KR20210054898A - 붓순나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 스쿠티카충 구제용 조성물 - Google Patents

붓순나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 스쿠티카충 구제용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 붓순나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 어류의 스쿠티카충 구제용 조성물 및 어류에 붓순나무 추출물을 투여하여 스쿠티카충을 구제하는 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 조성물 및 구제방법은 어류의 스쿠티카충의 구제 효과가 매우 우수하고, 경구 투여가 가능하여 양식업계에서 유용하게 활용될 수 있다.

Description

붓순나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 스쿠티카충 구제용 조성물{Composition for Exterminating Scutica in Fishes Containing Illicium anisatum Extract}
본 발명은 붓순나무 추출물을 함유하는 어류의 스쿠티카충 구제용 조성물에 관한 것으로, 더 상세하게는 붓순나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 어류의 스쿠티카충 구제용 조성물 및 어류에 붓순나무 추출물을 투여하여 스쿠티카충을 구제하는 방법에 관한 것이다.
유엔 보고서에 따르면 2050년에는 세계 인구가 70억 명에서 91억 명으로 기하급수적으로 증가할 것으로 전망되어 식량의 수요 또한 약 70% 이상 증가할 것이라고 전망되었다. 이러한 인구증가와 함께 세계 식량안보에 대한 관심이 급증하고 있으며, 최근에는 소득과 교육 수준 향상과 함께 식량 공급의 안정성 및 식품 안전성에 대한 의식이 급격히 증가하고 있다.
이러한 추세에 맞추어 우리나라 양식업도 급속히 발전되어 왔는데, 총 어업 생산량 중에서 양식업이 차지하는 비중은 2000년에 65만 3000t에서 2014년에 154만 7000t으로 137%가 증가하였으며, 그 중에서도 해산 어류의 양식 생산량이 지속적으로 증가하는 추세에 있다. 우리나라 주요 해산 양식 어종으로는 넙치, 조피볼락, 숭어, 참돔, 농어 등이 있는데, 어류를 양식하게 되면 자연 상태와는 달리 폐쇄된 환경에서 양식하게 되므로 양식환경에 따른 각종 질병이 발생하게 된다. 특히, 수질오염, 양식어장의 노화, 품종 열성화, 과밀 수육 등으로 인하여 다양한 질병이 발병하고 있으며, 이로 인한 양식어류의 폐사량이 매우 높아 양식어가 소득에 극심한 손실을 야기하고 있다. 양식어류에 감염하여 피해를 주는 대표적인 질병에는 스쿠티카병(scuticociliatosis)이 있다.
스쿠티카병은 어류의 외부기관(체표, 아가미)뿐만 아니라 내부기관(뇌, 신장, 비장, 척수)에 스쿠티카섬모충목(Scuticociliatida)에 속하는 스쿠티카충(scuticociliates)이 침입, 기생하여 발생하는 기생충성 질병이다. 스쿠티카충은 내부에 독특한 장치인 스쿠티카(scutica; 일시적으로 나타나는 고리 또는 채찍 모양의 기관)를 가지고 있어 다른 섬모충과는 쉽게 구별되나, 어체에 기생해 있는 스쿠티카충은 육안으로 관찰이 불가능하며 현미경(100배)으로 관찰할 수 있다. 스쿠티카충은 방추형 또는 오이씨 모양으로 충체의 전신에 섬모를 지니고 있어 활발하게 운동하고, 앞쪽 끝(다소 뾰족함)으로 어류 세포 사이를 파고들어 충체 중앙부에 있는 입으로 숙주세포를 갉아먹는다. 스쿠티카충에 감염되면 감염어의 표피가 박리되고 근육층이 노출되는 궤양증이 나타나며, 체표 염증, 지느러미 연조, 꼬리자루 노출, 두부손상(주둥이 출혈, 안구 백탁 및 돌출, 구강점막 울혈)과 같은 증상이 나타나고, 감염어를 해부하면 감염 부위에 따라 뇌조직의 액화성 괴사, 결합조직의 융해 및 괴사 증상이 나타나며, 종묘를 생산하는 종묘장에서는 이렇게 두부나 체표가 하얗게 변하면서 치어가 대량 폐사되는 경우가 많다. 스쿠티카병은 1990년대 초반에는 주로 사육 수온이 14~17℃로 유지되는 봄철, 종묘 생산장의 치어 체표에 궤양을 형성하는 것이 특징적이었다. 그런데 1990년도 중반부터는 겨울철에서부터 봄철에 걸쳐 발병 수온이 10~17℃로 확대될 뿐만 아니라, 치어에서 1년생 어류(10~25cm)에 이르기까지 더욱 더 넓어지는 경향이 두드러졌다. 한편, 1990년도 후반 이후부터는 수온에 상관없이 연중 발생하는 경향을 보이며 또한 감염 어종도 확대되는 현상이 두드러지고 있다.
2000년대 들어 스쿠티카병은 여전히 수온에 상관없이 연중 발생하며, 넙치의 모든 어군에 감염되고, 외부 증상이 매우 다양한 특징이 있다. 넙치 성어에 있어 감염증상은 선회를 동반한 주둥이 부위 충혈 또는 아무런 증상이 없이 선회와 발광하는 것이 특징이다. 이 경우 대부분의 병어는 뇌에서 다량의 스쿠티카충에 감염된 경우가 많다. 외부적으로 양식어류에서 체표가 거칠어지거나 궤양이 형성되고, 주둥이와 꼬리가 부식되는 현상이 관찰되거나 두부와 아가미 뚜껑이 붉어지는 것이 보이면 일단 스쿠티카충에 의한 것으로 의심해 볼 필요가 있다. 그리고 체표 점액, 아가미 점액 또는 뇌조직을 분리, 슬라이드 위에 두고 현미경(100배)으로 봤을 때 충체가 섬모를 휘두르면서 세포를 갉아먹는 듯이 보이면 스쿠티카충으로 확정 진단할 수 있다. 스쿠티카충은 어류의 크기나 수온에 관계없이 질병을 일으키며 체표에 감염된 경우는 포르말린으로 구제가 가능하나, 뇌를 비롯한 내부 장기에 기생하여 전신감염을 일으킬 때는 치료가 불가능한 실정이다.
스쿠티카충은 자연계 또는 자연상태에 서식하는 어류에 질병을 일으키지 않고 대부분이 양식 환경하에 있는 어류에 감염되어 피해를 주고 있다. 유럽 각국에서 보고된 바를 살펴보면 유로네마충(Uronema marinum, Uronema nigricans)에 의한 수족관 관상어의 산발적 피해 및 가두리 양식산 다랑어의 대량 폐사, 필라스테리데스충(Philasterides dicentrarchi)에 의한 육상수조 양식산 농어의 대량폐사, 미동정 스쿠티카충(scuticociliates)에 의한 육상수조 양식산 터봇의 대량폐사가 있다. 감염어종에는 터봇, 농어, 넙치, 능성어 등이 있는데, 터봇, 농어, 넙치에 병원성 강한 M. avidus(=P. dicentrarchi)에서 병원성 강한 Anophyroides haemophila, 그 외 U. nigricans, Mesanophrys carcini, Orchitophyra stellarum, Tetrahymena corlissi의 보고가 있다. 1990년대부터 대서양 연안의 터봇, 지중해 연안의 농어 양식장, 동아시아 및 유럽 지역에서 스쿠티카병이 발생하여 심각한 경제적 손실을 유발하였고, 일본에서는 염분농도가 낮은 지하 해수를 사용하는 육상 넙치 양식장에서 발생율이 높았다.
현재 넙치에 직접 투여해서 스쿠티카병을 구제하는 기술로는 케토코나졸의 [0008] 경구투여 구충제(대한민국 등록특허 제10-0379026호), 부틸알데하이드를 이용한 침지투여(약욕) 구충제(대한민국 등록특허 제10-0784917호), 4급 암모늄염 및 브로노폴을 유효성분으로 하는 침지투여 구충제(대한민국 등록특허 제10-1544049호)가 있으나, 2011년에 프랑스 건강제품위생안전청(AFSSAPS)은 케토코나졸(항진균제) 경구제의 심각한 간독성 유발로 인해 동 제제의 판매중단 및 회수를 결정하였고, 당시의 한국 식약처에서도 안전성 전반에 대한 종합 검토의 조치계획을 발표하였으며, 2013년에 동 제제의 경구용 제품에 대하여 판매중단 및 2등급 회수조치를 결정하는 등 많은 문제점이 보고되고 있다.
한편, 국내에서는 2005년 말라카이트 그린 사태를 계기로 양식넙치에서 스쿠티카병을 치료하는데 과거 효능 효과가 인정되어 상용하고 있었던 포르말린을 수산용 의약품으로 허가를 취득한 후 제도권 아래에서 사용할 필요성이 대두되면서, 국립수산과학원에서는 수산용 포르말린을 구충제로 개발하여 (구) 국립수의과학검역원으로부터 품목허가를 취득하게 지원하였고, 이 제품이 지금까지 유일한 스쿠티카충 구충제로 사용되고 있다. 그러나 포르말린은 1990년대부터 오랜 기간 넙치 양식장에서 사용되어져 왔으므로, 양식현장에서는 포르말린의 구충제로서의 효능성 감소 문제가 대두 되었고, 실제로 포항, 완도, 제주지역 등 양식 환경에 따라 수온(온도), 혼탁도, 어류 밀도가 특히 포르말린의 효능에 가장 직접적인 영향을 미친다는 사실을 확인하였다. 한편 넙치 스쿠티카충 구충제로 과산화수소를 유효성분으로 하는 수산용 제품(대한민국 등록특허 제10-1434553호)이 2015년에 최초로 품목허가를 받게 되었지만 이들 약욕의 스쿠티카충 구충제는 아가미나 체표 등 외부에 감염된 충을 구제하는데 효과적이나, 내부 장기에 감염된 충의 구제는 불가능하여 경구 투여용 구충제의 개발이 절실한 실정이다.
이러한 기술적 배경하에서, 본 발명자들은 스쿠티카충을 구제할 수 있는 안전성이 확보된 구충제 개발에 예의노력한 결과, 천연물질인 붓순나무 추출물이 스쿠티카충 구제 효과가 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
대한민국 등록특허 제10-0379026호 대한민국 등록특허 제10-1434553호
본 발명의 목적은 어류의 스쿠티카충을 구제하기 위한 신규한 조성물 및 사료를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 어류의 스쿠티카충을 구제 또는 예방하기 위한 신규한 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 붓순나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 어류의 스쿠티카충 구제용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 붓순나무 추출물을 포함하는 어류용 사료를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 조성물을 어류에 투여하는 단계를 포함하는 어류의 스쿠티카충을 구제하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 붓순나무 추출물을 첨가하여 양식수 내의 스쿠티카충을 사멸시키는 단계를 포함하는 스쿠티카병을 예방하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 조성물 및 구제방법은 어류의 스쿠티카충의 구제 효과가 매우 우수하고, 천연 추출물로서 어류에 부작용이 없이 안전하며, 경구 투여가 가능하여 양식업계에서 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 붓순나무 정유 투여에 따른 스쿠티카충 사멸효과를 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 2는 붓순나무 정유 투여에 따른 세포독성을 조사한 결과이다.
도 3은 붓순나무 추출물 경구투여에 따른 스쿠티카충에 대한 구제 효과 확인을 위한 in vivo 실험 결과이다.
도 4는 실험어의 아가미, 소화관, 신장, 간, 비장을 헤마톡실린-에오신(H＆E) 염색하여 붓순나무 추출물의 경구투여에 따른 조직 안정성을 확인한 결과이다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명자들은 어류의 스쿠티카충을 구제할 수 있는 천연성분 구충제를 개발하기 위하여, 다양한 식물 추출물을 조사한 결과, 붓순나무 추출물이 어류에 독성 없이 매우 낮은 농도에서 효과적으로 스쿠티카충에 대한 사멸 효과를 보임을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서 붓순나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 어류의 스쿠티카충 구제용 조성물에 관한 것이다.
붓순나무(llicium anisatum) 쌍떡잎식물 미나리아제비목 붓순나무과의 상록관목으로 일본과 대만에 주로 분포하며 우리나라에서는 제주도, 진도, 완도의 산지에서 자라는 식물이다. 다소 습기가 부족한 곳에서도 잘 자라지만 강한 햇볕을 받는 곳보다는 음지쪽을 선호하며 맹아력은 강하지만 생장은 느리고 이식이 잘 되지 않는 특징이 있다. Ilicium religiosum으로 불리기도 한다. 붓순나무의 잎에서는 동물이 기피하는 독특한 향이 나며, 독이 있다고 알려진 부위는 열매로, 소화기관, 신장 등에 심각한 염증을 유발하는 anisatin이 함유되어 있어 노약자나 어린이가 많이 섭취하면 위험 할수도 있으므로 섭취에 주의가 필요하다.
붓순나무 잎과 가지는 약재로도 사용하고 있으며, 효능은 이뇨작용을 촉진하고 통증을 줄여주며, 식욕을 촉진하고 소화기능을 보강하므로 위장병이나 소화불량, 치통, 피부염 등에 사용하는 것으로 알려져 있다.
본 발명에 있어서, 상기 추출물은 붓순나무 잎에서 추출한 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 추출물은 표 1에 기재된 성분을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 유칼립톨(Eucalyptol), 사프롤(Safrole), 리날로올(linalool) 및 미리스티신(Myristicin)을 주요성분으로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, "유효성분"이라 함은 내재된 약리작용에 의해 그 약품의 효능, 효과를 직접 또는 간접적으로 발현한다고 기대되는 물질 또는 물질군으로서 주성분을 포함하는 것을 의미한다.
본 발명의 붓순나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 어류의 스쿠티카충 구제용 조성물은 하나의 양태로서 약학제제일 수 있으며, 본 발명의 약학제제는 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 투여될 수 있다. 경구 투여 시에는 상기 유효성분 이외에 결합제, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학제제의 제형은 상술한 바와 같이 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있으며, 특히 경구 투여용 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 사료첨가제 조성에 관한 것이다. 본 발명의 사료첨가제 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서 붓순나무 잎이나 붓순나무 추출물 이외에 사료첨가제 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함한다.
본 발명의 사료 첨가제 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 오일 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 또 다른 관점에서 붓순나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 어류의 스쿠티카충 구제용 조성물을 어류에 투여하는 단계를 포함하는 어류의 스쿠티카충을 구제하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서, 상기 투여는 경구 투여인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
즉, 본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구 투여가 모두 가능하며, 본 발명에 따른 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 구강, 근육내, 복강내, 국소 투여가 가능하다. 이와 같은 임상 투여를 위해 본 발명의 조성물은 공지의 기술을 이용하여 적합한 제형으로 제제화할 수 있다. 예를 들어, 경구 투여를 위해서는 본 발명의 붓순나무 추출물을 사료에 흡착 또는 캡슐화할 수 있으며, 이는 어류에 약물 투여에 따른 스트레스를 최소화할 수 있다.
본 발명에서 붓순나무 추출물의 바람직한 투여 농도는 5ppm 이상 50ppm 이하일 수 있다. 이 경우, 5 ppm 이하에서는 스쿠티카충 구제 효과가 미비하고, 50 ppm 이상에서는 세포독성을 나타내기 때문에 그러하다. 본 발명의 일 양태로서, 붓순나무 추출물은 경구 투여 될 수 있으며, 경우 투여시의 농도는 5 ppm 이상 30 ppm 이하 일 수 있고, 바람직하게는 10 ppm 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 있어서, 상기 경구 투여는 1 내지 3회 투여하는 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 한편, 상기 붓순나무 추출물을 복수 회 투여하는 경우, 1 내지 3일 간격으로 투여하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 예를 들어, 상기 붓순나무 추출물을 10 내지 20 ppm 농도로 투여하는 경우, 체내 잔료 시간을 고려할 때 1 내지 2일 간격으로 투여하는 것이 바람직하고, 20 내지 30 ppm 농도로 투여하는 경우, 체내 잔류 시간을 고려할 때 2 내지 3일 간격으로 투여하는 것이 바람직하나, 이는 어류의 감염 정도 및 상태 등을 고려하여 당업자가 적절히 변경하여 실시할 수 있을 것이다.
본 발명에서 유효 투여량은 피처리 어류의 크기, 질량, 투여시간, 투여방법, 건강상태, 질병의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하며, 당해 기술분야의 통상의 전문가에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물 및 구제방법은 스쿠티카충의 구제를 위하여 단독으로, 또는 기타 약물치료 및 생물학적 반응조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
한편, 본 발명자들은 붓순나무 추출물이 저농도(10ppm)로 단시간에 스쿠티카충을 시험관 내(in vitro)에서 사멸시킨다는 것을 확인할 수 있었기 때문에, 양식수로서 채수하는 해수 내에 존재하는 스쿠티카충을 살충하고, 수조 내에서 스쿠티카병이 발생하는 것을 방지할 수 있으며, 수층 내에서 스쿠티카병에 걸린 어류로부터 건강한 어류에의 감염 확대도 방지할 수 있음을 알 수 있다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서 붓순나무 추출물을 첨가하여 양식수 내의 스쿠티카충을 사멸시키는 단계를 포함하는 스쿠티카병 예방방법을 제공한다.
상기 첨가되는 붓순나무 추출의 최종 농도는 5 내지 50 ppm일 수 있으며, 바람직하게는 5 내지 30 ppm일 수 있고, 더욱 바람직하게는 5 내지 10 ppm일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 스쿠티카충 구제용 조성물, 사료, 구제방법 또는 예방방법의 대상이 되는 어류는 스쿠티카병이 발병하는 어류이면 그 종류는 한정되지 않지만 특히 양식되는 경우가 많은 넙치, 조피볼락, 돔류, 능성어 등의 어류일 수 있다.
본 발명에 사용된 추출물은 붓순나무 잎에서 증류법을 이용하여 추출한 정유(essential oil)로 테르펜 계통의 모노테르펜(monoterpene)과 세스퀴테르펜(sesquiterpene) 성분들이 주요 구성 성분으로 포함된 추출물이다. 참고로, 정유는 기름상의 액체로 오일의 특성을 가지고 있어 비중이 물보다 낮은 특성을 가지고 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 재료 및 정유 추출
정유 추출을 위해 붓순나무(Illicium anisatum) 잎은 제주도의 태림조경을 통해서 구입하였다. 본 발명에서는 붓순나무 잎만 분리하여 증류법(hydrodistillation)으로 추출하였다. 10L 둥근바닥 플라스크에 1.5kg 붓순나무 잎을 넣고 7L 증류를 부은 후 101℃로 가열하여 휘발되는 성분을 냉각시켜 정유(essential oil)를 얻었다. 추출한 정유는 무수 Na2SO4(SAMCHUN,98.5%)로 수분을 제거하고 냉장보관하였다.
실시예 2. 정유의 성분 분석
붓순나무 잎 정유는 GC-MS(ISQ™ LT, ThermoScientific, USA)로 정성분석 하였으며, 분석조건은 다음과 같다.
분석을 위해 DB-5MS capillary column(30m x 0.25mm x 0.25μm; Thermoscientific, USA)을 사용하였으며, carrier gas는 He(1mL/min, 25psi)을 사용하고 시료 주입구는 250℃로 유지하였다. 오븐은 50℃에서 5분간 유지하였고, 10℃/min 로 65℃까지 승온한 뒤 30분간 유지하였다. 이후 5℃/min씩 120℃까지 승온 한 후 10분간 유지하였다. 연속하여 5℃/min 승온 조건 하에 210℃까지 온도를 올려 10분간 유지하고, 20℃/min 씩 325℃까지 승온하여 10분간 유지하였다.
검출된 화합물은 FID 신호와 질량스펙트럼 모두를 기록하였다. FID는 300℃ 조건하에 make-up 가스는 헬륨으로 40 mL/min을 유지하였다. 질량분석기의 인터페이스와 이온소스의 온도는 각각 250℃와 270℃로 유지하였고, 질량스펙트럼은 EI-스캔 범위 35∼550amu로 0.2 scans s-1의 속도로 획득하였다.
분석한 정유 내 물질들은 시료의 TIC(total-ion chromatogram)에서 S/N 비율이 100 이상인 피크들의 질량스펙트럼을 NIST 11(National Institute of Standards and Technology, USA) mass spectral library와 비교하여 match 값이 가장 높은 것을 선택하였다. 또한 정유 성분 확인을 위해 n-alkanes(C8~C20, Sigma-Aldrich)을 이용하여 KI(Kovats retention index)를 구하였다.
붓순나무 잎 정유의 구성성분
Retention time Constituent Cas(#) Area(%) KI
12.23 Prenol 556-82-1 0.28 766
13.67 Hexanal 66-25-1 0.03 800
17.37 2-Hexenal 6728-26-3 0.04 844
17.49 trans-3-Hexenol 544-12-7 0.08 845
25.30 Tricyclene 508-32-7 0.03 919
25.74 α-Thujene 2867-05-2 0.10 921
26.87 α-Pinene 80-56-8 1.65 928
29.52 Camphene 79-92-5 0.60 943
33.79 Sabinene 3387-41-5 0.92 968
34.74 β-Pinene 127-91-3 0.56 974
37.38 Myrcene 123-35-3 0.92 989
39.66 psi-Limonene 499-97-8 0.03 1005
39.98 α-Phellandrene 99-83-2 0.08 1008
41.35 α-Terpinene 99-86-5 0.83 1023
42.20 ο-Cymene 527-84-4 0.15 1033
42.72 D-Limonene 5989-27-5 1.35 1038
43.04 Eucalyptol 470-82-6 26.49 1042
43.44 α-Ocimene 6874-10-08 0.10 1046
44.39 β-Ocimene 13877-91-3 0.27 1057
45.36 γ-Terpinene 99-85-4 1.19 1067
47.38 Terpinolene 586-62-9 0.47 1089
48.34 Linalool 78-70-6 8.52 1100
50.03 trans-p-Menth-2-enol 29803-81-4 0.03 1122
51.72 Camphor 76-22-2 0.91 1145
52.33 β-Terpineol 7299-41-4 0.01 1153
54.32 4-Terpineol 562-74-3 2.62 1180
55.48 α-Terpineol 98-55-5 2.14 1195
57.98 Geraniol 106-24-1 0.04 1229
59.99 Nerol 106-25-2 0.18 1256
62.51 L-Bornyl acetate 5655-61-8 0.15 1290
62.87 Safrole 94-59-7 25.66 1295
65.79 α-Terpinyl acetate 80-26-2 1.86 1353
66.03 Eugenol 97-53-0 1.45 1358
66.20 Neryl acetate 141-12-8 0.08 1361
67.08 Geranyl acetate 16409-44-2 0.10 1380
67.33 Copaene 3856-25-5 0.13 1385
67.87 β-Elemene 515-13-9 0.17 1396
69.25 β-Caryophyllene 87-44-5 1.33 1433
69.60 α-Muurolene 483-75-0 0.03 1442
70.59 Humulene 6753-98-6 0.15 1469
70.77 Aromadendrene 25246-27-9 0.04 1474
71.09 δ-Cadinene 483-76-1 0.04 1483
71.18 γ-Muurolene 30021-74-0 0.08 1485
71.47 Germacrene D 23986-74-5 0.10 1493
71.73 Myristicin 607-91-0 6.42 1501
72.16 β-Cadinene 523-47-7 0.03 1515
붓순나무 잎 정유에는 표 1에서와 같이 약 50종의 성분들이 검출되었으며, eucalyptol 26.49%, safrole 25.55%, linalool 8.52%과 sesquiterpene 계열인 myristicin 6.42% 등이 확인되었다.
실시예 3. 붓순나무 정유의 항기생충 효과 분석
스쿠티카충에 감염된 개체 뇌에서 충을 분리하여 어류주화세포(CHSE-214)에 접종하고, 1% antibiotics(Gibco)와 10% FBS(Gibco)를 첨가한 MEM(Minimium essential media, Welgene) 배지를 이용하여 20℃ 인큐베이터에서 배양하였다. 3~4일 정도 배양하여 완전히 증식한 스쿠티카충은 3000g, 4℃에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 제거하여 스쿠티카충을 분리하였고, 96well에 1×105/well로 스쿠티카충을 분주해서 실험에 사용하였다. 배양된 스쿠티카충에 붓순나무 정유를 농도별로 첨가하여 20℃ 배양기에서 10분, 20분, 30분, 1시간, 2시간 3시간 간격으로 살충여부(충체의 사멸정도, 움직임, 세포질 파괴정도)를 관찰하였다.
그 결과는 표 2와 같은데, 붓순나무 정유를 농도별로 투여시 농도에 따라서 스쿠티카충 사멸효과가 높게 나타났다. 현재 수산용 구충제 중 스쿠티카충 치료제로 사용중인 포르말린 (권장농도 100~200ppm)보다도 최대 20배 높은 효능을 보이는 10ppm에서 추출물 투여 30분 이후 사멸해 항기생충 효능이 아주 높은 것으로 나타났으며, 5ppm의 추출물 투여시에도 2시간 경과 후 50% 기생충 사멸 효과를 나타내었다.
붓순나무 정유 투여농도에 따른 항기생충 효과 (단위 : ppm)
처리시간 대조구 1 2 5 10 100 1000 10000
10min 100% 100% 100% 100% 80% 사멸 사멸 사멸
30min 100% 100% 100% 80% 10% 사멸 사멸 사멸
1h 100% 100% 100% 60% 사멸 사멸 사멸 사멸
2h 100% 100% 100% 50% 사멸 사멸 사멸 사멸
3h 100% 100% 100% 50% 사멸 사멸 사멸 사멸
4h 100% 100% 100% 50% 사멸 사멸 사멸 사멸
실시예 4. 세포독성효과 조사
붓순나무 정유를 어류의 항기생충 용도로 활용하기 위해서는 어류 세포에 독성을 나타내지 않아야 한다. 따라서 붓순나무 정유의 독성을 어류주화세포(CHSE-214)를 이용하여 측정하였다. 1×105/well의 세포를 20℃에서 약 80% density가 되도록 약 48시간 배양한 후, 붓순나무 정유를 0 ~ 1000ppm까지 농도별로 처리하였다. 96시간 동안 인큐베이션 후에 세포독성 측정약물(CCK-8, Dojindo)을 처리하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 2에서와 같이 붓순나무 정유 43.63ppm 이하에서는 80% 이상 세포가 생존하는 것으로 나타나 이 농도 이하에서는 세포독성에 영향이 없음이 나타났다. 특히, 항기생충 높은 효력을 보인 10ppm에서 100% 이상의 세포가 생존하였으며, 붓순나무 추출물의 항기생충 효능평가를 위한 유의적인 값으로 나타나 향후 스쿠티카충 구제제로 활용가능성이 높을 것이라 판단된다.
실시예 5. 붓순나무 정유 주요 구성성분의 항기생충 효과 분석
붓순나무 잎 정유에서 존재하는 주요 성분은 앞서 Eucalyptol>Safrole>Linalool> Myristicin으로 나타났다. 이 물질 중 항기생충 효능을 나타내는 물질을 확인하기 위해 각 주요 성분을 농도별로 투여하여 스쿠티카충에 대한 사멸효과를 조사하였다. 실험방법은 실시예 3과 동일한 방법으로 진행하였다.
그 결과, 표 3에서와 같이 Linalool에서 항기생충 효능이 100ppm에서 효능을 나타내었고, Eucalytol은 500ppm에서 나머지 2종은 1000ppm에서 효능이 나타나, Linalool이 붓순나무의 항기생충 효능에서 가장 중요한 성분인 것으로 확인되었다.
Linalool의 농도별 투여에 따른 항기생충 효과 (단위 : ppm)
시간 대조구 0.1 0.2 0.5 1 10 20 50 100 500 1000 10000
10
min		 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 80% 30% 20% 10%
30
min		 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 20% 사멸 사멸 사멸
1h 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 사멸 사멸 사멸 사멸
2h 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 사멸 사멸 사멸 사멸
3h 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 사멸 사멸 사멸 사멸
4h 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 사멸 사멸 사멸 사멸
실시예 6. 붓순나무 추출물 경구투여에 따른 스쿠티카충에 대한 구제효과 실험
질병에 걸리지 않은 건강한 넙치를 경북 포항지역 넙치 양식장에서 구입하여, 해수유수식 육상수조에서 수온 21±1℃로 2주 동안 순치 후 실험어로 사용하였다. 실험어를 5마리씩 두 그룹으로 분류하고 국립수산과학원 병리연구과에서 보존 중인 스쿠티카충을 1*105cell/fish로 인위감염 시킨 후 1일 및 2일째 10ppm 농도로 사료환에 첨가하여 어류 마취 후 총 2회 경구투여 하였다. 이를 위하여 배합 분말사료에 반죽하여 사료환(약 0.25g)으로 제작 후, 어류 kg 당 10ug/ml이 섭취될 수 있도록 사료에 붓순나무 정유를 첨가하고, 한번 더 붓순나무 추출물이 새어 나오지 않도록 사료반죽으로 코팅하였다. 대조구에는 붓순나무 추출물이 첨가되지 않은 동일 방법으로 제작된 사료환을 어류 마취 후 경구 투여하였다.
그 결과 스쿠티카충으로 인위감염 실험을 실시한 대조구에서는 감염후 4일째부터 폐사하기 시작해서 일주일안에 모두 폐사가 발생하였으나, 붓순나무 추출물 투여구에서는 감염 후 일주일 동안 전혀 폐사가 발생하지 않았다.
실시예 7. 붓순나무 추출물 경구투여에 따른 안전성 조사
붓순나무 추출물을 10ppm, 100ppm으로 첨가된 사료환 또는 대조구를 실시예 6에서와 동일한 방법으로 경구 투여하고, 이에 따른 안전성을 평가하기 위해 1주일 경과 후 내부장기의 병리조직학 분석을 진행하였다. 병리조직학 분석은 실험어의 아가미, 소화관, 신장, 간, 비장을 10%의 중성 포르말린에 고정 후, 탈수, 파라핀 포매과정을 수행하고, 자른 조직에 헤마톡실린-에오신(H＆E) 염색하여 조직을 검경하였다.
병리조직 검경 결과, 대조구에서는 병리조직학적인 변화가 관찰되지 않았고, 10ppm 처리구에서도 대조구와 비교하여 유의적 변화가 나타나지 않았으나, 100ppm 처리구에서는 아가미에서 이차세엽 상피가 위축되었고, 간에서는 간세포가 약하기 위축되었으며, 비장에서는 비장내 백혈구계 세포가 약하게 증가되어 면역자극을 하는 것으로 확인되었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (10)

  1. 붓순나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 어류의 스쿠티카충 구제용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 추출물은 붓순나무 잎에서 추출한 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 어류는 넙치, 조피볼락, 돔류 및 능성어의 어류로 구성된 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 붓순나무 추출물을 포함하는 어류용 사료.
  5. 제4항에 있어서, 상기 어류는 넙치, 조피볼락, 돔류 및 능성어의 어류로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 사료.
  6. 제1항의 조성물을 어류에 투여하는 단계를 포함하는 어류의 스쿠티카충을 구제하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 투여는 경구 투여인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 경구 투여는 붓순나무 추출물을 5 내지 30 ppm으로 1 내지 3회 투여하는 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 추출물을 1 내지 3일 간격으로 투여하는 방법.
  10. 붓순나무 추출물을 첨가하여 양식수 내의 스쿠티카충을 사멸시키는 단계를 포함하는 어류의 스쿠티카병을 예방하는 방법.
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