KR20210043582A - 조작된 Fc-항원 결합 도메인 작제물에 관련된 조성물 및 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 Fc-항원 결합 도메인 작제물이 적어도 2개의 Fc 도메인 및 적어도 하나의 항원 결합 도메인을 포함하는 유전자 조작 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 조성물 및 방법에 관한 것이다.
Description
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2017년 1월 6일에 출원한 미국 특허 가출원 제62/443,523호의 출원일의 이익을 주장하며, 그 내용은 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
많은 치료 항체는 항체 의존성 세포독성(ADCC), 항체 의존성 세포 식균작용(ADCP), 및 보체 의존성 세포독성(CDC)과 같은 Fc 도메인의 효과기 기능을 통해 선천적 면역계의 요소를 보충함으로써 작용한다. 개선된 치료 단백질에 대한 요구가 지속적으로 제기되고 있다.
단백질 조작은 효과기 기능-기반 세포 살해를 강화할 수 있고, 특히, 하나 이상의 Fc 도메인의 부분적인 또는 완전한 탈푸코실화를 통해 FcγRIII에 대한 결합을 변형할 수 있다. 이러한 변형은 효과기 기능을 변경할 수 있다. 그러나, Fc 감마 수용체에 대한 결합을 강화시키기 위해 탈푸코실화를 다른 방법과 조합하는 일부 시도는 FcγRIII에 대한 결합 증가에도 불구하고 효과기 기능을 증가시키지 못했는데, 이는 FcγRIII 결합을 임계치를 초과하여 개선하더라도 효과기 기능이 추가로 개선될 수 없다는 것을 시사한다(Repp 등의 문헌[(2011) Combined Fc-protein- and Fc-glyco-engineering of scFv-Fc fusion proteins synergistically enhances CD16a binding but does not further enhance NK-cell mediated ADCC. J Immunol Methods. 373:67-78] 참조).
본 발명은 항원 결합 도메인의 표적-특이성을 적어도 2개의 Fc 도메인과 조합하여 고유의 생물학적 활성을 갖는 새로운 치료제를 생성하기 위한 조성물 및 방법을 특징으로 한다.
일부 경우에, 본 발명은 단일 Fc-도메인 함유 치료제(예: 공지의 치료 항체)의 항원 결합 도메인을 적어도 2개의 Fc 도메인과 결합하여 단일 Fc-도메인 함유 치료제보다 큰 생물학적 활성을 갖는 신규 치료제를 생성하는 것을 고려한다. 이러한 작제물을 생성하기 위해, 본 발명은 적어도 2개의, 예를 들어 다수의 Fc 도메인을 갖는 작제물을 조립하는 방법, 및 제한된 수의 폴리펩티드 사슬로부터 개별 크기의 분자를 조립하기 위해 이러한 Fc 도메인의 동종이량체화 및 이종이량체화를 제어하기 위한 다양한 방법을 제공하며, 이러한 폴리펩티드 또한 본 발명의 대상이다. 이들 작제물의 특성은 실질적으로 균질한 약학 조성물의 효율적인 생성을 가능하게 한다. 약학적 조성물에서의 이러한 동질성은 약학 조성물의 안전성, 효능, 균일성 및 신뢰성을 보장하기 위해 바람직하다.
다양한 경우에, 본원에 기재된 작제물 또는 폴리펩티드 복합체 또는 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 적어도 어느 정도까지는 탈푸코실화된다. 예를 들어, 조성물에 존재하는 글리칸(예를 들어, Fc 글리칸)의 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%에는 푸코스 잔기가 결여되어 있다. 따라서, 5%~60%, 5%~50%, 5%~40%, 10%~50%, 10%~50%, 10%~40%, 20%~50% 또는 20%~40%의 글리칸에는 푸코스 잔기가 결여되어 있다. 적어도 어느 정도 탈푸코실화된 조성물은 1,3,4-Tri-O-아세틸-2-데옥시-2-플루오로-L-푸코스 억제제의 존재 하에 항체를 생산하는 세포를 배양하여 생산될 수 있다. 본원에 기재된 작제물 및 폴리펩티드의 상대적으로 탈푸코실화된 형태는 FUT8의 발현이 감소되거나 없는 세포에서의 발현(예를 들어, FUT8을 녹아웃하거나 또는 RNAi(siRNA, miRNA 또는 shRNA)을 사용한 발현의 감소에 의해) 및 베타-1,4-만노실-당단백질 4-베타-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제(GnT-III)를 과발현하는 세포에서의 발현을 포함하는 다양한 다른 방법을 사용하여 생산될 수 있다. 본 발명은 본원에 기술된 Fc-항원 결합 도메인 작제물을 포함하는 조성물을 고려하며, 여기서 조성물에 존재하는 글리칸의 적어도 3%는 푸코스 잔기가 없으며, 다시 말해, 조성물 중 글리칸의 적어도 5%는 탈푸코실화된다.
제1 양태에서, 본 발명은 강화된 효과기 기능을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물에 관한 것으로서, 상기 Fc-항원 결합 도메인 작제물은 항원 결합 도메인, 및 링커에 의해 제2 Fc 도메인에 연결된 제1 Fc 도메인을 포함하며, Fc-항원 결합 도메인 작제물은 단일 Fc 도메인 및 항원 결합 도메인을 갖는 작제물에 비해 항체 의존성 세포독성(ADCC) 검정, 항체 의존성 세포 식균작용(ADCP), 및/또는 보체 의존성 세포독성(CDC) 검정에서 강화된 효과기 기능을 갖는다.
제2 양태에서, 본 발명은 항원 결합 도메인, 및 링커에 의해 제2 Fc 도메인에 연결된 제1 Fc 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 실질적으로 동종 집단을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
제3 양태에서, 본 발명은 항원 결합 도메인, 및 링커에 의해 제2 Fc 도메인에 연결된 제1 Fc 도메인을 포함하는 Fc 항원 결합 도메인 작제물에 관한 것으로서, 상기 Fc 항원 결합 도메인 작제물은 단일 Fc 도메인 및 항원 결합 도메인을 갖는 작제물에 의해서는 나타나지 않는 생물학적 활성을 포함한다.
제4 양태에서, 본 발명은 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 실질적으로 동종 집단을 포함하는 조성물에 관한 것으로서, 상기 Fc-항원 결합 도메인 작제물은: a) i) 제1 Fc 도메인 단량체, ii) 제2 Fc 도메인 단량체, 및 iii) 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체를 결합시키는 링커를 포함하는, 제1 폴리펩티드; b) 제3 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제2 폴리펩티드; c) 제4 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드; 및 d) 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 또는 제3 폴리펩티드에 연결된 항원 결합 도메인을 포함하고; 제1 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성한다.
제4 양태의 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드 또는 제3 폴리펩티드에 연결되거나, 제2 폴리펩티드 및 제3 폴리펩티드에 연결되거나; 항원 결합 도메인은 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드 및 제3 폴리펩티드에 연결된다.
제5 양태에서, 본 발명은 강화된 효과기 기능을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물에 관한 것으로서, 상기 Fc-항원 결합 도메인 작제물은: a) i) 제1 Fc 도메인 단량체, ii) 제2 Fc 도메인 단량체, 및 iii) 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커를 포함하는, 제1 폴리펩티드; b) 제3 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제2 폴리펩티드; c) 제4 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드; 및 d) 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드 또는 제3 폴리펩티드에 연결된 항원 결합 도메인을 포함하되, 제1 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성하며,
Fc-항원 결합 도메인 작제물은 단일 Fc 도메인 및 항원 결합 도메인을 갖는 작제물에 비해 항체 의존성 세포독성(ADCC) 검정, 항체 의존성 세포 식균작용(ADCP), 및/또는 보체 의존성 세포독성(CDC) 검정에서 강화된 효과기 기능을 갖는다.
제5 양태의 일부 구현예에서, 단일 Fc 도메인 작제물은 항체이다.
제6 양태에서, 본 발명은 Fc-항원 결합 도메인 작제물에 관한 것으로서, 상기 Fc-항원 결합 도메인 작제물은: a) i) 제1 Fc 도메인 단량체, ii) 제2 Fc 도메인 단량체, 및 iii) 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커를 포함하는, 제1 폴리펩티드; b) 제3 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제2 폴리펩티드; c) 제4 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드; 및 d) 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 또는 제3 폴리펩티드에 연결된 항원 결합 도메인을 포함하며;
제1 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성하며, Fc-항원 결합 도메인 작제물은 단일 Fc 도메인 및 항원 결합 도메인을 갖는 작제물에 의해서는 나타나지 않는 생물학적 활성을 포함한다.
제6 양태의 일부 구현예에서, 생물학적 활성은 Fc 수용체 매개 효과기 기능, 예컨대 ADCC, ADCP 및/또는 CDC 활성(예를 들어, ADCC 및 ADCP 활성, ADCC 및 CDC 활성, ADCP 및 CDC 활성, 또는 ADCC, ADCP, 및 CDC 활성)이다.
제7 양태에서, 본 발명은 Fc-항원 결합 도메인 작제물에 관한 것으로서, 상기 Fc-항원 결합 도메인 작제물은: a) i) 제1 Fc 도메인 단량체, ii) 제2 Fc 도메인 단량체, 및 iii) 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 스페이서를 포함하는, 제1 폴리펩티드; b) 제3 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제2 폴리펩티드; c) 제4 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드; 및 d) 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 또는 제3 폴리펩티드에 연결된 항원 결합 도메인을 포함하며; 제1 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성한다.
본 발명의 제5, 제6 및 제7 양태의 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드 또는 제3 폴리펩티드에 연결되거나, 제2 폴리펩티드 및 제3 폴리펩티드에 연결되거나; 항원 결합 도메인은 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드 및 제3 폴리펩티드에 연결된다.
본 발명은 제1, 제2, 제3 및 제4 양태의 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 Fab이다.
본 발명은 제4, 제5, 제6 및 제7 양태의 일부 구현예에서, 결합 도메인은 제1, 제2 또는 제3 폴리펩티드의 아미노산 서열의 일부이고, 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 scFv이다.
본 발명은 제4, 제5, 제6, 및 제7 양태의 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 VH 도메인 및 CH1 도메인을 포함하고, VH 및 CH1 도메인은 제1, 제2, 또는 제3 폴리펩티드의 아미노산 서열의 일부이다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 VL 도메인을 추가로 포함하되, 일부 구현예에서, Fc-항원 결합 도메인 작제물은 VL 도메인을 포함하는 제4 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, VH 도메인은 표 1에 기재된 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3 서열의 세트를 포함하거나; VH 도메인은 표 2에 기재된 항체의 서열을 포함하는 VH 도메인의 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하거나; VH 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 서열의 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하되, CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3 서열을 제외한 VH 서열은 표 2에 기재된 항체의 VH 서열과 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일하거나; VH 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 서열을 포함한다.
본 발명은 제4, 제5, 제6, 및 제7 양태의 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 표 1에 제시된 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 서열의 세트를 포함하거나; 항원 결합 도메인은 표 2에 제시된 항체의 VH 및 VL 서열의 세트로부터의 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 서열을 포함하거나; 항원 결합 도메인은 표 2에 제시된 항체의 VH 서열의 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인 및 표 2에 제시된 항체의 VL 서열의 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하되, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 서열을 제외한 VH 및 VL 도메인 서열은 표 2에 제시된 항체의 VH 및 VL 서열과 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일하거나; 항원 결합 도메인은 표 2에 제시된 항체의 VH 및 VL 서열의 세트를 포함한다.
본 발명의 제4, 제5, 제6, 및 제7 양태의 일부 구현예에서, Fc 항원 결합 도메인 작제물은 IgG CL 항체 불변 도메인 및 IgG CH1 항체 불변 도메인을 추가로 포함하고, IgG CH1 항체 불변 도메인은 링커에 의해 제1 폴리펩티드 또는 제2 폴리펩티드의 N-말단에 부착된다.
본 발명의 제4, 제5, 제6, 및 제7 양태의 일부 구현예에서, 제1 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체는 제1 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체 간의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함한다.
본 발명의 제4, 제5, 제6, 및 제7 양태의 일부 구현예에서, 제2 Fc 도메인 단량체 및 제4 Fc 도메인 단량체는 제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체 간의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함한다.
본 발명의 제4, 제5, 제6, 및 제7 양태의 일부 구현예에서, 이량체화 선택도 모듈은 Fc 도메인 단량체 중 하나의 CH3 도메인 내로의 유전자 조작 함몰부 및 Fc 도메인 단량체 중 다른 하나의 CH3 도메인 내로의 유전자 조작 돌출부를 포함하고, 유전자 조작 함몰부와 유전자 조작 돌출부는 Fc 도메인 단량체의 돌출부-함몰부 쌍을 형성하도록 위치된다. 일부 구현예에서, 유전자 조작 돌출부는 S354C, T366W, T366Y, T394W, T394F, 및 F405W로부터 선택된 적어도 하나의 변형을 포함하고, 유전자 조작 함몰부는 Y349C, T366S, L368A, Y407V, Y407T, Y407A, F405A, 및 T394S로부터 선택된 적어도 하나의 변형을 포함한다.
본 발명의 제4, 제5, 제6, 및 제7 양태의 일부 구현예에서, 이량체화 선택성 모듈은 도메인 단량체 중 하나의 CH3 도메인 내로 음-하전된 아미노산 및 Fc 도메인 단량체 중 다른 하나의 CH3 도메인 내로 양-하전된 아미노산을 포함하고, 음-하전된 아미노산 및 양-하전된 아미노산은 Fc 도메인의 형성을 촉진하도록 위치된다. 일부 구현예에서, 제1 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체 각각은 D399K와 K409D 또는 K409E 중 하나를 포함하거나, 제1 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체 각각은 K392D와 D399K를 포함하거나, 제1 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체 각각은 E357K와 K370E를 포함하거나, 제1 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체 각각은 D356K와 K439D를 포함하거나, 제1 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체 각각은 K392E와 D399K를 포함하거나, 제1 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체 각각은 E357K와 K370D를 포함하거나, 제1 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체 각각은 D356K와 K439E를 포함하거나; 제2 Fc 도메인 단량체 및 제4 Fc 도메인 단량체는 S354C와 T366W를 포함하고 제3 및 제4 폴리펩티드는 각각 Y349C, T366S, L368A, 및 Y407V를 포함하거나; 제3 및 제4 폴리펩티드 각각은 S354C와 T366W를 포함하고 제2 Fc 도메인 단량체 및 제4 Fc 도메인 단량체는 각각 Y349C, T366S, L368A, 및 Y407V를 포함하거나; 제2 Fc 도메인 단량체 및 제4 Fc 도메인 단량체 각각은 E357K 또는 E357R을 포함하고 제3 및 제4 폴리펩티드는 각각 K370D 또는 K370E를 포함하거나; 제2 Fc 도메인 단량체 및 제4 Fc 도메인 단량체 각각은 K370D 또는 K370E를 포함하고 제3 및 제4 폴리펩티드는 각각 E357K 또는 357R을 포함하거나; 제2 Fc 도메인 단량체 및 제4 Fc 도메인 단량체 각각은 K409D 또는 K409E를 포함하고 제3 및 제4 폴리펩티드는 각각 D399K 또는 D399R을 포함하거나; 제2 Fc 도메인 단량체 및 제4 Fc 도메인 단량체 각각은 D399K 또는 D399R을 포함하고 제3 및 제4 폴리펩티드는 각각 K409D 또는 K409E를 포함한다.
본 발명의 제4, 제5, 제6, 및 제7 양태의 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드 및 제3 폴리펩티드는 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 제4, 제5, 제6, 및 제7 양태의 일부 구현예에서, Fc 항원 결합 도메인 작제물 내의 하나 이상의 링커는 결합이다.
본 발명의 제4, 제5, 제6, 및 제7 양태의 일부 구현예에서, Fc 항원 결합 도메인 작제물 내의 하나 이상의 링커는 스페이서이다. 일부 구현예에서, 스페이서는 서열 GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG, GGGGS, GGSG, SGGG, GSGS, GSGSGS, GSGSGSGS, GSGSGSGSGS, GSGSGSGSGSGS, GGSGGS, GGSGGSGGS, GGSGGSGGSGGS, GGSG, GGSG, GGSGGGSG, GGSGGGSGGGSGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS, GENLYFQSGG, SACYCELS, RSIAT, RPACKIPNDLKQKVMNH, GGSAGGSGSGSSGGSSGASGTGTAGGTGSGSGTGSG, AAANSSIDLISVPVDSR, GGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGS, GGGSGGGSGGGS, SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG, GGSGGGSGGGSGGGSGGS, GGGG, GGGGGGGG, GGGGGGGGGGGG, 또는 GGGGGGGGGGGGGGGG를 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 스페이서는 글리신 스페이서, 예를 들어, 4 내지 30개, 8 내지 30개, 또는 12 내지 30개의 글리신 잔기로 이루어진 것, 예컨대 20개의 글리신 잔기로 이루어진 스페이서이다.
본 발명의 제4, 제5, 제6, 및 제7 양태의 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 링커에 의해 Fc 도메인 단량체에 연결된다. 일부 구현예에서, 링커는 스페이서이다.
본 발명의 제4, 제5, 제6, 및 제7 양태의 일부 구현예에서, Fc 도메인 중 적어도 하나는 위치 I253에서 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 위치 I253에서의 각각의 아미노산 변형은 I253A, I253C, I253D, I253E, I253F, I253G, I253H, I253I, I253K, I253L, I253M, I253N, I253P, I253Q, I253R, I253S, I253T, I253V, I253W, 및 I253Y로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구현예에서, 위치 I253에서의 각각의 아미노산 변형은 I253A이다.
본 발명의 제4, 제5, 제6, 및 제7 양태의 일부 구현예에서, Fc 도메인 중 적어도 하나는 위치 R292에서 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 위치 R292에서의 각각의 아미노산 변형은 R292D, R292E, R292L, R292P, R292Q, R292R, R292T, 및 R292Y로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구현예에서, 위치 R292에서의 각각의 아미노산 변형은 R292P이다.
본 발명의 제4, 제5, 제6, 및 제7 양태의 일부 구현예에서, Fc 도메인 단량체 중 하나 이상은 IgG 힌지 도메인, IgG CH2 항체 불변 도메인, 및 IgG CH3 항체 불변 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 도메인 단량체 각각은 IgG 힌지 도메인, IgG CH2 항체 불변 도메인, 및 IgG CH3 항체 불변 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, IgG는 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, 및 IgG4로 이루어진 군으로부터 선택된 아형이다.
본 발명의 제4, 제5, 제6, 및 제7 양태의 일부 구현예에서, 제4, 제5, 제6, 및 제7 폴리펩티드 각각에서의 N-말단 Asp는 Gln으로 돌연변이된다.
본 발명의 제4, 제5, 제6, 및 제7 양태의 일부 구현예에서, 제4, 제5, 제6, 및 제7 폴리펩티드 중 하나 이상은 N-말단 라이신이 결여된다. 일부 구현예에서, 제4, 제5, 제6, 및 제7 폴리펩티드 각각은 C-말단 라이신이 결여된다.
본 발명의 제4, 제5, 제6, 및 제7 양태의 일부 구현예에서, Fc-항원 결합 도메인 작제물은 링커에 의해 하나 이상의 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 접합된 알부민-결합 펩티드를 추가로 포함한다.
제8 양태에서, 본 발명은 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 집단을 포함하는 세포 배양 배지를 특징으로 하며, 몰 기준으로 상기 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 적어도 50%는 구조적으로 동일하고, Fc-항원 결합 도메인 작제물은 적어도 0.1 mg/L, 10 mg/L, 25 mg/L, 50 mg/L, 75 mg/L, 또는 100 mg/L의 농도로 배양 배지에 존재한다.
본 발명의 제8 양태의 일부 구현예에서, 몰 기준으로 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 적어도 75%, 적어도 85% 또는 적어도 95%는 구조적으로 동일하다.
제9 양태에서, 본 발명은 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 집단을 포함하는 세포 배양 배지를 특징으로 하며, 몰 기준으로 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 적어도 50%는 a) i) 제1 Fc 도메인 단량체, ii) 제2 Fc 도메인 단량체 및 iii) 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커를 포함하는 제1 폴리펩티드; b) 제3 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제2 폴리펩티드; c) 제4 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드; 및 d) 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드 또는 제3 폴리펩티드에 연결된 항원 결합 도메인을 포함하되, 제1 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성한다.
본 발명의 제9 양태의 일부 구현예에서, 몰 기준으로 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 적어도 75%, 적어도 85%, 또는 적어도 95%는 제1 Fc 도메인, 제2 Fc 도메인, 및 항원 결합 도메인을 포함한다.
제10 양태에서, 본 발명은 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 제조 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은: a) (1) i) 제1 Fc 도메인 단량체, ii) 제2 Fc 도메인 단량체, 및 iii) 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커를 포함하는, 제1 폴리펩티드; (2) 제3 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제2 폴리펩티드; (3) 제4 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드; 및 (4) 항원 결합 도메인을 발현하는 숙주 세포를 배양하는 단계(여기서, 제1 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성하고; 항원 결합 도메인은 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드 또는 제3 폴리펩티드에 연결되어, Fc-항원 결합 도메인 작제물을 형성하며; 몰 기준으로 세포 배양 상청액 중의 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 적어도 50%는 구조적으로 동일함); 및 b) 세포 배양 상청액으로부터 Fc-항원 결합 도메인 작제물을 정제하는 단계를 포함한다.
본 발명의 제9 및 제10 양태의 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드 또는 제3 폴리펩티드에 연결되거나, 제2 폴리펩티드 및 제3 폴리펩티드에 연결되거나; 항원 결합 도메인은 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드 및 제3 폴리펩티드에 연결된다.
본 발명의 제9 및 제10 양태의 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 Fab이다.
본 발명의 제9 및 제10 양태의 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 제1, 제2 또는 제3 폴리펩티드의 아미노산 서열의 일부이고, 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 scFv이다.
본 발명의 제9 및 제10 양태의 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 VH 도메인 및 CH1 도메인을 포함하며, VH 및 CH1 도메인은 제1, 제2, 또는 제3 폴리펩티드의 아미노산 서열의 일부이다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 VL 도메인을 추가로 포함하되, 일부 구현예에서, Fc-항원 결합 도메인 작제물은 VL 도메인을 포함하는 제4 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, VH 도메인은 표 1에 기재된 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3 서열의 세트를 포함하거나; VH 도메인은 표 2에 기재된 항체의 서열을 포함하는 VH 도메인의 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하거나; VH 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 서열의 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하되, CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3 서열을 제외한 VH 서열은 표 2에 기재된 항체의 VH 서열과 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일하거나; VH 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 서열을 포함한다.
본 발명의 제9 및 제10 양태의 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 표 1에 기재된 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3 서열의 세트를 포함하거나; 항원 결합 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 및 VL 서열의 세트로부터의 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3 서열을 포함하거나; 항원 결합 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 서열의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인 및 표 2에 기재된 항체의 VL 서열의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하되, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3 서열을 제외한 VH 및 VL 도메인 서열은 표 2에 기재된 항체의 VH 및 VL 서열과 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일하거나; 항원 결합 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 및 VL 서열의 세트를 포함한다.
본 발명의 제9 및 제10 양태의 일부 구현예에서, Fc-항원 결합 도메인 작제물은 IgG CL 항체 불변 도메인 및 IgG CH1 항체 불변 도메인을 추가로 포함하며, 상기 IgG CH1 항체 불변 도메인은 링커를 통해 제1 폴리펩티드 또는 제2 폴리펩티드의 N-말단에 부착된다.
본 발명의 제9 및 제10 양태의 일부 구현예에서, 제1 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체는 제1 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체 사이의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함한다.
본 발명의 제9 및 제10 양태의 일부 구현예에서, 제2 Fc 도메인 단량체 및 제4 Fc 도메인 단량체는 제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체 사이의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함한다.
본 발명의 제9 및 제10 양태의 일부 구현예에서, 이량체화 선택성 모듈은 Fc 도메인 단량체 중 하나의 CH3 도메인 내에 유전자 조작 함몰부를 포함하고 Fc 도메인 단량체 중 다른 하나의 CH3 도메인 내에 유전자 조작 돌출부를 포함하며, 유전자 조작 함몰부 및 유전자 조작 돌출부는 Fc 도메인 단량체의 돌출부-함몰부 쌍을 형성하도록 위치된다. 일부 구현예에서, 유전자 조작 돌출부는 S354C, T366W, T366Y, T394W, T394F 및 F405W에서 선택된 적어도 하나의 변형을 포함하고, 유전자 조작 함몰부는 Y349C, T366S, L368A, Y407V, Y407T, Y407A, F405A 및 T394S에서 선택된 적어도 하나의 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 도메인 단량체 중 하나는 Y407V와 Y349C를 포함하고, Fc 도메인 단량체 중 다른 하나는 T366W와 S354C를 포함한다.
본 발명의 제9 및 제10 양태의 일부 구현예에서, 이량체화 선택성 모듈은 도메인 단량체 중 하나의 CH3 도메인에 음전하 아미노산을 포함하고 Fc 도메인 단량체 중 다른 하나의 CH3 도메인에 양전하 아미노산을 포함하며, 음전하 아미노산과 양전하 아미노산은 Fc 도메인의 형성을 촉진하도록 위치된다. 일부 구현예에서, 제1 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체 각각은 D399K와 K409D 또는 K409E 중 하나를 포함하거나, 제1 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체 각각은 K392D와 D399K를 포함하거나, 제1 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체 각각은 E357K와 K370E를 포함하거나, 제1 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체 각각은 D356K와 K439D를 포함하거나, 제1 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체 각각은 K392E와 D399K를 포함하거나, 제1 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체 각각은 E357K와 K370D를 포함하거나, 제1 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체 각각은 D356K와 K439E를 포함하거나; 제2 Fc 도메인 단량체 및 제4 Fc 도메인 단량체는 S354C와 T366W를 포함하고 제3 및 제4 폴리펩티드는 각각 Y349C, T366S, L368A, 및 Y407V를 포함하거나; 제3 및 제4 폴리펩티드 각각은 S354C와 T366W를 포함하고 제2 Fc 도메인 단량체 및 제4 Fc 도메인 단량체는 각각 Y349C, T366S, L368A, 및 Y407V를 포함하거나; 제2 Fc 도메인 단량체 및 제4 Fc 도메인 단량체 각각은 E357K 또는 E357R을 포함하고 제3 및 제4 폴리펩티드는 각각 K370D 또는 K370E를 포함하거나; 제2 Fc 도메인 단량체 및 제4 Fc 도메인 단량체 각각은 K370D 또는 K370E를 포함하고 제3 및 제4 폴리펩티드는 각각 E357K 또는 357R을 포함하거나; 제2 Fc 도메인 단량체 및 제4 Fc 도메인 단량체 각각은 K409D 또는 K409E를 포함하고 제3 및 제4 폴리펩티드는 각각 D399K 또는 D399R을 포함하거나; 제2 Fc 도메인 단량체 및 제4 Fc 도메인 단량체 각각은 D399K 또는 D399R을 포함하고 제3 및 제4 폴리펩티드는 각각 K409D 또는 K409E를 포함한다.
본 발명의 제9 및 제10 양태의 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드 및 제3 폴리펩티드는 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 제9 및 제10 양태의 일부 구현예에서, Fc-항원 결합 도메인 작제물 내의 하나 이상의 링커는 결합이다.
본 발명의 제9 및 제10 양태의 일부 구현예에서, Fc-항원 결합 도메인 작제물 내의 하나 이상의 링커는 스페이서이다. 일부 구현예에서, 스페이서는 서열 GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG, GGGGS, GGSG, SGGG, GSGS, GSGSGS, GSGSGSGS, GSGSGSGSGS, GSGSGSGSGSGS, GGSGGS, GGSGGSGGS, GGSGGSGGSGGS, GGSG, GGSG, GGSGGGSG, GGSGGGSGGGSGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS, GENLYFQSGG, SACYCELS, RSIAT, RPACKIPNDLKQKVMNH, GGSAGGSGSGSSGGSSGASGTGTAGGTGSGSGTGSG, AAANSSIDLISVPVDSR, GGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGS, GGGSGGGSGGGS, SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG, GGSGGGSGGGSGGGSGGS, GGGG, GGGGGGGG, GGGGGGGGGGGG, 또는 GGGGGGGGGGGGGGGG를 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 스페이서는 글리신 스페이서, 예를 들어, 4 내지 30개, 8 내지 30개, 또는 12 내지 30개의 글리신 잔기로 이루어진 것, 예컨대 20개의 글리신 잔기로 이루어진 스페이서이다.
본 발명의 제9 및 제10 양태의 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 링커에 의해 Fc 도메인 단량체에 연결된다. 일부 구현예에서, 링커는 스페이서이다.
본 발명의 제9 및 제10 양태의 일부 구현예에서, Fc 도메인 중 적어도 하나는 위치 I253에서 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 위치 I253에서의 각각의 아미노산 변형은 I253A, I253C, I253D, I253E, I253F, I253G, I253H, I253I, I253K, I253L, I253M, I253N, I253P, I253Q, I253R, I253S, I253T, I253V, I253W, 및 I253Y로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구현예에서, 위치 I253에서의 각각의 아미노산 변형은 I253A이다.
본 개시의 제9 및 제10 양태의 일부 구현예에서, Fc 도메인 중 적어도 하나는 위치 R292에서 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 위치 R292에서의 각각의 아미노산 변형은 R292D, R292E, R292L, R292P, R292Q, R292R, R292T 및 R292Y로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구현예에서, 위치 R292에서의 각각의 아미노산 변형은 R292P이다.
본 개시의 제9 및 제10 양태의 일부 구현예에서, Fc 도메인 단량체 중 하나 이상은 IgG 힌지 도메인, IgG CH2 항체 불변 도메인 및 IgG CH3 항체 불변 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 도메인 단량체 각각은 IgG 힌지 도메인, IgG CH2 항체 불변 도메인, 및 IgG CH3 항체 불변 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, IgG는 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, 및 IgG4로 이루어진 군으로부터 선택된 아형이다.
본 개시의 제9 및 제10 양태의 일부 구현예에서, 제1, 제2, 제3, 및 제4 폴리펩티드 각각에서 N-말단 Asp는 Gln으로 변이된다.
본 개시의 제9 및 제10 양태의 일부 구현예에서, 제1, 제2, 제3, 및 제4 폴리펩티드 중 하나 이상은 C-말단 라이신이 결여된다. 일부 구현예에서, 제1, 제2, 제3, 및 제4 폴리펩티드 각각은 C-말단 라이신이 결여된다.
본 개시의 제9 및 제10 양태의 일부 구현예에서, Fc-항원 결합 도메인 작제물은 링커에 의해 하나 이상의 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 접합된 알부민-결합 펩티드를 추가로 포함한다.
제11 양태에서, 본 발명은 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 실질적으로 균질한 집단을 포함하는 조성물에 관한 것으로서, 상기 Fc-항원 결합 도메인 작제물은: a) i) 제1 Fc 도메인 단량체, ii) 제2 Fc 도메인 단량체, 및 iii) 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커를 포함하는, 제1 폴리펩티드; b) 제3 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제2 폴리펩티드; c) 제4 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드; d) 제1 폴리펩티드에 연결된 제1 항원 결합 도메인; 및 e) 제2 폴리펩티드 및/또는 제3 폴리펩티드에 연결된 제2 항원 결합 도메인을 포함하되; 제1 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성하며, 제1 및 제2 항원 결합 도메인은 상이한 항원에 결합한다.
본 개시의 제11 양태의 일부 구현예에서, 제1 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체는 제1 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체 사이의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함하고, 제2 Fc 도메인 단량체 및 제4 Fc 도메인 단량체는 제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체 사이의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함하며, 제2 폴리펩티드와 제3 폴리펩티드는 상이한 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 제11 양태의 일부 구현예에서, 제1 항원 결합 도메인은 제1 폴리펩티드에 연결되고, 제2 항원 결합 도메인은 제2 폴리펩티드 및 제3 폴리펩티드에 연결된다.
본 개시의 제11 양태의 일부 구현예에서, 제2 Fc 도메인 단량체 및 제4 Fc 도메인 단량체 각각은 E357K 및 K370D를 포함하며, 제1 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체 각각은 K370D 및 E357K를 포함한다.
제12 양태에서, 본 발명은 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 실질적으로 균질한 집단을 포함하는 조성물에 관한 것으로서, 상기 Fc-항원 결합 도메인 작제물은: a) i) 제1 Fc 도메인 단량체, ii) 제2 Fc 도메인 단량체, 및 iii) 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커를 포함하는, 제1 폴리펩티드; b) 제3 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제2 폴리펩티드; c) 제4 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드; d) 제1 폴리펩티드에 연결된 제1 항원 결합 도메인; e) 제2 폴리펩티드에 연결된 제2 항원 결합 도메인; 및 f) 제3 폴리펩티드에 연결된 제3 항원 결합 도메인을 포함하되, 제1 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성하며, 제1, 제2, 및 제3 항원 결합 도메인은 상이한 항원에 결합한다.
본 개시의 제12 양태의 일부 구현예에서, 제1 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체는 제1 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체 사이의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함하고, 제2 Fc 도메인 단량체 및 제4 Fc 도메인 단량체는 제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체 사이의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함하며, 제2 폴리펩티드와 제3 폴리펩티드는 상이한 아미노산 서열을 갖는다.
본 개시의 제12 양태의 일부 구현예에서, 제2 Fc 도메인 단량체 및 제4 Fc 도메인 단량체 각각은 D399K 및 K409D를 포함하며, 제1 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체 각각은 E357K 및 K370D를 포함한다.
본 발명의 제11 및 제12 양태의 일부 구현예에서, 제1 또는 제2 항원 결합은 Fab이다. 본 발명의 제11 및 제12 양태의 일부 구현예에서, 제1 및 제2 항원 결합 도메인은 Fab이다. 본 발명의 제9 양태의 일부 구현예에서, 제1, 제2 및 제3 항원 결합 도메인은 Fab이다.
본 발명의 제11 및 제12 양태의 일부 구현예에서, 제1 또는 제2 항원 결합은 scFv이다. 본 발명의 제11 및 제12 양태의 일부 구현예에서, 제1 및 제2 항원 결합 도메인은 scFv이다. 본 발명의 제9 양태의 일부 구현예에서, 제1, 제2, 및 제3 항원 결합 도메인은 scFv이다.
본 발명의 제11 양태의 일부 구현예에서, 제1 또는 제2 항원 결합 도메인은 VH 도메인 및 CH1 도메인을 포함하며, VH 및 CH1 도메인은 제1, 제2 또는 제3 폴리펩티드의 아미노산 서열의 일부이다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 VL 도메인을 추가로 포함하되, 일부 구현예에서, Fc-항원 결합 도메인 작제물은 VL 도메인을 포함하는 제4 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, VH 도메인은 표 1에 기재된 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3 서열의 세트를 포함하거나; VH 도메인은 표 2에 기재된 항체의 서열을 포함하는 VH 도메인의 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하거나; VH 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 서열의 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하되, CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3 서열을 제외한 VH 서열은 표 2에 기재된 항체의 VH 서열과 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일하거나; VH 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 서열을 포함한다.
본 발명의 제12 양태의 일부 구현예에서, 제1, 제2, 또는 제3 항원 결합 도메인은 VH 도메인 및 CH1 도메인을 포함하며, VH 및 CH1 도메인은 제1, 제2 또는 제3 폴리펩티드의 아미노산 서열의 일부이다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 VL 도메인을 추가로 포함하되, 일부 구현예에서, Fc-항원 결합 도메인 작제물은 VL 도메인을 포함하는 제4 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, VH 도메인은 표 1에 기재된 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3 서열의 세트를 포함하거나; VH 도메인은 표 2에 기재된 항체의 서열을 포함하는 VH 도메인의 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하거나; VH 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 서열의 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하되, CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3 서열을 제외한 VH 서열은 표 2에 기재된 항체의 VH 서열과 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일하거나; VH 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 서열을 포함한다.
본 발명의 제11 양태의 일부 구현예에서, 제1 또는 제2 항원 결합 도메인은 표 1에 기재된 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3 서열의 세트를 포함하며, 항원 결합 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 및 VL 서열의 세트로부터의 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3 서열을 포함하고, 항원 결합 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 서열의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 표 2에 기재된 항체의 VL 서열의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하며, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3 서열을 제외한 VH 및 VL 도메인 서열은 표 2에 기재된 항체의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나 또는 적어도 99.5% 동일하거나, 항원 결합 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 및 VL 서열의 세트를 포함한다.
본 발명의 제12 양태의 일부 구현예에서, 제1, 제2, 또는 제3 항원 결합 도메인은 표 1에 기재된 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3 서열의 세트를 포함하거나; 항원 결합 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 및 VL 서열 세트의 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3 서열을 포함하거나; 항원 결합 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 서열의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 표 2에 기재된 항체의 VL 서열의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하되, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3 서열을 제외한 VH 및 VL 도메인 서열은 표 2에 기재된 항체의 VH 및 VL 서열과 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일하거나; 항원 결합 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 및 VL 서열의 세트를 포함한다.
본 개시의 제11 및 제12 양태의 일부 구현예에서, Fc-항원 결합 도메인 작제물은 IgG CL 항체 불변 도메인 및 IgG CH1 항체 불변 도메인을 추가로 포함하며, IgG CH1 항체 불변 도메인은 링커를 통해 제1 또는 제2 폴리펩티드의 N-말단에 부착된다.
본 개시의 제11 및 제12 양태의 일부 구현예에서, 제1 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체는 제1 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체 사이의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함한다.
본 개시의 제11 및 제12 양태의 일부 구현예에서, 제2 Fc 도메인 단량체 및 제4 Fc 도메인 단량체는 제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체 사이의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함한다.
본 개시의 제11 및 제12 양태의 일부 구현예에서, 이량체화 선택성 모듈은 Fc 도메인 단량체 중 하나의 CH3 도메인에 유전자 조작 함몰부를 포함하고 Fc 도메인 단량체 중 다른 하나의 CH3 도메인에 유전자 조작 돌출부를 포함하며, 유전자 조작 함몰부 및 유전자 조작 돌출부는 Fc 도메인 단량체의 돌출부-함몰부 쌍을 형성하도록 위치된다. 일부 구현예에서, 유전자 조작 돌출부는 S354C, T366W, T366Y, T394W, T394F 및 F405W에서 선택된 적어도 하나의 변형을 포함하고, 유전자 조작 함몰부는 Y349C, T366S, L368A, Y407V, Y407T, Y407A, F405A 및 T394S에서 선택된 적어도 하나의 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 도메인 단량체 중 하나는 Y407V와 Y349C를 포함하고, Fc 도메인 단량체 중 다른 하나는 T366W와 S354C를 포함한다.
본 개시의 제11 및 제12 양태의 일부 구현예에서, 이량체화 선택성 모듈은 도메인 단량체 중 하나의 CH3 도메인 내에 음전하 아미노산을 포함하고 Fc 도메인 단량체 중 다른 하나의 CH3 도메인 내에 양전하 아미노산을 포함하며, 음전하 아미노산과 양전하 아미노산은 Fc 도메인의 형성을 촉진하도록 위치된다. 일부 구현예에서, 제1 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체 각각은 D399K와 K409D 또는 K409E 중 하나를 포함하거나, 제1 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체 각각은 K392D와 D399K를 포함하거나, 제1 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체 각각은 E357K와 K370E를 포함하거나, 제1 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체 각각은 D356K와 K439D를 포함하거나, 제1 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체 각각은 K392E와 D399K를 포함하거나, 제1 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체 각각은 E357K와 K370D를 포함하거나, 제1 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체 각각은 D356K와 K439E를 포함하거나; 제2 Fc 도메인 단량체 및 제4 Fc 도메인 단량체는 S354C와 T366W를 포함하고 제3 및 제4 폴리펩티드는 각각 Y349C, T366S, L368A, 및 Y407V를 포함하거나; 제3 및 제4 폴리펩티드 각각은 S354C와 T366W를 포함하고 제2 Fc 도메인 단량체 및 제4 Fc 도메인 단량체는 각각 Y349C, T366S, L368A, 및 Y407V를 포함하거나; 제2 Fc 도메인 단량체 및 제4 Fc 도메인 단량체 각각은 E357K 또는 E357R을 포함하고 제3 및 제4 폴리펩티드는 각각 K370D 또는 K370E를 포함하거나; 제2 Fc 도메인 단량체 및 제4 Fc 도메인 단량체 각각은 K370D 또는 K370E를 포함하고 제3 및 제4 폴리펩티드는 각각 E357K 또는 357R을 포함하거나; 제2 Fc 도메인 단량체 및 제4 Fc 도메인 단량체 각각은 K409D 또는 K409E를 포함하고 제3 및 제4 폴리펩티드는 각각 D399K 또는 D399R을 포함하거나; 제2 Fc 도메인 단량체 및 제4 Fc 도메인 단량체 각각은 D399K 또는 D399R을 포함하고 제3 및 제4 폴리펩티드는 각각 K409D 또는 K409E를 포함한다.
본 개시의 제11 및 제12 양태의 일부 구현예에서, Fc-항원 결합 도메인 작제물 내의 하나 이상의 링커는 결합이다.
본 개시의 제11 및 제12 양태의 일부 구현예에서, Fc-항원 결합 도메인 작제물 내의 하나 이상의 링커는 스페이서이다. 일부 구현예에서, 스페이서는 서열 GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG, GGGGS, GGSG, SGGG, GSGS, GSGSGS, GSGSGSGS, GSGSGSGSGS, GSGSGSGSGSGS, GGSGGS, GGSGGSGGS, GGSGGSGGSGGS, GGSG, GGSG, GGSGGGSG, GGSGGGSGGGSGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS, GENLYFQSGG, SACYCELS, RSIAT, RPACKIPNDLKQKVMNH, GGSAGGSGSGSSGGSSGASGTGTAGGTGSGSGTGSG, AAANSSIDLISVPVDSR, GGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGS, GGGSGGGSGGGS, SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG, GGSGGGSGGGSGGGSGGS, GGGG, GGGGGGGG, GGGGGGGGGGGG, 또는 GGGGGGGGGGGGGGGG를 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 스페이서는 글리신 스페이서, 예를 들어, 4 내지 30개, 8 내지 30개, 또는 12 내지 30개의 글리신 잔기로 이루어진 것, 예컨대 20개의 글리신 잔기로 이루어진 스페이서이다.
본 발명의 제11 및 제12 양태의 일부 구현예에서, 하나 이상의 항원 결합 도메인은 링커에 의해 Fc 도메인 단량체에 연결된다. 일부 구현예에서, 링커는 스페이서이다.
본 개시의 제11 및 제12 양태의 일부 구현예에서, Fc 도메인 중 적어도 하나는 위치 I253에서 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 위치 I253에서의 각각의 아미노산 변형은 I253A, I253C, I253D, I253E, I253F, I253G, I253H, I253I, I253K, I253L, I253M, I253N, I253P, I253Q, I253R, I253S, I253T, I253V, I253W, 및 I253Y로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구현예에서, 위치 I253에서의 각각의 아미노산 변형은 I253A이다.
본 개시의 제11 및 제12 양태의 일부 구현예에서, Fc 도메인 중 적어도 하나는 위치 R292에서 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 위치 R292에서의 각각의 아미노산 변형은 R292D, R292E, R292L, R292P, R292Q, R292R, R292T 및 R292Y로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구현예에서, 위치 R292에서의 각각의 아미노산 변형은 R292P이다.
본 개시의 제11 및 제12 양태의 일부 구현예에서, Fc 도메인 단량체 중 하나 이상은 IgG 힌지 도메인, IgG CH2 항체 불변 도메인, 및 IgG CH3 항체 불변 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 도메인 단량체 각각은 IgG 힌지 도메인, IgG CH2 항체 불변 도메인, 및 IgG CH3 항체 불변 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, IgG는 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, 및 IgG4로 이루어진 군으로부터 선택된 아형이다.
본 개시의 제11 및 제12 양태의 일부 구현예에서, 제1, 제2, 제3, 및 제4 폴리펩티드 각각에서 N-말단 Asp는 Gln으로 변이된다.
본 개시의 제11 및 제12 양태의 일부 구현예에서, 제1, 제2, 제3, 및 제4 폴리펩티드 중 하나 이상은 C-말단 라이신이 결여된다. 일부 구현예에서, 제1, 제2, 제3, 및 제4 폴리펩티드 각각은 C-말단 라이신이 결여된다.
본 개시의 제11 및 제12 양태의 일부 구현예에서, Fc-항원 결합 도메인 작제물은 링커에 의해 하나 이상의 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 접합된 알부민-결합 펩티드를 추가로 포함한다.
제13 양태에서, 본 발명은 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 실질적으로 균질한 집단을 포함하는 조성물에 관한 것으로서, 상기 Fc-항원 결합 도메인 작제물은: a) i) 제1 Fc 도메인 단량체, ii) 제2 Fc 도메인 단량체 및 iii) 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제1 링커를 포함하는 제1 폴리펩티드; 및 b) i) 제3 Fc 도메인 단량체, ii) 제4 Fc 도메인 단량체, 및 iv) 제3 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제2 링커를 포함하는 제2 폴리펩티드; 및 c) 제5 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드; d) 제6 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제4 폴리펩티드; 및 d) 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 제3 폴리펩티드 또는 제4 폴리펩티드에 연결된 항원 결합 도메인을 포함하되, 제1 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제2 Fc 도메인 단량체와 제5 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성하며, 제4 Fc 도메인 단량체와 제6 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제3 Fc 도메인을 형성한다.
본 개시의 제13 양태의 일부 구현예에서, 제1 및 제3 Fc 도메인 단량체 각각은 제1 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체 사이의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함하고, 제2 및 제5 Fc 도메인 단량체 각각은 제2 Fc 도메인 단량체와 제5 Fc 도메인 단량체 사이의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함하며, 제4 및 제6 Fc 도메인 단량체 각각은 제4 Fc 도메인 단량체와 제6 Fc 도메인 단량체 사이의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함한다.
제14 양태에서, 본 발명은 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 실질적으로 균질한 집단을 포함하는 조성물에 관한 것으로서, 상기 Fc-항원 결합 도메인 작제물은: a) i) 제1 Fc 도메인 단량체, ii) 제2 Fc 도메인 단량체 및 iii) 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제1 링커를 포함하는 제1 폴리펩티드; 및 b) i) 제3 Fc 도메인 단량체, ii) 제4 Fc 도메인 단량체 및 iv) 제3 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제2 링커를 포함하는 제2 폴리펩티드; 및 c) 제5 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드; d) 제6 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제4 폴리펩티드; 및 e) 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 제3 폴리펩티드 또는 제4 폴리펩티드에 연결된 항원 결합 도메인을 포함하되, 제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제1 Fc 도메인 단량체와 제5 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성하며, 제3 Fc 도메인 단량체와 제6 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제3 Fc 도메인을 형성한다.
본 개시의 제14 양태의 일부 구현예에서, 제2 및 제4 Fc 도메인 단량체 각각은 제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체 사이의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함하고, 제1 및 제5 Fc 도메인 단량체 각각은 제1 Fc 도메인 단량체와 제5 Fc 도메인 단량체 사이의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함하며, 제3 및 제6 Fc 도메인 단량체 각각은 제3 Fc 도메인 단량체와 제6 Fc 도메인 단량체 사이의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함한다.
제15 양태에서, 본 발명은 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 실질적으로 균질한 집단을 포함하는 조성물에 관한 것으로서, 상기 Fc-항원 결합 도메인 작제물은: a) i) 제1 Fc 도메인 단량체, ii) 제2 Fc 도메인 단량체, iii) 제3 Fc 도메인 단량체, iv) 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제1 링커; 및 v) 제2 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제2 링커를 포함하는 제1 폴리펩티드; b) i) 제4 Fc 도메인 단량체, ii) 제5 Fc 도메인 단량체, iii) 제6 Fc 도메인 단량체, iv) 제4 Fc 도메인 단량체와 제5 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제3 링커; 및 v) 제5 Fc 도메인 단량체와 제6 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제4 링커를 포함하는 제2 폴리펩티드; c) 제7 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드; d) 제8 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제4 폴리펩티드; e) 제9 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제5 폴리펩티드; f) 제10 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제6 폴리펩티드; 및 g) 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 제3 폴리펩티드, 제4 폴리펩티드, 제5 폴리펩티드 또는 제6 폴리펩티드에 연결된 항원 결합 도메인을 포함하되, 제2 Fc 도메인 단량체와 제5 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하며, 제1 Fc 도메인 단량체와 제7 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성하고, 제4 Fc 도메인 단량체와 제8 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제3 Fc 도메인을 형성하며, 제3 Fc 도메인 단량체와 제9 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제4 Fc 도메인을 형성하고, 제6 Fc 도메인 단량체와 제10 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제5 Fc 도메인을 형성한다.
본 개시의 제15 양태의 일부 구현예에서, 제2 및 제5 Fc 도메인 단량체 각각은 제2 Fc 도메인 단량체와 제5 Fc 도메인 단량체 사이의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함하고, 제1 및 제7 Fc 도메인 단량체 각각은 제1 Fc 도메인 단량체와 제7 Fc 도메인 단량체 사이의 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함하며, 제4 및 제8 Fc 도메인 단량체 각각은 제4 Fc 도메인 단량체와 제8 Fc 도메인 단량체 사이의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함하고, 제3 및 제9 Fc 도메인 단량체 각각은 제3 Fc 도메인 단량체와 제9 Fc 도메인 단량체 사이의 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함하며, 제6 및 제10 Fc 도메인 단량체 각각은 제6 Fc 도메인 단량체와 제10 Fc 도메인 단량체 사이의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함한다.
본 발명의 제13, 제14 및 제15 양태의 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 Fab이다.
본 발명의 제13, 제14 및 제15 양태의 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 하나 이상의 폴리펩티드의 아미노산 서열의 일부이고, 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 scFv이다.
본 개시의 제13, 제14, 및 제15 양태의 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 VH 도메인 및 CH1 도메인을 포함하며, VH 및 CH1 도메인은 제1, 제2 또는 제3 폴리펩티드의 아미노산 서열의 일부이다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 VL 도메인을 추가로 포함하되, 일부 구현예에서, Fc-항원 결합 도메인 작제물은 VL 도메인을 포함하는 제4 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, VH 도메인은 표 1에 기재된 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3 서열의 세트를 포함하거나, VH 도메인은 표 2에 기재된 항체의 서열을 포함하는 VH 도메인의 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하거나, VH 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 서열의 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하거나, CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3 서열을 제외한 VH 서열은 표 2에 기재된 항체의 VH 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 적어도 99.5% 동일하거나, 또는 VH 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 서열을 포함한다.
본 발명의 제13, 14, 및 15 양태의 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 표 1에 기재된 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3 서열의 세트를 포함하거나; 항원 결합 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 및 VL 서열 세트의 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3 서열을 포함하거나; 항원 결합 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 서열의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 표 2에 기재된 항체의 VL 서열의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하되, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3 서열을 제외한 VH 및 VL 도메인 서열은 표 2에 기재된 항체의 VH 및 VL 서열과 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 적어도 99.5% 동일하거나; 항원 결합 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 및 VL 서열의 세트를 포함한다.
본 개시의 제13, 제14, 및 제15 양태의 일부 구현예에서, Fc-항원 결합 도메인 작제물은 IgG CL 항체 불변 도메인 및 IgG CH1 항체 불변 도메인을 추가로 포함하며, 상기 IgG CH1 항체 불변 도메인은 링커를 통해 제1 폴리펩티드 또는 제2 폴리펩티드의 N-말단에 부착된다.
본 개시의 제13, 제14 및 제15 양태의 일부 구현예에서, 이량체화 선택성 모듈은 Fc 도메인 단량체 중 하나의 CH3 도메인 내에 유전자 조작 함몰부를 포함하고 Fc 도메인 단량체 중 다른 하나의 CH3 도메인 내에 유전자 조작 돌출부를 포함하며, 유전자 조작 함몰부 및 유전자 조작 돌출부는 Fc 도메인 단량체의 돌출부-함몰부 쌍을 형성하도록 위치된다. 일부 구현예에서, 유전자 조작 돌출부는 S354C, T366W, T366Y, T394W, T394F 및 F405W에서 선택된 적어도 하나의 변형을 포함하고, 유전자 조작 함몰부는 Y349C, T366S, L368A, Y407V, Y407T, Y407A, F405A 및 T394S에서 선택된 적어도 하나의 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 도메인 단량체 중 하나는 Y407V와 Y349C를 포함하고, Fc 도메인 단량체 중 다른 하나는 T366W와 S354C를 포함한다.
본 개시의 제13, 제14, 및 제15 양태의 일부 구현예에서, 이량체화 선택성 모듈은 도메인 단량체 중 하나의 CH3 도메인에 음전하 아미노산을 포함하고 Fc 도메인 단량체 중 다른 하나의 CH3 도메인에 양전하 아미노산을 포함하며, 음전하 아미노산과 양전하 아미노산은 Fc 도메인의 형성을 촉진하도록 위치된다. 일부 구현예에서, 제1 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체 각각은 D399K와 K409D 또는 K409E 중 하나를 포함하거나, 제1 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체 각각은 K392D와 D399K를 포함하거나, 제1 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체 각각은 E357K와 K370E를 포함하거나, 제1 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체 각각은 D356K와 K439D를 포함하거나, 제1 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체 각각은 K392E와 D399K를 포함하거나, 제1 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체 각각은 E357K와 K370D를 포함하거나, 제1 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체 각각은 D356K와 K439E를 포함하거나; 제2 Fc 도메인 단량체 및 제4 Fc 도메인 단량체는 S354C와 T366W를 포함하고 제3 및 제4 폴리펩티드는 각각 Y349C, T366S, L368A, 및 Y407V를 포함하거나; 제3 및 제4 폴리펩티드 각각은 S354C와 T366W를 포함하고 제2 Fc 도메인 단량체 및 제4 Fc 도메인 단량체는 각각 Y349C, T366S, L368A, 및 Y407V를 포함하거나; 제2 Fc 도메인 단량체 및 제4 Fc 도메인 단량체 각각은 E357K 또는 E357R을 포함하고 제3 및 제4 폴리펩티드는 각각 K370D 또는 K370E를 포함하거나; 제2 Fc 도메인 단량체 및 제4 Fc 도메인 단량체 각각은 K370D 또는 K370E를 포함하고 제3 및 제4 폴리펩티드는 각각 E357K 또는 357R을 포함하거나; 제2 Fc 도메인 단량체 및 제4 Fc 도메인 단량체 각각은 K409D 또는 K409E를 포함하고 제3 및 제4 폴리펩티드는 각각 D399K 또는 D399R을 포함하거나; 제2 Fc 도메인 단량체 및 제4 Fc 도메인 단량체 각각은 D399K 또는 D399R을 포함하고 제3 및 제4 폴리펩티드는 각각 K409D 또는 K409E를 포함한다.
본 개시의 제13, 제14, 및 제15 양태의 일부 구현예에서, Fc-항원 결합 도메인 작제물 내의 하나 이상의 링커는 결합이다.
본 개시의 제13, 제14, 및 제15 양태의 일부 구현예에서, Fc-항원 결합 도메인 작제물 내의 하나 이상의 링커는 스페이서이다. 일부 구현예에서, 스페이서는 서열 GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG, GGGGS, GGSG, SGGG, GSGS, GSGSGS, GSGSGSGS, GSGSGSGSGS, GSGSGSGSGSGS, GGSGGS, GGSGGSGGS, GGSGGSGGSGGS, GGSG, GGSG, GGSGGGSG, GGSGGGSGGGSGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS, GENLYFQSGG, SACYCELS, RSIAT, RPACKIPNDLKQKVMNH, GGSAGGSGSGSSGGSSGASGTGTAGGTGSGSGTGSG, AAANSSIDLISVPVDSR, GGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGS, GGGSGGGSGGGS, SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG, GGSGGGSGGGSGGGSGGS, GGGG, GGGGGGGG, GGGGGGGGGGGG, 또는 GGGGGGGGGGGGGGGG를 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 스페이서는 글리신 스페이서, 예를 들어, 4 내지 30개, 8 내지 30개, 또는 12 내지 30개의 글리신 잔기로 이루어진 것, 예컨대 20개의 글리신 잔기로 이루어진 스페이서이다.
본 개시의 제13, 제14, 및 제15 양태의 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 링커에 의해 Fc 도메인 단량체에 연결된다. 일부 구현예에서, 링커는 스페이서이다.
본 개시의 제13, 제14, 및 제15 양태의 일부 구현예에서, Fc 도메인 중 적어도 하나는 위치 I253에서 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 위치 I253에서의 각각의 아미노산 변형은 I253A, I253C, I253D, I253E, I253F, I253G, I253H, I253I, I253K, I253L, I253M, I253N, I253P, I253Q, I253R, I253S, I253T, I253V, I253W, 및 I253Y로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구현예에서, 위치 I253에서의 각각의 아미노산 변형은 I253A이다.
본 개시의 제13, 제14, 및 제15 양태의 일부 구현예에서, Fc 도메인 중 적어도 하나는 위치 R292에서 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 위치 R292에서의 각각의 아미노산 변형은 R292D, R292E, R292L, R292P, R292Q, R292R, R292T 및 R292Y로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구현예에서, 위치 R292에서의 각각의 아미노산 변형은 R292P이다.
본 개시의 제13, 제14, 및 제15 양태의 일부 구현예에서, Fc 도메인 단량체 중 하나 이상은 IgG 힌지 도메인, IgG CH2 항체 불변 도메인 및 IgG CH3 항체 불변 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 도메인 단량체 각각은 IgG 힌지 도메인, IgG CH2 항체 불변 도메인, 및 IgG CH3 항체 불변 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, IgG는 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, 및 IgG4로 이루어진 군으로부터 선택된 아형이다.
본 개시의 제13, 제14, 및 제15 양태의 일부 구현예에서, 폴리펩티드 각각에서 N-말단 Asp는 Gln으로 변이된다.
본 개시의 제13, 제14, 및 제15 양태의 일부 구현예에서, 폴리펩티드 중 하나 이상은 C-말단 라이신이 결여된다. 일부 구현예에서, 각각의 폴리펩티드는 C-말단 라이신이 결여된다.
본 개시의 제13, 제14, 및 제15 양태의 일부 구현예에서, Fc-항원 결합 도메인 작제물은 링커에 의해 하나 이상의 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 접합된 알부민-결합 펩티드를 추가로 포함한다.
제16 양태에서, 본 발명은 Fc-항원 결합 도메인 작제물에 관한 것으로서, 상기 Fc-항원 결합 도메인 작제물은: a) i) 제1 Fc 도메인 단량체, ii) 제2 Fc 도메인 단량체 및 iii) 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커를 포함하는 제1 폴리펩티드; b) 제3 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제2 폴리펩티드; c) 제4 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드; 및 d) 제1 폴리펩티드에 연결된 제1 항원 결합 도메인; 및 e) 제2 폴리펩티드 및/또는 제3 폴리펩티드에 연결된 제2 항원 결합 도메인을 포함하되, 제1 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성하며, 제1 및 제2 항원 결합 도메인은 상이한 항원에 결합하고, Fc-항원 결합 도메인 작제물은 단일 Fc 도메인 및 항원 결합 도메인을 갖는 작제물에 비해 항체 의존성 세포독성(ADCC) 검정, 항체 의존성 세포 식균작용(ADCP) 및/또는 보체 의존성 세포독성(CDC) 검정에서 강화된 효과기 기능을 갖는다.
제17 양태에서, 본 발명은 Fc-항원 결합 도메인 작제물에 관한 것으로서, 상기 Fc-항원 결합 도메인 작제물은:
a) i) 제1 Fc 도메인 단량체, ii) 제2 Fc 도메인 단량체, 및 iii) 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커를 포함하는, 제1 폴리펩티드; b) 제3 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제2 폴리펩티드; c) 제4 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드; d) 제1 폴리펩티드에 연결된 제1 항원 결합 도메인; 및 e) 제2 폴리펩티드 및/또는 제3 폴리펩티드에 연결된 제2 항원 결합 도메인을 포함하되, 제1 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성하며, 제1 및 제2 항원 결합 도메인은 상이한 항원에 결합하며, Fc-항원 결합 도메인 작제물은 단일 Fc 도메인 및 항원 결합 도메인을 갖는 작제물에 의해 나타나지 않는 생물학적 활성을 포함한다.
제18 양태에서, 본 발명은 Fc-항원 결합 도메인 작제물에 관한 것으로서, 상기 Fc-항원 결합 도메인 작제물은:
a) i) 제1 Fc 도메인 단량체, ii) 제2 Fc 도메인 단량체, 및 iii) 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 스페이서를 포함하는, 제1 폴리펩티드; b) 제3 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제2 폴리펩티드; c) 제4 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드; d) 제1 폴리펩티드에 연결된 제1 항원 결합 도메인; 및 e) 제2 폴리펩티드 및/또는 제3 폴리펩티드에 연결된 제2 항원 결합 도메인을 포함하되, 제1 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성하며, 제1 및 제2 항원 결합 도메인은 상이한 항원에 결합한다.
제19 양태에서, 본 발명은 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 집단을 포함하는 세포 배양 배지를 특징으로 하며, 몰 기준으로 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 적어도 50%는: a) i) 제1 Fc 도메인 단량체, ii) 제2 Fc 도메인 단량체 및 iii) 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커를 포함하는 제1 폴리펩티드; b) 제3 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제2 폴리펩티드; c) 제4 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드; 및 d) 제1 폴리펩티드에 연결된 제1 항원 결합 도메인; 및 e) 제2 폴리펩티드 및/또는 제3 폴리펩티드에 연결된 제2 항원 결합 도메인을 포함하되, 제1 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성하며, 제1 및 제2 항원 결합 도메인은 상이한 항원에 결합한다.
제20 양태에서, 본 발명은 Fc-항원 결합 도메인 작제물을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은: a) (1) i) 제1 Fc 도메인 단량체, ii) 제2 Fc 도메인 단량체, 및 iii) 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커를 포함하는 제1 폴리펩티드; (2) 제3 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제2 폴리펩티드; (3) 제4 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드; (4) 제1 폴리펩티드에 연결된 제1 항원 결합 도메인; 및 (5) 제2 폴리펩티드 및/또는 제3 폴리펩티드에 연결된 제2 항원 결합 도메인을 발현하는 숙주 세포를 배양하는 단계(여기서, 제1 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성하고; 항원 결합 도메인은 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드 또는 제3 폴리펩티드에 연결되어, Fc-항원 결합 도메인 작제물을 형성하고; 제1 및 제3 항원 결합 도메인은 상이한 항원에 결합하며; 몰 기준으로 세포 배양 상청액 중 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 적어도 50%는 구조적으로 동일함) 및 b) 세포 배양 상청액으로부터 Fc-항원 결합 도메인 작제물을 정제하는 단계를 포함한다.
제16, 제17, 제18, 제19, 및 제20 양태의 일부 구현예에서, 제1 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체는 제1 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체 사이의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함하고, 제2 Fc 도메인 단량체 및 제4 Fc 도메인 단량체는 제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체 사이의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함하며, 제2 폴리펩티드와 제3 폴리펩티드는 상이한 아미노산 서열을 갖는다.
제21 양태에서, 본 발명은 Fc-항원 결합 도메인 작제물에 관한 것으로서, 상기 Fc-항원 결합 도메인 작제물은:
a) i) 제1 Fc 도메인 단량체, ii) 제2 Fc 도메인 단량체, 및 iii) 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커를 포함하는, 제1 폴리펩티드; b) 제3 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제2 폴리펩티드; c) 제4 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드; d) 제1 폴리펩티드에 연결된 제1 항원 결합 도메인; e) 제2 폴리펩티드에 연결된 제2 항원 결합 도메인; 및 f) 제3 폴리펩티드에 연결된 제3 항원 결합 도메인을 포함하되, 제1 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성하며, 제1, 제2, 및 제3 항원 결합 도메인은 상이한 항원에 결합하고, Fc-항원 결합 도메인 작제물은 단일 Fc 도메인 및 항원 결합 도메인을 갖는 작제물에 비해 항체 의존성 세포독성(ADCC) 검정, 항체 의존성 세포 식균작용(ADCP) 및/또는 보체 의존성 세포독성(CDC) 검정에서 강화된 효과기 기능을 갖는다.
제22 양태에서, 본 발명은 Fc-항원 결합 도메인 작제물에 관한 것으로서, 상기 Fc-항원 결합 도메인 작제물은: a) i) 제1 Fc 도메인 단량체, ii) 제2 Fc 도메인 단량체, 및 iii) 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커를 포함하는, 제1 폴리펩티드; b) 제3 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제2 폴리펩티드; c) 제4 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드; d) 제1 폴리펩티드에 연결된 제1 항원 결합 도메인; e) 제2 폴리펩티드에 연결된 제2 항원 결합 도메인; 및 f) 제3 폴리펩티드에 연결된 제3 항원 결합 도메인을 포함하되; 제1 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성하고, 제1, 제2, 및 제3 항원 결합 도메인은 상이한 항원에 결합하며, Fc-항원 결합 도메인 작제물은 단일 Fc 도메인 및 항원 결합 도메인을 갖는 작제물에 의해 나타나지 않는 생물학적 활성을 포함한다.
제23 양태에서, 본 발명은 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 실질적으로 균질한 집단을 포함하는 조성물에 관한 것으로서, 상기 Fc-항원 결합 도메인 작제물은: a) i) 제1 Fc 도메인 단량체, ii) 제2 Fc 도메인 단량체, 및 iii) 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 스페이서를 포함하는, 제1 폴리펩티드; b) 제3 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제2 폴리펩티드; c) 제4 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드; d) 제1 폴리펩티드에 연결된 제1 항원 결합 도메인; e) 제2 폴리펩티드에 연결된 제2 항원 결합 도메인; 및 f) 제3 폴리펩티드에 연결된 제3 항원 결합 도메인을 포함하되, 제1 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성하며, 제1, 제2, 및 제3 항원 결합 도메인은 상이한 항원에 결합한다.
제24 양태에서, 본 발명은 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 집단을 포함하는 세포 배양 배지에 관한 것으로서, 몰 기준으로 상기 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 적어도 50%는: a) i) 제1 Fc 도메인 단량체, ii) 제2 Fc 도메인 단량체 및 iii) 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커를 포함하는, 제1 폴리펩티드; b) 제3 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제2 폴리펩티드; c) 제4 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드; d) 제1 폴리펩티드에 연결된 제1 항원 결합 도메인; e) 제2 폴리펩티드에 연결된 제2 항원 결합 도메인; 및 f) 제3 폴리펩티드에 연결된 제3 항원 결합 도메인을 포함하되, 제1 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성하며, 제1, 제2, 및 제3 항원 결합 도메인은 상이한 항원에 결합한다.
제25 양태에서, 본 발명은 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 제조 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은: a) (1) i) 제1 Fc 도메인 단량체, ii) 제2 Fc 도메인 단량체, 및 iii) 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커를 포함하는, 제1 폴리펩티드; (2) 제3 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제2 폴리펩티드; (3) 제4 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드; (4) 제1 폴리펩티드에 연결된 제1 항원 결합 도메인; 및 (5) 제2 폴리펩티드에 연결된 제2 항원 결합 도메인; 및 (6) 제3 폴리펩티드에 연결된 제3 항원 결합 도메인을 발현하는 숙주 세포를 배양하는 단계(여기서, 제1 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성하고; 항원 결합 도메인은 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 또는 제3 폴리펩티드에 연결되어 Fc-항원 결합 도메인 작제물을 형성하고; 제1 및 제2 항원 결합 도메인은 상이한 항원에 결합하며; 몰 기준으로 세포 배양 상청액 중 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 적어도 50%는 구조적으로 동일함) 및 b) 세포 배양 상청액으로부터 Fc-항원 결합 도메인 작제물을 정제하는 단계를 포함한다.
본 개시의 제21, 22, 23, 24, 및 25 양태의 일부 구현예에서, 제1 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체는 제1 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체 사이의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함하고, 제2 Fc 도메인 단량체 및 제4 Fc 도메인 단량체는 제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체 사이의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함하며, 제2 폴리펩티드와 제3 폴리펩티드는 상이한 아미노산 서열을 갖는다.
제26 양태에서, 본 발명은 Fc-항원 결합 도메인 작제물에 관한 것으로서, 상기 Fc-항원 결합 도메인 작제물은: a) i) 제1 Fc 도메인 단량체, ii) 제2 Fc 도메인 단량체, 및 iii) 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커를 포함하는, 제1 폴리펩티드; 및 b) iv) 제3 Fc 도메인 단량체, v) 제4 Fc 도메인 단량체, 및 vi) 제3 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제2 링커를 포함하는, 제2 폴리펩티드; 및 제5 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드; d) 제6 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제4 폴리펩티드; 및 d) 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 제3 폴리펩티드, 또는 제4 폴리펩티드에 연결된 항원 결합 도메인을 포함하되, 제1 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제2 Fc 도메인 단량체와 제5 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성하고, 제4 Fc 도메인 단량체와 제6 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제3 Fc 도메인을 형성하며, Fc-항원 결합 도메인 작제물은 단일 Fc 도메인 및 항원 결합 도메인을 갖는 작제물에 비해 항체 의존성 세포독성(ADCC) 검정, 항체 의존성 세포 식균작용(ADCP) 및/또는 보체 의존성 세포독성(CDC) 검정에서 강화된 효과기 기능을 갖는다.
제27 양태에서, 본 발명은 Fc-항원 결합 도메인 작제물에 관한 것으로서, 상기 Fc-항원 결합 도메인 작제물은: a) i) 제1 Fc 도메인 단량체, ii) 제2 Fc 도메인 단량체 및 iii) 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제1 링커를 포함하는, 제1 폴리펩티드; 및 b) iv) 제3 Fc 도메인 단량체, v) 제4 Fc 도메인 단량체 및 vi) 제3 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제2 링커를 포함하는, 제2 폴리펩티드; 및 c) 제5 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드; d) 제6 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제4 폴리펩티드; 및 e) 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 제3 폴리펩티드, 또는 제4 폴리펩티드에 연결된 항원 결합 도메인을 포함하되, 제1 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제2 Fc 도메인 단량체와 제5 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성하고, 제4 Fc 도메인 단량체와 제6 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제3 Fc 도메인을 형성하며, Fc-항원 결합 도메인 작제물은 단일 Fc 도메인 및 항원 결합 도메인을 갖는 작제물에 의해 나타나지 않는 생물학적 활성을 포함한다.
제28 양태에서, 본 개시는 Fc-항원 결합 도메인 작제물에 관한 것으로서, 상기 Fc-항원 결합 도메인 작제물은: a) i) 제1 Fc 도메인 단량체, ii) 제2 Fc 도메인 단량체 및 iii) 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제1 스페이서를 포함하는, 제1 폴리펩티드; 및 b) iv) 제3 Fc 도메인 단량체, v) 제4 Fc 도메인 단량체 및 vi) 제3 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제2 스페이서를 포함하는, 제2 폴리펩티드; 및 c) 제5 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드; d) 제6 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제4 폴리펩티드; 및 e) 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 제3 폴리펩티드, 또는 제4 폴리펩티드에 연결된 항원 결합 도메인을 포함하되, 제1 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제2 Fc 도메인 단량체와 제5 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성하고, 제4 Fc 도메인 단량체와 제6 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제3 Fc 도메인을 형성한다.
제29 양태에서, 본 개시는 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 집단을 포함하는 세포 배양 배지에 관한 것으로서, 몰 기준으로 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 적어도 50%는: a) i) 제1 Fc 도메인 단량체, ii) 제2 Fc 도메인 단량체 및 iii) 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제1 링커를 포함하는, 제1 폴리펩티드; 및 b) iv) 제3 Fc 도메인 단량체, v) 제4 Fc 도메인 단량체 및 vi) 제3 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제2 링커를 포함하는, 제2 폴리펩티드; 및 c) 제5 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드; d) 제6 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제4 폴리펩티드; 및 e) 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 제3 폴리펩티드, 또는 제4 폴리펩티드에 연결된 항원 결합 도메인을 포함하고; 제1 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제2 Fc 도메인 단량체와 제5 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성하며, 제4 Fc 도메인 단량체와 제6 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제3 Fc 도메인을 형성한다.
제30 양태에서, 본 개시는 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 제조 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은: a) (1) i) 제1 Fc 도메인 단량체, ii) 제2 Fc 도메인 단량체 및 iii) 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제1 링커를 포함하는, 제1 폴리펩티드; 및 (2) iv) 제3 Fc 도메인 단량체, v) 제4 Fc 도메인 단량체 및 vi) 제3 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제2 링커를 포함하는, 제2 폴리펩티드; 및 (3) 제5 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드; (4) 제6 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제4 폴리펩티드; 및 (5) 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 제3 폴리펩티드, 또는 제4 폴리펩티드에 연결된 항원 결합 도메인을 발현하는 숙주 세포를 배양하는 단계(제1 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제2 Fc 도메인 단량체와 제5 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성하고, 제4 Fc 도메인 단량체와 제6 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제3 Fc 도메인을 형성하며, 몰 기준으로 세포 배양 상청 중 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 적어도 50%는 구조적으로 동일함), 및 b) 세포 배양 상청액으로부터 Fc-항원 결합 도메인 작제물을 정제하는 단계를 포함한다.
본 발명의 제26, 제27, 제28, 제29 및 제30 양태의 일부 구현예에서, 제1 및 제3 Fc 도메인 단량체 각각은 제1 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체 사이의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함하고, 제2 및 제5 Fc 도메인 단량체 각각은 제2 Fc 도메인 단량체와 제5 Fc 도메인 단량체 사이의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함하며, 제4 및 제6 Fc 도메인 단량체 각각은 제4 Fc 도메인 단량체와 제6 Fc 도메인 단량체 사이의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함한다.
제31 양태에서, 본 발명은 Fc-항원 결합 도메인 작제물에 관한 것으로서, 상기 Fc-항원 결합 도메인 작제물은: a) i) 제1 Fc 도메인 단량체, ii) 제2 Fc 도메인 단량체, 및 iii) 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커를 포함하는, 제1 폴리펩티드; 및 b) iv) 제3 Fc 도메인 단량체, v) 제4 Fc 도메인 단량체, 및 vi) 제3 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제2 링커를 포함하는, 제2 폴리펩티드; 및 c) 제5 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드; d) 제6 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제4 폴리펩티드; 및 e) 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 제3 폴리펩티드, 또는 제4 폴리펩티드에 연결된 항원 결합 도메인을 포함하되, 제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제1 Fc 도메인 단량체와 제5 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성하며, 제3 Fc 도메인 단량체와 제6 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제3 Fc 도메인을 형성하며, Fc-항원 결합 도메인 작제물은 단일 Fc 도메인 및 항원 결합 도메인을 갖는 작제물에 비해 항체 의존성 세포독성(ADCC) 검정, 항체 의존성 세포 식균작용(ADCP) 및/또는 보체 의존성 세포독성(CDC) 검정에서 강화된 효과기 기능을 갖는다.
제32 양태에서, 본 발명은 Fc-항원 결합 도메인 작제물에 관한 것으로서, 상기 Fc-항원 결합 도메인 작제물은: a) i) 제1 Fc 도메인 단량체, ii) 제2 Fc 도메인 단량체 및 iii) 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제1 링커를 포함하는, 제1 폴리펩티드; 및 b) iv) 제3 Fc 도메인 단량체, v) 제4 Fc 도메인 단량체 및 vi) 제3 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제2 링커를 포함하는, 제2 폴리펩티드; 및 c) 제5 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드; d) 제6 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제4 폴리펩티드; 및 e) 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 제3 폴리펩티드, 또는 제4 폴리펩티드에 연결된 항원 결합 도메인을 포함하되, 제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제1 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성하고, 제3 Fc 도메인 단량체와 제6 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제3 Fc 도메인을 형성하며, Fc-항원 결합 도메인 작제물은 단일 Fc 도메인 및 항원 결합 도메인을 갖는 작제물에 의해 나타나지 않는 생물학적 활성을 포함한다.
제33 양태에서, 본 개시는 Fc-항원 결합 도메인 작제물에 관한 것으로서, 상기 Fc-항원 결합 도메인 작제물은: a) i) 제1 Fc 도메인 단량체, ii) 제2 Fc 도메인 단량체 및 iii) 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제1 스페이서를 포함하는, 제1 폴리펩티드; 및 b) iv) 제3 Fc 도메인 단량체, v) 제4 Fc 도메인 단량체, 및 vi) 제3 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제2 스페이서를 포함하는, 제2 폴리펩티드; 및 c) 제5 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드; d) 제6 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제4 폴리펩티드; 및 e) 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 제3 폴리펩티드, 또는 제4 폴리펩티드에 연결된 항원 결합 도메인을 포함하되, 제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제1 Fc 도메인 단량체와 제5 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성하며, 제3 Fc 도메인 단량체와 제6 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제3 Fc 도메인을 형성한다.
제34 양태에서, 본 개시는 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 집단을 포함하는 세포 배양 배지에 관한 것으로서, 몰 기준으로 상기 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 적어도 50%는: a) i) 제1 Fc 도메인 단량체, ii) 제2 Fc 도메인 단량체 및 iii) 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제1 링커를 포함하는, 제1 폴리펩티드; 및 b) iv) 제3 Fc 도메인 단량체, v) 제4 Fc 도메인 단량체 및 vi) 제3 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체를 접합하는 제2 링커를 포함하는, 제2 폴리펩티드; 및 c) 제5 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드; d) 제6 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제4 폴리펩티드; 및 e) 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 제3 폴리펩티드, 또는 제4 폴리펩티드에 연결된 항원 결합 도메인을 포함하되; 제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제1 Fc 도메인 단량체와 제5 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성하며, 제3 Fc 도메인 단량체와 제6 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제3 Fc 도메인을 형성한다.
제35 양태에서, 본 개시는 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 제조 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은: a) (1) i) 제1 Fc 도메인 단량체, ii) 제2 Fc 도메인 단량체 및 iii) 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제1 링커를 포함하는, 제1 폴리펩티드; 및 (2) iv) 제3 Fc 도메인 단량체, v) 제4 Fc 도메인 단량체 및 vi) 제3 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제2 링커를 포함하는, 제2 폴리펩티드; 및 (3) 제5 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드; (4) 제6 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제4 폴리펩티드; 및 (5) 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 제3 폴리펩티드, 또는 제4 폴리펩티드에 연결된 항원 결합 도메인을 발현하는 숙주 세포를 배양하는 단계(제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제1 Fc 도메인 단량체와 제5 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성하고, 제3 Fc 도메인 단량체와 제6 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제3 Fc 도메인을 형성하며, 몰 기준으로 세포 배양 상청액 중 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 적어도 50%는 구조적으로 동일함), 및 b) 세포 배양 상청액으로부터 Fc-항원 결합 도메인 작제물을 정제하는 단계를 포함한다.
본 개시의 제31, 제32, 제33, 제34, 또는 제35 양태의 일부 구현예에서, 제2 및 제4 Fc 도메인 단량체 각각은 제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체 사이의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함하고, 제1 및 제5 Fc 도메인 단량체 각각은 제1 Fc 도메인 단량체와 제5 Fc 도메인 단량체 사이의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함하며, 제3 및 제6 Fc 도메인 단량체 각각은 제3 Fc 도메인 단량체와 제6 Fc 도메인 단량체 사이의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함한다.
제36 양태에서, 본 발명은 Fc-항원 결합 도메인 작제물에 관한 것으로서, 상기 Fc-항원 결합 도메인 작제물은:
a) i) 제1 Fc 도메인 단량체, ii) 제2 Fc 도메인 단량체, iii) 제3 Fc 도메인 단량체, iv) 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제1 링커; 및 v) 제2 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제2 링커를 포함하는, 제1 폴리펩티드; b) vi) 제4 Fc 도메인 단량체, vii) 제5 Fc 도메인 단량체, viii) 제6 Fc 도메인 단량체, ix) 제4 Fc 도메인 단량체와 제5 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제3 링커; 및 x) 제5 Fc 도메인 단량체와 제6 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제4 링커를 포함하는, 제2 폴리펩티드; c) 제7 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드; d) 제8 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제4 폴리펩티드; e) 제9 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제5 폴리펩티드; f) 제10 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제6 폴리펩티드; 및 g) 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 제3 폴리펩티드, 제4 폴리펩티드, 제5 폴리펩티드, 또는 제6 폴리펩티드에 연결된 항원 결합 도메인을 포함하되, 제2 Fc 도메인 단량체와 제5 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하며, 제1 Fc 도메인 단량체와 제7 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성하고, 제4 Fc 도메인 단량체와 제8 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제3 Fc 도메인을 형성하며, 제3 Fc 도메인 단량체와 제9 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제4 Fc 도메인을 형성하고, 제6 Fc 도메인 단량체와 제10 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제5 Fc 도메인을 형성하며, Fc-항원 결합 도메인 작제물은 단일 Fc 도메인 및 항원 결합 도메인을 갖는 작제물에 비해 항체 의존성 세포독성(ADCC) 검정, 항체 의존성 세포 식균작용(ADCP) 및/또는 보체 의존성 세포독성(CDC) 검정에서 강화된 효과기 기능을 갖는다.
제37 양태에서, 본 발명은 Fc-항원 결합 도메인 작제물에 관한 것으로서, 상기 Fc-항원 결합 도메인 작제물은: a) i) 제1 Fc 도메인 단량체, ii) 제2 Fc 도메인 단량체, iii) 제3 Fc 도메인 단량체, iv) 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제1 링커; 및 v) 제2 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제2 링커를 포함하는, 제1 폴리펩티드; b) vi) 제4 Fc 도메인 단량체, vii) 제5 Fc 도메인 단량체, viii) 제6 Fc 도메인 단량체, ix) 제4 Fc 도메인 단량체와 제5 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제3 링커; 및 x) 제5 Fc 도메인 단량체와 제6 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제4 링커를 포함하는, 제2 폴리펩티드; c) 제7 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드; d) 제8 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제4 폴리펩티드; e) 제9 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제5 폴리펩티드; f) 제10 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제6 폴리펩티드; 및 g) 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 제3 폴리펩티드, 제4 폴리펩티드, 제5 폴리펩티드 또는 제6 폴리펩티드에 연결된 항원 결합 도메인을 포함하되, 제2 Fc 도메인 단량체와 제5 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하며, 제1 Fc 도메인 단량체와 제7 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성하고, 제4 Fc 도메인 단량체와 제8 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제3 Fc 도메인을 형성하며, 제3 Fc 도메인 단량체와 제9 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제4 Fc 도메인을 형성하고, 제6 Fc 도메인 단량체와 제10 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제5 Fc 도메인을 형성하며, Fc-항원 결합 도메인 작제물은 단일 Fc 도메인 및 항원 결합 도메인을 갖는 작제물에 의해 나타나지 않는 생물학적 활성을 포함한다.
제38 양태에서, 본 발명은 Fc-항원 결합 도메인 작제물에 관한 것으로서, 상기 Fc-항원 결합 도메인 작제물은: a) i) 제1 Fc 도메인 단량체, ii) 제2 Fc 도메인 단량체, iii) 제3 Fc 도메인 단량체, iv) 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제1 스페이서; 및 v) 제2 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제2 스페이서를 포함하는, 제1 폴리펩티드; b) vi) 제4 Fc 도메인 단량체, vii) 제5 Fc 도메인 단량체, viii) 제6 Fc 도메인 단량체, ix) 제4 Fc 도메인 단량체와 제5 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제3 스페이서; 및 x) 제5 Fc 도메인 단량체와 제6 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제4 스페이서를 포함하는, 제2 폴리펩티드; c) 제7 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드; d) 제8 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제4 폴리펩티드; e) 제9 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제5 폴리펩티드; f) 제10 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제6 폴리펩티드; 및 g) 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 제3 폴리펩티드, 제4 폴리펩티드, 제5 폴리펩티드 또는 제6 폴리펩티드에 연결된 항원 결합 도메인을 포함하되, 제2 Fc 도메인 단량체와 제5 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하며, 제1 Fc 도메인 단량체와 제7 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성하고, 제4 Fc 도메인 단량체와 제8 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제3 Fc 도메인을 형성하며, 제3 Fc 도메인 단량체와 제9 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제4 Fc 도메인을 형성하고, 제6 Fc 도메인 단량체와 제10 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제5 Fc 도메인을 형성한다.
제39 양태에서, 본 발명은 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 실질적으로 동종 집단을 포함하는 세포 배양 배지에 관한 것으로서, 몰 기준으로 상기 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 적어도 50%는: a) i) 제1 Fc 도메인 단량체, ii) 제2 Fc 도메인 단량체, iii) 제3 Fc 도메인 단량체, iv) 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제1 스페이서; 및 v) 제2 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제2 스페이서를 포함하는, 제1 폴리펩티드; b) vi) 제4 Fc 도메인 단량체, vii) 제5 Fc 도메인 단량체, viii) 제6 Fc 도메인 단량체, ix) 제4 Fc 도메인 단량체와 제5 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제3 스페이서; 및 x) 제5 Fc 도메인 단량체와 제6 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제4 스페이서를 포함하는, 제2 폴리펩티드; c) 제7 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드; d) 제8 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제4 폴리펩티드; e) 제9 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제5 폴리펩티드; f) 제10 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제6 폴리펩티드; 및 g) 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 제3 폴리펩티드, 제4 폴리펩티드, 제5 폴리펩티드 또는 제6 폴리펩티드에 연결된 항원 결합 도메인을 포함하되, 제2 Fc 도메인 단량체와 제5 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하며, 제1 Fc 도메인 단량체와 제7 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성하고, 제4 Fc 도메인 단량체와 제8 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제3 Fc 도메인을 형성하며, 제3 Fc 도메인 단량체와 제9 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제4 Fc 도메인을 형성하고, 제6 Fc 도메인 단량체와 제10 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제5 Fc 도메인을 형성한다.
제40 양태에서, 본 발명은 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 제조 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은: a) (1) i) 제1 Fc 도메인 단량체, ii) 제2 Fc 도메인 단량체, iii) 제3 Fc 도메인 단량체, iv) 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제1 스페이서; 및 v) 제2 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제2 스페이서를 포함하는, 제1 폴리펩티드; (2) vi) 제4 Fc 도메인 단량체, vii) 제5 Fc 도메인 단량체, viii) 제6 Fc 도메인 단량체, ix) 제4 Fc 도메인 단량체와 제5 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제3 스페이서; 및 x) 제5 Fc 도메인 단량체와 제6 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제4 스페이서를 포함하는, 제2 폴리펩티드; (3) 제7 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드; (4) 제8 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제4 폴리펩티드; (5) 제9 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제5 폴리펩티드; (6) 제10 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제6 폴리펩티드; 및 (7) 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 제3 폴리펩티드, 제4 폴리펩티드, 제5 폴리펩티드 또는 제6 폴리펩티드에 연결된 항원 결합 도메인을 발현하는 숙주 세포를 배양하는 단계(제2 Fc 도메인 단량체와 제5 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제1 Fc 도메인 단량체와 제7 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성하고, 제4 Fc 도메인 단량체와 제8 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제3 Fc 도메인을 형성하고, 제3 Fc 도메인 단량체와 제9 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제4 Fc 도메인을 형성하고, 제6 Fc 도메인 단량체와 제10 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제5 Fc 도메인을 형성하며, 몰 기준으로 세포 배양 상청액 중 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 적어도 50%는 동일함), 및 b) 세포 배양 상청액으로부터 Fc-항원 결합 도메인 작제물을 정제하는 단계를 포함한다.
본 발명의 제36, 제37, 제38, 제39, 및 제40 양태의 일부 구현예에서, 제2 및 제5 Fc 도메인 단량체 각각은 제2 Fc 도메인 단량체와 제5 Fc 도메인 단량체 사이의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함하고, 제1 및 제7 Fc 도메인 단량체 각각은 제1 Fc 도메인 단량체와 제7 Fc 도메인 단량체 사이의 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함하며, 제4 및 제8 Fc 도메인 단량체 각각은 제4 Fc 도메인 단량체와 제8 Fc 도메인 단량체 사이의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함하고, 제3 및 제9 Fc 도메인 단량체 각각은 제3 Fc 도메인 단량체와 제9 Fc 도메인 단량체 사이의 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함하며, 제6 및 제10 Fc 도메인 단량체 각각은 제6 Fc 도메인 단량체와 제10 Fc 도메인 단량체 사이의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함한다.
본 발명의 모든 양태의 일부 구현예에서, Fc-항원 결합 도메인 작제물은 감소된 푸코실화를 갖는다. 따라서, 일부 구현예에서, Fc-항원 결합 도메인 작제물을 포함하는 조성물 중 Fc-도메인 단량체의 40%, 30%, 20%, 15%, 10% 또는 5% 미만은 푸코실화된다.
본 발명의 모든 양태의 일부 구현예에서, Fc 도메인 단량체는 CH3 도메인에 최대 10개(9개, 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개)의 단일 아미노산 변화를 갖는 도 53a(서열 번호 43)의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 모든 양태의 일부 구현예에서, Fc 도메인 단량체는 CH3 도메인에 최대 10개(9개, 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개)의 단일 아미노산 변화를 갖는 도 53b(서열 번호 45)의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 모든 양태의 일부 구현예에서, Fc 도메인 단량체는 CH3 도메인에 최대 10개(9개, 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개)의 단일 아미노산 변화를 갖는 도 53c(서열 번호 47)의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 모든 양태의 일부 구현예에서, Fc 도메인 단량체는 CH3 도메인에 최대 10개(9개, 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개)의 단일 아미노산 변화를 갖는 도 53d(서열 번호 42)의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 모든 양태의 일부 구현예에서, 예를 들어, Fc 도메인 단량체가 폴리펩티드의 카복시-말단에 있을 경우, Fc 도메인 단량체는 K447을 포함하지 않는다. 다른 구현예에서, 예를 들어, Fc 도메인 단량체가 폴리펩티드의 카복시-말단에 있지 않을 경우, Fc 도메인 단량체는 K447을 포함한다.
본 발명의 모든 양태의 일부 구현예에서, 예를 들어, Fc 도메인 단량체가 링커에 대해 아미노 말단인 경우, Fc 도메인 단량체는 E216에서 C220까지의 힌지 부분을 포함하지 않지만, D221에서 L235까지의 힌지 부분을 포함한다. 다른 구현예에서, 예를 들어, Fc 도메인 단량체가 CH1 도메인에 대해 카복시-말단인 경우, Fc 도메인 단량체는 E216에서 L235까지의 힌지 부분을 포함한다. 본 발명의 모든 양태의 일부 구현예에서, 힌지 도메인, 예를 들어 폴리펩티드의 아미노 말단에 있는 힌지 도메인은 EU 위치 221에서 Asp에서 Gln으로의 돌연변이를 갖는다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 Fc-항원 결합 도메인 작제물은 2개 이상의 IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하는 폴리펩티드로부터 조립되며, 이러한 폴리펩티드는 본 발명의 양태이다.
제41 양태에서, 본 발명은 항원 결합 도메인; 링커; 힌지 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체; 제2 링커; 힌지 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체; 임의의 제3 링커; 및 힌지 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 임의의 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하되, 적어도 하나의 Fc 도메인 단량체는 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이를 포함하는, 폴리펩티드를 특징으로 한다.
제41 양태의 다양한 구현예에서, 항원 결합 도메인은 항체 중쇄 가변 도메인을 포함하고; 항원 결합 도메인은 항체 경쇄 가변 도메인을 포함하며; 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체는 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이를 포함하고, 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체는 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이를 포함하며, 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체는 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이를 포함하고, 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체는 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이를 포함하며; 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체와 제2 IgG 불변 도메인 단량체 둘 모두는 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이를 포함하고; 폴리펩티드는 제3 링커 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하되, 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체, 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체 각각은 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이를 포함하며; 폴리펩티드는 제3 링커 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하되, 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체와 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체 두 둘 모두는 각각 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이를 포함하며, 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체는 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이를 포함하고; 폴리펩티드는 제3 링커 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하되, 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체와 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체 둘 모두는 각각 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이를 포함하며, 제2 IgG1 도메인 단량체는 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이를 포함하며; 폴리펩티드는 제3 링커 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하되, 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체와 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체 둘 모두는 각각 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이를 포함하고, 제1 IgG1 도메인 단량체는 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이를 포함한다.
제41 양태의 다양한 구현예에서, 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이를 포함하는 IgG1 Fc 도메인 단량체들은 1, 2, 또는 3개의 역전하 돌연변이를 추가로 포함하고; 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이 및 역전하 돌연변이는 CH3 도메인에 있으며; 상기 돌연변이는 EU 위치 G341에서 EU 위치 K447까지의 서열 내에 있고; 상기 돌연변이는 단일 아미노산 변화이며; 제2 링커 및 임의의 제3 링커는 GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG, GGGGS, GGSG, SGGG, GSGS, GSGSGS, GSGSGSGS, GSGSGSGSGS, GSGSGSGSGSGS, GGSGGS, GGSGGSGGS, GGSGGSGGSGGS, GGSG, GGSG, GGSGGGSG, GGSGGGSGGGSGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS, GENLYFQSGG, SACYCELS, RSIAT, RPACKIPNDLKQKVMNH, GGSAGGSGSGSSGGSSGASGTGTAGGTGSGSGTGSG, AAANSSIDLISVPVDSR, GGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGS, GGGSGGGSGGGS, SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG, GGSGGGSGGGSGGGSGGS, GGGG, GGGGGGGG, GGGGGGGGGGGG 및 GGGGGGGGGGGGGGGG로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 이러한 아미노산 서열로 이루어지며; 제2 링커 및 임의의 제3 링커는 글리신 스페이서이고; 제2 링커 및 임의의 제3 링커는 독립적으로 4 내지 30개, 4 내지 20개, 8 내지 30개, 8 내지 20개, 12 내지 20개 또는 12 내지 30개의 글리신 잔기로 이루어지며; 제2 링커 및 임의의 제3 링커는 20개의 글리신 잔기로 이루어지고; Fc 도메인 단량체 중 적어도 하나는 EU 위치 I253에서 단일 아미노산 돌연변이를 포함하고, EU 위치 I253에서의 각각의 아미노산 돌연변이는 I253A, I253C, I253D, I253E, I253F, I253G, I253H, I253I, I253K, I253L, I253M, I253N, I253P, I253Q, I253R, I253S, I253T, I253V, I253W, 및 I253Y로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며; 위치 I253에서의 각각의 아미노산 돌연변이는 I253A이고; Fc 도메인 단량체 중 적어도 하나는 EU 위치 R292에서 단일 아미노산 돌연변이를 포함하며; EU 위치 R292에서의 각각의 아미노산 돌연변이는 R292D, R292E, R292L, R292P, R292Q, R292R, R292T, 및 R292Y로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; 위치 R292에서의 각각의 아미노산 돌연변이는 R292P이며; 각각의 Fc 도메인 단량체는 EPKSCDKTHTCPPCPAPELL 및 DKTHTCPPCPAPELL로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이러한 아미노산 서열로 이루어지며; 제2 Fc 도메인 단량체 및 제3 도메인 단량체의 힌지 부분은 아미노산 서열 DKTHTCPPCPAPELL을 갖고; 제1 Fc 도메인 단량체의 힌지 부분은 아미노산 서열 EPKSCDKTHTCPPCPAPEL을 갖고; 제1 Fc 도메인 단량체의 힌지 부분은 아미노산 서열 EPKSCDKTHTCPPCPAPEL을 갖고, 제2 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체의 힌지 부분은 아미노산 서열 DKTHTCPPCPAPELL을 가지며; 각 Fc 도메인 단량체의 CH2 도메인은 독립적으로 2개 이하의 단일 아미노산 결실 또는 치환을 갖는 아미노산 서열 GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK를 포함하고; 각 Fc 도메인의 CH2 도메인은 동일하며, 2개 이하의 단일 아미노산 결실 또는 치환을 갖는 아미노산 서열 GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK를 포함하고; 각 Fc 도메인의 CH2 도메인은 동일하며, 2개 이하의 단일 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열 GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK를 포함하고; 각 Fc 도메인 단량체의 CH2 도메인은 동일하며, 아미노산 서열 GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK를 포함하고; 각 Fc 도메인 단량체의 CH3 도메인은 독립적으로, 10개 이하의 단일 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG를 포함하고; 각 Fc 도메인 단량체의 CH3 도메인은 독립적으로, 8개 이하의 단일 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG를 포함하고; 각 Fc 도메인 단량체의 CH3 도메인은 독립적으로, 6개 이하의 단일 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG를 포함하고; 각 Fc 도메인 단량체의 CH3 도메인은 독립적으로, 5개 이하의 단일 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG를 포함하고; 단일 아미노산 치환은 T366Y, T366W, T394W, T394Y, F405W, F405A, Y407A, S354C, Y349T, T394F, K409D, K409E, K392D, K392E, K370D, K370E, D399K, D399R, E357K, E357R, D356K 및 D356R로 이루어진 군에서 선택되며; Fc 도메인 단량체 각각은 독립적으로 최대 10개의 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 42, 43, 45 및 47 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고; 단일 아미노산 치환 중 최대 6개는 CH3 도메인에 있는 역전하 돌연변이이거나 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이이며; 단일 아미노산 치환은 EU 위치 G341에서 EU 위치 K447까지의 서열 내에 있고; 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이 중 적어도 하나는 T366Y, T366W, T394W, T394Y, F405W, S354C, Y349T 및 T394F로 이루어진 군에서 선택되며; 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이는 K409D, K409E, K392D. K392E, K370D, K370E, D399K, D399R, E357K, E357R, D356K, 및 D356R에서 선택되며; 항원 결합 도메인은 scFv이고; 항원 결합 도메인은 VH 도메인 및 CH1 도메인을 포함하며; 항원 결합 도메인은 VL 도메인을 추가로 포함하고; VH 도메인은 표 1에 기재된 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 서열의 세트를 포함하고; VH 도메인은 표 2에 기재된 항체의 서열을 포함하는 VH 도메인의 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하고; VH 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 서열의 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하되, CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3 서열을 제외한 VH 서열은 표 2에 기재된 항체의 VH 서열과 적어도 95% 또는 98% 동일하고; VH 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 서열을 포함하고; 항원 결합 도메인은 표 1에 기재된 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 서열의 세트를 포함하며; 항원 결합 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 및 VL 서열의 세트로부터 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 서열을 포함하고; 항원 결합 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 서열의 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인 및 표 2에 기재된 항체의 VL 서열의 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하되, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 제외한 VH 및 VL 도메인 서열은 표 2에 기재된 항체의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 또는 98% 동일하며; 항원 결합 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 및 VL 서열의 세트를 포함하고; 항원 결합 도메인은 IgG CL 항체 불변 도메인 및 IgG CH1 항체 불변 도메인을 포함하며; 항원 결합 도메인은 VH 도메인 및 CH1 도메인을 포함하고 VL 도메인 및 CL 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 결합하여 Fab를 형성할 수 있다.
제1 또는 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체의 힌지 내의 시스테인 잔기 사이의 이황화 결합에 의해 연결된 전술한 조성물의 2개의 카피를 포함하는 폴리펩티드 복합체가 또한 기재되어 있다.
전술한 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 복합체가 또한 기재되어 있다.
힌지 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제2 폴리펩티드에 연결된 상술한 폴리펩티드를 포함하되, 상기 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드는 상기 폴리펩티드의 제1, 제2 또는 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체의 힌지 도메인 및 제2 폴리펩티드의 힌지 도메인 내의 시스테인 잔기 사이의 이황화 결합에 의해 연결되는, 폴리펩티드 복합체가 또한 기재되어 있다.
복합체의 다양한 구현예에서: 제2 폴리펩티드 단량체는 유전자 조작 함몰부를 형성하는 돌연변이를 포함하며; 유전자 조작 함몰부를 형성하는 돌연변이는 Y407T, Y407A, F405A, T394S, T394W/Y407A, T366W/T394S, T366S/L368A/Y407V/Y349C, S364H/F405A로 이루어진 군에서 선택되며; 제2 폴리펩티드는 최대 10개의 단일 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 42, 43, 45 및 47 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
제42 양태에서, 본 발명은 항원 결합 도메인; 링커; 힌지 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체; 제2 링커; 힌지 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체; 임의의 제3 링커; 및 힌지 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 임의의 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하되, 적어도 하나의 Fc 도메인 단량체는 1개, 2개 또는 3개의 역전하 돌연변이를 포함하는 폴리펩티드를 특징으로 한다.
제42 양태의 다양한 구현예에서, 항원 결합 도메인은 항체 중쇄 가변 도메인을 포함하고; 항원 결합 도메인은 항체 경쇄 가변 도메인을 포함하고; 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체는 표 5에 있는 것들에서 선택된 2개의 역전하 돌연변이 세트 또는 표 6에 있는 것들에서 선택된 4개의 역전하 돌연변이 세트를 포함하고, 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체는 표 4에서 선택된 1개, 2개, 또는 3개의 역전하 아미노산 돌연변이를 포함하며; 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체는 표 4에서 선택된 1개, 2개, 또는 3개의 역전하 아미노산 돌연변이를 포함하고, 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체는 표 5에 있는 것들에서 선택된 2개의 역전하 돌연변이 세트 또는 표 6에 있는 것들에서 선택된 4개의 역전하 돌연변이 세트를 포함하고; 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체 및 제2 IgG 불변 도메인 단량체 모두는 표 4에서 선택된 1개, 2개, 또는 3개의 역전하 아미노산 돌연변이를 포함하고; 폴리펩티드는 제3 링커 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체를 추가로 포함하되, 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체, 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체, 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체는 각각 표 4에서 선택된 1개, 2개, 또는 3개의 역전하 아미노산 돌연변이를 포함하고; 폴리펩티드는 제3 링커 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체를 추가로 포함하되, 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체 및 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체 모두는 각각 표 4에서 선택된 1개, 2개, 또는 3개의 역전하 아미노산 돌연변이를 포함하고, 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체는 표 5에 있는 것들에서 선택된 2개의 역전하 돌연변이 세트 또는 표 6에 있는 것들에서 선택된 4개의 역전하 돌연변이 세트를 포함하고; 폴리펩티드는 제3 링커 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체를 추가로 포함하되, 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체 모두는 각각 표 4에서 선택된 1개, 2개, 또는 3개의 역전하 아미노산 돌연변이를 포함하고, 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체는 표 5에 있는 것들에서 선택된 2개의 역전하 돌연변이 세트 또는 표 6에 있는 것들에서 선택된 4개의 역전하 돌연변이 세트를 포함하고; 폴리펩티드는 제3 링커 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체를 추가로 포함하되, 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체 모두는 각각 표 4에서 선택된 1개, 2개, 또는 3개의 역전하 아미노산 돌연변이를 포함하고, 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체는 표 5에 있는 것들에서 선택된 2개의 역전하 돌연변이 세트 또는 표 6에 있는 것들에서 선택된 4개의 역전하 돌연변이 세트를 포함하고; 표 4에서 선택된 1개, 2개, 또는 3개의 역전하 아미노산 돌연변이를 포함하는 IgG1 Fc 도메인 단량체는 동일한 CH3 도메인을 가지고; 표 4에서 선택된 1개, 2개, 또는 3개의 역전하 아미노산 돌연변이는 CH3 도메인에 있고; 돌연변이는 EU 위치 G341에서 EU 위치 K447까지의 서열 내에 있고; 돌연변이는 각각 단일 아미노산 변화이고; 돌연변이는 EU 위치 G341에서 EU 위치 K446까지의 서열 내에 있고; 돌연변이는 단일 아미노산 변화이고; 제2 링커 및 임의의 제3 링커는 GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG, GGGGS, GGSG, SGGG, GSGS, GSGSGS, GSGSGSGS, GSGSGSGSGS, GSGSGSGSGSGS, GGSGGS, GGSGGSGGS, GGSGGSGGSGGS, GGSG, GGSG, GGSGGGSG, GGSGGGSGGGSGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS, GENLYFQSGG, SACYCELS, RSIAT, RPACKIPNDLKQKVMNH, GGSAGGSGSGSSGGSSGASGTGTAGGTGSGSGTGSG, AAANSSIDLISVPVDSR, GGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGS, GGGSGGGSGGGS, SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG, GGSGGGSGGGSGGGSGGS, GGGG, GGGGGGGG, GGGGGGGGGGGG 및 GGGGGGGGGGGGGGGG로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 이러한 아미노산 서열로 이루어지며; 제2 링커 및 임의의 제3 링커는 글리신 스페이서이고; 제2 링커 및 임의의 제3 링커는 독립적으로 4 내지 30개, 4 내지 20개, 8 내지 30개, 8 내지 20개, 12 내지 20개 또는 12 내지 30개의 글리신 잔기로 이루어지며; 제2 링커 및 임의의 제3 링커는 20개의 글리신 잔기로 이루어지고; Fc 도메인 단량체 중 적어도 하나는 EU 위치 I253에서 단일 아미노산 돌연변이를 포함하고, EU 위치 I253에서의 각각의 아미노산 돌연변이는 독립적으로, I253A, I253C, I253D, I253E, I253F, I253G, I253H, I253I, I253K, I253L, I253M, I253N, I253P, I253Q, I253R, I253S, I253T, I253V, I253W, 및 I253Y로 이루어진 군에서 선택되며; 위치 I253에서의 각각의 아미노산 돌연변이는 I253A이고; Fc 도메인 단량체 중 적어도 하나는 EU 위치 R292에서 단일 아미노산 돌연변이를 포함하며; EU 위치 R292에서의 각각의 아미노산 돌연변이는 독립적으로 R292D, R292E, R292L, R292P, R292Q, R292R, R292T, 및 R292Y로 이루어진 군에서 선택되고; 위치 R292에서의 각각의 아미노산 돌연변이는 R292P이며; 각각의 Fc 도메인 단량체는 독립적으로, EPKSCDKTHTCPPCPAPELL 및 DKTHTCPPCPAPELL로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이러한 아미노산 서열로 이루어지며; 제2 Fc 도메인 단량체 및 제3 도메인 단량체의 힌지 부분은 아미노산 서열 DKTHTCPPCPAPELL을 갖고; 제1 Fc 도메인 단량체의 힌지 부분은 아미노산 서열 EPKSCDKTHTCPPCPAPEL을 갖고; 제1 Fc 도메인 단량체의 힌지 부분은 아미노산 서열 EPKSCDKTHTCPPCPAPEL을 갖고, 제2 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체의 힌지 부분은 아미노산 서열 DKTHTCPPCPAPELL을 가지며; 각 Fc 도메인 단량체의 CH2 도메인은 독립적으로 2개 이하의 단일 아미노산 결실 또는 치환을 갖는 아미노산 서열 GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK를 포함하고; 각 Fc 도메인의 CH2 도메인은 동일하며, 2개 이하의 단일 아미노산 결실 또는 치환을 갖는 아미노산 서열 GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK를 포함하고; 각 Fc 도메인의 CH2 도메인은 동일하며, 2개 이하의 단일 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열 GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK를 포함하고; 각 Fc 도메인 단량체의 CH2 도메인은 동일하며, 아미노산 서열 GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK를 포함하고; 각 Fc 도메인 단량체의 CH3 도메인은 독립적으로, 10개 이하의 단일 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG를 포함하고; 각 Fc 도메인 단량체의 CH3 도메인은 독립적으로, 8개 이하의 단일 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG를 포함하고; 각 Fc 도메인 단량체의 CH3 도메인은 독립적으로, 6개 이하의 단일 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG를 포함하고; 각 Fc 도메인 단량체의 CH3 도메인은 독립적으로, 5개 이하의 단일 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG를 포함하고; 단일 아미노산 치환은 T366Y, T366W, T394W, T394Y, F405W, F405A, Y407A, S354C, Y349T, T394F, K409D, K409E, K392D, K392E, K370D, K370E, D399K, D399R, E357K, E357R, D356K 및 D356R로 이루어진 군에서 선택되며; Fc 도메인 단량체 각각은 독립적으로 최대 10개의 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 42, 43, 45 및 47 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고; 단일 아미노산 치환 중 최대 6개는 CH3 도메인에 있는 역전하 돌연변이이거나 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이이며; 단일 아미노산 치환은 EU 위치 G341에서 EU 위치 K447까지의 서열 내에 있고; 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이 중 적어도 하나는 T366Y, T366W, T394W, T394Y, F405W, S354C, Y349T 및 T394F로 이루어진 군에서 선택되며; 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이는 K409D, K409E, K392D. K392E, K370D, K370E, D399K, D399R, E357K, E357R, D356K, 및 D356R에서 선택되며; 항원 결합 도메인은 scFv이고; 항원 결합 도메인은 VH 도메인 및 CH1 도메인을 포함하며; 항원 결합 도메인은 VL 도메인을 추가로 포함하고; VH 도메인은 표 1에 기재된 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 서열의 세트를 포함하고; VH 도메인은 표 2에 기재된 항체의 서열을 포함하는 VH 도메인의 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하고; VH 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 서열의 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하되, CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3 서열을 제외한 VH 서열은 표 2에 기재된 항체의 VH 서열과 적어도 95% 또는 98% 동일하고; VH 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 서열을 포함하고; 항원 결합 도메인은 표 1에 기재된 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 서열의 세트를 포함하며; 항원 결합 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 및 VL 서열의 세트로부터 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 서열을 포함하고; 항원 결합 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 서열의 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인 및 표 2에 기재된 항체의 VL 서열의 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하되, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 제외한 VH 및 VL 도메인 서열은 표 2에 기재된 항체의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 또는 98% 동일하며; 항원 결합 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 및 VL 서열의 세트를 포함하고; 항원 결합 도메인은 IgG CL 항체 불변 도메인 및 IgG CH1 항체 불변 도메인을 포함하며; 항원 결합 도메인은 VH 도메인 및 CH1 도메인을 포함하고 VL 도메인 및 CL 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 결합하여 Fab를 형성할 수 있다.
제1 또는 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체의 힌지 내의 시스테인 잔기 사이의 이황화 결합에 의해 연결된 상술한 폴리펩티드 중 어느 하나의 2개의 카피를 포함하는 폴리펩티드 복합체가 또한 기재되어 있다.
힌지 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제2 폴리펩티드에 연결된 상술한 폴리펩티드를 포함하되, 상기 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드는 상기 폴리펩티드의 제1, 제2 또는 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체의 힌지 도메인 및 제2 폴리펩티드의 힌지 도메인 내의 시스테인 잔기 사이의 이황화 결합에 의해 연결되는, 폴리펩티드 복합체가 또한 기재되어 있다. 다양한 구현예에서: 제2 폴리펩티드 단량체는 1개, 2개 또는 3개의 역전하 돌연변이를 포함하고; 제2 폴리펩티드 단량체는 표 4에서 선택된 1개, 2개 또는 3개의 역전하 돌연변이를 포함하되, 폴리펩티드에서 이들 역전하 돌연변이는 표 4에서 선택된 1개, 2개 또는 3개의 역전하 돌연변이에 상보적이고; 제2 폴리펩티드는 최대 10개의 단일 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 42, 43, 45 및 47 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
제43 양태에서, 본 발명은 힌지 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체; 제2 링커; 힌지 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체; 임의의 제3 링커; 및 힌지 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 임의의 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하되, 적어도 하나의 Fc 도메인 단량체는 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이를 포함하는, 폴리펩티드를 특징으로 한다.
제43 양태의 다양한 구현예에서, 폴리펩티드는 항체 중쇄 가변 도메인 및 제1 IgG1 단량체의 CH1 도메인 아미노 말단 또는 제1 IgG1 단량체의 scFv 아미노 말단을 포함하고; 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체는 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이를 포함하고; 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체는 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이를 포함하며; 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체는 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이를 포함하고; 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체는 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이를 포함하며; 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체와 제2 IgG 불변 도메인 단량체는 모두 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이를 포함하고; 폴리펩티드는 제3 링커 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하되, 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체, 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체 각각은 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이를 포함하며; 폴리펩티드는 제3 링커 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하되, 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체와 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체는 모두 각각 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이를 포함하며; 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체는 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이를 포함하고; 폴리펩티드는 제3 링커 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하되, 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체와 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체 둘 다는 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이를 각각 포함하며, 제3 IgG1 도메인 단량체는 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이를 포함하고; 폴리펩티드는 제3 링커 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하되, 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체와 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체 둘 다는 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이를 각각 포함하고, 제2 IgG1 도메인 단량체는 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이를 포함하고; 폴리펩티드는 제1 링커 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하되, 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체 둘 다는 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이를 각각 포함하고, 제1 IgG1 도메인 단량체는 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이를 포함한다.
제43 양태의 다양한 구현예에서, 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이를 포함하는 IgG1 Fc 도메인 단량체는 1개, 2개 또는 3개의 역전하 돌연변이를 추가로 포함하고;
유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이 및 역전하 돌연변이는 CH3 도메인에 있으며, 상기 돌연변이는 EU 위치 G341에서 EU 위치 K447까지의 서열 내에 있고, 돌연변이는 단일 아미노산 변화이며, 제2 링커 및 임의의 제3 링커는 GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG, GGGGS, GGSG, SGGG, GSGS, GSGSGS, GSGSGSGS, GSGSGSGSGS, GSGSGSGSGSGS, GGSGGS, GGSGGSGGS, GGSGGSGGSGGS, GGSG, GGSG, GGSGGGSG, GGSGGGSGGGSGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS, GENLYFQSGG, SACYCELS, RSIAT, RPACKIPNDLKQKVMNH, GGSAGGSGSGSSGGSSGASGTGTAGGTGSGSGTGSG, AAANSSIDLISVPVDSR, GGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGS, GGGSGGGSGGGS, SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG, GGSGGGSGGGSGGGSGGS, GGGG, GGGGGGGG, GGGGGGGGGGGG 및 GGGGGGGGGGGGGGGG로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 이러한 아미노산 서열로 이루어지며; 제2 링커 및 임의의 제3 링커는 글리신 스페이서이고; 제2 링커 및 임의의 제3 링커는 독립적으로 4 내지 30개, 4 내지 20개, 8 내지 30개, 8 내지 20개, 12 내지 20개 또는 12 내지 30개의 글리신 잔기로 이루어지며; 제2 링커 및 임의의 제3 링커는 20개의 글리신 잔기로 이루어지고; Fc 도메인 단량체 중 적어도 하나는 EU 위치 I253에서 단일 아미노산 돌연변이를 포함하고, EU 위치 I253에서의 각각의 아미노산 돌연변이는 독립적으로, I253A, I253C, I253D, I253E, I253F, I253G, I253H, I253I, I253K, I253L, I253M, I253N, I253P, I253Q, I253R, I253S, I253T, I253V, I253W, 및 I253Y로 이루어진 군에서 선택되며; 위치 I253에서의 각각의 아미노산 돌연변이는 I253A이고; Fc 도메인 단량체 중 적어도 하나는 EU 위치 R292에서 단일 아미노산 돌연변이를 포함하며; EU 위치 R292에서의 각각의 아미노산 돌연변이는 독립적으로 R292D, R292E, R292L, R292P, R292Q, R292R, R292T, 및 R292Y로 이루어진 군에서 선택되고; 위치 R292에서의 각각의 아미노산 돌연변이는 R292P이며; 각각의 Fc 도메인 단량체는 독립적으로, EPKSCDKTHTCPPCPAPELL 및 DKTHTCPPCPAPELL로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이러한 아미노산 서열로 이루어지며; 제2 Fc 도메인 단량체 및 제3 도메인 단량체의 힌지 부분은 아미노산 서열 DKTHTCPPCPAPELL을 갖고; 제1 Fc 도메인 단량체의 힌지 부분은 아미노산 서열 EPKSCDKTHTCPPCPAPEL을 갖고; 제1 Fc 도메인 단량체의 힌지 부분은 아미노산 서열 EPKSCDKTHTCPPCPAPEL을 갖고, 제2 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체의 힌지 부분은 아미노산 서열 DKTHTCPPCPAPELL을 가지며; 각 Fc 도메인 단량체의 CH2 도메인은 독립적으로 2개 이하의 단일 아미노산 결실 또는 치환을 갖는 아미노산 서열 GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK를 포함하고; 각 Fc 도메인의 CH2 도메인은 동일하며, 2개 이하의 단일 아미노산 결실 또는 치환을 갖는 아미노산 서열 GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK를 포함하고; 각 Fc 도메인의 CH2 도메인은 동일하며, 2개 이하의 단일 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열 GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK를 포함하고; 각 Fc 도메인 단량체의 CH2 도메인은 동일하며, 아미노산 서열 GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK를 포함하고; 각 Fc 도메인 단량체의 CH3 도메인은 독립적으로, 10개 이하의 단일 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG를 포함하고; 각 Fc 도메인 단량체의 CH3 도메인은 독립적으로, 8개 이하의 단일 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG를 포함하고; 각 Fc 도메인 단량체의 CH3 도메인은 독립적으로, 6개 이하의 단일 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG를 포함하고; 각 Fc 도메인 단량체의 CH3 도메인은 독립적으로, 5개 이하의 단일 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG를 포함하고; 단일 아미노산 치환은 T366Y, T366W, T394W, T394Y, F405W, S354C, Y349T, T394F, K409D, K409E, K392D, K392E, K370D, K370E, D399K, D399R, E357K, E357R, D356K 및 D356R로 이루어진 군에서 선택되며; Fc 도메인 단량체 각각은 독립적으로 최대 10개의 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 42, 43, 45 및 47 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고; 단일 아미노산 치환 중 최대 6개는 CH3 도메인에 있는 역전하 돌연변이이거나 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이이며; 단일 아미노산 치환은 EU 위치 G341에서 EU 위치 K447까지의 서열 내에 있고; 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이 중 적어도 하나는 T366Y, T366W, T394W, T394Y, F405W, S354C, Y349T 및 T394F로 이루어진 군에서 선택되며; 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이는 K409D, K409E, K392D. K392E, K370D, K370E, D399K, D399R, E357K, E357R, D356K 및 D356R로부터 선택된다.
제44 양태에서, 본 발명은 힌지 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체; 제2 링커; 힌지 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체; 임의의 제3 링커; 및 힌지 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 임의의 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하되, 적어도 하나의 Fc 도메인 단량체는 1개, 2개 또는 3개의 역전하 돌연변이를 포함하는 폴리펩티드를 특징으로 한다.
제44 양태의 다양한 구현예에서, 폴리펩티드는 항체 중쇄 가변 도메인 및 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체에 대한 CH1 도메인 아미노 말단 또는 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체에 대한 scFv 아미노 말단을 추가로 포함하고; 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체는 표 5에 있는 것들에서 선택된 2개의 역전하 돌연변이 세트 또는 표 6에 있는 것들에서 선택된 4개의 역전하 돌연변이 세트를 포함하고, 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체는 표 4에서 선택된 1개, 2개, 또는 3개의 역전하 아미노산 돌연변이를 포함하며; 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체는 표 4에서 선택된 1개, 2개, 또는 3개의 역전하 아미노산 돌연변이를 포함하고, 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체는 표 5에 있는 것들에서 선택된 2개의 역전하 돌연변이 세트 또는 표 6에 있는 것들에서 선택된 4개의 역전하 돌연변이 세트를 포함하고; 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체 및 제2 IgG 불변 도메인 단량체 모두는 표 4에서 선택된 1개, 2개, 또는 3개의 역전하 아미노산 돌연변이를 포함하고; 폴리펩티드는 제3 링커 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체를 추가로 포함하되, 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체, 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체, 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체는 각각 표 4에서 선택된 1개, 2개, 또는 3개의 역전하 아미노산 돌연변이를 포함하고; 폴리펩티드는 제3 링커 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체를 추가로 포함하되, 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체 및 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체 모두는 각각 표 4에서 선택된 1개, 2개, 또는 3개의 역전하 아미노산 돌연변이를 포함하고, 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체는 표 5에 있는 것들에서 선택된 2개의 역전하 돌연변이 세트 또는 표 6에 있는 것들에서 선택된 4개의 역전하 돌연변이 세트를 포함하고; 폴리펩티드는 제3 링커 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체를 추가로 포함하되, 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체 모두는 각각 표 4에서 선택된 1개, 2개, 또는 3개의 역전하 아미노산 돌연변이를 포함하고, 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체는 표 5에 있는 것들에서 선택된 2개의 역전하 돌연변이 세트 또는 표 6에 있는 것들에서 선택된 4개의 역전하 돌연변이 세트를 포함하고; 폴리펩티드는 제3 링커 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체를 추가로 포함하되, 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체 모두는 각각 표 4에서 선택된 1개, 2개, 또는 3개의 역전하 아미노산 돌연변이를 포함하고, 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체는 표 5에 있는 것들에서 선택된 2개의 역전하 돌연변이 세트 또는 표 6에 있는 것들에서 선택된 4개의 역전하 돌연변이 세트를 포함하고; 표 4에서 선택된 1개, 2개, 또는 3개의 역전하 아미노산 돌연변이를 포함하는 IgG1 Fc 도메인 단량체는 동일한 CH3 도메인을 가지고; 표 4에서 선택된 1개, 2개, 또는 3개의 역전하 아미노산 돌연변이는 CH3 도메인에 있고; 돌연변이는 EU 위치 G341에서 EU 위치 K447까지의 서열 내에 있고; 돌연변이는 각각 단일 아미노산 변화이고; 돌연변이는 EU 위치 G341에서 EU 위치 K446까지의 서열 내에 있고; 돌연변이는 단일 아미노산 변화이고; 제2 링커 및 임의의 제3 링커는 GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG, GGGGS, GGSG, SGGG, GSGS, GSGSGS, GSGSGSGS, GSGSGSGSGS, GSGSGSGSGSGS, GGSGGS, GGSGGSGGS, GGSGGSGGSGGS, GGSG, GGSG, GGSGGGSG, GGSGGGSGGGSGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS, GENLYFQSGG, SACYCELS, RSIAT, RPACKIPNDLKQKVMNH, GGSAGGSGSGSSGGSSGASGTGTAGGTGSGSGTGSG, AAANSSIDLISVPVDSR, GGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGS, GGGSGGGSGGGS, SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG, GGSGGGSGGGSGGGSGGS, GGGG, GGGGGGGG, GGGGGGGGGGGG 및 GGGGGGGGGGGGGGGG로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 이러한 아미노산 서열로 이루어지며; 제2 링커 및 임의의 제3 링커는 글리신 스페이서이고; 제2 링커 및 임의의 제3 링커는 독립적으로 4 내지 30개, 4 내지 20개, 8 내지 30개, 8 내지 20개, 12 내지 20개 또는 12 내지 30개의 글리신 잔기로 이루어지며; 제2 링커 및 임의의 제3 링커는 20개의 글리신 잔기로 이루어지고; Fc 도메인 단량체 중 적어도 하나는 EU 위치 I253에서 단일 아미노산 돌연변이를 포함하고, EU 위치 I253에서의 각각의 아미노산 돌연변이는 독립적으로, I253A, I253C, I253D, I253E, I253F, I253G, I253H, I253I, I253K, I253L, I253M, I253N, I253P, I253Q, I253R, I253S, I253T, I253V, I253W, 및 I253Y로 이루어진 군에서 선택되며; 위치 I253에서의 각각의 아미노산 돌연변이는 I253A이고; Fc 도메인 단량체 중 적어도 하나는 EU 위치 R292에서 단일 아미노산 돌연변이를 포함하며; EU 위치 R292에서의 각각의 아미노산 돌연변이는 독립적으로 R292D, R292E, R292L, R292P, R292Q, R292R, R292T, 및 R292Y로 이루어진 군에서 선택되고; 위치 R292에서의 각각의 아미노산 돌연변이는 R292P이며; 각각의 Fc 도메인 단량체는 독립적으로, EPKSCDKTHTCPPCPAPELL 및 DKTHTCPPCPAPELL로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이러한 아미노산 서열로 이루어지며; 제2 Fc 도메인 단량체 및 제3 도메인 단량체의 힌지 부분은 아미노산 서열 DKTHTCPPCPAPELL을 갖고; 제1 Fc 도메인 단량체의 힌지 부분은 아미노산 서열 EPKSCDKTHTCPPCPAPEL을 갖고; 제1 Fc 도메인 단량체의 힌지 부분은 아미노산 서열 EPKSCDKTHTCPPCPAPEL을 갖고, 제2 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체의 힌지 부분은 아미노산 서열 DKTHTCPPCPAPELL을 가지며; 각 Fc 도메인 단량체의 CH2 도메인은 독립적으로 2개 이하의 단일 아미노산 결실 또는 치환을 갖는 아미노산 서열 GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK를 포함하고; 각 Fc 도메인의 CH2 도메인은 동일하며, 2개 이하의 단일 아미노산 결실 또는 치환을 갖는 아미노산 서열 GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK를 포함하고; 각 Fc 도메인의 CH2 도메인은 동일하며, 2개 이하의 단일 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열 GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK를 포함하고; 각 Fc 도메인 단량체의 CH2 도메인은 동일하며, 아미노산 서열 GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK를 포함하고; 각 Fc 도메인 단량체의 CH3 도메인은 독립적으로, 10개 이하의 단일 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG를 포함하고; 각 Fc 도메인 단량체의 CH3 도메인은 독립적으로, 8개 이하의 단일 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG를 포함하고; 각 Fc 도메인 단량체의 CH3 도메인은 독립적으로, 6개 이하의 단일 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG를 포함하고; 각 Fc 도메인 단량체의 CH3 도메인은 독립적으로, 5개 이하의 단일 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG를 포함하고; 단일 아미노산 치환은 T366Y, T366W, T394W, T394Y, F405W, F405A, Y407A, S354C, Y349T, T394F, K409D, K409E, K392D, K392E, K370D, K370E, D399K, D399R, E357K, E357R, D356K, 및 D356R로 이루어진 군에서 선택되고; Fc 도메인 단량체 각각은 독립적으로 최대 10개의 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 42, 43, 45 및 47 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고; 단일 아미노산 치환 중 최대 6개는 CH3 도메인에 있는 역전하 돌연변이이거나, 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이이고; 단일 아미노산 치환은 EU 위치 G341에서 EU 위치 K447까지의 서열 내에 있고; VH 도메인 또는 scFv는 표 1에 기재된 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3 서열의 세트를 포함하며; VH 도메인 또는 scFv는 표 2에 기재된 항체의 서열을 포함하는 VH 도메인의 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하고; VH 도메인 또는 scFv는 표 2에 기재된 항체의 VH 서열의 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하며, CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 제외한 VH 서열은 표 2에 기재된 항체의 VH 서열과 적어도 95% 또는 98% 동일하며; VH 도메인 또는 scFv는 표 2에 기재된 항체의 VH 서열을 포함하고; VH 도메인 또는 scFv는 표 1에 기재된 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 서열의 세트를 포함하며; VH 도메인 또는 scFv는 표 2에 기재된 항체의 VH 및 VL 서열의 세트에서 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 서열을 포함하고; VH 도메인 또는 scFv는 표 2에 기재된 항체의 VH 서열의 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인 및 표 2에 기재된 항체의 VL 서열의 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하되, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 서열을 제외한 VH 및 VL 도메인 서열은 표 2에 기재된 항체의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 또는 98% 동일하며; VH 도메인 또는 scFv는 표 2에 기재된 항체의 VH 및 VL 서열의 세트를 포함한다.
제41, 제42, 제43 및 제44 양태의 전술한 폴리펩티드의 어느 하나를 암호화하는 핵산 분자가 또한 기재되어 있다.
전술한 폴리펩티드 중 어느 하나를 암호화하는 핵산을 포함하는 발현 벡터; 핵산 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포; 항체 VL 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자(예를 들어, 항체 VL 도메인 및 항체 CL 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자)를 추가로 포함하는 숙주 세포; 항체 VL 도메인 및 항체 CL 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 추가로 포함하는 숙주 세포; 10개 이하의 단일 아미노산 돌연변이를 갖는 IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 추가로 포함하는 숙주 세포; 10개 이하의 단일 아미노산 돌연변이를 갖는 IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 추가로 포함하는 숙주 세포가 또한 기재되어 있다. 다양한 구현예에서, IgG1 Fc 도메인 단량체는 CH3 도메인에 10개, 8개, 6개 또는 4개 이하의 단일 아미노산 돌연변이를 갖는 서열 번호 42, 43, 45 및 47 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 기재된 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체 중 어느 하나를 포함하는 약학 조성물이 또한 기재되어 있다. 다양한 구현예에서, 폴리펩티드의 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 2% 미만은 적어도 하나의 푸코스를 갖는다.
본 발명의 제41, 제42, 제43 및 제44 양태의 폴리펩티드는 본원에 기재된 다양한 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 성분으로서 유용하다. 따라서, 제1 내지 제40 양태 중 어느 하나의 폴리펩티드, 예를 들어, 항원 결합 도메인을 포함할 수 있는 것들은 본 발명의 제41, 제42, 제43 및 제44 양태 중 어느 하나의 폴리펩티드를 포함하거나, 이러한 폴리펩티드로 이루어질 수 있다.
본 발명의 모든 양태에서 사용하기 위한 다른 유용한 폴리펩티드는 (예를 들어, Y407T Y407A, F405A, T394S, T394W:Y407T, T394S:Y407A, T366W:T394S, F405T, T366S:L368A:Y407V:Y349C, S364H:F405A로부터 선택되는) 1개, 2개 또는 3개의 함몰부를 형성하는 돌연변이를 갖는 (예를 들어, 8개, 6개 5개, 4개 또는 3개 이하의 단일 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 42, 43, 45 및 47 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진) Fc 도메인 단량체를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 이들 폴리펩티드는 표 4 또는 표 5로부터의 1개, 2개 또는 3개의 역전하 돌연변이를 임의로 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물이 또한 본원에 기재되어 있으며, 상기 Fc-항원 결합 도메인 작제물은
a)
i) 제1 Fc 도메인 단량체,
ii) 제2 Fc 도메인 단량체,
iii) 제1 중쇄 결합 도메인, 및
iv) 제1 및 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커를 포함하는, 제1 폴리펩티드;
b)
i) 제3 Fc 도메인 단량체,
ii) 제4 Fc 도메인 단량체,
iii) 제2 중쇄 결합 도메인, 및
iv) 제3 및 제4 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커를 포함하는, 제2 폴리펩티드;
c) 제5 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드;
d) 제6 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제4 폴리펩티드;
e) 제1 경쇄 결합 도메인을 포함하는 제5 폴리펩티드; 및
f) 제2 경쇄 결합 도메인을 포함하는 제 6폴리펩티드를 포함하되,
제1 및 제3 Fc 도메인 단량체는 함께 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제2 및 제4 Fc 도메인 단량체는 함께 제2 Fc 도메인을 형성하고, 제4 및 제6 Fc 도메인 단량체는 함께 제3 Fc 도메인을 형성하고, 제1 중쇄 결합 도메인과 제1 경쇄 결합 도메인은 함께 제1 Fab를 형성하며, 제2 중쇄 결합 도메인과 제2 경쇄 결합 도메인은 함께 제2 Fab를 형성한다.
다양한 구현예에서: 제1 및 제2 폴리펩티드는 서열이 동일하고; 제3 및 제4 폴리펩티드는 서열이 동일하며; 제5 및 제6 폴리펩티드는 서열이 동일하고; 제1 및 제2 폴리펩티드는 서열이 동일하며, 제3 및 제4 폴리펩티드는 서열이 동일하고, 제5 및 제6 폴리펩티드는 서열이 동일하며; 각각의 Fc 도메인 단량체의 CH3 도메인은 최대 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하고; 각각의 Fc 도메인 단량체의 CH3 도메인은 인간 IgG1의 아미노산 서열과 비교하여, 최대 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하며; Fc 도메인 단량체 각각은 독립적으로, 최대 10, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 42, 43, 45 및 47 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고; 단일 아미노산 치환은 CH3 도메인에만 있으며; 제1 및 제3 Fc 도메인 단량체는 제1 및 제3 Fc 도메인 단량체 사이의 동종이량체화를 촉진하는 최대 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하고; 제2 및 제5 Fc 도메인 단량체는 제2 및 제5 Fc 도메인 단량체 사이의 이종이량체화를 촉진하는 최대 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하며, 제4 및 제6 Fc 도메인 단량체는 제4 및 제6 Fc 도메인 단량체 사이의 이종이량체화를 촉진하는 최대 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하고; 동종이량체화를 촉진하는 치환은 표 4a 및 표 4b의 치환으로부터 선택되며; 이종이량체화를 촉진하는 치환은 표 3의 치환으로부터 선택된다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물이 또한 기재되어 있으며, 상기 Fc-항원 결합 도메인 작제물은
a)
i) 제1 Fc 도메인 단량체,
ii) 제2 Fc 도메인 단량체,
iii) 제1 중쇄 결합 도메인, 및
iv) 제1 및 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커를 포함하는, 제1 폴리펩티드;
b)
i) 제3 Fc 도메인 단량체,
ii) 제4 Fc 도메인 단량체,
iii) 제2 중쇄 결합 도메인, 및
iv) 제3 및 제4 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커를 포함하는, 제2 폴리펩티드;
c) 제5 Fc 도메인 단량체와 제1 경쇄 결합 도메인을 포함하는 제3 폴리펩티드; 및
d) 제6 Fc 도메인 단량체와 제2 경쇄 결합 도메인을 포함하는 제4 폴리펩티드를 포함하되,
제1 및 제3 Fc 도메인 단량체는 함께 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제2 및 제4 Fc 도메인 단량체는 함께 제2 Fc 도메인을 형성하고, 제4 및 제6 Fc 도메인 단량체는 함께 제3 Fc 도메인을 형성하고, 제1 중쇄 결합 도메인과 제1 경쇄 결합 도메인은 함께 제1 Fab를 형성하며, 제2 중쇄 결합 도메인과 제2 경쇄 결합 도메인은 함께 제2 Fab를 형성한다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물이 또한 기재되어 있으며, 상기 Fc-항원 결합 도메인 작제물은
a)
i) 제1 Fc 도메인 단량체,
ii) 제2 Fc 도메인 단량체,
iii) 제1 중쇄 결합 도메인, 및
iv) 제1 및 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커를 포함하는, 제1 폴리펩티드;
b)
i) 제3 Fc 도메인 단량체,
ii) 제4 Fc 도메인 단량체,
iii) 제2 중쇄 결합 도메인, 및
iv) 제3 및 제4 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커를 포함하는, 제2 폴리펩티드;
c) 제5 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드;
d) 제6 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제4 폴리펩티드;
e) 제1 경쇄 결합 도메인을 포함하는 제5 폴리펩티드; 및
f) 제2 경쇄 결합 도메인을 포함하는 제 6폴리펩티드;
제1 및 제5 Fc 도메인 단량체는 함께 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제3 및 제6 Fc 도메인 단량체는 함께 제2 Fc 도메인을 형성하며, 제2 및 제4 Fc 도메인 단량체는 함께 제3 Fc 도메인을 형성하고, 제1 중쇄 결합 도메인과 제1 경쇄 결합 도메인은 함께 제1 Fab를 형성하며, 제2 중쇄 결합 도메인과 제2 경쇄 결합 도메인은 함께 제2 Fab를 형성한다.
다양한 구현예에서: 제1 및 제2 폴리펩티드는 서열이 동일하고; 제3 및 제4 폴리펩티드는 서열이 동일하며; 제5 및 제6 폴리펩티드는 서열이 동일하고; 제1 및 제2 폴리펩티드는 서열이 동일하며, 제3 및 제4 폴리펩티드는 서열이 동일하고, 제5 및 제6 폴리펩티드는 서열이 동일하며; 각각의 Fc 도메인 단량체의 CH3 도메인은 최대 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하고; 각각의 Fc 도메인 단량체의 CH3 도메인은 인간 IgG1의 아미노산 서열과 비교하여, 최대 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하며; Fc 도메인 단량체 각각은 독립적으로, 최대 10, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 42, 43, 45 및 47 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고; 단일 아미노산 치환은 CH3 도메인에만 있으며; 제2 및 제4 Fc 도메인 단량체는 제2 및 제4 Fc 도메인 단량체 사이의 동종이량체화를 촉진하는 최대 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하고; 제1 및 제5 Fc 도메인 단량체는 제1 및 제5 Fc 도메인 단량체 사이의 이종이량체화를 촉진하는 최대 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하며, 제3 및 제6 Fc 도메인 단량체는 제4 및 제6 Fc 도메인 단량체 사이의 이종이량체화를 촉진하는 최대 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하고; 동종이량체화를 촉진하는 치환은 표 4a 및 표 4b의 치환으로부터 선택되며; 이종이량체화를 촉진하는 치환은 표 3의 치환으로부터 선택된다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물이 또한 기재되어 있으며, 상기 Fc-항원 결합 도메인 작제물은
a)
i) 제1 Fc 도메인 단량체,
ii) 제2 Fc 도메인 단량체,
iii) 제3 Fc 도메인 단량체,
iv) 제1 중쇄 결합 도메인,
v) 제1 및 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커, 및
vi) 제2 및 제3 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커를 포함하는, 제1 폴리펩티드;
b)
i) 제4 Fc 도메인 단량체,
ii) 제5 Fc 도메인 단량체,
iii) 제6 Fc 도메인 단량체,
iv) 제2 중쇄 결합 도메인,
v) 제4 및 제5 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커, 및
vi) 제5 및 제6 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커를 포함하는, 제2 폴리펩티드;
c) 제7 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드;
d) 제8 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제4 폴리펩티드;
e) 제9 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제5 폴리펩티드;
f) 제10 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제6 폴리펩티드;
g) 제1 경쇄 결합 도메인을 포함하는 제7 폴리펩티드; 및
h) 제2 경쇄 결합 도메인을 포함하는 제8 폴리펩티드를 포함하되,
제1 및 제7 Fc 도메인 단량체는 함께 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제4 및 제8 Fc 도메인 단량체는 함께 제2 Fc 도메인을 형성하며, 제2 및 제5 Fc 단량체는 함께 제3 Fc 도메인을 형성하고, 제3 및 제9 Fc 도메인 단량체는 함께 제4 Fc 도메인을 형성하며, 제6 및 제10 Fc 단량체는 함께 제5 Fc 도메인을 형성하고, 제1 중쇄 결합 도메인 및 제1 경쇄 결합 도메인은 함께 제1 Fab를 형성하며, 제2 중쇄 결합 도메인 및 제2 경쇄 결합 도메인은 함께 제2 Fab를 형성한다.
다양한 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드가 서열이 동일하고; 제3 및 제4 폴리펩티드가 서열이 동일하며; 제5 및 제6 폴리펩티드가 서열이 동일하고; 제7 및 제8 폴리펩티드가 서열이 동일하며; 제1 및 제2 폴리펩티드가 서열이 동일하고, 제3 및 제4 폴리펩티드가 서열이 동일하며, 제5 및 제6 폴리펩티드가 서열이 동일하고, 제7 및 제8 폴리펩티드가 서열이 동일하며; Fc 도메인 단량체 각각의 CH3 도메인은 최대 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하고; Fc 도메인 단량체 각각의 CH3 도메인은 인간 IgG1의 아미노산 서열과 비교하여 최대 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하며; Fc 도메인 단량체는 독립적으로 최대 10, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 42, 43, 45 및 47 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고; 단일 아미노산 치환은 CH3 도메인에만 있고; 제2 및 제5 Fc 도메인 단량체는 제2와 제5 Fc 도메인 단량체 사이의 동종이량체화를 촉진하는 최대 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하며, 제1 및 제7 Fc 도메인 단량체는 제1과 제7 Fc 도메인 단량체 사이의 이종이량체화를 촉진하는 최대 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하고, 제4 및 제8 Fc 도메인 단량체는 제4와 제8 Fc 도메인 단량체 사이의 이종이량체화를 촉진하는 최대 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하며, 제3 및 제9 Fc 도메인 단량체는 제3과 제9 Fc 도메인 단량체 사이의 이종이량체화를 촉진하는 최대 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하고, 제6 및 제10 Fc 도메인 단량체는 제6과 제10 Fc 도메인 단량체 사이의 이종이량체화를 촉진하는 최대 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하며, 동종이량체화를 촉진하는 치환은 표 4a 및 4b에 있는 치환에서 선택되고, 이종이량체화를 촉진하는 치환은 표 3에 있는 치환에서 선택된다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물이 또한 기재되어 있으며, 상기 Fc-항원 결합 도메인 작제물은
a)
i) 제1 Fc 도메인 단량체,
ii) 제2 Fc 도메인 단량체,
iii) 제3 Fc 도메인 단량체,
iv) 제1 중쇄 결합 도메인,
v) 제1 및 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커, 및
vi) 제2 및 제3 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커를 포함하는, 제1 폴리펩티드;
b)
i) 제4 Fc 도메인 단량체,
ii) 제5 Fc 도메인 단량체,
iii) 제6 Fc 도메인 단량체,
iv) 제2 중쇄 결합 도메인,
v) 제4 및 제5 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커, 및
vi) 제5 및 제6 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커를 포함하는, 제2 폴리펩티드;
c) 제7 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드;
d) 제8 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제4 폴리펩티드;
e) 제9 Fc 도메인 단량체 및 제1 경쇄 결합 도메인을 포함하는 제5 폴리펩티드; 및
f) 제10 Fc 도메인 단량체 및 제2 경쇄 결합 도메인을 포함하는 제6 폴리펩티드를 포함하되,
제1 및 제7 Fc 도메인 단량체는 함께 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제4 및 제8 Fc 도메인 단량체는 함께 제2 Fc 도메인을 형성하며, 제2 및 제5 Fc 단량체는 함께 제3 Fc 도메인을 형성하고, 제3 및 제9 Fc 도메인 단량체는 함께 제4 Fc 도메인을 형성하며, 제6 및 제10 Fc 단량체는 함께 제5 Fc 도메인을 형성하고, 제1 중쇄 결합 도메인 및 제1 경쇄 결합 도메인은 함께 제1 Fab를 형성하며, 제2 중쇄 결합 도메인 및 제2 경쇄 결합 도메인은 함께 제2 Fab를 형성한다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물이 또한 기재되어 있으며, 상기 Fc-항원 결합 도메인 작제물은
a)
i) 제1 Fc 도메인 단량체,
ii) 제2 Fc 도메인 단량체,
iii) 제3 Fc 도메인 단량체,
iv) 제1 중쇄 결합 도메인,
v) 제1 및 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커, 및
vi) 제2 및 제3 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커를 포함하는, 제1 폴리펩티드;
b)
i) 제4 Fc 도메인 단량체,
ii) 제5 Fc 도메인 단량체,
iii) 제6 Fc 도메인 단량체,
iv) 제2 중쇄 결합 도메인,
v) 제4 및 제5 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커, 및
vi) 제5 및 제6 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커를 포함하는, 제2 폴리펩티드;
c) 제7 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드;
d) 제8 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제4 폴리펩티드;
e) 제9 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제5 폴리펩티드;
f) 제10 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제6 폴리펩티드;
g) 제1 경쇄 결합 도메인을 포함하는 제7 폴리펩티드; 및
h) 제2 경쇄 결합 도메인을 포함하는 제8 폴리펩티드를 포함하되,
제1 및 제4 Fc 도메인 단량체는 함께 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제2 및 제7 Fc 도메인 단량체는 함께 제2 Fc 도메인을 형성하며, 제5 및 제8 Fc 단량체는 함께 제3 Fc 도메인을 형성하고, 제3 및 제9 Fc 도메인 단량체는 함께 제4 Fc 도메인을 형성하며, 제6 및 제10 Fc 단량체는 함께 제5 Fc 도메인을 형성하고, 제1 중쇄 결합 도메인 및 제1 경쇄 결합 도메인은 함께 제1 Fab를 형성하며; 제2 중쇄 결합 도메인 및 제2 경쇄 결합 도메인은 함께 제2 Fab를 형성한다.
다양한 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드가 서열이 동일하고; 제3 및 제4 폴리펩티드가 서열이 동일하며; 제5 및 제6 폴리펩티드가 서열이 동일하고; 제7 및 제8 폴리펩티드가 서열이 동일하며; 제1 및 제2 폴리펩티드가 서열이 동일하고, 제3 및 제4 폴리펩티드가 서열이 동일하며, 제5 및 제6 폴리펩티드가 서열이 동일하고, 제7 및 제8 폴리펩티드가 서열이 동일하며; Fc 도메인 단량체 각각의 CH3 도메인은 최대 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하고; Fc 도메인 단량체 각각의 CH3 도메인은 인간 IgG1의 아미노산 서열과 비교하여 최대 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하며; Fc 도메인 단량체 각각은 독립적으로 최대 10, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 42, 43, 45 및 47 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고; 단일 아미노산 치환은 CH3 도메인에만 있고; 제1 및 제4 Fc 도메인 단량체는 제1과 제4 Fc 도메인 단량체 사이의 동종이량체화를 촉진하는 최대 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하며, 제2 및 제7 Fc 도메인 단량체는 제2와 제7 Fc 도메인 단량체 사이의 이종이량체화를 촉진하는 최대 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하고, 제5 및 제8 Fc 도메인 단량체는 제5와 제8 Fc 도메인 단량체 사이의 이종이량체화를 촉진하는 최대 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하며, 제3 및 제9 Fc 도메인 단량체는 제3과 제9 Fc 도메인 단량체 사이의 이종이량체화를 촉진하는 최대 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하고, 제6 및 제10 Fc 도메인 단량체는 제6과 제10 Fc 도메인 단량체 사이의 이종이량체화를 촉진하는 최대 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하며, 동종이량체화를 촉진하는 치환은 표 4A 및 4B에 있는 치환에서 선택되고, 이종이량체화를 촉진하는 치환은 표 3에 있는 치환에서 선택된다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물이 또한 기재되어 있으며, 상기 Fc-항원 결합 도메인 작제물은
a)
i) 제1 Fc 도메인 단량체,
ii) 제2 Fc 도메인 단량체,
iii) 제3 Fc 도메인 단량체,
iv) 제1 중쇄 결합 도메인,
v) 제1 및 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커, 및
vi) 제2 및 제3 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커를 포함하는, 제1 폴리펩티드;
b)
i) 제4 Fc 도메인 단량체,
ii) 제5 Fc 도메인 단량체,
iii) 제6 Fc 도메인 단량체,
iv) 제2 중쇄 결합 도메인,
v) 제4 및 제5 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커, 및
vi) 제5 및 제6 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커를 포함하는, 제2 폴리펩티드;
c) 제7 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드;
d) 제8 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제4 폴리펩티드;
e) 제9 Fc 도메인 단량체 및 제1 경쇄 결합 도메인을 포함하는 제5 폴리펩티드;
f) 제10 Fc 도메인 단량체 및 제2 경쇄 결합 도메인을 포함하는 제6 폴리펩티드를 포함하되,
제1 및 제4 Fc 도메인 단량체는 함께 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제2 및 제7 Fc 도메인 단량체는 함께 제2 Fc 도메인을 형성하며, 제5 및 제8 Fc 단량체는 함께 제3 Fc 도메인을 형성하고, 제3 및 제9 Fc 도메인 단량체는 함께 제4 Fc 도메인을 형성하며, 제6 및 제10 Fc 단량체는 함께 제5 Fc 도메인을 형성하고, 제1 중쇄 결합 도메인 및 제1 경쇄 결합 도메인은 함께 제1 Fab를 형성하며; 제2 중쇄 결합 도메인 및 제2 경쇄 결합 도메인은 함께 제2 Fab를 형성한다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물이 또한 기재되어 있으며, 상기 Fc-항원 결합 도메인 작제물은
a)
i) 제1 Fc 도메인 단량체,
ii) 제2 Fc 도메인 단량체,
iii) 제1 및 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커를 포함하는, 제1 폴리펩티드;
b)
i) 제3 Fc 도메인 단량체,
ii) 제4 Fc 도메인 단량체
iii) 제3 및 제4 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커를 포함하는, 제2 폴리펩티드;
c) 제5 Fc 도메인 단량체 및 제1 중쇄 결합 도메인을 포함하는 제3 폴리펩티드;
d) 제6 Fc 도메인 단량체 및 제2 중쇄 결합 도메인을 포함하는 제4 폴리펩티드;
e) 제1 경쇄 결합 도메인을 포함하는 제5 폴리펩티드; 및
f) 제2 경쇄 결합 도메인을 포함하는 제 6폴리펩티드;
제1 및 제5 Fc 도메인 단량체는 함께 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제3 및 제6 Fc 도메인 단량체는 함께 제2 Fc 도메인을 형성하며, 제2 및 제4 Fc 도메인 단량체는 함께 제3 Fc 도메인을 형성하고, 제1 중쇄 결합 도메인과 제1 경쇄 결합 도메인은 함께 제1 Fab를 형성하며, 제2 중쇄 결합 도메인과 제2 경쇄 결합 도메인은 함께 제2 Fab를 형성한다.
다양한 구현예에서: 제1 및 제2 폴리펩티드는 서열이 동일하고; 제3 및 제4 폴리펩티드는 서열이 동일하며; 제5 및 제6 폴리펩티드는 서열이 동일하고; 제1 및 제2 폴리펩티드는 서열이 동일하며, 제3 및 제4 폴리펩티드는 서열이 동일하고, 제5 및 제6 폴리펩티드는 서열이 동일하며; 각각의 Fc 도메인 단량체의 CH3 도메인은 최대 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하고; 각각의 Fc 도메인 단량체의 CH3 도메인은 인간 IgG1의 아미노산 서열과 비교하여, 최대 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하며; Fc 도메인 단량체 각각은 독립적으로, 최대 10, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 42, 43, 45 및 47 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고; 단일 아미노산 치환은 CH3 도메인에만 있으며; 제2 및 제4 Fc 도메인 단량체는 제2 및 제4 Fc 도메인 단량체 사이의 동종이량체화를 촉진하는 최대 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하고; 제1 및 제5 Fc 도메인 단량체는 제1 및 제5 Fc 도메인 단량체 사이의 이종이량체화를 촉진하는 최대 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하며, 제3 및 제6 Fc 도메인 단량체는 제3 및 제6 Fc 도메인 단량체 사이의 이종이량체화를 촉진하는 최대 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하고; 동종이량체화를 촉진하는 치환은 표 4a 및 표 4b의 치환으로부터 선택되며; 이종이량체화를 촉진하는 치환은 표 3의 치환으로부터 선택된다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물이 또한 기재되어 있으며, 상기 Fc-항원 결합 도메인 작제물은
a)
i) 제1 Fc 도메인 단량체,
ii) 제2 Fc 도메인 단량체,
iii) 제1 중쇄 결합 도메인, 및
iv) 제1 및 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커를 포함하는, 제1 폴리펩티드;
b)
i) 제3 Fc 도메인 단량체,
ii) 제4 Fc 도메인 단량체,
iii) 제2 중쇄 결합 도메인; 및
iv) 제3 및 제4 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커를 포함하는, 제2 폴리펩티드;
c) 제5 Fc 도메인 단량체 및 제3 중쇄 결합 도메인을 포함하는 제3 폴리펩티드;
f) 제6 Fc 도메인 단량체 및 제4 경쇄 결합 도메인을 포함하는 제4 폴리펩티드;
e) 제1 경쇄 결합 도메인을 포함하는 제5 폴리펩티드;
f) 제2 경쇄 결합 도메인을 포함하는 제 6폴리펩티드;
g) 제3 경쇄 결합 도메인을 포함하는 제7 폴리펩티드; 및
h) 제4 경쇄 결합 도메인을 포함하는 제8 폴리펩티드를 포함하되,
제1 및 제5 Fc 도메인 단량체는 함께 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제3 및 제6 Fc 도메인 단량체는 함께 제2 Fc 도메인을 형성하며, 제2 및 제4 Fc 단량체는 함께 제3 Fc 도메인을 형성하고, 제1 경쇄 결합 도메인 및 제3 중쇄 결합 도메인은 함께 제1 Fab를 형성하며, 제2 경쇄 결합 도메인 및 제4 중쇄 결합 도메인은 함께 제2 Fab를 형성하고, 제3 경쇄 결합 도메인 및 제1 중쇄 결합 도메인은 함께 제3 Fab를 형성하며; 제4 경쇄 결합 도메인 및 제2 중쇄 결합 도메인은 함께 제2 Fab를 형성한다.
다양한 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드가 서열이 동일하고; 제3 및 제4 폴리펩티드가 서열이 동일하며; 제5, 제6, 제7, 및 제8 폴리펩티드가 서열이 동일하고; 제1 및 제2 폴리펩티드가 서열이 동일하고, 제3 및 제4 폴리펩티드가 서열이 동일하며, 제5, 제6, 제7, 및 제8 폴리펩티드가 서열이 동일하고; Fc 도메인 단량체 각각의 CH3 도메인은 최대 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하고; Fc 도메인 단량체 각각의 CH3 도메인은 인간 IgG1의 아미노산 서열과 비교하여 최대 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하며; Fc 도메인 단량체 각각은 독립적으로 최대 10, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 42, 43, 45 및 47 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고; 단일 아미노산 치환은 CH3 도메인에만 있고; 제2 및 제4 Fc 도메인 단량체는 제2와 제4 Fc 도메인 단량체 사이의 동종이량체화를 촉진하는 최대 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하되, 제1 및 제5 Fc 도메인 단량체는 제1과 제5 Fc 도메인 단량체 사이의 이종이량체화를 촉진하는 최대 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하고, 제3 및 제6 Fc 도메인 단량체는 제3과 제6 Fc 도메인 단량체 사이의 이종이량체화를 촉진하는 최대 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하며, 동종이량체화를 촉진하는 치환은 표 4A 및 4B에 있는 치환에서 선택되고, 이종이량체화를 촉진하는 치환은 표 3에 있는 치환에서 선택된다.
여러 구현예에서, 각각의 링커는 GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG, GGGGS, GGSG, SGGG, GSGS, GSGSGS, GSGSGSGS, GSGSGSGSGS, GSGSGSGSGSGS, GGSGGS, GGSGGSGGS, GGSGGSGGSGGS, GGSG, GGSG, GGSGGGSG, GGSGGGSGGGSGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS, GENLYFQSGG, SACYCELS, RSIAT, RPACKIPNDLKQKVMNH, GGSAGGSGSGSSGGSSGASGTGTAGGTGSGSGTGSG, AAANSSIDLISVPVDSR, GGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGS, GGGSGGGSGGGS, SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG, GGSGGGSGGGSGGGSGGS, GGGG, GGGGGGGG, GGGGGGGGGGGG 및 GGGGGGGGGGGGGGGG로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 이러한 아미노산 서열로 이루어지며; Fc 도메인 단량체 중 적어도 하나는 EU 위치 I253에 치환을 포함하고; EU 위치 I253에서의 각각의 아미노산 치환은 독립적으로 I253A, I253C, I253D, I253E, I253F, I253G, I253H, I253I, I253K, I253L, I253M, I253N, I253P, I253Q, I253R, I253S, I253T, I253V, I253W, 및 I253Y로 이루어진 군에서 선택되며; Fc 도메인 단량체 중 적어도 하나는 EU 위치 R292에 치환을 포함하고; EU 위치 R292에서 각각의 아미노산 치환은 독립적으로 R292D, R292E, R292L, R292P, R292Q, R292R, R292T, 및 R292Y로 이루어진 군에서 선택되고; Fc 도메인 단량체 중 적어도 하나는 T366Y, T366W, T394W, T394Y, F405W, F405A, Y407A, S354C, Y349T, T394F, K409D, K409E, K392D, K392E, K370D, K370E, D399K, D399R, E357K, E357R, D356K, 및 D356R로 이루어진 군에서 선택되는 치환을 포함하며; Fc 도메인 단량체 각각의 힌지는 독립적으로 EPKSCDKTHTCPPCPAPELL 및 DKTHTCPPCPAPELL로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 이러한 아미노산 서열로 이루어진다.
본 발명의 모든 양태에서, Fc 도메인 단량체들의 일부 또는 전부(예를 들어, 10개, 8개, 6개, 또는 4개 이하의 단일 아미노산 치환을(예를 들어, CH3 도메인에서만) 갖는 서열 번호 42, 43, 45, 및 47 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 Fc 도메인 단량체)는 다른 아미노산 치환 또는 변형에 더하여 E345K 및 E430G 아미노산 치환 중 하나 또는 둘 다를 가질 수 있다. E345K 및 E430G 아미노산 치환은 Fc 도메인 다량체화를 증가시킬 수 있다(de Jong 등의 문헌 [PLoS Biol 14(1): e1002344)] 참조).
정의:
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "Fc 도메인 단량체"는 적어도 힌지 도메인 및 제2 및 제3 항체 불변 도메인(CH2 및 CH3) 또는 이의 기능성 단편(예를 들어, 적어도 힌지 도메인 또는 이의 기능성 단편, CH2 도메인 또는 이의 기능성 단편, 및 CH3 도메인 또는 이의 기능성 단편)(예를 들어, (i) 다른 Fc 도메인 단량체와 이량체화되어 Fc 도메인을 형성할 수 있고, (ii) Fc 수용체에 결합될 수 있는 단편)을 포함하는 폴리펩티드 사슬을 지칭한다. 바람직한 Fc 도메인 단량체는 아미노 말단에서 카복시 말단까지 IgG1 힌지, IgG1 CH2 도메인 및 IgG1 CH3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 따라서, Fc 도메인 단량체, 예컨대 인간 IgG1 Fc 도메인 단량체는 E316에서 G446 또는 K447까지, P317에서 G446 또는 K447까지, K318에서 G446 또는 K447까지, K318에서 G446 또는 K447까지, S319에서 G446 또는 K447까지, C320에서 G446 또는 K447까지, D321에서 G446 또는 K447까지, K322에서 G446 또는 K447까지, T323에서 G446 또는 K447까지, K323에서 G446 또는 K447까지, H324에서 G446 또는 K447까지, T325에서 G446 또는 K447까지, 또는 C326에서 G446 또는 K447까지 확장될 수 있다. Fc 도메인 단량체는 IgG, IgE, IgM, IgA 또는 IgD(예컨대, IgG)를 포함하는 임의의 면역글로불린 항체 동형일 수 있다. 추가로, Fc 도메인 단량체는 IgG 아형(예컨대, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 또는 IgG4)(예컨대, 인간 IgG1)일 수 있다. 인간 IgG1 Fc 도메인 단량체는 본원에 기재된 실시예에 사용된다. 인간 IgG1의 전체 힌지 도메인은 EU 넘버링 E316에서 P230 또는 L235까지 확장되고, CH2 도메인은 A231 또는 G236에서 K340까지 확장되고, CH3 도메인은 G341에서 K447까지 확장된다. 힌지 도메인의 마지막 아미노산의 위치에 대한 다른 견해가 있다. 이는 P230 또는 L235이다. 본원의 많은 예에서, CH3 도메인은 K347을 포함하지 않는다. 따라서, CH3 도메인은 G341에서 G446까지일 수 있다. 본원의 많은 예에서, 힌지 도메인은 E216 내지 L235를 포함할 수 있다. 이는, 예를 들어 힌지가 CH1 도메인 또는 CD38 결합 도메인의 카복시 말단인 경우에 해당된다. 일부 경우에, 예를 들어 힌지가 폴리펩티드의 아미노 말단에 있는 경우, EU 넘버링 221의 Asp는 Gln으로 돌연변이된다. Fc 도메인 단량체는 항원-인식 영역, 예컨대 가변 도메인 또는 상보성 결정 영역(CDR)으로 작용할 수 있는 면역글로불린의 어떤 부분도 포함하지 않는다. Fc 도메인 단량체는 Fc 도메인과 Fc 수용체 간의 상호작용을 변경하는 야생형(예컨대, 인간) Fc 도메인 단량체 서열로부터의 10개만큼의 변화(예컨대, 1~10개, 1~8개, 1~6개, 1~4개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실)를 함유할 수 있다. Fc 도메인 단량체는 Fc 도메인 단량체 간의 상호작용을 변경하는 야생형 Fc 도메인 단량체 서열로부터의 10개만큼의 변화(예컨대, 단일 아미노산 변화)(예컨대, 1~10개, 1~8개, 1~6개, 1~4개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실)를 함유할 수 있다. 특정 구현예에서, 인간 IgG1 CH3 서열 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG와 비교하여 CH3 도메인에는 최대 10개, 8개, 6개 또는 5개의 단일 아미노산 치환이 있다. 적합한 변화의 예는 당업계에 공지되어 있다.
본원에서 사용된 바와 같은, 용어 "Fc 도메인"은 Fc 수용체에 결합할 수 있는 2개의 Fc 도메인 단량체의 이량체를 지칭한다. 야생형 Fc 도메인에서, 2개의 Fc 도메인 단량체는 2개의 CH3 항체 불변 도메인 간의 상호작용뿐만 아니라 2개의 이량체화 Fc 도메인 단량체의 힌지 도메인 사이에 형성되는 하나 이상의 이황화 결합에 의해 이량체화된다.
본 발명에서, "Fc-항원 결합 도메인 작제물"이란 용어는 본원에 기재된 바와 같은 적어도 2개의 Fc 도메인을 형성하고 적어도 하나의 "항원 결합 도메인"을 포함하는 회합된 폴리펩티드 사슬을 지칭한다. 본원에 기재된 Fc-항원 결합 도메인 작제물은 동일하거나 상이한 서열을 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함할 수 있다. 예를 들어, Fc-항원 결합 도메인 작제물은 3개의 Fc 도메인을 가질 수 있고, 이 중 2개는 IgG1 또는 IgG1-유래 Fc 도메인 단량체를 포함하고, 세 번째 것은 IgG2 또는 IgG2-유래 Fc 도메인 단량체를 포함한다. 또 다른 예에서, Fc-항원 결합 도메인 작제물은 3개의 Fc 도메인을 가질 수 있고, 그 중 2개는 "돌출부-함몰부 쌍"을 포함하고, 세 번째는 "돌출부-함몰부 쌍"을 포함하지 않는다. Fc 도메인은 Fc 수용체, 예컨대 FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa, FcγRIIIb 또는 FcγRIV에 결합하는 최소 구조를 형성한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항원 결합 도메인"은 표적 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 펩티드, 폴리펩티드 또는 회합된 폴리펩티드를 지칭한다. 일부 구현예에서, "항원 결합 도메인"은 항체에 의해 결합된 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 최소 서열이다. 표면 플라스몬 공명(SPR) 또는 당업계에 공지된 다양한 면역검정, 예를 들어 웨스턴 블롯 또는 ELISA를 사용하여 항원에 대한 항체 특이성을 평가할 수 있다. 일부 구현예에서, "항원 결합 도메인"은 항체의 가변 도메인 또는 상보성 결정 영역(CDR), 예를 들어, 표 1에 기재된 항체의 하나 이상의 CDR, 표 2에 기재된 항체의 하나 이상의 CDR, 또는 표 2에 기재된 항체의 VH 및/또는 VL 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은, 선택적으로 VL 도메인과 함께, VH 도메인 및 CH1 도메인을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 항원 결합 도메인은 항체의 Fab 단편 또는 scFv이다. 항원 결합 도메인은 또한, 피브로넥틴 기반 결합 단백질(예를 들어, 피브로넥틴 III형 도메인(FN3) 모노바디)과 같은 표적에 특이적으로 결합하는 합성 유전자 조작 펩티드일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항원 결합 도메인"은 표적 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 펩티드, 폴리펩티드 또는 회합된 폴리펩티드를 지칭한다. 일부 구현예에서, "항원 결합 도메인"은 항체에 의해 결합된 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 최소 서열이다. 표면 플라스몬 공명(SPR) 또는 당업계에 공지된 다양한 면역검정, 예를 들어 웨스턴 블롯 또는 ELISA를 사용하여 항원에 대한 항체 특이성을 평가할 수 있다. 일부 구현예에서, "항원 결합 도메인"은 항체의 가변 도메인 또는 상보성 결정 영역(CDR), 예를 들어, 표 1에 기재된 항체의 하나 이상의 CDR, 표 2에 기재된 항체의 하나 이상의 CDR, 또는 표 2에 기재된 항체의 VH 및/또는 VL 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, CD38 결합 도메인은 VH 도메인 및 CH1 도메인을, 선택적으로 VL 도메인과 함께 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 항원(예: CD38) 결합 도메인은 항체의 Fab 단편 또는 scFv이다. 그러므로, CD38 결합 도메인은 VH 도메인 및 CH1 도메인을 포함하거나 이로 이루어지는 "CD38 중쇄 결합 도메인", 및 VL 도메인 및 CL 도메인을 포함하거나 이로 이루어지는 "CD38 경쇄 결합 도메인"을 포함할 수 있다. CD38 결합 도메인은 또한 피브로넥틴 기반 결합 단백질(예를 들어, 피브로넥틴 III형 도메인(FN3) 모노바디)과 같은 표적에 특이적으로 결합하는 합성 유전자 조작 펩티드일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "상보성 결정 영역"(CDR)은 항원 결합에 필요한 항체 가변 도메인의 아미노산 잔기를 지칭한다. 각각의 가변 도메인은 일반적으로 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3, 및 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3으로 식별되는 3개의 CDR 영역을 갖는다. 각각의 상보성 결정 영역은 Kabat에 의해 정의된 "상보성 결정 영역"으로부터의 아미노산 잔기(즉, 경쇄 가변 도메인에서 약 잔기 24~34(CDR-L1), 50~56(CDR-L2) 및 89~97(CDR-L3) 및 중쇄 가변 도메인에서 31~35(CDR-H1), 50~65(CDR-H2) 및 95~102(CDR-H3); 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.(1991)]) 및/또는 "초가변 루프"(즉, 경쇄 가변 도메인에서 약 잔기 26~32(CDR-L1), 50~52(CDR-L2) 및 91~96(CDR-L3), 및 중쇄 가변 도메인에서 26~32(CDR-H1), 53~55(CDR-H2) 및 96~101(CDR-H3); 문헌[Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917(1987)])로부터의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 상보성 결정 영역은 Kabat에 따라 정의된 CDR 영역 및 초가변 루프 둘 모두로부터의 아미노산을 포함할 수 있다.
"프레임워크 영역"(이하 FR)은 CDR 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다. 각각의 가변 도메인은 전형적으로 FR1, FR2, FR3 및 FR4으로 동정되는 4개의 FR을 갖는다. CDR이 Kabat에 따라 정의된 경우, 경쇄 FR 잔기는 약 잔기 1~23(LCFR1), 35~49(LCFR2), 57~88(LCFR3) 및 98~107(LCFR4)에 위치되며, 중쇄 FR 잔기는 중쇄 잔기의 약 잔기 1~30(HCFR1), 36~49(HCFR2), 66~94(HCFR3) 및 103~113(HCFR4)에 위치한다. CDR이 초가변 루프로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 경우, 경쇄 FR 잔기는 경쇄의 약 잔기 1~25(LCFR1), 33~49(LCFR2), 53~90(LCFR3) 및 97~107(LCFR4)에 위치하며, 중쇄 FR 잔기는 중쇄 잔기의 약 잔기 1~25(HCFR1), 33~52(HCFR2), 56~95(HCFR3) 및 102~113(HCFR4)에 위치한다. 일부 경우에, CDR이 Kabat에 의해 정의된 CDR 및 초가변 루프의 것들 모두로부터의 아미노산을 포함하는 경우, FR 잔기는 그에 따라 조정될 수 있다.
"Fv" 단편은 완전 항원 인식 및 결합 부위를 포함하는 항체 단편이다. 이러한 영역은 밀접하게 회합된 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 이루어지며, 이는 본질적으로, 예를 들어 scFv에서, 공유 결합일 수 있다. 이 구성에서 각각의 가변 도메인의 3개의 CDR은 상호작용하여 VH-VL 이량체 표면의 항원 결합 부위를 정의한다.
"Fab" 단편은 경쇄의 가변 및 불변 도메인, 및 중쇄의 가변 도메인 및 제1 불변 도메인(CH1)을 포함한다. F(ab')2 항체 단편은 일반적으로 힌지 시스테인에 의해 카복시 말단 근처에 공유 결합된 한 쌍의 Fab 단편을 포함한다.
"단일-사슬 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 단일 폴리펩티드 사슬에 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함한다. 일반적으로, scFv 폴리펩티드는 VH과 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함하며, 이는 scFv가 항원 결합에 바람직한 구조를 형성할 수 있게 한다.
본원에 사용된 용어 "항체 불변 도메인"은 항체의 불변 영역 도메인(예를 들어, CL 항체 불변 도메인, CH1 항체 불변 도메인, CH2 항체 불변 도메인, 또는 CH3 항체 불변 도메인)에 상응하는 폴리펩티드를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "촉진한다"는 다른 별개의 Fc 도메인 단량체보다 서로 간에 결합 친화도가 더 높은 2개의 Fc 도메인 단량체로부터 Fc 도메인의 형성을 장려하는 것과 같이 조장하거나 장려하게 하는 것을 의미한다. 본원에 기재된 바와 같이, 결합하여 Fc 도메인을 형성하는 2개의 Fc 도메인 단량체는 그들 각자의 CH3 항체 불변 도메인의 계면에서 양립성 아미노산 변형(예를 들어, 유전자 조작 돌출부 및 유전자 조작 함몰부 및/또는 정전기 스티어링 돌연변이)을 가질 수 있다. 양립성 아미노산 변형은 이러한 아미노산 변형이 결여되거나 비양립성 아미노산 변형을 갖는 다른 Fc 도메인 단량체와 비교하여 이러한 Fc 도메인 단량체의 서로 간의 선택적 상호작용을 촉진하거나 장려한다. 이는 2개의 상호작용하는 CH3 항체 불변 도메인의 계면에서의 아미노산 변형으로 인해, 아미노산 변형이 결여된 다른 Fc 도메인 단량체보다 서로를 향해 더 높은 친화도를 갖는 Fc 도메인 단량체 때문에 발생한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "이량체화 선택성 모듈"은 2개의 Fc 도메인 단량체 간의 장려되는 페어링을 용이하게 하는 Fc 도메인 단량체의 서열을 지칭한다. "상보적" 이량체화 선택성 모듈은 2개의 Fc 도메인 단량체의 서로 간의 선택적 상호작용을 촉진하거나 장려하는 이량체화 선택성 모듈이다. 상보적 이량체화 선택성 모듈은 동일한 또는 상이한 서열을 가질 수 있다. 예시적인 상보적 이량체화 선택성 모듈은 본원에 기재된다.
본원에서 사용된 바와 같은, 용어 "유전자 조작 함몰부"는 상이한 아미노산 잔기가 원래의 아미노산 잔기보다 더 작은 측쇄 체적을 가져 CH3 항체 불변 도메인에 3차원 함몰부를 생성하는 CH3 항체 불변 도메인에 있는 원래의 아미노산 잔기 중 적어도 하나의 치환을 지칭한다. "원래의 아미노산 잔기"라는 용어는 야생형 CH3 항체 불변 도메인의 유전 암호에 의해 암호화된 자연 발생 아미노산 잔기를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유전자 조작 돌출부"는 원래의 아미노산 잔기보다 더 큰 측쇄 체적을 갖는 상이한 아미노산 잔기를 가진 CH3 항체 불변 도메인에 있는 원래의 아미노산 잔기 중 적어도 하나의 치환을 지칭하며, 따라서 CH3 항체 불변 도메인에 3차원 돌출부를 생성한다. "원래의 아미노산 잔기들"이라는 용어는 야생형 CH3 항체 불변 도메인의 유전 암호에 의해 암호화된 자연 발생 아미노산 잔기들을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "돌출부-함몰부 쌍"은 2개의 Fc 도메인 단량체를 포함하는 Fc 도메인을 설명하되, 제1 Fc 도메인 단량체는 이의 CH3 항체 불변 도메인에 유전자 조작 함몰부를 포함하는 반면, 제2 Fc 도메인 단량체는 이의 CH3 항체 불변 도메인에 유전자 조작 돌출부를 포함한다. 돌출부-함몰부 쌍에서, 제1 Fc 도메인 단량체의 CH3 항체 불변 도메인에 있는 유전자 조작 돌출부는 CH3 항체 불변 도메인간 계면에서 이량체의 정상 회합을 유의미하게 교란시키지 않으면서 제2 Fc 도메인 단량체의 CH3 항체 불변 도메인의 유전자 조작 함몰부와 상호작용하도록 위치된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "이종이량체 Fc 도메인"은 2개의 Fc 도메인 단량체의 이종이량체화에 의해 형성되는 Fc 도메인을 지칭하되, 2개의 Fc 도메인 단량체는 이들 2개의 Fc 도메인 단량체의 유리한 형성을 촉진하는 상이한 역전하 돌연변이(예를 들어, 표 4의 돌연변이 참조)를 포함한다. 3개의 Fc 도메인, 즉 1개의 카복실 말단 "줄기" Fc 도메인 및 2개의 아미노 말단 "분지" Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물에서, 아미노 말단 "분지" Fc 도메인 각각은 이종이량체 Fc 도메인("분지 이종이량체 Fc 도메인"이라고도 함)일 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물의 개체군과 관련하여 본원에서 사용된 용어 "구조적으로 동일한"은 동일한 비율 및 구성으로 동일한 폴리펩티드 서열의 조립인 작제물을 지칭하며, 글리코실화와 같은 임의의 번역 후 변형을 지칭하지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "동종이량체 Fc 도메인"은 2개의 Fc 도메인 단량체의 동종이량체화에 의해 형성되는 Fc 도메인을 지칭하되, 2개의 Fc 도메인 단량체는 동일한 역전하 돌연변이(예를 들어, 표 5 및 표 6의 돌연변이 참조)를 포함한다. 3개의 Fc 도메인, 즉 1개의 카복실 말단 "줄기" Fc 도메인 및 2개의 아미노 말단 "분지" Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물에서, 카복시 말단 "줄기" Fc 도메인은 동종이량체 Fc 도메인("줄기 동종이량체 Fc 도메인"이라고도 함)일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "이종이량체화 선택성 모듈"은 양립성 이종이량체화 선택성 모듈을 갖는 2개의 Fc 도메인 단량체의 유리한 이종이량체화를 촉진하기 위해 Fc 도메인 단량체의 CH3 항체 불변 도메인에서 이루어질 수 있는 유전자 조작 돌출부, 유전자 조작 함몰부 및 특정 역전하 아미노산 치환을 지칭한다. 이종이량체화 선택성 모듈을 포함하는 Fc 도메인 단량체는 결합하여 이종이량체 Fc 도메인을 형성할 수 있다. 이종이량체화 선택성 모듈의 예는 표 3 및 표 4에 도시되어 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "동종이량체화 선택성 모듈"은 동종이량체 Fc 도메인을 형성하도록 Fc 도메인 단량체의 동종이량체화를 촉진하는 CH3 도메인 간의 계면에서 하전 잔기의 고리 내의 적어도 2개의 위치의 Fc 도메인 단량체의 역전하 돌연변이를 지칭한다. 동종이량체화 선택성 모듈의 예는 표 4 및 표 5에 도시되어 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "연결된(joined)"은 화학적 접합, 재조합 수단 및 화학 결합(예컨대, 이황화 결합 및 아미드 결합)을 포함하는 수단에 의한 둘 이상의 요소, 성분, 또는 단백질 도메인(예컨대, 폴리펩티드)의 조합 또는 부착을 설명하기 위해 사용된다. 예를 들어, 2개의 단일 폴리펩티드는 화학적 접합, 화학 결합, 펩티드 링커, 또는 임의의 다른 공유 결합 수단을 통해 연결되어 하나의 연속 단백질 구조를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 항원 결합 도메인 및 Fc 도메인 단량체 모두를 인코딩하는 연속 핵산 서열로부터 발현됨으로써 Fc 도메인 단량체에 연결된다. 다른 구현예에서, 항원 결합 도메인은 펩티드 링커를 통해 Fc 도메인 단량체에 연결되며, 펩티드 링커의 N-말단은 화학 결합, 예컨대 펩티드 결합을 통해 항원 결합 도메인의 C-말단에 연결되고, 펩티드 링커의 C-말단은 화학 결합, 예컨대 펩티드 결합을 통해 Fc 도메인 단량체의 N-말단에 연결된다.
본원에 사용된 "회합"이라는 용어는 폴리펩티드(또는 하나의 단일 폴리펩티드 내의 서열)가 본원에 기재된 Fc-항원 결합 도메인 작제물(예를 들어, 3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc-항원 결합 도메인 작제물)을 형성하도록 위치되게 하는 폴리펩티드(또는 하나의 단일 폴리펩티드 내의 서열) 간의 상호작용, 예컨대 수소 결합, 소수성 상호작용, 또는 이온성 상호작용을 기술하는 데 사용된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 4개의 폴리펩티드, 예를 들어 2개의 Fc 도메인 단량체를 각각 포함하는 2개의 폴리펩티드 및 하나의 Fc 도메인 단량체를 각각 포함하는 2개의 폴리펩티드는 회합되어(예를 들어, 도 50 및 도 51에 도시된 바와 같은) 3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물을 형성한다. 4개의 폴리펩티드는 이들 각자의 Fc 도메인 단량체를 통해 회합할 수 있다. 폴리펩티드 사이의 회합은 공유 상호작용을 포함하지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "링커"는 2개의 요소, 예를 들어 단백질 도메인 사이의 연결을 지칭한다. 링커는 공유 결합 또는 스페이서일 수 있다. "결합"이라는 용어는 화학 결합, 예컨대, 아미드 결합 또는 이황화 결합, 또는 화학 반응에 의해 생성된 임의의 종류의 결합, 예컨대, 화학적 접합을 지칭한다. "스페이서"라는 용어는 2개의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 도메인 사이에 공간 및/또는 가요성을 제공하기 위해 2개의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 도메인 사이에 발생하는 모이어티(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 중합체) 또는 아미노산 서열(예를 들어, 3~200개의 아미노산, 3~150개의 아미노산 또는 3~100개의 아미노산 서열)을 지칭한다. 아미노산 스페이서는(예를 들어, 폴리펩티드 골격을 통해 이격된 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 도메인에 연결된) 폴리펩티드의 1차 서열의 부분이다. 예를 들어, Fc 도메인을 형성하는 2개의 힌지 영역 또는 2개의 Fc 도메인 단량체 사이의 이황화 결합의 형성은 링커로 간주되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "글리신 스페이서"는 2개의 Fc 도메인 단량체를 직렬로 결합시키는 글리신만을 포함하는 링커를 지칭한다. 글리신 스페이서는 적어도 4, 8 또는 12개의 글리신(예를 들어, 4~30, 8~30 또는 12~30개의 글리신; 예를 들어, 12~30개, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 글리신)을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 글리신 스페이서는 GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG(서열 번호 27)의 서열을 갖는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "알부민-결합 펩티드"는 혈청 알부민에 대한 친화도를 가지며, 이에 결합하도록 기능하는 12 내지 16개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 지칭한다. 알부민-결합 펩티드는 상이한 기원, 예를 들어 인간, 마우스 또는 쥐의 것일 수 있다. 본 개시 내용의 일부 구현예에서, 알부민-결합 펩티드는 Fc 도메인 단량체의 C-말단에 융합되어 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 혈청 반감기를 증가시킨다. 알부민-결합 펩티드는 직접 또는 링커를 통해, Fc 도메인 단량체의 N-말단 또는 C-말단에 융합될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "정제 펩티드"는 폴리펩티드의 정제, 단리 또는 동정에 사용될 수 있는 임의의 길이의 펩티드를 지칭한다. 정제 펩티드는, 예를 들어 세포 용해 혼합물로부터 폴리펩티드를 정제하고/하거나 폴리펩티드를 단리하는 것을 돕기 위해 폴리펩티드에 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 정제 펩티드는 정제 펩티드에 특이적 친화도를 갖는 다른 모이어티에 결합한다. 일부 구현예에서, 정제 펩티드에 특이적으로 결합하는 이러한 모이어티는 매트릭스, 수지 또는 아가로스 비드와 같은 고형 지지체에 부착된다. Fc-항원 결합 도메인 작제물에 연결될 수 있는 정제 펩티드의 예는 본원에서 추가로 상세하게 기술된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "다량체"는 본원에 기재된 적어도 2개의 회합된 Fc 작제물 또는 Fc-항원 결합 도메인 작제물을 포함하는 분자를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "폴리뉴클레오티드"는 올리고뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드, 및 이의 단편 또는 일부를 지칭하며, 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있고 센스 가닥 또는 안티-센스 가닥을 나타낼 수 있는 게놈 기원 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA를 지칭한다. 단일 폴리뉴클레오티드는 단일 폴리펩티드로 번역된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "폴리펩티드"는 단량체가 아미드 결합을 통해 서로 연결되는 아미노산 잔기인 단일 중합체를 말한다. 폴리펩티드는 자연 발생, 재조합 또는 합성에 의해 생성된 임의의 아미노산 서열을 포함하도록 의도된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "아미노산 위치"는 단백질 또는 단백질 도메인에서 아미노산의 위치 번호를 지칭한다. 아미노산 위치는 표시된 경우 (예를 들어, CDR 및 FR 영역) Kabat 넘버링 시스템(Kabat 등의 문헌[Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., ed 5, 1991])을 사용하여 넘버링되며, 그렇지 않으면 EU 넘버링이 사용된다.
도 24a 내지 도 24d는 EU 넘버링 시스템을 사용하여 넘버링된 인간 IgG1 Fc 도메인을 도시한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "아미노산 변형"은 기준 서열(예를 들어, 야생형, 비돌연변이 또는 비변형 Fc 서열)과 비교하여, 약물동력학(PK) 및/또는 약물력학(PD) 특성, 혈청 반감기, 효과기 기능(예를 들어, 세포 용해(예를 들어, 항체-의존성 세포-매개 독성(ADCC) 및/또는 보체 의존성 세포독성 활성(CDC)), 식균작용(예를 들어, 항체 의존성 세포성 식균작용(ADCP) 및/또는 보체-의존성 세포성 세포독성(CDCC)), 면역 활성 및 T-세포 활성), Fc 리포터에(예를 들어, Fc-감마 수용체(FcγR)(예를 들어, FcγRI(CD64), FcγRIIA(CD32), FcγRIIB(CD32), FcγRIIIA(CD16a) 및/또는 FcγRIIIB(CD16b)), Fc-알파 리포터(FcαR), Fc-엡실론 수용체(FcεR) 및/또는 신생아의 Fc 수용체(FcRn)에) 대한 친화도, 보체 연쇄반응(compliment cascade)(예를 들어, C1q)에 관여하는 단백질에 대한 친화도, 번역 후 변형(예를 들어, 글리코실화, 시알산화), 응집 특성(예를 들어, 이량체(예를 들어, 동종이량체 및/또는 이종이량체) 및/또는 다량체를 형성하는 능력) 및 (예를 들어, CH1 및 CL 사이의 상호작용을 변경하고, 안정성을 변경하고/하거나 온도 및/또는 pH에 대한 감수성을 변경하는) Fc 작제물의 생물물리학적 특성에 영향을 끼칠 수 있고, 면역성 질환 및 염증성 질환의 치료 효능 개선을 촉진시킬 수 있는 Fc 도메인 폴리펩티드 서열의 변경을 지칭한다. 아미노산 변형은 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 포함한다. 일부 구현예에서, 아미노산 변형은 단일 아미노산의 변형이다. 다른 구현예에서, 아미노산 변형은 다수의(예컨대, 하나 초과의) 아미노산의 변형이다. 아미노산 변형은 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입의 조합을 포함할 수 있다. 아미노산 변형의 설명에는 점 돌연변이(예를 들어, 단일 뉴클레오티드를 다른 것과 교환하는 것)와 같은 유전자(즉, DNA 및 RNA) 변경, Fc 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 삽입 및 결실(예를 들어, 하나 이상의 뉴클레오티드의 첨가 및/또는 제거)이 포함된다.
특정 구현예에서, Fc 작제물 또는 Fc-항원 결합 도메인 작제물 내의 적어도 하나(예컨대, 1, 2, 또는 3개)의 Fc 도메인은 아미노산 변형을 포함한다. 일부 경우에, 적어도 하나의 Fc 도메인은 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 20개 이상)의 아미노산 변형을 포함한다.
특정 구현예에서, Fc 작제물 또는 Fc-항원 결합 도메인 작제물 내의 적어도 하나(예를 들어, 1, 2 또는 3개)의 Fc 도메인 단량체는 아미노산 변형(예컨대, 치환)을 포함한다. 일부 경우에, 적어도 하나의 Fc 도메인 단량체는 하나 이상의(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 20개 이하) 아미노산 변형들(예를 들어, 치환들)을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "퍼센트(%) 동일성"은, 필요한 경우, 최대 % 동일성을 달성하기 위해 서열을 정렬하고 갭(gap)을 도입한(즉, 갭은 최적의 정렬을 위해 후보 및 참조 서열 중 하나 또는 둘 모두에 도입될 수 있으며, 비상동 서열은 비교를 위해 무시할 수 있음) 후에 기준 서열, 예를 들어, 야생형 Fc 도메인 단량체의 서열의 아미노산(또는 핵산) 잔기와 동일한 후보 서열, 예를 들어 본원에 기재된 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 Fc 도메인 단량체의 서열의 아미노산(또는 핵산) 잔기의 백분율을 지칭한다. % 동일성을 결정하기 위한 정렬은 당업계의 기술 내에 있는 다양한 방법, 예를 들어 BLAST, ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 정렬을 측정하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 일부 구현예에서, 주어진 기준 서열에 대한, 이에 대해 또는 이와 비교하여 주어진 후보 서열의 % 아미노산(또는 핵산) 서열 동일성(이는 특정 % 아미노산(또는 핵산)을 갖거나 포함하는 주어진 후보 서열로 대안적으로 표현될 수 있음)은 다음과 같이 계산된다:
100 x (A/B의 분수)
여기서, A는 후보 서열 및 기준 서열의 정렬에서 동일한 것으로 점수가 부여된 아미노산(또는 핵산) 잔기의 수이고, B는 기준 서열에 있는 아미노산(또는 핵산) 잔기의 총 수이다. 후보 서열의 길이가 기준 서열의 길이와 같지 않은 일부 구현예에서, 기준 서열에 대한 후보 서열의 퍼센트 아미노산(또는 핵산) 서열 동일성은 후보 서열에 대한 기준 서열의 퍼센트 아미노산(또는 핵산) 서열 동일성과 같지 않을 수 있다.
특정 구현예에서, 후보 서열과 비교하여 정렬된 기준 서열은 후보 서열의 전체 길이 또는 후보 서열의 인접한 아미노산(또는 핵산) 잔기의 선택된 부분에 걸쳐서 후보 서열이 50% 내지 100%의 동일성(예컨대, 50% 내지 100%, 60% 내지 100%, 70% 내지 100%, 80% 내지 100%, 90% 내지 100%, 92% 내지 100%, 95% 내지 100%, 97% 내지 100%, 99% 내지 100%, 또는 99.5% 내지 100%의 동일성)을 보임을 나타낼 수 있다. 비교를 위해 정렬된 후보 서열의 길이는 기준 서열 길이의 적어도 30%, 예컨대, 적어도 40%, 예컨대, 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%이다. 후보 서열에서의 위치를 기준 서열에서의 상응하는 위치와 동일한 아미노산(또는 핵산) 잔기가 차지할 때, 분자는 해당 위치에서 동일하다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 Fc 작제물 내의 Fc 도메인 단량체(예를 들어, 3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc-항원 결합 도메인 작제물)는 야생형 Fc 도메인 단량체의 서열(예를 들어, 서열번호 42)에 적어도 95% 동일한(예를 들어, 적어도 97%, 99% 또는 99.5% 동일한) 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 Fc 작제물 내의 Fc 도메인 단량체(예를 들어, 3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc-항원 결합 도메인 작제물)는 서열번호 44, 46, 48 및 50~53 중 어느 하나의 서열에 적어도 95% 동일한(적어도 97%, 99% 또는 99.5% 동일한) 서열을 가질 수 있다. 특정 구현예에서, Fc 작제물 내의 Fc 도메인 단량체는 서열번호 48, 52 및 53의 서열에 적어도 95% 동일한(예를 들어, 적어도 97%, 99% 또는 99.5% 동일한) 서열을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 2개의 Fc 도메인 단량체 사이의 스페이서는 본원에 추가로 기재된 서열번호 1~36(예를 들어, 서열번호 17, 18, 26 및 27) 중 어느 하나의 서열에 적어도 75% 동일한(적어도 75%, 77%, 79%, 81%, 83%, 85%, 87%, 89%, 91%, 93%, 95%, 97%, 99%, 99.5% 또는 100% 동일한) 서열을 가질 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "숙주 세포"는 필요한 세포 성분, 예컨대, 그의 상응하는 핵산에서부터 단백질을 발현하는 데 필요한 세포 기관을 포함하는 비히클(vehicle)을 지칭한다. 핵산은 전형적으로 당업계에 공지된 종래 기술(형질전환, 형질감염, 전기 천공법, 인산칼슘 침전, 직접 미세주입(direct microinjection) 등)에 의해 숙주 세포에 도입될 수 있는 핵산 벡터에 포함된다. 숙주 세포는 원핵 세포(예를 들어, 세균 세포) 또는 진핵 세포(예를 들어, CHO 세포와 같은 포유류 세포)일 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 숙주 세포를 사용하여 원하는 도메인을 암호화하는 하나 이상의 폴리펩티드를 발현하며, 이는 이어서 결합하여 원하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물을 형성할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약학 조성물"은 유효 성분뿐만 아니라 유효 성분을 투여 방법에 적합하게 만들 수 있는 하나 이상의 부형제 및 희석제를 포함하는 의약 또는 약학 제형을 지칭한다. 본 개시 내용의 약학 조성물은 Fc-항원 결합 도메인 작제물과 양립 가능한, 약학적으로 허용 가능한 성분을 포함한다. 일반적으로, 약학 조성물은 정맥내 또는 피하 투여를 위한 수성 형태이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 폴리펩티드 또는 Fc 작제물의 "실질적으로 균질한 집단"은, 비환원 SDS 겔 전기영동 또는 크기 배제 크로마토그래피로 결정시, 조성물(예를 들어, 세포 배양 배지 또는 약학 조성물) 내 폴리펩티드 또는 Fc 작제물의 적어도 50%가 동일한 수의 Fc 도메인을 갖는 것이다. 폴리펩티드 또는 Fc 작제물의 실질적으로 균질한 집단은 정제 전에, 또는 단백질 A 또는 단백질 G 정제 후에, 또는 임의의 Fab 또는 Fc-특이적 친화도 크로마토그래피 후에만 수득될 수 있다. 다양한 구현예에서, 조성물에서의 폴리펩티드 또는 Fc 작제물의 적어도 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% 또는 85%는 동일한 수의 Fc 도메인을 갖는다. 다른 구현예에서, 조성물에서의 폴리펩티드 또는 Fc 작제물의 최대 85%, 90%, 92% 또는 95%는 동일한 수의 Fc 도메인을 갖는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약학적으로 허용 가능한 담체"는 약학 조성물 중의 부형제 또는 희석제를 지칭한다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 제형의 다른 성분과 양립 가능해야 하고 피투여자에게 해롭지 않아야 한다. 본 발명에서, 약학적으로 허용 가능한 담체는 Fc-항원 결합 도메인 작제물에 적절한 약학적 안정성을 제공해야 한다. 담체의 특성은 투여 방식에 따라 다르다. 예를 들어, 경구 투여에서는 고형 담체가 바람직하고, 정맥내 투여에서는 수용액 담체(예를 들어, WFI 및/또는 완충액)가 일반적으로 사용된다.
본원에서 사용된 "치료 유효량"은 대상 또는 환자에서 원하는 생물학적 효과를 유도하거나 본원에 기재된 질병 또는 장애를 갖는 환자를 치료하는 데 효과적인 약학적 투여량과 같은 양을 지칭한다. 또한 본원에서 "치료 유효량"은 1회 투여량으로 또는 임의의 용량 또는 경로로 섭취되거나 단독으로 또는 다른 치료제와 병용하여 섭취되어 원하는 치료 효과를 제공하는 양으로 해석될 수 있음이 이해되어야 한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 단편 및 용어 부분은 상호 교환 가능하게 사용될 수 있다.
도 1은 2개의 Fc 도메인 및 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 1)을 도시한다. 각각의 Fc 도메인은 2개의 Fc 도메인 단량체의 이량체이다. Fc 도메인 단량체 중 2개(106 및 108)는 그의 CH3 항체 불변 도메인의 돌출부를 포함하는 반면, Fc 도메인 단량체의 다른 2개(112 및 114)는 그의 CH3 항체 불변 도메인의 병렬 위치에 함몰부를 포함한다. 이 작제물은 3개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 제1 폴리펩티드(102)는 VH 도메인을 포함하는 항원 결합 도메인(110)에 N-말단에서 스페이서에 의해 직렬로 연결된 2개의 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(106 및 108)를 포함한다. VL 함유 도메인(104)은 VH 도메인에 연결된다. 제2 및 제3 폴리펩티드(112 및 114) 각각은 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체를 포함한다.
도 2는 3개의 Fc 도메인 및 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 2)을 도시한다. 이 작제물은 4개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 제1 폴리펩티드(202)는 VH 도메인을 포함하는 항원 결합 도메인(212)에 N-말단에서 스페이서에 의해 직렬로 연결된 3개의 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(206, 208 및 210)를 포함한다. VL 함유 도메인(204)은 VH 도메인에 연결된다. 제2, 제3, 및 제4 폴리펩티드(214, 216, 및 218) 각각은 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체를 포함한다.
도 3은 2개의 Fc 도메인 및 2개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 3)을 도시한다. 이 작제물은 3개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 제1 폴리펩티드(302)는 스페이서에 의해 직렬로 연결된 2개의 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(304 및 306)를 포함한다. 제2 및 제3 폴리펩티드(320 및 322) 각각은 VH 도메인을 포함하는 항원 결합 도메인(316 및 318)에 N-말단에서 직렬로 연결된 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(310 및 314)를 포함한다. VL 함유 도메인(308 및 312)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 4는 3개의 Fc 도메인 및 3개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 4)을 도시한다. 이 작제물은 4개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 제1 폴리펩티드(402)는 스페이서에 의해 직렬로 연결된 3개의 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(404, 406 및 408)를 포함한다. 제2, 제3 및 제4 폴리펩티드(428, 430 및 432) 각각은 VH 도메인을 포함하는 항원 결합 도메인(422, 416 및 410)에 N-말단에서 직렬로 연결된 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(426, 420 및 414)를 포함한다. VL 함유 도메인(424, 418, 및 412)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 5는 2개의 Fc 도메인 및 3개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 5)을 도시한다. 이 작제물은 3개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 제1 폴리펩티드(502)는 VH 도메인(510)을 포함하는 항원 결합 도메인에 N-말단에서 스페이서에 의해 직렬로 연결된 2개의 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(508 및 506)를 포함한다. 제2 및 제3 폴리펩티드(524 및 526) 각각은 VH 도메인을 포함하는 항원 결합 도메인(512 및 518)에 N-말단에서 직렬로 연결된 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(516 및 522)를 포함한다. VL 함유 도메인(504, 514, 및 520)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 6은 3개의 Fc 도메인 및 4개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 6)을 도시한다. 이 작제물은 4개의 Fc 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 제1 폴리펩티드(602)는 VH 도메인(612)을 포함하는 항원 결합 도메인(612)에 N-말단에서 스페이서에 의해 직렬로 연결된 3개의 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(606, 608 및 610)를 포함한다. 제2, 제3 및 제4 폴리펩티드(632, 634 및 636) 각각은 VH 도메인을 포함하는 항원 결합 도메인(616, 622 및 628)에 N-말단에서 직렬로 연결된 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(618, 624 및 630)를 포함한다. VL 함유 도메인(604, 616, 622, 및 628)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 7은 3개의 Fc 도메인 및 2개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 7)을 도시한다. 본 Fc-항원 결합 도메인 작제물은 2개의 Fc 도메인 단량체(706 및 718)의 이량체를 포함하되, Fc 도메인 단량체 둘 다는 이들 2개의 Fc 도메인 단량체 사이에서 유리한 정전기적 상호작용을 촉진하기 위해 WT 서열과 상이한 하전 아미노산을 이의 CH3-CH3 계면에 포함한다. 이 작제물은 4개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(702 및 724)는, WT 서열과 상이한 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(706 및 718) 및 VH 도메인을 포함하는 항원 결합 도메인(712 및 714)에 N-말단에서 스페이서에 의해 직렬로 연결된 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(710 및 720)를 각각 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(708 및 722)는 각각 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체를 포함한다. VL 함유 도메인(704 및 716)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 8은 3개의 Fc 도메인 및 2개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 8)을 도시한다. 이 작제물은 4개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(802 및 828)는, WT 서열과 다른 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(810 및 816)에 스페이서에 의해 직렬로 연결된 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(814 및 820)를 각각 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(804 및 826) 각각은 VH 도메인을 포함하는 항원 결합 도메인(812 및 818)에 N-말단에서 직렬로 연결된 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(808 및 824)를 포함한다. VL 함유 도메인(806 및 822)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 9는 3개의 Fc 도메인 및 4개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 9)을 도시한다. 이 작제물은 4개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(902 및 936)는, WT 서열과 다른 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(910 및 924) 및 VH 도메인을 포함하는 항원 결합 도메인(908 및 920)에 N-말단에서 스페이서에 의해 직렬로 연결된 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(918 및 928)를 각각 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(904 및 934)는 VH 도메인을 포함하는 항원 결합 도메인(912 및 926)에 N-말단에서 직렬로 연결된 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(916 및 932)를 포함한다. VL 함유 도메인(906, 914, 922, 및 930)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 10은 5개의 Fc 도메인 및 2개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 10)을 도시한다. 이 작제물은 6개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(1002 및 1032)는, 또 다른 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(1014 및 1028), WT 서열과 상이한 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(1008 및 1022), 및 VH 도메인을 포함하는 항원 결합 도메인(1006 및 1018)에 N-말단에서 스페이서에 의해 직결로 연결된 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(1016 및 1030)를 각각 포함한다. 제3, 제4, 제5 및 제6 폴리펩티드(1012, 1010, 1026 및 1024)는 각각 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체를 포함한다. VL 함유 도메인(1004 및 1020)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 11은 5개의 Fc 도메인 및 4개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 11)을 도시한다. 이 작제물은 6개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(1102 및 1148)는, 또 다른 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(1120 및 1130) 및 WT 서열과 상이한 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(1124 및 1126)에 스페이서에 의해 직렬로 연결된 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(1118 및 1132)를 포함한다 제3, 제4, 제5 및 제6 폴리펩티드(1106, 1104, 1144 및 1146)는 VH 도메인을 포함하는 항원 결합 도메인(1112, 1122, 1138 및 1128)에 N-말단에서 직렬로 연결된 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(1116, 1110, 1134 및 1140)를 각각 포함한다. VL 함유 도메인(1108, 1114, 1135, 및 1142)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 12는 5개의 Fc 도메인 및 6개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 12)을 도시한다. 이 작제물은 6개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(1202 및 1256)는, 또 다른 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(1226 및 1228), WT 서열과 상이한 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(1210 및 1244), 및 VH 도메인을 포함하는 항원 결합 도메인(1250 및 1248)에 N-말단에서 스페이서에 의해 직렬로 연결된 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(1224 및 1230)를 포함한다. 제3, 제4, 제5 및 제6 폴리펩티드(1206, 1204, 1254 및 1252)는 VH 도메인을 포함하는 항원 결합 도메인(1218, 1212, 1236 및 1242)에 N-말단에서 직렬로 연결된 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(1222, 1216, 1232 및 1238)를 각각 포함한다. VL 함유 도메인(1208, 1214, 1220, 1234, 1240 및 1246)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 13은 3개의 Fc 도메인 및 2개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 13)을 도시한다. 이 작제물은 4개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(1302 및 1324)는, 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(1312 및 1316) 및 VH 도메인을 포함하는 항원 결합 도메인(1310 및 1314)에 N-말단에서 스페이서에 의해 직렬로 연결되고 WT 서열과 상이한 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(1308 및 1318)를 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(1306 및 1320)는 각각 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체를 포함한다. VL 함유 도메인(1304 및 1322)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 14는 3개의 Fc 도메인 및 2개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 14)을 도시한다. 이 작제물은 4개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(1404 및 1426)는, 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(1414 및 1418)에 스페이서에 의해 직렬로 연결되고 WT 서열과 상이한 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(1308 및 1318)를 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(1402 및 1428)는 VH 도메인을 포함하는 항원 결합 도메인(1408 및 1416)에 N-말단에서 직렬로 연결된 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(1410 및 1422)를 포함한다. VL 함유 도메인(1406 및 1424)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 15는 3개의 Fc 도메인 및 4개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 15)을 도시한다. 이 작제물은 4개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(1502 및 1536)는, 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(1518 및 1522) 및 VH 도메인을 포함하는 항원 결합 도메인(1514 및 1532)에 N-말단에서 스페이서에 의해 직렬로 연결되고 WT 서열과 상이한 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(1512 및 1524)를 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(1504 및 1534)는 VH 도메인을 포함하는 항원 결합 도메인(1508 및 1530)에 N-말단에서 직렬로 연결된 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(1510 및 1526)를 포함한다. VL 함유 도메인(1506, 1516, 1520, 및 1528)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 16은 5개의 Fc 도메인 및 2개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 16)을 도시한다. 이 작제물은 6개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(1602 및 1632)는, 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(1612 및 1622), 제2 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(1614 및 1620), 및 VH 도메인을 포함하는 항원 결합 도메인(1616 및 1618)에 N-말단에서 스페이서에 의해 직렬로 연결되고 WT 서열과 상이한 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(1610 및 1624)를 포함한다. 제3, 제4, 제5 및 제6 폴리펩티드(1608, 1606, 1626 및 1628)는 함몰부-함유 Fc 도메인을 각각 포함한다. VL 함유 도메인(1604 및 1630)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 17은 5개의 Fc 도메인 및 4개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 17)을 도시한다. 작제물은 6개의 Fc 도메인 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(1702 및 1748)는, 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(1720 및 1730) 및 제2 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(1722 및 1728)에 N-말단에서 스페이서에 의해 직렬로 연결되고 WT 서열과 상이한 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(1718 및 1732)를 포함한다. 제3, 제4, 제5 및 제6 폴리펩티드(1706, 1704, 1746 및 1744)는 VH 도메인을 포함하는 항원 결합 도메인(1712, 1724, 1738 및 1726)에 N-말단에서 직렬로 연결된 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(1716, 1710, 1734 및 1740)를 포함한다. VL 함유 도메인1708, 1714, 1736 및 1742)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 18은 5개의 Fc 도메인 및 6개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 18)을 도시한다. 이 작제물은 6개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(1802 및 1856)는, 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(1820 및 1836), 제2 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(1822 및 1834), 및 VH 도메인을 포함하는 항원 결합 도메인(1826 및 1830)에 N-말단에서 스페이서에 의해 직렬로 연결되고 WT 서열과 다른 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(1818 및 1838)를 포함한다. 제3, 제4, 제5 및 제6 폴리펩티드(1806, 1804, 1854, 및 1852)는 VH 도메인을 포함하는 항원 결합 도메인(1812, 1828, 1844, 및 1850)에 N-말단에서 직렬로 연결된 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(1816, 1810, 1840, 및 1846)를 각각 포함한다. VL 함유 도메인(1808, 1814, 1824, 1832, 1842, 및 1848)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 19는 5개의 Fc 도메인 및 2개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 19)을 도시한다. 이 작제물은 6개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(1902 및 1932)는, WT 서열과 상이한 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(1908 및 1926), 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(1916 및 1918), 및 VH 도메인을 포함하는 항원 결합 도메인(1914 및 1920)에 N-말단에 스페이서에 의해 직렬로 연결된 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(1912 및 1930)를 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(1910 및 1928)는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체를 포함하고, 제5 및 제6 폴리펩티드(1906 및 1924)는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체를 포함한다. VL 함유 도메인(1904 및 1922)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 20는 5개의 Fc 도메인 및 4개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 20)을 도시한다. 이 작제물은 6개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(2002 및 2048)는, WT 서열과 상이한 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(2012 및 2030) 및 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(2040 및 2038)에 N-말단에서 스페이서에 의해 직렬로 연결된 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(2020 및 2022)를 포함한다. 제3, 제4, 제5, 및 제6 폴리펩티드(2006, 2004, 2046 및 2044)는 VH 도메인을 포함하는 항원 결합 도메인(2014, 2042, 2028 및 2036)에 N-말단에서 직렬로 연결된 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(2018, 2010, 2024 및 2032)를 각각 포함한다. VL 함유 도메인(2008, 2016, 2026, 및 2034)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 21은 5개의 Fc 도메인 및 6개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 21)을 도시한다. 이 작제물은 6개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(2102 및 2156)는, WT 서열과 다른 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(2112 및 2130), 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(2144 및 2142), 및 VH 도메인을 포함하는 항원 결합 도메인(2148 및 2138)에 N-말단에서 스페이서에 의해 직렬로 연결된 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(2120 및 2122)를 포함한다. 제3, 제4, 제5 및 제6 폴리펩티드(2106, 2104, 2154, 및 2152)는, VH 도메인을 포함하는 항원 결합 도메인(2114, 2150, 2128, 및 2136)에 N-말단에서 직렬로 연결된 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(2118, 2110, 2124, 및 2132)를 각각 포함한다. VL 함유 도메인(2108, 2116, 2126, 2134, 2140 및 2146)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 22는 2개의 Fc 도메인 및 2개의 상이한 특이성을 갖는 3개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 22)을 도시한다. 이 작제물은 3개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 제1 폴리펩티드(2202)는, 또 다른 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(2206) 및 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(2222)에 N-말단에서 스페이서에 의해 직렬로 연결된 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(2208)를 포함한다. 제2 및 제3 폴리펩티드(2226 및 2224)는 VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(2214 및 2220)에 N-말단에서 직렬로 연결된 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(2210 및 2216)를 각각 포함한다. VL 함유 도메인(2204, 2212, 및 2218)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 23은 3개의 Fc 도메인 및 2개의 상이한 특이성을 갖는 4개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 23)을 도시한다. 이 작제물은 4개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 제1 폴리펩티드(2302)는 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(2330)과 N-말단에서 스페이서에 의해 직렬로 연결된 3개의 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(2310, 2308, 및 2306)를 포함한다. 제2, 제3, 및 제4 폴리펩티드(2336, 2334, 및 2332)는 VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(2316, 2322, 및 2328)과 N-말단에서 직렬로 연결된 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(2312, 2318, 및 2324)를 포함한다. VL 함유 도메인(2304, 2314, 2320, 및 2326)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 24는 3개의 Fc 도메인 및 2개의 상이한 특이성을 갖는 4개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 24)을 도시한다. 이 작제물은 4개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(2402 및 2436)는, 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(2426 및 2424) 및 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(2430 및 2420)에 N-말단에서 스페이서에 의해 직렬로 연결되고 WT 서열과 다른 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(2410 및 2412)를 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(2404 및 2434)는 VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(2432 및 2418)에 직렬로 연결된 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(2408 및 2414)를 포함한다. VL 함유 도메인(2406, 2416, 2422, 및 2428)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 25는 3개의 Fc 도메인 및 2개의 상이한 특이성을 갖는 4개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 25)를 도시한다. 이 작제물은 4개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(2502 및 2536)는, WT 서열과 다른 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(2508 및 2526) 및 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(2532 및 2530)에 N-말단에서 스페이서에 의해 직렬로 연결된 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(2516 및 2518)를 포함한다. 제2 및 제3 폴리펩티드(2504 및 2534)는, VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(2510 및 2524)에 N-말단에서 직렬로 연결된 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(2514 및 2520)를 포함한다. VL 함유 도메인(2506, 2512, 2522, 및 2528)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 26은 5개의 Fc 도메인 및 2개의 상이한 특이성을 갖는 6개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 26)을 도시한다. 이 작제물은 6개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(2602 및 2656)는, 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(2642 및 2640), 제2 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(2644 및 2638), 및 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(2648 및 2634)에 N-말단에서 스페이서에 의해 직렬로 연결되고 WT 서열과 다른 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(2618 및 2620)를 포함한다. 제3, 제4, 제5, 및 제6 폴리펩티드(2606, 2604, 2654, 및 2652)는 VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(2612, 2650, 2626, 및 2632)에 N-말단에서 직렬로 연결된 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(2616, 2610, 2622, 및 2628)를 포함한다. VL 함유 도메인(2608, 2614, 2624, 2630, 2636, 및 2646)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 27은 5개의 Fc 도메인 및 2개의 상이한 특이성을 갖는 6개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 27)을 도시한다. 이 작제물은 6개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(2702 및 2756)는, WT 서열과 다른 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(2712 및 2730), 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(2744 및 2742), 및 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(2748 및 2738)에 N-말단에서 스페이서에 의해 직렬로 연결된 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(2720 및 2722)를 포함한다. 제3, 제4, 제5, 및 제6 폴리펩티드(2706, 2704, 2754, 및 2752)는 VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(2714, 2728, 2750, 및 2736)에 N-말단에서 직렬로 연결된 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(2718, 2724, 2710, 및 2732)를 포함한다. VL 함유 도메인(2708, 2716, 2726, 2743, 2740, 및 2746)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 28은 5개의 Fc 도메인 및 2개의 상이한 특이성을 갖는 6개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 28)을 도시한다. 이 작제물은 6개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(2802 및 2856)는 제2 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(2826 및 2828), WT 서열과 다른 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(2810 및 2844), 및 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(2850 및 2848)에 N-말단에서 스페이서에 의해 직렬로 연결된 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(2824 및 2830)를 포함한다. 제3, 제4, 제5, 및 제6 폴리펩티드(2806, 2804, 2854, 및 2852)는 VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(2818, 2812, 2836, 및 2842)에 N-말단에서 직렬로 연결된 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(2822, 2816, 2832, 및 2838)를 포함한다. VL 함유 도메인(2808, 2814, 2820, 2834, 2840, 및 2846)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 29는 2개의 Fc 도메인 및 2개의 상이한 특이성을 갖는 2개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 29)을 도시한다. 이 작제물은 3개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 제1 폴리펩티드(2902)는, VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(2918)에 스페이서에 의해 직렬로 연결되고 상이한 세트의 이종이량체화 돌연변이를 각각 갖는 2개의 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(2908 및 2906)를 포함한다. 제2 폴리펩티드(2920)는, VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(2914)에 N-말단에서 직렬로 연결되고 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(2910)를 포함한다. 제3 폴리펩티드(2916)는 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체를 포함한다. VL 함유 도메인(2904 및 2912)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 30은 2개의 Fc 도메인 및 2개의 상이한 특이성을 갖는 3개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 30)을 도시한다. 이 작제물은 3개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 제1 폴리펩티드(3002)는, VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(3022)에 N-말단에서 스페이서에 의해 직렬로 연결되고 상이한 세트의 이종이량체화 돌연변이를 각각 갖는 2개의 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(3008 및 3006)를 포함한다. 제2 폴리펩티드(3024)는, VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(3014)에 N-말단에서 직렬로 연결되고 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(3010)를 포함한다. 제3 폴리펩티드(3026)는, VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(3020)에 N-말단에서 직렬로 연결되고 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(3016)를 포함한다. VL 함유 도메인(3004, 3012, 및 3018)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 31은 2개의 Fc 도메인 및 3개의 상이한 특이성을 갖는 3개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 31)을 도시한다. 이 작제물은 3개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 제1 폴리펩티드(3102)는, VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(3122)에 N-말단에서 스페이서에 의해 직렬로 연결되고 상이한 세트의 이종이량체화 돌연변이를 각각 갖는 2개의 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(3108 및 3106)를 포함한다. 제2 폴리펩티드(3126)는, VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(3114)에 N-말단에서 직렬로 연결되고 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(3110)를 포함한다. 제3 폴리펩티드(3124)는, VH 도메인을 포함하는 제3 특이성의 항원 결합 도메인(3120)에 N-말단에서 직렬로 연결되고 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(3116)를 포함한다. VL 함유 도메인(3104, 3112, 및 3118)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 32는 3개의 Fc 도메인 및 2개의 상이한 특이성을 갖는 3개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 32)을 도시한다. 이 작제물은 4개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 제1 폴리펩티드(3202)는, VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(3226)에 N-말단에서 스페이서에 의해 직렬로 연결되고 이종이량체화 돌연변이 세트를 갖는 3개의 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(3210, 3208, 및 3206)를 포함하되, 세 번째 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체는 처음 2개와 다른 이종이량체화 돌연변이 세트를 갖는다. 제2 및 제3 폴리펩티드(3230 및 3228)는, VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(3216 및 3222)에 N-말단에서 직렬로 연결되고 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(3212 및 3218)를 포함한다. 제4 폴리펩티드(3224)는 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체를 포함한다. VL 함유 도메인(3204, 3214, 및 3220)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 33은 3개의 Fc 도메인 및 2개의 상이한 특이성을 갖는 4개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 33)을 도시한다. 이 작제물은 4개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 제1 폴리펩티드(3302)는, VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(3330)에 N-말단에서 스페이서에 의해 직렬로 연결되고 이종이량체화 돌연변이를 세트를 갖는 3개의 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(3310, 3308, 및 3306)를 포함하되, 세 번째 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체는 처음 2개와 다른 이종이량체화 돌연변이 세트를 갖는다. 제2 및 제3 폴리펩티드(3336 및 3334)는, VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(3316 및 3322)에 N-말단에서 직렬로 연결되고 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(3312 및 3318)를 포함한다. 제4 폴리펩티드(3322)는, VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(3328)에 N-말단에서 직렬로 연결되고 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(3324)를 포함한다. VL 함유 도메인(3304, 3314, 3320, 및 3326)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 34는 3개의 Fc 도메인 및 3개의 상이한 특이성을 갖는 4개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 34)를 도시한다. 이 작제물은 4개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 제1 폴리펩티드(3402)는, VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(3430)에 N-말단에서 스페이서에 의해 직렬로 연결되고 이종이량체화 돌연변이 세트를 갖는 3개의 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(3410, 3408, 및 3406)를 포함하되, 세 번째 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체는 처음 2개와 다른 이종이량체화 돌연변이 세트를 갖는다. 제2 및 제3 폴리펩티드(3436 및 3434)는, VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(3416 및 3422)에 N-말단에서 직렬로 연결되고 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(3412 및 3418)를 포함한다. 제4 폴리펩티드(3432)는, VH 도메인을 포함하는 제3 특이성의 항원 결합 도메인(3428)에 N-말단에서 직렬로 연결되고 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(3424)를 포함한다. VL 함유 도메인(3404, 3414, 3420, 및 3426)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 35는 3개의 Fc 도메인 및 3개의 상이한 특이성을 갖는 4개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 35)을 도시한다. 이 작제물은 4개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 제1 폴리펩티드(3502)는, 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(3526) 및 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(3530)에 N-말단에서 스페이서에 의해 직렬로 연결되고 WT 서열과 다른 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(3510)를 포함한다. 제2 폴리펩티드(3536)는, 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(3524) 및 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(3520)에 N-말단에서 스페이서에 의해 직렬로 연결되고 WT 서열과 다른 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(3512)를 포함한다. 제3 폴리펩티드(3504)는, VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(3532)에 N-말단에서 직렬로 연결되고 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(3508)를 포함한다. 제4 폴리펩티드(3534)는, VH 도메인을 포함하는 제3 특이성의 항원 결합 도메인(3518)에 N-말단에서 직렬로 연결되고 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(3514)를 포함한다. VL 함유 도메인(3506, 3516, 3522, 및 3528)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 36은 5개의 Fc 도메인 및 2개의 상이한 특이성을 갖는 4개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 36)의 예시이다. 이 작제물은 6개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(3602 및 3644)는, WT 서열과 다른 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(3610 및 3620), 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 또 다른 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(3634 및 3632), 및 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(3638 및 3628)에 N-말단에서 스페이서에 의해 직렬로 연결되고 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(3614 및 3616)를 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(3612 및 3618)는 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체를 포함한다. 제5 및 제6 폴리펩티드(3604 및 3642)는, VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(3640 및 3626)에 N-말단에서 직렬로 연결되고 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(3608 및 3622)를 포함한다. VL 함유 도메인(3606, 3624, 3630, 및 3636)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 37은 5개의 Fc 도메인 및 3개의 상이한 특이성을 갖는 6개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 37)을 도시한다. 이 작제물은 6개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(3702 및 3756)는, WT 서열과 다른 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(3712 및 3730), 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 또 다른 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(3744 및 3742), 및 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(3748 및 3738)에 N-말단에서 스페이서에 의해 직렬로 연결되고 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(3720 및 3722)를 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(3706 및 3754)는, VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(3714 및 3728)에 N-말단에서 직렬로 연결되고 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(3718 및 3724)를 포함한다. 제5 및 제6 폴리펩티드(3704 및 3752)는, VH 도메인을 포함하는 제3 특이성의 항원 결합 도메인(3750 및 3736)에 N-말단에서 직렬로 연결되고 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(3710 및 3732)를 포함한다. VL 함유 도메인(3708, 3716, 3726, 3234, 3740, 및 3746)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 38은 3개의 Fc 도메인 및 3개의 상이한 특이성을 갖는 4개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 38)을 도시한다. 이 작제물은 4개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 제1 폴리펩티드(3802)는, WT 서열과 다른 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(3808) 및 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(3832)에 N-말단에서 스페이서에 의해 직렬로 연결되고 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(3816)를 포함한다. 제2 폴리펩티드(3836)는, WT 서열과 다른 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(3826) 및 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(3830)에 N-말단에서 스페이서에 의해 직렬로 연결되고 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(3818)를 포함한다. 제3 폴리펩티드(3804)는, VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(3810)에 N-말단에서 직렬로 연결되고 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(3814)를 포함한다. 제4 폴리펩티드(3834)는, VH 도메인을 포함하는 제3 특이성의 항원 결합 도메인(3824)에 N-말단에서 직렬로 연결되고 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(3820)를 포함한다. VL 함유 도메인(3806, 3812, 3822, 및 3828)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 39는 5개의 Fc 도메인 및 2개의 상이한 특이성의 4개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 39)을 도시한다. 이 작제물은 6개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(3902 및 3944)는, 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(3932 및 3930), 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 제2 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(3934 및 3928), 및 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(3938 및 3924)에 N-말단에서 스페이서에 의해 직렬로 연결되고 WT 서열과 다른 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(3912 및 3914)를 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(3910 및 3916)는 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체를 포함한다. 제5 및 제6 폴리펩티드(3904 및 3942)는, VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(3940 및 3922)에 N-말단에서 직렬로 연결되고 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(3908 및 3918)를 포함한다. VL 함유 도메인(3906, 3920, 3926, 및 3936)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 40은 5개의 Fc 도메인 및 3개의 상이한 특이성의 6개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 40)을 도시한다. 이 작제물은 6개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(4002 및 4056)는, 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(4042 및 4040), 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 제2 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(4044 및 4038), 및 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(4048 및 4034)에 N-말단에서 스페이서에 의해 직렬로 연결되고 WT 서열과 다른 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(4018 및 4020)를 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(4006 및 4054)는, VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(4012 및 4026)에 N-말단에서 직렬로 연결되고 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(4016 및 4022)를 포함한다. 제5 및 제6 폴리펩티드(4004 및 4052)는, VH 도메인을 포함하는 제3 특이성의 항원 결합 도메인(4050 및 4032)에 N-말단에서 직렬로 연결되고 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(4010 및 4028)를 포함한다. VL 함유 도메인(4008, 4014, 4024, 4030, 4036, 및 4046)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 41은 5개의 Fc 도메인 및 2개의 상이한 특이성의 4개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 41)을 도시한다. 이 작제물은 6개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(4102 및 4144)는, 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 제2 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(4120 및 4122), WT 서열과 다른 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(4108 및 4134), 및 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(4140 및 4138)에 N-말단에서 스페이서에 의해 직렬로 연결되고 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(4118 및 4124)를 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(4104 및 4142)는, VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(4112 및 4130)에 N-말단에서 직렬로 연결되고 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(4116 및 4126)를 포함한다. 제5 및 제6 폴리펩티드(4110 및 4132)는 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체를 포함한다. VL 함유 도메인(4106, 4114, 4128, 및 4136)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 42는 5개의 Fc 도메인 및 3개의 상이한 특이성의 6개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 42)을 도시한다. 이 작제물은 6개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(4202 및 4256)는, 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 제2 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(4226 및 4228), WT 서열과 다른 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(4210 및 4244), 및 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(4250 및 4248)에 N-말단에서 스페이서에 의해 직렬로 연결되고 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(4224 및 4230)를 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(4206 및 4254)는, VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(4218 및 4236)에 N-말단에서 직렬로 연결되고 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(4222 및 4232)를 포함한다. 제5 및 제6 폴리펩티드(4204 및 4252)는, VH 도메인을 포함하는 제3 특이성의 항원 결합 도메인(4212 및 4242)에 N-말단에서 직렬로 연결되고 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(4216 및 4238)를 포함한다. VL 함유 도메인(4208, 4214, 4220, 4234, 4240, 및 4246)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 43은 리툭시맙(Rtxn), 항-CD20 IgG1 mAB, 및 작제물 7, 13, 19, 및 1의 발현 및 순도를 보여주는 비환원성 SDS-PAGE 겔을 도시한 것이다.
도 44는 다양한 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 발현을 보여주는 겔이다. 처음 3개의 레인은 별개의 3가지 폴리펩티드의 비율을 달리한 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 발현을 보여준다. 네 번째 레인은 SIF3 작제물(항원 결합 도메인을 포함하지 않는 3개의 Fc 도메인을 갖는 작제물)의 발현을 보여주고, 다섯 번째 레인은 항원 결합 도메인을 포함하지 않는 5개의 Fc 도메인을 갖는 작제물의 발현을 보여준다. 여섯 번째 레인은 분자량 마커이다.
도 45는 표면 플라스몬 공명(SPR) 검정의 결과를 보여주는 2개의 그래프이다. 좌측 그래프에서의 결과는, Fc3Y(도 13의 작제물 13의 구조를 갖는 작제물)가 상응하는 부모 단클론 항체(mAb)보다 훨씬 더 강하게 CTLA-4 표적에 결합하는 반면, Fc3I(도 7의 작제물 7의 구조를 갖는 작제물)는 부모 mAb와 유사한 결합 친화도를 갖는다는 것을 보여준다. 우측 그래프에서의 결과는, 항체를 탈푸코실화하면 세포 표면 FcγRIIIa 결합이 약 10배 증가하는 반면, 다양한 Fc-항원 결합 도메인 작제물을 사용하면 결합이 약 300 내지 800배 강화됨을 보여준다.
도 46은 2가지 세포 표면 FcγR 결합 검정의 결과를 보여주는 2개의 그래프이다. 좌측 그래프는 FcγRIIIa에 대한 결합 친화도를 다양한 작제물 별로 보여준다. (상업적으로 이용 가능한 항-CD20 항체인) Gazyva와 동일한 CDR로 mAb를 탈푸코실화하면 결합이 약 10배 증가하는 반면, 모든 Fc-항원 결합 도메인 작제물은 부모 mAb에 비해 100배를 초과하는 강화된 결합을 보여준다. 우측 그래프는 FcγRIIa에 대한 결합 친화도를 다양한 작제물 별로 보여준다. mAb의 탈푸코실화는 결합에 영향을 미치지 않은 반면, 모든 Fc-항원 결합 도메인 작제물은 부모 mAb에 비해 100배를 초과하는 강화된 결합을 보여준다.
도 47은 B 세포를 표적으로 하는 다양한 항-CD20 작제물을 사용한 CDC, ADCP 및 ADCC 검정의 결과를 보여주는 3개의 그래프이다. 첫 번째 그래프는 S3Y Fc-항원 결합 도메인 작제물이 CDC를 매개할 수 있음을 보여준다. 중간 그래프는 SAI 및 S3Y Fc-항원 결합 도메인 작제물 둘 모두가 ADCP FcγRIIa 리포터 검정에서 100배 초과의 강화된 효능을 나타냄을 보여준다. 세 번째 그래프는 SAI 및 S3Y Fc-항원 결합 도메인 작제물이 푸코실화 mAb에 비해 강화된 ADCC 활성을 나타내고, 탈푸코실화 mAb와 유사한 활성을 나타냄을 보여준다.
도 48은 CTLA-4 형질감염 HEK 세포를 표적으로 하는 다양한 항-CTLA-4 작제물을 사용한 CDC, ADCP 및 ADCC 검정의 결과를 보여주는 3개의 그래프이다. 첫 번째 그래프는 SAI 작제물(도 7에 도시된 구조를 갖는 Fc-항원 결합 도메인 작제물) 및 S3Y 작제물(도 13에 도시된 구조를 갖는 Fc-항원 결합 도메인 작제물)이 강화된 CDC를 매개함을 보여준다. 두 번째 그래프는 SAI 및 S3Y 작제물이 강화된 ADCP를 매개함을 보여주고, 세 번째 그래프는 SAI 및 S3Y Fc-항원 결합 도메인 작제물 모두가 푸코실화 mAb에 비해 강화된 ADCC 활성을 나타내고 탈푸코실화 mAb와 유사한 활성을 나타냄을 보여준다.
도 49는 PD-L1 형질감염 HEK 세포를 표적으로 하는 다양한 항-PD-L1 작제물을 사용한 ADCC, ADCP 및 CDC 검정의 결과를 보여주는 3개의 그래프이다. 첫 번째 그래프는 SAI 작제물(도 7의 Fc-항원 결합 도메인 작제물 7의 구조를 갖는 작제물) 및 S3Y Fc-항원 결합 도메인 작제물(도 13의 Fc-항원 결합 도메인 작제물 13의 구조를 갖는 작제물) 모두가 푸코실화 및 탈푸코실화 mAb와 유사한 ADCC 활성을 나타냄을 보여준다. 두 번째 그래프는 SAI 및 S3Y 작제물이 강화된 ADCP를 매개함을 보여주고, 세 번째 그래프는 S3Y 작제물이 CDC를 매개할 수 있음을 보여준다.
도 50은 미정제 배지에서의 Fc 작제물 A 및 Fc 작제물 B의 비환원 SDS-PAGE에 의한 크기 분포를 보여준다.
도 51은 Fc 작제물 A 및 3개의 Fc 도메인을 갖지만 "줄기" 소단위체에 정전기 스티어링 돌연변이가 없는 또 다른 Fc 작제물의 발현 및 조립을 보여준다.
도 52는 항원 결합 도메인이 Fc 작제물의 Fc 도메인에 연결될 수 있는 3개의 예시적인 방법의 개략도이다. 패널 A는 항원 결합 도메인의 중쇄 성분이 Fc 사슬의 융합 단백질로 발현될 수 있고, 경쇄 성분은 별도의 폴리펩티드로 발현될 수 있음을 보여준다. 패널 B는 Fc 장쇄의 융합 단백질로서 발현된 scFv를 보여준다. 패널 C는 별도로 발현되고 외적으로 첨가되어, 화학 결합에 의해 Fc-항원 결합 도메인 작제물에 연결된 중쇄 및 경쇄 성분을 보여준다.
도 53a는 인간 IgG1의 아미노산 서열(서열 번호 43)을 EU 넘버링과 함께 도시한다. 힌지 영역은 이중 밑줄로 표시되어 있고, CH2 도메인은 밑줄이 없으며, CH3 영역은 밑줄로 표시되어 있다.
도 53b는 인간 IgG1의 아미노산 서열(서열 번호 45)을 EU 넘버링과 함께 도시한다. E216에서 C220까지가 없는 힌지 영역은 이중 밑줄로 표시되어 있고, CH2 도메인은 밑줄이 없으며, CH3 영역은 밑줄로 표시되어 있고 K447이 없다.
도 53은 인간 IgG1의 아미노산 서열(서열 번호 47)을 EU 넘버링과 함께 도시한다. 힌지 영역은 이중 밑줄로 표시되어 있고, CH2 도메인은 밑줄이 없으며, CH3 영역은 밑줄로 표시되어 있고 447K가 없다.
도 53d는 인간 IgG1의 아미노산 서열(서열 번호 42)을 EU 넘버링과 함께 도시한다. E216에서 C220까지가 없는 힌지 영역은 이중 밑줄로 표시되어 있고, CH2 도메인은 밑줄이 없으며, CH3 영역은 밑줄로 표시되어 있다.
도 54는 Daudi 세포에서 항-CD20 작제물 7, 항-CD20 작제물 13, Gazyva, 및 푸코실화 항-CD20 IgG1 항체(오비누투주맙)에 의한 보체 의존성 세포독성(CDC)의 유도를 보여주는 그래프이다.
도 55는 ADCP 리포터 검정에서 항-CD20 작제물 7, 항-CD20 작제물 13, Gazyva, 및 푸코실화 항-CD20 IgG1 항체(오비누투주맙)에 의한 FcγRIIa 신호전달의 유도(배수 유도)를 보여주는 그래프이다.
도 56은 ADCC P 리포터 검정에서 항-CD20 작제물 7, 항-CD20 작제물 13, Gazyva, 및 푸코실화 항-CD20 IgG1 항체(오비누투주맙)에 의한 FcγRIIIa 신호전달의 유도(배수 유도)를 보여주는 그래프이다.
도 57은 인간 전혈에서 푸코실화 및 탈푸코실화 항-CD20 작제물 13, 및 푸코실화 및 탈푸코실화 오비누투주맙 단클론 항체에 의한 CD19+ B 세포의 고갈을 보여주는 그래프이다.
도 58은 항-CD20 작제물 13, 푸코실화 오비누투주맙 단클론 항체, 또는 다라투무맙 단클론 항체의 일회 투여량을 주입한 후, 또는 항-CD20 작제물 13의 다중 투여량을 주입한 후 마우스 림프종 모델에서 종양 성장의 감소를 보여주는 그래프이다.
도 59는 항-CD20 작제물들을 비교한 ADCC 리포터 검정의 결과를 보여주는 그래프이다. 푸코실화 작제물은 파선으로 연결된 회색 사각형으로 도시되어 있고, 탈푸코실화 작제물은 실선으로 연결된 검은색 원으로 도시되어 있다.
도 60은 항-CD20 작제물들을 비교한 ADCP 리포터 검정의 결과를 도시한 그래프이다. 푸코실화 작제물은 파선으로 연결된 회색 사각형으로 도시되어 있고, 탈푸코실화 작제물은 실선으로 연결된 검은색 원으로 도시되어 있다.
도 61은 항-CD20 작제물을 이용한 치료에 의한 전혈로부터 CD19+ B 세포의 고갈을 분석한 결과를 도시한 그래프이다. 푸코실화 작제물은 파선으로 연결된 회색 사각형으로 도시되어 있고, 탈푸코실화 작제물은 실선으로 연결된 검은색 원으로 도시되어 있다.
도 62는 항-PD-L1 작제물로 치료한 인간 폐암 세포의 ADCC 분석 결과를 도시한 그래프이다. 푸코실화 작제물은 파선으로 연결된 회색 사각형으로 도시되어 있고, 탈푸코실화 작제물은 실선으로 연결된 검은색 원으로 도시되어 있다.
도 63은 항-PD-L1 작제물로 치료한 인간 폐암 세포의 ADCP 분석 결과를 도시한 그래프이다. 푸코실화 작제물은 파선으로 연결된 회색 사각형으로 도시되어 있고, 탈푸코실화 작제물은 실선으로 연결된 검은색 원으로 도시되어 있다.
도 64는 항-PD-L1 작제물로 처리한 PD-L1 형질감염 HEK 세포의 CDC 분석 결과를 도시한 그래프이다. 푸코실화 작제물은 파선으로 연결된 회색 사각형으로 도시되어 있고, 탈푸코실화 작제물은 실선으로 연결된 검은색 원으로 도시되어 있다.
도 2는 3개의 Fc 도메인 및 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 2)을 도시한다. 이 작제물은 4개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 제1 폴리펩티드(202)는 VH 도메인을 포함하는 항원 결합 도메인(212)에 N-말단에서 스페이서에 의해 직렬로 연결된 3개의 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(206, 208 및 210)를 포함한다. VL 함유 도메인(204)은 VH 도메인에 연결된다. 제2, 제3, 및 제4 폴리펩티드(214, 216, 및 218) 각각은 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체를 포함한다.
도 3은 2개의 Fc 도메인 및 2개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 3)을 도시한다. 이 작제물은 3개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 제1 폴리펩티드(302)는 스페이서에 의해 직렬로 연결된 2개의 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(304 및 306)를 포함한다. 제2 및 제3 폴리펩티드(320 및 322) 각각은 VH 도메인을 포함하는 항원 결합 도메인(316 및 318)에 N-말단에서 직렬로 연결된 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(310 및 314)를 포함한다. VL 함유 도메인(308 및 312)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 4는 3개의 Fc 도메인 및 3개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 4)을 도시한다. 이 작제물은 4개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 제1 폴리펩티드(402)는 스페이서에 의해 직렬로 연결된 3개의 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(404, 406 및 408)를 포함한다. 제2, 제3 및 제4 폴리펩티드(428, 430 및 432) 각각은 VH 도메인을 포함하는 항원 결합 도메인(422, 416 및 410)에 N-말단에서 직렬로 연결된 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(426, 420 및 414)를 포함한다. VL 함유 도메인(424, 418, 및 412)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 5는 2개의 Fc 도메인 및 3개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 5)을 도시한다. 이 작제물은 3개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 제1 폴리펩티드(502)는 VH 도메인(510)을 포함하는 항원 결합 도메인에 N-말단에서 스페이서에 의해 직렬로 연결된 2개의 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(508 및 506)를 포함한다. 제2 및 제3 폴리펩티드(524 및 526) 각각은 VH 도메인을 포함하는 항원 결합 도메인(512 및 518)에 N-말단에서 직렬로 연결된 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(516 및 522)를 포함한다. VL 함유 도메인(504, 514, 및 520)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 6은 3개의 Fc 도메인 및 4개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 6)을 도시한다. 이 작제물은 4개의 Fc 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 제1 폴리펩티드(602)는 VH 도메인(612)을 포함하는 항원 결합 도메인(612)에 N-말단에서 스페이서에 의해 직렬로 연결된 3개의 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(606, 608 및 610)를 포함한다. 제2, 제3 및 제4 폴리펩티드(632, 634 및 636) 각각은 VH 도메인을 포함하는 항원 결합 도메인(616, 622 및 628)에 N-말단에서 직렬로 연결된 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(618, 624 및 630)를 포함한다. VL 함유 도메인(604, 616, 622, 및 628)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 7은 3개의 Fc 도메인 및 2개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 7)을 도시한다. 본 Fc-항원 결합 도메인 작제물은 2개의 Fc 도메인 단량체(706 및 718)의 이량체를 포함하되, Fc 도메인 단량체 둘 다는 이들 2개의 Fc 도메인 단량체 사이에서 유리한 정전기적 상호작용을 촉진하기 위해 WT 서열과 상이한 하전 아미노산을 이의 CH3-CH3 계면에 포함한다. 이 작제물은 4개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(702 및 724)는, WT 서열과 상이한 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(706 및 718) 및 VH 도메인을 포함하는 항원 결합 도메인(712 및 714)에 N-말단에서 스페이서에 의해 직렬로 연결된 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(710 및 720)를 각각 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(708 및 722)는 각각 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체를 포함한다. VL 함유 도메인(704 및 716)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 8은 3개의 Fc 도메인 및 2개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 8)을 도시한다. 이 작제물은 4개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(802 및 828)는, WT 서열과 다른 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(810 및 816)에 스페이서에 의해 직렬로 연결된 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(814 및 820)를 각각 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(804 및 826) 각각은 VH 도메인을 포함하는 항원 결합 도메인(812 및 818)에 N-말단에서 직렬로 연결된 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(808 및 824)를 포함한다. VL 함유 도메인(806 및 822)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 9는 3개의 Fc 도메인 및 4개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 9)을 도시한다. 이 작제물은 4개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(902 및 936)는, WT 서열과 다른 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(910 및 924) 및 VH 도메인을 포함하는 항원 결합 도메인(908 및 920)에 N-말단에서 스페이서에 의해 직렬로 연결된 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(918 및 928)를 각각 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(904 및 934)는 VH 도메인을 포함하는 항원 결합 도메인(912 및 926)에 N-말단에서 직렬로 연결된 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(916 및 932)를 포함한다. VL 함유 도메인(906, 914, 922, 및 930)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 10은 5개의 Fc 도메인 및 2개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 10)을 도시한다. 이 작제물은 6개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(1002 및 1032)는, 또 다른 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(1014 및 1028), WT 서열과 상이한 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(1008 및 1022), 및 VH 도메인을 포함하는 항원 결합 도메인(1006 및 1018)에 N-말단에서 스페이서에 의해 직결로 연결된 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(1016 및 1030)를 각각 포함한다. 제3, 제4, 제5 및 제6 폴리펩티드(1012, 1010, 1026 및 1024)는 각각 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체를 포함한다. VL 함유 도메인(1004 및 1020)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 11은 5개의 Fc 도메인 및 4개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 11)을 도시한다. 이 작제물은 6개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(1102 및 1148)는, 또 다른 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(1120 및 1130) 및 WT 서열과 상이한 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(1124 및 1126)에 스페이서에 의해 직렬로 연결된 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(1118 및 1132)를 포함한다 제3, 제4, 제5 및 제6 폴리펩티드(1106, 1104, 1144 및 1146)는 VH 도메인을 포함하는 항원 결합 도메인(1112, 1122, 1138 및 1128)에 N-말단에서 직렬로 연결된 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(1116, 1110, 1134 및 1140)를 각각 포함한다. VL 함유 도메인(1108, 1114, 1135, 및 1142)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 12는 5개의 Fc 도메인 및 6개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 12)을 도시한다. 이 작제물은 6개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(1202 및 1256)는, 또 다른 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(1226 및 1228), WT 서열과 상이한 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(1210 및 1244), 및 VH 도메인을 포함하는 항원 결합 도메인(1250 및 1248)에 N-말단에서 스페이서에 의해 직렬로 연결된 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(1224 및 1230)를 포함한다. 제3, 제4, 제5 및 제6 폴리펩티드(1206, 1204, 1254 및 1252)는 VH 도메인을 포함하는 항원 결합 도메인(1218, 1212, 1236 및 1242)에 N-말단에서 직렬로 연결된 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(1222, 1216, 1232 및 1238)를 각각 포함한다. VL 함유 도메인(1208, 1214, 1220, 1234, 1240 및 1246)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 13은 3개의 Fc 도메인 및 2개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 13)을 도시한다. 이 작제물은 4개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(1302 및 1324)는, 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(1312 및 1316) 및 VH 도메인을 포함하는 항원 결합 도메인(1310 및 1314)에 N-말단에서 스페이서에 의해 직렬로 연결되고 WT 서열과 상이한 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(1308 및 1318)를 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(1306 및 1320)는 각각 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체를 포함한다. VL 함유 도메인(1304 및 1322)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 14는 3개의 Fc 도메인 및 2개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 14)을 도시한다. 이 작제물은 4개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(1404 및 1426)는, 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(1414 및 1418)에 스페이서에 의해 직렬로 연결되고 WT 서열과 상이한 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(1308 및 1318)를 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(1402 및 1428)는 VH 도메인을 포함하는 항원 결합 도메인(1408 및 1416)에 N-말단에서 직렬로 연결된 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(1410 및 1422)를 포함한다. VL 함유 도메인(1406 및 1424)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 15는 3개의 Fc 도메인 및 4개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 15)을 도시한다. 이 작제물은 4개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(1502 및 1536)는, 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(1518 및 1522) 및 VH 도메인을 포함하는 항원 결합 도메인(1514 및 1532)에 N-말단에서 스페이서에 의해 직렬로 연결되고 WT 서열과 상이한 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(1512 및 1524)를 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(1504 및 1534)는 VH 도메인을 포함하는 항원 결합 도메인(1508 및 1530)에 N-말단에서 직렬로 연결된 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(1510 및 1526)를 포함한다. VL 함유 도메인(1506, 1516, 1520, 및 1528)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 16은 5개의 Fc 도메인 및 2개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 16)을 도시한다. 이 작제물은 6개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(1602 및 1632)는, 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(1612 및 1622), 제2 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(1614 및 1620), 및 VH 도메인을 포함하는 항원 결합 도메인(1616 및 1618)에 N-말단에서 스페이서에 의해 직렬로 연결되고 WT 서열과 상이한 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(1610 및 1624)를 포함한다. 제3, 제4, 제5 및 제6 폴리펩티드(1608, 1606, 1626 및 1628)는 함몰부-함유 Fc 도메인을 각각 포함한다. VL 함유 도메인(1604 및 1630)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 17은 5개의 Fc 도메인 및 4개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 17)을 도시한다. 작제물은 6개의 Fc 도메인 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(1702 및 1748)는, 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(1720 및 1730) 및 제2 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(1722 및 1728)에 N-말단에서 스페이서에 의해 직렬로 연결되고 WT 서열과 상이한 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(1718 및 1732)를 포함한다. 제3, 제4, 제5 및 제6 폴리펩티드(1706, 1704, 1746 및 1744)는 VH 도메인을 포함하는 항원 결합 도메인(1712, 1724, 1738 및 1726)에 N-말단에서 직렬로 연결된 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(1716, 1710, 1734 및 1740)를 포함한다. VL 함유 도메인1708, 1714, 1736 및 1742)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 18은 5개의 Fc 도메인 및 6개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 18)을 도시한다. 이 작제물은 6개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(1802 및 1856)는, 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(1820 및 1836), 제2 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(1822 및 1834), 및 VH 도메인을 포함하는 항원 결합 도메인(1826 및 1830)에 N-말단에서 스페이서에 의해 직렬로 연결되고 WT 서열과 다른 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(1818 및 1838)를 포함한다. 제3, 제4, 제5 및 제6 폴리펩티드(1806, 1804, 1854, 및 1852)는 VH 도메인을 포함하는 항원 결합 도메인(1812, 1828, 1844, 및 1850)에 N-말단에서 직렬로 연결된 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(1816, 1810, 1840, 및 1846)를 각각 포함한다. VL 함유 도메인(1808, 1814, 1824, 1832, 1842, 및 1848)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 19는 5개의 Fc 도메인 및 2개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 19)을 도시한다. 이 작제물은 6개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(1902 및 1932)는, WT 서열과 상이한 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(1908 및 1926), 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(1916 및 1918), 및 VH 도메인을 포함하는 항원 결합 도메인(1914 및 1920)에 N-말단에 스페이서에 의해 직렬로 연결된 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(1912 및 1930)를 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(1910 및 1928)는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체를 포함하고, 제5 및 제6 폴리펩티드(1906 및 1924)는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체를 포함한다. VL 함유 도메인(1904 및 1922)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 20는 5개의 Fc 도메인 및 4개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 20)을 도시한다. 이 작제물은 6개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(2002 및 2048)는, WT 서열과 상이한 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(2012 및 2030) 및 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(2040 및 2038)에 N-말단에서 스페이서에 의해 직렬로 연결된 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(2020 및 2022)를 포함한다. 제3, 제4, 제5, 및 제6 폴리펩티드(2006, 2004, 2046 및 2044)는 VH 도메인을 포함하는 항원 결합 도메인(2014, 2042, 2028 및 2036)에 N-말단에서 직렬로 연결된 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(2018, 2010, 2024 및 2032)를 각각 포함한다. VL 함유 도메인(2008, 2016, 2026, 및 2034)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 21은 5개의 Fc 도메인 및 6개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 21)을 도시한다. 이 작제물은 6개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(2102 및 2156)는, WT 서열과 다른 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(2112 및 2130), 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(2144 및 2142), 및 VH 도메인을 포함하는 항원 결합 도메인(2148 및 2138)에 N-말단에서 스페이서에 의해 직렬로 연결된 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(2120 및 2122)를 포함한다. 제3, 제4, 제5 및 제6 폴리펩티드(2106, 2104, 2154, 및 2152)는, VH 도메인을 포함하는 항원 결합 도메인(2114, 2150, 2128, 및 2136)에 N-말단에서 직렬로 연결된 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(2118, 2110, 2124, 및 2132)를 각각 포함한다. VL 함유 도메인(2108, 2116, 2126, 2134, 2140 및 2146)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 22는 2개의 Fc 도메인 및 2개의 상이한 특이성을 갖는 3개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 22)을 도시한다. 이 작제물은 3개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 제1 폴리펩티드(2202)는, 또 다른 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(2206) 및 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(2222)에 N-말단에서 스페이서에 의해 직렬로 연결된 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(2208)를 포함한다. 제2 및 제3 폴리펩티드(2226 및 2224)는 VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(2214 및 2220)에 N-말단에서 직렬로 연결된 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(2210 및 2216)를 각각 포함한다. VL 함유 도메인(2204, 2212, 및 2218)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 23은 3개의 Fc 도메인 및 2개의 상이한 특이성을 갖는 4개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 23)을 도시한다. 이 작제물은 4개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 제1 폴리펩티드(2302)는 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(2330)과 N-말단에서 스페이서에 의해 직렬로 연결된 3개의 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(2310, 2308, 및 2306)를 포함한다. 제2, 제3, 및 제4 폴리펩티드(2336, 2334, 및 2332)는 VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(2316, 2322, 및 2328)과 N-말단에서 직렬로 연결된 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(2312, 2318, 및 2324)를 포함한다. VL 함유 도메인(2304, 2314, 2320, 및 2326)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 24는 3개의 Fc 도메인 및 2개의 상이한 특이성을 갖는 4개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 24)을 도시한다. 이 작제물은 4개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(2402 및 2436)는, 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(2426 및 2424) 및 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(2430 및 2420)에 N-말단에서 스페이서에 의해 직렬로 연결되고 WT 서열과 다른 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(2410 및 2412)를 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(2404 및 2434)는 VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(2432 및 2418)에 직렬로 연결된 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(2408 및 2414)를 포함한다. VL 함유 도메인(2406, 2416, 2422, 및 2428)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 25는 3개의 Fc 도메인 및 2개의 상이한 특이성을 갖는 4개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 25)를 도시한다. 이 작제물은 4개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(2502 및 2536)는, WT 서열과 다른 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(2508 및 2526) 및 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(2532 및 2530)에 N-말단에서 스페이서에 의해 직렬로 연결된 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(2516 및 2518)를 포함한다. 제2 및 제3 폴리펩티드(2504 및 2534)는, VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(2510 및 2524)에 N-말단에서 직렬로 연결된 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(2514 및 2520)를 포함한다. VL 함유 도메인(2506, 2512, 2522, 및 2528)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 26은 5개의 Fc 도메인 및 2개의 상이한 특이성을 갖는 6개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 26)을 도시한다. 이 작제물은 6개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(2602 및 2656)는, 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(2642 및 2640), 제2 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(2644 및 2638), 및 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(2648 및 2634)에 N-말단에서 스페이서에 의해 직렬로 연결되고 WT 서열과 다른 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(2618 및 2620)를 포함한다. 제3, 제4, 제5, 및 제6 폴리펩티드(2606, 2604, 2654, 및 2652)는 VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(2612, 2650, 2626, 및 2632)에 N-말단에서 직렬로 연결된 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(2616, 2610, 2622, 및 2628)를 포함한다. VL 함유 도메인(2608, 2614, 2624, 2630, 2636, 및 2646)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 27은 5개의 Fc 도메인 및 2개의 상이한 특이성을 갖는 6개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 27)을 도시한다. 이 작제물은 6개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(2702 및 2756)는, WT 서열과 다른 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(2712 및 2730), 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(2744 및 2742), 및 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(2748 및 2738)에 N-말단에서 스페이서에 의해 직렬로 연결된 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(2720 및 2722)를 포함한다. 제3, 제4, 제5, 및 제6 폴리펩티드(2706, 2704, 2754, 및 2752)는 VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(2714, 2728, 2750, 및 2736)에 N-말단에서 직렬로 연결된 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(2718, 2724, 2710, 및 2732)를 포함한다. VL 함유 도메인(2708, 2716, 2726, 2743, 2740, 및 2746)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 28은 5개의 Fc 도메인 및 2개의 상이한 특이성을 갖는 6개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 28)을 도시한다. 이 작제물은 6개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(2802 및 2856)는 제2 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(2826 및 2828), WT 서열과 다른 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(2810 및 2844), 및 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(2850 및 2848)에 N-말단에서 스페이서에 의해 직렬로 연결된 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(2824 및 2830)를 포함한다. 제3, 제4, 제5, 및 제6 폴리펩티드(2806, 2804, 2854, 및 2852)는 VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(2818, 2812, 2836, 및 2842)에 N-말단에서 직렬로 연결된 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(2822, 2816, 2832, 및 2838)를 포함한다. VL 함유 도메인(2808, 2814, 2820, 2834, 2840, 및 2846)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 29는 2개의 Fc 도메인 및 2개의 상이한 특이성을 갖는 2개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 29)을 도시한다. 이 작제물은 3개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 제1 폴리펩티드(2902)는, VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(2918)에 스페이서에 의해 직렬로 연결되고 상이한 세트의 이종이량체화 돌연변이를 각각 갖는 2개의 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(2908 및 2906)를 포함한다. 제2 폴리펩티드(2920)는, VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(2914)에 N-말단에서 직렬로 연결되고 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(2910)를 포함한다. 제3 폴리펩티드(2916)는 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체를 포함한다. VL 함유 도메인(2904 및 2912)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 30은 2개의 Fc 도메인 및 2개의 상이한 특이성을 갖는 3개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 30)을 도시한다. 이 작제물은 3개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 제1 폴리펩티드(3002)는, VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(3022)에 N-말단에서 스페이서에 의해 직렬로 연결되고 상이한 세트의 이종이량체화 돌연변이를 각각 갖는 2개의 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(3008 및 3006)를 포함한다. 제2 폴리펩티드(3024)는, VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(3014)에 N-말단에서 직렬로 연결되고 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(3010)를 포함한다. 제3 폴리펩티드(3026)는, VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(3020)에 N-말단에서 직렬로 연결되고 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(3016)를 포함한다. VL 함유 도메인(3004, 3012, 및 3018)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 31은 2개의 Fc 도메인 및 3개의 상이한 특이성을 갖는 3개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 31)을 도시한다. 이 작제물은 3개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 제1 폴리펩티드(3102)는, VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(3122)에 N-말단에서 스페이서에 의해 직렬로 연결되고 상이한 세트의 이종이량체화 돌연변이를 각각 갖는 2개의 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(3108 및 3106)를 포함한다. 제2 폴리펩티드(3126)는, VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(3114)에 N-말단에서 직렬로 연결되고 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(3110)를 포함한다. 제3 폴리펩티드(3124)는, VH 도메인을 포함하는 제3 특이성의 항원 결합 도메인(3120)에 N-말단에서 직렬로 연결되고 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(3116)를 포함한다. VL 함유 도메인(3104, 3112, 및 3118)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 32는 3개의 Fc 도메인 및 2개의 상이한 특이성을 갖는 3개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 32)을 도시한다. 이 작제물은 4개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 제1 폴리펩티드(3202)는, VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(3226)에 N-말단에서 스페이서에 의해 직렬로 연결되고 이종이량체화 돌연변이 세트를 갖는 3개의 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(3210, 3208, 및 3206)를 포함하되, 세 번째 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체는 처음 2개와 다른 이종이량체화 돌연변이 세트를 갖는다. 제2 및 제3 폴리펩티드(3230 및 3228)는, VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(3216 및 3222)에 N-말단에서 직렬로 연결되고 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(3212 및 3218)를 포함한다. 제4 폴리펩티드(3224)는 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체를 포함한다. VL 함유 도메인(3204, 3214, 및 3220)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 33은 3개의 Fc 도메인 및 2개의 상이한 특이성을 갖는 4개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 33)을 도시한다. 이 작제물은 4개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 제1 폴리펩티드(3302)는, VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(3330)에 N-말단에서 스페이서에 의해 직렬로 연결되고 이종이량체화 돌연변이를 세트를 갖는 3개의 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(3310, 3308, 및 3306)를 포함하되, 세 번째 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체는 처음 2개와 다른 이종이량체화 돌연변이 세트를 갖는다. 제2 및 제3 폴리펩티드(3336 및 3334)는, VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(3316 및 3322)에 N-말단에서 직렬로 연결되고 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(3312 및 3318)를 포함한다. 제4 폴리펩티드(3322)는, VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(3328)에 N-말단에서 직렬로 연결되고 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(3324)를 포함한다. VL 함유 도메인(3304, 3314, 3320, 및 3326)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 34는 3개의 Fc 도메인 및 3개의 상이한 특이성을 갖는 4개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 34)를 도시한다. 이 작제물은 4개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 제1 폴리펩티드(3402)는, VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(3430)에 N-말단에서 스페이서에 의해 직렬로 연결되고 이종이량체화 돌연변이 세트를 갖는 3개의 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(3410, 3408, 및 3406)를 포함하되, 세 번째 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체는 처음 2개와 다른 이종이량체화 돌연변이 세트를 갖는다. 제2 및 제3 폴리펩티드(3436 및 3434)는, VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(3416 및 3422)에 N-말단에서 직렬로 연결되고 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(3412 및 3418)를 포함한다. 제4 폴리펩티드(3432)는, VH 도메인을 포함하는 제3 특이성의 항원 결합 도메인(3428)에 N-말단에서 직렬로 연결되고 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(3424)를 포함한다. VL 함유 도메인(3404, 3414, 3420, 및 3426)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 35는 3개의 Fc 도메인 및 3개의 상이한 특이성을 갖는 4개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 35)을 도시한다. 이 작제물은 4개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 제1 폴리펩티드(3502)는, 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(3526) 및 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(3530)에 N-말단에서 스페이서에 의해 직렬로 연결되고 WT 서열과 다른 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(3510)를 포함한다. 제2 폴리펩티드(3536)는, 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(3524) 및 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(3520)에 N-말단에서 스페이서에 의해 직렬로 연결되고 WT 서열과 다른 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(3512)를 포함한다. 제3 폴리펩티드(3504)는, VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(3532)에 N-말단에서 직렬로 연결되고 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(3508)를 포함한다. 제4 폴리펩티드(3534)는, VH 도메인을 포함하는 제3 특이성의 항원 결합 도메인(3518)에 N-말단에서 직렬로 연결되고 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(3514)를 포함한다. VL 함유 도메인(3506, 3516, 3522, 및 3528)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 36은 5개의 Fc 도메인 및 2개의 상이한 특이성을 갖는 4개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 36)의 예시이다. 이 작제물은 6개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(3602 및 3644)는, WT 서열과 다른 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(3610 및 3620), 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 또 다른 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(3634 및 3632), 및 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(3638 및 3628)에 N-말단에서 스페이서에 의해 직렬로 연결되고 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(3614 및 3616)를 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(3612 및 3618)는 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체를 포함한다. 제5 및 제6 폴리펩티드(3604 및 3642)는, VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(3640 및 3626)에 N-말단에서 직렬로 연결되고 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(3608 및 3622)를 포함한다. VL 함유 도메인(3606, 3624, 3630, 및 3636)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 37은 5개의 Fc 도메인 및 3개의 상이한 특이성을 갖는 6개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 37)을 도시한다. 이 작제물은 6개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(3702 및 3756)는, WT 서열과 다른 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(3712 및 3730), 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 또 다른 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(3744 및 3742), 및 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(3748 및 3738)에 N-말단에서 스페이서에 의해 직렬로 연결되고 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(3720 및 3722)를 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(3706 및 3754)는, VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(3714 및 3728)에 N-말단에서 직렬로 연결되고 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(3718 및 3724)를 포함한다. 제5 및 제6 폴리펩티드(3704 및 3752)는, VH 도메인을 포함하는 제3 특이성의 항원 결합 도메인(3750 및 3736)에 N-말단에서 직렬로 연결되고 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(3710 및 3732)를 포함한다. VL 함유 도메인(3708, 3716, 3726, 3234, 3740, 및 3746)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 38은 3개의 Fc 도메인 및 3개의 상이한 특이성을 갖는 4개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 38)을 도시한다. 이 작제물은 4개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 제1 폴리펩티드(3802)는, WT 서열과 다른 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(3808) 및 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(3832)에 N-말단에서 스페이서에 의해 직렬로 연결되고 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(3816)를 포함한다. 제2 폴리펩티드(3836)는, WT 서열과 다른 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(3826) 및 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(3830)에 N-말단에서 스페이서에 의해 직렬로 연결되고 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(3818)를 포함한다. 제3 폴리펩티드(3804)는, VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(3810)에 N-말단에서 직렬로 연결되고 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(3814)를 포함한다. 제4 폴리펩티드(3834)는, VH 도메인을 포함하는 제3 특이성의 항원 결합 도메인(3824)에 N-말단에서 직렬로 연결되고 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(3820)를 포함한다. VL 함유 도메인(3806, 3812, 3822, 및 3828)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 39는 5개의 Fc 도메인 및 2개의 상이한 특이성의 4개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 39)을 도시한다. 이 작제물은 6개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(3902 및 3944)는, 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(3932 및 3930), 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 제2 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(3934 및 3928), 및 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(3938 및 3924)에 N-말단에서 스페이서에 의해 직렬로 연결되고 WT 서열과 다른 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(3912 및 3914)를 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(3910 및 3916)는 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체를 포함한다. 제5 및 제6 폴리펩티드(3904 및 3942)는, VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(3940 및 3922)에 N-말단에서 직렬로 연결되고 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(3908 및 3918)를 포함한다. VL 함유 도메인(3906, 3920, 3926, 및 3936)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 40은 5개의 Fc 도메인 및 3개의 상이한 특이성의 6개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 40)을 도시한다. 이 작제물은 6개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(4002 및 4056)는, 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(4042 및 4040), 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 제2 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(4044 및 4038), 및 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(4048 및 4034)에 N-말단에서 스페이서에 의해 직렬로 연결되고 WT 서열과 다른 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(4018 및 4020)를 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(4006 및 4054)는, VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(4012 및 4026)에 N-말단에서 직렬로 연결되고 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(4016 및 4022)를 포함한다. 제5 및 제6 폴리펩티드(4004 및 4052)는, VH 도메인을 포함하는 제3 특이성의 항원 결합 도메인(4050 및 4032)에 N-말단에서 직렬로 연결되고 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(4010 및 4028)를 포함한다. VL 함유 도메인(4008, 4014, 4024, 4030, 4036, 및 4046)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 41은 5개의 Fc 도메인 및 2개의 상이한 특이성의 4개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 41)을 도시한다. 이 작제물은 6개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(4102 및 4144)는, 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 제2 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(4120 및 4122), WT 서열과 다른 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(4108 및 4134), 및 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(4140 및 4138)에 N-말단에서 스페이서에 의해 직렬로 연결되고 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(4118 및 4124)를 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(4104 및 4142)는, VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(4112 및 4130)에 N-말단에서 직렬로 연결되고 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(4116 및 4126)를 포함한다. 제5 및 제6 폴리펩티드(4110 및 4132)는 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체를 포함한다. VL 함유 도메인(4106, 4114, 4128, 및 4136)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 42는 5개의 Fc 도메인 및 3개의 상이한 특이성의 6개의 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(작제물 42)을 도시한다. 이 작제물은 6개의 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드로 형성된다. 2개의 폴리펩티드(4202 및 4256)는, 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 제2 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(4226 및 4228), WT 서열과 다른 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에서 포함하는 Fc 도메인 단량체(4210 및 4244), 및 VH 도메인을 포함하는 제1 특이성의 항원 결합 도메인(4250 및 4248)에 N-말단에서 스페이서에 의해 직렬로 연결되고 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(4224 및 4230)를 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(4206 및 4254)는, VH 도메인을 포함하는 제2 특이성의 항원 결합 도메인(4218 및 4236)에 N-말단에서 직렬로 연결되고 제1 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(4222 및 4232)를 포함한다. 제5 및 제6 폴리펩티드(4204 및 4252)는, VH 도메인을 포함하는 제3 특이성의 항원 결합 도메인(4212 및 4242)에 N-말단에서 직렬로 연결되고 제2 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체(4216 및 4238)를 포함한다. VL 함유 도메인(4208, 4214, 4220, 4234, 4240, 및 4246)은 각각의 VH 도메인에 연결된다.
도 43은 리툭시맙(Rtxn), 항-CD20 IgG1 mAB, 및 작제물 7, 13, 19, 및 1의 발현 및 순도를 보여주는 비환원성 SDS-PAGE 겔을 도시한 것이다.
도 44는 다양한 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 발현을 보여주는 겔이다. 처음 3개의 레인은 별개의 3가지 폴리펩티드의 비율을 달리한 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 발현을 보여준다. 네 번째 레인은 SIF3 작제물(항원 결합 도메인을 포함하지 않는 3개의 Fc 도메인을 갖는 작제물)의 발현을 보여주고, 다섯 번째 레인은 항원 결합 도메인을 포함하지 않는 5개의 Fc 도메인을 갖는 작제물의 발현을 보여준다. 여섯 번째 레인은 분자량 마커이다.
도 45는 표면 플라스몬 공명(SPR) 검정의 결과를 보여주는 2개의 그래프이다. 좌측 그래프에서의 결과는, Fc3Y(도 13의 작제물 13의 구조를 갖는 작제물)가 상응하는 부모 단클론 항체(mAb)보다 훨씬 더 강하게 CTLA-4 표적에 결합하는 반면, Fc3I(도 7의 작제물 7의 구조를 갖는 작제물)는 부모 mAb와 유사한 결합 친화도를 갖는다는 것을 보여준다. 우측 그래프에서의 결과는, 항체를 탈푸코실화하면 세포 표면 FcγRIIIa 결합이 약 10배 증가하는 반면, 다양한 Fc-항원 결합 도메인 작제물을 사용하면 결합이 약 300 내지 800배 강화됨을 보여준다.
도 46은 2가지 세포 표면 FcγR 결합 검정의 결과를 보여주는 2개의 그래프이다. 좌측 그래프는 FcγRIIIa에 대한 결합 친화도를 다양한 작제물 별로 보여준다. (상업적으로 이용 가능한 항-CD20 항체인) Gazyva와 동일한 CDR로 mAb를 탈푸코실화하면 결합이 약 10배 증가하는 반면, 모든 Fc-항원 결합 도메인 작제물은 부모 mAb에 비해 100배를 초과하는 강화된 결합을 보여준다. 우측 그래프는 FcγRIIa에 대한 결합 친화도를 다양한 작제물 별로 보여준다. mAb의 탈푸코실화는 결합에 영향을 미치지 않은 반면, 모든 Fc-항원 결합 도메인 작제물은 부모 mAb에 비해 100배를 초과하는 강화된 결합을 보여준다.
도 47은 B 세포를 표적으로 하는 다양한 항-CD20 작제물을 사용한 CDC, ADCP 및 ADCC 검정의 결과를 보여주는 3개의 그래프이다. 첫 번째 그래프는 S3Y Fc-항원 결합 도메인 작제물이 CDC를 매개할 수 있음을 보여준다. 중간 그래프는 SAI 및 S3Y Fc-항원 결합 도메인 작제물 둘 모두가 ADCP FcγRIIa 리포터 검정에서 100배 초과의 강화된 효능을 나타냄을 보여준다. 세 번째 그래프는 SAI 및 S3Y Fc-항원 결합 도메인 작제물이 푸코실화 mAb에 비해 강화된 ADCC 활성을 나타내고, 탈푸코실화 mAb와 유사한 활성을 나타냄을 보여준다.
도 48은 CTLA-4 형질감염 HEK 세포를 표적으로 하는 다양한 항-CTLA-4 작제물을 사용한 CDC, ADCP 및 ADCC 검정의 결과를 보여주는 3개의 그래프이다. 첫 번째 그래프는 SAI 작제물(도 7에 도시된 구조를 갖는 Fc-항원 결합 도메인 작제물) 및 S3Y 작제물(도 13에 도시된 구조를 갖는 Fc-항원 결합 도메인 작제물)이 강화된 CDC를 매개함을 보여준다. 두 번째 그래프는 SAI 및 S3Y 작제물이 강화된 ADCP를 매개함을 보여주고, 세 번째 그래프는 SAI 및 S3Y Fc-항원 결합 도메인 작제물 모두가 푸코실화 mAb에 비해 강화된 ADCC 활성을 나타내고 탈푸코실화 mAb와 유사한 활성을 나타냄을 보여준다.
도 49는 PD-L1 형질감염 HEK 세포를 표적으로 하는 다양한 항-PD-L1 작제물을 사용한 ADCC, ADCP 및 CDC 검정의 결과를 보여주는 3개의 그래프이다. 첫 번째 그래프는 SAI 작제물(도 7의 Fc-항원 결합 도메인 작제물 7의 구조를 갖는 작제물) 및 S3Y Fc-항원 결합 도메인 작제물(도 13의 Fc-항원 결합 도메인 작제물 13의 구조를 갖는 작제물) 모두가 푸코실화 및 탈푸코실화 mAb와 유사한 ADCC 활성을 나타냄을 보여준다. 두 번째 그래프는 SAI 및 S3Y 작제물이 강화된 ADCP를 매개함을 보여주고, 세 번째 그래프는 S3Y 작제물이 CDC를 매개할 수 있음을 보여준다.
도 50은 미정제 배지에서의 Fc 작제물 A 및 Fc 작제물 B의 비환원 SDS-PAGE에 의한 크기 분포를 보여준다.
도 51은 Fc 작제물 A 및 3개의 Fc 도메인을 갖지만 "줄기" 소단위체에 정전기 스티어링 돌연변이가 없는 또 다른 Fc 작제물의 발현 및 조립을 보여준다.
도 52는 항원 결합 도메인이 Fc 작제물의 Fc 도메인에 연결될 수 있는 3개의 예시적인 방법의 개략도이다. 패널 A는 항원 결합 도메인의 중쇄 성분이 Fc 사슬의 융합 단백질로 발현될 수 있고, 경쇄 성분은 별도의 폴리펩티드로 발현될 수 있음을 보여준다. 패널 B는 Fc 장쇄의 융합 단백질로서 발현된 scFv를 보여준다. 패널 C는 별도로 발현되고 외적으로 첨가되어, 화학 결합에 의해 Fc-항원 결합 도메인 작제물에 연결된 중쇄 및 경쇄 성분을 보여준다.
도 53a는 인간 IgG1의 아미노산 서열(서열 번호 43)을 EU 넘버링과 함께 도시한다. 힌지 영역은 이중 밑줄로 표시되어 있고, CH2 도메인은 밑줄이 없으며, CH3 영역은 밑줄로 표시되어 있다.
도 53b는 인간 IgG1의 아미노산 서열(서열 번호 45)을 EU 넘버링과 함께 도시한다. E216에서 C220까지가 없는 힌지 영역은 이중 밑줄로 표시되어 있고, CH2 도메인은 밑줄이 없으며, CH3 영역은 밑줄로 표시되어 있고 K447이 없다.
도 53은 인간 IgG1의 아미노산 서열(서열 번호 47)을 EU 넘버링과 함께 도시한다. 힌지 영역은 이중 밑줄로 표시되어 있고, CH2 도메인은 밑줄이 없으며, CH3 영역은 밑줄로 표시되어 있고 447K가 없다.
도 53d는 인간 IgG1의 아미노산 서열(서열 번호 42)을 EU 넘버링과 함께 도시한다. E216에서 C220까지가 없는 힌지 영역은 이중 밑줄로 표시되어 있고, CH2 도메인은 밑줄이 없으며, CH3 영역은 밑줄로 표시되어 있다.
도 54는 Daudi 세포에서 항-CD20 작제물 7, 항-CD20 작제물 13, Gazyva, 및 푸코실화 항-CD20 IgG1 항체(오비누투주맙)에 의한 보체 의존성 세포독성(CDC)의 유도를 보여주는 그래프이다.
도 55는 ADCP 리포터 검정에서 항-CD20 작제물 7, 항-CD20 작제물 13, Gazyva, 및 푸코실화 항-CD20 IgG1 항체(오비누투주맙)에 의한 FcγRIIa 신호전달의 유도(배수 유도)를 보여주는 그래프이다.
도 56은 ADCC P 리포터 검정에서 항-CD20 작제물 7, 항-CD20 작제물 13, Gazyva, 및 푸코실화 항-CD20 IgG1 항체(오비누투주맙)에 의한 FcγRIIIa 신호전달의 유도(배수 유도)를 보여주는 그래프이다.
도 57은 인간 전혈에서 푸코실화 및 탈푸코실화 항-CD20 작제물 13, 및 푸코실화 및 탈푸코실화 오비누투주맙 단클론 항체에 의한 CD19+ B 세포의 고갈을 보여주는 그래프이다.
도 58은 항-CD20 작제물 13, 푸코실화 오비누투주맙 단클론 항체, 또는 다라투무맙 단클론 항체의 일회 투여량을 주입한 후, 또는 항-CD20 작제물 13의 다중 투여량을 주입한 후 마우스 림프종 모델에서 종양 성장의 감소를 보여주는 그래프이다.
도 59는 항-CD20 작제물들을 비교한 ADCC 리포터 검정의 결과를 보여주는 그래프이다. 푸코실화 작제물은 파선으로 연결된 회색 사각형으로 도시되어 있고, 탈푸코실화 작제물은 실선으로 연결된 검은색 원으로 도시되어 있다.
도 60은 항-CD20 작제물들을 비교한 ADCP 리포터 검정의 결과를 도시한 그래프이다. 푸코실화 작제물은 파선으로 연결된 회색 사각형으로 도시되어 있고, 탈푸코실화 작제물은 실선으로 연결된 검은색 원으로 도시되어 있다.
도 61은 항-CD20 작제물을 이용한 치료에 의한 전혈로부터 CD19+ B 세포의 고갈을 분석한 결과를 도시한 그래프이다. 푸코실화 작제물은 파선으로 연결된 회색 사각형으로 도시되어 있고, 탈푸코실화 작제물은 실선으로 연결된 검은색 원으로 도시되어 있다.
도 62는 항-PD-L1 작제물로 치료한 인간 폐암 세포의 ADCC 분석 결과를 도시한 그래프이다. 푸코실화 작제물은 파선으로 연결된 회색 사각형으로 도시되어 있고, 탈푸코실화 작제물은 실선으로 연결된 검은색 원으로 도시되어 있다.
도 63은 항-PD-L1 작제물로 치료한 인간 폐암 세포의 ADCP 분석 결과를 도시한 그래프이다. 푸코실화 작제물은 파선으로 연결된 회색 사각형으로 도시되어 있고, 탈푸코실화 작제물은 실선으로 연결된 검은색 원으로 도시되어 있다.
도 64는 항-PD-L1 작제물로 처리한 PD-L1 형질감염 HEK 세포의 CDC 분석 결과를 도시한 그래프이다. 푸코실화 작제물은 파선으로 연결된 회색 사각형으로 도시되어 있고, 탈푸코실화 작제물은 실선으로 연결된 검은색 원으로 도시되어 있다.
많은 치료 항체는 항체 의존성 세포독성(ADCC), 항체 의존성 세포 식균작용(ADCP), 및 보체 의존성 세포독성(CDC)과 같은 Fc 도메인의 효과기 기능을 통해 선천적 면역계의 요소를 보충함으로써 작용한다. 일부 경우에, 본 발명은 고유 생물학적 활성을 갖는 신규 치료 작제물을 생성하기 위해 치료제, 예를 들어, 공지의 치료 항체를 포함하는 공지의 단일 Fc 도메인의 항원 결합 도메인을 적어도 2개의 Fc 도메인과 조합하는 것을 고려한다. 일부 경우에, 본원에 개시된 신규 치료제는 공지의 Fc-도메인 함유 치료제, 예를 들어, 공지의 치료 항체보다 큰 생물학적 활성을 갖는다. 적어도 2개의 Fc 도메인의 존재는 효과기 기능을 강화하고, ADCP 및/또는 CDC와 조합하여 ADCC와 같은 다중 효과기 기능들을 활성화하여, 치료 분자의 효능을 증가시킬 수 있다. 일관된 생물학적 기능을 갖는 생성물을 생성하기 위해, Fc 도메인의 수를 제어하는 것이 중요하다. 본 개시는 제한된 수의 폴리펩티드 사슬로부터 별개의 크기의 분자를 조립하기 위해, Fc 도메인을 암호화하는 펩티드의 동종이량체화 및 이종이량체화를 제어하기 위한 Fc 유전자 조작 수단의 세트를 특징으로 한다. 국제 공개 번호 WO/2015/168643호, WO2017/151971호, WO 2017/205436호 및 WO 2017/205434호는 2개 이상의 Fc 도메인을 조립하기 위한 Fc 유전자 조작 수단 및 방법을 개시하며, 이는 전문이 본원에 참조로 포함된다. 유전자 조작 수단은 제조 결과를 상당히 개선시키는 구조적 특징(예를 들어, 글리신 링커)을 포함한다. 이들 작제물의 특성은 실질적으로 균질한 약학 조성물의 효율적인 생성을 가능하게 한다. 약학적 조성물에서의 이러한 동질성은 약학 조성물의 안전성, 효능, 균일성 및 신뢰성을 보장하기 위해 바람직하다. 또한, 약학적 조성물에서 이러한 동질성의 정도가 높으면 원치 않는 물질(예컨대, 분해 산물 및/또는 응집 산물 또는 다량체)에 의해 야기되는 약학적 생성물의 잠재적인 응집 또는 분해를 최소화할 뿐만 아니라 원치 않는 물질에 의해 야기되는 비표적 및 부작용을 제한한다.
본원에 자세히 기재된 바와 같이, 2개의 Fc 도메인 단량체를 직렬로 연결하기 위한 글리신 잔기만을 포함하는 스페이서의 사용, 말단 라이신 잔기가 제거된 폴리펩티드 서열의 사용 및 이종이량체화 선택성 모듈: (i) 상이한 역전하 돌연변이를 갖는 이종이량체화 선택성 모듈 및 (ii) 유전자 조작 함몰부 및 돌출부를 갖는 이종이량체화 선택성 모듈의 두 세트의 사용을 포함하는 접근법을 사용하여 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 Fc 도메인 성분을 유전자 조작하여 조성물의 균질성이 개선되었다.
링커에 의해 분리된 다수의 Fc 서열을 포함하는 하나의 긴 펩티드 사슬과 단일 Fc 서열을 포함하는 단쇄의 다수의 카피(Fc-항원 결합 도메인 작제물 1~6; 도 1~도 6)를 사용하여, Fc 도메인이 직렬로 연결된 일련의 Fc-항원 결합 도메인 작제물을 설계하였다. 더 작거나 더 큰 복합체를 최소로 형성하면서, 조립을 원하는 직렬 구성으로 보장하기 위해 이종이량체화 돌연변이를 각각의 Fc 서열에 도입하였다. 임의의 수의 Fc 도메인이 이러한 방식으로 직렬 연결로 연결되어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 Fc 도메인을 갖는 작제물을 생성할 수 있다. N개의 Fc 도메인을 갖는 펩티드의 경우, 이러한 작제물은 항원 결합 도메인이 펩티드 장쇄, 펩티드 단쇄, 또는 둘 모두에 각각 도입되는지 여부에 따라 1 내지 N+1개의 항원 결합 도메인을 사용하여 제조할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 1~6(도 1~도 6)에서, Fc 도메인은 Fc 도메인 사이에 단일 분지점으로 연결되었다. 이러한 작제물은 링커에 의해 분리된 다수의 Fc 서열을 포함하는 긴 펩티드 사슬의 2개의 카피를 포함하며, 여기서 분지형 Fc 서열은 동종이량체화 돌연변이를 포함하고, 비분지형 Fc 도메인은 이종이량체화 돌연변이를 포함한다. 장쇄에서 이종이량체화 돌연변이에 상보적인 돌연변이를 갖는 단일 Fc 서열을 포함하는 단쇄의 다수의 카피를 사용하여 다량체 Fc 스캐폴드를 완성한다. 이종이량체화 Fc 도메인은 분지형 Fc 도메인의 C-말단(예를 들어, Fc-항원 결합 도메인 작제물 7~12; 도 7~도 12), N-말단(예를 들어, Fc-항원 결합 도메인 작제물 13~18; 도 13~도 18) 또는 양 말단(예를 들어, Fc-항원 결합 도메인 작제물 19~21; 도 19~도 21)에 연결될 수 있다. 직렬 연결된 다수의 Fc 도메인은 분지형 Fc 도메인의 어느 하나의 말단에 연결될 수 있다. 항원 결합 도메인은 펩티드 장쇄에 도입되어, 조립된 단백질 분자 당 2개의 항원 결합 도메인을 생성할 수 있다. 대안적으로, 항원 결합 도메인은 펩티드 단쇄에 도입되어, 조립된 단백질 분자 당 N-1개의 항원 결합 도메인을 생성할 수 있으며, 여기서 N은 조립된 단백질 분자 내의 Fc 도메인의 수이다. 항원 결합 도메인이 펩티드 단쇄 및 펩티드 장쇄 모두에 도입되면, 생성된 조립된 단백질 분자는 N+1개의 항원 결합 도메인을 포함한다.
이중 특이적 작제물은, 2개의 상이한 항원 결합 서열이 직렬로 연결된 항원 결합 도메인을 사용함으로써 전술한 설계 중 어느 하나로부터 생성할 수 있다. 대안적으로, 이중 특이적 작제물은, 장쇄가 하나의 항원 결합 도메인을 암호화하고 단쇄는 상이한 항원 결합 도메인을 암호화하는 전술한 Fc 스캐폴드로부터 생성할 수 있다. 상이한 항원 결합 도메인은 상이한 경쇄, 또는 공통 경쇄를 사용할 수 있거나, 또는 scFv 도메인으로 이루어질 수 있다. 이 개념의 대표적인 예는 Fc-항원 결합 도메인 작제물 22~28(도 22 내지 도 28)이다.
이중 특이적 및 삼중 특이적 작제물은, 2개의 상이한 이종이량체화 돌연변이 세트(예를 들어, Fc-항원 결합 도메인 작제물 29~42; 도 29 내지 도 42)를 사용해 생성할 수도 있다. 이러한 이종이량체화 서열은 다른 이종이량체화 서열과의 회합을 불리하게 하는 방식으로 설계되어야 한다. 이러한 설계는 본원에 기재된 바와 같은 2세트의 이종이량체화 돌연변이 간의 상이한 정전기 스티어링 돌연변이를 사용하여 달성될 수 있다. 직교 정전기 스티어링 돌연변이의 일례는 제1 노브 Fc에서의 E357K, 제1 홀 Fc에서의 K370D, 제2 노브 Fc에서의 D399K, 및 제2 홀 Fc에서의 K409D이다.
단클론 항체(mAb) 및 Fc 도메인을 위한 과거의 유전자 조작 노력에는 FcγRIIIa에 대한 결합을 강화하고, 이에 따라 항체 의존성 세포-매개 세포독성(ADCC) 반응을 강화하기 위해 Fc 도메인에서 돌연변이를 만드는 것, 및 FcγRIIIa에 대한 결합을 강화하고, 이에 따라 ADCC 반응을 강화하는 Fc 도메인의 탈푸코실화가 포함되었다.
FcγRIIIa에 대한 결합 또는 Fc 도메인의 탈푸코실화를 강화하기 위해 Fc 도메인 내에 돌연변이를 갖는 항체와 비교하여, 본 개시 내용에 개시된 Fc-항원 결합 도메인 작제물은 예기치 않게 Fcγ 수용체의 여러 부류에 대한 더 강한 결합 및 다중 세포독성 경로의 강화된 활성을 특징으로 한다. 본 발명의 Fc-항원 결합 도메인 작제물은 이들의 상응하는 푸코실화 및 탈푸코실화 모 단클론 항체와 비교하여 FcγRIIa 및 FcγRIIIa 둘 모두에 대한 결합을 강화할 수 있다(실시예 46 참조). 추가로, 본 발명의 Fc-항원 결합 도메인 작제물은 예기치 않게 ADCC 경로 반응을 강화하는 것 외에도 보체 의존성 세포독성(CDC) 경로 및/또는 항체 의존성 세포 식균작용(ADCP) 경로를 매개하는 능력을 특징으로 한다(실시예 47 참조).
I. Fc 도메인 단량체
Fc 도메인 단량체는 힌지 도메인, CH2 항체 불변 도메인 및 CH3 항체 불변 도메인(예를 들어, 선택적인 아미노산 치환을 갖는 인간 IgG1 힌지, CH2 항체 불변 도메인 및 CH3 항체 불변 도메인)의 적어도 일부를 포함한다. Fc 도메인 단량체는 면역글로불린 항체 동형 IgG, IgE, IgM, IgA 또는 IgD일 수 있다. Fc 도메인 단량체는 또한 임의의 면역글로불린 항체 동형(예를 들어, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 또는 IgG4)일 수 있다. 또한, Fc 도메인 단량체는, 예를 들어 IgG1로부터의 힌지 및 CH2를 갖거나, IgA로부터의 CH3를 갖거나, IgG1로부터의 힌지 및 CH2를 갖지만 IgG3로부터의 CH3를 갖는 혼성체일 수 있다. Fc 도메인 단량체의 이량체는 백혈구의 표면에 위치한 수용체인 Fc 수용체, 예를 들어, FcγRIIIa에 결합할 수 있는(본원에서 추가로 정의된) Fc 도메인이다. 본 명세서에서, Fc 도메인 단량체의 CH3 항체 불변 도메인은 서로의 회합을 촉진하기 위해 CH3-CH3 항체 불변 도메인의 계면에 아미노산 치환을 함유할 수 있다. 다른 구현예에서, Fc 도메인 단량체는 N-말단 또는 C-말단에 부착된 추가 모이어티, 예를 들어, 알부민-결합 펩티드 또는 정제 펩티드를 포함한다. 본 명세서에서, Fc 도메인 단량체는 임의의 유형의 항체 가변 영역, 예를 들어, VH, VL, 상보성 결정 영역(CDR) 또는 초가변 영역(HVR)을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 Fc－항원 결합 도메인 작제물(예를 들어, 3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc-항원 결합 도메인 작제물) 내의 Fc 도메인 단량체는 서열번호 42의 서열에 적어도 95% 동일한(적어도 97%, 99% 또는 99.5% 동일한) 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 Fc-항원 결합 도메인 작제물(예를 들어, 3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc-항원 결합 도메인 작제물) 내의 Fc 도메인 단량체는 서열번호 44, 46, 48 및 50~53 중 어느 하나의 서열에 적어도 95% 동일한(적어도 97%, 99% 또는 99.5% 동일한) 서열을 가질 수 있다. 특정 구현예에서, Fc-항원 결합 도메인 작제물 내의 Fc 도메인 단량체는 서열번호 48, 52, 및 53 중 어느 하나의 서열과 적어도 95% 동일한(적어도 97%, 99% 또는 99.5% 동일한) 서열을 가질 수 있다.
서열 번호 42
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
서열 번호 44
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
서열 번호 46
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
서열 번호 48
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
서열 번호 50
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
서열 번호 51
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
서열 번호 52
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
서열 번호 53
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
II. Fc 도메인
본원에 정의된 바와 같이, Fc 도메인은 CH3 항체 불변 도메인 사이의 상호작용으로 이량체화된 2개의 Fc 도메인 단량체를 포함한다. Fc 도메인은 Fc 수용체, 예를 들어, Fc-감마 수용체(즉, Fcγ 수용체(FcγR)), Fc-알파 수용체(즉, Fcα 수용체(FcαR)), Fc-엡실론 수용체(즉, Fcε 수용체(FcεR)) 및/또는 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 결합하는 최소 구조를 형성한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 Fc 도메인은 Fcγ 수용체(예컨대, FcγRI(CD64), FcγRIIa(CD32), FcγRIIb(CD32), FcγRIIIa(CD16a), FcγRIIIb(CD16b)), 및/또는 FcγRIV 및/또는 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 결합한다.
III. 항원 결합 도메인
항원 결합 도메인은 표적 분자에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함한다. 항원 결합 도메인은 항체의 항원 결합 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 항체 또는 항체-작제물의 단편, 예를 들어 표적 항원에 결합하는 항체의 최소 부분일 수 있다. 항원 결합 도메인은 또한, 피브로넥틴 기반 결합 단백질(예를 들어, FN3 모노바디)과 같이 표적에 특이적으로 결합하는 합성 유전자 조작 펩티드일 수 있다. 단편 항원-결합(Fab) 단편은 표적 항원에 결합하는 항체의 영역이다. 이는 중쇄 및 경쇄 각각의 하나의 불변 도메인 및 하나의 가변 도메인을 구성한다. Fab 단편은 VH, VL, CH1 및 CL 도메인을 포함한다. 가변 도메인 VH 및 VL은 각각 단량체의 아미노 말단에 3개의 상보성 결정 영역(CDR)의 세트를 포함한다. Fab 단편은 면역글로불린 항체 동형 IgG, IgE, IgM, IgA 또는 IgD일 수 있다. 또한, Fab 단편 단량체는 임의의 면역글로불린 항체 동형(예를 들어, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 또는 IgG4)일 수 있다. 일부 구현예에서, Fab 단편은 프로테아제 처리(예를 들어, 펩신) 후에 면역글로불린의 제2 동일 Fab 단편에 공유 결합으로 부착되어 F(ab')2 단편을 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, Fab는, 예를 들어 도메인 사이에 링커로 융합된 가변 도메인 및 불변 도메인 모두를 포함하는 단일 폴리펩티드로 발현될 수 있다.
일부 구현예에서, Fab 단편의 일부만이 항원 결합 도메인으로 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, Fab의 경쇄 성분(VL + CL)만이 사용될 수 있거나, Fab의 중쇄 성분(VH + CH)만이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, Fab 가변 영역의 VH와 VL 사슬의 융합 단백질인 단일-사슬 가변 단편(scFv)이 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 직렬 Fd 분절 쌍(VH-CH1-VH-CH1)을 포함하고 상보적 경쇄 폴리펩티드와 함께 항원 결합 영역 쌍을 형성하는 선형 항체가 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시의 항원 결합 도메인은 표 1에 열거된 표적 또는 항원에 대해, 열거된 표적 또는 항원에 대한 표 1에 열거된 CDR 서열 중 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개 모두를 포함하며, 이는 하기 표 1에 추가로 상세히 제공된다.
[표 1a]
[표 1b]
Fc-항원 결합 도메인 작제물 1의 항원 결합 도메인(도 1의 110/104)은 표 1에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 2의 항원 결합 도메인(도 2의 212/204)은 표 1에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 3의 항원 결합 도메인(도 3의 308/316 및 312/318)은 표 1에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 각각 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 4의 항원 결합 도메인(도 4의 410/412, 416/418, 및 422/424)은 표 1에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 각각 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 5의 항원 결합 도메인(도 5의 510/504, 512/514, 및 518/520)은 표 1에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 각각 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 6의 항원 결합 도메인(도 6의 612/604, 614/616, 620/622, 및 626/628)은 표 1에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 각각 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 7의 항원 결합 도메인(도 7의 712/714 및 714/716)은 표 1에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 각각 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 8의 항원 결합 도메인(도 8의 812/806 및 818/822)은 표 1에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 각각 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 9의 항원 결합 도메인(도 9의 908/906, 920/922, 912/914, 및 926/930)은 표 1에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 각각 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 10의 항원 결합 도메인(도 10의 1006/1004 및 1018/1020)은 표 1에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 각각 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 11의 항원 결합 도메인(도 11의 1112/1114, 1122/1108, 1128/1142, 및 1138/1136)은 표 1에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 각각 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 12의 항원 결합 도메인(도 12의 1218/1220, 1212/1214, 1250/1208, 1248/1246, 1242/1240, 및 1236/1234)은 표 1에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 각각 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 13의 항원 결합 도메인(도 13의 1310/1304 및 1314/1322)은 표 1에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 각각 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 14의 항원 결합 도메인(도 14의 1408/1406 및 1416/1424)은 표 1에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 각각 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 15의 항원 결합 도메인(도 15의 1508/1506, 1514/1516, 1532/1520, 및 1530/1528)은 표 1에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 각각 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 16의 항원 결합 도메인(도 16의 1616/1604 및 1618/1630)은 표 1에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 각각 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 17의 항원 결합 도메인(도 17의 1712/1714, 1724/1708, 1726/1742, 및 1738/1736)은 표 1에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 각각 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 18의 항원 결합 도메인(도 18의 1812/1814, 1828/1808, 1826/1824, 1830/1832, 1850/1848 및 1844/1842)은 표 1에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 각각 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 19의 항원 결합 도메인(도 19의 1914/1904 및 1920/1922)은 표 1에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 각각 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 20의 항원 결합 도메인(도 20의 2014/2016, 2042/2008, 2036/2034, 및 2028/2026)은 표 1에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 각각 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 21의 항원 결합 도메인(도 21의 2114/2116, 2150/2108, 2148/2146, 2138/2140, 2136/2134 및 2128/2126)은 표 1에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 각각 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 22의 항원 결합 도메인(도 22의 2204/2222)은 표 1에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 22의 항원 결합 도메인(도 22의 2218/2220 및 2212/2214의 각각)은 표 1에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 23의 항원 결합 도메인(도 23의 2330/2304)은 표 1에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 23의 항원 결합 도메인(도 23의 2328/2326, 2322/2320, 및 2316/2314의 각각)은 표 1에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 24의 항원 결합 도메인(도 24의 2430/2428 및 2420/2422의 각각)은 표 1에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 24의 항원 결합 도메인(도 24의 2432/2406 및 2418/2416의 각각)은 표 1에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 25의 항원 결합 도메인(도 25의 2532/2506 및 2530/2528의 각각)은 표 1에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 25의 항원 결합 도메인(도 25의 2510/2512 및 2524/2522의 각각)은 표 1에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 26의 항원 결합 도메인(도 26의 2648/2646 및 2634/2636의 각각)은 표 1에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 26의 항원 결합 도메인(도 26의 2612/2614, 2650/2608, 2632/2630, 및 2626/2624의 각각)은 표 1에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 27의 항원 결합 도메인(도 27의 2748/2746 및 2738/2740의 각각)은 표 1에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 27의 항원 결합 도메인(도 27의 2714/2716, 2750/2708, 2736/2734, 및 2728/2726의 각각)은 표 1에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 28의 항원 결합 도메인(도 27의 2850/2808 및 2848/2846의 각각)은 표 1에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 28의 항원 결합 도메인(도 28의 2818/2820, 2812/2814, 2842/2840, 및 2836/2834의 각각)은 표 1에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 29의 항원 결합 도메인(도 29의 2918/2904)은 표 1에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 29의 항원 결합 도메인(도 29의 2914/2912)은 표 1에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 30의 항원 결합 도메인(도 30의 3022/3004 및 3020/3018의 각각)은 표 1에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 30의 항원 결합 도메인(도 30의 3014/3012)은 표 1에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 31의 항원 결합 도메인(도 31의 3122/3104)은 표 1에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 31의 항원 결합 도메인(도 31의 3120/3118)은 표 1에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 31의 항원 결합 도메인(도 31의 3114/3112)은 표 1에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 32의 항원 결합 도메인(도 32의 3226/3204)은 표 1에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 32의 항원 결합 도메인(도 32의 3222/3220 및 3216/3214의 각각)은 표 1에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 33의 항원 결합 도메인(도 33의 3330/3304 및 3328/3326의 각각)은 표 1에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 33의 항원 결합 도메인(도 33의 3322/3320 및 3316/3314의 각각)은 표 1에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 34의 항원 결합 도메인(도 34의 3430/3404)은 표 1에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 34의 항원 결합 도메인(도 34의 3428/3426)은 표 1에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 34의 항원 결합 도메인(도 34의 3422/3420 및 3416/3414의 각각)은 표 1에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 35의 항원 결합 도메인(도 35의 3530/3528 및 3520/3522의 각각)은 표 1에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 35의 항원 결합 도메인(도 35의 3532/3506)은 표 1에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 35의 항원 결합 도메인(도 35의 3518/3516)은 표 1에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 36의 항원 결합 도메인(도 36의 3638/3636 및 3628/3620의 각각)은 표 1에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 36의 항원 결합 도메인(도 36의 3640/3606 및 3626/3624의 각각)은 표 1에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 37의 항원 결합 도메인(도 37의 3748/3746 및 3738/3740의 각각)은 표 1에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 37의 항원 결합 도메인(도 37의 3750/3708 및 3736/3734의 각각)은 표 1에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 37의 항원 결합 도메인(도 37의 3714/3716 및 3728/3726의 각각)은 표 1에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 38의 항원 결합 도메인(도 38의 3832/3806 및 3830/3822의 각각)은 표 1에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 38의 항원 결합 도메인(도 38의 3810/3812)은 표 1에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 38의 항원 결합 도메인(도 38의 3824/3822)은 표 1에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 39의 항원 결합 도메인(도 39의 3938/3936 및 3924/3926의 각각)은 표 1에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 39의 항원 결합 도메인(도 39의 3940/3906 및 3922/3920의 각각)은 표 1에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 40의 항원 결합 도메인(도 40의 4048/4046 및 4034/4036의 각각)은 표 1에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 40의 항원 결합 도메인(도 40의 4050/4008 및 4032/4030의 각각)은 표 1에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 40의 항원 결합 도메인(도 40의 4012/4014 및 4026/4024의 각각)은 표 1에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 41의 항원 결합 도메인(도 41의 4140/4106 및 4138/4136의 각각)은 표 1에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 41의 항원 결합 도메인(도 41의 4112/4114 및 4130/4128의 각각)은 표 1에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 42의 항원 결합 도메인(도 42의 4250/4208 및 4248/4246의 각각)은 표 1에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 42의 항원 결합 도메인(도 42의 4218/4220 및 4236/4234의 각각)은 표 1에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 42의 항원 결합 도메인(도 42의 4212/4214 및 4242/4240의 각각)은 표 1에 열거된 항체 중 어느 하나의 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 항원 결합 도메인(예컨대, Fab 또는 scFv)은 표 2에 열거된 항체의 VH 및 VL 사슬을 포함한다. 일부 구현예에서, Fab는 표 2에 열거된 항체의 VH 및 VL 사슬에 포함된 CDR을 포함한다. 일부 구현예에서, Fab는 표 2에 열거된 항체의 VH 및 VL 사슬에 포함된 CDR을 포함하며, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2의 항체의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 적어도 99.5% 동일하다.
| 표적 | 항체명 |
| AbGn-7 항원 | AbGn-7 |
| AMHR2 | GM-102 |
| B7-H3 | DS-5573a |
| CA19-9 | MVT-5873 |
| CAIX | Anti-CAIX |
| CD19 | XmAb5871 |
| CD33 | BI-836858 |
| CD37 | BI-836826 |
| CD38 | MOR-202 |
| CD47 | Anti-CD47 |
| CD70 | ARGX-110 |
| CD70 | ARGX-110 |
| CD98 | IGN-523 |
| CD147 | 메투주맙 |
| CD157 | MEN-1112 |
| c-Met | ARGX-111 |
| EGFR2 | GT-Mab 7.3-GEX |
| EphA2 | DS-8895a |
| FGFR2 | FPA-144 |
| GM2 | BIW-8962 |
| HPA-1a | NAITgam |
| ICAM-1 | BI-505 |
| IL-3R알파 | 탈라코투주맙 |
| JL-1 | 류코툭시맙 |
| 카파 골수종 항원 | MDX-1097 |
| KIR32DL2 | IPH-4102 |
| LAG-3 | GSK-2381781 |
| 녹농균 혈청형 O1 | AR-104 |
| pGlu-a베타 | PBD-C06 |
| TA-MUC1 | GT-MAB 2.5-GEX |
Fc-항원 결합 도메인 작제물 1의 항원 결합 도메인(도 1의 110/104)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 2의 항원 결합 도메인(도 2의 212/204)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 3의 항원 결합 도메인(도 3의 308/316 및 312/318)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 각각 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 4의 항원 결합 도메인(도 4의 410/412, 416/418, 및 422/424)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 각각 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 5의 항원 결합 도메인(도 5의 510/504, 512/514, 및 518/520)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 각각 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 6의 항원 결합 도메인(도 6의 612/604, 614/616, 620/622, 및 626/628)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 각각 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 7의 항원 결합 도메인(도 7의 712/714 및 714/716)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 각각 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 8의 항원 결합 도메인(도 8의 812/806 및 818/822)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 각각 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 9의 항원 결합 도메인(도 9의 908/906, 920/922, 912/914, 및 926/930)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 각각 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 10의 항원 결합 도메인(도 10의 1006/1004 및 1018/1020)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 각각 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 11의 항원 결합 도메인(도 11의 1112/1114, 1122/1108, 1128/1142, 및 1138/1136)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 각각 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 12의 항원 결합 도메인(도 12의 1218/1220, 1212/1214, 1250/1208, 1248/1246, 1242/1240, 및 1236/1234)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 각각 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 13의 항원 결합 도메인(도 13의 1310/1304 및 1314/1322)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 각각 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 14의 항원 결합 도메인(도 14의 1408/1406 및 1416/1424)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 각각 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 15의 항원 결합 도메인(도 15의 1508/1506, 1514/1516, 1532/1520, 및 1530/1528)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 각각 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 16의 항원 결합 도메인(도 16의 1616/1604 및 1618/1630)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 각각 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 17의 항원 결합 도메인(도 17의 1712/1714, 1724/1708, 1726/1742, 및 1738/1736)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 각각 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 18의 항원 결합 도메인(도 18의 1812/1814, 1828/1808, 1826/1824, 1830/1832, 1850/1848, 및 1844/1842)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 각각 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 19의 항원 결합 도메인(도 19의 1914/1904 및 1920/1922)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 각각 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 20의 항원 결합 도메인(도 20의 2014/2016, 2042/2008, 2036/2034, 및 2028/2026)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 각각 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 21의 항원 결합 도메인(도 21의 2114/2116, 2150/2108, 2148/2146, 2138/2140, 2136/2134, 및 2128/2126)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 각각 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 22의 항원 결합 도메인(도 22의 2204/2222)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 22의 항원 결합 도메인(도 22의 2218/2220 및 2212/2214의 각각)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 23의 항원 결합 도메인(도 23의 2330/2304)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 23의 항원 결합 도메인(도 23의 2328/2326, 2322/2320, 및 2316/2314의 각각)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 24의 항원 결합 도메인(도 24의 2430/2428 및 2420/2422의 각각)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 24의 항원 결합 도메인(도 24의 2432/2406 및 2418/2416의 각각)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 25의 항원 결합 도메인(도 25의 2532/2506 및 2530/2528의 각각)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 25의 항원 결합 도메인(도 25의 2510/2512 및 2524/2522의 각각)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 26의 항원 결합 도메인(도 26의 2648/2646 및 2634/2636의 각각)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 26의 항원 결합 도메인(도 26의 2612/2614, 2650/2608, 2632/2630, 및 2626/2624의 각각)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 27의 항원 결합 도메인(도 27의 2748/2746 및 2738/2740의 각각)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 27의 항원 결합 도메인(도 27의 2714/2716, 2750/2708, 2736/2734, 및 2728/2726의 각각)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 28의 항원 결합 도메인(도 27의 2850/2808 및 2848/2846의 각각)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 28의 항원 결합 도메인(도 28의 2818/2820, 2812/2814, 2842/2840, 및 2836/2834의 각각)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 29의 항원 결합 도메인(도 29의 2918/2904)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 29의 항원 결합 도메인(도 29의 2914/2912)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 30의 항원 결합 도메인(도 30의 3022/3004 및 3020/3018의 각각)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 30의 항원 결합 도메인(도 30의 3014/3012)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 31의 항원 결합 도메인(도 31의 3122/3104)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 31의 항원 결합 도메인(도 31의 3120/3118)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 31의 항원 결합 도메인(도 31의 3114/3112)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 32의 항원 결합 도메인(도 32의 3226/3204)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 32의 항원 결합 도메인(도 32의 3222/3220 및 3216/3214의 각각)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 33의 항원 결합 도메인(도 33의 3330/3304 및 3328/3326의 각각)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 33의 항원 결합 도메인(도 33의 3322/3320 및 3316/3314의 각각)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 34의 항원 결합 도메인(도 34의 3430/3404)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 34의 항원 결합 도메인(도 34의 3428/3426)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 34의 항원 결합 도메인(도 34의 3422/3420 및 3416/3414의 각각)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 35의 항원 결합 도메인(도 35의 3530/3528 및 3520/3522의 각각)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 35의 항원 결합 도메인(도 35의 3532/3506)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 35의 항원 결합 도메인(도 35의 3518/3516)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 36의 항원 결합 도메인(도 36의 3638/3636 및 3628/3620의 각각)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 36의 항원 결합 도메인(도 36의 3640/3606 및 3626/3624의 각각)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 37의 항원 결합 도메인(도 37의 3748/3746 및 3738/3740의 각각)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 37의 항원 결합 도메인(도 37의 3750/3708 및 3736/3734의 각각)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 37의 항원 결합 도메인(도 37의 3714/3716 및 3728/3726의 각각)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 38의 항원 결합 도메인(도 38의 3832/3806 및 3830/3822의 각각)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 38의 항원 결합 도메인(도 38의 3810/3812)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 38의 항원 결합 도메인(도 38의 3824/3822)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 39의 항원 결합 도메인(도 39의 3938/3936 및 3924/3926의 각각)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 39의 항원 결합 도메인(도 39의 3940/3906 및 3922/3920의 각각)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 40의 항원 결합 도메인(도 40의 4048/4046 및 4034/4036의 각각)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 40의 항원 결합 도메인(도 40의 4050/4008 및 4032/4030의 각각)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 40의 항원 결합 도메인(도 40의 4012/4014 및 4026/4024의 각각)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 41의 항원 결합 도메인(도 41의 4140/4106 및 4138/4136의 각각)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 41의 항원 결합 도메인(도 41의 4112/4114 및 4130/4128의 각각)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 42의 항원 결합 도메인(도 42의 4250/4208 및 4248/4246의 각각)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 42의 항원 결합 도메인(도 42의 4218/4220 및 4236/4234의 각각)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 42의 항원 결합 도메인(도 42의 4212/4214 및 4242/4240의 각각)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 1의 항원 결합 도메인(도 1의 110/104)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 2의 항원 결합 도메인(도 2의 212/204)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 3의 항원 결합 도메인(도 3의 308/316 및 312/318)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 각각 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 4의 항원 결합 도메인(도 4의 410/412, 416/418, 및 422/424)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 각각 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 5의 항원 결합 도메인(도 5의 510/504, 512/514, 및 518/520)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 각각 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 6의 항원 결합 도메인(도 6의 612/604, 614/616, 620/622, 및 626/628)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 각각 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 7의 항원 결합 도메인(도 7의 712/714 및 714/716)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 각각 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 8의 항원 결합 도메인(도 8의 812/806 및 818/822)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 각각 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 9의 항원 결합 도메인(도 9의 908/906, 920/922, 912/914, 및 926/930)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 각각 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 10의 항원 결합 도메인(도 10의 1006/1004 및 1018/1020)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 각각 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 11의 항원 결합 도메인(도 11의 1112/1114, 1122/1108, 1128/1142, 및 1138/1136)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 각각 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 12의 항원 결합 도메인(도 12의 1218/1220, 1212/1214, 1250/1208, 1248/1246, 1242/1240, 및 1236/1234)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 각각 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 13의 항원 결합 도메인(도 13의 1310/1304 및 1314/1322)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 각각 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 14의 항원 결합 도메인(도 14의 1408/1406 및 1416/1424)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 각각 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 15의 항원 결합 도메인(도 15의 1508/1506, 1514/1516, 1532/1520, 및 1530/1528)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 각각 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 16의 항원 결합 도메인(도 16의 1616/1604 및 1618/1630)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 각각 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 17의 항원 결합 도메인(도 17의 1712/1714, 1724/1708, 1726/1742, 및 1738/1736)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 각각 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 18의 항원 결합 도메인(도 18의 1812/1814, 1828/1808, 1826/1824, 1830/1832, 1850/1848, 및 1844/1842)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 각각 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 19의 항원 결합 도메인(도 19의 1914/1904 및 1920/1922)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 각각 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 20의 항원 결합 도메인(도 20의 2014/2016, 2042/2008, 2036/2034, 및 2028/2026)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 각각 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 21의 항원 결합 도메인(도 21의 2114/2116, 2150/2108, 2148/2146, 2138/2140, 2136/2134, 및 2128/2126)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 각각 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 22의 항원 결합 도메인(도 22의 2204/2222)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 22의 항원 결합 도메인(도 22의 2218/2220 및 2212/2214의 각각)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 23의 항원 결합 도메인(도 23의 2330/2304)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 23의 항원 결합 도메인(도 23의 2328/2326, 2322/2320, 및 2316/2314의 각각)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 24의 항원 결합 도메인(도 24의 2430/2428 및 2420/2422의 각각)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 24의 항원 결합 도메인(도 24의 2432/2406 및 2418/2416의 각각)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 25의 항원 결합 도메인(도 25의 2532/2506 및 2530/2528의 각각)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 25의 항원 결합 도메인(도 25의 2510/2512 및 2524/2522의 각각)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 26의 항원 결합 도메인(도 26의 2648/2646 및 2634/2636의 각각)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 26의 항원 결합 도메인(도 26의 2612/2614, 2650/2608, 2632/2630, 및 2626/2624의 각각)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 27의 항원 결합 도메인(도 27의 2748/2746 및 2738/2740의 각각)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 27의 항원 결합 도메인(도 27의 2714/2716, 2750/2708, 2736/2734, 및 2728/2726의 각각)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 28의 항원 결합 도메인(도 27의 2850/2808 및 2848/2846의 각각)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 28의 항원 결합 도메인(도 28의 2818/2820, 2812/2814, 2842/2840, 및 2836/2834의 각각)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 29의 항원 결합 도메인(도 29의 2918/2904)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 29의 항원 결합 도메인(도 29의 2914/2912)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 30의 항원 결합 도메인(도 30의 3022/3004 및 3020/3018의 각각)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 30의 항원 결합 도메인(도 30의 3014/3012)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 31의 항원 결합 도메인(도 31의 3122/3104)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 31의 항원 결합 도메인(도 31의 3120/3118)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 31의 항원 결합 도메인(도 31의 3114/3112)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 32의 항원 결합 도메인(도 32의 3226/3204)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 32의 항원 결합 도메인(도 32의 3222/3220 및 3216/3214의 각각)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 33의 항원 결합 도메인(도 33의 3330/3304 및 3328/3326의 각각)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 33의 항원 결합 도메인(도 33의 3322/3320 및 3316/3314의 각각)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 34의 항원 결합 도메인(도 34의 3430/3404)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 34의 항원 결합 도메인(도 34의 3428/3426)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 34의 항원 결합 도메인(도 34의 3422/3420 및 3416/3414의 각각)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 35의 항원 결합 도메인(도 35의 3530/3528 및 3520/3522의 각각)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 35의 항원 결합 도메인(도 35의 3532/3506)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 35의 항원 결합 도메인(도 35의 3518/3516)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 36의 항원 결합 도메인(도 36의 3638/3636 및 3628/3620의 각각)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 36의 항원 결합 도메인(도 36의 3640/3606 및 3626/3624의 각각)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 37의 항원 결합 도메인(도 37의 3748/3746 및 3738/3740의 각각)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 37의 항원 결합 도메인(도 37의 3750/3708 및 3736/3734의 각각)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 37의 항원 결합 도메인(도 37의 3714/3716 및 3728/3726의 각각)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 38의 항원 결합 도메인(도 38의 3832/3806 및 3830/3822의 각각)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 38의 항원 결합 도메인(도 38의 3810/3812)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 38의 항원 결합 도메인(도 38의 3824/3822)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 39의 항원 결합 도메인(도 39의 3938/3936 및 3924/3926의 각각)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 39의 항원 결합 도메인(도 39의 3940/3906 및 3922/3920의 각각)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 40의 항원 결합 도메인(도 40의 4048/4046 및 4034/4036의 각각)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 40의 항원 결합 도메인(도 40의 4050/4008 및 4032/4030의 각각)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 40의 항원 결합 도메인(도 40의 4012/4014 및 4026/4024의 각각)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 41의 항원 결합 도메인(도 41의 4140/4106 및 4138/4136의 각각)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 41의 항원 결합 도메인(도 41의 4112/4114 및 4130/4128의 각각)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 42의 항원 결합 도메인(도 42의 4250/4208 및 4248/4246의 각각)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 42의 항원 결합 도메인(도 42의 4218/4220 및 4236/4234의 각각)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 42의 항원 결합 도메인(도 42의 4212/4214 및 4242/4240의 각각)은 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 1의 항원 결합 도메인(도 1의 110/104)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 2의 항원 결합 도메인(도 2의 212/204)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 3의 항원 결합 도메인(도 3의 308/316 및 312/318)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 각각 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 4의 항원 결합 도메인(도 4의 410/412, 416/418, 및 422/424)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 각각 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 5의 항원 결합 도메인(도 5의 510/504, 512/514, 및 518/520)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 각각 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 6의 항원 결합 도메인(도 6의 612/604, 614/616, 620/622, 및 626/628)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 각각 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 7의 항원 결합 도메인(도 7의 712/714 및 714/716)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 각각 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 8의 항원 결합 도메인(도 8의 812/806 및 818/822)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 각각 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 9의 항원 결합 도메인(도 9의 908/906, 920/922, 912/914, 및 926/930)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 각각 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 10의 항원 결합 도메인(도 10의 1006/1004 및 1018/1020)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 각각 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 11의 항원 결합 도메인(도 11의 1112/1114, 1122/1108, 1128/1142, 및 1138/1136)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 각각 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 12의 항원 결합 도메인(도 12의 1218/1220, 1212/1214, 1250/1208, 1248/1246, 1242/1240, 및 1236/1234)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 각각 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 13의 항원 결합 도메인(도 13의 1310/1304 및 1314/1322)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 각각 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 14의 항원 결합 도메인(도 14의 1408/1406 및 1416/1424)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 각각 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 15의 항원 결합 도메인(도 15의 1508/1506, 1514/1516, 1532/1520, 및 1530/1528)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 각각 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 16의 항원 결합 도메인(도 16의 1616/1604 및 1618/1630)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 각각 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 17의 항원 결합 도메인(도 17의 1712/1714, 1724/1708, 1726/1742, 및 1738/1736)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 각각 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 18의 항원 결합 도메인(도 18의 1812/1814, 1828/1808, 1826/1824, 1830/1832, 1850/1848, 및 1844/1842)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 각각 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 19의 항원 결합 도메인(도 19의 1914/1904 및 1920/1922)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 각각 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 20의 항원 결합 도메인(도 20의 2014/2016, 2042/2008, 2036/2034, 및 2028/2026)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 각각 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 21의 항원 결합 도메인(도 21의 2114/2116, 2150/2108, 2148/2146, 2138/2140, 2136/2134, 및 2128/2126)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 각각 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 22의 항원 결합 도메인(도 22의 2204/2222)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 22의 항원 결합 도메인(도 22의 2218/2220 및 2212/2214의 각각)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 23의 항원 결합 도메인(도 23의 2330/2304)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 23의 항원 결합 도메인(도 23의 2328/2326, 2322/2320, 및 2316/2314의 각각)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 24의 항원 결합 도메인(도 24의 2430/2428 및 2420/2422의 각각)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 24의 항원 결합 도메인(도 24의 2432/2406 및 2418/2416의 각각)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 25의 항원 결합 도메인(도 25의 2532/2506 및 2530/2528의 각각)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 25의 항원 결합 도메인(도 25의 2510/2512 및 2524/2522의 각각)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 26의 항원 결합 도메인(도 26의 2648/2646 및 2634/2636의 각각)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 26의 항원 결합 도메인(도 26의 2612/2614, 2650/2608, 2632/2630, 및 2626/2624의 각각)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 27의 항원 결합 도메인(도 27의 2748/2746 및 2738/2740의 각각)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 27의 항원 결합 도메인(도 27의 2714/2716, 2750/2708, 2736/2734, 및 2728/2726의 각각)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 28의 항원 결합 도메인(도 27의 2850/2808 및 2848/2846의 각각)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 28의 항원 결합 도메인(도 28의 2818/2820, 2812/2814, 2842/2840, 및 2836/2834의 각각)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 29의 항원 결합 도메인(도 29의 2918/2904)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 29의 항원 결합 도메인(도 29의 2914/2912)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 30의 항원 결합 도메인(도 30의 3022/3004 및 3020/3018의 각각)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 30의 항원 결합 도메인(도 30의 3014/3012)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 31의 항원 결합 도메인(도 31의 3122/3104)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 31의 항원 결합 도메인(도 31의 3120/3118)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 31의 항원 결합 도메인(도 31의 3114/3112)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 32의 항원 결합 도메인(도 32의 3226/3204)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 32의 항원 결합 도메인(도 32의 3222/3220 및 3216/3214의 각각)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 33의 항원 결합 도메인(도 33의 3330/3304 및 3328/3326의 각각)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 33의 항원 결합 도메인(도 33의 3322/3320 및 3316/3314의 각각)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 34의 항원 결합 도메인(도 34의 3430/3404)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 34의 항원 결합 도메인(도 34의 3428/3426)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 34의 항원 결합 도메인(도 34의 3422/3420 및 3416/3414의 각각)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 35의 항원 결합 도메인(도 35의 3530/3528 및 3520/3522의 각각)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 35의 항원 결합 도메인(도 35의 3532/3506)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 35의 항원 결합 도메인(도 35의 3518/3516)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 36의 항원 결합 도메인(도 36의 3638/3636 및 3628/3620의 각각)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 36의 항원 결합 도메인(도 36의 3640/3606 및 3626/3624의 각각)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 37의 항원 결합 도메인(도 37의 3748/3746 및 3738/3740의 각각)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 37의 항원 결합 도메인(도 37의 3750/3708 및 3736/3734의 각각)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 37의 항원 결합 도메인(도 37의 3714/3716 및 3728/3726의 각각)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 38의 항원 결합 도메인(도 38의 3832/3806 및 3830/3822의 각각)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 38의 항원 결합 도메인(도 38의 3810/3812)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 38의 항원 결합 도메인(도 38의 3824/3822)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 39의 항원 결합 도메인(도 39의 3938/3936 및 3924/3926의 각각)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 39의 항원 결합 도메인(도 39의 3940/3906 및 3922/3920의 각각)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 40의 항원 결합 도메인(도 40의 4048/4046 및 4034/4036의 각각)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 40의 항원 결합 도메인(도 40의 4050/4008 및 4032/4030의 각각)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 40의 항원 결합 도메인(도 40의 4012/4014 및 4026/4024의 각각)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 41의 항원 결합 도메인(도 41의 4140/4106 및 4138/4136의 각각)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 41의 항원 결합 도메인(도 41의 4112/4114 및 4130/4128의 각각)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 42의 항원 결합 도메인(도 42의 4250/4208 및 4248/4246의 각각)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 42의 항원 결합 도메인(도 42의 4218/4220 및 4236/4234의 각각)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 42의 항원 결합 도메인(도 42의 4212/4214 및 4242/4240의 각각)은 VH 및 VL 서열에 함유된 CDR 서열을 포함할 수 있고, VH 및 VL 서열의 나머지는 표 2에 열거된 항체 중 어느 하나의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일하거나, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 동일하거나, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
IV. 이량체화 선택성 모듈
본 개시 내용에서, 이량체화 선택성 모듈은 Fc 도메인을 형성하는 2개의 Fc 도메인 단량체의 선호되는 페어링을 용이하게 하는 Fc 도메인 단량체 내의 성분 또는 선택 아미노산을 포함한다. 구체적으로, 이량체화 선택성 모듈은 2개의 Fc 도메인 단량체의 상호작용하는 CH3 항체 불변 도메인의 계면에 위치된 아미노산 치환을 포함하는 Fc 도메인 단량체의 CH3 항체 불변 도메인 쌍의 일부이다. 이량체화 선택성 모듈에서, 아미노산 치환은 이들 치환을 위해 선택된 아미노산의 양립성의 결과로서 2개의 CH3 항체 불변 도메인의 단량체화를 유리하게 한다. 선호되는 Fc 도메인의 최종 형성은 이량체화 선택성 모듈이 결여되거나 이량체화 선택성 모듈 내의 비양립성 아미노산 치환을 갖는 Fc 도메인 단량체로부터 형성되는 다른 Fc 도메인에 대해 선택적이다. 이러한 유형의 아미노산 치환은 QuikChange® 돌연변이 유발과 같이 당업계에 잘 알려진 통상적인 분자 클로닝 기술을 사용하여 이루어질 수 있다.
일부 구현예에서, 이량체화 선택성 모듈은 CH3 항체 불변 도메인의(본원에서 추가로 기재된 "홀"의) 유전자 조작 함몰부를 포함한다. 다른 구현예에서, 이량체화 선택성 모듈은 CH3 항체 불변 도메인의(본원에서 추가로 기재된 "노브"의) 유전자 조작 돌출부를 포함한다. Fc 도메인을 선택적으로 형성하기 위해, 양립성 이량체화 선택성 모듈을 갖는 2개의 Fc 도메인 단량체, 예컨대, 유전자 조작 함몰부를 포함하는 하나의 CH3 항체 불변 도메인 및 유전자 조작 돌출부를 포함하는 다른 하나의 CH3 항체 불변 도메인은 결합하여 Fc 도메인 단량체의 돌출부-함몰부(또는 "노브 및 홀") 쌍을 형성한다. 유전자 조작 돌출부 및 유전자 조작 함몰부는 양립성 이종이량체화 선택성 모듈을 갖는 2개의 Fc 도메인 단량체의 유리한 이종이량체화를 촉진하기 위해 Fc 도메인 단량체의 CH3 항체 불변 도메인에서 이루어질 수 있는 이종이량체화 선택성 모듈의 예이다. 적합한 돌연변이가 표 3에 열거된다.
다른 구현예에서, 양전하 아미노산 치환을 포함하는 이량체화 선택성 모듈을 갖는 Fc 도메인 단량체 및 음전하 아미노산 치환을 포함하는 이량체화 선택성 모듈을 갖는 Fc 도메인 단량체는(본원에서 추가로 기재된) 하전 아미노산의 유리한 정전기 스티어링을 통해 선택적으로 결합하여 Fc 도메인을 형성할 수 있으며, 상기 Fc 도메인 단량체를 사용하여 이량체화가 달성된다. 일부 구현예에서, Fc 도메인 단량체는 다음의 양하전 및 음하전 아미노산 치환 중 하나를 포함할 수 있다: K392D, K392E, D399K, K409D, K409E, K439D 및 K439E. 일 실시예에서, 양하전 아미노산 치환, 예를 들어, D356K 또는 E357K를 포함하는 Fc 도메인 단량체와 음하전 아미노산 치환, 예를 들어, K370D 또는 K370E를 포함하는 Fc 도메인 단량체는 하전 아미노산의 유리한 정전기 스티어링을 통해 선택적으로 결합하여 Fc 도메인을 형성할 수 있다. 또 다른 실시예에서, E357K를 포함하는 Fc 도메인 단량체와 K370D를 포함하는 Fc 도메인 단량체는 하전 아미노산의 유리한 정전기 스티어링을 통해 선택적으로 결합하여 Fc 도메인을 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 역전하 아미노산 치환은 이종이량체화 선택성 모듈로 사용될 수 있는데, 상이하지만 양립성인 역전하 아미노산 치환을 포함하는 2개의 Fc 도메인 단량체는 결합하여 이종이량체 Fc 도메인을 형성한다. 이종이량체화를 촉진하기 위한 다양한 역전하 이량체화 선택성 모듈이 표 3에 열거된다.
노브 앤드 홀 돌연변이 및 정전기 스티어링 돌연변이 외에, 이종이량체화를 촉진하기 위해 사용될 수 있는 추가의 유형의 돌연변이가 존재한다. 이러한 돌연변이가 또한 표 3에 열거된다.
다른 구현예에서, 2개의 Fc 도메인 단량체는 CH3 도메인 사이의 계면에서 하전된 잔기의 고리 내의 적어도 2개의 위치에 동일한 역전하 돌연변이를 포함하는 동종이량체화 선택성 모듈을 포함한다. 동종이량체화 선택성 모듈은 Fc 도메인 단량체의 동종이량체화를 촉진하여 동종이량체 Fc 도메인을 형성하는 역전하 아미노산 치환이다. 2개의 Fc 도메인 단량체에서 2개 이상의 상보적인 잔기 쌍의 두 구성원의 전하를 역전시킴으로써, 돌연변이된 Fc 도메인 단량체는 동일한 돌연변이된 서열의 Fc 도메인 단량체에 대한 상보성을 유지하지만, 이러한 돌연변이가 없는 Fc 도메인 단량체에 대해 더 낮은 상보성을 갖는다. 일 구현예에서, Fc 도메인은 이중 돌연변이 K409D/D399K, K392D/D399K, E357K/K370E, D356K/K439D, K409E/D399K, K392E/D399K, E357K/K370D 또는 D356K/K439E를 포함하는 Fc 도메인 단량체를 포함한다. 또 다른 구현예에서, Fc 도메인은 임의의 쌍의 이중 돌연변이, 예를 들어 K409D/D399K/E357K/K370E를 결합하는 4중 돌연변이를 포함하는 Fc 도메인 단량체를 포함한다. 동종이량체화를 촉진하는 다양한 선택성 모듈이 표 4a 및 4b에 열거된다.
추가의 구현예에서, (i) 적어도 하나의 역전하 돌연변이 및 (ii) 적어도 하나의 유전자 조작 함몰부 또는 적어도 하나의 유전자 조작 돌출부를 포함하는 Fc 도메인 단량체는 (i) 적어도 하나의 역전하 돌연변이 및 (ii) 적어도 하나의 유전자 조작 돌출부 또는 적어도 하나의 유전자 조작 함몰부를 포함하는 또 다른 Fc 도메인 단량체와 선택적으로 결합하여 Fc 도메인을 형성할 수 있다. 예를 들어, 역전하 돌연변이 K370D 및 유전자 조작 함몰부 Y349C, T366S, L368A 및 Y407V를 포함하는 Fc 도메인 단량체와 역전하 돌연변이 E357K 및 유전자 조작 돌출부 S354C 및 T366W를 포함하는 또 다른 Fc 도메인 단량체는 선택적으로 결합하여 Fc 도메인을 형성할 수 있다.
이러한 Fc 도메인의 형성은 CH3 항체 불변 도메인의 양립성 아미노산 치환에 의해 촉진된다. 비양립성 아미노산 치환을 포함하는 2개의 이량체화 선택성 모듈, 예를 들어, 둘 모두가 CH3-CH3 계면에서 유전자 조작 함몰부를 포함하는 것, 둘 모두가 유전자 조작 돌출부를 포함하는 것, 또는 둘 모두가 동일한 하전 아미노산을 포함하는 것은 이종이량체 Fc 도메인의 형성을 촉진하지 않을 것이다.
또한, 정의된 Fc 도메인 단량체를 갖는 Fc 도메인의 형성을 촉진하는 데 사용된 다른 방법은 류신 지퍼의 단량체 α-나선을 Fc 도메인 단량체 각각에 C-말단 융합하여 이종이량체의 형성을 가능하게 하는 LUZ-Y 접근법(미국 특허 출원 공개 제WO2011034605호)뿐 아니라, 각각이 IgA 및 IgG CH3 서열의 교차하는 세그먼트를 포함하는 이종이량체 Fc 도메인 단량체를 갖는 Fc 도메인을 생성하는 SEED(strand-exchange engineered domain) 바디 접근법(Davis 등의 문헌[Protein Eng Des Sel. 23:195-202, 2010])을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
V. 유전자 조작 함몰부 및 유전자 조작 돌출부
유전자 조작 함몰부 및 유전자 조작 돌출부(또는 "노브-홀" 전략)는 Carter 및 동료 연구자들에 의해 설명된다(Ridgway 등의 문헌[Protein Eng. 9:617-612, 1996]; Atwell 등의 문헌[J Mol Biol. 270:26-35, 1997]; Merchant 등의 문헌[Nat Biotechnol. 16:677-681, 1998]). 노브-홀의 상호작용은 이종이량체 형성을 유리하게 하는 반면, 노브-노브 및 홀-홀 상호작용은 입체적 충돌 및 유리한 상호작용의 결실로 인해 동종이량체 형성을 저해한다. "노브-홀" 기술은 미국 특허 번호 제5,731,168호에도 개시되어 있다.
본 개시 내용에서, 유전자 조작 함몰부 및 유전자 조작 돌출부는 본원에 기재된 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 제조에 사용된다. 유전자 조작 함몰부는 단백질의 원래의 아미노산이 측쇄 부피가 더 작은 상이한 아미노산으로 대체될 때 생성되는 빈 공간이다. 유전자 조작 돌출부는 단백질의 원래의 아미노산이 측쇄 부피가 더 큰 상이한 아미노산으로 대체될 때 생성되는 돌출이다. 구체적으로, 대체된 아미노산은 Fc 도메인 단량체의 CH3 항체 불변 도메인에 있고 2개의 Fc 도메인 단량체의 이량체화에 관여한다. 일부 구현예에서, 하나의 CH3 항체 불변 도메인의 유전자 조작 함몰부는 또 다른 CH3 항체 불변 도메인의 유전자 조작 돌출부를 수용하도록 생성되어, CH3 항체 불변 도메인 둘 모두는 2개의 Fc 도메인 단량체의 이량체화를 촉진하거나 유리하게 하는 (상술한) 이량체화 선택성 모듈(예컨대, 이종이량체화 선택성 모듈)로서 작용한다. 다른 구현예에서, 하나의 CH3 항체 불변 도메인의 유전자 조작 함몰부는 또 다른 CH3 항체 불변 도메인의 원래의 아미노산을 더 잘 수용하도록 생성된다. 또 다른 구현예에서, 하나의 CH3 항체 불변 도메인의 유전자 조작 돌출부는 또 다른 CH3 항체 불변 도메인의 원래의 아미노산과 추가 상호작용을 형성하도록 생성된다.
유전자 조작 함몰부는 타이로신 또는 트립토판과 같은 더 큰 측쇄를 포함하는 아미노산을 알라닌, 발린 또는 트레오닌과 같은 더 작은 측쇄를 포함하는 아미노산으로 대체함으로써 구성될 수 있다. 구체적으로, (상기에 추가로 기재된) 일부 이량체화 선택성 모듈(예컨대, 이종이량체화 선택성 모듈)은 CH3 항체 불변 도메인에 Y407V 돌연변이와 같은 유전자 조작 함몰부를 포함한다. 유사하게, 유전자 조작 돌출부는 더 작은 측쇄를 포함하는 아미노산을 더 큰 측쇄를 포함하는 아미노산으로 대체함으로써 구성될 수 있다. 구체적으로, (상기에 추가로 기술된) 일부 이량체화 선택성 모듈(예컨대, 이종이량체화 선택성 모듈)은 CH3 항체 불변 도메인에 T366W 돌연변이와 같은 유전자 조작 돌출부를 포함한다. 본 개시 내용에서, 유전자 조작 함몰부 및 유전자 조작 돌출부는 또한 이종이량체 형성을 강화하기 위해 CH3 도메인 간의 이황화 결합 유전자 조작과 결합된다. 일 실시예에서, 유전자 조작 함몰부 Y349C, T366S, L368A 및 Y407V를 포함하는 Fc 도메인 단량체는 유전자 조작 돌출부 S354C 및 T366W를 포함하는 또 다른 Fc 도메인 단량체와 선택적으로 결합하여 Fc 도메인을 형성할 수 있다. 또 다른 실시예에서, Y349C가 첨가된 유전자 조작 함몰부를 포함하는 Fc 도메인 단량체와 S354C가 첨가된 유전자 조작 돌출부를 포함하는 Fc 도메인 단량체는 선택적으로 결합하여 Fc 도메인을 형성할 수 있다. 다른 유전자 조작 함몰부 및 유전자 조작 돌출부, 이황화 결합 유전자 조작 또는 구조 계산(혼합 HA-TF)과 함께 표 3에 제한 없이 포함된다.
상이한 아미노산 잔기를 갖는 CH3 항체 불변 도메인의 원래의 아미노산 잔기를 대체하는 것은 원래의 아미노산 잔기를 암호화하는 핵산을 변경함으로써 달성될 수 있다. 대체될 수 있는 원래의 아미노산 잔기 수의 상한은 계면에서의 충분한 상호작용이 여전히 유지되는 한, CH3 항체 불변 도메인의 계면에서 있는 총 잔기의 수이다.
유전자 조작 함몰부 및 유전자 조작 돌출부와 정전기 스티어링의 조합
전기 스티어링을 노브-홀 기술과 조합하여, 예를 들어, 2개의 상이한 폴리펩티드의 Fc 도메인 단량체 사이의 이종이량체화를 유리하게 할 수 있다. 이후에 보다 자세히 설명되는 정전기 스티어링은 보다 고차 단백질 분자의 형성을 조절하기 위해 펩티드, 단백질 도메인 및 단백질의 반대로 하전된 아미노산 사이의 유리한 정전기 상호작용을 이용하는 것이다. 전기 스티어링을 사용하여 동종이량체화 또는 이종이량체화를 촉진할 수 있으며, 후자는 노브-홀 기술과 유용하게 조합될 수 있다. 이종이량체화의 경우, 상이하지만 양립성인 돌연변이는 이종이량체화되는 각각의 Fc 도메인 단량체에 도입된다. 따라서, Fc 도메인 단량체는 다음의 양전하 및 음전하 아미노산 치환 중 하나를 포함하도록 변형될 수 있다: D356K, D356R, E357K, E357R, K370D, K370E, K392D, K392E, D399K, K409D, K409E, K439D 및 K439E. 예를 들어, 하나의 Fc 도메인 단량체, 예를 들어, 함몰부(Y349C, T366S, L368A 및 Y407V)를 갖는 Fc 도메인 단량체는 K370D 돌연변이를 또한 포함하며, 다른 Fc 도메인 단량체, 예를 들어, 돌출부(S354C 및 T366W)를 갖는 Fc 도메인 단량체는 E357K를 포함할 수 있다.
보다 일반적으로, 임의의 함몰부 돌연변이(또는 돌연변이 조합): Y407T, Y407A, F405A, Y407T, T394S, T394W:Y407A, T366W:T394S, T366S:L368A:Y407V:Y349C 및 S3364H:F405가 표 3의 정전기 스티어링 돌연변이와 조합될 수 있고, 임의의 돌출부 돌연변이(또는 돌연변이 조합): T366Y, T366W, T394W, F405W, T366Y:F405A, T366W:Y407A, T366W:S354C, 및 Y349T:T394F가 표의 정전기 스티어링 돌연변이와 조합될 수 있으며, 이는 함몰부 돌연변이(또는 돌연변이 조합)와 함께 사용되는 표 3의 정전기 스티어링 돌연변이와 페어링된다.
보다 일반적으로, 임의의 함몰부 돌연변이(또는 돌연변이 조합): Y407T, Y407A, F405A, Y407T, T394S, T394W:Y407A, T366W:T394S, T366S:L368A:Y407V:Y349C 및 S3364H:F405가 표 3의 정전기 스티어링 돌연변이와 조합될 수 있고, 임의의 돌출부 돌연변이(또는 돌연변이 조합): T366Y, T366W, T394W, F405W, T366Y:F405A, T366W:Y407A, T366W:S354C 및 Y349T:T394F가 표 3의 정전기 스티어링 돌연변이와 조합될 수 있다.
VI. 정전기 스티어링
정전기 스티어링은 보다 고차 단백질 분자의 형성을 조절하기 위해 펩티드, 단백질 도메인 및 단백질의 반대로 하전된 아미노산 사이의 유리한 정전기 상호작용을 이용하는 것이다. 이중-특이적 항체의 생성에서 이종이량체 형성을 위하여 동종이량체의 형성을 감소시키는 항체 도메인의 상호작용을 변경하는 정전기 스티어링 효과를 이용하는 방법은 미국 특허 출원 공개 제2014-0024111호에 개시되어 있다.
본 개시 내용에서, 정전기 스티어링은 Fc 도메인 단량체의 이량체화 및 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 형성을 제어하는 데 사용된다. 특히, 정전기 스티어링을 사용하는 Fc 도메인 단량체의 이량체화를 제어하기 위하여, CH3-CH3 계면을 구성하는 하나 이상의 아미노산 잔기는 양전하 또는 음전하 아미노산 잔기로 대체되어 도입된 특정 하전 아미노산에 따라 상호작용은 정전기적으로 유리하거나 불리하게 된다. 일부 구현예에서, 계면의 양전하 아미노산, 예를 들어 라이신, 아르기닌 또는 히스티딘은 음전하 아미노산, 예를 들어 아스파르트산 또는 글루탐산으로 대체된다. 다른 구현예에서, 계면의 음전하 아미노산은 양전하 아미노산으로 대체된다. 하전 아미노산은 상호작용하는 CH3 항체 불변 도메인 중 하나 또는 둘 모두에 도입될 수 있다. 하전 아미노산을 상호작용하는 CH3 항체 불변 도메인에 도입함으로써, 하전 아미노산 사이의 상호작용으로 인한 정전기 스티어링 효과에 의해 제어되는 Fc 도메인 단량체의 이량체를 선택적으로 형성할 수 있는 (상기에서 추가로 기재되는) 이량체화 선택성 모듈이 생성된다.
일부 구현예에서, 정전기 스티어링 효과에 의해 제어되어 Fc 도메인 단량체의 이량체를 선택적으로 형성할 수 있는 역전하를 포함하는 이량체화 선택성 모듈을 생성하기 위해, 2개의 Fc 도메인 단량체는 이종이량체화 또는 동종이량체화를 통해 선택적으로 형성될 수 있다.
Fc 도메인 단량체의 이종이량체화
Fc 도메인 단량체의 이종이량체화는 표 3에 포함된 전하 잔기 쌍과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는, 상이하지만 양립성인 돌연변이를 2개의 Fc 도메인 단량체에 도입함으로써 촉진될 수 있다. 일부 구현예에서, Fc 도메인 단량체는 다음의 양하전 및 음하전 아미노산 치환 중 하나를 포함할 수 있다: D356K, D356R, E357K, E357R, K370D, K370E, K392D, K392E, D399K, K409D, K409E, K439D 및 K439E. 일 실시예에서, 양하전 아미노산 치환, 예컨대 D356K 또는 E357K를 포함하는 Fc 도메인 단량체와 음하전 아미노산 치환, 예컨대 K370D 또는 K370E를 포함하는 Fc 도메인 단량체는 하전 아미노산의 유리한 정전기 스티어링을 통해 선택적으로 결합하여 Fc 도메인을 형성할 수 있다. 또 다른 실시예에서, E357K를 포함하는 Fc 도메인 단량체와 K370D를 포함하는 Fc 도메인 단량체는 하전 아미노산의 유리한 정전기 스티어링을 통해 선택적으로 결합하여 Fc 도메인을 형성할 수 있다.
예를 들어, 3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc-항원 결합 도메인 작제물에서, 3개의 Fc 도메인 중 2개는 정전기 스티어링 효과에 의해 촉진되어 2개의 Fc 도메인 단량체의 이종이량체화에 의해 형성될 수 있다. "이종이량체 Fc 도메인"은 2개의 Fc 도메인 단량체의 이종이량체화에 의해 형성되는 Fc 도메인을 지칭하되, 2개의 Fc 도메인 단량체는 이들 2개의 Fc 도메인 단량체의 유리한 형성을 촉진하는 상이한 역전하 돌연변이(이종이량체화 선택성 모듈)(예를 들어, 표 4A 및 4B의 돌연변이 참조)를 포함한다. 3개의 Fc 도메인(하나의 카복시 말단 "줄기" Fc 도메인 및 2개의 아미노 말단 "가지" Fc 도메인)을 갖는 Fc-항원 결합 도메인 작제물에서, 아미노 말단 "가지" Fc 도메인 각각은 이종이량체 Fc 도메인("가지 이종이량체 Fc 도메인"이라고도 불림)(예컨대, 도 1의 Fc 도메인 단량체(106 및 114) 또는 Fc 도메인 단량체(112 및 116)에 의해 형성된 이종이량체 Fc 도메인; 도 2의 Fc 도메인 단량체(206 및 214) 또는 Fc 도메인 단량체(212 및 216)에 의해 형성된 이종이량체 Fc 도메인)일 수 있다. 가지 이종이량체 Fc 도메인은 E357K를 포함하는 Fc 도메인 단량체 및 K370D를 포함하는 또 다른 Fc 도메인 단량체에 의해 형성될 수 있다.
| Fc 이종이량체화 방법 | |||
| 방법 | 돌연변이(사슬 A) | 돌연변이(사슬 B) | 참조 문헌 |
| 노브-인투-홀 (Y-T) | Y407T | T336Y | 미국 특허 # 8,216,805 |
| 노브-인투-홀 | Y407A | T336W | 미국 특허 # 8,216,805 |
| 노브-인투-홀 | F405A | T394W | 미국 특허 # 8,216,805 |
| 노브-인투-홀 | Y407T | T366Y | 미국 특허 # 8,216,805 |
| 노브-인투-홀 | T394S | F405W | 미국 특허 # 8,216,805 |
| 노브-인투-홀 | T394W, Y407T | T366Y, F406A | 미국 특허 # 8,216,805 |
| 노브-인투-홀 | T394S, Y407A | T366W, F405W | 미국 특허 # 8,216,805 |
| 노브-인투-홀 | T366W, T394S | F405W, T407A | 미국 특허 # 8,216,805 |
| 노브-인투-홀 | S354C, T366W | Y349C, T366S, L368A, Y407V | |
| 노브-인투-홀 (CW-CSAV) | Y349C, T366S, L368A, Y407V | S354C, T366W | Zeidler 등의 J Immunol. 163: 1246-52, 1999 |
| HA-TF | S364H, F405A | Y349T, T394F | WO2011028952 |
| 정전기 스티어링 | K409D | D399K | US 2014/0024111 |
| 정전기 스티어링 | K409D | D399R | US 2014/0024111 |
| 정전기 스티어링 | K409E | D399K | US 2014/0024111 |
| 정전기 스티어링 | K409E | D399R | US 2014/0024111 |
| 정전기 스티어링 | K392D | D399K | US 2014/0024111 |
| 정전기 스티어링 | K392D | D399R | US 2014/0024111 |
| 정전기 스티어링 | K392E | D399K | US 2014/0024111 |
| 정전기 스티어링 | K392E | D399R | US 2014/0024111 |
| 정전기 스티어링 (DD-KK) | K392D, K409D | E356K, D399K | Gunasekaran 등의 J Biol Chem. 285: 19637-46, 2010 |
| 정전기 스티어링 | K370E, K409D, K439E | E356K, E357K, D399K | WO 2006/106905 |
| 노브-인투-홀 + 정전기 스티어링 | S354C, E357K, T366W | Y349C, T366S, L368A, K370D, Y407V |
WO 2015/168643 |
| VYAV-VLLW | T350V, L351Y, F405A, Y407V | T350V, T366L, K392L, T394W | Von Kreudenstein 등의 MAbs, 5:646-54, 2013 |
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| EW-RVT | K360E, K409W | Q347R, D399V, F405T | Choi 등의 Mol Cancer Ther, 12:2748-59, 2013 |
| EW-RVTS-S | K360E, K409W, Y349C | Q347R, D399V, F405T, S354C | Choi 등의 Mol Immunol, 65:377-83, 2015 |
| 전하 도입 (DK) | L351D | T366K | De Nardis, J Biol Chem, 292:14706-17, 2017 |
| 전하 도입 (DEKK) | L351D, L368E | L351K, T366K | De Nardis, J Biol Chem, 292:14706-17, 2017 |
| L-R | F405L | K409R | Labrijn 등의 Proc Natl Acad Sci USA, 110:5145-50, 2013 |
| IgG/A 키메라 | IgG/A 키메라 | Davis 등의 Protein Eng Des Sel, 23:195-202, 2010 | |
| S364K, T366V, K370T, K392Y, F405S, Y407V, K409W, T411N | Q347E, Y349A, L351F, S364T, T366V, K370T, T394D, V397L, D399E, F405A, Y407S, K409R, T411R | Skegro 등의 J Biol Chem, 292:9745-59, 2017 | |
| S364K, T366V, K370T, K392Y, K409W, T411N | F405A, Y407S | Skegro 등의 J Biol Chem, 292:9745-59, 2017 | |
| Q347A, S364K, T366V, K370T, K392Y, F405S, Y407V, K409W, T411N | Q347E, Y349A, L351F, S364T, T366V, K370T, T394D, V397L, D399E, F405A, Y407S, K409R, T411R | Skegro 등의 J Biol Chem, 292:9745-59, 2017 | |
| BEAT (A/B - T) | S364K, T366V, K370T, K392Y, F405S, Y407V, K409W, T411N | Q347E, Y349A, L351F, S364T, T366V, K370T, T394D, V397L, D399E, F405A, Y407S, K409R | Skegro 등의 J Biol Chem, 292:9745-59, 2017 |
| DMA-RRVV | K360D, D399M, Y407A | E345R, Q347R, T366V, K409V | Leaver-Fay 등의 Structure, 24:641-51, 2016 |
| SYMV-GDQA | Y349S, K370Y, T366M, K409V | E356G, E357D, S364Q, Y407A | Leaver-Fay 등의 Structure, 24:641-51, 2016 |
| 정전기 스티어링 | K370D | E357K | |
| 정전기 스티어링 | K370D | E357R | |
| 정전기 스티어링 | K370E | E357K | |
| 정전기 스티어링 | K370E | E357R | |
| 정전기 스티어링 | K370D | D356K | |
| 정전기 스티어링 | K370D | D356R | |
| 정전기 스티어링 | K370E | D356K | |
| 정전기 스티어링 | K370E | D356R | |
주: 모든 잔기는 EU 넘버링 체계에 따라 넘버링됨(문헌[Edelmet al, Proc Natl Acad Sci USA, 63:78-85, 1969])
Fc 도메인 단량체의 동종이량체화
Fc 도메인 단량체의 동종이량체화는 동일한 정전기 스티어링 돌연변이(동종이량체화 선택성 모듈)를 Fc 도메인 단량체 둘 모두에 대칭 방식으로 도입함으로써 촉진될 수 있다. 일부 구현예에서, 2개의 Fc 도메인 단량체는 CH3 도메인 사이의 계면에서 하전된 잔기의 고리 내의 적어도 2개의 위치에 동일한 역전하 돌연변이를 포함하는 동종이량체화 선택성 모듈을 포함한다. 2개의 Fc 도메인 단량체에서 2개 이상의 상보적인 잔기 쌍의 두 구성원의 전하를 역전시킴으로써, 돌연변이된 Fc 도메인 단량체는 동일한 돌연변이된 서열의 Fc 도메인 단량체에 대한 상보성을 유지하지만, 이러한 돌연변이가 없는 Fc 도메인 단량체에 대해 더 낮은 상보성을 갖는다. Fc 도메인 단량체 내에 도입되어 이의 동종이량체화를 촉진할 수 있는 정전기 스티어링 돌연변이는 표 4a 및 4b에 제한 없이 나타나 있다. 일 구현예에서, Fc 도메인은 이중 역전하 돌연변이(표 4a 및 4b), 예를 들어, K409D/D399K를 각각 포함하는 2개의 Fc 도메인 단량체를 포함한다. 또 다른 구현예에서, Fc 도메인은 사중 역전하 돌연변이(표 4a 및 4b), 예를 들어, K409D/D399K/K370D/E357K를 각각 포함하는 2개의 Fc 도메인 단량체를 포함한다.
예를 들어, 3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc-항원 결합 도메인 작제물에서, 3개의 Fc 도메인 중 1개는 정전기 스티어링 효과에 의해 촉진되어 2개의 Fc 도메인 단량체의 동종이량체화에 의해 형성될 수 있다. "동종이량체 Fc 도메인"은 2개의 Fc 도메인 단량체의 동종이량체화에 의해 형성되는 Fc 도메인을 지칭하되, 2개의 Fc 도메인 단량체는 동일한 역전하 돌연변이(예를 들어, 표 5 및 표 6의 돌연변이 참조)를 포함한다. 3개의 Fc 도메인(하나의 카복실 말단 "줄기" Fc 도메인 및 2개의 아미노 말단 "분지" Fc 도메인)을 갖는 Fc-항원 결합 도메인 작제물에서, 카복시 말단 "줄기" Fc 도메인은 동종이량체 Fc 도메인(또한 "줄기 동종이량체 Fc 도메인"으로도 불림)일 수 있다. 줄기 동종이량체 Fc 도메인은, 각각 이중 돌연변이 K409D/D399K를 포함하는 2개의 Fc 도메인 단량체에 의해 형성될 수 있다.
[표 4a]
[표 4b]
VII. 링커
본 개시에서, 링커는 폴리펩티드 또는 단백질 도메인 및/또는 회합된 비단백질 모이어티 간의 결합 또는 연결을 기술하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 링커는 적어도 2개의 Fc 도메인 단량체 사이의 결합 또는 연결이고, 이 경우 링커는 제1 Fc 도메인 단량체의 CH3 항체 불변 도메인의 C-말단을 제2 Fc 도메인 단량체의 힌지 도메인의 N-말단에 연결하여, 2개의 Fc 도메인 단량체가 직렬로 서로 연결된다. 다른 구현예에서, 링커는 Fc 도메인 단량체와 이에 부착되는 임의의 다른 단백질 도메인 사이의 결합이다. 예를 들어, 링커는 Fc 도메인 단량체의 CH3 항체 불변 도메인의 C-말단을 알부민-결합 펩티드의 N-말단에 부착시킬 수 있다.
링커는 펩티드 결합과 같은 단순 공유 결합, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 중합체와 같은 합성 중합체이거나, 화학적 접합과 같이 화학 반응으로 생성된 임의의 종류의 결합일 수 있다. 링커가 펩티드 결합인 경우, 하나의 단백질 도메인의 C-말단의 카복실산 기는 펩티드 결합을 형성하는 축합 반응에서 또 다른 단백질 도메인의 N-말단에서 아미노 기와 반응할 수 있다. 구체적으로, 펩티드 결합은 당업계에 잘 알려진 통상의 유기 화학 반응을 통한 합성 수단으로 형성될 수 있거나, 숙주 세포에서의 천연 생성에 의해 형성될 수 있으며, 두 단백질 모두의 DNA 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, 예컨대, 직렬 연결의 2개의 Fc 도메인 단량체는 필수 분자 기구, 예컨대, 숙주 세포의 DNA 중합효소 및 리보솜에 의해 두 단백질 모두를 암호화하는 인접 폴리펩티드로 직접 전사 및 번역될 수 있다.
링커가 합성 중합체, 예컨대 PEG 중합체인 경우, 중합체는 각 말단에서 반응성 화학 작용기로 작용화되어, 두 단백질의 연결 말단에서 말단 아미노산과 반응할 수 있다.
(전술한 펩티드 결합을 제외하고) 링커가 화학 반응으로 만들어지는 경우, 화학 작용기, 예컨대 아민, 카복실산, 에스테르, 아지드, 또는 당업계에서 통상 사용되는 기타 작용기는 하나의 단백질의 C-말단 및 또 다른 단백질의 N-말단에 각각 합성되어 부착될 수 있다. 이어서, 두 작용기는 화학 결합을 형성하는 합성 화학 수단을 통해 반응하여, 2개의 단백질을 함께 연결할 수 있다. 이러한 화학적 접합 절차는 당업자에게 통상적인 것이다.
스페이서
본 개시 내용에서, 2개의 Fc 도메인 단량체 사이의 링커는 3~200개의 아미노산(예를 들어, 3~200개, 3~180개, 3~160개, 3~140개, 3~120개, 3~100개, 3~90개, 3~80개, 3~70개, 3~60개, 3~50개, 3~45개, 3~40개, 3~35개, 3~30개, 3~25개, 3~20개, 3~15개, 3~10개, 3~9개, 3~8개, 3~7개, 3~6개, 3~5개, 3~4개, 4~200개, 5~200개, 6~200개, 7~200개, 8~200개, 9~200개, 10~200개, 15~200개, 20~200개, 25~200개, 30~200개, 35~200개, 40~200개, 45~200개, 50~200개, 60~200개, 70~200개, 80~200개, 90~200개, 100~200개, 120~200개, 140~200개, 160~200개 또는 180~200개의 아미노산)을 포함하는 아미노산 스페이서일 수 있다. 일부 구현예에서, 2개의 Fc 도메인 단량체 사이의 링커는 적어도 12개의 아미노산, 예컨대 12~200개의 아미노산(예를 들어, 12~200개, 12~180개, 12~160개, 12~140개, 12~120개, 12~100개, 12~90개, 12~80개, 12~70개, 12~60개, 12~50개, 12~40개, 12~30개, 12~20개, 12~19개, 12~18개, 12~17개, 12~16개, 12~15개, 12~14개, 또는 12~13개의 아미노산) (예컨대, 14~200개, 16~200개, 18~200개, 20~200개, 30~200개, 40~200개, 50~200개, 60~200개, 70~200개, 80~200개, 90~200개, 100~200개, 120~200개, 140~200개, 160~200개, 180~200개 또는 190~200개의 아미노산)을 포함하는 아미노산 스페이서이다. 일부 구현예에서, 2개의 Fc 도메인 단량체 사이의 링커는 12~30개의 아미노산(예를 들어, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 아미노산)을 포함하는 아미노산 스페이서이다. 적합한 펩티드 스페이서는 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 글리신 및 세린과 같은 가요성 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드 링커를 포함한다. 특정 구현예에서, 스페이서는 모티프, 예컨대 GS, GGS, GGGGS(서열 번호 1), GGSG(서열 번호 2) 또는 SGGG(서열 번호 3)의 다중 모티프 또는 반복 모티프를 함유할 수 있다. 특정 구현예에서, 스페이서는 GS, 예컨대, GS, GSGS(서열 번호 4), GSGSGS(서열 번호 5), GSGSGSGS(서열 번호 6), GSGSGSGSGS(서열 번호 7), 또는 GSGSGSGSGSGS(서열 번호 8)의 모티프를 포함하는 2 내지 12개의 아미노산을 함유할 수 있다. 특정 다른 구현예에서, 스페이서는 GGS, 예컨대, GGS, GGSGGS(서열 번호 9), GGSGGSGGS(서열 번호 10) 및 GGSGGSGGSGGS(서열 번호 11)의 모티프를 포함하는 3 내지 12개의 아미노산을 함유할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 스페이서는 GGSG(서열번호 2), 예컨대, GGSGGGSG(서열번호 12), GGSGGGSGGGSG(서열번호 13), GGSGGGSGGGSGGGSG(서열번호 14) 또는 GGSGGGSGGGSGGGSGGGSG(서열번호 15)의 모티프를 포함하는 4 내지 20개의 아미노산을 함유할 수 있다. 다른 구현예에서, 스페이서는 GGGGS(서열번호 1), 예컨대, GGGGSGGGGS(서열번호 16) 또는GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 17)의 모티프를 함유할 수 있다. 특정 구현예에서, 스페이서는 SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG(서열번호 18)이다.
일부 구현예에서, 2개의 Fc 도메인 단량체 사이의 스페이서는 글리신 잔기만, 예컨대, 적어도 4개의 글리신 잔기(예컨대, 4~200개, 4~180개, 4~160개, 4~140개, 4~40개, 4~100개, 4~90개, 4~80개, 4~70개, 4~60개, 4~50개, 4~40개, 4~30개, 4~20개, 4~19개, 4~18개, 4~17개, 4~16개, 4~15개, 4~14개, 4~13개, 4~12개, 4~11개, 4~10개, 4~9개, 4~8개, 4~7개, 4~6개 또는 4~5개의 글리신 잔기) (예컨대, 4~200개, 6~200개, 8~200개, 10~200개, 12~200개, 14~200개, 16~200개, 18~200개, 20~200개, 30~200개, 40~200개, 50~200개, 60~200개, 70~200개, 80~200개, 90~200개, 100~200개, 120~200개, 140~200개, 160~200개, 180~200개 또는 190~200개의 글리신 잔기)를 포함한다. 특정 구현예에서, 스페이서는 4~30개의 글리신 잔기(예컨대, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 글리신 잔기)를 갖는다. 일부 구현예에서, 글리신 잔기만 포함하는 스페이서는 글리코실화되지 않을 수 있거나(예컨대, O-연결 글리코실화(O-linked glycosylation), O-글리코실화라고도 지칭됨), 예컨대 하나 이상의 세린 잔기(예컨대, SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG(서열번호 18))를 포함하는 스페이서와 비교하여 글리코실화 수준이 감소(예컨대, O-글리코실화 수준의 감소)(예컨대, 크실로스, 만노스, 시알산, 푸코스(Fuc) 및/또는 갈락토스(Gal)(예컨대, 크실로스)와 같은 글리칸을 갖는 O-글리코실화 수준의 감소)될 수 있다.
일부 구현예에서, 글리신 잔기만 포함하는 스페이서는 O-글리코실화(예컨대, O-자일로실화)되지 않을 수 있거나, 예를 들어 하나 이상의 세린 잔기(예컨대, SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG(서열번호 18))를 포함하는 스페이서와 비교하여 O-글리코실화 수준이 감소될 수 있다(예컨대, O-자일로실화 수준의 감소).
일부 구현예에서, 글리신 잔기만 포함하는 스페이서는 단백질 분해를 겪지 않을 수 있거나 예컨대, 하나 이상의 세린 잔기(예컨대, SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG(서열번호 18))를 포함하는 스페이서와 비교하여 단백질 분해율이 감소될 수 있다.
특정 구현예에서, 스페이서는 GGGG(서열 번호 19), 예컨대, GGGGGGGG(서열 번호 20), GGGGGGGGGGGG(서열 번호 21), GGGGGGGGGGGGGGGG(서열 번호 22), 또는 GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG(서열 번호 23)의 모티프를 함유할 수 있다. 특정 구현예에서, 스페이서는 GGGGG(서열번호 24), 예컨대, GGGGGGGGGG(서열번호 25) 또는GGGGGGGGGGGGGGG(서열번호 26)의 모티프를 함유할 수 있다. 특정 구현예에서, 스페이서는 GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG(서열 번호 27)이다.
다른 구현예에서, 스페이서는 글리신 및 세린 외의 아미노산, 예를 들어 GENLYFQSGG(서열번호 28), SACYCELS(서열번호 29), RSIAT(서열번호 30), RPACKIPNDLKQKVMNH(서열번호 31), GGSAGGSGSGSSGGSSGASGTGTAGGTGSGSGTGSG(서열번호 32), AAANSSIDLISVPVDSR(서열번호 33), 또는 GGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGS(서열번호 34)를 또한 함유할 수 있다.
본 개시의 특정 구현예에서, 12- 또는 20-아미노산 펩티드 스페이서는 2개의 Fc 도메인 단량체를 직렬로 연결하는 데 사용되며, 12- 및 20-아미노산 펩티드 스페이서는 각각 서열 GGGSGGGSGGGS(서열 번호 35) 및 SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG(서열 번호 18)로 이루어진다. 다른 구현예에서, 서열 GGSGGGSGGGSGGGSGGS(서열번호 36)로 이루어진 18-아미노산 펩티드 스페이서가 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 2개의 Fc 도메인 단량체 사이의 스페이서는 상술한 서열번호 1~36 중 어느 하나의 서열에 적어도 75% 동일한(적어도 77%, 79%, 81%, 83%, 85%, 87%, 89%, 91%, 93%, 95%, 97%, 99% 또는 99.5% 동일한) 서열을 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 2개의 Fc 도메인 단량체 사이의 스페이서는 상술한 서열번호 17, 18, 26 및 27 중 어느 하나의 서열에 적어도 80% 동일한(적어도 82%, 85%, 87%, 90%, 92%, 95%, 97%, 99% 또는 99.5% 동일한) 서열을 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 2개의 Fc 도메인 단량체 사이의 스페이서는 상술한 서열번호 18 또는 27 중 어느 하나의 서열에 적어도 80% 동일한(적어도 82%, 85%, 87%, 90%, 92%, 95%, 97%, 99% 또는 99.5% 동일한) 서열을 가질 수 있다.
특정 구현예에서, Fc 도메인 단량체의 힌지의 아미노 말단과 동일한 폴리펩티드에 있는 Fc 단량체의 카복시 말단 사이의 링커(즉, 제1 Fc 도메인 단량체의 CH3 항체 불변 도메인의 C-말단을 제2 Fc 도메인 단량체의 힌지 도메인의 N-말단에 연결하여, 2개의 Fc 도메인 단량체가 서로 직렬이 되도록 연결하는 링커)는 공유 결합이 아닌 3개 이상의 아미노산(예를 들어, 3~200개의 아미노산(예를 들어, 3~200, 3~180, 3~160, 3~140, 3~120, 3~100, 3~90, 3~80, 3~70, 3~60, 3~50, 3~45, 3~40, 3~35, 3~30, 3~25, 3~20, 3~15, 3~10, 3~9, 3~8, 3~7, 3~6, 3~5, 3~4, 4~200, 5~200, 6~200, 7~200, 8~200, 9~200, 10~200, 15~200, 20~200, 25~200, 30~200, 35~200, 40~200, 45~200, 50~200, 60~200, 70~200, 80~200, 90~200, 100~200, 120~200, 140~200, 160~200 또는 180~200개의 아미노산)을 갖는 스페이서, 또는 적어도 12개의 아미노산, 예컨대 12~200개의 아미노산(예를 들어, 12~200, 12~180, 12~160, 12~140, 12~120, 12~100, 12~90, 12~80, 12~70, 12~60, 12~50, 12~40, 12~30, 12~20, 12~19, 12~18, 12~17, 12~16, 12~15, 12~14 또는 12~13개의 아미노산)(예를 들어, 14~200, 16~200, 18~200, 20~200, 30~200, 40~200, 50~200, 60~200, 70~200, 80~200, 90~200, 100~200, 120~200, 140~200, 160~200, 180~200 또는 190~200개의 아미노산))을 포함하는 아미노산 스페이서이다.
스페이서는 또한, Fc 도메인 단량체의 힌지 도메인의 N-말단과 CD38 결합 도메인(예를 들어, CD38 중쇄 결합 도메인의 CH1 도메인 또는 CD38 경쇄 결합 도메인의 CL 도메인)의 카복시 말단 사이에 존재할 수 있어, 도메인들이 3개 이상 아미노산의 스페이서(예컨대, 3~200개의 아미노산(예를 들어, 3~200, 3~180, 3~160, 3~140, 3~120, 3~100, 3~90, 3~80, 3~70, 3~60, 3~50, 3~45, 3~40, 3~35, 3~30, 3~25, 3~20, 3~15, 3~10, 3~9, 3~8, 3~7, 3~6, 3~5, 3~4, 4~200, 5~200, 6~200, 7~200, 8~200, 9~200, 10~200, 15~200, 20~200, 25~200, 30~200, 35~200, 40~200, 45~200, 50~200, 60~200, 70~200, 80~200, 90~200, 100~200, 120~200, 140~200, 160~200, 또는 180~200개의 아미노산) 또는 적어도 12개의 아미노산, 예컨대 12~200개의 아미노산(예를 들어, 12~200, 12~180, 12~160, 12~140, 12~120, 12~100, 12~90, 12~80, 12~70, 12~60, 12~50, 12~40, 12~30, 12~20, 12~19, 12~18, 12~17, 12~16, 12~15, 12~14, 또는 12~13개의 아미노산)(예를 들어, 14~200, 16~200, 18~200, 20~200, 30~200, 40~200, 50~200, 60~200, 70~200, 80~200, 90~200, 100~200, 120~200, 140~200, 160~200, 180~200, 또는 190~200개의 아미노산을 포함하는 아미노산 스페이서))에 의해 연결되도록 한다.
VIII. 혈청 단백질-결합 펩티드
혈청 단백질 펩티드에 대한 결합은 단백질 의약품의 약동학을 개선할 수 있으며, 특히 본원에 기재된 Fc-항원 결합 도메인 작제물은 혈청 단백질-결합 펩티드와 융합될 수 있다.
일례로, 본원에 기재된 방법 및 조성물에서 사용될 수 있는 알부민-결합 펩티드는 당업계에 일반적으로 알려져 있다. 일 구현예에서, 알부민 결합 펩티드는 서열 DICLPRWGCLW(서열 번호 37)을 포함한다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 펩티드는 서열 번호 37의 서열과 적어도 80% 동일한(예를 들어, 80%, 90% 또는 100% 동일한) 서열을 갖는다.
본 발명에서, 알부민-결합 펩티드는 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 특정 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 부착될 수 있다. 일 구현예에서, 알부민-결합 펩티드는 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc 작제물의 하나 이상의 폴리펩티드의 C-말단에 부착될 수 있다. 다른 구현예에서, 알부민-결합 펩티드는 항원 결합 도메인을 포함하는 Fc 작제물에서 직렬로 연결된 2개의 Fc 도메인 단량체를 암호화하는 폴리펩티드의 C-말단에 융합될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 알부민-결합 펩티드는 직렬연결로 연결된 2개의 Fc 도메인 단량체를 인코딩하는 폴리펩티드의 제2 Fc 도메인 단량체에 접합되는 Fc 도메인 단량체의 C-말단(예컨대, 도 1의 폴리펩티드(114 및 116)와 도 2의 폴리펩티드(214 및 216))에 부착될 수 있다. 알부민-결합 펩티드는 Fc-항원 결합 도메인 작제물에 유전적으로 융합될 수 있거나, 또는 Fc-항원 결합 도메인 작제물에 화학적 수단, 예컨대, 화학적 접합을 통해 부착될 수 있다. 원하는 경우, 스페이서는 Fc-항원 결합 도메인 작제물과 알부민-결합 펩티드 사이에 삽입될 수 있다. 이론에 구속되지 않고, 본 개시 내용의 Fc-항원 결합 도메인 작제물에 알부민-결합 펩티드를 포함시키면 혈청 알부민에 대한 이의 결합을 통해 치료 단백질을 장기간 유지할 수 있을 것으로 예상된다.
IX. Fc-항원 결합 도메인 작제물
일반적으로, 본 발명은 2~10개의 Fc 도메인 및 하나 이상의 부착된 항원 결합 도메인을 갖는 Fc-항원 결합 도메인 작제물을 특징으로 한다. 이들은 Fc 수용체, 예컨대 FcγRIIIa에 대한 단일 야생형 Fc 도메인보다 더 큰 결합 친화도 및/또는 친화력을 가질 수 있다. 본 개시는 Fc 도메인의 2개의 Fc 도메인 단량체가 서로 선택적으로 이량체를 형성하여, 원치 않는 다량체 또는 응집체의 형성을 방지하도록 2개의 상호작용하는 CH3 항체 불변 도메인의 계면에서 아미노산을 유전자 조작하는 방법을 개시한다. Fc-항원 결합 도메인 작제물은 Fc 도메인 단량체의 각각의 쌍이 Fc 도메인을 형성하는 짝수의 Fc 도메인 단량체를 포함한다. Fc-항원 결합 도메인 작제물은 4개의 Fc 도메인 단량체의 이량체 및 1개의 항원 결합 도메인으로 형성된 최소 2개의 작용성 Fc 도메인을 포함한다. 항원 결합 도메인은, 예를 들어 링커, 스페이서, 펩티드 결합, 화학 결합, 또는 화학 모이어티를 사용하여 Fc 도메인에 연결될 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물은 여러 가지 방식으로 조립될 수 있다. Fc-항원 결합 도메인 작제물은 비대칭 직렬 Fc 도메인으로부터 조립될 수 있다(도 1~도 6). Fc-항원 결합 도메인 작제물은 단일 분지형 Fc 도메인으로부터 조립될 수 있으며, 분지점은 N-말단 Fc 도메인에 있다(도 7~도 12). Fc-항원 결합 도메인 작제물은 단일 분지형 Fc 도메인으로부터 조립될 수 있으며, 분지점은 C-말단 Fc 도메인에 있다(도 13~도 18). Fc-항원 결합 도메인 작제물은 N-말단 또는 C-말단 Fc 도메인에 없는 단일 분지형 Fc 도메인으로부터 조립될 수 있다(도 19~도 21). Fc-항원 결합 도메인 작제물은 상이한 항원 결합 도메인 서열을 갖는 장쇄 및 단쇄를 사용하여 이중 특이적 작제물을 형성하도록 조립될 수 있다(도 22~도 28). Fc-항원 결합 도메인 작제물은 상이한 세트의 이종이량체화 돌연변이(도 19~도 42) 및 상이한 항원 결합 도메인을 갖는 사슬을 사용하여 이중 특이적 및 삼중 특이적 작제물을 형성하도록 조립될 수 있다. 이중 특이적 Fc-항원 결합 도메인 작제물은 2개의 상이한 항원 결합 도메인을 포함한다. 삼중 특이적 Fc-항원 결합 도메인 작제물은 3개의 상이한 항원 결합 도메인을 포함한다.
항원 결합 도메인은 다양한 방식으로 Fc-항원 결합 도메인 작제물에 연결될 수 있다. 항원 결합 도메인은 Fc 사슬의 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 항원의 중쇄 성분은 Fc 사슬의 융합 단백질로서 발현될 수 있고, 경쇄 성분은 별도의 폴리펩티드로서 발현될 수 있다(도 50, 패널 A). 일부 구현예에서, scFv는 항원 결합 도메인으로서 사용된다. scFv는 Fc 장쇄의 융합 단백질로서 발현될 수 있다(도 50, 패널 B). 일부 구현예에서, 중쇄 및 경쇄 성분은 개별적으로 발현되고 Fc-항원 결합 도메인 작제물에 외인성으로 첨가된다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 개별적으로 발현되어, 나중에 화학 결합으로 Fc-항원 결합 도메인 작제물에 연결된다(도 50, 패널 C).
일부 구현예에서, Fc-항원 결합 도메인 작제물의 하나 이상의 Fc 폴리펩티드는 C-말단 라이신 잔기가 결여되어 있다. 일부 구현예에서, Fc-항원 결합 도메인 작제물의 모든 Fc 폴리펩티드는 C-말단 라이신 잔기가 결여되어 있다. 일부 구현예에서, Fc-항원 결합 도메인 작제물의 하나 이상의 Fc 폴리펩티드에서 C-말단 라이신의 부재는 Fc-항원 결합 도메인 작제물(예컨대, 3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc-항원 결합 도메인 작제물)의 집단, 예컨대, 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 균질한 3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 집단의 균질성을 개선할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 Fc-항원 결합 도메인 작제물 내의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 또는 제6 폴리펩티드(예를 들어, 도 1의 폴리펩티드(102, 112, 및 114), 도 2의 폴리펩티드(202, 214, 216, 및 218), 도 3의 폴리펩티드(302, 320, 및 322), 도 4의 폴리펩티드(402, 428, 430, 및 432), 도 5의 폴리펩티드(502, 524, 및 526), 도 6의 폴리펩티드(602, 632, 634, 및 636), 도 7의 폴리펩티드(702, 708, 722, 및 724), 도 8의 폴리펩티드(802, 804, 826, 및 828), 도 9의 폴리펩티드(902, 904, 934, 및 936), 도 10의 폴리펩티드(1002, 1010, 1012, 1024, 1026, 및 1032), 도 11의 폴리펩티드(1102, 1104, 1106, 1144, 1146, 및 1148), 도 12의 폴리펩티드(1202, 1204, 1206, 1252, 1254, 및 1256), 도 13의 폴리펩티드(1302, 1306 1320, 및 1324), 도 14의 폴리펩티드(1402, 1404, 1426, 및 1428), 도 15의 폴리펩티드(1502, 1504, 1534, 및 1536), 도 16의 폴리펩티드(1602, 1606, 1608, 1626, 1628, 및 1632), 도 17의 폴리펩티드(1702, 1704, 1706, 1744, 1746, 및 1748), 도 18의 폴리펩티드(1802, 1804, 1806, 1852, 1854, 및 1856), 도 19의 폴리펩티드(1902, 1906, 1910, 1924, 1928, 및 1932), 도 20의 폴리펩티드(2002, 2004, 2006, 2044, 2046, 및 2048), 도 21의 폴리펩티드(2102, 2104, 2106, 2152, 2154, 및 2156), 도 22의 폴리펩티드(2202, 2222, 및 2224), 도 23은 폴리펩티드(2302, 2332, 2334, 및 2336), 도 24의 폴리펩티드(2402, 2404, 2434, 및 2436), 도 25의 폴리펩티드(2502, 2504, 2534, 및 2536), 도 26의 폴리펩티드(2602, 2604, 2606, 2652, 2654, 및 2656), 도 27의 폴리펩티드(2702, 2704, 2706, 2752, 2754, 및 2756), 도 28의 폴리펩티드(2802, 2804, 2806, 2852, 2854, 및 2856), 도 29의 폴리펩티드(2902, 2916, 및 2920), 도 30의 폴리펩티드(3002, 3024, 및 3026), 도 31의 폴리펩티드(3102, 312, 및 3126), 도 32의 폴리펩티드(3202, 3224, 3228, 및 3230), 도 33의 폴리펩티드(3302, 3332, 3334, 및 3336), 도 34의 폴리펩티드(3402, 3432, 3434, 및 3436), 도 35의 폴리펩티드(3502, 3504, 3534, 및 3536), 도 36의 폴리펩티드(3602, 3604, 3612, 3618, 3642, 및 3644), 도 37의 폴리펩티드(3702, 3704, 3706, 3752, 3754, 및 3756), 도 38의 폴리펩티드(3802, 3804, 3834, 및 3836), 도 39의 폴리펩티드(3902, 3904, 3910, 3916, 3942, 및 3944), 도 40의 폴리펩티드(4002, 4004, 4006, 4052, 4054, 및 4056), 도 41의 폴리펩티드(4102, 4104, 4110, 4132, 4142, 및 4144), 도 42의 폴리펩티드(4202, 4204, 4206, 4252, 4254, 및 4256) 중 하나 이상의 N-말단 Asp는 Gln으로 돌연변이될 수 있다.
본원의 실시예에 기재된 예시적인 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 경우, Fc-항원 결합 도메인 작제물 1~28은 노브 및 홀 서브유닛에 각각 E357K 및 K370D 전하 쌍을 포함할 수 있다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 29~42는 E357K 및 K370D 쌍을 포함할 수 있는 직교 정전기 스티어링 돌연변이를 사용할 수 있으며, 또한 추가 스티어링 돌연변이를 포함할 수 있다. 직교 노브 및 홀을 갖는 Fc-항원 결합 작제물 29~42의 경우, 정전기 스티어링 돌연변이가 직교 쌍 중 하나를 제외하고 모두 필요하며, 모든 직교 쌍에 포함될 수 있다.
일부 구현예에서, 2개의 직교 노브 및 홀이 필요한 경우, 노브1에 대한 정전기 스티어링 변형은 E357K이고 홀1에 대한 정전기 스티어링 변형은 K370D일 수 있으며, 노브2에 대한 정전기 스티어링 변형은 K370D이고 홀2에 대한 정전기 스티어링 변형은 E357K일 수 있다. 제3 직교 노브 및 홀이 필요한 경우(예를 들어, 삼중 특이적 항체의 경우), 정전기 스티어링 변형 E357K 및 D399K가 노브3에 대해 첨가될 수 있고 정전기 스티어링 변형 K370D 및 K409D가 홀3에 대해 첨가될 수 있거나, 또는 정전기 스티어링 변형 K370D 및 K409D가 노브3에 대해 첨가될 수 있고 정전기 스티어링 변형 E357K 및 D399K가 홀3에 대해 첨가될 수 있다.
본원에 기재된 예시적인 Fc-항원 결합 도메인 작제물(예를 들어, Fc-항원 결합 도메인 작제물 1~42) 중 어느 하나는 단일 Fc 도메인 및 항원 결합 도메인을 갖는 작제물에 비해 항체 의존성 세포독성(ADCC) 검정, 항체 의존성 세포 식균작용(ADCP), 및/또는 보체 의존성 세포독성(CDC) 검정에서 강화된 효과기 기능을 가질 수 있거나, 단일 Fc 도메인 및 항원 결합 도메인을 갖는 작제물에 의해 나타나지 않는 생물학적 활성을 포함할 수 있다.
X. 숙주 세포 및 단백질 생산
본 개시에서, 숙주 세포는 본원에 기재된 폴리펩티드 및 작제물을 이의 상응하는 핵산으로부터 발현하는 데 필요한 필수 세포 성분, 예컨대, 세포 기관을 포함하는 비히클을 지칭한다. 핵산은 당업계에 공지된 종래 기술(형질전환, 형질감염, 전기 천공법, 인산칼슘 침전, 직접 미세현미주입 등)에 의해 숙주 세포에 도입될 수 있는 핵산 벡터에 포함될 수 있다. 숙주 세포는 포유류, 세균, 진균 또는 곤충 기원 중 하나일 수 있다. 포유류 숙주 세포는 CHO(또는 CHO-유래 세포주, 예컨대, CHO-K1, CHO-DXB11 CHO-DG44), 쥐 숙주 세포(예컨대, NS0, Sp2/0), VERY, HEK(예컨대, HEK293), BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT20 및 T47D, CRL7O3O 및 HsS78Bst 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 단백질 작제물의 발현을 조절하거나, 원하는 특정 방식으로 단백질 산물을 변형하고 처리하는 숙주 세포가 또한 선택될 수 있다. 상이한 숙주 세포는 단백질 산물의 번역 후 처리 및 변형을 위한 특징과 특정 메커니즘을 갖는다. 발현된 단백질의 올바른 변형 및 처리를 보장하기 위해 적절한 세포주 또는 숙주 시스템이 선택될 수 있다.
상응하는 DNA 플라스미드 작제물에서 단백질 산물의 발현 및 분비를 위해, 숙주 세포는 프로모터, 인핸서, 서열, 전사 종결자, 폴리아데닐화 부위 및 선별 마커를 포함하여, 당업계에 알려진 적절한 발현 조절 요소에 의해 조절된 DNA로 형질 감염되거나 형질 전환될 수 있다. 치료 단백질의 발현 방법이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, Paulina Balbas, Argelia Lorence (eds.)의 문헌[Recombinant Gene Expression: Reviews and Protocols (Methods in Molecular Biology), Humana Press; 2nd ed. 2004 edition (July 20, 2004)]; Vladimir Voynov 및 Justin A. Caravella (eds.)의 문헌[Therapeutic Proteins: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology) Humana Press; 2nd ed. 2012 edition (June 28, 2012]을 참조한다.
XI. 탈푸코실화
각 Fc 단량체는 Asn 297에 N-글리코실화 부위를 포함한다. 글리칸은 주어진 Fc 단량체에서 다수의 상이한 형태로 존재할 수 있다. 본원에 기재된 항원-결합 Fc 작제물 또는 항체 함유 조성물에서, 글리칸은 꽤 이종성일 수 있으며, 존재하는 글리칸의 성질은, 무엇보다도, 항체 또는 항원-결합 Fc 작제물을 생산하기 위해 사용되는 세포 유형, 세포의 성장 조건(성장 배지 포함) 및 생산 후 정제에 따라 달라질 수 있다. 다양한 경우에, 본원에 기재된 작제물 또는 폴리펩티드 복합체 또는 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 적어도 어느 정도까지는 탈푸코실화된다. 예를 들어, 조성물에 존재하는 글리칸(예를 들어, Fc 글리칸)의 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%에는 푸코스 잔기가 결여되어 있다. 따라서, 5%~60%, 5%~50%, 5%~40%, 10%~50%, 10%~50%, 10%~40%, 20%~50% 또는 20%~40%의 글리칸에는 푸코스 잔기가 결여되어 있다. 적어도 어느 정도 탈푸코실화된 조성물은 1,3,4-Tri-O-아세틸-2-데옥시-2-플루오로-L-푸코스 억제제의 존재 하에 항체를 생산하는 세포를 배양하여 생산될 수 있다. 본원에 기재된 작제물 및 폴리펩티드의 상대적으로 탈푸코실화된 형태는 FUT8의 발현이 감소되거나 없는 세포에서의 발현(예를 들어, FUT8을 녹아웃하거나 또는 RNAi(siRNA, miRNA 또는 shRNA)을 사용한 발현의 감소에 의해) 및 베타-1,4-만노실-당단백질 4-베타-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제(GnT-III)를 과발현하는 세포에서의 발현을 포함하는 다양한 다른 방법을 사용하여 생산될 수 있다.
XII. 정제
Fc-항원 결합 도메인 작제물은, 예를 들어, 크로마토그래피(예컨대, 이온 교환, 친화(예컨대, 단백질 A 친화) 및 크기-배제 컬럼 크로마토그래피), 원심 분리, 용해도 차이 또는 단백질 정제를 위한 임의의 기타 표준 기술 등 단백질 정제 분야에 공지된 임의의 방법으로 정제될 수 있다. 예를 들어, Fc-항원 결합 도메인 작제물은 크로마토그래피 컬럼, 여과, 한외여과, 염석 및 투석 절차(예컨대, 문헌[Process Scale Purification of Antibodies, Uwe Gottschalk (ed.) John Wiley & Sons, Inc., 2009]; 및 문헌[Subramanian (ed.) Antibodies-Volume I-Production and Purification, Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York (2004)] 참조)로 단백질 A 컬럼과 같은 친화 컬럼을 적절하게 선택하고 결합함으로써 단리되고 정제될 수 있다.
일부 경우에, Fc-항원 결합 도메인 작제물은, 예를 들어 전체 세포 용해 혼합물로부터 Fc-항원 결합 도메인 작제물을 용이하게 정제하고 단리하기 위해 하나 이상의 정제 펩티드에 접합될 수 있다. 일부 구현예에서, 정제 펩티드는 정제 펩티드에 특이적 친화도를 갖는 다른 모이어티에 결합한다. 일부 구현예에서, 정제 펩티드에 특이적으로 결합하는 이러한 모이어티는 매트릭스, 수지 또는 아가로스 비드와 같은 고형 지지체에 부착된다. Fc-항원 결합 도메인 작제물에 연결될 수 있는 정제 펩티드의 예는 헥사-히스티딘 펩티드, FLAG 펩티드, myc 펩티드, 및 혈구응집소(HA) 펩티드를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 헥사-히스티딘 펩티드(HHHHHH(서열번호 38))는 마이크로몰 친화도로 니켈-작용화된 아가로스 친화성 컬럼에 결합한다. 일부 구현예에서, FLAG 펩티드는 서열 DYKDDDDK(서열번호 39)를 포함한다. 일부 구현예에서, FLAG 펩티드는 직렬로 서열 DYKDDDDK의 정수 배수, 예컨대, 3xDYKDDDDK를 포함한다. 일부 구현예에서, myc 펩티드는 서열 EQKLISEEDL(서열번호 40)을 포함한다. 일부 구현예에서, myc 펩티드는 직렬로 서열 EQKLISEEDL의 정수 배수, 예컨대, 3xEQKLISEEDL을 포함한다. 일부 구현예에서, HA 펩티드는 서열 YPYDVPDYA(서열번호 41)를 포함한다. 일부 구현예에서, HA 펩티드는 직렬로 서열 YPYDVPDYA의 정수 배수, 예컨대, 3xYPYDVPDYA를 포함한다. FLAG, myc, 또는 HA 정제 펩티드를 특이적으로 인식하여 이에 결합하는 항체는 당업계에 잘 알려져 있으며, 종종 시판된다. 이들 항체와 작용화된 고형 지지체(예컨대, 매트릭스, 수지 또는 아가로스 비드)는 FLAG, myc 또는 HA 펩티드를 포함하는 Fc-항원 결합 도메인 작제물을 정제하는 데 사용될 수 있다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물의 경우, 단백질 A 컬럼 크로마토그래피가 정제 과정으로 이용될 수 있다. 단백질 A 리간드는 Fc 영역을 통해 Fc-항원 결합 도메인 작제물과 상호작용하여, 단백질 A 크로마토그래피를 숙주 세포 단백질의 대부분을 제거할 수 있는 고도의 선별 포획 과정으로 만든다. 본 개시에서, Fc-항원 결합 도메인 작제물은 실시예 2에 기재된 단백질 A 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 정제될 수 있다.
XIII. 약학적 조성물/제제
본 개시는 본원에 기재된 하나 이상의 Fc-항원 결합 도메인 작제물을 포함하는 약학 조성물을 특징으로 한다. 일 구현예에서, 약학 조성물은 구조가 동일하거나 실질적으로 동일한 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 실질적으로 균질한 집단을 포함한다. 다양한 실시예에서, 약학 조성물은 Fc-항원 결합 도메인 작제물 1~42 중 어느 하나의 실질적으로 균질한 집단을 포함한다.
본 개시의 치료 단백질 작제물, 예컨대, 본원에 기재된 Fc-항원 결합 도메인 작제물(예컨대, 3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc-항원 결합 도메인 작제물)은 약학 조성물에 혼입될 수 있다. 치료 단백질을 포함하는 약학 조성물은 당업자에게 공지된 방법으로 제형화될 수 있다. 약학 조성물은 물 또는 또 다른 약학적으로 허용 가능한 액체에 멸균 용액 또는 현탁액을 포함하는 주사 가능한 제형의 형태로 비경구 투여될 수 있다. 예를 들어, 약학 조성물은 주사용 멸균수(WFI), 생리 식염수, 유화제, 현탁제, 계면활성제, 안정화제, 희석제, 결합제, 부형제와 같은 약학적으로 허용 가능한 비히클 또는 매질과 Fc-항원 결합 도메인 작제물을 적합하게 조합한 다음, 일반적으로 허용되는 약무(pharmaceutical practice)에서 필요한 단위 용량 형태로 혼합함으로써 제형화될 수 있다. 약제(pharmaceutical preparation)에 포함된 유효 성분의 양은 지정된 범위 내에서 제공되는 적합한 용량이다.
주사용 멸균 조성물은 비히클로서 주사용 증류수를 사용하여 통상적인 약무에 따라 제형화될 수 있다. 예를 들어, 생리 식염수 또는 글루코스 및 D-소르비톨, D-만노스, D-만니톨 및 염화나트륨과 같은 기타 보충제를 포함하는 등장액은 선택적으로 통상 당업계에 공지되어 있는 적합한 안정화제, 예를 들어, 에탄올과 같은 알코올 및 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 다가 알코올, 및 폴리소르베이트 80TM, HCO-50과 같은 비이온성 계면활성제 등과 조합하여 주사용 수용액으로 사용될 수 있다. 치료 단백질 산물을 위한 제형화 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예컨대, 문헌[Banga (ed.) Therapeutic Peptides and Proteins: Formulation, Processing and Delivery Systems (2d ed.) Taylor & Francis Group, CRC Press (2006)]을 참조한다.
XIV. 치료 방법 및 투여량
본원에 기재된 작제물은 항원 결합 도메인이 유래된 항체에 의해 치료되는 장애를 치료하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 작제물이 CD38을 인식하는 항원 결합 도메인 갖는 경우, 작제물은 다양한 암(예를 들어, 혈액학적 악성종양 및 고형 종양) 및 가 면역 질환을 치료하는 데 사용될 수 있다.
약제학적 조성물은 투약 제형과 양립 가능한 방식으로 및 증상을 개선하거나 치료하는 치료 유효량과 같은 양으로 투여된다. 약학 조성물은 다양한 투약 형태, 예컨대 정맥내 투약 형태, 피하 투약 형태, 경구 투약 형태, 예컨대 섭취 가능 용액, 약물 방출 캡슐 등으로 투여된다. 개별 대상에 대한 적절한 투여량은 치료 목적, 투여 경로 및 환자의 상태에 따라 다르다. 일반적으로, 재조합 단백질은 1~200 mg/kg, 예컨대, 1~100 mg/kg, 예컨대, 20~100 mg/kg으로 투여된다. 따라서, 의료 제공자는 투약을 조정 및 적정하고, 최적의 치료 유효량을 얻기 위해 요구되는 투약 경로를 수정하는 것이 필요할 것이다.
XV. 보체 의존성 세포독성(CDC)
본 개시에 기재된 Fc-항원 결합 도메인 작제물은 여러 가지 Fc 수용체 매개 효과기 기능을 활성화할 수 있다. 항체와 식세포가 외부 병원체를 제거하는 능력을 강화하는 선천 면역계의 일부인 보체 의존성 세포독성(CDC) 시스템은 면역계의 한 구성 요소이다. 3가지 생화학적 경로, 즉 고전 보체 경로, 대체 보체 경로, 및 렉틴 경로는 보체계를 활성화하며, 이들 모두는 일련의 복합체 활성화 및 신호전달 캐스케이드를 수반한다.
고전 보체 경로에서, IgG 또는 IgM은 보체 활성화를 유발한다. C1q 단백질은 항원에 결합한 후 이들 항체에 결합하여 C1 복합체를 형성한다. 이러한 복합체는 C1s 에스테라제를 생성하는데, 이는 C4 및 C2 단백질을 C4a 및 C4b, 그리고 C2a 및 C2b로 절단하여 활성화한다. 이어서, C2a 및 C4b 단편은 C3 전환효소로 불리는 단백질 복합체를 형성하며, 이는 C3을 C3a 및 C3b로 절단하여, 신호 증폭 및 막 공격 복합체의 형성을 유도한다.
본 개시의 Fc-항원 결합 도메인 작제물은 면역계에 의해 CDC 활성을 강화할 수 있다.
CDC는 Raji 세포(ATCC)를 연속 희석된 항체, Fc-항원 결합 도메인 작제물, 또는 IVIg로 코팅하는 비색 분석법을 사용하여 평가될 수 있다. 인간 혈청 보체(Quidel)를 25% v/v로 모든 웰에 첨가하고, 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션할 수 있다. WST-1 세포 증식 시약(Roche Applied Science)을 첨가한 후 세포를 37℃에서 12시간 동안 인큐베이션할 수 있다. 그런 다음, 플레이트를 2분간 진탕기에 놓고, 450 nm에서 흡광도를 측정할 수 있다.
XVI. 항체 의존성 세포-매개 세포독성(ADCC)
본 개시의 Fc-항원 결합 도메인 작제물은 또한 면역계에 의해 항체 의존성 세포-매개 세포독성(ADCC) 활성을 강화할 수 있다. ADCC는 항체가 외부 병원체의 표면 항원과 결합하여 그들을 사멸의 표적으로 하는 적응 면역계의 일부이다. ADCC는 항체에 의한 자연 살해(NK) 세포의 활성화를 수반한다. NK 세포는 항체, 예컨대 IgG 및 IgM의 Fc 부분에 결합하는 Fc 수용체를 발현한다. 항체가 병원체 감염 표적 세포의 표면에 결합되면 이후에 NK 세포와 결합하여 이를 활성화한다. NK 세포는 IFN-γ와 같은 사이토카인과 퍼포린 및 그랜자임과 같은 단백질을 방출한다. 퍼포린은 칼슘의 존재 하에 올리고머화되는 기공 형성 세포용해소이다. 그랜자임은 표적 세포에서 프로그래밍된 세포 사멸을 유도하는 세린 프로테아제이다. NK 세포 외에, 대식세포, 호중구 및 호산구도 ADCC를 매개할 수 있다.
ADCC를 발광 검정을 사용하여 평가할 수 있다. 인간 1차 NK 효과기 세포(Hemacare)를 해동하고 37°C에서 하룻밤 동안 5x105/mL의 림프구 성장 배지-3(Lonza)에 정치시킨다. 다음날, 인간 림프아구성 세포주 Raji 표적 세포(ATCC CCL-86)를 수확하고, 검정 배지(페놀 레드 무함유 RPMI, 10% FBSΔ, GlutaMAX™)에 재현탁하고, 다양한 농도의 목적 프로브 각각의 존재 하에 37℃에서 30분 동안 도말한다. 이어서, 정치시킨 NK 세포를 회수하고, 검정 배지에 재현탁하고, 항-CD20 코팅된 Raji 세포를 포함하는 플레이트에 첨가한다. 플레이트를 효과기-대-표적 세포의 최종 비율이 5:1(5x104 NK 세포: 1x104 Raji)가 되도록 37°C에서 6시간 동안 인큐베이션한다.
CytoTox-Glo™ 세포독성 검정 키트(Promega)를 사용하여 ADCC 활성을 결정한다. CytoTox-Glo™ 검정은 발광성 펩티드 기질을 사용하여, 막 무결성을 상실한 세포, 예를 들어 용해된 Raji 세포에 의해 방출된 죽은 세포 프로테아제 활성을 측정한다. 6시간의 인큐베이션 후, 준비된 시약(기질)을 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 실온에서 15분 동안 오비탈 플레이트 진탕기에 둔다. PHERAstar F5 플레이트 판독기(BMG Labtech)를 사용하여 발광을 측정한다. 백그라운드를 제거하기 위해 대조 조건(NK 세포 + Raji만 해당)의 판독치를 시험 조건에서 뺀 후 데이터를 분석한다.
XVII. 항체 의존성 세포 식균작용(ADCP)
본 개시의 Fc-항원 결합 도메인 작제물은 또한 면역계에 의해 항체 의존성 세포 식균작용(ADCP) 활성을 강화할 수 있다. 항체 옵소닌 작용으로도 알려진 ADCP는 병원체가 식세포에 의해 섭취되어 제거되도록 표시되는 과정이다. 식세포는 유해한 외래 병원체와 죽은 세포 또는 죽어가는 세포를 섭취하여 신체를 보호하는 세포이다. 이 과정은 병원체-관련 분자 패턴(PAMPS)에 의해 활성화되어 NF-κB 활성화로 이어진다. 이어서, C3b 및 항체와 같은 옵소닌은 표적 병원체에 부착할 수 있다. 표적이 옵소닌에 코팅되면 Fc 도메인은 Fc 수용체를 통해 식세포를 유인한다. 이어서, 식세포가 세포를 삼키고, 섭취된 물질의 포식소체(phagosome)는 리소좀과 융합된다. 이어서, 후속하는 파고리소좀(phagolysosome)은 세포성 물질을 단백질 분해로 소화시킨다.
ADCP는 생물발광 검정을 사용하여 평가할 수 있다. 항체 의존성 세포-매개 식균작용(ADCP)은 치료 항체의 중요한 작용 메커니즘이다. ADCP는 FcγRIIa(CD32a), FcγRI(CD64) 및 FcγRIIIa(CD16a)를 통해 단핵구, 대식세포, 호중구 및 수지상 세포에 의해 매개될 수 있다. 3가지 수용체 모두 항체 인식, 면역 수용체 클러스터링, 및 ADCP를 유발하는 신호전달 이벤트에 참여할 수 있지만, 차단 연구는 FcγRIIa가 이러한 과정에 관여하는 주요 Fcγ 수용체임을 시사한다.
FcγRIIa-H ADCP 리포터 생물검정은 FcγRIIa에 특이적으로 결합하여 이를 활성화하는 Fc 도메인을 사용하여 항체 및 다른 생물 제제의 효능과 안정성을 측정하는 데 사용할 수 있는 생물발광 세포 기반 검정이다. 이러한 검정은 아미노산 131에 히스티딘(H)을 포함하는 고친화도 인간 FcγRIIa-H 변이체를 발현하는 유전자 조작 Jurkat T 세포주 및 NFAT-반응 요소(NFAT-RE)에 의해 유도되는 루시퍼라제 리포터로 구성된다.
표적 세포 및 관련 항체와 공배양하는 경우, FcγRIIa-H 효과기 세포는 항체의 Fc 도메인에 결합하여 FcγRIIa 신호전달 및 NFAT-RE 매개 루시퍼라제 활성을 유발한다. 생물발광 신호는 루시퍼라제 검정과 표준 발광 측정기를 사용하여 검출되고 정량화된다.
실시예
하기 실시예는 본원에 청구된 방법 및 화합물을 수행하고, 제조하고, 평가하는 방법의 완전한 개시 및 설명을 당업자에게 제공하기 위해 기재되며, 본 개시를 순전히 예시하기 위한 것으로, 본 발명자들이 개시 내용으로 간주하는 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다.
이들 실시예에서, 특정 항체 및 작제물은 "탈푸코실화(afucosylated)"된 것으로 지칭된다. 이는 항체 또는 작제물이 완전히 탈푸코실화된다는 것을 의미하는 것은 아니다. 오히려, 이는 항체 또는 작제물이 상대적으로 탈푸코실화되는 것, 예를 들어, 항체 또는 작제물의 조성물 중 글리칸의 10% 이상이 푸코스 잔기를 결여하는 것을 의미한다.
실시예 1. 항-CD20 항원 결합 도메인 또는 항-PD-L1 항원 결합 도메인을 갖는 Fc-항원 결합 도메인 작제물 7의 설계 및 정제
단백질 발현
Fc-항원 결합 도메인 작제물은 폴딩 효율을 증가시키고, 원치 않는 고분자량의 올리고머 및 다량체를 생성할 수 있는 서브유닛의 제어되지 않은 결합을 최소화하며, 실질적으로 균질한(예를 들어, 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동질인) 제약적 용도를 위한 조성물을 생성하도록 설계된다. 이러한 목표를 고려하여, 분지점이 N-말단 Fc 도메인에 있는 단일 분지형 Fc 도메인으로부터 형성된 작제물을 하기 기재된 바와 같이 제조하였다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 7(CD20) 및 작제물 7(PD-L1)은 2개의 구별되는 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드(항-CD20 Fc 장쇄(서열 번호 62) 또는 항-PD-L1 Fc 장쇄(서열 번호 54)의 2개의 카피, 및 Fc 단쇄(서열 번호 63)의 2개의 카피), 및 항-CD20 경쇄 폴리펩티드(서열 번호 61) 또는 항-PD-L1 경쇄 폴리펩티드(서열 번호 49)의 2개의 카피를 각각 포함한다. Fc 장쇄는 (이종이량체화를 촉진하기 위한) S354C 및 T366W 돌출부-형성 돌연변이 및 E357K 전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하며, 상기 Fc 도메인 단량체는 (동종이량체화를 촉진하기 위한) 전하-돌연변이된(K409D/D399K 돌연변이) Fc 도메인 단량체 및 항-CD20 VH 및 CH1 도메인(EU 위치 1~220) 중 어느 하나와 N-말단에서(작제물 7(CD20)) 또는 항-PD-L1 VH 및 CH1 도메인(EU 위치 1~220)과 N-말단에서 직렬로 연결된다(작제물 7(PD-L1)). Fc 단쇄는 K370D 전하 돌연변이 및 (이종이량체화를 촉진하기 위한) Y349C, T366S, L368A 및 Y407V 함몰부-형성 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함한다. 항-CD20 경쇄 또는 항-PD-L1 경쇄는 또한 scFv의 일부로서 Fc 장쇄의 N-말단에 융합되도록 발현될 수 있다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하였고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝하였다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입하였다. 표 5의 아미노산 서열을 3개의 별개의 플라스미드(경쇄(항-CD20 또는 항-PD-L1)를 암호화하는 하나의 플라스미드, Fc 장쇄(항-CD20 또는 항-PD-L1)를 암호화하는 하나의 플라스미드, 및 Fc 단쇄를 암호화하는 하나의 플라스미드)에 의해 암호화하였다.
| 작제물 7(CD20) 및 작제물 7(PD-L1) 서열 | |||
| 작제물 | 경쇄 | Fc 장쇄 (항-CD20 또는 항-PD-L1 VH 및 CH1 포함) |
Fc 단쇄 |
| 작제물 7(CD20) | 서열번호 61 DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLVSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC |
서열 번호 62 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSYSWINWVRQAPGQGLEWMGRIFPGDGDTDYNGKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNVFDGYWLVYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
서열 번호 63 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
| 작제물 7(PD-L1) | 서열 번호 49 QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRVFGTGTKVTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS |
서열 번호 54 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMMWVRQAPGKGLEWVSSIYPSGGITFYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
서열 번호 63 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
발현된 단백질을 Poros MabCapture A(LifeTechnologies) 컬럼을 사용하는 단백질 A-기반 친화 컬럼 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상청액으로부터 정제하였다. 포획된 Fc-항원 결합 도메인 작제물을 인산염 완충 식염수로 세척하고(저염 세척) pH 3, 100 mM 글리신으로 용리하였다. 용출액을 1 M TRIS(pH 7.4)의 첨가로 빠르게 중화하고, 0.2 μm 필터로 멸균 여과하였다. 단백질을 Poros XS 수지(Applied Biosciences)를 사용하여 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 분리하였다. 컬럼을 50 mM MES, pH 6(완충액 A)로 사전 평형화하였고 샘플을 용출 완충액으로서 50 mM MES, 400 mM 염화나트륨, pH 6(완충액 B)을 사용하여 단계 구배로 용리하였다. 이온 교환 후에, 표적 분획물을 접선 유동 여과 시스템상에서 10 kDa 컷오프 폴리에테르설폰(PES) 막 카트리지를 사용하여 PBS 완충액으로 완충액 교환하였다. 샘플을 대략 30 mg/mL로 농축하였고 0.2 μm 필터로 멸균 여과하였다.
비환원 황산도데실나트륨-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)
샘플을 95℃에서 10분간 Laemmli 샘플 완충액(4% SDS, Bio-Rad)에서 변성시켰다. Criterion TGX 무착색 겔(4~15% 폴리아크릴아미드, Bio-Rad)상에 샘플을 흘렸다. 단백질 밴드를 UV 조사 또는 쿠마시 블루 염색으로 시각화하였다. ChemiDoc MP Imaging System(Bio-Rad)으로 겔을 이미지화하였다. Imagelab 4.0.1 소프트웨어(Bio-Rad)를 사용하여 밴드를 정량 분석하였다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 7(CD20)은 순수한 것으로 나타났다(도 43, 레인 4).
실시예 2 항-CD20 항원 결합 도메인 또는 항-PD-L1 항원 결합 도메인을 갖는 Fc-항원 결합 도메인 작제물 13의 설계 및 정제
단백질 발현
분지점이 C-말단 Fc 도메인에 있는 단일 분지형 Fc 도메인으로 형성된 작제물을 하기 기재된 바와 같이 제조하였다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 13(CD20) 및 작제물 13(PD-L1)은 2개의 구별되는 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드(항-CD20 Fc 장쇄(서열 번호 64 및 67~69 중 어느 하나) 또는 항-PD-L1 Fc 장쇄(서열번호 58, 59, 60, 및 65 중 어느 하나)의 2개의 카피 및 Fc 단쇄(서열 번호 63)의 2개의 카피) 및 항-CD20 경쇄 폴리펩티드(서열 번호 61) 또는 항-PD-L1 경쇄 폴리펩티드(서열 번호 49)의 2개의 카피를 각각 포함한다. Fc 장쇄는 (동종이량체화를 촉진하기 위한) 전하-돌연변이된(K409D/D399K 돌연변이) Fc 도메인 단량체를 포함하며, 상기 Fc 도메인 단량체는 E357K 전하 돌연변이 및 (이종이량체화를 촉진하기 위한) S354C 및 T366W 돌출부 형성 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체 및 항-CD20 VH 및 CH 도메인(EU 위치 1~220)과 N-말단에서 직렬로 연결되거나(작제물 13(CD20)), 항-PD-L1 VH 및 CH1 도메인(EU 위치 1~220)과 N-말단에서 직렬로 연결된다(작제물 13(PD-L1)). Fc 단쇄는 K370D 전하 돌연변이 및 (이종이량체화를 촉진하기 위한) Y349C, T366S, L368A 및 Y407V 함몰부-형성 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함한다. 항-CD20 경쇄 또는 PD-L1 경쇄는 scFv의 일부로서 Fc 장쇄의 N-말단에 융합되어 발현될 수도 있다. 작제물 13의 4개의 버전은 항-CD20 중쇄 및 항-PD-L1 중쇄로 제조되었고, 여기서 각각의 버전은 Fc 장쇄 폴리펩티드 내의 Fc 도메인 단량체 사이에서 상이한 크기의 글리신 스페이서(G4, G10, G15 또는 G20 링커)를 보유했다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하였고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝하였다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입하였다. 다음의 작제물 각각에 대한 아미노산 서열을 3개의 별개의 플라스미드(경쇄(항-CD20 또는 항-PD-L1)를 암호화하는 하나의 플라스미드, Fc 장쇄(항-CD20 또는 항-PD-L1)를 암호화하는 하나의 플라스미드, 및 Fc 단쇄를 암호화하는 하나의 플라스미드)에 의해 암호화하였다.
| 작제물 13(CD20) 및 작제물 13(PD-L1) 서열 | |||
| 작제물 | 경쇄 | Fc 장쇄 (항-CD20 또는 항-PD-L1 VH 및 CH1 포함) |
Fc 단쇄 |
| 작제물 13(CD20), G20 링커 | SEQ ID NO: 61 DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLVSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC |
SEQ ID NO: 64 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSYSWINWVRQAPGQGLEWMGRIFPGDGDTDYNGKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNVFDGYWLVYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
SEQ ID NO: 63 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
| 작제물 13(CD20), G15 링커 | SEQ ID NO: 61 DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLVSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC |
SEQ ID NO: 55 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSYSWINWVRQAPGQGLEWMGRIFPGDGDTDYNGKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNVFDGYWLVYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
SEQ ID NO: 63 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
| 작제물 13(CD20), G10 링커 | SEQ ID NO: 61 DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLVSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC |
SEQ ID NO: 56 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSYSWINWVRQAPGQGLEWMGRIFPGDGDTDYNGKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNVFDGYWLVYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
SEQ ID NO: 63 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
| 작제물 13(CD20), G4 링커 | SEQ ID NO: 61 DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLVSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC |
SEQ ID NO: 57 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSYSWINWVRQAPGQGLEWMGRIFPGDGDTDYNGKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNVFDGYWLVYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
SEQ ID NO: 63 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
| 작제물 13 (PD-L1), G20 링커 | SEQ ID NO: 49 QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRVFGTGTKVTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS |
SEQ ID NO: 58 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMMWVRQAPGKGLEWVSSIYPSGGITFYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
SEQ ID NO: 63 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
| 작제물 13 (PD-L1), G15 링커 | SEQ ID NO: 49 QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRVFGTGTKVTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS |
SEQ ID NO: 59 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMMWVRQAPGKGLEWVSSIYPSGGITFYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
SEQ ID NO: 63 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
| 작제물 13 (PD-L1), G10 링커 | SEQ ID NO: 49 QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRVFGTGTKVTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS |
SEQ ID NO: 60 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMMWVRQAPGKGLEWVSSIYPSGGITFYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
SEQ ID NO: 63 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
| 작제물 13 (PD-L1), G4 링커 | SEQ ID NO: 49 QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRVFGTGTKVTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS |
SEQ ID NO: 65 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMMWVRQAPGKGLEWVSSIYPSGGITFYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
SEQ ID NO: 63 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
발현된 단백질을 Poros MabCapture A(LifeTechnologies) 컬럼을 사용하는 단백질 A-기반 친화 컬럼 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상청액으로부터 정제하였다. 포획된 Fc-항원 결합 도메인 작제물을 인산염 완충 식염수로 세척하고(저염 세척) pH 3, 100 mM 글리신으로 용리하였다. 용출액을 1 M TRIS(pH 7.4)의 첨가로 빠르게 중화하고, 0.2 μm 필터로 멸균 여과하였다. 단백질을 Poros XS 수지(Applied Biosciences)를 사용하여 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 분리하였다. 컬럼을 50 mM MES, pH 6(완충액 A)로 사전 평형화하였고 샘플을 용출 완충액으로서 50 mM MES, 400 mM 염화나트륨, pH 6(완충액 B)을 사용하여 단계 구배로 용리하였다. 이온 교환 후에, 표적 분획물을 접선 유동 여과 시스템상에서 10 kDa 컷오프 폴리에테르설폰(PES) 막 카트리지를 사용하여 PBS 완충액으로 완충액 교환하였다. 샘플을 대략 30 mg/mL로 농축하였고 0.2 μm 필터로 멸균 여과하였다.
비환원 황산도데실나트륨-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)
샘플을 95℃에서 10분간 Laemmli 샘플 완충액(4% SDS, Bio-Rad)에서 변성시켰다. Criterion TGX 무착색 겔(4~15% 폴리아크릴아미드, Bio-Rad)상에 샘플을 흘렸다. 단백질 밴드를 UV 조사 또는 쿠마시 블루 염색으로 시각화하였다. ChemiDoc MP Imaging System(Bio-Rad)으로 겔을 이미지화하였다. Imagelab 4.0.1 소프트웨어(Bio-Rad)를 사용하여 밴드를 정량 분석하였다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 13(CD20)은 순수한 것으로 나타났다(도 43, 레인 5).
실시예 3. Fc-항원 결합 도메인 작제물 1의 설계 및 정제
비대칭 직렬 Fc 도메인으로 형성된 비분지형 작제물을 하기 기재된 바와 같이 제조한다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 1(도 1)은 2개의 구별되는 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(Fc 장쇄, 및 Fc 단쇄의 2개의 카피) 및 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. Fc 장쇄는 직렬로 연결된 2개의 Fc 도메인 단량체를 포함하고 항원 결합 도메인을 N-말단에서 포함하되, 여기서 각각의 Fc 도메인 단량체는 표 3에서 선택된 적어도 하나의 돌출부-형성 돌연변이(예컨대, S354C 및 T366W 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 돌출부 및 임의로 표 4에서 선택된 (이종이량체화를 촉진하기 위한) 하나 이상의 역전하 돌연변이(예컨대, E357K)를 갖는다. 항원 결합 도메인은 (예를 들어, scFv를 형성하기 위해) Fc 장쇄와 동일한 아미노산 서열의 일부로서 발현될 수 있다. Fc 단쇄는 표 3에서 선택된 적어도 하나의 함몰부-형성 돌연변이(예컨대, Y349C, T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 함몰부 및 임의로 표 4에서 선택된 (이종이량체화를 촉진하기 위한) 역전하 돌연변이(예컨대, K370D)를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함한다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝한다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입한다. Fc 단쇄 및 Fc 장쇄에 대한 아미노산 서열은 2개의 개별 플라스미드에 의해 암호화된다. 본 실시예에서, 그리고 Fc-항원 결합 도메인 작제물 2~42에 대한 하기 실시예 각각에서, 세포는 항체 가변 경쇄를 발현하는 제3 플라스미드를 함유할 수 있다.
발현된 단백질을 Poros MabCapture A(LifeTechnologies) 컬럼을 사용하는 단백질 A-기반 친화 컬럼 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상청액으로부터 정제한다. 포획된 Fc-항원 결합 도메인 작제물을 인산염 완충 식염수로 세척하고(저염 세척) pH 3, 100 mM 글리신으로 용리한다. 용리액을 1 M TRIS(pH 7.4)의 첨가로 빠르게 중화하고, 0.2 μm 필터로 멸균 여과한다. 단백질을 Poros XS 수지(Applied Biosciences)를 사용하여 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 분리한다. 컬럼을 50 mM MES, pH 6(완충액 A)로 사전 평형화하고 샘플을 용리 완충액으로서 50 mM MES, 400 mM 염화나트륨, pH 6(완충액 B)을 사용하여 단계 구배로 용리한다. 이온 교환 후에, 표적 분획물을 접선 유동 여과 시스템 상에서 10 kDa 컷오프 폴리에테르설폰(PES) 막 카트리지를 사용하여 PBS 완충액으로 완충액 교환한다. 샘플을 약 30 mg/mL로 농축하고, 0.2 μm 필터를 통해 멸균 여과한다.
샘플을 95℃에서 10분간 Laemmli 샘플 완충액(4% SDS, Bio-Rad)에서 변성시킨다. Criterion TGX 무착색 겔(4~15% 폴리아크릴아미드, Bio-Rad)상에 샘플을 흘린다. 단백질 밴드를 UV 조사 또는 쿠마시 블루 염색으로 시각화한다. ChemiDoc MP Imaging System(Bio-Rad)으로 겔을 이미지화한다. Imagelab 4.0.1 소프트웨어(Bio-Rad)를 사용하여 밴드의 정량화를 수행한다.
실시예 4. Fc-항원 결합 도메인 작제물 2의 설계 및 정제
비대칭 직렬 Fc 도메인으로 형성된 비분지형 작제물을 하기 기재된 바와 같이 제조한다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 2(도 2)는 2개의 구별되는 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(Fc 장쇄 및 3개 카피의 Fc 단쇄) 및 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. Fc 장쇄는, 항원 결합 도메인과 N-말단에서 직렬로 연결된 3개의 Fc 도메인 단량체를 포유하며, 여기서 각각의 Fc 도메인 단량체는 표 3에서 선택된 적어도 하나의 돌출부-형성 돌연변이(예컨대, S354C 및 T366W 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 돌출부 및 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이(예컨대, E357K)를 갖는다. Fc 단쇄는 표 3에서 선택된 적어도 하나의 함몰부-형성 돌연변이(예컨대, Y349C, T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 함몰부 및 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이(예컨대, K370D)를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함한다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝한다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입한다. Fc 단쇄 및 Fc 장쇄에 대한 아미노산 서열은 2개의 개별 플라스미드에 의해 암호화된다. 발현된 단백질은 실시예 3에서와 같이 정제한다.
실시예 5. Fc-항원 결합 도메인 작제물 3의 설계 및 정제
비대칭 직렬 Fc 도메인으로 형성된 작제물을 하기 기재된 바와 같이 제조한다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 3(도 3)은 2개의 구별되는 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(Fc 장쇄, 및 Fc 단쇄의 2개의 카피) 및 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. Fc 장쇄는 직렬로 연결된 2개의 Fc 도메인 단량체를 포함하며, 여기서 각각의 Fc 도메인 단량체는 표 3에서 선택된 적어도 하나의 돌출부-형성 돌연변이(예컨대, S354C 및 T366W 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 돌출부 및 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이(예컨대, E357K)를 갖는다. Fc 단쇄는 표 3에서 선택된 적어도 하나의 함몰부-형성 돌연변이(예컨대, Y349C, T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 함몰부 및 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이(예컨대, K370D)를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하고, N-말단에서 항원 결합 도메인을 포함한다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝한다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입한다. Fc 단쇄 및 Fc 장쇄에 대한 아미노산 서열은 2개의 개별 플라스미드에 의해 암호화된다. 발현된 단백질은 실시예 3에서와 같이 정제한다.
실시예 6. Fc-항원 결합 도메인 작제물 4의 설계 및 정제
비대칭 직렬 Fc 도메인으로 형성된 작제물을 하기 기재된 바와 같이 제조하였다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 4(도 4)는 2개의 구별되는 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(Fc 장쇄 및 3개 카피의 Fc 단쇄) 및 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. Fc 장쇄는 직렬로 연결된 3개의 Fc 도메인 단량체를 포함하며, 여기서 각각의 Fc 도메인 단량체는 표 3에서 선택된 적어도 하나의 돌출부-형성 돌연변이(예컨대, S354C 및 T366W 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 돌출부 및 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이(예컨대, E357K)를 갖는다. Fc 단쇄는 표 3에서 선택된 적어도 하나의 함몰부-형성 돌연변이(예컨대, Y349C, T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 함몰부 및 임의로 표 4에서 선택된 역전하 돌연변이(예컨대, K370D)를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하고, N-말단에서 항원 결합 도메인을 포함한다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하였고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝하였다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입하였다. Fc 단쇄 및 Fc 장쇄에 대한 아미노산 서열은 2개의 개별 플라스미드에 의해 암호화되었다. 발현된 단백질은 실시예 3에서와 같이 정제하였다.
실시예 7. Fc-항원 결합 도메인 작제물 5의 설계 및 정제
비대칭 직렬 Fc 도메인으로 형성된 작제물을 하기 기재된 바와 같이 제조한다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 5(도 5)는 2개의 구별되는 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(Fc 장쇄, 및 Fc 단쇄의 2개의 카피) 및 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. Fc 장쇄는 항원 결합 도메인과 N-말단에서 직렬로 연결된 2개의 Fc 도메인 단량체를 포함하되, 각각의 Fc 도메인 단량체는 표 3에서 선택된 적어도 하나의 돌출부-형성 돌연변이(예컨대, S354C 및 T366W 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 돌출부 및 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이(예컨대, E357K)를 갖는다. Fc 단쇄는 표 3에서 선택된 적어도 하나의 함몰부-형성 돌연변이(예컨대, Y349C, T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 함몰부 및 임의로 표 4에서 선택된 역전하 돌연변이(예컨대, K370D)를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하고, N-말단에서 항원 결합 도메인을 포함한다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝한다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입한다. Fc 단쇄 및 Fc 장쇄에 대한 아미노산 서열은 2개의 개별 플라스미드에 의해 암호화된다. 발현된 단백질은 실시예 3에서와 같이 정제한다.
실시예 8. Fc-항원 결합 도메인 작제물 6의 설계 및 정제
비대칭 직렬 Fc 도메인으로 형성된 작제물을 하기 기재된 바와 같이 제조한다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 6(도 6)은 2개의 구별되는 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(Fc 장쇄 및 3개 카피의 Fc 단쇄) 및 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. Fc 장쇄는 항원 결합 도메인과 N-말단에서 직렬로 연결된 3개의 Fc 도메인 단량체를 포함하되, 각각의 Fc 도메인 단량체는 표 3에서 선택된 적어도 하나의 돌출부-형성 돌연변이(예컨대, S354C 및 T366W 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 돌출부 및 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이(예컨대, E357K)를 갖는다. Fc 단쇄는 표 3에서 선택된 적어도 하나의 함몰부-형성 돌연변이(예컨대, Y349C, T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 함몰부 및 임의로 표 4에서 선택된 역전하 돌연변이(예컨대, K370D)를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하고, N-말단에서 항원 결합 도메인을 포함한다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝한다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입한다. Fc 단쇄 및 Fc 장쇄에 대한 아미노산 서열은 2개의 개별 플라스미드에 의해 암호화된다. 발현된 단백질은 실시예 3에서와 같이 정제한다.
실시예 9. Fc-항원 결합 도메인 작제물 7의 설계 및 정제
분지점이 N-말단 Fc 도메인에 있는 단일 분지형 Fc 도메인으로 형성된 작제물을 하기 기재된 바와 같이 제조하였다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 7(도 7)은 2개의 구별되는 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(Fc 장쇄의 2개의 카피, 및 Fc 단쇄의 2개의 카피) 및 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. Fc 장쇄는 표 3에서 선택된 적어도 하나의 돌출부-형성 돌연변이(예컨대, S354C 및 T366W 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 돌출부와 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이(예컨대, E357K)를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하며, 상기 Fc 도메인 단량체는 표 4 또는 표 5에서 선택된 역전하 돌연변이(예컨대, K409D/D399K 돌연변이)를 갖는 Fc 도메인 단량체 및 항원 결합 도메인과 N-말단에서 직렬로 연결된다. Fc 단쇄는 표 3에서 선택된 적어도 하나의 함몰부-형성 돌연변이(예컨대, Y349C, T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 함몰부 및 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이(예컨대, K370D)를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함한다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하였고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝하였다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입하였다. Fc 단쇄 및 Fc 장쇄에 대한 아미노산 서열은 2개의 개별 플라스미드에 의해 암호화되었다. 발현된 단백질은 실시예 3에서와 같이 정제하였다.
실시예 10. Fc-항원 결합 도메인 작제물 8의 설계 및 정제
분지점이 N-말단 Fc 도메인에 있는 단일 분지형 Fc 도메인으로 형성된 작제물을 하기 기재된 바와 같이 제조하였다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 8(도 8)은 2개의 구별되는 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(Fc 장쇄의 2개의 카피 및 Fc 단쇄의 2개의 카피) 및 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. Fc 장쇄는 표 3에서 선택된 적어도 하나의 돌출부-형성 돌연변이(예컨대, S354C 및 T366W 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 돌출부와 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이(예컨대, E357K)를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하며, 상기 Fc 도메인 단량체는 표 4 또는 표 5에서 선택된 역전하 돌연변이(예컨대, K409D/D399K 돌연변이)를 갖는 Fc 도메인 단량체와 직렬로 연결된다. Fc 단쇄는 표 3에서 선택된 적어도 하나의 함몰부-형성 돌연변이(예컨대, Y349C, T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 함몰부 및 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이(예컨대, K370D)를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하고, N-말단에서 항원 결합 도메인을 포함한다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하였고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝하였다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입하였다. Fc 단쇄 및 Fc 장쇄에 대한 아미노산 서열은 2개의 개별 플라스미드에 의해 암호화되었다. 발현된 단백질은 실시예 3에서와 같이 정제하였다.
실시예 11. Fc-항원 결합 도메인 작제물 9의 설계 및 정제
분지점이 N-말단 Fc 도메인에 있는 단일 분지형 Fc 도메인으로 형성된 작제물을 하기 기재된 바와 같이 제조하였다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 9(도 9)는 2개의 구별되는 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(Fc 장쇄의 2개의 카피 및 Fc 단쇄의 2개의 카피) 및 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. Fc 장쇄는 표 3에서 선택된 적어도 하나의 돌출부-형성 돌연변이(예컨대, S354C 및 T366W 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 돌출부와 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이(예컨대, E357K)를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하며, 상기 Fc 도메인 단량체는 표 4 또는 표 5에서 선택된 역전하 돌연변이(예컨대, K409D/D399K 돌연변이)를 갖는 Fc 도메인 단량체 및 항원 결합 도메인과 N-말단에서 직렬로 연결된다. Fc 단쇄는 표 3에서 선택된 적어도 하나의 함몰부-형성 돌연변이(예컨대, Y349C, T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 함몰부 및 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이(예컨대, K370D)를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하고, N-말단에서 항원 결합 도메인을 포함한다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하였고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝하였다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입하였다. Fc 단쇄 및 Fc 장쇄에 대한 아미노산 서열은 2개의 개별 플라스미드에 의해 암호화되었다. 발현된 단백질은 실시예 3에서와 같이 정제하였다.
실시예 12. Fc-항원 결합 도메인 작제물 10의 설계 및 정제
분지점이 N-말단 Fc 도메인에 있는 단일 분지형 Fc 도메인으로 형성된 작제물을 하기 기재된 바와 같이 제조하였다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 10(도 10)은 2개의 구별되는 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(Fc 장쇄의 2개의 카피 및 Fc 단쇄의 4개의 카피) 및 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. Fc 장쇄는 직렬로 연결된 2개의 Fc 도메인 단량체를 포함하되, 각각의 Fc 도메인 단량체는 표 3에서 선택된 적어도 하나의 돌출부-형성 돌연변이(예컨대, S354C 및 T366W 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 돌출부와 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이(예컨대, E357K)를 가지며, 상기 2개의 Fc 도메인 단량체는 표 4 또는 5에서 선택된 역전하 돌연변이(예컨대, K409D/D399K 돌연변이)를 갖는 Fc 도메인 단량체 및 항원 결합 도메인과 N-말단에서 직렬로 연결된다. Fc 단쇄는 표 3에서 선택된 적어도 하나의 함몰부-형성 돌연변이(예컨대, Y349C, T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 함몰부 및 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이(예컨대, K370D)를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함한다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하였고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝하였다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입하였다. Fc 단쇄 및 Fc 장쇄에 대한 아미노산 서열은 2개의 개별 플라스미드에 의해 암호화되었다. 발현된 단백질은 실시예 3에서와 같이 정제하였다.
실시예 13. Fc-항원 결합 도메인 작제물 11의 설계 및 정제
분지점이 N-말단 Fc 도메인에 있는 단일 분지형 Fc 도메인으로 형성된 작제물을 하기 기재된 바와 같이 제조한다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 11(도 11)은 2개의 구별되는 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(Fc 장쇄의 2개의 카피 및 Fc 단쇄의 4개의 카피) 및 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. Fc 장쇄는 직렬로 연결된 2개의 Fc 도메인 단량체를 포함하되, 각각의 Fc 도메인 단량체는 표 3에서 선택된 적어도 하나의 돌출부-형성 돌연변이(예컨대, S354C 및 T366W 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 돌출부와 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이(예컨대, E357K)를 가지며, 상기 2개의 Fc 도메인 단량체는 표 4 또는 5에서 선택된 역전하 돌연변이(예컨대, K409D/D399K 돌연변이)를 갖는 Fc 도메인 단량체와 N-말단에서 직렬로 연결된다. Fc 단쇄는 표 3에서 선택된 적어도 하나의 함몰부-형성 돌연변이(예컨대, Y349C, T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 함몰부 및 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이(예컨대, K370D)를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하고, N-말단에서 항원 결합 도메인을 포함한다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝한다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입한다. Fc 단쇄 및 Fc 장쇄에 대한 아미노산 서열은 2개의 개별 플라스미드에 의해 암호화된다. 발현된 단백질은 실시예 3에서와 같이 정제한다.
실시예 14. Fc-항원 결합 도메인 작제물 12의 설계 및 정제
분지점이 N-말단 Fc 도메인에 있는 단일 분지형 Fc 도메인으로 형성된 작제물을 하기 기재된 바와 같이 제조한다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 12(도 12)는 2개의 구별되는 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(Fc 장쇄의 2개의 카피 및 Fc 단쇄의 4개의 카피) 및 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. Fc 장쇄는 직렬로 연결된 2개의 Fc 도메인 단량체를 포함하되, 각각의 Fc 도메인 단량체는 표 3에서 선택된 적어도 하나의 돌출부-형성 돌연변이(예컨대, S354C 및 T366W 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 돌출부와 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이(예컨대, E357K)를 가지며, 상기 2개의 Fc 도메인 단량체는 표 4 또는 5에서 선택된 역전하 돌연변이(예컨대, K409D/D399K 돌연변이)를 갖는 Fc 도메인 단량체 및 항원 결합 도메인과 N-말단에서 직렬로 연결된다. Fc 단쇄는 표 3에서 선택된 적어도 하나의 함몰부-형성 돌연변이(예컨대, Y349C, T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 함몰부 및 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이(예컨대, K370D)를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하고, N-말단에서 항원 결합 도메인을 포함한다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝한다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입한다. Fc 단쇄 및 Fc 장쇄에 대한 아미노산 서열은 2개의 개별 플라스미드에 의해 암호화된다. 발현된 단백질은 실시예 3에서와 같이 정제한다.
실시예 15. Fc-항원 결합 도메인 작제물 13의 설계 및 정제
분지점이 C-말단 Fc 도메인에 있는 단일 분지형 Fc 도메인으로 형성된 작제물을 하기 기재된 바와 같이 제조하였다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 13(도 13)은 2개의 구별되는 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(Fc 장쇄의 2개의 카피 및 Fc 단쇄의 2개의 카피) 및 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. Fc 장쇄는 표 4 또는 표 5에서 선택된 역전하 돌연변이(예컨대, K409D/D399K 돌연변이)를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하며, 상기 Fc 도메인 단량체는 표 3에서 선택된 적어도 하나의 돌출부-형성 돌연변이(예컨대, S354C 및 T366W 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 돌출부와 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이(예컨대, E357K)를 갖는 Fc 도메인 단량체 및 항원 결합 도메인과 N-말단에서 직렬로 연결된다. Fc 단쇄는 표 3에서 선택된 적어도 하나의 함몰부-형성 돌연변이(예컨대, Y349C, T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 함몰부 및 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이(예컨대, K370D)를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함한다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하였고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝하였다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입하였다. Fc 단쇄 및 Fc 장쇄에 대한 아미노산 서열은 2개의 개별 플라스미드에 의해 암호화되었다. 발현된 단백질은 실시예 3에서와 같이 정제하였다.
실시예 16. Fc-항원 결합 도메인 작제물 14의 설계 및 정제
분지점이 C-말단 Fc 도메인에 있는 단일 분지형 Fc 도메인으로 형성된 작제물을 하기 기재된 바와 같이 제조한다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 14(도 14)는 2개의 구별되는 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(Fc 장쇄의 2개의 카피 및 Fc 단쇄의 2개의 카피) 및 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. Fc 장쇄는 표 4 또는 표 5에서 선택된 역전하 돌연변이(예컨대, K409D/D399K 돌연변이)를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하며, 상기 Fc 도메인 단량체는 표 3에서 선택된 적어도 하나의 돌출부-형성 돌연변이(예컨대, S354C 및 T366W 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 돌출부 및 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이(예컨대, E357K)를 갖는 Fc 도메인 단량체와 N-말단에서 직렬로 연결된다. Fc 단쇄는 표 3에서 선택된 적어도 하나의 함몰부-형성 돌연변이(예컨대, Y349C, T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 함몰부 및 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이(예컨대, K370D)를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하고, N-말단에서 항원 결합 도메인을 포함한다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝한다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입한다. Fc 단쇄 및 Fc 장쇄에 대한 아미노산 서열은 2개의 개별 플라스미드에 의해 암호화된다. 발현된 단백질은 실시예 3에서와 같이 정제한다.
실시예 17. Fc-항원 결합 도메인 작제물 15의 설계 및 정제
분지점이 C-말단 Fc 도메인에 있는 단일 분지형 Fc 도메인으로 형성된 작제물을 하기 기재된 바와 같이 제조한다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 15(도 15)는 2개의 구별되는 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(Fc 장쇄의 2개의 카피 및 Fc 단쇄의 2개의 카피) 및 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. Fc 장쇄는 표 4 또는 표 5에서 선택된 역전하 돌연변이(예컨대, K409D/D399K 돌연변이)를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하며, 상기 Fc 도메인 단량체는 표 3에서 선택된 적어도 하나의 돌출부-형성 돌연변이(예컨대, S354C 및 T366W 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 돌출부와 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이(예컨대, E357K)를 갖는 Fc 도메인 단량체 및 항원 결합 도메인과 N-말단에서 직렬로 연결된다. Fc 단쇄는 표 3에서 선택된 적어도 하나의 함몰부-형성 돌연변이(예컨대, Y349C, T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 함몰부 및 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이(예컨대, K370D)를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하고, N-말단에서 항원 결합 도메인을 포함한다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝한다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입한다. Fc 단쇄 및 Fc 장쇄에 대한 아미노산 서열은 2개의 개별 플라스미드에 의해 암호화된다. 발현된 단백질은 실시예 3에서와 같이 정제한다.
실시예 18. Fc-항원 결합 도메인 작제물 16의 설계 및 정제
분지점이 C-말단 Fc 도메인에 있는 단일 분지형 Fc 도메인으로 형성된 작제물을 하기 기재된 바와 같이 제조하였다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 16(도 16)은 2개의 구별되는 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(Fc 장쇄의 2개의 카피 및 Fc 단쇄의 4개의 카피) 및 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. Fc 장쇄는 표 4 또는 표 5에서 선택된 역전하 돌연변이(예컨대, K409D/D399K 돌연변이)를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하며, 상기 Fc 도메인 단량체는 표 3에서 선택된 적어도 하나의 돌출부-형성 돌연변이(예컨대, S354C 및 T366W 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 돌출부와 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이(예컨대, E357K)를 각각 갖는 2개의 Fc 도메인 단량체 및 항원 결합 도메인과 N-말단에서 직렬로 연결된다. Fc 단쇄는 표 3에서 선택된 적어도 하나의 함몰부-형성 돌연변이(예컨대, Y349C, T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 함몰부 및 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이(예컨대, K370D)를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함한다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하였고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝하였다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입하였다. Fc 단쇄 및 Fc 장쇄에 대한 아미노산 서열은 2개의 개별 플라스미드에 의해 암호화되었다. 발현된 단백질은 실시예 3에서와 같이 정제하였다.
실시예 19. Fc-항원 결합 도메인 작제물 17의 설계 및 정제
분지점이 C-말단 Fc 도메인에 있는 단일 분지형 Fc 도메인으로 형성된 작제물을 하기 기재된 바와 같이 제조한다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 17(도 17)은 2개의 구별되는 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(Fc 장쇄의 2개의 카피 및 Fc 단쇄의 4개의 카피) 및 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. Fc 장쇄는 표 4 또는 표 5에서 선택된 역전하 돌연변이(예컨대, K409D/D399K 돌연변이)를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하며, 상기 Fc 도메인 단량체는 표 3에서 선택된 적어도 하나의 돌출부-형성 돌연변이(예컨대, S354C 및 T366W 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 돌출부와 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이(예컨대, E357K)를 각각 갖는 2개의 Fc 도메인 단량체와 N-말단에서 직렬로 연결된다. Fc 단쇄는 표 3에서 선택된 적어도 하나의 함몰부-형성 돌연변이(예컨대, Y349C, T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 함몰부 및 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이(예컨대, K370D)를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하고, N-말단에서 항원 결합 도메인을 포함한다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝한다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입한다. Fc 단쇄 및 Fc 장쇄에 대한 아미노산 서열은 2개의 개별 플라스미드에 의해 암호화된다. 발현된 단백질은 실시예 3에서와 같이 정제한다.
실시예 20. Fc-항원 결합 도메인 작제물 18의 설계 및 정제
분지점이 C-말단 Fc 도메인에 있는 단일 분지형 Fc 도메인으로 형성된 작제물을 하기 기재된 바와 같이 제조한다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 18(도 18)은 2개의 구별되는 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(Fc 장쇄의 2개의 카피 및 Fc 단쇄의 4개의 카피) 및 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. Fc 장쇄는 표 4 또는 표 5에서 선택된 역전하 돌연변이(예컨대, K409D/D399K 돌연변이)를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하며, 상기 Fc 도메인 단량체는 표 3에서 선택된 적어도 하나의 돌출부-형성 돌연변이(예컨대, S354C 및 T366W 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 돌출부와 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이(예컨대, E357K)를 각각 갖는 2개의 Fc 도메인 단량체 및 항원 결합 도메인과 N-말단에서 직렬로 연결된다. Fc 단쇄는 표 3에서 선택된 적어도 하나의 함몰부-형성 돌연변이(예컨대, Y349C, T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 함몰부 및 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이(예컨대, K370D)를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하고, N-말단에서 항원 결합 도메인을 포함한다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝한다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입한다. Fc 단쇄 및 Fc 장쇄에 대한 아미노산 서열은 2개의 개별 플라스미드에 의해 암호화된다. 발현된 단백질은 실시예 3에서와 같이 정제한다.
실시예 21. Fc-항원 결합 도메인 작제물 19의 설계 및 정제
분지점이 N-말단 또는 C-말단 Fc 도메인에 없는 단일 분지형 Fc 도메인으로 형성된 작제물을 하기 기재된 바와 같이 제조하였다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 19(도 19)는 2개의 구별되는 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(Fc 장쇄의 2개의 카피 및 Fc 단쇄의 4개의 카피) 및 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. Fc 장쇄는 표 3에서 선택된 적어도 하나의 돌출부-형성 돌연변이(예컨대, S354C 및 T366W 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 돌출부와 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이(예컨대, E357K)를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하며, 상기 Fc 도메인 단량체는 표 4 또는 표 5에서 선택된 역전하 돌연변이(예컨대, K409D/D399K 돌연변이)를 갖는 Fc 도메인 단량체, 표 3에서 선택된 적어도 하나의 돌출부-형성 돌연변이(예컨대, S354C 및 T366W 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 돌출부와 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이(예컨대, E357K)를 갖는 또 다른 Fc 도메인 단량체, 및 항원 결합 도메인과 N-말단에서 직렬로 연결된다. Fc 단쇄는 표 3에서 선택된 적어도 하나의 함몰부-형성 돌연변이(예컨대, Y349C, T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 함몰부 및 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이(예컨대, K370D)를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함한다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하였고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝하였다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입하였다. Fc 단쇄 및 Fc 장쇄에 대한 아미노산 서열은 2개의 개별 플라스미드에 의해 암호화되었다. 발현된 단백질은 실시예 3에서와 같이 정제하였다.
실시예 22. Fc-항원 결합 도메인 작제물 20의 설계 및 정제
분지점이 C-말단 Fc 도메인에 있는 단일 분지형 Fc 도메인으로 형성된 작제물을 하기 기재된 바와 같이 제조한다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 20(도 20)은 2개의 구별되는 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(Fc 장쇄의 2개의 카피 및 Fc 단쇄의 4개의 카피) 및 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. Fc 장쇄는 표 3에서 선택된 적어도 하나의 돌출부-형성 돌연변이(예컨대, S354C 및 T366W 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 돌출부와 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이(예컨대, E357K)를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하며, 상기 Fc 도메인 단량체는 표 4 또는 표 5에서 선택된 역전하 돌연변이(예컨대, K409D/D399K 돌연변이)를 갖는 Fc 도메인 단량체, 및 표 3에서 선택된 적어도 하나의 돌출부-형성 돌연변이(예컨대, S354C 및 T366W 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 돌출부와 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이(예컨대, E357K)를 갖는 또 다른 Fc 도메인 단량체와 N-말단에서 직렬로 연결된다. Fc 단쇄는 표 3에서 선택된 적어도 하나의 함몰부-형성 돌연변이(예컨대, Y349C, T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 함몰부 및 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이(예컨대, K370D)를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하고, N-말단에서 항원 결합 도메인을 포함한다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝한다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입한다. Fc 단쇄 및 Fc 장쇄에 대한 아미노산 서열은 2개의 개별 플라스미드에 의해 암호화된다. 발현된 단백질은 실시예 3에서와 같이 정제한다.
실시예 23. Fc-항원 결합 도메인 작제물 21의 설계 및 정제
분지점이 C-말단 Fc 도메인에 있는 단일 분지형 Fc 도메인으로 형성된 작제물을 하기 기재된 바와 같이 제조한다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 21(도 21)은 2개의 구별되는 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(Fc 장쇄의 2개의 카피 및 Fc 단쇄의 4개의 카피) 및 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. Fc 장쇄는 표 3에서 선택된 적어도 하나의 돌출부-형성 돌연변이(예컨대, S354C 및 T366W 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 돌출부와 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이(예컨대, E357K)를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하며, 상기 Fc 도메인 단량체는 표 4 또는 표 5에서 선택된 역전하 돌연변이(예컨대, K409D/D399K 돌연변이)를 갖는 Fc 도메인 단량체, 표 3에서 선택된 적어도 하나의 돌출부-형성 돌연변이(예컨대, S354C 및 T366W 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 돌출부와 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이(예컨대, E357K)를 갖는 또 다른 Fc 도메인 단량체, 및 항원 결합 도메인과 N-말단에서 직렬로 연결된다. Fc 단쇄는 표 3에서 선택된 적어도 하나의 함몰부-형성 돌연변이(예컨대, Y349C, T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 함몰부 및 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이(예컨대, K370D)를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하고, N-말단에서 항원 결합 도메인을 포함한다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝한다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입한다. Fc 단쇄 및 Fc 장쇄에 대한 아미노산 서열은 2개의 개별 플라스미드에 의해 암호화된다. 발현된 단백질은 실시예 3에서와 같이 정제한다.
실시예 24. Fc-항원 결합 도메인 작제물 22의 설계 및 정제
상이한 항원 결합 도메인을 갖는 Fc 장쇄 및 단쇄를 사용해 형성된 이중 특이적 작제물은 하기와 같이 제조된다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 22(도 22)는 2개의 구별되는 별개 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(긴 Fc 사슬 및 두 카피의 짧은 Fc 사슬) 및 2개의 별개의 경쇄 폴리펩티드 또는 공통 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. Fc 장쇄는 표 3에서 선택된 적어도 하나의 돌출부-형성 돌연변이(예컨대, S354C 및 T366W 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 돌출부와 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이(예컨대, E357K)를 각각 갖는 직렬로 연결된 2개의 Fc 도메인 단량체를 포함하고, 제1 특이성의 항원 결합 도메인을 N-말단에서 포함한다. Fc 단쇄는 표 3에서 선택된 적어도 하나의 함몰부-형성 돌연변이(예컨대, Y349C, T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 함몰부와 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이(예컨대, K370D)를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하고, 제2 특이성의 항원 결합 도메인을 N-말단에서 포함한다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝한다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입한다. Fc 단쇄 및 Fc 장쇄에 대한 아미노산 서열은 2개의 개별 플라스미드에 의해 암호화된다. 발현된 단백질은 실시예 3에서와 같이 정제한다.
실시예 25. Fc-항원 결합 도메인 작제물 23의 설계 및 정제
상이한 항원 결합 도메인을 갖는 Fc 장쇄 및 단쇄를 사용해 형성된 이중 특이적 작제물은 하기와 같이 제조된다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 23(도 23)은 2개의 구별되는 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(Fc 장쇄, 및 Fc 단쇄의 3개의 카피) 및 2개의 구별되는 경쇄 폴리펩티드 또는 공통 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. Fc 장쇄는 표 3에서 선택된 적어도 하나의 돌출부-형성 돌연변이(예컨대, S354C 및 T366W 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 돌출부와 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이(예컨대, E357K)를 각각 갖는 직렬로 연결된 3개의 Fc 도메인 단량체를 포함하고, 제1 특이성의 항원 결합 도메인을 N-말단에서 포함한다. Fc 단쇄는 표 3에서 선택된 적어도 하나의 함몰부-형성 돌연변이(예컨대, Y349C, T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 함몰부와 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이(예컨대, K370D)를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하고, 제2 특이성의 항원 결합 도메인을 N-말단에서 포함한다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝한다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입한다. Fc 단쇄 및 Fc 장쇄에 대한 아미노산 서열은 2개의 개별 플라스미드에 의해 암호화된다. 발현된 단백질은 실시예 3에서와 같이 정제한다.
실시예 26. Fc-항원 결합 도메인 작제물 24의 설계 및 정제
상이한 항원 결합 도메인을 갖는 Fc 장쇄 및 단쇄를 사용해 형성된 이중 특이적 작제물은 하기와 같이 제조된다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 24(도 24)는 2개의 구별되는 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(Fc 장쇄의 2개의 카피, 및 Fc 단쇄의 2개의 카피) 및 2개의 구별되는 경쇄 폴리펩티드 또는 공통 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. Fc 장쇄는 표 4 또는 5에서 선택된 역전하 돌연변이(예컨대, K409D/D399K 돌연변이)를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하며, 상기 Fc 도메인 단량체는 표 3에서 선택된 적어도 하나의 돌출부-형성 돌연변이(예컨대, S354C 및 T366W 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 돌출부와 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이(예컨대, E357K)를 갖는 Fc 도메인 단량체 및 제1 특이성의 항원 결합 도메인과 N-말단에서 직렬로 연결된다. Fc 단쇄는 표 3에서 선택된 적어도 하나의 함몰부-형성 돌연변이(예컨대, Y349C, T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 함몰부와 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이(예컨대, K370D)를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하고, 제2 특이성의 항원 결합 도메인을 N-말단에서 포함한다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝한다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입한다. Fc 단쇄 및 Fc 장쇄에 대한 아미노산 서열은 2개의 개별 플라스미드에 의해 암호화된다. 발현된 단백질은 실시예 3에서와 같이 정제한다.
실시예 27. Fc-항원 결합 도메인 작제물 25의 설계 및 정제
상이한 항원 결합 도메인을 갖는 Fc 장쇄 및 단쇄를 사용해 형성된 이중 특이적 작제물은 하기와 같이 제조된다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 25(도 25)는 2개의 구별되는 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(Fc 장쇄의 2개의 카피, 및 Fc 단쇄의 2개의 카피) 및 2개의 구별되는 경쇄 폴리펩티드 또는 공통 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. Fc 장쇄는 표 3에서 선택된 적어도 하나의 돌출부-형성 돌연변이(예컨대, S354C 및 T366W 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 돌출부와 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이(예컨대, E357K)를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하며, 상기 Fc 도메인 단량체는 표 4 또는 표 5에서 선택된 역전하 돌연변이(예컨대, K409D/D399K 돌연변이)를 갖는 Fc 도메인 단량체 및 제1 특이성의 항원 결합 도메인과 N-말단에서 직렬로 연결된다. Fc 단쇄는 표 3에서 선택된 적어도 하나의 함몰부-형성 돌연변이(예컨대, Y349C, T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 함몰부와 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이(예컨대, K370D)를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하고, 제2 특이성의 항원 결합 도메인을 N-말단에서 포함한다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝한다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입한다. Fc 단쇄 및 Fc 장쇄에 대한 아미노산 서열은 2개의 개별 플라스미드에 의해 암호화된다. 발현된 단백질은 실시예 3에서와 같이 정제한다.
실시예 28. Fc-항원 결합 도메인 작제물 26의 설계 및 정제
상이한 항원 결합 도메인을 갖는 Fc 장쇄 및 단쇄를 사용해 형성된 이중 특이적 작제물은 하기와 같이 제조된다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 26(도 26)은 2개의 구별되는 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(Fc 장쇄의 2개의 카피, 및 Fc 단쇄의 4개의 카피) 및 2개의 구별되는 경쇄 폴리펩티드 또는 공통 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. Fc 장쇄는 표 4 또는 표 5에서 선택된 역전하 돌연변이(예컨대 K409D/D399K 돌연변이)를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하며, 상기 Fc 도메인 단량체는 표 3에서 선택된 적어도 하나의 돌출부-형성 돌연변이(예컨대, S354C 및 T366W 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 돌출부와 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이(예컨대, E357K)를 각각 갖는 2개의 Fc 도메인 단량체 및 제1 특이성의 항원 결합 도메인과 N-말단에서 직렬로 연결된다. Fc 단쇄는 표 3에서 선택된 적어도 하나의 함몰부-형성 돌연변이(예컨대, Y349C, T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 함몰부와 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이(예컨대, K370D)를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하고, 제2 특이성의 항원 결합 도메인을 N-말단에서 포함한다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝한다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입한다. Fc 단쇄 및 Fc 장쇄에 대한 아미노산 서열은 2개의 개별 플라스미드에 의해 암호화된다. 발현된 단백질은 실시예 3에서와 같이 정제한다.
실시예 29. Fc-항원 결합 도메인 작제물 27의 설계 및 정제
상이한 항원 결합 도메인을 갖는 Fc 장쇄 및 단쇄를 사용해 형성된 이중 특이적 작제물은 하기와 같이 제조된다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 27(도 27)은 2개의 구별되는 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(Fc 장쇄의 2개의 카피, 및 Fc 단쇄의 4개의 카피) 및 2개의 구별되는 경쇄 폴리펩티드 또는 공통 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. Fc 장쇄는 표 3에서 선택된 적어도 하나의 돌출부-형성 돌연변이(예컨대, S354C 및 T366W 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 돌출부와 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이(예컨대, E357K)를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하며, 상기 Fc 도메인 단량체는 표 4 또는 표 5에서 선택된 역전하 돌연변이(예컨대, K409D/D399K 돌연변이)를 갖는 Fc 도메인 단량체, 표 3에서 선택된 적어도 하나의 돌출부-형성 돌연변이(예컨대, S354C 및 T366W 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 돌출부와 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이(예컨대, E357K)를 갖는 또 다른 Fc 도메인 단량체, 및 제1 특이성의 항원 결합 도메인과 N-말단에서 직렬로 연결된다. Fc 단쇄는 표 3에서 선택된 적어도 하나의 함몰부-형성 돌연변이(예컨대, Y349C, T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 함몰부와 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이(예컨대, K370D)를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하고, 제2 특이성의 항원 결합 도메인을 N-말단에서 포함한다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝한다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입한다. Fc 단쇄 및 Fc 장쇄에 대한 아미노산 서열은 2개의 개별 플라스미드에 의해 암호화된다. 발현된 단백질은 실시예 3에서와 같이 정제한다.
실시예 30. Fc-항원 결합 도메인 작제물 28의 설계 및 정제
상이한 항원 결합 도메인을 갖는 Fc 장쇄 및 단쇄를 사용해 형성된 이중 특이적 작제물은 하기와 같이 제조된다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 28(도 28)은 2개의 구별되는 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(Fc 장쇄의 2개의 카피, 및 Fc 단쇄의 4개의 카피) 및 2개의 구별되는 경쇄 폴리펩티드 또는 공통 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. Fc 장쇄는 표 3에서 선택된 적어도 하나의 돌출부-형성 돌연변이(예컨대, S354C 및 T366W 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 돌출부와 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이(예컨대, E357K)를 각각 갖는 2개의 Fc 도메인 단량체를 포함하며, 상기 Fc 도메인 단량체들은 표 4 또는 표 5에서 선택된 역전하 돌연변이(예컨대, K409D/D399K 돌연변이)를 갖는 Fc 도메인 단량체 및 제1 특이성의 항원 결합 도메인과 N-말단에서 직렬로 연결된다. Fc 단쇄는 표 3에서 선택된 적어도 하나의 함몰부-형성 돌연변이(예컨대, Y349C, T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이)를 도입하여 만들어진 유전자 조작 함몰부와 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이(예컨대, K370D)를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하고, 제2 특이성의 항원 결합 도메인을 N-말단에서 포함한다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝한다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입한다. Fc 단쇄 및 Fc 장쇄에 대한 아미노산 서열은 2개의 개별 플라스미드에 의해 암호화된다. 발현된 단백질은 실시예 3에서와 같이 정제한다.
실시예 31. Fc-항원 결합 도메인 작제물 29의 설계 및 정제
상이한 항원 결합 도메인 및 2개의 상이한 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 Fc 장쇄 및 Fc 단쇄를 사용하여 형성된 이중 특이적 작제물은 하기와 같이 제조된다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 29(도 29)는 3개의 구별되는 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(Fc 장쇄, 및 2개의 구별되는 Fc 단쇄) 및 2개의 구별되는 경쇄 폴리펩티드 또는 공통 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. Fc 장쇄는 표 3으로부터 선택된 돌출부-형성 돌연변이의 상이한 세트(이종이량체화 돌연변이) 및 임의로 표 4로부터 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 각각 갖는 2개의 Fc 도메인 단량체를 포함하며, 상기 Fc 도메인 단량체들은 제1 특이성의 항원 결합 도메인과 N-말단에서 직렬로 연결된다. 제1 Fc 단쇄는 표 3에서 선택된 제1 세트의 함몰부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하고, 제2 특이성의 항원 결합 도메인을 N-말단에서 포함한다. 제2 Fc 단쇄는, 표 3에서 선택되고 제1 Fc 단쇄의 제1 세트의 돌연변이와 다른 제2 세트의 함몰부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함한다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝한다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입한다. Fc 단쇄 및 Fc 장쇄에 대한 아미노산 서열은 3개의 개별 플라스미드에 의해 암호화된다. 발현된 단백질은 실시예 3에서와 같이 정제한다.
실시예 32. Fc-항원 결합 도메인 작제물 30의 설계 및 정제
상이한 항원 결합 도메인 및 2개의 상이한 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 Fc 장쇄 및 Fc 단쇄를 사용하여 형성된 이중 특이적 작제물은 하기와 같이 제조된다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 30(도 30)은 3개의 구별되는 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(Fc 장쇄, 및 2개의 구별되는 Fc 단쇄) 및 2개의 구별되는 경쇄 폴리펩티드 또는 공통 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. Fc 장쇄는 표 3으로부터 선택된 돌출부-형성 돌연변이의 상이한 세트(이종이량체화 돌연변이) 및 임의로 표 4로부터 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 각각 갖는 2개의 Fc 도메인 단량체를 포함하며, 상기 Fc 도메인 단량체들은 제1 특이성의 항원 결합 도메인과 N-말단에서 직렬로 연결된다. 제1 Fc 단쇄는 표 3에서 선택된 제1 세트의 함몰부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하고, 제2 특이성의 항원 결합 도메인을 N-말단에서 포함한다. 제2 Fc 단쇄는, 표 3에서 선택되고 제1 Fc 단쇄의 제1 세트의 돌연변이와 다른 제2 세트의 함몰부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하고, 제1 특이성의 항원 결합 도메인을 N-말단에서 포함한다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝한다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입한다. Fc 단쇄 및 Fc 장쇄에 대한 아미노산 서열은 3개의 개별 플라스미드에 의해 암호화된다. 발현된 단백질은 실시예 3에서와 같이 정제한다.
실시예 33. Fc-항원 결합 도메인 작제물 31의 설계 및 정제
상이한 항원 결합 도메인 및 2개의 상이한 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 Fc 장쇄 및 Fc 단쇄를 사용하여 형성된 삼중 특이적 작제물은 하기와 같이 제조된다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 31(도 31)은 3개의 구별되는 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(Fc 장쇄, 및 2개의 구별되는 Fc 단쇄) 및 2개의 구별되는 경쇄 폴리펩티드 또는 공통 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. Fc 장쇄는 표 3으로부터 선택된 돌출부-형성 돌연변이의 상이한 세트(이종이량체화 돌연변이) 및 임의로 표 4로부터 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 각각 갖는 2개의 Fc 도메인 단량체를 포함하며, 상기 Fc 도메인 단량체들은 제1 특이성의 항원 결합 도메인과 N-말단에서 직렬로 연결된다. 제1 Fc 단쇄는 표 3에서 선택된 제1 세트의 함몰부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하고, 제2 특이성의 항원 결합 도메인을 N-말단에서 포함한다. 제2 Fc 단쇄는, 표 3에서 선택되고 제1 Fc 단쇄의 제1 세트의 돌연변이와 다른 제2 세트의 함몰부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하고, 제3 특이성의 항원 결합 도메인을 N-말단에서 포함한다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝한다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입한다. Fc 단쇄 및 Fc 장쇄에 대한 아미노산 서열은 3개의 개별 플라스미드에 의해 암호화된다. 발현된 단백질은 실시예 3에서와 같이 정제한다.
실시예 34. Fc-항원 결합 도메인 작제물 32의 설계 및 정제
상이한 항원 결합 도메인 및 2개의 상이한 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 Fc 장쇄 및 Fc 단쇄를 사용하여 형성된 이중 특이적 작제물은 하기와 같이 제조된다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 32(도 32)는 3개의 구별되는 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(Fc 장쇄, 하나의 Fc 단쇄의 2개의 카피, 및 제2 Fc 단쇄의 1개의 카피) 및 2개의 구별되는 경쇄 폴리펩티드 또는 공통 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. Fc 장쇄는 3개의 Fc 도메인 단량체를 포함하되, 상기 Fc 도메인 단량체는 표 3에서 선택된 돌출부-형성 돌연변이의 세트(이종이량체화 돌연변이) 및 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 각각 가지고(제3 Fc 도메인 단량체는 첫 2개의 Fc 도메인 단량체와 다른 이종이량체화 돌연변이 세트를 가짐), 제1 특이성의 항원 결합 도메인과 N-말단에서 직렬로 연결된다. 제1 Fc 단쇄는 표 3에서 선택된 제1 세트의 함몰부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하고, 제2 특이성의 항원 결합 도메인을 N-말단에서 포함한다. 제2 Fc 단쇄는, 표 3에서 선택되고 제1 Fc 단쇄의 제1 세트의 돌연변이와 다른 제2 세트의 함몰부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함한다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝한다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입한다. Fc 단쇄 및 Fc 장쇄에 대한 아미노산 서열은 3개의 개별 플라스미드에 의해 암호화된다. 발현된 단백질은 실시예 3에서와 같이 정제한다.
실시예 35. Fc-항원 결합 도메인 작제물 33의 설계 및 정제
상이한 항원 결합 도메인 및 2개의 상이한 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 Fc 장쇄 및 Fc 단쇄를 사용하여 형성된 이중 특이적 작제물은 하기와 같이 제조된다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 33(도 33)은 3개의 구별되는 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(Fc 장쇄, 제1 Fc 단쇄의 2개의 카피, 및 제2 Fc 단쇄의 1개의 카피) 및 2개의 구별되는 경쇄 폴리펩티드 또는 공통 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. Fc 장쇄는 3개의 Fc 도메인 단량체를 포함하되, 상기 Fc 도메인 단량체는 표 3에서 선택된 돌출부-형성 돌연변이의 세트(이종이량체화 돌연변이) 및 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 각각 가지고(제3 Fc 도메인 단량체는 첫 2개의 Fc 도메인 단량체와 다른 이종이량체화 돌연변이 세트를 가짐), 제1 특이성의 항원 결합 도메인과 N-말단에서 직렬로 연결된다. 제1 Fc 단쇄는 표 3에서 선택된 제1 세트의 함몰부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하고, 제2 특이성의 항원 결합 도메인을 N-말단에서 포함한다. 제2 Fc 단쇄는, 표 3에서 선택되고 제1 Fc 단쇄의 제1 세트의 돌연변이와 다른 제2 세트의 함몰부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하고, 제1 특이성의 항원 결합 도메인을 N-말단에서 포함한다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝한다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입한다. Fc 단쇄 및 Fc 장쇄에 대한 아미노산 서열은 3개의 개별 플라스미드에 의해 암호화된다. 발현된 단백질은 실시예 3에서와 같이 정제한다.
실시예 36. Fc-항원 결합 도메인 작제물 34의 설계 및 정제
상이한 항원 결합 도메인 및 2개의 상이한 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 Fc 장쇄 및 Fc 단쇄를 사용하여 형성된 삼중 특이적 작제물은 하기와 같이 제조된다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 34(도 34)는 3개의 구별되는 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(Fc 장쇄, 제1 Fc 단쇄의 2개의 카피, 제2 Fc 단쇄의 1개의 카피) 및 3개 또는 2개의 구별되는 경쇄 폴리펩티드 또는 공통 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. Fc 장쇄는 3개의 Fc 도메인 단량체를 포함하되, 상기 Fc 도메인 단량체는 표 3에서 선택된 돌출부-형성 돌연변이의 세트(이종이량체화 돌연변이) 및 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 각각 가지고(제3 Fc 도메인 단량체는 첫 2개의 Fc 도메인 단량체와 다른 이종이량체화 돌연변이 세트를 가짐), 제1 특이성의 항원 결합 도메인과 N-말단에서 직렬로 연결된다. 제1 Fc 단쇄는 표 3에서 선택된 제1 세트의 함몰부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하고, 제2 특이성의 항원 결합 도메인을 N-말단에서 포함한다. 제2 Fc 단쇄는, 표 3에서 선택되고 제1 Fc 단쇄의 제1 세트의 돌연변이와 다른 제2 세트의 함몰부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하고, 제3 특이성의 항원 결합 도메인을 N-말단에서 포함한다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝한다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입한다. Fc 단쇄 및 Fc 장쇄에 대한 아미노산 서열은 3개의 개별 플라스미드에 의해 암호화된다. 발현된 단백질은 실시예 3에서와 같이 정제한다.
실시예 37. Fc-항원 결합 도메인 작제물 35의 설계 및 정제
상이한 항원 결합 도메인 및 2개의 상이한 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 Fc 장쇄 및 Fc 단쇄를 사용하여 형성된 삼중 특이적 작제물은 하기와 같이 제조된다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 35(도 35)는 4개의 구별되는 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(2개의 구별되는 Fc 장쇄, 및 2개의 구별되는 Fc 단쇄) 및 3개 또는 2개의 구별되는 경쇄 폴리펩티드 또는 공통 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. 제1 Fc 장쇄는 표 4 또는 표 5에서 선택된 역전하 돌연변이(예컨대 K409D/D399K 돌연변이)를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하며, 상기 Fc 도메인 단량체는 표 3에서 선택된 제1 세트의 돌출부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이)와 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체 및 제1 특이성의 항원 결합 도메인과 N-말단에서 직렬로 연결된다. 제2 Fc 장쇄는 표 4 또는 표 5에서 선택된 역전하 돌연변이(예컨대, K409D/D399K 돌연변이)를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하며, 상기 Fc 도메인 단량체는, 표 3에서 선택되고 제1 Fc 장쇄의 제1 세트의 돌연변이와 다른 제2 세트의 돌출부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이)와 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체 및 제1 특이성의 항원 결합 도메인과 N-말단에서 직렬로 연결된다. 제1 Fc 단쇄는 표 3에서 선택된 제1 세트의 함몰부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이)와 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하고, 제2 특이성의 항원 결합 도메인을 N-말단에서 포함한다. 제2 Fc 단쇄는, 표 3에서 선택되고 제1 Fc 단쇄의 제1 세트의 돌연변이와 다른 제2 세트의 함몰부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이)와 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하고, 제3 특이성의 항원 결합 도메인을 N-말단에서 포함한다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝한다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입한다. Fc 단쇄 및 Fc 장쇄에 대한 아미노산 서열은 4개의 개별 플라스미드에 의해 암호화된다. 발현된 단백질은 실시예 3에서와 같이 정제한다.
실시예 38. Fc-항원 결합 도메인 작제물 36의 설계 및 정제
상이한 항원 결합 도메인 및 2개의 상이한 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 Fc 장쇄 및 Fc 단쇄를 사용하여 형성된 이중 특이적 작제물은 하기와 같이 제조된다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 36(도 36)은 3개의 구별되는 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(Fc 장쇄의 2개의 카피, 2개의 구별되는 Fc 단쇄 각각의 2개의 카피) 및 2개의 구별되는 경쇄 폴리펩티드 또는 공통 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. Fc 장쇄는 사슬은 표 3에서 선택된 제1 세트의 돌출부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이)와 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하며, 상기 Fc 도메인 단량체는 표 4 또는 표 5에서 선택된 역전하 돌연변이(예컨대, K409D/D399K 돌연변이)를 갖는 Fc 도메인 단량체, 표 3에서 선택된 제2 세트의 돌출부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이)와 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 제2 Fc 도메인 단량체, 및 제1 특이성의 항원 결합 도메인과 N-말단에서 직렬로 연결된다. 제1 Fc 단쇄는, 표 3에서 선택된 제1 세트의 함몰부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이)와 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함한다. 제2 Fc 단쇄는, 표 3에서 선택되고 제1 Fc 단쇄의 제1 세트의 돌연변이와 다른 제2 세트의 함몰부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이)와 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하고, 제2 특이성의 항원 결합 도메인을 N-말단에서 포함한다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝한다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입한다. Fc 단쇄 및 Fc 장쇄에 대한 아미노산 서열은 3개의 개별 플라스미드에 의해 암호화된다. 발현된 단백질은 실시예 3에서와 같이 정제한다.
실시예 39. Fc-항원 결합 도메인 작제물 37의 설계 및 정제
상이한 항원 결합 도메인 및 2개의 상이한 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 Fc 장쇄 및 Fc 단쇄를 사용하여 형성된 삼중 특이적 작제물은 하기와 같이 제조된다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 37(도 37)은 3개의 구별되는 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(Fc 장쇄의 2개의 카피, 및 2개의 구별되는 Fc 단쇄 각각의 2개의 카피) 및 3개 또는 2개의 구별되는 경쇄 폴리펩티드 또는 공통 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. Fc 장쇄는 사슬은 표 3에서 선택된 제1 세트의 돌출부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이)와 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하며, 상기 Fc 도메인 단량체는 표 4 또는 표 5에서 선택된 역전하 돌연변이(예컨대, K409D/D399K 돌연변이)를 갖는 Fc 도메인 단량체, 표 3에서 선택된 제2 세트의 돌출부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이)와 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 제2 Fc 도메인 단량체, 및 제1 특이성의 항원 결합 도메인과 N-말단에서 직렬로 연결된다. 제1 Fc 단쇄는 표 3에서 선택된 제1 세트의 함몰부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하고, 제2 특이성의 항원 결합 도메인을 N-말단에서 포함한다. 제2 Fc 단쇄는, 표 3에서 선택되고 제1 Fc 단쇄의 제1 세트의 돌연변이와 다른 제2 세트의 함몰부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이)와 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하고, 제3 특이성의 항원 결합 도메인을 N-말단에서 포함한다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝한다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입한다. Fc 단쇄 및 Fc 장쇄에 대한 아미노산 서열은 3개의 개별 플라스미드에 의해 암호화된다. 발현된 단백질은 실시예 3에서와 같이 정제한다.
실시예 40. Fc-항원 결합 도메인 작제물 38의 설계 및 정제
상이한 항원 결합 도메인 및 2개의 상이한 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 Fc 장쇄 및 Fc 단쇄를 사용하여 형성된 삼중 특이적 작제물은 하기와 같이 제조된다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 38(도 38)은 4개의 구별되는 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(2개의 구별되는 Fc 장쇄, 및 2개의 구별되는 Fc 단쇄) 및 3개 또는 2개의 구별되는 경쇄 폴리펩티드 또는 공통 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. 제1 Fc 장쇄는 표 3에서 선택된 제1 세트의 돌출부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이)와 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하며, 상기 Fc 도메인 단량체는 표 4 또는 표 5에서 선택된 역전하 돌연변이(예컨대, K409D/D399K 돌연변이)를 갖는 Fc 도메인 단량체 및 제1 특이성의 항원 결합 도메인과 N-말단에서 직렬로 연결된다. 제2 Fc 장쇄는, 표 3에서 선택되고 제1 Fc 장쇄의 제1 세트의 돌연변이와 다른 제2 세트의 돌출부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이)와 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하며, 상기 Fc 도메인 단량체는 표 4 또는 표 5에서 선택된 역전하 돌연변이(예컨대, K409D/D399K 돌연변이)를 갖는 Fc 도메인 단량체 및 제1 특이성의 항원 결합 도메인과 N-말단에서 직렬로 연결된다. 제1 Fc 단쇄는 표 3에서 선택된 제1 세트의 함몰부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하고, 제2 특이성의 항원 결합 도메인을 N-말단에서 포함한다. 제2 Fc 단쇄는, 표 3에서 선택되고 제1 Fc 단쇄의 제1 세트의 돌연변이와 다른 제2 세트의 함몰부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이)와 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하고, 제3 특이성의 항원 결합 도메인을 N-말단에서 포함한다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝한다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입한다. Fc 단쇄 및 Fc 장쇄에 대한 아미노산 서열은 4개의 개별 플라스미드에 의해 암호화된다. 발현된 단백질은 실시예 3에서와 같이 정제한다.
실시예 41. Fc-항원 결합 도메인 작제물 39의 설계 및 정제
상이한 항원 결합 도메인 및 2개의 상이한 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 Fc 장쇄 및 Fc 단쇄를 사용하여 형성된 이중 특이적 작제물은 하기와 같이 제조된다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 39(도 39)는 3개의 구별되는 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(Fc 장쇄의 2개의 카피, 및 2개의 구별되는 Fc 단쇄 각각의 2개의 카피) 및 2개의 구별되는 경쇄 폴리펩티드 또는 공통 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. Fc 장쇄는 표 4 또는 표 5에서 선택된 역전하 돌연변이(예컨대, K409D/D399K 돌연변이)를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하며, 상기 Fc 도메인 단량체는, 표 3에서 선택된 제1 세트의 돌출부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이)와 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체, 표 3에서 선택된 제2 세트의 돌출부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이)와 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 제2 Fc 도메인 단량체, 및 제1 특이성의 항원 결합 도메인과 N-말단에서 직렬로 연결된다. 제1 Fc 단쇄는, 표 3에서 선택된 제1 세트의 함몰부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이)와 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함한다. 제2 Fc 단쇄는, 표 3에서 선택되고 제1 Fc 단쇄의 제1 세트의 돌연변이와 다른 제2 세트의 함몰부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이)와 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하고, 제2 특이성의 항원 결합 도메인을 N-말단에서 포함한다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝한다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입한다. Fc 단쇄 및 Fc 장쇄에 대한 아미노산 서열은 3개의 개별 플라스미드에 의해 암호화된다. 발현된 단백질은 실시예 3에서와 같이 정제한다.
실시예 42. Fc-항원 결합 도메인 작제물 40의 설계 및 정제
상이한 항원 결합 도메인 및 2개의 상이한 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 Fc 장쇄 및 Fc 단쇄를 사용하여 형성된 삼중 특이적 작제물은 하기와 같이 제조된다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 40(도 40)은 3개의 구별되는 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(Fc 장쇄의 2개의 카피, 및 2개의 구별되는 Fc 단쇄 각각의 2개의 카피) 및 3개 또는 2개의 구별되는 경쇄 폴리펩티드 또는 공통 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. Fc 장쇄는 표 4 또는 표 5에서 선택된 역전하 돌연변이(예컨대, K409D/D399K 돌연변이)를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하며, 상기 Fc 도메인 단량체는, 표 3에서 선택된 제1 세트의 돌출부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이)와 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체, 표 3에서 선택된 제2 세트의 돌출부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이)와 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 제2 Fc 도메인 단량체, 및 제1 특이성의 항원 결합 도메인과 N-말단에서 직렬로 연결된다. 제1 Fc 단쇄는, 표 3에서 선택된 제1 세트의 함몰부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이)와 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하고, 제2 특이성의 항원 결합 도메인을 N-말단에서 포함한다. 제2 Fc 단쇄는, 표 3에서 선택되고 제1 Fc 단쇄의 제1 세트의 돌연변이와 다른 제2 세트의 함몰부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이)와 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하고, 제3 특이성의 항원 결합 도메인을 N-말단에서 포함한다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝한다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입한다. Fc 단쇄 및 Fc 장쇄에 대한 아미노산 서열은 3개의 개별 플라스미드에 의해 암호화된다. 발현된 단백질은 실시예 3에서와 같이 정제한다.
실시예 43. Fc-항원 결합 도메인 작제물 41의 설계 및 정제
상이한 항원 결합 도메인 및 2개의 상이한 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 Fc 장쇄 및 Fc 단쇄를 사용하여 형성된 이중 특이적 작제물은 하기와 같이 제조된다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 41(도 41)은 3개의 구별되는 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(Fc 장쇄의 2개의 카피, 및 2개의 구별되는 Fc 단쇄 각각의 2개의 카피) 및 2개의 구별되는 경쇄 폴리펩티드 또는 공통 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. Fc 장쇄는 표 3에서 선택된 제1 세트의 돌출부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이)와 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 각각 갖는 2개의 Fc 도메인 단량체를 포함하며, 상기 Fc 도메인 단량체들은 표 4 또는 표 5에서 선택된 역전하 돌연변이(예컨대, K409D/D399K 돌연변이)를 갖는 Fc 도메인 단량체 및 제1 특이성의 항원 결합 도메인과 N-말단에서 직렬로 연결된다. 제1 Fc 단쇄는 표 3에서 선택된 제1 세트의 함몰부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하고, 제2 특이성의 항원 결합 도메인을 N-말단에서 포함한다. 제2 Fc 단쇄는, 표 3에서 선택되고 제1 Fc 단쇄의 제1 세트의 돌연변이와 다른 함몰부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이)와 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 함몰부 함유 Fc 도메인 단량체를 포함한다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝한다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입한다. Fc 단쇄 및 Fc 장쇄에 대한 아미노산 서열은 3개의 개별 플라스미드에 의해 암호화된다. 발현된 단백질은 실시예 3에서와 같이 정제한다.
실시예 44. Fc-항원 결합 도메인 작제물 42의 설계 및 정제
상이한 항원 결합 도메인 및 2개의 상이한 세트의 이종이량체화 돌연변이를 갖는 Fc 장쇄 및 Fc 단쇄를 사용하여 형성된 삼중 특이적 작제물은 하기와 같이 제조된다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 42(도 42)는 3개의 구별되는 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(Fc 장쇄의 2개의 카피, 및 2개의 구별되는 Fc 단쇄 각각의 2개의 카피) 및 3개 또는 2개의 구별되는 경쇄 폴리펩티드 또는 공통 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. Fc 장쇄는 표 3에서 선택된 제1 세트의 돌출부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이)와 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 각각 갖는 2개의 Fc 도메인 단량체를 포함하며, 상기 Fc 도메인 단량체들은 표 4 또는 표 5에서 선택된 역전하 돌연변이(예컨대, K409D/D399K 돌연변이)를 갖는 Fc 도메인 단량체 및 제1 특이성의 항원 결합 도메인과 N-말단에서 직렬로 연결된다. 제1 Fc 단쇄는 표 3에서 선택된 제1 세트의 함몰부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이) 및 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하고, 제2 특이성의 항원 결합 도메인을 N-말단에서 포함한다. 제2 Fc 단쇄는, 표 3에서 선택되고 제1 Fc 단쇄의 제1 세트의 돌연변이와 다른 제2 세트의 함몰부-형성 돌연변이(이종이량체화 돌연변이)와 임의로 표 4에서 선택된 하나 이상의 역전하 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하고, 제3 특이성의 항원 결합 도메인을 N-말단에서 포함한다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝한다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입한다. Fc 단쇄 및 Fc 장쇄에 대한 아미노산 서열은 3개의 개별 플라스미드에 의해 암호화된다. 발현된 단백질은 실시예 3에서와 같이 정제한다.
실시예 45. Fc-항원 결합 도메인 작제물의 발현
3개의 Fc 도메인 및 N-말단에서 CTLA4 Fab 도메인을 갖는 Fc-항원 결합 도메인 작제물을 설계했다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하였고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝하였다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입하였다. 발현된 단백질은 실시예 1에서와 같이 정제하였다. 단백질을 비환원 SDS-PAGE 겔 위로 흘렸다(도 44). S3I 및 S3Y SIF-바디 단백질은 2개의 상이한 단백질을 포함하는 육량체이며, 이들 각각은 상이한 플라스미드에서 발현되었다. 레인 상단의 숫자는 발현을 위해 세포 내로 형질감염시킨 플라스미드 DNA의 비율을 나타낸다. 2:1:1의 비율은 형질감염에 사용한 1 리터의 세포 중에 0.5 mg의 SIF-바디 장쇄 플라스미드, 0.25 mg의 SIF 단쇄 플라스미드, 및 0.25 mg의 Fab 경쇄가 존재함을 나타낸다. 1:1:1의 비율인 경우, 0.33 mg의 각 플라스미드가 사용되었다. 4:1:1의 비율인 경우, 0.67 mg의 장쇄, 0.167 mg의 단쇄, 및 0.167 mg의 경쇄가 사용되었다.
샘플을 95℃에서 10분간 Laemmli 샘플 완충액(4% SDS, Bio-Rad)에서 변성시켰다. Criterion TGX 무착색 겔(4~15% 폴리아크릴아미드, Bio-Rad)상에 샘플을 흘렸다. 단백질 밴드를 UV 조사 또는 쿠마시 블루 염색으로 시각화하였다. ChemiDoc MP Imaging System(Bio-Rad)으로 겔을 이미지화하였다. 작제물은 부모 항체와 유사하게 발현되는 것으로 나타났으며, SIF3와 유사한 기술을 사용해 불순물이 최소화되도록 정제하였다.
실시예 46. 표적 및 Fcγ 수용체에 대한 Fc 결합을 측정하기 위한 SPR 검정
작제물 7 및 13용 설계에 기반하여, 항-CTLA-4 항원 결합 도메인을 포함하는 2개의 작제물을 생성하였다. 두 Fc-항원 결합 도메인 작제물 모두의 부모 mAb 및 항원 결합 도메인은 이필리무맙의 CDR을 포함한다. CTLA-4에 대한 표적 결합을 측정하기 위해 SPR 검정을 수행하였다(도 45). 좌측 패널에서는, 부모 mAB, Fc3Y- Fc-항원 결합 도메인 작제물(이필리무맙 항원-결합 도메인을 사용해 변형된 버전의 작제물 13), 및 Fc3I- Fc-항원 결합 도메인 작제물(이필리무맙 항원-결합 도메인을 사용해 변형된 버전의 작제물 7)의 해리 상수를 측정하였다. Fc3Y-Fc는 부모 mAb에 비해 강화된 CTLA-4 표적 결합을 보여주었지만, Fc3I-Fc는 부모 mAb와 유사한 CTLA-4 표적 결합을 보여주었다. 우측 패널에는, 상이한 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 FcγRIIIa 결합을 측정하는 데 사용된 또 다른 SPR 검정의 결과가 도시되어 있다. 3가지 버전의 이필리무맙을 시험하였으며, 탈푸코실화는 결합을 약 10배 강화시키는 것으로 나타났다. 다음의 4개의 Fc-항원 결합 도메인 작제물을 시험하였다: SIF3I, SIF3Y, 및 이필리무맙 CDR을 포함하는 상응하는 항원 결합 도메인을 갖는 이들 2개의 작제물. 모든 4개의 작제물은 부모 mAb에 비해 약 300 내지 800배 강화된 FcγRIIIa 결합을 보여주었다.
Fc-항원 결합 도메인 작제물 7 및 13용 설계에 기반하여, 항-CD20 항원 결합 도메인을 포함하는 2개의 작제물을 생성하였다. 두 Fc-항원 결합 도메인 작제물 모두의 부모 mAb 및 항원 결합 도메인은 Gazyva(오비누투주맙)의 CDR을 포함한다. FcγIIIa 및 FcγIIa 모두에 대한 결합을 측정하기 위해 SPR 검정을 수행하였다(도 46). 좌측 패널의 경우, 탈푸코실화가 FcγIIIa에 대한 결합을 약 10배 강화시킨 반면, 모든 Fc-항원 결합 도메인 작제물은 mAb에 비해 FcγIIIa에 대한 결합을 100배 넘게 강화시킨 것으로 나타났다. 우측 패널의 경우, 탈푸코실화는 FcγIIa에 대한 결합에 거의 영향을 미치지 않았지만, 모든 Fc-항원 결합 도메인 작제물은 mAb에 비해 FcγIIa에 대한 결합을 100배 넘게 강화시킨 것으로 나타났다.
실시예 47. Fc-항원 결합 도메인 작제물에 의한 CDC, ADCP 및 ADCC 활성화
세 가지 검정을 사용하여 부모 mAb 및 다양한 Fc-항원 결합 도메인 작제물에 의한 CDC, ADCP 및 ADCC 경로의 활성화를 시험하였다. Gazyva(오비누투주맙)로부터의 CDR, 항-CD20 단클론 항체를 포함하는 4개의 작제물을 생성하였다. 푸코실화 및 탈푸코실화 mAb 둘 다를 제조했을 뿐 아니라, S3Y(작제물 13의 구조, 도 13, 실시예 2에 기재된 바와 같음,) 및 SAI(작제물 7의 구조, 도 7, 실시예 1에 기재된 바와 같음) Fc-항원 결합 도메인 작제물을 제조하였다. CDC 검정을 다음과 같이 수행하였다:
1. 항-CD20 CDC 검정에 사용된 표적 세포는 Raji 림프아구성 인간 B 세포주(ATCC CCL-86)이다. Raji 세포를 원심분리에 의해 현탁액 배양액으로부터 제거하여, 6 x 105개의 세포/ml로 X-VIVO 15 배지에 재현탁하였다.
2. Raji 세포를 웰당 100 μl(6 x 104개의 세포/웰)의 부피로 바닥이 편평한 96 웰 검정 플레이트로 옮겼다.
3. 항-CD20 단일 클론 항체(mAb) 및 SIF 바디 각각을 X-VIVO 15 배지에서 3.33 μM로 희석하였다. 이어서, 1.5 ml의 폴리프로필렌 튜브에서 항-CD20 mAb 및 SIF 바디 각각으로 일련의 1:3 희석을 수행하여 11 포인트의 연속 희석을 생성하였다.
4. 항-CD20 mAb 및 SIF 바디의 각 희석액을 50 μl/웰로 검정 플레이트의 적절한 웰로 옮겼다.
5. 항-CD20 mAb 및 SIF 바디를 옮긴 직후, 50 μl의 정상 인간 혈청 보체를 검정 플레이트의 각 웰로 옮겼다.
6. 검정 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 2시간 동안 인큐베이션하였다.
7. 2시간 인큐베이션한 후, 20 μl의 WST-1 증식 시약을 검정 플레이트의 각 웰에 첨가하였다.
8. 플레이트를 37℃, 5% CO2 인큐베이터로 다시 넣어 14시간 동안 인큐베이션하였다.
9. 14시간 인큐베이션한 후, 플레이트를 플레이트 진탕기에서 1분 동안 진탕하고, 웰의 흡광도를 분광광도계를 사용하여 600 nm 보정으로 450 nm에서 즉시 결정하였다.
표적 세포가 Raji(도 47, 왼쪽 패널)인 CDC 검정에서, S3Y(작제물 13(CD20)) 작제물은 세포독성을 매개할 수 있는 반면, 다른 작제물은 그렇지 못하다.
ADCP 검정을 다음과 같이 수행하였다:
FcγRIIa-H ADCP 리포터 생물검정(전체 키트(Promega Cat.# G9901))는 FcγRIIa에 특이적으로 결합하여 이를 활성화하는 Fc 도메인을 사용하여 항체 및 다른 생물 제제의 효능과 안정성을 측정하는 데 사용할 수 있는 생물발광 세포 기반 분석이다. 이러한 검정은 아미노산 131에 히스티딘(H)과 NFAT-반응 요소(NFAT-RE)에 의해 유도되는 루시퍼라제 리포터를 포함하는 고친화도 인간 FcgRIIa-H 변이체를 발현하는 유전자 조작된 Jurkat T 세포주로 구성된다. 표적 세포 및 관련 항체와 공배양한 경우, FcγRIIa-H 효과기 세포는 항체의 Fc 도메인에 결합하여 FcγRIIa 신호전달 및 NFAT-RE 매개 루시퍼라제 활성을 유발하였다. Bio-Glo™ 루시퍼라제 검정 시스템 및 표준 광도계를 사용해 생체 발광 신호를 검출하고 정량화하였다. 증가하는 농도의 항-CD20 Ab 및 항-CD20 작제물(작제물 7 (CD20) 또는 작제물 13(CD20))을 Raji(CD20+) 표적 세포 및 Fc와 함께 인큐베이션하고, 증가하는 농도의 항-CD20 Ab 및 작제물을 도 47의 중간 패널에 나타낸 농도의 Raji(CD20+) 표적 세포 및 FcγRIIa-H 효과기 세포와 함께 인큐베이션하였다(2:1 E:T 비; 약 35,000개의 효과기 세포:15,000개의 표적 세포). 인큐베이션을 37℃에서 6시간 동안 진행하였다(Bio-Glo™). 시약을 첨가하고, PHERAstar FS 기기에서 발광을 측정하였다. 도 47의 중간 패널에 나타낸 농도의 RIIa-H 효과기 세포(2:1 E:T 비; 약 35,000개의 효과기 세포:15,000개의 표적 세포)에 대한 데이터를 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용해 4PL 곡선에 피팅하였다. 인큐베이션은 37℃에서 6시간 동안 진행하였다(Bio-Glo™). 시약을 첨가하고, PHERAstar FS 기기에서 발광을 측정하였다. GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 데이터를 4PL 곡선에 피팅하였다(도 47의 중간 패널). SAI(작제물 7(CD20)) 및 S3Y(작제물 13(CD20)) 작제물 모두는 mAb에 비해 100배 초과의 강화된 효능을 나타냈다.
ADCC 검정을 다음과 같이 수행하였다:
인간 1차 NK 효과기 세포(Hemacare)를 해동하고 37℃에서 밤새 5x105/mL의 림프구 성장 배지-3(Lonza)에 정치시켰다. 다음날, 인간 림프아구성 세포주 Raji 표적 세포(ATCC CCL-86)를 수확하고, 검정 배지(페놀 레드 무함유 RPMI, 10% FBSΔ, GlutaMAX™)에 재현탁하고, 다양한 농도의 관심 프로브 각각의 존재 하에 37℃에서 30분 동안 도말하였다. 이어서, 정치시킨 NK 세포를 수확하고, 검정 배지에 재현탁하고, 항-CD20 코팅된 Raji 세포를 포함하는 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 효과기 대 표적 세포의 최종 비율이 5:1(5x104 NK 세포: 1x104 Raji)이 되도록 37℃에서 6시간 동안 인큐베이션하였다.
CytoTox-Glo™ 세포독성 검정 키트(Promega)를 사용하여 ADCC 활성을 측정하였다. CytoTox-Glo™ 검정은 발광성 펩티드 기질을 사용하여, 막 무결성을 상실한 세포, 예를 들어 용해된 Raji 세포에 의해 방출된 죽은 세포 프로테아제 활성을 측정한다. 6시간 인큐베이션 후, 준비한 시약(기질)을 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 실온에서 15분 동안 오비탈 플레이트 진탕기에 넣었다. 발광을 PHERAstar F5 플레이트 판독기(BMG Labtech)를 사용하여 측정하였다. 백그라운드를 제거하기 위해 대조 조건(NK 세포 + Raji만 해당)의 판독치를 시험 조건에서 뺀 후 데이터를 분석하였다. (도 47, 오른쪽 패널). SAI(작제물 7(CD20)) 및 S3Y(작제물 13(CD20)) 작제물은 모두 푸코실화 mAb에 비해 강화된 세포독성을 보이며, 탈푸코실화 mAb와 비교하여 유사한 세포독성을 보였다.
이필리무맙 항체에 기반한 작제물을 사용하여 유사한 세트의 검정을 수행하였다. 항-CTLA-4 단클론 항체인 이필리무맙으로부터 CDR을 포함하는 4개의 작제물을 생성하였다. 푸코실화 mAb 및 탈푸코실화 mAb 둘 다를 제조하였을 뿐 아니라, S3Y(작제물 13(CTLA-4)) 및 SAI(작제물 7(CTLA-4)) Fc-항원 결합 도메인 작제물도 제조하였다. 표적 세포가 CTLA-4 형질감염 HEK 세포인 CDC 검정에서(표 48, 좌측 패널), SAI(작제물 7(CTLA-4)) 및 S3Y(작제물 13(CTLA-4)) 작제물은 2가지 mAb 작제물에 비해 강화된 세포독성을 나타냈다. CTLA-4 형질감염 HEK 세포를 표적으로 하는 검정으로 ADCP 활성을 시험하였다 (도 48, 중간 패널). SAI(작제물 7(CTLA-4)) 및 S3Y(작제물 13(CTLA-4)) 작제물 모두는 mAb에 비해 강화된 식균작용을 나타냈다. CTLA-4 형질감염 HEK 표적 세포를 사용하여 ADCC를 검정하였다 (도 48, 우측 패널). SAI(작제물 7(CTLA-4)) 및 S3Y(작제물 13(CTLA-4)) 작제물 모두는 푸코실화 mAb에 비해 강화된 세포독성을 나타냈고, 탈푸코실화 mAb와 유사한 세포독성을 나타냈다.
항체에 기반한 작제물을 사용하여 유사한 세트의 검정을 수행하였다. 항-PD-L1 단클론 항체로부터 CDR을 포함하는 4개의 작제물을 생성하였다. 푸코실화 및 탈푸코실화 mAb 둘 다를 제조하였을 뿐 아니라, S3Y(작제물 13(PD-L1) 및 SAI(작제물 7(PD-L1) Fc-항원 결합 도메인 작제물을 제조하였다. PD-L1 형질감염 HEK 표적 세포를 사용하여 ADCC를 검정하였다 (도 49, 좌측 패널). SAI(작제물 7(PD-L1)) 및 S3Y(작제물 13(PD-L1)) 작제물 모두는 푸코실화 및 탈푸코실화 mAb 모두와 유사한 세포독성을 나타냈다. PD-L1 형질감염 HEK 세포를 표적으로 하는 검정으로 ADCP 활성을 시험하였다 (도 49, 중간 패널). SAI(작제물 7(PD-L1)) 및 S3Y(작제물 13(PD-L1)) 작제물 모두는 식균작용을 활성화시킨 반면, mAb는 모두 그렇지 못했다. PD-L1 형질감염 HEK 세포를 표적으로 하는 CDC 검정(도 49, 우측 패널)에서, S3Y(작제물 13(PD-L1)) 작제물은 세포독성을 매개할 수 있었지만, 다른 작제물은 그렇지 못했다.
실시예 48. Fc-항원 결합 도메인 작제물을 특성화하는 데 사용되는 실험 검정
펩티드 및 글리코펩티드 액체 크로마토그래피-MS/MS
단백질을 6M 구아니딘(Sigma)에서 1 μg/μL로 희석하였다. 디티오트레이톨(DTT)을 10 mM의 농도로 첨가하여 65℃에서 30분 동안 변성 조건 하에 이황화결합을 감소시켰다. 얼음에서 냉각한 후, 샘플을 암실에서 1시간 동안 30 mM 요오드아세트아미드(IAM)와 함께 인큐베이션하여 유리 티올을 알킬화(카바미도메틸화)하였다. 그런 다음 단백질을 10-kDa 멤브레인을 통과하여 25 mM 중탄산 암모늄 완충액(pH 7.8)으로 투석하여 IAM, DTT 및 구아니딘을 제거하였다. 단백질을 Barocycler(NEP 2320; Pressure Biosciences, Inc.)에서 트립신으로 분해하였다. 압력은 37℃에서 20,000 psi와 주위 압력 사이를 1시간 동안 총 30 사이클 순환하였다. 펩티드의 LC-MS/MS 분석을 Ultimate 3000(Dionex) Chromatography System 및 Q-Exactive (Thermo Fisher Scientific) Mass Spectrometer 상에서 수행하였다. 물 중의 0.1% FA 및 아세토니트릴 중의 0.1% FA를 이동상으로 사용하여 BEH PepMap(Waters) 컬럼에서 펩티드를 분리하였다. 단독 자일로실화 링커 펩티드를 ± 1.5 Da 사중극자 단리폭(quadrupole isolation width)으로 이중 하전 이온(z=2) m/z 842.5에 기초하여 표적화하였다.
원형 질량 분석
단백질을 78.98% 물, 20% 아세토니트릴, 1% 포름산 (FA), 및 0.02% 트리플루오로아세트산으로 이루어지는 전개 완충액(running buffer)에서 2 μg/μL의 농도로 희석하였다. 컬럼의 전체 길이가 700 mm인 2개의 Zenix-C SEC-300(Sepax Technologies, Newark, DE) 2.1 Х 350 mm 상에서 직렬로 크기 배제 크로마토그래피 분리를 수행하였다. 전술한 전개 완충액을 사용하여 80 μL/분의 유속으로 SEC 컬럼에서 단백질을 용리하였다. QSTAR Elite(Applied Biosystems) Q-ToF 질량 분석기를 양이온 모드(positive mode)에서 작동시켜 질량 스펙트럼을 획득하였다. Bayesian 피크 디콘볼루션(deconvolution)을 사용하여 크로마토그래피 피크의 전체 폭에 걸친 스펙트럼을 합침으로써 개별 크기 분획하의 중성 질량을 디콘볼루팅하였다.
모세관 전기영동-도데실 황산나트륨(CE-SDS) 검정
샘플을 1 mg/mL로 희석하고 HT Protein Express 변성 완충액(PerkinElmer)과 혼합하였다. 혼합물을 40℃에서 20분간 인큐베이션하였다. 샘플을 70 μL의 물로 희석하고 96-웰 플레이트로 옮겼다. 샘플을 HT Protein Express LabChip(PerkinElmer)에 장착된 Caliper GXII 도구(PerkinElmer)로 분석하였다. 각각의 크기 변형의 상대적인 양을 산출하는 데 형광 강도를 사용하였다.
비환원 SDS-PAGE
샘플을 95℃에서 10분간 Laemmli 샘플 완충액(4% SDS, Bio-Rad)에서 변성시켰다. Criterion TGX 무착색 겔(4~15% 폴리아크릴아미드, Bio-Rad)상에 샘플을 흘렸다. 단백질 밴드를 UV 조사 또는 쿠마시 블루 염색으로 시각화하였다. ChemiDoc MP Imaging System(Bio-Rad)으로 겔을 이미지화하였다. Imagelab 4.0.1 소프트웨어(Bio-Rad)를 사용하여 밴드를 정량 분석하였다.
보체 의존성 세포독성(CDC)
Raji 세포(ATCC)를 연속 희석된 리툭시맙, Fc 작제물 4 또는 IVIg로 코팅하는 비색 분석법으로 CDC를 평가하였다. 인간 혈청 보체(Quidel)를 25% v/v로 모든 웰에 첨가하였고 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. WST-1 세포 증식 시약(Roche Applied Science)을 첨가한 후 세포를 37℃에서 12시간 동안 배양하였다. 플레이트를 2분간 진탕기에 두었고, 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다.
실시예 49. 노브-인투-홀 기술에 의한 이종이량체화의 최적화
3개의 Fc 도메인과 2개의 "분지" 아단위에 노브-인투-홀 돌연변이를 갖는 Fc 작제물(Fc 작제물 A), 또는 3개의 Fc 도메인과 2개의 "분지" 아단위에 노브-인투-홀 및 정전기 스티어링 돌연변이를 갖는 Fc 작제물(Fc 작제물 B)의 긴 폴리펩티드와 짧은 폴리펩티드를 발현하는 플라스미드를 HEK293 세포 내로 형질감염시켰다. 7일간의 배양 후에, 세포를 원심분리로 제거하고, 원배지 상청액을 비환원 SDS-PAGE로 분리하였다(도 10). 시각화된 단백질 밴드의 농도계 분석을 통해 3개의 Fc 도메인을 갖는 작제물 A 및 3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물 B(Fc3)가 유사한 수준으로 발현됨을 확인하였다. 그러나, Fc 작제물 A에 대한 작제물들은 유의하게 더 높은 오염 수준으로 이량체 종(Fc2)을 발현하였다(도 51). 두 세트의 작제물 모두는 단량체 종(Fc1)을 유사한 수준으로 발현하였다. 이미지에 존재하는 추가 밴드는 모의 형질주입 대조군에 존재하는 배지 성분을 나타낸다.
이들 결과는, "분지" 아단위에서 이종이량체화를 촉진하는 정전기 스티어링 돌연변이 및 이종이량체화를 촉진하는 노브-인투-홀 돌연변이 모두를 가지면, Fc 작제물에서 이종이량체 Fc 도메인 형성이 강화되고, 3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물의 조립이 최적화되며, Fc 작제물을 포함하는 조성물의 동질성이 개선됨을 나타낸다.
실시예 50. 동종이량체화의 제어를 위한 정전기 스티어링
원치 않는 고분자량 올리고머 및 다량체를 생성하는 아단위의 오프-레지스터(off-register) 결합을 최소화하기 위해, 이종이량체화(예컨대, 노브-홀)를 용이하게 하는 돌연변이를 "분지" 아단위 내로 도입하였다. 이들 아미노산 치환은 홀 카운터파트에 대한 노브 아단위의 인력(attraction)을 보존함과 동시에 노브 아단위 간의 결합을 방해한다. 노브 돌연변이는 또한 야생형 Fc 서열과의 결합을 억제하므로, 노브 및 홀 "분지" 아단위에 대한 "줄기" Fc 아단위의 친화도를 더 감소시키는 추가 돌연변이를 포함하는 것이 필요한지에 대한 의문이 제기된다. 이러한 의문을 해결하기 위해, 카복시 말단 "줄기" 소단위체에 야생형 Fc 도메인 단량체 서열을 포함하고 아미노 말단 "가지" 소단위체에 노브 돌연변이를 지니는 Fc 도메인 단량체를 포함하는 Fc 작제물의 긴 폴리펩티드를 생성하였다. 상응하는 짧은 폴리펩티드는 홀 돌연변이를 지니는 Fc 도메인 단량체였다. 이러한 Fc 작제물은 Fc 작제물 A의 폴리펩티드의 서열에 기초하지만, 긴 폴리펩티드 각각의 카복시 말단 "줄기" 소단위체의 야생형 Fc 도메인 단량체 서열을 갖는다.
(긴 폴리펩티드 각각의 카복시 말단 "줄기" 아단위에 있는 Fc 도메인 단량체에서 동종이량체화 정전기 스티어링 돌연변이를 갖는) Fc 작제물 A을 발현하거나, 긴 폴리펩티드 각각의 카복시 말단 "줄기" 아단위에 있는 Fc 도메인 단량체가 야생형 Fc 도메인 단량체 서열(서열번호 42)과 치환된 Fc 작제물 A를 기반으로 하는 Fc 작제물을 발현하는 플라스미드로 HEK293 세포를 공-형질감염시켰다. 7일간의 배양 후에, 세포를 원심분리로 제거하고, 원배지 상청액을 비환원 SDS-PAGE로 분리하였다. 염색된 단백질의 이미징을 통해, "줄기" 아단위에 정전기 스티어링 돌연변이가 없는 Fc 작제물(도 52에서 "정전기 스티어링 없음"으로 표지된 (레인 1~3))이 Fc 작제물 A 상대(도 52의 "정전기 스티어링 있음"으로 표지된 (레인 4 및 5))보다 훨씬 더 높은 수준의 단량체(Fc1) 및 이량체(Fc2)를 포함하였음을 확인하였다. 또한, 삼량체보다 분자량이 더 높은 훨씬 더 많은 수의 밴드를 검출할 수 있다(도 52의 레인 1~3).
이들 결과는, "줄기" 아단위에서 동종이량체화를 촉진하는 정전기 스티어링 돌연변이를 가지면, Fc 작제물에서 동종이량체 Fc 도메인의 형성이 더 강화되고, 3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물의 결합이 최적화되고, Fc 작제물을 포함하는 조성물의 동질성이 개선됨을 확인시켜 준다.
실시예 51. 항-CD20 항원 결합 도메인 또는 항-PD-L1 항원 결합 도메인을 갖는 Fc-항원 결합 도메인 작제물 4의 설계 및 정제
단백질 발현
비대칭 직렬 Fc 도메인으로 형성된 작제물을 하기 기재된 바와 같이 제조하였다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 4(CD20) 및 작제물 4(PD-L1)는 각각 2개의 구별되는 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(Fc 장쇄(서열 번호 66); 항-CD20 Fc 단쇄(서열 번호 67) 또는 항-PD-L1 Fc 단쇄(서열 번호 68)의 3개의 카피) 및 항-CD20 경쇄 폴리펩티드(서열 번호 61) 또는 항-PD-L1 경쇄 폴리펩티드(서열 번호 49)의 3개의 카피를 각각 포함한다. Fc 장쇄는 직렬로 연결된 3개의 Fc 도메인 단량체를 포함하며, 각각의 Fc 도메인 단량체는 E357K 전하 돌연변이 및 (이종이량체화를 촉진하기 위한) S354C 및 T366W 돌출부-형성 돌연변이를 갖는다. Fc 단쇄는 K370D 전하 돌연변이 및 (이종이량체화를 촉진하기 위한) Y349C, T366S, L368A, 및 Y407V 함몰부-형성 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하고, 항-CD20 VH와 CH1 도메인(EU 위치 1~220)를 N-말단에서 포함하거나(작제물 4(CD20)), 항-PD-L1 VH와 CH1 도메인(EU 위치 1~220)을 N-말단에서 포함한다(작제물 4(PD-L1)). 항-CD20 경쇄 또는 PD-L1 경쇄는 scFv의 일부로서 Fc 단쇄의 N-말단에 융합되어 발현될 수도 있다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하였고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝하였다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입하였다. 표 7의 각 작제물에 대한 다음의 아미노산 서열을 3개의 별개의 플라스미드(경쇄(항-CD20 또는 항-PD-L1)를 암호화하는 하나의 플라스미드, Fc 장쇄를 암호화하는 하나의 플라스미드, 및 Fc 단쇄(항-CD20 또는 항-PD-L1)를 암호화하는 하나의 플라스미드)에 의해 암호화하였다.
| 작제물 4(CD20) 및 작제물 4(PD-L1) 서열 | |||
| 작제물 | 경쇄 | Fc 장쇄 | Fc 단쇄 (항-CD20 또는 항-PD-L1 VH 및 CH1 포함) |
| 작제물 4(CD20) | 서열번호 61 DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLVSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC |
서열번호 66 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
서열 번호 67 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSYSWINWVRQAPGQGLEWMGRIFPGDGDTDYNGKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNVFDGYWLVYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
| 작제물 4(PD-L1) | 서열 번호 49 QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRVFGTGTKVTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS |
서열번호 66 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
서열 번호 68 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMMWVRQAPGKGLEWVSSIYPSGGITFYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
발현된 단백질을 Poros MabCapture A(Life Technologies) 컬럼을 사용하는 단백질 A-기반 친화 컬럼 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상청액으로부터 정제하였다. 포획된 Fc-항원 결합 도메인 작제물을 인산염 완충 식염수로 세척하고(저염 세척) pH 3, 100 mM 글리신으로 용리하였다. 용출액을 1 M TRIS(pH 7.4)의 첨가로 빠르게 중화하고, 0.2 μm 필터로 멸균 여과하였다. 단백질을 Poros XS 수지(Applied Biosciences)를 사용하여 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 분리하였다. 컬럼을 50 mM MES, pH 6(완충액 A)로 사전 평형화하였고 샘플을 용출 완충액으로서 50 mM MES, 400 mM 염화나트륨, pH 6(완충액 B)을 사용하여 단계 구배로 용리하였다. 이온 교환 후에, 표적 분획물을 접선 유동 여과 시스템상에서 10 kDa 컷오프 폴리에테르설폰(PES) 막 카트리지를 사용하여 PBS 완충액으로 완충액 교환하였다. 샘플을 대략 30 mg/mL로 농축하였고 0.2 μm 필터로 멸균 여과하였다.
비환원 황산도데실나트륨-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)
샘플을 95℃에서 10분간 Laemmli 샘플 완충액(4% SDS, Bio-Rad)에서 변성시켰다. Criterion TGX 무착색 겔(4~15% 폴리아크릴아미드, Bio-Rad)상에 샘플을 흘렸다. 단백질 밴드를 UV 조사 또는 쿠마시 블루 염색으로 시각화하였다. ChemiDoc MP Imaging System(Bio-Rad)으로 겔을 이미지화하였다. Imagelab 4.0.1 소프트웨어(Bio-Rad)를 사용하여 밴드를 정량 분석하였다.
실시예 52. 항-CD20 항원 결합 도메인 또는 항-PD-L1 항원 결합 도메인을 갖는 Fc-항원 결합 도메인 작제물 8의 설계 및 정제
단백질 발현
분지점이 N-말단 Fc 도메인에 있는 단일 분지형 Fc 도메인으로 형성된 작제물을 하기 기재된 바와 같이 제조하였다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 8(CD20) 및 작제물 8(PD-L1)은 각각 2개의 구별되는 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(Fc 장쇄(서열 번호 69)의 2개의 카피, 및 항-CD20 Fc 단쇄(서열 번호 67) 또는 항-PD-L1 Fc 단쇄(서열 번호 68)의 2개의 카피) 및 항-CD20 경쇄 폴리펩티드(서열 번호 61) 또는 항-PD-L1 경쇄 폴리펩티드(서열 번호 49)의 카피를 각각 포함한다. Fc 장쇄는 E357K 전하 돌연변이 및 (이종이량체화를 촉진하기 위한) S354C 및 T366W 돌출부-형성 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하며, 상기 Fc 도메인 단량체는 (동종이량체화를 촉진하기 위한) 역전하 돌연변이 K409D 및 D399K를 갖는 Fc 도메인 단량체와 직렬로 연결된다. Fc 단쇄는 K370D 전하 돌연변이 및 (이종이량체화를 촉진하기 위한) Y349C, T366S, L368A, 및 Y407V 함몰부-형성 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하고, 항-CD20 VH와 CH1 도메인(EU 위치 1~220)를 N-말단에서 포함하거나(작제물 8(CD20)), 항-PD-L1 VH와 CH1 도메인(EU 위치 1~220)을 N-말단에서 포함한다(작제물 8(PD-L1)). 항-CD20 경쇄 또는 PD-L1 경쇄는 scFv의 일부로서 Fc 단쇄의 N-말단에 융합되어 발현될 수도 있다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하였고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝하였다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입하였다. 표 8의 각 작제물에 대한 다음의 아미노산 서열을 3개의 별개의 플라스미드(경쇄(항-CD20 또는 항-PD-L1)를 암호화하는 하나의 플라스미드, Fc 장쇄를 암호화하는 하나의 플라스미드, 및 Fc 단쇄(항-CD20 또는 항-PD-L1)를 암호화하는 하나의 플라스미드)에 의해 암호화하였다:
| 작제물 8(CD20) 및 작제물 8(PD-L1) 서열 | |||
| 작제물 | 경쇄 | Fc 장쇄 | Fc 단쇄 (항-CD20 또는 항-PD-L1 VH 및 CH1 포함) |
| 작제물 8(CD20) | 서열번호 61 DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLVSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC |
서열번호 69 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
서열 번호 67 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSYSWINWVRQAPGQGLEWMGRIFPGDGDTDYNGKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNVFDGYWLVYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
| 작제물 8(PD-L1) | 서열 번호 49 QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRVFGTGTKVTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS |
서열번호 69 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
서열 번호 68 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMMWVRQAPGKGLEWVSSIYPSGGITFYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
발현된 단백질을 Poros MabCapture A(LifeTechnologies) 컬럼을 사용하는 단백질 A-기반 친화 컬럼 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상청액으로부터 정제하였다. 포획된 Fc-항원 결합 도메인 작제물을 인산염 완충 식염수로 세척하고(저염 세척) pH 3, 100 mM 글리신으로 용리하였다. 용출액을 1 M TRIS(pH 7.4)의 첨가로 빠르게 중화하고, 0.2 μm 필터로 멸균 여과하였다. 단백질을 Poros XS 수지(Applied Biosciences)를 사용하여 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 분리하였다. 컬럼을 50 mM MES, pH 6(완충액 A)로 사전 평형화하였고 샘플을 용출 완충액으로서 50 mM MES, 400 mM 염화나트륨, pH 6(완충액 B)을 사용하여 단계 구배로 용리하였다. 이온 교환 후에, 표적 분획물을 접선 유동 여과 시스템상에서 10 kDa 컷오프 폴리에테르설폰(PES) 막 카트리지를 사용하여 PBS 완충액으로 완충액 교환하였다. 샘플을 대략 30 mg/mL로 농축하였고 0.2 μm 필터로 멸균 여과하였다.
비환원 황산도데실나트륨-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)
샘플을 95℃에서 10분간 Laemmli 샘플 완충액(4% SDS, Bio-Rad)에서 변성시켰다. Criterion TGX 무착색 겔(4~15% 폴리아크릴아미드, Bio-Rad)상에 샘플을 흘렸다. 단백질 밴드를 UV 조사 또는 쿠마시 블루 염색으로 시각화하였다. ChemiDoc MP Imaging System(Bio-Rad)으로 겔을 이미지화하였다. Imagelab 4.0.1 소프트웨어(Bio-Rad)를 사용하여 밴드를 정량 분석하였다.
실시예 53. 항-CD20 항원 결합 도메인 또는 항-PD-L1 항원 결합 도메인을 갖는 Fc-항원 결합 도메인 작제물 9의 설계 및 정제
단백질 발현
분지점이 N-말단 Fc 도메인에 있는 단일 분지형 Fc 도메인으로 형성된 작제물을 하기 기재된 바와 같이 제조하였다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 9(CD20) 및 작제물 9(PD-L1)는 각각 2개의 구별되는 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(항-CD20 Fc 장쇄(서열 번호 62) 또는 항-PD-L1 Fc 장쇄(서열번호 54)의 2개의 카피, 및 항-CD20 Fc 단쇄(서열 번호 67) 또는 항-PD-L1 Fc 단쇄(서열 번호 68)의 2개의 카피) 및 항-CD20 경쇄 폴리펩티드(서열 번호 61) 또는 항-PD-L1 경쇄 폴리펩티드(서열 번호 49)의 카피를 각각 포함한다. Fc 장쇄는 E357K 전하 돌연변이 및 (이종이량체화를 촉진하기 위한) S354C 및 T366W 돌출부-형성 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하며, 상기 Fc 도메인 단량체는 (동종이량체화를 촉진하기 위한) 전하-돌연변이된(K409D/D399K 돌연변이) Fc 도메인 단량체 및 항-CD20 VH와 CH1 도메인(EU 위치 1~220)과 N-말단에서 직렬로 연결되거나(작제물 9(CD20)), 항-PD-L1 VH와 CH1 도메인(EU 위치 1~220)과 N-말단에서 직렬로 연결된다(작제물 9(PD-L1)). Fc 단쇄는 K370D 전하 돌연변이 및 (이종이량체화를 촉진하기 위한) Y349C, T366S, L368A 및 Y407V 함몰부-형성 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하고, 항-CD20 중쇄를 N-말단에서 포함하거나(작제물 9(CD20)), 항-PD-L1 중쇄를 N-말단에서 포함한다(작제물 9(PD-L1)). 항-CD20 경쇄 또는 PD-L1 경쇄는 scFv의 일부로서 Fc 장쇄 및/또는 Fc 단쇄의 N-말단에서 융합되어 발현될 수도 있다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하였고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝하였다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입하였다. 표 9의 각 작제물에 대한 다음의 아미노산 서열을 3개의 별개의 플라스미드(경쇄(항-CD20 또는 항-PD-L1)를 암호화하는 하나의 플라스미드, Fc 장쇄(항-CD20 또는 항-PD-L1)를 암호화하는 하나의 플라스미드, 및 Fc 단쇄(항-CD20 또는 항-PD-L1)를 암호화하는 하나의 플라스미드)에 의해 암호화하였다:
| 작제물 9(CD20) 및 작제물 9(PD-L1) 서열 | |||
| 작제물 | 경쇄 | Fc 장쇄 (항-CD20 또는 항-PD-L1 VH 및 CH1 포함) |
Fc 단쇄 (항-CD20 또는 항-PD-L1 VH 및 CH1 포함) |
| 작제물 9(CD20) | 서열번호 61 DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLVSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC |
서열 번호 62 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSYSWINWVRQAPGQGLEWMGRIFPGDGDTDYNGKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNVFDGYWLVYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
서열 번호 67 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSYSWINWVRQAPGQGLEWMGRIFPGDGDTDYNGKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNVFDGYWLVYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
| 작제물 9(PD-L1) | 서열 번호 49 QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRVFGTGTKVTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS |
서열 번호 54 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMMWVRQAPGKGLEWVSSIYPSGGITFYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
서열 번호 68 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMMWVRQAPGKGLEWVSSIYPSGGITFYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
발현된 단백질을 Poros MabCapture A(LifeTechnologies) 컬럼을 사용하는 단백질 A-기반 친화 컬럼 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상청액으로부터 정제하였다. 포획된 Fc-항원 결합 도메인 작제물을 인산염 완충 식염수로 세척하고(저염 세척) pH 3, 100 mM 글리신으로 용리하였다. 용출액을 1 M TRIS(pH 7.4)의 첨가로 빠르게 중화하고, 0.2 μm 필터로 멸균 여과하였다. 단백질을 Poros XS 수지(Applied Biosciences)를 사용하여 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 분리하였다. 컬럼을 50 mM MES, pH 6(완충액 A)로 사전 평형화하였고 샘플을 용출 완충액으로서 50 mM MES, 400 mM 염화나트륨, pH 6(완충액 B)을 사용하여 단계 구배로 용리하였다. 이온 교환 후에, 표적 분획물을 접선 유동 여과 시스템상에서 10 kDa 컷오프 폴리에테르설폰(PES) 막 카트리지를 사용하여 PBS 완충액으로 완충액 교환하였다. 샘플을 대략 30 mg/mL로 농축하였고 0.2 μm 필터로 멸균 여과하였다.
비환원 황산도데실나트륨-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)
샘플을 95℃에서 10분간 Laemmli 샘플 완충액(4% SDS, Bio-Rad)에서 변성시켰다. Criterion TGX 무착색 겔(4~15% 폴리아크릴아미드, Bio-Rad)상에 샘플을 흘렸다. 단백질 밴드를 UV 조사 또는 쿠마시 블루 염색으로 시각화하였다. ChemiDoc MP Imaging System(Bio-Rad)으로 겔을 이미지화하였다. Imagelab 4.0.1 소프트웨어(Bio-Rad)를 사용하여 밴드를 정량 분석하였다.
실시예 54. 항-CD20 항원 결합 도메인 또는 항-PD-L1 항원 결합 도메인을 갖는 Fc-항원 결합 도메인 작제물 10의 설계 및 정제
단백질 발현
분지점이 N-말단 Fc 도메인에 있는 단일 분지형 Fc 도메인으로 형성된 작제물을 하기 기재된 바와 같이 제조하였다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 10(CD20) 및 작제물 10(PD-L1)은 각각 2개의 구별되는 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(항-CD20 Fc 장쇄(서열 번호 70) 또는 항-PD-L1 Fc 장쇄(서열번호 71)의 2개의 카피, 및 Fc 단쇄(서열 번호 63)의 4개의 카피) 및 항-CD20 경쇄 폴리펩티드(서열 번호 61) 또는 항-PD-L1 경쇄 폴리펩티드(서열 번호 49)의 카피를 각각 포함한다. Fc 장쇄는 직렬로 연결된 2개의 Fc 도메인 단량체를 포함하되, 각각의 Fc 도메인 단량체는 E357K 전하 돌연변이 및 (이종이량체화를 촉진하기 위한) S354C 및 T366W 돌출부 형성 돌연변이를 가지고, 상기 Fc 도메인 단량체는 (동종이량체화를 촉진하기 위한) 역전하 돌연변이 K409D 및 D399K를 갖는 Fc 도메인 단량체 및 항-CD20 VH와 CH1 도메인(EU 위치 1~220)과 N-말단에서 직렬로 연결되거나(작제물 10(CD20)), 항-PD-L1 VH와 CH1 도메인(EU 위치 1~220)과 N-말단에서 직렬로 연결된다(작제물 10(PD-L1)). Fc 단쇄는 K370D 전하 돌연변이 및 (이종이량체화를 촉진하기 위한) Y349C, T366S, L368A 및 Y407V 함몰부-형성 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함한다. 항-CD20 경쇄 또는 PD-L1 경쇄는 scFv의 일부로서 Fc 장쇄의 N-말단에 융합되어 발현될 수도 있다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하였고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝하였다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입하였다. 표 10의 각 작제물에 대한 다음의 아미노산 서열을 3개의 별개의 플라스미드(경쇄(항-CD20 또는 항-PD-L1)를 암호화하는 하나의 플라스미드, Fc 장쇄(항-CD20 또는 항-PD-L1)를 암호화하는 하나의 플라스미드, 및 Fc 단쇄를 암호화하는 하나의 플라스미드)에 의해 암호화하였다:
| 작제물 10(CD20) 및 작제물 10(PD-L1) 서열 | |||
| 작제물 | 경쇄 | Fc 장쇄 (항-CD20 또는 항-PD-L1 VH 및 CH1 포함) |
Fc 단쇄 |
| 작제물 10(CD20) | 서열번호 61 DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLVSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC |
서열번호 70 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSYSWINWVRQAPGQGLEWMGRIFPGDGDTDYNGKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNVFDGYWLVYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
서열 번호 63 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
| 작제물 10(PD-L1) | 서열 번호 49 QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRVFGTGTKVTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS |
서열번호 71 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMMWVRQAPGKGLEWVSSIYPSGGITFYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
서열 번호 63 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
발현된 단백질을 Poros MabCapture A(LifeTechnologies) 컬럼을 사용하는 단백질 A-기반 친화 컬럼 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상청액으로부터 정제하였다. 포획된 Fc-항원 결합 도메인 작제물을 인산염 완충 식염수로 세척하고(저염 세척) pH 3, 100 mM 글리신으로 용리하였다. 용출액을 1 M TRIS(pH 7.4)의 첨가로 빠르게 중화하고, 0.2 μm 필터로 멸균 여과하였다. 단백질을 Poros XS 수지(Applied Biosciences)를 사용하여 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 분리하였다. 컬럼을 50 mM MES, pH 6(완충액 A)로 사전 평형화하였고 샘플을 용출 완충액으로서 50 mM MES, 400 mM 염화나트륨, pH 6(완충액 B)을 사용하여 단계 구배로 용리하였다. 이온 교환 후에, 표적 분획물을 접선 유동 여과 시스템상에서 10 kDa 컷오프 폴리에테르설폰(PES) 막 카트리지를 사용하여 PBS 완충액으로 완충액 교환하였다. 샘플을 대략 30 mg/mL로 농축하였고 0.2 μm 필터로 멸균 여과하였다.
비환원 황산도데실나트륨-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)
샘플을 95℃에서 10분간 Laemmli 샘플 완충액(4% SDS, Bio-Rad)에서 변성시켰다. Criterion TGX 무착색 겔(4~15% 폴리아크릴아미드, Bio-Rad)상에 샘플을 흘렸다. 단백질 밴드를 UV 조사 또는 쿠마시 블루 염색으로 시각화하였다. ChemiDoc MP Imaging System(Bio-Rad)으로 겔을 이미지화하였다. Imagelab 4.0.1 소프트웨어(Bio-Rad)를 사용하여 밴드를 정량 분석하였다.
실시예 55. 항-CD20 항원 결합 도메인 또는 항-PD-L1 항원 결합 도메인을 갖는 Fc-항원 결합 도메인 작제물 16의 설계 및 정제
단백질 발현
분지점이 C-말단 Fc 도메인에 있는 단일 분지형 Fc 도메인으로 형성된 작제물을 하기 기재된 바와 같이 제조하였다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 16(CD20) 및 작제물 16(PD-L1)은 각각 2개의 구별되는 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(항-CD20 Fc 장쇄(서열 번호 72) 또는 항-PD-L1 Fc 장쇄(서열번호 73)의 2개의 카피, 및 Fc 단쇄(서열 번호 63)의 4개의 카피) 및 항-CD20 경쇄 폴리펩티드(서열 번호 61) 또는 항-PD-L1 경쇄 폴리펩티드(서열 번호 49)의 카피를 각각 포함한다. Fc 장쇄는 (동종이량체화를 촉진하기 위한) 역전하 돌연변이 K409D 및 D399K를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하고, 상기 Fc 도메인 단량체는 E357K 전하 돌연변이 및 (이종이량체화를 촉진하기 위한) S354C 및 T366W 돌출부-형성 돌연변이를 각각 갖는 2개의 Fc 도메인 단량체, 및 항-CD20 VH와 CH1 도메인(EU 위치 1~220)과 N-말단에서 직렬로 연결되거나(작제물 10(CD20)), 항-PD-L1 VH와 CH1 도메인(EU 위치 1~220)과 N-말단에서 직렬로 연결된다(작제물 10(PD-L1)). Fc 단쇄는 K370D 전하 돌연변이 및 (이종이량체화를 촉진하기 위한) Y349C, T366S, L368A 및 Y407V 함몰부-형성 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함한다. 항-CD20 경쇄 또는 PD-L1 경쇄는 scFv의 일부로서 Fc 장쇄의 N-말단에 융합되어 발현될 수도 있다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하였고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝하였다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입하였다. 표 11의 각 작제물에 대한 다음의 아미노산 서열을 3개의 별개의 플라스미드(경쇄(항-CD20 또는 항-PD-L1)를 암호화하는 하나의 플라스미드, Fc 장쇄(항-CD20 또는 항-PD-L1)를 암호화하는 하나의 플라스미드, 및 Fc 단쇄를 암호화하는 하나의 플라스미드)에 의해 암호화하였다:
| 작제물 16(CD20) 및 작제물 16(PD-L1) 서열 | |||
| 작제물 | 경쇄 | Fc 장쇄 (항-CD20 또는 항-PD-L1 VH 및 CH1 포함) |
Fc 단쇄 |
| 작제물 16(CD20) | 서열번호 61 DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLVSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC |
서열번호 72 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSYSWINWVRQAPGQGLEWMGRIFPGDGDTDYNGKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNVFDGYWLVYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
서열 번호 63 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
| 작제물 16(PD-L1) | 서열 번호 49 QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRVFGTGTKVTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS |
서열번호 73 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMMWVRQAPGKGLEWVSSIYPSGGITFYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
서열 번호 63 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
발현된 단백질을 Poros MabCapture A(LifeTechnologies) 컬럼을 사용하는 단백질 A-기반 친화 컬럼 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상청액으로부터 정제하였다. 포획된 Fc-항원 결합 도메인 작제물을 인산염 완충 식염수로 세척하고(저염 세척) pH 3, 100 mM 글리신으로 용리하였다. 용출액을 1 M TRIS(pH 7.4)의 첨가로 빠르게 중화하고, 0.2 μm 필터로 멸균 여과하였다. 단백질을 Poros XS 수지(Applied Biosciences)를 사용하여 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 분리하였다. 컬럼을 50 mM MES, pH 6(완충액 A)로 사전 평형화하였고 샘플을 용출 완충액으로서 50 mM MES, 400 mM 염화나트륨, pH 6(완충액 B)을 사용하여 단계 구배로 용리하였다. 이온 교환 후에, 표적 분획물을 접선 유동 여과 시스템상에서 10 kDa 컷오프 폴리에테르설폰(PES) 막 카트리지를 사용하여 PBS 완충액으로 완충액 교환하였다. 샘플을 대략 30 mg/mL로 농축하였고 0.2 μm 필터로 멸균 여과하였다.
비환원 황산도데실나트륨-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)
샘플을 95℃에서 10분간 Laemmli 샘플 완충액(4% SDS, Bio-Rad)에서 변성시켰다. Criterion TGX 무착색 겔(4~15% 폴리아크릴아미드, Bio-Rad)상에 샘플을 흘렸다. 단백질 밴드를 UV 조사 또는 쿠마시 블루 염색으로 시각화하였다. ChemiDoc MP Imaging System(Bio-Rad)으로 겔을 이미지화하였다. Imagelab 4.0.1 소프트웨어(Bio-Rad)를 사용하여 밴드를 정량 분석하였다.
실시예 56. 항-CD20 항원 결합 도메인 또는 항-PD-L1 항원 결합 도메인을 갖는 Fc-항원 결합 도메인 작제물 19의 설계 및 정제
단백질 발현
분지점이 N-말단 또는 C-말단 Fc 도메인에 없는 단일 분지형 Fc 도메인으로 형성된 작제물을 하기 기재된 바와 같이 제조하였다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 19(CD20) 및 작제물 19(PD-L1)는 각각 2개의 구별되는 Fc 단량체 함유 폴리펩티드(항-CD20 Fc 장쇄(서열 번호 74) 또는 항-PD-L1 Fc 장쇄(서열번호 75)의 2개의 카피, 및 Fc 단쇄(서열 번호 63)의 4개의 카피) 및 항-CD20 경쇄 폴리펩티드(서열 번호 61) 또는 항-PD-L1 경쇄 폴리펩티드(서열 번호 49)의 카피를 각각 포함한다. Fc 장쇄는 E357K 전하 돌연변이 및 (이종이량체화를 촉진하기 위한) S354C 및 T366W 돌출부-형성 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함하며, 상기 Fc 도메인 단량체는 (동종이량체화를 촉진하기 위한) 역전하 돌연변이 K409D 및 D399K를 갖는 Fc 도메인 단량체와 직렬로 연결되고, E357K 전하 돌연변이 및 (이종이량체화를 촉진하기 위한) S354C 및 T366W 돌출부-형성 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체 및 항-CD20 VH와 CH1 도메인(EU 위치 1~220)과 N-말단에서 직렬로 연결되거나(작제물 19(CD20)), 항-PD-L1 VH와 CH1 도메인(EU 위치 1~220)과 N-말단에서 직렬로 연결된다(작제물 19(PD-L1)). Fc 단쇄는 K370D 전하 돌연변이 및 (이종이량체화를 촉진하기 위한) Y349C, T366S, L368A 및 Y407V 함몰부-형성 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함한다. 항-CD20 경쇄 또는 항-PD-L1 경쇄는 또한 scFv의 일부로서 Fc 장쇄의 N-말단에 융합되도록 발현될 수 있다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하였고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝하였다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입하였다. 표 12의 각 작제물에 대한 다음의 아미노산 서열을 3개의 별개의 플라스미드(경쇄(항-CD20 또는 항-PD-L1)를 암호화하는 하나의 플라스미드, Fc 장쇄(항-CD20 또는 항-PD-L1)를 암호화하는 하나의 플라스미드, 및 Fc 단쇄를 암호화하는 하나의 플라스미드)에 의해 암호화하였다:
| 작제물 19(CD20) 및 작제물 19(PD-L1) 서열 | |||
| 작제물 | 경쇄 | Fc 장쇄 (항-CD20 또는 항-PD-L1 VH 및 CH1 포함) |
Fc 단쇄 |
| 작제물 19(CD20) | 서열번호 61 DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLVSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC |
서열번호 74 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSYSWINWVRQAPGQGLEWMGRIFPGDGDTDYNGKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNVFDGYWLVYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
서열 번호 63 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
| 작제물 19(PD-L1) | 서열 번호 49 QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRVFGTGTKVTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS |
서열번호 75 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMMWVRQAPGKGLEWVSSIYPSGGITFYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
서열 번호 63 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
발현된 단백질을 Poros MabCapture A(LifeTechnologies) 컬럼을 사용하는 단백질 A-기반 친화 컬럼 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상청액으로부터 정제하였다. 포획된 Fc-항원 결합 도메인 작제물을 인산염 완충 식염수로 세척하고(저염 세척) pH 3, 100 mM 글리신으로 용리하였다. 용출액을 1 M TRIS(pH 7.4)의 첨가로 빠르게 중화하고, 0.2 μm 필터로 멸균 여과하였다. 단백질을 Poros XS 수지(Applied Biosciences)를 사용하여 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 분리하였다. 컬럼을 50 mM MES, pH 6(완충액 A)로 사전 평형화하였고 샘플을 용출 완충액으로서 50 mM MES, 400 mM 염화나트륨, pH 6(완충액 B)을 사용하여 단계 구배로 용리하였다. 이온 교환 후에, 표적 분획물을 접선 유동 여과 시스템상에서 10 kDa 컷오프 폴리에테르설폰(PES) 막 카트리지를 사용하여 PBS 완충액으로 완충액 교환하였다. 샘플을 대략 30 mg/mL로 농축하였고 0.2 μm 필터로 멸균 여과하였다.
비환원 황산도데실나트륨-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)
샘플을 95℃에서 10분간 Laemmli 샘플 완충액(4% SDS, Bio-Rad)에서 변성시켰다. Criterion TGX 무착색 겔(4~15% 폴리아크릴아미드, Bio-Rad)상에 샘플을 흘렸다. 단백질 밴드를 UV 조사 또는 쿠마시 블루 염색으로 시각화하였다. ChemiDoc MP Imaging System(Bio-Rad)으로 겔을 이미지화하였다. Imagelab 4.0.1 소프트웨어(Bio-Rad)를 사용하여 밴드를 정량 분석하였다.
실시예 57. 항-CD20 Fc 작제물에 의한 보체 의존성 세포독성(CDC) 활성화
CDC 검정을 개발하여 항-CD20 Fc 작제물이 항-CD20 단클론 항체인 오비누투주맙에 비해 CDC 활성을 강화하는 정도를 시험하였다. Gazyva의 CDR을 갖는 항-CD20 Fc 작제물 4, 7, 8, 9, 10, 13 및 19를 실시예 1, 2, 및 51~56에 기재된 바와 같이 생산하였다. 장쇄의 Fc 장쇄 단량체 간에 글리신 스페이서(G4, G10, G15 및 G20 링커)의 크기만 다른 4가지 버전의 작제물 13(CD20)을 생성하였다. 각 항-CD20 Fc 작제물 및 오비누투주맙 단클론 항체를 다음과 같이 수행된 CDC 검정으로 시험하였다:
10% 열-불활성화 FBS가 보충된 RPMI-1640에서 성장한 Daudi 세포를 펠릿화하고 얼음처럼 차가운 PBS로 1회 세정하여, 1.0 x 106개의 생존 세포/mL의 농도로 0.1 % BSA를 포함하는 RPMI-1640에 재현탁하였다. 이러한 세포 현탁액 50 마이크로리터를 96-웰 플레이트의 모든 웰(플레이트 가장자리 제외)에 첨가하였다. 첨가가 모두 완료될 때까지 플레이트를 얼음 위에 보관하였다. 시험 물품을 RPMI-1640 + BSA에서 450 nM의 시작 농도에서 4배 연속 희석하였다. 각 시험 항목을 대상으로 총 10가지 농도를 시험하였다. 도말된 Daudi 세포에 각각 50 마이크로리터를 첨가하였다. 정상 또는 C1q-고갈 인간 보체 혈청(Quidel, San Diego, CA)을 RPMI-1640 + BSA에서 1:5로 희석하였다. 도말된 Daudi 세포에 각각 50 마이크로리터를 첨가하였다. 6개의 정상 혈청 대조군 웰에 세포, 배지 단독(처리 없음) 및 1/5 정상 혈청(정상 백그라운드)을 제공하였다. 이들 웰 중 3개에는 16.5 μL Triton X-100(Promega, Madison, WI)(정상 용해 대조군)도 제공하였다. C1q 고갈 백그라운드 및 용해 대조군을 유사하게 제조하였다. PBS를 모든 플레이트 에지 웰에 첨가하였다. 플레이트를 37°C에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 2시간 후, 50 μL의 예열한 Alamar blue(Thermo, Waltham, MA)를 모든 웰(플레이트 가장자리 제외)에 첨가하였다. 플레이트를 인큐베이터로 다시 넣고 밤새 두었다(37℃에서 18시간). 18시간 후 FlexStation 3에서 형광을 측정하였다. 플레이트를 544/590 Ex/Em 필터 및 Auto Cut-Off를 사용하여 판독하였다. 정상 백그라운드, 정상 용해 대조군, C1q 고갈 백그라운드 및 C1q 고갈 용해 대조군 웰의 평균을 계산하였다. 세포 용해율은 다음과 같이 계산하였다:
세포 용해율(%) = (RFU 시험 - RFU 백그라운드) /(RFU 용해 대조군 - RFU 백그라운드) * 100. 각 작제물의 EC50 (nM)을 측정하였다.
표 13에 표기된 바와 같이, 항-CD20 Fc 작제물은 Daudi 세포에서 CDC를 유도하였고, 더 낮은 EC50 값에 의해 입증된 바와 같이, 오비누투주맙 단클론 항체에 비해 세포독성을 강화하는 데 있어서 더 큰 효능을 나타냈다. 도 54는 항-CD20 작제물 7 및 항-CD20 작제물 13의 결과를 도시하는데, 각각의 Fc 작제물이 푸코실화 항-CD20 IgG1 항체 및 Gazyva 대조군 모두에 비해 더 낮은 농도에서 더 높은 세포 용해를 유도한다는 것을 보여준다.
| Daudi 세포에서 CDC를 유도하는 항-CD20 Fc 작제물의 효능 | ||||
| 작제물 1 | n | EC50 (nM) | ||
| 범위 | 평균 | SD | ||
| IgG1 항체, 푸코실화 | 5 | 38 - 65 | 47 | 11 |
| S3I-AA-OBI 작제물 7 (항-CD20) |
5 | 0.39 - 0.70 | 0.55 | 0.12 |
| S5I-AA-OBI 작제물 10 (항-CD20) |
1 | 0.88 | 0.88 | 해당 없음 |
| S3W-AA-OBI 작제물 82 (항-CD20) |
3 | 0.15 - 0.18 | 0.17 | 0.017 |
| S3A-AA-OBI 작제물 9 (항-CD20) |
3 | 0.19 - 0.20 | 0.19 | 0.0036 |
| S3Y-AA-OBI4 작제물 13 (항-CD20), G4 링커 |
3 | 0.11 - 0.19 | 0.16 | 0.045 |
| S3Y-AA-OBI10 작제물 13 (항-CD20), G10 링커 |
3 | 0.11 - 0.19 | 0.16 | 0.047 |
| S3Y-AA-OBI15 작제물 13 (항-CD20), G15 링커 |
4 | 0.13 - 0.36 | 0.22 | 0.098 |
| S3Y-AA-OBI 작제물 13 (항-CD20), G20 링커 |
4 | 0.13 - 0.22 | 0.18 | 0.046 |
| S5X-AA-OBI 작제물 19 (항-CD20) |
1 | 0.20 | 0.20 | 해당 없음 |
| S3L-AAA-OBI3 작제물 4 (항-CD20) |
4 | 0.12 - 0.18 | 0.15 | 0.031 |
1달리 명시되지 않는 한 모든 작제물은 G20 링커를 포함하였다.
2작제물은 자연발생 E388D 돌연변이를 포함한다.
실시예 58. 항-PD-L1 Fc 작제물에 의한 보체 의존성 세포독성(CDC) 활성화
CDC 검정을 개발하여 항-PD-L1 단클론 항체인 아벨루맙(Bavencio) 대비 항-PD-L1 Fc 작제물이 CDC 활성을 강화하는 정도를 시험하였다. 아벨루맙의 CDR을 갖는 항-PD-L1 Fc 작제물 7, 8, 10, 13 및 19를 실시예 1, 2, 및 51~56에 기재된 바와 같이 제작하였다. 장쇄의 Fc 장쇄 단량체 사이에서 글리신 스페이서(G4, G10, G15 및 G20 링커)의 크기만 다른 4가지 버전의 작제물 13(PD-L1)을 생성하였다. 각각의 항-PD-L1 Fc 작제물, 및 아벨루맙 단클론 항체를 다음과 같이 수행한 CDC 검정에서 시험하였다:
인간 PD-L1 유전자를 안정적으로 발현하도록 형질감염시킨 인간 배아 신장(HEK) 세포주(CrownBio)를 선택 마커로서 DMEM, 10% FBS, 및 2 μg/mL 퓨로마이신 중에서 배양하였다. 세포를 수확하고 제네테신(genetecin) 또는 페놀 레드(phenol red)(Lonza) 없이 X-Vivo-15 배지에서 희석하였다. 100 μl의 HEK-PD-L1 세포(6 x105 세포/mL)를 96 웰 조직 배양물로 처리한 바닥이 평평한 플레이트(BD Falcon)에 도말하였다. Fc 작제물과 항체를 X-Vivo-15 배지에서 1:3으로 연속 희석하였다. 50 μL의 희석된 작제물을 웰 내의 표적 세포 위에 첨가하였다. 50 μl의 희석하지 않은 인간 혈청 보체(Quidel Corporation)를 웰 각각에 첨가하였다. 그런 다음, 검정 플레이트를 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 2시간의 인큐베이션 후, 20 μL의 WST-1 세포 증식제(Roche Diagnostics Corp)를 각각의 웰에 첨가하고, 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음날 아침, 검정 플레이트를 2 내지 5분 동안 플레이트 진탕기 상에 두었다. 분광 광도계(Molecular Devices SPECTRAmax M2)를 이용해 450 nm에서 흡광도를 측정하고 600 nm에서 보정하였다. 각 작제물의 EC50 (nM)을 측정하였다.
표 14에 나타낸 바와 같이, 항-PD-L1 Fc 작제물 일부는 인간 PD-L1을 발현하는 HEK 세포에서 CDC를 유도하였다.
| PD-L1 발현 HEK 세포에서 CDC를 유도하는 항-PD-L1 작제물의 효능 | ||||
| 작제물 1 | n | EC50 (nM) | ||
| 범위 | 평균 | SD | ||
| IgG1 항체, 푸코실화 | 7 | CDC 활성 없음3 | CDC 활성 없음3 | 해당 없음 |
| IgG1 항체, 탈푸코실화 | 1 | CDC 활성 없음3 | CDC 활성 없음3 | 해당 없음 |
| S3I-AA-AVE 작제물 72 (항-PD-L1) |
6 | CDC 활성 없음3 | CDC 활성 없음3 | 해당 없음 |
| S5I-AA-AVE 작제물 10 (항-PD-L1) |
2 | CDC 활성 없음3 | CDC 활성 없음3 | 해당 없음 |
| S3W-AA-AVE 작제물 82 (항-PD-L1) |
3 | 1.2-2.4 | 1.7 |
0.63 |
| S3Y-AA-AVE4 작제물 13 (항-PD-L1), G4 링커 |
2 | 0.43-0.84 | 0.64 |
0.29 |
| S3Y-AA-AVE10 작제물 13 (항-PD-L1), G10 링커 |
2 | 0.58-1.0 | 0.81 |
0.33 |
| S3Y-AA-AVE15 작제물 13 (항-PD-L1), G15 링커 |
2 | 0.56-1.1 | 0.85 | 0.41 |
| S3Y-AA-AVE 작제물 13 (항-PD-L1), G20 링커 |
15 | 0.38-3.6 | 1.4 | 1.2 |
| S5X-AA-AVE 작제물 19 (항-PD-L1) |
3 | 0.88-3.4 | 1.9 |
1.4 |
1달리 명시되지 않는 한 모든 작제물은 G20 링커를 포함하였다.
2작제물은 자연발생 E388D 돌연변이를 포함한다.
3작제물은 검정 조건하에서 측정가능한 CDC를 생성하지 않았다.
실시예 59. 항-CD20 Fc 작제물에 의한 항체 의존성 세포 식균작용(ADCP) 활성화
ADCP 리포터 검정
ADCP 리포터 검정을 개발하여 항-CD20 단클론 오비누투주맙 항체(Gazyva)에 비해 항-CD20 Fc 작제물이 FcγRIIa 신호전달을 활성화하여, ADCP 활성을 강화하는 정도를 시험하였다. Gazyva의 CDR을 갖는 항-CD20 Fc 작제물 4, 7, 8, 9, 10, 13 및 19를 실시예 1, 2, 및 51~56에 기재된 바와 같이 생산하였다. Fc 장쇄 단량체 사이에서 글리신 스페이서(G4, G10, G15 및 G20 링커)의 크기가 다른 4가지 버전의 작제물 13(CD20)을 시험하였다. 각각의 항-CD20 Fc 작제물 및 푸코실화 및 탈푸코실화 오비누투주맙 단클론 항체를 다음과 같이 수행한 ADCC 리포터 검정에서 시험하였다:
Raji 표적 세포(1.5 x 104개의 세포/웰) 및 Jurkat/Fc?RIIa-H 효과기 세포(Promega)(3.5 x 104개의 세포/웰)을 4% 저 IgG 혈청이 보충된 RPMI 1640 배지(Promega)에 재현탁하고 연속 희석된 항-CD20 Fc 작제물을 갖는 96-웰 플레이트에 접종하였다. 5% CO2 하에 37℃에서 6시간 동안 배양한 후, PHERAstar FS 발광 측정기(BMG LABTECH)를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 Bio-Glo 루시페라제 검정 시약(Promega)을 사용하여 발광을 측정하였다.
표 15에 도시된 바와 같이, 항-CD20 Fc 작제물은 더 낮은 EC50 값에 의해 입증된 바와 같이 오비누투주맙 단클론 항체에 비해 ADCP 리포터 검정에서 FcγRIIa 신호전달을 유도하였고, ADCP 활성을 강화하는 데 있어서 더 큰 효능을 나타냈다. 도 55는 항-CD20 작제물 7 및 항-CD20 작제물 13의 결과를 도시하는데, 각각의 Fc 작제물이 푸코실화 및 탈푸코실화 항-CD20 IgG1 항체 대조군 모두에 비해 더 낮은 농도에서 더 높은 FcγRIIa 신호전달을 유도한다는 것을 보여준다.
| ADCP 리포터 검정에서 FcγRIIa 신호전달을 유도하는 항-CD20 Fc 작제물의 효능 | ||||
| 작제물 1 | n | EC50 (nM) | ||
| 범위 | 평균 | SD | ||
| IgG1 항체, 푸코실화 | 6 | 4.5 - 10.8 | 7.1 | 2.2 |
| IgG1 항체, 탈푸코실화 | 3 | 5.5 - 6.1 | 5.8 | 0.3 |
| S3I-AA-OBI 작제물 7 (항-CD20) |
6 | 0.0016 - 0.12 | 0.067 | 0.0409 |
| S5I-AA-OBI 작제물 10 (항-CD20) |
1 | 0.11 | 0.11 | 해당 없음 |
| S3W-AA-OBI 작제물 82 (항-CD20) |
1 | 0.087 | 0.087 | 해당 없음 |
| S3A-AA-OBI 작제물 9 (항-CD20) |
1 | 0.026 | 0.026 | 해당 없음 |
| S3Y-AA-OBI4 작제물 13 (항-CD20), G4 링커 |
1 | 0.061 | 0.061 | 해당 없음 |
| S3Y-AA-OBI10 작제물 13 (항-CD20), G10 링커 |
1 | 0.056 | 0.056 | 해당 없음 |
| S3Y-AA-OBI15 작제물 13 (항-CD20), G15 링커 |
1 | 0.074 | 0.074 | 해당 없음 |
| S3Y-AA-OBI 작제물 13 (항-CD20), G20 링커 |
5 | 0.041 - 0.14 | 0.064 | 0.041 |
| S5X-AA-OBI 작제물 19 (항-CD20) |
1 | 0.045 | 0.045 | 해당 없음 |
| S3L-AAA-OBI3 작제물 4 (항-CD20) |
1 | 0.055 | 0.055 | 해당 없음 |
1달리 명시되지 않는 한 모든 작제물은 G20 링커를 포함하였다.
2작제물은 자연발생 E388D 돌연변이를 포함한다.
ADCP 2차 검정
ADCP 리포터 검정 결과를 확인하기 위하여 항-CD20 Fc 작제물 7, 8, 9, 13(G20 링커), 및 19를 추가 ADCP 검정으로 시험하였다. 각각의 항-CD20 Fc 작제물 및 푸코실화 및 탈푸코실화 오비누투주맙 단클론 항체를 다음과 같이 수행한 ADCC 검정에서 시험하였다:
단핵구를 동결 PBMC에서 정제하고, M-CSF의 존재 하에 백에서 배양하였다. IL-10을 배양 백에 첨가하고, 2일 후에 분화된 M2c 대식세포를 ADCP 검정에 사용하였다. 단핵구/대식세포에 대한 총 배양 시간은 8일이었다. 항-CD20 Fc 작제물을 10배로 연속 희석하고, KILR Raji 세포에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 대식세포를 Hyclone의 10% Super Low IgG Defined FBS(열 불활성화)가 포함된 페놀 레드 무함유 RPMI(Life Technologies) 중의 검정 배지에 재현탁하고, 8:1의 비율로 코팅된 KILR Raji 세포(M2C)와 효과기 세포를 포함하는 플레이트(들)에 첨가하고, 24시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 시간 후, PathHunter® ProLabel®/ProLink™ 검출 키트 시약을 플레이트(들)에 첨가하고, 실온에서 60분 동안 인큐베이션한 후 PHERAstar FS 발광 측정기(BMG LABTEH)를 이용해 판독하였다.
표 16에 나타난 결과는, 항-CD20 Fc 작제물이 2차 ADCP 검정에서 FcγRIIa 신호전달을 유도하였고, 더 낮은 EC50 값에 의해 입증된 바와 같이, 푸코실화 또는 탈푸코실화 오비누투주맙 단클론 항체에 비해 ADCP 활성을 강화하는 데 있어서 더 큰 효능을 가졌음을 입증한다. 2차 ADCP 검정의 결과는 ADCP 리포터 검정의 결과와 일치하였다.
| KILR Raji 세포에서 ADCP를 유도하는 항-CD20 Fc 작제물의 효능 | ||||
| 작제물 1 | n | EC50 (nM) | ||
| 범위 | 평균 | SD | ||
| IgG1 항체, 푸코실화 | 8 | 0.00053-1.8 | 0.82 | 0.82 |
| IgG1 항체, 탈푸코실화 | 4 | 0.0015-0.96 | 0.37 | 0.51 |
| S3I-AA-OBI 작제물 7 (항-CD20) |
8 | 0.00058-0.27 | 0.042 | 0.095 |
| S3W-AA-OBI 작제물 82 (항-CD20) |
2 | 0.00015-0.053 | 0.026 | 0.037 |
| S3A-AA-OBI 작제물 9 (항-CD20) |
2 | 0.0020-0.089 | 0.045 |
0.061 |
| S3Y-AA-OBI 작제물 13 (항-CD20) |
4 | 0.000063-0.076 | 0.019 | 0.038 |
| S5X-AA-OBI 작제물 19 (항-CD20) |
2 | 0.00038-0.026 | 0.013 | 0.018 |
1달리 명시되지 않는 한 모든 작제물은 G20 링커를 포함하였다.
2작제물은 자연발생 E388D 돌연변이를 포함한다.
실시예 60. 항-PD-L1 Fc 작제물에 의한 항체 의존성 세포 식균작용(ADCP) 활성화
ADCP 리포터 검정
ADCP 리포터 검정을 개발하여 항-PD-L1 단클론 항체인 아벨루맙(Bavencio)에 비해 항-PD-L1 Fc 작제물이 FcγRIIa 신호전달을 활성화하여, ADCP 활성을 강화하는 정도를 시험하였다. 아벨루맙의 CDR을 갖는 항-PD-L1 Fc 작제물 4, 7, 8, 9, 10, 13, 16 및 19를 실시예 1, 2, 및 51~56에 기재된 바와 같이 제작하였다. Fc 장쇄 단량체 사이에서 글리신 스페이서(G4, G10, G15 및 G20 링커)의 크기가 다른 4가지 버전의 작제물 13(PD-L1)을 시험하였다. 각각의 항-PD-L1 Fc 작제물, 및 푸코실화 및 탈푸코실화 아벨루맙 단클론 항체를 다음과 같이 수행한 ADCC 리포터 검정으로 시험하였다:
표적 HEK-PD-L1 세포(1.5 x 104개의 세포/웰) 및 효과기 Jurkat/FcγRIIa-H 세포(Promega)(3.5 x 104개의 세포/웰)를 4% 저 IgG 혈청이 보충된 RPMI 1640 배지(Promega)에 재현탁하고 연속 희석된 항-PD-L1 Fc 작제물을 갖는 96-웰 플레이트에 접종하였다. 5% CO2 하에 37℃에서 6시간 동안 인큐베이션한 후, PHERAstar FS 발광 측정기(BMG LABTECH)를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 Bio-Glo 루시퍼라제 검정 시약(Promega)을 사용하여 발광을 측정하였다.
표 17에 도시된 바와 같이, 항-PD-L1 Fc 작제물은 ADCP 리포터 검정에서 FcγRIIa 신호전달을 유도하였다.
| ADCP 리포터 검정에서 FcγRIIa 신호전달을 유도하는 항-PD-L1 Fc 작제물의 효능 | ||||
| 작제물 번호 1 | n | EC50 (nM) | ||
| 범위 | 평균 | SD | ||
| IgG1 항체, 푸코실화 | 6 | 효과 없음3 | 효과 없음3 | 해당 없음 |
| IgG1 항체, 탈푸코실화 | 1 | 효과 없음3 | 효과 없음3 | 해당 없음 |
| S3I-AA-AVE 작제물 72 (항-PD-L1) |
6 | 0.012 - 0.036 | 0.026 | 0.012 |
| S5I-AA-AVE 작제물 10 (항-PD-L1) |
1 | 0.031 | 0.031 | 해당 없음 |
| S3W-AA-AVE 작제물 82(항-PD-L1) |
1 | 0.028 | 0.028 | 해당 없음 |
| S3A-AA-AVE 작제물 92(항-PD-L1) |
1 | 0.026 | 0.026 | 해당 없음 |
| S3Y-AA-AVE4 작제물 13 (항-PD-L1), G4 링커 |
1 | 0.05 | 0.05 | 해당 없음 |
| S3Y-AA-AVE10 작제물 13 (항-PD-L1), G10 링커 |
1 | 0.085 | 0.085 | 해당 없음 |
| S3Y-AA-AVE15 작제물 13 (항-PD-L1), G15 링커 |
1 | 0.05 | 0.05 | 해당 없음 |
| S3Y-AA-AVE 작제물 13 (항-PD-L1), G20 링커 |
6 | 0.027 - 0.052 | 0.038 | 0.01 |
| S5X-AA-AVE 작제물 19 (항-PD-L1) |
1 | 0.033 | 0.033 | 해당 없음 |
| S5Y-AA-AVE 작제물 16 (항-PD-L1) |
1 | 0.04 | 0.04 | 해당 없음 |
| S3L-3AAA-AVE 작제물 4 (항-PD-L1) |
1 | 0.028 | 0.028 | 해당 없음 |
1달리 명시되지 않는 한 모든 작제물은 G20 링커를 포함하였다.
2작제물은 자연발생 E388D 돌연변이를 포함한다.
3작제물은 검정 조건 하에서 측정 가능한 FcγRIIa 신호전달을 유도하지 않았다.
ADCP 2차 검정
ADCP 리포터 검정 결과를 확인하기 위하여 항-PD-L1 Fc 작제물 8, 9 및 13(G20 링커)을 추가 ADCP 검정으로 시험하였다. 각각의 항-PD-L1 Fc 작제물, 및 푸코실화 아벨루맙 단클론 항체를 다음과 같이 수행한 ADCC 검정으로 시험하였다:
M2c 대식 세포를 웰당 2 x 105개의 세포로 96 웰 U-자형 바닥 초저 결합 플레이트(Costar, 7007)에 접종하였고, 5% CO2 가습 인큐베이터에서 적어도 1시간 동안 37°C에서 평형화되게 하였다. HEK293 PD-L1 세포를 제조업자의 프로토콜에 따라 칼세인(calcein)-AM(Invitrogen, C-3100)으로 염색하였고, 6.7 nM에서 5배 희석된 항-PD-L1 작제물과 함께 15분 동안 상온에서 예비 인큐베이션하였다. 그런 다음, 이들 세포를 3:1의 효과기:표적 비율로 대식세포와 조합하였고, 5% CO2 인큐베이터에서 2시간 동안 37°C에서 인큐베이션하였다. 염색을 위해 세포를 V-자형 바닥 96 웰 플레이트로 옮긴 후 FACS 완충액(PBS + 2% FBS)으로 세척하였다. 모인 세포를 Fc 블록(Biolegend, 422302)을 사용하여 차단하였고 항-CD11b-APC Ab(Biolegend, 301310)를 사용하여 4°C에서 1시간 동안 염색하였다. 세포를 FACS 완충액으로 세척하고 BD FACS Verse상에서 판독하였다. FlowJo를 사용하여 분석하였다. 다중세포를 FSC-H vs FSC-A 플롯으로 계산하여 제거하였다. 칼세인-AM 및 CD11b에 양성인 세포를 식세포 활동 또는 이중 양성 대식세포(DP)로 간주하였다. 식균작용 백분율을 계산하여 산출하였다 (DP 세포/총 표적 세포)*100.
표 18에 나타난 결과는, 항-PD-L1 Fc 작제물이 2차 검정에서 ADCP를 유도하였고, 더 낮은 EC50 값에 의해 입증된 바와 같이, 푸코실화 아벨루맙 단클론 항체에 비해 ADCP 활성을 강화하는 데 있어서 더 큰 효능을 가졌음을 입증한다. 2차 ADCP 검정의 결과는 ADCP 리포터 검정의 결과와 일치하였다.
| HEK-PD-L1 세포 및 M2c 대식세포를 사용한 FACS-기반 검정에서 ADCP를 유도하는 항-PD-L1 Fc 작제물의 효능 | ||||
| 작제물 번호 1 | n | EC50 (nM) | ||
| 범위 | 평균 | SD | ||
| IgG1 항체, 푸코실화 | 1 | 0.211 |
0.211 |
해당 없음 |
| S3W-AA-AVE 작제물 82 (항-PD-L1) |
1 | 0.054 |
0.054 | 해당 없음 |
| S3A-AA-AVE 작제물 92(항-PD-L1) |
2 | 0.00097 - 0.0061 |
0.0035 | 0.0036 |
| S3Y-AA-AVE 작제물 13 (항-PD-L1), G20 링커 |
2 | 0.01947 - 0.05635 | 0.03791 |
0.026078 |
1달리 명시되지 않는 한 모든 작제물은 G20 링커를 포함하였다.
2작제물은 자연발생 E388D 돌연변이를 포함한다.
실시예 61. 항-CD20 Fc 작제물에 의한 항체 의존성 세포-매개 세포독성(ADCC) 활성화
ADCC 리포터 검정
ADCC 리포터 검정을 개발하여 항-CD20 단클론 항체인 오비누투주맙(Gazyva)에 비해 항-CD20 Fc 작제물이 FcγRIIa 신호전달을 활성화하여, ADCC 활성을 강화하는 정도를 시험하였다. Gazyva의 CDR을 갖는 항-CD20 Fc 작제물 4, 7, 8, 9, 10, 13 및 19를 실시예 1, 2, 및 51~56에 기재된 바와 같이 생산하였다. Fc 장쇄 단량체들 간에 글리신 스페이서(G4, G10, G15 및 G20 링커)의 크기가 다른 4가지 버전의 작제물 13(CD20)을 시험하였다. 각각의 항-CD20 Fc 작제물 및 푸코실화 및 탈푸코실화 오비누투주맙 단클론 항체를 다음과 같이 수행한 ADCC 리포터 검정에서 시험하였다:
Raji 표적 세포(1.25 x 104개의 세포/웰) 및 Jurkat/FcγRIIIa 효과기 세포(Promega)(7.45 x 104개의 세포/웰)을 4% 저 IgG 혈청이 보충된 RPMI 1640 배지(Promega)에 재현탁하고 연속 희석된 항-CD20 Fc 작제물을 갖는 96-웰 플레이트에 접종하였다. 5% CO2 하에 37℃에서 6시간 동안 인큐베이션한 후, PHERAstar FS 발광 측정기(BMG LABTECH)를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 Bio-Glo 루시퍼라제 검정 시약(Promega)을 사용하여 발광을 측정하였다.
표 19에 나타난 바와 같이, 항-CD20 Fc 작제물은 ADCC 리포터 검정에서 FcγRIIIa 신호전달을 유도하였고, 더 낮은 EC50 값에 의해 입증된 바와 같이 푸코실화 오비누투주맙 단클론 항체에 비해 ADCC 활성을 강화하는 데 있어서 더 큰 효능을 나타냈다. 도 56은 항-CD20 작제물 7 및 항-CD20 작제물 13의 결과를 도시하는데, 각각의 Fc 작제물이 푸코실화 및 탈푸코실화 항-CD20 항체에 비해 더 낮은 농도에서 더 높은 FcγRIIIa 신호전달을 유도하지만, 탈푸코실화 항-CD20 항체만큼 효과적이지는 않았음을 보여준다.
| ADCC 리포터 검정에서 FcγRIIa 신호전달을 유도하는 항-CD20 Fc 작제물의 효능 | ||||
| 작제물 1 | n | EC50 (nM) | ||
| 범위 | 평균 | SD | ||
| IgG1 항체, 푸코실화 | 6 | 4.5 - 10.8 | 7.1 | 2.2 |
| IgG1 항체, 탈푸코실화 | 3 | 5.5 - 6.1 | 5.8 | 0.3 |
| S3I-AA-OBI 작제물 7 (항-CD20) |
6 | 0.0016 - 0.12 | 0.067 | 0.041 |
| S5I-AA-OBI 작제물 10 (항-CD20) |
1 | 0.11 | 0.11 | 해당 없음 |
| S3W-AA-OBI 작제물 82 (항-CD20) |
1 | 0.087 | 0.087 | 해당 없음 |
| S3A-AA-OBI 작제물 9 (항-CD20) |
1 | 0.026 | 0.026 | 해당 없음 |
| S3Y-AA-OBI4 작제물 13 (항-CD20), G4 링커 |
1 | 0.061 | 0.061 | 해당 없음 |
| S3Y-AA-OBI10 작제물 13 (항-CD20), G10 링커 |
1 | 0.056 | 0.056 | 해당 없음 |
| S3Y-AA-OBI15 작제물 13 (항-CD20), G15 링커 |
1 | 0.074 | 0.074 | 해당 없음 |
| S3Y-AA-OBI 작제물 13 (항-CD20), G20 링커 |
5 | 0.041 - 0.14 | 0.064 | 0.041 |
| S5X-AA-OBI 작제물 19 (항-CD20) |
1 | 0.045 | 0.045 | 해당 없음 |
| S3L-AAA-OBI3 작제물 4 (항-CD20) |
1 | 0.055 | 0.055 | 해당 없음 |
1달리 명시되지 않는 한 모든 작제물은 G20 링커를 포함하였다.
2작제물은 자연발생 E388D 돌연변이를 포함한다.
ADCC 2차 검정
ADCC 리포터 검정 결과를 확인하기 위하여 항-CD20 Fc 작제물 7, 8, 9, 13(G20 링커), 및 19를 추가 ADCC 검정으로 시험하였다. 각각의 항-CD20 Fc 작제물 및 푸코실화 Gazyva 단클론 항체를 다음과 같이 수행한 ADCC 검정에서 시험하였다:
NK 세포를 해동시키고, Lonza LGM 배지에 250,000개의 세포/ml로 재현탁한 다음 밤새 배양하였다. 프로브를 연속 희석하고((10배), 5:1의 효과기:표적 비율로 (50,000:10,000 또는 25,000:5,000; 공여자에 따라 다름) KILR Raji 세포와 함께 30분 동안 인큐베이션하였다. NK 세포를 카운트하고, Hyclone의 10% 초저 IgG Defined FBS(열 불활성화)가 포함된 페놀 레드 무함유 RPMI (Life Technologies) 중의 검정 배지에 재현탁하고, 코팅된 KILR Raji 세포를 포함하는 플레이트(들)에 첨가하였다. 5시간 30분 후, KILR 검출 시약을 혼합하여 플레이트(들)에 첨가하였다. RT에서 30분 동안 인큐베이션한 후 PHERAstar FS 발광 측정기(BMG LABTECH)를 이용해 플레이트를 판독하였다.
표 20에 나타난 결과는, 항-CD20 Fc 작제물이 2차 ADCC 검정에서 FcγRIIIa 신호전달을 유도하였고, 더 낮은 EC50 값에 의해 입증된 바와 같이, 푸코실화 Gazyva 단클론 항체에 비해 ADCC 활성을 강화하는 데 있어서 더 큰 효능을 가졌음을 입증한다. 2차 ADCC 검정의 결과는 ADCC 리포터 검정의 결과와 일치한다.
| KILR Rajii 세포에서 ADCC를 유도하는 항-CD20 Fc 작제물의 효능 | ||||
| 작제물 1 | n | EC50 (nM) | ||
| 범위 | 평균 | SD | ||
| IgG1 항체, 푸코실화 | 10 | 0.00043-0.17 | 0.033 |
0.052 |
| S3I-AA-OBI 작제물 7 (항-CD20) |
10 | 0.0000021-0.014 | 0.0029 |
0.0046 |
| S3W-AA-OBI 작제물 82 (항-CD20) |
2 | 0.000036-0.016 | 0.0078 |
0.011 |
| S3A-AA-OBI 작제물 9 (항-CD20) |
2 | 0.00018-0.011 | 0.0057 |
0.0079 |
| S3Y-AA-OBI 작제물 14 (항-CD20), G20 링커 |
4 | 0.00036-0.22 | 0.010 |
0.011 |
| S5X-AA-OBI 작제물 19 (항-CD20) |
2 | 0.0000041-0.0045 | 0.0022 |
0.0032 |
1달리 명시되지 않는 한 모든 작제물은 G20 링커를 포함하였다.
2작제물은 자연발생 E388D 돌연변이를 포함한다.
실시예 62. 항-PD-L1 Fc 작제물에 의한 항체 의존성 세포-매개 세포독성(ADCC) 활성화
ADCC 리포터 검정
ADCC 리포터 검정을 개발하여 항-PD-L1 단클론 항체인 아벨루맙(Bavencio)에 비해 항-PD-L1 Fc 작제물이 FcγRIIa 신호전달을 활성화하여, ADCC 활성을 강화하는 정도를 시험하였다. 아벨루맙의 CDR을 갖는 항-PD-L1 Fc 작제물 4, 7, 8, 10, 13, 16 및 19를 실시예 1, 2, 및 51~56에 기재된 바와 같이 제작하였다. Fc 장쇄 단량체 사이에서 글리신 스페이서(G4, G10, G15 및 G20 링커)의 크기가 다른 4가지 버전의 작제물 13(PD-L1)을 시험하였다. 각각의 항-PD-L1 Fc 작제물, 및 푸코실화 아벨루맙 단클론 항체를 다음과 같이 수행한 ADCC 리포터 검정으로 시험하였다:
표적 HEK-PD-L1 세포(1.25 x 104개의 세포/웰) 및 효과기 Jurkat/FcγRIIa 세포(Promega)(7.45 x 104개의 세포/웰)를 4% 저 IgG 혈청이 보충된 RPMI 1640 배지(Promega)에 재현탁하고 연속 희석된 항-PD-L1 Fc 작제물을 갖는 96-웰 플레이트에 접종하였다. 5% CO2 하에 37℃에서 6시간 동안 인큐베이션한 후, PHERAstar FS 발광 측정기(BMG LABTECH)를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 Bio-Glo 루시퍼라제 검정 시약(Promega)을 사용하여 발광을 측정하였다.
표 21에 나타난 바와 같이, 항-PD-L1 Fc 작제물은 ADCC 리포터 검정에서 FcγRIIIa 신호전달을 유도하였다.
| ADCC 리포터 검정에서 FcγRIIa 신호전달을 유도하는 항-PD-L1 Fc 작제물의 효능 | ||||
| 작제물 번호 1 | n | EC50 (nM) | ||
| 범위 | 평균 | SD | ||
| IgG1 항체, 푸코실화 | 5 | 0.037 - 0.056 | 0.049 | 0.008 |
| S3I-AA-AVE 작제물 72 (항-PD-L1) |
6 | 0.023 - 0.05 | 0.039 | 0.012 |
| S5I-AA-AVE 작제물 10 (항-PD-L1) |
1 | 0.025 | 0.025 | 해당 없음 |
| S3W-AA-AVE 작제물 82 (항-PD-L1) |
1 | 0.034 | 0.034 | 해당 없음 |
| S3Y-AA-AVE4 작제물 14 (항-PD-L1), G4 링커 |
1 | 0.041 | 0.041 | 해당 없음 |
| S3Y-AA-AVE10 작제물 14 (항-PD-L1), G10 링커 |
1 | 0.062 | 0.062 | 해당 없음 |
| S3Y-AA-AVE15 작제물 14 (항-PD-L1), G15 링커 |
1 | 0.044 | 0.044 | 해당 없음 |
| S3Y-AA-AVE 작제물 14 (항-PD-L1), G20 링커 |
6 | 0.025 - 0.044 | 0.032 | 0.008 |
| S5X-AA-AVE 작제물 19 (항-PD-L1) |
1 | 0.027 | 0.027 | 해당 없음 |
| S5Y-AA-AVE 작제물 16 (항-PD-L1) |
1 | 0.032 | 0.032 | 해당 없음 |
1달리 명시되지 않는 한 모든 작제물은 G20 링커를 포함하였다.
2작제물은 자연발생 E388D 돌연변이를 포함한다.
ADCC 2차 검정
ADCC 리포터 검정 결과를 확인하기 위하여 항-PD-L1 Fc 작제물 8, 9, 13(G20 링커), 및 19를 추가 ADCC 검정으로 시험하였다. 각각의 항-PD-L1 Fc 작제물, 및 푸코실화 및 탈푸코실화 아벨루맙 단클론 항체를 다음과 같이 수행한 ADCC 검정으로 시험하였다:
제조업자의 지시(DiscoverX)에 따라 ADCC A549-KILR 검정을 수행하였다. AssayComplete™ 세포 배양 키트-105를 사용하여 A549-KILR 세포주를 조직 배양 플라스크에서 성장시켰다. 세포를 AssayComplete™ 세포 분리 시약을 사용하여 수확하였고, AssayComplete™ 세포 플레이팅 39 시약을 사용하여 2 x 105개의 세포/mL로 조정하였으며, 50 μL/웰(1 x 104개의 세포)로 96-웰 흰색 바닥 조직 배양 처리 플레이트로 분배하였다. 연속 희석(1:4)을 수행하기 직전에 항-PD-L1 작제물을 AssayComplete™ 세포 플레이팅 39 시약에서 11 nM로 희석하였다. 희석된 작제물을 10 μL/웰로 웰에 첨가하였고 검정 플레이트를 5% CO2로 30분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 냉동 NK 세포(Hemacare)를 해동하고 AssayComplete™ 세포 플레이팅 39 시약을 사용하여 1 x 106개의 세포/mL로 재현탁하였다. 30분간의 인큐베이션 후에, NK 세포를 50 μL/웰(5 x 104개의 세포/웰)로 검정 플레이트에 첨가하였다. 탈푸코실화 항-PD-L1 IgG1 항체를 사용한 양성 대조군 및 A549-KILR 세포와 함께 항체의 부재 하에 공배양한 NK 세포로 구성되는 음성 대조군을 또한 포함하였다. 그런 다음, 검정 플레이트를 5% CO2하 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 직후에, (4:1:1의 부피비로 혼합된 KILR 검출 시약 1, 2, 및 3으로 구성된) KILR 검출 표준 용액 100 μL/웰을 각 웰에 첨가하였다. 그 후에, PHERAstar FS 발광 측정기(BMG LABTECH)를 사용하여 발광 수준을 측정하기 전에, 검정 플레이트를 상온에서 30분 동안 인큐베이션하였다.
표 22에 나타낸 결과는 항-PD-L1 Fc 작제물이 2차 ADCC 검정에서 FcγRIIIa 신호전달을 유도하였음을 보여준다. 2차 ADCC 검정의 결과는 ADCC 리포터 검정의 결과와 일치하였다.
| KILR-A549 세포에서 ADCC를 유도하는 항-PD-L1 Fc 작제물의 효능 | ||||
| 작제물 번호 1 | n | EC50 (nM) | ||
| 범위 | 평균 | SD | ||
| IgG1 항체, 푸코실화 | 1 | 0.017 | 0.017 | 해당 없음 |
| IgG1 항체, 탈푸코실화 | 8 | 0.00016 - 0.011 | 0.0054 | 0.0041 |
| S3W-AA-AVE작제물 82 (항-PD-L1) | 1 | 0.0018 | 0.0018 |
해당 없음 |
| S3A-AA-AVE 작제물 92 (항-PD-L1) |
1 | 0.00074 |
0.00074 |
해당 없음 |
| S3Y-AA-AVE 작제물 13 (항-PD-L1) |
3 | 0.0042 - 0.011 | 0.0068 | 0.0035 |
| S5X-AA-AVE 작제물 19 (항-PD-L1) |
2 | 0.000070 - 0.0012 |
0.00065 |
0.00082 |
1달리 명시되지 않는 한 모든 작제물은 G20 링커를 포함하였다.
2작제물은 자연발생 E388D 돌연변이를 포함한다.
실시예 63. 인간 혈액에서 푸코실화 및 탈푸코실화 항-CD20 Fc 작제물에 의한 CD19+ B 세포의 고갈
전혈 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 고갈 검정을 사용해, 오비누투주맙(Gazyva)의 CDR을 포함하는 항-CD20 Fc 작제물의 푸코실화 및 탈푸코실화 버전의 항-CD20 작제물 13(아래 실시예 65에 기술됨)이 CD19+ B 세포를 고갈시키는 데 사용될 수 있는지 결정하였다. CD19는 B 세포 특이적 표면 항원이고, B 세포에서 유래된 백혈병 및 림프종은 CD19를 발현한다. 인간 전혈을 EDTA 튜브에 채취하고, 100 μL를 VivoTag 645로 표지된 항-CD20 Fc 작제물의 2.96 μM 내지 0.3 pM 범위의 연속 희석물과 함께 37℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 플루오로세인 이소티오시안산염(FITC) 항-IgD, 피코에리트린(PE) 항-CD11c, 알로피코시아닌-H7(APC/H7) 항-CD14, PerCp Cy5.5 항-CD19, 피코에리트린-시아닌7(PE/Cy7) 항-CD56, 및 퍼시픽 블루(Pac Blue) 항-CD3 항체(BioLegend)를 포함하는 면역 세포-특이적 항체 칵테일을 혈액 세포에 첨가하고, 37℃에서 30분 동안 추가로 염색하였다. 염색 후, 적혈구(RBC)를 염화암모늄 용액(STEMCELL technologies)으로 실온(RT)에서 10분 동안 2회 용해시키고, 세포를 PBS 중에서 세척하였다. 200 μL FACS 완충액(2% FBS가 포함된 PBS)에 세포를 재현탁하고, FACSVerseTM 기기(BD Biosciences)에서 샘플을 수득하였다. 전방 산란(FSC) 및 측방 산란(SSC)을 사용해 백혈구 게이트를 설정하고, SSClow, FSCint, CD11c-, CD14-, CD56-, CD3-, 및 CD19+, IgD+로서 B 세포를 특성화하였다.
도 57은 푸코실화 및 탈푸코실화 작제물 13(항-CD20) 모두가 푸코실화 및 탈푸코실화 항-CD20 IgG1 단클론 항체(오비누투주맙)보다 더 낮은 농도(nM)에서 CD19+ B 세포를 고갈시켰음을(IgD+ 세포(%)) 보여준다. 탈푸코실화 항-CD20 작제물 13은 푸코실화 항-CD20 작제물 13보다 더 효과적으로 CD19+ B 세포를 고갈시켰다. 마찬가지로, 탈푸코실화 항-CD20 단클론 항체는 푸코실화 항체보다 더 효과적으로 CD19+ B 세포를 고갈시켰다.
실시예 64. 마우스 림프종 모델에서 항-CD20 Fc 작제물에 의한 종양 성장 감소
인간 림프종에 대한 마우스 파종성 종양 모델을 사용해 단일 투여량 또는 다중 투여량의 항-CD20 Fc 작제물(항-CD20 작제물 13)이 질환 진행에 미치는 효과와 치료 반응을 생물 광학 이미징에 의해 시험하였다. CB17-중증 합병 면역결핍증(SCID) 마우스(암컷, 6~7 주령, 평균 체중 20g, Charles River Laboratories의 236계통)를 동물 관리 시설에 48시간 동안 수용한 다음 IACUC 프로토콜에 따라 사용하였다. 물과 먹이는 자유롭게 제공하였다. 모든 실험은 동물 실험 윤리위원회의 승인을 받았다. 가벼운 통증의 징후와 전체적인 외형에 대해 마우스를 매일 체크하였다. 종양 이식 모델의 경우, 5x106개의 루시퍼라제-발현 일간 버킷 림프종 Daudi 세포(Daudi-Luc)를 꼬리 정맥을 통해 정맥 내 주입하였다. 주입에 앞서, Daudi-luc 세포는 CD20 및 CD38의 세포 표면 발현을 나타냈다. 종양 세포를 이식한 후 1시간차에, 마우스를 집결시키고 생물 발광 신호(이러한 조기 시점에는 주로 폐에 집중됨)에 기반하여 다양한 치료 그룹으로 무작위배정하였다(7마리/그룹). 종양 세포 주입 후 5시간차에, 각 마우스 그룹을 임상 투여량 범위와 유사한 단일 투여량의 제제(18 mg/kg의 다라투무맙(항-CD38 단클론 항체); 18 mg/kg의 오비누투주맙(Gazyva, 항-CD20 IgG1 단클론 항체); 30 mg/kg의 항-CD20 작제물 13, 등몰 투여량의 IgG1)를 복강 내 주입하여 치료하였다. 음성 대조군으로서, 한 그룹의 마우스에게는 식염수를 투여하였다. 별도 아암을 대상으로, 항-CD20 작제물 13을 2일마다 30 mg/kg씩 총 6회 투여하였다(즉, 종양 세포 주입 후 1, 3, 5, 7, 9, 및 11일차에 항-CD20 작제물 13으로 마우스를 치료하였음). 시간별 종양 성장의 변화는 IVIS 스펙트럼(PerkinElmer)을 이용한 생물 광학 이미징으로 결정하였다. 이미징을 위해, 마우스를 마취시킨 다음 D-발광소(D-luciferin)을 주입하였다( 150 μL의 15 mg/mL 모액/마우스). 그런 다음, 마우스를 차광 박스에 넣고 전하 결합 소자 검출기로 이미지를 촬영하였다. 노출 기간에 걸쳐 마우스 내의 루시퍼라제-발현 세포로부터 발광된 광양자를 카운트하였다. 총 플럭스로서의 원시 복사도 데이터(광양자/초)를 계산하고, Living Image 소프트웨어(PerkinElmer)를 사용해 정량적 이미지 분석을 수행하였다. 조명 하에서, 관심 영역을 그려내기 위한 해부학적 기준을 위해 흑-백 이미지를 수득하였다. 등 표면 및 복부 표면에서 수집한 광 방출을 개별 마우스의 전체 신체 면적에 걸쳐 통합하고, 종양 질량 발달의 척도로서 시간 경과에 따라 플롯팅하였다. 종양 부담을 나타내는 통합된 생물 발광의 광 강도를 측정하였으며, 데이터는 평균 ± SEM으로 제시되어 있다(7마리/그룹).
도 58은, 항-CD20 작제물 13이 파종성 림프종 모델에서 종양 발달을 크게 제한한다는 것을 입증한다. 단일 투여량의 항-CD20 작제물 13은, 종양 세포 이식 후 21일 동안의 과정에 걸쳐 종양 성장을 억제하는 데 있어서 다라투무맙 및 오비누투주맙만큼 효과적이었다. 식염수 그룹의 경우, ****로 표지된 점들은 상응하는 치료 그룹에 비해 <0.0001의 p 값을 가졌다. 다중 투여량의 항-CD20 작제물 13은 본 모델 검정에서의 작제물의 단일 투여량과 거의 비슷한 효과를 나타냈다. 마우스는 다중 투여량의 작제물 13에 대해 양호한 내약성을 가졌으며, 눈에 띄는 이상 사례를 나타내지는 않았다(데이터 미도시).
실시예 65. CTLA-4 결합 도메인을 갖는 Fc-항원 결합 도메인 작제물 13의 설계 및 정제
단백질 발현
분지점이 C-말단 Fc 도메인에 있는 단일 분지형 Fc 도메인으로 형성된 작제물을 하기 기재된 바와 같이 제조하였다. Fc-항원 결합 도메인 작제물 13(CTLA-4) 각각은 2개의 구별되는 Fc 도메인 단량체 함유 폴리펩티드(항-CTLA-4 Fc 장쇄(서열 번호 ZZ중 어느 하나)의 2개의 카피, 및 Fc 단쇄(서열 번호 ZZ)의 2개의 카피) 및 항-CTLA-4 경쇄 폴리펩티드(서열 번호 ZZ)의 2개의 카피를 포함한다. Fc 장쇄는 (동종이량체화를 촉진하기 위해) 전하-돌연변이된(K409D/D399K 돌연변이) Fc 도메인 단량체를 포함하며, 상기 Fc 도메인 단량체는 E357K 전하 돌연변이 및 (이종이량체화를 촉진하기 위한) S354C 및 T366W 돌출부-형성 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체 및 항-CTLA-4 VH 및 CH1 도메인(EU 위치 1~220)과 N-말단에서 직렬로 연결된다(작제물 13(CTLA-4)). Fc 단쇄는 K370D 전하 돌연변이 및 (이종이량체화를 촉진하기 위한) Y349C, T366S, L368A 및 Y407V 함몰부-형성 돌연변이를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함한다. 항-CTLA-4 경쇄 및 항-CTLA-4 VH와 CH1은 이필리무맙으로부터 취한 것이다. CTLA-4 경쇄는 또한 scFv의 일부로서 Fc 장쇄의 N-말단에 융합되도록 발현될 수 있다. 작제물 13의 다른 버전은 항-CTLA-4 중쇄로 제조될 수 있으며, 여기서 각각의 버전은 Fc 장쇄 폴리펩티드 내의 Fc 도메인 단량체 사이에 상이한 크기의 글리신 스페이서(G4, G10, G15 또는 G20 링커)를 갖는다. DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하였고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝하였다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입하였다. 다음의 작제물 각각에 대한 아미노산 서열을 3개의 별개의 플라스미드(경쇄(항-CTLA-4)를 암호화하는 하나의 플라스미드, Fc 장쇄(항-CTLA-4)를 암호화하는 하나의 플라스미드 및 Fc 단쇄를 암호화하는 하나의 플라스미드)에 의해 암호화하였다.
| 작제물 13(CTLA-4) 서열 | |||
| 작제물 | 경쇄 | Fc 장쇄 (항-CTLA-4 VH 및 CH1) |
Fc 단쇄 |
| 작제물 13 (CTLA-4), G20 링커 | 서열 번호 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVGSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGAFSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC |
서열 번호 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
서열 번호 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
실시예 66. 탈푸코실화가 작제물의 활성에 미치는 영향
탈푸코실화가 작제물의 활성에 미치는 영향을 조사하기 위해 일련의 연구를 수행하였다. 작제물에는 다음을 포함시켰다: 상기 실시예 2, 표 8에 기술된 항-CD20 작제물 13 (S3Y); 상기 실시예 2, 표 8에 기술된 항-PD-L1 작제물 13 (S3Y); 및 상기 실시예 65에 기술된 항-CLTA-4 작제물 13 (S3Y).
작제물의 제조 및 특성 분석
DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하였고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝하였다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입하였다. 아미노산 서열을 3개의 별개의 플라스미드(경쇄를 암호화하는 하나의 플라스미드, Fc 장쇄를 암호화하는 하나의 플라스미드, 및 Fc 단쇄를 암호화하는 하나의 플라스미드)에 의해 암호화하였다. 형질감염된 세포 배양물에 첨가하여 막 투과성 1,3,4-트리-O-아세틸-2-데옥시-2-플루오로-L-푸코스 억제제를 푸코실화를 억제하였다.
단백질 정제
발현된 단백질을 Poros MabCapture A 컬럼을 사용하여 단백질 A-기반 친화성 컬럼 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상청액으로부터 정제하였다. 포획된 SIF 바디를 로딩 후 인산염 완충 식염수(PBS, pH 7.0)로 세정하고, 추가 공정 관련 불순물을 제거하기 위해 중간 세정 완충액 50 mM 구연산염 완충액(pH 5.5)으로 추가 세정하였다. 결합된 SIF 바디 물질을 pH 3의 100 mM 글리신으로 용리하고, pH 7.4의 1 M TRIS를 첨가하여 용리액을 신속하게 중화한 후, 원심분리하고, 0.2 μm 필터를 통해 멸균 여과하였다.
단백질을 Poros XS 수지를 사용하여 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 분류하였다. pH 6의 50 mM MES(완충액 A)로 컬럼을 사전 평형화하고, 로딩을 위해 샘플을 평형화 완충액에 희석하였다(1:3). 12 내지 15 컬럼 볼륨에 걸쳐 50 mM MES(100% A)에서 400 mM 염화나트륨, pH 6(100% B)까지의 선형 구배를 사용해 샘플을 용리하였다. 용리 중에 수집된 모든 분획을 분석용 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 분석하고, 표적 분획을 풀링하여 정제된 물질을 생성하였다.
생리화학적 특성 분석
이온 교환 후, 풀링된 물질을 접선 유동 여과 시스템에서 30 kDa 컷오프 폴리에테르 설폰(PES) 막 카트리지를 사용하여 1X-PBS 완충액으로 완충액 교환하였다. 샘플을 약 10~15 mg/mL로 농축하고, 0.2 μm 필터를 통해 멸균 여과하였다.
작제물을 크기 순도, 내독성, 및 탈푸코실화 수준에 대해 평가하였다. 분석용 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 포스트 단백질 A, 풀링된 이온-교환 분획 및 최종 정제된 물질에 대한 순도를 평가하였다. 정제된 물질을 1X-PBS를 사용하여 1 mg/ml로 희석하고, 분석 컬럼으로서 Zenix SEC-300(4.6 x 300 mm, 3 μm, 300 *?*, Sepax, Cat. #213300-4630)을 사용하여 UV & FLD 검출기가 구비된 Agilent 1200 시스템 상에서 분석하였다. 분석 전에, 100 mM 인산나트륨, 200 mM 아르기닌, 0.05% w/v 아지드화 나트륨 완충액이 포함된 300 mM 염화나트륨 pH=6.7을 0.3 ml/분으로 사용해 컬럼을 평형화하였다. 주입량 약 10~15 ul, 컬럼 온도: 30℃, 280 nm에서 UV 검출, 및 280 mm에서 여기 및 330 nm에서 방출을 갖는 FLD(총 실행 시간:15분). 내독소 수준은 Charles Rivers Labs의 Endosafe®-PTS 내독소 테스팅 시스템을 사용해 측정하였다. 일반적으로 각 정제 단계가 끝난 후 0.22 μm 필터를 통해 샘플을 여과하여 입자와 박테리아를 걸러 낸 다음 내독소에 대해 확인하였다. 완충액과 프로브는 LAL 시약 물(Charles River Labs, cat. # W130)로 10X 내지 20X로 희석하고, Charles River Labs Endosafe®-PTS 카트리지(0.005 EU/ml, cat. # PTS20005F 또는 0.01 EU/ml, cat. # PTS2001F) 중 하나를 사용해 시험하였다.
글리코펩티드 질량 분석법에 의한 탈푸코실화 수준
대략 50 μg의 작제물 물질을 50 mM 중탄산암모늄 pH 7.8 완충액에서 6 M 구아니딘 HCl 중 1 ug/uL으로 희석하였다. 65℃에서 DTT를 이용해 단백질을 변성시켜 환원하고, 상온의 암소에서 요오드아세트아미드로 1시간 동안 알킬화한 다음, 4℃에서 밤새 4 L의 25 mM 중탄산 암모늄에 대해 투석하였다. 다음날 아침, 트립신을 1:25의 효소:기질 비율로 첨가하고 barocyler에서 분해하였다. 포름산을 사용해 물질을 즉시 ??칭하였다.
약 2 μg의 단백질을 1 x 100 mm Waters Acquity C18 BEH 컬럼에 주입하였다. 물 중 0.1% 포름산(A) 내지 아세토니트릴 중 0.1% 포름산(B)의 구배를 75 μL/분의 유속으로 사용하였다. 포지티브 모드로 작동하는 QExactive를 사용해 350 내지 2000 m/z의 스캔 범위에서 질량 분광 분석을 수행하였다. N-글리칸 조성은 각각의 글리코펩티드 종의 면적을 적분하여 결정하였다. 탈푸코실화 글리칸의 백분율은 모든 N-클리칸을 대상으로 비-푸코실화 글리칸을 합산하여 계산하였다.
항-CD20 작제물 13
표 26은 아래에 기술된 연구들에 사용된 항-CD20 작제물의 특징을 기술한다.
| 항-CD20 작제물 13의 물리화학적 특징 분석 | ||
| 푸코실화 항-CD20 작제물 13 (S3Y-AA-OBI-002) | 탈푸코실화 항-CD20 작제물 13 (S3Y-AA-OBI-003) | |
| 크기 순도 (질량 %) | 90% | 93% |
| 내독소 (EU/g) | 11.4 | 12.3 |
| 탈푸코실화 수준 (전체 글리칸의 %) | 0.3% | 40% |
항체 의존성 세포 세포독성 (ADCC)
Raji 표적 세포(1.25 x 104개의 세포/웰) 및 Jurkat/FcγRIIIa 효과기 세포(Promega)(7.45 x 104개의 세포/웰)을 4% 저 IgG 혈청이 보충된 RPMI 1640 배지(Promega)에 재현탁하고 연속 희석된 항-CD20 작제물이 포함된 96-웰 플레이트에 시딩하였다. 5% CO2 하에 37℃에서 6시간 동안 인큐베이션한 후, PHERAstar FS 발광 측정기(BMG LABTECH)를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 Bio-Glo 루시퍼라제 분석 시약(Promega)을 사용하여 발광을 측정하였다.
도 59의 결과는, 탈푸코실화 작제물이 ADCC 리포터 검정에서 푸코실화 작제물에 비해 강화된 효능을 가진다는 것을 보여준다.
항체 의존성 세포 식균작용(ADCP)
Raji 표적 세포(1.5 x 104개의 세포/웰) 및 Jurkat/FcγRIIa-H 효과기 세포(Promega)(3.5 x 104개의 세포/웰)을 4% 저 IgG 혈청이 보충된 RPMI 1640 배지(Promega)에 재현탁하고 연속 희석된 항-CD20 작제물이 포함된 96-웰 플레이트에 시딩하였다. 5% CO2 하에 37℃에서 6시간 동안 인큐베이션한 후, PHERAstar FS 발광 측정기(BMG LABTECH)를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 Bio-Glo 루시퍼라제 분석 시약(Promega)을 사용하여 발광을 측정하였다.
도 60의 결과는, 탈푸코실화 작제물이 ADCP 리포터 검정에서 푸코실화 작제물과 비슷한 효능을 가진다는 것을 보여준다.
전혈로부터 CD19+ 세포의 고갈
인간 전혈을 EDTA 튜브에 채취하고 이 중 60 uL를 VivoTag 645-표지된 항-CD20 작제물의 5배 연속 희석물(범위: 2.96 μM 내지 0.3 pM)과 함께 37℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 다음을 포함하는 면역 세포-특이적 염색 칵테일을 혈액 세포에 첨가하고 37℃에서 30분 동안 추가로 염색하였다: 플루오로세인 이소티오시아네이트 (FITC) 항-IgD (BioLegend), 피코-에리트린 (PE) 항-CD11c (BioLegend), 알로피코시아닌-H7 (APC/H7) 항-CD14 (BioLegend), PerCp Cy5.5 항-CD19 (BioLegend), 피코에리트린-시아7닌(PE/Cy7) 항-CD56 (BioLegend), 퍼시픽 블루 (Pac Blue) 항-CD4 항체 (BioLegend), 및 BV510 항-CD3 (BD Bioscience). 그 이후, RBC를 염화암모늄 용액(STEMCELL technologies)으로 실온에서 10분 동안 2회 용리시키고, PBS에서 2회 세척하였다. 200 μL PBS/1% PFA에 세포를 재현탁하고, FACSVerseTM 기기(BD Biosciences)에서 샘플을 수득하였다. 전방 산란(FSC) 및 측방 산란(SSC)을 사용해 백혈구 게이트를 설정하고, SSClow, FSCint, CD11c-, CD14-, CD56-, CD3-, 및 CD19+, IgD+로서 B 세포를 특성화하였다.
항-CD20 작제물로 치료 시, 전혈로부터 CD19+ B 세포의 소실은 도 61에 도시되어 있다. 탈푸코실화 항-CD20은 CD19+ 세포의 비율을 감소시키는 데 더 강력하였다.
항-PD-L1 작제물 13
표 25는 아래에 기술된 연구들에 사용된 항-PD-L1 작제물의 특징을 기술한다.
| 항-PD-L1 작제물의 물리화학적 특징 분석 | ||
| 푸코실화 항-PD-L1 작제물 (S3Y) | 탈푸코실화 항-PD-L1 작제물 (S3Y) | |
| 크기 순도 (질량 %) | 95% | 98% |
| 내독소 (EU/g) | 3.3 | 3.3 |
| 탈푸코실화 수준 (전체 글리칸의 %) | 0.5% | 33% |
항체 의존성 세포의 세포독성 (ADCC)
A549 세포(ATCC)를 획득하여 F-12K 배지(Gibco), 10% FBS(Hyclone) 및 2mM glutamax(Gibco)에서 배양하였다. 실험 24시간 전에, 150,000개의 세포/mL의 A549 세포를 성장 배지에서 배양하고, 50 ng/mL의 IFN-?를 첨가하여 PD-L1 발현을 자극하였다. 이러한 분석에서 Hemacare NK 세포를 효과기 세포로 사용하고 비조직 배양 처리 플라스크(Falcon)에서 하룻밤 정치시켰다. 이어서, A549 세포를 5분 동안 3ml의 Accutase(Corning)으로 수확하였다. 세포를 0.2x10^6개의 세포/mL로 재현탁하였다. 50 μL의 A549 세포를 96웰 조직 배양 처리 흰색 평평한 바닥 플레이트(Costar)의 각 웰에 첨가하였다. 인큐베이션 시간 없이, 10 μL의 작제물을 각 웰에 첨가하였다. 첨가 직후, 플레이트의 각 웰에 50 μL의 NK 세포(1x10^6개의 세포/mL)를 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 5시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 50 μL의 Cytotox glo 시약(Promega)을 첨가하여, 37℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 발광은 PHERAstar FS (BMG Labtech)를 사용하여 판독하였다. 도 62는 항-PD-L1 작제물로 치료한 PD-L1-발현 A549 세포의 ADCC 검정 결과를 보여준다. 탈푸코실화는 ADCC를 유도하는 작제물의 효능을 증가시킨다.
항체 의존성 세포의 세포독성 (ADCC)
M2c 대식 세포로 최종 분화시키기 위해, 바닥이 편평한 특수 광학 96-웰 조직 배양 플레이트(Falcon/Corning 3072)에서 50 ng/mL의 IL-10(R&D Systems)이 존재하는 가운데 OptiMem 배지(Gibco) 중 2% 열 불활성화 초저 IgG FBS(HyClone)에 M0 대식세포를 50,000개의 세포/웰/50 μL로 도말하였다. 다음날, 작제물을 4X 농도의 2배 연속 희석물(25μL/웰)로 M2c 효과기 세포에 2~4시간 동안 첨가하였다. Accutase(Corning)를 이용해 H441 표적 세포를 정상 배양 조건(10% FBS, 열 불활성화(Hyclone, Defined), RPMI, GlutaMax)으로부터 분리하여 이들의 세포 표면 수용체를 보존하였다. 그런 다음, 세포를 pHrodo 레드 셀 라벨링 키트(Essen)로 1 x 106/mL로 표지하였다(500ng/mL x 1시간 x 37℃). 그런 다음, 100μL의 최종 볼륨이 되도록, 표지된 표적을 10,000개의 세포/웰/25 μL로 첨가하였다. 활세포 이미징 시스템(Essen/Sartorius, IncuCyte S3)으로 pHrodo 레드 형광 강도를 증가시켜 식균작용을 측정하였다.
검정을 3회 중복 수행하고, 10X 대물렌즈를 사용해 웰 당 4개의 상(phase) 및 형광 이미지를 캡쳐하였다. 분석을 위해 대조군을 매번 흘렸다 - (백그라운드 레드 형광 컷오프를 설정하기 위한) H441 pHrodo 단독, 및 M2c 단독(대식세포를 식별하기 위한 상 마스크). 스캔 시간은 24시간에 걸쳐 1시간 단위로 설정하였다. 분석 후, 총 H441 식균작용을 정량화하는 데 사용한 척도는 총 레드 객체 통합 강도(RCU x μm2/이미지)였다. 표 63은 항-PD-L1 작제물로 치료한 PD-L1 발현 A549 세포의 ADCP 검정 결과를 보여준다. 탈푸코실화는 ADCP를 유도하는 작제물의 효능을 변경시키지 않았다.
보체 의존성 세포독성
인간 PD-L1 유전자를 안정적으로 발현하도록 형질감염시킨 인간 배아 신장(HEK) 세포(CrownBio)를 선택 마커로서 DMEM, 10% FBS, 및 2 μg/mL 퓨로마이신 중에서 배양하였다. 세포를 수확하고 제네테신 또는 페놀 레드(Lonza) 없이 X-Vivo-15 배지에서 희석하였다. 100 μl의 HEK-PD-L1 세포(6 x105개의 세포/mL)를 96 웰 조직 배양물로 처리한 바닥이 평평한 플레이트(BD Falcon)에 도말하였다. 작제물과 항체를 X-Vivo-15 배지에서 1:3으로 연속 희석하였다. 50 μL의 희석된 작제물을 웰 내의 표적 세포 위에 첨가하였다. 50 μL의 희석하지 않은 인간 혈청 보체(Quidel Corporation)를 웰 각각에 첨가하였다. 그런 다음 분석 플레이트를 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 2시간의 인큐베이션 후, 20 μL의 WST-1 세포 증식제(Roche Diagnostics Corp)를 각 웰에 첨가하고 플레이트를 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음날 아침, 분석 플레이트를 플레이트 진탕기 상에 2~5분 동안 두었다. 흡광도는 분광 광도계(Molecular Devices SPECTRAmax M2)를 이용해 450 nm에서 측정하고 600 nm에서 보정하였다.
표 64는 항-PD-L1 작제물로 치료한 PD-L1 발현 A549 세포의 CDC 검정 결과를 보여준다. 탈푸코실화는 CDC를 유도하는 작제물의 효능을 변경시키지 않았다.
다른 구현예
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 독립적인 간행물 도는 특허 출원이 구체적으로 그리고 개별적으로 참조로서 포함되는 것으로 나타내어진 것처럼 그와 같은 정도로 본원에 참조로서 포함된다.
본 개시는 이의 구체적 구현예와 관련하여 기술되어 있지만, 추가의 변형이 가능하고 본 출원은 일반적으로 본 개시의 원리를 따르고 본 개시가 관련된 분야에 공지되거나 통상적인 관행에 속하고 상기 기술된 본질적 특징에 적용될 수 있는 본 개시로부터의 이러한 변경을 포함하는 본 개시의 임의의 변형, 사용 또는 응용을 포함하도록 의도되며, 청구항의 범주를 따르는 것으로 이해될 것이다.
다른 구현예는 청구 범위에 포함된다.
SEQUENCE LISTING
<110> MOMENTA PHARMACEUTICALS, INC.
<120> COMPOSITIONS AND METHODS RELATED TO ENGINEERED FC-ANTIGEN BINDING
DOMAIN CONSTRUCTS
<130> 14131-0192WO1
<140> PCT/US2019/041438
<141> 2019-07-11
<150> 62/696,673
<151> 2018-07-11
<160> 307
<170> KoPatentIn 3.0
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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly
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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Ser Gly
20
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gly Gly Gly
20
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1
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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<400> 23
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly
20
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Gly Gly Gly Gly Gly
1 5
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10
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<400> 26
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 27
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly
20
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Gly Gly
1 5 10
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<211> 8
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<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 29
Ser Ala Cys Tyr Cys Glu Leu Ser
1 5
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
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Arg Ser Ile Ala Thr
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<211> 17
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 31
Arg Pro Ala Cys Lys Ile Pro Asn Asp Leu Lys Gln Lys Val Met Asn
1 5 10 15
His
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 32
Gly Gly Ser Ala Gly Gly Ser Gly Ser Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser
1 5 10 15
Gly Ala Ser Gly Thr Gly Thr Ala Gly Gly Thr Gly Ser Gly Ser Gly
20 25 30
Thr Gly Ser Gly
35
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<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 33
Ala Ala Ala Asn Ser Ser Ile Asp Leu Ile Ser Val Pro Val Asp Ser
1 5 10 15
Arg
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 34
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser
20 25 30
Gly Gly Gly Ser
35
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 35
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
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<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser
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<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
Albumin binding peptide
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Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
6xHis tag
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His His His His His His
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 39
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 40
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
1 5 10
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
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Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
1 5
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 42
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 43
<211> 232
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 43
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 44
<211> 227
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 44
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 45
<211> 226
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 45
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly
225
<210> 46
<211> 226
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 46
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly
225
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<211> 231
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 47
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
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Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
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Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
225 230
<210> 48
<211> 226
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 48
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
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Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
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65 70 75 80
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115 120 125
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130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Asp Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly
225
<210> 49
<211> 216
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 49
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
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65 70 75 80
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195 200 205
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 50
<211> 227
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 50
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
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Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 51
<211> 227
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 51
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
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Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
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Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
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210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 52
<211> 226
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 52
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
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Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
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Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
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Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
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Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly
225
<210> 53
<211> 227
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 53
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
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Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Lys Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
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Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
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His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
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Pro Gly Lys
225
<210> 54
<211> 696
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 54
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
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65 70 75 80
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115 120 125
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
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Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
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Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
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Gly Lys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
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<210> 55
<211> 690
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 55
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser
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50 55 60
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100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
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130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
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275 280 285
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Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
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Leu Pro Pro Cys Arg Asp Lys Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp
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Lys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
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580 585 590
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660 665 670
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
675 680 685
Pro Gly
690
<210> 56
<211> 685
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 56
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser
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65 70 75 80
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100 105 110
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130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Cys Arg Asp Lys Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
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435 440 445
Lys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr
450 455 460
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Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
485 490 495
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
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545 550 555 560
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
565 570 575
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
580 585 590
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
595 600 605
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
610 615 620
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Lys Ser Asp
625 630 635 640
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Asp Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
645 650 655
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
660 665 670
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
675 680 685
<210> 57
<211> 679
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 57
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser
20 25 30
Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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65 70 75 80
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100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
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Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
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260 265 270
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515 520 525
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595 600 605
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<211> 696
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 58
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<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 60
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<210> 61
<211> 219
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 61
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<210> 62
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 62
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<210> 63
<211> 226
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 63
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<400> 64
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 68
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 69
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 70
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485 490 495
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
500 505 510
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
515 520 525
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
530 535 540
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
545 550 555 560
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
565 570 575
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
580 585 590
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
595 600 605
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
610 615 620
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
625 630 635 640
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Lys Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
645 650 655
Ser Asp Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
660 665 670
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
675 680 685
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Lys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
690 695 700
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Asp Lys Thr
705 710 715 720
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
725 730 735
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
740 745 750
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
755 760 765
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
770 775 780
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
785 790 795 800
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
805 810 815
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
820 825 830
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
835 840 845
Pro Pro Cys Arg Asp Lys Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys
850 855 860
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
865 870 875 880
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
885 890 895
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
900 905 910
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
915 920 925
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
930 935 940
<210> 75
<211> 944
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 75
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ile Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Lys Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
450 455 460
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
465 470 475 480
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
485 490 495
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
500 505 510
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
515 520 525
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
530 535 540
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
545 550 555 560
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
565 570 575
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
580 585 590
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
595 600 605
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
610 615 620
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
625 630 635 640
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Lys Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
645 650 655
Tyr Ser Asp Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
660 665 670
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
675 680 685
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Lys Gly Gly Gly Gly Gly Gly
690 695 700
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Asp Lys
705 710 715 720
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
725 730 735
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
740 745 750
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
755 760 765
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
770 775 780
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
785 790 795 800
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
805 810 815
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
820 825 830
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
835 840 845
Leu Pro Pro Cys Arg Asp Lys Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp
850 855 860
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
865 870 875 880
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
885 890 895
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
900 905 910
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
915 920 925
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
930 935 940
<210> 76
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 76
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly
1 5
<210> 77
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 77
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1 5
<210> 78
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 78
Gly Phe Ile Phe Ser Asn Tyr Gly
1 5
<210> 79
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 79
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser Trp
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 80
Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser Trp
1 5
<210> 81
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 81
Gly Arg Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His
1 5 10
<210> 82
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 82
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 83
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp
1 5
<210> 84
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 84
Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Asn
1 5
<210> 85
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 85
Gly Phe Thr Phe Asn Ser Phe Ala
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 86
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Trp
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 87
Gly Phe Lys Phe Ser Gly Tyr Gly
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 88
Gly Phe Thr Phe Thr Asp Phe Tyr
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 89
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala Trp
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 90
Gly Tyr Ile Phe Thr Ala Tyr Thr
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 91
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Thr
1 5
<210> 92
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 92
Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 93
Gly Tyr Thr Phe Arg Ser Ser Tyr
1 5
<210> 94
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 94
Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr Trp
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 95
Gly Phe Ala Phe Ser His Tyr Ala
1 5
<210> 96
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 96
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Glu
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 97
Gly Gly Thr Phe Ser Phe Tyr Ala
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 98
Gly Phe Ser Leu Ser Lys Phe Gly
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 99
Gly Phe Thr Phe Lys Asn Tyr Ala
1 5
<210> 100
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 100
Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr Trp
1 5
<210> 101
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 101
Gly Phe Thr Phe Asn Ser Tyr Ala
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 102
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ile
1 5
<210> 103
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 103
Ser Tyr Trp Met His
1 5
<210> 104
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 104
Gly Tyr Thr Phe Leu Asn Cys Pro Ile
1 5
<210> 105
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 105
Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr Tyr Met Gln
1 5 10
<210> 106
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 106
Ile Ser Ser Asp Ser Ser Ala Ile
1 5
<210> 107
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 107
Ile Asn Ala Ser Gly Thr Arg Thr
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 108
Ile Ser Ser Ala Ser Thr Tyr Ser
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 109
Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 110
Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr
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<210> 111
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 111
Ala Ile Tyr Pro Leu Thr Gly Asp Thr
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 112
Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr
1 5
<210> 113
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 113
Ile Asn Pro Arg Asn Asp Tyr Thr
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 114
Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Thr
1 5
<210> 115
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 115
Ile Ser Gly Ser Gly Gly Gly Thr
1 5
<210> 116
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 116
Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Lys
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<210> 117
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 117
Ile Arg Asp Lys Ala Lys Gly Tyr Thr Thr
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<210> 118
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 118
Ile Arg Ser Lys Ala Ser Asn His Ala Thr
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<210> 119
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 119
Ile Arg Ser Ala Asn Asn His Ala Pro Thr
1 5 10
<210> 120
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 120
Ile Lys Pro Asn Asn Gly Leu Ala
1 5
<210> 121
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 121
Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys
1 5
<210> 122
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 122
Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr
1 5
<210> 123
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 123
Ile Tyr Ala Gly Thr Gly Ser Pro
1 5
<210> 124
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 124
Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr
1 5
<210> 125
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 125
Ile Ser Ser Gly Gly Ser Gly Thr
1 5
<210> 126
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 126
Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr
1 5
<210> 127
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 127
Phe Ile Pro Ile Phe Gly Ala Ala
1 5
<210> 128
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 128
Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr
1 5
<210> 129
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 129
Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Asp Thr
1 5
<210> 130
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 130
Ile Ser Tyr Asp Gly Arg Asn Ile
1 5
<210> 131
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 131
Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Ile
1 5
<210> 132
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 132
Ile Ser Gly Ser Gly Gly Phe Thr
1 5
<210> 133
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 133
Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr
1 5
<210> 134
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 134
Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Lys Asp Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 135
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 135
Gly Trp Met Lys Pro Arg Gly Gly Ala Val Asn
1 5 10
<210> 136
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 136
Ile Gly Ser Ser Gly Gly Val Thr Asn
1 5
<210> 137
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 137
Gly Arg Gly Arg Glu Asn Ile Tyr Tyr Gly Ser Arg Leu Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 138
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 138
Ala Arg Gly Lys Gly Asn Thr His Lys Pro Tyr Gly Tyr Val Arg Tyr
1 5 10 15
Phe Asp Val
<210> 139
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 139
Gly Arg His Ser Asp Gly Asn Phe Ala Phe Gly Tyr
1 5 10
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 140
Ala Arg Ser Gly Phe Ile Thr Thr Val Arg Asp Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 141
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 141
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1 5 10
<210> 142
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 142
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1 5 10
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<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 143
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1 5 10 15
<210> 144
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 144
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 145
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 146
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 147
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 148
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<210> 149
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 149
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 150
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 151
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 157
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 158
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<213> Artificial Sequence
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Thr Arg Val Lys Leu Gly Thr Tyr Tyr Phe Asp Ser
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<213> Artificial Sequence
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Val Lys Gly Gly Tyr Tyr Gly His Trp Tyr Phe Asp Val
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<211> 19
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 164
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Phe His Ile
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<211> 13
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<213> Artificial Sequence
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<400> 166
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<213> Artificial Sequence
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<400> 167
Ala Arg Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr
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<211> 9
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 168
Ala Ile Thr Thr Thr Pro Phe Asp Phe
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 169
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<211> 14
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 170
Ala Arg Val Gly Leu Gly Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gln Gln
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 171
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 172
Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 173
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 174
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<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr
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<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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Gln Ser Val Ser Ser Tyr
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 181
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<211> 6
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 185
Gln Ser Val Gly Ser Ser Tyr
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<211> 6
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 187
Gln Ser Val Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr
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<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 188
Gln Gly Ile Ile Ser Tyr
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<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 189
Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
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<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 190
Gln Ser Leu Val His Ser Asn Arg Asn Thr Tyr
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 191
Ser Ser Ile Ser Tyr
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<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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Gln Asp Ile Gly Ser Ser
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<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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Gln Asp Ile Arg Asn Tyr
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<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 194
Gln Asp Val Gly Ile Ala
1 5
<210> 195
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 195
Gln Gly Ile Ser Ser Trp
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<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr
1 5
<210> 197
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 197
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn Leu His
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 198
Ser Gln Tyr Gly Ser Leu Ala Trp
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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Ser Leu Ser Asn Ile Gly Leu Asn
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<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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Tyr Ser Gln Ser Ile Ser
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Phe Thr
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<211> 9
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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Leu Gln Ile Tyr Asn Met Pro Ile Thr
1 5
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<211> 9
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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Phe Gln Gly Ser Leu Leu Pro Trp Thr
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 204
Gln Gln Ser Lys Glu Val Pro Phe Thr
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<211> 9
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 205
Ala Gln Asn Leu Glu Leu Pro Tyr Thr
1 5
<210> 206
<211> 9
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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Gln Gln Trp Leu Ser Asn Pro Pro Thr
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 207
Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr
1 5
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<211> 9
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 208
Gln Gln Trp Thr Phe Asn Pro Pro Thr
1 5
<210> 209
<211> 6
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 209
His Gln Tyr Leu Ser Ser
1 5
<210> 210
<211> 9
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 210
Gln His His Ser Asp Asn Pro Trp Thr
1 5
<210> 211
<211> 9
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 211
Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro Thr
1 5
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<211> 9
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 212
Gln Gln His Tyr Ser Pro Pro Tyr Thr
1 5
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<211> 10
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 213
Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro Leu Thr
1 5 10
<210> 214
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 214
Leu Gln His Ile Ser Arg Pro Arg Thr
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<210> 215
<211> 9
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 215
Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
1 5
<210> 216
<211> 7
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 216
Gln Gln Asp Thr Ser Pro Pro
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<210> 217
<211> 9
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 217
Gln Gln Ser Lys Glu Asp Pro Leu Thr
1 5
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<211> 9
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 218
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr
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<210> 219
<211> 9
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 219
Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr
1 5
<210> 220
<211> 9
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 220
Gln Ser Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 221
<211> 9
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 221
Gly Gln Tyr Ala Asn Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 222
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 222
His Gln Tyr Ser Lys Leu Pro
1 5
<210> 223
<211> 9
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 223
Ser Gln Asn Thr His Val Pro Pro Thr
1 5
<210> 224
<211> 9
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 224
Gln Gln Arg Ser Asn Trp Met Tyr Thr
1 5
<210> 225
<211> 9
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 225
His Gln Arg Asp Ser Tyr Pro Trp Thr
1 5
<210> 226
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 226
Leu Gln Tyr Val Ser Ser Pro Pro Thr
1 5
<210> 227
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 227
Gln Gln Tyr Tyr Asn Ser Pro Pro Thr
1 5
<210> 228
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 228
Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Tyr Thr
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 229
Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 230
Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Arg Val
1 5 10
<210> 231
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 231
Gln Gln Ser Asn Thr Trp Pro Tyr Thr
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 232
Gln Gln Tyr Glu Phe Phe Gly Gln Gly Thr
1 5 10
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<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 233
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Pro Pro Gly
1 5
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<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 234
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
<210> 235
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
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<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(30)
<223> This sequence may encompass 4-30 residues
<400> 235
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
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<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<222> (1)..(30)
<223> This sequence may encompass 8-30 residues
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
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<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<220>
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<222> (1)..(30)
<223> This sequence may encompass 12-30 residues
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
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<212> PRT
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<220>
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly
20
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<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(20)
<223> This sequence may encompass 8-20 residues
<400> 239
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly
20
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<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
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<222> (1)..(20)
<223> This sequence may encompass 12-20 residues
<400> 240
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly
20
<210> 241
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 241
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu
20
<210> 242
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 242
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
1 5 10 15
<210> 243
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 243
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu
<210> 244
<211> 105
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 244
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
1 5 10 15
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
20 25 30
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
35 40 45
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
50 55 60
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
65 70 75 80
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
85 90 95
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
100 105
<210> 245
<211> 106
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 245
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
1 5 10 15
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
100 105
<210> 246
<211> 447
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 246
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 247
<211> 451
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 247
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Gly Trp Phe Gly Glu Leu Ala Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Ser Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 248
<211> 451
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 248
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Pro Arg Gly Ala Thr Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met
100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
115 120 125
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser
130 135 140
Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
145 150 155 160
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
165 170 175
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
180 185 190
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys
195 200 205
Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu
210 215 220
Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 249
<211> 450
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 249
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Ala Lys Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Lys Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met His Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asp Tyr Tyr Gly Ser Asn Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 250
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 250
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Gly Asp Pro Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Leu Pro Leu Val Tyr Thr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val
115
<210> 251
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 251
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 252
<211> 215
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 252
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Arg Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Leu Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 253
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 253
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Ser Tyr
20 25 30
Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Phe
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Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
165 170 175
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
180 185 190
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
85 90 95
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
35 40
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly
100
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<213> Artificial Sequence
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polypeptide
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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polypeptide
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly
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<213> Artificial Sequence
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<220>
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<220>
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
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<400> 275
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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<213> Artificial Sequence
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peptide
<220>
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<220>
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<213> Artificial Sequence
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peptide
<220>
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(6)
<223> This sequence may encompass 4-6 residues
<400> 280
Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
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Gly Gly Gly Gly Gly
1 5
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(200)
<223> This sequence may encompass 6-200 residues
<400> 282
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
85 90 95
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
165 170 175
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
180 185 190
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
195 200
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<211> 200
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(200)
<223> This sequence may encompass 8-200 residues
<400> 283
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
85 90 95
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
165 170 175
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
180 185 190
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
195 200
<210> 284
<211> 200
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(200)
<223> This sequence may encompass 10-200 residues
<400> 284
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
85 90 95
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
115 120 125
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
165 170 175
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
180 185 190
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
85 90 95
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
165 170 175
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
180 185 190
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
165 170 175
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
165 170 175
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
165 170 175
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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130 135 140
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
165 170 175
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
180 185 190
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
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<223> This sequence may encompass 40-200 residues
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
165 170 175
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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<223> This sequence may encompass 50-200 residues
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165 170 175
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
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<223> This sequence may encompass 70-200 residues
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115 120 125
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130 135 140
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(200)
<223> This sequence may encompass 80-200 residues
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50 55 60
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
85 90 95
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
130 135 140
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
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<223> This sequence may encompass 90-200 residues
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(200)
<223> This sequence may encompass 100-200 residues
<400> 297
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100 105 110
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115 120 125
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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165 170 175
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(200)
<223> This sequence may encompass 120-200 residues
<400> 298
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
85 90 95
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
165 170 175
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180 185 190
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
195 200
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(200)
<223> This sequence may encompass 140-200 residues
<400> 299
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1 5 10 15
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20 25 30
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
85 90 95
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
165 170 175
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
180 185 190
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
195 200
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(200)
<223> This sequence may encompass 160-200 residues
<400> 300
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
85 90 95
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
165 170 175
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
180 185 190
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
195 200
<210> 301
<211> 200
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(200)
<223> This sequence may encompass 180-200 residues
<400> 301
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
85 90 95
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
165 170 175
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
180 185 190
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
195 200
<210> 302
<211> 200
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(200)
<223> This sequence may encompass 190-200 residues
<400> 302
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
85 90 95
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
165 170 175
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
180 185 190
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
195 200
<210> 303
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 303
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5 10 15
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
20
<210> 304
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 304
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Glu Gln Lys Leu Ile Ser
1 5 10 15
Glu Glu Asp Leu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
20 25 30
<210> 305
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 305
Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp
1 5 10 15
Tyr Ala Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
20 25
<210> 306
<211> 215
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 306
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Phe Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 307
<211> 694
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 307
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Cys Arg Asp Lys Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
450 455 460
Gly Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
465 470 475 480
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
485 490 495
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
500 505 510
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
515 520 525
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
530 535 540
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
545 550 555 560
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
565 570 575
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
580 585 590
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
595 600 605
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
610 615 620
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
625 630 635 640
Thr Thr Pro Pro Val Leu Lys Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
645 650 655
Asp Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
660 665 670
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
675 680 685
Leu Ser Leu Ser Pro Gly
690
Claims (409)
- Fc-항원 결합 도메인 작제물을 포함하는 조성물로서, Fc-항원 결합 도메인 작제물은 항원 결합 도메인 및 제2 Fc 도메인에 링커에 의해 연결된 제1 Fc 도메인을 포함하고, 조성물 중 글리칸의 적어도 5%는 푸코스 잔기가 없는, 조성물.
- 폴리펩티드를 포함하는 조성물로서, 상기 폴리펩티드는: 항원 결합 도메인; 링커; 힌지 도메인, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체; 제2 링커; 힌지 도메인, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체; 임의의 제3 링커; 및 힌지 도메인, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 임의의 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하되, 적어도 하나의 Fc 도메인 단량체는 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이를 포함하고, 조성물 중 글리칸의 적어도 5%는 푸코스 잔기가 없는, 조성물.
- 제2항에 있어서, 항원 결합 도메인은 항체 중쇄 가변 도메인을 포함하는, 조성물.
- 제2항에 있어서, 항원 결합 도메인은 항체 경쇄 가변 도메인을 포함하는, 조성물.
- 제2항에 있어서, 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체는 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이를 포함하고, 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체는 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이를 포함하는, 조성물.
- 제2항에 있어서, 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체는 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이를 포함하고, 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체는 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이를 포함하는, 조성물.
- 제2항에 있어서, 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체 및 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체 둘 다는 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이를 포함하는, 조성물.
- 제2항에 있어서, 제3 링커 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하되, 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체, 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체, 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체는 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이를 각각 포함하는, 조성물.
- 제2항에 있어서, 제3 링커 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하되, 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체 및 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체 둘 다는 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이를 각각 포함하고, 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체는 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이를 포함하는, 조성물.
- 제2항에 있어서, 제3 링커 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하되, 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체 둘 다는 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이를 각각 포함하고, 제2 IgG1 도메인 단량체는 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이를 포함하는, 조성물.
- 제2항에 있어서, 제3 링커 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하되, 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체 둘 다는 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이를 각각 포함하고, 제1 IgG1 도메인 단량체는 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이를 포함하는, 조성물.
- 제2항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이를 포함하는 IgG1 Fc 도메인 단량체는 1개, 2개, 또는 3개의 역전하 돌연변이를 추가로 포함하는, 폴리펩티드.
- 제2항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이 및 역전하 돌연변이는 CH3 도메인에 있는, 조성물.
- 제13항에 있어서, 돌연변이는 EU 위치 G341에서 EU 위치 K447까지의 서열 내에 있는, 조성물.
- 제2항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이는 단일 아미노산 변화인, 조성물.
- 제2항에 있어서, 제2 링커 및 임의의 제3 링커는
GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG, GGGGS, GGSG, SGGG, GSGS, GSGSGS, GSGSGSGS, GSGSGSGSGS, GSGSGSGSGSGS, GGSGGS, GGSGGSGGS, GGSGGSGGSGGS, GGSG, GGSG, GGSGGGSG, GGSGGGSGGGSGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS, GENLYFQSGG, SACYCELS, RSIAT, RPACKIPNDLKQKVMNH, GGSAGGSGSGSSGGSSGASGTGTAGGTGSGSGTGSG, AAANSSIDLISVPVDSR, GGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGS, GGGSGGGSGGGS, SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG, GGSGGGSGGGSGGGSGGS, GGGG, GGGGGGGG, GGGGGGGGGGGG, 및 GGGGGGGGGGGGGGGG로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는, 조성물. - 제2항에 있어서, 제2 링커 및 임의의 제3 링커는 글리신 스페이서인, 조성물.
- 제2항에 있어서, 제2 링커 및 임의의 제3 링커는 독립적으로 4 내지 30개, 4 내지 20개, 8 내지 30개, 8 내지 20개, 12 내지 20개, 또는 12 내지 30개의 글리신 잔기로 이루어지는, 조성물.
- 제2항에 있어서, 제2 링커 및 임의의 제3 링커는 20개의 글리신 잔기로 이루어지는, 조성물.
- 제2항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 도메인 단량체 중 적어도 하나는 EU 위치 I253에서 단일 아미노산 돌연변이를 포함하는, 조성물.
- 제20항에 있어서, EU 위치 I253에서의 각각의 아미노산 돌연변이는 독립적으로, I253A, I253C, I253D, I253E, I253F, I253G, I253H, I253I, I253K, I253L, I253M, I253N, I253P, I253Q, I253R, I253S, I253T, I253V, I253W, 및 I253Y로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
- 제21항에 있어서, 위치 I253에서의 각각의 아미노산 돌연변이는 I253A인, 조성물.
- 제2항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 도메인 단량체 중 적어도 하나는 EU 위치 R292에서 단일 아미노산 돌연변이를 포함하는, 조성물.
- 제23항에 있어서, EU 위치 R292에서의 각각의 아미노산 돌연변이는 독립적으로, R292D, R292E, R292L, R292P, R292Q, R292R, R292T, 및 R292Y로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
- 제24항에 있어서, 위치 R292에서의 각각의 아미노산 돌연변이는 R292P인, 조성물.
- 제2항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 Fc 도메인 단량체의 힌지는 독립적으로, EPKSCDKTHTCPPCPAPELL 및 DKTHTCPPCPAPELL로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는, 조성물.
- 제26항에 있어서, 제2 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체의 힌지 부분은 아미노산 서열 DKTHTCPPCPAPELL을 갖는, 조성물.
- 제26항에 있어서, 제1 Fc 도메인 단량체의 힌지 부분은 아미노산 서열 EPKSCDKTHTCPPCPAPEL을 갖는, 조성물.
- 제26항에 있어서, 제1 Fc 도메인 단량체의 힌지 부분은 아미노산 서열 EPKSCDKTHTCPPCPAPEL을 갖고, 제2 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체의 힌지 부분은 아미노산 서열 DKTHTCPPCPAPELL을 갖는, 조성물.
- 제2항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 Fc 도메인 단량체의 CH2 도메인은 독립적으로, 2개 이하의 단일 아미노산 결실 또는 치환을 갖는 아미노산 서열
GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK를 포함하는, 조성물. - 제2항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 Fc 도메인 단량체의 CH2 도메인은 동일하고, 2개 이하의 단일 아미노산 결실 또는 치환을 갖는 아미노산 서열
GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK를 포함하는, 조성물. - 제2항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 Fc 도메인 단량체의 CH2 도메인은 동일하고, 2개 이하의 단일 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열 GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK를 포함하는, 조성물.
- 33. 제2항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 Fc 도메인 단량체의 CH2 도메인은 동일하고, 아미노산 서열
GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK를 포함하는, 조성물. - 제2항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 Fc 도메인 단량체의 CH3 도메인은 독립적으로, 10개 이하의 단일 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG를 포함하는, 조성물.
- 제2항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 Fc 도메인 단량체의 CH3 도메인은 독립적으로, 8개 이하의 단일 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG를 포함하는, 조성물.
- 제2항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 Fc 도메인 단량체의 CH3 도메인은 독립적으로, 6개 이하의 단일 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG를 포함하는, 조성물.
- 제2항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 Fc 도메인 단량체의 CH3 도메인은 독립적으로, 5개 이하의 단일 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG를 포함하는, 조성물.
- 제30항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 아미노산 치환은 T366Y, T366W, T394W, T394Y, F405W, F405A, Y407A, S354C, Y349T, T394F, K409D, K409E, K392D, K392E, K370D, K370E, D399K, D399R, E357K, E357R, D356K 및 D356R로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
- 제2항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 도메인 단량체 각각은 독립적으로, 최대 10개의 단일 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 42, 43, 45, 및 47 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는, 조성물.
- 제39항에 있어서, 단일 아미노산 치환 중 최대 6개는 CH3 도메인에서의 역전하 돌연변이이거나 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이인, 조성물.
- 제39항에 있어서, 단일 아미노산 치환은 EU 위치 G341에서 EU 위치 K447까지의 서열 내에 있는, 조성물.
- 제2항에 있어서, 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이 중 적어도 하나는 T366Y, T366W, T394W, T394Y, F405W, F405A, Y407A, S354C, Y349T, 및 T394F로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
- 제5항, 제6항 및 제9항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이는 K409D, K409E, K392D. K392E, K370D, K370E, D399K, D399R, E357K, E357R, D356K 및 D356R로부터 선택되는, 조성물.
- 제2항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 도메인은 scFv인, 조성물.
- 제2항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 도메인은 VH 도메인 및 CH1 도메인을 포함하는, 조성물.
- 제43항에 있어서, 항원 결합 도메인은 VL 도메인을 추가로 포함하는, 조성물.
- 제45항에 있어서, VH 도메인은 표 1에 기재된 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3 서열의 세트를 포함하는, 조성물.
- 제45항에 있어서, VH 도메인은 표 2에 기재된 항체의 서열을 포함하는 VH 도메인의 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하는, 조성물.
- 제45항에 있어서, VH 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 서열의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하고, CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3 서열을 제외한 VH 서열은 표 2에 기재된 항체의 VH 서열과 적어도 95% 또는 98% 동일한, 조성물.
- 제45항에 있어서, VH 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 서열을 포함하는, 조성물.
- 제45항에 있어서, 항원 결합 도메인은 표 1에 기재된 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 서열의 세트를 포함하는, 조성물.
- 제45항에 있어서, 항원 결합 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 및 VL 서열 세트의 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 서열을 포함하는, 조성물.
- 제45항에 있어서, 항원 결합 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 서열의 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 표 2에 기재된 항체의 VL 서열의 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 서열을 제외한 VH 및 VL 도메인 서열은 표 2에 기재된 항체의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 또는 98% 동일한, 조성물.
- 제45항에 있어서, 항원 결합 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 및 VL 서열의 세트를 포함하는, 조성물.
- 제2항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 도메인은 IgG CL 항체 불변 도메인 및 IgG CH1 항체 불변 도메인을 포함하는, 조성물.
- 제2항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 도메인은 VH 도메인 및 CH1 도메인을 포함하고, VL 도메인 및 CL 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 결합하여 Fab를 형성할 수 있는, 조성물.
- 제2항 내지 제56항 중 어느 한 항의 조성물의 2개의 카피를 포함하는 폴리펩티드 복합체로서, 제1 또는 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체의 힌지 내 시스테인 잔기 간의 이황화 결합에 의해 연결되는 폴리펩티드 복합체.
- 제2항 내지 제56항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 복합체를 포함하는 조성물로서, 상기 폴리펩티드는 힌지 도메인, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제2 폴리펩티드에 연결되고; 상기 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드는 상기 폴리펩티드의 제1, 제2, 또는 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체의 힌지 도메인 및 제2 폴리펩티드의 힌지 도메인 내의 시스테인 잔기 간의 이황화 결합에 의해 연결되고; 조성물 중 글리칸의 적어도 5%는 푸코스 잔기가 없는, 조성물.
- 제58항에 있어서, 제2 폴리펩티드 단량체는 유전자 조작 함몰부를 형성하는 돌연변이를 포함하는, 조성물.
- 제59항에 있어서, 유전자 조작 함몰부를 형성하는 돌연변이는 Y407T, Y407A, F405A, T394S, T394W/Y407A, T366W/T394S, T366S/L368A/Y407V/Y349C, S364H/F405A로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
- 제58항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 폴리펩티드는 최대 10개의 단일 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 42, 43, 45 및 47 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는, 조성물.
- 항원 결합 도메인; 링커; 힌지 도메인, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체; 힌지 도메인, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체; 임의의 제3 링커; 및 힌지 도메인, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 임의의 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하는 폴리펩티드로서,
적어도 하나의 Fc 도메인 단량체는 1개, 2개 또는 3개의 역전하 돌연변이를 포함하는, 폴리펩티드. - 제62항에 있어서, 항원 결합 도메인은 항체 중쇄 가변 도메인을 포함하는, 조성물.
- 제62항에 있어서, 항원 결합 도메인은 항체 경쇄 가변 도메인을 포함하는, 조성물.
- 제62항에 있어서, 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체는 표 5에서 선택된 2개의 역전하 돌연변이 세트, 또는 표 6에서 선택된 4개의 역전하 돌연변이 세트를 포함하고, 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체는 표 4에서 선택된 1개, 2개, 또는 3개의 역전하 아미노산 돌연변이를 포함하는, 조성물.
- 제62항에 있어서, 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체는 표 4에서 선택된 1개, 2개 또는 3개의 역전하 아미노산 돌연변이를 포함하고, 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체는 표 5에서 선택된 2개의 역전하 돌연변이의 세트 또는 표 6에서 선택된 4개의 역전하 돌연변이의 세트를 포함하는, 조성물.
- 제62항에 있어서, 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체와 제2 IgG 불변 도메인 단량체는 표 4에서 선택된 1개, 2개 또는 3개의 역전하 아미노산 돌연변이를 포함하는, 조성물.
- 제62항에 있어서, 제3 링커 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하되, 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체, 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체, 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체 각각은 표 4에서 선택된 1개, 2개 또는 3개의 역전하 아미노산 돌연변이를 포함하는, 조성물.
- 제62항에 있어서, 제3 링커 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하되, 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체 및 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체 모두는 표 4에서 선택된 1개, 2개, 또는 3개의 역전하 아미노산 돌연변이를 각각 포함하고, 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체는 표 5에서 선택된 2개의 역전하 돌연변이의 세트 또는 표 6에서 선택된 4개의 역전하 돌연변이의 세트를 포함하는, 조성물.
- 제62항에 있어서, 제3 링커 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하되, 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체 모두는 표 4에서 선택된 1개, 2개, 또는 3개의 역전하 아미노산 돌연변이를 각각 포함하고, 제2 IgG1 도메인 단량체는 표 5에서 선택된 2개의 역전하 돌연변이의 세트 또는 표 6에서 선택된 4개의 역전하 돌연변이의 세트를 포함하는, 조성물.
- 제62항에 있어서, 제3 링커 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하되, 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체 모두는 표 4에서 선택된 1개, 2개, 또는 3개의 역전하 아미노산 돌연변이를 각각 포함하고, 제1 IgG1 도메인 단량체는 표 5에서 선택된 2개의 역전하 돌연변이의 세트 또는 표 6에서 선택된 4개의 역전하 돌연변이의 세트를 포함하는, 조성물.
- 제62항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 표 4에서 선택된 1개, 2개, 또는 3개의 역전하 아미노산 돌연변이를 포함하는 IgG1 Fc 도메인 단량체는 동일한 CH3 도메인을 갖는, 폴리펩티드.
- 제62항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 표 4에서 선택된 1개, 2개, 또는 3개의 역전하 아미노산 돌연변이는 CH3 도메인에 있는, 조성물.
- 제73항에 있어서, 돌연변이는 EU 위치 G341에서 EU 위치 K447까지의 서열 내에 있는, 조성물.
- 제62항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이는 각각 단일 아미노산 변화인, 조성물.
- 제72항에 있어서, 제2 링커 및 임의의 제3 링커는
GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG, GGGGS, GGSG, SGGG, GSGS, GSGSGS, GSGSGSGS, GSGSGSGSGS, GSGSGSGSGSGS, GGSGGS, GGSGGSGGS, GGSGGSGGSGGS, GGSG, GGSG, GGSGGGSG, GGSGGGSGGGSGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS, GENLYFQSGG, SACYCELS, RSIAT, RPACKIPNDLKQKVMNH, GGSAGGSGSGSSGGSSGASGTGTAGGTGSGSGTGSG, AAANSSIDLISVPVDSR, GGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGS, GGGSGGGSGGGS, SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG, GGSGGGSGGGSGGGSGGS, GGGG, GGGGGGGG, GGGGGGGGGGGG, 및 GGGGGGGGGGGGGGGG로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는, Fc-항원 결합 도메인 작제물. - 제62항에 있어서, 제2 링커 및 임의의 제3 링커는 글리신 스페이서인, 조성물.
- 제62항에 있어서, 제2 링커 및 임의의 제3 링커는 독립적으로 4 내지 30개, 4 내지 20개, 8 내지 30개, 8 내지 20개, 12 내지 20개, 또는 12 내지 30개의 글리신 잔기로 이루어지는, 조성물.
- 제62항에 있어서, 제2 링커 및 임의의 제3 링커는 20개의 글리신 잔기로 이루어지는, 조성물.
- 제62항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 도메인 단량체 중 적어도 하나는 EU 위치 I253에서 단일 아미노산 돌연변이를 포함하는, 조성물.
- 제80항에 있어서, EU 위치 I253에서의 각각의 아미노산 돌연변이는 독립적으로, I253A, I253C, I253D, I253E, I253F, I253G, I253H, I253I, I253K, I253L, I253M, I253N, I253P, I253Q, I253R, I253S, I253T, I253V, I253W, 및 I253Y로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
- 제81항에 있어서, 위치 I253에서의 각각의 아미노산 돌연변이는 I253A인, 조성물.
- 제62항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 도메인 단량체 중 적어도 하나는 EU 위치 R292에서 단일 아미노산 돌연변이를 포함하는, 조성물.
- 제83항에 있어서, EU 위치 R292에서의 각각의 아미노산 돌연변이는 독립적으로, R292D, R292E, R292L, R292P, R292Q, R292R, R292T, 및 R292Y로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
- 제84항에 있어서, 위치 R292에서의 각각의 아미노산 돌연변이는 R292P인, 조성물.
- 제62항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 Fc 도메인 단량체의 힌지는 독립적으로, EPKSCDKTHTCPPCPAPELL 및 DKTHTCPPCPAPELL로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는, 조성물.
- 제86항에 있어서, 제2 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체의 힌지 부분은 아미노산 서열 DKTHTCPPCPAPELL을 갖는, 조성물.
- 제86항에 있어서, 제1 Fc 도메인 단량체의 힌지 부분은 아미노산 서열 EPKSCDKTHTCPPCPAPEL을 갖는, 조성물.
- 제86항에 있어서, 제1 Fc 도메인 단량체의 힌지 부분은 아미노산 서열 EPKSCDKTHTCPPCPAPEL을 갖고, 제2 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체의 힌지 부분은 아미노산 서열 DKTHTCPPCPAPELL을 갖는, 조성물.
- 제62항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 Fc 도메인 단량체의 CH2 도메인은 독립적으로, 2개 이하의 단일 아미노산 결실 또는 치환을 갖는 아미노산 서열
GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK를 포함하는, 조성물. - 제62항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 Fc 도메인 단량체의 CH2 도메인은 동일하고, 2개 이하의 단일 아미노산 결실 또는 치환을 갖는 아미노산 서열
GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK를 포함하는, 조성물. - 제62항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 Fc 도메인 단량체의 CH2 도메인은 동일하고, 2개 이하의 단일 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열 GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK를 포함하는, 조성물.
- 제62항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 Fc 도메인 단량체의 CH2 도메인은 동일하고, 아미노산 서열
GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK를 포함하는, 조성물. - 제62항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 Fc 도메인 단량체의 CH3 도메인은 독립적으로, 10개 이하의 단일 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG를 포함하는, 조성물.
- 제62항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 Fc 도메인 단량체의 CH3 도메인은 독립적으로, 8개 이하의 단일 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG를 포함하는, 조성물.
- 제62항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 Fc 도메인 단량체의 CH3 도메인은 독립적으로, 6개 이하의 단일 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG를 포함하는, 조성물.
- 제62항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 Fc 도메인 단량체의 CH3 도메인은 독립적으로, 5개 이하의 단일 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG를 포함하는, 조성물.
- 제90항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 아미노산 치환은 T366Y, T366W, T394W, T394Y, F405W, F405A, Y407A, S354C, Y349T, T394F, K409D, K409E, K392D, K392E, K370D, K370E, D399K, D399R, E357K, E357R, D356K 및 D356R로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
- 제62항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 도메인 단량체 각각은 독립적으로, 최대 10개의 단일 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 42, 43, 45, 및 47 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는, 조성물.
- 제99항에 있어서, 단일 아미노산 치환 중 최대 6개는 CH3 도메인에서의 역전하 돌연변이인, 조성물.
- 제99항에 있어서, 단일 아미노산 치환은 EU 위치 G341에서 EU 위치 K447까지의 서열 내에 있는, 조성물.
- 제62항에 있어서, 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이 중 적어도 하나는 T366Y, T366W, T394W, T394Y, F405W, S354C, Y349T, 및 T394F로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
- 제65항, 제66항, 및 제69항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이는 K409D, K409E, K392D. K392E, K370D, K370E, D399K, D399R, E357K, E357R, D356K 및 D356R로부터 선택되는, 조성물.
- 제62항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 도메인은 scFv인, 조성물.
- 제62항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 도메인은 VH 도메인 및 CH1 도메인을 포함하는, 조성물.
- 제103항에 있어서, 항원 결합 도메인은 VL 도메인을 추가로 포함하는, 조성물.
- 제105항에 있어서, VH 도메인은 표 1에 기재된 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3 서열의 세트를 포함하는, 조성물.
- 제105항에 있어서, VH 도메인은 표 2에 기재된 항체의 서열을 포함하는 VH 도메인의 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하는, 조성물.
- 제105항에 있어서, VH 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 서열의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하고, CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3 서열을 제외한 VH 서열은 표 2에 기재된 항체의 VH 서열과 적어도 95% 또는 98% 동일한, 조성물.
- 제105항에 있어서, VH 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 서열을 포함하는, 조성물.
- 제105항에 있어서, 항원 결합 도메인은 표 1에 기재된 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 서열의 세트를 포함하는, 조성물.
- 제105항에 있어서, 항원 결합 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 및 VL 서열 세트의 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 서열을 포함하는, 조성물.
- 제105항에 있어서, 항원 결합 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 서열의 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 표 2에 기재된 항체의 VL 서열의 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 서열을 제외한 VH 및 VL 도메인 서열은 표 2에 기재된 항체의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 또는 98% 동일한, 조성물.
- 제105항에 있어서, 항원 결합 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 및 VL 서열의 세트를 포함하는, 조성물.
- 제62항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 도메인은 IgG CL 항체 불변 도메인 및 IgG CH1 항체 불변 도메인을 포함하는, 조성물.
- 제62항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 도메인은 VH 도메인 및 CH1 도메인을 포함하고, VL 도메인 및 CL 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 결합하여 Fab를 형성할 수 있는, 조성물.
- 제2항 내지 제56항 중 어느 한 항의 조성물의 2개의 카피를 포함하는 조성물로서, 제2항 내지 제56항 중 어느 한 항의 상기 조성물은 제1 또는 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체의 힌지 내 시스테인 잔기 간의 이황화 결합에 의해 연결되는, 조성물.
- 제62항 내지 제116항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 조성물로서, 제62항 내지 제116항 중 어느 한 항의 상기 조성물은 힌지 도메인, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제2 폴리펩티드에 연결되고, 상기 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드는 상기 폴리펩티드의 제1, 제2, 또는 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체의 힌지 도메인 및 제2 폴리펩티드의 힌지 도메인 내의 시스테인 잔기 간의 이황화 결합에 의해 연결되는, 조성물.
- 제118항에 있어서, 제2 폴리펩티드 단량체는 1개, 2개 또는 3개의 역전하 돌연변이를 포함하는, 조성물.
- 제129항에 있어서, 제2 폴리펩티드 단량체는 표 4에서 선택된 1개, 2개, 또는 3개의 역전하 돌연변이를 포함하고, 상기 역전하 돌연변이들은 폴리펩티드에서 표 4에서 선택된 1개, 2개, 또는 3개의 역전하 돌연변이에 상보적인, 조성물.
- 제118항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 폴리펩티드는 최대 10개의 단일 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 42, 43, 45 및 47 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는, 조성물.
- 힌지 도메인, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체; 제2 링커; 힌지 도메인, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체; 임의의 제3 링커; 및 힌지 도메인, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 임의의 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하는 폴리펩티드로서,
적어도 하나의 Fc 도메인 단량체는 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이를 포함하는, 폴리펩티드. - 제122항에 있어서, 항체 중쇄 가변 도메인 및 제1 IgG1 단량체에 대한 CH1 도메인 아미노 말단을 추가로 포함하는, 조성물.
- 제122항에 있어서, 제1 IgG1 단량체에 대한 scFv 아미노 말단을 추가로 포함하는, 조성물.
- 제122항에 있어서, 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체는 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이를 포함하고, 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체는 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이를 포함하는, 조성물.
- 제122항에 있어서, 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체는 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이를 포함하고, 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체는 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이를 포함하는, 조성물.
- 제122항에 있어서, 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체 및 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체 둘 다는 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이를 포함하는, 조성물.
- 제2항에 있어서, 제3 링커 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하되, 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체, 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체, 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체는 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이를 각각 포함하는, 조성물.
- 제122항에 있어서, 제3 링커 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하되, 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체 및 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체 둘 다는 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이를 각각 포함하고, 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체는 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이를 포함하는, 조성물.
- 제122항에 있어서, 제3 링커 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하되, 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체 둘 다는 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이를 각각 포함하고, 제2 IgG1 도메인 단량체는 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이를 포함하는, 조성물.
- 제122항에 있어서, 제3 링커 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하되, 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체 둘 다는 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이를 각각 포함하고, 제1 IgG1 도메인 단량체는 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이를 포함하는, 조성물.
- 제122항 내지 제131항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이를 포함하는 IgG1 Fc 도메인 단량체는 1개, 2개, 또는 3개의 역전하 돌연변이를 추가로 포함하는, 폴리펩티드.
- 제122항 내지 제131항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이 및 역전하 돌연변이는 CH3 도메인에 있는, 조성물.
- 힌지 도메인, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체; 제2 링커; 힌지 도메인, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체; 임의의 제3 링커; 및 힌지 도메인, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 임의의 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하는 폴리펩티드로서,
적어도 하나의 Fc 도메인 단량체는 1개, 2개 또는 3개의 역전하 돌연변이를 포함하는, 폴리펩티드. - 제134항에 있어서, 항체 중쇄 가변 도메인 및 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체에 대한 CH1 도메인 아미노 말단을 추가로 포함하는, 조성물.
- 제134항에 있어서, 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체에 대한 scFv 아미노 말단을 추가로 포함하는, 조성물.
- 제134항에 있어서, 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체는 표 5에서 선택된 2개의 역전하 돌연변이 세트, 또는 표 6에서 선택된 4개의 역전하 돌연변이 세트를 포함하고, 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체는 표 4에서 선택된 1개, 2개, 또는 3개의 역전하 아미노산 돌연변이를 포함하는, 조성물.
- 제134항에 있어서, 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체는 표 4에서 선택된 1개, 2개, 또는 3개의 역전하 아미노산 돌연변이를 포함하고, 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체는 표 5에서 선택된 2개의 역전하 돌연변이의 세트 또는 표 6에서 선택된 4개의 역전하 돌연변이의 세트를 포함하는, 조성물.
- 제134항에 있어서, 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체와 제2 IgG 불변 도메인 단량체는 표 4에서 선택된 1개, 2개, 또는 3개의 역전하 아미노산 돌연변이를 포함하는, 조성물.
- 제134항에 있어서, 제3 링커 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하되, 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체, 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체, 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체 각각은 표 4에서 선택된 1개, 2개, 또는 3개의 역전하 아미노산 돌연변이를 포함하는, 조성물.
- 제134항에 있어서, 제3 링커 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하되, 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체 및 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체 모두는 표 4에서 선택된 1개, 2개, 또는 3개의 역전하 아미노산 돌연변이를 각각 포함하고, 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체는 표 5에서 선택된 2개의 역전하 돌연변이의 세트 또는 표 6에서 선택된 4개의 역전하 돌연변이의 세트를 포함하는, 조성물.
- 제134항에 있어서, 제3 링커 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하되, 제1 IgG1 Fc 도메인 단량체 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체 모두는 표 4에서 선택된 1개, 2개, 또는 3개의 역전하 아미노산 돌연변이를 각각 포함하고, 제2 IgG1 도메인 단량체는 표 5에서 선택된 2개의 역전하 돌연변이의 세트 또는 표 6에서 선택된 4개의 역전하 돌연변이의 세트를 포함하는, 조성물.
- 제134항에 있어서, 제3 링커 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하되, 제2 IgG1 Fc 도메인 단량체 및 제3 IgG1 Fc 도메인 단량체 모두는 표 4에서 선택된 1개, 2개, 또는 3개의 역전하 아미노산 돌연변이를 각각 포함하고, 제1 IgG1 도메인 단량체는 표 5에서 선택된 2개의 역전하 돌연변이의 세트 또는 표 6에서 선택된 4개의 역전하 돌연변이의 세트를 포함하는, 조성물.
- 제134항 내지 제143항 중 어느 한 항에 있어서, 표 4에서 선택된 1개, 2개, 또는 3개의 역전하 아미노산 돌연변이를 포함하는 IgG1 Fc 도메인 단량체는 동일한 CH3 도메인을 갖는, 폴리펩티드.
- 제134항 내지 제143항 중 어느 한 항에 있어서, 표 4에서 선택된 1개, 2개, 또는 3개의 역전하 아미노산 돌연변이는 CH3 도메인에 있는, 조성물.
- 제122항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이는 EU 위치 G341에서 EU 위치 K447까지의 서열 내에 있는, 조성물.
- 제122항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이는 각각 단일 아미노산 변화인, 조성물.
- 제122항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 링커 및 임의의 제3 링커는
GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG, GGGGS, GGSG, SGGG, GSGS, GSGSGS, GSGSGSGS, GSGSGSGSGS, GSGSGSGSGSGS, GGSGGS, GGSGGSGGS, GGSGGSGGSGGS, GGSG, GGSG, GGSGGGSG, GGSGGGSGGGSGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS, GENLYFQSGG, SACYCELS, RSIAT, RPACKIPNDLKQKVMNH, GGSAGGSGSGSSGGSSGASGTGTAGGTGSGSGTGSG, AAANSSIDLISVPVDSR, GGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGS, GGGSGGGSGGGS, SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG, GGSGGGSGGGSGGGSGGS, GGGG, GGGGGGGG, GGGGGGGGGGGG, 및 GGGGGGGGGGGGGGGG로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는, Fc-항원 결합 도메인 작제물. - 제122항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 링커 및 임의의 제3 링커는 독립적으로 4 내지 30개, 4 내지 20개, 8 내지 30개, 8 내지 20개, 12 내지 20개, 또는 12 내지 30개의 글리신 잔기로 이루어지는, 조성물.
- 제122항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 링커 및 임의의 제3 링커는 20개의 글리신 잔기로 이루어지는, 조성물.
- 제122항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 도메인 단량체 중 적어도 하나는 EU 위치 I253에서 단일 아미노산 돌연변이를 포함하는, 조성물.
- 제151항에 있어서, EU 위치 I253에서의 각각의 아미노산 돌연변이는 독립적으로, I253A, I253C, I253D, I253E, I253F, I253G, I253H, I253I, I253K, I253L, I253M, I253N, I253P, I253Q, I253R, I253S, I253T, I253V, I253W, 및 I253Y로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
- 제152항에 있어서, 위치 I253에서의 각각의 아미노산 돌연변이는 I253A인, 조성물.
- 제122항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 도메인 단량체 중 적어도 하나는 EU 위치 R292에서 단일 아미노산 돌연변이를 포함하는, 조성물.
- 제154항에 있어서, EU 위치 R292에서의 각각의 아미노산 돌연변이는 독립적으로, R292D, R292E, R292L, R292P, R292Q, R292R, R292T, 및 R292Y로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
- 제155항에 있어서, 위치 R292에서의 각각의 아미노산 돌연변이는 R292P인, 조성물.
- 제122항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 Fc 도메인 단량체의 힌지는 독립적으로, EPKSCDKTHTCPPCPAPELL 및 DKTHTCPPCPAPELL로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는, 조성물.
- 제122항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체의 힌지 부분은 아미노산 서열 DKTHTCPPCPAPELL을 갖는, 조성물.
- 제122항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 Fc 도메인 단량체의 힌지 부분은 아미노산 서열 EPKSCDKTHTCPPCPAPEL을 갖는, 조성물.
- 제122항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 Fc 도메인 단량체의 힌지 부분은 아미노산 서열 EPKSCDKTHTCPPCPAPEL을 갖고, 제2 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체의 힌지 부분은 아미노산 서열 DKTHTCPPCPAPELL을 갖는, 조성물.
- 제122항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 Fc 도메인 단량체의 CH2 도메인은 독립적으로, 2개 이하의 단일 아미노산 결실 또는 치환을 갖는 아미노산 서열
GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK를 포함하는, 조성물. - 제122항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 Fc 도메인 단량체의 CH2 도메인은 동일하고, 2개 이하의 단일 아미노산 결실 또는 치환을 갖는 아미노산 서열
GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK를 포함하는, 조성물. - 내용 없음
- 내용 없음
- 제122항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 Fc 도메인 단량체의 CH2 도메인은 동일하고, 2개 이하의 단일 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열 GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK를 포함하는, 조성물.
- 제122항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 Fc 도메인 단량체의 CH2 도메인은 동일하고, 아미노산 서열
GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK를 포함하는, 조성물. - 제122항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 Fc 도메인 단량체의 CH3 도메인은 독립적으로, 10개 이하의 단일 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열
GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG를 포함하는, 조성물. - 제122항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 Fc 도메인 단량체의 CH3 도메인은 독립적으로, 8개 이하의 단일 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG를 포함하는, 조성물.
- 제122항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 Fc 도메인 단량체의 CH3 도메인은 독립적으로, 6개 이하의 단일 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG를 포함하는, 조성물.
- 제122항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 Fc 도메인 단량체의 CH3 도메인도메인으로, 5개 이하의 단일 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG를 포함하는, 조성물.
- 제122항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 아미노산 치환은 T366Y, T366W, T394W, T394Y, F405W, F405A, Y407A, S354C, Y349T, T394F, K409D, K409E, K392D, K392E, K370D, K370E, D399K, D399R, E357K, E357R, D356K 및 D356R로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
- 제122항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 도메인 단량체 각각은 독립적으로, 최대 10개의 단일 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 42, 43, 45, 및 47 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는, 조성물.
- 제99항에 있어서, 단일 아미노산 치환 중 최대 6개는 CH3 도메인에서의 역전하 돌연변이인, 조성물.
- 제173항에 있어서, 단일 아미노산 치환은 EU 위치 G341에서 EU 위치 K447까지의 서열 내에 있는, 조성물.
- 제122항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 조작 돌출부를 형성하는 돌연변이 중 적어도 하나는 T366Y, T366W, T394W, T394Y, F405W, F405A, Y407A, S354C, Y349T, 및 T394F로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
- 제122항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, 2개 또는 4개의 역전하 돌연변이는 K409D, K409E, K392D. K392E, K370D, K370E, D399K, D399R, E357K, E357R, D356K 및 D356R로부터 선택되는, 조성물.
- 내용 없음
- 제123항, 제124항, 제135항, 및 제136항 중 어느 한 항에 있어서, VH 도메인 또는 ScFv는 표 1에 기재된 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3 서열의 세트를 포함하는, 조성물.
- 제123항, 제124항, 제135항, 및 제136항 중 어느 한 항에 있어서, VH 도메인 또는 ScFv는 표 2에 기재된 항체의 서열을 포함하는 VH 도메인의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는, 조성물.
- 제123항, 제124항, 제135항, 및 제136항 중 어느 한 항에 있어서, VH 도메인 또는 ScFv는 표 2에 기재된 항체의 VH 서열의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하고, CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3 서열을 제외한 VH 서열은 표 2에 기재된 항체의 VH 서열과 적어도 95% 또는 98% 동일한, 조성물.
- 제123항, 제124항, 제135항, 및 제136항 중 어느 한 항에 있어서, VH 도메인 또는 ScFv는 표 2에 기재된 항체의 VH 서열을 포함하는, 조성물.
- 제123항, 제124항, 제135항, 및 제136항 중 어느 한 항에 있어서, VH 도메인 또는 ScFv는 표 1에 기재된 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3 서열의 세트를 포함하는, 조성물.
- 제123항, 제124항, 제135항, 및 제136항 중 어느 한 항에 있어서, VH 도메인 또는 ScFv는 표 2에 기재된 항체의 VH 및 VL 서열의 세트로부터의 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3 서열을 포함하는, 조성물.
- 제123항, 제124항, 제135항, 및 제136항 중 어느 한 항에 있어서, VH 도메인 또는 ScFv는 표 2에 기재된 항체의 VH 서열의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 표 2에 기재된 항체의 VL 서열의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3 서열을 제외한 VH 및 VL 도메인 서열은 표 2에 기재된 항체의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 또는 98% 동일한, 조성물.
- 제123항, 제124항, 제135항, 및 제136항 중 어느 한 항에 있어서, VH 도메인 또는 ScFv는 표 2에 기재된 항체의 VH 및 VL 서열의 세트를 포함하는, 조성물.
- 제122항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, IgG CL 항체 불변 도메인 및 IgG CH1 항체 불변 도메인을 포함하는, 조성물.
- 제2항 내지 제187항 중 어느 한 항의 조성물을 암호화하는 핵산 분자.
- 제187항의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
- 제187항의 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포.
- 제188항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
- 제2항 내지 제187항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 폴리펩티드를 발현하는 조건 하에서 제189항 또는 제190항의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법.
- 제189항에 있어서, 항체 VL 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 추가로 포함하는 숙주 세포.
- 제190항에 있어서, 항체 VL 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 추가로 포함하는 숙주 세포.
- 제189항에 있어서, 항체 VL 도메인 및 항체 CL 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 추가로 포함하는 숙주 세포.
- 제190항에 있어서, 항체 VL 도메인 및 항체 CL 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 추가로 포함하는 숙주 세포.
- 제189항에 있어서, 10개 이하의 단일 아미노산 변형을 갖는 IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 추가로 포함하는, 숙주 세포.
- 제190항에 있어서, 10개 이하의 단일 아미노산 변형을 갖는 IgG1 Fc 도메인 단량체를 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 추가로 포함하는, 숙주 세포.
- 내용 없음
- 제196항 또는 제197항에 있어서, 상기 IgG1 Fc 도메인 단량체는 상기 CH3 도메인에서 10개, 8개, 6개, 또는 4개 이하의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열 번호 42, 43, 45, 및 47 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는, 숙주 세포.
- 제2항 내지 제186항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 약학적 조성물.
- 제200항에 있어서, 상기 폴리펩티드의 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 2% 미만은 Fc 도메인 단량체 상에 적어도 하나의 푸코스 변형을 갖는, 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, Fc-항원 결합 도메인 작제물은:
a)
i) 제1 Fc 도메인 단량체,
ii) 제2 Fc 도메인 단량체, 및
iii) 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커를 포함하는, 제1 폴리펩티드;
b) 제3 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제2 폴리펩티드;
c) 제4 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드; 및
d) 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 또는 제3 폴리펩티드에 연결된 항원 결합 도메인을 포함하되,
제1 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성하는, Fc-항원 결합 도메인 작제물. - 제1항 또는 제202항에 있어서, 단일 Fc 도메인 작제물은 항체인, Fc-항원 결합 도메인 작제물.
- Fc-항원 결합 도메인 작제물의 실질적으로 균질한 집단을 포함하는 조성물로서, 상기 Fc-항원 결합 도메인 작제물은:
a)
i) 제1 Fc 도메인 단량체,
ii) 제2 Fc 도메인 단량체, 및
iii) 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커를 포함하는, 제1 폴리펩티드;
b) 제3 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제2 폴리펩티드;
c) 제4 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드; 및
d) 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 또는 제3 폴리펩티드에 연결된 항원 결합 도메인을 포함하되,
제1 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성하는, 조성물. - 제204항에 있어서, 항원 결합 도메인은 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드 또는 제3 폴리펩티드에 연결되거나, 제2 폴리펩티드와 제3 폴리펩티드에 연결되는, 조성물.
- 제204항에 있어서, 항원 결합 도메인은 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 및 제3 폴리펩티드에 연결되는, 조성물.
- Fc-항원 결합 도메인 작제물로서,
a)
i) 제1 Fc 도메인 단량체,
ii) 제2 Fc 도메인 단량체, 및
iii) 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커를 포함하는, 제1 폴리펩티드;
b) 제3 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제2 폴리펩티드;
c) 제4 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드; 및
d) 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 또는 제3 폴리펩티드에 연결된 항원 결합 도메인을 포함하되,
제1 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성하며, Fc-항원 결합 도메인 작제물은 단일 Fc 도메인 및 항원 결합 도메인을 갖는 작제물에 의해 나타나지 않는 생물학적 활성을 포함하는, Fc-항원 결합 도메인 작제물. - 제207항에 있어서, 생물학적 활성은 Fc 수용체 매개 효과기 기능인, Fc-항원 결합 도메인 작제물.
- 제208항에 있어서, Fc 수용체 매개 효과기 기능은 ADCC 및 ADCP 및/또는 CDC 활성인, Fc-항원 결합 도메인 작제물.
- Fc-항원 결합 도메인 작제물로서,
a)
i) 제1 Fc 도메인 단량체,
ii) 제2 Fc 도메인 단량체, 및
iii) 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 스페이서를 포함하는, 제1 폴리펩티드;
b) 제3 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제2 폴리펩티드;
c) 제4 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드; 및
d) 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 또는 제3 폴리펩티드에 연결된 항원 결합 도메인을 포함하되,
제1 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성하는, Fc-항원 결합 도메인 작제물. - 제202항, 제207항, 또는 제210항에 있어서, 항원 결합 도메인은 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드 또는 제3 폴리펩티드에 연결되거나, 제2 폴리펩티드와 제3 폴리펩티드에 연결되는, Fc-항원 결합 도메인 작제물.
- 제202항, 제207항, 또는 제210항에 있어서, 항원 결합 도메인은 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 및 제3 폴리펩티드에 연결되는, Fc-항원 결합 도메인 작제물.
- 제1항, 및 제202항 내지 제212항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 도메인은 Fab인, Fc-항원 결합 도메인 작제물.
- 제202항 내지 제212항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 도메인은 제1, 제2 또는 제3 폴리펩티드의 아미노산 서열의 일부인, Fc-항원 결합 도메인 작제물.
- 제214항에 있어서, 항원 결합 도메인은 scFv인, Fc-항원 결합 도메인 작제물.
- 제202항 내지 제212항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 도메인은 VH 도메인 및 CH1 도메인을 포함하고, VH 및 CH1 도메인은 제1, 제2, 또는 제3 폴리펩티드의 아미노산 서열의 일부인, Fc-항원 결합 도메인 작제물.
- 제216항에 있어서, 항원 결합 도메인은 VL 도메인을 추가로 포함하는, Fc-항원 결합 도메인 작제물.
- 제217항에 있어서, Fc-항원 결합 도메인 작제물은 VL 도메인을 포함하는 제4 폴리펩티드를 포함하는, Fc-항원 결합 도메인 작제물.
- 제216항에 있어서, VH 도메인은 표 1에 기재된 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3 서열의 세트를 포함하는, Fc-항원 결합 도메인 작제물.
- 제216항에 있어서, VH 도메인은 표 2에 기재된 항체의 서열을 포함하는 VH 도메인의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는, Fc-항원 결합 도메인 작제물.
- 제216항에 있어서, VH 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 서열의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하고, CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3 서열을 제외한 VH 서열은 표 2에 기재된 항체의 VH 서열과 적어도 95% 동일한, Fc-항원 결합 도메인 작제물.
- 제216항에 있어서, VH 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 서열을 포함하는, Fc-항원 결합 도메인 작제물.
- 제1항, 및 제202항 내지 제215항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 도메인은 표 1에 기재된 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3 서열의 세트를 포함하는, Fc-항원 결합 도메인 작제물.
- 제1항, 및 제202항 내지 제215항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 및 VL 서열의 세트로부터 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 서열을 포함하는, Fc-항원 결합 도메인 작제물.
- 제1항, 및 제202항 내지 제215항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 서열의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인 및 표 2에 기재된 항체의 VL 서열의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하고, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3 서열을 제외한 VH 및 VL 도메인 서열은 표 2에 기재된 항체의 VH 및 VL 서열과 적어도 95% 동일한, Fc-항원 결합 도메인 작제물.
- 제1항, 및 제202항 내지 제215항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 도메인은 표 2에 기재된 항체의 VH 및 VL 서열을 포함하는, Fc-항원 결합 도메인 작제물.
- 제1항, 및 제202항 내지 제212항 중 어느 한 항에 있어서, IgG CL 항체 불변 도메인 및 IgG CH1 항체 불변 도메인을 추가로 포함하되, IgG CH1 항체 불변 도메인은 링커를 통해 제1 폴리펩티드 또는 제2 폴리펩티드의 N-말단에 부착되는, Fc-항원 결합 도메인 작제물.
- 제202항 내지 제227항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체는 제1 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체 사이의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함하는, Fc-항원 결합 도메인 작제물.
- 제202항 내지 제228항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 Fc 도메인 단량체 및 제4 Fc 도메인 단량체는 제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체 사이의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함하는, Fc-항원 결합 도메인 작제물.
- 제202항 내지 제228항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 폴리펩티드 및 제3 폴리펩티드는 동일한 아미노산 서열을 갖는, Fc-항원 결합 도메인 작제물.
- 제228항 또는 제229항에 있어서, 이량체화 선택성 모듈은 Fc 도메인 단량체 중 하나의 CH3 도메인에 유전자 조작 함몰부를 포함하고, Fc 도메인 단량체 중 다른 하나의 CH3 도메인에 유전자 조작 돌출부를 포함하며, 유전자 조작 함몰부와 유전자 조작 돌출부는 Fc 도메인 단량체의 돌출부-함몰부 쌍을 형성하도록 위치되는, Fc-항원 결합 도메인 작제물.
- 제231항에 있어서, 유전자 조작 돌출부는 S354C, T366W, T366Y, T394W, T394F 및 F405W로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 변형을 포함하고, 유전자 조작 함몰부는 Y349C, T366S, L368A, Y407V, Y407T, Y407A, F405A 및 T394S로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 변형을 포함하는, Fc-항원 결합 도메인 작제물.
- 제228항 또는 제229항에 있어서, Fc 도메인 단량체 중 하나는 Y407V 및 Y349C를 포함하고, Fc 도메인 단량체 중 다른 하나는 T366W 및 S354C를 포함하는, Fc-항원 결합 도메인 작제물.
- 제228항 또는 제229항에 있어서, 이량체화 선택성 모듈은 도메인 단량체 중 하나의 CH3 도메인 내에 음하전 아미노산을 포함하고, Fc 도메인 단량체 중 다른 하나의 CH3 도메인 내에 양하전 아미노산을 포함하며, 음하전 아미노산 및 양하전 아미노산은 Fc 도메인의 형성을 촉진하도록 위치되는, Fc-항원 결합 도메인 작제물.
- 제234항에 있어서, 제1 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체 각각은 D399K 및 K409D 또는 K409E를 포함하는, Fc-항원 결합 도메인 작제물.
- 제234항에 있어서, 제1 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체 각각은 K392D 및 D399K를 포함하는, Fc-항원 결합 도메인 작제물.
- 제234항에 있어서, 제1 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체 각각은 E357K 및 K370E를 포함하는, Fc-항원 결합 도메인 작제물.
- 제234항에 있어서, 제1 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체 각각은 D356K 및 K439D를 포함하는, Fc-항원 결합 도메인 작제물.
- 제234항에 있어서, 제1 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체 각각은 K392E 및 D399K를 포함하는, Fc-항원 결합 도메인 작제물.
- 제234항에 있어서, 제1 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체 각각은 E357K 및 K370D를 포함하는, Fc-항원 결합 도메인 작제물.
- 제234항에 있어서, 제1 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체 각각은 D356K 및 K439E를 포함하는, Fc-항원 결합 도메인 작제물.
- 제234항에 있어서, 제2 Fc 도메인 단량체 및 제4 Fc 도메인 단량체 각각은 S354C 및 T366W를 포함하고, 제3 및 제4 폴리펩티드 각각은 Y349C, T366S, L368A 및 Y407V를 포함하는, Fc-항원 결합 도메인 작제물.
- 제234항에 있어서, 제3 및 제4 폴리펩티드 각각은 S354C 및 T366W를 포함하고, 제2 Fc 도메인 단량체 및 제4 Fc 도메인 단량체는 Y349C, T366S, L368A 및 Y407V를 각각 포함하는, Fc-항원 결합 도메인 작제물.
- 제234항에 있어서, 제2 Fc 도메인 단량체 및 제4 Fc 도메인 단량체 각각은 E357K 또는 E357R을 포함하고, 제3 및 제4 폴리펩티드 각각은 K370D 또는 K370E를 포함하는, Fc-항원 결합 도메인 작제물.
- 제234항에 있어서, 제2 Fc 도메인 단량체 및 제4 Fc 도메인 단량체는 K370D 또는 K370E를 포함하고, 제3 및 제4 폴리펩티드는 E357K 또는 357R을 각각 포함하는, Fc-항원 결합 도메인 작제물.
- 제234항에 있어서, 제2 Fc 도메인 단량체 및 제4 Fc 도메인 단량체 각각은 K409D 또는 K409E를 포함하고, 제3 및 제4 폴리펩티드는 D399K 또는 D399R을 각각 포함하는, Fc-항원 결합 도메인 작제물.
- 제234항에 있어서, 제2 Fc 도메인 단량체 및 제4 Fc 도메인 단량체는 D399K 또는 D399R을 포함하고, 제3 및 제4 폴리펩티드는 K409D 또는 K409E를 각각 포함하는, Fc-항원 결합 도메인 작제물.
- 제1항, 및 제202항 내지 제247항 중 어느 한 항에 있어서, Fc-항원 결합 도메인 작제물 내의 하나 이상의 링커는 결합인, Fc-항원 결합 도메인 작제물.
- 제1항, 및 제202항 내지 제247항 중 어느 한 항에 있어서, Fc-항원 결합 도메인 작제물 내의 하나 이상의 링커는 스페이서인, Fc-항원 결합 도메인 작제물.
- 제249항에 있어서, 스페이서는 서열 GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG, GGGGS, GGSG, SGGG, GSGS, GSGSGS, GSGSGSGS, GSGSGSGSGS, GSGSGSGSGSGS, GGSGGS, GGSGGSGGS, GGSGGSGGSGGS, GGSG, GGSG, GGSGGGSG, GGSGGGSGGGSGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS, GENLYFQSGG, SACYCELS, RSIAT, RPACKIPNDLKQKVMNH, GGSAGGSGSGSSGGSSGASGTGTAGGTGSGSGTGSG, AAANSSIDLISVPVDSR, GGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGS, GGGSGGGSGGGS, SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG, GGSGGGSGGGSGGGSGGS, GGGG, GGGGGGGG, GGGGGGGGGGGG, 또는 GGGGGGGGGGGGGGGG를 갖는 폴리펩티드를 포함하는, Fc-항원 결합 도메인 작제물.
- 제249항에 있어서, 스페이서는 글리신 스페이서인, Fc-항원 결합 도메인 작제물.
- 제251항에 있어서, 스페이서는 4 내지 30개, 8 내지 30개 또는 12 내지 30개의 글리신 잔기로 이루어진, Fc-항원 결합 도메인 작제물.
- 제252항에 있어서, 스페이서는 20개의 글리신 잔기로 이루어지는, Fc-항원 결합 도메인 작제물.
- 제1항, 및 제202항 내지 제212항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 도메인은 링커에 의해 Fc 도메인 단량체에 연결되는, Fc-항원 결합 도메인 작제물.
- 제254항에 있어서, 링커는 스페이서인, Fc-항원 결합 도메인 작제물.
- 제1항, 및 제202항 내지 제255항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 Fc 도메인은 위치 I253에서 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하는, Fc-항원 결합 도메인 작제물.
- 제256항에 있어서, 위치 I253에서의 아미노산 치환은 독립적으로, I253A, I253C, I253D, I253E, I253F, I253G, I253H, I253I, I253K, I253L, I253M, I253N, I253P, I253Q, I253R, I253S, I253T, I253V, I253W 및 I253Y로 이루어진 군으로부터 선택되는, Fc-항원 결합 도메인 작제물.
- 제257항에 있어서, 위치 I253에서의 각각의 아미노산 변형은 I253A인, Fc-항원 결합 도메인 작제물.
- 제1항, 및 제202항 내지 제258항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 Fc 도메인은 위치 R292에서 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하는, Fc-항원 결합 도메인 작제물.
- 제259항에 있어서, 위치 R292에서의 각각의 아미노산 돌연변이는 독립적으로, R292D, R292E, R292L, R292P, R292Q, R292R, R292T 및 R292Y로 이루어진 군으로부터 선택되는, Fc-항원 결합 도메인 작제물.
- 제260항에 있어서, 위치 R292에서의 각각의 아미노산 변형은 R292P인, Fc-항원 결합 도메인 작제물.
- 제1항, 및 제202항 내지 제261항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 도메인 단량체 중 하나 이상은 IgG 힌지 도메인, IgG CH2 항체 불변 도메인, 및 IgG CH3 항체 불변 도메인을 포함하는, Fc-항원 결합 도메인 작제물.
- 제262항에 있어서, Fc 도메인 단량체 각각은 IgG 힌지 도메인, IgG CH2 항체 불변 도메인 및 IgG CH3 항체 불변 도메인을 포함하는, Fc-항원 결합 도메인 작제물.
- 제262항 또는 제263항에 있어서, IgG는 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 및 IgG4로 이루어진 군에서 선택되는 아형인, Fc-항원 결합 도메인 작제물.
- 제1항, 및 제202항 내지 제264항 중 어느 한 항에 있어서, 제1, 제2, 제3 및 제4 폴리펩티드 각각에서 N-말단 Asp는 Gln으로 돌연변이된, Fc-항원 결합 도메인 작제물.
- 제1항, 및 제202항 내지 제265항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 제1, 제2, 제3 및 제4 폴리펩티드에는 C-말단 라이신이 결여되어 있는, Fc-항원 결합 도메인 작제물.
- 제266항에 있어서, 각각의 제1, 제2, 제3 및 제4 폴리펩티드에는 C-말단 라이신이 결여되어 있는, Fc-항원 결합 도메인 작제물.
- 제1항, 및 제202항 내지 제267항 중 어느 한 항에 있어서, 링커에 의해 하나 이상의 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 연결되는 알부민-결합 펩티드를 추가로 포함하는, Fc-항원 결합 도메인 작제물.
- Fc-항원 결합 도메인 작제물의 집단을 포함하는 세포 배양 배지로서, 몰 기준으로 상기 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 적어도 50%는
a)
i) 제1 Fc 도메인 단량체,
ii) 제2 Fc 도메인 단량체, 및
iii) 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커를 포함하는, 제1 폴리펩티드;
b) 제3 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제2 폴리펩티드;
c) 제4 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드; 및
d) 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 또는 제3 폴리펩티드에 연결된 항원 결합 도메인을 포함하되,
제1 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성하는, 세포 배양 배지. - 제269항에 있어서, 몰 기준으로 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 적어도 75%는 제1 Fc 도메인, 제2 Fc 도메인, 및 항원 결합 도메인을 포함하는, 세포 배양 배지.
- Fc-항원 결합 도메인 작제물의 집단을 포함하는 세포 배양 배지로서, 몰 기준으로 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 적어도 50%는 구조적으로 동일하고, Fc-항원 결합 도메인 작제물은 적어도 0.1 mg/L의 농도로 배양 배지에 존재하는, 세포 배양 배지.
- 제271항에 있어서, 몰 기준으로 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 적어도 75%는 구조적으로 동일한, 세포 배양 배지.
- 제269항 내지 제272항 중 어느 한 항에 있어서, Fc-항원 결합 도메인 작제물은 적어도 10 mg/L의 농도로 배양 배지에 존재하는, 세포 배양 배지.
- 제269항 내지 제273항 중 어느 한 항에 있어서, Fc-항원 결합 도메인 작제물은 적어도 100 mg/L의 농도로 배양 배지에 존재하는, 세포 배양 배지.
- Fc-항원 결합 도메인 작제물의 제조 방법으로서, 상기 방법은:
a) 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 상기 숙주 세포는
(1)
i) 제1 Fc 도메인 단량체,
ii) 제2 Fc 도메인 단량체, 및
iii) 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커를 포함하는, 제1 폴리펩티드;
(2) 제3 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제2 폴리펩티드; (3) 제4 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드; 및 (4) 항원 결합 도메인을 발현하되; 제1 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하고; 제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성하고; 항원 결합 도메인은 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 또는 제3 폴리펩티드와 연결되어 Fc-항원 결합 도메인 작제물을 형성하며; 몰 기준으로, 세포 배양 상청액 중 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 적어도 50%는 구조적으로 동일한, 단계, 및
b) 세포 배양 상청액으로부터 Fc-항원 결합 도메인 작제물을 정제하는 단계를 포함하는, 방법. - Fc-항원 결합 도메인 작제물의 실질적으로 균질한 집단을 포함하는 조성물로서, 상기 Fc-항원 결합 도메인 작제물은:
a)
i) 제1 Fc 도메인 단량체,
ii) 제2 Fc 도메인 단량체, 및
iii) 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커를 포함하는, 제1 폴리펩티드;
b) 제3 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제2 폴리펩티드;
c) 제4 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드;
d) 제1 폴리펩티드에 연결된 제1 항원 결합 도메인; 및
e) 제2 폴리펩티드 및/또는 제3 폴리펩티드에 연결된 제2 항원 결합 도메인을 포함하되,
제1 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성하며, 제1 및 제2 항원 결합 도메인은 상이한 항원과 결합하는, 조성물. - 제276항에 있어서, 제1 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체는 제1 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체 사이의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함하고, 제2 Fc 도메인 단량체 및 제4 Fc 도메인 단량체는 제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체 사이의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함하며, 제2 폴리펩티드와 제3 폴리펩티드는 상이한 아미노산 서열을 갖는, 조성물.
- 제277항에 있어서, 제2 Fc 도메인 단량체 및 제4 Fc 도메인 단량체 각각은 E357K 및 K370D를 포함하고, 제1 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체 각각은 K370D 및 E357K를 포함하는, 조성물.
- Fc-항원 결합 도메인 작제물의 실질적으로 균질한 집단을 포함하는 조성물로서, 상기 Fc-항원 결합 도메인 작제물은:
a)
i) 제1 Fc 도메인 단량체,
ii) 제2 Fc 도메인 단량체, 및
iii) 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커를 포함하는, 제1 폴리펩티드;
b) 제3 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제2 폴리펩티드;
c) 제4 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드;
d) 제1 폴리펩티드에 연결된 제1 항원 결합 도메인;
e) 제2 폴리펩티드에 연결된 제2 항원 결합 도메인; 및
f) 제3 폴리펩티드에 연결된 제3 항원 결합 도메인을 포함하되,
제1 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성하며, 제1, 제2 및 제3 항원 결합 도메인은 상이한 항원과 결합하는, 조성물. - 제279항에 있어서, 제1 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체는 제1 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체 사이의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함하고, 제2 Fc 도메인 단량체 및 제4 Fc 도메인 단량체는 제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체 사이의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함하며, 제2 폴리펩티드와 제3 폴리펩티드는 상이한 아미노산 서열을 갖는, 조성물.
- 제280항에 있어서, 제2 Fc 도메인 단량체 및 제4 Fc 도메인 단량체 각각은 E357K 및 K370D를 포함하고, 제1 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체 각각은 K370D 및 E357K를 포함하는, 조성물.
- Fc-항원 결합 도메인 작제물의 실질적으로 균질한 집단을 포함하는 조성물로서, 상기 Fc-항원 결합 도메인 작제물은:
a)
i) 제1 Fc 도메인 단량체,
ii) 제2 Fc 도메인 단량체, 및
iii) 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제1 링커를 포함하는, 제1 폴리펩티드;
b)
iv) 제3 Fc 도메인 단량체,
v) 제4 Fc 도메인 단량체, 및
vi) 제3 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제2 링커를 포함하는, 제2 폴리펩티드;
c) 제5 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드;
d) 제6 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제4 폴리펩티드; 및
e) 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 제3 폴리펩티드, 또는 제4 폴리펩티드에 연결되는 항원 결합 도메인을 포함하되,
제1 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제2 Fc 도메인 단량체와 제5 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성하며, 제4 Fc 도메인 단량체와 제6 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제3 Fc 도메인을 형성하는, 조성물. - 제282항에 있어서, 제1 및 제3 Fc 도메인 단량체 각각은 제1 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체 사이의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함하고,
제2 및 제5 Fc 도메인 단량체 각각은 제2 Fc 도메인 단량체와 제5 Fc 도메인 단량체 사이의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함하며,
제4 및 제6 Fc 도메인 단량체 각각은 제4 Fc 도메인 단량체와 제6 Fc 도메인 단량체 사이의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함하는, Fc-항원 결합 도메인 작제물. - Fc-항원 결합 도메인 작제물의 실질적으로 균질한 집단을 포함하는 조성물로서, 상기 Fc-항원 결합 도메인 작제물은:
a)
i) 제1 Fc 도메인 단량체,
ii) 제2 Fc 도메인 단량체, 및
iii) 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제1 링커를 포함하는, 제1 폴리펩티드;
b)
iv) 제3 Fc 도메인 단량체,
v) 제4 Fc 도메인 단량체, 및
vi) 제3 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제2 링커를 포함하는, 제2 폴리펩티드;
c) 제5 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드;
d) 제6 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제4 폴리펩티드; 및
e) 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 제3 폴리펩티드, 또는 제4 폴리펩티드에 연결되는 항원 결합 도메인을 포함하되,
제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제1 Fc 도메인 단량체와 제5 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성하며, 제3 Fc 도메인 단량체와 제6 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제3 Fc 도메인을 형성하는, 조성물. - 제284항에 있어서, 제2 Fc 및 제4 Fc 도메인 단량체 각각은 제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체 사이의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함하고,
제1 및 제5 Fc 도메인 단량체 각각은 제1 Fc 도메인 단량체와 제5 Fc 도메인 단량체 사이의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함하며,
제3 및 제6 Fc 도메인 단량체 각각은 제3 Fc 도메인 단량체와 제6 Fc 도메인 단량체 사이의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함하는, Fc-항원 결합 도메인 작제물. - Fc-항원 결합 도메인 작제물의 실질적으로 균질한 집단을 포함하는 조성물로서, 상기 Fc-항원 결합 도메인 작제물은:
a)
i) 제1 Fc 도메인 단량체,
ii) 제2 Fc 도메인 단량체,
iii) 제3 Fc 도메인 단량체,
iv) 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제1 링커, 및
v) 제2 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제2 링커를 포함하는, 제1 폴리펩티드;
b)
vi) 제4 Fc 도메인 단량체,
vii) 제5 Fc 도메인 단량체,
viii) 제6 Fc 도메인 단량체,
ix) 제4 Fc 도메인 단량체와 제5 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제3 링커, 및
x) 제5 Fc 도메인 단량체와 제6 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제4 링커를 포함하는, 제2 폴리펩티드;
c) 제7 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드;
d) 제8 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제4 폴리펩티드;
e) 제9 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제5 폴리펩티드;
f) 제10 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제6 폴리펩티드; 및
g) 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 제3 폴리펩티드, 제4 폴리펩티드, 제5 폴리펩티드, 또는 제6 폴리펩티드에 연결되는 항원 결합 도메인을 포함하되,
제2 Fc 도메인 단량체와 제5 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제1 Fc 도메인 단량체와 제7 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성하며, 제4 Fc 도메인 단량체와 제8 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제3 Fc 도메인을 형성하고, 제3 Fc 도메인 단량체와 제9 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제4 Fc 도메인을 형성하며, 제6 Fc 도메인 단량체와 제10 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제5 Fc 도메인을 형성하는, 조성물. - 제286항에 있어서, 제2 및 제5 Fc 도메인 단량체 각각은 제2 Fc 도메인 단량체와 제5 Fc 도메인 단량체 사이의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함하고,
제1 및 제7 Fc 도메인 단량체 각각은 제1 Fc 도메인 단량체와 제7 Fc 도메인 단량체 사이의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함하고,
제4 및 제8 Fc 도메인 단량체 각각은 제4 Fc 도메인 단량체와 제8 Fc 도메인 단량체 사이의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함하고,
제3 및 제9 Fc 도메인 단량체 각각은 제3 Fc 도메인 단량체와 제9 Fc 도메인 단량체 사이의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함하며,
제6 및 제10 Fc 도메인 단량체 각각은 제6 Fc 도메인 단량체와 제10 Fc 도메인 단량체 사이의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함하는, Fc-항원 결합 도메인 작제물. - Fc-항원 결합 도메인 작제물로서,
a)
i) 제1 Fc 도메인 단량체,
ii) 제2 Fc 도메인 단량체, 및
iii) 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커를 포함하는, 제1 폴리펩티드;
b) 제3 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제2 폴리펩티드;
c) 제4 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드; 및
d) 제1 폴리펩티드에 연결된 제1 항원 결합 도메인; 및
e) 제2 폴리펩티드 및/또는 제3 폴리펩티드에 연결된 제2 항원 결합 도메인을 포함하되,
제1 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성하며, 제1 및 제2 항원 결합 도메인은 상이한 항원에 결합하고, Fc-항원 결합 도메인 작제물은 단일 Fc 도메인 및 항원 결합 도메인을 갖는 작제물에 비해 항체 의존성 세포독성(ADCC) 검정, 항체 의존성 세포 식균작용(ADCP) 및/또는 보체 의존성 세포독성(CDC) 검정에서 강화된 효과기 기능을 갖는, Fc-항원 결합 도메인 작제물. - Fc-항원 결합 도메인 작제물로서,
a)
i) 제1 Fc 도메인 단량체,
ii) 제2 Fc 도메인 단량체, 및
iii) 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커를 포함하는, 제1 폴리펩티드;
b) 제3 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제2 폴리펩티드;
c) 제4 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드;
d) 제1 폴리펩티드에 연결된 제1 항원 결합 도메인; 및
e) 제2 폴리펩티드 및/또는 제3 폴리펩티드에 연결된 제2 항원 결합 도메인을 포함하되,
제1 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성하며, 제1 및 제2 항원 결합 도메인은 상이한 항원에 결합하고, Fc-항원 결합 도메인 작제물은 단일 Fc 도메인 및 항원 결합 도메인을 갖는 작제물에 의해 나타나지 않는 생물학적 활성을 포함하는, Fc-항원 결합 도메인 작제물. - Fc-항원 결합 도메인 작제물로서,
a)
i) 제1 Fc 도메인 단량체,
ii) 제2 Fc 도메인 단량체, 및
iii) 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 스페이서를 포함하는, 제1 폴리펩티드;
b) 제3 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제2 폴리펩티드;
c) 제4 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드;
d) 제1 폴리펩티드에 연결된 제1 항원 결합 도메인; 및
e) 제2 폴리펩티드 및/또는 제3 폴리펩티드에 연결된 제2 항원 결합 도메인을 포함하되,
제1 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성하며, 제1 및 제2 항원 결합 도메인은 상이한 항원과 결합하는, Fc-항원 결합 도메인 작제물. - Fc-항원 결합 도메인 작제물의 집단을 포함하는 세포 배양 배지로서, 몰 기준으로 상기 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 적어도 50%는
a)
i) 제1 Fc 도메인 단량체,
ii) 제2 Fc 도메인 단량체, 및
iii) 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커를 포함하는, 제1 폴리펩티드;
b) 제3 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제2 폴리펩티드;
c) 제4 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드;
d) 제1 폴리펩티드에 연결된 제1 항원 결합 도메인; 및
e) 제2 폴리펩티드 및/또는 제3 폴리펩티드에 연결된 제2 항원 결합 도메인을 포함하되,
제1 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성하며, 제1 및 제2 항원 결합 도메인은 상이한 항원과 결합하는, 세포 배양 배지. - Fc-항원 결합 도메인 작제물의 제조 방법으로서, 상기 방법은:
a) 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 상기 숙주 세포는
(1)
i) 제1 Fc 도메인 단량체,
ii) 제2 Fc 도메인 단량체, 및
iii) 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커를 포함하는, 제1 폴리펩티드;
(2) 제3 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제2 폴리펩티드; (3) 제4 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드; (4) 제1 폴리펩티드에 연결되는 제1 항원 결합 도메인; 및 (5) 제2 폴리펩티드 및/또는 제3 폴리펩티드에 연결되는 제2 항원 결합 도메인을 발현하되, 제1 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성하고, 항원 결합 도메인은 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 또는 제3 폴리펩티드와 연결되어 Fc-항원 결합 도메인 작제물을 형성하며, 제1 및 제2 항원 결합 도메인은 상이한 항원과 결합하고, 몰 기준으로 세포 배양 상청액 중 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 적어도 50%는 구조적으로 동일한, 단계, 및
b) 세포 배양 상청액으로부터 Fc-항원 결합 도메인 작제물을 정제하는 단계를 포함하는, 방법. - 제288항, 제289항, 제290항, 제291항, 또는 제292항에 있어서, 제1 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체는 제1 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체 사이의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함하고, 제2 Fc 도메인 단량체 및 제4 Fc 도메인 단량체는 제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체 사이의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함하며, 제2 폴리펩티드 및 제3 폴리펩티드는 상이한 아미노산 서열을 갖는, Fc-항원 결합 도메인 작제물.
- Fc-항원 결합 도메인 작제물로서,
a)
i) 제1 Fc 도메인 단량체,
ii) 제2 Fc 도메인 단량체, 및
iii) 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커를 포함하는, 제1 폴리펩티드;
b) 제3 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제2 폴리펩티드;
c) 제4 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드;
d) 제1 폴리펩티드에 연결된 제1 항원 결합 도메인;
e) 제2 폴리펩티드에 연결된 제2 항원 결합 도메인; 및
f) 제3 폴리펩티드에 연결된 제3 항원 결합 도메인을 포함하되,
제1 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성하며, 제1, 제2 및 제3 항원 결합 도메인은 상이한 항원과 결합하고, Fc-항원 결합 도메인 작제물은 단일 Fc 도메인 및 항원 결합 도메인을 갖는 작제물에 비해 항체 의존성 세포독성(ADCC) 검정, 항체 의존성 세포 식균작용(ADCP) 및/또는 보체 의존성 세포독성(CDC) 검정에서 강화된 효과기 기능을 갖는, Fc-항원 결합 도메인 작제물. - Fc-항원 결합 도메인 작제물로서,
a)
i) 제1 Fc 도메인 단량체,
ii) 제2 Fc 도메인 단량체, 및
iii) 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커를 포함하는, 제1 폴리펩티드;
b) 제3 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제2 폴리펩티드;
c) 제4 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드;
d) 제1 폴리펩티드에 연결된 제1 항원 결합 도메인;
e) 제2 폴리펩티드에 연결된 제2 항원 결합 도메인; 및
f) 제3 폴리펩티드에 연결된 제3 항원 결합 도메인을 포함하되,
제1 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성하며, 제1, 제2 및 제3 항원 결합 도메인은 상이한 항원과 결합하고, Fc-항원 결합 도메인 작제물은 단일 Fc 도메인 및 항원 결합 도메인을 갖는 작제물에 의해 나타나지 않는 생물학적 활성을 포함하는, Fc-항원 결합 도메인 작제물. - Fc-항원 결합 도메인 작제물로서,
a)
i) 제1 Fc 도메인 단량체,
ii) 제2 Fc 도메인 단량체, 및
iii) 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 스페이서를 포함하는, 제1 폴리펩티드;
b) 제3 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제2 폴리펩티드;
c) 제4 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드;
d) 제1 폴리펩티드에 연결된 제1 항원 결합 도메인;
e) 제2 폴리펩티드에 연결된 제2 항원 결합 도메인; 및
f) 제3 폴리펩티드에 연결된 제3 항원 결합 도메인을 포함하되,
제1 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성하며, 제1, 제2 및 제3 항원 결합 도메인은 상이한 항원과 결합하는, Fc-항원 결합 도메인 작제물. - Fc-항원 결합 도메인 작제물의 집단을 포함하는 세포 배양 배지로서, 몰 기준으로 상기 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 적어도 50%는
a)
i) 제1 Fc 도메인 단량체,
ii) 제2 Fc 도메인 단량체, 및
iii) 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커를 포함하는, 제1 폴리펩티드;
b) 제3 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제2 폴리펩티드;
c) 제4 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드;
d) 제1 폴리펩티드에 연결된 제1 항원 결합 도메인;
e) 제2 폴리펩티드에 연결된 제2 항원 결합 도메인; 및
f) 제3 폴리펩티드에 연결된 제3 항원 결합 도메인을 포함하되,
제1 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성하며, 제1, 제2 및 제3 항원 결합 도메인은 상이한 항원과 결합하는, 세포 배양 배지. - Fc-항원 결합 도메인 작제물의 제조 방법으로서, 상기 방법은:
a) 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 상기 숙주 세포는
(1)
i) 제1 Fc 도메인 단량체,
ii) 제2 Fc 도메인 단량체, 및
iii) 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커를 포함하는, 제1 폴리펩티드;
(2) 제3 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제2 폴리펩티드; (3) 제4 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드; (4) 제1 폴리펩티드에 연결되는 제1 항원 결합 도메인; (5) 제2 폴리펩티드 및/또는 제3 폴리펩티드에 연결되는 제2 항원 결합 도메인; 및 (6) 제3 폴리펩티드에 연결되는 제3 항원 결합 도메인을 발현하되, 제1 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성하고, 항원 결합 도메인은 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 또는 제3 폴리펩티드와 연결되어 Fc-항원 결합 도메인 작제물을 형성하며, 제1 및 제2 항원 결합 도메인은 상이한 항원과 결합하고, 몰 기준으로 세포 배양 상청액 중 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 적어도 50%는 구조적으로 동일한, 단계, 및
b) 세포 배양 상청액으로부터 Fc-항원 결합 도메인 작제물을 정제하는 단계를 포함하는, 방법. - 제294항, 제295항, 제296항, 제297항 또는 제298항에 있어서, 제1 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체는 제1 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체 사이의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함하고, 제2 Fc 도메인 단량체 및 제4 Fc 도메인 단량체는 제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체 사이의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함하며, 제2 폴리펩티드와 제3 폴리펩티드는 상이한 아미노산 서열을 갖는, 조성물.
- Fc-항원 결합 도메인 작제물로서,
a)
i) 제1 Fc 도메인 단량체,
ii) 제2 Fc 도메인 단량체, 및
iii) 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제1 링커를 포함하는, 제1 폴리펩티드;
b)
iv) 제3 Fc 도메인 단량체,
v) 제4 Fc 도메인 단량체, 및
vi) 제3 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제2 링커를 포함하는, 제2 폴리펩티드;
c) 제5 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드;
d) 제6 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제4 폴리펩티드; 및
e) 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 제3 폴리펩티드, 또는 제4 폴리펩티드에 연결되는 항원 결합 도메인을 포함하되,
제1 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제2 Fc 도메인 단량체와 제5 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성하며, 제4 Fc 도메인 단량체와 제6 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제3 Fc 도메인을 형성하고, Fc-항원 결합 도메인 작제물은 단일 Fc 도메인 및 항원 결합 도메인을 갖는 작제물에 비해 항체 의존성 세포독성(ADCC) 검정, 항체 의존성 세포 식균작용(ADCP) 및/또는 보체 의존성 세포독성(CDC) 검정에서 강화된 효과기 기능을 갖는, Fc-항원 결합 도메인 작제물. - Fc-항원 결합 도메인 작제물로서,
a)
i) 제1 Fc 도메인 단량체,
ii) 제2 Fc 도메인 단량체, 및
iii) 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제1 링커를 포함하는, 제1 폴리펩티드;
b)
iv) 제3 Fc 도메인 단량체,
v) 제4 Fc 도메인 단량체, 및
vi) 제3 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제2 링커를 포함하는, 제2 폴리펩티드;
c) 제5 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드;
d) 제6 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제4 폴리펩티드; 및
e) 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 제3 폴리펩티드, 또는 제4 폴리펩티드에 연결되는 항원 결합 도메인을 포함하되,
제1 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제2 Fc 도메인 단량체와 제5 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성하며, 제4 Fc 도메인 단량체와 제6 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제3 Fc 도메인을 형성하고, Fc-항원 결합 도메인 작제물은 단일 Fc 도메인 및 항원 결합 도메인을 갖는 작제물에 의해 나타나지 않는 생물학적 활성을 포함하는, Fc-항원 결합 도메인 작제물. - Fc-항원 결합 도메인 작제물로서,
a)
i) 제1 Fc 도메인 단량체,
ii) 제2 Fc 도메인 단량체, 및
iii) 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제1 스페이서를 포함하는, 제1 폴리펩티드;
b)
iv) 제3 Fc 도메인 단량체,
v) 제4 Fc 도메인 단량체, 및
vi) 제3 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제2 스페이서를 포함하는, 제2 폴리펩티드;
c) 제5 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드;
d) 제6 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제4 폴리펩티드; 및
e) 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 제3 폴리펩티드, 또는 제4 폴리펩티드에 연결되는 항원 결합 도메인을 포함하되,
제1 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제2 Fc 도메인 단량체와 제5 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성하며, 제4 Fc 도메인 단량체와 제6 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제3 Fc 도메인을 형성하는, Fc-항원 결합 도메인 작제물. - Fc-항원 결합 도메인 작제물의 집단을 포함하는 세포 배양 배지로서, 몰 기준으로 상기 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 적어도 50%는
a)
i) 제1 Fc 도메인 단량체,
ii) 제2 Fc 도메인 단량체, 및
iii) 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제1 링커를 포함하는, 제1 폴리펩티드;
b)
iv) 제3 Fc 도메인 단량체,
v) 제4 Fc 도메인 단량체, 및
vi) 제3 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제2 링커를 포함하는, 제2 폴리펩티드;
c) 제5 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드;
d) 제6 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제4 폴리펩티드; 및
e) 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 제3 폴리펩티드, 또는 제4 폴리펩티드에 연결되는 항원 결합 도메인을 포함하되,
제1 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제2 Fc 도메인 단량체와 제5 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성하며, 제4 Fc 도메인 단량체와 제6 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제3 Fc 도메인을 형성하는, 세포 배양 배지. - Fc-항원 결합 도메인 작제물의 제조 방법으로서, 상기 방법은:
a) 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 상기 숙주 세포는
(1)
i) 제1 Fc 도메인 단량체,
ii) 제2 Fc 도메인 단량체, 및
iii) 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제1 링커를 포함하는, 제1 폴리펩티드;
(2)
iv) 제3 Fc 도메인 단량체,
v) 제4 Fc 도메인 단량체, 및
vi) 제3 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제2 링커를 포함하는, 제2 폴리펩티드;
(3) 제5 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드;
(4) 제6 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제4 폴리펩티드; 및
(5) 상기 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 제3 폴리펩티드, 또는 제4 폴리펩티드에 연결되는 항원 결합 도메인을 발현하되,
제1 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제2 Fc 도메인 단량체 및 제5 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성하고, 제4 Fc 도메인 단량체 및 제6 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제3 Fc 도메인을 형성하며, 몰 기준으로 세포 배양 상청액 중 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 적어도 50%는 구조적으로 동일한, 단계, 및
b) 세포 배양 상청액으로부터 Fc-항원 결합 도메인 작제물을 정제하는 단계를 포함하는, 방법. - 제300항, 제301항, 제302항, 제303항, 또는 제304항에 있어서, 제1 및 제3 Fc 도메인 단량체 각각은 제1 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체 사이의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함하고,
제2 및 제5 Fc 도메인 단량체 각각은 제2 Fc 도메인 단량체와 제5 Fc 도메인 단량체 사이의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함하며,
제4 및 제6 Fc 도메인 단량체 각각은 제4 Fc 도메인 단량체와 제6 Fc 도메인 단량체 사이의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함하는, Fc-항원 결합 도메인 작제물. - Fc-항원 결합 도메인 작제물로서,
a)
i) 제1 Fc 도메인 단량체,
ii) 제2 Fc 도메인 단량체, 및
iii) 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제1 링커를 포함하는, 제1 폴리펩티드;
b)
iv) 제3 Fc 도메인 단량체,
v) 제4 Fc 도메인 단량체, 및
vi) 제3 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제2 링커를 포함하는, 제2 폴리펩티드;
c) 제5 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드;
d) 제6 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제4 폴리펩티드; 및
e) 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 제3 폴리펩티드, 또는 제4 폴리펩티드에 연결되는 항원 결합 도메인을 포함하되,
제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제1 Fc 도메인 단량체와 제5 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성하며, 제3 Fc 도메인 단량체와 제6 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제3 Fc 도메인을 형성하고, Fc-항원 결합 도메인 작제물은 단일 Fc 도메인 및 항원 결합 도메인을 갖는 작제물에 비해 항체 의존성 세포독성(ADCC) 검정, 항체 의존성 세포 식균작용(ADCP) 및/또는 보체 의존성 세포독성(CDC) 검정에서 강화된 효과기 기능을 갖는, Fc-항원 결합 도메인 작제물. - Fc-항원 결합 도메인 작제물로서,
a)
i) 제1 Fc 도메인 단량체,
ii) 제2 Fc 도메인 단량체, 및
iii) 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제1 링커를 포함하는, 제1 폴리펩티드;
b)
iv) 제3 Fc 도메인 단량체,
v) 제4 Fc 도메인 단량체, 및
vi) 제3 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제2 링커를 포함하는, 제2 폴리펩티드;
c) 제5 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드;
d) 제6 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제4 폴리펩티드; 및
e) 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 제3 폴리펩티드, 또는 제4 폴리펩티드에 연결되는 항원 결합 도메인을 포함하되,
제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제1 Fc 도메인 단량체와 제5 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성하며, 제3 Fc 도메인 단량체와 제6 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제3 Fc 도메인을 형성하고, Fc-항원 결합 도메인 작제물은 단일 Fc 도메인 및 항원 결합 도메인을 갖는 작제물에 의해 나타나지 않는 생물학적 활성을 포함하는, Fc-항원 결합 도메인 작제물. - Fc-항원 결합 도메인 작제물로서,
a)
i) 제1 Fc 도메인 단량체,
ii) 제2 Fc 도메인 단량체, 및
iii) 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제1 스페이서를 포함하는, 제1 폴리펩티드;
b)
iv) 제3 Fc 도메인 단량체,
v) 제4 Fc 도메인 단량체, 및
vi) 제3 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제2 스페이서를 포함하는, 제2 폴리펩티드;
c) 제5 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드;
d) 제6 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제4 폴리펩티드; 및
e) 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 제3 폴리펩티드, 또는 제4 폴리펩티드에 연결되는 항원 결합 도메인을 포함하되,
제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제1 Fc 도메인 단량체와 제5 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성하며, 제3 Fc 도메인 단량체와 제6 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제3 Fc 도메인을 형성하는, Fc-항원 결합 도메인 작제물. - Fc-항원 결합 도메인 작제물의 집단을 포함하는 세포 배양 배지로서, 몰 기준으로 상기 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 적어도 50%는
a)
i) 제1 Fc 도메인 단량체,
ii) 제2 Fc 도메인 단량체, 및
iii) 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제1 링커를 포함하는, 제1 폴리펩티드;
b)
iv) 제3 Fc 도메인 단량체,
v) 제4 Fc 도메인 단량체, 및
vi) 제3 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제2 링커를 포함하는, 제2 폴리펩티드;
c) 제5 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드;
d) 제6 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제4 폴리펩티드; 및
e) 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 제3 폴리펩티드, 또는 제4 폴리펩티드에 연결되는 항원 결합 도메인을 포함하되,
제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제1 Fc 도메인 단량체와 제5 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성하며, 제3 Fc 도메인 단량체와 제6 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제3 Fc 도메인을 형성하는, 세포 배양 배지. - Fc-항원 결합 도메인 작제물의 제조 방법으로서, 상기 방법은:
a) 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 상기 숙주 세포는
(1)
i) 제1 Fc 도메인 단량체,
ii) 제2 Fc 도메인 단량체, 및
iii) 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제1 링커를 포함하는, 제1 폴리펩티드;
(2)
iv) 제3 Fc 도메인 단량체,
v) 제4 Fc 도메인 단량체, 및
vi) 제3 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제2 링커를 포함하는, 제2 폴리펩티드;
(3) 제5 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드;
(4) 제6 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제4 폴리펩티드; 및
(5) 상기 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 제3 폴리펩티드, 또는 제4 폴리펩티드에 연결되는 항원 결합 도메인을 발현하되,
제2 Fc 도메인 단량체 및 제4 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제1 Fc 도메인 단량체 및 제5 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성하고, 제3 Fc 도메인 단량체 및 제6 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제3 Fc 도메인을 형성하며, 몰 기준으로 세포 배양 상청액 중 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 적어도 50%는 구조적으로 동일한, 단계, 및
b) 세포 배양 상청액으로부터 Fc-항원 결합 도메인 작제물을 정제하는 단계를 포함하는, 방법. - 제306항, 제307항, 제308항, 제309항, 또는 제310항에 있어서, 제2 Fc 및 제4 Fc 도메인 단량체 각각은 제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체 사이의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함하고,
제1 및 제5 Fc 도메인 단량체 각각은 제1 Fc 도메인 단량체와 제5 Fc 도메인 단량체 사이의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함하며,
제3 및 제6 Fc 도메인 단량체 각각은 제3 Fc 도메인 단량체와 제6 Fc 도메인 단량체 사이의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함하는, Fc-항원 결합 도메인 작제물. - Fc-항원 결합 도메인 작제물로서,
a)
i) 제1 Fc 도메인 단량체,
ii) 제2 Fc 도메인 단량체,
iii) 제3 Fc 도메인 단량체,
iv) 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제1 링커, 및
v) 제2 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제2 링커를 포함하는, 제1 폴리펩티드;
b)
vii) 제4 Fc 도메인 단량체,
vii) 제5 Fc 도메인 단량체,
viii) 제6 Fc 도메인 단량체,
ix) 제4 Fc 도메인 단량체와 제5 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제3 링커, 및
x) 제5 Fc 도메인 단량체와 제6 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제4 링커를 포함하는, 제2 폴리펩티드;
c) 제7 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드;
d) 제8 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제4 폴리펩티드;
e) 제9 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제5 폴리펩티드;
f) 제10 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제6 폴리펩티드; 및
g) 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 제3 폴리펩티드, 제4 폴리펩티드, 제5 폴리펩티드, 또는 제6 폴리펩티드에 연결되는 항원 결합 도메인을 포함하되,
제2 Fc 도메인 단량체와 제5 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제1 Fc 도메인 단량체와 제7 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성하며, 제4 Fc 도메인 단량체와 제8 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제3 Fc 도메인을 형성하고, 제3 Fc 도메인 단량체와 제9 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제4 Fc 도메인을 형성하며, 제6 Fc 도메인 단량체와 제10 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제5 Fc 도메인을 형성하고, Fc-항원 결합 도메인 작제물은 단일 Fc 도메인 및 항원 결합 도메인을 갖는 작제물에 비해 항체 의존성 세포독성(ADCC) 검정, 항체 의존성 세포 식균작용(ADCP) 및/또는 보체 의존성 세포독성(CDC) 검정에서 강화된 효과기 기능을 갖는, Fc-항원 결합 도메인 작제물. - Fc-항원 결합 도메인 작제물로서,
a)
i) 제1 Fc 도메인 단량체,
ii) 제2 Fc 도메인 단량체,
iii) 제3 Fc 도메인 단량체,
iv) 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제1 링커, 및
v) 제2 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제2 링커를 포함하는, 제1 폴리펩티드;
b)
vi) 제4 Fc 도메인 단량체,
vii) 제5 Fc 도메인 단량체,
viii) 제6 Fc 도메인 단량체,
ix) 제4 Fc 도메인 단량체와 제5 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제3 링커, 및
x) 제5 Fc 도메인 단량체와 제6 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제4 링커를 포함하는, 제2 폴리펩티드;
c) 제7 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드;
d) 제8 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제4 폴리펩티드;
e) 제9 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제5 폴리펩티드;
f) 제10 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제6 폴리펩티드; 및
g) 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 제3 폴리펩티드, 제4 폴리펩티드, 제5 폴리펩티드, 또는 제6 폴리펩티드에 연결되는 항원 결합 도메인을 포함하되,
제2 Fc 도메인 단량체와 제5 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제1 Fc 도메인 단량체와 제7 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성하며, 제4 Fc 도메인 단량체와 제8 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제3 Fc 도메인을 형성하고, 제3 Fc 도메인 단량체와 제9 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제4 Fc 도메인을 형성하며, 제6 Fc 도메인 단량체와 제10 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제5 Fc 도메인을 형성하고, Fc-항원 결합 도메인 작제물은 단일 Fc 도메인 및 항원 결합 도메인을 갖는 작제물에 의해 나타나지 않는 생물학적 활성을 포함하는, Fc-항원 결합 도메인 작제물. - Fc-항원 결합 도메인 작제물로서,
a)
i) 제1 Fc 도메인 단량체,
ii) 제2 Fc 도메인 단량체,
iii) 제3 Fc 도메인 단량체,
iv) 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제1 스페이서, 및
v) 제2 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제2 스페이서를 포함하는, 제1 폴리펩티드;
b)
vi) 제4 Fc 도메인 단량체,
vii) 제5 Fc 도메인 단량체,
viii) 제6 Fc 도메인 단량체,
ix) 제4 Fc 도메인 단량체와 제5 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제3 스페이서, 및
x) 제5 Fc 도메인 단량체와 제6 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제4 스페이서를 포함하는, 제2 폴리펩티드;
c) 제7 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드;
d) 제8 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제4 폴리펩티드;
e) 제9 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제5 폴리펩티드;
f) 제10 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제6 폴리펩티드; 및
g) 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 제3 폴리펩티드, 제4 폴리펩티드, 제5 폴리펩티드, 또는 제6 폴리펩티드에 연결되는 항원 결합 도메인을 포함하되,
제2 Fc 도메인 단량체와 제5 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제1 Fc 도메인 단량체와 제7 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성하며, 제4 Fc 도메인 단량체와 제8 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제3 Fc 도메인을 형성하고, 제3 Fc 도메인 단량체와 제9 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제4 Fc 도메인을 형성하며, 제6 Fc 도메인 단량체와 제10 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제5 Fc 도메인을 형성하는, Fc-항원 결합 도메인 작제물. - Fc-항원 결합 도메인 작제물의 집단을 포함하는 세포 배양 배지로서, 몰 기준으로 상기 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 적어도 50%는
a)
i) 제1 Fc 도메인 단량체,
ii) 제2 Fc 도메인 단량체,
iii) 제3 Fc 도메인 단량체,
iv) 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제1 스페이서, 및
v) 제2 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제2 스페이서를 포함하는, 제1 폴리펩티드;
b)
vi) 제4 Fc 도메인 단량체,
vii) 제5 Fc 도메인 단량체,
viii) 제6 Fc 도메인 단량체,
ix) 제4 Fc 도메인 단량체와 제5 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제3 스페이서, 및
x) 제5 Fc 도메인 단량체와 제6 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제4 스페이서를 포함하는, 제2 폴리펩티드;
c) 제7 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드;
d) 제8 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제4 폴리펩티드;
e) 제9 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제5 폴리펩티드;
f) 제10 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제6 폴리펩티드; 및
g) 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 제3 폴리펩티드, 제4 폴리펩티드, 제5 폴리펩티드, 또는 제6 폴리펩티드에 연결되는 항원 결합 도메인을 포함하되,
제2 Fc 도메인 단량체와 제5 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제1 Fc 도메인 단량체와 제7 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성하며, 제4 Fc 도메인 단량체와 제8 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제3 Fc 도메인을 형성하고, 제3 Fc 도메인 단량체와 제9 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제4 Fc 도메인을 형성하며, 제6 Fc 도메인 단량체와 제10 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제5 Fc 도메인을 형성하는, 세포 배양 배지. - Fc-항원 결합 도메인 작제물의 제조 방법으로서, 상기 방법은:
a) 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 상기 숙주 세포는
(1)
i) 제1 Fc 도메인 단량체,
ii) 제2 Fc 도메인 단량체,
iii) 제3 Fc 도메인 단량체,
iv) 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제1 스페이서, 및
v) 제2 Fc 도메인 단량체와 제3 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제2 스페이서를 포함하는, 제1 폴리펩티드;
(2)
vi) 제4 Fc 도메인 단량체,
vii) 제5 Fc 도메인 단량체,
viii) 제6 Fc 도메인 단량체,
ix) 제4 Fc 도메인 단량체와 제5 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제3 스페이서, 및
x) 제5 Fc 도메인 단량체와 제6 Fc 도메인 단량체를 연결하는 제4 스페이서를 포함하는, 제2 폴리펩티드;
(3) 제7 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드;
(4) 제8 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제4 폴리펩티드;
(5) 제9 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제5 폴리펩티드;
(6) 제10 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제6 폴리펩티드; 및
(7) 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 제3 폴리펩티드, 제4 폴리펩티드, 제5 폴리펩티드 또는 제6 폴리펩티드에 연결되는 항원 결합 도메인을 발현하되,
제2 Fc 도메인 단량체와 제5 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제1 Fc 도메인 단량체와 제7 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성하며, 제4 Fc 도메인 단량체와 제8 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제3 Fc 도메인을 형성하고, 제3 Fc 도메인 단량체와 제9 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제4 Fc 도메인을 형성하며, 제6 Fc 도메인 단량체와 제10 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제5 Fc 도메인을 형성하고, 몰 기준으로 세포 배양 상청액 중 Fc-항원 결합 도메인 작제물의 적어도 50%는 구조적으로 동일한, 단계, 및
b) 세포 배양 상청액으로부터 Fc-항원 결합 도메인 작제물을 정제하는 단계를 포함하는, 방법. - 제312항, 제313항, 제314항, 제315항, 또는 제316항에 있어서, 제2 및 제5 Fc 도메인 단량체 각각은 제2 Fc 도메인 단량체와 제5 Fc 도메인 단량체 사이의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함하고,
제1 및 제7 Fc 도메인 단량체 각각은 제1 Fc 도메인 단량체와 제7 Fc 도메인 단량체 사이의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함하고,
제4 및 제8 Fc 도메인 단량체 각각은 제4 Fc 도메인 단량체와 제8 Fc 도메인 단량체 사이의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함하고,
제3 및 제9 Fc 도메인 단량체 각각은 제3 Fc 도메인 단량체와 제9 Fc 도메인 단량체 사이의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함하며,
제6 및 제10 Fc 도메인 단량체 각각은 제6 Fc 도메인 단량체와 제10 Fc 도메인 단량체 사이의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함하는, Fc-항원 결합 도메인 작제물. - 제1항 내지 제317항 중 어느 한 항의 작제물을 포함하는 조성물로서, 조성물 중 글리칸의 적어도 5%, 10, 15%, 20%, 30%, 또는 40%는 푸코스 잔기가 없는, 조성물.
- Fc-항원 결합 도메인 작제물로서,
a)
i) 제1 Fc 도메인 단량체,
ii) 제2 Fc 도메인 단량체,
iii) 제1 중쇄 결합 도메인, 및
iv) 제1 및 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커를 포함하는, 제1 폴리펩티드;
b)
i) 제3 Fc 도메인 단량체,
ii) 제4 Fc 도메인 단량체
iii) 제2 중쇄 결합 도메인, 및
iv) 제3 및 제4 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커를 포함하는, 제2 폴리펩티드;
c) 제5 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드;
d) 제6 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제4 폴리펩티드;
e) 제1 경쇄 결합 도메인을 포함하는 제5 폴리펩티드; 및
f) 제2 경쇄 결합 도메인을 포함하는 제 6폴리펩티드;
제1 및 제3 Fc 도메인 단량체는 함께 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제2 및 제4 Fc 도메인 단량체는 함께 제2 Fc 도메인을 형성하고, 제4 및 제6 Fc 도메인 단량체는 함께 제3 Fc 도메인을 형성하고, 제1 중쇄 결합 도메인과 제1 경쇄 결합 도메인은 함께 제1 Fab를 형성하며, 제2 중쇄 결합 도메인과 제2 경쇄 결합 도메인은 함께 제2 Fab를 형성하는, Fc-항원 결합 도메인 작제물. - 제319항에 있어서, 제1 및 제2 폴리펩티드는 서열이 동일한, Fc 항원 도메인 작제물.
- 제319항에 있어서, 제3 및 제4 폴리펩티드는 서열이 동일한, Fc 항원 도메인 작제물.
- 제319항에 있어서, 제5 및 제6 폴리펩티드는 서열이 동일한, Fc 항원 도메인 작제물.
- 제319항에 있어서, 제1 및 제2 폴리펩티드는 서열이 동일하고, 제3 및 제4 폴리펩티드는 서열이 동일하며, 제5 및 제6 폴리펩티드는 서열이 동일한, Fc 항원 도메인 작제물.
- 제319항 내지 제323항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 도메인 단량체 각각의 CH3 도메인은 최대 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하는, Fc 항원 도메인 작제물.
- 제319항 내지 제323항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 도메인 단량체 각각의 CH3 도메인은 인간 IgG1의 아미노산 서열과 비교하여, 최대 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하는, Fc 항원 도메인 작제물.
- 제319항 내지 제323항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 도메인 단량체 각각은 독립적으로, 최대 10, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 42, 43, 45 및 47 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는, Fc 항원 도메인 작제물.
- 제324항 내지 제326항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 아미노산 치환은 CH3 도메인에만 있는, Fc 항원 도메인 단량체.
- 제319항 내지 제323항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제3 Fc 도메인 단량체는 제1 및 제3 Fc 도메인 단량체 사이의 동종이량체화를 촉진하는 최대 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하는, Fc 항원 도메인 작제물.
- 제319항 내지 제323항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 및 제5 Fc 도메인 단량체는 제2 및 제5 Fc 도메인 단량체 사이의 이종이량체화를 촉진하는 최대 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하며, 제4 및 제6 Fc 도메인 단량체는 제4 및 제6 Fc 도메인 단량체 사이의 이종이량체화를 촉진하는 최대 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하는, Fc 항원 도메인 작제물.
- 제328항에 있어서, 동종이량체화를 촉진하는 치환은 표 4a 및 4b의 치환으로부터 선택되는, Fc 항원 도메인 작제물.
- 제329항에 있어서, 이종이량체화를 촉진하는 치환은 표 3의 치환으로부터 선택되는, Fc 항원 도메인 작제물.
- Fc-항원 결합 도메인 작제물로서,
a)
i) 제1 Fc 도메인 단량체,
ii) 제2 Fc 도메인 단량체,
iii) 제1 중쇄 결합 도메인, 및
iv) 제1 및 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커를 포함하는, 제1 폴리펩티드;
b)
i) 제3 Fc 도메인 단량체,
ii) 제4 Fc 도메인 단량체
iii) 제2 중쇄 결합 도메인, 및
iv) 제3 및 제4 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커를 포함하는, 제2 폴리펩티드;
c) 제5 Fc 도메인 단량체와 제1 경쇄 결합 도메인을 포함하는 제3 폴리펩티드; 및
d) 제6 Fc 도메인 단량체와 제2 경쇄 결합 도메인을 포함하는 제4 폴리펩티드를 포함하되,
제1 및 제3 Fc 도메인 단량체는 함께 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제2 및 제4 Fc 도메인 단량체는 함께 제2 Fc 도메인을 형성하고, 제4 및 제6 Fc 도메인 단량체는 함께 제3 Fc 도메인을 형성하고, 제1 중쇄 결합 도메인과 제1 경쇄 결합 도메인은 함께 제1 Fab를 형성하며, 제2 중쇄 결합 도메인과 제2 경쇄 결합 도메인은 함께 제2 Fab를 형성하는, Fc-항원 결합 도메인 작제물. - Fc-항원 결합 도메인 작제물로서,
a)
i) 제1 Fc 도메인 단량체,
ii) 제2 Fc 도메인 단량체,
iii) 제1 중쇄 결합 도메인, 및
iv) 제1 및 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커를 포함하는, 제1 폴리펩티드;
b)
i) 제3 Fc 도메인 단량체,
ii) 제4 Fc 도메인 단량체
iii) 제2 중쇄 결합 도메인, 및
iv) 제3 및 제4 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커를 포함하는, 제2 폴리펩티드;
c) 제5 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드;
d) 제6 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제4 폴리펩티드;
e) 제1 경쇄 결합 도메인을 포함하는 제5 폴리펩티드; 및
f) 제2 경쇄 결합 도메인을 포함하는 제 6폴리펩티드를 포함하되,
제1 및 제5 Fc 도메인 단량체는 함께 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제3 및 제6 Fc 도메인 단량체는 함께 제2 Fc 도메인을 형성하며, 제2 및 제4 Fc 단량체는 함께 제3 Fc 도메인을 형성하고, 제1 중쇄 결합 도메인과 제1 경쇄 결합 도메인은 함께 제1 Fab를 형성하며, 제2 중쇄 결합 도메인과 제2 경쇄 결합 도메인은 함께 제2 Fab를 형성하는, Fc-항원 결합 도메인 작제물. - 제333항에 있어서, 제1 및 제2 폴리펩티드는 서열이 동일한, Fc 항원 도메인 작제물.
- 제333항에 있어서, 제3 및 제4 폴리펩티드는 서열이 동일한, Fc 항원 도메인 작제물.
- 제333항에 있어서, 제5 및 제6 폴리펩티드는 서열이 동일한, Fc 항원 도메인 작제물.
- 제333항에 있어서, 제1 및 제2 폴리펩티드는 서열이 동일하고, 제3 및 제4 폴리펩티드는 서열이 동일하며, 제5 및 제6 폴리펩티드는 서열이 동일한, Fc 항원 도메인 작제물.
- 제333항 내지 제337항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 도메인 단량체 각각의 CH3 도메인은 최대 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하는, Fc 항원 도메인 작제물.
- 제333항 내지 제337항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 도메인 단량체 각각의 CH3 도메인은 인간 IgG1의 아미노산 서열과 비교하여, 최대 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하는, Fc 항원 도메인 작제물.
- 제333항 내지 제337항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 도메인 단량체 각각은 독립적으로, 최대 10, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 42, 43, 45 및 47 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는, Fc 항원 도메인 작제물.
- 제333항 내지 제337항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 아미노산 치환은 CH3 도메인에만 있는, Fc 항원 도메인 단량체.
- 제333항 내지 제337항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 및 제4 Fc 도메인 단량체는 제2 및 제4 Fc 도메인 단량체 사이의 동종이량체화를 촉진하는 최대 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하는, Fc 항원 도메인 작제물.
- 제333항 내지 제337항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제5 Fc 도메인 단량체는 제1 및 제5 Fc 도메인 단량체 사이의 이종이량체화를 촉진하는 최대 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하며, 제3 및 제6 Fc 도메인 단량체는 제4 및 제6 Fc 도메인 단량체 사이의 이종이량체화를 촉진하는 최대 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하는, Fc 항원 도메인 작제물.
- 제342항에 있어서, 동종이량체화를 촉진하는 치환은 표 4a 및 4b의 치환으로부터 선택되는, Fc 항원 도메인 작제물.
- 제343항에 있어서, 이종이량체화를 촉진하는 치환은 표 3의 치환으로부터 선택되는, Fc 항원 도메인 작제물.
- Fc-항원 결합 도메인 작제물로서,
a)
i) 제1 Fc 도메인 단량체,
ii) 제2 Fc 도메인 단량체,
iii) 제3 Fc 도메인 단량체,
iv) 제1 중쇄 결합 도메인,
v) 제1 및 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커, 및
vi) 제2 및 제3 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커를 포함하는, 제1 폴리펩티드;
b)
i) 제4 Fc 도메인 단량체,
ii) 제5 Fc 도메인 단량체,
iii) 제6 Fc 도메인 단량체,
iv) 제2 중쇄 결합 도메인,
v) 제4 및 제5 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커, 및
vi) 제5 및 제6 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커를 포함하는, 제2 폴리펩티드;
c) 제7 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드;
d) 제8 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제4 폴리펩티드;
e) 제9 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제5 폴리펩티드;
f) 제10 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제6 폴리펩티드;
g) 제1 경쇄 결합 도메인을 포함하는 제7 폴리펩티드; 및
h) 제2 경쇄 결합 도메인을 포함하는 제8 폴리펩티드를 포함하되,
제1 및 제7 Fc 도메인 단량체는 함께 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제4 및 제8 Fc 도메인 단량체는 함께 제2 Fc 도메인을 형성하며, 제2 및 제5 Fc 단량체는 함께 제3 Fc 도메인을 형성하고, 제3 및 제9 Fc 도메인 단량체는 함께 제4 Fc 도메인을 형성하며, 제6 및 제10 Fc 단량체는 함께 제5 Fc 도메인을 형성하고, 제1 중쇄 결합 도메인 및 제1 경쇄 결합 도메인은 함께 제1 Fab를 형성하며, 제2 중쇄 결합 도메인 및 제2 경쇄 결합 도메인은 함께 제2 Fab를 형성하는, Fc-항원 결합 도메인 작제물. - 제346항에 있어서, 제1 및 제2 폴리펩티드는 서열이 동일한, Fc 항원 도메인 작제물.
- 제346항에 있어서, 제3 및 제4 폴리펩티드는 서열이 동일한, Fc 항원 도메인 작제물.
- 제346항에 있어서, 제5 및 제6 폴리펩티드는 서열이 동일한, Fc 항원 도메인 작제물.
- 제346항에 있어서, 제7 및 제8 폴리펩티드는 서열이 동일한, Fc 항원 도메인 작제물.
- 제346항에 있어서, 제1 및 제2 폴리펩티드는 서열이 동일하고, 제3 및 제4 폴리펩티드는 서열이 동일하며, 제5 및 제6 폴리펩티드는 서열이 동일하고, 제7 및 제8 폴리펩티드는 서열이 동일한, Fc 항원 도메인 작제물.
- 제346항 내지 제351항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 도메인 단량체 각각의 CH3 도메인은 최대 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하는, Fc 항원 도메인 작제물.
- 제346항 내지 제351항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 도메인 단량체 각각의 CH3 도메인은 인간 IgG1의 아미노산 서열과 비교하여, 최대 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하는, Fc 항원 도메인 작제물.
- 제346항 내지 제351항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 도메인 단량체 각각은 독립적으로, 최대 10, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 42, 43, 45 및 47 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는, Fc 항원 도메인 작제물.
- 제346항 내지 제351항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 아미노산 치환은 CH3 도메인에만 있는, Fc 항원 도메인 단량체.
- 제346항 내지 제351항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 및 제5 Fc 도메인 단량체는 제2 및 제4 Fc 도메인 단량체 사이의 동종이량체화를 촉진하는 최대 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하는, Fc 항원 도메인 작제물.
- 제346항 내지 제351항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제7 Fc 도메인 단량체는 제1 및 제7 Fc 도메인 단량체 사이의 이종이량체화를 촉진하는 최대 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하고, 제4 및 제8 Fc 도메인 단량체는 제4 및 제8 Fc 도메인 단량체 사이의 이종이량체화를 촉진하는 최대 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하며, 제3 및 제9 Fc 도메인 단량체는 제3 및 제9 Fc 도메인 단량체 사이의 이종이량체화를 촉진하는 최대 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하고, 제6 및 제10 Fc 도메인 단량체는 제6 및 제10 Fc 도메인 단량체 사이의 이종이량체화를 촉진하는 최대 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하는, Fc 항원 도메인 작제물.
- 제357항에 있어서, 동종이량체화를 촉진하는 치환은 표 4a 및 4b의 치환으로부터 선택되는, Fc 항원 도메인 작제물.
- 제358항에 있어서, 이종이량체화를 촉진하는 치환은 표 3의 치환으로부터 선택되는, Fc 항원 도메인 작제물.
- Fc-항원 결합 도메인 작제물로서,
a)
i) 제1 Fc 도메인 단량체,
ii) 제2 Fc 도메인 단량체,
iii) 제3 Fc 도메인 단량체,
iv) 제1 중쇄 결합 도메인,
v) 제1 및 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커, 및
vi) 제2 및 제3 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커를 포함하는, 제1 폴리펩티드;
b)
i) 제4 Fc 도메인 단량체,
ii) 제5 Fc 도메인 단량체,
iii) 제6 Fc 도메인 단량체,
iv) 제2 중쇄 결합 도메인,
v) 제4 및 제5 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커, 및
vi) 제5 및 제6 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커를 포함하는, 제2 폴리펩티드;
c) 제7 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드;
d) 제8 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제4 폴리펩티드;
e) 제9 Fc 도메인 단량체 및 제1 경쇄 결합 도메인을 포함하는 제5 폴리펩티드; 및
f) 제10 Fc 도메인 단량체 및 제2 경쇄 결합 도메인을 포함하는 제6 폴리펩티드를 포함하되,
제1 및 제7 Fc 도메인 단량체는 함께 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제4 및 제8 Fc 도메인 단량체는 함께 제2 Fc 도메인을 형성하며, 제2 및 제5 Fc 단량체는 함께 제3 Fc 도메인을 형성하고, 제3 및 제9 Fc 도메인 단량체는 함께 제4 Fc 도메인을 형성하며, 제6 및 제10 Fc 단량체는 함께 제5 Fc 도메인을 형성하고, 제1 중쇄 결합 도메인 및 제1 경쇄 결합 도메인은 함께 제1 Fab를 형성하며, 제2 중쇄 결합 도메인 및 제2 경쇄 결합 도메인은 함께 제2 Fab를 형성하는, Fc-항원 결합 도메인 작제물. - Fc-항원 결합 도메인 작제물로서,
a)
i) 제1 Fc 도메인 단량체,
ii) 제2 Fc 도메인 단량체,
iii) 제3 Fc 도메인 단량체,
iv) 제1 중쇄 결합 도메인,
v) 제1 및 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커, 및
vi) 제2 및 제3 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커를 포함하는, 제1 폴리펩티드;
b)
i) 제4 Fc 도메인 단량체,
ii) 제5 Fc 도메인 단량체,
iii) 제6 Fc 도메인 단량체,
iv) 제2 중쇄 결합 도메인,
v) 제4 및 제5 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커, 및
vi) 제5 및 제6 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커를 포함하는, 제2 폴리펩티드;
c) 제7 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드;
d) 제8 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제4 폴리펩티드;
e) 제9 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제5 폴리펩티드;
f) 제10 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제6 폴리펩티드;
g) 제1 경쇄 결합 도메인을 포함하는 제7 폴리펩티드; 및
h) 제2 경쇄 결합 도메인을 포함하는 제8 폴리펩티드를 포함하되,
제1 및 제4 Fc 도메인 단량체는 함께 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제2 및 제7 Fc 도메인 단량체는 함께 제2 Fc 도메인을 형성하며, 제5 및 제8 Fc 단량체는 함께 제3 Fc 도메인을 형성하고, 제3 및 제9 Fc 도메인 단량체는 함께 제4 Fc 도메인을 형성하며, 제6 및 제10 Fc 단량체는 함께 제5 Fc 도메인을 형성하고, 제1 중쇄 결합 도메인 및 제1 경쇄 결합 도메인은 함께 제1 Fab를 형성하며; 제2 중쇄 결합 도메인 및 제2 경쇄 결합 도메인은 함께 제2 Fab를 형성하는, Fc-항원 결합 도메인 작제물. - 제361항에 있어서, 제1 및 제2 폴리펩티드는 서열이 동일한, Fc 항원 도메인 작제물.
- 제361항에 있어서, 제3 및 제4 폴리펩티드는 서열이 동일한, Fc 항원 도메인 작제물.
- 제361항에 있어서, 제5 및 제6 폴리펩티드는 서열이 동일한, Fc 항원 도메인 작제물.
- 제361항에 있어서, 제7 및 제8 폴리펩티드는 서열이 동일한, Fc 항원 도메인 작제물.
- 제361항에 있어서, 제1 및 제2 폴리펩티드는 서열이 동일하고, 제3 및 제4 폴리펩티드는 서열이 동일하며, 제5 및 제6 폴리펩티드는 서열이 동일하고, 제7 및 제8 폴리펩티드는 서열이 동일한, Fc 항원 도메인 작제물.
- 제361항 내지 제366항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 도메인 단량체 각각의 CH3 도메인은 최대 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하는, Fc 항원 도메인 작제물.
- 제361항 내지 제366항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 도메인 단량체 각각의 CH3 도메인은 인간 IgG1의 아미노산 서열과 비교하여, 최대 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하는, Fc 항원 도메인 작제물.
- 제361항 내지 제366항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 도메인 단량체 각각은 독립적으로, 최대 10, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 42, 43, 45 및 47 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는, Fc 항원 도메인 작제물.
- 제361항 내지 제366항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 아미노산 치환은 CH3 도메인에만 있는, Fc 항원 도메인 단량체.
- 제361항 내지 제366항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제4 Fc 도메인 단량체는 제1 및 제4 Fc 도메인 단량체 사이의 동종이량체화를 촉진하는 최대 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하는, Fc 항원 도메인 작제물.
- 제361항 내지 제366항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 및 제7 Fc 도메인 단량체는 제2 및 제7 Fc 도메인 단량체 사이의 이종이량체화를 촉진하는 최대 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하고, 제5 및 제8 Fc 도메인 단량체는 제5 및 제8 Fc 도메인 단량체 사이의 이종이량체화를 촉진하는 최대 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하며, 제3 및 제9 Fc 도메인 단량체는 제3 및 제9 Fc 도메인 단량체 사이의 이종이량체화를 촉진하는 최대 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하고, 제6 및 제10 Fc 도메인 단량체는 제6 및 제10 Fc 도메인 단량체 사이의 이종이량체화를 촉진하는 최대 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하는, Fc 항원 도메인 작제물.
- 제371항에 있어서, 동종이량체화를 촉진하는 치환은 표 4a 및 4b의 치환으로부터 선택되는, Fc 항원 도메인 작제물.
- 제372항에 있어서, 이종이량체화를 촉진하는 치환은 표 3의 치환으로부터 선택되는, Fc 항원 도메인 작제물.
- Fc-항원 결합 도메인 작제물로서,
a)
i) 제1 Fc 도메인 단량체,
ii) 제2 Fc 도메인 단량체,
iii) 제3 Fc 도메인 단량체,
iv) 제1 중쇄 결합 도메인,
v) 제1 및 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커, 및
vi) 제2 및 제3 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커를 포함하는, 제1 폴리펩티드;
b)
i) 제4 Fc 도메인 단량체,
ii) 제5 Fc 도메인 단량체,
iii) 제6 Fc 도메인 단량체,
iv) 제2 중쇄 결합 도메인,
v) 제4 및 제5 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커, 및
vi) 제5 및 제6 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커를 포함하는, 제2 폴리펩티드;
c) 제7 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드;
d) 제8 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제4 폴리펩티드;
e) 제9 Fc 도메인 단량체 및 제1 경쇄 결합 도메인을 포함하는 제5 폴리펩티드;
f) 제10 Fc 도메인 단량체 및 제2 경쇄 결합 도메인을 포함하는 제6 폴리펩티드를 포함하되,
제1 및 제4 Fc 도메인 단량체는 함께 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제2 및 제7 Fc 도메인 단량체는 함께 제2 Fc 도메인을 형성하며, 제5 및 제8 Fc 단량체는 함께 제3 Fc 도메인을 형성하고, 제3 및 제9 Fc 도메인 단량체는 함께 제4 Fc 도메인을 형성하며, 제6 및 제10 Fc 단량체는 함께 제5 Fc 도메인을 형성하고, 제1 중쇄 결합 도메인 및 제1 경쇄 결합 도메인은 함께 제1 Fab를 형성하며; 제2 중쇄 결합 도메인 및 제2 경쇄 결합 도메인은 함께 제2 Fab를 형성하는, Fc-항원 결합 도메인 작제물. - Fc-항원 결합 도메인 작제물로서,
a)
i) 제1 Fc 도메인 단량체,
ii) 제2 Fc 도메인 단량체,
iii) 제1 및 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커를 포함하는, 제1 폴리펩티드;
b)
i) 제3 Fc 도메인 단량체,
ii) 제4 Fc 도메인 단량체
iii) 제3 및 제4 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커를 포함하는, 제2 폴리펩티드;
c) 제5 Fc 도메인 단량체 및 제1 중쇄 결합 도메인을 포함하는 제3 폴리펩티드;
d) 제6 Fc 도메인 단량체 및 제2 중쇄 결합 도메인을 포함하는 제4 폴리펩티드;
e) 제1 경쇄 결합 도메인을 포함하는 제5 폴리펩티드; 및
f) 제2 경쇄 결합 도메인을 포함하는 제 6폴리펩티드를 포함하되,
제1 및 제5 Fc 도메인 단량체는 함께 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제3 및 제6 Fc 도메인 단량체는 함께 제2 Fc 도메인을 형성하며, 제2 및 제4 Fc 도메인 단량체는 함께 제3 Fc 도메인을 형성하고, 제1 중쇄 결합 도메인과 제1 경쇄 결합 도메인은 함께 제1 Fab를 형성하며, 제2 중쇄 결합 도메인과 제2 경쇄 결합 도메인은 함께 제2 Fab를 형성하는, Fc-항원 결합 도메인 작제물. - 제202항에 있어서, 제1 및 제2 폴리펩티드는 서열이 동일한, Fc 항원 도메인 작제물.
- 제202항에 있어서, 제3 및 제4 폴리펩티드는 서열이 동일한, Fc 항원 도메인 작제물.
- 제202항에 있어서, 제5 및 제6 폴리펩티드는 서열이 동일한, Fc 항원 도메인 작제물.
- 제202항에 있어서, 제1 및 제2 폴리펩티드는 서열이 동일하고, 제3 및 제4 폴리펩티드는 서열이 동일하며, 제5 및 제6 폴리펩티드는 서열이 동일한, Fc 항원 도메인 작제물.
- 제376항 내지 제380항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 도메인 단량체 각각의 CH3 도메인은 최대 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하는, Fc 항원 도메인 작제물.
- 제376항 내지 제380항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 도메인 단량체 각각의 CH3 도메인은 인간 IgG1의 아미노산 서열과 비교하여, 최대 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하는, Fc 항원 도메인 작제물.
- 제376항 내지 제380항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 도메인 단량체 각각은 독립적으로, 최대 10, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 42, 43, 45 및 47 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는, Fc 항원 도메인 작제물.
- 제376항 내지 제380항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 아미노산 치환은 CH3 도메인에만 있는, Fc 항원 도메인 단량체.
- 제376항 내지 제380항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 및 제4 Fc 도메인 단량체는 제2 및 제4 Fc 도메인 단량체 사이의 동종이량체화를 촉진하는 최대 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하는, Fc 항원 도메인 작제물.
- 제376항 내지 제380항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제5 Fc 도메인 단량체는 제1 및 제5 Fc 도메인 단량체 사이의 이종이량체화를 촉진하는 최대 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하며, 제3 및 제6 Fc 도메인 단량체는 제3 및 제6 Fc 도메인 단량체 사이의 이종이량체화를 촉진하는 최대 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하는, Fc 항원 도메인 작제물.
- 제385항에 있어서, 동종이량체화를 촉진하는 치환은 표 4a 및 4b의 치환으로부터 선택되는, Fc 항원 도메인 작제물.
- 제386항에 있어서, 이종이량체화를 촉진하는 치환은 표 3의 치환으로부터 선택되는, Fc 항원 도메인 작제물.
- Fc-항원 결합 도메인 작제물로서,
a)
i) 제1 Fc 도메인 단량체,
ii) 제2 Fc 도메인 단량체,
iii) 제1 중쇄 결합 도메인, 및
iv) 제1 및 제2 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커를 포함하는, 제1 폴리펩티드;
b)
i) 제3 Fc 도메인 단량체,
ii) 제4 Fc 도메인 단량체,
iii) 제2 중쇄 결합 도메인; 및
iv) 제3 및 제4 Fc 도메인 단량체를 연결하는 링커를 포함하는, 제2 폴리펩티드;
c) 제5 Fc 도메인 단량체 및 제3 중쇄 결합 도메인을 포함하는 제3 폴리펩티드;
f) 제6 Fc 도메인 단량체 및 제4 경쇄 결합 도메인을 포함하는 제4 폴리펩티드;
e) 제1 경쇄 결합 도메인을 포함하는 제5 폴리펩티드;
f) 제2 경쇄 결합 도메인을 포함하는 제 6폴리펩티드;
g) 제3 경쇄 결합 도메인을 포함하는 제7 폴리펩티드; 및
h) 제4 경쇄 결합 도메인을 포함하는 제8 폴리펩티드를 포함하되,
제1 및 제5 Fc 도메인 단량체는 함께 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제3 및 제6 Fc 도메인 단량체는 함께 제2 Fc 도메인을 형성하며, 제2 및 제4 Fc 단량체는 함께 제3 Fc 도메인을 형성하고, 제1 경쇄 결합 도메인 및 제3 중쇄 결합 도메인은 함께 제1 Fab를 형성하며, 제2 경쇄 결합 도메인 및 제4 중쇄 결합 도메인은 함께 제2 Fab를 형성하고, 제3 경쇄 결합 도메인 및 제1 중쇄 결합 도메인은 함께 제3 Fab를 형성하며; 제4 경쇄 결합 도메인 및 제2 중쇄 결합 도메인은 함께 제2 Fab를 형성하는, Fc-항원 결합 도메인 작제물. - 제389항에 있어서, 제1 및 제2 폴리펩티드는 서열이 동일한, Fc 항원 도메인 작제물.
- 제389항에 있어서, 제3 및 제4 폴리펩티드는 서열이 동일한, Fc 항원 도메인 작제물.
- 제389항에 있어서, 제5, 제6, 제7, 및 제8 폴리펩티드는 서열이 동일한, Fc 항원 도메인 작제물.
- 제389항에 있어서, 제1 및 제2 폴리펩티드는 서열이 동일하고, 제3 및 제4 폴리펩티드는 서열이 동일하며, 제5 및 제6 폴리펩티드는 서열이 동일하고, 제5, 제6, 제7 및 제8 폴리펩티드는 서열이 동일한, Fc 항원 도메인 작제물.
- 제389항 내지 제393항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 도메인 단량체 각각의 CH3 도메인은 최대 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하는, Fc 항원 도메인 작제물.
- 제389항 내지 제393항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 도메인 단량체 각각의 CH3 도메인은 인간 IgG1의 아미노산 서열과 비교하여, 최대 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하는, Fc 항원 도메인 작제물.
- 제389항 내지 제393항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 도메인 단량체 각각은 독립적으로, 최대 10, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 42, 43, 45 및 47 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는, Fc 항원 도메인 작제물.
- 제389항 내지 제393항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 아미노산 치환은 CH3 도메인에만 있는, Fc 항원 도메인 단량체.
- 제389항 내지 제393항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 및 제4 Fc 도메인 단량체는 제2 및 제4 Fc 도메인 단량체 사이의 동종이량체화를 촉진하는 최대 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하는, Fc 항원 도메인 작제물.
- 제389항 내지 제393항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제5 Fc 도메인 단량체는 제1 및 제5 Fc 도메인 단량체 사이의 이종이량체화를 촉진하는 최대 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하며, 제3 및 제6 Fc 도메인 단량체는 제3 및 제6 Fc 도메인 단량체 사이의 이종이량체화를 촉진하는 최대 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 단일 아미노산 치환을 포함하는, Fc 항원 도메인 작제물.
- 제398항에 있어서, 동종이량체화를 촉진하는 치환은 표 4a 및 4b의 치환으로부터 선택되는, Fc 항원 도메인 작제물.
- 제399항에 있어서, 이종이량체화를 촉진하는 치환은 표 3의 치환으로부터 선택되는, Fc 항원 도메인 작제물.
- 제319항 내지 제401항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 링커는
GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG, GGGGS, GGSG, SGGG, GSGS, GSGSGS, GSGSGSGS, GSGSGSGSGS, GSGSGSGSGSGS, GGSGGS, GGSGGSGGS, GGSGGSGGSGGS, GGSG, GGSG, GGSGGGSG, GGSGGGSGGGSGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS, GENLYFQSGG, SACYCELS, RSIAT, RPACKIPNDLKQKVMNH, GGSAGGSGSGSSGGSSGASGTGTAGGTGSGSGTGSG, AAANSSIDLISVPVDSR, GGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGS, GGGSGGGSGGGS, SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG, GGSGGGSGGGSGGGSGGS, GGGG, GGGGGGGG, GGGGGGGGGGGG, 및 GGGGGGGGGGGGGGGG로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는, Fc-항원 결합 도메인 작제물. - 제319항 내지 제401항 중 어느 한 항에 있어서,
Fc 도메인 단량체 중 적어도 하나는 EU 위치 I253에서 치환을 포함하는, Fc-항원 결합 도메인 작제물. - 제403항에 있어서, EU 위치 I253에서의 아미노산 치환의 각각은 I253A, I253C, I253D, I253E, I253F, I253G, I253H, I253I, I253K, I253L, I253M, I253N, I253P, I253Q, I253R, I253S, I253T, I253V, I253W 및 I253Y로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, Fc-항원 결합 도메인 작제물.
- 제319항 내지 제401항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 도메인 단량체 중 적어도 하나는 EU 위치 R292에서 아미노산 치환을 포함하는, Fc-항원 결합 도메인 작제물.
- 제45항에 있어서, EU 위치 R292에서의 아미노산 치환의 각각은 R292D, R292E, R292L, R292P, R292Q, R292R, R292T 및 R292Y로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, Fc-항원 결합 도메인 작제물.
- 제319항 내지 제401항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 도메인 단량체 중 적어도 하나는 T366Y, T366W, T394W, T394Y, F405W, F405A, Y407A, S354C, Y349T, T394F, K409D, K409E, K392D, K392E, K370D, K370E, D399K, D399R, E357K, E357R, D356K, 및 D356R로 이루어진 군으로부터 선택된 치환을 포함하는, Fc-항원 결합 도메인 작제물.
- 제319항 내지 제401항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 도메인 단량체 각각의 힌지는 독립적으로, EPKSCDKTHTCPPCPAPELL 및 DKTHTCPPCPAPELL로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는, Fc-항원 결합 도메인 작제물.
- 제316항에 있어서, 세포는 FUT8 발현 또는 활성의 억제제가 존재하는 가운데 배양되는, 방법.
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