KR20210051508A - Screening Method of Therapeutic Stem Cells for the Treatment of Neurological Disorders Using 3-Dimensional Brain Organoid - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 뇌신경계질환 치료용 줄기세포 스크리닝 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 3차원 뇌 오가노이드(organoid)를 이용하여 뇌신경계질환 치료에 유효한 줄기세포를 스크리닝 하는 방법 등에 관한 것이다.The present invention relates to a method for screening stem cells for the treatment of cranial nervous system diseases, and more specifically, to a method of screening stem cells effective for treating cranial nerve diseases by using a three-dimensional brain organoid.
최근 개발되고 있는 줄기세포 기술 중, 줄기세포를 특정 세포로 분화시킬뿐 아니라, 특정 세포로 분화하는 과정에서 3D 상태로 분화를 유도하였을 때, 신체 장기와 유사한 모양의 구조를 갖는 3D 상태의 오가노이드(Organoid; 유사장기) 구조체를 만들 수 있다고 밝혀지고 있으며, 이러한 발견들을 바탕으로, 현재까지 뇌 오가노이드(brain organoid), 심장 오가노이드(heart organoid), 간 오가노이드(liver organoid), 폐 오가노이드(lung organoid), 소장 오가노이드(small intestine organoid) 등 다양한 미니 오가노이드가 제작될 수 있다는 결과들이 보고되었다. 이러한 유사장기, 즉 오가노이드의 개발은 생체 내와 가까운 3D 환경의 조성을 보임으로서, 기존에 보여질수 없던 '몸 밖'의 실험 상황에서도 약물이 마치 '몸 안'에서 작용하듯이 실험할 수 있을뿐만 아니라, 실제 사람의 장기에서 나타나는 효과를 그대로 재현할 수 있다는 장점이 있다.Among the stem cell technologies being developed recently, when not only differentiates stem cells into specific cells, but also induces differentiation into a 3D state in the process of differentiating into a specific cell, an organoid in a 3D state that has a structure similar to that of body organs. (Organoid; pseudo-organ) structure, and based on these findings, to date, brain organoid, heart organoid, liver organoid, lung organoid (lung organoid), small intestine organoid (small intestine organoid), and various mini-organoids can be produced has been reported. The development of these pseudo-organs, that is, organoids, shows the creation of a 3D environment close to the in vivo, so that drugs can be tested as if they were acting in the'inside' even in the'outside' experimental situation that could not be seen before. Rather, it has the advantage of being able to reproduce the effects that appear in real human organs as it is.
한편, 알츠하이머병, 파킨슨병, 뇌경색, 뇌출혈, 척수손상 등의 뇌신경계질환 치료에 있어서, 신경세포의 재생을 통한 새로운 치료 후보물질이 다양하게 등장되어 왔으며, 이러한 해결책으로는 배아줄기세포 및 만능성 줄기세포 등을 이용하여 환자 특이적 치료용 세포를 만들어 투여함으로써 뇌신경계질환을 치료하는 여러 가지 방법이 대두되어 왔다. 그러나 이와 같은 줄기세포치료가 아직 보편화되지 못한 주 이유는 공여 줄기세포별로 치료효능이 동일하지 않아 치료결과에 차이를 보이는 경우가 발생하기 때문이다. 하지만 치료 효능을 예측할 수 있는 줄기세포를 선별할 수 있는 평가 시스템은 개발된 것이 전무하며, 이 부분에 대한 연구도 상대적으로 미흡한 실정이다.On the other hand, in the treatment of cranial nervous system diseases such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, cerebral infarction, cerebral hemorrhage, and spinal cord injury, a variety of new therapeutic candidates have appeared through the regeneration of nerve cells, and such solutions include embryonic stem cells and pluripotency. Various methods for treating cranial nervous system diseases have emerged by creating and administering cells for patient-specific treatment using stem cells or the like. However, the main reason stem cell therapy has not yet become common is that there are cases in which the treatment results are different because the treatment efficacy is not the same for each donor stem cell. However, no evaluation system has been developed to select stem cells that can predict treatment efficacy, and research on this part is relatively insufficient.
본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 하기의 단계를 포함하는, 뇌신경계질환 치료용 줄기세포 스크리닝 방법을 제공하는 것이다:The present invention has been conceived to solve the above-described problems, and an object of the present invention is to provide a stem cell screening method for treating cranial and nervous system diseases, comprising the following steps:
(a) 인간 역분화줄기세포를 이용하여 3차원 뇌 오가노이드(3-Dimensional brain organoid)를 제작하는 단계;(a) preparing a 3-Dimensional brain organoid using human dedifferentiated stem cells;
(b) 상기 뇌 오가노이드에 아밀로이드 베타 올리고머(Amyloid β oligomers)와 후보 줄기세포를 동시에 처리하여 배양하는 단계; 및(b) treating and culturing the brain organoids with amyloid beta oligomers and candidate stem cells at the same time; And
(c) 상기 후보 줄기세포 중에서 치료 효과가 있는 줄기세포를 선택하는 단계.(c) selecting a stem cell having a therapeutic effect from among the candidate stem cells.
본 발명의 다른 목적은 하기의 단계를 포함하는, 뇌신경계질환 치료용 줄기세포 스크리닝 방법을 제공하는 것이다:Another object of the present invention is to provide a method for screening stem cells for treatment of cranial and nervous system diseases, comprising the following steps:
(a) 인간 역분화줄기세포를 이용하여 3차원 뇌 오가노이드를 제작하는 단계;(a) preparing a three-dimensional brain organoid using human dedifferentiated stem cells;
(b) 상기 뇌 오가노이드를 배양하는 단계;(b) culturing the brain organoids;
(c) 상기 뇌 오가노이드에 아밀로이드 베타 올리고머(Amyloid β oligomers)와 후보 줄기세포를 동시에 처리하여 배양하는 단계; 및(c) treating and culturing the brain organoids with amyloid beta oligomers and candidate stem cells at the same time; And
(d) 상기 후보 줄기세포 중에서 치료 효과가 있는 줄기세포를 선택하는 단계.(d) selecting a stem cell having a therapeutic effect from among the candidate stem cells.
본 발명의 또 다른 목적은 하기의 단계를 포함하는, 뇌신경계질환 치료용 줄기세포 스크리닝 방법을 제공하는 것이다:Another object of the present invention is to provide a method for screening stem cells for treatment of cranial and nervous system diseases, comprising the following steps:
(a) 인간 역분화줄기세포를 이용하여 3차원 뇌 오가노이드를 제작하는 단계;(a) preparing a three-dimensional brain organoid using human dedifferentiated stem cells;
(b) 상기 뇌 오가노이드를 배양하는 단계;(b) culturing the brain organoids;
(c) 상기 뇌 오가노이드에 아밀로이드 베타 올리고머(Amyloid β oligomers)와 후보 줄기세포를 동시에 처리하여 배양하는 단계;(c) treating and culturing the brain organoids with amyloid beta oligomers and candidate stem cells at the same time;
(d) 상기 후보 줄기세포 중에서 치료 효과가 있는 줄기세포를 선택하는 단계; 및(d) selecting stem cells having a therapeutic effect from among the candidate stem cells; And
(e) 상기 선택된 줄기세포들을 뇌신경계질환 모델 동물에 처리하여 치료 효과를 비교 확인하는 단계.(e) comparing the treatment effect by treating the selected stem cells to a cranial nerve disease model animal.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the technical task to be achieved by the present invention is not limited to the above-mentioned tasks, and other tasks that are not mentioned can be clearly understood by those of ordinary skill in the technical field to which the present invention belongs from the following description. will be.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 뇌신경계질환 치료용 줄기세포 스크리닝 방법을 제공한다:In order to achieve the object of the present invention as described above, the present invention provides a stem cell screening method for the treatment of neurological disorders, including the following steps:
(a) 인간 역분화줄기세포를 이용하여 3차원 뇌 오가노이드(3-Dimensional brain organoid)를 제작하는 단계;(a) preparing a 3-Dimensional brain organoid using human dedifferentiated stem cells;
(b) 상기 뇌 오가노이드에 아밀로이드 베타 올리고머(Amyloid β oligomers)와 후보 줄기세포를 동시에 처리하여 배양하는 단계; 및(b) treating and culturing the brain organoids with amyloid beta oligomers and candidate stem cells at the same time; And
(c) 상기 후보 줄기세포 중에서 치료 효과가 있는 줄기세포를 선택하는 단계.(c) selecting a stem cell having a therapeutic effect from among the candidate stem cells.
본 발명의 일 구체예로, 상기 (a) 단계의 3차원 뇌 오가노이드는 9 × 103개 내지 1 × 104개의 인간 역분화줄기세포를 이용하여 제작될 수 있다.In one embodiment of the present invention, the three-dimensional brain organoid of step (a) may be prepared using 9×10 3 to 1×10 4 human dedifferentiated stem cells.
본 발명의 다른 구체예로, 상기 (b) 단계의 아밀로이드 베타 올리고머는 8 내지 12 μM의 농도로 2 내지 4일 동안 처리될 수 있으며, 바람직하게는 10 μM의 농도로 3일 동안 처리될 수 있다.In another embodiment of the present invention, the amyloid beta oligomer of step (b) may be treated at a concentration of 8 to 12 μM for 2 to 4 days, preferably at a concentration of 10 μM for 3 days. .
본 발명의 또 다른 구체예로, 상기 (b) 단계의 후보 줄기세포는 1 × 104개 내지 5 × 104개의 의 세포를 상기 뇌 오가노이드와 공동배양(co-culture)할 수 있다.In another embodiment of the present invention, the candidate stem cells of the step (b) may be co-cultured with the brain organoids of 1 × 10 4 to 5 × 10 4 cells.
본 발명의 또 다른 구체예로, 상기 (b) 단계의 후보 줄기세포는 각기 다른 공여자로부터 유래한 것이거나, 동일한 공여자의 각기 다른 종류의 조직으로부터 유래한 것일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the candidate stem cells in step (b) may be derived from different donors or may be derived from different types of tissues of the same donor.
본 발명의 또 다른 구체예로, 상기 (c) 단계는 신경세포의 사멸이 가장 적게 일어난 군, 튜불린-베타(tubulin-beta) III의 발현이 가장 적게 감소한 군, 또는 네스틴(nestin)의 발현이 가장 적게 감소한 군의 줄기세포를 선택하는 것일 수 있다.In another embodiment of the present invention, in the step (c), the group in which the death of neurons occurs the least, the group in which the expression of tubulin-beta III is the least decreased, or the nestin It may be to select the stem cells of the group with the least decreased expression.
본 발명의 다른 구체예로, 상기 뇌신경계질환은 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 헌팅턴병(Huntington's disease), 근위축성측삭경화증(Amyotrophic lateral sclerosis), 바텐병(Batten disease), 뇌경색, 뇌출혈, 및 척수손상으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the cranial nervous system disease is Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease, Amyotrophic lateral sclerosis, Batten disease, It may be one or more selected from the group consisting of cerebral infarction, cerebral hemorrhage, and spinal cord injury.
본 발명은 또한, 하기의 단계를 포함하는, 뇌신경계질환 치료용 줄기세포 스크리닝 방법을 제공한다:The present invention also provides a stem cell screening method for the treatment of cranial and nervous system diseases, comprising the following steps:
(a) 인간 역분화줄기세포를 이용하여 3차원 뇌 오가노이드를 제작하는 단계;(a) preparing a three-dimensional brain organoid using human dedifferentiated stem cells;
(b) 상기 뇌 오가노이드를 배양하는 단계;(b) culturing the brain organoids;
(c) 상기 뇌 오가노이드에 아밀로이드 베타 올리고머(Amyloid β oligomers)와 후보 줄기세포를 동시에 처리하여 배양하는 단계; 및(c) treating and culturing the brain organoids with amyloid beta oligomers and candidate stem cells at the same time; And
(d) 상기 후보 줄기세포 중에서 치료 효과가 있는 줄기세포를 선택하는 단계.(d) selecting a stem cell having a therapeutic effect from among the candidate stem cells.
본 발명의 일 구체예로, 상기 (b) 단계의 배양은 mTeSR1, N2 보충제(supplement), 및 MEM NEAA(Non-Essential Amino Acid)가 포함된 배지에서 배양될 수 있으며, 바람직하게는 mTeSR1, N2 보충제(supplement), MEM NEAA 및 헤파린(heparin)이 포함된 배지에서 배양될 수 있다.In one embodiment of the present invention, the culture of step (b) may be cultured in a medium containing mTeSR1, N2 supplement, and MEM NEAA (Non-Essential Amino Acid), preferably mTeSR1, N2 It can be cultured in a medium containing supplements, MEM NEAA and heparin.
본 발명의 다른 구체예로, 상기 (b) 단계의 배양은 30일 내지 50일 동안 이루어질 수 있으며, 바람직하게는 30일 내지 40일 동안 이루어질 수 있다.In another embodiment of the present invention, the cultivation of step (b) may be performed for 30 to 50 days, and preferably may be performed for 30 to 40 days.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 뇌신경계질환 치료용 줄기세포 스크리닝 방법을 제공한다:In addition, the present invention provides a stem cell screening method for the treatment of cranial and nervous system diseases, comprising the following steps:
(a) 인간 역분화줄기세포를 이용하여 3차원 뇌 오가노이드를 제작하는 단계;(a) preparing a three-dimensional brain organoid using human dedifferentiated stem cells;
(b) 상기 뇌 오가노이드를 배양하는 단계;(b) culturing the brain organoids;
(c) 상기 뇌 오가노이드에 아밀로이드 베타 올리고머(Amyloid βoligomers)와 후보 줄기세포를 동시에 처리하여 배양하는 단계;(c) treating and culturing the brain organoids with amyloid beta oligomers and candidate stem cells at the same time;
(d) 상기 후보 줄기세포 중에서 치료 효과가 있는 줄기세포를 선택하는 단계; 및(d) selecting stem cells having a therapeutic effect from among the candidate stem cells; And
(e) 상기 선택된 줄기세포들을 뇌신경계질환 모델 동물에 처리하여 치료 효과를 비교 확인하는 단계.(e) comparing the treatment effect by treating the selected stem cells to a cranial nerve disease model animal.
본 발명의 일 구체예로, 본 발명에 따른 줄기세포 스크리닝 방법은, 상기 (d) 단계 및 (e) 단계 모두에서 다른 후보 줄기세포와 비교하여 치료 효과가 더 높은 줄기세포를 최종 선택하는 단계를 더 포함할 수 있다.In one embodiment of the present invention, the stem cell screening method according to the present invention comprises the step of finally selecting a stem cell having a higher therapeutic effect compared to other candidate stem cells in both steps (d) and (e). It may contain more.
본 발명에 따른 줄기세포 스크리닝 방법을 이용하는 경우, in vitro 상에서 뇌신경계질환의 치료에 실질적으로 유효한 줄기세포를 효과적으로 선별함으로써, 뇌신경계질환 환자에 대한 줄기세포치료 효과를 극대화할 수 있다. 뿐만 아니라, 기존의 검증 없이 블라인드로 줄기세포 치료를 적용하였던 방식과 비교하여 치료 효과를 혁신적으로 향상시키고 치료 결과의 균일성을 높여, 궁극적으로는 줄기세포치료가 보편적으로 활용될 수 있는 대안을 제시할 것으로 기대된다.In the case of using the stem cell screening method according to the present invention, stem cells that are substantially effective in the treatment of neurological diseases in vitro can be effectively selected, thereby maximizing the effect of stem cell treatment for patients with neurological disorders. In addition, compared to the method of applying stem cell treatment with blind without existing verification, it innovatively improves the treatment effect and improves the uniformity of treatment results, ultimately suggesting an alternative that stem cell treatment can be used universally. It is expected to do.
도 1은 3차원 뇌 오가노이드에 아밀로이드 베타 올리고머(Aβ)만 단독으로, 또는 아밀로이드 베타 올리고머와 인간 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포(hNTSCs)를 공동으로 처리한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 3차원 뇌 오가노이드를 이용한 in vitro 알츠하이머병 모델에서 줄기세포 처리에 따른 튜불린-베타(tubulin-beta) III, TUNEL, 및 Iba-1의 발현을 면역형광염색법으로 확인한 도면이다.
도 3은 3차원 뇌 오가노이드를 이용한 in vitro 알츠하이머병 모델에서 서로 다른 조직에서 유래한 줄기세포 또는 서로 다른 공여자의 줄기세포 처리에 따른 신경세포의 조직학적 분석을 H&E 염색으로 확인한 도면이다.
도 4a 및 도 4b는 3차원 뇌 오가노이드를 이용한 in vitro 알츠하이머병 모델에서 다양한 종류의 줄기세포 처리에 따른 신경세포에서의 네스틴(Nestin; 도 4a) 및 Tuj1(도 4b)의 발현을 확인한 도면이다.
도 5는 3차원 뇌 오가노이드를 이용한 in vitro 알츠하이머병 모델에서 다양한 종류의 줄기세포를 처리한 후 사이토카인 분석을 수행하여 단백질들의 발현이 변화한 양상을 나타낸 도면이다.
도 6a 내지 도 6c는 알츠하이머병 동물 모델을 이용하여 본 발명에 따른 줄기세포 스크리닝 방법을 검증한 결과를 나타낸 도면으로서, 도 6a는 아밀로이드 베타의 발현 수준을, 도 6b는 모리스 수중미로(Morris water maze) 검사 결과를, 도 6c는 TIMP-2의 발현 수준을 나타낸 도면이다.1 is a diagram showing the result of co-treatment of amyloid beta oligomer (Aβ) alone or with amyloid beta oligomer and human inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells (hNTSCs) in a three-dimensional brain organoid.
2 is a view confirming the expression of tubulin-beta III, TUNEL, and Iba-1 according to stem cell treatment in an in vitro Alzheimer's disease model using a three-dimensional brain organoid by immunofluorescence staining.
3 is a view confirming the histological analysis of neurons according to the treatment of stem cells derived from different tissues or stem cells from different donors in an in vitro Alzheimer's disease model using 3D brain organoids by H&E staining.
4A and 4B are diagrams confirming the expression of Nestin (FIG. 4A) and Tuj1 (FIG. 4B) in neurons according to various types of stem cell treatment in an in vitro Alzheimer's disease model using 3D brain organoids. to be.
FIG. 5 is a diagram showing changes in expression of proteins by performing cytokine analysis after processing various types of stem cells in an in vitro Alzheimer's disease model using 3D brain organoids.
6A to 6C are diagrams showing the results of verifying the stem cell screening method according to the present invention using an Alzheimer's disease animal model, FIG. 6A shows the expression level of amyloid beta, and FIG. 6B shows the Morris water maze (Morris water maze). ) Test results, Figure 6c is a diagram showing the expression level of TIMP-2.
본 발명자들은, 3차원 뇌 오가노이드를 이용하여 in vitro 상에서 재현 가능한 알츠하이머병 모델을 확립하고, 이를 이용하여 알츠하이머병의 치료에 유효한 줄기세포를 선별하였으며, 선별된 줄기세포가 in vivo 알츠하이머 모델 동물에서도 동일한 치료 효과를 나타냄을 확인하여 본 발명을 완성하였다. The present inventors established a reproducible Alzheimer's disease model in vitro using three-dimensional brain organoids, and selected stem cells effective for the treatment of Alzheimer's disease using this, and the selected stem cells are also in vivo Alzheimer's model animals. The present invention was completed by confirming that it exhibited the same therapeutic effect.
본 발명의 일 실시예에서는, 인간 역분화줄기세포로부터 3차원 뇌 오가노이드를 제작하고, 이를 이용하여 in vitro 알츠하이머병 모델을 확립하였다(실시예 1 및 2 참조).In one embodiment of the present invention, a three-dimensional brain organoid was produced from human dedifferentiated stem cells, and an in vitro Alzheimer's disease model was established using this (see Examples 1 and 2).
본 발명의 다른 실시예에서는, 상기 3차원 뇌 오가노이드를 이용하여 줄기세포의 치료 효능을 평가한 결과 376번 공여자의 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 치료 효율이 가장 좋은 것으로 확인되었다(실시예 4 및 5 참조).In another embodiment of the present invention, as a result of evaluating the treatment efficacy of stem cells using the three-dimensional brain organoid, it was confirmed that the treatment efficiency of mesenchymal stem cells derived from the inferior turbinate of the
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 3차원 뇌 오가노이드를 이용한 in vitro 알츠하이머병 모델에서 줄기세포의 처리에 따라 TIMP1, TIMP2, OPN, OPG, IL-6 등 다양한 단백질들의 발현 차이가 나타난다는 것을 확인하였다(실시예 6 참조).In another embodiment of the present invention, it was confirmed that the expression difference of various proteins such as TIMP1, TIMP2, OPN, OPG, and IL-6 appeared according to the treatment of stem cells in an in vitro Alzheimer's disease model using a three-dimensional brain organoid. (See Example 6).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, in vivo 알츠하이머 모델 동물 실험에서도 376번 공여자의 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 치료 효율이 가장 좋은 것으로 나타나 상기 3차원 뇌 오가노이드를 이용한 in vitro 평가 결과와 일치함을 확인하였다(실시예 7 참조).In another embodiment of the present invention, the treatment efficiency of mesenchymal stem cells derived from the inferior turbinate of the
따라서, 본 발명에 따른 줄기세포 스크리닝 방법은 뇌신경계질환 치료용 줄기세포를 선별함에 있어 재현가능성 있는 표준화 플랫폼을 구축한 것으로서, 줄기세포를 이용한 치료 결과의 불확실성을 줄일 수 있고, 궁극적으로 줄기세포치료제가 여러 가지 뇌신경계질환 치료에 보편적으로 사용될 수 있도록 한다.Therefore, the stem cell screening method according to the present invention has established a reproducible standardized platform in selecting stem cells for the treatment of cranial and nervous system diseases, and can reduce the uncertainty of the treatment result using stem cells, and ultimately, a stem cell treatment agent. Is to be universally used in the treatment of various cranial and nervous system diseases.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 뇌신경계질환 치료용 줄기세포 스크리닝 방법을 제공할 수 있다.The present invention can provide a stem cell screening method for the treatment of neurological diseases, including the following steps.
(a) 인간 역분화줄기세포를 이용하여 3차원 뇌 오가노이드(3-Dimensional brain organoid)를 제작하는 단계;(a) preparing a 3-Dimensional brain organoid using human dedifferentiated stem cells;
(b) 상기 뇌 오가노이드에 아밀로이드 베타 올리고머(Amyloid βoligomers)와 후보 줄기세포를 동시에 처리하여 배양하는 단계; 및(b) treating and culturing the brain organoids with amyloid beta oligomers and candidate stem cells at the same time; And
(c) 상기 후보 줄기세포 중에서 치료 효과가 있는 줄기세포를 선택하는 단계.(c) selecting a stem cell having a therapeutic effect from among the candidate stem cells.
본 발명에서 “줄기세포”란, 미분화된 세포로서 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 서로 다른 종류의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말한다.In the present invention, the term "stem cell" refers to a cell that has the ability to differentiate into two or more different types of cells while having the ability to self-replicate as an undifferentiated cell.
본 발명에서 “역분화줄기세포”란, 재프로그램 인자의 발현 또는 발현 유도에 의해 체세포를 재프로그램하여 생성된 유도 다능성 줄기 세포(iPS 세포)를 포함한다. 역분화줄기세포는 태아, 출생후(postnatal), 신생아, 청소년 또는 성인 체세포를 사용하여 생성될 수 있다. 역분화줄기세포는 RPE 세포 또는 다른 세포 타입으로의 분화가 시작되기 전에 새로이 생성될 수 있다(당업계 공지 방법에 의해). 역분화줄기세포는 조직-매칭된 RPE 세포를 생성할 목적으로 특정 환자 또는 매칭된 공여자로부터 온 물질을 사용하여 특이적으로 생성될 수 있다. 역분화줄기세포는 의도된 수여자에서 실질적으로 면역원성이 아닌 세포, 예를 들면 자가세포 또는 의도된 수여자에 세포 조직적합한 세포에서 제조된 세포에서 제조될 수 있다. 추가적 예시로서, 역분화줄기세포는 체세포 또는 다른 세포를 하나 이상의 재프로그램 인자로 세포를 접촉하여 재프로그램함으로써 생성될 수 있다. 예를 들면, 재프로그램 인자는 세포에 의해, 예를 들면, 세포에 부가된 외인성 핵산으로부터, 또는 소분자, microRNA, 등 그 유전자 발현을 촉진 또는 유도하는 인자에 반응하는 내인성 유전자로부터 발현될 수 있다. 재프로그램 인자는 외인성 공급원, 예를 들면, 배양 배지에 추가하고 세포 내로 당업계에 알려진 방법 예컨대 세포 도입 펩타이드, 단백질 또는 핵산 트랜스팩션제, 리포펙틴과의 커플링, 전기천공, 유전자총, 마이크로주입법 등에 의해 도입됨으로써 제공될 수 있다. 체세포를 역분화줄기세포로 재프로그램하는데 사용되는 인자들은 예를 들면, Oct4(Oct 3/4로도 지칭됨), Sox2, c-Myc, 및 Klf4로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 조합을 포함한다. 또한, 체세포를 역분화줄기세포로 재프로그램하는데 사용되는 인자들은 예를 들면, Oct-4, Sox2, Nanog, 및 Lin28로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 조합을 포함한다. 체세포는 적어도 두 개의 재프로그램 인자, 적어도 세 개의 재프로그램 인자, 또는 네 개의 재프로그램 인자를 발현시킴으로써 재프로그램될 수 있다. 특정 역분화줄기세포주는 그 발현 프로파일이 다양할 수 있으나, 역분화줄기세포는 통상적으로 배아 줄기 세포와 동일한 마커의 발현에 의해 동정할 수 있다. 체세포는 적어도 1, 2, 3, 4, 5개의 재프로그램 인자를 발현함으로써 재프로그램된다. 재프로그램 인자는 Oct 3/4, Sox2, NANOG, Lin28, c-Myc 및 Klf4로부터 선택될 수 있다. 재프로그램 인자의 발현은 재프로그램 인자의 발현을 유도하는 소 유기분자물질과 같은 적어도 하나의 물질과 체세포를 접촉함으로써 유도될 수 있다.In the present invention, “reversely differentiated stem cells” include induced pluripotent stem cells (iPS cells) generated by reprogramming somatic cells by expression or induction of expression of a reprogramming factor. Dedifferentiated stem cells can be produced using fetal, postnatal, neonatal, juvenile or adult somatic cells. Dedifferentiated stem cells can be newly generated (by methods known in the art) before differentiation into RPE cells or other cell types begins. Dedifferentiated stem cells can be specifically generated using material from a specific patient or matched donor for the purpose of generating tissue-matched RPE cells. Dedifferentiated stem cells can be prepared from cells that are not substantially immunogenic in the intended recipient, such as autologous cells or cells prepared from cells that are cytostatically compatible with the intended recipient. As a further example, dedifferentiated stem cells can be generated by reprogramming somatic cells or other cells by contacting the cells with one or more reprogramming factors. For example, the reprogramming factor can be expressed by the cell, for example, from an exogenous nucleic acid added to the cell, or from an endogenous gene that responds to a factor that promotes or induces expression of the gene, such as a small molecule, microRNA, or the like. The reprogramming factor can be added to an exogenous source, e.g., culture medium, and into cells by methods known in the art such as cell transduction peptides, protein or nucleic acid transfection agents, coupling with lipofectin, electroporation, gene guns, microinjection methods. It may be provided by being introduced by or the like. Factors used to reprogram somatic cells into dedifferentiated stem cells include, for example, one or more combinations selected from the group consisting of Oct4 (also referred to as Oct 3/4), Sox2, c-Myc, and Klf4. In addition, factors used to reprogram somatic cells into dedifferentiated stem cells include, for example, combinations of one or more selected from the group consisting of Oct-4, Sox2, Nanog, and Lin28. Somatic cells can be reprogrammed by expressing at least two reprogramming factors, at least three reprogramming factors, or four reprogramming factors. Certain dedifferentiated stem cell lines may have various expression profiles, but dedifferentiated stem cells can usually be identified by expression of the same markers as embryonic stem cells. Somatic cells are reprogrammed by expressing at least 1, 2, 3, 4, 5 reprogramming factors. The reprogramming factor can be selected from Oct 3/4, Sox2, NANOG, Lin28, c-Myc and Klf4. Expression of the reprogramming factor can be induced by contacting somatic cells with at least one substance, such as a small organic molecular substance, that induces the expression of the reprogramming factor.
본 발명에서 “오가노이드 (organoid)”란, 3D 입체구조를 가지는 세포를 의미하며, 동물 등에서 수집, 취득하지 않은 인공적인 배양 과정을 통하여 제조한 신경 및 장과 유사한 모델을 의미한다. 이를 구성하는 세포의 유래는 제한되지 않는다. 상기 오가노이드(organoid)는 세포의 성장 과정에서 주변 환경과 상호 작용하도록 허용되는 환경을 가질 수 있다. 2D 배양과는 달리, 3D 세포 배양은 체외에서 세포가 모든 방향으로 성장 할 수 있다. 이에 따라 본 발명에서 3D 오가노이드는 실제로 생체내에서 상호 작용을 하고 있는 장기를 거의 완벽히 모사하여, 질병의 치료제 개발 및 등을 관찰할 수 있는 훌륭한 모델이 될 수 있다.In the present invention, "organoid" refers to a cell having a 3D three-dimensional structure, and refers to a model similar to a nerve and intestine manufactured through an artificial culture process that is not collected or acquired in an animal or the like. The origin of the cells constituting it is not limited. The organoid may have an environment allowed to interact with the surrounding environment during the cell growth process. Unlike 2D culture, 3D cell culture allows cells to grow in all directions in vitro. Accordingly, the 3D organoid in the present invention can be an excellent model for observing the development of therapeutic agents for diseases and the like by almost completely simulating the organs that are actually interacting in vivo.
본 발명에서 “베타-아밀로이드”란, 아밀로이드의 주요 구성 성분으로서, 아밀로이드 전구체 단백질(amyloid precursor protein; APP) 로부터 프로테아제의 작용에 의해 생산되는 40 내지 42 아미노산으로 이루어지는 펩타이드로 알려져 있다.In the present invention, "beta-amyloid" is known as a peptide consisting of 40 to 42 amino acids produced by the action of a protease from an amyloid precursor protein (APP) as a major constituent of amyloid.
본 발명에서, “베타-아밀로이드 올리고머”란, 아밀로이드 전구체 단백질이 베타-분해효소에 의해 베타-아밀로이드 40 또는 42(Aβ40 또는 Aβ단량체(monomer))가 된 후 집적하여 형성된 복합체를 말한다. 예를 들어, 베타-아밀로이드 40 올리고머, 베타-아밀로이드 42 올리고머, 및 베타-아밀로이드 40 올리고머 및 베타-아밀로이드 42 올리고머 중 적어도 하나가 포함된 올리고머 일 수 있다. 이러한 여러 단계의 베타-아밀로이드 중에서 올리고머가 되는 상태부터 뇌에 강한 신경 독성을 나타내어 뇌세포를 사멸시키게 된다.In the present invention, "beta-amyloid oligomer" refers to a complex formed by integration of an amyloid precursor protein into beta-
본 발명의 일 구체예에서, 상기 (a) 단계의 뇌 오가노이드는 9 × 103개 내지는 1 × 104개의 인간 역분화줄기세포를 이용하여 제작될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In one embodiment of the present invention, the brain organoid of step (a) may be produced using 9 × 10 3 to 1 × 10 4 human dedifferentiated stem cells, but is not limited thereto.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 (b) 단계의 아밀로이드 베타 올리고머는 8 내지 12 μM의 농도로 2 내지 4일 동안 처리될 수 있으며, 바람직하게는 10 μM의 농도로 3일 동안 처리될 수 있다.In another embodiment of the present invention, the amyloid beta oligomer of step (b) may be treated at a concentration of 8 to 12 μM for 2 to 4 days, preferably at a concentration of 10 μM for 3 days. .
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 (b) 단계의 후보 줄기세포는 1 × 104개 내지 5 × 104개의 세포를 상기 뇌 오가노이드와 공동배양(co-culture)하는 것일 수 있으나, 상기 세포의 개수는 뇌 오가노이드 제작에 이용된 세포의 개수에 따라 달라질 수 있는 것으로서, 본 발명의 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 적절한 줄기세포 개수가 선택될 수 있다.In another embodiment of the present invention, the candidate stem cells in step (b) may be co-cultured with the brain organoids of 1 × 10 4 to 5 × 10 4 cells, but the The number of cells may vary depending on the number of cells used to produce brain organoids, and an appropriate number of stem cells may be selected by a person of ordinary skill in the art.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 (b) 단계의 후보 줄기세포는 각기 다른 공여자로부터 유래한 것일 수 있으며, 보다 구체적으로는 다른 공여자로부터 유래한 동일 조직 유래의 줄기세포일 수 있다. 예를 들면, 어느 한 공여자로부터 유래한 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포와 다른 공여자로부터 유래한 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 본 발명에 따른 줄기세포 스크리닝 방법을 이용하여 치료 효과를 비교할 수 있다. 또한 상기 후보 줄기세포는 동일한 공여자의 각기 다른 조직 유래 줄기세포일 수 있다. 예를 들면, 어느 한 공여자로부터 유래한 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포와 동일한 공여자로부터 유래한 골수 유래 중간엽 줄기세포를 본 발명에 따른 줄기세포 스크리닝 방법을 이용하여 치료 효과를 비교할 수 있다.In another embodiment of the present invention, the candidate stem cells in step (b) may be derived from different donors, and more specifically, stem cells derived from the same tissue derived from different donors. For example, it is possible to compare the therapeutic effect of mesenchymal stem cells derived from inferior turbinates derived from one donor and mesenchymal stem cells derived from inferior turbinates derived from another donor using the stem cell screening method according to the present invention. In addition, the candidate stem cells may be stem cells derived from different tissues of the same donor. For example, it is possible to compare the therapeutic effect between the mesenchymal stem cells derived from the lower turbinate and the mesenchymal stem cells derived from the bone marrow derived from the same donor using the stem cell screening method according to the present invention.
또한, 본 발명의 일 구체예에서, 상기 (c) 단계는 치료 효과를 평가하여 줄기세포를 선택하는 단계로서, 치료 효과 평가 방법으로는 신경세포의 사멸(apoptosis)을 평가하여 신경세포의 사멸이 가장 적게 일어난 군의 줄기세포를 선택할 수 있다. 상기 신경세포의 사멸 평가는 당업계에 공지된 방법으로 수행될 수 있으며, 예로 TUNEL assay를 이용한 세포사멸 평가가 있다. 또한, 신경세포 마커(neuronal marker)인 튜불린-베타(tubulin-beta) III 또는 네스틴(nestin)의 발현 수준을 평가하여 발현이 가장 적게 감소한 군의 줄기세포를 선택할 수 있다. 상기 열거한 치료 효과 평가 방법 외에도 줄기세포의 치료 효과 내지는 신경세포 보호 효과를 평가하기 위하여 당업계에 공지된 방법을 적절하게 선택할 수 있으며, 따라서 상기 평가 방법은 예시적인 것으로서 본 발명이 상기 치료 효과 평가 방법에 의해 제한되는 것은 아니다. In addition, in one embodiment of the present invention, step (c) is a step of selecting stem cells by evaluating a therapeutic effect, and as a method of evaluating a therapeutic effect, apoptosis of nerve cells is evaluated to determine the death of nerve cells. Stem cells from the least-prone group can be selected. The neuronal cell death evaluation may be performed by a method known in the art, for example, apoptosis evaluation using the TUNEL assay. In addition, by evaluating the expression level of tubulin-beta III or nestin, which is a neuronal marker, the stem cells of the group having the least decreased expression can be selected. In addition to the above-listed methods of evaluating the therapeutic effect, methods known in the art may be appropriately selected to evaluate the therapeutic effect of stem cells or the protective effect of neurons.Therefore, the evaluation method is exemplary, and the present invention evaluates the therapeutic effect. It is not limited by the method.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 뇌신경계질환은 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 헌팅턴병(Huntington's disease), 근위축성측삭경화증(Amyotrophic lateral sclerosis), 바텐병(Batten disease), 뇌경색, 뇌출혈, 및 척수손상으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 줄기세포치료에 의해 호전될 수 있는 뇌신경계질환이라면 상기 열거한 질환에 제한되는 것은 아니다.In another embodiment of the present invention, the cranial nervous system disease is Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease, Amyotrophic lateral sclerosis, Batten disease, It may be one or more selected from the group consisting of cerebral infarction, cerebral hemorrhage, and spinal cord injury, but is not limited to the above-listed diseases as long as it is a cranial nervous system disease that can be improved by stem cell therapy.
본 발명은 또한 하기의 단계를 포함하는, 뇌신경계질환 치료용 줄기세포 스크리닝 방법을 제공할 수 있다.The present invention can also provide a method for screening stem cells for treatment of cranial and nervous system diseases, including the following steps.
(a) 인간 역분화줄기세포를 이용하여 3차원 뇌 오가노이드를 제작하는 단계;(a) preparing a three-dimensional brain organoid using human dedifferentiated stem cells;
(b) 상기 뇌 오가노이드를 배양하는 단계;(b) culturing the brain organoids;
(c) 상기 뇌 오가노이드에 아밀로이드 베타 올리고머(Amyloid βoligomers)와 후보 줄기세포를 동시에 처리하여 배양하는 단계; 및(c) treating and culturing the brain organoids with amyloid beta oligomers and candidate stem cells at the same time; And
(d) 상기 후보 줄기세포 중에서 치료 효과가 있는 줄기세포를 선택하는 단계.(d) selecting a stem cell having a therapeutic effect from among the candidate stem cells.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 (b) 단계의 배양은 mTeSR1, N2 보충제(supplement), 및 MEM NEAA(Non-Essential Amino Acid)가 포함된 배지에서 배양될 수 있으며, 바람직하게는 mTeSR1, N2 보충제, MEM NEAA 및 헤파린(heparin)이 포함된 배지에서 배양될 수 있다.In one embodiment of the present invention, the culture of step (b) may be cultured in a medium containing mTeSR1, N2 supplement, and MEM NEAA (Non-Essential Amino Acid), preferably mTeSR1, N2 Supplement, MEM NEAA and can be cultured in a medium containing heparin.
본 발명에서 상기 “mTeSR1” 배지에 대한 상세한 기술은 “Ludwig, T.E. et al., Nature methods 3:637-646(2006)”에서 알 수 있으며, STEMCELL Technologies 사에서 구매될 수 있다(카탈로그 번호 #85850, #85857 등). 또한, 상기 “N2 보충제”는 Thermo Fisher Scientific 사(카탈로그 번호 17502048 등), STEMCELL Technologies 사(카탈로그 번호 07152, 07156 등), R&D Systems 사(카탈로그 번호 #AR033) 등에서 구매될 수 있다. 또한, 상기 MEM NEAA는 Thermo Fisher Scientific 사(카탈로그 번호 11140050, 11140076 등), STEMCELL Technologies 사(카탈로그 번호 #36550 등), LONZA 사(카탈로그 번호 13-114E 등) 등에서 구매될 수 있다.Detailed description of the “mTeSR1” medium in the present invention is “Ludwig, T.E. et al., Nature methods 3:637-646 (2006)” and can be purchased from STEMCELL Technologies (Cat. #85850, #85857, etc.). In addition, the "N2 supplement" may be purchased from Thermo Fisher Scientific (catalog number 17502048, etc.), STEMCELL Technologies (catalog number 07152, 07156, etc.), R&D Systems (catalog number #AR033), and the like. In addition, the MEM NEAA can be purchased from Thermo Fisher Scientific (catalog number 11140050, 11140076, etc.), STEMCELL Technologies (catalog number #36550, etc.), LONZA (catalog number 13-114E, etc.).
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 (b) 단계의 배양은 30일 내지 50일 동안 이루어질 수 있으며, 바람직하게는 30일 내지 40일 동안 이루어질 수 있다.In another embodiment of the present invention, the cultivation of step (b) may be performed for 30 to 50 days, preferably 30 to 40 days.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 뇌신경계질환 치료용 줄기세포 스크리닝 방법을 제공할 수 있다.In addition, the present invention can provide a stem cell screening method for the treatment of neurological disorders, including the following steps.
(a) 인간 역분화줄기세포를 이용하여 3차원 뇌 오가노이드를 제작하는 단계;(a) preparing a three-dimensional brain organoid using human dedifferentiated stem cells;
(b) 상기 뇌 오가노이드를 배양하는 단계;(b) culturing the brain organoids;
(c) 상기 뇌 오가노이드에 아밀로이드 베타 올리고머(Amyloid βoligomers)와 후보 줄기세포를 동시에 처리하여 배양하는 단계;(c) treating and culturing the brain organoids with amyloid beta oligomers and candidate stem cells at the same time;
(d) 상기 후보 줄기세포 중에서 치료 효과가 있는 줄기세포를 선택하는 단계; 및(d) selecting stem cells having a therapeutic effect from among the candidate stem cells; And
(e) 상기 선택된 줄기세포들을 뇌신경계질환 모델 동물에 처리하여 치료 효과를 비교 확인하는 단계.(e) comparing the treatment effect by treating the selected stem cells to a cranial nerve disease model animal.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 줄기세포 스크리닝 방법은, 상기 (d) 단계 및 (e) 단계 모두에서 다른 후보 줄기세포와 비교하여 치료 효과가 더 높은 줄기세포를 최종 선택하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 치료 효과가 더 높은 줄기세포는 상기 (d) 단계 및 (e) 단계에서 다른 후보 줄기세포와 비교하여 치료 효과가 상위 10% 내지 30%인 것을 선택하는 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the stem cell screening method further comprises the step of finally selecting stem cells having a higher therapeutic effect compared to other candidate stem cells in both the (d) and (e) steps. I can. Stem cells having a higher therapeutic effect may be those having a therapeutic effect of 10% to 30% compared to other candidate stem cells in steps (d) and (e).
본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.The terms or words used in the specification and claims should not be construed as being limited to their usual or dictionary meanings, and the inventor may appropriately define the concept of terms in order to describe his own invention in the best way. It should be interpreted as a meaning and concept consistent with the technical idea of the present invention based on the principle that there is.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, a preferred embodiment is presented to aid the understanding of the present invention. However, the following examples are provided for easier understanding of the present invention, and the contents of the present invention are not limited by the following examples.
[실시예][Example]
실시예 1: 인간 역분화줄기세포를 이용한 3차원 뇌 오가노이드의 제작Example 1: Preparation of 3D brain organoid using human dedifferentiated stem cells
인간의 혈액에서 유도한 역분화 줄기세포 9 × 103개 또는 1 × 104개를 mTeSR와 섞은 후, U 바텀(bottom) 96-well 플레이트에 각각 분주 후 37 ℃, 5 % CO2 환경 하의 배양기에서 약 7일 간, 스페로이드를 유도하였다. 그 후, 형성된 스페로이드를 N2 supplement, 및 MEM NEAA가 포함된 분화배지를 이용하여 약 5~7일간 분화를 유도하였다. 완전한 성숙체가 될 때까지 배지를 약 3에서 4일마다 교환해 주며, 셰이커(shaker)를 배양기에 넣어 70 rpm의 속도로 37 ℃, 5 % CO2 환경 하에서 약 30~40일 동안 배양하였다. After mixing 9 × 10 3 or 1 × 10 4 dedifferentiated stem cells derived from human blood with mTeSR, dispensing each into a U bottom 96-well plate and incubating in an environment of 37°C and 5% CO 2 In about 7 days, spheroids were induced. Thereafter, the formed spheroids were differentiated for about 5 to 7 days using a differentiation medium containing N2 supplement and MEM NEAA. The medium was changed every 3 to 4 days until complete maturity was reached, and a shaker was put into the incubator and incubated for about 30 to 40 days in an environment of 37° C. and 5% CO 2 at a speed of 70 rpm.
실시예 2: 3차원 뇌 오가노이드를 이용한 Example 2: Using three-dimensional brain organoids in vitroin vitro 알츠하이머병 모델 확립 Establishing Alzheimer's disease model
상기 실시예 1에서 제작한 3차원 뇌 오가노이드를 37 ℃, 5 % CO2 환경 하의 배양기에서 약 40일 동안 배양한 뒤, 10 μM 아밀로이드 베타 올리고머(amyloid β oligomers, Aβ를 처리하고, Transwell® 시스템을 이용하여 실험군은 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포가 플레이팅(plating)되어 있는 상부 챔버(upper chamber)를, 대조군은 배지만 넣은 상부 챔버를 각각 6일 동안 공동배양 (co-culture)하였다.After incubating the 3D brain organoid prepared in Example 1 for about 40 days in an incubator under an environment of 37°C and 5% CO 2 , 10 μM amyloid β oligomers (Aβ) were treated, and Transwell ® system Using, the experimental group was co-cultured for 6 days in the upper chamber in which the lower turbinate-derived mesenchymal stem cells were plated, and the control group was the upper chamber containing only medium.
그 결과 도 1에 나타난 바와 같이, 아밀로이드 베타 올리고머를 처리한 오가노이드에서는 신경세포의 사멸이 크게 유도되었으며, 이에 따라 오가노이드가 풀어지면서 형태가 크게 변하는 것을 확인하였다. 반면, 줄기세포를 함께 처리한 오가노이드에서는 큰 변화 없이 오가노이드 형태가 잘 유지되는 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과로부터, 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포는 아밀로이드 베타에 의하여 유도되는 신경독성(neurotoxin)을 억제함으로써 신경 보호 효과를 나타낸다는 것을 알 수 있었다.As a result, as shown in Figure 1, in the organoid treated with the amyloid beta oligomer, apoptosis of nerve cells was greatly induced, and accordingly, it was confirmed that the shape of the organoid was largely changed as the organoid was released. On the other hand, it was confirmed that the organoid shape was well maintained without significant change in the organoids treated with stem cells. From the above results, it was found that the mesenchymal stem cells derived from the lower turbinate exhibit a neuroprotective effect by inhibiting neurotoxin induced by amyloid beta.
이와 비교하여, 10 μM 아밀로이드 베타 올리고머를 처리한 뒤, Transwell® 시스템을 이용하여 실험군은 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포(hNTSCs) 또는 골수 유래 중간엽 줄기세포(hBMSCs)가 플레이팅되어 있는 상부 챔버를, 대조군은 배지만 넣은 상부 챔버를 각각 3일 동안 공동배양(co-culture)한 경우에는, 아밀로이드 베타를 처리한 오가노이드에서 신경세포 사멸이 유도되어 오가노이드 형태 일부가 변하는 것이 관찰되었지만, 6일 동안 배양한 경우처럼 오가노이드가 풀어지는 현상은 관찰할 수 없었다. 나아가 줄기세포를 함께 처리한 군에서는 세포 사멸이 억제되어 오가노이드의 형태가 잘 유지되는 것을 확인할 수 있었다.In comparison, after treatment with 10 μM amyloid beta oligomer, using the Transwell ® system, the experimental group was placed in an upper chamber plated with mesenchymal stem cells derived from inferior turbinate (hNTSCs) or bone marrow derived mesenchymal stem cells (hBMSCs) , In the case of co-culture of the upper chamber containing only the medium for the control group for 3 days, it was observed that nerve cell death was induced in the organoid treated with amyloid beta, and part of the organoid morphology was changed, but for 6 days. As in the case of culture, the phenomenon that the organoids were released could not be observed. Furthermore, in the group treated with the stem cells, it was confirmed that cell death was suppressed and the shape of the organoid was well maintained.
여러 번의 반복실험을 통해, 아밀로이드 베타 처리 후 3일을 배양한 경우의 뇌 오가노이드 형태가 훨씬 더 안정적인 것을 알 수 있었다. 이에 따라, 재현 가능한 in vitro 알츠하이머병 모델을 제작하고 표준화 하는데는 10 μM 아밀로이드 베타 올리고머를 37 ℃, 5 % CO2 환경 하 배양기에서, 3일 동안 처리하여 평가하는 것이 좋다는 결과를 확인하였다.Through several replicates, it was found that the brain organoid morphology was much more stable when cultured for 3 days after amyloid beta treatment. Accordingly, in order to prepare and standardize a reproducible in vitro Alzheimer's disease model, it was confirmed that it is good to evaluate 10 μM amyloid beta oligomer in an incubator at 37° C. and 5% CO 2 in an incubator for 3 days.
실시예 3: 3차원 뇌 오가노이드를 이용한 줄기세포의 치료 효능 평가Example 3: Evaluation of treatment efficacy of stem cells using three-dimensional brain organoids
인간 역분화줄기세포를 이용하여 제작한 3차원 뇌 오가노이드를 37 ℃, 5 % CO2 환경 하 배양기에서 약 40일 동안 배양하고 10 μM 아밀로이드 베타 올리고머를 처리한 뒤, Transwell® 시스템을 이용하여 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포가 플레이팅되어 있는 상부 챔버를 각각 3일 동안 공동배양(co-culture)하였다. Three-dimensional brain organoids prepared using human dedifferentiated stem cells were incubated for about 40 days in an incubator under an environment of 37°C and 5% CO 2 , treated with 10 μM amyloid beta oligomer, and then treated with a Transwell ® system. The upper chambers plated with turbinate-derived mesenchymal stem cells were co-cultured for 3 days, respectively.
상기 배양이 끝난 후 1X PBS(Phosphate-buffered saline)로 한 차례 세척하고, 4 % 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 24시간 고정한 후, 15 % 및 30 % 수크로스(sucrose) 용액을 순차적으로 처리하였다. 이후 OCT(Optimal cutting temperature) 컴파운드를 이용하여 블록을 만들고, 동결절편(frozen slide)을 제작하였다. 상기 절편을 PBS 세척하여 준 다음 0.1 % Triton X-100을 처리하여 투과화(permeabilization; 염색이 될 수 있게 세포막을 뚫어줌) 하였다. 다시 PBS로 세척하고, 1 % normal goat serum을 상온에서 1시간 동안 처리하여 비특이적 결합(non-specific binding)을 블록킹(blocking) 한 후 신경세포 관련 단백질에 대한 1차 항체(tubulin beta III 또는 Iba-1)를 처리하여 4 ℃에서 24시간 동안 반응시켰다. 그 후 PBS로 세정하고, 1차 항체에 대한 형광이 붙은 2차 항체(Alexa Fluor 594-conjugates)를 처리하여 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 상기 반응물을 PBS로 세정하고, 마운팅(mounting) 용액으로 마운팅을 한 후 공초점현미경(confocal microscopy)을 사용하여 신경세포 관련 단백질의 발현 여부를 면역형광염색법으로 분석하였다. DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)는 대비염색(counterstaining)용으로 사용되었다. 이와 더불어 TUNEL 염색을 통해 세포 사멸 정도에 대한 분석을 수행하였다.After the cultivation was completed, it was washed once with 1X PBS (Phosphate-buffered saline), fixed with 4% paraformaldehyde for 24 hours, and then 15% and 30% sucrose solutions were sequentially treated. After that, a block was made using an OCT (Optimal cutting temperature) compound, and a frozen slide was produced. The section was washed with PBS and then treated with 0.1% Triton X-100 to permeabilize (permeabilize the cell membrane so that it can be stained). After washing again with PBS, 1% normal goat serum was treated at room temperature for 1 hour to block non-specific binding, and then the primary antibody against neuronal cell-related proteins (tubulin beta III or Iba- 1) was treated and reacted at 4° C. for 24 hours. Then, it was washed with PBS, treated with a secondary antibody (Alexa Fluor 594-conjugates) with fluorescence against the primary antibody, and reacted at room temperature for 1 hour. The reaction product was washed with PBS, mounted with a mounting solution, and then analyzed for expression of neuron-related proteins using confocal microscopy by immunofluorescence staining. DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) was used for counterstaining. In addition, an analysis of the degree of cell death was performed through TUNEL staining.
실시예 4: 공여자 및 유래에 따른 줄기세포의 치료 효능 평가Example 4: Evaluation of the therapeutic efficacy of stem cells according to donor and origin
상기 실시예 3에서 기술한 바와 같이, 인간 역분화줄기세포를 이용하여 제작한 3차원 뇌 오가노이드를 37 ℃, 5 % CO2 환경 하 배양기에서 약 40일 동안 배양하고 10 μM 아밀로이드 베타 올리고머를 처리한 뒤, Transwell® 시스템을 이용하여 2명의 서로 다른 공여자로부터 얻은 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포 또는 골수 유래 중간엽 줄기세포가 각각 플레이팅되어 있는 상부 챔버를 3일 동안 공동배양(co-culture)하였다. 상기 배양이 끝난 후, 1X PBS로 한 차례 세척하고 4 % 파라포름알데하이드로 24시간 동안 고정한 후, 15 %, 30 % 수크로스 처리과정을 거쳐 OCT 컴파운드를 이용해 블록을 제작하였다. 동결절편을 제작한 후 PBS로 세척하고, H&E(Hematoxylin & Eosin) 염색으로 전체적인 오가노이드 형태를 관찰한다.As described in Example 3, 3D brain organoids prepared using human dedifferentiated stem cells were cultured in an incubator under an environment of 37°C and 5% CO 2 for about 40 days and treated with 10 μM amyloid beta oligomer. After that, the upper chamber in which the inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells or bone marrow-derived mesenchymal stem cells obtained from two different donors were plated, respectively, was co-cultured for 3 days using the Transwell ® system. . After the cultivation was completed, after washing with 1X PBS and fixing with 4% paraformaldehyde for 24 hours, a block was manufactured using an OCT compound through 15% and 30% sucrose treatment. After preparing the frozen section, it was washed with PBS, and the whole organoid shape was observed by H&E (Hematoxylin & Eosin) staining.
그 결과 도 3에 나타난 바와 같이, 아밀로이드 베타를 처리한 오가노이드에서는 신경세포의 사멸이 크게 유도되어 오가노이드 일부가 손상되어 있는 것을 확인하였다. 반면, 줄기세포를 함께 처리한 군에서는 아밀로이드 베타만 처리한 군과 비교하여 오가노이드의 조직 손상 정도가 적었다.As a result, as shown in Figure 3, in the organoid treated with amyloid beta, it was confirmed that the death of nerve cells was greatly induced, and a part of the organoid was damaged. On the other hand, in the group treated with stem cells together, the degree of tissue damage to organoids was less than in the group treated with only amyloid beta.
나아가 줄기세포의 공여자에 따라, 유래한 조직의 종류에 따라 그 효과에서 차이를 나타냈다. 즉, 도 3에 나타낸 바와 같이, 하비갑개 유래 줄기세포의 경우 473번 공여자의 줄기세포 보다는 376번 공여자의 줄기세포를 처리한 오가노이드에서 그 형태가 더 잘 유지되는 것을 확인하였고, 이러한 효과는 골수 유래 줄기세포를 처리한 경우보다 하비갑개 유래 줄기세포를 처리한 경우 더 큰 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명자들은 376번 공여자의 하비갑개 유래 줄기세포의 치료 효율이 가장 좋은 것으로 판단하였다.Furthermore, the effect differed according to the donor of stem cells and the type of tissue derived from it. That is, as shown in FIG. 3, it was confirmed that in the case of the lower turbinate-derived stem cells, the morphology was better maintained in the organoid treated with the stem cells of the 376 donor than the stem cells of the 473 donor. It was confirmed that it was larger when the inferior turbinate-derived stem cells were treated than when the derived stem cells were treated. Therefore, the present inventors determined that the treatment efficiency of stem cells derived from inferior turbinate of
실시예 5: 신경세포 관련 단백질 발현 분석을 통한 줄기세포의 치료 효능 평가Example 5: Evaluation of treatment efficacy of stem cells through analysis of protein expression related to nerve cells
상기 실시예 4에서 기술한 바와 같이, 인간 역분화줄기세포를 이용하여 제작한 3차원 뇌 오가노이드를 37 ℃, 5 % CO2 환경 하 배양기에서 약 40일 동안 배양하고 10 μM 아밀로이드 베타 올리고머를 처리한 뒤, Transwell® 시스템을 이용하여 2명의 서로 다른 공여자로부터 얻은 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포 또는 골수 유래 중간엽 줄기세포가 각각 플레이팅되어 있는 상부 챔버를 3일 동안 공동배양하였다. 상기 배양이 끝난 후 1X PBS로 한 차례 세척하고, 4 % 파라포름알데하이드로 24시간 동안 고정한 후, 15 %, 30 % 수크로스 처리과정을 거쳐 OCT 컴파운드를 이용해 블록을 제작하였다. 동결절편을 제작한 후 PBS로 세척하여준 다음 0.1 % Triton X-100을 이용하여 투과화 하였다. 다시 PBS로 세척하고, 1 % normal goat serum을 상온에서 1시간 동안 처리하여 비특이적 결합을 블록킹 한 후 신경세포 관련 단백질에 대한 1차 항체(tubulin beta III 또는 Iba-1)를 처리하여 4 ℃에서 24시간 동안 반응시켰다. 그 후 PBS로 세정하고, 1차 항체에 대한 형광이 붙은 2차 항체(Alexa Fluor 594-conjugates)를 처리하여 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 상기 반응물을 PBS로 세정하고, 마운팅(mounting) 용액으로 마운팅을 한 후 공초점현미경(confocal microscopy)을 사용하여 신경세포 관련 단백질의 발현 여부를 면역형광염색법으로 분석하였다. DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)는 대비염색(counterstaining)용으로 사용되었다.As described in Example 4, the three-dimensional brain organoids produced using human dedifferentiated stem cells were cultured in an incubator under an environment of 37° C. and 5% CO 2 for about 40 days and treated with 10 μM amyloid beta oligomer. a rear, a top chamber in the Transwell ® using a system of two mutually inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells or bone marrow-derived mesenchymal stem cells from different donors are plated each were co-cultured for 3 days. After the cultivation was completed, it was washed once with 1X PBS, fixed with 4% paraformaldehyde for 24 hours, and then subjected to 15% and 30% sucrose treatment to prepare a block using an OCT compound. Frozen sections were prepared, washed with PBS, and permeabilized using 0.1% Triton X-100. After washing again with PBS, 1% normal goat serum was treated at room temperature for 1 hour to block non-specific binding, and then treated with a primary antibody (tubulin beta III or Iba-1) against neuronal cell-related proteins and treated at 4°C for 24 hours. It was allowed to react for hours. Then, it was washed with PBS, treated with a secondary antibody (Alexa Fluor 594-conjugates) with fluorescence against the primary antibody, and reacted at room temperature for 1 hour. The reaction product was washed with PBS, mounted with a mounting solution, and then analyzed for expression of neuron-related proteins using confocal microscopy by immunofluorescence staining. DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) was used for counterstaining.
그 결과 도 4에 나타낸 바와 같이, 골수유래 줄기세포를 함께 처리한 오가노이드에 비해 하비갑개 조직 유래 줄기세포를 처리한 오가노이드에서 신경세포 발현이 훨씬 크게 나타나는 것을 확인하였다.As a result, as shown in FIG. 4, it was confirmed that neuron expression was much greater in organoids treated with stem cells derived from inferior turbinate tissue compared to organoids treated with bone marrow-derived stem cells together.
실시예 6: 사이토카인 분석을 통한 줄기세포의 치료 효능 평가Example 6: Evaluation of treatment efficacy of stem cells through cytokine analysis
인간 역분화줄기세포를 이용하여 제작한 3차원 뇌 오가노이드를 37 ℃, 5 % CO2 환경 하 배양기에서 약 40일 동안 배양하고 10 μM 아밀로이드 베타 올리고머를 처리한 뒤, Transwell® 시스템을 이용하여 2명의 서로 다른 공여자로부터 얻은 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포 또는 골수 유래 중간엽 줄기세포가 각각 플레이팅되어 있는 상부 챔버를 3일 동안 공동배양하였다. 상기 배양이 끝난 후 배양액을 모아 사이토카인 분석(cytokine assay)을 통해 오가노이드에서 분비되는 단백질들의 차이를 분석하였다.After the human de-differentiation produced by the stem cells three-dimensional brain organosilane Carcinoid the 37 ℃, 5% CO 2 environment and culture medium cultured for about 40 days and handle 10 μM beta oligomers, by using the Transwell ® system 2 Inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells or bone marrow-derived mesenchymal stem cells obtained from different donors were plated in the upper chamber for 3 days. After the culture was completed, the culture medium was collected and analyzed for differences in proteins secreted from organoids through cytokine assay.
그 결과 도 5에 나타난 바와 같이, 아밀로이드 베타만 처리한 군의 오가노이드와 비교하였을 때, 줄기세포를 함께 처리한 군의 오가노이드에서는 TIMP1, TIMP2, OPN, OPG, IL-6 등 다양한 단백질들의 발현 차이가 나타난다는 것을 확인하였다.As a result, as shown in FIG. 5, when compared with the organoids of the group treated with only amyloid beta, the organoids of the group treated with stem cells also expressed various proteins such as TIMP1, TIMP2, OPN, OPG, and IL-6. It was confirmed that a difference appeared.
실시예 7: Example 7: in vivoin vivo 실험을 통한 Through experiment in vitroin vitro 스크리닝 플랫폼의 유효성 확인 Validation of the screening platform
본 발명자들은 상기 실시예들을 통해 확인한 줄기세포의 치료 효과의 양상이 in vivo에서도 동일하게 나타나는지 확인하기 위하여, 알츠하이머 동물 모델을 이용하여 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포 및 골수 유래 중간엽 줄기세포의 치료 효과를 확인하였다.The present inventors used the Alzheimer's animal model to confirm the therapeutic effect of the stem cells identified through the above examples in the same manner in vivo , and the therapeutic effect of the lower turbinate-derived mesenchymal stem cells and the bone marrow-derived mesenchymal stem cells Was confirmed.
그 결과 도 6a 내지 6c에 나타난 바와 같이, 376번 공여자의 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 처리한 군에서 아밀로이드 베타 발현이 가장 억제되었고 TIMP-2의 발현 비율이 증가하였으며, 모리스 수중미로실험에서도 기억력 개선이 더 크게 나타남을 확인하였다. 이러한 결과는 상기 실시예들을 통해 확인한 줄기세포의 치료 효과 결과와 일치하는 것으로서, 본 발명에 따른 줄기세포 스크리닝 방법이 유효함을 증명하는 것이다.As a result, as shown in Figs. 6a to 6c, in the group treated with the inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells of
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.The above description of the present invention is for illustrative purposes only, and those of ordinary skill in the art to which the present invention pertains will be able to understand that other specific forms can be easily modified without changing the technical spirit or essential features of the present invention. will be. Therefore, it should be understood that the embodiments described above are illustrative in all respects and are not limiting.
Claims (13)
(a) 인간 역분화줄기세포를 이용하여 3차원 뇌 오가노이드(3-Dimensional brain organoid)를 제작하는 단계;
(b) 상기 뇌 오가노이드에 아밀로이드 베타 올리고머(Amyloid β oligomers)와 후보 줄기세포를 동시에 처리하여 배양하는 단계; 및
(c) 상기 후보 줄기세포 중에서 치료 효과가 있는 줄기세포를 선택하는 단계.
Stem cell screening method for treating cranial nerve system diseases, comprising the following steps:
(a) preparing a 3-Dimensional brain organoid using human dedifferentiated stem cells;
(b) treating and culturing the brain organoids with amyloid beta oligomers and candidate stem cells at the same time; And
(c) selecting a stem cell having a therapeutic effect from among the candidate stem cells.
상기 (a) 단계의 3차원 뇌 오가노이드는 9 × 103개 내지 1 × 104개의 인간 역분화줄기세포를 이용하여 제작되는 것을 특징으로 하는, 줄기세포 스크리닝 방법.
The method of claim 1,
The three-dimensional brain organoid of step (a) is characterized in that produced using 9 × 10 3 to 1 × 10 4 human dedifferentiated stem cells, stem cell screening method.
상기 (b) 단계의 아밀로이드 베타 올리고머는 8 내지 12 μM의 농도로 2 내지 4일 동안 처리되는 것을 특징으로 하는, 줄기세포 스크리닝 방법.
The method of claim 1,
The amyloid beta oligomer of step (b) is characterized in that it is treated for 2 to 4 days at a concentration of 8 to 12 μM, stem cell screening method.
상기 (b) 단계의 후보 줄기세포는 1 × 104개 내지 5 × 104개의 세포를 상기 뇌 오가노이드와 공동배양(co-culture)하는 것을 특징으로 하는, 줄기세포 스크리닝 방법.
The method of claim 1,
Candidate stem cells of the step (b) is characterized in that 1 × 10 4 to 5 × 10 4 cells co-cultured with the brain organoids (co-culture), stem cell screening method.
상기 (b) 단계의 후보 줄기세포는 각기 다른 공여자로부터 유래한 것을 특징으로 하는, 줄기세포 스크리닝 방법.
The method of claim 1,
The stem cell screening method, characterized in that the candidate stem cells in step (b) are derived from different donors.
상기 (b) 단계의 후보 줄기세포는 동일한 공여자의 각기 다른 종류의 조직으로부터 유래한 것을 특징으로 하는, 줄기세포 스크리닝 방법.
The method of claim 1,
The stem cell screening method, characterized in that the candidate stem cells in step (b) are derived from different types of tissues of the same donor.
상기 (c) 단계는 신경세포의 사멸이 가장 적게 일어난 군, 튜불린-베타(tubulin-beta) III의 발현이 가장 적게 감소한 군 또는 네스틴(nestin)의 발현이 가장 적게 감소한 군의 줄기세포를 선택하는 것을 특징으로 하는, 줄기세포 스크리닝 방법.
The method of claim 1,
In the step (c), the stem cells of the group with the least decrease in neuronal cell death, the group with the least decrease in the expression of tubulin-beta III, or the group with the least decrease in the expression of nestin. A method for screening stem cells, characterized in that selection.
상기 뇌신경계질환은 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 헌팅턴병(Huntington's disease), 근위축성측삭경화증(Amyotrophic lateral sclerosis), 바텐병(Batten disease), 뇌경색, 뇌출혈 및 척수손상으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 줄기세포 스크리닝 방법.
The method of claim 1,
The cranial nervous system diseases consist of Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease, amyotrophic lateral sclerosis, Batten disease, cerebral infarction, cerebral hemorrhage and spinal cord injury. It is characterized in that at least one selected from the group, stem cell screening method.
(a) 인간 역분화줄기세포를 이용하여 3차원 뇌 오가노이드를 제작하는 단계;
(b) 상기 뇌 오가노이드를 배양하는 단계;
(c) 상기 뇌 오가노이드에 아밀로이드 베타 올리고머와 후보 줄기세포를 동시에 처리하여 배양하는 단계; 및
(d) 상기 후보 줄기세포 중에서 치료 효과가 있는 줄기세포를 선택하는 단계.
Stem cell screening method for treating cranial nerve system diseases, comprising the following steps:
(a) preparing a three-dimensional brain organoid using human dedifferentiated stem cells;
(b) culturing the brain organoids;
(c) treating and culturing the brain organoids with amyloid beta oligomer and candidate stem cells at the same time; And
(d) selecting a stem cell having a therapeutic effect from among the candidate stem cells.
상기 (b) 단계의 배양은 mTeSR1, N2 보충제(supplement) 및 MEM NEAA(Non-Essential Amino Acid)가 포함된 배지에서 배양되는 것을 특징으로 하는, 줄기세포 스크리닝 방법.
The method of claim 9,
The culture of step (b) is characterized in that the culture is cultured in a medium containing mTeSR1, N2 supplement, and MEM NEAA (Non-Essential Amino Acid), stem cell screening method.
상기 (b) 단계의 배양은 30일 내지 40일 동안 이루어지는 것을 특징으로 하는, 줄기세포 스크리닝 방법.
The method of claim 9,
The cultivation of step (b) is characterized in that made for 30 to 40 days, stem cell screening method.
(a) 인간 역분화줄기세포를 이용하여 3차원 뇌 오가노이드를 제작하는 단계;
(b) 상기 뇌 오가노이드를 배양하는 단계;
(c) 상기 뇌 오가노이드에 아밀로이드 베타 올리고머와 후보 줄기세포를 동시에 처리하여 배양하는 단계;
(d) 상기 후보 줄기세포 중에서 치료 효과가 있는 줄기세포를 선택하는 단계; 및
(e) 상기 선택된 줄기세포들을 뇌신경계질환 모델 동물에 처리하여 치료 효과를 비교 확인하는 단계.
Stem cell screening method for treating cranial nerve system diseases, comprising the following steps:
(a) preparing a three-dimensional brain organoid using human dedifferentiated stem cells;
(b) culturing the brain organoids;
(c) treating and culturing the brain organoids with amyloid beta oligomer and candidate stem cells at the same time;
(d) selecting stem cells having a therapeutic effect from among the candidate stem cells; And
(e) comparing the treatment effect by treating the selected stem cells to a cranial nerve disease model animal.
상기 (d) 단계 및 (e) 단계 모두에서 다른 후보 줄기세포와 비교하여 치료 효과가 더 높은 줄기세포를 최종 선택하는 단계를 더 포함하는, 줄기세포 스크리닝 방법.The method of claim 12,
The stem cell screening method further comprising the step of finally selecting stem cells having a higher therapeutic effect compared to other candidate stem cells in both of the (d) and (e) steps.
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2022270993A1 (en) * | 2021-06-25 | 2022-12-29 | 서울대학교산학협력단 | Screening platform for enteric strain having efficacy of alleviating pathology of alzheimer's disease |
WO2024091060A1 (en) * | 2022-10-27 | 2024-05-02 | 가톨릭대학교 산학협력단 | Method for producing brain cancer-brain organoid complex by co-culturing brain organoid derived from induced pluripotent stem cells of brain cancer patient with patient brain cancer organoid |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA3224222A1 (en) * | 2021-06-17 | 2022-12-22 | Q-State Biosciences, Inc. | Methods for producing neural cells |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20180115236A (en) * | 2017-04-12 | 2018-10-22 | 한국생명공학연구원 | A method for preparing an in vitro-matured human intestinal organoid and a use thereof |
US10323229B1 (en) * | 2015-11-13 | 2019-06-18 | The Florida State University Research Foundation, Inc. | Three-dimensional human stem cell-derived cortical spheroid model |
KR20190089143A (en) * | 2019-07-23 | 2019-07-30 | 사회복지법인 삼성생명공익재단 | Method of screening for patient-specific stem cell treating agent |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR102087294B1 (en) * | 2016-11-15 | 2020-03-10 | 한국생명공학연구원 | A method for preparing the Parkinson's disease model comprising 3D intestinal organoid and 3D neuro ectodermal sphere, and use thereof |
KR101948396B1 (en) * | 2016-12-26 | 2019-02-14 | 동국대학교 산학협력단 | Method for efficient generation of 3D midbrain organoid using specific electromagnetic field |
-
2019
- 2019-10-30 KR KR1020190136879A patent/KR102285600B1/en active IP Right Grant
-
2020
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Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US10323229B1 (en) * | 2015-11-13 | 2019-06-18 | The Florida State University Research Foundation, Inc. | Three-dimensional human stem cell-derived cortical spheroid model |
KR20180115236A (en) * | 2017-04-12 | 2018-10-22 | 한국생명공학연구원 | A method for preparing an in vitro-matured human intestinal organoid and a use thereof |
KR20190089143A (en) * | 2019-07-23 | 2019-07-30 | 사회복지법인 삼성생명공익재단 | Method of screening for patient-specific stem cell treating agent |
KR102018313B1 (en) * | 2019-07-23 | 2019-09-04 | 사회복지법인 삼성생명공익재단 | Method of screening for patient-specific stem cell treating agent |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Hee Jin Kim et al., Stereotactic brain injection of human umbilical cord blood mesenchymal stem cells in patients with Alzheimer's disease dementia: A phase 1 clinical trial, Alzheimers Dement (N Y). 2015 Sep; 1(2): 95-102. |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2022270993A1 (en) * | 2021-06-25 | 2022-12-29 | 서울대학교산학협력단 | Screening platform for enteric strain having efficacy of alleviating pathology of alzheimer's disease |
WO2024091060A1 (en) * | 2022-10-27 | 2024-05-02 | 가톨릭대학교 산학협력단 | Method for producing brain cancer-brain organoid complex by co-culturing brain organoid derived from induced pluripotent stem cells of brain cancer patient with patient brain cancer organoid |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
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KR102285600B1 (en) | 2021-08-05 |
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