KR20210029471A - 과식에 의해 유도된 위식도역류질환 동물모델의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 위식도역류질환 동물모델의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 비수술적인 방법인 과식에 의해 유도된 위식도역류질환 마우스 모델의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 과식에 의해 유도된 위식도역류질환 마우스 모델은 제조가 용이하고, 장기간 생존율이 우수하므로 위식도역류질환 연구 및 치료제 개발에 매우 유용하다.

Description

과식에 의해 유도된 위식도역류질환 동물모델의 제조방법 {Method for Manufacturing Animal Model of Gastroesophageal Reflux Disease Induced by Overeating}

본 발명은 위식도역류질환 동물모델의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 비수술적인 방법인 과식에 의해 유도된 위식도역류질환 마우스 모델의 제조방법에 관한 것이다.

위식도역류질환이란 위산이나 위 속의 내용물이 식도로 역류하여 가슴 안쪽으로 타는 듯한 통증이나 쓰림을 일으키는 질환으로, 역류가 지나치게 많이 일어나 식도로 넘어온 위산과 위 속 내용물이 식도점막을 자극하여 쓰리고 아픈 증상을 일으키고, 심할 경우 식도염, 식도궤양, 협착 등을 일으키는 질병이다. 이러한 증상으로 인한 진단 방법은 가슴 쓰림과 산 역류라는 특징적인 증상이 있으면 위산역류질환을 의심할 수 있다. 이러한 증상은 눕거나 앞으로 구부릴 때 심해지고, 물을 마시거나 제산제를 복용하면 좋아지는 효과를 나타낸다. 현재까지 이용되는 진단 방법인 내시경 검사는 위산역류로 인해 일어난 식도손상을 확인하는 가장 객관적인 방법이지만, 위식도역류질환 환자의 반 수 이상에서는 미란성 식도염이 관찰되지 않는 정상소견을 나타낸다는 제한점이 있다 (Dent J et al., Gut 54:710-717, 2005; Fujiwara Y et al., Am J Gastroenterol 100:754-758, 2005; Okamoto K et al., Dig Dis and Sci 48:2237-2241, 2003).

현재까지 보고된 바에 따르면, 위식도역류질환 동물모델로 수술적인 방법을 이용하여 발생시킨 역류성 식도염 모델의 제시가 있었다 (Hai-Qing Hu et al., J Thorac Dis . 10(3): 1607-1613, 2018; He J et al., JoVE 102:e53012, 2015; Koji Takeuchi et al., Biomed Res Int . 2014; 532594, 2014). 마우스와 같은 동물에서는 자연적으로 발생하는 위식도역류질환의 존재에 대한 기록이 없기 때문에 인위적으로 모델을 제작해야 한다. 그러나, 수술적인 방법을 이용한 모델은 생존율이 낮기 때문에 장기간의 연구를 하기에는 어려움이 있다는 단점이 있다.

이에, 본 발명자들은 위식도역류질환의 한계 개선 연구에 사용할 수 있는 장기간 생존율이 우수한 동물모델을 제조하기 위해 예의 노력한 결과, 비수술적인 방법이며, 위식도역류질환의 원인으로 알려진 과식을 유발하여 위식도역류질환 마우스 모델을 확립하였다.

본 발명의 목적은 위식도역류질환의 연구, 치료제 및 치료방법을 개발하기 위하여, 실험동물에서 과식을 유도하는 비수술적인 방법으로 생존율이 우수한 위식도역류질환 동물모델을 제조하는 방법 및 상기 방법으로 제조된 위식도역류질환 동물모델을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 위식도역류질환 동물모델을 이용하여 위식도역류질환 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 금식과 식이를 반복하여 실험동물의 과식을 유도하는 단계; 및 (b) 과식에 의해 위식도역류질환이 유발된 실험동물을 위식도역류질환 동물모델로 선별하는 단계를 포함하는 위식도역류질환 동물모델의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 방법으로 제조된 위식도역류질환 동물모델을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 상기 위식도역류질환 동물모델에 위식도역류질환 치료제 후보물질을 투여하는 단계; (b) 상기 위식도역류질환 치료제 후보물질이 투여된 동물모델의 위 식도 조직 손상을 확인하는 단계; 및 (c) 후보물질 미처리 동물모델의 위 식도 조직과 비교하여 조직 손상이 완화되는 경우의 후보물질을 위식도역류질환 치료제로 선별하는 단계를 포함하는 위식도역류질환 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 과식에 의해 유도된 위식도역류질환 마우스 모델은 제조가 용이하고, 장기간 생존율이 우수하므로 위식도역류질환 연구 및 치료제 개발에 매우 유용하다.

도 1은 위식도역류질환 동물모델 확립을 위한 4개 그룹의 식이 조건을 나타낸 모식도이다.
도 2는 위식도역류질환 동물모델 각 그룹의 체중 변화를 확인한 것이다.
도 3은 과식으로 유발시킨 위식도역류질환 동물모델의 하부 식도를 H&E 염색으로 관찰한 것이다.
도 4는 과식으로 유발시킨 위식도역류질환 동물모델의 위와 식도 변화를 확인한 것이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명에서는 위식도역류질환 연구 및 치료제 개발을 위한 위식도역류질환 동물모델을 제작하였다. 기존의 수술적인 방법을 이용한 동물모델은 생존율이 낮기 때문에 장기간의 연구를 하기에는 어려움이 있으므로, 이러한 한계를 극복할 수 있는 비수술적인 방법인 과식을 유발하여 위식도역류질환 동물모델을 제작하였다. 구체적으로 살펴보면 도 1에 나타낸 것과 같이, 마우스에 금식과 식이를 8주 이상 반복하여 과식에 의해 유도되는 위식도역류질환을 유발시켰다. 그 결과, 24시간 금식과 24시간 식이를 8주 이상 반복하여 과식을 유도한 마우스 그룹에서 위식도역류질환이 유발되었다. 이는 수술적인 방법을 이용하여 유발시킨 위식도역류질환 동물모델의 결과와 유사하였다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, (a) 금식과 식이를 반복하여 실험동물의 과식을 유도하는 단계; 및 (b) 과식에 의해 위식도역류질환이 유발된 실험동물을 위식도역류질환 동물모델로 선별하는 단계를 포함하는 위식도역류질환 동물모델의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에서는 과식을 유발하기 위해 금식 시간을 각각 다르게 하여 과식에 의한 위식도역류질환을 유도하였다.

본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계는 20 ~ 28시간 동안 금식과 20 ~ 28시간 식이를 반복하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 24시간 금식과 24시간 식이를 반복하는 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 금식과 식이의 반복은 8주 이상 진행하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명에서 금식 시간이 24시간으로 동일한 경우에도 식이 시간이 24시간 이상일 경우, 과식에 의한 위식도역류질환 정도가 미미하였다. 마찬가지로, 본 발명에서 금식과 식이가 반복 진행되는 기간이 8주 이하일 경우에는 과식에 의한 위식도역류질환 정도가 미미하였다.

본 발명의 식이는 일반적인 정상 식이를 공급하였다.

본 발명에 있어서, 상기 식이는 한 케이지 당 18g 마우스 5 마리를 기준으로 먹이 70g 및 물 200ml을 24시간 동안 공급하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 동물은 마우스, 랫트, 모르모트, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 소, 양, 돼지 및 염소로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 비인간 동물인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 마우스가 아닌 랫트, 모르모트, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 소, 양, 돼지 및 염소로 구성된 군에서 선택된 하나 이상으로 진행할 경우, 먹이 및 물의 양을 몸무게에 비례하여 증가시킬 수 있다.

마우스, 랫트, 모르모트, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 소, 양, 돼지, 염소 등과 같은 포유동물은 일정한 성질을 지닌 개체가 안정적으로 공급되고, 실험할 때에 사육이나 처리가 쉽다는 등의 이유 때문에 모델 동물로서 바람직하다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 마우스 (C57BL6, 6주령)를 사용하였으나 이에 제한되지 않는다. 모델 동물을 제작하기 전의 사육 조건은 통상적인 방법에 따라 선택하면 되고 특별히 한정되지 않지만, 균질의 모델 동물을 얻기 위해서는 가능한 한 각 개체를 동일한 조건하에서 사육하는 것이 바람직하다.

본 발명은 다른 관점에서, 상기 과식에 의해 유도되는 위식도역류질환 동물모델 제조방법으로 제조된 위식도역류질환 동물모델에 관한 것이다.

본 발명에 관한 모델 동물은 위식도역류질환 연구의 피험 약제의 약효 평가에 적합한 것이면 특별히 한정되지 않고, 어떠한 형태의 것이어도 사용할 수 있다. 예컨대, 마우스, 랫트, 모르모트, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 소, 양, 돼지 및 염소로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 비인간동물 어느 것이나 사용할 수 있다.

본 발명의 과식에 의해 유도되는 위식도역류질환 동물모델은 종래의 수술로 유발시킨 위식도역류질환 동물모델에 비해 장기간 생존이 가능하므로, 장기간의 연구에 사용 가능하다. 따라서, 위식도역류질환 치료제 개발에서 약제의 효과를 평가할 수 있는 기간이 연장되고, 치료제의 효과를 안정적으로 평가할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 제5항의 위식도역류질환 동물모델에 위식도역류질환 치료제 후보물질을 투여하는 단계; (b) 상기 위식도역류질환 치료제 후보물질이 투여된 동물모델의 위 식도 조직 손상을 확인하는 단계; 및 (c) 후보물질 미처리 동물모델의 위 식도 조직과 비교하여 조직 손상이 완화되는 경우의 후보물질을 위식도역류질환 치료제로 선별하는 단계를 포함하는 위식도역류질환 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

본 발명의 모델 동물을 이용한 평가방법의 대상이 되는 피험 약제는 특별히 제한되지 않고, 위식도역류질환에 대한 치료 효과를 평가하는 목적을 갖는 것이면 어떠한 것이어도 된다. 위식도역류질환을 치유하는 것을 목적으로 조제된 1종류 이상의 유효성분을 함유하는 조성물은 그 대상에 포함된다.

통상 의약품이나 의약부외품을 가리키는데, 특정 보건용 식품(기능성 식품), 특정 영양 보조 식품, 건강 식품 등과 같은 보조 식품 등도 포함된다.

당연히 기존의 작용 메커니즘을 갖는 약제뿐 아니라 신규 작용 메커니즘을 갖는 약제를 스크리닝할 수도 있다.

투여 시기나 투여 횟수 등의 투여 조건은 약제의 성질, 시험 및 평가 목적 등에 따라 적절하게 최적이 되도록 설정하면 되며 특별히 제한되지 않는다. 예컨대, 투여 시기에 대해서는 모델 동물 제작 직후부터 30분 마다 수회 투여한 후, 그 다음 1시간 마다 수회 투여하고, 그때마다 증상의 변화를 관찰, 평가하는 방법이 많이 이용될 수 있다. 투여 횟수에 대해서는 약제의 성질에 따라 다르고, 1회 이상 수회가 될 수도 있다.

[실시예]

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 과식에 의한 위식도역류질환 유발

과식을 유발하기 위해 마우스 (C57BL6, 6주령)를 4가지 조건의 그룹으로 나누었다. 그룹 1은 일반적인 조건으로 마우스를 사육한 대조군이며, 그룹 2 내지 4는 도 1의 모식도를 바탕으로 과식을 유발시켰다. 각 그룹당 6마리의 마우스로 실험하였으며, 2, 4, 8주뒤 안락사하여 결과를 확인하였다.

각 그룹별 먹이 섭취량 (70g) 및 음수량 (200ml)의 기준을 정하여 24시간 후, 줄어든 양을 측정하였으며, 마우스의 몸무게도 측정하였다. 이러한 측정은 하루에 한번씩 2주~8주 동안 실시하였다.

그 결과, 대조군 그룹 1의 몸무게는 꾸준히 증가하였으며, 과식을 유발시킨 그룹 2 내지 4의 몸무게는 안먹는 날에 비해 먹는 날의 무게가 증가하였다 (도 2). 하루 차이로 굶고, 먹는 그룹 2의 몸무게는 하루 평균 3~4g이 변하였으며, 이틀을 굶고 하루를 먹는 그룹 3의 무게 또한 3~4g이 변하였다. 즉, 하루 더 굶는 것에 비례하여 몸무게가 줄지는 않음을 확인한 것이다. 실험 결과의 경향은 종료 시점인 8주까지 동일하였다.

실시예 2: 위식도역류질환 동물모델의 적합성 확인

실시예 1에서 과식을 유발한 그룹 1 내지 4의 마우스를 2, 4, 8주 각 종료 시점에 안락사시킨 후, 장기 위와 가까운 하부 식도를 적출하여 최적 표준 방법으로 알려진 H&E 염색 기법을 이용하여 조직학적 변화를 관찰하였다.

그 결과, 2주와 4주의 종료 시점에는 각 그룹별로 조직학적 변화가 관찰되지 않았다. 그러나, 8주 종료 시점에는 그룹 2의 하부 식도에서 상피세포의 손상이 관찰되었으며, 이러한 손상이 점막하층의 손상에도 영향을 미치는 것을 확인하였다 (도 3).

실시예 3: 위식도역류질환 동물모델의 최적 조건 확립

과식으로 유발시킨 위식도역류질환 동물모델의 최적 조건 확립 및 확인을 위해, 각 종료시점 이후 조직 변화를 유발할 수 있는 장기의 크기 및 조직 손상 유무에 대해 확인하였다.

그 결과, 2주 및 4주의 종료시점에서는 그룹 간의 차이점을 확인할 수 없었다. 그러나, 8주 종료시점에서 그룹 2의 장기 위의 크기가 커져 있는 것을 관찰할 수 있었으며, 식도 안쪽의 조직 손상이 유발됨을 확인하였다 (도 4). 이러한 식도 안쪽의 조직 손상 결과는 이전 보고된 수술로 유발시킨 위식도역류 질환 랫트 (Rat) 모델의 식도 손상 결과와 유사한 결과를 나타냈다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (7)

1. 다음 단계를 포함하는 위식도역류질환 동물모델의 제조방법:
   (a) 금식과 식이를 반복하여 실험동물의 과식을 유도하는 단계; 및
   (b) 과식에 의해 위식도역류질환이 유발된 실험동물을 위식도역류질환 동물모델로 선별하는 단계.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계는 20 ~ 28시간 동안 금식과 20 ~ 28시간 식이를 8 ~ 12주간 반복하는 것을 특징으로 하는 제조방법:
   
3. 제2항에 있어서, 상기 식이는 마우스 5마리 기준으로 먹이 70g 및 물 200ml을 24시간 동안 공급하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 동물은 마우스, 랫트, 모르모트, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 소, 양, 돼지 및 염소로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 비인간 동물인 것을 특징으로 하는 제조방법.
   
5. 제1항의 방법으로 제조된 위식도역류질환 동물모델.
   
6. 제5항에 있어서, 상기 동물은 마우스, 랫트, 모르모트, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 소, 양, 돼지 및 염소로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 비인간 동물인 것을 특징으로 하는 동물모델.
   
7. 다음 단계를 포함하는 위식도역류질환 치료제의 스크리닝 방법:
   (a) 제5항의 위식도역류질환 동물모델에 위식도역류질환 치료제 후보물질을 투여하는 단계;
   (b) 상기 위식도역류질환 치료제 후보물질이 투여된 동물모델의 위 식도 조직 손상을 확인하는 단계; 및
   (c) 후보물질 미처리 동물모델의 위 식도 조직과 비교하여 조직 손상이 완화되는 경우의 후보물질을 위식도역류질환 치료제로 선별하는 단계.
   

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