KR20210057230A - 인덴 n-옥시드 유도체를 포함하는 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 하기 화학식 1의 화합물을 포함하는 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
[화학식 1]

Description

인덴 N-옥시드 유도체를 포함하는 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING THROMBOTIC DISEASE COMPRISING INDENE N-OXIDE DERIVATIVE}

본 발명은 인덴 N-옥시드 유도체인 하기 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 포함하는 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

[화학식 1]

혈소판은 혈액 응고 및 상처 치료에 중요한 역할을 하는 혈액 성분이다. 혈관이 손상되었을 경우 세포 외 매트릭스의 노출이 혈소판 활성화를 유발하여 혈액 응고를 일으켜 출혈을 제어하는데, 이는 정상적인 지혈에 있어서 매우 중요하다. 하지만 혈소판의 수나 반응성이 과다하게 증가하는 경우에는 부적절한 혈전이 형성될 수 있다. 동맥경화의 원인이 되는 불안정하거나 파열된 동맥 플라크의 확장은 혈관의 폐색 또는 심근 경색이나 뇌졸중과 같은 심혈관 질환을 유발할 수 있다. 따라서 혈소판은 혈관 항상성을 유지하는 기능을 하고, 항혈전제 약물의 주요 타겟이다.

혈소판의 형성 및 구조에 대해 살펴보면, 혈소판은 거핵구(megakaryocyte)로부터 유래된 가장 작은 혈액 세포이다. 초기에 미성숙 거핵구의 유사분열 및 전사 활성화가 일어난다. 그 후, 소기관(organelle) 합성 및 혈소판 특이적 단백질 증폭은 미세 소관(microtubule) 형성으로 이어지고, 미세 소관은 피질로 이동한다. 전혈소판(proplatelet) 형성에 필수적인 미세 소관의 배열 이후, 두꺼운 위족(pseudopod)이 발달한다. 위족(pseudopod)은 거핵구로부터 연장되고, 소기관은 미세 소관을 따라 전혈소판의 끝으로 이동한다. 굽힘(bending) 및 분기(branching)가 기존의 전혈소판 끝을 증폭시키면서 전혈소판 형성은 세포 전체에 걸쳐 계속 확장된다. 전체 거핵구 세포질은 대량의 전혈소판으로 변형되고, 이는 세포에서 방출된다. 결국 핵은 대량의 전혈소판으로부터 분출되고 전혈소판 끝에서 새로운 혈소판이 방출된다.

혈소판은 거핵구의 세포막, 과립 및 소기관으로 구성되어 있지만, 핵을 가지고 있지 않다. 정상적인 사람의 혈소판은 직경이 2 ~ 5μm이고 두께가 0.5μm 인 원판 모양이다. 혈소판의 크기와 모양으로 인해 더 큰 혈액 세포가 혈소판을 혈관의 가장자리쪽으로 밀려나게 하고, 혈소판은 가로막힌 내피에 가깝게 놓이게 된다. 건강한 사람의 순환되는 혈소판의 생리학적 농도 범위는 1.5-4 × 10⁹ 혈소판/mL이며 일반적으로 약 7-10일 동안 순환한다. 노화되고 결함이 있는 혈소판은 비장과 간에서 식균작용에 의해 제거된다.

혈소판의 기능에 대해 살펴보면, 혈소판은 지혈(hemostatis)과 혈전증(thrombosis)에서 중요한 역할을 하며 과도한 혈액 손실을 방지하기 위해 손상 부위에 지혈 플러그를 빠르게 형성한다. 혈소판은 또한 염증, 혈관긴장도 조절, 숙주 방어 및 종양 전이를 포함한 많은 병리학적 과정에 관여한다.

지혈(hemostatis)에서의 혈소판의 작용과 관련하여 구체적으로 살펴보면, 일반적으로 순환되는 혈소판은 비활성 상태이다. 정상 내피는 산화 질소(NO)와 프로스타글란딘(PG)I₂를 분비하여 혈소판을 비활성 상태로 유지한다. 내피 표면의 CD39는 혈소판의 강력한 활성화제인 ADP를 AMP로 전환한다. 내피는 손상된 혈관벽에서 von Willebrand factor(vWF) 및 콜라겐과 같은 리간드를 노출시키며, 이는 활성화된 혈소판 표면의 당단백질 IB/IX/V (GPIb/IX/V) 및 당단백질 VI (GPVI)과 같은 수용체에 결합한다. 트롬빈 및 ADP를 포함한 용해성 작용제는 혈소판 활성화를 유발한다. 그 후, 활성화된 혈소판은 ADP, 혈소판 유래 성장 인자 및 트롬빈을 포함한 수많은 부혈전(prothrombotic) 인자를 저장 과립에서 방출한다. 즉각적인 생합성에 의해 생성된 Thromboxane A2 (TXA2)은 혈전 과정을 증폭시킨다. 혈소판의 integrin α_IIbβ₃ 활성형은 피브리노겐에 결합하고 혈소판 사이에 피브리노겐 브릿지가 형성되며 혈소판이 응집되고 혈전이 형성된다. 최종적으로, 응고 수축으로 인해 안정적인 혈전이 형성된다. 이 과정은 정상적인 지혈에 중요하지만, 혈소판의 과활성화는 병리학적 혈전 형성을 유발할 수 있다.

혈전증(Thrombosis)에서의 혈소판의 작용과 관련하여 구체적으로 살펴보면, 혈전증(Thrombosis)은 혈관에 혈전이 형성되어 순환계를 통한 혈액의 흐름을 저해시키는 것이다. 혈전증과 지혈의 메커니즘이 매우 유사하기 때문에 혈소판은 혈전증의 주요 매개자이기도 하다. 항혈소판 약물에 대한 임상 연구에서 혈소판과 혈전증의 연관성이 확인되었다. 또한 항혈소판 약물은 심혈관 질환의 위험을 크게 감소시킨다. 동맥 혈전증은 동맥에서 발생하는 혈전의 형성으로, 동맥의 플라크 파열로 발생되는 동맥 혈전증은 뇌졸중, 뇌허혈, 심근경색, 협심증 및 말초 동맥 질환과 같은 여러 유형의 심각한 질환을 유발할 수 있다. 따라서, 정상적인 혈소판 기능을 유지하는 것이 중요하며, 혈소판은 항혈전제 약물의 주요 타겟이 된다.

혈소판 활성화에는 여러가지 신호 전달경로가 관련되어 있다. 우선, 혈소판 활성화에는 혈소판 작용제(platelet agonist)와 이들의 수용체가 관여하는데, 혈소판은 혈소판 기능을 조절하는 다양한 표면 수용체를 가지고 있다. 혈관 손상 부위에서 혈소판 수용체-리간드 상호 작용은 혈소판 활성화 및 응집에 필수적이다. 구체적으로, 노출된 내피하층(subendothelium)으로의 혈소판의 초기 동원은 콜라겐 수용체 GPVI, integrin α₂β₁ 및 GPIb/IX/V에 의해 매개된다. 콜라겐은 내피하층의 세포 외 매트릭스 중 가장 풍부한 단백질로서, 손상된 혈관계에 혈소판을 부착함으로써 혈소판을 활성화시키는 강력한 자극제이다. GPIb/IX/V 및 내피에서 방출된 vWF의 상호 작용은 높은 전단 응력 하에서 손상된 내피하층에서 혈소판을 동원시킨다. 혈관 손상으로 인해 노출된 콜라겐에 고정된 vWF는 강력한 접착 작용제로서 역할한다. 트롬빈, ADP, 및 TXA₂와 같은 용해성 혈소판 작용제는 혈소판 활성화 및 혈전 생성에 중요한 역할을 담당한다. 트롬빈은 매우 낮은 농도에서 혈소판을 활성화시킬 수 있는 가장 효과적인 혈소판 활성화제이다. 트롬빈은 혈소판 표면의 프로테아제-활성화 수용체 1에 결합하고, 혈소판 모양의 변화, TXA₂ 생성, Ca²⁺ 이동, 단백질 인산화 및 혈소판 응집을 유도한다. 혈소판의 조밀한 과립에 저장된 ADP는 혈소판 활성화시 분비되어 순환 혈소판을 활성화한다. ADP는 초기 혈전 성장을 촉진하는 P2Y1 수용체와 형성된 혈전의 안정성을 유지하는 P2Y12 수용체를 통해 혈소판 활성화를 유도한다. TXA2는 cyclooxygenase 및 TXA2 synthase의 순차적인 작용을 통해 활성화된 혈소판에 의해 합성되며, 혈소판 모양의 변화, phosphoinositide hydrolysis, Ca²⁺ 이동, 단백질 인산화 및 응집을 유발하는 강력한 혈소판 작용제이다.

이러한 작용제 및 이들의 수용체와의 상호 작용은 inside-out signaling을 생성하고, integrin α_IIbβ₃의 입체형태적 활성화를 유도하여 리간드 친화도를 증가시킨다. integrin α_IIbβ₃은 피브리노겐과 같은 리간드에 결합하여 응고 수축 및 혈소판 응집과 같은 과정을 유발한다.

내피하층 콜라겐의 노출은 혈소판 부착 및 응집을 유발하고 그 후 혈전이 형성된다. 콜라겐-유도 혈소판 활성화는 혈소판 표면의 주요 신호 전달 수용체 GPVI와의 결합에 의해 매개되는데, GPVI 신호 연속단계(cascade)는 Fyn 및 Lyn과 같은 Src 패밀리 키나제(SFK)를 통한 Fc receptor γ(FcRγ)-사슬 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(immunoreceptor tyrosine based activation motif, ITAM)의 티로신 인산화에 의해 개시된다. 수용체형 단백질 티로신 포스파타제(receptor-type protein tyrosine phosphatase, PTP)인 CD148은 혈소판에서 GPVI 신호 전달 경로를 활성화시키는데 필수적이며, SFK 억제 부위의 탈인산화를 통해 SFK를 활성화시키는 중요한 양성 조절제이다. C-말단 억제 티로신 잔기의 탈인산화는 트랜스-자가인산화(trans-autophosphorylation)에 의해 활성화 루프 티로신 인산화(activation loop tyrosine phosphorylation)를 활성화시키고 SFK 활성을 증가시킨다. ITAM을 포함한 FcRγ-사슬에서 티로신 잔기의 SFK-매개 인산화는 단백질 티로신 키나제 Syk(spleen tyrosine kinase) 결합 부위와의 높은 친화도를 유도한다. SFK는 Syk을 인산화 및 활성화시키고, 활성화된 Syk는 막 어댑터(transmembrane adapter)인 LAT (활성화된 T 세포에 대한 링커)와 같은 downstream 타겟을 인산화시킨다. 인산화된 LAT는 SLP-76 (76kDa의 SH2 도메인 함유 백혈구 단백질), Gads (Shc의 Grb2-유사 adapter downstream), Gab2 (성장 인자 수용체 결합 단백질 2 관련 단백질 2), ADAP (접착 및 탈과립 촉진 어댑터 단백질; SLAP-130이라고도 함), Btk (Bruton의 티로신 키나제), Vav1 및 phospholipase (PLC)γ2와 같은 신호 복합체를 모이게 한다. PLCγ2는 1,2-디아실글리세롤 및 이노시톨 1,4,5-트리포스페이트를 생성하고 Ca²⁺의 이동, integrin α_IIbβ₃의 활성화 및 탈과립을 유발하는 주요 반응기 효소(effector enzyme)이다. 이 과정은 정상적인 지혈에 있어 중요하지만, 혈소판의 과활성화는 병리학적 혈전 형성을 유발할 수 있다.

한편, PPAR은 다양한 조직에서 전사 인자(transcription factor)로 작용하는 핵 수용체 수퍼 패밀리의 구성원이다. 혈소판은 핵이 빠져나간 후 생성된 세포 단편이지만, PPARα, β/δ 및 γ를 발현한다. 최근 연구에 따르면 PPAR은 전사 인자로 작용하는 것과는 별개로 혈소판 활성화를 억제하는 것으로 밝혀졌다. 특히, 로지글리타존(rosiglitazone)은 PPARγ 리간드로 잘 알려진 티아졸리딘디온(thiazolidinedione)계 물질로, 콜라겐 자극 혈소판에서 GPVI의 하류 신호 전달의 억제 및 AMP 활성화 단백질 키나제(AMP kinase)의 활성화를 통해 혈소판 응집을 감소시킨다 (Irons BK et al., Pharmacotherapy 26: 168-81, 2006).

그러나, 로지글리타존은 심근 경색의 위험 증가와 관련이 있는 것으로 밝혀졌고, 심장 독성의 부작용이 보고되면서 금지 약물로 지정되었던 적이 있다. 또한, 로지글리타존은 LAT 및 PLCγ의 티로신 인산화를 억제하지만, 콜라겐으로 유도된 Syk의 티로신 인산화를 억제하지 않는다는 것이 밝혀졌고, 이는 로지글리타존이 SFK와 같은 상위 신호 조절 분자의 활성화를 조절하지 못하는 것을 의미한다(Moraes LA et al., J Thromb Haemost 8: 577-87, 2010).

이러한 배경하에, 본 발명에서는 비-티아졸리딘디온(non-thiazolidinedione)계 PPARγ 작용제를 항혈소판제로 적용가능함을 새롭게 발견하여 본 발명을 완성하였다.

Irons BK et al., Pharmacotherapy 26: 168-81, 2006 Moraes LA et al., J Thromb Haemost 8: 577-87, 2010

본 발명은 혈전성 질환을 효과적으로 예방 또는 치료하는 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

구체적으로, 본 발명은 혈전 생성을 억제함으로써 혈전성 질환을 예방 또는 치료하는 하기 화학식 1의 화합물의 신규한 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다. 하기 화학식 1의 화합물은 1-(트랜스-메틸이미노-N-옥시)-6-(2-모르폴리노에톡시)-3-페닐-1H-인덴-2-카르복실산 에틸 에스테르로 명명된다.

[화학식 1]

또한 본 발명은 혈전성 질환 및 당뇨병을 효과적으로 예방 또는 치료하는 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

일 실시태양에서, 상기 혈전성 질환은 동맥혈전증, 정맥혈전증, 관상동맥혈전증, 심부정맥혈전증, 뇌동맥혈전증, 말초혈관혈전증, 동맥색전증, 정맥색전증, 동맥경화, 고혈압, 폐고혈압, 뇌경색, 뇌졸증, 뇌출혈, 뇌색전증, 신장색전증, 만성동맥폐색증, 폐경색, 혈전성 정맥염, 또는 심부전증일 수 있다.

일 실시태양에서, 상기 조성물은 Syk의 티로신(예컨대, Tyr525/526), Vav1의 티로신(예컨대, Tyr174), Btk의 티로신(예컨대, Tyr551) 또는 PLCγ2의 티로신(예컨대, Tyr753) 인산화를 억제함으로써 혈전성 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

일 실시태양에서, 상기 조성물은 PPARγ와 Syk의 상호작용 또는 PPARγ와 LAT의 상호작용을 억제함으로써 혈전성 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

일 실시태양에서, 상기 조성물은 Lyn의 활성화 루프의 티로신(예컨대, Tyr396) 인산화, PPARγ와 Lyn의 상호작용, FcRγ-사슬의 티로신 인산화, 또는 FcRγ-사슬과 Syk의 상호작용을 억제함으로써 혈전성 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

일 실시태양에서, 상기 조성물은 세포질 내 Ca²⁺의 농도를 감소시킴으로써 혈전성 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

일 실시태양에서, 상기 조성물은 integrin α_IIbβ₃의 활성화 또는 P-selectin의 표면 발현을 억제함으로써 혈전성 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

일 실시태양에서, 상기 조성물은 혈소판의 응집을 억제함으로써 혈전성 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

일 실시태양에서, 상기 조성물은 혈소판의 콜라겐에의 부착을 억제함으로써 혈전성 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

일 실시태양에서, 상기 조성물은 아스피린(asprin), 클로피도그렐(clopidogrel), 티클로피딘(ticlopidine), 실로스타졸(cilostazol), 트리플루살(triflusal), 리바록사반(rivaroxaban), 아픽사반(apixaban), 에독사반(edoxaban), 베트릭사반(betrixaban), 다비가트란(dabigatran), 와파린(warfarin), 헤파린(heparin), 에녹사파린(enoxaparin), 달테파린(dalteparin), 히루딘(hirudin), 비발리루딘(bivalirudin), 데시루딘(desirudin), 아르가트로반(argatroban), 및 레피루딘(lepirudin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 항혈전제를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

본 발명은 또한 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 혈전성 질환 및 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

본 발명은 또한 a) 혈소판을 콜라겐 또는 콘불신(convulxin)으로 활성화시키는 단계;

b) 상기 활성화된 혈소판을 후보 화합물로 처리하는 단계; 및

c) 상기 b) 단계에서 처리된 혈소판을 분석하여 하기를 확인하는 단계;

(i) Syk, Vav1, Btk 또는 PLCγ2 상의 티로신 잔기의 인산화 억제;

(ii) PPARγ와 Syk의 상호작용 또는 PPARγ와 LAT의 상호작용의 억제;

(iii) Lyn의 활성화 루프의 티로신 인산화, PPARγ와 Lyn의 상호작용, FcRγ-사슬의 티로신 인산화, 또는 FcRγ-사슬 및 Syk의 상호작용의 억제;

(iv) 세포질 내 Ca²⁺의 농도의 감소; 및

(v) integrin α_IIbβ₃의 활성화 또는 P-selectin의 표면 발현의 억제

를 포함하는, 후보 화합물의 혈전성 질환 치료 효과에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명의 화학식 1의 화합물을 포함하는 조성물은 혈소판 활성화의 억제를 통해 혈소판의 응집 및 부착을 방지함으로써 혈전 생성을 억제하여 혈전성 질환을 예방 또는 치료하는 효과를 갖는다.

또한, 본 발명의 화학식 1의 화합물을 포함하는 조성물은 기존의 PPARγ 작용제인 로지글리타존의 부작용을 배제하여 안전하게 혈전성 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

또한, 본 발명의 화학식 1의 화합물을 포함하는 조성물은 당뇨병의 주요 합병증인 혈전증 및 당뇨병을 동시에 예방 또는 치료할 수 있다.

따라서 본 발명의 화학식 1의 화합물을 포함하는 조성물은 혈전성 질환 및/또는 당뇨병 치료제로 이용될 수 있다.

도 1 및 2는 콜라겐으로 활성화된 혈소판의 응집능에 대한 화학식 1의 화합물의 효과를 나타낸다.
도 1은 화학식 1의 화합물의 농도별 광 투과율을 시간에 따라 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 화학식 1의 화합물의 농도에 따른 광 투과율을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3 내지 7은 콜라겐으로 활성화된 혈소판에서 콜라겐 수용체(GPVI) 신호 전달계에 관여하는 주요 분자의 티로신 인산화에 대한 화학식 1의 화합물의 효과를 나타낸다.
도 3은 GPVI 신호 전달계에 관여하는 주요 분자의 인산화된 형태를 Immunoblot으로 확인한 결과 및 GPVI 신호 전달계에 관여하는 주요 분자의 티로신 인산화 정도를 시간에 따라 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 Syk의 인산화된 형태를 Immunoblot으로 확인한 결과 및 Sky의 티로신 인산화 정도를 시간에 따라 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 Vav1의 인산화된 형태를 Immunoblot으로 확인한 결과 및 Vav1의 티로신 인산화 정도를 시간에 따라 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 Btk의 인산화된 형태를 Immunoblot으로 확인한 결과 및 Btk의 티로신 인산화 정도를 시간에 따라 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 PLCγ2의 인산화된 형태를 Immunoblot으로 확인한 결과 및 PLCγ2의 티로신 인산화 정도를 시간에 따라 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8 내지 10은 콜라겐으로 활성화된 혈소판에서 PPARγ 및 GPVI 신호 전달 경로의 주요 분자의 상호작용에 대한 화학식 1의 화합물의 효과를 나타낸다.
도 8은 항-Syk로 면역 침전(IP)시킨 후 PPARγ와 Syk의 상호작용 정도를 Immunoblot으로 확인한 결과 및 구체적인 수치(%)로 나타낸 그래프이다.
도 9 및 10은 각각 항-LAT로 면역 침전(IP)시킨 후 PPARγ와 GPVI 신호 전달 경로 내의 단백질의 상호작용 정도를 Immunoblot으로 확인한 결과 및 구체적인 수치(%)로 나타낸 그래프이다.
도 11 내지 13은 콜라겐으로 활성화된 혈소판에서 GPVI 신호 전달 경로의 상위 신호 전달 분자의 티로신 인산화에 대한 화학식 1의 화합물의 효과를 나타낸다.
도 11은 Lyn의 티로신 인산화 정도를 Immunoblot으로 확인한 결과 및 Lyn의 티로신 인산화 정도를 시간에 따라 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 12는 PPARγ와 Lyn의 상호작용 정도를 Immunoblot으로 확인한 결과 및 구체적인 수치(%)로 나타낸 그래프이다.
도 13은 FcRγ-사슬의 티로신 인산화 정도 및 Syk와 FcRγ-사슬의 상호작용을 정도를 Immunoblot으로 확인한 결과 및 구체적인 수치(%)로 나타낸 그래프이다.
도 14 및 15는 콜라겐으로 활성화된 혈소판에서 세포질 내 Ca²⁺ 농도의 증가에 대한 화학식 1의 화합물의 효과를 나타낸다.
도 14는 화학식 1의 화합물의 농도별로 세포질 내 Ca²⁺ 농도를 시간에 따라 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 15는 세포질 내 Ca²⁺ 농도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 16 내지 19는 convulxin으로 활성화된 혈소판에서 integrin α_IIbβ₃의 활성화 및 P-selectin의 표면 발현에 대한 화학식 1의 화합물의 효과를 나타낸다.
도 16 및 17은 integrin α_IIbβ₃의 활성화 정도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 18 및 19는 P-selectin의 표면 발현 정도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 20은 콜라겐에서의 혈소판 부착 및 응집을 보여주는 사진 및 혈소판이 콜라겐에 부착되어 덮인 표면적을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 21은 동맥 혈전증 모델에서 혈전 폐색 시간을 측정한 결과를 나타낸다.
도 22는 화학식 1의 화합물의 PPARγ에의 작용을 통한 항혈소판 활성의 작용 기전을 나타낸 모식도이다.

이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시태양 및 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시태양 및 실시예에 한정되지 않는다.

본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 발명은 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

본원에 사용된 용어 "혈전"은 혈관 속이나 심장 속에서 혈액 성분이 국소적(局所的)으로 응고해서 생기는 응어리로서, 혈소판(血小板), 피브린, 적혈구 및 백혈구를 포함하는 것을 의미한다.

상기 혈전성 질환은 동맥혈전증, 정맥혈전증, 관상동맥혈전증, 심부정맥혈전증, 뇌동맥혈전증, 말초혈관혈전증, 동맥색전증, 정맥색전증, 동맥경화, 고혈압, 폐고혈압, 뇌경색, 뇌졸증, 뇌출혈, 뇌색전증, 신장색전증, 만성동맥폐색증, 폐경색, 혈전성 정맥염, 또는 심부전증일 수 있다.

상기 조성물은 Syk의 티로신(예컨대, Tyr525/526), Vav1의 티로신(예컨대, Tyr174), Btk의 티로신(예컨대, Tyr551) 또는 PLCγ2의 티로신(예컨대, Tyr753) 인산화를 억제함으로써 혈전성 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

또한, 상기 조성물은 PPARγ; 및 Syk 또는 LAT의 상호작용을 억제함으로써 혈전성 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

또한, 상기 조성물은 Lyn의 활성화 루프 티로신(예컨대, Tyr396) 인산화, PPARγ 및 Lyn의 상호작용, FcRγ-사슬의 티로신 인산화, 또는 FcRγ-사슬 및 Syk의 상호작용을 억제함으로써 혈전성 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

또한, 상기 조성물은 세포질 내 Ca²⁺의 농도를 감소시킴으로써 혈전성 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

또한, 상기 조성물은 integrin α_IIbβ₃의 활성화 또는 P-selectin의 표면 발현을 억제함으로써 혈전성 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

또한, 상기 조성물은 혈소판의 응집을 억제함으로써 혈전성 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

또한, 상기 조성물은 혈소판의 콜라겐에의 부착을 억제함으로써 혈전성 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

상기 조성물은 또한 항혈전제를 추가로 포함할 수 있다. 이에 따라, 본 발명은 또한 (a) 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염; 및 (b) 항혈전제를 유효성분으로 포함하는 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

상기 항혈전제는 아스피린(asprin), 클로피도그렐(clopidogrel), 티클로피딘(ticlopidine), 실로스타졸(cilostazol), 트리플루살(triflusal), 리바록사반(rivaroxaban), 아픽사반(apixaban), 에독사반(edoxaban), 베트릭사반(betrixaban), 다비가트란(dabigatran), 와파린(warfarin), 헤파린(heparin), 에녹사파린(enoxaparin), 달테파린(dalteparin), 히루딘(hirudin), 비발리루딘(bivalirudin), 데시루딘(desirudin), 아르가트로반(argatroban), 및 레피루딘(lepirudin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 약학 조성물에서, 상기 (a) 화학식 1의 화합물 또는 이의 제약상 허용되는 염; 및 (b) 항혈전제는 하나의 제형으로 동시에 투여되거나, 또는 별개의 제형으로 동시에 또는 순차적으로 투여되는 것일 수 있다.

본 발명은 또한 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 혈전성 질환 및 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

본원에 사용된 용어 "동시에"는 두 질병이 각각 또는 함께 존재하는 경우를 모두 포함한다. 본원에 사용된 용어 "동시에 예방 또는 치료"는 혈전성 질환 및 당뇨병 중 한 질병만이 존재하는 경우 그 질병의 예방 또는 치료에 유효한 것과 혈전성 질환 및 당뇨병이 한 개체에 함께 존재하는 경우 두 질병 모두의 예방 또는 치료에 유효한 것을 포함한다.

본 발명에서는 화학식 1의 화합물이 콜라겐 등으로 활성화된 혈소판에서 일어나는 GPVI 신호 전달 경로에서 PPARγ가 upstream 신호 전달 경로에 작용하여, Lyn 단백질이 키나제 활성을 발휘하는데 핵심적인 Lyn 단백질 내 티로신 잔기의 자가 인산화를 억제함을 최초로 밝혔다. 구체적으로, 본 발명에서는 실시예를 통해 화학식 1의 화합물이 하기와 같은 작용을 나타냄을 밝혔다.

(i) Syk, Vav1, Btk 또는 PLCγ2 상의 티로신 잔기의 인산화 억제;

(ii) PPARγ와 Syk의 상호작용 또는 PPARγ와 LAT의 상호작용의 억제;

(iii) Lyn의 활성화 루프의 티로신 인산화, PPARγ와 Lyn의 상호작용, FcRγ-사슬의 티로신 인산화, 또는 FcRγ-사슬 및 Syk의 상호작용의 억제;

(iv) 세포질 내 Ca²⁺의 농도의 감소; 또는

(v) integrin α_IIbβ₃의 활성화 또는 P-selectin의 표면 발현의 억제.

또한 본 발명의 화학식 1의 화합물은 이러한 작용을 통하여 in vitro에서 혈소판의 응집능과 부착능을 in vivo 동물 실험에서 혈관 내 혈전 형성까지도 억제함을 확인하였다.

이에 따라, 본 발명에서는 특정 화합물의 혈전성 질환 치료 효과에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 상기 방법은

a) 혈소판을 콜라겐 또는 콘불신(convulxin)으로 활성화시키는 단계;

b) 상기 활성화된 혈소판을 후보 화합물로 처리하는 단계; 및

c) 상기 b) 단계에서 처리된 혈소판을 분석하여 하기를 확인하는 단계;

(i) Syk, Vav1, Btk 또는 PLCγ2 상의 티로신 잔기의 인산화 억제;

(ii) PPARγ와 Syk의 상호작용 또는 PPARγ와 LAT의 상호작용의 억제;

(iii) Lyn의 활성화 루프의 티로신 인산화, PPARγ와 Lyn의 상호작용, FcRγ-사슬의 티로신 인산화, 또는 FcRγ-사슬 및 Syk의 상호작용의 억제;

(iv) 세포질 내 Ca²⁺의 농도의 감소; 및

(v) integrin α_IIbβ₃의 활성화 또는 P-selectin의 표면 발현의 억제

를 포함하는, 후보 화합물의 혈전성 질환 치료 효과에 관한 정보를 제공하는 방법일 수 있다. 일 실시태양에서, 상기 후보 화합물은 화학식 1의 화합물이다.

본 발명의 화학식 1의 화합물을 포함하는 조성물은 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 상기 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액, 외용산제, 외용정제, 외용액제, 연고제, 크림제, 겔제, 경고제, 드레싱제, 패취제, 스프레이 또는 주사제의 형태로 제형화될 수 있다.

본 발명의 화학식 1의 화합물을 포함하는 조성물에 약제학적으로 허용 가능한 통상의 첨가제, 예를 들어 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 가용화제, 현탁화제, 보존제 또는 증량제 등이 더 포함될 수 있다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것이며 본원 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.

[참고예 1]

시약 및 항체

화학식 1의 화합물을 공지된 방법으로 > 95%의 순도로 합성하여 사용하였다. 기타 실시예에서 사용된 시약은 다음과 같다: DiOC₆ (Sigma-Aldrich), ECL western blotting detection reagent, protein A/G-sepharose 4B (Amersham), horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit or anti-mouse IgG antibodies (all from Amersham), Fura-2-AM (Molecular Probes), PTP Assay Kit 1 (EMD Millipore), convulxin (Alexis Biochemicals), collagen type 1 (Chrono-Log).

항-PPARγ, 항-포스포-Vav1 (Tyr174), 항-Syk, 항-Lyn, 아가로스-접합된 항-Lyn, 항-LAT, 항-SLP-76, 항-포스포-PLCγ2 (Tyr753), 항-PLCγ2, 및 항-α-튜불린 항체는 Santa Cruz Biotechnology에서 구입하여 사용하였다. 항-포스포-Syk (Tyr525/526) 항체는 Cell Signaling Technology에서 구입하여 사용하였고, 항-CD148 및 항-포스포-Btk (Tyr551) 항체는 Biosource에서 구입하여 사용하였다. 항-포스포-Lyn (Tyr396), 및 항-포스포-Lyn (Tyr507)는 Abcam에서, 항-포스포 티로신 (4G10), 항-Vav1, 항-ADAP, 항-Gab2, 항-Gads, 및 항-FcεRI 항체는 Upstate Biotechnology에서 구입하여 사용하였다. PE-표지된 항-P-selectin 항체 (PE-CD62P) 및 FITC-표지된 항-활성화-integrin α_IIbβ₃ 항체 (PAC-1-FITC)는 BD Biosciences에서 구입하여 사용하였다.

[참고예 2]

면역 블로팅 및 면역 침전 방법

콜라겐으로 자극하여 혈소판의 응집을 유발시킨 후, 혈소판을 세포 추출 완충액 (20 mM Hepes, pH 7.0, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 10% glycerol, 1 mM EDTA, 2 mM EGTA, 20 mM β-glycerophosphate, 1 mM Na₃VO₄, 1 mM AEBSF, 1 μg/mL leupeptin, 1 μg/mL aprotinin)에 용해시켰다. 세포 용해물을 4 ℃에서 12,500×g으로 10 분간 원심분리하여 세포 파편이 제거된 상층액을 얻었다. 그 후, 특정 항체를 사용하여 면역 블로팅 및 면역 침전을 수행하였다.

[실시예 1]

혈소판 준비

채혈 이전 10일 이내에 비타민, 영양제, 비스테로이드성 항염증제 또는 해열제 등의 약물을 복용하지 않은 건강한 지원자로부터 채혈한 전혈에 Acid Citrate Dextrose Solution (ACD: 1 L 당 22.0 g sodium citrate, 24.5 g dextrose, 7.3 g citric acid)을 처리하여 응고를 방지하였다. 채혈 후, 상온에서 150×g로 15분 동안 원심분리하여 상층인 platelet rich plasma (PRP)를 얻었다. PRP를 300×g에서 10분 동안 원심분리하여 얻은 침전을 Tyrode's buffer (10 mM HEPES [pH 7.4], 129 mM NaCl, 0.8 mM KH₂PO₄, 8.9 mM NaHCO₃, 2.8 mM KCl, 0.8 mM MgCl₂, 5.6 mM glucose)에 추가로 2 mM EDTA, 10% ACD 및 1 μM prostaglandin E1를 넣은 washing buffer로 세척한 후, 300×g에서 10분 동안 원심분리 하였다. 혈소판은 Tyrode's buffer에서 3x10⁸ platelets/mL 농도로 재현탁시켜 사용하였다.

[실시예 2]

혈소판의 응집능 측정

본 실시예에서는 화학식 1의 화합물이 혈소판의 응집을 억제하는 효능을 나타내는지 확인하기 위하여 탁도의 변화에 따른 광 투과율을 측정하여 혈소판의 응집 정도를 평가하였다. turbidomertric method (Born, G.V., Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal. Nature, 1962. 194: p. 927-9.)에 의해 CHRONO-LOG 4-channel aggregometer (Chrono-log Corp, USA)를 이용하여 탁도의 변화에 따른 응집 정도를 측정하였다.

세척된 인간 혈소판(WP)을 실리콘이 코팅된 cuvette에 담아 aggregometer에서 37 ℃, 1,000 rpm으로 교반시키면서 실험하였다. WP를 3, 10, 30, 50 μM의 화학식 1의 화합물로 처리한 후 5분 동안 예비 배양하였다. 그 후, 0.35 % BSA가 들어있는 Tyrode's buffer를 대조하여 WP를 1 mM CaCl₂와 2분 동안 반응시키고, 콜라겐 (10 μg/mL)으로 자극하여 혈소판의 응집을 유발시켰다. Data는 Chrono-log "Aggrolink" software를 사용해 수집하였다. 탁도계로 광 투과율을 측정하여 그 결과를 도 1 및 도 2에 나타내었다.

그 결과, 화학식 1의 화합물을 처리한 군에서 WP의 콜라겐-유도 응집이 농도의존적으로 감소되었다. 콜라겐-유도 혈소판 응집에 대한 화학식 1의 화합물의 IC₅₀은 14.5 μM이었다.

이로써 화학식 1의 화합물이 콜라겐-유도 응집 억제 활성을 나타냄을 확인하였다.

[실시예 3]

티로신 인산화 정도 측정

본 실시예에서는 콜라겐 수용체(GPVI)-매개 신호 전달에서 화학식 1의 화합물의 혈소판 활성화 억제 메커니즘을 확인하기 위하여, 특정 항체를 사용한 사용한 면역 블롯 분석을 통해 단백질 티로신 인산화를 평가하였다.

[실시예 3-1]

WP를 10, 30 μM의 화학식 1의 화합물로 처리한 후 5분 동안 예비 배앙하였다. 그 후, WP를 1 mM CaCl₂의 존재하에 콜라겐 (10 μg/mL)으로 2분 동안 자극하여 혈소판의 응집을 유발시켰다. 전체 세포 용해물을 원심분리하여 상층액을 얻은 후 이를 단일 클론 항-포스포 티로신 항체(4G10)로 면역 블로팅하여 그 결과를 도 3에 나타내었다.

그 결과, 화학식 1의 화합물을 처리하였을 때 콜라겐 자극 혈소판에서의 티로신 인산화가 농도의존적으로 억제되었다. 이로써 PPARγ 리간드인 화학식 1의 화합물이 콜라겐 수용체인 GPVI의 하위 신호 전달 경로 성분의 티로신 인산화를 억제함을 확인하였다.

[실시예 3-2]

또한, 혈소판에서 콜라겐 수용체(GPVI) 신호 전달계에 관여하는 주요 분자의 티로신 인산화를 억제하는지를 구체적으로 확인하기 위하여, 위와 동일한 방법으로 혈소판 응집이 유발된 세포 용해물을 원심분리하여 상층액을 얻은 후, 이를 항-Syk-pY525/526, 항-Vav1-pY174, 항-Btk-pY551 및 항-PLCγ2-pY753 항체로 면역 블로팅하여 결과를 도 4 내지 7에 나타내었다.

그 결과, 특히 30 μΜ의 화학식 1의 화합물은 Syk의 Tyr525/526, Vav1의 Tyr174, Btk의 Tyr551, PLCγ2의 Tyr753과 같은 신호 전달 분자의 티로신 인산화를 효과적으로 억제했다. 이로부터 화학식 1의 화합물이 Syk, Vav1, Btk 및 PLCγ2상의 특정 티로신 잔기의 인산화를 감소시킴으로써 콜라겐-유도 혈소판 활성화를 억제하는 것을 확인하였다.

[실시예 4]

PPARγ 및 GPVI 신호 전달 경로의 주요 분자의 상호작용 측정

GPVI 신호 전달 경로는 FcRγ-사슬 내의 티로신 인산화에 의해 개시되어 Syk의 동원 및 자가인산화를 초래한다. Syk 의존적인 신호 전달계가 개시되면 SLP-76, Gab2, ADAP 및 Gads와 같은 어댑터를 통해 Vav1, Btk 및 PLCγ2를 포함하는 LAT 신호가 형성된다. 또한 콜라겐 자극 혈소판에서 PPARγ가 Syk 및 LAT와 상호작용한다.

본 실시예에서는 콜라겐 자극 혈소판에서의 PPARγ와 Syk 또는 LAT의 상호작용에 대한 PPARγ 리간드인 화학식 1의 화합물의 억제 활성을 확인하였다.

WP를 10, 30 μM의 화학식 1의 화합물로 처리한 후 5분 동안 예비 배앙하였다. 그 후, WP를 1 mM CaCl₂의 존재하에 콜라겐(10 μg/mL)으로 2분 동안 자극하여 혈소판의 응집을 유발시켰다. 세포 용해물을 원심분리하여 상층액을 얻은 후, 이를 항-Syk 또는 항-LAT 항체로 면역 침전(IP)시키고, 이로부터 얻어진 침전물을 항-PPARγ, 항-Syk, 항-Vav1, 항-Btk, 항-PLCγ2, 항-SLP-76, 항-Gab2, 항-ADAP, 항-Gads, 또는 항-LAT 항체로 면역 블로팅하였다. 그 결과를 도 8 내지 10에 나타내었다.

그 결과, 혈소판이 콜라겐으로 자극되었을 경우 PPARγ는 Vav1, Btk, PLCγ2, SLP-76, Gab2, ADAP 및 Gads를 포함한 PPARγ-Syk 및 PPARγ-LAT 신호 전달 분자와 상호작용하고, 화학식 1의 화합물을 전처리한 혈소판에서는 이러한 상호작용이 감소한 것을 확인하였다.

이로써 화학식 1의 화합물의 억제 메커니즘이 GPVI 신호 전달 경로 내에서 Syk 및 하위 분자 수준에서 매개되는 것임을 확인하였다.

[실시예 5]

GPVI 신호 전달 경로의 상위 신호 전달 분자 티로신 인산화 측정

신호 전달 경로의 upstream에 해당하는 Lyn의 활성화는 수용체 단백질의 ITAM 내에서 티로신 잔기를 인산화시키고, Syk 및 PLCγ2를 포함한 키나제를 동원 및 활성화시킨다. 결과적으로 이로써 일련의 신호 전달계를 활성화시킨다.

상기 실시예 3에서 확인한 바와 같이 화학식 1의 화합물은 Syk에서 자가인산화 부위의 인산화를 감소시킴으로써 콜라겐-유도 혈소판 활성화를 억제하기 때문에, 화학식 1의 화합물이 GPVI 신호 전달 경로의 upstream 분자에도 작용한다는 가설을 세우고 본 실시예에서는 이를 확인하고자 하였다. 구체적으로 Lyn의 활성화 루프 티로신(Tyr396) 인산화, PPARγ 및 Lyn의 상호작용, FcRγ-사슬의 티로신 인산화, FcRγ-사슬 및 Syk의 상호작용 정도를 측정하였다.

WP를 3, 10, 30, 100 μM의 화학식 1의 화합물로 처리하고 5분 동안 예비 배앙하였다. 그 후, WP를 1 mM CaCl₂ 존재하에 콜라겐 (10 μg/mL)으로 2분간 자극하여 혈소판의 응집을 유발시켰다. 전체 세포 용해물을 원심분리하여 상층액을 얻은 후, 이를 단일 클론 항-Lyn-pY396 항체로 면역 블로팅하여 그 결과를 도 11에 나타내었다. 또한 아가로스-접합된 항-Lyn 항체를 사용하여 얻은 단백질 면역 침전물(IP)을 항-PPARγ 항체로 면역 블로팅하여 그 결과를 도 12에 나타내었다. 추가로 항-FcRγ-사슬 항체로 면역 침전(IP)된 단백질을 각각 항-포스포 티로신 (4G10) 및 항-Syk 항체로 면역 블로팅하여 그 결과를 도 13에 나타내었다.

그 결과, 화학식 1의 화합물을 처리한 군에서 Lyn의 활성화 루프의 티로신(Tyr396) 인산화가 억제되었다(도 11). 또한 화학식 1의 화합물은 콜라겐 유발 혈소판에서 농도의존적으로 PPARγ와 Lyn 사이의 상호작용을 억제하였다(도 12).

이로써 혈소판 활성화를 조절하기 위한 화학식 1의 화합물의 작용이 PPARγ-Lyn 상호작용 조절과 밀접한 관련이 있음을 확인하였다. 또한, 화학식 1의 화합물에 의해 PPARγ가 활성화되면, Lyn의 티로신 인산화가 억제되어, 결국 콜라겐-유도 혈소판 활성화를 억제하게 된다는 것을 알 수 있었다.

또한 화학식 1의 화합물은 농도의존적으로 FcRγ-사슬의 티로신 인산화를 억제하였다. 또한, 화학식 1의 화합물이 처리된 혈소판에서 FcRγ-사슬과 Syk의 상호작용이 감소되었다(도 13).

이러한 결과로부터 화학식 1의 화합물이 콜라겐 수용체 GPVI를 끌어들이는 upstream 단백질 티로신 잔기의 인산화를 감소시킴으로써 콜라겐-유도 혈소판 활성화를 억제함을 확인할 수 있었다.

[실시예 6]

세포질 내의 Ca ²⁺ 농도 측정

혈소판 활성화의 주요 효소이자 신호전달계의 2차 메신저인 PLCγ2는 막 인지질 포스파티딜이노시톨 4, 5-비스포스페이트를 가수 분해하여 이노시톨 1,4,5-트리포스페이트와 1,2-디아실글리세롤을 형성시킨다. 콜라겐 자극 혈소판에서, PLCγ2 활성이 증가함으로써 증가된 이노시톨 1,4,5-트리포스페이트는 세포 내 소포체에 저장되어 있던 Ca²⁺ 방출을 유발하여 세포질 Ca²⁺ 농도를 증가시킨다.

본 실시예에서는 PLCγ2 활성화에 대한 PPARγ 리간드인 화학식 1의 화합물의 억제 활성을 확인하기 위하여, 세포질 Ca²⁺ 수준을 Fura-2AM염료를 이용하여 분석하였다.

PBS에 현탁된 WP를 어두운 곳에서 37 ℃에서 20분 동안 Fura-2-AM (5 μM) 염료와 함께 반응시켰다. 그 후, 과도한 염료를 제거하고 혈소판을 Tyrode의 완충액에 재현탁하였다. 염료가 로딩된 WP에 10, 30 μM의 화학식 1의 화합물로 5분 동안 예비 배앙하였다. 그 후, 1 mM CaCl₂로 2분 동안 예비 반응시킨 후 37 ℃에서 1,000rpm으로 연속 교반하면서 콜라겐(10 μg/mL)으로 5분 동안 자극하였다.

세포 내 칼슘 수준은 스펙트로 플루오로 광도계 (Shimadzu)를 사용하여 340 및 380 nm의 여기 파장(excitation wavelength) 및 510 nm의 방출 파장(emission wavelength)에서 측정하였다. 2 개의 여기 파장에서의 형광 강도의 비를 사용하여 하기 식에 따라 세포질 칼슘의 농도를 분석하였다.

상기 식에서 Kd는 Fura-2-Ca²⁺ 복합체의 해리 상수에 대해 224 nM이고, Fmin 및 Fmax는 각각 매우 낮은 Ca²⁺ 농도, 매우 높은 Ca²⁺ 농도에서의 형광 강도 수준을 나타낸다. S_f2 및 S_b2는 포화 Ca²⁺ 농도의 존재 및 부재하에 380 nm에서의 형광 값이다. 본 실험에서, Fmax는 1 mM CaCl₂를 함유하는 혈소판 현탁액이 Triton X-100 (0.1 %)에 의해 용해된 후 510 nm에서 Fura-2-Ca²⁺ 복합체가 나타내는 형광 강도였다. Fmin은 5 mM EGTA (pH 9.0)를 함유하는 혈소판 현탁액이 Triton X-100 (0.1 %)에 의해 용해된 후 510 nm에서 Fura-2-Ca²⁺ 복합체가 나타내는 형광 강도였다. F는 혈소판 현탁액이 1 mM CaCl₂의 존재 하에서 콜라겐에 의해 자극된 후 510 nm에서 Fura-2-Ca²⁺ 복합체가 나타내는 형광 강도를 나타낸다.

Ca²⁺ 농도의 시간에 따른 변화를 분석하였고, 그 결과를 도 14에 나타내었다. 또한 4분 경과 후 계산된 Ca²⁺ 농도를 도 15에 나타내었다.

그 결과, 콜라겐 자극 혈소판에서 세포질 Ca²⁺ 농도는 평균 551.4 ± 27.3 nM으로 현저히 증가했다. 반면, 10, 30 μM의 화학식 1의 화합물 처리군에서는 세포질 Ca²⁺ 농도가 각각 380.1 ± 48.0 nM 및 303.3 ± 48.6 nM로 상당히 감소하였다.

이로써, 화학식 1의 화합물은 혈소판에서 콜라겐으로 인한 세포질 Ca²⁺ 농도 상승을 억제함을 확인하였다. 또한 화학식 1의 화합물의 항 혈소판 활성이 티로신 인산화-매개 신호 전달의 하향 조절을 통한 PLCγ2의 억제로 인한 것임을 알 수 있었다.

[실시예 7]

integrin α _IIb β ₃ 의 활성화 및 P-selectin의 표면 발현 측정

PLCγ2가 매개하는 단백질 키나아제 C(PKC)의 활성화 및 세포질 Ca²⁺ 상승은 콜라겐 자극 혈소판에서 integrin α_IIbβ₃ 활성화 및 탈과립화를 유발한다. 피브리노겐에 대한 친화성이 높은 integrin α_IIbβ₃의 내부 활성화는 혈소판 부착 및 응집에 중요한 역할을 한다. 또한, 과립 분비는 피브리노겐의 방출로 이어지고, 혈소판에서 피브리노겐과 활성화된 integrin α_IIbβ₃ 사이의 가교를 증가시킨다. α-과립의 탈과립화를 겪은 활성 혈소판 표면에 존재하는 P-selectin은 혈소판-백혈구 상호 작용을 매개할 때 부착 분자의 역할을 한다.

integrin α_IIbβ₃ 활성화 및 탈과립에 대한 화학식 1의 화합물의 억제 활성을 평가하기 위하여 integrin α_IIbβ₃ 활성화 및 탈과립 의존적 P-selectin의 표면 발현을 유세포 분석법으로 분석하였다.

콜라겐은 자체의 가교 결합 및 혈소판 응집 등으로 인해 유세포 분석에 문제를 일으킬 수 있기 때문에 혈소판을 convulxin (CVX)으로 자극하였다. CVX는 콜라겐의 주요 신호 전달 수용체인 GPVI의 작용제 역할을 한다. GPVI 수용체의 활성화는 FcRγ-사슬, Syk 및 PLCγ2.68의 티로신 인산화에 필수적이다.

WP에 10, 30 μM의 화학식 1의 화합물을 전처리한 후, Convulxin (100 ng/mL)으로 자극하고, 0.5 μg/mL농도의 FITC-표지된 항-활성 integrin α_IIbβ₃ 항체 PAC-1-FITC 및 P-selectin에 특이적인 0.5 μg/mL의 PE-표지된 항체 PE-CD62P 와 함께 5분 간 어두운 곳에서 반응시켰다. 그 후, 혈소판의 세포막 표면의 형광 강도를 FACSCalibur 유세포 분석기 (Becton Dickinson)를 이용하여 측정하였다. 샘플당 최소 5 × 10⁴ 개의 세포가 분석에 사용되었고, 혈소판에서의 integrin α_IIbβ₃의 활성화 및 P-selectin의 표면 발현을 각각 530 nm (FL1) 및 585 nm (FL2)에서 측정하였다. 형광의 상대적인 변화는 WinMDI 소프트웨어를 사용하여 계산했다. 그 결과를 도 16 내지 19에 나타내었다.

CVX로 혈소판을 자극하기 전과 비교하여, CVX 자극 후에는, 화학식 1의 화합물을 처리한 군에서의 integrin α_IIbβ₃의 활성화 및 P-selectin의 표면 발현은 거의 변화가 없거나 약간 증가하였으나, 화학식 1의 화합물을 처리하지 않은 대조군에서는 integrin α_IIbβ₃의 활성화 및 P-selectin의 표면 발현이 현저하게 증가하였다.

이로써 화학식 1의 화합물이 CVX로 유도된 integrin α_IIbβ₃ 활성화 및 탈과립-의존적 P-selectin 표면 발현을 유의적으로 억제하는 것을 확인하였다.

[실시예 8]

혈소판의 부착 및 응집체 형성 측정

손상된 혈관 부위에서 혈전이 형성되려면, 혈행에 따른 유동성이 없어진 혈소판이 세포 외 기질(extracellular matrix)에 잘 부착해야만 한다.

본 실시예에서는 상기 과정에 대한 화학식 1의 화합물의 효과를 평가하기 위해, 콜라겐에 대한 혈소판의 부착 및 이에 따른 혈전 형성을 유동성 챔버 내에 위치시킨 콜라겐이 코팅된 커버 슬립을 사용하여 분석하였다.

세척된 혈소판 (1 x 10⁹ platelets/mL)을 37 ℃에서 10분 동안 1 μM 형광 염료 DiOC6 (Sigma)와 함께 배양하였다. 콜라겐-코팅된 coverslip (Neuvitro)을 흐름 챔버 (flow chamber, Chamlide CF; Live Cell Instruments)에 장착하였다. 이어서, 형광 표지된 혈소판을 화학식 1의 화합물 10, 30 uM과 반응시킨 후, 주사기 펌프 (Harvard Apparatus)를 사용하여 1,000 s^-1에서 콜라겐 매트릭스 위에 관류시켰다. 챔버 내의 비부착성 혈소판은 PBS로 세척하였다. 부착된 혈소판을 차가운 4 % 파라포름알데히드로 15분 동안 고정시킨 다음 PBS로 세척하였다. 혈전 형성은 Nikon A1R 레이저 스캐닝 공 초점 현미경을 사용하여 40x 장거리 거리 대물 렌즈로 시각화하였다. 혈전에 의한 유동 챔버 표면 커버리지는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 계산했다. 혈소판으로 덮인 표면적 및 혈전량을 도 20에 나타내었다.

1000 s^-1의 전단 속도에서, 대조군(화학식 1의 화합물 미처리군) 혈소판의 콜라겐에 대한 부착이 현저하게 증가되었다. 반면, 화학식 1의 화합물 처리군에서는 혈소판으로 덮인 표면적과 혈전량 모두 감소하였다.

이러한 결과로부터 화학식 1의 화합물이 유동 조건 하에서 콜라겐에의 혈소판 부착 및 이에 따른 응집체 형성을 억제함을 확인하였다.

[실시예 9]

동맥 혈전증 모델에서 혈전 형성 측정

본 실시예에서는 화학식 1의 화합물의 in vivo 혈전 형성 억제 활성을 확인하기 위하여 동맥 혈전증 모델에서 혈전 폐색을 측정하였다.

특정 병원체가 없는 시설에서, 표준 사료 (Harlan Teklad)를 공급하여 사육된 Jackson Laboratory에서 얻은 생쥐 (C57BL/J, 수컷) 모델을 사용하였다. 약 7 주령 마우스에 5 일 동안 15 % 폴리에틸렌 글리콜 400에 용해된 화학식 1의 화합물을 25 또는 50 mg/kg의 농도, 10 mL/kg(체중)의 양으로 경구 위관 영양으로 경구 투여하고, 1시간 후 동맥 혈전증을 검사하였다. 마취를 위해 1.0 mL/kg Zoletil (Virbac Animal Health) 및 0.7 mL/kg Rompun (Bayer Korea)을 복강 내 주사하고, 좌측 경동맥을 노출시켰다. 화학식 1의 화합물 투여 1시간 후 마우스의 노출된 경동맥 표면에 20 % FeCl₃로 포화된 여과지 (1 x 1 mm)를 적용하여 혈관 손상을 유발했다. OxiPulse 프로브 (Hurev)를 사용하여 광혈류 측정법을 통해 경동맥의 하류에서 경동맥의 혈액량 변화를 측정하였고 그 결과를 도 21에 나타내었다. 혈전 폐색 시간은 정상 혈류량에 비해 90 % 이상 억제가 나타나는데 소요된 시간으로 정하였다.

대조군(화학식 1의 화합물 미처리군) 마우스에서의 경동맥 폐쇄는 10.7 ± 4.0분 (n = 10)에서 발생하는 반면, 화학식 1의 화합물 50 mg/kg 용량 투여군에서 폐색 시간은 22.2 ± 10.8분 (P <0.01, n = 10)으로 상당히 지연되었다.

이로써 화학식 1의 화합물이 혈전성 혈관 질환을 예방하거나 치료하는데 응용될 수 있고, 나아가 당뇨병 치료는 물론 당뇨병 환자의 주요 합병증인 혈전증을 예방 및 치료할 수 있는 효과를 동시에 나타낼 것으로 예상되는 제제로 개발될 수 있음을 확인하였다.

Claims (12)

1. 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   [화학식 1]
   

   

   
   
2. 제1항에 있어서, 상기 혈전성 질환은 동맥혈전증, 정맥혈전증, 관상동맥혈전증, 심부정맥혈전증, 뇌동맥혈전증, 말초혈관혈전증, 동맥색전증, 정맥색전증, 동맥경화, 고혈압, 폐고혈압, 뇌경색, 뇌졸중, 뇌출혈, 뇌색전증, 신장색전증, 만성동맥폐색증, 폐경색, 혈전성 정맥염, 및 심부전증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 Syk, Vav1, Btk 또는 PLCγ2 상의 티로신 잔기의 인산화를 억제하는 것을 특징으로 하는, 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 PPARγ와 Syk의 상호작용 또는 PPARγ와 LAT의 상호작용을 억제하는 것을 특징으로 하는, 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 Lyn의 활성화 루프의 티로신 인산화, PPARγ와 Lyn의 상호작용, FcRγ-사슬의 티로신 인산화, 또는 FcRγ-사슬과 Syk의 상호작용을 억제하는 것을 특징으로 하는, 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   
6. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 세포질 내 Ca²⁺의 농도를 감소시키는 것을 특징으로 하는, 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   
7. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 integrin α_IIbβ₃의 활성화 또는 P-selectin의 표면 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는, 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   
8. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 혈소판의 응집을 억제하는 것을 특징으로 하는, 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   
9. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 혈소판의 콜라겐에의 부착을 억제하는 것을 특징으로 하는, 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   
10. 제1항에 있어서, 아스피린(asprin), 클로피도그렐(clopidogrel), 티클로피딘(ticlopidine), 실로스타졸(cilostazol), 트리플루살(triflusal), 리바록사반(rivaroxaban), 아픽사반(apixaban), 에독사반(edoxaban), 베트릭사반(betrixaban), 다비가트란(dabigatran), 와파린(warfarin), 헤파린(heparin), 에녹사파린(enoxaparin), 달테파린(dalteparin), 히루딘(hirudin), 비발리루딘(bivalirudin), 데시루딘(desirudin), 아르가트로반(argatroban), 및 레피루딘(lepirudin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 항혈전제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
    
11. 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
    [화학식 1]
    

    

    
    
12. a) 혈소판을 콜라겐 또는 콘불신(convulxin)으로 활성화시키는 단계;
    b) 상기 활성화된 혈소판을 후보 화합물로 처리하는 단계; 및
    c) 상기 b) 단계에서 처리된 혈소판을 분석하여 하기를 확인하는 단계;
    (i) Syk, Vav1, Btk 또는 PLCγ2 상의 티로신 잔기의 인산화 억제;
    (ii) PPARγ와 Syk의 상호작용 또는 PPARγ와 LAT의 상호작용의 억제;
    (iii) Lyn의 활성화 루프의 티로신 인산화, PPARγ와 Lyn의 상호작용, FcRγ-사슬의 티로신 인산화, 또는 FcRγ-사슬 및 Syk의 상호작용의 억제;
    (iv) 세포질 내 Ca²⁺의 농도의 감소; 및
    (v) integrin α_IIbβ₃의 활성화 또는 P-selectin의 표면 발현의 억제
    를 포함하는, 후보 화합물의 혈전성 질환 치료 효과에 관한 정보를 제공하는 방법.
    
    

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