KR20210039078A - Peptide probe for diagnosing peritoneal carcinomatosis of gastric cancer - Google Patents

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Abstract

The present invention relates to a peptide probe for diagnosing peritoneal carcinomatosis of gastric cancer, and more particularly, as the peptide probe of the present invention specifically binds to a gastric cancer cell line, the peptide probe can be used as an imaging index in clinical analysis and endoscopy for diagnosing the abdominal metastasis of gastric cancer.

Description

위암의 복강 전이 진단용 펩타이드 프로브{Peptide probe for diagnosing peritoneal carcinomatosis of gastric cancer}Peptide probe for diagnosing peritoneal carcinomatosis of gastric cancer

본 발명은 위암의 복강 전이 진단용 펩타이드 프로브에 관한 것이다.The present invention relates to a peptide probe for diagnosing abdominal metastasis of gastric cancer.

위암은 주요 공중 위생 문제로, 서구 국가와 한국에서 세 번째로 흔한 암이다. 예후와 생존이 악성 병변의 크기와 단계와 관련되어 있기 때문에 위장관에서 조기 종양 병변의 검출은 치료에 필수적이다.Gastric cancer is a major public health problem and is the third most common cancer in Western countries and Korea. Since prognosis and survival are related to the size and stage of malignant lesions, early detection of tumor lesions in the gastrointestinal tract is essential for treatment.

전-악성 병변의 내시경 선별 및 치료는 위암의 약 80%를 예방한다. 그러나 백색광 내시경 검사는 평가에서 최대 25%의 누락된 비율이 보고되었기 때문에 불완전한 기술이다. 또한, 악성 가능성이 없는 용종이 이익없이 치료되었으나, 환자에게는 추가적인 비용과 위험이 있었다. 내시경 검사가 부적절하다고 알려진 여러 예측변수가 있다. 여기에는 내시경 치료인의 환자 특성 또는 기술이 포함된다. 따라서, 이러한 문제를 극복하기 위해 다양한 첨단 기술이 시도되고있다. Endoscopic screening and treatment of pre-malignant lesions prevents about 80% of gastric cancer. However, white light endoscopy is an incomplete technique, as a maximum of 25% missing rates have been reported in the evaluation. In addition, polyps without malignant potential were treated without benefit, but there were additional costs and risks to the patient. There are several predictors that are known to be inadequate for endoscopy. This includes the patient characteristics or skills of the endoscopic therapist. Therefore, various advanced technologies have been attempted to overcome this problem.

분자 영상은 위장관 내시경 검사의 새로운 원칙으로 등장했다. 분자 이미징은 생체 시스템 내에서 세포 및 세포 내 수준에서 생물학적 과정의 시각화 및 측정으로 정의된다. 표적화된 분자 이미징은 표적 진단을 정량화할 수 있으며, 이는 질병의 진단 및 관리에 사용될 수있다. 현재의 표적화 리간드는 펩타이드, 앱타머, 단백질 또는 항체를 포함한다. 내시경 분자 영상화는 내시경 검사를 통한 분자 특성의 시각화로 정의될 수 있다. 이러한 혁신을 통해 종양 또는 이형성 병변을 찾을 수 있을뿐만 아니라 분자 특성과 특정 분자의 활동 및 종양 거동 및/또는 치료에 대한 반응에 영향을 미치는 생물학적 과정을 시각화할 수 있다. 침습적 치료 또는 감시를 위한 환자의 선택과 함께 점막 변경의 보다 정확한 분류를 위해 분자 이미징 기술이 개발되었다. 또한, 분자 및 기능적 영상 기술은 요법에 대한 새로운 표적 및 요법에 대한 반응에 접근할 새로운 전망을 식별할 수 있다. 내시경 진단의 미래는 바이오마커와 기술의 조합에 의해 영향을 받을 것이다.Molecular imaging has emerged as a new principle in gastrointestinal endoscopy. Molecular imaging is defined as the visualization and measurement of biological processes at the cellular and intracellular level within a living system. Targeted molecular imaging can quantify targeted diagnosis, which can be used for diagnosis and management of disease. Current targeting ligands include peptides, aptamers, proteins or antibodies. Endoscopic molecular imaging can be defined as visualization of molecular properties through endoscopy. These innovations allow not only to find tumors or atypical lesions, but also to visualize the molecular properties and activity of specific molecules and biological processes that influence tumor behavior and/or response to treatment. Molecular imaging techniques have been developed for more accurate classification of mucosal alterations with patient selection for invasive treatment or surveillance. In addition, molecular and functional imaging techniques can identify new targets for therapy and new prospects to approach response to therapy. The future of endoscopic diagnostics will be influenced by the combination of biomarkers and technologies.

Jeong Hoon Lee et al. The Lancet Gastroenterology % Hepatology, vol. 1(2), pp.147-155(2016.10.01) Jeong Hoon Lee et al. The Lancet Gastroenterology% Hepatology, vol. 1(2), pp.147-155 (2016.10.01)

본 발명의 목적은 파지 디스플레이에 의해 개발된 위암의 복강 전이를 진단할 수 있는 LGR5에 특이적으로 결합하는 펩타이드 및 이의 약제학적 용도를 제공하는 것이다. An object of the present invention is to provide a peptide specifically binding to LGR5 capable of diagnosing abdominal metastasis of gastric cancer developed by phage display and a pharmaceutical use thereof.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함하는 LGR5(Leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor 5) 단백질 표적용 펩타이드를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a peptide for targeting LGR5 (Leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor 5) protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.

본 발명은 또한 상기 펩타이드를 포함하는 LGR5 단백질 검출용 조성물을 제공한다.The present invention also provides a composition for detecting LGR5 protein comprising the peptide.

본 발명은 또한 상기 펩타이드를 포함하는 위암의 복강 전이 진단용 조성물을 제공한다.The present invention also provides a composition for diagnosing abdominal metastasis of gastric cancer comprising the peptide.

본 발명은 또한 상기 펩타이드를 포함하는 위암의 복강 전이 영상화용 조성물을 제공한다.The present invention also provides a composition for imaging metastasis of the abdominal cavity of gastric cancer comprising the peptide.

본 발명은 또한 검체로부터 분리된 생물학적 시료 및 상기 펩타이드를 접촉시켜 LGR5 단백질을 검출하고, 검출된 수준이 비-위암세포 대조군보다 높은 경우 위암의 복강 전이로 진단하는 단계를 포함하는 위암의 복강 전이 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.The present invention also detects LGR5 protein by contacting the biological sample isolated from the specimen and the peptide, and diagnosing abdominal metastasis of gastric cancer when the detected level is higher than that of the non-gastric cancer cell control group. Provides a way to provide the necessary information.

본 발명은 또한 검체로부터 분리된 생물학적 시료 및 상기 펩타이드를 접촉시켜 LGR5 단백질을 검출하고, 검출된 수준이 비-위암세포 대조군보다 높은 경우 위암의 복강 전이로 진단하는 단계를 포함하는 위암의 복강 전이 진단 방법을 제공한다.The present invention also detects LGR5 protein by contacting the biological sample isolated from the specimen and the peptide, and diagnosing abdominal metastasis of gastric cancer when the detected level is higher than that of the non-gastric cancer cell control group. Provides a way.

본 발명은 또한 펩타이드를 포함하는 위암에 특이적인 약물 전달용 조성물을 제공한다.The present invention also provides a composition for drug delivery specific to gastric cancer comprising a peptide.

본 발명은 또한 상기 펩타이드; 및 상기 펩타이드와 결합하는 약제학적 활성성분을 포함하는 위암의 복강 전이 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.The present invention also includes the peptide; And It provides a composition for preventing or treating abdominal metastasis of gastric cancer comprising a pharmaceutical active ingredient that binds to the peptide.

본 발명의 표적 펩타이드는 위암세포 또는 위암줄기세포 마커에 특이적으로 결합함에 따라 위암의 복강 전이 진단, 약물 전달을 위한 임상 분석 및 내시경에서의 이미징 지표로서 사용될 수 있다.As the target peptide of the present invention specifically binds to a gastric cancer cell or gastric cancer stem cell marker, it can be used as an intraperitoneal metastasis diagnosis of gastric cancer, a clinical analysis for drug delivery, and an imaging index in an endoscope.

도 1은 파지 디스플레이에 의해 LGR5 단백질과 결합능이 랜덤 파지의 ELISA 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 파지 디스플레이에 의해 LGR5 단백질과 결합능이 있는 24번 파지의 위암세포주 표적능에 대한 면역화학염색 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 파지 디스플레이에 의해 LGR5 단백질과 결합능이 있는 24번 파지의 대장암세포주 표적능에 대한 면역화학염색 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 파지 디스플레이에 의해 LGR5 단백질과 결합능이 있는 24번 파지에서 획득한 형광 표지 펩타이드의 위암세포주 결합능에 대한 면역화학염색 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 파지 디스플레이에 의해 LGR5 단백질과 결합능이 있는 24번 파지에서 획득한 형광 표지 펩타이드의 위 및 대장암세포주 결합능에 대한 면역화학염색 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 형광 표지된 24번 펩타이드의 위암세포주에 대한 결합능에 대한 유세포 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 경쟁적 저해능 확인을 위한 형광 표지된 24번 펩타이드 및 LGR5 항체의 위암세포주에 대한 결합능에 대한 면역화학염색 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 위암 동물 모델에서 형광 표지된 24번 펩타이드의 체내 전달 여부를 확인한 IVIS 영상을 나타낸 것이다.
도 9는 위암 동물 모델에서 형광 표지된 24번 펩타이드 및 대조군 펩타이드의 장간막에 형성된 암과의 결합능을 보여주는 IVIS 영상이다.
도 10은 위암 동물 모델에서 형광 표지된 24번 펩타이드 및 대조군 펩타이드의 심장, 폐, 간, 비장, 신장, 종양 조직과의 결합능을 보여주는 IVIS 영상이다.Figure 1 shows the results of ELISA analysis of random phage binding ability to LGR5 protein by phage display.
Figure 2 shows the results of immunochemical staining for the targeting ability of the gastric cancer cell line of phage 24 having the ability to bind to the LGR5 protein by phage display.
3 shows the results of immunochemical staining for the targeting ability of the colon cancer cell line of phage 24 having the ability to bind to the LGR5 protein by phage display.
FIG. 4 shows the immunochemical staining results for the binding ability of a gastric cancer cell line of a fluorescently labeled peptide obtained from phage 24 having the ability to bind to an LGR5 protein by phage display.
5 shows the results of immunochemical staining for the binding ability of gastric and colon cancer cell lines of the fluorescently labeled peptide obtained from phage 24 having the ability to bind to the LGR5 protein by phage display.
6 shows the results of flow cytometry for the binding ability of the fluorescently labeled peptide 24 to gastric cancer cell lines.
7 shows the immunochemical staining results for the binding ability of the fluorescently-labeled peptide No. 24 and the LGR5 antibody to gastric cancer cell lines for the confirmation of competitive inhibitory ability.
FIG. 8 shows an IVIS image confirming whether or not a fluorescently labeled peptide 24 was delivered in the body in an animal model of gastric cancer.
9 is an IVIS image showing the binding ability of the fluorescently-labeled peptide No. 24 and the control peptide to cancer formed in the mesentery in the gastric cancer animal model.
10 is an IVIS image showing the binding ability of the fluorescently-labeled peptide No. 24 and the control peptide to heart, lung, liver, spleen, kidney, and tumor tissues in an animal model of gastric cancer.

이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.Hereinafter, the configuration of the present invention will be described in detail.

본 발명은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함하는 LGR5(Leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor 5) 단백질 표적용 펩타이드에 관한 것이다.The present invention relates to a peptide for targeting LGR5 (Leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor 5) protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.

상기 펩타이드는 파지 디스플레이를 통해 위암세포 또는 위암줄기세포 마커로 알려져 있는 LGR5 단백질에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 한다.The peptide is characterized in that it specifically binds to LGR5 protein known as a gastric cancer cell or gastric cancer stem cell marker through phage display.

본 명세서에서 사용되는 용어 "단백질"은 "폴리펩타이드(polypeptide)" 또는 "펩타이드(peptide)"와 호환성 있게 사용되며, 예컨대, 자연 상태의 단백질에서 일반적으로 발견되는 바와 같이 아미노산 잔기의 중합체를 말한다. 본 발명의 펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 및 이의 기능적 변이체를 포함하는 개념이다. "기능적 변이체"란 위암세포에 결합하는 본 발명의 펩타이드의 성질에는 영향을 미치지 않고 아미노산 위치에서 일부 아미노산의 치환이 발생된 모든 유사한 서열을 의미한다. As used herein, the term "protein" is used interchangeably with "polypeptide" or "peptide", and refers to a polymer of amino acid residues, for example, as commonly found in proteins in their natural state. The peptide of the present invention is a concept including the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and functional variants thereof. "Functional variant" refers to all similar sequences in which some amino acids have been substituted at amino acid positions without affecting the properties of the peptides of the present invention that bind to gastric cancer cells.

본 발명의 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성(Creighton, Proteins; Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman and Co., NY, 1983)에 의해 쉽게 제조될 수 있다. 대표적인 방법으로서 이들로 한정되는 것은 아니지만 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC 또는 T-BOC 화학법이 포함된다(Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams et al., Eds., CRC Press, Boca Raton Florida, 1997; A Practical Approach, Athert on & Sheppard, Eds., IRL Press, Oxford, England, 1989). 또한 본 발명의 펩타이드는 유전공학적 방법에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 펩타이드 합성을 위한 유전공학적 방법은 다음의 문헌을 참고할 수 있다: Maniatis et al., Molecular Cloning; A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, 1982; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y., Second(1998) and Third(2000) Edition; Gene Expression Technology, Method in Enzymology, Genetics and Molecular Biology, Method in Enzymology, Guthrie & Fink (eds.), Academic Press, San Diego, Calif, 1991; 및 Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:12073-12080, 1990.The peptides of the present invention can be readily prepared by chemical synthesis known in the art (Creighton, Proteins; Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman and Co., NY, 1983). Representative methods include, but are not limited to, liquid or solid phase synthesis, fragment condensation, F-MOC or T-BOC chemistry (Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams et al., Eds., CRC Press). , Boca Raton Florida, 1997; A Practical Approach, Athert on & Sheppard, Eds., IRL Press, Oxford, England, 1989). In addition, the peptide of the present invention can be prepared by a genetic engineering method. The genetic engineering method for synthesizing the peptide of the present invention may be referred to the following literature: Maniatis et al., Molecular Cloning; A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, 1982; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y., Second (1998) and Third (2000) Edition; Gene Expression Technology, Method in Enzymology, Genetics and Molecular Biology, Method in Enzymology, Guthrie & Fink (eds.), Academic Press, San Diego, Calif, 1991; And Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:12073-12080, 1990.

본 발명은 또한 상기 펩타이드를 포함하는 LGR5 단백질 검출용 조성물에 관한 것이다.The present invention also relates to a composition for detecting LGR5 protein comprising the peptide.

본 발명의 펩타이드는 LGR5에 특이적으로 결합하므로 효소면역분석법(ELISA), 방사면역분석법(radioimmunoassay, RIA), 방사면역확산법(Radial Immunodiffusion), 샌드위치 ELISA법, 웨스턴 블롯, 면역침전법, 면역조직화학염색법, 면역전기영동법, 오우크테로니 면역확산법(Ouchterlony immunodiffusion), 면역형광법, 효소기질발색법, 항원-항체 응집법, SPR(surface plasmon resonance) 및 단백질 칩으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법을 통해 LGR5 단백질을 검출할 수 있다.Since the peptide of the present invention specifically binds to LGR5, enzyme immunoassay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion (Radial Immunodiffusion), sandwich ELISA, Western blot, immunoprecipitation, immunohistochemistry Any one method selected from the group consisting of staining, immunoelectrophoresis, Ouchterlony immunodiffusion, immunofluorescence, enzyme substrate coloring, antigen-antibody aggregation, SPR (surface plasmon resonance), and protein chip Through the LGR5 protein can be detected.

본 발명은 또한 상기 펩타이드를 포함하는 위암의 복강 전이 진단용 조성물에 관한 것이다.The present invention also relates to a composition for diagnosing abdominal metastasis of gastric cancer comprising the peptide.

본 발명의 펩타이드는 LGR5에 특이적으로 결합하므로 위의 장간막 또는 복강액에서 LGR5 단백질의 발현 수준을 탐지하여 정상세포 또는 비-위암세포 대비 발현 수준이 높은 경우 위암의 복강 전이로 진단할 수 있는 것을 특징으로 한다. 일 구체예에 따르면, 본 발명의 펩타이드는 AGS, MKN28, MKN45와 같은 위암세포주에는 훨씬 더 유의적으로 결합하나, 대장암세포주인 HT29, LOVO, DLD-1 세포에 대한 결합능을 확인하였으나 위암세포주와 같은 유의적인 차이는 없었다.Since the peptide of the present invention specifically binds to LGR5, it can be diagnosed as abdominal metastasis of gastric cancer when the expression level of the LGR5 protein is high compared to normal cells or non-gastric cancer cells by detecting the expression level of the LGR5 protein in the gastric mesentery or peritoneal fluid. It is characterized. According to one embodiment, the peptide of the present invention binds much more significantly to gastric cancer cell lines such as AGS, MKN28, and MKN45, but the binding ability to HT29, LOVO, and DLD-1 cells, which are colon cancer cell lines, was confirmed. There was no significant difference.

따라서, 본 발명의 펩타이드는 위암세포 또는 위암줄기세포를 표적으로 하는 프로브로 사용될 수 있다.Therefore, the peptide of the present invention can be used as a probe targeting gastric cancer cells or gastric cancer stem cells.

본 명세서에서 사용되는 용어 "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 대상(subject)의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 대상이 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 대상의 예후(prognosis)(예컨대, 전-전이성 또는 전이성 암 상태의 동정, 암의 단계 결정 또는 치료에 대한 암의 반응성 결정)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링하는 것)을 포함한다. 본 발명의 목적상, 상기 진단은 위암의 복강 전이의 유무를 확인하는 것이다. As used herein, the term "diagnosis" refers to determining the susceptibility of a subject to a specific disease or disorder, determining whether a subject currently has a specific disease or disorder, or a specific disease or disorder. Determining the prognosis (e.g., identification of a pre-metastatic or metastatic cancer state, determining the stage of the cancer, or determining the responsiveness of the cancer to treatment) of a subject suffering from the disease, or therametrics (e.g., therapeutic efficacy Monitoring the state of the object to provide information about For the purposes of the present invention, the diagnosis is to confirm the presence or absence of abdominal metastasis of gastric cancer.

본 발명에서 상기 "프로브"란 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미한다. 프로브의 종류는 당업계에서 통상적으로 사용되는 물질로서 제한은 없으나, 바람직하게는 펩타이드일 수 있다.In the present invention, the "probe" refers to a substance capable of specifically binding to a target substance to be detected in a sample, and refers to a substance capable of specifically confirming the presence of a target substance in a sample through the binding. The type of probe is not limited as a material commonly used in the art, but may be preferably a peptide.

상기 진단용 조성물에는 본 발명의 펩타이드 이외에도 펩타이드 구조 또는 생리활성을 안정하게 유지시켜 주는 완충액 또는 반응액이 추가로 포함될 수 있으며, 또한, 안정성을 유지하기 위해, 분말 상태 또는 적절한 완충액에 용해된 상태 또는 4℃가 유지된 상태로 제공될 수 있다.In addition to the peptide of the present invention, the diagnostic composition may further include a buffer solution or a reaction solution that stably maintains the peptide structure or physiological activity. In addition, in order to maintain stability, a powder state or a state dissolved in an appropriate buffer solution or 4 It may be provided with the ℃ maintained.

본 발명의 펩타이드가 위암 조직 또는 세포에 결합하였는지 여부를 용이하게 확인, 검출 및 정량하기 위하여, 본 발명의 펩타이드는 표지된 상태로 제공될 수 있다. 즉, 검출가능한 표지에 링크(예: 공유 결합 또는 가교)되어 제공될 수 있다. 상기 검출 가능한 표지는 발색효소(예: 퍼옥시다제(peroxidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase)), 방사성 동위원소(예: 124I, 125I, 111In, 99mTc, 32P, 35S), 발색단(chromophore), 바이오틴(biotin), 발광물질 또는 형광물질(예: FITC, RITC, 로다민(rhodamine), 텍사스레드(Texas Red), 플로레신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 퀀텀닷(quantum dots)), 자기공명영상조영제(예: 수퍼파라마그네틱 산화철(superparamagnetic iron oxides, SPIO), 울트라수퍼파라마그네틱 산화철(ultrasuperparamagnetic iron oxides, USPIO)) 등 일 수 있다. 유사하게, 상기 검출 가능한 표지는 항체 에피토프(epitope), 기질(substrate), 보조인자(cofactor), 저해제 또는 친화 리간드일 수 있다. 이러한 표지는 본 발명의 펩타이드를 합성하는 과정 중에 수행할 수도 있고, 이미 합성된 펩타이드에 추가로 수행될 수도 있다. 만약 검출가능한 표지로 형광물질을 이용하는 경우에는 형광단층촬영(Fluorescence mediated tomography:FMT)으로 위암의 복강 전이를 진단할 수 있다. 예컨대, 형광물질로 표지된 본 발명의 펩타이드를 복강 내 주사 후 형광단층촬영으로 펩타이드에 의한 형광을 관찰할 수 있다. 형광이 관찰된다면, 위암의 복강 전이로 진단된다. 또한 검출가능한 표지로 방사선 물질을 이용하는 경우에는 양전자단층촬영(Positron emission tomography:PET)으로 펩타이드에 의한 방사능을 관찰하여 위암의 복강 전이를 진단할 수 있다. 이 경우에는 보다 민감하게 위암의 복강 전이의 진단 및 분자영상이 가능할 것이다.In order to easily identify, detect, and quantify whether the peptide of the present invention binds to gastric cancer tissues or cells, the peptide of the present invention may be provided in a labeled state. That is, it can be provided by linking to a detectable label (eg, covalently bonded or crosslinked). The detectable label is a chromogenic enzyme (e.g., peroxidase, alkaline phosphatase), a radioactive isotope (e.g. , 124 I, 125 I, 111 In, 99m Tc, 32 P, 35 S), Chromophore, biotin, luminescent material or fluorescent material (e.g. FITC, RITC, rhodamine, Texas Red, fluorescein, phycoerythrin, quantum dot) (quantum dots)), magnetic resonance imaging contrast agents (e.g., superparamagnetic iron oxides (SPIO), ultrasuperparamagnetic iron oxides (USPIO)), and the like. Similarly, the detectable label may be an antibody epitope, a substrate, a cofactor, an inhibitor or an affinity ligand. Such labeling may be performed during the process of synthesizing the peptide of the present invention, or may be performed in addition to the already synthesized peptide. If a fluorescent substance is used as a detectable label, then fluorescence mediated tomography (FMT) can be used to diagnose abdominal metastasis of gastric cancer. For example, after intraperitoneal injection of the peptide of the present invention labeled with a fluorescent substance, fluorescence by the peptide can be observed by fluorescence tomography. If fluorescence is observed, it is diagnosed as abdominal metastasis of gastric cancer. In addition, in the case of using a radioactive material as a detectable label, it is possible to diagnose abdominal metastasis of gastric cancer by observing the radioactivity by the peptide by positron emission tomography (PET). In this case, more sensitive diagnosis and molecular imaging of abdominal metastasis of gastric cancer will be possible.

따라서, 본 발명은 상기 펩타이드를 포함하는 위암의 복강 전이 영상화용 조성물을 제공한다. Accordingly, the present invention provides a composition for imaging metastasis in the abdominal cavity of gastric cancer comprising the peptide.

본 발명의 위암의 복강 전이 영상화용 조성물은 본 발명의 펩타이드를 함유하여 위암의 복강 전이를 영상화하는데 사용될 수 있다. The composition for imaging intraperitoneal metastasis of gastric cancer of the present invention can be used to image the intraperitoneal metastasis of gastric cancer by containing the peptide of the present invention.

본 발명의 펩타이드를 포함하는 위암의 복강 전이 영상화용 조성물은 반음영부를 영상화하거나 검출 및 정량하는데 유용하게 사용될 수 있다. The composition for imaging metastasis to the abdominal cavity of gastric cancer comprising the peptide of the present invention can be usefully used to image, detect, and quantify the semi-shaded region.

본 발명의 조성물에서, 상기 펩타이드는, 이에 한정되지는 않으나, 발색효소, 방사성동위원소, 발색단(chromophore), 발광물질, 형광물질(fluorescer), 상자성입자(superparamagnetic particles) 또는 초상자성입자(ultrasuper paramagnetic particles)로 표지된 것일 수 있다. In the composition of the present invention, the peptide is, but is not limited to, a chromogenic enzyme, a radioisotope, a chromophore, a luminescent material, a fluorescent material, a superparamagnetic particle, or an ultrasuper paramagnetic particle. particles).

본 발명의 일 실시예에 따르면, 대조군 펩타이드와 본 발명의 형광 표지된 표적 펩타이드를 복강 내 주사를 통해 위암 동물 모델에 투여하고 장간막에 생성된 암과의 결합능을 비교한 결과, 형광 표지된 표적 펩타이드의 결합력이 대조군에 비해 훨씬 높았다. 장간막 외에 심장, 폐, 간, 비장, 신장, 종양 조직을 따로 떼어 낸 후 IVIS 촬영을 진행한 결과, 대조군에서는 종양조직에서 형광 세기가 약하지만 표적 펩타이드를 처리한 종양조직에서는 형광값이 매우 높게 나타났다. According to an embodiment of the present invention, a control peptide and a fluorescently labeled target peptide of the present invention were administered to a gastric cancer animal model through intraperitoneal injection, and as a result of comparing the binding ability with cancer generated in the mesentery, a fluorescently-labeled target peptide The binding power of was much higher than that of the control group. In addition to the mesentery, heart, lung, liver, spleen, kidney, and tumor tissues were separately removed and then IVIS photographed. As a result, the fluorescence intensity was weak in the tumor tissue in the control group, but the fluorescence value was very high in the tumor tissue treated with the target peptide. .

또한, 본 발명의 상기 위암의 복강 전이 진단용 조성물 또는 위암의 복강 전이 영상화용 조성물은 키트 형태로 제조될 수 있다. In addition, the composition for diagnosing abdominal metastasis of gastric cancer or the composition for imaging abdominal metastasis of gastric cancer of the present invention may be prepared in the form of a kit.

본 발명의 키트에는 상기한 바와 같은 발색효소 또는 방사성 동위원소 등으로 표지된 펩타이드가 포함될 수 있다. The kit of the present invention may contain a peptide labeled with a chromogenic enzyme or a radioactive isotope as described above.

본 발명의 키트에는 본 발명의 펩타이드 이외에 상기 펩타이드와 위암세포 또는 위암줄기세포의 결합 반응을 위한 적당한 완충용액 또는 배지 및 대조군 세포(정상세포, 대장암세포)를 추가로 포함할 수 있다.In addition to the peptide of the present invention, the kit of the present invention may further include an appropriate buffer solution or medium for binding reaction between the peptide and gastric cancer cells or gastric cancer stem cells, and control cells (normal cells, colon cancer cells).

또한, 본 발명의 펩타이드가 표지되지 않은 채로 제공되는 경우에는, 펩타이드의 표지를 위한 검출가능한 표지가 추가로 키트에 포함될 수 있다. 양자택일적으로, 본 발명의 펩타이드에 대한 항체, 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등이 상기 키트에 추가로 포함될 수도 있다. 본 발명의 펩타이드에 대한 항체는 상기 기재한 바와 같이 당업계에 공지된 통상적인 항체의 제조방법에 따라 제조될 수 있다. In addition, when the peptide of the present invention is provided unlabeled, a detectable label for labeling the peptide may be additionally included in the kit. Alternatively, an antibody against the peptide of the present invention, a secondary antibody labeled with a fluorescent substance, a color developing substrate, and the like may be further included in the kit. Antibodies against the peptides of the present invention can be prepared according to conventional methods for producing antibodies known in the art as described above.

또한, 본 발명의 펩타이드는 플레이트의 표면에 코팅된 형태로 제공될 수도 있다. 이 경우에는 상기 플레이트에 직접 장간막 또는 복강액을 접촉시켜 적당한 조건에서 반응시킨 후, 플레이트의 표면상에서의 위암세포 또는 위암줄기세포와 펩타이드의 결합을 관찰하여 위암의 복강 전이를 진단할 수 있다. In addition, the peptide of the present invention may be provided in a form coated on the surface of a plate. In this case, the plate is directly contacted with the mesentery or peritoneal fluid to react under appropriate conditions, and then gastric cancer cells or the binding of gastric cancer stem cells and peptides on the surface of the plate can be observed to diagnose abdominal metastasis of gastric cancer.

또한, 상기 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다. 예를 들면, ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. ELISA 키트는 상기 단백질에 대해 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.In addition, the kit may further include one or more other component compositions, solutions, or devices suitable for the analysis method. For example, it may contain the necessary elements necessary to perform an ELISA. The ELISA kit contains an antibody specific for the protein. Antibodies are antibodies with high specificity and affinity for a marker protein and little cross-reactivity with other proteins, and are monoclonal, polyclonal, or recombinant antibodies. In addition, the ELISA kit may contain an antibody specific for a control protein. Other ELISA kits include reagents capable of detecting bound antibodies, such as labeled secondary antibodies, chromophores, enzymes (e.g., conjugated with antibodies) and their substrates or antibodies capable of binding. Other materials may be included.

본 발명은 또한 검체로부터 분리된 생물학적 시료 및 상기 펩타이드를 접촉시켜 LGR5 단백질을 검출하고, 검출된 수준이 비-위암세포 대조군보다 높은 경우 위암의 복강 전이로 진단하는 단계를 포함하는 위암의 복강 전이 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.The present invention also detects LGR5 protein by contacting the biological sample isolated from the specimen and the peptide, and diagnosing abdominal metastasis of gastric cancer when the detected level is higher than that of the non-gastric cancer cell control group. On how to provide the necessary information.

본 발명은 또한 검체로부터 분리된 생물학적 시료 및 상기 펩타이드를 접촉시켜 LGR5 단백질을 검출하고, 검출된 수준이 비-위암세포 대조군보다 높은 경우 위암의 복강 전이로 진단하는 단계를 포함하는 위암의 복강 전이 진단 방법을 제공한다.The present invention also detects LGR5 protein by contacting the biological sample isolated from the specimen and the peptide, and diagnosing abdominal metastasis of gastric cancer when the detected level is higher than that of the non-gastric cancer cell control group. Provides a way.

상기 "검체"는 분석 대상 개체를 의미하는 것일 수 있다. 바람직하게는, 포유동물일 수 있다.The "sample" may mean an individual to be analyzed. Preferably, it may be a mammal.

상기 생물학적 시료는 분석 대상 개체에서 유래한 것으로, 바람직하게는, 장간막 또는 복강액일 수 있다. 상기 시료는 검출 또는 진단에 사용하기 전에 전처리할 수 있다. 예를 들어, 균질화(homogenization), 여과, 증류, 추출, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등을 포함할 수 있다.The biological sample is derived from an individual to be analyzed, and may preferably be a mesentery or peritoneal fluid. The sample can be pretreated prior to use for detection or diagnosis. For example, it may include homogenization, filtration, distillation, extraction, concentration, inactivation of interfering components, addition of reagents, and the like.

본 발명에서 용어 "검출"은 목적하는 물질의 존재 여부를 측정 및 확인하는 것, 또는 목적하는 물질의 존재 수준(발현 수준)의 변화를 측정 및 확인하는 것을 의미하며, 상기 측정은 정성적인 방법과 정량적인 방법을 모두 포함하여 제한없이 수행될 수 있다.In the present invention, the term "detection" means measuring and confirming the presence or absence of a target substance, or measuring and confirming a change in the presence level (expression level) of the target substance, and the measurement is a qualitative method and It can be performed without limitation, including all quantitative methods.

상기 단백질 검출은, 본 발명에서 LGR5 단백질의 존재 여부 검출, 또는 상기 단백질 발현량의 증가 또는 감소를 확인하는 것을 포함하는 의미이다. 당업계에 공지된 단백질 발현 측정 방법에 의한 것이라면 측정 방법이 특별히 제한되지 않는다. 구체적으로 본 발명에서 단백질 검출은 효소면역분석법(ELISA), 방사면역분석법(radioimmunoassay, RIA), 방사면역확산법(Radial Immunodiffusion), 샌드위치 ELISA법, 웨스턴 블롯, 면역침전법, 면역조직화학염색법, 면역전기영동법, 오우크테로니 면역확산법(Ouchterlony immunodiffusion), 면역형광법, 효소기질발색법, 항원-항체 응집법, SPR(surface plasmon resonance) 및 단백질 칩으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나에 의한 것일 수 있다.The protein detection means detecting the presence or absence of the LGR5 protein in the present invention, or confirming an increase or decrease in the expression level of the protein. The measurement method is not particularly limited as long as it is by a method for measuring protein expression known in the art. Specifically, the protein detection in the present invention is enzyme immunoassay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), radioimmunoassay (RIA), radioimmunoassay (RIA), sandwich ELISA, western blot, immunoprecipitation, immunohistochemical staining, immunoelectricity. It may be by any one selected from the group consisting of electrophoresis method, Ouchterlony immunodiffusion, immunofluorescence method, enzyme substrate coloring method, antigen-antibody aggregation method, SPR (surface plasmon resonance), and protein chip.

본 발명은 또한 상기 펩타이드를 포함하는 위암에 특이적인 약물 전달용 조성물에 관한 것이다.The present invention also relates to a composition for drug delivery specific to gastric cancer comprising the peptide.

본 발명의 펩타이드는 위암 치료제와 같은 약물을 위암 조직에 선택적으로 전달하는 지능형 약물 전달체로서 사용될 수 있다. 본 발명의 펩타이드를 종래 위암 치료제와 연결하여 위암 치료에 이용한다면 본 발명의 펩타이드에 의해 위암 치료제가 위암세포 또는 위암줄기세포에만 선택적으로 전달되기 때문에 약의 효력을 증가시킬 수 있고 동시에 정상조직에 미치는 약물의 부작용을 현저히 줄일 수 있다. The peptide of the present invention can be used as an intelligent drug delivery system that selectively delivers drugs such as gastric cancer therapeutics to gastric cancer tissues. If the peptide of the present invention is used for gastric cancer treatment by linking with a conventional gastric cancer treatment, the effect of the drug can be increased because the peptide of the present invention is selectively delivered only to gastric cancer cells or gastric cancer stem cells. The side effects of drugs can be significantly reduced.

상기 약물은 이에 한정되지는 않으나, 위암을 치료하는 약물로 허가 받은 약물일 수 있다.The drug is not limited thereto, but may be a drug licensed as a drug for treating gastric cancer.

본 발명의 펩타이드와 상기 약물은 공유결합으로 연결될 수 있고, 특히, 링커(Linker)에 의해 연결될 수 있으나, 이에 제한을 두지 않는다.The peptide of the present invention and the drug may be covalently linked, and in particular, may be linked by a linker, but the present invention is not limited thereto.

본 발명은 또한 상기 펩타이드; 및 상기 펩타이드와 결합하는 약제학적 활성성분을 포함하는 위암의 복강 전이 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. The present invention also includes the peptide; And it relates to a composition for preventing or treating abdominal metastasis of gastric cancer comprising a pharmaceutical active ingredient that binds to the peptide.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양의 본 발명의 펩타이드 단독 또는 펩타이드 및 이와 결합하는 위암 치료물질을 포함할 수 있다. 상기에서 "약학적으로 유효한 양"이란 음성 대조군에 비해 그 이상의 반응을 나타내는 양을 말하며 바람직하게는 위암을 예방 또는 치료하기에 충분한 양을 말한다.The pharmaceutical composition according to the present invention may contain a pharmaceutically effective amount of the peptide of the present invention alone or a peptide and a gastric cancer therapeutic substance bound thereto. In the above, "pharmaceutically effective amount" refers to an amount that exhibits a higher response compared to the negative control group, and preferably refers to an amount sufficient to prevent or treat gastric cancer.

본 발명의 펩타이드에 연결될 수 있는 약제는 종래 위암의 치료에 사용되는 것이라면 제한 없이 사용될 수 있다. 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나, 위암을 치료하는 약물로 허가 받은 독시플루리딘(doxifluridine), 독소루비신(doxorubicin), 시스플라틴(cisplatin), 에토포사이드(etoposide), 테가푸르(tegafur), 우라실(uracil), 마이토마이신 C(mitomycin C), 에토포사이드(etoposide), 플루오로우라실(fluorouracil), 에피루비신(epirubicin), 메토트렉세이트(methotrexate), 파클리탁셀(paclitaxel), 이마티닙(imatinib), 수니티닙(sunitinib), 루코보린(leucovorin), 기메라실(gimeracil), 오테라실(oteracil), 카페시타빈(capecitabine), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 트라스투주맙(trastuzumab), 카페시타빈(capecitabine), 도세탁셀(docetaxel), 이리노테칸(irinotecan), 헵타플라틴(heptaplatin), 에피루비신(epirubicin), 라무시루맙(ramucirumab) 등일 수 있다. Drugs that can be linked to the peptides of the present invention may be used without limitation as long as they are conventionally used for the treatment of gastric cancer. For example, but not limited to this, doxyfluridine, doxorubicin, cisplatin, etoposide, tegafur, uracil licensed as drugs to treat gastric cancer (uracil), mitomycin C, etoposide, fluorouracil, epirubicin, methotrexate, paclitaxel, imatinib, suniti Nib, leucovorin, gimeracil, oteracil, capecitabine, oxaliplatin, trastuzumab, capecitabine , Docetaxel, irinotecan, heptaplatin, epirubicin, ramucirumab, and the like.

본 발명의 펩타이드와 위암 치료물질의 결합은 당업계에 공지된 방법, 예컨대, 공유 결합, 가교 등을 통해 수행될 수 있으며, 본 발명의 펩타이드와 위암 치료물질이 직접적으로 결합되거나 또는 매개체를 통하여 간접적으로 결합될 수도 있다. 아울러, 상기 결합은 생체 외에서 수행될 수도 있으나, 본 발명의 펩타이드 및 위암 치료물질은 개별적으로 투여되어 생체 내에서 결합될 수도 있다. 이를 위해 본 발명의 펩타이드 또는 위암 치료물질은 필요하다면 그 활성이 소실되지 않는 범위에서 화학적으로 수식(modification)될 수 있다.The binding of the peptide of the present invention and the gastric cancer therapeutic substance may be performed through methods known in the art, such as covalent bonding, cross-linking, etc., and the peptide of the present invention and the gastric cancer therapeutic substance are directly bound or indirectly through a mediator. It can also be combined with. In addition, the binding may be performed in vitro, but the peptide and the gastric cancer therapeutic substance of the present invention may be separately administered and combined in vivo. To this end, the peptide or gastric cancer therapeutic substance of the present invention may be chemically modified within a range in which its activity is not lost, if necessary.

본 발명의 펩타이드가 위암세포에 결합되어 위암 치료물질이 적절하게 투여되었는지 여부를 용이하게 확인하기 위하여, 본 발명의 펩타이드는 발색효소, 방사성동위원소 등으로 표지된 상태로 제공될 수 있다.In order to easily confirm whether the peptide of the present invention is bound to gastric cancer cells and the substance to treat gastric cancer is properly administered, the peptide of the present invention may be provided in a state labeled with a chromogenic enzyme, a radioisotope, or the like.

본 발명의 조성물에 포함되는 본 발명의 펩타이드 및 이와 결합되는 위암 치료물질의 양은 결합되는 약제의 종류 및 양에 따라 달라질 수 있으며, 바람직하게는 위암세포에 충분히 전달되어, 유효한 효과를 보이는 양일 수 있다. 그러나, 약물은 그 투여 경로 및 치료 횟수뿐 만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 펩타이드를 약제와 결합시켜 위암을 치료하기 위한 용도에 따른 본 발명의 펩타이드의 적절한 유효량을 결정할 수 있을 것이다.The amount of the peptide of the present invention and the gastric cancer therapeutic substance bound to the peptide of the present invention included in the composition of the present invention may vary depending on the type and amount of the drug to be bound, and preferably may be an amount that is sufficiently delivered to gastric cancer cells and exhibits an effective effect. . However, the effective dosage for the patient is determined by taking into account various factors such as the patient's age, weight, health condition, sex, disease severity, diet and excretion rate, as well as the route of administration and the number of treatments. Considering this, those of ordinary skill in the art will be able to determine an appropriate effective amount of the peptide of the present invention according to the use for treating gastric cancer by combining the peptide with a drug.

본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 약학적 조성물은 본 발명에 의한 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다. 예컨대, 본 발명의 펩타이드는 경구 투여 또는 비경구 투여될 수 있다. 경구 투여 시에는 위장관 내 소화효소에 의한 분해를 방지하기 위하여 본 발명의 펩타이드를 L형 아미노산으로 구성하여 사용하는 것이 바람직하다. 상기 비경구 투여로는 피하 주사, 근육내 주사, 정맥 주사 등이 있는데, 바람직하게는 복강내 주사일 수 있다.The pharmaceutical composition containing the peptide according to the present invention is not particularly limited in its formulation, route of administration, and method of administration as long as it exhibits the effect of the present invention. For example, the peptide of the present invention may be administered orally or parenterally. When administered orally, it is preferable to use the peptide of the present invention composed of L-type amino acids in order to prevent degradation by digestive enzymes in the gastrointestinal tract. The parenteral administration includes subcutaneous injection, intramuscular injection, intravenous injection, and the like, and preferably, may be intraperitoneal injection.

본 발명의 약학적 조성물을 경구 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 경구 투여용 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 형태로 제형화될 수 있다. 적합한 담체의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 상기 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.In the case of oral administration of the pharmaceutical composition of the present invention, the pharmaceutical composition of the present invention can be prepared in powders, granules, tablets, pills, dragees, capsules, liquids, and gels according to a method known in the art together with a suitable carrier for oral administration. , Syrup, suspension, wafer, etc. may be formulated. Examples of suitable carriers include sugars including lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol and maltitol, and starches including corn starch, wheat starch, rice starch and potato starch, cellulose, Fillers such as celluloses including methyl cellulose, sodium carboxymethylcellulose and hydroxypropylmethyl-cellulose, gelatin, polyvinylpyrrolidone, and the like may be included. In addition, in some cases, cross-linked polyvinylpyrrolidone, agar, alginic acid or sodium alginate may be added as a disintegrant. Furthermore, the pharmaceutical composition may further include an anti-aggregating agent, a lubricant, a wetting agent, a flavoring agent, an emulsifying agent and a preservative.

또한, 본 발명의 약학적 조성물을 비경구적으로 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 비경구용 담체와 함께 예를 들면, 주사제의 형태로 당업계에 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다. 상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다.In addition, when the pharmaceutical composition of the present invention is administered parenterally, the pharmaceutical composition of the present invention can be formulated with a suitable parenteral carrier, for example, in the form of an injection, according to a method known in the art. In the case of the injection, it must be sterilized and protected from contamination by microorganisms such as bacteria and fungi. Examples of suitable carriers for injections include, but are not limited to, water, ethanol, polyols (e.g., glycerol, propylene glycol and liquid polyethylene glycol, etc.), mixtures thereof, and/or solvents or dispersion media containing vegetable oils. I can. More preferably, suitable carriers include isotonic solutions such as Hanks' solution, Ringer's solution, phosphate buffered saline (PBS) containing triethanol amine or sterile water for injection, 10% ethanol, 40% propylene glycol and 5% dextrose. Etc. can be used. In order to protect the injection from microbial contamination, various antibacterial and antifungal agents such as paraben, chlorobutanol, phenol, sorbic acid, thimerosal, and the like may be additionally included. In addition, the injection may further contain an isotonic agent such as sugar or sodium chloride in most cases.

그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington'sPharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995). 이외에도 본 발명의 조성물에는 일반적인 약학적 조성물에 통상적으로 첨가되는 약학적으로 허용되는 담체가 추가로 포함될 수 있다. 상기 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 사람이나 동물에 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체는 주사제의 경우에는, 예컨대 완충제(예를 들어, 식염수 또는 PBS), 카보하이트레이트(예를 들어, 글루코스, 만노즈, 슈크로즈 또는 덱스트란), 항산화제, 정균제, 킬레이트화제(예를 들어, EDTA 또는 글루타치온), 아쥬반트(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드), 현탁제, 농후제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제 및/또는 안정화제를 사용할 수 있다. 이와 같이 본 발명의 펩타이드를 포함하는 조성물의 제형은 상술한 바와 같이 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 포함제 형태로 제조할 수 있다. 본 발명의 펩타이드를 포함하는 약물 전달용 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 약물 투여 방법으로 투여될 수 있다.Other pharmaceutically acceptable carriers may be referred to as those described in the following literature (Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995). In addition, the composition of the present invention may further include a pharmaceutically acceptable carrier that is usually added to a general pharmaceutical composition. The term "pharmaceutically acceptable" is physiologically acceptable and when administered to humans or animals, it generally refers to not causing an allergic reaction such as gastrointestinal disorders, dizziness, or similar reactions. Pharmaceutically acceptable carriers are for injections, such as buffers (e.g., saline or PBS), carbohythrates (e.g., glucose, mannose, sucrose or dextran), antioxidants, bacteriostatic agents, chelates. Agents (e.g., EDTA or glutathione), adjuvants (e.g. aluminum hydroxide), suspending agents, thickening agents, preservatives, painless agents, solubilizing agents, isotonic agents and/or stabilizers can be used. As described above, the formulation of the composition comprising the peptide of the present invention can be prepared in various ways as described above. For example, in the case of injection, it can be prepared in the form of a unit dosage ampoule or a multi-dose dosage form. The composition for drug delivery comprising the peptide of the present invention may be administered by a conventional drug administration method known in the art.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다.In addition, the pharmaceutical compositions of the present invention may be formulated using methods known in the art to provide rapid, sustained or delayed release of the active ingredient after administration to a mammal.

이하, 본 발명에 따르는 실시예 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples according to the present invention, but the scope of the present invention is not limited by the examples presented below.

<실시예 1> 위암의 복강 전이 진단용 펩타이드 프로브의 개발<Example 1> Development of a peptide probe for diagnosing abdominal metastasis of gastric cancer

(파지 디스플레이 및 타이터 검증)(Grass display and titer verification)

LGR5 단백질에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 획득하기 위하여 phD.-7 TM phage display peptide library kit를 사용하였으며 이는 ER2738 strain인 대장균(E.coli)와 무작위적으로 결합할 수 있는 2×1013 개의 랜덤 펩타이드를 포함한다. 먼저 96-웰 플레이트에 인간 LGR5 재조합 단백질을 5 mg/mL의 농도로 코팅한 후, 비특이적 결합을 저해하기 위해 3% BSA로 1시간 블록킹을 진행하였다. 블록킹이 끝난 플레이트에 랜덤 라이브러리 펩타이드를 1 mL 처리한 후 1시간 결합시키고 붙지 않은 라이브러리를 제거하기 위하여 TTBS(pH 7.5) 용액으로 충분히 헹궈주었다. 이 후 특이적으로 결합된 라이브러리만 획득하기 위하여 0.2 M 글리신(pH 2.2) 용액을 1 mL 첨가한 후 볼텍싱을 충분히 해주었다. 중화를 위해 150 ㎕의 1 M tris-HCl(pH 9.1) 용액을 첨가하여 주었다. 충분히 중화시킨 후 이를 대장균(E.coli) 배양액과 혼합하여 4시간 동안 라이브러리의 양을 증폭시켰다. 증폭된 라이브러리는 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 침지시키고 이는 다음 단백질 패닝의 라이브러리로 사용된다. 위와 같은 과정을 3회 거쳐 결과적으로 LGR5 재조합 단백질에 특이적으로 결합하는 라이브러리의 후보군을 도출하였다.To obtain a peptide that specifically binds to the LGR5 protein, the phD.-7 TM phage display peptide library kit was used, which is 2×10 13 randomly bound to the ER2738 strain E.coli. Contains peptides. First, a 96-well plate was coated with a human LGR5 recombinant protein at a concentration of 5 mg/mL, and then blocking was performed with 3% BSA for 1 hour to inhibit non-specific binding. After 1 mL of the random library peptide was treated on the blocked plate, it was bound for 1 hour, and sufficiently rinsed with TTBS (pH 7.5) solution to remove the non-stick library. After that, in order to obtain only the specifically bound library, 1 mL of a 0.2 M glycine (pH 2.2) solution was added and vortexing was performed sufficiently. For neutralization, 150 µl of 1 M tris-HCl (pH 9.1) solution was added. After sufficiently neutralizing it, the amount of the library was amplified for 4 hours by mixing it with the E. coli culture solution. The amplified library is immersed using polyethylene glycol, which is then used as a library for protein panning. As a result, a candidate group of a library that specifically binds to the LGR5 recombinant protein was derived through the above process three times.

아웃풋 검증은 최종적으로 도출된 라이브러리를 적정 농도로 희석한 후 isopropyl b-D-1 thiogalactopyranoside(IPTG)와 X-gal 제한 효소가 포함된 배지에 도말함으로써 진행된다. 단백질 패닝의 경우 아웃풋의 범위는 102에서 105 내로 나타났다.Output verification is carried out by diluting the finally derived library to an appropriate concentration and then spreading it on a medium containing isopropyl bD-1 thiogalactopyranoside (IPTG) and X-gal restriction enzyme. In the case of protein panning, the output range was found to be within 10 2 to 10 5.

(ELISA 분석)(ELISA analysis)

Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) 분석을 위해 96-웰 플레이트에 5 mg/mL의 농도로 LGR5 단백질과 BSA로 코팅한 후 블록킹을 진행하고 이 후 랜덤으로 선택된 48개의 파지를 각각 처리하였다. 처리 24시간 이후 충분히 헹궈주고 항-M13 항체-HRP를 100 ㎕씩 처리하였다. 반응하지 않은 항체를 제거하기 위해 헹궈주고 반응 용액으로 TMB를 15 분간 처리하였다. 이후 색의 변화를 관찰하고 충분히 반응이 이뤄졌다고 생각되면 반응정지액으로 H2SO4 용액을 처리하였다. 이후 420 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. For Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) analysis, a 96-well plate was coated with LGR5 protein and BSA at a concentration of 5 mg/mL, followed by blocking, followed by treatment of 48 randomly selected phages. After 24 hours of treatment, it was sufficiently rinsed and treated with 100 µl of anti-M13 antibody-HRP. To remove unreacted antibody, it was rinsed and TMB was treated with a reaction solution for 15 minutes. After observing the change in color, and if it was thought that the reaction was sufficiently achieved, the H 2 SO 4 solution was treated as a reaction stopper. Then, absorbance was measured at a wavelength of 420 nm.

(펩타이드 시퀀싱 및 합성)(Peptide sequencing and synthesis)

총 3회의 단백질 패닝의 마지막 아웃풋 라이브러리에서 48개의 콜로니를 무작위적으로 뽑아 대장균(E.coli)을 이용하여 농도를 증폭시킨 후 ssDNA를 획득하기 위하여 요오드 완충용액(iodide buffer)을 이용하여 용출시켰다. 이 후 250 ㎕의 100% 에탄올을 추가하고 20분간 상온에서 반응시킨 후 14,000 rpm에서 10분간 원심분리 후 70% 에탄올로 DNA 펠렛을 헹궈주었다. 마지막으로 증류수에 용출시켜준 후 시퀀싱하였다. 시퀀싱에 사용되는 가이드 프라이머는 5‘ - CCC TCA TAG TTA GC TAA C- 3’ (-96 gⅢ) 와 5‘ - GTA TGG GAT TTT GCT AAA CAA C - 3’ (-28 gⅢ) 가 사용된다. 이 후 ExPASy의 translate tool 과 reverse complement bioinformatics tool을 이용하여 최종 펩타이드 서열을 확인하였다. 48 colonies were randomly picked from the last output library of protein panning three times , and the concentration was amplified using E. coli , and then eluted using an iodine buffer to obtain ssDNA. Thereafter, 250 µl of 100% ethanol was added, reacted at room temperature for 20 minutes, centrifuged at 14,000 rpm for 10 minutes, and then the DNA pellet was rinsed with 70% ethanol. Finally, it was eluted in distilled water and then sequenced. Guide primers used for sequencing are 5'-CCC TCA TAG TTA GC TAA C-3' (-96 gIII) and 5'-GTA TGG GAT TTT GCT AAA CAA C-3' (-28 gIII). After that, the final peptide sequence was confirmed using ExPASy's translate tool and reverse complement bioinformatics tool.

최종 확인된 펩타이드 서열은 IPQILSI 서열의 7-mer 서열로 확인되었으며 Peptron Co.에 의뢰하여 합성하였다. 이후 인 비트로 및 인 비보 실험을 위하여 펩타이드의 N-말단에 Fluorescein isothiocyanate(FITC)와 cyanine 5.5(cy5.5) dye를 결합시켰으며 HPLC를 통해 순도 95% 이상의 펩타이드를 선택적으로 사용하였다. The final identified peptide sequence was identified as a 7-mer sequence of the IPQILSI sequence, and was synthesized by requesting Peptron Co. Subsequently, for in vitro and in vivo experiments, Fluorescein isothiocyanate (FITC) and cyanine 5.5 (cy5.5) dye were bound to the N-terminus of the peptide, and a peptide with a purity of 95% or more was selectively used through HPLC.

(세포 배양 및 세포 결합능 확인)(Confirmation of cell culture and cell binding ability)

본 발명에서 사용된 세포는 인간 위암세포로서 AGS, MKN28, MKN45 가 사용되었으며 추가적인 검증을 위하여 대장암 세포인 LoVo, HT29, SW480, DLD-1 세포가 사용되었다. 비교를 위해 대조군 세포로 CCD841 대장 섬유아세포를 선택하였으며 이는 MEM 배지에서 배양하였으며 나머지 세포는 RPMI 배지를 이용하였다. 이 후 LGR5 단백질에 특이적으로 결합하는 펩타이드의 각 위암 및 대장암 세포로의 결합력을 확인하기 위하여 면역화학염색 및 유세포 분석을 진행하였다.The cells used in the present invention were human gastric cancer cells, AGS, MKN28, MKN45, and colon cancer cells LoVo, HT29, SW480, and DLD-1 cells were used for further verification. For comparison, CCD841 colon fibroblasts were selected as control cells, which were cultured in MEM medium, and RPMI medium was used for the remaining cells. After that, immunochemical staining and flow cytometry were performed to confirm the binding ability of the peptides specifically binding to the LGR5 protein to each gastric cancer and colon cancer cells.

먼저 세포를 8-웰 챔버 슬라이드에 적당한 수로 씨딩한 후 4% 파라포름알데히드로 고정시켰다. 비특이적 결합을 막기 위해 3% BSA를 처리하고 이 후 FITC가 라벨링 된 펩타이드를 10 μM 의 농도로 각 웰에 1시간 가량 처리해주었다. 이 후 0.05% PBST(Triton X-100)로 충분히 헹궈준 후 핵 염색을 위해 DAPI 추가 염색을 진행하고 마운팅하였다. 슬라이드는 약 200배의 배율로 현미경을 통해 관찰되었으며 각 세포 간의 형광 노출 시간은 동일하게 진행하였다. 동일한 원리로 고정시키지 않은 세포의 결합력을 확인하기 위해 유세포 분석을 추가로 진행하였다. 세포를 트립신 처리로 떼어낸 후 원심분리하여 펩타이드를 처리하기 용이하게 준비한다. 각 세포에 3% BSA로 블록킹 후 10 μM FITC가 표지된 펩타이드를 10 μM의 농도로 처리하여 배양하였다. 이 후 원심분리하고 1% BSA에 용출시킨 후 유세포 분석기를 통해 분석하였다. First, cells were seeded with an appropriate number on an 8-well chamber slide, and then fixed with 4% paraformaldehyde. To prevent non-specific binding, 3% BSA was treated, and then, FITC-labeled peptide was treated in each well at a concentration of 10 μM for about 1 hour. Thereafter, after sufficiently rinsing with 0.05% PBST (Triton X-100), additional DAPI staining was performed and mounted for nuclear staining. The slide was observed through a microscope at a magnification of about 200 times, and the fluorescence exposure time between cells was the same. Flow cytometric analysis was further performed to confirm the binding force of cells that were not fixed according to the same principle. The cells are detached by trypsin treatment and then centrifuged to prepare the peptide for easy processing. After blocking with 3% BSA to each cell, 10 μM FITC-labeled peptide was treated at a concentration of 10 μM and cultured. Thereafter, centrifugation was performed, eluted in 1% BSA, and analyzed by flow cytometry.

(펩타이드의 경쟁적 저해)(Competitive inhibition of peptides)

본 발명의 펩타이드와 기존 개발된 LGR5 항체의 세포 결합 세기를 비교하기 위해 경쟁적 저해능을 진행하였다. 위암세포주인 MKN45 세포주를 8웰 챔버에 씨딩한 후 4% 파라포름알데히드로 24시간 고정시킨 후 FITC가 표지된 펩타이드, 기존 LGR5 항체, 펩타이드와 항체를 섞어서 각각 처리하였다. 이 후 분석을 위해 형광현미경을 통해 200배의 배율로 확인하였다. Competitive inhibition was performed to compare the cell binding strength of the peptide of the present invention and the previously developed LGR5 antibody. The gastric cancer cell line, MKN45 cell line, was seeded in an 8-well chamber, fixed with 4% paraformaldehyde for 24 hours, and treated with FITC-labeled peptide, existing LGR5 antibody, and peptide and antibody mixed. After that, it was confirmed at 200 times magnification through a fluorescence microscope for analysis.

대조군 펩타이드는 2008년 nature medicine 에 게재된 Thomas D Wang 교신저자의 논문(https://www.nature.com/articles/nm1692)에서 사용된 대조군 펩타이드인 QLMRPPV 서열을 사용하였다.As a control peptide, the QLMRPPV sequence, a control peptide used in the paper of Thomas D Wang's corresponding author (https://www.nature.com/articles/nm1692) published in Nature Medicine in 2008, was used.

(위암 복강 전이 동물 모델)(Stomach cancer abdominal metastasis animal model)

인 비트로 실험 데이터를 기반으로 더 나아가 인 비보에서의 펩타이드의 결합능을 확인하기 위해 위암세포주로 복강 전이 모델을 만들었으며 8주령의 수컷 Balb/c nude 마우스를 사용하였다. 먼저 GFP-MKN45 세포를 각 마우스에 1×107 의 세포수가 되도록 1×PBS에 희석한 후 복강을 통해 주입해주었으며 약 2주 이후 위암 복강 전이 모델을 확립하였다. GFP-MKN45 세포는 가톨릭대학교 임향숙 교수팀에서 제공받아 사용되었으며 이 후 동물실험은 가톨릭대학교 실험동물센터의 관리 하에 진행되었고 AAALAC 가이드라인을 준수하여 진행하였다. Based on the in vitro experimental data, in order to further confirm the binding ability of the peptide in vivo, an intraperitoneal metastasis model was made to a gastric cancer cell line, and an 8-week-old male Balb/c nude mouse was used. First, GFP-MKN45 cells were diluted in 1×PBS to a cell number of 1×10 7 in each mouse, and then injected through the intraperitoneal cavity, and a gastric cancer intraperitoneal metastasis model was established after about 2 weeks. The GFP-MKN45 cells were provided and used by Professor Hyang-Sook Lim's team at the Catholic University of Korea. After that, animal experiments were conducted under the management of the Catholic University Laboratory Animal Center and followed the AAALAC guidelines.

(동물 모델 이미징)(Animal model imaging)

본 발명의 펩타이드의 표적능을 확인하기 위해 완성된 위암 복강 전이 모델에 cy5.5가 표지된 펩타이드를 주입한 후 형광을 측정하였다. 총 2개의 그룹으로 진행되었으며 본 발명의 펩타이드를 복강 주입해준 그룹(n=5)과 대조군 그룹(n=4, 1마리는 실험 도중 몸무게의 급격한 감소로 안락사 진행)으로 구성하였다. 펩타이드는 10 μM 농도로 1 mL의 1×PBS에 희석한 후 복강 주사를 통해 주입하였으며 1시간 동안 체내 반응 후 이미징 분석을 실시하였다. 480 nm에서 520 nm의 파장대의 형광(green)을 통해 마우스 체내 GFP-MKN45 세포의 복강 내 분포 및 종양 형성 정도를 확인하였으며 620 nm에서 680 nm의 파장대(red)의 형광으로 각 펩타이드의 표적능을 추가로 확인하였다. 이 후 안락사를 진행하여 마우스의 심장, 폐, 간, 비장, 신장, 장간막, 종양 조직에서의 펩타이드 형광분포를 확인하였다. 이미징 촬영은 각 장기에 비특이적으로 결합된 펩타이드의 제거를 위해 1×PBS로 충분한 세척 과정을 거친 후 진행하였다. In order to confirm the target function of the peptide of the present invention, a peptide labeled with cy5.5 was injected into the completed gastric cancer intraperitoneal metastasis model, and then fluorescence was measured. It consisted of a total of two groups, a group in which the peptide of the present invention was injected intraperitoneally (n=5) and a control group (n=4, one animal was euthanized due to a rapid decrease in body weight during the experiment). Peptides were diluted in 1 mL of 1×PBS at a concentration of 10 μM and injected through intraperitoneal injection. After reaction in the body for 1 hour, imaging analysis was performed. The intraperitoneal distribution and tumor formation of GFP-MKN45 cells in the mouse body were confirmed through fluorescence (green) in the wavelength band of 480 nm to 520 nm, and the target ability of each peptide was determined by fluorescence in the wavelength band (red) of 620 nm to 680 nm. Further confirmed. Afterwards, euthanasia was performed to confirm the distribution of peptide fluorescence in the heart, lung, liver, spleen, kidney, mesentery, and tumor tissues of mice. Imaging was performed after a sufficient washing process with 1×PBS to remove non-specifically bound peptides to each organ.

<실험예 1> ELISA 결과<Experimental Example 1> ELISA result

파지 디스플레이를 통해 획득한 총 48개의 랜덤 파지 중 LGR5 단백질에 결합능이 높은 파지를 선택적으로 분리하기 위하여 ELISA를 진행하였다. ELISA was performed to selectively isolate phage having high binding ability to LGR5 protein among a total of 48 random phages obtained through phage display.

그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 총 4개의 파지가 LGR5 단백질에 대한 결합능이 높게 나타났으며 본 발명은 그중에서 24번 파지를 선택하여 추후 실험에 사용하였다. 나머지 파지 후보군인 16번, 22번과 23번 파지에 대한 실험도 추가적으로 진행되었으나 이 후 다른 실험 결과에서 24번 파지의 결과에 미치지 못하여 최종적인 후보군에서 제외되었다.As a result, as shown in FIG. 1, a total of four phages showed high binding ability to the LGR5 protein, and the present invention selected phage No. 24 from among them and used for later experiments. The remaining phage candidate groups, phage Nos. 16, 22, and 23, were additionally tested, but after that, the results of other experiments did not reach the result of phage No. 24, so they were excluded from the final candidate group.

<실험예 2> 면역화학염색 결과<Experimental Example 2> Immunochemical staining result

선택된 24번 파지의 위암세포에 대한 표적능을 육안으로 확인하기 위하여 면역화학염색을 실시하였다. 위암세포로는 AGS, MKN28, MKN45를 사용하였으며 대조군세포로 CCD18Co 대장 섬유아세포를 사용하였다. Immunochemical staining was performed to visually confirm the target ability of the selected phage 24 against gastric cancer cells. AGS, MKN28, and MKN45 were used as gastric cancer cells, and CCD18Co colon fibroblasts were used as control cells.

그 결과, 도 2 및 3에 나타난 바와 같이, CCD18Co 세포에는 높게 결합하지 않으나 AGS, MKN28, MKN45와 같은 위암세포주에는 훨씬 더 유의적으로 결합하는 것을 확인하였다. 추가로 대장암에 대한 반응성을 확인하기 위하여 대장암세포주인 HT29, LOVO, DLD-1 세포에 대한 결합능을 확인하였으나 위암세포주와 같은 유의적인 차이는 없었다.As a result, as shown in Figs. 2 and 3, it was confirmed that it was not highly bound to CCD18Co cells, but much more significantly bound to gastric cancer cell lines such as AGS, MKN28, and MKN45. In addition, in order to confirm the reactivity to colorectal cancer, the binding ability to HT29, LOVO, and DLD-1 cells, which are colorectal cancer cell lines, was confirmed, but there was no significant difference as in the gastric cancer cell line.

이후 24번 파지의 DNA 서열을 근거로 펩타이드 합성을 진행하였으며 N-말단에 FITC를 표지하였다. FITC가 표지된 합성 펩타이드의 결합능을 면역화학염색을 통해 확인하였으며 마찬가지로 위암세포주에 처리하였을 때 대조군 세포보다 유의적으로 결합하는 것을 확인하였다. 또한, 대조군 펩타이드의 결합능을 확인하였으나 이는 모든 위암세포주와 대장암세포주에서 유의적인 변화가 없는 것을 확인할 수 있었으며 이를 근거로 동물실험에도 같은 대조군 펩타이드로 동일하게 사용하였다(도 4 및 도 5).Thereafter, peptide synthesis was performed based on the DNA sequence of phage No. 24, and FITC was labeled at the N-terminus. The binding ability of the synthetic peptide labeled with FITC was confirmed through immunochemical staining, and similarly, when treated with gastric cancer cell lines, it was confirmed that it binds more significantly than the control cells. In addition, it was confirmed that the binding ability of the control peptide was confirmed, but it was confirmed that there was no significant change in all gastric cancer cell lines and colorectal cancer cell lines, and based on this, the same control peptide was used as the same control peptide in animal experiments (FIGS. 4 and 5).

<실험예 3> 유세포 분석 <Experimental Example 3> Flow cytometric analysis

표지된 펩타이드의 위암세포주에 대한 결합력을 한 번 더 확인하고자 유세포 분석을 실시하였으며 이는 세포를 고정시키지 않고 살아있는 상태로 진행되었다. 대조군 세포인 CCD841 세포와 위암세포주인 AGS, MKN28, MKN45에 합성된 펩타이드를 10 μM의 농도로 처리하여 펩타이드와 결합된 세포의 수를 계수하였다. Flow cytometry was performed to confirm the binding ability of the labeled peptide to the gastric cancer cell line once more, which proceeded to a living state without immobilizing the cells. The peptides synthesized in the control cells, CCD841 cells and gastric cancer cell lines, AGS, MKN28, and MKN45, were treated at a concentration of 10 μM, and the number of cells bound to the peptide was counted.

그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 대조군에 비하여 훨씬 더 많은 세포가 형광이 표지된 표적 펩타이드와 결합한 것을 확인할 수 있었다. As a result, as shown in FIG. 6, it was confirmed that much more cells were bound to the fluorescently-labeled target peptide compared to the control group.

<실험예 4> 경쟁적 저해능 확인 결과<Experimental Example 4> Competitive inhibitory ability confirmation result

표적 펩타이드와 기존에 사용되는 LGR5 항체간의 결합성 차이를 확인하기 위해 면역화학염색을 진행하였다. 표적 펩타이드만 처리한 그룹과 항체만 처리한 그룹, 그리고 펩타이드와 항체를 섞은 후 함께 처리한 그룹으로 나누어 진행하였다.Immunochemical staining was performed to confirm the difference in binding between the target peptide and the existing LGR5 antibody. The process was divided into a group treated with only the target peptide, a group treated with only the antibody, and a group treated with the peptide and antibody mixed and then treated together.

그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 항체보다 표적 펩타이드가 MKN45 위암세포주에 먼저 선점적으로 결합하여 항체의 결합능이 떨어지는 것을 확인하였다.As a result, as shown in FIG. 7, it was confirmed that the target peptide was preemptively bound to the MKN45 gastric cancer cell line rather than the antibody, and the binding ability of the antibody was lowered.

<실험예 5> 인 비보 실험 결과<Experimental Example 5> In vivo test results

마우스 체내에서의 종양 생성 및 표적 펩타이드의 결합능을 확인하기 위하여 위암 복강 전이 모델을 확립하였다. GFP-MKN45 세포주를 복강에 주입한 후 종양 생성을 유도하고 이 후 표적 펩타이드 및 대조군 펩타이드를 복강 내 주입함으로써 펩타이드 간 종양으로의 결합능을 in vivo imaging system(IVIS)을 통해서 비교하였다. A gastric cancer intraperitoneal metastasis model was established to confirm tumor formation and binding ability of the target peptide in the mouse body. After injecting the GFP-MKN45 cell line into the peritoneal cavity, tumor formation was induced, and then, by intraperitoneal injection of the target peptide and the control peptide, the binding ability to the tumor between the peptides was compared through an in vivo imaging system (IVIS).

그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, GFP-MKN45 세포의 주입을 통해 복강 내 종양 생성이 잘 되었음을 확인하였고 cy5.5가 표지된 펩타이드의 주입 또한 복강 내로 잘 전달되었음을 확인하였다.As a result, as shown in FIG. 8, it was confirmed that tumor formation in the intraperitoneal cavity was well performed through the injection of GFP-MKN45 cells, and it was confirmed that the injection of the peptide labeled with cy5.5 was also well delivered into the intraperitoneal cavity.

대조군 펩타이드와 표적 펩타이드의 체내 주입 후 장간막에 생성된 암과의 결합능을 비교하였다. 각 마우스 마다 장간막을 채취한 후 비특이적인 결합을 제거하기 위해 1×PBS로 충분히 헹궈준 후 IVIS 촬영을 진행하였다. 그 결과, 표적 펩타이드의 결합력이 대조군에 비해 훨씬 높은 것을 확인하였다(도 9). The binding ability with cancer generated in the mesentery was compared after injection of the control peptide and the target peptide into the body. After the mesentery was collected for each mouse, it was sufficiently rinsed with 1×PBS to remove non-specific binding, and then IVIS was taken. As a result, it was confirmed that the binding power of the target peptide was much higher than that of the control group (FIG. 9).

장간막 외에 심장, 폐, 간, 비장, 신장, 종양 조직을 따로 떼어 낸 후 IVIS 촬영을 진행하였다. 그 결과, 대조군에서는 종양조직에서 형광 세기가 약하지만 표적 펩타이드를 처리한 종양조직에서는 형광값이 매우 높게 나타났다(도 10). In addition to the mesentery, the heart, lung, liver, spleen, kidney, and tumor tissues were separately removed, and then IVIS was taken. As a result, in the control group, the fluorescence intensity was weak in the tumor tissue, but the fluorescence value was very high in the tumor tissue treated with the target peptide (FIG. 10).

이러한 결과를 바탕으로 본 발명의 표적 펩타이드가 위암세포주에 특이적으로 결합함에 따라 향후 임상 분석 및 내시경에서의 이미징 지표로서 사용될 수 있는 가능성을 확인하였다. Based on these results, as the target peptide of the present invention specifically binds to a gastric cancer cell line, it was confirmed that it could be used as an imaging index in future clinical analysis and endoscopy.

<110> CATHOLIC UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Peptide probe for diagnosing peritoneal carcinomatosis of gastric cancer <130> P19U11C0510 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide probe of LGR5 protein <400> 1 Ile Pro Gln Ile Leu Ser Ile 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Control peptide probe <400> 2 Gln Leu Met Arg Pro Pro Val 1 5 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 96 gIII primer <400> 3 ccctcatagt tagctaac 18 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 28 gIII primer <400> 4 gtatgggatt ttgctaaaca ac 22 <110> CATHOLIC UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Peptide probe for diagnosing peritoneal carcinomatosis of gastric cancer <130> P19U11C0510 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide probe of LGR5 protein <400> 1 Ile Pro Gln Ile Leu Ser Ile 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Control peptide probe <400> 2 Gln Leu Met Arg Pro Pro Val 1 5 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 96 gIII primer <400> 3 ccctcatagt tagctaac 18 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 28 gIII primer <400> 4 gtatgggatt ttgctaaaca ac 22

Claims (10)

SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함하는 LGR5(Leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor 5) 단백질 표적용 펩타이드.
LGR5 (Leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor 5) protein targeting peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
 제1항의 펩타이드를 포함하는 LGR5 단백질 검출용 조성물.
A composition for detecting LGR5 protein comprising the peptide of claim 1.
 제1항의 펩타이드를 포함하는 위암의 복강 전이 진단용 조성물.
A composition for diagnosing abdominal metastasis of gastric cancer comprising the peptide of claim 1.
 제1항의 펩타이드를 포함하는 위암의 복강 전이 영상화용 조성물.
A composition for imaging intraperitoneal metastasis of gastric cancer comprising the peptide of claim 1.
 제4항에 있어서,
펩타이드는 발색효소, 방사성동위원소, 발색단(chromophore), 발광물질, 형광물질, 상자성입자(superparamagnetic particles) 및 초상자성입자(ultrasuper paramagnetic particles)로 이루어진 군에서 선택되는 하나로 표지된 것인, 포함하는 위암의 복강 전이 영상화용 조성물.
The method of claim 4,
Peptides are labeled with one selected from the group consisting of chromogenic enzymes, radioisotopes, chromophores, luminescent substances, fluorescent substances, superparamagnetic particles, and ultrasuper paramagnetic particles, including gastric cancer. A composition for imaging metastasis of the abdominal cavity.
 검체로부터 분리된 생물학적 시료 및 제1항의 펩타이드를 접촉시켜 LGR5 단백질을 검출하고, 검출된 수준이 비-위암세포 대조군보다 높은 경우 위암의 복강 전이로 진단하는 단계를 포함하는 위암의 복강 전이 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
It is necessary for the diagnosis of abdominal metastasis of gastric cancer, including the step of detecting the LGR5 protein by contacting the biological sample isolated from the sample and the peptide of claim 1, and diagnosing the intraperitoneal metastasis of gastric cancer when the detected level is higher than the non-gastric cancer cell control How to provide information.
 제6항에 있어서,
생물학적 시료는 장간막 및 복강액을 포함하는, 방법.
The method of claim 6,
The method of claim 1, wherein the biological sample comprises mesentery and peritoneal fluid.
 제6항에 있어서,
단백질 검출은 효소면역분석법(ELISA), 방사면역분석법(radioimmunoassay, RIA), 방사면역확산법(Radial Immunodiffusion), 샌드위치 ELISA법, 웨스턴 블롯, 면역침전법, 면역조직화학염색법, 면역전기영동법, 오우크테로니 면역확산법(Ouchterlony immunodiffusion), 면역형광법, 효소기질발색법, 항원-항체 응집법, SPR(surface plasmon resonance) 및 단백질 칩으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나에 의한 것인, 방법.
The method of claim 6,
Protein detection is enzyme immunoassay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), radioimmunoassay (RIA), sandwich ELISA, western blot, immunoprecipitation, immunohistochemical staining, immunoelectrophoresis, oktero. Nii immunodiffusion (Ouchterlony immunodiffusion), immunofluorescence, enzyme substrate coloring, antigen-antibody aggregation method, SPR (surface plasmon resonance), and by any one selected from the group consisting of a protein chip, the method.
 제1항의 펩타이드를 포함하는 위암에 특이적인 약물 전달용 조성물.
A composition for drug delivery specific for gastric cancer comprising the peptide of claim 1.
 제1항의 펩타이드; 및
상기 펩타이드와 결합하는 약제학적 활성성분을 포함하는 위암의 복강 전이 예방 또는 치료용 조성물.The peptide of claim 1; And
A composition for preventing or treating abdominal metastasis of gastric cancer comprising a pharmaceutical active ingredient that binds to the peptide.
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