KR20210030846A - 세포밖 소포의 메타게놈 및 대사체 기반 대장암 진단방법 - Google Patents

세포밖 소포의 메타게놈 및 대사체 기반 대장암 진단방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세포밖 소포의 메타게놈 및 대사체 기반 대장암 진단방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 대장암 진단방법은 장내 세균에서 분비되는 세포밖 소포의 메타게놈 분석 및 세포밖 소포에서의 대사체 분석을 통해 대장암을 조기에 진단 및 예측할 수 있으며, 대장암에서 유의하게 함량이 변화한 세균 유래 세포밖 소포 및 아미노산, 아미노알콜, 방향족알콜, 카복실산, 지방산 등의 대사물질을 확인하고, 이들의 연관성을 확인하여 바이오마커로 함께 사용함으로써 대장암 진단의 정확도를 향상시켜 대장암의 발병률을 낮추고 치료효과를 높일 수 있을 것으로 기대된다.

Description

세포밖 소포의 메타게놈 및 대사체 기반 대장암 진단방법 {Method for diagnosing colorectal cancer based on metagenome and metabolome of extracellular vesicles}
본 발명은 세균 유래 세포밖 소포의 메타게놈 및 대사체 분석을 기반으로 대장암을 진단하는 방법에 관한 것이다.
대장암 (Colorectal cancer, CRC)은 가장 흔한 암 중 하나이며 전 세계적으로 암 관련 사망의 두 번째 주요 원인으로, 대부분의 대장암 사례는 산발적으로 발생하며 환경적 요인이 질병의 주요 원인으로 나타난다. 식이요법은 오랫동안 대장암의 가장 중요한 생활 습관 위험 요소로 간주되어 왔다. In vivo 및 in vitro 연구는 단백질 섭취가 대장암 위험에 미치는 영향을 조사했으며 고단백질 식이요법이 대장암에서 DNA 손상을 일으키고 대장 점막 두께를 감소시키며 대장 세포의 미소융모 높이를 감소시킬 수 있다고 보고된 바 있다. 이러한 식이요법으로 유도된 사람 장내 미생물의 변화로 인해 대장암 발병율이 증가한다는 우려가 커지고 있으며, 이에 연구자들은 종양이 주로 약 70%의 숙주 미생물 군집이 정착한 대장 말단과 직장에서 우선적으로 발생하기 때문에, 장내 미생물군집이 대장암의 시작과 진행에 중요하다고 밝혔다. 미생물은 인터루킨, 종양 괴사 인자-알파(TNF-alpha), 활성산소종과 같은 매개체를 분비하여 대장암 발병을 돕는 미세환경을 생성할 잠재성이 있으며, 장내 미생물의 대사물질은 대장암 발병 위험을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 장내 미생물에 의해 생산되는 아세트 알데히드의 함량이 높을 경우, 장내 엽산이 분해되어 대장암 위험이 증가할 수 있다.
초기 대장암의 경우에는 특별한 증상이 나타나지 않으나 증상이 없는 경우에도 눈에 띄지 않는 장 출혈로 혈액이 손실되어 빈혈이 생길 수 있고, 간혹 식욕부진과 체중감소가 나타나기도 한다. 암이 진행된 경우에는 배가 아프거나 설사 또는 변비가 생기는 등 배변습관의 변화가 나타나기도 하고 항문에서 피가 나오는 직장출혈의 증세가 나타나기도 하며, 혈액은 밝은 선홍색을 띄거나 검은 색으로 나타날 수 있다. 대장암이 진행이 된 경우에는 배에서 평소에 만져지지 않던 덩어리가 만져질 수 있다. 가장 주의해야 할 증상으로는 배변 습관의 변화, 혈변, 동통 및 빈혈이며, 특히 40세 이상의 성인에서 이와 같은 변화가 있을 때에는 철저히 조사할 필요가 있다.
대장암의 확진은 대장 내시경 검사를 통한 조직검사를 통해 암세포를 발견해야 가능하다. 대부분 대장암은 조기에는 증상이 없으므로 진단이 상당히 어렵고, 현재 비침습적인 방법으로 대장암을 예측하는 방법은 전무하다. 기존 진단방법으로는 대장암 등의 고형암이 진행된 경우에 발견되는 경우가 많기 때문에, 대장암으로 인한 의료비용과 사망을 예방하기 위해선 대장암 발생 및 원인인자를 미리 예측하여, 고위험군에서 대장암 발생을 예방하는 방법을 제공하는 것이 효율적인 방법이다.
한편, 인체에 공생하는 미생물은 100조에 이르러 인간 세포보다 10배 많으며, 미생물의 유전자수는 인간 유전자수의 100배가 넘는 것으로 알려지고 있다. 미생물총(microbiota 혹은 microbiome)은 주어진 거주지에 존재하는 세균(bacteria), 고세균(archaea), 진핵생물(eukarya)을 포함한 미생물 군집(microbial community)을 말하고, 장내 미생물총은 사람의 생리현상에 중요한 역할을 하며, 인체 세포와 상호작용을 통해 인간의 건강과 질병에 큰 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 최근에는 metaloprotease와 같은 특정 독소를 갖는 장내 세균에 의해 대장암이 발생한다고 보고된 바 있다.
미생물 유래 세포밖 소포는 장내 미생물과 인간 건강의 교차점을 이해하는데 있어서 중요한 새로운 연구 주제로 부상하고 있다. 장내 미생물이 외막 소포체, 소포체 배출(shedding vesicles) 및 세포 사멸체(apoptotic body)를 포함하여 여러 종류의 세포밖 소포(extracellular vesicle, EV)를 분비한다는 것은 잘 알려져 있다. 세포밖 소포는 주로 지질, 단백질, 핵산 및 대사물질로 구성되고, 근본적인 메커니즘은 여전히 불분명하지만, 주된 역할은 장거리에서 활성 생체 분자를 세포 내로 이동시켜 표적 부위에 약물 전달을 제공하거나 숙주 세포 반응을 조절하는 것이다.
최근의 연구는 대장암 진행에 있어서 장내 미생물의 관여에 대한 기계론적인 증거를 제공하고 있다. 생체 내 연구에서 유전적으로 대장암 발생에 영향을 받는 돌연변이 마우스가 기존의 미생물을 가진 마우스에 비해 무균 상태에서 현저히 적은 종양을 가지고 있음을 보여 주었다. 또한, Enterococcus faecalis와 Eschelichia coli는 세포 외 유전 독성과 대장암 발생에 기여할 수 있는 DNA를 표적하는 자유 라디칼을 생성한다. 그러나, 장에서 세균이 어떤 질병의 유발 신호를 생성하는지는 아직 분명하게 밝혀진 바가 없다.
이에, 본 발명자들은 16S rDNA 앰플리콘 시퀀싱 및 대사체를 이용하여 대장암 환자와 정상인으로부터 세균 유래 세포밖 소포를 분리하여 이의 메타게놈 분석 및 대사체 분석을 통해 대장암을 진단하는 방법을 개발하였다.
한국공개특허공보 10-2004-0039304호
본 발명자들은 대장암을 진단하기 위하여, 정상인 및 피검자의 대변 샘플에서 세균 유래 세포밖 소포를 분리하고 이로부터 유전자를 추출하여 메타게놈 분석을 수행함과 동시에 상기 세포밖 소포에서의 대사체 분석을 수행하여 대장암의 원인인자로 작용할 수 있는 세균 유래 세포밖 소포 및 대사물질을 동정하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 (a) 정상인 및 피검자 샘플을 분리하는 단계;
(b) 상기 샘플로부터 세포밖 소포를 분리하는 단계;
(c) 분리한 세포밖 소포로부터 DNA를 추출하여 메타게놈(metagenome) 분석을 통해 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계; 및
(d) 분리한 세포밖 소포에서의 대사체 분석을 통해 대사물질의 함량 증감을 비교하는 단계를 포함하는, 대장암 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 대장암 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다:
(a) 정상인 및 피검자 샘플을 분리하는 단계;
(b) 상기 샘플로부터 세포밖 소포를 분리하는 단계;
(c) 분리한 세포밖 소포로부터 DNA를 추출하여 메타게놈(metagenome) 분석을 통해 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계; 및
(d) 분리한 세포밖 소포에서의 대사체 분석을 통해 대사물질의 함량 증감을 비교하는 단계.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 대장암 발병을 예측하기 위한 정보제공방법을 제공한다:
(a) 정상인 및 피검자 샘플을 분리하는 단계;
(b) 상기 샘플로부터 세포밖 소포를 분리하는 단계;
(c) 분리한 세포밖 소포로부터 DNA를 추출하여 메타게놈(metagenome) 분석을 통해 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계; 및
(d) 분리한 세포밖 소포에서의 대사체 분석을 통해 대사물질의 함량 증감을 비교하는 단계.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 대장암 진단방법을 제공한다:
(a) 정상인 및 피검자 샘플을 분리하는 단계;
(b) 상기 샘플로부터 세포밖 소포를 분리하는 단계;
(c) 분리한 세포밖 소포로부터 DNA를 추출하여 메타게놈(metagenome) 분석을 통해 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계; 및
(d) 분리한 세포밖 소포에서의 대사체 분석을 통해 대사물질의 함량 증감을 비교하는 단계.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 샘플은 대변일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 대사물질은 아미노산(amino acid), 아미노알콜(amino alcohol), 방향족알콜(aromatic alcohol), 카복실산(carboxylic acid), 및 지방산(fatty acid)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 (c) 단계에서 퍼미쿠테스(Firmicutes) 및 프로테오박테리아(Proteobacteria)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 문(phylum) 세균 유래 세포밖 소포, 또는
액티노마이세스(Actinomyces), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 로티아(Rothia), 프로피오니박테리움(Propionibacterium), 콜린셀라(Collinsella), 박테로이달레스(Bacteroidales) S24-7 그룹 (f), 클로로플라스트(Chloroplast) (o), 블라우티아(Blautia), 라치노클로스트리디움(Lachnoclostridium), 라치노스피라시에(Lachnospiraceae) NK4A136 그룹, 라치노스피라시에(Lachnospiraceae) UCG-008, 도레아(Dorea), 에우박테리움 코프로스타놀리게네스(Eubacterium coprostanoligenes) 그룹, 루미노코카시에(Ruminococcaceae) UCG-002, 루미노코커스(Ruminococcus) 2, 서브돌리그라눌럼(Subdoligranulum), 루미노코카시에(Ruminococcaceae) (f), 루미노코카시에(Ruminococcaceae) UCG-014, 패칼리박테리움(Faecalibacterium), 루미노코카시에(Ruminococcaceae) NK4A214 그룹, 스타필로코커스(Staphylococcus), 카테니박테리움(Catenibacterium), 파르비모나스(Parvimonas), 루미니클로스트리디움(Ruminiclostridium) 5, 메틸로박테리움(Methylobacterium), 솔라늄 멜로게나(Solanum Melongena), 스핑고모나스(Sphingomonas), 디아포로박터(Diaphorobacter), 에스케리치아-시겔라(Escherichia-shigella), 프로테우스(Proteus), 슈도모나스(Pseudomonas), 엔테로박터(Enterobacter), 사카리박테리아(Saccharibacteria) (p), 및 몰리쿠테스(Mollicutes) RF9 (o) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 (c) 단계에서 정상인에 비해 퍼미쿠테스(Firmicutes) 문(phylum) 세균 유래 세포밖 소포, 또는
비피도박테리움(Bifidobacterium), 콜린셀라(Collinsella), 블라우티아(Blautia), 라치노클로스트리디움(Lachnoclostridium), 라치노스피라시에(Lachnospiraceae) UCG-008, 도레아(Dorea), 에우박테리움 코프로스타놀리게네스(Eubacterium coprostanoligenes) 그룹, 루미노코카시에(Ruminococcaceae) UCG-002, 루미노코커스(Ruminococcus) 2, 서브돌리그라눌럼(Subdoligranulum), 루미노코카시에(Ruminococcaceae) (f), 패칼리박테리움(Faecalibacterium), 루미노코카시에(Ruminococcaceae) NK4A214 그룹, 카테니박테리움(Catenibacterium), 파르비모나스(Parvimonas), 루미니클로스트리디움(Ruminiclostridium) 5, 디아포로박터(Diaphorobacter), 및 엔테로박터(Enterobacter)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 증가되어 있는 경우 대장암의 발병 위험도가 높을 것으로 예측할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 (c) 단계에서 정상인에 비해 프로테오박테리아(Proteobacteria) 문(phylum) 세균 유래 세포밖 소포, 또는
액티노마이세스(Actinomyces), 로티아(Rothia), 프로피오니박테리움(Propionibacterium), 박테로이달레스(Bacteroidales) S24-7 그룹 (f), 클로로플라스트(Chloroplast) (o), 라치노스피라시에(Lachnospiraceae) NK4A136 그룹, 루미노코카시에(Ruminococcaceae) UCG-014, 스타필로코커스(Staphylococcus), 메틸로박테리움(Methylobacterium), 솔라늄 멜로게나(Solanum melongena), 스핑고모나스(Sphingomonas), 에스케리치아-시겔라(Escherichia-shigella), 프로테우스(Proteus), 슈도모나스(Pseudomonas), 사카리박테리아(Saccharibacteria) (p), 및 몰리쿠테스(Mollicutes) RF9 (o)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 감소되어 있는 경우 대장암의 발병 위험도가 높을 것으로 예측할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 (d) 단계에서 류신(Leucine), 이소류신(Isoleucine), 알라닌(Alanine), 리신(Lysine), 티라민(Tyramine), 아미노이소부티르산(Aminoisobutyric acid), 에탄올아민(Ethanolamine), 페놀(Phenol), 퓨로산(Furoic acid), 숙신산(Succinic acid), 옥살산(Oxalic acid), 부탄산(Butanoic acid), 헥산산(Hexanoic acid), 팔미트산(Palmitic acid), 및 올레산(Oleic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 대사물질의 함량 증감을 비교할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 (d) 단계에서 정상인에 비해 류신(Leucine), 이소류신(Isoleucine), 알라닌(Alanine), 리신(Lysine), 티라민(Tyramine), 에탄올아민(Ethanolamine), 페놀(Phenol), 퓨로산(Furoic acid), 숙신산(Succinic acid), 옥살산(Oxalic acid), 헥산산(Hexanoic acid), 팔미트산(Palmitic acid), 및 올레산(Oleic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 대사물질의 함량이 증가되어 있는 경우 대장암의 발병 위험도가 높을 것으로 예측할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 (d) 단계에서 정상인에 비해 아미노이소부티르산(Aminoisobutyric acid) 또는 부탄산(Butanoic acid)의 함량이 감소되어 있는 경우 대장암의 발병 위험도가 높을 것으로 예측할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 (c) 단계에서 정상인에 비해 콜린셀라(Collinsella) 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 증가되어 있고 솔라늄 멜로게나(Solanum melongena)속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 감소되어 있으며,
상기 (d) 단계에서 정상인에 비해 류신(Leucine) 및 옥살산(Oxalic acid)이 증가되어 있는 경우 대장암의 발병 위험도가 높을 것으로 예측할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 대장암 진단방법은 장내 세균에서 분비되는 세포밖 소포의 메타게놈 분석 및 세포밖 소포에서의 대사체 분석을 통해 대장암을 조기에 진단 및 예측할 수 있으며, 대장암에서 유의하게 함량이 변화한 세균 유래 세포밖 소포 및 아미노산, 아미노알콜, 방향족알콜, 카복실산, 지방산 등의 대사물질을 확인하고, 이들의 연관성을 확인하여 바이오마커로 함께 사용함으로써 대장암 진단의 정확도를 향상시켜 대장암의 발병률을 낮추고 치료효과를 높일 수 있을 것으로 기대된다.
도 1a는 본 발명의 일 구현예에 따른 대장암 환자 및 정상인 유래 세포밖 소포에서 Chao1 지수와 Shannon 지수를 이용하여 알파(alpha) 다양성을 비교한 결과를 나타낸 도면이다.
도 1b는 본 발명의 일 구현예에 따른 대장암 환자 및 정상인 유래 세포밖 소포에서 주요 좌표 분석(principal coordinate analysis, pCoA)을 통해 문(phylum)(왼쪽) 및 속(genus)(오른쪽) 수준에서 베타(beta) 다양성을 비교한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2a 및 2b는 본 발명의 일 구현예에 따른 대장암 환자 및 정상인 유래 세포밖 소포의 메타게놈 분석을 통해 문(phylum) 수준에서 유의적으로 변화한 세균 유래 세포밖 소포의 분포를 나타낸 것으로, 도 2a는 히트 맵(heat map)으로 나타낸 도면이고 도 2b는 막대 그래프로 나타낸 도면이다.
도 2c 및 2d는 본 발명의 일 구현예에 따른 대장암 환자 및 정상인 유래 세포밖 소포의 메타게놈 분석을 통해 속(genus) 수준에서 유의적으로 변화한 세균 유래 세포밖 소포의 분포를 나타낸 것으로, 도 2c는 히트 맵(heat map)으로 나타낸 도면이고 도 2d는 막대 그래프로 나타낸 도면이다.
도 3a는 본 발명의 일 구현예에 따른 대장암 환자 및 정상인으로부터 분리한 세균 유래 세포밖 소포의 문(phylum) 수준에서의 분류학적 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 3b는 본 발명의 일 구현예에 따른 대장암 환자 및 정상인으로부터 분리한 세균 유래 세포밖 소포의 속(genus) 수준에서의 분류학적 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 4a 및 4b는 본 발명의 일 구현예에 따른 대장암 환자 및 정상인에서의 대사체를 가스 크로마토그래피 time-of-flight 질량 분석을 이용하여 분석한 결과를 확인한 것으로, 도 4a는 3차원 PCA의 스코어 플롯(score plot)을 나타낸 도면이고, 도 4b는 PC1 및 PC2의 로딩 플롯(loading plot)을 나타낸 도면이다.
도 5a는 본 발명의 일 구현예에 따른 세균 유래 세포밖 소포 및 대사물질의 연관성을 피어슨 상관관계 분석을 통해 확인한 도면이다.
도 5b는 본 발명의 일 구현예에 따른 세균 유래 세포밖 소포 및 대사물질 바이오마커에 대해 이원 로지스틱 회귀(binary logistic regression) 분석을 실시하여 receiver operation 곡선을 나타낸 도면이다.
본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 대장암 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다:
(a) 정상인 및 피검자 샘플을 분리하는 단계;
(b) 상기 샘플로부터 세포밖 소포를 분리하는 단계;
(c) 분리한 세포밖 소포로부터 DNA를 추출하여 메타게놈(metagenome) 분석을 통해 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계; 및
(d) 분리한 세포밖 소포에서의 대사체 분석을 통해 대사물질의 함량 증감을 비교하는 단계.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 대장암 발병을 예측하기 위한 정보제공방법을 제공한다:
(a) 정상인 및 피검자 샘플을 분리하는 단계;
(b) 상기 샘플로부터 세포밖 소포를 분리하는 단계;
(c) 분리한 세포밖 소포로부터 DNA를 추출하여 메타게놈(metagenome) 분석을 통해 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계; 및
(d) 분리한 세포밖 소포에서의 대사체 분석을 통해 대사물질의 함량 증감을 비교하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 정상인 및 피검자 샘플은 대변일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계에서 퍼미쿠테스(Firmicutes) 및 프로테오박테리아(Proteobacteria)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 문(phylum) 세균 유래 세포밖 소포, 또는
액티노마이세스(Actinomyces), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 로티아(Rothia), 프로피오니박테리움(Propionibacterium), 콜린셀라(Collinsella), 박테로이달레스(Bacteroidales) S24-7 그룹 (f), 클로로플라스트(Chloroplast) (o), 블라우티아(Blautia), 라치노클로스트리디움(Lachnoclostridium), 라치노스피라시에(Lachnospiraceae) NK4A136 그룹, 라치노스피라시에(Lachnospiraceae) UCG-008, 도레아(Dorea), 에우박테리움 코프로스타놀리게네스(Eubacterium coprostanoligenes) 그룹, 루미노코카시에(Ruminococcaceae) UCG-002, 루미노코커스(Ruminococcus) 2, 서브돌리그라눌럼(Subdoligranulum), 루미노코카시에(Ruminococcaceae) (f), 루미노코카시에(Ruminococcaceae) UCG-014, 패칼리박테리움(Faecalibacterium), 루미노코카시에(Ruminococcaceae) NK4A214 그룹, 스타필로코커스(Staphylococcus), 카테니박테리움(Catenibacterium), 파르비모나스(Parvimonas), 루미니클로스트리디움(Ruminiclostridium) 5, 메틸로박테리움(Methylobacterium), 솔라늄 멜로게나(Solanum Melongena), 스핑고모나스(Sphingomonas), 디아포로박터(Diaphorobacter), 에스케리치아-시겔라(Escherichia-shigella), 프로테우스(Proteus), 슈도모나스(Pseudomonas), 엔테로박터(Enterobacter), 사카리박테리아(Saccharibacteria) (p), 및 몰리쿠테스(Mollicutes) RF9 (o) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계를 통해 대장암을 진단할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 세균들 중 특정 균 이름 뒤에 기재된 (p), (o), 또는 (f)는 문(phylum), 목(order), 또는 과(family)로서, 분석한 시퀀스가 문(phylum), 목(order), 또는 과(family) 수준까지만 매치된 균들에 한해 상기 (p), (o), 및 (f)를 표시하였으며, 이들은 모두 속(genus) 수준에서 확인된 균들에 속한다. 즉, 상기 균명에 (p), (o), 또는 (f)가 기재된 균들은 속(genus) 수준이 있으나 이를 파악하기 위한 시퀀스가 정확하지 않거나 DB 자체가 없는 등의 이유로, 속(genus) 수준에서 확인하였지만 문(phylum), 목(order), 또는 과(family) 수준까지만 매치되어 나타난 균들을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 (d) 단계에서 류신(Leucine), 이소류신(Isoleucine), 알라닌(Alanine), 리신(Lysine), 티라민(Tyramine), 아미노이소부티르산(Aminoisobutyric acid), 에탄올아민(Ethanolamine), 페놀(Phenol), 퓨로산(Furoic acid), 숙신산(Succinic acid), 옥살산(Oxalic acid), 부탄산(Butanoic acid), 헥산산(Hexanoic acid), 팔미트산(Palmitic acid), 및 올레산(Oleic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 대사물질의 함량 증감을 비교하는 단계를 통해 대장암을 진단할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 방법은, 정상 대조군(정상인) 시료와 비교적으로 수행될 수 있으며, 상기 정상 대조군은 검사 대상인 잠재환자(즉, 상기 (a) 단계에서 검사 대상이 된 환자와 동일 개체)의 시료에서 정상인 부위로부터 채취된 시료 또는 다른 정상 개체(대장암이 없는 개체)로부터 채취된 시료를 모두 포함하는 의미이다. 이때 상기 잠재 환자(피검자)로부터 채취한 시료에서 정상인에 비해 퍼미쿠테스(Firmicutes) 문(phylum) 세균 유래 세포밖 소포, 또는
비피도박테리움(Bifidobacterium), 콜린셀라(Collinsella), 블라우티아(Blautia), 라치노클로스트리디움(Lachnoclostridium), 라치노스피라시에(Lachnospiraceae) UCG-008, 도레아(Dorea), 에우박테리움 코프로스타놀리게네스(Eubacterium coprostanoligenes) 그룹, 루미노코카시에(Ruminococcaceae) UCG-002, 루미노코커스(Ruminococcus) 2, 서브돌리그라눌럼(Subdoligranulum), 루미노코카시에(Ruminococcaceae) (f), 패칼리박테리움(Faecalibacterium), 루미노코카시에(Ruminococcaceae) NK4A214 그룹, 카테니박테리움(Catenibacterium), 파르비모나스(Parvimonas), 루미니클로스트리디움(Ruminiclostridium) 5, 디아포로박터(Diaphorobacter), 및 엔테로박터(Enterobacter)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 증가되어 있는 경우 대장암으로 판단할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 잠재 환자(피검자)로부터 채취한 시료에서 정상인에 비해 프로테오박테리아(Proteobacteria) 문(phylum) 세균 유래 세포밖 소포, 또는
액티노마이세스(Actinomyces), 로티아(Rothia), 프로피오니박테리움(Propionibacterium), 박테로이달레스(Bacteroidales) S24-7 그룹 (f), 클로로플라스트(Chloroplast) (o), 라치노스피라시에(Lachnospiraceae) NK4A136 그룹, 루미노코카시에(Ruminococcaceae) UCG-014, 스타필로코커스(Staphylococcus), 메틸로박테리움(Methylobacterium), 솔라늄 멜로게나(Solanum melongena), 스핑고모나스(Sphingomonas), 에스케리치아-시겔라(Escherichia-shigella), 프로테우스(Proteus), 슈도모나스(Pseudomonas), 사카리박테리아(Saccharibacteria) (p), 및 몰리쿠테스(Mollicutes) RF9 (o)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 감소되어 있는 경우 대장암으로 판단할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 잠재 환자(피검자)로부터 채취한 시료에서 정상인에 비해 류신(Leucine), 이소류신(Isoleucine), 알라닌(Alanine), 리신(Lysine), 티라민(Tyramine), 에탄올아민(Ethanolamine), 페놀(Phenol), 퓨로산(Furoic acid), 숙신산(Succinic acid), 옥살산(Oxalic acid), 헥산산(Hexanoic acid), 팔미트산(Palmitic acid), 및 올레산(Oleic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 대사물질의 함량이 증가되어 있는 경우 대장암으로 판단할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 잠재 환자(피검자)로부터 채취한 시료에서 정상인에 비해 아미노이소부티르산(Aminoisobutyric acid) 또는 부탄산(Butanoic acid)의 함량이 감소되어 있는 경우 대장암으로 판단할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 대장암 진단시, 콜린셀라(Collinsella) 속(genus) 및 솔라늄 멜로게나(Solanum melongena)속(genus) 세균 유래 세포밖 소포, 및 류신(Leucine) 및 옥살산(Oxalic acid)을 바이오마커로 사용하여, 상기 세균 유래 세포밖 소포 및 대사산물을 조합한 두 가지 오믹스 바이오마커를 사용할 경우, 대장암 진단에 대한 정확도(AUC)를 높일 수 있다.
구체적으로, 상기 (c) 단계에서 정상인에 비해 콜린셀라(Collinsella) 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 증가되어 있고 솔라늄 멜로게나(Solanum melongena)속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 감소되어 있으며,
상기 (d) 단계에서 정상인에 비해 류신(Leucine) 및 옥살산(Oxalic acid)이 증가되어 있는 경우 대장암의 발병 위험도가 높을 것으로 예측할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
따라서 본 발명의 방법은 정확도(AUC)를 향상시키는 방법으로 이해될 수 있으며, 마커로서 콜린셀라(Collinsella) 속(genus) 및 솔라늄 멜로게나(Solanum melongena)속(genus) 세균 유래 세포밖 소포를 사용하는 경우, 또는 마커로서 류신(Leucine) 및 옥살산(Oxalic acid)을 사용하는 경우, 정확도가 90% 내지 100%, 바람직하게 정확도가 90% 내지 98% 수준을 나타내는 것일 수 있다. 상기 수준의 구체적 수치는 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 및 100%로 이루어지는 군에서 선택되는 두 개의 숫자를 경계값으로 하는 범위값을 모두 포함한다. 본원 발명의 하나의 실시양태(embodiment)에서, 상기 수치범위 중 구체적으로 90% 및 98%의 경계값이 선택될 수 있고, 이에 따라 90% 내지 98% 범위에 있는 모든 값들이 본 발명에서 의도됨은 당업자에 자명하다. 또 다른 하나의 실시양태(ebodiment)에서 바람직하게는 마커로서 콜린셀라(Collinsella) 속(genus) 및 솔라늄 멜로게나(Solanum melongena)속(genus) 세균 유래 세포밖 소포를 사용하는 경우 95%의 정확도를 나타낼 수 있으며, 마커로서 류신(Leucine) 및 옥살산(Oxalic acid)을 사용하는 경우 92%의 정확도를 나타낼 수 있다.
또한, 본 발명에서 마커로서 콜린셀라(Collinsella) 속(genus) 및 솔라늄 멜로게나(Solanum melongena)속(genus) 세균 유래 세포밖 소포, 및 류신(Leucine) 및 옥살산(Oxalic acid)을 사용하는 경우, 정확도가 90% 내지 100%, 바람직하게 정확도가 95% 내지 100% 수준을 나타내는 것일 수 있다. 상기 수준의 구체적 수치는 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 및 100%로 이루어지는 군에서 선택되는 두 개의 숫자를 경계값으로 하는 범위값을 모두 포함한다. 본원 발명의 하나의 실시양태(embodiment)에서, 상기 수치범위 중 구체적으로 95% 및 100%의 경계값이 선택될 수 있고, 이에 따라 95% 내지 100% 범위에 있는 모든 값들이 본 발명에서 의도됨은 당업자에 자명하다. 또 다른 하나의 실시양태(ebodiment)에서 바람직하게는 100%의 정확도를 나타낼 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "대사물질(metabolites)"은 물질대사(metabolism)의 중간체와 생성물을 총칭하는 것으로, 본 발명에 있어서 상기 대사물질은 아미노산(amino acid), 아미노알콜(amino alcohol), 방향족알콜(aromatic alcohol), 카복실산(carboxylic acid), 및 지방산(fatty acid)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어, "대사체(metabolome)"는 세포, 조직, 체액과 같은 생물학적 시료 내에 존재하는 대사물질들의 총체를 의미하는 것으로, 본 발명에 있어서 상기 대사체는 대변 샘플로부터 분리한 세균 유래 세포밖 소포에 존재하는 대사물질들의 총체를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "대장암(colorectal cancer)"이란 대장(맹장, 결장, 직장)에 발생하는 악성 종양을 가리키며, 부위별의 명칭인 맹장암, 결장암, 직장암은 대장암에 포함된다.
본 발명에서 사용되는 용어, "대장암 진단" 이란 환자에 대하여 대장암이 발병할 가능성이 있는지, 대장암이 발병할 가능성이 상대적으로 높은지, 또는 대장암이 이미 발병하였는지 여부를 판별하는 것을 의미한다. 본 발명의 방법은 임의의 특정 환자에 대한 대장암 발병 위험도가 높은 환자로써 특별하고 적절한 관리를 통하여 발병 시기를 늦추거나 발병하지 않도록 하는데 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 대장암을 조기에 진단하여 가장 적절한 치료방식을 선택함으로써 치료를 결정하기 위해 임상적으로 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "메타게놈(metagenome)"이란, "군유전체"라고도 하며, 흙, 동물의 장 등 고립된 지역 내의 모든 바이러스, 세균, 곰팡이 등을 포함하는 유전체의 총합을 의미하는 것으로, 주로 배양이 되지 않는 미생물을 분석하기 위해서 서열분석기를 사용하여 한꺼번에 많은 미생물을 동정하는 것을 설명하는 유전체의 개념으로 쓰인다. 특히, 메타게놈은 한 종의 게놈 또는 유전체를 말하는 것이 아니라, 한 환경단위의 모든 종의 유전체로서 일종의 혼합유전체를 말한다. 이는 오믹스적으로 생물학이 발전하는 과정에서 한 종을 정의할 때 기능적으로 기존의 한 종뿐만 아니라, 다양한 종이 서로 상호작용하여 완전한 종을 만든다는 관점에서 나온 용어이다. 기술적으로는 빠른 서열분석법을 이용해서, 종에 관계없이 모든 DNA, RNA를 분석하여, 한 환경 내에서의 모든 종을 동정하고, 상호작용, 대사작용을 규명하는 기법의 대상이다. 본 발명에서는 바람직하게 대변에서 분리한 세균 유래 세포밖 소포를 이용하여 메타게놈 분석을 실시하였다.
본 발명의 실시예에서는 정상인 및 대장암환자의 대변 내 세균 유래 세포밖 소포에 존재하는 유전자에 대한 메타게놈 분석을 실시하였으며, 문(phylum) 및 속(genus) 수준에서 각각 분석하여 실제로 대장암 발생의 원인으로 작용할 수 있는 세균 유래 소포를 동정하였다.
보다 구체적으로 본 발명의 일 실험예에서는, 대변에 존재하는 세균 유래 소포 메타게놈을 문(phylum) 및 속(genus) 수준에서 분석한 결과, 퍼미쿠테스(Firmicutes) 및 프로테오박테리아(Proteobacteria) 문(phylum) 세균 유래 세포밖 소포, 및 액티노마이세스(Actinomyces), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 로티아(Rothia), 프로피오니박테리움(Propionibacterium), 콜린셀라(Collinsella), 박테로이달레스(Bacteroidales) S24-7 그룹 (f), 클로로플라스트(Chloroplast) (o), 블라우티아(Blautia), 라치노클로스트리디움(Lachnoclostridium), 라치노스피라시에(Lachnospiraceae) NK4A136 그룹, 라치노스피라시에(Lachnospiraceae) UCG-008, 도레아(Dorea), 에우박테리움 코프로스타놀리게네스(Eubacterium coprostanoligenes) 그룹, 루미노코카시에(Ruminococcaceae) UCG-002, 루미노코커스(Ruminococcus) 2, 서브돌리그라눌럼(Subdoligranulum), 루미노코카시에(Ruminococcaceae) (f), 루미노코카시에(Ruminococcaceae) UCG-014, 패칼리박테리움(Faecalibacterium), 루미노코카시에(Ruminococcaceae) NK4A214 그룹, 스타필로코커스(Staphylococcus), 카테니박테리움(Catenibacterium), 파르비모나스(Parvimonas), 루미니클로스트리디움(Ruminiclostridium) 5, 메틸로박테리움(Methylobacterium), 솔라늄 멜로게나(Solanum Melongena), 스핑고모나스(Sphingomonas), 디아포로박터(Diaphorobacter), 에스케리치아-시겔라(Escherichia-shigella), 프로테우스(Proteus), 슈도모나스(Pseudomonas), 엔테로박터(Enterobacter), 사카리박테리아(Saccharibacteria) (p), 및 몰리쿠테스(Mollicutes) RF9 (o) 속(genus) 세균 유래 소포가 대장암환자와 정상인 사이에 유의한 차이가 있었다(실험예 1 참조).
또한, 본 발명의 실시예에서는 정상인 및 대장암환자의 대변 내 세균 유래 세포밖 소포에 대해 gas chromatography time-of-flight mass spectrometry 분석을 이용하여 대사물질을 분석하였다.
보다 구체적으로 본 발명의 일 실험예에서는 정상인 및 대장암 환자의 대변 내 세균 유래 세포밖 소포에서 대사물질을 분석한 결과, 류신(Leucine), 이소류신(Isoleucine), 알라닌(Alanine), 리신(Lysine), 티라민(Tyramine), 아미노이소부티르산(Aminoisobutyric acid), 에탄올아민(Ethanolamine), 페놀(Phenol), 퓨로산(Furoic acid), 숙신산(Succinic acid), 옥살산(Oxalic acid), 부탄산(Butanoic acid), 헥산산(Hexanoic acid), 팔미트산(Palmitic acid), 및 올레산(Oleic acid)의 함량이 대장암 환자와 정상인 사이에 유의한 차이가 있었다(실험예 2 참조).
가스 크로마토그래피 질량 분석(gas chromatography mass spectrometry, GC-MS)을 사용한 소분자 분석은 암 발달과 장내 미생물군집을 연결시키는데 사용될 수 있다. 본 발명의 일 실험예에서는 특히 GC-MS로 대장암 환자에서 상향 조절된 아미노산 집단을 확인하였으며, 강화된 아미노산 수준은 대장암 위험과 밀접한 관련이 있었다. 이의 원인으로는 오랫동안 대장암의 가장 중요한 생활 습관 위험 요소로 여겨져 왔던 고단백 섭취와 같은 식이 습관의 변화; 암 환자의 영양소 흡수를 감소시키는 염증; 대장암 환자의 원위 결장 내 박테리아를 발효시켜 음식물의 단백질의 분해로 대변 내 아미노산 대사물 수치가 높아짐 등이 있다.
본 발명의 일 실험예에서는 Pearson rank 연관성 분석을 통해 장내 미생물군집과 특정 대사물질 사이의 상관관계를 확인한 결과, 대부분의 대사물질의 함량이 Firmicutes 문(phylum) 세균들과 양의 상관 관계가 있었으며, Proteobacteria 문(phylum) 세균과는 음의 상관관계가 있었다(실험예 3 참조).
Firmicutes는 에너지 재활용을 위해 아미노산을 촉매할 수 있는 반면, Proteobacteria는 소화되지 않는 단백질을 포함한 아미노산을 분해할 수 있다. 상기와 같은 장내 미생물 군집의 변화는 우선적으로 아미노산 대사에 영향을 미친다. 부탄산(Butanoic acid) 및 아미노이소부티르산(Aminoisobutyric acid)을 포함한 단쇄 지방산은 사람의 장에서 잘 확립된 에너지원이다. 이 미생물 대사물질은 숙주 대사 및 면역 반응을 조절하는 역할을 한다. 본 발명에서는 상기 실험예를 통해 식이 관련 단쇄 지방산이 질병을 예방하고 대장암에 대한 치료에 영향을 미치는 것을 증명하였다.
본 발명의 일 실험예에서는 이원 로지스틱 회귀(binary logistic regression) 분석을 통해 2가지 대사물질(leucine 및 oxalic acid) 및 2가지 속(genus) 세균(Collinsella 및 Solanum melongena) 유래 세포밖 소포를 대장암 진단을 위한 최적의 바이오마커로 선택하고, 상기 바이오마커들의 조합을 사용하는 경우 단일 오믹스 바이오마커를 사용하는 경우에 비해 진단의 정확도가 높은 것을 확인하였다(실험예 4 참조).
본 발명은 상기와 같은 실험예 결과를 통해, 대변으로부터 분리한 세균 유래 세포밖 소포에 대하여 메타게놈 분석을 실시함으로써 정상인 및 대장암 환자에서 세균 유래 세포밖 소포들의 함량 증감을 분석하고, 세포밖 소포에서 대사물질의 함량 증감을 분석함으로써 대장암을 진단할 수 있음을 확인하였다. 또한, 세균 유래 세포밖 소포에서 세균 및 대사물질 간의 연관성을 확인하여 장내 미생물 변화가 대사물질, 특히 아미노산의 대사를 변화시킬 수 있음을 알 수 있었으며, 상기 세균 유래 세포밖 소포 및 대사물질 바이오마커를 조합하여 두 가지 오믹스 바이오마커를 사용할 경우 대장암 진단의 정확도를 높일 수 있음을 확인하였다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 “포함” 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 “~(하는) 단계” 또는 “~의 단계”는 “~ 를 위한 단계”를 의미하지 않는다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 연구 개체
서울대학교 분당 병원과 중앙대학교 병원에서 대장암 환자 32명과 해운대 백병원에서 건강한 대조군(이하, 정상인) 40명이 2016년 4월부터 2018년 4월까지 참여하였다. 대장암 환자는 2013년 국제암연합(International Union Against Cancer) 및 미국 암연합위원회(American Joint Committee on Cancer)에서 제시한 진단 기준에 따라 처음 진단받았다. 환자들은 나이, 성별, 병기, 종양 위치, 및 암배아성 항원(carcinoembryonic antigen, CEA) 검사와 같은 환자 특성을 검사받았으며, 건강한 피험자는 정기적인 건강 검진을 위해 병원을 방문하였다. 검진 후, 알려진 질병이없고 실험실 테스트 결과 정상인 것으로 확인된 건강한 대조군을 선택하였다. 건강한 대조군에 대한 제외 기준에는 장 질환 진단, 장 질환 치료제 복용 및 이전 대장암 진단이 포함되었다. 건강한 대조군의 경우, 연령, 성별 및 병력을 포함한 일반적인 특징이 기록되었다. 환자 및 건강한 대조군의 제외 기준은 수술 직후 대장암 재발, 화학요법, 대장암의 합병증으로 인한 다른 암이나 대사성 질환, 또는 샘플 채취 1 개월 이내의 항생제 치료가 포함되었다. 본 발명의 실험은 서울대학교 분당 병원 임상 시험위원회 (IRB No. B-1708/412-301) 및 해운대 백병원 (IRB No. 129792-2015-064)의 승인을 받아 진행하였으며, 모든 피검자로부터 정보 제공 동의를 얻었다.
실시예 2. 샘플 채취 및 세포밖 소포(EV) 분리
대변 샘플은 수술 또는 장 세척 전에 채취하였으며, 모든 피검자는 샘플을 채취하기 1 일 전에는 부드러운 음식을 섭취하고 금연, 금주하였다. 대변 샘플은 멸균된 면봉을 사용하여 대변의 중앙에서 수집하여 -20℃에서 보관하였으며, 대변 샘플로부터 세균의 세포밖 소포를 분리하기 전에, 대변 샘플(1g)을 10mL의 인산염 완충 식염수(PBS)로 유화시킨 다음 24시간 동안 진동시켰다. 그런 다음 인간 대변에서 세포밖 소포를 분리하기 위해 샘플을 배양하였으며, 대변 샘플의 세포밖 소포는 4 ℃에서 10분 동안 10,000 x g로 분획원심분리를 사용하여 분리하였다. 상층액에 함유된 세균(bacteria) 및 이물질은 직경이 0.22μm인 필터로 여과하여 완전히 제거하였다.
실시예 3. 가스 크로마토그래피를 이용한 질량 분석
냉동한 세포밖 소포(EV) 샘플을 4℃에서 해동시키고 각 50μL의 샘플을 1mL의 acetonitrile : isopropanol : water (3:3:2) 혼합물로 희석시켰다. 그리고 나서 상기 혼합된 샘플을 5분간 교반한 후 4℃에서 18,341 x g로 5분 동안 원심 분리하였다. 그 후, 400μL의 상층액을 증발시켜 실온에서 완전히 건조시키고 50% acetonitrile을 이용하여 400μL로 재구성하였다. 상기와 같이 원심분리를 반복한 후 상층액을 증발시키고 피리딘(pyridine)에 녹인 메톡시아민(methoxyamine) 10μL로 재구성하였으며, 90분간 흔드는 동안 30℃를 유지시켜 주었다. 그런 다음 샘플을 실온으로 냉각시킨 후, MSTFA (N-Methyl-N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide) 및 FAME (fatty acid methyl esters)의 혼합물 90μL를 각각의 실험 샘플 및 혼합 품질관리 샘플에 첨가하였다. 이후 70℃에서 56분 동안 진탕 배양하고 샘플을 glass inserts로 autosampler 병에 옮겼다. 그 다음, 이를 Pegasus HT time-of-flight 질량 분석기 (Leco Corporation, St. Joseph, MI)에 연결된 Agilent 7890A 가스 크로마토그래프에 주입하였다.
실시예 4. DNA 추출 및 시퀀싱
세균의 세포밖 소포 막으로부터 DNA를 추출하기 위해, 세균의 세포밖 소포를 40분간 100℃에서 끓였고, 남아있는 부유 입자 및 폐기물을 제거하기 위해 4℃에서 13,000rpm으로 30분 동안 원심분리한 후 상층액을 수득하였다. DNA는 Dneasy PowerSoil kit (QIAGEN, Germany)를 사용하여 추출하였으며, 표준 프로토콜은 키트 안내서에 따라 수행하였다. QIAxpert 시스템 (QIAGEN, Germany)을 사용하여 각 샘플에서 세균의 세포밖 소포로부터 DNA를 정량화하였고, 세균의 게놈 DNA는 16S rDNA 유전자의 V3-V4 초가변 영역에 특이적인 16S_V3_F (5′ -TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG -3′; 서열번호 1) 및 16S_V4_R (5′ -GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC -3′; 서열번호 2) 프라이머로 증폭시켰다. 라이브러리는 MiSeq 시스템 가이드 (Illumina, USA)에 따라 PCR 생성물을 사용하여 준비하였으며, 각각의 앰플리콘(amplicon)을 정량하고 등몰비로 설정하고 혼합하였으며, 제조사의 지시에 따라 MiSeq 플랫폼 (Illumina, USA)상에서 서열을 분석하였다.
실시예 5. 생물정보학
어댑터 시퀀스를 매치하는 Paired-end reads는 cutadapt 1.1.6 버전에 의해 트리밍되었다. 그 결과로 Paired-end reads를 포함하는 FASTQ 파일은 CASPER와 병합되고, Bokulich에 의해 설명된 표준을 기반으로 한 Phred(Q) 점수로 품질이 필터링되었다. 병합 후 350bp보다 짧거나 550bp보다 더 긴 리드(read) 또한 제거하였다. 키메릭 서열(chimeric sequence)을 확인하기 위해, 참조 기반 키메라 검출 단계는 SILVA gold 데이터베이스에 반하여 VSEARCH로 수행하였다. 그 다음, 서열 판독은 97% 서열 유사성의 임계치 하에서 de novo 클러스터링(clustering) 알고리즘으로 VSEARCH를 사용하여 Operational Taxonamic Units (OTU)로 클러스터링 하였으며, 하나의 샘플에 하나의 서열을 포함하는 OTU는 추후 분석에서 제외되었다. OTU의 대표적인 서열은 최종적으로 UCLUST (script on QIIME version 1.9.1)를 갖는 SILVA 128 데이터베이스를 사용하여 분류하였으며, 총 카운트(total count) 방법을 사용하여 데이터 세트에 정규화(normalization)를 적용하였다. 각각의 taxa 풍부도(richness)를 평가할 수 있는 Chao 지수는 각 샘플의 알파 다양성을 측정하는 것으로 추측되었다. 진단 모델에 포함되기 위한 메타게놈(metagenome) 바이오마커의 선택은 속(genus) 수준에서 상대 존재비(relative abundance)에 기초하였다. Wilcoxon 테스트에 의해 결정된 FDR (false discovery rate)-조정된 p-value의 기준, 폴드-체인지(fold-changes) 및 평균 상대 존재비는 임의의 그룹에서 각각 0.05 미만, 2 배 초과 및 0.5 % 초과였다. 또한, 조정된 p-value가 0.05 미만이고 2배를 초과하여 변화한 대사체 바이오마커를 선택하였다. 모든 진단 모델은 80:20 비율로 무작위로 선택된 트레이닝(training) 및 테스트(test) 세트로 단계적 선택 방법을 사용하여 Akaike 정보 기준을 기반으로 하는 로지스틱 회귀 분석(logistic regression)으로 계산되었다. AUC, 민감도, 특이도, 및 정확도와 같은 성능 값은 밸리데이션(validation) 세트를 사용하여 보고되었다. 로지스틱 회귀 모델은 메타게놈 및 대사체 바이오마커로부터 각각의 오믹스(omics) 데이터를 사용하여 개발되었고, 이의 정확도는 메타게놈 및 대사체 바이오마커의 결합 모델과 비교되어 정상인으로부터 암을 구별하였다.
실시예 6. 대사체학적 데이터에 대한 통계
Metaboanalyst 4.0을 사용하여 다변량(multivariate) 및 단변량(univariate) 분석을 실시하였으며, 로그 변환(log transformation) 및 파레토 스케일링(pareto scaling)을 사용하여 정규화된 데이터 세트를 분석하고 principal component analysis (PCA)를 수행하여 그룹 간의 전체 대사물질 프로파일의 차별화 여부를 조사하였다. FDR (false discovery rate)-조정된 p-value를 사용하여 단변량 분석을 통해 대사물질 후보를 선택하였다. 정상인 및 대장암(CRC) 환자군 사이의 유의한 차이는 연속 변수에 대한 Wilcoxon 테스트를 사용하여 결정되었으며, p-value가 0.05 미만일 경우 결과는 유의한 것으로 간주하였다.
실시예 7. 통계적 분석
풍부도(richness) 및 균등도(evenness)에 대한 미생물 조성의 알파 다양성은 정상인과 대장암 환자군 사이에서 샘플의 종 다양성을 비교하기 위해, Chao1 지수와 Shannon 지수를 사용하여 측정하였다. 베타 다양성에 대한 Bray-Curtis 유사성 기반 주요 좌표 분석(Principal coordinate analysis, PCoA)을 사용하여 샘플 간의 관계를 시각화하였으며, 모든 통계 분석은 R version 3.5.1을 사용하여 수행하였다.
[실험예]
실험예 1. 대장암 환자 및 정상인 대변 샘플에서 미생물 유래 세포밖 소포의 메타게놈 분석
대장암 환자 및 정상인으로부터 대변 유래 세포밖 소포의 미생물 조성을 조사하기 위해 16S rDNA 앰플리콘(amplicon) 시퀀싱을 기반으로 메타게놈(유전체) 분석을 수행하였으며, 상기 실시예 4에서와 같이 16S rDNA V3 및 V4 영역에 대한 시퀀싱 데이터를 사용하여 샘플당 10,000 리드의 rarefaction 정도를 분석하였다.
도 1a는 대장암 환자 및 정상인의 알파(alpha) 다양성을 비교한 결과를 나타낸 것으로, Chao1과 Shannon 지수에 기초하였을 때 유의한 차이는 나타나지 않았다. 박스 내 위스커(whiskers)는 특이값(outlier)을 제외하고 모집단 내의 최소 및 최대 알파 다양성 값의 범위를 나타낸다.
도 1b는 주요 좌표 분석(principal coordinate analysis, pCoA)을 통해 문(phylum) 및 속(genus) 수준에서의 베타(beta) 다양성을 나타낸 것으로, 붉은색 원은 정상인, 푸른색 원은 대장암 환자를 나타낸다. 베타 다양성 확인 결과, 속(genus) 수준에서의 베타 다양성의 비교는 문(phylum) 수준 클러스터(cluster)와 비교하여 그룹 간의 명확한 분리를 나타내었다.
또한, 히트 맵(Heat maps)을 이용하여 문(phylum)(도 2a) 및 속(genus)(도 2c) 수준에서 미생물 빈도(abundance)의 상대적인 변화를 시각화하여 도 2a 및 2c에 나타내었다.
히트 맵은 대장암 환자 및 정상인에서 문(phylum) 수준 및 속(genus) 수준에서의 상대 빈도(relative abundance)를 나타낸다. 빈도 값이 0에 가까운 세포는 밝은 파란색으로 표시되고, 0.5보다 큰 세포는 어두운 파란색으로 표시된다. 총 빈도는 1이다.
도 2b 및 2d에 나타낸 막대 그래프는 대장암 환자 및 정상인의 문(phylum)(도 2b) 수준 및 속(genus)(도 2d) 수준에서의 비교에 기초하여 통계적으로 유의한 미생물 조성을 나타낸다. 회색 막대는 대장암 환자의 상대 빈도를 나타내고 검은 막대는 정상인의 상대 빈도를 나타낸다(대장암 환자 및 정상인 사이에서 **p<0.05, ***p<0.01).
도 2b에 나타낸 바와 같이 문(phylum) 수준의 비교에서 대장암 환자에서는 Firmicutes가 유의적으로 증가한 반면, Proteobacteria는 감소하였으며, 정상인과 비교하여 대장암 환자의 속(genus) 수준에서 변화한 미생물 조성을 도 2d에서 막대 그래프로 나타내었다. 상기 데이터에 대한 자세한 기록은 하기 표 1에 나타내었다.
문(phylum) 속(genus) 정상인의 MAV (mean abundance value)
(%)		 대장암 환자의 MAV
(%)		 Log2
(Fold-change)		 P-value
(Wilcoxon)		 FDR adjusted p-value
(Wilcoxon)		 regulation
Actinobacteria Actinomyces 0.646 0.053 -3.613 0 0.001 Down
Bifidobacterium 0.871 1.832 1.073 0.001 0.014 Up
Rothia 0.533 0.016 -5.099 0 0 Down
Propionibacterium 0.685 0.164 -2.061 0 0 Down
Collinsella 0.065 0.953 3.88 0 0 Up
Bacteroidetes Bacteroidales S24-7
group (f) 		0.61 0.491 -0.313 0.003 0.031 Down
Cyanobacteria Chloroplast (o) 0.507 0.059 -3.104 0 0 Down
Firmicutes Blautia 0.187 0.599 1.677 0 0 Up
Lachnoclostridium 0.096 0.74 2.943 0 0 Up
LachnospiraceaeNK4A136 group 0.561 0.17 -1.718 0.002 0.019 Down
LachnospiraceaeUCG-008 0.591 1.069 0.855 0 0 Up
Dorea 0.45 0.51 0.181 0 0.008 Up
[Eubacterium]coprostanoligenes
group 		1.332 5.696 2.096 0 0 Up
RuminococcaceaeUCG-002 0.484 2.18 2.171 0 0.002 Up
Ruminococcus 2 0.53 2.329 2.136 0 0.002 Up
Subdoligranulum 0.562 2.408 2.099 0 0 Up
Ruminococcaceae(f) 0.317 1.187 1.905 0 0 Up
RuminococcaceaeUCG-014 1.098 0.706 -0.638 0 0.004 Down
Faecalibacterium 4.624 11.974 1.373 0 0.003 Up
RuminococcaceaeNK4A214 group 0.209 1.045 2.319 0.001 0.009 Up
Staphylococcus 0.819 0.41 -0.998 0.003 0.033 Down
Catenibacterium 0.041 0.729 4.161 0 0 Up
Parvimonas 0.028 0.812 4.84 0.001 0.013 Up
Ruminiclostridium 5 0.083 0.527 2.672 0.001 0.01 Up
Proteobacteria Methylobacterium 2.846 0.027 -6.743 0 0.007 Down
Solanum melongena (eggplant) 1.046 0.141 -2.887 0 0 Down
Sphingomonas 0.548 0.172 -1.674 0 0 Down
Diaphorobacter 0 0.974 12.397 0 0.001 Up
Escherichia-Shigella 3.427 0.871 -1.975 0 0 Down
Proteus 1.169 0 << 0 0 Down
Pseudomonas 2.913 0.242 -3.589 0 0 Down
Enterobacter 0.158 0.816 2.37 0.004 0.035 Up
Saccharibacteria Saccharibacteria (p) 0.54 0.132 -2.029 0.001 0.017 Down
Tenericutes Mollicutes RF9 (o) 2.053 0.208 -3.304 0.001 0.011 Down
표 1에 나타낸 바와 같이, 대장암과 정상인 사이에 34개의 속(genus) 세균에서 유의한 차이가 관찰되었다. 그 중 Actinomyces, Rothia, Propionibacterium, Bacteroidiales S24-7 group (f), Chloroplast (o), Lachnospiraceae NK4A136 group, Ruminococcaceae UCG-014, Staphylococcus, Methylobacterium, Solanum melongena, Sphingomonas, Escherichia-shigella, Proteus, Pseudomonas, Saccharibacteria (p), 및 Mollicutes RF9 (o) 속(genus) 세균의 비율은 정상인과 비교하여 대장암 환자에서 감소한 반면(p<0.05), Bifidobacterium, Collinsella, Blautia, Lachnoclostridium, Lachnospiraceae UCG-008, Dorea, Eubacterium coprostanoligenes group, Ruminococcus 2, Faecalibacterium, Ruminococcaceae NK4A214 group, Ruminococcaceae UCG-002, Subdoligranulum, Ruminococcaceae (f), Catenibacterium, Parvimonas, Ruminiclostridium 5, Enterobacter, 및 Diaphorobacter 속(genus) 세균의 비율은 유의적으로 증가하였다(p<0.05).
특히, Firmicutes의 경우, Lachnospiraceae NK4A136 group, Ruminococcaceae UCG-014, 및 Staphylococcus의 조성을 제외하고는 모두 대장암 환자에서 증가하였으며, Proteobacteria의 경우, Diaphorobacter 및 Enterobacter를 제외하고 모두 대장암 환자에서 조성이 감소하였다. 또한, Proteobacteria 중 Proteus spp. 는 대장암 환자에서 눈에 띄게 변화하였고 정상인에는 존재하지 않았다. 대장암 환자 및 정상인에서의 미생물 유래 세포밖 소포의 분류학적 프로파일은 도 3a(phylum)및 3b(genus)에 나타내었다.
도 3a 및 3b는 16S rDNA V3 및 V4 영역 데이터에 대해 수행된 분석 데이터로, 샘플 당 10,000 리드의 rarefaction 정도를 분석하였다. 문(phylum) 수준(도 3a) 및 속(genus) 수준(도 3b)에서 대장암 환자 및 정상인에 대해 상대적인 분류학적 빈도를 표시하였으며, 각 개체는 가로 축을 따라 표시되고 상대적 분류 빈도는 세로 축에 표시된다.
실험예 2. 대장암 환자 및 정상인 대변 유래 세포밖 소포의 대사물질 분석
미생물 유래 세포밖 소포에서 소분자 대사물질의 특성을 평가하기 위해, 상기 실시예 3의 방법으로 가스 크로마토그래피 time-of-flight 질량 분석(gas chromatography time-of-flight mass spectrometry)을 사용하여 글로벌(global) 대사체 분석을 실시한 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이 3차원 PCA 점수 그래프에서 3개의 PC(PC1, PC2, PC3)는 대장암 환자와 정상인의 대사체 프로파일을 명확하게 분리시켰다.
도 4a에서 3차원 주성분 분석(principal component analysis, PCA)의 스코어 플롯(score plot)은 대변 세포밖 소포(EV) 샘플의 대사 패턴을 보여준다. 빨간색 원은 대장암을 나타내고 녹색 원은 정상인을 나타낸다(PC, 주성분(principal component)).
다변량(multivariate) 분석으로 확인된 대사물질은 FDR에 대해 조정된 p-value인 Q-value에 따라 선택되었다. 통계적으로 유의하게 나타난(Q <0.05) 대사물질을 하기 표 2에 나타내었다.
도 4b에는 대장암 환자 대 정상인으로부터 차등적으로 축적되는 대사 산물의 PCA 결과로부터 PC1 및 PC2의 로딩 플롯(loading plot)을 나타내었으며, 상기 로딩 플롯은 대장암 환자를 정상인과 효과적으로 구별한 대사체를 보여주었다.
Metabolite Class Fold-change p-value Regulation
Leucine Amino acid 2.433 5.75E-03 Up
Isoleucine 2.192 5.23E-03 Up
Alanine 1.667 4.31E-02 Up
Lysine 1.441 1.48E-02 Up
Tyramine 1.423 1.57E-22 Up
Aminoisobutyric acid -1.116 6.66E-03 Down
Ethanolamine Amino alcohol 1.384 4.56E-04 Up
Phenol Aromatic alcohol 1.589 1.99E-12 Up
Furoic acid Carboxylic acid 1.417 1.31E-29 Up
Succinic acid 3.154 4.46E-09 Up
Oxalic acid 1.396 1.66E-03 Up
Butanoic acid Fatty acid -1.300 2.26E-04 Down
Hexanoic acid 1.302 9.38E-06 Up
Palmitic acid 1.436 4.37E-25 Up
Oleic acid 1.317 3.09E-04 Up
상기 표 2에 나타낸 대사물질 중 가장 비율이 높은 것은 아미노산이었으며, 대장암 환자에서 대부분 상향 조절되었다. 또한, 알코올 형태(에탄올아민(ethanolamine) 및 페놀(phenol)), 카르복실산(퓨로산(Furoic acid), 숙신산(succinic acid), 및 옥살산(oxalic acid)), 및 지방산(헥산산(hexanoic acid), 팔미트산(palmitic acid), 및 올레산(oleic acid))은 정상인에 비해 대장암 환자에서 향상되었으며, 아미노이소부티르산(aminoisobutyric acid) 및 부탄산(butanoic acid)과 같은 세균 대사물질은 감소되었다.
실험예 3. 대변 유래 세포밖 소포에서 미생물 및 대사 프로파일 간의 연관성 확인
피어슨(Pearson) rank 연관성 분석은 장내 미생물군집과 특정 대사 산물 사이의 밀접한 상관관계를 보여 주었다.
도 5a는 피어슨 연관성 분석을 수행하여 메타게놈 및 대사체 분석 데이터 간의 연관성을 조사한 결과를 나타낸 것으로, y축에는 통계적 비교를 통해 얻은 세균 유래 세포밖 소포의 메타게놈 분석 결과를 나타내었고 x축에는 대사체 바이오마커를 나타내었다. 각 사각형은 상관 계수 값을 나타낸다. 빨간색 사각형은 양의 상관관계를 나타내고 파란색 사각형은 미생물 및 대사물질 빈도 사이의 음의 상관관계를 나타낸다.
도 5a에 나타낸 바와 같이 대부분의 대사체 마커의 상대 빈도는 Firmicutes에 속하는 속(genus) 세균들과 큰 양의 상관 관계가 있었다. 특히, 대장암 환자의 장내 미생물군집의 일관된 조절에 따라 몇몇 아미노산이 증가하였으며, 이러한 세균은 티라민(tyramine), 페놀(phenol), 및 헥산산(hexanoic acid)과 유의한 관계가 있었다(r >｜0.5｜, P <0.05). 반면, Proteobacteria에 속하는 세균은 대사체 마커와 음의 상관관계가 있었고 이러한 Proteobacteria에 대한 관찰은 Firmicutes의 관찰 결과와 반대였다(r<｜0.5｜, P<0.05). 대사체 바이오마커 중에서 카르복실산(furoic acid, succinic acid, oxalic acid)과 장쇄 지방산(palmitic acid, oleic acid)은 전체 장내 미생물 수준과 유의적이지는 않으나 상관 관계가 있었다.
실험예 4. 대변 유래 세포밖 소포에서 미생물 및 대사 프로파일에 기반한 대장암 진단 모델
메타게놈 및 대사체 바이오마커로부터 유용한 바이오마커를 추가로 규정하기 위해, 이원 로지스틱 회귀(binary logistic regression) 분석 및 순방향 단계별 방법의 최적화된 알고리즘을 사용하여 정상인으로부터 대장암 양성 개체를 구별할 수 있는 바이오마커로 최적의 모델을 구축하였으며, 그 결과 AUC(area under curve)값을 고려하여 2가지 대사체(류신(leucine) 및옥살산(oxalic acid)) 및 2가지 속(genus) 세균( Collinsella 및 Solanum melongena) 유래 세포밖 소포가 선택되었다.
도 5b는 leucine, butanoic acid, isoleucine, 및 succinic acid와 Bifidobacterium, Lactobacillus, Faecalibacterium, Pseudomonas 및 Methylobacterium마커에 대한 로지스틱 회귀 모델의 수신자 조작 특성 (receiver operation characteristic, ROC) 곡선을 나타내는 것으로, 이는 정상인으로부터 대장암 환자를 구분하는 능력에 기초한다. 빨간색 선은 대사체학 기반 모델을 나타내고 파란색 선은 메타게놈학 기반 모델을 나타내며, 녹색 선은 대사체학과 메타게놈학의 조합을 기반으로 한 모델을 나타낸다.
도 5b에 나타낸 로지스틱 회귀 모델의 ROC 곡선을 확인함으로써, 선택된 바이오마커를 사용하여 정상인으로부터 대장암 양성 샘플을 구별하였다.
그 결과, 상기 2가지의 대사체 바이오마커를 사용하였을 때, 대장암의 예측 가능성은 80.0%의 민감도 및 100%의 특이도를 가져 92.0%로 나타났으며, 2가지의 선택된 메타게놈 바이오마커는 90.0%의 민감도와 100%의 특이도를 나타내어 AUC값(95.0%)이 약간 더 높았다.
또한, 상기 두 가지 오믹스 데이터 패널을 통합한 경우 대장암 양성 샘플과 정상인을 구별함에 있어서 관련된 정확도로 AUC가 100%로 나타났으며 트레이닝 세트(도 5b의 왼쪽 도면)과 테스트 세트(도 5b의 오른쪽 도면) 사이에 큰 차이는 없었다. AUC는 값이 높을수록 정상인은 정상인으로, 대장암 환자는 대장암으로 판단을 제대로 하는 비율이 높다는 것을 의미하기 때문에, 가장 높은 AUC를 가지는 마커들의 조합은 진단의 유의성이 가장 높은 것을 의미한다.
이에, 이러한 데이터로부터 메타게놈 및 대사체 바이오마커의 조합인 대장암의 잠재적 대표 바이오마커가 단일 오믹스 바이오마커보다 대장암을 더 정확히 진단할 것으로 예상되었다.
또한, 상기 결과들로부터, 장내 미생물(Firmicutes 및 Proteobacteria)의 빈도와 대사물질(주로 아미노산) 사이에는 강한 연관성이 있으며, 이는 대장암에서 다량 영양소 발효 및 분해 박테리아의 변경된 조성이 아미노산의 축적 및 에너지원의 고갈을 초래할 수 있음을 알 수 있었다. 또한, 장내 미생물에 의해 분비된 세포밖 소포가 질병의 존재 하에서 숙주의 영양 상태, 대사 및 면역 반응을 반영하는 동적 범위의 대사 정보를 전달한다는 것을 알 수 있었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.
<110> MD Healthcare Inc. <120> Method for diagnosing colorectal cancer based on metagenome and metabolome of extracellular vesicles <130> MP19-203P1 <150> KR 10-2019-0111921 <151> 2019-09-10 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16S_V3_F <220> <221> misc_feature <222> (42) <223> n = a or g or c or t/u <400> 1 tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagcctacgg gnggcwgcag 50 <210> 2 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16S_V4_R <400> 2 gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acaggactac hvgggtatct aatcc 55

Claims (10)

  1. 하기의 단계를 포함하는, 대장암 진단을 위한 정보제공방법:
    (a) 정상인 및 피검자 샘플을 분리하는 단계;
    (b) 상기 샘플로부터 세포밖 소포를 분리하는 단계;
    (c) 분리한 세포밖 소포로부터 DNA를 추출하여 메타게놈(metagenome) 분석을 통해 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계; 및
    (d) 분리한 세포밖 소포에서의 대사체 분석을 통해 대사물질의 함량 증감을 비교하는 단계.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 샘플은 대변인 것을 특징으로 하는, 대장암 진단을 위한 정보제공방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 대사물질은 아미노산(amino acid), 아미노알콜(amino alcohol), 방향족알콜(aromatic alcohol), 카복실산(carboxylic acid), 및 지방산(fatty acid)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 대장암 진단을 위한 정보제공방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 퍼미쿠테스(Firmicutes) 및 프로테오박테리아(Proteobacteria)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 문(phylum) 세균 유래 세포밖 소포, 또는
    액티노마이세스(Actinomyces), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 로티아(Rothia), 프로피오니박테리움(Propionibacterium), 콜린셀라(Collinsella), 박테로이달레스(Bacteroidales) S24-7 그룹 (f), 클로로플라스트(Chloroplast) (o), 블라우티아(Blautia), 라치노클로스트리디움(Lachnoclostridium), 라치노스피라시에(Lachnospiraceae) NK4A136 그룹, 라치노스피라시에(Lachnospiraceae) UCG-008, 도레아(Dorea), 에우박테리움 코프로스타놀리게네스(Eubacterium coprostanoligenes) 그룹, 루미노코카시에(Ruminococcaceae) UCG-002, 루미노코커스(Ruminococcus) 2, 서브돌리그라눌럼(Subdoligranulum), 루미노코카시에(Ruminococcaceae) (f), 루미노코카시에(Ruminococcaceae) UCG-014, 패칼리박테리움(Faecalibacterium), 루미노코카시에(Ruminococcaceae) NK4A214 그룹, 스타필로코커스(Staphylococcus), 카테니박테리움(Catenibacterium), 파르비모나스(Parvimonas), 루미니클로스트리디움(Ruminiclostridium) 5, 메틸로박테리움(Methylobacterium), 솔라늄 멜로게나(Solanum Melongena), 스핑고모나스(Sphingomonas), 디아포로박터(Diaphorobacter), 에스케리치아-시겔라(Escherichia-shigella), 프로테우스(Proteus), 슈도모나스(Pseudomonas), 엔테로박터(Enterobacter), 사카리박테리아(Saccharibacteria) (p), 및 몰리쿠테스(Mollicutes) RF9 (o) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것을 특징으로 하는, 대장암 진단을 위한 정보제공방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 정상인에 비해 퍼미쿠테스(Firmicutes) 문(phylum) 세균 유래 세포밖 소포, 또는
    비피도박테리움(Bifidobacterium), 콜린셀라(Collinsella), 블라우티아(Blautia), 라치노클로스트리디움(Lachnoclostridium), 라치노스피라시에(Lachnospiraceae) UCG-008, 도레아(Dorea), 에우박테리움 코프로스타놀리게네스(Eubacterium coprostanoligenes) 그룹, 루미노코카시에(Ruminococcaceae) UCG-002, 루미노코커스(Ruminococcus) 2, 서브돌리그라눌럼(Subdoligranulum), 루미노코카시에(Ruminococcaceae) (f), 패칼리박테리움(Faecalibacterium), 루미노코카시에(Ruminococcaceae) NK4A214 그룹, 카테니박테리움(Catenibacterium), 파르비모나스(Parvimonas), 루미니클로스트리디움(Ruminiclostridium) 5, 디아포로박터(Diaphorobacter), 및 엔테로박터(Enterobacter)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 증가되어 있는 경우 대장암의 발병 위험도가 높을 것으로 예측하는 것을 특징으로 하는, 대장암 진단을 위한 정보제공방법.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 정상인에 비해 프로테오박테리아(Proteobacteria) 문(phylum) 세균 유래 세포밖 소포, 또는
    액티노마이세스(Actinomyces), 로티아(Rothia), 프로피오니박테리움(Propionibacterium), 박테로이달레스(Bacteroidales) S24-7 그룹 (f), 클로로플라스트(Chloroplast) (o), 라치노스피라시에(Lachnospiraceae) NK4A136 그룹, 루미노코카시에(Ruminococcaceae) UCG-014, 스타필로코커스(Staphylococcus), 메틸로박테리움(Methylobacterium), 솔라늄 멜로게나(Solanum melongena), 스핑고모나스(Sphingomonas), 에스케리치아-시겔라(Escherichia-shigella), 프로테우스(Proteus), 슈도모나스(Pseudomonas), 사카리박테리아(Saccharibacteria) (p), 및 몰리쿠테스(Mollicutes) RF9 (o)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 감소되어 있는 경우 대장암의 발병 위험도가 높을 것으로 예측하는 것을 특징으로 하는, 대장암 진단을 위한 정보제공방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 (d) 단계에서 류신(Leucine), 이소류신(Isoleucine), 알라닌(Alanine), 리신(Lysine), 티라민(Tyramine), 아미노이소부티르산(Aminoisobutyric acid), 에탄올아민(Ethanolamine), 페놀(Phenol), 퓨로산(Furoic acid), 숙신산(Succinic acid), 옥살산(Oxalic acid), 부탄산(Butanoic acid), 헥산산(Hexanoic acid), 팔미트산(Palmitic acid), 및 올레산(Oleic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 대사물질의 함량 증감을 비교하는 것을 특징으로 하는, 대장암 진단을 위한 정보제공방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 (d) 단계에서 정상인에 비해 류신(Leucine), 이소류신(Isoleucine), 알라닌(Alanine), 리신(Lysine), 티라민(Tyramine), 에탄올아민(Ethanolamine), 페놀(Phenol), 퓨로산(Furoic acid), 숙신산(Succinic acid), 옥살산(Oxalic acid), 헥산산(Hexanoic acid), 팔미트산(Palmitic acid), 및 올레산(Oleic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 대사물질의 함량이 증가되어 있는 경우 대장암의 발병 위험도가 높을 것으로 예측하는 것을 특징으로 하는, 대장암 진단을 위한 정보제공방법.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 (d) 단계에서 정상인에 비해 아미노이소부티르산(Aminoisobutyric acid) 또는 부탄산(Butanoic acid)의 함량이 감소되어 있는 경우 대장암의 발병 위험도가 높을 것으로 예측하는 것을 특징으로 하는, 대장암 진단을 위한 정보제공방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 정상인에 비해 콜린셀라(Collinsella) 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 증가되어 있고 솔라늄 멜로게나(Solanum melongena)속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 감소되어 있으며,
    상기 (d) 단계에서 정상인에 비해 류신(Leucine) 및 옥살산(Oxalic acid)이 증가되어 있는 경우 대장암의 발병 위험도가 높을 것으로 예측하는 것을 특징으로 하는, 대장암 진단을 위한 정보제공방법.

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EP2955232A1 (en) * 2014-06-12 2015-12-16 Peer Bork Method for diagnosing adenomas and/or colorectal cancer (CRC) based on analyzing the gut microbiome
KR20180070070A (ko) * 2016-12-16 2018-06-26 강원대학교산학협력단 무인항공기를 이용한 침수흔적도 작성 시스템 및 방법

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Biochim Biophys Acta Rev Cancer, 1868(2): 372-393 (2017.06.29.)* *

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