KR20210056344A - 융합 단백질 및 그가 종양 및/또는 바이러스 감염을 치료하기 위한 약물 제조에서의 응용 - Google Patents

융합 단백질 및 그가 종양 및/또는 바이러스 감염을 치료하기 위한 약물 제조에서의 응용 Download PDF

Info

Publication number
KR20210056344A
KR20210056344A KR1020217006850A KR20217006850A KR20210056344A KR 20210056344 A KR20210056344 A KR 20210056344A KR 1020217006850 A KR1020217006850 A KR 1020217006850A KR 20217006850 A KR20217006850 A KR 20217006850A KR 20210056344 A KR20210056344 A KR 20210056344A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
ser
leu
thr
lys
val
Prior art date
Application number
KR1020217006850A
Other languages
English (en)
Inventor
시푸 모
용 짜오
웨이 쉬
쯔차오 왕
지에 양
리윈 구
동 딩
Original Assignee
난징 유엠에이비-바이오파마 컴퍼티 리미티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 난징 유엠에이비-바이오파마 컴퍼티 리미티드 filed Critical 난징 유엠에이비-바이오파마 컴퍼티 리미티드
Publication of KR20210056344A publication Critical patent/KR20210056344A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/56—IFN-alpha
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 융합 단백질 및 그가 종양 및/또는 바이러스 감염을 치료하기 위한 약물 제조에서의 응용에 관한 것이고, 상기 융합 단백질은 인간 OX40에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 세그먼트 및 인간 인터페론을 포함한다.

Description

융합 단백질 및 그가 종양 및/또는 바이러스 감염을 치료하기 위한 약물 제조에서의 응용
본 발명은 생물 의학 분야에 속한다. 구체적으로, 본 발명은 융합 단백질 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 항 OX40 항체 및 인간 인터페론을 함유하는 융합 단백질 및 그가 종양 및/또는 바이러스 감염을 치료하기 위한 약물 제조에서의 응용에 관한 것이다.
인간 OX40은 주로 CD4, CD8, Th 및 Treg세포를 포함한 활성화된 T세포에서 발현된다[1]. naive T세포에서 OX40의 발현은 매우 낮지만 항원 유도 자극 후 발현 수준이 상향 조절되고 12시간 내지 5-6일 내에 피크에 도달한다. 유사하게, OX40L의 발현은 또한 세포 활성화 상태의 영향을 받는다[1]. APC 세포는 항원 자극 후 1-3일에 OX40L의 발현을 검출할 수 있다. 흥미롭게도 면역 세포 외에, 근육 세포도 염증 인자의 자극 하에 OX40L을 발현하고[2, 3], OX40L-OX40 신호 통로는 유기체의 염증 반응에 널리 사용될 수 있음을 시사한다.
항원 의존성 OX40L/OX40 공동 자극 분자의 활성화는 T세포 내의 복수개의 신호 통로에 결합 연결된다. 결정 구조 연구는, OX40L과 OX40의 결합이 OX40-OX40L 복합체 삼량체화를 유도함으로써[4] 세포 내에서 수용체 관련 인자(receptor-associated factor, TRAF)에 대한 결합 부위를 형성할 수 있음을 나타낸다. 후자(TRAF2,5)는 나아가 NF-κB 신호 통로를 활성화시키고 T세포 사멸을 억제할 수 있다[2, 5, 6]. 연구에 따르면, OX40 활성화는 Bcl-2 및 Bcl-xL의 고발현을 야기할 수 있고[7], OX40이 NF-κB신호 통로를 통해 항 사멸 단백질의 발현을 유도하여 T세포 사멸을 억제하는 기능을 실현할 수 있음을 시사한다.
PKB/PI3K는 OX40 다운스트림의 다른 중요한 신호 통로이다. 연구에 따르면, 한편으로 T세포에서 OX40의 공동 자극 신호는 PKB 활성화를 유지하는 필요한 조건이고, 다른 한편으로는 구성적으로 활성화된 PKB는 OX40 결함으로 인한 T세포에서 항 사멸 단백질의 하향 조절에 길항할 수 있음을 발견하였다. OX40 공동 자극 신호는 PKB/PI3K신호 통로를 통해 Survivin 단백질의 발현을 유지할 수 있다[8].
마지막으로, T세포에서 TCR 및 OX40의 활성화는 칼슘 플럭스 및 NFAT 신호 통로의 활성화를 시너지 발생하고, IL-2, IL-4, IL-5 및 IFN-γ를 포함한 사이토카인의 발현을 조절할 수 있다[9].
요약하면, 상기 연구는 OX40의 활성화가 NF-κB 신호 통로, PKB/PI3K 신호 통로 및 NFAT 신호 통로를 통해 T세포의 증식, 사멸 및 사이토카인 분비 활성을 조절함으로써 면역계의 활력을 향상시키는 효과에 도달할 수 있음을 나타낸다.
상기 발현을 기반으로, OX40은 면역 요법의 중요한 표적이 되고, 수많은 임상 전 및 임상 연구에서 OX40은 종양 면역 요법의 중요한 표적으로 사용될 수 있음을 시사한다. 흥미롭게도, 최근 연구에서는 B형 간염 바이러스 감염을 억제하는 OX40 신호 통로의 역할을 발견하였고[10], 이는 OX40 작용제가 B형 간염 환자 치료와 같은 항 바이러스 감염의 잠재적인 수단으로 사용될 수 있음을 시사한다.
인터페론은 일종의 고활성 및 다기능성 당 단백질이다. 한편으로,인터페론은 종양 세포 증식을 조절하고 종양 전이와 혈관 생성을 억제하며 항 종양 면역 반응을 활성화시켜 강한 항 종양 작용을 발휘할 수 있으며; 다른 한편으로는 인체 면역계를 조절하여 인터페론은 항 바이러스 측면에서 중요한 임상 적용 가치를 가지는 바, 예를 들면 인터페론은 이미 B형 간염 바이러스 감염을 임상 치료하는 중요한 수단 중 하나가 되었다.
OX40 작용제 및 인터페론은 모두 항 종양 및 항 바이러스 측면에서 중요한 적용 가치 또는 잠재력을 갖고 있지만 기존의 증거는 양자가 환자 반응률 및 약효 면에서 모두 단점이 있음을 나타낸다. 따라서, 현재 치료 효과가 더 우수한 OX40 작용제 및 인터페론에 대한 요구가 존재한다.
Willoughby J, Griffiths J, Tews I, Cragg MS가 저술한 "OX40: Structure and function - What questions remain?"의 타이틀을 가지는 자료로서, Mol Immunol. 2017; 83: 13-22. doi: 10.1016/j.molimm.2017.01.006를 통해 발간된 자료. Imura A, Hori T, Imada K, Ishikawa T, Tanaka Y, Maeda M, Imamura S, Uchiyama T가 저술한 "The human OX40/gp34 system directly mediates adhesion of activated T cells to vascular endothelial cells"의 타이틀을 가지는 자료로서, J Exp Med. 1996; 183: 2185-95. doi:를 통해 발간된 자료. Burgess JK, Carlin S, Pack RA, Arndt GM, Au WW, Johnson PR, Black JL, Hunt NH가 저술한 "Detection and characterization of OX40 ligand expression in human airway smooth muscle cells: a possible role in asthma?"의 타이틀을 가지는 자료로서, J Allergy Clin Immunol. 2004; 113: 683-9. doi: 10.1016/j.jaci.2003.12.311를 통해 발간된 자료. Compaan DM, Hymowitz SG가 저술한 "The crystal structure of the costimulatory OX40-OX40L complex"의 타이틀을 가지는 자료로서, Structure. 2006; 14: 1321-30. doi: 10.1016/j.str.2006.06.015를 통해 발간된 자료. Song J, So T, Croft M가 저술한 "Activation of NF-kappaB1 by OX40 contributes to antigen-driven T cell expansion and survival"의 타이틀을 가지는 자료로서, J Immunol. 2008; 180: 7240-8. doi:를 통해 발간된 자료. Croft M가 저술한 "Control of immunity by the TNFR-related molecule OX40 （CD134）"의 타이틀을 가지는 자료로서, Annu Rev Immunol. 2010; 28: 57-78. doi: 10.1146/annurev-immunol-030409-101243를 통해 발간된 자료. Rogers PR, Song J, Gramaglia I, Killeen N, Croft M가 저술한 "OX40 promotes Bcl-xL and Bcl-2 expression and is essential for long-term survival of CD4 T cells"의 타이틀을 가지는 자료로서, Immunity. 2001; 15: 445-55. doi:를 통해 발간된 자료. Song J, So T, Cheng M, Tang X, Croft M가 저술한 "Sustained survivin expression from OX40 costimulatory signals drives T cell clonal expansion의 타이틀을 가지는 자료로서, Immunity. 2005; 22: 621-31. doi: 10.1016/j.immuni.2005.03.012.를 통해 발간된 자료. So T, Song J, Sugie K, Altman A, Croft M가 저술한 "Signals from OX40 regulate nuclear factor of activated T cells c1 and T cell helper 2 lineage commitment"의 타이틀을 가지는 자료로서, Proc Natl Acad Sci U S A. 2006; 103: 3740-5. doi: 10.1073/pnas.0600205103를 통해 발간된 자료. Publicover J, Gaggar A, Jespersen JM, Halac U, Johnson AJ, Goodsell A, Avanesyan L, Nishimura SL, Holdorf M, Mansfield KG, Judge JB, Koshti A, Croft M, et al가 저술한 "An OX40/OX40L interaction directs successful immunity to hepatitis B virus"의 타이틀을 가지는 자료로서, Sci Transl Med. 2018; 10. doi: 10.1126/scitranslmed.aah5766를 통해 발간된 자료.
본 발명의 목적은 융합 단백질을 제공하고, 상기 융합 단백질은 인간 OX40에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 세그먼트 및 인간 인터페론을 포함한다. 본 발명은 종양 및/또는 바이러스 감염을 치료하기 위한 상기 융합 단백질의 용도를 더 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 기술적 해결수단을 사용한다.
한편으로, 본 발명은 융합 단백질을 제공하는데,
a)인간 OX40에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 세그먼트; 및
b)인간 인터페론을 포함하는 융합 단백질에 있어서,
상기 인간 인터페론은 직접적으로 또는 펩타이드 링커를 통해 상기 항체의 경쇄 또는 중쇄의 카복시 말단 또는 아미노 말단에 연결된다.
본 발명의 융합 단백질에 따르면, 상기 인간 OX40에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 세그먼트는,
SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1, SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2, 및 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3을 포함하는 항체 중쇄 가변 영역; 및
SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1, SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2, 및 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3을 포함하는 항체 경쇄 가변 영역을 포함한다.
본 발명의 융합 단백질에 따르면, 상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 8로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 융합 단백질에 따르면, 상기 인간 OX40에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 세그먼트는 카멜화 단일 도메인 항체, scFv, scFv 이중체, BsFv, dsFv, dsFv2, dsFv-dsFv', Fv 세그먼트, Fab, Fab', F(ab')2, ds 이중 기능 항체, 나노 항체, 도메인 항체 또는 2가 도메인 항체이다.
본 발명의 융합 단백질에 따르면, 상기 항체는 면역 글로불린의 불변 영역, 예를 들면 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4의 불변 영역을 더 포함한다.
본 발명의 융합 단백질에 따르면, 상기 인간 인터페론은 I형 인간 인터페론, II형 인간 인터페론 및 III형 인간 인터페론으로부터 선택되고, 바람직하게, 상기 인간 인터페론은 IFNα2a, IFNβ, IFNγ, IFNλ, IFNα2b이며; 보다 바람직하게, 상기 인간 인터페론은 IFNα2b이고, 이의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 9로 표시된다.
더 바람직하게, 상기 인간 인터페론은 IFNα2b의 돌연변이체이고, 이는 SEQ ID NO: 9로 표시되는 아미노산 서열에서, T106A, R149A, A145G, A145D, R120A, L117A로부터 선택되는 한가지 또는 여러 가지 돌연변이를 가지며;
보다 바람직하게, 상기 IFNα2b의 돌연변이체는 SEQ ID NO: 9에표시되는 아미노산 서열에서,
T106A/A145D, T106A/R149A, T106A/A145G, T106A/L117A, T106A/R120A로부터 선택되는 이중 돌연변이를 갖는다.
본 발명의 융합 단백질에 따르면, 상기 펩타이드 링커는 (G)n, KESGSVSSEQLAQFRSLD, EGKSSGSGSESKST, GSAGSAAGSGEF, (GGGGS)n, (GGSGG)n으로부터 선택되고; 바람직하게, 상기 펩타이드 링커는 (GGGGS)n이며, 여기서 n은 0-5사이의 정수이고; 바람직하게는, n은 1-3사이의 정수이다.
본 발명의 융합 단백질에 따르면, 상기 융합 단백질은,
SEQ ID NO: 10으로 표시되는 아미노산 서열 및 SEQ ID NO: 11로 표시되는 아미노산 서열을 포함하되, 여기서, SEQ ID NO: 10으로 표시되는 아미노산 서열은 OX40의 항체의 중쇄, 펩타이드 링커 및 인간 인터페론이고, SEQ ID NO: 11로 표시되는 아미노산 서열은 OX40의 항체의 경쇄인 UMY02-L1;
SEQ ID NO: 12로 표시되는 아미노산 서열 및 SEQ ID NO: 13으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하되, 여기서, SEQ ID NO: 12로 표시되는 아미노산 서열은 OX40의 항체의 중쇄이고, SEQ ID NO: 13으로 표시되는 아미노산 서열은 OX40의 항체의 경쇄, 펩타이드 링커 및 인간 인터페론인UMY02-L2; 또는
SEQ ID NO: 14로 표시되는 아미노산 서열 및 SEQ ID NO: 13으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하되, 여기서, SEQ ID NO: 14로 표시되는 아미노산 서열은 OX40의 항체의 중쇄이고, SEQ ID NO: 13으로 표시되는 아미노산 서열은 OX40의 항체의 경쇄, 펩타이드 링커 및 인간 인터페론인 UMY02-L3;
중쇄는 SEQ ID NO: 14로 표시되고, 경쇄 및 인간 인터페론은 SEQ ID NO: 13의 경쇄 및 인간 인터페론으로 표시되며, 펩타이드 링커가 없는 UMY02-L4;
중쇄는 SEQ ID NO: 14로 표시되고, 경쇄 및 인간 인터페론은 SEQ ID NO: 13의 경쇄 및 인간 인터페론으로 표시되며, 펩타이드 링커는 GGGGS인 UMY02-L5;
중쇄는 SEQ ID NO: 14로 표시되고, 경쇄 및 인간 인터페론은 SEQ ID NO: 13의 경쇄 및 인간 인터페론으로 표시되며, 펩타이드 링커는 (GGGGS)2인 UMY02-L6;
중쇄는 SEQ ID NO: 15로 표시되고, 경쇄 및 인간 인터페론은 SEQ ID NO: 13의 경쇄 및 인간 인터페론으로 표시되며, 펩타이드 링커는 GGGGS인 UMY02-L7;
중쇄는 SEQ ID NO: 15로 표시되고, 경쇄 및 인간 인터페론은 SEQ ID NO: 13의 경쇄 및 인간 인터페론으로 표시되며, 펩타이드 링커는 (GGGGS)2인 UMY02-L8;
중쇄는 SEQ ID NO: 15로 표시되고, 경쇄 및 인간 인터페론은 SEQ ID NO: 13의 경쇄 및 인간 인터페론으로 표시되며, 펩타이드 링커는 (GGGGS)2이고, 인터페론는 SEQ ID NO: 9로 표시되는 기초 상에서 T106A/A145D로 돌연변이되는 UMY02-L13;
중쇄는 SEQ ID NO: 15로 표시되고, 경쇄 및 인간 인터페론은 SEQ ID NO: 13의 경쇄 및 인간 인터페론으로 표시되며, 펩타이드 링커는 (GGGGS)2이고, 인터페론은 SEQ ID NO: 9로 표시되는 기초 상에서 T106A/R149A로 돌연변이되는 UMY02-L14;
중쇄는 SEQ ID NO: 15로 표시되고, 경쇄 및 인간 인터페론은 SEQ ID NO: 13의 경쇄 및 인간 인터페론으로 표시되며, 펩타이드 링커는 (GGGGS)2이고, 인터페론은 SEQ ID NO: 9로 표시되는 기초 상에서 T106A/R120A로 돌연변이되는 UMY02-L15;
중쇄는 SEQ ID NO: 15로 표시되고, 경쇄 및 인간 인터페론은 SEQ ID NO: 13의 경쇄 및 인간 인터페론으로 표시되며, 펩타이드 링커는 (GGGGS)2이고, 인터페론은 SEQ ID NO: 9로 표시되는 기초 상에서 T106A/A145G로 돌연변이되는 UMY02-L16;
중쇄는 SEQ ID NO: 15로 표시되고, 경쇄 및 인간 인터페론은 SEQ ID NO: 13의 경쇄 및 인간 인터페론으로 표시되며, 펩타이드 링커는 (GGGGS)3이고, 인터페론은 SEQ ID NO: 9로 표시되는 기초 상에서 T106A/R149A로 돌연변이되는 UMY02-L17;
중쇄는 SEQ ID NO: 15로 표시되고, 경쇄 및 인간 인터페론은 SEQ ID NO: 13의 경쇄 및 인간 인터페론으로 표시되며, 펩타이드 링커는 (GGGGS)2이고, 인터페론은 SEQ ID NO: 9로 표시되는 기초 상에서 T106A/L117A로 돌연변이되는 UMY02-L18;
OX40 IFN-α2a, OX40-IFNβ, OX40-IFNγ, OX40-IFNλ3의 중쇄는 SEQ ID NO: 15로 표시되고; OX40 IFN-α2a의 경쇄, 펩타이드 링커 및 인터페론은 SEQ ID NO: 16로 표시되며; OX40 IFN-β의 경쇄, 펩타이드 링커 및 인터페론은 SEQ ID NO: 17로 표시되고; OX40 IFN-γ의 경쇄, 펩타이드 링커 및 인터페론은 SEQ ID NO: 18로 표시되며; OX40 IFN-λ3의 경쇄, 펩타이드 링커 및 인터페론은 SEQ ID NO: 19로 표시되는 융합 단백질OX40 IFN-α2a, OX40-IFNβ, OX40-IFNγ, OX40-IFNλ3으로부터 선택된다.
다른 한편으로, 본 발명은 상기 융합 단백질을 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
또 다른 한편으로, 본 발명은 상기 분리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 담체를 제공한다.
또 다른 한편으로, 본 발명은 상기 담체를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
본 발명은 상기 융합 단백질을 발현하는 방법을 더 제공하는데, 이는 분리된 폴리뉴클레오티드를 발현할 수 있는 조건에서 상기 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
본 발명은 상기 융합 단백질을 포함하는 키트를 더 제공한다.
본 발명은 상기 융합 단백질 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약물 조성물을 더 제공한다.
본 발명은 상기 융합 단백질이 약물 제조에서의 용도를 더 제공하는데, 상기 약물은 면역 반응을 향상시키거나 및/또는 인터페론에 노출시키면 유익할 수 있는 병세를 치료하기 위한 것이다.
바람직하게는, 상기 병세는 암 또는 바이러스 감염이고, 예컨대 B형 간염 바이러스 감염이다.
본 발명은 면역 반응을 향상시키거나 및/또는 인터페론에 노출시키면 유익할 수 있는 병세를 치료하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 치료적 유효량의 상기 융합 단백질을 필요로 하는 피험자에게 투여하는 단계를 포함하고; 바람직하게, 상기 병세는 암 또는 바이러스 감염이며, 예컨대 B형 간염 바이러스 감염이다.
본 발명은 면역 반응을 향상시키거나 및/또는 인터페론에 노출시키면 유익할 수 있는 병세를 치료하는 융합 단백질을 제공하는데; 바람직하게, 상기 병세는 암 또는 바이러스 감염이고, 예컨대 B형 간염 바이러스 감염이다.
본 발명은 OX40 작용성 항체와 인터페론의 융합 단백질을 제공하는데, 양자의 상이한 작용 메커니즘을 동시에 결합하고 시너지 향상 효과를 형성한다. 한편으로 융합 단백질의 인터페론 부분이 고도로 발현된 인터페론 수용체의 세포(예컨대 종양 또는 바이러스에 감염된 세포) 표면에 결합되면 수용체 매개 방식으로 OX40 활성화 항체의 활성을 향상시킴으로써 면역계의 활성을 더 향상시킬 수 있고; 다른 한편으로, 본 발명의 융합 단백질은 인터페론 분자의 반감기보다 훨씬 연장되며 임상에서 더 낮은 빈도로 사용할 수 있어 현재 임상에서 매일 주입해야 하는 인터페론에 비해 큰 장점을 구비한다.
요약하면, 본 발명의 융합 단백질은 항 종양 및 항 바이러스 치료에서 독특한 약효 및 순응도 장점을 나타낼 수 있다.
이하, 도면과 결부하여 본 발명의 실시형태를 상세하게 설명한다. 여기서,
도 1은 본 발명에 따른 융합 단백질의 구조 모식도를 나타낸다.
도 2는 본 발명에 따른 융합 단백질과 인간 OX40 단백질의 ELISA 결합 실험 결과를 나타낸다.
도 3의 FACS 검출 결과는 MT01-L1항체가 인간 및 필리핀 원숭이 OX40 모두와 결합이 있지만 마우스 OX40과 결합이 없는 것을 나타낸다.
도 4는 본 발명에 따른 융합 단백질이 Daudi 세포에 대한 증식 억제 작용을 나타낸다.
도 5는 본 발명에 따른 융합 단백질이 Jurkat 세포 NF-kB 신호 통로 활성을 활성화시키는 것을 나타낸다.
도 6은 본 발명에 따른 융합 단백질이 MT01-C1 항체의 OX40 신호 통로 활성화 활성을 촉진할 수 있는 것을 나타낸다. 단독적인 OX40 단일 항체(MT01-C1 또는 MT01-C1(G2)) 또는 인터페론 분자 IFNα2b는 본 실험 시스템에서 Jurkat 세포의 OX40 신호 통로에 대해 활성화 작용이 없거나 약하다(6a). 하지만 융합 단백질(UMY02-L1, UMY02-L2 및 UMY02-L3)은 동일한 조건에서 OX40의 신호 통로에 대해 현저한 활성화 활성을 갖는다(6b).
도 7은 마우스에서 UMY02-L1 및 UMY02-L3의 약물동태학 그래프를 나타낸다(7a). 비교로써, 도 7b는 마우스에서 MT01-C1의 약물동태학 그래프를 나타낸다.
도 8 은 본 발명에 따른 융합 단백질이 종양 세포에 미치는 살상 작용을 나타낸다.
본원 발명의 하기 설명은 본원 발명의 여러 가지 실시형태를 설명하기 위한 것이다. 따라서, 여기서 논의된 구체적인 수정 방식은 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 아니된다. 본 분야의 기술자는 본원 발명의 범위를 벗어나지 않고 여러 가지 동등한 방식, 변경 및 수정을 쉽게 얻을 수 있으며 이러한 동등한 실시형태는 본 발명의 범위 내에 포함되는 것을 이해하여야 한다. 본원 발명에서 인용된 간행물, 특허 및 특허 출원을 포함하는 모든 문헌은 인용하는 방식을 통해 본문에 통합된다.
정의
본 발명의 "항체"는 특정 항원을 결합할 수 있는 임의의 면역 글로불린, 단일 클론 항체, 다중 클론 항체, 다중 특이성 항체 또는 이중 특이성(2가) 항체를 포함한다. 하나의 천연적인 완전한 항체는 두 가닥의 중쇄 및 두 가닥의 경쇄를 포함한다. 매 가닥의 중쇄는 가변 영역 및 제1, 제2, 제3 불변 영역으로 구성되고; 매 가닥의 경쇄는 가변 영역 및 불변 영역으로 구성된다. 포유 동물의 중쇄는 α, δ, ε, γ 및 μ로 나눌 수 있고 포유 동물의 경쇄는 λ 또는 κ로 나눌 수 있다. 항체는 "Y"형이고 Y형 구조의 경부는 두 가닥의 중쇄의 제2 및 제3불변 영역으로 구성되며 이는 이황화 결합을 통해 결합된다. "Y"형 구조의 매 가닥의 아암은 한 가닥의 경쇄의 가변 영역 및 불변 영역에 결합된 한 가닥의 중쇄의 가변 영역 및 제1불변 영역을 포함한다. 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은 항원의 결합을 결정한다. 매 가닥의 사슬의 가변 영역은 모두 상보성 결정 영역(CDR)이라 지칭되는 세 개의 초가변 영역을 함유한다. 경쇄(L)의 CDR은 LCDR1, LCDR2, LCDR3을 포함하고, 중쇄(H)의 CDR은 HCDR1, HCDR2, HCDR3을 포함한다. 본 발명에 개시된 항체 및 항원 결합 세그먼트의 CDR경계는 Kabat, Chothia 또는 Al-Lazikani 명명법을 통해 명명되거나 인식될 수 있다. (AI-Lazikani, B., Chothia, C., Lesk, A.M., J.Mol.Biol., 273(4): 927(1997); Chothia, C. 등, J.Mol.Biol., 186(3): 651-63(1985); Chothia, C.and Lesk, A.M., J.Mol.Biol., 196: 901 (1987); Chothia, C. 등, Nature, 342(6252): 877-83 (1989); Kabat, E.A. 등, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). 여기서, 세 개의 CDR은 프레임 영역(FR)이라고 지칭되는 측면의 연속적인 부분에 의해 이격되고 프레임 영역은 CDR보다 더 잘 보존되어 있으며 초가변 루프를 지원하는 하나의 스캐 폴드를 형성한다. 중쇄 및 경쇄의 불변 영역은 항원 결합과 관련이 없지만 여러 가지 효과 기능을 갖는다. 항체는 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열에 따라 여러 유형으로 나눌 수 있다. α, δ, ε, γ 및 μ중쇄를 포함하는 지의 여부에 근거하여, 항체는 각각 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 다섯 가지 주요한 분류 또는 이성질체로 나눌 수 있다. IgG1(γ1중쇄), IgG2(γ2중쇄), IgG3(γ3중쇄), IgG4(γ4중쇄), IgA1(α1중쇄) 또는 IgA2(α2 중쇄)와 같은 몇가지 주요한 항체 분류도 하위 클래스로 나눌 수 있다.
본원 발명의 "항원 결합 세그먼트"는 하나 또는 복수개의 CDR을 함유하는 항체 부분 또는 항원을 결합하지만 완전한 항체 구조를 갖지 않는 임의의 다른 항체 세그먼트에 의해 형성된 항체 세그먼트를 지칭한다. 항원 결합 세그먼트의 예는 이중 기능 항체(diabody), Fab, Fab', F(ab')2, Fv 세그먼트, 이황화 결합 안정화 Fv 세그먼트(dsFv), (dsFv)2, 이중 특이성 dsFv (dsFv-dsFv '), 이황화 결합 안정화 이중 기능 항체(ds diabody), 단일 사슬 항체 분자(scFv), scFv이중체(2가 이중 기능 항체), 2가 단일 사슬 항체(BsFv), 다중 특이성 항체, 카멜화 단일 도메인 항체(camelized single domain antibody), 나노 항체, 도메인 항체 및 2가 도메인 항체를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 항원 결합 세그먼트는 모체 항체와 동일한 항원을 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 세그먼트는 어느 특정 인간 항체로부터의 하나 또는 복수개의 CDR을 함유할 수 있고, 하나 또는 복수개의 상이한 인간 항체로부터의 프레임 영역으로 이접된다.
항체의 "Fab" 세그먼트는 한 가닥의 경쇄(가변 영역 및 불변 영역을 포함) 및 한 가닥의 중쇄의 가변 영역 및 부분 불변 영역이 이황화 결합을 통해 결합된 그 부분의 항체 분자를 지칭한다.
"Fab'" 세그먼트는 부분 힌지 영역을 포함하는 Fab 세그먼트를 지칭한다.
"F(ab')2"는 Fab의 이중체를 지칭한다.
항체의 Fc 세그먼트는 ADCC 및 CDC와 같은 여러 가지 상이한 효과 기능을 담당하지만 항원의 결합에는 참여하지 않는다.
항체의 "Fv" 세그먼트는 완전한 항원 결합 부위를 포함하는 가장 작은 항체 세그먼트를 지칭한다. Fv 세그먼트는 한 가닥의 경쇄의 가변 영역 및 한 가닥의 중쇄의 가변 영역으로 구성된다.
"융합 단백질"은 유전자 수준에서 표적 단백질을 코딩하는 cDNA를 항체 또는 항체 세그먼트를 코딩하는 cDNA에 연결시키고, 진핵 또는 원핵 발현 시스템에서 발현되는 재조합 단백질을 지칭한다.
"링커(linker)"는 펩타이드 결합을 형성한 1~50개의 아미노산으로 구성된 펩타이드 사슬 또는 이의 유도체를 지칭하고, 이의 N말단 및 C말단은 각각 항 OX40 항체 또는 인터페론의 임의의 하나와 공유 결합을 형성함으로써, 항 OX40 항체를 인터페론에 결합시킨다. 항 OX40 항체의 중쇄 또는 경쇄의 C말단측 또는 N말단측에서 링커 서열을 통하거나 펩타이드 결합을 직접 이용하여 인터페론의 N말단 또는 C말단을 각각 결합시킴으로써, 항 OX40 항체 및 인터페론이 일체화되도록 한다. 인터페론과 항 OX40 항체의 융합 단백질의 바람직한 실시형태로써, 항 OX40 항체의 중쇄 또는 경쇄의 C말단을 링커 서열을 통해 인터페론의 N말단에 결합시킴으로써 얻은 융합 단백질; 또는, 항 OX40 항체의 중쇄 또는 경쇄의 N말단에서 링커 서열을 통해 인터페론의 C말단을 결합하여 얻은 융합 단백질을 열거할 수 있다.
"단일 사슬 Fv 항체" 또는 "scFv"는 경쇄 가변 영역과 중쇄 가변 영역이 직접 연결되거나 또는 하나의 펩타이드 사슬을 통해 연결된 엔지니어링 항체(Huston JS 등, Proc Natl Acad Sci USA, 85: 5879 (1988))를 지칭한다.
"단일 사슬 항체 Fv-Fc" 또는 "scFv-Fc"는 항체 Fc세그먼트에 연결된 scFv로 구성된 엔지니어링 항체를 지칭한다.
"카멜화 단일 도메인 항체(Camelized single domain antibody)", "중쇄 항체" 또는 "HCAb(Heavy-chain-only antibodies, HCAb)"는 모두 두 개의 VH 도메인을 함유하지만 경쇄를 함유하지 않는 항체를 지칭한다(Riechmann L. 및 Muyldermans S., J Immunol Methods.231(1-2): 25-38 (1999); Muyldermans S., J Biotechnol. 74(4): 277-302 (2001); W094/04678; W094/25591; U.S.Patent No.6,005, 079). 중쇄 항체는 최초 낙타과(낙타, 단봉 낙타 및 라마)로부터 유래되어 얻은 것이다. 경쇄가 누락되었지만, 카멜화 항체(camelized antibodies)는 확인된 항원 결합의 전부 기능을 갖는다(Hamers Casterman C. 등, Nature 363(6428): 446-8(1993); Nguyen VK. 등, "Heavy-chain antibodies in Camelidae: a case of evolutionary innovation, Immunogenetics. 54 (1): 39-47 (2002); Nguyen VK. 등, Immunology. 109(1): 93-101 (2003)). 중쇄 항체의 가변 영역(VH 도메인)은 획득성 면역에 의해 생성되는 공지된 가장 작은 항원 결합 단위이다(Koch-Nolte F. 등, FASEB J.21(13): 3490-8. Epub(2007)).
"나노 항체"는 중쇄 항체로부터의 하나의 VH 도메인 및 두 개의 불변 영역CH2 및 CH3으로 구성된 항체 세그먼트를 지칭한다.
"이중 기능 항체(diabody)"는 두 개의 항원 결합 부위를 갖는 작은 항체 세그먼트를 포함하고, 여기서 상기 세그먼트는 동일한 가닥의 폴리펩타이드 사슬에 연결된 VH 도메인 및 VL 도메인을 함유한다(Holliger P. 등, Proc Natl Acad Sci U S A.90(14): 6444-8(1993); EP404097; W093/11161을 참조바람). 두 개의 도메인 사이의 어댑터가 매우 짧아서 동일한 가닥의 사슬의 두 개의 도메인이 서로 매칭될 수 없음으로써, 두 개의 도메인이 다른 두 가닥의 사슬의 상보적 도메인과 매칭되도록 하여 두 개의 항체 결합 부위를 형성한다. 이 두 개의 항체 결합 부위는 동일하거나 상이한 항원(또는 에피토프)을 표적화 결합할 수 있다.
"도메인 항체"는 단지 한 가닥의 중쇄 가변 영역 또는 한 가닥의 경쇄 가변 영역을 함유하는 항체 세그먼트를 지칭한다. 일부 경우, 두 개 또는 복수개의 VH 도메인은 하나의 폴리펩타이드 어댑터에 의해 공유 결합되어 2가 도메인 항체를 형성한다. 2가 도메인 항체의 두 개의 VH 도메인은 동일하거나 상이한 항원에 표적화 작용할 수 있다.
일부 실시형태에서, "(dsFv)2"는 세 가닥의 펩타이드 사슬을 함유하고 두 개의 VH 유전자 사이는 한 가닥의 폴리펩타이드 어댑터를 통해 연결되며 이황화 결합을 통해 두 개의 VL 그룹에 결합된다.
일부 실시형태에서 "이중 특이성ds 이중 기능 항체"는 VL1-VH2(두 개의 폴리펩타이드 어댑터에 의해 연결됨) 및 VH1-VL2(또한 두 개의 폴리펩타이드 어댑터에 의해 연결됨)를 함유하고, 양자는 VH1과 VLl 사이에서 이황화 결합을 통해 결합된다.
"이중 특이성dsFv" 또는 "dsFv-dsFv"는 세 가닥의 폴리펩타이드 사슬을 함유하고 VH1-VH2그룹에서, 양자의 중쇄는 폴리펩타이드 어댑터(예: 긴 탄성 어댑터)를 통해 연결되고 이황화 결합을 통해 VL1 및 VL2그룹에 각각 결합되며 이황화 결합을 통해 매칭된 매 쌍의 중쇄 및 경쇄는 상이한 항원 특이성을 갖는다.
일부 실시형태에서, "scFv 이중체"는 2가 이중 기능 항체 또는 2가 단일 사슬 항체(BsFv)이고, 2합체화된 두 개의 VH-VL(폴리펩타이드 어댑터에 의해 연결됨) 그룹을 함유하며, 여기서 두 개의 그룹의 VH는 다른 하나의 그룹의 VL과 협력하여 동일한 항원(또는 에피토프) 또는 상이한 항원(또는 에피토프)을 표적화 결합할 수 있는 두 개의 결합 부위를 형성한다. 다른 일부 실시형태에서, "scFv 이중체"는 이중 특이성 이중 기능 항체이고, 서로 연결된 VL1-VH2(폴리펩타이드 어댑터에 의해 연결됨) 및 VH1-VL2(폴리펩타이드 어댑터에 의해 연결됨)를 함유하며, 여기서 VH1과 VL1은 협력하고 VH2와 VL2는 협력하며 매 하나의 협력의 매칭은 상이한 항원 특이성을 갖는다.
본원 발명에서 사용되는 용어 "완전 인간"은 항체 또는 항원 결합 세그먼트에 사용될 경우, 상기 항체 또는 항원 결합 세그먼트가 특정 아미노산 서열을 갖거나 상기 아미노산 서열로 구성되는 것을 지칭하고, 상기 아미노산 서열은 인간 또는 인간 면역 세포에 의해 생성되거나, 인간 항체 라이브러리를 이용하는 전이 유전자 비인간 동물과 같은 비인간 공급원으로부터 유래된 항체의 아미노산 서열, 또는 인간 항체를 코딩하는 다른 서열에 대응된다. 일부 실시형태에서, 완전 인간 항체는 비인간 항체로부터 유래된 아미노산 잔기(특히 항원 결합 잔기)를 포함하지 않는다.
본원 발명에서 사용되는 용어 "인간화"는 항체 또는 항원 결합 세그먼트에 사용될 경우, 비인간 동물 유래 CDR, 인간 유래 FR영역, 및 인간 유래 불변 영역(적용 시)의 항체 또는 항원 결합 세그먼트를 포함하는 것을 지칭한다. 인간화 항체 또는 항원 결합 세그먼트는 감소된 면역 원성을 갖기 때문에, 일부 실시형태에서 이는 인간의 치료제로 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 비인간 동물은 마우스, 래트, 토끼, 염소, 양, 기니피그 또는 햄스터와 같은 포유 동물이다. 일부 실시형태에서, 상기 인간화 항체 또는 항원 결합 세그먼트는 CDR 서열이 비인간화인 것을 제외하고, 기본적으로 모두 인간화 서열로 구성된다. 일부 실시형태에서, 상기 인간 유래 FR 영역은 그것이 유래된 인간 항체와 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 이는 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개를 초과하지 않는 아미노산 변화와 같은 일부 아미노산 변화를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 아미노산 변화는 단지 중쇄 FR영역에만 존재하거나 경쇄 FR영역에만 존재하거나 두 개의 사슬에 동시에 존재할 수 있다. 일부 바람직한 실시형태에서, 상기 인간화 항체는 인간 FRl-3 및 인간 JH 및 JK를 포함한다.
본원 발명에서 사용되는 용어 "키메라"는 하나의 종으로부터 유래된 중쇄 및/또는 경쇄의 일부, 및 상기 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지 부분에서 상이한 종으로부터 유래된 항체 또는 항원 결합 세그먼트를 갖는 것을 지칭한다. 일 예시적인 예에서, 키메라 항체는 인간으로부터 유래된 불변 영역 및 마우스와 같은 비인간 동물로부터 유래된 가변 영역을 포함할 수 있다.
용어 "OX40"은 OX40L에 결합하는 수용체를 지칭한다. 이는 TNF 수용체 패밀리에 속하는 I형 막 단백질이다. 다른 명명은 ACT-4, OX40L 수용체, CD134 항원, ACT35 항원, TNFRSF4이다. 이는 50kDa의 분자량을 갖고 SwissProt에 저장되며 등록 번호는 P43489이다.
본원 발명에서 사용되는 "인간 인터페론"은 고활성, 다기능의 분비형 당 단백질이고 항 바이러스, 면역 조절 및 항 종양 등 작용을 갖는다. 유전자 서열, 수용체 특이성에 근거하여 I형, II형 및 III형 IFNs으로 나눌 수 있다. 인간 Ｉ형 인터페론은 13가지 아형의 IFNα 및 IFNβ, IFNε, IFNκ, IFNω를 포함한다. Ⅰ형 IFNs는 하나의 공통 세포 표면 수용체 IFNAR을 갖고 IFNAR1 및 IFNAR2인 두 개의 서브 유닛으로 구성된다. II형 인터페론은 단지 IFNγ이다. 즉 IFNγ의 세포 표면 수용체는 IFNGR이고 IFNGR1 및 IFNGR2인 두 개의 서브 유닛으로 구성된다. III형 IFNs는 IFNλ1, IFNλ2, IFNλ3 및 IFNλ4를 포함한다. 본원 발명의 융합 단백질의 인터페론은 본 분야에 공지된 인터페론 변이체를 포함한다.
본원 발명의 "특이적으로 결합" 또는 "특이적인 결합"은 항체와 항체 사이의 반응과 같은 두 개의 분자 사이의 비무작위 결합 반응을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 본원 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 세그먼트는 인간 및/또는 원숭이 OX40에 특이적으로 결합하고, 결합 친화력(KD)은 ≤10-6M이다. 본원 발명의 KD는 해리 속도와 결합 속도의 비율(koff/kon)이고 예를 들면 Biacore와 같은 기기를 사용하여 표면 플라즈몬 공명의 방법을 통해 측정될 수 있다.
본원 발명에서 사용되는 "UMY02-L1"은 SEQ ID NO: 10으로 표시되는 중쇄, 펩타이드 링커 및 인간 인터페론, SEQ ID NO: 11로 표시되는 경쇄를 갖는 것을 지칭하고, 여기서 중쇄 카복시 말단에 펩타이드 링커를 통해 SEQ ID NO: 9로 표시되는 인간 인터페론 IFNα2b의 융합 단백질을 연결시킨다.
본원 발명에서 사용되는 "UMY02-L2"는 SEQ ID NO: 12로 표시되는 중쇄, SEQ ID NO: 13으로 표시되는 경쇄, 펩타이드 링커 및 인간 인터페론을 갖는 것을 지칭하고, 여기서 경쇄 카복시 말단에 펩타이드 링커를 통해 SEQ ID NO: 9로 표시되는 인간 인터페론 IFNα2b의 융합 단백질을 연결시킨다.
본원 발명에서 사용되는 "UMY02-L3"은 SEQ ID NO: 14로 표시되는 중쇄, SEQ ID NO: 13으로 표시되는 경쇄, 펩타이드 링커 및 인간 인터페론을 갖는 것을 지칭하고, 여기서 경쇄 카복시 말단에 펩타이드 링커를 통해 SEQ ID NO: 9로 표시되는 인간 인터페론 IFNα2b의 융합 단백질을 연결시킨다.
본원 발명에서 사용되는 "MT01-C1"은 UMY02-L1, UMY02-L2 및 UMY02-L3과 동일한 VH(SEQ ID NO: 7) 및 VL (SEQ ID NO: 8) 서열을 갖고, 중쇄 및 경쇄 불변 영역은 각각 인간 IgG1 및 κ사슬인 단일 클론 항체를 지칭한다.
본원 발명에서 사용되는 "MT01-C1(G2)"는 UMY02-L1, UMY02-L2 및 UMY02-L3과 동일한 VH(SEQ ID NO: 7) 및 VL(SEQ ID NO: 8) 서열을 갖고, 중쇄 및 경쇄 불변 영역은 각각 인간 IgG2 및 κ사슬인 단일 클론 항체를 지칭한다.
본원 발명에서 사용되는 "MT01-L1"은 UMY02-L1, UMY02-L2 및 UMY02-L3과 동일한 중쇄 및 경쇄 CDR 서열(SEQ ID NO: 1-6)을 갖고 중쇄 및 경쇄 불변 영역은 각각 인간 IgG1 및 κ사슬인 인간-마우스 키메라 항체를 지칭한다.
여기서, 상기 "MT01-C1", "MT01-C1(G2)", "MT01-L1"은 모두 중국 특허 201711476160.3으로부터 유래되고 이의 구체적인 서열은 표 1 및 서열표에 나타낸 바와 같으며 인용을 통해 전체적으로 본문에 통합된다.
본원 발명에서 "보존적 대체"가 아미노산 서열에 사용되는 경우, 하나의 아미노산 잔기를 유사한 물리적 및 화학적 성질을 갖는 측쇄 사슬의 아미노산 잔기로 대체하는 것을 지칭한다. 예를 들면, 소수성 측쇄 사슬 아미노산 잔기 사이(예를 들면 Met, Ala, VaL, Leu 및 Ile), 중성 친수성 측쇄 사슬 잔기 사이(예를 들면 Cys, Ser, Thr, Asn 및 Gln), 산성 측쇄 사슬 잔기 사이(예를 들면 Asp, Glu), 알칼리성 측쇄 사슬 아미노산 사이(예를 들면His, Lys 및 Arg) 또는 방향족 측쇄 사슬 잔기 사이(예를 들면Trp, Tyr 및 Phe)에서 보존적 대체를 진행할 수 있다. 보존적 대체는 일반적으로 단백질의 구조적 구조에 현저한 변화를 일으키지 않으므로 단백질의 생물학적 활성을 유지할 수 있다는 것은 본 분야에 알려져 있다.
"백분율 서열 동일성"이 아미노산 서열(또는 핵산 서열)에 사용될 경우, 서열 비교를 진행하고 필요할 경우 간격을 도입하여 동일한 아미노산(또는 핵산)의 개수가 최대화에 도달한 후, 후보 서열에서, 참조 서열과 동일한 아미노산(또는 핵산) 잔기가 상기 후보 서열의 아미노산(또는 핵산) 잔기에서 차지하는 백분율을 지칭한다. 상기 아미노산 잔기의 보존적 대체는 동일한 잔기로 간주될 수 있거나 그렇지 않을 수 있다. 본 분야에 개시된 도구를 통해 서열을 비교하여 아미노산(또는 핵산) 서열의 백분율 서열 동일성을 결정할 수 있다. 본 분야의 기술자는 상기 도구의 디폴트 파라미터를 사용하거나 예를 들면 적합한 알고리즘을 선택하는 것과 같이 비교의 필요에 근거하여 파라미터를 적절하게 조정할 수 있다.
본원 발명에서 사용되는 "T세포"는 CD4+T세포, CD8+T세포, T보조 1형 T세포, T보조 2형 T세포, T보조 17형 T세포 및 억제성 T세포를 포함한다.
본원 발명에서 사용되는 "효과 기능"은 항체의 Fc 영역이 예를 들면 C1 복합체 및 Fc 수용체와 같은 이펙터에 결합하는 생물학적 활성을 지칭한다. 예시적인 효과 기능은 항체가 C1복합체의 C1q와의 상호 작용에 의해 유도된 보체 의존성 세포 독성(CDC), 항체의 Fc 영역이 효과 기능 세포의 Fc 수용체에 결합하여 유도된 항체 의존성 세포에 의해 매개된 세포 독성(ADCC) 및 식균 작용을 포함한다.
본원 발명에서 "암" 또는 "암 상태"는 종양 또는 악성 세포 성장, 증식 또는 전이에 의해 매개되고 고형 종양 및 백혈병과 같은 비고형 종양을 유발하는 모든 의학적 상태를 지칭한다. 본 발명에서 "종양"은 종양 및/또는 악성 세포의 고형 물질을 지칭한다.
본원 발명에서 "바이러스 감염"은 바이러스가 여러 경로를 통해 인간의 유기체에 침입하여 인간 세포에서 증식하여 유기체를 손상시키는 병원성 과정을 지칭하고, 예를 들면 B형 간염, C형 간염, 헤르페스 바이러스, EB(Epstein-Barr) 바이러스, 에이즈 바이러스, 거대세포 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스 I형, 단순 헤르페스 바이러스 2형, 인간 유두종 바이러스, 아데노 바이러스의 바이러스 감염, 카포시 육종 관련 헤르페스 바이러스 유행병, 토크테노 바이러스(Torquetenovirus), JC 바이러스 또는 BK 바이러스와 같은 만성 바이러스 감염을 포함한다.
특정 상태의 "치료" 또는 "요법"은 특정 상태를 예방하거나 또는 완화시키고, 특정 상태의 발생 또는 발전을 감소시키며, 특정 상태의 발병 위험을 감소시키고, 관련 증상의 발전을 예방하거나 또는 지연시키며, 특정 상태와 관련된 증상을 감소시키거나 또는 종료하고, 특정 상태의 완전 또는 부분의 반전을 생성하며, 특정 상태를 치유하거나, 또는 이들의 조합을 포함한다. 암에 있어서, "치료" 또는 "요법"은 종양 또는 악성 세포 성장, 번식, 또는 전이, 또는 이들의 일부 조합을 억제하거나 완화시키는 것을 지칭할 수 있다. 종양에 있어서, "치료" 또는 "요법"은 전부 또는 일부 종양 제거, 종양 성장 및 전이 억제 또는 완화, 종양의 발전을 예방 또는 지연, 또는 이들의 일부 조합을 포함한다.
"분리된" 물질은 이미 자연 상태에서 인위적으로 변경되었다. 만약 특정 "분리된" 물질 또는 성분이 자연계에 나타나면, 원래 상태가 변경되었거나 벗어난 것이거나, 또는 양자가 모두 발생한 것이다. 예를 들면, 어느 하나의 생체 동물 체내에 천연적으로 존재하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드는 분리되지 않은 것이지만 만약 이러한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드가 이의 천연 상태에서 공존하는 물질이 충분히 분리되어 충분히 순수한 상태로 존재하면, "분리된" 것으로 간주될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체 및 항원 결합 세그먼트의 순도는 적어도 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%이고, 이는 전기영동 방법(예컨대 SDS-PAGE, 등전점 전기영동, 모세관 전기영동), 또는 크로마토그래피법(예컨대 이온 교환 크로마토그래피법 또는 역상 HPLC)에 의해 결정된다.
본 발명에서 "담체"는 특정 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 삽입되어 상기 단백질로 하여금 발현될 수 있는 캐리어 도구를 지칭한다. 담체는 숙주 세포를 형질 전환, 형질 도입 또는 형질 감염하기 위한 것으로 이들이 구비한 유전 물질 요소가 숙주 세포 내에서 발현되도록 할 수 있다. 예를 들어, 담체는 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 예컨대 효모 인공 염색체(YAC), 세균 인공 염색체(BAC) 또는 P1 유래 인공 염색체(PAC)와 같은 인공 염색체, λ파지 또는 M13파지와 같은 파지, 및 동물 바이러스 등을 포함한다. 담체로 사용되는 동물 바이러스 종류에는 역전사 바이러스(렌티 바이러스, 아데노 바이러스, 아데노 관련 바이러스, 헤르페스 바이러스(예컨대 단순 헤르페스 바이러스), 폭스 바이러스, 바큘로 바이러스, 유두종 바이러스, 유두종 공포 바이러스(예컨대 SV40)를 포함)가 있다. 담체에는 발현을 제어하는 다양한 요소를 함유할 수 있고 프로모터 서열, 전사 개시 서열, 인핸서 서열, 선택 요소 및 리포터 유전자를 포함한다. 이 밖에, 담체는 복제 개시 부위를 더 함유할 수 있다. 담체는 세포로의 진입을 돕는 성분을 포함할 수 있고 바이러스 입자, 리포좀 또는 단백질 코트를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서 "숙주 세포"는 외인성 폴리뉴클레오티드 및/또는 담체가 도입된 세포를 지칭한다.
본 발명에서 "치료 유효량" 또는 "유효량"은 특정 약물이 질환을 효과적으로 치료하는 조제량 또는 농도를 지칭한다. 예를 들면, 본 발명에 개시된 항체 또는 이의 항원 결합 세그먼트의 용도에 있어서, 치료 유효량은 상기 조제량 또는 농도 하에서, 상기 항체 또는 항원 결합 물질은 종양의 전부 또는 일부를 제거하고 종양 성장을 억제하거나 완화시키며 종양 세포 전이를 억제하고 종양 또는 암 상태와 관련된 모든 증상 또는 마커를 완화시키며 종양 또는 암 상황의 발전을 예방하거나 지연하고 바이러스 또는 바이러스에 감염된 세포를 억제하거나 제거하며 또는 이들의 특정 조합일 수 있다.
"약학적으로 허용 가능한"은 일반적으로 제형의 다른 성분과 화학적으로 및/또는 물리적으로 호환되고 수용자와 생리학적으로 호환되는 담체, 용매, 희석제, 보조재 및/또는 염을 지칭한다.
본 발명에 관한 융합 단백질
일부 실시형태에서, 본원 발명은 예시적은 융합 단백질 UMY02-L1, UMY02-L2 및/또는 UMY02-L3을 제공한다.
본 분야의 기술자는 전술한 CDR 서열을 변형시켜 하나 또는 더 많은 아미노산의 치환을 포함하도록 할 수 있고, 이로써 예를 들면 향상된 인간 OX40과의 결합 친화성과 같은 향상된 생물학적 활성을 얻을 수 있음을 이해할 수 있다. 예를 들면, 파지 디스플레이 기술을 이용하여 항체 변이체 라이브러리(예를 들면 Fab 또는 FcFv 변이체)를 생산하고 발현한 후, 인간 OX40과 친화성을 갖는 항체를 선별할 수 있다. 다른 일 예에서, 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 상기 항체가 인간 OX40과의 결합을 시뮬레이션하고 결합 인터페이스를 형성하는 아미노산 잔기를 감별할 수 있다. 이러한 잔기의 대체를 피하여 결합 친화성이 감소되는 것을 방지하거나, 또는 이러한 잔기를 표적화하여 더 강한 결합을 형성하도록 대체할 수 있다. 일부 실시형태에서, CDR 서열의 적어도 하나(또는 모든)의 치환은 보존적 대체이다.
일부 실시형태에서, 상기 융합 단백질 및 항원 결합 세그먼트는 하나 또는 복수개의 CDR 서열을 포함하고, 이러한 서열은 본원 발명에 의해 제공되는 예시적인 융합 단백질 UMY02-L1, UMY02-L2 및/또는 UMY02-L3에 열거된 서열과 적어도 80%(예를 들면 적어도 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%)의 서열 동일성을 가지며, 동시에 이의 부모 항체와 유사하거나 심지어 더 높은 인간 OX40과의 결합 친화성을 유지하고, 상기 부모 항체는 기본적으로 동일한 서열을 갖지만, 이에 상응한 CDR서열은 열겨된 서열과 100% 서열 동일성을 갖는다.
일부 실시형태에서, 본원 발명의 융합 단백질은 ≤10-7M의 결합 친화성(KD)으로 인간 OX40에 특이적으로 결합하고, 이는 표면 플라즈몬 공명법에 의해 측정될 수 있다. 결합 친화성의 값은 KD값으로 표시될 수 있고 이는 항원과 항원 결합 분자의 결합이 평형에 도달할 경우의 해리 속도와 결합 속도의 비율(koff/kon)을 통해 계산하여 얻은 것이다. 상기 항원 결합 친화성(예를 들면 KD)은 본 분야에 공지된 적절한 방법, 예를 들면 Biacore와 같은 사용 기기를 사용하는 플라즈몬 공명 결합법을 통해 적절하게 결정될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원 발명의 융합 단백질은 인간 OX40에 10ng/mL-10μg/mL의 EC50(즉 절반 결합 농도)으로 결합한다. 항체 또는 융합 단백질과 인간 OX40의 결합은 예컨대 ELISA, Western 블롯, FACS 또는 다른 결합 시험과 같은 샌드위치 방법 등 본 분야에 공지된 방법을 통해 측정될 수 있다. 예시적인 예에서, 시험할 항체(즉 1차 항체)를 고정화된 인간 OX40 또는 인간 OX40을 발현하는 세포에 결합시킨 후 결합하지 않은 항체를 세척하고 표지된 2차 항체가 도입되어 1차 항체에 결합할 수 있으므로 결합된 2차 항체를 검출할 수 있다. 고정화된 OX40을 사용할 경우 마이크로 플레이트 리더 플레이트에서 상기 검출을 진행할 수 있거나 인간 OX40을 발현하는 세포를 사용할 경우 FACS 분석을 사용하여 상기 검출을 진행할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원 발명의 융합 단백질은 0.1μg/mL 내지 10μg/mL(FACS 분석을 사용하여 측정함)의 EC50(즉 50%의 유효 농도)으로 인간 OX40에 결합한다.
일부 실시형태에서, 본원 발명의 융합 단백질은 FcR 매개 또는 인터페론 수용체 매개 방식을 통해 인간 OX40 신호 통로를 활성화시킬 수 있고, 이로써 예를 들면 활성화된 T세포가 사이토카인(예컨대 CD4+T세포 및 CD8+T세포)을 생성하도록 유도하며, 활성화된 T세포의 증식을 유도하고(예컨대 CD4+T세포 및 CD8+T세포) 조절성 Treg를 역전시키는 억제 기능을 포함하는 생물학적 활성을 제공한다.
상기 융합 단백질은 인간 OX40에 특이적인 것이다. 일부 실시형태에서, 상기 융합 단백질은 마우스 OX40에 결합하지 않지만, 인간 OX40와 유사한 결합 친화성으로 원숭이 OX40에 결합한다. 예를 들면, 본 발명의 융합 단백질과 동일한 CDR 서열을 갖는 단일 클론 항체 MT01-L1과 마우스 OX40의 결합은 FACS 분석과 같은 통상적인 결합 측정 방법을 사용하여 검출할 수 없으나 FACS는 MT01-L1이 원숭이 OX40 및 인간 OX40와 모두 결합이 존재하는 것을 검출한다.
일부 실시형태에서, 상기 융합 단백질은 IgG2 이소 타입의 불변 영역을 갖고, 이는 감소된 또는 제거된 효과 기능을 갖는다. 예를 들면ADCC 및 CDC 등 효과 기능은 OX40을 발현하는 세포에 세포 독성을 유발할 수 있다. 일부 정상 세포는 OX40을 발현할 수 있다. 이러한 정상 세포에 대한 잠재적으로 바람직하지 않은 독성을 피하기 위하여, 본 발명의 항체의 특정 실시형태는 감소된 또는 심지어 제거된 효과 기능을 갖는다. 공지된 많은 시험은 ADCC 또는 CDC 활성을 추정하기 위한 것이고, 예를 들면 Fc 수용체 결합 시험, 보체 Clq 결합 실험 및 세포 분해법이며, 본 분야의 기술자는 용이하게 선택할 수 있다. 이론에 얽매이지 않지만, 감소된 또는 제거된 효과 기능을 갖는 예컨대 ADCC 및 CDC의 항체는 OX40을 발현하는 세포(예를 들면 정상 세포)의 세포 독성을 유발하거나 최소화 정도로 감소시키지 않으므로 바람직하지 않은 부작용을 피한다.
일부 실시형태에서, 본원 발명의 융합 단백질은 생체 내에서 인터페론 분자보다 더 긴 작용 시간을 갖는다. 이는 융합 단백질이 동물 체내에서 더 긴 반감기와 약물 보유 시간을 갖기 때문이다. 이 성질은 환자가 사용하는 약물의 차수를 감소시키고 약물의 효과를 향상하는데 유용하다.
일부 실시형태에서, 본원 발명의 융합 단백질은 감소된 부작용을 갖는다. 예를 들면 상기 항 OX40 항체 및 이의 항원 결합 세그먼트는 완전한 인간 IgG 서열을 가질 수 있으므로, 이의 면역 원성은 인간화 항체보다 낮다. 다른 예를 들면, 상기 융합 단백질 및 이의 항원 결합 세그먼트는 IgG2 또는 IgG4의 형태를 가져 ADCC 및 CDC를 제거할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원 발명의 융합 단백질의 장점은 종양 세포, 정제된 종양 항원 및 면역 자극 인자를 코딩하는 형질 감염된 세포, 종양 백신과 같은 면역 원성을 갖는 물질과 조합하여 사용할 수 있는 것이다. 이 밖에, 상기 항 OX40 항체 및 이의 항원 결합 세그먼트는 표준 화학 요법 및 방사선 요법, 표적 기반 소분자 요법, 기타 새로운 면역 체크 포인트 조절제 요법을 포함하는 조합 치료에 포함될 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 항체 및 이의 항원 결합 세그먼트는 항체-약물 접합체, 이중 특이성 또는 다가 항체의 기본 분자로서 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원 발명의 융합 단백질 및 이의 항원 결합 세그먼트는 카멜화 단일 도메인 항체(camelized single chain domain antibody), 이중 기능 항체(diabody), scFv, scFv 이중체, BsFv, dsFv, (dsFv)2, dsFv-dsFv', Fv 세그먼트, Fab, Fab', F(ab')2, ds 이중 기능 항체(ds diabody), 나노 항체, 도메인 항체 또는 2가 도메인 항체이다.
일부 실시형태에서, 본원 발명의 융합 단백질은 면역 글로불린 불변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역 글로불린 불변 영역은 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역을 포함한다. 상기 중쇄 불변 영역은 CH1, CH1-CH2 또는 CH1-CH3 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역 글로불린 불변 영역은 하나 또는 복수개의 변형을 추가로 포함하여 필요한 성질을 획득할 수 있다. 예를 들면, 상기 불변 영역은 한가지 또는 여러 가지 효과 기능을 감소 또는 제거하여 FcRn 수용체 결합을 향상시키거나 하나 또는 복수개의 시스테인 잔기를 도입하도록 변형될 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 항체 및 이의 항원 결합 세그먼트는 접합체를 추가로 포함한다. 발명에서 항체 또는 이의 항원 결합 세그먼트는 다양한 접합체에 연결될 수 있다고 생각할 수 있다(예를 들면 "Conjugate Vaccines", Contributions to Microbiology and Immunology, J.M.Cruse and R.E.Lewis, Jr. (eds.), Carger Press, New York (1989)를 참조). 이러한 접합체는 공유 결합, 친화성 결합, 삽입, 등가 결합(coordinate binding), 복합체화, 결합, 혼합 또는 첨가와 같은 다른 방식에 의해 상기 항체 또는 항원 결합 물질에 연결될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 개시된 항체 및 항원 결합 세그먼트는 에피토프 결합 부분 외의 특정 부위를 함유하도록 조작될 수 있고, 이러한 부위는 한가지 또는 여러 가지 접합체를 결합하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 이러한 부위는 결합 물질에 대한 공유 연결을 돕기 위하여 시스테인 잔기 및 히스티딘 잔기와 같은 한가지 또는 여러 가지 반응성 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체는 접합체에 간접적으로 연결되거나, 또는 다른 하나의 접합체를 통해 연결될 수 있다. 예를 들면, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 세그먼트는 비오틴에 결합한 후, 두번째 접합체에 간접적으로 결합할 수 있고, 이는 아비딘에 연결된다. 상기 접합체는 검출 가능한 표지, 약물동태학적 변형 부분, 정제된 부분 또는 세포 독성 부분일 수 있다. 검출 가능한 표지의 예로는 형광 표지(예를 들면 루시페린, 로다민, 단실, 피코에리트린 또는 텍사스레드), 효소 기질 마커(예를 들면 서양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리포스파타제, 루시페라제, 글루코아밀라제, 리소자임, 당산화 효소 또는 β-D갈락토시다제), 안정된 동위 원소 또는 방사성 동위 원소, 발색단 부분, 디곡신, 비오틴/아비딘, DNA 분자 또는 금 분자를 포함하여 검출할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 접합체는 PEG와 같은 약물동태학적 변형 부분이고 항체의 반감기를 연장시키는데 도움이 될 수 있다. 다른 적합한 중합체는 카복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈, 에틸렌글리콜/프로필렌글리 콜공중합체 등을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 접합체는 자기 비드와 같은 정제된 부분일 수 있다. "세포 독성 부분"은 세포에 유해하거나 세포를 손상시키거나 죽일 수 있는 임의의 제제일 수 있다. 세포 독성 부분의 예시는 파클리탁셀, 사이토칼라신B, 그라미시딘D, 아세토페논브로마이드, 이미트린, 미토마이신, 에토폭시브, 테니포칸, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디히드록시안트라신디온, 미토산트론, 미트라마이신, 악티노마이신D, l-데히드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로테알롤, 퓨로마이신 및 그 유사체, 항 대사 물질(예를 들면, 메토트렉세이트, 6-머캅토퓨린, 6-머캅토구아나민, 시타라빈, 5-플루오로우라실다카르바), 알킬화제(예를 들면, 질소 머스타드, 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴(BSNU) 및 로무스틴(CCNU), 시클로포스파미드, 부설판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신C 및 시스-디클로로디아민플라틴(DDP) 시스플라틴), 안트라사이클린 항생제(예를 들면 다우노루비신(이전의 다우노루비신) 및 독소루비신), 항생제(예를 들면 닥티노마이신(이전의 악티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신 및 아미노마이신(AMC)) 및 유사 분열 방지제(예를 들면 빈크리스틴 및 빈블라스틴)를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
폴리뉴클레오티드 및 재조합 방법
본 분야에 공지된 유전 공학 기술을 사용하여, 본원 발명의 융합 단백질의 아미노산 서열을 상응한 DNA 코딩 서열로 변환할 수 있다. 유전자 코드의 퇴행성으로 인해 변환된 DNA 서열은 완전히 일치할 수 있고 코딩된 단백질 서열은 변하지 않는다.
본 분야에 공지된 재조합 기술을 사용하여 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 담체를 숙주 세포에 도입하여 클로닝(증폭 DNA) 또는 유전자 발현에 사용될 수 있다. 다른 일 실시형태에서, 상기 융합 단백질은 본 분야에 공지된 상동 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다. 다양한 담체를 사용할 수 있다. 담체의 조성 성분은 일반적으로 신호 서열, 복제 기점, 한가지 또는 여러 가지 표지 유전자, 인핸서 서열, 프로모터(예를 들면: SV40, CMV, EF-1a) 및 전사 종료 서열 중 두 가지 또는 여러 가지를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
일부 실시형태에서, 상기 담체 시스템은 포유 동물, 세균, 효모 시스템 등을 포함하고, 플라스미드를 포함하지만 pALTER, pBAD, pcDNA, pCal, pL, pELpGEMEX, pGEX, pCLpCMV, pEGFP, pEGFT, pSV2, pFUSE, pVITRO, pVIVO, pMAL, pMONO, pSELECT, pUNO, pDUO, Psg5L, pBABE, pWPXL, pBI, p15TV-L, pPro18, pTD, pRS420, pLexA, pACT2 등 실험실에서 획득할 수 있거나 시판되는 다른 담체에 한정되지 않는다. 적합한 담체는 플라스미드 또는 바이러스 담체(예를 들면, 복제 결함형 역전사 바이러스, 아데노 바이러스 및 아데노 관련 바이러스)를 포함할 수 있다.
상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 담체를 숙주 세포에 도입하여 클로닝 또는 유전자 발현에 사용할 수 있다. 본 발명에서 상기 담체의 DNA를 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 원핵 세포, 효모 또는 상기 고등 진핵 세포이다. 본 발명의 용도에 적합한 원핵 세포는 그람 음성 박테리아 또는 그람 양성 박테리아와 같은 진정세균, 예컨대, 엔테로박터, 에르위니아, 클렙시엘라, 프로테우스, 살모넬라와 같은 대장균, 세라티아와 같은 살모넬라티피뮤리움, 시겔라와 같은 세라티아마르세센스균, 및 고초균과 바실루스리케니포르미스균과 같은 간균, 그린펩타이드간균 및 스트렙토미세스와 같은 슈도모나스 등 장내세균을 포함한다.
원핵 세포 외에, 사상균 또는 효모와 같은 진핵 미생물을 숙주 세포로 사용하여 융합 단백질을 코딩하는 담체를 클로닝하거나 발현할 수 있다. 맥주 효모, 또는 제빵용 효모는 가장 일반적으로 사용되는 진핵 숙주 미생물이다. 하지만, 많은 다른 속, 종 및 균주는 모두 일반적으로 사용되고 본 발명에 적용되며, 예를 들면, 스키조사카로마이세스 폼베; 클루이베로마이세스 락티스, 클루이베로마이세스 프라질리스(ATCC 12, 424), 불가리아 클루이베로미세스(ATCC 16, 045), 워이스 클루이베로미세스(ATCC 24, 178), 클루이베로미세스 왈티(ATCC 56, 500), 초파리 클루이베로미세스(ATCC36, 906), 내열성 클루이베로미세스 및 야로위아 리포리티카(EP 402, 226)와 같은 클루이베로미세스 마르시아누스 등 클루이베로미세스 숙주; 피히아 파스토리스(EP 183 ,070); 트리코더마 레세이(EP 244 ,234)와 같은 칸디다; 뉴로스포라; 웨스턴 슈반 효모와 같은 웨스턴 슈반 효모; 및 붉은빵곰팡이, 푸른곰팡이, Tolypocladium 및 아스페르길루스니둘란스 및 검정 곰팡이와 같은 아스페르길루스 등 사상균이다.
본 발명에서 제공되는 글리코실화된 항체 또는 이의 항원 결합 세그먼트 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 생물로부터 유래된다. 무척추 세포의 구현예로는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 다양한 배큘로 바이러스 균주(baculoviral strains) 및 이의 변이체 및 대응되는 허용 곤충 숙주 세포(permissive insect host cells)를 발견하였고, 예컨대 스포도프테라 프루기페르다(애벌레), 아에데스 아에기프티(모기), 흰줄숲모기(모기), 황색초파리(초파리) 및 누에 등 숙주로부터 유래된다. 형질 감염에 사용되는 다양한 바이러스 균주는 공지되게 얻을 수 있는 것이고 예를 들면 아우토그라파 칼리포니카 바이러스 및 누에나방 고치의 핵다각 바이러스의 Bm-5 변이체와 같은 이러한 바이러스는 모두 본 발명에서 사용될 수 있으며, 특히 스포도프테라 프루기페르다 세포 형질 감염에 사용된다. 목화, 옥수수, 감자, 대두, 피튜니아, 토마토 및 담배의 식물 세포 배양도 숙주로 사용할 수 있다.
하지만, 가장 흥미로운 것은 척추 세포이고 척추 세포의 배양(조직 배양)은 통상적인 작업이 되었다. 사용 가능한 포유 동물 숙주 세포의 구현예는 SV40 형질 전환된 원숭이 신장 세포CV1계(COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포계(293 또는 현탁 배양된 293 세포 서브 클론, Graham et al. ,].Gen Virol.36: 59(1977)); 아기 햄스터 신장 세포 (B혈액, ATCC CCL 10); 중국 햄스터 난소 세포/-DHFR(CHO, Urlaub et al. ,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77: 4216(1980)); 마우스 고환 지지 세포(TM4, Ma ther, Biol.Reprod. 23: 243-251(1980)); 원숭이 신장 세포 (CV1ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76 ,ATCC CRL-1587); 인간 자궁 경부암 세포(HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포(MDCK,ATCC CCL 34); 버팔로 랫트 간 세포(BRL 3A,ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포(W138, ATCC CCL75); 인간 간 세포(Hep G2,HB 8065); 마우스 유선종(MMT 060562,ATCC CCL51); TRI 세포(Ma ther 등, Annals N. Y. Acad. Sci.383: 44-68 (1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간암 세포계(HepG2)가 있다. 일부 바람직한 실시형태에서, 상기 숙주 세포는 293F 세포이다.
상기 융합 단백질을 생산할 수 있는 상기 발현 또는 클로닝 담체를 숙주 세포를 형질 전환하고, 통상적인 영양 배지에서 배양하며, 상기 영양 배지는 변형 후 프로모터 유도, 형질 전환된 세포 선택 또는 코딩 목적의 서열의 유전자 증폭에 적합하다.
본 발명에서 상기 융합 단백질을 생산하기 위한 숙주 세포는 본 분야에 공지된 다양한 배지에서 배양할 수 있다. 상기 배지는 본 분야에 공지된 적절한 농도의 임의의 다른 필요한 첨가제를 더 함유할 수 있다. 온도, pH 등 유사한 조건과 같은 상기 배지의 조건은 발현을 위한 숙주 세포를 선택하기 이전에 사용된 조건이고, 통상의 지식을 가진 자에게 숙지된 것이다.
재조합 기술을 사용할 경우, 상기 항체는 세포 내, 벽막 공간에서 생성되거나 배지로 직접 분비될 수 있다. 만약 상기 항체가 세포 내에서 생성되면, 먼저 숙주 세포 또는 분해된 세그먼트의 잔해를 제거하고, 예를 들면, 원심 분리 또는 초음파의 방법을 통할 수 있다. Carter et al.,Bio/Technology 10: 163-167(1992)은 대장균 벽막 공간으로 분비되는 항체를 분리하는 방법을 설명한다. 간단히 말해서, 우라닐아세테이트(pH 3.5), EDTA 및 PMSF의 존재 하에서 세포 페이스트(cell paste)를 약 30분 이상 녹인다. 원심 분리하여 세포 파편을 제거한다. 상기 항체가 배지로 분비되면, 통상적으로 먼저 lAmicon 또는 Millipore Pellicon ultrafiltration unit와 같은 시판되는 단백질 농도 필터를 사용하고 상기 발현 시스템의 상층액을 농축한다. 전술한 모든 단계에서 PMSF와 같은 프로테아제 억제제를 첨가하여 단백질 분해를 억제하고 항생제를 첨가하여 우발적인 오염 물질의 성장을 방지할 수 있다.
상기 세포에서 얻은 항체는 히드록시아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기 영동, 투석, DEAE-셀룰로오스 이온 교환 크로마토그래피 컬럼, 황산암모늄 침전, 염석 및 친화성 크로마토그래피와 같은 정제 방법으로 정제할 수 있고, 여기서 친화성 크로마토그래피는 바람직한 정제 기술이다. 상기 항체의 종류 및 상기 항체에 존재하는 임의의 면역 글로불린의 Fc 구조 도메인은 단백질A가 친화성 리간드로 적합한 지의 여부를 결정한다. 단백질A는 인간 γ1, γ2 또는 γ4 중쇄에 기반한 항체(Lindmark et al. , J.lmmunol.Meth.62: 卜13 (1983))를 정제하기 위한 것이다. 단백질G는 모든 뮤린 이성질체 및 인간 γ3(Guss et al. ,EMBO J.5: 1567 1575(1986))에 적용된다. 아가로오스는 가장 통상적인 친화성 리간드 부착 매트릭스이지만, 다른 매트릭스도 사용할 수 있다. 제어 가능한 기공 유리 또는 폴리(스티렌)벤젠과 같은 기계적으로 안정된 매트릭스 아가로오스보다 더 빠른 유속과 더 짧은 처리 시간을 실현할 수 있다. 상기 항체가 CH3 구조 도메인을 함유하면, Bakerbond ABX.TM 수지로 정제할 수 있다(J.T.Baker, Phillipsburg, N.J.). 또한 획득해야 하는 항체에 근거하여 예컨대 이온 교환 컬럼에서의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카겔 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지에 기반한 헤파린 아가로오스겔 크로마토그래피(예를 들어 폴리아스파틱산 컬럼), 크로마토그래피 집속, SDS-PAGE, 및 황산 암모늄 침전과 같은 다른 단백질 정제 기술을 결정할 수 있다.
임의의 예비 정제 단계 후, 낮은 pH 소수성 상호 작용 크로마토그래피 방법으로 관심 항체 및 불순물을 함유하는 혼합물을 처리하고 pH가 약 2.5-4.5인 용출 완충액을 사용하며 바람직하게는 낮은 염 농도 하에서 진행한다(예를 들면, 약 0 내지 0.25M의 염 농도).
키트
본원 발명은 상기 융합 단백질을 포함하는 키트를 제공한다. 일부 실시형태에서, 상기 키트는 생물학적 샘플에서 OX40의 존재 상황 또는 수준을 검출하기 위한 것이다. 상기 생물학적 샘플은 세포 또는 조직을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 키트는 검출 가능한 표지에 접합된 융합 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 키트는 비표지 융합 단백질을 포함하고, 비표지 융합 단백질에 결합할 수 있는 표지된 2차 항체를 추가로 포함한다. 상기 키트는 사용 설명 및 키트에서 매 하나의 요소를 분리하는 포장을 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 융합 단백질은 기질 또는 기기에 연결되어 ELISA 또는 면역 크로마토그래피 측정과 같은 샌드위치 측정을 위한 것이다. 적합한 기질 또는 기기는 예컨대 마이크로 플레이트 및 테스트 용지일 수 있다.
약물 조성물 및 치료 방법
본원 발명은 상기 융합 단백질을 포함하는 약물 조성물 및 하나 또는 복수개의 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 제공한다.
본원 발명에 개시된 약물 조성물에 사용되는 약학적으로 허용 가능한 담체는 예를 들면, 약학적으로 허용 가능한 액체, 겔 또는 고체 담체, 수상 매질, 비수상 매질, 항 미생물 물질, 등장성 물질, 완충액, 항산화제, 마취제, 현탁제/분산제, 통합제, 희석제, 보조제, 보조재 또는 무독성 보조 물질, 본 분야에 공지된 다른 조성 성분 또는 이들의 다양한 조합을 포함할 수 있다.
적합한 조성 성분은 항산화제, 충진제, 접착제, 붕해제, 완충액, 방부제, 윤활제, 향료, 증점제, 착색제, 유화제 또는 설탕 또는 시클로덱스트린과 같은 안정제를 포함할 수 있다. 적합한 항산화제는 메티오닌, 아스코르브산, EDTA, 티오황산나트륨, 백금, 카탈라제, 구연산, 시스테인, 머캅토글리세롤, 티오글리콜산, 머캅토소르비톨, 부틸메틸아니솔, 부틸화히드록시톨루엔 및/또는 프로필갈레이트를 포함할 수 있다. 본 발명에 개시된 융합 단백질을 함유하는 조성물은 메티오닌과 같은 한가지 또는 여러 가지 항산화제를 포함하여 상기 융합 단백질의 산화를 감소시킬 수 있다. 산화 작용에 대한 감소는 결합 친화력의 감소를 방지하거나 감소시킴으로써 항체 안정성을 향상시키고 품질 보증 기간을 연장시킬 수 있다.
나아가, 약학적으로 허용 가능한 담체는 예를 들면, 염화나트륨 주사액, 링거액 주사액, 등장성 포도당 주사액, 멸균수 주사액, 또는 포도당 및 락테이트 링거 주사액과 같은 수상 매질, 식물 유래 불휘발성 오일, 목화씨유, 옥수수유, 참기름, 또는 땅콩유, 세균 억제 또는 진균 억제 농도의 항균 물질과 같은 비수성 매질, 염화나트륨 또는 포도당과 같은 등장제, 인산염 또는 구연산염 완충액과 같은 완충액, 황산수소나트륨과 같은 항산화제, 염산 프로카인과 같은 국소 마취제, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스 또는 폴리비닐피롤리돈과 같은 현탁제 및 분산제, 폴리소르베이트80(트윈-80)와 같은 유화제, EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) 또는 EGTA(에틸렌글리콜비스(2-아미노에틸에테르)테트라아세트산), 에탄올, 폴리에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 수산화나트륨, 염산, 구연산 또는 젖산과 같은 통합 시약을 포함할 수 있다. 담체로서의 항균제를 조제량 용기의 약물 조성물에 여러번 첨가할 수 있고, 페놀 또는 크레졸, 수은 제제, 벤질알코올, 클로로부탄올, 메틸 및 프로필파라벤, 메르티올레이트, 염화벤잘코늄 및 클로로펜에틸 암모늄을 포함한다. 적합한 보조재는 예를 들면, 물, 염, 포도당, 글리세롤 또는 에탄올을 포함할 수 있다. 적합한 무독성 보조 물질은 예를 들면, 유화제, pH 완충제, 안정제, 용해화제, 또는 아세트산나트륨, 소르비탄라우레이트, 트리에탄올아민올레이트 또는 시클로덱스트린 물질을 포함할 수 있다.
상기 약물 조성물은 액체 용액, 현탁액, 에멀젼, 환약, 캡슐, 정제, 지속적인 서방형 제제 또는 분말일 수 있다. 경구 제제는 약물 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘스테아레이트, 폴리비닐피롤리돈, 나트륨사카린, 셀룰로오스, 마그네슘카보네이트 등과 같은 표준 담체를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 약물 조성물은 주사 가능한 조성물로 제제화된다. 주사 가능한 약물 조성물은 임의의 통상적인 형태, 예를 들면, 액체 용매, 현탁제, 유화제 또는 액체 용매, 현탁제 또는 유화제를 생성하기 적합한 고체 형태로 제조될 수 있다. 주사 제제는 현재 사용되는 멸균 및/또는 발열원이 없는 용액, 동결 건조 분말과 같은 사용 전에 용매에 결합되는 멸균 건조 가용 물질을 포함할 수 있고, 피하 정제, 주사용 멸균 현탁제, 사용 전 매질에 결합되는 멸균 건조 불용 제품, 및 멸균 및/또는 발열원이 없는 에멀젼을 포함한다. 용매는 수상 또는 비수상일 수 있다.
일부 실시형태에서, 단위 조제량의 주사 제제는 앰플, 튜브 또는 바늘이 있는 주사기로 포장된다. 본 분야에 알려진 바와 같이, 모든 주사 투여하는 제제는 멸균되고 발열원이 없어야 한다.
일부 실시형태에서, 본원 발명에 개시된 항체 또는 이의 항원 결합 세그먼트를 적합한 용매에 용해시켜 멸균 동결 건조된 분말을 제조할 수 있다. 상기 용매는 분말 또는 분말로부터 제조된 재조합 용액의 안정성을 향상시키거나 분말 또는 재조합 용액의 다른 약리학적 조성 성분을 함유할 수 있다. 적합한 보조 물질은 물, 포도당, 트리비톨, 과당, 옥수수 시럽, 자일리톨, 글리세롤, 포도당, 갈색 설탕 또는 기타 적용 가능한 물질을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 용매는 시트레이트 완충액, 인산 나트륨 또는 인산 칼륨 완충액 또는 본 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 다른 완충액과 같은 완충액을 함유할 수 있고, 일 실시형태에서, 완충액의 pH는 중성이다. 본 분야에 공지된 표준 조건에서 상기 용액에 대한 후속적인 여과 및 살균을 진행한 후, 동결 건조하여 이상적인 제제를 얻는다. 일 실시형태에서, 얻은 용매는 바이알로 분할되고 동결 건조된다. 매 하나의 바이알은 단일 조제량 또는 다중 조제량의 상기 항 OX40 항체 또는 이의 항원 결합 세그먼트 또는 이의 조합물을 수용할 수 있다. 매 하나의 바이알의 충진량은 매번의 필요한 조제량 또는 여러번의 필요한 조제량(예를 들면 10% 과량)보다 약간 더 높음으로써 정확한 샘플링 및 정확한 투여를 확보할 수 있다. 동결 건조 분말은 약 4℃ 내지 실온 범위와 같은 적절한 조건에서 저장될 수 있다.
동결 건조 분말을 주사용수로 재용해시켜 주사 투여하기 위한 제제를 얻는다. 일 실시형태에서, 동결 건조 분말을 멸균 및 발열원이 없는 물 또는 다른 적합한 액체 담체에서 재용해시킬 수 있다. 정확한 양은 선택한 요법에 의해 결정되고 경험값에 근거하여 결정할 수 있다.
본 발명은 치료적 유효량의 본원 발명의 융합 단백질을 이를 필요로 하는 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법을 더 제공한다.
본원 발명에서 제공되는 융합 단백질의 치료 유효량은 체중, 연령, 과거 병력, 현재 치료, 대상체의 건강 상태 및 교차 감염의 잠재력, 알레르기, 과민증과 부작용, 및 투여 경로와 종양 발전의 정도와 같은 본 분야에 공지된 다양한 요인에 의존한다. 본 분야에 통상의 지식을 가진 자(예를 들면 의사 또는 수의사)는 이러한 또는 다른 조건 또는 요구에 근거하여 조제량을 비율적으로 감소시키거나 증가시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 의해 제공되는 융합 단백질은 약 0.0lmg/kg 내지 약 100mg/kg 사이의 치료 유효량으로 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 융합 단백질은 약 50mg/kg 또는 더 적은 조제량으로 투여되고 일부 실시형태에서, 투여되는 조제량은 10mg/kg 또는 이하, 5mg/kg 또는 이하, 1mg/kg 또는 이하, 0.5mg/kg 또는 이하 또는 0.1mg/kg 또는 이하이다. 특정 조제량은 하루에 한 번, 하루에 두 번 또는 이상, 한 달에 두번 또는 이상, 일주일에 한 번, 2주에 한 번, 3주에 한 번, 한 달에 한 번 또는 2달 또는 이상에 한 번과 같은 여러 간격으로 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 투여 조제량은 치료 과정에 따라 변화될 수 있다. 예를 들면, 일부 실시형태에서, 초기 투여 조제량은 후속 투여 조제량보다 높을 수 있다. 일부 실시형태에서, 투여 조제량은 치료 과정에서 대상체의 반응에 근거하여 조정된다.
투여 방법은 조정을 통해 최적의 반응(예컨대 치료 반응)을 달성할 수 있다. 예를 들면, 단일 조제량으로 투여하거나 두 기간에 걸쳐 여러 분할 조제량으로 투여될 수 있다.
본 발명에 개시된 융합 단백질은 본 분야에 공지된 투여 방식을 통해 투여될 수 있고, 예를 들면 주사 투여(예컨대, 피하 주사, 복강 내 주사, 정맥 주사를 포함한 정맥 주사, 근육 내 주사 또는 피내 주사) 또는 비주사 투여(예컨대, 경구 투여, 비강 투여, 설하 투여, 직장 투여 또는 국소 투여)이다.
일부 실시형태에서, 상기 융합 단백질은 분자 메커니즘과 관련된 병증을 치료할 수 있고, 종양 및 암을 포함하며, 예를 들면, 비소 세포 폐암, 소세포 폐암, 신장 세포암, 결장 직장암, 난소암, 유방암, 췌장암, 위암, 방광암, 식도암, 중피종, 흑색종, 두경부암, 갑상선암, 육종, 전립선암, 교모세포종, 자궁 경부암, 흉선암, 백혈병, 림프종, 골수종, 잔디형 육아종(mycoses fungoids), 메르켈세포암 및 예컨대 전형적인 호지킨 림프종(CHL), 원발성 종격동 거대 B세포 림프종, T세포/조직 세포의 B세포가 풍부한 림프종, EBV 양성 및 음성 PTLD 및 EBV 관련 미만성 거대 B세포 림프종(DLBCL), 형질 모세포 림프종, 결절 외 NK/T세포 림프종, 비인두암 및 HHV8 관련 원발성 삼출성 림프종, 호지킨 림프종과 같은 기타 악성 혈액병, 예컨대 원발성 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경 교종과 같은 중추 신경계(CNS) 종양이다. 일부 실시형태에서, 상기 융합 단백질에 의해 치료되는 병증은 예를 들면 B형 간염, C형 간염, 헤르페스 바이러스, Epstein-Barr 바이러스, 에이즈 바이러스, 거대세포 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스 I형, 단순 헤르페스 바이러스 2형, 인간 유두종 바이러스, 아데노 바이러스의 바이러스 감염, 카포시 육종 관련헤르페스 바이러스 유행병, 토크테노 바이러스(Torquetenovirus), JC 바이러스 또는 BK 바이러스와 같은 만성 바이러스 감염을 포함한다.
사용 방법
본원 발명은 상기 융합 단백질을 사용하는 방법을 추가로 제공한다.
일부 실시형태에서, 본원 발명은 개체에서 상기 융합 단백질 메커니즘과 관련된 상태 또는 병증을 치료하는 방법을 제공하고, 치료적 유효량의 본원 발명의 융합 단백질을 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명에 개시된 융합 단백질은 단독으로 또는 한가지 또는 여러 가지 다른 치료 수단 또는 물질과 조합하여 투여될 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 개시된 융합 단백질은 화학 요법, 방사선 요법, 암 치료 수술(예컨대 종양 절제술), 항 바이러스 약물, 한가지 또는 여러 가지 항구토 약물 또는 기타 화학 요법에 의해 유발된 합병증의 요법, 또는 임의의 암 또는 바이러스 치료 물질과 조합하여 사용될 수 있다. 일부 이러한 실시형태에서, 본 발명에 개시된 융합 단백질이 한가지 또는 여러 가지 치료 물질과 조합하여 사용될 경우, 상기 한가지 또는 여러 가지 치료 물질과 동시에 투여될 수 있고, 일부 이러한 실시형태에서, 상기 융합 단백질은 동일한 약물 조성물의 일부로서 동시에 투여될 수 있다. 그러나, 다른 치료 물질과 "조합하여 사용"되는 융합 단백질은 동시에 투여되거나 상기 치료 물질과 동일한 조성물에 투여될 필요가 없다. 본 발명에서 "조합하여 사용"의 의미는 상기 융합 단백질과 제2 물질이 상이한 투여 방식을 통해 투여되더라도 다른 하나의 치료 물질 이전 또는 이후에 투여된 융합 단백질이 상기 치료 물질과 "조합하여 사용"되는 것으로 간주되는 것을 더 포함한다. 가능한 경우, 본 발명에 개시된 융합 단백질과 조합하여 사용되는 다른 치료 물질은 상기 다른 치료 물질의 제품 설명서의 방법을 참조하여 투여되거나, 또는 외과 의사 데스크 참고서 2003(Physicians'Desk Reference, 57th Ed; Medical Economics Company; ISBN: 1563634457; 제57버전(2002년 11월))을 참조하거나, 또는 본 분야에 공지된 다른 방법을 참조할 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 치료 물질은 암에 대한 면역 반응을 유도하거나 향상시킬 수 있다. 예를 들면, 종양 백신은 특정 종양 또는 암에 대한 면역 반응을 유도하는데 사용될 수 있다. 사이토카인 치료는 면역계에 대한 종양 항원의 제시를 향상시킬 수 있다. 사이토카인 치료의 예시는 인터페론α, β ?? γ와 같은 인터페론, 대식세포 CSF, 과립구 대식세포 CSF 및 과립구 CSF와 같은 콜로니 자극 인자, 1L-L, 1L-1a, 1L-2, 1L 3, 1L-4, 1L-5, 1L-6, 1L-7, 1L-8, 1L-9, 1L-10, 1L-ll 및 1L-12와 같은 인터루킨, TNF-α 및 TNF-β와 같은 종양 괴사인자를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 또한 PD-L1/PD-1 항체, TGF-β 억제제, IL-10 억제제 및 Fas 리간드 억제제와 같은 면역 억제 표적을 살상하는 시약을 사용할 수 있다. 다른 하나의 그룹의 시약은 종양 또는 암 세포에 대한 면역 반응을 활성화시키는 시약, 예를 들면, T세포 활성화를 증가시키는 시약(예를 들면 CTLA-4, ICOS와 같은 T세포 공동 자극 분자 작용제), 및 수지상 세포 기능 및 항원 제시를 향상시킬 수 있는 시약이다.
이하 실시예는 본 발명을 더 잘 설명하기 위한 것이고, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해하여서는 아니된다. 하기 모든 특정 조성물, 재료 및 방법은 전체적으로 또는 부분적으로 본 발명의 범위 내에 있다. 이러한 특정 조성물, 재료 및 방법은 본 발명을 제한하려는 것이 아니라, 특정 실시형태가 본 발명의 범위 내에 있음을 설명하기 위한 것이다. 본 분야의 통상의 기술을 가진 자는 창조성을 첨가하지 않고 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 동등한 조성물, 재료 및 방법을 개발할 수 있다. 본 발명의 방법에 대한 다양한 수정은 여전히 본 발명의 범위 내에 포함될 수 있음을 이해하여야 한다. 발명자는 이러한 변경을 본 발명의 범위 내에 포함하고자 한다.
실시예1: 본 발명의 융합 단백질의 제조
본 실시예는 여러 가지 항 OX40 항체-인간 인터페론 융합 단백질의 설계 및 발현을 예시적으로 설명한다. 여기서 항 인간 OX40 활성화 항체의 중쇄 및 경쇄 서열은 중국 특허 201711476160.3의 MT01-C1 또는 MT01-C1(G2)로부터 유래되고, 여기서, "MT01-C1"은 UMY02-L1, UMY02-L2 및 UMY02-L3과 동일한 VH(SEQ ID NO: 7) 및 VL (SEQ ID NO: 8) 서열을 갖고, 중쇄 및 경쇄 불변 영역이 각각 인간 IgG1 및 κ사슬인 단일 클론 항체를 지칭한다. "MT01-C1(G2)"는 UMY02-L1, UMY02-L2 및 UMY02-L3과 동일한 VH(SEQ ID NO: 7) 및 VL(SEQ ID NO: 8) 서열을 갖고, 중쇄 및 경쇄 불변 영역이 각각 인간 IgG2 및 κ사슬인 단일 클론 항체를 지칭한다.
인터페론 IFNα2b 서열은 인간 인터페론 IFNα2b(NP_000596.2)로부터 유래되고 이의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 9에 표시된다.
예시적인 융합 단백질의 설계 구조는 도 1에 도시된 바와 같다. 여기서, "UMY02-L1"은 SEQ ID NO: 10으로 표시되는 중쇄, 펩타이드 링커 및 인간 인터페론, SEQ ID NO: 11로 표시되는 경쇄를 갖는 것을 지칭하고, 여기서 중쇄 카복시 말단에 펩타이드 링커를 통해 SEQ ID NO: 9로 표시되는 인간 인터페론 IFNα2b의 융합 단백질을 연결시킨다. "UMY02-L2"는 SEQ ID NO: 12로 표시되는 중쇄, SEQ ID NO: 13으로 표시되는 경쇄, 펩타이드 링커 및 인간 인터페론을 갖는 것을 지칭하고, 여기서 경쇄 카복시 말단에 펩타이드 링커를 통해 SEQ ID NO: 9로 표시되는 인간 인터페론 IFNα2b의 융합 단백질을 연결시킨다. "UMY02-L3"은 SEQ ID NO: 14로 표시되는 중쇄, SEQ ID NO: 13으로 표시되는 경쇄, 펩타이드 링커 및 인간 인터페론을 갖는 것을 지칭하고, 여기서 경쇄 카복시 말단에 펩타이드 링커를 통해 SEQ ID NO: 9로 표시되는 인간 인터페론 IFNα2b의 융합 단백질을 연결시킨다.
융합 단백질을 코딩하는 항체 중쇄 및 경쇄의 cDNA 서열을 각각 포유 동물 세포 발현 담체 pcDNA3.4에 클로닝한다. 중쇄 발현 플라스미드 및 경쇄 발현 플라스미드를 2: 1의 몰비로 Lipofectamine 2000 형질 감염 시약(Invitrogen)으로 HEK293 세포에 형질 감염시키고, 37℃, 5%의 이산화탄소 조건에서 7일 동안 배양한다. 배양액의 상등액을 수집하고, Protein A 친화성 크로마토그래피법으로 상등액의 항체를 정제한다. 정제된 항체를 PBS 용액으로 투석하고 동결 건조 및 농축한 후, -20℃에서 보관한다.
실시예2: ELISA 결합 실험
농도가 1μg/mL인 인간 OX40 단백질 용액을 100μL/웰로 96웰 고친화성 플레이트를 코팅하고, 4℃에서 하룻밤 진탕한다. 다음날, 먼저 300μL PBST(Tween20: 0.5‰)로 3번 세척한 후, 100μL/웰의 5% BSA/PBS로 2시간 동안 차단하고 실온에서 진탕한다. 300μL PBST로 3번 세척한다. PBS로 융합 단백질 샘플의 구배 희석 용액을 조제한다. 100μL/웰로 96웰 플레이트에 추가하고, 실온에서 1시간 동안 진탕한다. 300μL PBST로 3번 세척한다. 2차 항체 염소 항 인간 IgG HRP 용액을 조제하고, 100μL/웰로 96웰 플레이트에 추가하며, 실온에서 1시간 동안 진탕한다. 300μL PBST로 4번 세척한다. 100μL/웰 TMB를 추가하고 20min 동안 발색한다. 100μL/웰에 0.6N H2SO4를 추가하고 발색을 중지하며 OD450nm를 검출한다.
검출을 거쳐, 결과는 도 2에 도시된 바와 같고 융합 단백질UMY02-L1, UMY02-L2 및 UMY02-L3의 ELISA 결합 EC50은 각각 0.7626, 0.3948 및 0.3177μg/mL이며 OX40 항체 MT01-C1의 EC50(0.2977 μg/mL)에 해당한다(도 2).
실시예3: 인간, 필리핀 원숭이 및 마우스 OX40과의 결합(FACS)
인간, 필리핀 원숭이 또는 마우스 OX40 단백질을 코딩한 발현 플라스미드로 CHO 세포를 형질 감염시킨 후 48시간 동안 배양한다. PBS로 OX40 항체 MT01-L1 농도의 구배 용액을 조제하고, 최종 농도의 10Х 작업 용액으로 조제한다. CHO-hOX40 세포를 수집하고, PBS로 한 번 세척한 후 카운트하며, 2*106/ml의 세포 현탁액으로 희석하고; 각각 10μL OX40 항체 MT01-L1 작업 용액을 취하여 100μL 세포 현탁액에 추가하며 4℃에서 30min 동안 어두운 곳에서 배양하고; PBS로 2번 세척한 후, 2차 항체를 추가하며, 4℃에서 30min 동안 어두운 곳에서 배양하고, PBS로 한 번 세척한 후, 400μL FACS의 완충액으로 현탁시키며, 기계에서 검출한다. 도 3에 도시된 바와 같이, 결과는 MT01-L1이 인간 OX40(hsOX40)과 결합이 있는 것을 나타내고, EC50은 0.66μg/mL이다.
유사하게, 본원 발명의 발명자는 마우스 OX40을 발현하는 CHO 세포와의 항체의 결합을 검출하고, MT01-L1이 마우스 OX40(msOX40)과 결합이 없는 것을 발견하였다.
유사하게, 본원 발명의 발명자는 필리핀 원숭이 OX40을 발현하는 CHO 세포와의 결합을 검출하고, MT01-L1이 필리핀 원숭이 OX40(cyOX40)와 현저한 결합이 있는 것을 발견하였다.
실시예4: Daudi 세포 증식 억제 실험
Daudi 세포(ATCC)는 인터페론 수용체를 고도로 발현하므로 인터페론에는 생물학적 활성이 있다. Daudi 세포를 20000 세포/90μL/웰로 96웰 플레이트에 펴고, 측정할 샘플을 농도 구배 희석의 10Х 작업 용액으로 희석하며, 각각 10μL/웰로 96웰 플레이트에 추가하고, 37℃의 인큐베이터에 넣으며, 72시간 후 CCK8을 추가하여 OD450을 검출하고 각 웰의 세포의 증식 억제율을 계산한다. 상기 억제율은 샘플에서 인터페론의 활성을 반영한다. 실험 결과, Daudi 세포에 대한 융합 단백질 UMY02-L1, UMY02-L2 및 UMY02-L3의 증식 억제 활성(IC50)은 각각 9.549, 9.152 및 27.44pM(도 4)이다.
실시예5: FcR에 의해 매개된 OX40 신호 통로 활성화 실험
본원 발명의 발명자는 OX40 활성화제 검출을 위한 세포 실험 시스템을 구축한다. 구체적으로, 본원 발명의 발명자는 "Jurkat-OX40-NFκB-루시퍼라제 리포터 유전자" 안정된 형질 감염 세포주를 구축하고, OX40 활성화 항체를 상기 안정된 형질 감염 세포주 및 FcR을 과발현하는 HEK293 세포와 혼합시킨 후, NFκB-luciferase 리포터 유전자의 발현을 활성화시킬 수 있다.
PBS로 융합 단백질 농도 구배 용액을 조제하고, 최종 농도의 2Х작업 용액으로 조제하며, 얼음에서 작업한다. Jurkat-NFkB-luc-OX40 세포 및 FcR을 과발현하는 HEK293 세포를 수집하고, 원심 분리한 후 배지에 재현탁시키며, 384웰 플레이트에 편다. 384웰 플레이트에서, 융합 단백질 작업 용액 및 적정량의 세포 현탁액을 추가하고, 5시간 동안 배양한 후, One-Glo(Promega) 검출 시약을 추가하며, 혼합 후 Pherastar 자동 초점 형광 발광 기기 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 형광 신호를 검출한다.
도 5에 도시된 바와 같이, 검출을 거쳐, OX40 항체 MT01-C1, 융합 단백질 UMY02-L1, UMY02-L2 및 UMY02-L3이 상기 실험 시스템에서 NFκB-루시페라제 리포터 유전자를 활성화시키는 EC50은 각각 0.04523, 0.02437, 0.02837 및 0.02907ng/mL이다. 결과는, FcR에 의해 매개된 OX40의 활성화 활성 UMY02-L1, UMY02-L2 및 UMY02-L3은 MT01-C1보다 강한 것을 나타낸다.
실시예6: 인터페론 수용체에 의해 매개된 OX40 신호 통로 활성화 실험
"Jurkat-OX40-NFκB-루시퍼라제 리포터 유전자" 안정된 형질 감염 세포주를 10000개/웰로 384웰 플레이트에 편다. PBS로 융합 단백질 농도 구배 용액 또는 대조군 용액으로 조제하고, 최종 농도의 2Х작업 용액으로 조제하며, 얼음에서 작업한다. 384 웰 플레이트에서, 융합 단백질 작업 용액 및 적정량의 세포 현탁액을 추가하고, 5시간 동안 배양한 후, One-Glo(Promega) 검출 시약을 추가하며, 혼합 후 Pherastar 자동 초점 형광 발광 기기 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 형광 신호를 검출한다.
도 6a에 도시된 바와 같이, 시험에서 모든 항체 또는 인터페론의 최종 농도는 모두 10nM이다. OX40 항체 MT01-C1 또는 MT01-C1(G2)은 Jurkat 세포의 OX40 신호 통로를 활성화시키지 않고, 인터페론 IFNα2b를 단독으로 추가하거나 OX40 항체 MT01-C1 및 IFNα2b를 동시에 추가하면 대조군에 비해 단지 40% 미만의 활성화 작용이 있다. 그러나, 융합 단백질 UMY02-L1, UMY02-L2 또는 UMY02-L3을 추가한 후, Jurkat 세포의 OX40 신호 통로는 현저하게 활성화되고 활성화 정도는 단독적인 인터페론군보다 훨씬 크다(도 6b).
실시예7: C57BL/6 마우스 약물동태학적 실험
18마리의 6-8주령의 암컷 C57BL/6 마우스를 3개의 군, 매 군에 6마리로 나누고, 각각 UMY02-L1, UMY02-L3, MT01-C1을 정맥 주사 투여한다. 투여 조제량은 5mg/kg이다. UMY02-L1, UMY02-L3에 있어서, 투여 전, 투여 후의 1, 2, 6, 24, 48, 72, 96, 174, 220, 288 시간의 동물 외주 정맥 혈액을 수집하고; MT01-C1에 있어서, 투여 전, 투여 후의 1, 2, 6, 24, 48, 72, 96, 192, 312 시간의 동물 외주 정맥 혈액을 수집하며; 원심 분리하여 혈청을 수집한다. 매 하나의 시간점에서 3마리 동물의 혈청을 수집하고, 매 군의 6마리 동물에 대해 서로 다른 시간점에서 교대로 혈액 샘플을 수집한다.
농도가 1μg/mL인 인간 OX40 단백질 용액을 100μL/웰로 96웰 고친화성 플레이트를 코팅하고, 4℃에서 하룻밤 진탕한다. 다음날, 먼저 300μL PBST(Tween20: 0.5‰)로 3번 세척한 후, 100μL/웰의 5% BSA/PBS로 2시간 동안 차단하고 실온에서 진탕한다. 300μL PBST로 4번 세척한다. PBS로 측정할 혈청 샘플, 및 상이한 농도의 대조군 혈청 용액의 100배 희석 용액을 조제한다. 100μL/웰로 96웰 플레이트에 추가하고, 실온에서 1.5시간 동안 진탕한다. 300μL PBST로 4번 세척한다. MT01-C1에 있어서, 2차 항체 당나귀 항 인간 IgG HRP(Jackson ImmunoResearch, 제품 번호 709-035-149) 용액을 조제하고, 100μL/웰로 96웰 플레이트에 추가하며, 실온에서 1시간 동안 진탕한다. 300μL PBST로 4번 세척한다. 100μL/웰 TMB를 추가하고 20min 동안 발색한다. 100μL/웰에 0.6N H2SO4를 추가하고 발색을 중지하며 OD450nm를 검출한다. UMY02-L1, UMY02-L3에 있어서, 0.5μg/mL의 토끼 항 인간 IFN(abcam, 제품 번호 ab222552) 용액을 조제하고 100μL/웰로 96웰 플레이트에 추가하며 실온에서 1.5시간 동안 진탕한다. 300μL PBST로 4번 세척한다. 2차 항체 염소 항 토끼 IgG HRP(GenScript 생명 공학, 제품 번호 A00098) 용액을 조제하고, 100μL/웰로 96웰 플레이트에 추가하며, 실온에서 1시간 동안 진탕한다. 300μL PBST로 4번 세척한다. 100μL/웰 TMB를 추가하고 20min 동안 발색한다. 100μL/웰에 0.6N H2SO4를 추가하고 발색을 중지하며 OD450nm를 검출한다. 상이한 농도의 대조 제품 용액의 검출값과 대조 제품 농도에 대해 Logistic 4-파라미터 피팅을 수행하여 표준 그래프 회귀 방정식을 얻는다. 측정할 샘플의 검출값을 방정식에 대입하여 상이한 시간점의 혈청 약물 농도를 얻는다.
도 7a, 7b에 도시된 바와 같이, 시험에서 마우스에 5mg/kg의 UMY02-L3, UMY02-L1을 정맥 주사하고, 7일 투여 후, UMY02-L3의 혈청 약물 농도는 여전히 10μg/mL 이상이며, 12일 투여 후, UMY02-L1의 혈청 약물 농도는 여전히 10μg/mL 이상이다. 이는 융합 단백질 UMY02-L3, UMY02-L1이 마우스 체내에서 항체 약물 MT01-C1과 유사한 약물동태학적 특성을 갖고, IFNα2b의 2~3 시간의 반감기보다 크게 연장됨을 나타낸다(Merck 회사의 제품 Intron A의 제품 설명서 참조).
실시예8: 항체 융합 단백질 활성에 대한 항체 아형 및 펩타이드 링커 길이의 영향
OX40 활성화 항체와 인터페론 IFNα2b를 연결하는 펩타이드 링커 길이 및 항체 아형이 융합 단백질의 OX40 신호 통로 활성화 활성에 미치는 영향을 연구하기 위해, UMY02-L3의 기초 상에서, 상이한 길이의 펩타이드 링커 및 상이한 항체 아형을 함유하는 항체 융합 단백질을 구축한다(표 1 참조).
여기서, 융합 단백질 UMY02-L4, UMY02-L5 및 UMY02-L6의 중쇄는 SEQ ID NO: 14로 표시되고, 경쇄 및 인간 인터페론은 SEQ ID NO: 13의 경쇄 및 인간 인터페론으로 표시되며, 구별점은 단지 펩타이드 링커의 개수이고, 표 1에 나타낸 바와 같다.
여기서, 융합 단백질 UMY02-L7 및 UMY02-L8의 중쇄는 SEQ ID NO: 15로 표시되고, 경쇄 및 인간 인터페론은 SEQ ID NO: 13의 경쇄 및 인간 인터페론으로 표시되며, 구별점은 단지 펩타이드 링커의 개수이고, 표 1에 나타낸 바와 같다.
실시예4의 방법에 따라, 이러한 항체 융합 단백질이 Daudi 세포 증식에 미치는 영향을 검출한 결과, 상이한 펩타이드 링커 길이가 항체 융합 단백질의 인터페론 활성에 현저한 영향을 미치는 것으로 나타나고, 펩타이드 링커 길이가 짧을수록, 인터페론 활성은 낮다(표 1 참조).
실시예5의 방법을 사용하여 OX40 신호 통로에 대한 이러한 융합 단백질의 활성화 활성을 검출한다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 검출을 거쳐, OX40 항체 MT01-C1, 및 각 항체 융합 단백질은 모두 Jurkat-OX40 세포의 OX40 신호 통로를 효과적으로 활성화시킬 수 있다.
표 1: 인터페론 활성에 대한 항체 아형 및 linker 길이의 영향
명칭 항체 아형 펩타이드 링커 Daudi 세포 증식 실험 OX40신호 통로 활성화 활성
IC50(pM) 상대적 활성 EC50(nM) 상대적 활성
MT01-C1 IgG1 / / / 0.178 1
IFN α2b / / 0.7982 1
UMY02-L3 IgG1 (GGGGS)3 21.45 3.72E-02 0.179 0.99
UMY02-L4 IgG1 펩타이드 링커 없음 855.3 9.33E-04 0.28 0.64
UMY02-L5 IgG1 GGGGS 86.75 9.20E-03 0.302 0.59
UMY02-L6 IgG1 (GGGGS)2 53.20 1.50E-02 0.309 0.58
UMY02-L7 IgG4 GGGGS 1263.00 6.32E-04 0.497 0.36
UMY02-L8 IgG4 (GGGGS)2 259.10 3.08E-03 0.358 0.5
실시예9: OX40 항체와 상이한 IFNα2b 돌연변이 단백질의 융합
OX40 활성화 항체는 또한 인터페론 돌연변이체와 융합될 수 있다. 이러한 돌연변이의 인터페론은 야생형 인터페론보다 특이적 활성이 낮으므로 동일한 약물 농도에서 OX40 항체와 함께 시너지 작용을 발휘하는 동시에 과도한 인터페론 활성으로 인한 독성 부작용을 피할 수 있다.
본 실시예에서, HEK293 발현 시스템을 구축하고 일련의 OX40 항체-돌연변이 인터페론의 융합 단백질(표 2)을 발현하였다. 이러한 항체 융합 단백질에서, OX40의 항체 아형은 IgG4인 동시에, IFNα2b 부분은 모두 T106A 돌연변이를 가지고 있어 글리코실화된 부위를 제거한다.
여기서, 융합 단백질 UMY02-L13, UMY02-L14, UMY02-L15, UMY02-L16, UMY02-L17 및 UMY02-L18의 중쇄는 SEQ ID NO: 15로 표시되고, 경쇄 및 인간 인터페론은 SEQ ID NO: 13의 경쇄 및 인간 인터페론으로 표시되며, 구별점은 다음과 같다.
1. UMY02-L13, UMY02-L14, UMY02-L15, UMY02-L16, 및 UMY02-L18의 펩타이드 링커는 (GGGGS)2이고, UMY02-L17의 펩타이드 링커는 (GGGGS)3이다.
2. 융합 단백질 UMY02-L13, UMY02-L14, UMY02-L15, UMY02-L16, UMY02-L17 및 UMY02-L18의 인터페론은 SEQ ID NO: 9로 표시되는 기초 상에서 표 2에 나타낸 바와 같이 돌연변이된다.
실시예4의 방법에 따라, 이러한 항체 융합 단백질이 Daudi 세포 증식에 미치는 영향을 검출한 결과, 돌연변이의 항체 융합 단백질의 인터페론 활성은 야생형 IFNα2b보다 현저히 감소된 것으로 나타난다(표 2). 동시에 실시예5의 방법에 따라 Jurkat세포 OX40 신호 통로에 대한 이러한 항체 융합 단백질의 활성화 작용을 검출한 결과, 이러한 돌연변이의 항체 융합 단백질의 OX40 활성화 활성이 기본적으로 변하지 않았음을 나타낸다(표 2). 이 결과는 인터페론 서열에 특정된 돌연변이를 도입하여, 적합한 OX40 항체-IFN 융합 단백질을 얻을 수 있고, OX40 활성화 활성 및 인터페론 활성이 동일한 몰 농도에서 매칭되도록 확보하며 인체 내에서 양자의 기능을 협력하여 발휘하여, 그 중 하나의 활성이 너무 높거나 너무 낮아 치료 효과가 바람직하지 않거나 또는 심각한 부작용을 피한다.
표 2: 돌연변이된 항체 융합 단백질의 활성
Daudi 세포 증식 실험 OX40 신호 통로 활성화 활성
인터페론 돌연변이1 IC50 상대적 활성2 EC50(nM) 상대적 활성3
(pM)
MT01-C1 / / / 0.3251 1
IFNα2b wt 0.683 1 / /
UMY02-L13 T106A/A145D 28589 2.39E-05 0.4972 0.65
UMY02-L14 T106A/R149A 18110 3.77E-05 0.4634 0.7
UMY02-L15 T106A/R120A 1892 3.61E-04 / /
UMY02-L16 T106A/A145G 2069 3.30E-04 0.5661 0.57
UMY02-L17 T106A/R149A 16094 4.24E-05 0.4608 0.71
UMY02-L18 T106A/L117A 3318 2.06E-04 0.541 0.6
1. 돌연변이된 아미노산 위치 번호는 야생형 인간 인터페론 IFNα2b의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 9를 참조한다. 2. IFNα2b의 활성을 1로 정의한다.
3. OX40 단일 항체 MT01-C1의 활성을 1로 정의한다.
실시예10: 종양 세포에 대한 융합 단백질의 살상 작용
나아가, 발명자는 OX40 항체의 중쇄를 상이한 유형의 인터페론과 융합하여 상이한 융합 단백질을 제조하고, 여기서 OX40 IFN-α2a, OX40-IFNβ, OX40-IFNγ, OX40-IFNλ3의 중쇄는 SEQ ID NO: 15로 표시되고; OX40 IFN-α2a의 경쇄, 펩타이드 링커 및 인터페론은 SEQ ID NO: 16으로 표시되며; OX40 IFN-β의 경쇄, 펩타이드 링커 및 인터페론은 SEQ ID NO: 17로 표시되고; OX40 IFN-γ의 경쇄, 펩타이드 링커 및 인터페론은 SEQ ID NO: 18로 표시되며; OX40 IFN-λ3의 경쇄, 펩타이드 링커 및 인터페론은 SEQ ID NO: 19로 표시된다.
종양 세포에 대한 이러한 항체 융합 단백질의 살상 작용을 검출한다. 구체적으로, 발명자는 인간 유래 PBMCs와 난소암 SKOV3 세포를 20:1의 비율로 혼합 및 공동 배양하고, 각각 PBS(대조)를 투여하거나, 또는 0.1nM 농도의 OX40 단일 항체 MT01-C1 및 상이한 항체 융합 단백질(OX40 IFN-α2a, OX40-IFNβ, OX40-IFNγ, OX40-IFNλ3)로 자극하며, 37℃, 5% CO2 조건에서 48h 동안 배양한 후, CCK8 키트를 사용하여 SKOV3세포에 대한 PBMC 세포 독성 작용을 검출하고, 실험 결과는 도 8에 도시된 바와 같이, 자극이 없는 경우 PBMC는 SKOV3 세포 증식에 대한 억제 작용이 없음을 나타내며; OX40 단일 항체로 자극할 경우, SKOV3에 대한 PBMC의 억제율은 약 28%이고; 융합 단백질의 자극 하에서, PBMC의 세포 독성 작용은 모두 OX40 단일 자극보다 강하며, 여기서 OX40 단일 항체 MT01-C1-IFNα2a 및 OX40 단일 항체 MT01-C1-FN β는 현저히 향상되고, 억제율은 각각 60% 및 63%이다.
전술한 내용은 본 발명의 바람직한 실시예일 뿐, 본 발명에 어떠한 제한 작용도 하지 않는다. 본 기술분야에 속하는 어떠한 기술자가 본 발명의 기술적 해결수단을 벗어나지 않는 범위 내에서, 본 발명에 개시된 기술적 해결수단 및 기술적 내용에 대해 어떠한 형식의 동등한 대체 또는 수정 등 변경을 진행하여도 모두 본 발명의 기술적 해결수단을 벗어나지 않는 내용에 속하기에 여전히 본 발명의 보호범위 내에 속한다.
<110> NANJING UMAB-BIOPHARMA CO., LTD. <120> FUSION PROTEIN AND ITS APPLICATION IN PREPARING MEDICINE FOR TREATING TUMOR AND/OR VIRAL INFECTION <130> EIC19310016P <160> 19 <170> SIPOSequenceListing 1.0 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> artificial sequence <400> 1 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Val Met His 1 5 10 <210> 2 <211> 19 <212> PRT <213> artificial sequence <400> 2 Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly Lys Ala <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> artificial sequence <400> 3 Ala Asn Tyr Tyr Gly Ser Lys Phe Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> artificial sequence <400> 4 Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Ser 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> artificial sequence <400> 5 Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> artificial sequence <400> 6 Gln Gln Gly Ile Thr Leu Pro Trp Thr 1 5 <210> 7 <211> 119 <212> PRT <213> artificial sequence <400> 7 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Leu Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Gln Val Thr Ile Ser Ser Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Asn Tyr Tyr Gly Ser Lys Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 8 <211> 107 <212> PRT <213> artificial sequence <400> 8 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gly Ala Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ile Thr Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 9 <211> 165 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln 35 40 45 Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe 50 55 60 Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu 65 70 75 80 Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu 85 90 95 Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys 100 105 110 Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu 115 120 125 Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg 130 135 140 Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160 Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 10 <211> 629 <212> PRT <213> artificial sequence <400> 10 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Leu Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Gln Val Thr Ile Ser Ser Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Asn Tyr Tyr Gly Ser Lys Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 450 455 460 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met 465 470 475 480 Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp 485 490 495 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln 500 505 510 Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe 515 520 525 Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu 530 535 540 Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu 545 550 555 560 Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys 565 570 575 Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu 580 585 590 Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg 595 600 605 Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser 610 615 620 Leu Arg Ser Lys Glu 625 <210> 11 <211> 214 <212> PRT <213> artificial sequence <400> 11 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gly Ala Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ile Thr Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 12 <211> 445 <212> PRT <213> artificial sequence <400> 12 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Leu Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Gln Val Thr Ile Ser Ser Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Asn Tyr Tyr Gly Ser Lys Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu 210 215 220 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln 260 265 270 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu 290 295 300 Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320 Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350 Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 355 360 365 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 405 410 415 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 13 <211> 394 <212> PRT <213> artificial sequence <400> 13 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gly Ala Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ile Thr Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 210 215 220 Gly Gly Gly Gly Ser Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser 225 230 235 240 Arg Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe 245 250 255 Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe 260 265 270 Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met 275 280 285 Ile Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala 290 295 300 Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln 305 310 315 320 Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu 325 330 335 Thr Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe 340 345 350 Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala 355 360 365 Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr 370 375 380 Asn Leu Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu 385 390 <210> 14 <211> 449 <212> PRT <213> artificial sequence <400> 14 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Leu Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Gln Val Thr Ile Ser Ser Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Asn Tyr Tyr Gly Ser Lys Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 15 <211> 446 <212> PRT <213> artificial sequence <400> 15 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Leu Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Gln Val Thr Ile Ser Ser Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Asn Tyr Tyr Gly Ser Lys Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro 210 215 220 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 225 230 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 245 250 255 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 290 295 300 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320 Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 445 <210> 16 <211> 384 <212> PRT <213> artificial sequence <400> 16 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gly Ala Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ile Thr Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Cys Asp Leu Pro Gln 210 215 220 Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gln Met 225 230 235 240 Arg Lys Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly 245 250 255 Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile 260 265 270 Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr 275 280 285 Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr 290 295 300 Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln 305 310 315 320 Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu 325 330 335 Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys 340 345 350 Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg 355 360 365 Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu 370 375 380 <210> 17 <211> 385 <212> PRT <213> artificial sequence <400> 17 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gly Ala Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ile Thr Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Met Ser Tyr Asn Leu 210 215 220 Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln Cys Gln Lys Leu Leu 225 230 235 240 Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu Lys Asp Arg Met Asn 245 250 255 Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu 260 265 270 Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln Asn Ile Phe Ala Ile 275 280 285 Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile Val Glu 290 295 300 Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val 305 310 315 320 Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys Leu Met 325 330 335 Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile Leu His Tyr Leu 340 345 350 Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr Ile Val Arg Val Glu 355 360 365 Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly Tyr Leu Arg 370 375 380 Asn 385 <210> 18 <211> 362 <212> PRT <213> artificial sequence <400> 18 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gly Ala Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ile Thr Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gln Asp Pro Tyr Val 210 215 220 Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn Ala Gly His Ser Asp 225 230 235 240 Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile Leu Lys Asn Trp Lys 245 250 255 Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr 260 265 270 Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln Ser Ile Gln Lys Ser 275 280 285 Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys Phe Phe Asn Ser Asn 290 295 300 Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr Asn Tyr Ser Val Thr 305 310 315 320 Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu Leu Ile Gln Val Met 325 330 335 Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser Gln 340 345 350 Met Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala Ser Gln 355 360 <210> 19 <211> 394 <212> PRT <213> artificial sequence <400> 19 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gly Ala Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ile Thr Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Val Pro Val Ala Arg 210 215 220 Leu Arg Gly Ala Leu Pro Asp Ala Arg Gly Cys His Ile Ala Gln Phe 225 230 235 240 Lys Ser Leu Ser Pro Gln Glu Leu Gln Ala Phe Lys Arg Ala Lys Asp 245 250 255 Ala Leu Glu Glu Ser Leu Leu Leu Lys Asp Cys Lys Cys Arg Ser Arg 260 265 270 Leu Phe Pro Arg Thr Trp Asp Leu Arg Gln Leu Gln Val Arg Glu Arg 275 280 285 Pro Val Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr Leu Lys Val Leu Glu 290 295 300 Ala Thr Ala Asp Thr Asp Pro Ala Leu Gly Asp Val Leu Asp Gln Pro 305 310 315 320 Leu His Thr Leu His His Ile Leu Ser Gln Leu Arg Ala Cys Ile Gln 325 330 335 Pro Gln Pro Thr Ala Gly Pro Arg Thr Arg Gly Arg Leu His His Trp 340 345 350 Leu His Arg Leu Gln Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Pro Gly Cys Leu 355 360 365 Glu Ala Ser Val Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr Arg Asp Leu 370 375 380 Asn Cys Val Ala Ser Gly Asp Leu Cys Val 385 390

Claims (16)

  1. a)인간 OX40에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 세그먼트; 및
    b)인간 인터페론을 포함하는 융합 단백질에 있어서,
    상기 인간 인터페론은 직접적으로 또는 펩타이드 링커를 통해 상기 항체의 경쇄 또는 중쇄의 카복시 말단 또는 아미노 말단에 연결되는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 인간 OX40에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 세그먼트는,
    SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1, SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2, 및 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3을 포함하는 항체 중쇄 가변 영역; 및
    SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1, SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2, 및 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3을 포함하는 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 8로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 인간 OX40에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 세그먼트는 카멜화 단일 도메인 항체, scFv, scFv 이중체, BsFv, dsFv, dsFv2, dsFv-dsFv', Fv 세그먼트, Fab, Fab', F(ab')2, ds 이중 기능 항체, 나노 항체, 도메인 항체 또는 2가 도메인 항체인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체는 면역 글로불린의 불변 영역을 더 포함하되, 바람직하게, 상기 불변 영역은 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4의 불변 영역인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 인간 인터페론은 I형 인간 인터페론, II형 인간 인터페론 및 III형 인간 인터페론으로부터 선택되고;
    바람직하게, 상기 인간 인터페론은 IFNα2a, IFNβ, IFNγ, IFNλ3, IFNα2b이며;
    보다 바람직하게, 상기 인간 인터페론은 IFNα2b이고, 이의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 9로 표시되며;
    더 바람직하게, 상기 인간 인터페론은 IFNα2b의 돌연변이체이고, 이는 SEQ ID NO: 9로 표시되는 아미노산 서열에서,
    T106A, R149A, A145G, A145D, R120A, L117A로부터 선택되는 한가지 또는 여러 가지 돌연변이를 가지며;
    보다 더 바람직하게, 상기 IFNα2b의 돌연변이체는 SEQ ID NO: 9로 표시되는 아미노산 서열에서,
    T106A/A145D, T106A/R149A, T106A/A145G, T106A/R120A, T106A/L117A로부터 선택되는 이중 돌연변이를 갖는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  7. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 펩타이드 링커는 (G)n, KESGSVSSEQLAQFRSLD, EGKSSGSGSESKST, GSAGSAAGSGEF, (GGGGS)n, (GGSGG)n으로부터 선택되고; 바람직하게, 상기 펩타이드 링커는 (GGGGS)n이며, 여기서 n은 0-5 사이의 정수이고; 바람직하게, n은 1-3 사이의 정수인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 융합 단백질은,
    UMY02-L1, UMY02-L2, UMY02-L3, UMY02-L4, UMY02-L5, UMY02-L6, UMY02-L7, UMY02-L8, UMY02-L13, UMY02-L14, UMY02-L15, UMY02-L16, UMY02-L17, UMY02-L18, OX40 IFN-α2a, OX40-IFNβ, OX40-IFNγ, OX40-IFNλ3 중 한가지 또는 여러 가지로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  10. 제9항에 따른 분리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 담체.
  11. 제10항에 따른 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
  12. 제9항에 따른 분리된 폴리뉴클레오티드를 발현할 수 있는 조건에서 제11항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 발현하는 방법.
  13. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  14. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 약물 조성물.
  15. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질이 약물 제조에서의 용도에 있어서,
    상기 약물은 면역 반응을 향상시키거나 및/또는 인터페론에 노출시키면 유익할 수 있는 병세를 치료하기 위한 것으로서; 바람직하게, 상기 병세는 암 또는 바이러스 감염이고; 보다 바람직하게, 상기 바이러스 감염은 B형 간염 바이러스 감염인 것을 특징으로 하는 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질이 약물 제조에서의 용도.
  16. 면역 반응을 향상시키거나 및/또는 인터페론에 노출시키면 유익할 수 있는 병세를 치료하는 방법에 있어서,
    상기 방법은 치료적 유효량의 제1항 내지 제8항 중 임의의한 항에 따른 융합 단백질 또는 제14항에 따른 약물 조성물을 필요로 하는 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는데; 바람직하게, 상기 병세는 암 또는 바이러스 감염이고; 보다 바람직하게, 상기 바이러스 감염은 B형 간염 바이러스 감염인 것을 특징으로 하는 면역 반응을 향상시키거나 및/또는 인터페론에 노출시키면 유익할 수 있는 병세를 치료하는 방법.
KR1020217006850A 2018-09-04 2019-09-03 융합 단백질 및 그가 종양 및/또는 바이러스 감염을 치료하기 위한 약물 제조에서의 응용 KR20210056344A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811024783.1 2018-09-04
CN201811024783 2018-09-04
PCT/CN2019/104217 WO2020048454A1 (zh) 2018-09-04 2019-09-03 融合蛋白及其在制备用于治疗肿瘤和/或病毒感染的药物中的应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20210056344A true KR20210056344A (ko) 2021-05-18

Family

ID=69721450

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020217006850A KR20210056344A (ko) 2018-09-04 2019-09-03 융합 단백질 및 그가 종양 및/또는 바이러스 감염을 치료하기 위한 약물 제조에서의 응용

Country Status (6)

Country Link
EP (1) EP3848397A4 (ko)
JP (1) JP7404343B2 (ko)
KR (1) KR20210056344A (ko)
CN (1) CN112585169A (ko)
AU (1) AU2019336426A1 (ko)
WO (1) WO2020048454A1 (ko)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114966061B (zh) * 2022-07-28 2022-10-21 中国食品药品检定研究院 一种抗ox40抗体的生物活性检测方法
WO2024067785A1 (zh) * 2022-09-29 2024-04-04 中国科学院生物物理研究所 基于干扰素协同免疫检查点阻断抗体治疗慢性乙型肝炎

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
ATE207080T1 (de) 1991-11-25 2001-11-15 Enzon Inc Multivalente antigen-bindende proteine
DE69330523T4 (de) 1992-08-21 2012-08-23 Vrije Universiteit Brussel Immunoglobuline ohne leichte ketten
US6005079A (en) 1992-08-21 1999-12-21 Vrije Universiteit Brussels Immunoglobulins devoid of light chains
US6838254B1 (en) 1993-04-29 2005-01-04 Conopco, Inc. Production of antibodies or (functionalized) fragments thereof derived from heavy chain immunoglobulins of camelidae
WO2014028502A1 (en) * 2012-08-13 2014-02-20 ImmunGene Inc. Engineered antibody-interferon fusion molecules for treatment of autoimmune diseases
KR102639037B1 (ko) * 2014-10-29 2024-02-20 테바 파마슈티컬즈 오스트레일리아 피티와이 엘티디 인터페론 α2b 변이체
EP3411397A1 (en) * 2016-02-05 2018-12-12 Orionis Biosciences NV Cd8 binding agents
CN108218990B (zh) * 2017-12-29 2021-03-02 南京优迈生物科技有限公司 分离的抗体或其抗原结合片段及其在肿瘤治疗中的应用
US20210198375A1 (en) * 2018-09-04 2021-07-01 Nanjing Umab-Biopharma Co., Ltd. Fusion protein and its applicaton in preparing medicine for treating tumor and/or viral infection

Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Burgess JK, Carlin S, Pack RA, Arndt GM, Au WW, Johnson PR, Black JL, Hunt NH가 저술한 "Detection and characterization of OX40 ligand expression in human airway smooth muscle cells: a possible role in asthma?"의 타이틀을 가지는 자료로서, J Allergy Clin Immunol. 2004; 113: 683-9. doi: 10.1016/j.jaci.2003.12.311를 통해 발간된 자료.
Compaan DM, Hymowitz SG가 저술한 "The crystal structure of the costimulatory OX40-OX40L complex"의 타이틀을 가지는 자료로서, Structure. 2006; 14: 1321-30. doi: 10.1016/j.str.2006.06.015를 통해 발간된 자료.
Croft M가 저술한 "Control of immunity by the TNFR-related molecule OX40 （CD134）"의 타이틀을 가지는 자료로서, Annu Rev Immunol. 2010; 28: 57-78. doi: 10.1146/annurev-immunol-030409-101243를 통해 발간된 자료.
Imura A, Hori T, Imada K, Ishikawa T, Tanaka Y, Maeda M, Imamura S, Uchiyama T가 저술한 "The human OX40/gp34 system directly mediates adhesion of activated T cells to vascular endothelial cells"의 타이틀을 가지는 자료로서, J Exp Med. 1996; 183: 2185-95. doi:를 통해 발간된 자료.
Publicover J, Gaggar A, Jespersen JM, Halac U, Johnson AJ, Goodsell A, Avanesyan L, Nishimura SL, Holdorf M, Mansfield KG, Judge JB, Koshti A, Croft M, et al가 저술한 "An OX40/OX40L interaction directs successful immunity to hepatitis B virus"의 타이틀을 가지는 자료로서, Sci Transl Med. 2018; 10. doi: 10.1126/scitranslmed.aah5766를 통해 발간된 자료.
Rogers PR, Song J, Gramaglia I, Killeen N, Croft M가 저술한 "OX40 promotes Bcl-xL and Bcl-2 expression and is essential for long-term survival of CD4 T cells"의 타이틀을 가지는 자료로서, Immunity. 2001; 15: 445-55. doi:를 통해 발간된 자료.
So T, Song J, Sugie K, Altman A, Croft M가 저술한 "Signals from OX40 regulate nuclear factor of activated T cells c1 and T cell helper 2 lineage commitment"의 타이틀을 가지는 자료로서, Proc Natl Acad Sci U S A. 2006; 103: 3740-5. doi: 10.1073/pnas.0600205103를 통해 발간된 자료.
Song J, So T, Cheng M, Tang X, Croft M가 저술한 "Sustained survivin expression from OX40 costimulatory signals drives T cell clonal expansion의 타이틀을 가지는 자료로서, Immunity. 2005; 22: 621-31. doi: 10.1016/j.immuni.2005.03.012.를 통해 발간된 자료.
Song J, So T, Croft M가 저술한 "Activation of NF-kappaB1 by OX40 contributes to antigen-driven T cell expansion and survival"의 타이틀을 가지는 자료로서, J Immunol. 2008; 180: 7240-8. doi:를 통해 발간된 자료.
Willoughby J, Griffiths J, Tews I, Cragg MS가 저술한 "OX40: Structure and function - What questions remain?"의 타이틀을 가지는 자료로서, Mol Immunol. 2017; 83: 13-22. doi: 10.1016/j.molimm.2017.01.006를 통해 발간된 자료.

Also Published As

Publication number Publication date
AU2019336426A1 (en) 2021-04-29
JP2021536231A (ja) 2021-12-27
JP7404343B2 (ja) 2023-12-25
CN112585169A (zh) 2021-03-30
EP3848397A4 (en) 2022-07-20
WO2020048454A1 (zh) 2020-03-12
EP3848397A1 (en) 2021-07-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210269528A1 (en) Novel anti-pd-l1 antibodies
US10696745B2 (en) Anti-PD-L1 antibodies
JP2022161997A (ja) 新規抗ｐｄ－１抗体
JP7317858B2 (ja) 単離された抗体またはその抗原結合断片、および腫瘍治療におけるその使用
CN106432501B (zh) 新型抗pd-l1抗体
CN109563146A (zh) 包含tnf家族配体三聚体和pd1结合模块的抗原结合分子
CN106243225B (zh) 新型抗-pd-l1抗体
US20210198375A1 (en) Fusion protein and its applicaton in preparing medicine for treating tumor and/or viral infection
CN112714768A (zh) 新型抗cd39抗体
WO2020244526A1 (zh) 一种抗ceacam5的单克隆抗体及其制备方法和用途
CN113444180B (zh) 靶向axl蛋白的抗体及其抗原结合片段、其制备方法和应用
WO2022261846A1 (zh) 靶向axl蛋白的抗体及其抗原结合片段、其制备方法和应用
JP7404343B2 (ja) 融合タンパク質、並びに腫瘍及び／又はウイルス感染の治療薬を製造するためのその使用
WO2022116079A1 (zh) 一种抗ceacam5的人源化抗体及其制备方法和用途
CN116323671A (zh) 具有增加的选择性的多靶向性双特异性抗原结合分子
EP4130043A1 (en) Anti-human cd47 antibody and antigen-binding fragment thereof, and preparation method therefor and use thereof
CN114634577A (zh) 融合蛋白及其制备用于治疗肿瘤和病毒感染的药物的应用
TWI844684B (zh) 一種抗ceacam5的單殖株抗體及其製備方法和用途
JP7358367B2 (ja) 抗グリコｍｕｃ１抗体およびその使用
JP2024523436A (ja) Ａｘｌタンパク質を標的とする抗体及びその抗原結合断片、その調製方法と使用