 5 mM silver acetate (CH₃COOAg) 수용액에 15분간 담가 다층막 내부의 -COOH 작용기와 은 양이온의 이온교환 반응을 일으킨 뒤, 2차 증류수에 2분간 두 번 세척하여 잔여물질을 제거하였다. 그 다음 환원용액인 2 Mm Borane-dimethylamine complex ((CH₃)₂NH·BH₃; DMAB) 수용액에 5분간 담가 다층막 내부에 분산되어있던 은 양이온을 은 나노입자로 환원시켰다. 마지막으로 잔여 환원용액을 제거하기 위해 2차 증류수로 2분간 두 번 세척하였다.

실시예 6. 미세유체소자를 이용한 세포 모니터링

다양한 기능성 코팅막이 적용된 미세유체채널에 세포를 주입하여 세포 배양과 약물에 대한 세포 독성을 관찰하였다. 세포는 HEK293 세포와 HeLA 세포를 사용하였다. 먼저, 세포 주입 전, 제작한 미세유체채널을 UV-light에 30분 동안 노출시킨 뒤 70% ethanol을 이용해 시편을 소독하였다. 또한 1 ml 실린지를 이용하여 DPBS solution을 채널 내부에 여러 차례 흘려보내 세척하였고, 동일한 방법으로 세포배양액을 채널 내부에 주입하였다. 그 후 준비된 세포를 1 ml 실린지를 이용하여 채널 내부에 주입하여 37℃, CO₂ 5% 환경의 인큐베이터에서 배양하였으며, 세포 도입 후 4시간부터 96시간까지 약물방출에 따른 세포 변화를 관찰하였다.

도 2는 본 발명에서 항암약물 등 약물을 탑재한 하이드로겔 입자의 사진(도 2a)과 탈이온수 pH인 5.5에서와 생체의 pH 환경인 혈장 pH인 7.4에서의 젤 입자로부터 약물이 방출되는 거동 결과를 나타낸다.

도 3은 미세유체소자의 표면개질에 사용한 고분자화합물의 구조를 나타낸 것으로, (a)는 non-adhesive 코팅막의 PAA, PAAm 고분자이고, (b)는 cell-adhesive 코팅막의 Cat-CyD, PAH, PLL, TA 고분자를 나타낸다. 이들 중 PAA/PAAm의 다층막은 미세유체채널의 친수성 및 항오염성(미생물 부착방지)을 나타냄에 따라 이들을 이하 “Non-adhesive” 코팅이라 칭하도록 한다. Cat-CyD/PAH의 다층박막과 PLL/TA 다층박막은 세포의 표면 흡착과 배양을 촉진하여 세포접착성이 있는 것으로 보인다. 따라서, 이들 코팅막은 이하 “cell-adhesive” 코팅막으로 칭한다.

PLL/TA는 두 고분자 모두 자연계 고분자(natural polymer)로 생체친화적, 친화경적인 코팅막으로 개발하였다. [PLL(7.0)/TA(5.0)]의 코팅막의 경우, 소수성인 PDMS의 표면을 친수성으로 바꾸고 세포 성장도 잘되게 하였다.

도 4는 PLL/TA을 코팅막으로 사용하여 미세유체칩의 표면 젖음성을 향상시킨 결과를 나타낸 것으로, (a) 코팅막의 적층수에 따른 물 접촉각 변화, (b)PLL/TA 코팅막 적용 전, 후의 PDMS의 물 접촉각 측정 사진이다. 도 4에서처럼 110° 정도의 접촉각이 PLL/TA 코팅막 후에 50° 근방으로 낮아졌고, 도 5에서처럼 코팅막에서 PC12 세포가 잘 성장하는 결과를 얻었다. PC12 세포처럼 신경세포를 미세유체소자에서 배양할 때 적용할 수 있을 것으로 보인다.

도 5는 PLL/TA을 코팅막으로 사용한 cell adhesive 표면을 나타낸 것으로, (a) TA 최외각층, (b)PLL 최외각층 코팅 필름위에서의 PC12 신경세포의 4일차까지의 배양결과를 나타낸다.

도 6은 미세유체소자에서의 세포배양 결과를 나타낸 것으로, (a) 표면처리가 되어 있지 않은 기존의 일반 미세유체칩의 경우 암세포 및 정상세포(대조군)의 배양이 세포배양부에서 선택적으로 이루어지지 못하고 채널 전반부에 불규칙적으로 이루어지는 것을 확인할 수 있다. 반면, 비오염성 코팅이 된 미세유체칩 (b)와 (c)의 경우 세포성장이 세포배양부에 선택적으로 집중되어 이루어진 것을 확인할 수 있으며, 이로써 방출된 약물이 세포에 도달될 때의 효과를 오염 없이 분석할 수 있다. 특히, Non-adhesive 코팅과 cell-adhesive 코팅을 사용한 (c)의 경우는 Cat-CyD 한층만의 적층으로도 세포배양부에서 세포배양이 잘 되어 신뢰도 높은 분석결과를 얻을 수 있었다. Cat-CyD는 CyD분자에 이온화기능기를 첨가하고 고분자형태로 합성한 것으로 본 발명자가 보유한 특허 등록된 화합물이다(대한민국 등록특허 제1190267호, 제1195533호 등).

도 7은 미세유체소자의 약물입자 고정부 안에 도입된 약물을 포함한 SA 겔 입자의 현미경 이미지로, 이를 참조하여 설명하면, (a) 일반 미세유체소자의 경우 표면처리가 되어있지 않아 미세유체소자 표면에 흡착한 세포와 약물입자가 직접 접촉되는 반면, (b) 비오염성 표면처리가 된 본 발명의 미세유체소자의 경우 비오염성 코팅으로 인해 약물입자 주변에 직접적인 접촉을 하는 세포가 전혀 발견되지 않는 것을 확인할 수 있다.

도 8은 본 발명에서 사용한 코팅막의 PAA 등 카르복실기를 가진 고분자를 이용하여 비오염성 코팅된 미세유체소자에 은 나노입자의 도입 유무에 따른 장시간세포배양시 세포지속성을 시험한 결과를 나타낸다. 은 나노입자가 도입되지 않은 (a)에 비해 은 나노입자가 코팅막에 도입된 (b)가 은 나노입자의 항균력에 의해 장시간 세포배양시 오염없이 세포배양이 잘 이루어지는 것을 확인할 수 있다.

최종적으로 미세유체칩에서 약물담지 입자를 넣고 세포도 배양하면서 약물의 효과를 관찰한 결과를 도 9에 정리하였다. 도 9는 항암약물을 탑재한 수화젤 입자에서 약물이 방출됨에 따라 배양중인 세포에서 일어나는 변화를 모니터링한 결과로 항암약물 방출 72시간 경과후 암세포인 HeLa 세포는 모두 사멸하였지만 정상세포인 HEK293세포는 문제없이 배양되고 있음을 확인하였다. 이와 같이 수 일 동안 세포가 오염없이 잘 배양되어 약효를 실시간 모니터링할 수 있었고 같은 조건에서 정상세포 대 암세포에 대한 효능 비교가 용이하였다.

종합해 볼 때, 본 발명에 따른 소형화된 미세유체칩에서도 국소부위별로 다르면서도 세포 또는 미생물 배양과 약효 모니터링에 필수적인 조건을 충족하는 기능성 고분자 복합소재를 구현한 것이고, 미세유체소자는 약물도입부와 암세포 배양부가 잘 분리되어 미생물의 오염 없이 세포배양과 약물방출이 이루어질 수 있어 약물의 암세포에 대한 효과를 실시간으로 효과적으로 모니터링 할 수 있다.

이상, 본 발명을 예시적으로 설명하였으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자라면 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 다양한 변형이 가능할 것이다. 따라서, 본 명세서에 개시된 실시예들은 본 발명을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예에 의하여 본 발명의 사상과 범위가 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 보호범위는 아래의 청구범위에 의해서 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술은 본 발명의 권리범위에 포함하는 것으로 해석되어야 할 것이다.

(1) : 도입부 (2) : 약물입자 고정부
(3) : 약물효능 모니터부 (4) : 세포배양부

Claims

친수성 단일 중합체의 적층과 폴리아크릴아마이드(polyacrylamide) 적층을 교대로 반복하여 형성된 비접착부(non-adhesive); 및
친수성 단일 중합체의 적층과 초분자 구조 화합물의 적층을 교대로 반복하여 형성된 세포접착부(cell-adhesive); 로 표면을 개질한 미세유체칩
제1항에 있어서, 약물 도입부, 약물입자 고정부, 약물효능 모니터부 및 세포배양부가 연결된 채널을 포함하는 미세유체칩
제1항에 있어서, 폴리알릴아민 하이드로클로라이드(polyallylamine hydrochloride)로 사전 처리된 미세유체칩
제1항에 있어서, 폴리-L-리신(poly-L-Lysine) 및 탄닌산(tannic acid)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상으로 사후 처리된 미세유체칩
제1항에 있어서, 은 나노입자(silver nanoparticle)로 사후 처리된 미세유체칩
제1항에 있어서, 적층은 2 내지 100회 교대로 반복하여 형성된 미세유체칩
제1항에 있어서, 친수성 단일 중합체는 폴리에틸렌옥사이드, 폴리에틸렌글리콜, 폴리아크릴산 및 폴리비닐 알코올로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상인 미세유체칩
제1항에 있어서, 초분자 구조 화합물은 크라운 에테르(crown ether), 사이클로덱스트린(cyclodextrin), 로텍산(rotaxan), 제올라이트(zeolite), 포르피린(porphyrin), 쿠커비투릴(cucurbituril)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상인 미세유체칩
제1항에 있어서, 미세유체칩은 폴리디메틸 실록산(polydimethyl siloxane), 폴리메틸 메타크릴레이트(polymethyl methacrylate) 및 사이클로-올레핀 공중합체(cyclo-olefin copolymer)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상인 미세유체칩
친수성 단일 중합체의 적층과 폴리아크릴아마이드(polyacrylamide) 적층을 교대로 반복하여 형성된 비접착부; 및
친수성 단일 중합체의 적층과 초분자 구조 화합물의 적층을 교대로 반복하여 형성된 세포접착층부; 로 표면을 개질한 미세유체칩을 포함하는 미세유체소자
제10항에 있어서, 미세유체칩의 하면에 유리, 폴리디메틸 실록산(polydimethyl siloxane), 폴리메틸 메타크릴레이트(polymethyl methacrylate) 및 사이클로-올레핀 공중합체(cyclo-olefin copolymer)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상인 하판을 포함하는 미세유체소자
친수성 단일 중합체의 적층과 폴리아크릴아마이드(polyacrylamide) 적층을 교대로 반복하여 형성된 비접착부를 적층하는 단계; 및
친수성 단일 중합체의 적층과 초분자 구조 화합물의 적층을 교대로 반복하여 형성된 세포접착부를 적층하는 단계; 로 표면을 개질한 미세유체칩의 제조방법