KR20210021767A - Avian flu oral vaccine delivery vehicle including Eudragit - Google Patents

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Abstract

The present invention relates to an avian influenza oral virus vaccine carrier, which comprise avian influenza virus vaccine particles for oral use, an Eudragit layer formed on the avian influenza oral virus vaccine particles, and a branched polyvinyl-alcohol layer formed on the Eudragit layer. According to the present invention, by simply ingesting the avian influenza oral virus vaccine carrier to generate avian influenza antibodies in the body for avian influenza in which current serosubtypes are diversified, mutations easily occur, and various types of viruses even in wild birds in natural ecosystems are distributed, there is an effect of preventing birds from catching avian influenza.

Description

유드라짓을 포함하는 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체 {Avian flu oral vaccine delivery vehicle including Eudragit}Avian flu oral vaccine delivery vehicle including Eudragit

본 발명은 고분자 소재를 이용한 백신 전달체와 백신과 전달체를 복합체화하는 기술에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 가금류에 적용이 가능한 경구용 조류독감 백신을 소화기관의 강한 산성, 소화효소 등의 환경에서 안정적으로 보호하고 소장과 같은 흡수기관에서 백신을 용출시키는 고분자 전달체 및 이를 백신과 복합체화 하는 기술이다. The present invention relates to a technology for complexing a vaccine delivery system and a vaccine and delivery system using a polymer material, and more particularly, an oral bird flu vaccine applicable to poultry is stable in an environment such as strong acidity and digestive enzymes in the digestive system. It is a polymeric delivery system that protects it with and elutes the vaccine from the absorption organs such as the small intestine, and a technology that complexes it with the vaccine.

조류독감은 조류인플루엔자 바이러스에 의해 조류가 감염되는 전염성 급성호흡기 질병으로 닭, 칠면조, 오리 등 가금류의 피해가 심각하게 나타난다. 바이러스 병원성에 따라 저병원성(H1N1등)과 고병원성(H5N1, H5N8, H5N6등)조류인플루엔자로 구분되며 고병원성 조류인플루엔자에 감염된 가금류는 급성 호흡기증상을 보이며 100%에 가까운 폐사를 나타내는 것이 특징이다. Bird flu is a contagious acute respiratory disease in which birds are infected by the avian influenza virus, and the damage to poultry such as chickens, turkeys and ducks is serious. According to viral pathogenicity, it is classified into low pathogenicity (H1N1, etc.) and highly pathogenic (H5N1, H5N8, H5N6, etc.) avian influenza. Poultry infected with highly pathogenic avian influenza show acute respiratory symptoms and nearly 100% mortality.

매년 국내에서 발생하는 조류독감으로 인해 해마다 1000만마리 이상의 가금류가 살처분되고 특히 2016~2017년에는 2000만마리 이상 살처분 되는 역사이래 최악의 피해가 발생하기도 하였다. More than 10 million poultry are killed every year due to the bird flu that occurs in Korea every year, especially in 2016-2017, the worst damage since history of more than 20 million.

조류인플루엔자 바이러스는 혈청아형(subtype)이 다양하고 변이가 쉽게 일어나며, 자연생태계의 야생조류에도 다양한 종류의 바이러스가 분포되어 있다. Avian influenza viruses have a variety of serotypes and are easily mutated, and various types of viruses are distributed in wild birds of the natural ecosystem.

현재까지 국내에 유행된 조류인플루엔자 바이러스는 H5N1형, H5N8형, H5N6형이고 독감 바이러스의 특성상 빈번한 변이로 인해 새로운 바이러스의 유행에 대처가 어려운 상황이다. The avian influenza viruses that have been prevalent in Korea so far are H5N1, H5N8, and H5N6 types, and due to the nature of the flu virus, it is difficult to cope with the outbreak of new viruses due to frequent mutations.

국내외 연구 개발 현황을 살펴보면, 바이러스 유사입자를 이용한 단일 조류 인플루엔자 감염을 방어하는 근육경로 접종, 또는 흡입경로 접종 방식의 연구개발은 있다. 그러나 동시에 여러 종류 변형 바이러스 감염을 방어하는 범용 바이러스 유사입자 백신 및 상기 백신의 경구용 백신 전달체에 대한 연구개발이 전무한 상황이다. Looking at the current state of research and development at home and abroad, there is a research and development of intramuscular route vaccination or inhalation route vaccination to protect against single avian influenza infection using virus-like particles. However, there is no research and development on a general-purpose virus-like particle vaccine that simultaneously protects against various types of modified virus infections and an oral vaccine delivery system for the vaccine.

이에 따라 본 발명은 바이러스와 유사한 캡시드 (capsid) 단백질 또는 매트릭스 단백질을 과발현시켜, 바이러스 유사입자를 대량으로 생산하는 유전자재조합 기술(바이러스 유사입자 기술)을 도입하여, 감염원의 항원성을 지닌 단백질 또는 당단백질을 바이러스 유사입자 표면에 노출되게 하였다. 이렇게 제조된 바이러스 유사입자는 바이러스와 거의 유사한 특징을 가지지만 바이러스의 유전자 및 복제능이 전혀 없는 바이러스이다. 이러한 바이러스를 경구용 백신 전달체로 캡슐화하여 구강으로 간편하게 섭취할 수 있게 함으로써, 바이러스를 직접 이용하는 기술임에도 불구하고 매우 안전하면서도 빠른 대처가 가능하도록 하는 백신 전달체를 개발하였다. Accordingly, the present invention introduces a gene recombination technology (virus-like particle technology) that overexpresses a virus-like capsid protein or matrix protein to produce a large amount of virus-like particles, Proteins were exposed to the surface of virus-like particles. The virus-like particles prepared in this way have almost similar characteristics to the virus, but are a virus that does not have any gene and replication ability of the virus. By encapsulating these viruses with an oral vaccine delivery system and allowing them to be conveniently ingested orally, a vaccine delivery system was developed that enables a very safe and quick response despite the technology that directly uses the virus.

대한민국 공개특허 10-2017-0009207 “경구용 바이러스 백신 전달체”Republic of Korea Patent Publication 10-2017-0009207 “Oral virus vaccine delivery system”

Virus-Like Particle Vaccine Induces Protective Immunity against Homologous and Heterologous Strains of Influenza Virus. Journal of Virology, 2007Virus-Like Particle Vaccine Induces Protective Immunity against Homologous and Heterologous Strains of Influenza Virus. Journal of Virology, 2007 Stability Kinetics of Influenza Vaccine Coated onto Microneedles During Drying and Storage. Pharmaceutical Research, 2011Stability Kinetics of Influenza Vaccine Coated onto Microneedles During Drying and Storage. Pharmaceutical Research, 2011 Incorporation of Membrane-Anchored Flagellin into Influenza Virus-Like Particles Enhances the Breadth of Immune Responses. Journal of Virology, 2008)Incorporation of Membrane-Anchored Flagellin into Influenza Virus-Like Particles Enhances the Breadth of Immune Responses. Journal of Virology, 2008)

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 조류가 섭취하는 물, 사료 등에 혼합하여 사용할 수 있는 전달체를 포함하는 조류독감 백신 복합체에 관한 것으로, 닭을 비롯한 조류에 주사를 통한 백신의 예방접종이 현실적으로 어려우므로, 소화기관에서 안정성을 유지하고 최종 목적 기관에서 조류독감 백신이 효과적으로 용출되는 전달체-백신 복합체와 그 제조방법 발명을 통해 조류독감을 사전에 예방하고자 한다. The problem to be solved by the present invention relates to a bird flu vaccine complex comprising a delivery system that can be used by mixing water, feed, etc. consumed by birds, because vaccination of a vaccine through injection into birds including chickens is practically difficult, It is intended to prevent bird flu in advance through the invention of a vehicle-vaccine complex and a method of manufacturing the same, which maintains stability in the digestive system and effectively elutes the bird flu vaccine in the final target organ.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체를 제공한다. In order to achieve the above object, the present invention provides an oral viral vaccine delivery system for bird flu.

상기 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체의 경구용 바이러스 백신은 조류독감 경구용 바이러스 백신 입자이고, 상기 조류독감 경구용 바이러스 백신 입자상에 형성되는 고분자 유드라짓(Eudragit)층, 및 상기 유드라짓(Eudragit)층 상에 형성되는 가지형태들의 폴리비닐알코올(Polyvinyl-alcohol)층을 포함한다.The oral viral vaccine of the avian flu oral viral vaccine carrier is avian flu oral viral vaccine particles, a polymer Eudragit layer formed on the avian flu oral viral vaccine particles, and the Eudragit ) It includes a polyvinyl alcohol (Polyvinyl-alcohol) layer of the form formed on the layer.

상기와 같은 본 발명에 따르면, 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체를 제공함으로써, 현재 혈청아형(subtype)이 다양하고 변이가 쉽게 일어나며, 자연생태계의 야생조류에도 다양한 종류의 바이러스가 분포하고 있는 조류독감을 간단하게 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체를 섭취하는 것만으로 체내에 조류독감 항체가 생기도록 유도하여, 조류가 조류독감에 걸리지 않도록 예방하는 효과가 있다.According to the present invention as described above, by providing a virus vaccine delivery system for oral avian flu, the current serosubtype is diverse and mutations easily occur, and various kinds of viruses are distributed in wild birds of the natural ecosystem. By simply ingesting a bird flu oral viral vaccine carrier, it is effective to induce the generation of bird flu antibodies in the body, thereby preventing birds from getting bird flu.

도 1 은 경구용 바이러스 백신 전달체(nano particle)가 pH(수소이온농도)에 따라 전달되는 과정 및 백신 방출 모식도를 도시하였다.
도 2 는 소태아혈청(BSA)을 이용하여 경구용 바이러스 백신 전달체(nano particle)를 제조하는 방법을 도시하였다.
도 3 은 소태아혈청(BSA)을 이용하여 제조한 경구용 바이러스 백신 전달체(nano particle)의 pH 안정성과 pH에 따른 BSA 방출 결과를 도시하였다.
도 4 는 H1N1 조류독감 백신(PR8)을 이용하여 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체(nano particle)를 제조하는 방법을 도시하였다.
도 5 는 백신을 포함하지 않은 경구용 바이러스 백신 전달체(nano particle) 및 H1N1 조류독감 백신(PR8)을 포함하는 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체(nano particle)의 Scanning Electron Microscope(SEM) 촬영 결과를 도시하였다.
도 6 은 H1N1 조류독감 백신(PR8)을 이용하여 제조한 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체(nano particle)의 pH 안정성과 pH에 따른 H1N1 조류독감 백신 방출 결과를 도시하였다.
도 7 은 H1N1 조류독감 백신(PR8)을 이용하여 제조한 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체(nano particle)의 H1N1 조류독감 백신 방출을 재확인한 결과를 도시하였다.
도 8 은 M2e 조류독감 바이러스 유사입자 백신을 이용하여 제조한 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체(virus-like particle, VLP)의 Poly Dispersity Index (PDI)값과 z-potential 값을 도시하였다.
도 9 는 M2e 조류독감 바이러스 유사입자 백신을 이용하여 제조한 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체(virus-like particle, VLP)의 pH 안정성과 pH에 따른 M2e 조류독감 바이러스 유사입자 백신 방출 결과를 도시하였다.
도 10 은 본원발명의 조류독감 경구용 바이러스 백신의 HA(Hemagglutinin) Activity를 확인하기 위한 HA Titer test 결과를 도시하였다. FIG. 1 shows a schematic diagram of a process in which an oral viral vaccine carrier (nano particle) is delivered according to pH (hydrogen ion concentration) and a vaccine release.
FIG. 2 shows a method of preparing an oral viral vaccine carrier (nano particle) using fetal bovine serum (BSA).
3 shows the pH stability of the oral viral vaccine carrier (nano particle) prepared using fetal bovine serum (BSA) and the BSA release results according to the pH.
Figure 4 shows a method of preparing a virus vaccine carrier (nano particle) for oral avian flu using H1N1 avian flu vaccine (PR8).
Figure 5 shows the scanning results of the oral viral vaccine carrier (nano particle) without the vaccine and the bird flu oral viral vaccine carrier (nano particle) including the H1N1 avian flu vaccine (PR8) Scanning Electron Microscope (SEM) I did.
Figure 6 shows the pH stability of avian flu oral viral vaccine carrier (nano particle) prepared using the H1N1 avian flu vaccine (PR8) and the results of the H1N1 avian flu vaccine release according to the pH.
7 shows the results of reconfirming the release of the H1N1 avian flu vaccine from the oral avian flu vaccine carrier (nano particle) prepared using the H1N1 avian flu vaccine (PR8).
FIG. 8 shows the Poly Dispersity Index (PDI) and z-potential values of a virus-like particle (VLP) for oral avian flu prepared using the M2e avian flu virus-like particle vaccine.
9 shows the pH stability of a virus-like particle (VLP) for oral avian flu prepared using the M2e avian flu virus-like particle vaccine and the release result of the M2e avian flu virus-like particle vaccine according to the pH.
10 shows the results of the HA Titer test for confirming the HA (Hemagglutinin) activity of the oral avian flu virus vaccine of the present invention.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명의 일 형태에 따라 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체를 제공한다. According to one embodiment of the present invention, a virus vaccine delivery system for oral bird flu is provided.

상기 경구용 바이러스 백신은 조류독감 경구용 바이러스 백신 입자이고, 상기 조류독감 경구용 바이러스 백신 입자상에 형성되는 유드라짓(Eudragit)층, 및 상기 유드라짓(Eudragit)층 상에 형성되는 가지형태들의 폴리비닐알코올(Polyvinyl-alcohol)층을 포함한다. The oral virus vaccine is a bird flu oral virus vaccine particle, Eudragit layer formed on the bird flu oral virus vaccine particle, and branch forms formed on the Eudragit layer. It includes a polyvinyl-alcohol layer.

상기 유드라짓(Eudragit)층은 pH(수소이온지수) 감응성 고분자층으로 pH 2 내지 6 미만에서는 잘 이온화되지 않고, pH 6 내지 8에서 잘 이온화 되어 유드라짓이 감싸고 있는 조류독감 경구용 백신 입자가 중성pH에서 잘 방출 될 수 있도록 한다.The Eudragit layer is a pH (hydrogen ion index) sensitive polymer layer, which is not well ionized below pH 2 to 6, and is well ionized at pH 6 to 8, and is surrounded by avian flu oral vaccine particles So that it can be released well at neutral pH.

상기 유드라짓(Eudragit)층은 유드라짓(Eudragit)의 소수성 부분과 백신 단백질의 소수성 부분이 서로 만나 결합하여 형성된 층이고, 백신 단백질의 친수성 부분이 유드라짓과 결합하여 유드라짓(Eudragit) 층의 외각에 돌출될 수 있다. The Eudragit layer is a layer formed by meeting and bonding between a hydrophobic portion of Eudragit and a hydrophobic portion of a vaccine protein, and the hydrophilic portion of the vaccine protein binds to Eudragit to form Eudragit. ) It can protrude from the outer surface of the layer.

상기 폴리비닐알코올(Polyvinyl-alcohol)층은 상기 유드라짓(Eudragit)층 외각에 돌출된 유드라짓(Eudragit)과 백신 단백질 복합체의 단백질 친수성 부분을 감싼다. 상기 유드라짓(Eudragit)층 외각에 돌출된 유드라짓(Eudragit)과 백신 단백질 복합체의 단백질 친수성 부분을 PVA가 감싸면서 백신단백질 보호 및 입자의 견고성을 유지한다.The polyvinyl-alcohol layer covers the protein hydrophilic portion of the Eudragit and vaccine protein complexes protruding from the outer surface of the Eudragit layer. PVA protects the vaccine protein and maintains the robustness of the particles while enclosing the protein hydrophilic portion of the Eudragit and vaccine protein complexes protruding from the outer surface of the Eudragit layer.

상기 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체는 수용액 상태에서 안정적으로 존재할 수 있으며, 이는 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체의 최외각부위인 친수성 가지형태의 폴리비닐알코올(Polyvinyl-alcohol)층으로 인한 것이다. The avian flu oral viral vaccine delivery system may be stably present in an aqueous solution state, which is due to the hydrophilic branched polyvinyl alcohol (Polyvinyl-alcohol) layer, which is the outermost part of the avian flu oral viral vaccine delivery system.

상기 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체는 그 크기가 250 내지 550nm 크기일 수 있다.The bird flu oral virus vaccine delivery system may have a size of 250 to 550 nm.

조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체는 pH7에서 전위차(Z-potential)값이 -30 내지 -40 mV 일수 있다. Avian flu oral viral vaccine delivery system may have a Z-potential value of -30 to -40 mV at pH 7.

상기 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체는 다 분산 지수(Poly Dispersity Index)가 평균 0.03 내지 0.05일 수 있다. The bird flu oral viral vaccine delivery system may have a polydispersity index of 0.03 to 0.05 on average.

본 발명의 다른 형태에 따라 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체 제조방법을 제공한다. According to another aspect of the present invention, a method for preparing a virus vaccine delivery system for oral bird flu is provided.

상기 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체 제조방법은 1) 조류독감 경구용 바이러스 백신을 소수성 용매인 디클로로메탄(dichloro methane, DCM)에 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계, 2) 상기 혼합물을 고분자 유드라짓(Eudragit)이 녹아 있는 수용액과 혼합하여 초음파 처리하는 단계, 3) 상기 초음파 처리한 혼합물을 폴리바이닐알콜(Polyvinyl-alcohol, PVA) 용액과 다시 혼합 후 초음파 처리하여 W/O/W 에멀젼을 제조하는 단계, 4) 상기 W/O/W 에멀젼에 들어있는 디클로로메탄(dichloro methane, DCM)을 제거한 후 나노파티클을 수거하는 단계, 및 5) 상기 나노파티클을 세척하는 단계를 포함한다. The method for preparing a virus vaccine delivery system for oral avian flu comprises: 1) preparing a mixture by mixing an oral virus vaccine for avian flu in dichloromethane (DCM), a hydrophobic solvent, 2) preparing a mixture by using a polymer Eudragit ( Eudragit) is mixed with an aqueous solution and subjected to ultrasonic treatment, 3) mixing the sonicated mixture with a polyvinyl-alcohol (PVA) solution and then ultrasonicating to prepare a W/O/W emulsion And 4) collecting nanoparticles after removing dichloromethane (DCM) contained in the W/O/W emulsion, and 5) washing the nanoparticles.

상기 2)단계의 초음파 처리는 2분동안 수행할 수 있다. The ultrasonic treatment in step 2) may be performed for 2 minutes.

상기 3)단계의 초음파 처리는 10분동안 수행할 수 있다. The ultrasonic treatment in step 3) may be performed for 10 minutes.

상기 4)단계의 W/O/W 에멀젼에 들어있는 디클로로메탄(dichloro methane, DCM) 제거는 W/O/W 에멀젼을 12시간 흔들어서 제거할 수 있다. The removal of dichloromethane (DCM) contained in the W/O/W emulsion of step 4) can be removed by shaking the W/O/W emulsion for 12 hours.

상기 W/O/W 에멀젼은 물 성분, 기름 성분, 물 성분의 순서로 첨가하여 제조되는 에멀젼을 의미할 수 있다. The W/O/W emulsion may mean an emulsion prepared by adding a water component, an oil component, and a water component in this order.

상기 4)단계의 나노파티클을 수거는 상기 디클로로메탄(dichloro methane, DCM)이 제거된 W/O/W 에멀젼을 4500g의 중력으로 60분간 원심 분리하여 상등액은 버리고 가라앉은 침전물을 수거하는 것이다. To collect the nanoparticles in step 4), the W/O/W emulsion from which the dichloromethane (DCM) has been removed is centrifuged for 60 minutes under a gravity of 4500 g, and the supernatant is discarded and the settled precipitate is collected.

상기 5)단계의 나노파티클을 세척하여 수거하는 것은 상기 나노파티클을 증류수(distilled water, DW)로 용해한 후 4500g의 중력으로 60분간 원심 분리하여 상등액과 침전물 분리를 총 2회 수행하는 것이다. Washing and collecting the nanoparticles in step 5) involves dissolving the nanoparticles in distilled water (DW) and centrifuging for 60 minutes under a gravity of 4500 g to separate the supernatant and the precipitate a total of two times.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are for illustrative purposes only, and it will be apparent to those of ordinary skill in the art that the scope of the present invention is not construed as being limited by these examples.

실시예 1.Example 1.

소혈청알부민(Bovine Serum Albumin, BSA) 5㎎을 포함한 수용액을 소수성 용매인 디클로로메탄(dichloro methane, DCM) 2㎖에 혼합하고 고분자 유드라짓 50mg이 녹아 있는 수용액과 혼합하여 2분간 초음파 처리하고, 폴리바이닐알콜(Polyvinyl-alcohol, PVA)용액과 다시 혼합하여 10분간 초음파 처리하여 W/O/W 에멀젼을 제조한다. An aqueous solution containing 5 mg of bovine serum albumin (BSA) was mixed with 2 ml of dichloromethane (DCM), a hydrophobic solvent, mixed with an aqueous solution containing 50 mg of polymer Eudragit, and sonicated for 2 minutes. A W/O/W emulsion was prepared by mixing again with a polyvinyl-alcohol (PVA) solution and sonicating for 10 minutes.

상기 W/O/W 에멀젼을 12시간 흔들어서 DCM을 제거하고, 4500g의 중력으로 60분간 원심 분리하여 상등액을 분리하고, 튜브 바닥에 생성된 침전물을 3차 증류수 (distilled water, DW)로 용해한 후 다시 4500g의 중력으로 60분간 원심 분리하여 상등액을 분리하며 이 과정을 총 2번 진행 하여 얻어진 침전물을 회수하여 최종 나노파티클을 획득함으로써 바이러스 백신 전달체를 제조한다. The W/O/W emulsion was shaken for 12 hours to remove DCM, centrifuged for 60 minutes under a gravity of 4500 g to separate the supernatant, and the precipitate formed at the bottom of the tube was dissolved in distilled water (DW) and then again. The supernatant is separated by centrifugation for 60 minutes under a gravity of 4500 g, and the resulting precipitate is recovered by performing this process a total of two times to obtain the final nanoparticles to prepare a virus vaccine delivery system.

실시예 2. Example 2.

불활성화 인플루엔자백신 H1N1 (inactivated H1N1 Vaccine) 500μg을 포함한 수용액을 소수성 용매인 디클로로메탄(dichloro methane, DCM) 2㎖에 혼합하고 고분자 유드라짓 50mg이 녹아 있는 수용액과 혼합하여 2분간 초음파 처리하고, 폴리바이닐알콜(Polyvinyl-alcohol, PVA) 용액과 다시 혼합하여 10분간 초음파 처리하여 W/O/W 에멀젼을 제조한다. An aqueous solution containing 500 μg of inactivated influenza vaccine H1N1 (inactivated H1N1 Vaccine) is mixed with 2 ml of dichloromethane (DCM), a hydrophobic solvent, mixed with an aqueous solution containing 50 mg of eudragit polymer, and sonicated for 2 minutes. A W/O/W emulsion was prepared by mixing again with a polyvinyl-alcohol (PVA) solution and sonicating for 10 minutes.

상기 W/O/W 에멀젼을 12시간 흔들어서 DCM을 제거하고, 4500g의 중력으로 60분간 원심 분리하여 상등액을 분리하고, 튜브 바닥에 생성된 침전물을 3차 증류수 (distilled water, DW)로 용해한 후 다시 4500g의 중력으로 60분간 원심 분리하여 상등액을 분리하며, 상기 3차 증류수로 침전물을 용해 후 원심 분리하는 과정을 전체 총 2번 진행 하여 얻어진 침전물을 회수하여 최종 나노파티클을 획득함으로써 바이러스 백신 전달체를 제조한다. The W/O/W emulsion was shaken for 12 hours to remove DCM, centrifuged for 60 minutes under a gravity of 4500 g to separate the supernatant, and the precipitate formed at the bottom of the tube was dissolved in distilled water (DW) and then again. The supernatant is separated by centrifugation for 60 minutes under the gravity of 4500g, and the process of centrifuging after dissolving the precipitate with the third distilled water is performed twice in total to recover the obtained precipitate to obtain the final nanoparticles to prepare a virus vaccine delivery system. do.

실시예 3. Example 3.

M2e 바이러스 유사입자 (virus-like particle, VLP)백신 500μg을 포함한 수용액을 소수성 용매인 디클로로메탄(dichloro methane, DCM) 2㎖에 혼합하고 고분자 유드라짓 50mg이 녹아 있는 수용액과 혼합하여 2분간 초음파 처리하고, 폴리바이닐알콜(Polyvinyl-alcohol, PVA) 용액과 다시 혼합하여 10분간 초음파 처리하여 W/O/W 에멀젼을 제조한다. An aqueous solution containing 500 μg of M2e virus-like particle (VLP) vaccine is mixed with 2 ml of dichloromethane (DCM), a hydrophobic solvent, mixed with an aqueous solution containing 50 mg of polymer Eudragit, and sonicated for 2 minutes. Then, the mixture was mixed with a polyvinyl-alcohol (PVA) solution again and subjected to ultrasonic treatment for 10 minutes to prepare a W/O/W emulsion.

상기 W/O/W 에멀젼을 12시간 흔들어서 DCM을 제거하고, 4500g의 중력으로 60분간 원심 분리하여 상등액을 분리하고, 튜브 바닥에 생성된 침전물을 3차 증류수 (distilled water, DW)로 용해한 후 다시 4500g의 중력으로 60분간 원심 분리하여 상등액을 분리하며, 상기 3차 증류수로 침전물을 용해 후 원심 분리하는 과정을 전체 총 2번 진행 하여 얻어진 침전물을 회수하여 최종 나노파티클을 획득함으로써 바이러스 백신 전달체를 제조한다. The W/O/W emulsion was shaken for 12 hours to remove DCM, centrifuged for 60 minutes under a gravity of 4500 g to separate the supernatant, and the precipitate formed at the bottom of the tube was dissolved in distilled water (DW) and then again. The supernatant is separated by centrifugation for 60 minutes under the gravity of 4500g, and the process of centrifuging after dissolving the precipitate with the third distilled water is performed twice in total to recover the obtained precipitate to obtain the final nanoparticles to prepare a virus vaccine delivery system. do.

측정예 1.Measurement Example 1.

상기 실시예 1 내지 3에서 제조한 최종 바이러스 백신 전달체(나노파티클) 샘플을 pH7의 버퍼용액에 용해 후 12시간 방치 후 동적 광 산란법 (DLS, Dynamic Light Scattering)으로 파티클의 사이즈, 다분산지수 (PDI, Polydispersity Index), 제타전위(Z-potential)를 측정하였다. The final virus vaccine delivery system (nanoparticle) samples prepared in Examples 1 to 3 were dissolved in a buffer solution of pH 7 and allowed to stand for 12 hours, and then the particle size and polydispersity index (DLS, Dynamic Light Scattering) were used. PDI, Polydispersity Index), and Z-potential were measured.

측정결과는 하기 표 1에 도시하였다. The measurement results are shown in Table 1 below.

　 BSA-NPBSA-NP H1N1-NPH1N1-NP M2e-NPM2e-NP Particle size (nm)Particle size (nm) 378.73±10.49378.73±10.49 273.26±1.31273.26±1.31 282.91±2.14282.91±2.14 PDIPDI 0.05±0.0170.05±0.017 0.02±0.0190.02±0.019 0.03±0.0070.03±0.007 z-potential (mV)z-potential (mV) -35.78±1.42-35.78±1.42 -36.78±3.65-36.78±3.65 -31.26±1.88-31.26±1.88 Encapsulation Efficiency (%)Encapsulation Efficiency (%) 48.29±6.4548.29±6.45 91.25±4.3391.25±4.33 87.67±9.1387.67±9.13

상기 표 1을 참조하면 M2e VLP 백신으로 제조한 바이러스 백신 전달체(나노파티클)의 사이즈는 282.91nm로 이상적인 나노사이즈를 형성하였다. Referring to Table 1, the size of the virus vaccine delivery system (nanoparticle) prepared with the M2e VLP vaccine was 282.91 nm, which formed an ideal nano size.

PDI 측정값 범위는 0 내지 1사이로, 0.5 이하면 비교적 균질화된 샘플인데, M2e VLP 백신으로 제조한 바이러스 백신 전달체(나노파티클)의 PDI는 0.03으로 매우 균질화된 나노파티클이 만들어졌음을 확인할 수 있었다. The PDI measurement value range is between 0 and 1, and if it is 0.5 or less, it is a relatively homogenized sample, and the PDI of the viral vaccine carrier (nanoparticle) prepared with the M2e VLP vaccine was 0.03, indicating that highly homogenized nanoparticles were made.

z-potential은 0에 가까울수록 분산이 안되고 엉겨붙을 가능성이 높지만 M2e VLP 백신으로 제조한 바이러스 백신 전달체(나노파티클)의 측정값은 -31.26mV로 각 나노입자간의 반발력이 크고 안정하여 분산이 잘되어 있음을 확인할 수 있었다. The closer the z-potential is to 0, the more likely it is not to disperse and become entangled, but the measured value of the viral vaccine carrier (nanoparticles) prepared with the M2e VLP vaccine is -31.26mV. The repulsive force between each nanoparticle is large and stable, so the dispersion is good It could be confirmed that there is.

측정예 2.Measurement example 2.

상기 실시예 1 내지 3에서 제조한 최종 바이러스 백신 전달체(나노파티클)샘플을 pH2, pH5, pH7의 버퍼용액에 용해 후 12시간 방치 후 동적 광 산란법(DLS, Dynamic Light Scattering)으로 파티클의 사이즈, 다분산지수 (PDI, Polydispersity Index), 제타전위(Z-potential)를 측정하여 pH stability를 비교하였다. 결과는 도 3, 도 6, 도 9에 각각 도시하였다. The final virus vaccine delivery system (nanoparticle) sample prepared in Examples 1 to 3 was dissolved in a buffer solution of pH2, pH5, and pH7, left for 12 hours, and then the particle size by dynamic light scattering (DLS), The pH stability was compared by measuring the polydispersity index (PDI) and the zeta potential (Z-potential). The results are shown in Figs. 3, 6, and 9, respectively.

도 3, 도 6, 도 9의 pH stbility 결과를 참조하면, 상기 도 3은 실시예 1, 상기 도 6은 실시예 2, 상기 도 9는 실시예 3에서 제조한 최종 바이러스 백신 전달체(나노파티클) 샘플의 파티클의 크기와 제타전위(Z-potential) 가 pH 조건에 따라 변화하는 특성을 나타내고 있으며, 도 3, 도 6, 도 9의 pH stbility에서 pH7 버퍼용액 실험결과의 경우 입자간의 사이가 벌어져서 파티클의 사이즈가 증가하고, 이로 인해 백신 방출이 용이하여지며, 또한 제타전위(Z-potential)값은 감소하는 특성을 확인 할 수 있었다. Referring to the pH stbility results of FIGS. 3, 6 and 9, FIG. 3 is an example 1, FIG. 6 is an example 2, and FIG. 9 is a final virus vaccine delivery system prepared in Example 3 (nanoparticles). The particle size and the zeta potential of the sample change according to the pH condition. It was confirmed that the size of was increased, thereby making it easier to release the vaccine, and also decreasing the Z-potential value.

측정예 3. Measurement example 3.

상기 실시예 1 내지 3에서 제조한 최종 바이러스 백신 전달체(나노파티클) 샘플을 pH2, pH5, pH7의 용액에 용해후 0시간, 0.5시간, 1시간, 2시간, 5시간, 8시간, 20시간에 각각 샘플을 취하여 원심분리 후 상등액에 들어 있는 각 실시예들의 입자(실시예 1은 BSA, 실시예 2는 H1N1, 실시예 3은 M2e)의 농도를 측정하여 pH에 따라 시간대별로 바이러스 백신 전달체(나노파티클)에서 용출되는 입자의 양을 측정한다.At 0 hours, 0.5 hours, 1 hour, 2 hours, 5 hours, 8 hours, 20 hours after dissolving the final virus vaccine delivery system (nanoparticle) samples prepared in Examples 1 to 3 in a solution of pH2, pH5, and pH7. After each sample was taken and centrifuged, the concentration of the particles of each Example (BSA in Example 1, H1N1 in Example 2, M2e in Example 3) in the supernatant was measured, and the virus vaccine delivery system (nano Particles) to measure the amount of particles eluted.

결과는 도 3, 도 6, 도 9에 pH Release Test에 도시하였다. The results are shown in the pH Release Test in FIGS. 3, 6 and 9.

도 3, 도 6, 도 9의 pH Release Test 결과를 참조하면, 상기 도 3은 실시예 1, 상기 도 6은 실시예 2, 상기 도 9는 실시예 3에서 제조한 최종 바이러스 백신 전달체(나노파티클)들이 각각 pH 환경하에서 바이러스 백신 전달체(나노파티클)에서 용출되는 입자의 양을 확인하고 pH2, pH5의 용출정도가 pH7에 비하여 훨씬 낮음을 확인하였다. 이는 해당 바이러스 백신 전달체(나노파티클)가 낮은 pH에서 단백질을 보호 할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다. Referring to the results of the pH Release Test of FIGS. 3, 6, and 9, FIG. 3 is an example 1, FIG. 6 is an example 2, and FIG. 9 is a final virus vaccine delivery system prepared in Example 3 (nanoparticles ), respectively, confirmed the amount of particles eluted from the virus vaccine carrier (nanoparticles) under the pH environment, and confirmed that the elution degree of pH2 and pH5 was much lower than that of pH7. This confirmed that the virus vaccine carrier (nanoparticle) can protect the protein at low pH.

측정예 4. Measurement Example 4.

실시예 1의 제조방법으로 제조된 바이러스 백신 전달체(나노파티클)과 실시예 1의 제조방법에서 BSA없이 제조된 바이러스 백신 전달체(나노파티클)를 SEM(Scanning Electron Microscope) 주사전자현미경을 이용하여 각 나노파티클 입자를 촬영하였다. The virus vaccine delivery system (nanoparticles) prepared by the manufacturing method of Example 1 and the virus vaccine delivery system (nanoparticles) manufactured without BSA in the manufacturing method of Example 1 were each nanoparticles using a scanning electron microscope (SEM). Particle particles were photographed.

촬영 결과는 도 5에 도시하였다. The photographing results are shown in FIG. 5.

도 5를 참조하면, 도 5는 물에 분산된 바이러스 백신 전달체(나노파티클) 시료를 촬영한 것이 아닌 동결건조 후의 시료를 촬영한 것으로 바이러스 백신 전달체(나노파티클)들이 균일하게 형성되어 있음을 확인 할 수 있었다. Referring to FIG. 5, FIG. 5 shows a sample after lyophilization, not a sample of a virus vaccine delivery system (nanoparticles) dispersed in water, and it can be confirmed that the virus vaccine delivery system (nanoparticles) are uniformly formed. Could.

측정예 5. Measurement Example 5.

사독백신 H1N1 바이러스 백신 전달체(나노파티클)의 항원성을 측정하기 위하여 NP20㎍ (H1N1 nanoparticle 20㎍), NPFD20㎍ sucrose O (sucrose를 첨가하여 동결건조(Freeze-dried)된 H1N1 nanoparticle 20㎍), NPFD20㎍ sucrose X(sucrose를 첨가하지 않고 동결건조(Freeze-dried)된 H1N1 nanoparticle 20㎍), PR8 inact 20μg(대조군으로써 일반 H1N1사독백신 20㎍)을 이용하여 혈구응집반응실험 (hemagglutination assay)을 진행하였다. To measure the antigenicity of the Zadok vaccine H1N1 virus vaccine carrier (nanoparticles), NP20㎍ (H1N1 nanoparticle 20㎍), NPFD20㎍ sucrose O (freeze-dried H1N1 nanoparticle 20㎍ with added sucrose), NPFD20 Hemagglutination assay was carried out using ㎍ sucrose X (freeze-dried H1N1 nanoparticle 20 ㎍ without adding sucrose) and PR8 inact 20 μg (general H1N1 dead vaccine 20 ㎍ as a control group). .

결과는 도 10에 도시하였다. The results are shown in FIG. 10.

도 10을 참조하면, 대조군인 PR8 inact 20μg군의 HA Titer가 1:8인 것에 비해 NP20㎍은 HA Titer가 1:64, NPFD20㎍ sucrose O 군은 HA Titer가 1:256로 더 좋은 항원성을 가진 것으로 확인되었다. Referring to Figure 10, compared to the control group PR8 inact 20μg HA Titer 1: 8 compared to the NP20 ㎍ HA Titer 1: 64, NPFD 20 ㎍ sucrose O group HA Titer 1: 256, better antigenicity. Confirmed to have.

이는 바이러스 백신 전달체(나노파티클) 제조과정에서 백신의 항원성이 감소되지 않았음을 확인할 수 있고, 동결건조(Freeze-dried)시에는 Sucrose을 사용하면 백신의 항원성이 감소되지 않음을 확인 할 수 있었다. 반대로 Sucrose을 사용하지 않으면 동결건조시 백신의 항원성이 없어짐을 확인 할 수 있었다. This confirms that the antigenicity of the vaccine was not reduced during the manufacturing process of the virus vaccine carrier (nanoparticle), and the use of Sucrose during freeze-dried did not decrease the antigenicity of the vaccine. there was. On the contrary, it could be confirmed that if sucrose was not used, the antigenicity of the vaccine was lost upon lyophilization.

이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다. As mentioned above, a specific part of the present invention has been described in detail, and for those of ordinary skill in the art, it is obvious that this specific technique is only a preferred embodiment, and the scope of the present invention is not limited thereby. something to do. Therefore, it will be said that the practical scope of the present invention is defined by the appended claims and their equivalents.

Claims (14)

경구용 바이러스 백신 전달체에 있어서,
상기 경구용 바이러스 백신은 조류독감 경구용 바이러스 백신 입자이고;
상기 조류독감 경구용 바이러스 백신 입자상에 형성되는 유드라짓(Eudragit)층; 및
상기 유드라짓(Eudragit)층 상에 형성되는 가지형태들의 폴리비닐알코올(Polyvinyl-alcohol)층을 가지는 유드라짓을 포함하는 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체.
In the oral viral vaccine delivery system,
The oral viral vaccine is a bird flu oral viral vaccine particle;
Eudragit layer formed on the bird flu oral virus vaccine particles; And
Avian flu oral virus vaccine delivery system comprising Eudragit having a polyvinyl-alcohol layer of branches formed on the Eudragit layer.
 제1항에 있어서,
상기 조류독감 경구용 바이러스 백신 입자는 불활성화 조류독감 인플루엔자 백신 또는 조류독감 바이러스 유사입자인 것을 특징으로 하는 유드라짓을 포함하는 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체.
The method of claim 1,
The bird flu oral virus vaccine particles are avian flu oral virus vaccine delivery system comprising Eudragit, characterized in that the inactivated bird flu vaccine or avian flu virus-like particles.
 제1항에 있어서,
상기 유드라짓(Eudragit)층은 유드라짓(Eudragit)의 소수성 부분과 상기 조류독감 경구용 바이러스 백신 입자의 백신 단백질의 소수성 부분이 서로 만나 결합하여 형성되는 것을 특징으로 하는 유드라짓을 포함하는 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체.
The method of claim 1,
The Eudragit layer comprises Eudragit, characterized in that the hydrophobic portion of Eudragit and the hydrophobic portion of the vaccine protein of the oral virus vaccine particle for bird flu meet and bind to each other. Bird flu oral viral vaccine carrier.
 제1항에 있어서,
상기 유드라짓(Eudragit)층은 pH(수소이온지수) 감응성 고분자층으로 pH 2 내지 5에서는 이온화되지 않는 것을 특징으로 하는 유드라짓을 포함하는 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체.
The method of claim 1,
The Eudragit layer is a pH (hydrogen ion index) sensitive polymer layer, and a virus vaccine delivery system for oral avian flu comprising Eudragit, characterized in that it is not ionized at pH 2 to 5.
 제1항에 있어서,
상기 폴리비닐알코올(Polyvinyl-alcohol)층은 상기 유드라짓(Eudragit)층 외각에 돌출된 유드라짓(Eudragit)과 백신 단백질 복합체의 단백질 친수성 부분을 감싸는 것을 특징으로 하는 유드라짓을 포함하는 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체.
The method of claim 1,
The polyvinyl alcohol (Polyvinyl-alcohol) layer is the Eudragit (Eudragit) protruding from the outer surface of the Eudragit (Eudragit) and the algae containing Eudragit, characterized in that surrounding the protein hydrophilic portion of the vaccine protein complex Flu oral viral vaccine carrier.
 제1항에 있어서,
상기 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체는 250 내지 550nm 크기인 것을 특징으로 하는 유드라짓을 포함하는 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체.
The method of claim 1,
The bird flu oral virus vaccine delivery system is a bird flu oral virus vaccine delivery system comprising Eudragit, characterized in that the size of 250 to 550nm.
 제1항에 있어서,
상기 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체는 pH7에서 전위차(Z-potential)값이 -30 내지 -40 mV인 것을 특징으로 하는 유드라짓을 포함하는 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체.
The method of claim 1,
The avian flu oral viral vaccine delivery system is a bird flu oral viral vaccine delivery system comprising Eudragit, characterized in that the potential difference (Z-potential) value at pH 7 is -30 to -40 mV.
 제1항에 있어서,
기 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체는 다 분산 지수(Poly Dispersity Index)가 평균 0.03 내지 0.05인 것을 특징으로 하는 유드라짓을 포함하는 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체.
The method of claim 1,
Avian flu oral viral vaccine delivery system is a bird flu oral viral vaccine delivery system comprising Eudragit, characterized in that the polydispersity index (Poly Dispersity Index) is an average of 0.03 to 0.05.
 1) 조류독감 경구용 바이러스 백신을 소수성 용매에 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계,
2) 상기 혼합물을 고분자 유드라짓(Eudragit)이 녹아 있는 수용액과 혼합하여 초음파 처리하는 단계,
3) 상기 초음파 처리한 혼합물을 폴리바이닐알콜(Polyvinyl-alcohol, PVA) 용액과 다시 혼합 후 초음파 처리하여 W/O/W 에멀젼을 제조하는 단계,
4) 상기 W/O/W 에멀젼에 들어있는 디클로로메탄(dichloro methane, DCM)을 제거한 후 나노파티클을 수거하는 단계, 및
5) 상기 나노파티클을 세척하여 수거하는 단계를 포함하는 유드라짓을 포함하는 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체 제조방법.

1) preparing a mixture by mixing an oral virus vaccine for bird flu in a hydrophobic solvent,
2) mixing the mixture with an aqueous solution in which a polymer Eudragit is dissolved and ultrasonicating the mixture,
3) preparing a W/O/W emulsion by mixing the sonicated mixture with a polyvinyl-alcohol (PVA) solution again and then ultrasonicating the sonicated mixture,
4) collecting nanoparticles after removing dichloromethane (DCM) contained in the W/O/W emulsion, and
5) Avian flu oral virus vaccine delivery system manufacturing method comprising Eudragit comprising the step of washing and collecting the nanoparticles.

 제9항에 있어서,
상기 1)단계의 소수성 용매는 디클로로메탄(dichloro methane, DCM)인 것을 특징으로 하는 유드라짓을 포함하는 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체 제조방법.
The method of claim 9,
The hydrophobic solvent of the step 1) is dichloromethane (DCM).
 제9항에 있어서,
상기 2)단계의 초음파 처리는 2분동안 수행하는 것을 특징으로 하는 유드라짓을 포함하는 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체 제조방법.
The method of claim 9,
The method of manufacturing a virus vaccine delivery system for oral avian flu, including Eudragit, wherein the ultrasonic treatment in step 2) is performed for 2 minutes.
 제9항에 있어서,
상기 3)단계의 초음파 처리는 10분동안 수행하는 것을 특징으로 하는 유드라짓을 포함하는 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체 제조방법.
The method of claim 9,
The method of manufacturing a virus vaccine delivery system for oral avian flu, including Eudragit, wherein the ultrasonic treatment in step 3) is performed for 10 minutes.
 제9항에 있어서,
상기 4)단계의 W/O/W 에멀젼에 들어있는 디클로로메탄(dichloro methane, DCM) 제거는 W/O/W 에멀젼을 12시간 흔들어서 제거하는 것을 특징으로 하는 유드라짓을 포함하는 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체 제조방법.
The method of claim 9,
To remove dichloromethane (DCM) contained in the W/O/W emulsion of step 4), oral avian flu including Eudragit, characterized in that the W/O/W emulsion is removed by shaking for 12 hours Viral vaccine delivery system manufacturing method.
 제9항에 있어서,
상기 5)단계의 나노파티클을 세척하여 수거하는 것은 상기 나노파티클을 증류수(distilled water, DW)로 용해한 후 4500g의 중력으로 60분간 원심 분리하여 상등액과 침전물 분리하는 것을 총 2회 수행하는 것을 특징으로 하는 유드라짓을 포함하는 조류독감 경구용 바이러스 백신 전달체 제조방법.
The method of claim 9,
Washing and collecting the nanoparticles in step 5) is characterized in that the nanoparticles are dissolved in distilled water (DW) and centrifuged for 60 minutes under a gravity of 4500 g to separate the supernatant and the precipitate for a total of two times. A method for producing a virus vaccine delivery system for oral bird flu, including Eudragit.
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