KR20210021014A - 조류 집단에서의 괴사성 장염 돌발의 조기 검출 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 조류 집단에서의 괴사성 장염 돌발의 조기 검출을 위한 시험관내 방법에 관한 것으로서, 이러한 방법은 a) 연속적인 시점에서 조류 집단으로부터 유래하는 분변 샘플 물질을 수집하는 단계; 및 b) 단계 a)에서 수득된 샘플 물질에 함유되어 있는 마커 유전자 netB 대 cpa의 양의 비를 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 시간 경과에 따른 netB 대 cpa 양의 비의 반전은 괴사성 장염 돌발의 조기 징후이다.

Description

조류 집단에서의 괴사성 장염 돌발의 조기 검출 방법

본 발명은 조류 집단에서의 괴사성 장염 돌발의 조기 검출을 위한 시험관내 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 괴사성 장염 돌발의 조기 징후를 가능하게 하는 시간 경과에 따른 분변 샘플 물질에서의 2종의 독소-코딩된 유전자의 양의 비 (각각 netB /cpa 및 cpa/ netB)를 모니터링하는 방법을 제공한다.

클로스트리디움 페르프린겐스(Clostridium perfringens )는 동물 및 또한 인간에서 조직독성 및 장 감염을 야기하는 독소라는 무기를 사용하는 편재성 병원체이다. 씨. 페르프린겐스는 그람-양성의 막대-형상이며 포자 형성성인 산소-내성 혐기균이다. 모든 씨. 페르프린겐스 균주가 병독성인 것은 아니다. 병독성 씨. 페르프린겐스 균주는 통상적으로 4종의 의심되는 주요 독소 (알파, 베타, 엡실론 및 이오타)의 생산을 기반으로 하여 5종의 독소 유형 (A, B, C, D 및 E)으로 분류된다. 생산되는 독소 (주요 및 추가 독소 예컨대 NetB, Cpb2 등)에 따라, 상이한 숙주 생물체에서 씨. 페르프린겐스 아종 특이적 증후군/질환이 유도될 수 있다 [Rood, J. I. (1998) "Virulence genes of Clostridium perfringens"; Annual Review of Microbiology 52: 333-360]. 독소는 염색체 및/또는 독소 플라스미드 상에 위치하는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다 [Popoff, M. R. and P. Bouvet (2013). "Genetic characteristics of toxigenic Clostridia and toxin gene evolution" Toxicon 75: 63-89].

동물 병원체로서, 씨. 페르프린겐스는 전세계 농업 시스템으로부터 대략 60억 US$/년을 소모시키는 조류 괴사성 장염을 포함한 몇 가지 심각한 질환의 원인이 된다 [Wade, B., Keyburn, A.L. (2015), "The true cost of necrotic enteritis" World Poultry 31, 16-17].

괴사성 장염 (NE)은 1961년에 처음 기재된 가금류의 장 질환이다. 닭에서의 NE는 급성 또는 만성 장독소혈증으로 나타난다. 급성 질환은 장벽에서의 괴사성 병변 발생으로 인한 상당 수준의 사망률로 이어지는 반면, 만성 질환은 생산성 및 후생의 상당한 손실로 이어진다. NE에 대한 초기의 연구는 질환과 연관되어 있는 주요 병독성 인자가 포스포리파제 C 및 스핑고미엘리나제 활성을 갖는 알파-독소 (Cpa 또는 Plc로 알려져 있음)라는 것을 시사하였다 [Keyburn, A. L. et al. (2006) "Alpha-toxin of Clostridium perfringens is not an essential virulence factor in necrotic enteritis in chickens", Infection and Immunity 74(11): 6496-6500]. 모든 씨. 페르프린겐스 균주는 알파 독소를 코딩하는 유전자를 보유하고 있다 [Rood, J. I. (1998) "Virulence genes of Clostridium perfringens", Annual Review of Microbiology 52: 333-360; Titball, R. W., et al. (1999) "The Clostridium perfringens α-toxin." Anaerobe 5(2): 51-64]). 그러나, 최근의 연구는 알파-독소가 필수적인 병독성 인자가 아닌 것으로 보인다는 것을 제시하였으며, 알파 독소 돌연변이 균주가 NE를 야기할 수 있었기 때문으로, 이는 일반적인 질환에서의 알파-독소의 역할을 의문스럽게 한다. 더 최근의 연구에서는, 새로운 기공 형성 독소인 NetB가 이와 같은 질환의 발생에 주요 핵심 역할을 하는 것으로 시사된 바 있다 [Keyburn, A. L. et al. (2008) "NetB, a new toxin that is associated with avian necrotic enteritis caused by Clostridium perfringens" PLoS Pathogens 4(2)].

NE는 육계, 산란계, 칠면조 및 메추라기에 영향을 주는 것으로 알려져 있다. 임상 형태는 2 내지 5주령의 육계에서 가장 흔하게 보여진다. 전형적으로, 이는 각각 식이가 스타터 사료에서 육성용 사료로 교체되는 시점 부근 및 모성 면역 시스템에서 적응성 면역 시스템으로의 전이 기간 부근이기도 해서, 기회감염성 씨. 페르프린겐스가 장 환경에서 이와 같은 전이 기간의 이점을 취하여 증식할 수 있다 [Timbermont, L. et al. (2011) "Necrotic enteritis in broilers: An updated review on the pathogenesis." Avian Pathology 40(4): 341-347].

모든 클로스트리디움 페르프린겐스 균주가 NE를 야기할 수 있는 것이 아니기 때문에, NE 야기 균주를 추가로 식별하기 위해서는 식별 분석이 필요하다. 클로스트리디움 페르프린겐스 균주의 식별에는 PCR, AFLP (증폭 단편 길이 다형) 및/또는 PFGE (펄스-필드 겔 전기영동)와 같은 분자적 방법이 이용가능하다. 그러나, 이들 방법은 클로스트리디움 페르프린겐스의 NE 야기 균주를 구별하는 그의 양적 능력에 있어서 여전히 제한되어 있다.

더욱이, 조류 집단에서의 NE 돌발의 조기 검출 방법은 특히 중요한데, 그와 같은 조기 검출이 조기 개입을 가능하게 하게 됨으로써, 통상적인 조류 집단에서의 NE 검출 방법에 비해 농부에게 수일의 이점을 제공하게 되기 때문이다. 따라서, 조류 집단에서의 괴사성 장염 돌발의 조기 검출을 위한 신속하고 신뢰성 있는 비-침습적 사전 방법을 제공할 긴급한 필요성이 있었다.

이에 따라, 본 발명의 하나의 목적은 조류 집단에서의 괴사성 장염 돌발의 조기 검출을 위한 시험관내 방법을 제공하는 것이며, 이러한 방법은 하기 단계를 포함하며:

a) 연속적인 시점에서 조류 집단으로부터 유래하는 분변 샘플 물질을 수집하는 단계; 및

b) 단계 a)에서 수득된 샘플 물질에 함유되어 있는 마커 유전자 netB 대 cpa의 양의 비를 결정하는 단계;

여기서 시간 경과에 따른 netB 대 cpa의 양의 비의 반전 ("전이")은 괴사성 장염 돌발의 조기 징후이다.

본 발명의 추가적인 목적은 조류 집단에서 괴사성 장염 상태를 제어하기 위한 시험관내 방법의 제공으로서, 이러한 방법은 연속적인 시점에서 수집된 분변 샘플에 함유되어 있는 마커 유전자 netB 대 cpa의 양의 비를 모니터링하는 것을 포함하며,

여기서

a) 시간 경과에 따른 netB 대 cpa의 양의 비의 반전 ("전이")은 영양적 또는 치료적 개입의 필요성을 나타내고/거나,

b) 영양제 또는 치료제를 투여한 후의 시간 경과에 따른 netB 대 cpa 양 비의 재-반전 ("역전이")은 영양적 또는 치료적 개입의 효과성을 나타낸다.

추가로, 본 발명은 상기 방법에 그를 적용하기에 적합한 다중 qPCR 키트를 제공하며, 이러한 키트는 netB에 대한 프라이머의 특정 쌍 및 cpa에 대한 프라이머의 특정 쌍을 포함한다.

하기에서는, 본 발명의 중요 측면을 상세하게 기재한다.

본 발명자들은 예상밖으로 조류 집단에서의 괴사성 장염의 병리학적 진단 전에 일관되게 마커 유전자 netB 대 cpa의 양의 비 (즉 각각 netB /cpa 및 cpa/ netB의 비)의 반전이 발생한다는 것을 발견하였다. 다시 말하자면, 마커 유전자 netB 대 cpa의 양의 비의 상기 반전은 조류 무리에서의 괴사성 장염의 발병 및/또는 돌발을 예측하기 위한 진단 마커로서 사용될 수 있다.

이에 따라, 본 발명은 조류 집단에서의 괴사성 장염 돌발의 조기 검출을 위한 시험관내 방법에 관한 것으로서, 이러한 방법은 하기를 포함하며:

a) 연속적인 시점에서 조류 집단으로부터 유래하는 분변 샘플 물질을 수집하는 단계; 및

b) 단계 a)에서 수득된 샘플 물질에 함유되어 있는 마커 유전자 netB 대 cpa의 양의 비를 결정하는 단계;

여기서 시간 경과에 따른 netB 대 cpa의 양의 비의 반전 ("전이")은 괴사성 장염 돌발의 조기 징후이다.

본 발명의 맥락에서, 용어 "마커 유전자"는 각각의 마커 유전자의 기능성 단편, 즉 netB 및 cpa의 기능성 단편을 포괄한다.

용어 "괴사성 장염"/NE는 임상 및 임상 미만/잠재적 병태 둘 다를 지칭한다. 이에 따라, 용어 "돌발"은 정상적인 조류 집단에서의 질환 (괴사성 장염)의 돌연적이거나 자발적인 발생, 뿐만 아니라 단독 또는 소인성 조건과의 조합으로서의 클로스트리디움 페르프린겐스의 투여에 의한 그의 유도로 이해되어야 한다 [Shojadoost, B., Vince, A.R., Prescott, J.F., 2012. The successful experimental induction of necrotic enteritis in chickens by Clostridium perfringens: a critical review. Vet. Res. 43, 74; Fernandes da Costa, S.P., Mot, D., Bokori-Brown, M., Savva, C.G., Basak, A.K., Van Immerseel, F., Titball, R.W., 2013. Protection against avian necrotic enteritis after immunisation with NetB genetic or formaldehyde toxoids. Vaccine 31, 4003-4008; Williams, R.B., Marshall, R.N., La Ragione, R.M., Catchpole, J., 2003. A new method for the experimental production of necrotic enteritis and its use for studies on the relationships between necrotic enteritis, coccidiosis and anticoccidial vaccination of chickens. Parasitol. Res. 90, 19-26; Wu, S.B., Rodgers, N., Choct, M., 2010. Optimized necrotic enteritis model producing clinical and subclinical infection of Clostridium perfringens in broiler chickens. Avian Dis. 54, 1058-1065; Wu S-B, Stanley D, Rodgers N, Swick RA, Moore RJ. Two necrotic enteritis predisposing factors, dietary fishmeal and eimeria infection, induce large changes in the caecal microbiota of broiler chickens. Vet Microbiol 2014;169:188e97].

본 발명자들은 마커 유전자 netB 대 cpa의 양의 비의 반전과 통상적인 기술을 사용한 괴사성 장염의 병리학적 진단 사이의 시간 간격이 1일 내지 5일 사이라는 것을 발견하였다.

그와 같은 반전 또는 전이의 예로서, 어느 날 netB /cpa 비는 < 1 (> 1의 cpa/netB 비에 해당)일 수 있으며; 다음 날에는 netB /cpa 비가 > 1 (< 1의 cpa/ netB 비에 해당)일 수 있다.

이러한 발견에 따라, 상기 언급된 방법은 하기를 추가로 포함할 수 있다:

c) 마커 유전자 netB 대 cpa의 양의 비가 반전되는 시점 ("전이점")을 확인하는 단계.

상기 전이점은 예를 들면 그래프 분석을 통하여 결정될 수 있다. 이에 따라, 2개의 그래프가 작성되어야 하며: 첫 번째 그래프는 netB의 양 대 샘플 수집 시점을 나타내며; 두 번째 그래프는 cpa의 양 대 샘플 수집 시점을 나타낸다. 이러한 2개 그래프의 교차점으로부터 전이점이 판독될 수 있다.

netB 및 cpa의 폴리뉴클레오티드 서열에 대해서는 관련 기술분야에 알려져 있다. 그러나, 명료성 및 완전성을 위하여, netB의 공통 서열은 서열식별번호(SEQ ID NO): 1 하에 나타내어지며, cpa의 공통 서열은 서열식별번호: 2 하에 나타내어진다. cpa 유전자는 모든 씨. 페르프린겐스 균주 (병원성 및 비-병원성)의 염색체 상에 위치하는 반면; netB 유전자는 병원성 (NE 유도) 씨. 페르프린겐스 균주의 독소 플라스미드 상에 위치한다.

단계 a)의 분변 샘플 물질은 무작위로 선택된 개별 샘플로부터의 복합 분변 샘플일 수 있다.

본 발명의 맥락에서, 용어 "분변"은 조류 대상체의 배설 배변 산물로 이해되어야 한다. 따라서, 분변 샘플 물질은 비-침습적 방식으로 수득되며, 하기에서 기재되는 샘플링 기술에 의해 수집된다.

특정 조류 집단으로부터 채취할 분변 샘플은 총괄적으로 동물 집단을 대표하는 풀링된 샘플을 수득하기 위해서는 동물 하우스 내의 별개 수의 부위에서 채취하는 것이 이상적이다.

샘플 크기 (즉 채취되는 분변 샘플의 수; 각각의 샘플은 동물 하우스 내의 특정 부위에서 채취됨)는 실제 사육 밀도의 관점에서, 즉 시험될 조류 집단에 속하는 실제 동물 수에 따라 결정되어야 한다.

샘플 크기는 하기 공식을 사용하여 계산될 수 있다:

여기서

n₀는 샘플 크기 권장값이고,

Z는 95% 신뢰 수준의 경우 1.96이고,

p는 해당 속성을 가진 집단의 추정 비율이며, q는 1-p이고,

e는 십진수로 표현되는 신뢰 구간이다.

일반적으로, 최소 80 내지 100개의 개별 분변 샘플이 대부분의 가축 조류 집단에 대해 충분하다. 예로서, 20000마리 동물의 육계 무리인 경우, 95%의 신뢰 수준에 대해 96개의 개별 샘플이 요구된다.

단계 a)에서 요구되는 바와 같은 풀링된 분변 샘플 물질을 수득하는데에는 몇 가지 샘플링 방법이 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 풀링 분변 샘플은 체계적인 격자 샘플링 (체계적 무작위 샘플링)에 의해 수득된다. 이와 같은 방법의 경우, 동물 하우스 또는 조류 집단이 사육되는 구역이 원하는 수의 개별 분변 샘플 (즉 샘플 크기)에 기반하여 격자 패턴의 균일한 셀 또는 하위-구역으로 분할된다. 다음에, 제1 격자 셀 내에서 무작위 샘플 수집 부위가 확인된 후, 해당 부위에서 제1 샘플이 채취된다. 마지막으로, 각각의 셀 내의 동일한 상대적 위치를 사용하여 인접 셀로부터 순차적으로 - 예컨대 구불구불한, 각형 또는 지그재그 방식으로 - 추가 샘플이 수득된다. 무작위 개시점은 주사위 또는 난수 생성기로 수득될 수 있다.

상기 프로세스는 임의적으로 반복 샘플에 대해 반복될 수 있다. 즉, 모든 셀에서 반복될 단일 수집 지점에 대한 새로운 무작위 위치가 확립된다. 반복 샘플을 분석함으로써, 원래 샘플에 의해 제공된 평균 추정치 상의 변동성을 결정할 수 있다.

이에 따라, 상기 언급된 방법은 하기의 하위-단계를 추가로 포함할 수 있다:

(a1) 동물 하우스 또는 동물 집단이 사육되는 구역을 격자 패턴인 동일한 수의 균일한 셀로 분할하는 단계;

(a2) 제1 셀 내의 적어도 하나의 무작위 샘플 수집 부위를 확인하고, 상기 무작위 샘플 수집 부위에서 하나의 제1 샘플을 채취하는 단계; 및

(a3) 각각의 셀 내의 동일한 상대적 샘플 수집 부위를 사용하여 나머지 셀 내의 개별 분변 샘플을 순차적으로 수집하는 단계;

및 임의적으로

(a4) 적어도 하나의 반복 샘플에 대하여 단계 (a2) 및 (a3)를 반복하는 단계.

샘플 크기는 셀당 하나의 샘플을 채취해야 하는 경우에는 격자 패턴의 셀 수에 상응한다. 일반적으로, 샘플 크기는 셀당 x개의 샘플을 채취해야 하는 경우에는 셀 수를 x로 나눈 값이다.

체계적인 격자 샘플링 방법은 현장에서 쉽게 구현될 수 있다. 이로 인해, 하위구역의 과다- 또는 과소표현을 피할 수 있다. 본 발명에 따른 체계적인 격자 샘플링 패턴은 도 1 및 도 2에 예시되어 있다.

또 다른 샘플링 방법은 계층화된 무작위 샘플링 (즉, 격자 내의 무작위 샘플링)이다. 여기서, 샘플은 인접한 격자 셀로부터 순차적으로 수득되지만, 각각의 셀 내의 샘플의 위치는 무작위이다.

대안적으로, 샘플은 동물이 사육되는 구역 전체에 걸쳐 (격자형성 없이) 무작위 위치로부터 샘플이 채취되는 단순 무작위 샘플링에 의해 채취될 수 있다. 이와 같은 방법에서는, 예를 들면 난수 생성기에 기반하여, 무작위 샘플 위치를 결정하기 위한 공식적인 접근법이 사용되어야 한다.

샘플은 스패튤라 또는 유사한 장치를 사용하여 수동으로 수집할 수 있으며, 샘플 수집 용기 또는 튜브로 즉시 옮긴다.

대안적 실시양태에서, 하우스의 모든 파트 또는 각각의 섹터에 대한 대표적인 샘플을 생산하게 될 경로를 사용하여 하우스를 걷는 동안 오버슈즈 방법을 사용하여 풀링된 분변 샘플을 수득할 수 있다. 이러한 경로는, 예를 들어, 균일한 모양의 구불구불하거나 또는 물결 모양의 선, 각진 선 또는 지그재그 선일 수 있다. 수분을 빨아들이기에 충분히 흡수성인 부츠 스왑이 특히 적합하다. 그러나, 튜브 거즈 삭스도 또한 허용된다.

채취되는 개별 샘플에 대해 적합한 샘플 질량은, 예를 들면, 0.1 내지 20 g, 특히 0.2 내지 10 g, 바람직하게는 0.5 내지 5 g이다. 샘플은 스패튤라, 리터 그랩 또는 유사 장치를 사용하여 수동으로 수집될 수 있다.

샘플 수집을 종료한 후, 샘플 물질은 균질화되어야 한다. 숙련된 기술자라면, 적합한 통상적으로 사용되는 균질화 기술을 알고 있다. 이와 같이 수득되는 풀링 샘플은 희석 및/또는 안정화될 수 있다. 이와 같은 맥락에서의 샘플 안정화는, 예를 들면 뉴클레아제 억제제를 포함하는 완충제 용액을 사용하는 것에 의해 용액 중 뉴클레아제로부터 샘플에 함유되어 있는 핵산 물질을 보호하는 것을 의미한다.

샘플 물질은 연속적인 시점에서 수집되어야 한다. 분변 샘플 물질은 매주, 매일 또는 매시간 기준으로 수집 및 분석될 수 있다. 예를 들면, 분변 시험 샘플은 출생부터 도축까지 매일 기준으로 수집 및 분석될 수 있다.

조류 집단은 바람직하게는 조류 무리이다. 본 발명에 따른 조류 무리는 바람직하게는 가금류이다. 본 발명에 따른 바람직한 가금류는 닭, 칠면조, 오리 및 거위이다. 가금류는 어린 가축을 생산하기 위해 최적화될 수 있다. 이러한 유형의 가금류는 또한 부모 및 조부모 동물로서 지칭된다. 따라서, 바람직한 부모 및 조부모 동물은 (조)부모 육계, (조)부모 오리, (조)부모 칠면조 및 (조)부모 거위이다.

본 발명에 따른 가금류는 또한 팬시 가금류 및 야생 조류로부터 선택될 수 있다. 바람직한 팬시 가금류 또는 야생 조류는 공작새, 꿩, 자고새, 뿔닭, 메추라기, 큰뇌조, 거위, 비둘기 및 백조이다. 본 발명에 따른 추가의 바람직한 가금류는 타조 및 앵무새이다. 본 발명에 따른 가장 바람직한 가금류는 육계이다.

육계 무리의 경우, 분변 샘플은 최초 성장 시기 (스타터 시기, 제5일 내지 제10일) 동안, 및/또는 강화된 성장 시기 (제11일 내지 제18일) 동안, 및 임의적으로 후기 단계에도 매일 기준으로 수집 및 분석될 수 있다.

한 실시양태에서, 분변 샘플 물질, 특히 육계 무리로부터의 분변 샘플 물질은 제10일부터 시작하여 매일 기준으로 수집 및 분석된다.

마커 유전자 netB 및 cpa는 정량화 전에 분변 샘플로부터 단리될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 단리는 예를 들면 세틸트리메틸암모늄브로마이드 (CTAB) 방법을 사용한 추출을 통하여, 또는 화학적 용해 및/또는 기계적 세포 붕괴 중 어느 하나를 통하여 세포 용해가 달성되며 실리카 매트릭스 또는 실리카-클래딩된 자석 비드 상에 핵산이 포획되는 다양한 상업적 핵산 추출 키트에 의해 수행될 수 있다. 분변 물질 또는 조질 물질용으로 특화된 상업적 추출 키트가 특히 적합하다.

마커 유전자는 관련 기술분야에 알려져 있는 시퀀싱, 혼성화 또는 다양한 PCR 기술과 같은 통상적으로 알려져 있는 방법에 의해 검출 및/또는 정량화될 수 있다.

대안적인 실시양태에서, 동물 샘플에 함유되어 있는 마커 유전자는, 예를 들면 PCR, qPCR, 시퀀싱 또는 혼성화 기술을 통하여 직접적으로 정량화될 수 있다.

하나의 구체적 실시양태에서, 단계 a)에서 수득된 샘플 물질에 함유되어 있는 마커 유전자 netB 대 cpa, 또는 이러한 마커 유전자의 동종 또는 기능성 단편의 양의 비는 qPCR을 통하여 결정된다.

상기에서 상술된 본 발명의 방법에서는, 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로서 및/또는 PCR 프로브로서 사용될 수 있다:

a) 서열식별번호: 3에 제시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95%, 가장 바람직하게는 100%의 서열 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드;

b) 서열식별번호: 4에 제시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95%, 가장 바람직하게는 100%의 서열 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드;

c) 서열식별번호: 5에 제시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95%, 가장 바람직하게는 100%의 서열 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드;

d) 서열식별번호: 6에 제시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95%, 가장 바람직하게는 100%의 서열 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드;

e) 서열식별번호: 7에 제시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95%, 가장 바람직하게는 100%의 서열 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드;

f) 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95%, 가장 바람직하게는 100%의 서열 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드;

g) (a) 내지 (f)에 따른 올리고뉴클레오티드에 대하여 상보성인 올리고뉴클레오티드;

h) (a) 내지 (g)에 따른 올리고뉴클레오티드 중 어느 하나를 포함하며 (a) 내지 (g)에 따른 올리고뉴클레오티드에 비해 5개 이하의 염기 쌍만큼 연장된 올리고뉴클레오티드.

여기서, 서열식별번호: 3에 제시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드는 netB를 검출하기 위한 PCR 프라이머 (fwd)이다. 서열식별번호: 4에 제시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드는 netB를 검출하기 위한 PCR 프라이머 (rev)이다. 서열식별번호: 5에 제시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드는 netB를 검출하기 위한 PCR 프로브이다.

추가로, 서열식별번호: 6에 제시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드는 cpa를 검출하기 위한 PCR 프라이머 (fwd)이다. 서열식별번호: 7에 제시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드는 cpa를 검출하기 위한 PCR 프라이머 (rev)이다. 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드는 cpa를 검출하기 위한 PCR 프로브이다.

상기에 따라, 본 발명은 추가로 조류 집단에서의 괴사성 장염 돌발의 조기 검출을 위한, 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드의 용도에 관한 것이다:

a) 서열식별번호: 3에 제시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95%, 가장 바람직하게는 100%의 서열 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드;

b) 서열식별번호: 4에 제시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95%, 가장 바람직하게는 100%의 서열 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드;

c) 서열식별번호: 5에 제시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95%, 가장 바람직하게는 100%의 서열 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드;

d) 서열식별번호: 6에 제시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95%, 가장 바람직하게는 100%의 서열 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드;

e) 서열식별번호: 7에 제시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95%, 가장 바람직하게는 100%의 서열 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드;

f) 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95%, 가장 바람직하게는 100%의 서열 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드;

g) (a) 내지 (f)에 따른 올리고뉴클레오티드에 대하여 상보성인 올리고뉴클레오티드;

h) (a) 내지 (g)에 따른 올리고뉴클레오티드 중 어느 하나를 포함하며 (a) 내지 (g)에 따른 올리고뉴클레오티드에 비해 5개 이하의 염기 쌍만큼 연장된 올리고뉴클레오티드.

본 발명은 사전에 수행될 수 있는, NE 돌발의 조기 검출을 위한 상기 기재된 비-침습적 방법을 제공한다. 이는 농부가 조기 단계에 괴사성 장염 돌발에 대비하여 조치를 취하는 것을 가능하게 한다.

이에 따라, 본 발명은 또한 영양적 또는 치료적 개입의 필요성을 결정하기 위한, 상기 언급된 방법 중 어느 하나의 용도에 관한 것이다.

그와 같은 개입 또는 조치는 축산학적 사료 첨가제 또는 치료제와 같은 건강-촉진 물질을 공급하거나 투여하는 것을 포함한다. 용어 "투여하는 것" 또는 관련 용어는 경구 투여를 포함한다. 경구 투여는 식수, 구강 위관영양, 에어로졸 스프레이 또는 동물 사료를 통해 이루어질 수 있다. 용어 "축산학적 사료 첨가제"는 건강 상태가 좋은 동물의 성능에 유리하게 영향을 미치기 위해 사용되거나 또는 환경에 유리하게 영향을 미치기 위해 사용되는 임의의 첨가제를 지칭한다. 축산학적 사료 첨가제의 예는 소화율 증강제, 즉 동물에게 공급될 때 표적 사료 물질에 대한 작용을 통해 상용 사료의 소화율을 증가시키는 물질; 장내 세균총 안정화제; 동물에게 공급될 때 장내 세균총에 긍정적인 영향을 미치는 미생물 또는 다른 화학적으로 규정된 물질; 또는 환경에 유리하게 영향을 미치는 물질이다. 바람직하게는, 건강-증진 물질은 프로바이오틱 작용제, 프리바이오틱 작용제, 식물성 물질, 유기/지방 산, 제올라이트, 박테리오파지 및 박테리아 용해성 효소 또는 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

추가로, 본 발명자들은 시간 경과에 따른 netB 대 cpa의 양의 비의 재-반전 ("역전이")이 조류 집단에서의 괴사성 장염의 퇴행 또는 소멸을 나타낸다는 것을 발견하였다. 상기 퇴행 또는 소멸은 자연적으로 (자발적 회복으로서) 발생할 수 있거나, 또는 치료적 또는 영양적 개입에 의해 야기될 수 있다.

이에 따라, 본 발명은 조류 집단에서 괴사성 장염 상태를 제어하기 위한 시험관내 방법을 제공하며, 이러한 방법은 연속적인 시점에서 수집된 분변 샘플에 함유되어 있는 마커 유전자 netB 대 cpa의 양의 비를 모니터링하는 것을 포함하며,

여기서

a) 시간 경과에 따른 netB 대 cpa의 양의 비의 반전 ("전이")은 영양적 또는 치료적 개입의 필요성을 나타내고,

b) 영양제 또는 치료제를 투여한 후의 시간 경과에 따른 netB 대 cpa 양 비의 재-반전 ("역전이")은 영양적 또는 치료적 개입의 효과성을 나타낸다.

재-반전의 시점 ("역전이점")은 전이점에 대하여 상기에서 기재된 바와 같이 그래프로 결정될 수 있다.

용어 "괴사성 장염 상태를 제어하는 것"은 각각 괴사성 장염 돌발 또는 괴사성 장염의 퇴행/소멸에 대한 소정의 징후가 존재하는지 여부를 결정하는 것으로 이해되어야 한다.

이와 같은 방법을 위한 적합한 샘플 물질 및 샘플 수집 방법은 상기에서 기재된 바와 같다.

상기 영양적 또는 치료적 개입은 프로바이오틱 작용제, 프리바이오틱 작용제, 식물성 물질, 유기/지방 산, 박테리오파지 및 박테리아 용해성 효소, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질을 투여하는 것을 수반할 수 있다. 프로바이오틱스가 특히 바람직하다.

이에 따라, 본 발명은 추가로 괴사성 장염 돌발이 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 의해 검출되는 괴사성 장염의 치료에서 사용하기 위한 프로바이오틱 작용제에 관한 것이다.

조류 집단에서 괴사성 장염 상태를 제어하기 위한 상기 방법의 예로서, 시간 경과에 따른 netB 대 cpa의 양의 비의 반전에 기반하여 괴사성 장염이 진단되며; 예를 들면 netB/cpa 비가 <1의 값에서 >1의 값으로 전환된다. 진단 직후, 농부는 예를 들면 프로바이오틱 작용제를 투여하는 것에 의해 개입한다. 연속적인 시점에서 수집된 분변 샘플에 함유되어 있는 netB 대 cpa의 양의 비는 추가로 모니터링된다. 개입이 효과적인 경우, netB 대 cpa의 비는 다시 반전되며, 예를 들면 netB/cpa 비가 >1의 값에서 <1의 값으로 전환된다.

조류 집단에서 괴사성 장염 상태를 제어하기 위한 상기 방법의 한 실시양태에서는, 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로서 및/또는 PCR 프로브로서 사용된다:

a) 서열식별번호: 3에 제시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95%, 가장 바람직하게는 100%의 서열 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드;

b) 서열식별번호: 4에 제시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95%, 가장 바람직하게는 100%의 서열 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드;

c) 서열식별번호: 5에 제시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95%, 가장 바람직하게는 100%의 서열 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드;

d) 서열식별번호: 6에 제시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95%, 가장 바람직하게는 100%의 서열 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드;

e) 서열식별번호: 7에 제시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95%, 가장 바람직하게는 100%의 서열 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드;

f) 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95%, 가장 바람직하게는 100%의 서열 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드;

g) (a) 내지 (f)에 따른 올리고뉴클레오티드에 대하여 상보성인 올리고뉴클레오티드;

h) (a) 내지 (g)에 따른 올리고뉴클레오티드 중 어느 하나를 포함하며 (a) 내지 (g)에 따른 올리고뉴클레오티드에 비해 5개 이하의 염기 쌍만큼 연장된 올리고뉴클레오티드.

상기에 따라, 본 발명은 추가로 영양적 또는 치료적 개입의 효과성을 결정하기 위한, 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드의 용도에 관한 것이다:

a) 서열식별번호: 3에 제시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95%, 가장 바람직하게는 100%의 서열 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드;

b) 서열식별번호: 4에 제시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95%, 가장 바람직하게는 100%의 서열 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드;

c) 서열식별번호: 5에 제시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95%, 가장 바람직하게는 100%의 서열 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드;

d) 서열식별번호: 6에 제시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95%, 가장 바람직하게는 100%의 서열 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드;

e) 서열식별번호: 7에 제시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95%, 가장 바람직하게는 100%의 서열 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드;

f) 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95%, 가장 바람직하게는 100%의 서열 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드;

g) (a) 내지 (f)에 따른 올리고뉴클레오티드에 대하여 상보성인 올리고뉴클레오티드;

h) (a) 내지 (g)에 따른 올리고뉴클레오티드 중 어느 하나를 포함하며 (a) 내지 (g)에 따른 올리고뉴클레오티드에 비해 5개 이하의 염기 쌍만큼 연장된 올리고뉴클레오티드.

본 발명은 추가로 각각 netB 대 cpa의 양의 비를 결정하고 시간 경과에 따라 netB 대 cpa의 양의 비를 모니터링하기 위한 진단용 다중 qPCR 키트를 제공한다.

상기 키트는 netB를 검출하기 위한 프라이머 쌍 및 cpa를 검출하기 위한 프라이머 쌍을 포함하며,

여기서 netB에 대한 프라이머 쌍은 하기를 포함하고:

서열식별번호: 3에 제시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95%, 가장 바람직하게는 100%의 서열 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드; 및

서열식별번호: 4에 제시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95%, 가장 바람직하게는 100%의 서열 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드;

cpa에 대한 프라이머 쌍은 하기를 포함한다:

서열식별번호: 6에 제시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95%, 가장 바람직하게는 100%의 서열 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드; 및

서열식별번호: 7에 제시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95%, 가장 바람직하게는 100%의 서열 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드.

임의적으로, 본 발명에 따른 다중 qPCR 키트는 netB를 검출하기 위한 1종 이상의 프로브 및/또는 cpa를 검출하기 위한 1종 이상의 프로브를 추가적으로 포함할 수 있다.

한 실시양태에서, 다중 qPCR 키트는 - 상기 언급된 netB 및 cpa에 대한 프라이머 쌍 이외에 - netB를 검출하기 위한 프로브 및 cpa를 검출하기 위한 프로브를 포함하며,

여기서 netB를 검출하기 위한 프로브는 하기를 포함하고:

서열식별번호: 5에 제시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95%, 가장 바람직하게는 100%의 서열 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드;

cpa를 검출하기 위한 프로브는 하기를 포함한다:

서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95%, 가장 바람직하게는 100%의 서열 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드.

키트는 완충제 용액, 예컨대 PCR 완충제; 마그네시아 염; 데옥시 뉴클레오티드 트리포스페이트 (dNTP)를 추가로 포함할 수 있다. 키트는 또한 샘플 수집 튜브, 핵산을 단리하기 위한 시약 및/또는 그의 사용 지침과 같은 요소를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 방법의 적용은 예를 들면 (i) 조류 괴사성 장염의 진단 및/또는 예후를 돕는 것, (ii) 조류 괴사성 장염의 진행 또는 재발을 모니터링하는 것, (iii) 치료를 받고 있거나 고려 중인 동물 집단에 대한 치료 효능의 평가를 돕는 것, 또는 (iv) 씨. 페르프린겐스 유도 조류 괴사성 장염에 대비하여 (치료적) 백신접종 효율을 제어하는 것이다.

본 발명에 따른 방법의 적용은 특히 체중 증량 및 사료 전환과 같은 동물 수행능력의 손실을 방지하는데 도움을 준다.

하기에서는, 비-제한적인 실시예 및 예시적인 실시양태에 의해 본 발명을 예시한다.

실시예

실질적인 관리 및 감사 요구를 포함하여 도축 시 6.2 파운드/제곱 피트로 밀도를 제한하는 아메리칸 휴메인 어소시에이션(American Humane Association) 인증 프로그램에 따라 약 20,000마리의 육계를 회사의 일반 닭 배치 절차의 일부로서 육계 하우스에 무작위로 할당하였다. 모든 무리를 조명, 온도 및 환기에 대한 사육자 권장사항과 일치하는 회사의 표준 프로토콜에 따라 관리하였다. 사료는 스타터, 육성용 & 피니셔 사료에 대한 조류 요건에 맞추어 조정된 기본 식이 (옥수수 및 콩)로 구성되었다. 하기의 일반적인 무리 상태는 매일 모니터링하였다: 사료 및 물의 이용률, 온도 제어, 및 임의의 이상 상태. 죽은 조류는 꺼내어 부검함으로써 사망의 원인을 결정하였으며, 쇠약해진 조류는 도태시켜 추가적인 고통을 방지하였다.

샘플 수집

몇 가지 표준 육계 생체 생산 프로세스로부터의 분변 샘플 및 무리 수행능력 데이터를 2년의 기간 동안 일자 10/11로부터 24/25까지 매일 수집하였다. 이와 같은 기간 동안, 3개의 무리 (실시예 1, 2, & 3)가 NE 질환 기간 동안의 사망률 급증, 및 수의사에 의한 부검된 죽은 조류의 장에서의 NE 전형적 병변의 관찰에 의해 괴사성 장염 양성 무리 (돌발 무리)로 진단되었다. 이들 NE 돌발 무리로부터 수집된 모든 분변 샘플을 에보닉(Evonik)의 특허받은 샘플 프로세싱 및 qPCR 워크플로우 지침에 따라 별도로 처리하였다.

각각의 수집 시점 또는 이벤트에서, 각각의 사분면을 지그재그 방식으로 워킹하면서, 플라스틱 집게로 하우스의 각각의 사분면으로부터 24개의 개별 샘플을 골라내었다. 샘플의 교차 오염을 방지하기 위해, 각각의 하우스에 새로운 멸균 집게를 사용했을 뿐만 아니라 규정된 생물 보안 조치를 관찰하였다. 더욱이, 4 사분면으로부터의 모든 샘플을 합성하여 멸균 샘플 수집 백에 단일 풀링된 샘플 (96개의 개별 분변 샘플로 이루어짐)을 형성하기 전에, 잔해물, 예컨대 대팻밥, 리터 등을 샘플로부터 제거하였다. 샘플을 얼음에 놓아두고 -80℃ 하에서의 저장을 위해 실험실로 옮겼다.

DNA 추출

풀링된 96개 샘플이 들어 있는 각각의 백을 실온에서 천천히 해동하도록 하였고; 그런 다음, 분변을 멸균 용기에 옮기고 멸균 설압자로 철저히 혼합하였다. 5 그램의 균질화된 샘플을, 20 ml의 안정화 버퍼와 유리 비드를 함유하는 독점 샘플 수집 튜브로 옮겼다. 샘플 수집 튜브 내의 분변 샘플은 +15℃ 내지 +30℃에서 최대 7일 동안 안정적이다.

분변 샘플을 함유하는 튜브를 70℃에서 20분 동안 수조에서 인큐베이션하였다. 이어서, 튜브를 20 Hz에서 15분 동안 균질화하기 위해 폴리 믹스 밀 (비드 비터)로 옮겼다. 균질화가 끝날 무렵, 샘플을 2000 g에서 5분 동안 원심분리하고, 500 μl의 상청액을 DNA 추출에 사용하였다. DNA 추출은 에보닉의 독점 분변 추출 키트의 프로토콜을 준수하여, 킹 피셔 플렉스(King Fisher Flex) 시스템 (써모 피셔(Thermo Fisher), 미국)으로 수행되었다.

킹 피셔 기기는 추출 프로세스의 다양한 단계를 정의하는 사전 정의된 프로그램 ("Cper_Extraction_01")을 업로드함으로써 준비되었으며; 샘플링 팁, DNA 용출 플레이트, 세척 플레이트 및 샘플 플레이트는 하기에 기재된 바와 같이 준비되었다.

96개의 팁 콤브를 비어있는 심층 웰 플레이트에 삽입하고, 상기 기기에 배치하였다. 이어서, 용출 플레이트에 100 μl의 용출 버퍼를 도입하고, 이러한 플레이트를 또한 상기 기기에 배치하였다. 더욱이, 500 μl의 세척 버퍼 3, 2 및 1을 각각 3개의 상이한 세척 플레이트의 각각의 웰에 배치하고, 이들 플레이트를 동일한 순서로 기기에 배치하였다. 마지막으로, 300 μl의 용해 버퍼, 25 μl의 자기 비드, 20 μl 인핸서, 10 μl의 내부 대조군 및 분변 샘플로부터의 상청액 500 μl를 샘플 플레이트의 각각의 웰에 부가하였다. 기기 위에 샘플 플레이트를 놓아둔 후, 시작 버튼을 눌러 추출을 시작하였다.

DNA 정량화

DNA 내의 마커의 정량화를 위해, 반응에 따라 에보닉 뉴트리션 앤 케어 게엠베하(Evonik Nutrition & Care GmbH)의 독점 실시간 PCR 검출 키트의 지침에 따라 5 μl 마스터 A, 15 μl 마스터 B 및 1 μl의 IC (내부 대조군)로 이루어진 20 μl 마스터 믹스를 준비하였다. 모든 샘플, 비-주형 대조군 (NTC) 및 4가지 표준 (S1 내지 S4)을 이중으로 실행할 수 있도록 충분한 마스터 믹스가 준비되었다. 20 μl의 마스터 믹스를 96 웰 플레이트의 개별 웰에 분배하였다. 그런 다음, 추출된 DNA 샘플 10 μl를 각각의 웰에 옮겼다. 각각의 표준 물질 10 μl 및 IC 1 μl를 각각의 표준 웰에 적절하게 옮겼다. NTC를 준비하기 위해, 10 μl의 뉴클레아제가 없는 멸균 물과 1 μl의 IC를 각각 NTC 웰에 옮겼다. 플레이트의 내용물을 멀티-채널 피펫으로 완전히 혼합하고, 플레이트를 클리어 웰드 실 마크(Clear Weld Seal Mark) II 호일 필름으로 밀봉하였다. 플레이트를 1000 g (~3000 rpm)에서 30초 동안 원심분리하였다. 마지막으로, CFX96 실시간 PCR 기기 (바이오 래드(Bio Rad), 독일) 상에서 하기 PCR 조건을 사용하여 플레이트를 실행하였다: 95℃에서 15초 동안 변성, 58℃에서 45초 동안 어닐링 및 72℃에서 15초 동안 연장의 45 주기. 데이터는 QPCR 실행의 증폭 시기 동안 획득되었다. 실행이 끝날 무렵, 바이오래드 CFX96으로부터 받은 데이터는 바이오-래드 CFX 매니저 3.1로 미리 프로세싱되었으며, 추가 분석을 위해 엑셀 2013으로 내보내졌다. 샘플 중의 마커의 정량화는 두 표적의 동등한 농도를 함유하는 표준 용액 (S1 내지 S4)으로 구축된 표준 곡선으로부터 결정되었다. S1, S2, S3 및 S4 중의 netB 및 cpa의 농도는 각각 10⁴개 카피/μl, 10³개 카피/μl, 10²개 카피/μl, 및 10¹개 카피/μl이다. 표준물의 로그는 x-축을 따라 플로팅된 반면, Ct (주기 한계치)는 y-축을 따라 플로팅되었다. 이로써 생성되는 선형 회귀 선 [y=mx + b 또는 Ct= m (로그 양) + b]을 사용하여 시험된 샘플 중에서의 표적의 농도를 결정하였다.

표적의 발현의 수준을 정량화하기 위하여 qPCR에 사용된 프라이머 및 프로브의 목록:

실시예 1:

본 실시예에서, netB 대 cpa의 양의 비의 반전 (전이점)은 제14일과 제15일 사이에 발생하였다. 괴사성 장염의 돌발은 제16일에 수의사 진단 (부검)에 의해 확정되었다.

실시예 1의 데이터의 그래프 표시는 도 3에서 찾아볼 수 있다.

실시예 2:

본 실시예에서, netB 대 cpa의 양의 비의 반전 (전이점)은 제14일과 제15일 사이에 발생하였다. 괴사성 장염의 돌발은 제16일에 수의사 진단 (부검)에 의해 확정되었다.

실시예 1의 데이터의 그래프 표시는 도 4에서 찾아볼 수 있다.

실시예 3:

본 실시예에서, netB 대 cpa의 양의 비의 반전 (전이점)은 제14일과 제17일 사이에 발생하였다. 괴사성 장염의 돌발은 제17일에 수의사 진단 (부검)에 의해 확정되었다.

실시예 1의 데이터의 그래프 표시는 도 5에서 찾아볼 수 있다.

요약

상기 실험은 조류 집단에서 괴사성 장염의 병리학적 진단 전에 일관되게 마커 유전자 netB 및 cpa의 상대적 양의 반전이 발생한다는 것을 제시한다. 따라서, 마커 유전자 netB 대 cpa의 양의 비의 상기 반전은 조류 무리에서 가까운 기일 내의 괴사성 장염 돌발을 예측하기 위한 진단 마커로서 적격이다.

SEQUENCE LISTING <110> Evonik Degussa GmbH <120> Method for predicting a necrotic enteritis outbreak in an avian population <130> 201800116 <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 969 <212> DNA <213> Clostridium perfringens <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (391)..(396) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (418)..(420) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (443)..(443) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (497)..(497) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (502)..(502) <223> n is a, c, g, or t <400> 1 ttgaaaagan taaaaattat ttcaattaca ctagttctta caagtgtaat tagtacaagc 60 cttttttcaa ctcaaactca agtttttgca agtgaattaa atgacataaa caaaattgag 120 ttgaaaaatc taagtggaga aataataaaa gaaaatggaa aggaagctat taaatatact 180 tctagtgata ccgcttcaca taaaggttgg aaggcaactt taagtggaac atttattgaa 240 gatcctcatt ctgataagaa aactgcttta ttaaatttag aaggatttat accttctgat 300 aaacagattt ttggttctaa atattacgga aaaatgaaat ggcctgaaac ttatagaatt 360 aatgtaaaaa gtgctgatgt aaataataat nnnnnnatag caaattctat tcctaaannn 420 actatagata aaaaagatgt atntaattca attggttatt ctataggcgg taatatatct 480 gttgaaggaa aaactgntgg tnctggaata aatgcttcat ataatgtcca aaatactata 540 agctatgaac aacctgattt tagaacaatt caaagaaaag atgatgcaaa tttagcatca 600 tgggatataa aatttgttga gactaaggac ggttataata tagattctta tcatgctatt 660 tatggaaatc aattattcat gaaatcaaga ttgtataata atggtgataa aaatttcaca 720 gatgatagag atttatcaac attaatttct ggtggatttt cacccaatat ggctttagca 780 ttaacagcac ctaaaaatgc taaagaatct gtaataatag ttgaatatca aagatttgat 840 aatgactata ttttaaattg ggaaactact caatggcgag gaacaaacaa actttcgtca 900 acaagtgaat ataacgaatt tatgtttaaa ataaattggc aagatcataa aatagaatat 960 tatctgtaa 969 <210> 2 <211> 1197 <212> DNA <213> Clostridium perfringens <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (23)..(24) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (36)..(37) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (40)..(40) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (44)..(44) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (64)..(65) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (78)..(78) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (81)..(81) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (96)..(96) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (102)..(102) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (128)..(128) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (138)..(139) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (147)..(147) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (160)..(160) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (165)..(165) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (167)..(167) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (170)..(170) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (213)..(213) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (225)..(225) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (264)..(264) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (267)..(267) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (274)..(274) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (288)..(288) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (307)..(307) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (318)..(318) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (360)..(360) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (393)..(393) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (420)..(420) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (423)..(423) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (429)..(429) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (453)..(453) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (510)..(510) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (540)..(540) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (552)..(552) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (558)..(558) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (567)..(567) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (584)..(584) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (600)..(600) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (604)..(605) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (613)..(613) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (621)..(621) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (633)..(633) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (680)..(680) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (684)..(684) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (738)..(738) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (741)..(742) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (757)..(757) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (759)..(759) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (783)..(783) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (807)..(807) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (825)..(826) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (840)..(840) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (843)..(843) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (885)..(885) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (963)..(963) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (978)..(978) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (985)..(985) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (993)..(993) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (999)..(999) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1014)..(1014) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1020)..(1020) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1087)..(1087) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1094)..(1094) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1117)..(1117) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1124)..(1124) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1143)..(1143) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1149)..(1149) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1158)..(1158) <223> n is a, c, g, or t <400> 2 atgaaaagaa agatttgtaa ngnncttntt tgtgcnncgn tagnaactag cctatgggct 60 gggnnatcaa ctaaagtnta ngcttgggat ggaaanattg anggaacagg aactcatgct 120 atgattgnaa ctcaaggnnt ttcaatntta gaaaatgatn tgtcnanaan tgaaccagaa 180 agtgtaagaa aaaacttaga gattttaaaa ganaacatgc atgancttca attaggttct 240 acttatccag attatgataa gaangcntat gatntatatc aagatcantt ctgggatcct 300 gatacanata ataatttntc aaaggataat agttggtatt tagcttattc tatacctgan 360 acaggggaat cacaaataag aaaattttca gcnttagcta gatatgaatg gcaaagaggn 420 aantataanc aagctacatt ctatcttgga gangctatgc actattttgg agatatagat 480 actccatatc atcctgctaa tgttactgcn gttgatagcg caggacatgt taagtttgan 540 acttttgcag angaaagnaa agaacantat aaaataaaca cagnaggttg caaaactaan 600 gagnnttttt atnctgatat nttaaaaaac aangatttta atgcatggtc aaaagaatat 660 gcaagaggtt ttgctaaaan aggnaaatca atatactata gtcatgctag catgagtcat 720 agttgggatg attggganta nncagcaaag gtaactntng ctaactctca aaaaggaaca 780 gcnggatata tttatagatt cttacangat gtatcagagg gtaannatcc atcagttggn 840 aanaatgtaa aagaactagt agcttacata tcaactagtg gtganaaaga tgctggaaca 900 gatgactaca tgtattttgg aatcaaaaca aaggatggaa aaactcaaga atgggaaatg 960 ganaacccag gaaatgantt tatgnctgga agnaaagana cttatacttt caanttaaan 1020 gatgaaaatc taaaaattga tgatatacaa aatatgtgga ttagaaaaag aaaatataca 1080 gcattcncag atgnttataa gccagaaaac ataaagntaa tagnaaatgg aaaagttgta 1140 gtngacaang atataaanga gtggatttca ggaaattcaa cttataatat aaaataa 1197 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 tatacttcta gtgataccgc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 atcagaatga ggatcttcaa 20 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 5 tcacataaag gttggaaggc aac 23 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 tacatatcaa ctagtggtga 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 attcttgagt ttttccatcc 20 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 8 tggaacagat gactacatgt attttgg 27 201800116 Ausland 9

Claims (12)

1. 하기 단계를 포함하는, 조류 집단에서의 괴사성 장염 돌발의 조기 검출을 위한 시험관내 방법으로서:
   a) 연속적인 시점에서 조류 집단으로부터 유래하는 분변 샘플 물질을 수집하는 단계; 및
   b) 단계 a)에서 수득된 샘플 물질에 함유되어 있는 마커 유전자 netB 대 cpa의 양의 비를 결정하는 단계;
   여기서 시간 경과에 따른 netB 대 cpa의 양의 비의 반전은 괴사성 장염 돌발의 조기 징후인
   방법.
2. 제1항에 있어서, 단계 a)의 분변 샘플 물질이 무작위로 선택된 개별 샘플로부터의 복합 분변 샘플인 방법.
3. 제2항에 있어서, 채취될 샘플의 수가 하기 공식을 사용하여 결정되는 것인 방법:
   

   

   
   여기서
   n₀는 샘플 크기 권장값이고,
   Z는 95% 신뢰 수준의 경우 1.96이고,
   p는 해당 속성을 가진 집단의 추정 비율이며, q는 1-p이고,
   e는 십진수로 표현되는 신뢰 구간이다.
4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 복합 분변 샘플이 하기 단계에 의해 수득되는 것인 방법:
   (a1) 동물 하우스 또는 동물 집단이 사육되는 구역을 격자 패턴인 동일한 수의 균일한 셀로 분할하는 단계;
   (a2) 제1 셀 내의 적어도 하나의 무작위 샘플 수집 부위를 확인하고, 상기 무작위 샘플 수집 부위에서 하나의 제1 샘플을 채취하는 단계; 및
   (a3) 각각의 셀 내의 동일한 상대적 샘플 수집 부위를 사용하여 나머지 셀 내의 개별 분변 샘플을 순차적으로 수집하는 단계;
   및 임의적으로
   (a4) 적어도 하나의 반복 샘플에 대하여 단계 (a2) 및 (a3)를 반복하는 단계.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 조류 집단이 육계 무리인 방법.
6. 제5항에 있어서, 육계 무리로부터의 분변 샘플 물질이 제10일부터 시작하여 매일 기준으로 수집 및 분석되는 것인 방법.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a)에서 수득된 샘플 물질에 함유되어 있는 마커 유전자 netB 대 cpa의 양의 비가 qPCR을 통하여 결정되는 것인 방법.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로서 및/또는 PCR 프로브로서 사용되는 것인 방법:
   a) 서열식별번호: 3에 제시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95%, 가장 바람직하게는 100%의 서열 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드;
   b) 서열식별번호: 4에 제시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95%, 가장 바람직하게는 100%의 서열 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드;
   c) 서열식별번호: 5에 제시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95%, 가장 바람직하게는 100%의 서열 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드;
   d) 서열식별번호: 6에 제시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95%, 가장 바람직하게는 100%의 서열 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드;
   e) 서열식별번호: 7에 제시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95%, 가장 바람직하게는 100%의 서열 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드;
   f) 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95%, 가장 바람직하게는 100%의 서열 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드;
   g) (a) 내지 (f)에 따른 올리고뉴클레오티드에 대하여 상보성인 올리고뉴클레오티드;
   h) (a) 내지 (g)에 따른 올리고뉴클레오티드 중 어느 하나를 포함하며 (a) 내지 (g)에 따른 올리고뉴클레오티드에 비해 5개 이하의 염기 쌍만큼 연장된 올리고뉴클레오티드.
9. 괴사성 장염 돌발의 조기 검출을 위한, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 방법의 용도.
10. 조류 집단에서 괴사성 장염 상태를 제어하기 위한 시험관내 방법으로서, 연속적인 시점에서 수집된 분변 샘플에 함유되어 있는 마커 유전자 netB 대 cpa의 양의 비를 모니터링하는 것을 포함하며,
    여기서
    a) 시간 경과에 따른 netB 대 cpa의 양의 비의 반전은 영양적 또는 치료적 개입의 필요성을 나타내고,
    b) 영양제 또는 치료제를 투여한 후의 시간 경과에 따른 netB 대 cpa 양의 비의 재-반전은 영양적 또는 치료적 개입의 효과성을 나타내는 것인
    방법.
11. 제10항에 있어서, 영양적 또는 치료적 개입이 프로바이오틱 작용제, 프리바이오틱 작용제, 식물성 물질, 유기/지방 산, 박테리오파지 및 박테리아 용해성 효소, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질을 투여하는 것을 수반하는 것인 방법.
12. 제10항 또는 제12항에 있어서, 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로서 및/또는 PCR 프로브로서 사용되는 것인 방법:
    a) 서열식별번호: 3에 제시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95%, 가장 바람직하게는 100%의 서열 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드;
    b) 서열식별번호: 4에 제시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95%, 가장 바람직하게는 100%의 서열 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드;
    c) 서열식별번호: 5에 제시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95%, 가장 바람직하게는 100%의 서열 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드;
    d) 서열식별번호: 6에 제시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95%, 가장 바람직하게는 100%의 서열 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드;
    e) 서열식별번호: 7에 제시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95%, 가장 바람직하게는 100%의 서열 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드;
    f) 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85, 90 또는 95%, 가장 바람직하게는 100%의 서열 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드;
    g) (a) 내지 (f)에 따른 올리고뉴클레오티드에 대하여 상보성인 올리고뉴클레오티드;
    h) (a) 내지 (g)에 따른 올리고뉴클레오티드 중 어느 하나를 포함하며 (a) 내지 (g)에 따른 올리고뉴클레오티드에 비해 5개 이하의 염기 쌍만큼 연장된 올리고뉴클레오티드.

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