KR20210007568A - 최적화된 키토산 글리콜 나노입자에 포획된 산화철 나노입자를 포함하는 복합 나노입자를 이용한 체내 이식된 줄기세포의 추적방법 및 이를 이용한 뇌졸중 병변 확인 방법 - Google Patents

최적화된 키토산 글리콜 나노입자에 포획된 산화철 나노입자를 포함하는 복합 나노입자를 이용한 체내 이식된 줄기세포의 추적방법 및 이를 이용한 뇌졸중 병변 확인 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 극대화된 신호를 발생시킬 수 있도록 최적화된 키토산 글리콜 나노입자에 포획된 산화철 나노입자를 포함하는 복합 나노입자를 이용한 체내 이식된 줄기세포의 추적방법 및 이를 이용한 뇌졸중 병변 확인 방법에 관한 것이다.

Description

최적화된 키토산 글리콜 나노입자에 포획된 산화철 나노입자를 포함하는 복합 나노입자를 이용한 체내 이식된 줄기세포의 추적방법 및 이를 이용한 뇌졸중 병변 확인 방법{Method for tracking stem cells injected in vivo using complexed nanoparticles comprising iron oxide nanoparticles encapsulated by chitosan glycol nanoparticles and method for checking brain stroke lesion}
본 발명은 극대화된 신호를 발생시킬 수 있도록 최적화된 키토산 글리콜 나노입자에 포획된 산화철 나노입자를 포함하는 복합 나노입자를 이용한 체내 이식된 줄기세포의 추적방법 및 이를 이용한 뇌졸중 병변 확인 방법에 관한 것이다.
세포 표지 및 추적 기술은 in vivo에서 접종된 세포의 치료적 효과 및 생물학적 메카니즘을 연구하는데 중요한 기술이다. 세포 표지 및 추적 기술은 숙주 세포와 이식된 세포를 구별하고, 이식 후 분포(distribution) 및 이동(migration)을 모니터링하고, 이식된 세포의 기능적 효과를 평가하는데 이용될 수 있다. 실제로, in vivo에서 관심 세포를 시각화하기 위한 다양한 접근법이 개발되어 왔다.
세포의 직접적인 표지 및 추적화를 위하여, 다양한 시약, 예컨대, 형광 프로브, 수퍼-파라마그네틱 산화철 및 방사성 추적자 등을 이용한다. 기본적으로, 줄기 세포를 이식하기 전 이들 프로브로 세포를 표지화하고, 적절한 이미지 장치로 시각화한다. 세포에 직접 표지하는 이들 프로브의 사용은 세포의 시각화를 용이하게 하지만, 이들 프로브에 의한 생물학적 영향으로 인해 세포 추적화는 상당히 제한적이다. 예컨대, 죽은 세포 및 방출된 이미지 프로브는 숙주 대식세포에 의해 이차적으로 식균되어진다. 따라서, 검출되는 신호가 표적화된 세포로부터 발생하는 것인지 대식세포로부터 발생하는 것인지 구분이 어렵다. 이러한 직접 표지의 단점을 극복하기 위하여, 유전적 개질방법이 외부 유전자의 발현에 대한 간접적 표지 및 추적화 방법으로 사용되어 왔다. 그러나, 비바이러스 및 바이러스 시스템을 이용하는 유전적 개질은 발암 가능성이 있으며, 유전자 발현의 조절이 어렵다는 단점이 있다. 따라서, 이러한 문제점을 해결하기 위한 새로운 세포 표지 및 추적화 방법을 고안하는 것은 생물학적 메커니즘 및 in vivo에서의 치료학적 효과를 향상시키기 위해 중요하다.
생물 직교성 무동 클릭화학 반응은, 세포 독성을 갖는 구리 촉매를 필요로 하지 않는 아지드-알킨 고리화 생접합 반응으로서 알킨-아지드 고리화 첨가반응에 의해 수행되는 매우 신속하고 효과적인 반응이다.
이러한 생물 직교성 무동 클릭화학 반응은, 특히 생물학 분야에서 대사 당쇄조작(metabolic glycoengineering)과 조합되어 더욱 강력한 용도로 사용되고 있다. 대사 당쇄조작은 적당한 전구체를 투입함으로써 고유 대사작용을 이용하여 세포에 비천연 글리칸을 도입하는 방식이다.
대사 당쇄조작을 이용한 표지는 세포 이미지를 위한 생물 직교성 화학적 리포터로 생물에 적합할 수 있으므로, 대사 당쇄조작 표지화가 형광 프로브로 화학적 결찰(ligation)에 의한 시각화가 가능할 수 있다는 다수의 증거가 있다. 특히, N-아세틸 만노스아민의 비천연 아날로그는 배양된 세포에 의해 신진대사되어, 어떠한 상당한 생리적 위험 없이 다양한 세포의 표면 상에서 아지도 시알산으로 전환된다. 세포 표면 상의 아지드기는 세포 이미지를 위한 디벤질 시클로옥틴(DBCO)-표지된 형광 프로브로 처리되어 왔다. 그러나, 이러한 연구는 in vivo의 특정 세포의 추적에 집중되지 않았으며, 실제로 in vivo의 특정 세포에서 추적화를 위한 반응을 보여준 연구는 없다. 세포 표지화 및 추적화에 응용되는 경우, 이러한 방법은 상기 반응이 생물학적 시스템에서 정상적으로 발견되지 않기 때문에 생물학적 효과에 의한 제한을 극복할 수 있다. 또한, 이러한 반응은 신속하고, 선택적이며, 효율이 높다. 따라서, 이를 in vivo에서 특정 세포의 검출에 사용하는 경우 외부 유전자 발현을 조절하는 어려움 없이 낮은 바탕신호 및 높은 민감도를 나타낸다.
한편, in vitro와는 달리, in vivo 주입된 세포는 체외에서 장치를 이용하여 이미지를 검출하게 되므로 강한 신호를 발생시킬 수 있는 최적화된 조건을 발굴하는 것 또한 중요한 과제이다.
특허문헌 1: 한국등록공보 제10-1416290호; 특허문헌 2: 한국등록공보 제10-1627271호.
비특허문헌 1: ARTHURS, Owen J. and GALLAGHER, Ferdia A., Pediatric radiology, 2011, 41(2): 185-198; 비특허문헌 2: Hong, V. et al., Bioconjugate chemistry, 2010, 21(10): 1912-1916; 비특허문헌 3: Gutierrez-Fernandez, M. et al., Journal of Cellular and Molecular Medicine, 2012, 16(10): 2280-2290; 비특허문헌 4: Kim, D. E. et al., Stroke, 2004, 35(4): 952-957; 비특허문헌 5: Kircher, M. F. et al., Nature Reviews Clinical Oncology, 2011, 8: 677-688; 비특허문헌 6: Lee, S. et al., Biomaterials, 2017, 139: 12-29; 비특허문헌 7: Yi, P. et al., Biomaterials, 2013, 34(12): 3010-3019; 비특허문헌 8: Li, L. et al., Theranostics, 2013, 3(8): 595-615; 비특허문헌 9: Du, J. et al., Glycobiology, 2009, 19(12): 1382-1401; 비특허문헌 10: Kang, S.-W. et al., Theranostics, 2014, 4(4): 420-431; 비특허문헌 11: Nam, T. et al., Bioconjugate chemistry, 2010, 21(4); 578-582; 비특허문헌 12: Han, S.-S. et al., Scientific Reports, 2018, 8(1): 13212; 비특허문헌 13: Xie, R. et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2016, 113(19): 5173-5178; 비특허문헌 14: Kawabori, M. et al., Neurosurgery, 2011, 68(4): 1036-1047; 비특허문헌 15: Hill, W. D. et al., Journal of Neuropathology & Experimental Neurology, 2004, 63(1): 84-96.
본 발명자들은 대사 당쇄조작을 이용하여 세포 독성 없이 줄기세포의 증식 및/또는 분화에 영향을 주지 않는 직접 표지방법 및 이를 이용한 체내에 이식된 줄기세포의 추적방법을 발굴하고, 이에 최적화된 향상된 신호를 발생시키는 표지 물질의 조건을 확립하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 키토산 글리콜 나노입자에 산화철 나노입자가 포획된 복합 나노입자를 이용하되, 상기 키토산 글리콜 나노입자로는 표면에 사이클로알킨기 및 형광 분자를 갖는 분자가 결합된 입자를 사용하고, 상기 산화철 나노입자로는 표면이 올레산으로 개질되고 크기를 조절한 입자를 사용함으로써 생물 직교성 무동 클릭화학을 통해 표면에 아지드기를 도입한 줄기세포에 빠르게 결합하고, 극대화된 MR 이미징 및 형광 신호를 통한 이중 검출이 가능한 줄기세포를 직접 표지하여 생체 내에서 이를 민감하고 효율적으로 추적할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 올레산으로 표면 개질된, 평균 직경 15 내지 25 nm 크기를 갖는 2개 이상의 산화철 나노입자가 2개 이상의 키토산 글리콜 나노입자에 의해 둘러싸여(encapsulated) 형성된, 평균 직경 200 내지 300 nm의 크기를 가지며 산화철 함량은 13 내지 18%인, 복합 나노입자를 제공한다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 올레산으로 표면 개질된, 평균 직경 15 내지 25 nm 크기를 갖는 2개 이상의 산화철 나노입자가 2개 이상의 키토산 글리콜 나노입자에 의해 둘러싸여(encapsulated) 형성된, 평균 직경 200 내지 300 nm의 크기를 가지며 산화철 함량은 13 내지 18%인, 복합 나노입자를 포함하는 줄기세포 표지용 조성물로서, 상기 키토산 글리콜 나노입자는, 표면에 결합된 사이클로알킨기를 포함하여, 대사 당쇄 조작을 통해 도입된 아지드기를 표면에 포함하는 줄기세포에 생물 직교성 무동 클릭화학을 통해 결합 가능한 것인, 줄기세포 표지용 조성물을 제공한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 올레산으로 표면 개질된, 평균 직경 15 내지 25 nm 크기를 갖는 2개 이상의 산화철 나노입자가 2개 이상의 키토산 글리콜 나노입자에 의해 둘러싸여(encapsulated) 형성된, 평균 직경 200 내지 300 nm의 크기를 가지며 산화철 함량은 13 내지 18%인, 복합 나노입자; 및 분리된 줄기세포;를 포함하는 뇌졸중 병변 검출용 조성물로서, 상기 키토산 글리콜 나노입자는 표면에 결합된 사이클로알킨기를 포함하며, 분리된 줄기세포는 대사 당쇄 조작을 통해 도입된 아지드기를 표면에 포함하여 생물 직교성 무동 클릭화학을 통해 서로 결합가능한 것인, 뇌졸중 병변 검출용 조성물을 제공한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 생체 내 주입 시, 추적이 가능한 줄기세포로서, 올레산으로 표면 개질된, 평균 직경 15 내지 25 nm 크기를 갖는 2개 이상의 산화철 나노입자가 2개 이상의 키토산 글리콜 나노입자에 의해 둘러싸여(encapsulated) 형성된, 평균 직경 200 내지 300 nm의 크기를 가지며 산화철 함량은 13 내지 18%인, 복합 나노입자; 및 분리된 줄기세포;를 포함하며, 상기 키토산 글리콜 나노입자는 표면에 결합된 사이클로알킨기를 포함하고, 분리된 줄기세포는 대사 당쇄 조작을 통해 도입된 아지드기를 표면에 포함하여 생물 직교성 무동 클릭화학을 통해 서로 결합된 것인, 줄기세포를 제공한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 올레산으로 표면 개질된, 평균 직경 15 내지 25 nm 크기를 갖는 2개 이상의 산화철 나노입자가 2개 이상의 키토산 글리콜 나노입자에 의해 둘러싸여(encapsulated) 형성된, 평균 직경 200 내지 300 nm의 크기를 가지며 산화철 함량은 13 내지 18%인, 복합 나노입자; 및 분리된 줄기세포;를 포함하는 뇌졸중 병변 검출용 조성물로서, 상기 키토산 글리콜 나노입자는 표면에 결합된 사이클로알킨기를 포함하며, 분리된 줄기세포는 대사 당쇄 조작을 통해 도입된 아지드기를 표면에 포함하여 생물 직교성 무동 클릭화학을 통해 서로 결합가능한 것인, 뇌졸중 병변 검출용 조성물을 제공한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 올레산으로 표면 개질된, 평균 직경 15 내지 25 nm 크기를 갖는 2개 이상의 산화철 나노입자가 2개 이상의 키토산 글리콜 나노입자에 의해 둘러싸여(encapsulated) 형성된, 평균 직경 200 내지 300 nm의 크기를 가지며 산화철 함량은 13 내지 18%인, 복합 나노입자를 줄기세포에 처리하여 표지하는 단계를 포함하는, 자기공명영상에 의해 추적 가능한 줄기세포의 제조방법으로서, 상기 키토산 글리콜 나노입자는 표면에 결합된 사이클로알킨기를 포함하며, 줄기세포는 대사 당쇄 조작을 통해 도입된 아지드기를 표면에 포함하여 생물 직교성 무동 클릭화학을 통해 서로 결합하는 것인, 방법을 제공한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 올레산으로 표면 개질된, 평균 직경 15 내지 25 nm 크기를 갖는 2개 이상의 산화철 나노입자가 2개 이상의 키토산 글리콜 나노입자에 의해 둘러싸여(encapsulated) 형성된, 평균 직경 200 내지 300 nm의 크기를 가지며 산화철 함량은 13 내지 18%인, 복합 나노입자를 주입하고자 하는 줄기세포에 처리하여 표지하는 단계; 상기 복합 나노입자로 표지된 줄기세포를 개체에 주입하는 단계; 및 상기 줄기세포를 주입한 개체로부터 자기공명영상(magnetic resonance imaging; MRI) 신호를 측정하는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 개체의 생체 내 주입된 줄기세포를 추적하는 방법으로서, 상기 키토산 글리콜 나노입자는 표면에 결합된 사이클로알킨기를 포함하며, 줄기세포는 대사 당쇄 조작을 통해 도입된 아지드기를 표면에 포함하여 생물 직교성 무동 클릭화학을 통해 서로 결합하는 것인, 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 보다 자세히 설명한다.
본 발명은 체내 주입시 뇌졸중 병변을 표적할 수 있는 줄기세포에 생물 직교성 무동 클릭화학을 통해 자기공명영상 신호를 발생시키는 입자를 표지하여 뇌졸중을 진단함에 있어서, 자기공명영상 신호를 발생시키는 입자로서 산화철 나노입자가 키토산 글리콘 나노입자에 의해 둘러싸여 형성된 직경 수백 nm 크기의 복합 나노입자를 이용하되, 상기 산화철 나노입자로서 직경 15 내지 25 nm로 조절된 크기의 입자를 함유하여 제조된 복합 나노입자가 다른 크기의 산화철 나노입자로부터 형성된 것에 비해 현저히 증가된 자기공명영상 신호를 발생시킴을 발견한 것에 특징이 있다.
본 발명은 올레산으로 표면 개질된, 평균 직경 15 내지 25 nm 크기를 갖는 2개 이상의 산화철 나노입자가 2개 이상의 키토산 글리콜 나노입자에 의해 둘러싸여(encapsulated) 형성된, 평균 직경 200 내지 300 nm의 크기를 가지며 산화철 함량은 13 내지 18%인, 복합 나노입자를 주입하고자 하는 줄기세포에 처리하여 표지하는 단계; 상기 복합 나노입자로 표지된 줄기세포를 개체에 주입하는 단계; 및 상기 줄기세포를 주입한 개체로부터 자기공명영상(magnetic resonance imaging; MRI) 신호를 측정하는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 개체의 생체 내 주입된 줄기세포를 추적하는 방법을 제공한다. 이때, 상기 키토산 글리콜 나노입자는 표면에 결합된 사이클로알킨기를 포함하며, 줄기세포는 대사 당쇄 조작을 통해 도입된 아지드기를 표면에 포함하여 생물 직교성 무동 클릭화학을 통해 서로 결합하는 것을 특징으로 한다.
예컨대, 본 발명의 추적방법에 있어서, 상기 키토산 글리콜 나노입자는 형광분자로 추가로 표지된 것일 수 있으며, 이에 따라 다중 검출 가능이 가능한 것이 특징이다.
예컨대, 상기 형광분자는 450 내지 800 nm 파장 범위에서 흡수 피크를, 550 내지 1000 nm 파장 범위에서 형광 피크를 갖는 물질일 수 있다.
상기 형광분자의 비제한적인 예는 7-AAD(7-Amionoactinomycin D), Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680, Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 750, Allophycocyanin(APC), PharRed(APC-Cy7), BOBO-3/BO-PRO-3, BODIPY TR-X, BODIPY 630/650-X, BODIPY 650/665-X, Calcium Crimson, 5-Carboxynaphthofluoroscein, Carboxy-X-rhodamine(5-ROX), CFC Formazan, Cy5, Cy5.5, Cy7, PE-Cy5(Cychrome, Quantum Red, R670, Tri-color), DiD(DilC18(5)), Dir(DilC18(7)), Ethidium bromide, Ethidium homodimer-1(EthD-1), Fura Red/Fluo-3, Indodicarbocyanine, Indotricarbocyanine, LDS 751(+DNA), LDS 751(+RNA), Nile Red, PE-Cy7, PE-Texas Red(Red 613), PerCP(Peridinin chlorphyll protein), PerCP-Cy5.5(TruRed), C-phycocyanin, R-phycocyanin, PI(Propidium Iodide), RH 414, SNAFL-1(high pH), SNARF-1(high pH), SpectrumRed, SYTO 17, Texas Red/Texas Red-X, Thiadicarbocyanine, TOTO-3/TO-PRO-3, TO-PRO-5, WW 781, X-Rhodamine(XRITC), YOYO-3/YO-PRO-3을 포함할 수 있다.
예컨대, 상기 줄기세포는 하기 화학식 1 내지 3의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물로 처리하여 표면에 아지드기가 도입된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다:
[화학식 1]
Figure pat00001
[화학식 2]
Figure pat00002
[화학식 3]
Figure pat00003
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구체적으로, 상기 줄기세포는 테트라아세틸화 N-아지도아세틸-D-만노스아민(Ac4ManNAz)를 처리하여 세포의 표면에 생성된 아지드기를 갖는 비천연 시알산을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
나아가, 상기 키토산 글리콜 나노입자는 상기 줄기세포의 표면에 도입된 아지드기와 생물 직교성 클릭화학을 통해 결합을 형성할 수 있도록 표면에 하기 화학식 4 내지 16의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물이 결합된 것일 수 있다:
[화학식 4]
Figure pat00004
[화학식 5]
Figure pat00005
[화학식 6]
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[화학식 7]
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[화학식 8]
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[화학식 9]
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[화학식 10]
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[화학식 11]
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[화학식 12]
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[화학식 13]
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[화학식 14]
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[화학식 15]
Figure pat00015
[화학식 16]
Figure pat00016
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그러나, 이에 제한되는 것은 아니며, 줄기세포 표면의 아지드기와 생물 직교성 클릭화학에 의해 결합을 형성할 수 있는 한, 키토산 글리콜 나노입자의 표면에 도입되는 물질은 상기 화학식에 제한되지 않는다.
예컨대, 본 발명에 따른 개체에 주입되는 상기 복합 나노입자로 표지된 줄기세포는 표지되지 않은 순수 줄기세포 자체와 동일한 수준의 세포적 특성을 유지하는 것일 수 있다. 줄기세포 자체의 세포적 특성 즉, 성장, 증식, 이동 및/또는 분화 특성을 유지하는 것은 치료적 목적에 사용을 위해 중요한 요소일 수 있다. 예컨대, 복합 나노입자의 표지로 세포의 독성을 유발하여 세포를 사멸시키고 대식세포에 섭취되는 경우 추적하고자 하는 줄기세포가 아닌 이를 포식한 대식세포를 이미징하여 명확하지 않은 추적 정보를 제공하게 될 수 있다. 또는 증식이나 분화에 영향을 주는 경우, 오히려 이의 주입으로 인해 체내에서 암을 유발하거나, 이상 조직 형성을 유발할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 줄기세포에 표지된 및/또는 그 자체로서의 복합 나노입자로부터 측정된 MR 팬텀 이미지에 기초하여 산출된 r2 완화도는 200 내지 1000 /mM·sec일 수 있다. 상기와 같이 향상된 r2 완화도를 가지므로 이의 사용은 보다 명확한 자기공명영상 획득에 유리할 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는, 복합 제조입자 제조시 크기가 상이한, 예컨대, 직경 20 nm의 산화철 나노입자 대신 각각 직경 5 nm 및 30 nm의 산화철 나노입자를 사용하는 것을 제외하고는 유사한 산화철 함량을 갖도록 제조된 복합 나노입자들에 비해 각각 약 4.9배 내지 5.7배로 증가된 r2 완화도를 갖는 것을 확인하였다.
나아가, 본 발명의 줄기세포 추적방법에 사용되는 상기 복합 나노입자는 생리활성용액 조건에서 14일까지 10% 이내로 적은 편차의 크기 변화를 나타낼 수 있다. 이는 본 발명의 줄기세포 추적방법에 사용되는 표지물질인 복합 나노입자는 생체 내에 주입되어도 2주 이상의 장기간 동안 크기의 변화 없이 즉, 분해되거나 팽윤되지 않고 본래의 형태를 유지하므로 시간에 따른 줄기세포의 추적에 적합하여, 질환의 진단 및/또는 치료 등에 유용하게 적용될 수 있다.
예컨대, 본 발명의 줄기세포 추적방법에 사용되는 상기 복합 나노입자는 동일 크기의 산화철 나노입자를 동일한 양으로 사용하는 것에 비해 10 내지 30배 증가된 T2-가중된 신호 크기를 나타낼 수 있다. 이는 소량의 표지물질로도 민감한 추적이 가능함을 시사하는 것이다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 올레산으로 표면 개질된, 평균 직경 15 내지 25 nm 크기를 갖는 2개 이상의 산화철 나노입자가 2개 이상의 키토산 글리콜 나노입자에 의해 둘러싸여(encapsulated) 형성된, 평균 직경 200 내지 300 nm의 크기를 가지며 산화철 함량은 13 내지 18%인, 복합 나노입자로 표지된 줄기세포를 인간을 제외한 뇌졸중 발병이 의심되는 개체에 주입하는 단계; 및 상기 줄기세포를 주입한 개체로부터 자기공명영상(magnetic resonance imaging; MRI) 신호를 측정하는 단계를 포함하는, 뇌졸중 병변을 확인하는 방법을 제공한다. 이때, 상기 키토산 글리콜 나노입자는 표면에 결합된 사이클로알킨기를 포함하며, 줄기세포는 이의 표면에 대사 당쇄 조작을 통해 도입된 아지드기와 키토산 글리콜 나노입자 표면에 결합된 사이클로알킨기 사이의 생물 직교성 무동 클릭화학에 의한 결합을 통해 상기 복합 나노입자로 표지된 것일 수 있다.
본 발명의 용어 "개체"란, 상기 뇌졸중이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함한 모든 동물을 의미할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 뇌졸중 유발 마우스 동물모델에 상기 복합 나노입자를 표지한 줄기세포를 주입하여 1일 내지 4일 간격으로 14일까지 추적한 결과, 주입된 줄기세포가 뇌졸중 병변으로 이동하여 선택적으로 위치하는 것을 확인하였으며, 이는 본 발명에 따른 복합 나노입자로 표지된 줄기세포의 추적방법을 이용하여 뇌졸중 병변, 즉, 뇌졸중이 발생한 구체적인 위치를 확인할 수 있음을 나타내는 것이다.
이상과 같이, 본 발명에 따른 복합 나노입자를 표지한 줄기세포는 뇌졸중 병변으로 이동하고, 이에 선택적으로 머무를 수 있으므로, 이에 약물을 탑재함으로써 병변을 확인하는 동시에 약물을 전달하여 치료하는 다중의 기능을 수행하도록 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 약물로는 당업계에 공지된 뇌졸중 치료용 약물을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 복합 나노입자를 표지한 줄기세포에 약물을 탑재하여 주입하는 동시에 다른 경로로 기존의 치료제를 투여하는 치료방식과 병행할 수 있다.
본 발명에 따르면, 줄기세포에 독성을 나타내지 않으며 증식 및/또는 분화 특성에 영향을 주지 않는, 대사 당쇄조작 및 생물 직교성 무동 클릭화학을 이용한 줄기세포 표면에의 자성 나노입자를 포함하는 복합 나노입자의 직접 표지를 통해 체내에 주입된 줄기세포를 추적함에 있어서, 상기 복합 나노입자에 포함된 자성 나노입자의 크기를 조절함으로써 극대화된 신호를 나타낼 수 있으며, 추가적으로 복합 나노입자에 형광 분자 등을 도입함으로써 다중 검출에 의한 줄기세포의 보다 정확한 추적을 가능하게 한다.
도 1은 산화철 나노입자를 담지한 복합 나노입자(DMCNs)의 특성분석 결과를 나타낸 도이다. (A)는 사용한 산화철 나노입자의 직경에 따른 복합 나노입자의 산화철 함량, 전체 입자의 직경, 및 MR r2 완화시간을, (B)는 DMCNs 20의 크기 분포 및 개별 입자의 TEM 이미지를, (C)는 DMCNs 20의 생리 활성 용액에서의 시간 경과에 따른 직경 변화를, (D)는 DMCNs 20 중의 산화철 농도에 따른 MRI 조영 효능을, (E)는 DMCNs 20의 BCN-CNPs 농도에 따른 형광 세기를 나타낸다.
도 2는 평균 직경 5 nm 및 30 nm의 산화철 나노입자를 담지한 복합 나노입자(각각 DMCNs 5 및 DMCNs 30)의 특성 분석 결과를 나타낸 도이다. (A)는 DMCNs 5 와 DMCNs 30의 크기 분포 및 개별 입자의 TEM 이미지를, (B)는 DMCNs 5, DMCNs 20, 및 DMCNs 30 중의 산화철 농도에 따른 MRI T2 조영 효능을, (C)는 DMCNs 5, DMCNs 20 및 DMCNs 30 중의 산화철 농도에 따른 MR r2 완화도를 나타낸다.
도 3은 대사 표지된 줄기세포(hMSCs)의 시험관 내 세포독성 및 분화 분석 결과를 나타낸 도이다. (A)는 DMCNs 20의 처리 농도에 따른 줄기세포에 대한 독성 평가 분석 결과를, (B)는 직교성 클릭화학으로 DMCNs 20이 표지된 줄기세포 및 비표지 줄기세포의 배양 기간에 따른 증식 경향을, (C)는 직교성 클릭화학으로 DMCNs 20이 표지된 줄기세포 및 비표지 줄기세포의 연골세포, 지방세포, 골세포로의 분화능을, (D)는 직교성 클릭화학으로 DMCNs 20이 표지된 줄기세포 및 비표지 줄기세포의 연골세포, 지방세포, 골세포로의 분화에 따른 상대적인 분화정도를 나타낸다.
도 4는 시험관 내 Ac4ManNAz의 세포독성 및 생성된 아자이드(N3)의 효능 분석 결과를 나타낸 도이다. (A)는 Ac4ManNAz의 농도에 따른 hMSCs에 대한 독성 및 형광표지효과를, (B)는 Ac4ManNAz(10μM)의 인큐베이션 시간에 따른 줄기세포에서의 아자이드 발현양을 확인하기 위한 웨스턴블롯 결과를, (C) 및 (D)는 각각 공초점현미경(confocal)을 이용한 Ac4ManNAz의 인큐베이션 시간에 따른 DBCO-Cy5를 이용한 형광 표지효과 및 FACS 분석 결과를, (E) 및 (F)는 각각 공초점현미경을 이용한 DBCO-Cy5의 인큐베이션 농도에 따른 형광 표지효과 및 FACS 분석 결과를 나타낸다.
도 5는 DMCNs 20으로 대사 표지된 줄기세포의 표지 효능을 나타낸 도이다. (A) 및 (B)는 각각 공초점레이저주사현미경 이미지를 통한 Ac4ManNAz 처리된 줄기세포 및 처리되지 않은 줄기세포에서의 DMCNs 20와의 인큐베이션 시간에 따른 대사 표지 정도 및 FACS 분석을 통한 형광세기를, (C)는 Ac4ManNAz 처리된 줄기세포에 대사 표지 물질인 BCN이 제거된 DMCNs 20과 BCN의 경쟁적 저해제인 TCEP와 각각 인큐베이션한 후 DMCNs를 처리한 세포의 공초점레이저주사현미경 분석 결과를, (D)는 DMCNs 20-표지된 hMSCs의 프러시안 블루 염색(prussian blue staining) 결과를, (E)는 DMCNs 20-표지된 hMSCs의 저온-전자현미경(Cyro-TEM) 분석 결과를, (F)는 ICP-MS를 이용하여 측정한 배양 기간에 따른 DMCNs 20-표지된 hMSCs 내의 Fe3O4의 함량 감소를, (G)는 DMCNs 20-표지된 hMSCs의 T2-가중된 MR 신호 분석 결과를 나타낸다.
도 6은 DMCNs 20-표지된 hMSCs의 세포 농도에 따른 T2-가중된 MR 신호 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 광혈전성 뇌졸중(photothrombotic stroke; PTS)이 유발된 마우스 모델에 이식된 DMCNs 20-표지된 hMSCs에 대한 광학 이미징을 이용한 생체 내 추적 결과를 나타낸 도이다. (A)는 마우스를 이용한 동물실험모델을, (B)는 정상 마우스 및 PTS가 유도된 마우스의 뇌에서 TTC(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride) 염색 결과를, (C)는 대사 표지된 hMSCs의 주입 농도에 따른 뇌졸중 마우스에서의 NIRF 신호 분석 결과를 나타낸다.
도 8은 뇌졸중이 유발된 마우스 모델에서 대사 표지된 hMSCs 주입 후 NIRF를 이용한 세포 거동 및 면역 염색 분석 결과를 나타낸 도이다. (A)는 뇌졸중이 유발된 마우스와 유발되지 않은 마우스에 이식된 대사 표지된 hMSCs의 이식 후 시간 경과에 따른 NIRF 이미지를, (B)는 대사 표지된 hMSCs의 주입 부위와 병변 부위로부터의 상대적 NIRF 시그널의 변화를, (C)는 대사 표지된 hMSCs가 주입된 뇌졸중 유도 마우스의 절개된 뇌의 NIRF 이미지를, (D)는 공초점현미경을 이용한 뇌졸중 유도 마우스에 주입된 대사 표지된 hMSCs의 형광신호 및 인간 핵 항체(HNA-FITC) 면역 염색 결과를, (E)는 공초점현미경을 이용한 뇌졸중 유도 마우스에 주입된 대사 표지된 hMSCs의 형광신호 및 대식세포(F4/80-FITC) 면역 염색 결과를 나타낸다.
도 9는 뇌졸중 유발된 마우스 모델의 형광 및 면역 염색 분석 결과를 나타낸 도이다. (A)는 뇌졸중이 유발된 마우스의 절개된 뇌의 NIRF 이미지를, (B)는 공초점현미경을 이용한 뇌졸중 유도 마우스의 형광신호 및 인간 핵 항체(HNA-FITC) 면역 염색 결과를, (C)는 뇌졸중 유도 마우스의 절개된 뇌의 프러시안 블루 염색 이미지를 나타낸다.
도 10은 뇌졸중이 유발된 마우스 모델에서 대사 표지된 hMSCs의 주입 후 시간 경과에 따른 MR 영상을 나타낸 도이다. (A)는 뇌졸중이 유발된 마우스와 유발되지 않은 마우스에 이식된 대사 표지된 hMSCs의 시간 경과에 따른 MR T2 이미지, (B)는 대사 표지된 hMSCs의 주입 부위와 병변 부위에서의 상대적 MR 시그널 변화를, (C) 및 (D)는 각각 뇌졸중 유발 후 대사 표지된 hMSCs가 이식된 마우스의 뇌 및 #1 뇌졸중 병변, #2 해마, 및 #3 주입 부위 확대 이미지에서 프러시안 블루 염색 결과를 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<물질>
직경 5, 20 및 30 nm 크기의 올레산-코팅된 초상자성(superparamagnetic) 산화철 나노입자((OA-Fe3O4), 글리콜 키토산(glycol chitosan, MW=2.5×105 Da, 탈아세틸화도(degree of deacetylation)=82.7%), N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카보디이미드(N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide; EDC), N-히드록시석신이미드(N-hydroxysuccinimide; NHS), 5β-콜란산(5β-cholanic acid), 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran; THF, 순도 ＞99%), 메탄올(순도 ＞99%), 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide; DMSO, 순도 ＞99%), 알시안블루(alcian blue), 알리자린레드 S(alizarin red S) 및 오일레드 O(oil red O)는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. Cy5.5-NHS 에스테르 및 테트라아세틸화 N-아지도아세틸-D-만노스아민(tetraacetylated N-azidoacetyl-D-mannosamine; Ac4ManNAz)은 Click Chemistry Tools(Scottsdale, AZ, USA)로부터 구입하였다. 지방형성 분화 키트(adipogenesis differentiation kit), 연골형성 분화 키트(chondrogenesis differentiation kit), 골형성 분화 키트(osteogenesis differentiation kit), 소태아혈청(fetal bovine serum; FBS), 최소필수배지(minimum essential media; MEM), 스트렙타비딘-호스래디쉬 과산화효소(streptavidin-horseradish peroxidase; streptavidin-HRP), 준세포 단백질 분획 키트(subcellular protein fractionation kit) 및 포스핀-PEG3-바이오틴(phosphine-PEG3-biotin)은 Thermo Fisher Scientific(Rockford, IL, USA)으로부터 구입하였다. 바이사이클로[6.1.0]노닌 N-히드록시석신이미드 에스테르 II(bicyclo[6.1.0]nonyne N-hydroxysuccinimide ester II; BCN-PEG2-NHS)는 Berry & Associates(Dexter, MI, USA)으로부터 구입하였다. FITC 결합된 항-F4/80 항체(FITC conjugated anti-F4/80 antibody; FITC-F4/80) 및 철 염색 키트(iron stain kit)는 Abcam(Cambridge, MA, USA)으로부터 구입하였다. 알렉사 488 결합된 항-인간 핵 항체(Alexa 488 conjugated anti-human nuclei antibody; FITC-HNA)는 Merck Millipore(Darmstadt, Germany)로부터 구입하였다. 모든 화합물은 분석용 등급을 구입하여 추가적인 정제 없이 사용하였다.
세포배양실험을 위하여, 인간 지방조직-유래 간엽줄기세포(human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells; hMSCs)를 ATCC(American Type Culture Collection, VA, USA)로부터 입수하였다. FBS 및 MEM은 Thermo Fisher Scientific(Rockford, IL, USA)으로부터 구입하였다. Dulbecco's 인산완충용액(Dulbecco's phosphate buffered saline; DPBS, pH 7.4) 및 항생제-항진균제(antibiotics-antimycotics; AA)는 WelGENE Inc.(Daegu, Republic of Korea)로부터 구입하였다.
실시예 1: 글리콜 키토산 나노입자( CNPs )의 제조
5β-콜란산과 결합된 양친매성(amphiphilic) 글리콜 키토산 고분자의 자기조립(self-assembly)에 의해 글리콜 키토산 나노입자(glycol chitosan nanoparticles; CNPs)를 제조하였다. 먼저, 5β-콜란산(120 mg, 800 μmol)을 NHS(72 mg, 1.2 mmol)와 혼합된 124 mL 메탄올에 용해시켰다. 글리콜 키토산(500 mg, 4 μmol)을 60 mL 탈이온수에 용해시키고 EDC(120 mg, 1.2 mmol)를 함유하는 60 mL 메탄올 용액에 첨가하였다. 상기 준비한 5β-콜란산 용액을 글리콜 키토산 용액과 혼합하고, 혼합 용액을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 이후, 상기 혼합 용액은 투석막(dialysis membrne, MWCO 12 - 14,000, Spectrum Laboratories, CA, USA)을 이용하여 탈이온수/메탄올의 1:3, 1:2, 1:1 및 1:0(v/v) 혼합용매에 대해 투석하였다. 정제된 용액을 동결건조하여 흰색 분말로 글리콜 키토산 나노입자(CNPs)를 수득하였다.
실시예 2: Cy5 .5-표지된 글리콜 키토산 나노입자( CNP - Cy5 . 5)의 제조
근적외선형광(near infrared fluorescence; NIRF) 이미징에 기초하여 대사(metabolically) 표지된 hMSCs을 추적하기 위하여, CNPs를 NIR 형광 염료(NIR fluorescent dye)인 Cy5.5로 화학적으로 개질하였다. 구체적으로, 2 mg의 Cy5.5-NHS 에스테르(1.7 μmol)를 1 mL의 DMSO에 용해시키고, 상기 실시예 1에 따라 준비한 CNPs(200 mg)를 10 mL의 DMSO에 분산시켰다. 상기 Cy5.5-NHS 에스테르 용액을 CNPs 용액에 서서히 적가하고, 혼합 용액을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 이후, 상기 혼합 용액은 투석막(MWCO 12 - 14,000)을 이용하여 탈이온수에 대해 2일 동안 투석하였다. 회수한 용액을 동결건조하여 Cy5.5 표지된 CNPs인 CNP-Cy5.5를 수득하였다.
실시예 3: BCN - 콘쥬게이트된 Cy5 .5-표지된 글리콜 키토산 나노입자( BCN - CNP -Cy5.5)의 제조
생물직교성 클릭 화학(bioorthogonal click chemistry)을 통한 hMSCs의 CNP-Cy5.5로의 대사 표지를 위하여, BCN-PEG2-NHS 에스테르로 CNP-Cy5.5를 화학적으로 개질하였다. 구체적으로, 10 mg의 BCN-PEG2-NHS 에스테르(20 μmol)를 1 mL의 DMSO에 용해시키고, 상기 실시예 2에 따라 준비한 CNP-Cy5.5(100 mg)를 10 mL의 DMSO에 분산시켰다. 상기 BCN-PEG2-NHS 에스테르 용액을 CNP-Cy5.5 용액에 적가하고, 혼합 용액을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 이후, 상기 혼합 용액은 투석막(MWCO 12 - 14,000)을 이용하여 탈이온수에 대해 2일 동안 투석하였다. 회수한 용액을 동결건조하여 BCN 개질된 CNP-Cy5.5인 BCN-CNP-Cy5.5를 수득하였다.
실시예 4: 이중 모드의 자성 키토산 나노입자( DMCNs )의 제조 및 시험관 내( in vitro ) 특성분석
NIRF/MR 이중 모드의 자성 키토산 나노입자(dual-modal magnetic chitosan nanoparticles; DMCNs)를 제조하기 위하여, 투석법을 통해 직경 5, 20, 및 30 nm 크기의 올레산 코팅된 산화철 나노입자(OA-Fe3O4 NPs)를 BCN-CNP-Cy5.5로 캡슐화(encapsulated)하였다. 구체적으로, 상기 실시예 3에 따라 준비한 BCN-CNP-Cy5.5(20 mg)를 2 mL의 THF:탈이온수 용액(1:1 v/v)에 분산시켰다. 6 mg의 OA-Fe3O4 NPs를 0.2 mL의 THF에 분산시키고, BCN-CNP-Cy5.5 용액과 혼합하였다. 상기 혼합 용액은 투석막(MWCO 12 - 14,000)을 이용하여 탈이온수에 대해 24시간 동안 투석하여 THF를 제거하였다. 회수한 용액은 0.45 μm 실린지 필터로 여과하여 잔여물을 제거하였다. 최종적으로, 동결건조를 통해 5 nm OA-Fe3O4 NPs-캡슐화된 BCN-CNP-Cy5.5(DMCNs 5), 20 nm OA-Fe3O4 NPs-캡슐화된 BCN-CNP-Cy5.5(DMCNs 20) 및 30 nm OA-Fe3O4 NPs-캡슐화된 BCN-CNP-Cy5.5(DMCNs 30)를 각각 수득하였다. DMCNs 5, DMCNs 20 및 DMCNs 30 내의 OA-Fe3O4 NPs의 양을 유도 결합 플라즈마 질량 분광계(inductively coupled plasma mass spectrometry; ICP-MS, Perkin Elmer, MA, USA)로 정량하였다. DMCNs 5, DMCNs 20 및 DMCNs 30의 직경 및 크기 분포를 분석하기 위하여, 각각의 나노입자(1 mg)를 1 mL의 PBS(pH 7.4)에 분산시키고, 제타-사이저(Zeta-sizer, Nano ZS, Malvern Instruments, U.K.)를 이용하여 직경 및 크기 분포를 측정하였다. DMCNs 5, DMCNs 20 및 DMCNs 30의 형태(morphologies)를 200 keV의 가속 전압에서 투과전자현미경(transmission electron microscopy; TEM, Tecnai F20, FEI, Netherlands)으로 관찰하였다. DMCNs 20의 크기 안정성을 모니터하기 위하여, 1 mg의 DMCNs 20을 PBS 또는 10% FBS 함유 PBS에 분산시키고, 37℃에서 인큐베이션하였다. 14일 동안 제타-사이저로 DMCNs 20의 크기를 모니터하였다. DMCNs 20의 시험관 내(in vitro) NIRF 대비 효과(contrast effect)를 관찰하기 위하여, DMCNs 20 및 CNs(0, 16, 31, 63, 125 및 250 μg/mL 농도의 CNs)을 PBS(pH 7.4)에 분산시키고, IVIS 루미나 시리지 III(IVIS Lumina Series III, Perkin Elmer, MA, USA)을 이용하여 NIRF 이미지를 획득하였다. DMCNs 20 및 CNs의 NIRF 세기를 Living Image® 소프트웨어(Perkin Elmer, MA, USA)를 사용하여 정량하였다. 시험관 내 MR 대비 효과를 관찰하기 위하여, DMCNs 20(DMCNs 20 내에 16, 31, 63, 125 및 250 μM 농도의 Fe3O4 함유), 직경 20 nm 크기의 OA-Fe3O4 NPs(OA-Fe3O4 NPs 내에 16, 31, 63, 125 및 250 μM 농도의 Fe3O4 함유), CNs 및 PBS를 1%(w/v) 아가로스 함유 PBS(pH 7.4)에 분산시키고, 4.7 테슬라(tesla, T) 동물 MRI 시스템(Axgilent　Technologies, CA, USA)을 사용하여 T2-가중화된(weighted) MR 팬텀이미지(phantom images)를 획득하였다. 상대적인 MR T2 신호를 이미지 J 소프트웨어(National Institute of Health, Bethesda, USA)를 사용하여 정량하였다.
실시예 5: 시험관 내 아자이드 형성 분석
hMSCs를 10%(v/v) FBS, 1%(v/v) 페니실린-스트렙토마이신-암포테리신 B(penicillin-streptomycin-amphotericin B) 용액(10 units/mL 페니실린, 10 mg/mL 스트렙토마이신, 24 ng/mL 암포테리신 B) 및 5 ng/mL의 인간 재조합 섬유아세포 성장 인자(human recombinant fibroblast growth factor; rhFGF)로 보충된 MEM에 배양하였다. hMSCs는 습식 5% CO2 내에서 37℃에 인큐베이션하였다. 이하 실험을 위하여, 5 내지 7 계대수(passage number)의 hMSCs를 사용하였다.
대사 조작(metabolic engineering) 이후 hMSCs 표면 상에서 아자이드 형성을 확인하기 위하여, 웨스턴 블롯 분석으로 hMSCs의 아자이드 함유 글리칸(azide-containing glycans)을 가시화하였다. 구체적으로, 5×105개의 hMSCs를 직경 100 mm 플레이트 상에 분주하고, 37℃ 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 안정화하였다. 안정화 후, 상기 hMSCs를 10 μM Ac4ManNAz로 처리하고 0, 6, 12, 24, 48 및 72시간 동안 인큐베이션하였다. 이후, 상기 hMSCs를 DPBS로 2회 세척하고, 프로테아제 억제제 칵테일(protease inhibitor cocktail)을 포함하는 1 mL의 용해 완충액(lysis buffer, 1% SDS, 100 mM Tris-HCl, pH 7.4)을 사용하여 4℃에서 30분 동안 용해시켰다. 상기 세포 용해물을 20분 동안 12,000 rpm으로 4℃에서 원심분리하고 상층액을 회수하여 바이신코닌산 단백질 어세이(bicinchoninic acid protein assay; BCA, Pierce, USA)를 이용하여 단백질 농도를 결정하였다. 100 μL의 각 세포 용해물(5 mg/mL 농도의 총 단백질)을 10 μL의 5 mM 포스핀-PEG3-바이오틴(Pierce, USA)과 혼합하여 실온에서 12시간 동안 인큐베이션하였다. 각 시료로부터의 단백질을 1× 소디움 도데실 설페이트(sodium dodecyl sulfate; SDS) 겔-로딩 염료와 혼합하여 5분 동안 끓였다. 20 μg의 단백질을 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(electrophoresis)으로 분리하고, 이모빌론-P 막(Immobilon-P membrane, Millipore, Billerica, MA, USA) 상에 옮겼다. 상기 막은 5% 소혈청알부민(bovine serum albumin; BSA) 함유 1× TBST 용액(10 mol/L Tris, 100 mol/L NaCl 및 0.1% Tween 20, pH 7.4)으로 실온에서 1시간 동안 차단하였다. 마지막으로, 1× TBST를 사용하여 막을 3회 세척하고 단백질 밴드를 증강된 화학발광(enhanced chemiluminescence) 키트(Millipore, Billerica, USA)로 검출하였다. 밴드의 신호는 LAS 3000(Fujifilm, Tokyo, Japan)을 사용하여 획득하였다. 대조군으로서, 총 단백질을 쿠마시 브릴리언트 블루 염색(Coomassies brilliant blue stain)으로 가시화하였다.
실시예 6: 대사 표지된 hMSCs의 세포독성 분석
hMSCs에 대한 대사 표지의 세포독성(cytotoxicity)을 확인하기 위하여, hMSCs를 Ac4ManNAz 또는 DMCNs 20과 24시간 동안 인큐베이션한 후, hMSCs의 생존율을 CCK-8 어세이 키트(Dojindo Molecular Technologies, Inc., Rockvile, USA)를 사용하여 측정하였다. 구체적으로, 5×103개의 hMSCs를 96-웰 플레이트 상에 분주하고, 37℃ 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 안정화하였다. 안정화 후, hMSCs를 Ac4ManNAz(0 - 100 μM)와 48시간 동안 또는 DMCNs 20(0 - 1000 μg/mL)와 37℃에서 24시간 동안 각각 인큐베이션하였다. 이후, 상기 hMSCs를 DPBS로 2회 세척하고 200 μL의 CCK-8 용액(10 μL의 CCK-8 및 190 μL 배지)에 37℃에서 2시간 동안 추가로 인큐베이션하였다. 각 웰에 대해 450 nm에서의 흡광도를 마이크로플레이트 리더(VERSAmaxTM, Molecular Devices Corp., CA, USA)를 사용하여 기록하였다. ㄷ 표대사 표지된 hMSCs의 증식을 모니터하기 위하여, 1×105개의 hMSCs를 직경 100 mm 크기의 세포 배양 플레이트에 분주하고 10 μM의 Ac4ManNAz와 37℃ 5% CO2 인큐베이터에서 48시간 동안 인큐베이션하여, hMSCs의 표면에서 아자이드 그룹의 형성(N3-hMSCs)을 유도하였다. DMCNs 20으로 N3-hMSCs를 표지하기 위하여, N3-hMSCs를 300 μg/mL의 DMCNs 20과 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. DMCNs 20으로 N3-hMSCs 표지 후, 대사 표지된 hMSCs를 DPBS로 2회 세척하고 대사 표지된 hMSCs의 수를 12일 동안 매 3일 마다 수집하였다. 세포 계수를 위하여, 대사 표지된 hMSCs를 0.4%(v/v) 트리판 블루(trypan blue, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)를 함유하는 DPBS에 부유시키고, 세포계수기(cell counter, R1, Olympus, Japan)를 사용하여 하였다.
실시예 7: 대사 표지된 hMSCs의 시험관 내 분화 분석
대사 표지된 hMSCs의 분화 성질을 확인하기 위하여, 대사 표지된 hMSCs를 사용하여 연골원성(chondrogenic), 지방원성(adipogenic) 및 골원성(osteogenic) 분화를 수행하였다. hMSCs의 대사 표지를 위해, 2×106개의 hMSCs를 직경 150 mm 크기의 세포 배양 플레이트 상에 분주하고 24시간 동안 안정화하였다. 안정화 후, hMSCs를 10 μM의 Ac4ManNAz와 37℃ 5% CO2 인큐베이터에서 48시간 동안 인큐베이션하고, 300 μg/mL의 DMCNs 20으로 37℃에서 2시간 동안 표지하였다. 연골형성 분화를 확인하기 위하여, 1×107개의 대사 표지된 hMSCs를 연골형성 분화 키트(Thermo Fisher Scientific, Rockford, USA)에 부유 상태를 유지(maintained at suspension)하고 배지를 14일 동안 매 3일 마다 교환하였다. 14일 후, 세포 펠렛을 OCT 화합물로 고정하고 -20℃에서 24시간 동안 동결시키고, 알시안 블루(alcian blue, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) 용액으로 염색하였다. 지방원성 분화를 확인하기 위하여, 5×104개의 대사 표지된 hMSCs를 6-웰 플레이트 상에 분주하고 37℃ 5% CO2 인큐베이터에서 48시간 동안 안정화하였다. 상기 대사 표지된 hMSCs를 지방형성 분화 키트(Thermo Fisher Scientific, Rockford, USA)에서 인큐베이션하고, 배지를 14일 동안 매 3일마다 교환하였다. 14일 후, 대사 표지된 hMSCs를 고정 완충액(fixation buffer, 10% 포름알데하이드, 1% 글루타르알데하이드 함유 DPBS)으로 실온에서 20분 동안 고정하고, 오일 레드 O 용액으로 염색하였다. 골형성 분화를 확인하기 위하여, 5×104개의 대사 표지된 hMSCs를 6-웰 플레이트 상에 분주하고 37℃ 5% CO2 인큐베이터에서 48시간 동안 안정화하였다. 상기 대사 표지된 hMSCs를 골형성 분화 키트(Thermo Fisher Scientific, Rockford, USA)에서 인큐베이션하고, 배지를 14일 동안 매 3일 마다 교환하였다. 14일 후,대사 표지된 hMSCs를 고정 완충액으로 실온에서 20분 동안 고정하고, 알리자린 레드 S 용액으로 염색하였다. 광학 현미경(CK40, Olympus, Japan)을 사용하여 대사 표지된 hMSCs의 연골형성-, 지방형성- 및 골형성 분화 이미지를 얻었다.
실시예 8: DMCNs 20으로 대사 표지된 hMSCs
대사 조작 및 생물직교 클릭 화학을 통해 hMSCs를 DMCNs 20으로 표지하기 위하여, 1×105개의 hMSCs를 35 mm 세포 배양 플레이트 상에 분주하고 24시간 동안 안정화하였다. 안정화 후, hMSCs를 10 μM의 Ac4ManNAz와 37℃ 5% CO2 인큐베이터에서 48시간 동안 인큐베이션하고 37℃에서 2시간 동안 300 μg/mL의 DMCNs 20으로 표지하였다. hMSCs의 표지 효율(labeling efficacy)을 각각 공초점 레이저 주사 현미경(confocal laser scanning microscope; CLSM)과 유세포분석기(flow cytometer; FACS)를 사용하여 관찰하고 정량하였다. 또한, 대사 표지된 DMCNs 20-hMSCs와 비대사 표지된 DMCNs 20-hMSCs를 프러시안 블루 염색법(Prussian blue staining)을 통해 철을 염색하여 광학 현미경으로 관찰하였다. 구체적으로, 35 mm 세포 배양 플레이트 상의 대사 표지된 hMSCs를 DPBS로 2회 세척하고 4% 포름알데하이드로 4℃에서 2시간 동안 고정하였다. 고정 후, DMCNs 20-표지된 hMSCs를 DAPI로 염색하고 405-다이오드(405 nm) 및 HeNe-Red(633 nm) 레이저를 구비한 CLSM(Leica, Germany)으로 형광 신호를 관찰하였다. DMCNs 20-표지된 hMSCs로부터의 형광 신호를 정량하기 위하여, 세포를 DPBS로 2회 세척하고 DMCNs 20-표지된 hMSCs로부터의 형광 신호를 FACS(FACS Calibur, BD Biosciences, CA, USA)를 사용하여 분석하였다. 유세포분석 데이터는 셀 퀘스트(Cell Quest, BD Biosciences, CA, USA)를 사용하여 분석하였다. 또한, DMCNs 20-표지된 hMSCs에서 DMCNs에 담지된 철을 염색하기 위해 프러시안 블루 염색법(Prussian blue staining)을 진행하였다. 5% 염산(hydrochloric acid)과 5% 페로시안화칼륨(potassium ferrocyanide)이 동일비율(1:1)로 희석된 용액을 DMCNs 20-표지된 hMSCs에 5분 동안 처리하고 정제수(distilled water)로 3회 세척하였다. 세척 후 Nuclear-fast Red 용액으로 5분 동안 처리한 후 정제수로 3회 세척하고 광학 현미경을 사용하여 관찰하였다. DMCNs 20-표지된 hMSCs의 고배율(high-magnified) 이미지를 관찰하기 위하여, 1×104개의 hMSCs를 24-웰 세포 배양 플레이트 내의 콜라겐-코팅된 디스크(Wako, Osaka, Japan) 상에 분주하였다. DMCNs 20으로 hMSCs를 표지하기 위하여, hMSCs를 10 μM의 Ac4ManNAz와 37℃ 5% CO2 인큐베이터에서 48시간 동안 인큐베이션하고 37℃에서 2시간 동안 300 μg/mL의 DMCNs 20으로 표지하였다. 표지 후, DMCNs 20-표지된 hMSCs를 DPBS로 2회 세척하여 표지되지 않은 DMCNs 20을 제거하고 2.5% 글루타르알데하이드(Sigma-Aldrich, MO, USA)의 DPBS 용액으로 4℃에서 3시간 동안 고정하였다. 이후, DMCNs 20-표지된 hMSCs를 2% 오스뮴 테트록사이드(osmium tetroxide, Sigma-Aldrich, MO, USA)의 DPBS 용액으로 4℃에서 3시간 동안 후 고정(post fixed)하였다. DMCNs 20-표지된 hMSCs의 음성 염색(negative staining)을 위하여, 고정된 세포를 증류수에 용해시킨 2% 우라닐 아세테이트(uranyl acetate) 용액으로 12시간 동안 일괄(en bloc) 염색하였다. 이후 시료를 일련의 농도로 증류수에 희석한 에탄올로 탈수하고 스퍼 수지(Spurr's resin, Sigma-Aldrich, MO, USA)에 포매시켰다. 최종적으로, 포매된 시료를 300 nm 두께로 연속적으로 절단하고 포름바 코팅된 그리드(formvar coated grids) 상에 수집하여 저온-전자현미경(Cryo-electron microscopy, Tecnai F20, FEI, Netherlands)으로 관찰하였다.
실시예 9: DMCNs 20-표지된 hMSCs 내의 Fe 3 O 4 함량의 정량적 분석
DMCNs 20-표지된 hMSCs 내의 Fe3O4의 양을 유도결합플라즈마 질량 분석기(inductively coupled plasma mass spectrometry; ICP-MS)로 정량하였다. 구체적으로, 1×105개의 hMSCs를 100 mm 세포 배양 플레이트 상에 분주하고 24시간 동안 안정화하였다. 안정화 후, hMSCs를 10 μM의 Ac4ManNAz와 37℃ 5% CO2 인큐베이터에서 48시간 동안 인큐베이션하고 37℃에서 2시간 동안 300 μg/mL의 DMCNs 20(45.9 μg의 Fe3O4)으로 표지하였다. 대조 실험군으로서, hMSCs를 20 nm 크기의 Fe3O4 NPs(45.9 μg)와 함께 2시간 동안 인큐베이션하거나, 대사 조작 없이 300 μg/mL의 DMCNs 20과 함께 인큐베이션하였다. 이후, 모든 세포를 DPBS로 2회 세척하고 2일 더 인큐베이션하였다. Fe3O4을 정량하기 위하여, 세포를 RIPA 완충액(Sigma-Aldrich, MO, USA)으로 용해시키고 Fe3O4의 양을 ICP-MS(Perkin Elmer, MA, USA)로 결정하였다.
실시예 10: 시험관 내( In vitro ) 세포 수준의 MR 팬텀 이미징 (phantom imaging)
DMCNs 20-표지된 hMSCs로부터의 T2-가중된(weighted) MR 신호를 확인하기 위하여, 1×105개의 hMSCs를 100 mm 세포 배양 플레이트에 분주하고 24시간 동안 안정화하였다. 안정화 후, hMSCs를 10 μM의 Ac4ManNAz와 37℃ 5% CO2 인큐베이터에서 48시간 동안 인큐베이션하고 300 μg/mL의 DMCNs 20으로 37℃에서 2시간 동안 표지하였다. 대조 실험군으로서, hMSCs를 300 μg/mL의 DMCNs 20과 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 이후, 모든 세포를 DPBS로 2회 세척하고 트립신처리하여 회수하였다. 1×105, 3×105, 5×105 및 1×106개의 DMCNs 20-표지된 hMSCs 또는 DMCNs 20-처리된 hMSCs를 0.2 mL PCR 튜브에 옮기고 4.7T 동물 MRI 시스템(TR = 10000 ms, 1 mm 슬라이스 두께, 7.5 ms로부터 960 ms까지 범위에서 7.5 TE)을 이용하여 T2-가중된 신호를 측정하였다.
실시예 11: 마우스 광혈전성 뇌졸중( photothrombotic stroke; PTS ) 모델의 제조
살아있는 동물을 이용하는 모든 실험은 한국과학기술연구원(Korea Institute of Science and Technology; KIST) 내의 관련 법규 및 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee; IACUC)의 기관 지침에 따라 수행하였으며, 해당 실험은 IACUC에 의해 승인되었다(승인번호 2017-005). 마우스 뇌졸중 모델(mouse brain stroke model)을 준비하기 위하여, Balb/c 누드 마우스(10 주령, 20 내지 25g, 수컷)를 오리엔트사(Orient Bio, Seoul, Korea)로부터 구입하였다. 졸레틸 50(Zoletil 50, 30 mg/kg)을 복강내주사(intraperitoneal injection)하여 마우스를 마취시키고 뇌고정장치(stereotaxic apparatus) 상에 고정하였다(restrained). 뇌졸중을 유도하기 위하여, 음경정맥(penile vein)을 통해 100 μ1의 로즈벵갈(rose bengal, 10 mg/mL in saline) 용액을 주사한 후 뇌의 좌측 전두피질(frontal cortex, 정수리점(bregma)까지 5 mm 전방(anterior) 및 중간선으로부터 2.5 mm 측면)을 561 nm 레이저에 16분 동안 노출시켰다. 뇌졸중 유도를 확인하기 위하여, 뇌조직 슬라이스를 2%의 2,3,5-트리페닐테트라졸리움 클로라이드(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride; TTC) 용액으로 37℃에서 30분 동안 염색하였다.
실시예 12: NIRF /MR 이중모드 이미징을 이용한 DMCNs 20-표지된 hMSCs의 시험관 내 추적( in vivo tracking)
NIRF/MR 이중모드 이미징을 이용한 DMCNs 20-표지된 hMSCs의 추적에 앞서, 주입 후 NIRF 이미징에 의해 추적가능한 hMSCs의 수를 최적화하였다. 구체적으로, 염수(saline), 5×104, 1×105, 5×105 및 1×106개의 DMCNs 20-표지된 hMSCs를 각각 뇌졸중 병변에 대한 우측 전두엽 대측부(right frontal lobe contralateral to the stroke lesion)에 주입하였다. 이후, DMCNs 20-표지된 hMSCs로부터의 NIRF 신호를 IVIS 루미나 시리즈 III(IVIS Lumina Series III, Perkin Elmer, MA, USA)을 사용하여 14일 동안 추적하였다. 최종적으로, NIRF/MR 이중모드 이미징을 이용하여 뇌졸중 병변에 대한 우측 전두엽 대측부에 주입된 1×106개의 DMCNs 20-표지된 hMSCs를 주입 후 14일 동안 추적하였다. DMCNs 20-표지된 hMSCs로부터의 NIRF 신호 및 T2-가중된 MR 신호를 IVIS 루미나 시스템 III 및 9.4 T 동물 MRI 시스템(TR = 4000 ms, TE = 32.5 ms, 1 mm 슬라이스 두께, Agilent　Technologies, CA, USA)으로 각각 추적하였다.
실시예 13: 조직학적 분석
뇌 조직을 4% 파라포름알데하이드(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)로 4℃에서 24시간 동안 고정하고 농도 구배 에탄올(70, 80, 90, 95 및 100%)을 사용하여 탈수하였다(dehydrated). 탈수된 시료는 자일렌(xylene)에 담구어 투명하게 하고 파라핀 용액에 포매시켰다(embedded). 상기 포매된 시료를 6 μm-두께의 슬라이스로 자르고, 뇌졸중-유도된 뇌 조직 내의 DMCNs 20-표지된 hMSCs를 관찰하기 위하여 Alexa fluor 488-결합된 인간 핵 항체(human nuclei antibody)(HNA-488)로 염색하였다. 구체적으로, 뇌 조직 슬라이드를 자일렌 및 농도 구배 에탄올에서 탈파라핀화하였다. HNA-488 염색을 위하여, 뇌 조직 슬라이드를 DPBS(pH 7.4)로 3회 세척하고, HNA-488 항체의 비특이적 결합을 차단하기 위하여, PBST(1% BSA, 0.1% Tween 20 in PBS)와 30분 동안 인큐베이션한 후, 상기 뇌 조직을 습식 챔버에서 HNA-488(1:100, 1% BSA in PBST)과 4℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 최종적으로, 상기 뇌 조직을 DAPI로 염색하고 405-다이오드 레이저(405 nm), Ar 레이저(488 nm) 및 HeNe-레드 레이저(633 nm)를 구비한 CLSM로 형광 신호를 관찰하였다. 뇌졸중 병변에서 대식세포의 식균 작용(phagocytosis)에 의한 DMCNs 20의 비특이적 신호를 추정하기 위하여, 상기 뇌 조직을 FITC(fluorescein isothiocyanate)-결합된 F4/80 항체(F4/80-FITC)로 염색하였다. 상기 뇌 조직 슬라이드를 자일렌 및 농도 구배 에탄올에서 탈파라핀화하였다. F4/80-FITC 염색을 위하여, 뇌 조직 슬라이드를 DPBS(pH 7.4)로 3회 세척하고 F4/80-FITC 항체의 비특이적 결합을 차단하기 위하여 PBST(1% BSA, 0.1% Tween 20 in PBS)와 30분 동안 인큐베이션한 후, 상기 뇌 조직을 습식 챔버에서 F4/80-FITC(1:200, 1% BSA in PBST)와 4℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 최종적으로, 상기 뇌 조직을 DAPI로 염색하고 405-다이오드 레이저(405 nm), Ar 레이저(488 nm) 및 HeNe-레드 레이저(633 nm)를 구비한 CLSM로 형광 신호를 관찰하였다. T2-가중된 MR 신호가 뇌졸중-유도 뇌 내의 DMCNs 20-표지된 hMSCs로부터 유래되는지를 나타내기 위하여, 상기 뇌 조직 슬라이드를 프러시안 블루(Prussian blue) 염색 키트로 염색하였다. 구체적으로, 뇌 조직 슬라이드를 자일렌 및 농도 구배 에탄올에서 탈파라핀화하였다. 상기 뇌 조직 슬라이드를 염산 및 포타슘 페로시아나이드(potassium ferrocyanide) 용액 혼합물(1:1, v/v)에 20분 동안 담궜다. 이후, 상기 뇌 조직 슬라이드를 탈이온수로 3회 세척한 후, nuclear fast red 용액으로 5분 동안 상대염색하고(counterstained) 농도구배 에탄올 및 자일렌으로 탈수하였다. 최종적으로, 상기 조직을 커버 글래스에 올려 광학 현미경(CK40, Olympus, Japan)으로 관찰하였다.
실시예 14: 통계적 분석
본 발명에서, 실험군 및 대조군 간의 차이는 일방(one-way) ANOVA를 사용하여 분석하였으며, 상대적으로 유의한 것으로 판단하였다(도면에서 별표(asterisk; *)로 표시).
실험예 1: OA - Fe 3 O 4 NPs 탑재된(encapsulated) BCN - CNPs의 제조 및 최적화
먼저, 소수성 5β-콜란산을 아미드 결합 형성을 통해 글리콜 키토산에 직접 결합시켜, 조영제인 Cy5.5 및 SPION(초상자성 산화철 나노입자; superparamagnetic iron oxide nanoparticles)의 전달체(delivery carrier)로서, 자기조립된 글리콜 키토산 나노입자(glycol chitosan nanoparticles; CNPs)를 형성하였다. 다음으로, 근적외선 형광(near-infrared fluorescence; NIRF) 이미징을 위하여 형광 염료, Cy5.5를 CNPs에 직접 결합시켰다. 이후, Cy5.5-결합된 CNPs를 bicyclo[6.1.0]nonyne (BCN)으로 개질하여, 생물직교 클릭 화학을 위한 BCN-CNP-Cy5.5(CNs)를 형성하였다. 마지막으로, OA-Fe3O4 NPs를 CNs 내에 탑재하여, 이중 모드 자성 글리콜 키토산 나노입자(dual-modal magnetic glycol chitosan nanoparticles; DMCNs)를 형성하였다. 특히, OA-Fe3O4 NPs-탑재된 조건을 최적화하여 바람직한 나노입자 크기 및 MR 대비 효과를 얻었다. 구체적으로, 각각 5, 20 및 30 nm 크기의 OA-Fe3O4 NPs를 THF에 분산시키고, 단순 투석법(simple dialysis method)으로 CNs 내에 탑재하여, 5 nm-OA-Fe3O4 NPs-탑재된 CNs(DMCNs 5), 20 nm-OA-Fe3O4 NPs-탑재된 CNs(DMCNs 20) 및 30 nm-OA-Fe3O4 NPs-탑재된 CNs(DMCNs 30)을 각각 수득하였다. 이어서, 상기 DMCNs 5, DMCNs 20 및 DMCNs 30의 Fe3O4 함량, 유체역학적 직경(hydrodynamic diameter) 및 r2-완화도(relaxivity)를 각각 유도결합플라즈마 질량 분석기(ICP-MS), 동적레이저산란(dynamic laser scattering; DLS) 및 4.7 Tesla 자기공명(magnetic resonance; MR) 이미징으로 확인하였다. 상기와 같이 측정된 DMCNs 5, DMCNs 20 및 DMCNs 30의 Fe3O4 함량, 유체역학적 직경 및 r2-완화도를 도 1A에 나타내었다. DMCNs 5, DMCNs 20 및 DMCNs 30 중의 OA-Fe3O4 함량은, ICP-MS를 사용하여 정량된 바와 같이, 각각 15.0±1.9, 15.3±1.7 및 13.8±1.1이었다. 인산완충용액(phosphate buffered saline; PBS) 새롭게 분산시킨 DMCNs 5, DMCNs 20 및 DMCNs 30의 유체역학적 직경은 DLS로 측정하였으며, 그 결과 각각 369.9±10.0, 238.9±6.6 및 366.4±8.6 nm의 직경을 나타내었다. 상기 DMCNs 5, DMCNs 20 및 DMCNs 30은 CNs의 내부 공간에 다수의 Fe3O4 NPs를 보유하여, 단일 크기 분포(unimodal size distribution)를 갖는 구형 나노입자 형태를 보였다(도 1B 및 도 2A). DMCNs 5, DMCNs 20 및 DMCNs 30의 r2 완화도는 다양한 농도의 DMCNs(0 내지 1000 μM의 Fe3O4)의 MR 팬텀 이미지에 기초하여 각각 107.7, 526.1 및 92.5 mM-1s-1로 계산되었다(도 2B). 특히, DMCNs 20의 r2-완화도는 DMCNs 5 및 DMCNs 30의 그것에 비해 각각 4.88배 및 5.69배 더 높게 관찰되었다(도 2C). 이는 20 nm 크기의 Fe3O4 NPs가 CNs 내에서 상대적으로 높은 Fe3O4 NPs-밀도를 형성함으로써, 소수성 코어 내의 국부적 자성 용량(local magnetic dose; LMD)을 증가시키는데 기인한다. 이에, 본 발명자들은 이하 실험에서 대사 표지 및 생체 내 조건에서 hMSCs의 추적을 위한 최적화된 나노입자로서 DMCNs 20을 선별하여 사용하였다. 다음으로, 10% FBS 함유 PBS에서 DMCNs 20의 크기 안정성을 DLS를 사용하여 14일 동안 확인하였다. DMCNs 20의 평균 직경(mean diameter)은, 각각 PBS 및 10% FBS-함유 PBS에 분산시, 14일 동안 어떠한 유의적인 변화도 나타내지 않았다(도 1C). 이는 중성의 표면 전하 성질 및 글리콜 키토산 상의 친수성 에틸렌 글리콜 모이어티가 CNs와 단백질의 상호작용을 방지할 수 있음을 나타내는 것이다.
독성이 없는 DMCNs 20의 높은 대비 효과 및 표지 효율은 시험관 내 조선에서뿐만 아니라 생체 내에서 hMSCs의 효과적인 추적을 위한 중요한 요소이다. 따라서, 시험관 내 NIRF 및 MR 이미징에서의 대비 효과를 확인하기 위하여, 다양한 농도의 DMCNs 20을 이용하여 NIRF 및 MR 팬텀 이미징을 수행하였다. 도 1D에 나타난 바와 같이, DMCNs 20 및 CNs로부터의 NIRF 신호는 점진적으로 용량-의존적 방식(dose-dependent manner, 0 내지 250 μg/ml의 CNs)으로 증가하는 것으로 명확히 관찰되었다. 또한, DMCNs 20의 NIRF 신호는 CNs의 그것과 어떠한 유의적인 차이도 나타내지 않았으며, 이는 DMCNs 20의 NIRF 신호가 Fe3O4 NPs에 의해 영향받지 않음을 나타내는 것이다. 16, 31, 63, 125 및 250 μM의 Fe3O4에 대해 용량 의존적 T2-가중된 MR 신호 또한 DMCNs 20에서 관찰되었으며, 이때, 250 μM에서 DMCNs 20의 T2 MR 신호는 PBS, CNs 및 250 μM의 20 nm-Fe3O4 NPs의 그것에 비해 각각 37배, 37.5배, 및 18.9배 더 강하게 나타났다(도 1E). DMCNs 20의 강한 MR T2-/NIRF-대비 효과 및 장기간 안정성은 DMCNs 20이 hMSCs의 효과적인 표지에 사용될 수 있음을 나타내는 것이다.
실험예 2: 세포 생존율, 증식 및 분화에 대한 대사 표지의 효과
대사 표지 방법에 의한 hMSCs의 성공적인 표지 및 추적을 위해 표지 방법과 함께 이미징제의 표지 변수(labeling parameters) 및 독성이 최적화되어야 한다. DMCNs 20을 이용한 hMSCs의 대사 표지를 최적화하기에 앞서, 각각 DMCNs 20 또는 Ac4ManNAz로 24시간 동안 처리 후 CCK8 어세이에 의해 hMSCs에서 시험관 내 세포독성을 평가하였다. 도 3A에 나타난 바와 같이, hMSCs를 DMCNs 20(0 내지 1000 μg/ml)으로 24시간 동안 처리하였을 때, 세포 생존율에서 어떠한 유의미적 변화도 관찰되지 않았다. 또한, Ac4ManNAz-처리된 hMSCs 역시 50 μM의 Ac4ManNAz까지 세포 생존율에서 전혀 유의미한 변화를 나타내지 않았다(도 4A). 그러나, 100 μM의 Ac4ManNAz로 24시간 동안 처리하였을 때, hMSCs의 세포 생존율은 현저하게 감소되었다. 이는 고농도의 Ac4ManNAz가 고혈당증-유도 손상(hyperglycemia-induced damage)에 의해 세포의 해당활성(glycolytic activity)을 감소시킬 수 있고, hMSCs에서 미토콘드리아의 산소 소비(mitochondrial oxygen consumption)를 감소시킬 수 있으므로, hMSCs의 증식을 저해할 수 있음을 나타내는 것이다. 따라서, 10 μM의 Ac4ManNAz를 hMSCs의 대사 조작을 통한 아자이드 생성(N3-hMSCs)을 위한 최적화된 농도로 선택하였다. 다음으로, hMSCs와 Ac4ManNAz(10 μM)의 다양한 인큐베이션 시간(0, 6, 12, 24, 48 및 72시간)에서 아자이드 생성 효과를 확인하였다. 도 4B에 나타난 바와 같이, 10 μM의 Ac4ManNAz로 6시간 처리 후 웨스턴 블롯 분석에서 강한 밴드 세기가 관찰되었으며, 상기 밴드의 세기는 24시간까지 인큐베이션 시간에 따라 점차적으로 증가되었고, 48 및 72시간에서 포화되었으며, 이는 아자이드 그룹이 24시간 내에 hMSCs의 글리칸에 성공적으로 결합될 수 있음을 나타내는 것이다. 생물직교 클릭 화학을 통한 DMCNs 20에 의한 N3-hMSCs의 표지 효율을 확인하기 위하여, 300 μg/ml의 DMCNs 20으로 1, 2, 3 및 6시간 동안 표지된 N3-hMSCs의 형광을 관찰하고 정량하였다. 공초점 현미경 이미지는 DMCNs 20과의 인큐베이션에 의해 2시간까지 점차 증가하는 형광 신호를 나타내었으며, 강한 형광 신호는 대사 표지된 hMSCs의 표면에서 주로 관찰되었다(도 4C). 또한, 유세포분석(flow cytometry) 결과는 대사 표지된 hMSCs로부터의 형성 신호가 DMCNs 20 처리 후 2시간, 3시간 및 6시간 후에 포화됨을 나타내었고, 이는 DMCNs 20이 2시간 이내에 생물직교 클릭 화학에 의해 N3-hMSCs에 결합함을 나타내는 것이다(도 4D). 이에, 생물직교 클릭 화학을 통한 N3-hMSCs 표지에 적합한 시간으로서 DMCNs 20과의 인큐베이션 시간을 2시간으로 설정하였다. 최종적으로, CCK8 어세이를 이용하여 대사 표지된 hMSCs의 증식을 확인하였다. DMCNs 20으로 hMSCs의 대사 표지를 위하여, 1×105개의 hMSCs를 10 μM의 Ac4ManNAz로 48시간 동안 처리하였다. 이후, N3-hMSCs 상의 아자이드 그룹을 300 μg/ml의 DMCNs 20과 2시간 동안의 생물직교 클릭 화학을 통해 화학적으로 표지하였다. 대사 표지된 hMSCs의 수는, 비처리 또는 10 μM의 Ac4ManNAz로 처리한 hMSCs와 비교하여, 증식에서 유의미한 차이를 나타내지 않았다(도 3B). 이는 상기 대사 표지 방법이 독성을 유발하지 않는 hMSCs에 대한 효율적인 효지 방법을 제공함을 나타내는 것이다.
임상적 응용에 대한 성공적인 줄기세포 표지의 적용 및 추적 기술을 위하여, 표지 방법은 세포에 비독성(non-cytotoxic)이어야 하며, 줄기세포의 분화 성질에 영향을 주지 않아야 한다. 따라서, 생체 내 적용(in vivo application)에 앞서, Ac4ManNAz(10 μM, 48 h) 및 DMCNs 20(300 μg/ml, 2h)으로 처리한 대사 표지된 hMSCs의 분화 특성을 연골형성, 지방형성 및 골형성 평가를 통해 확인하였다. 도 3C에 나타난 바와 같이, 비처리 hMSCs와 비교하여, 글루코사미노글리칸(glucosaminoglycan; GAGs)의 거의 동일한 부분(subequal area)이 대사 표지된 hMSCs 및 대사 처리없이 DMCNs 20-처리한 hMSCs 모두에서 연골형성 이후 염색되었다. 또한, 지방형성 분화 후 오일-레드-O 염색을 이용한 경우 표지된 hMSCs 및 비처리 hMSCs 모두에서 동일한 빈도의 지질액포(lipid vacuoles)가 관찰되었다. hMSCs의 골형성 분화 역시 비처리 hMSCs, 대사 표지된 hMSCs, 및 대사 조작없이 DMCNs 20 처리한 hMSCs를 사용하여 2주 동안 골원성 배지에서 배양 후 평가하였다. 모든 그룹의 hMSCs에서 알리자린 레트 S 염색 후 골형성 분화의 표지자인 칼슘 침적이 거의 동일한 영역에서 관찰되었다. 대사 표지된 hMSC 및 대사 조작없이 DMCNs 20 처리된 hMSCs의 상대적인 분화 특성은 비처리 hMSCs의 분화 특성과 비교하여 이들의 성질에서 유의미한 변화를 나타내지 않았다(도 3D). 대사 표지된 hMSCs의 이러한 분화 평가는 대사 조작-기반 세포 표지 방법이 표현형(phenotype)의 변화없이 hMSCs를 효율적으로 표지할 수 있음을 나타낸다.
실험예 3: DMCNs 20으로의 시험관 내 hMSC 표지
최적화된 대사 표지 조건에 기초하여, 대사 표지 및 hMSCs에 의한 비특이적 DMCNs 20 섭취 간의 표지 효율을 비교하였다. 도 5A에 나타난 바와 같이, 공초점 현미경에 의해 DMCNs 20을 이용한 hMSCs의 표지 효과를 확인하였으며, DMCNs 20 처리한 hMSCs로부터의 형광 세기가, 비처리 또는 DMCNs 20 처리된 hMSCs에 비해 대사 조작 후 현저하게 증가함을 확인하였다. 또한, 유세포분석 데이터는 DMCNs 20으로 대사 표지된 hMSCs가 비처리 및 DMCNs 20 처리한 hMSCs의 그것에 비해 각가 3.3배 및 2.39배 더 높은 평균 형광 세기(mean fluorescence intensity; MFI)를 나타냄을 보여주었다(도 5B). DMCNs 20으로 대사 표지된 hMSCs가 대사공학적으로 표지된 것을 확인하기 위해 BCN이 제거된 DMCNs 20과 DMCNs 20에 부착된 BCN의 경쟁적 저해제인 TCEP(tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride)를 각각 Ac4ManNAz 처리한 hMSCs에 처리하였다. 공초첨 현미경을 통해 대사 저해 조건에서는 DMCNs 20의 표지가 현저하게 감소한 것을 확인하였다(도 5C). 나아가, 프러시안 블루 염색 이미지는 대사 조작없이 DMCNs 20 처리한 hMSCs에 비해 대사 표지된 hMSCs에서 보다 강한 산화철 세기를 나타내었다(도 5D). 추가로, 세포 표면 막으로부터 세포질을 포함하여 hMSCs 내에서 DMCNs 20의 분포를 확인하기 위하여, 저온전자현미경(Cryo-Electron microscopy)을 사용하여 DMCNs 20 처리한 hMSCs 및 DMCNs 20으로 대사 표지된 hMSCs을 분석하였다(도 5E). DMCNs 20 처리한 hMSCs는 hMSCs에 의한 비특이적 섭취로 인해 세포질에서 약간의 DMCNs 20이 나타났다. 그러나, hMSCs를 Ac4ManNAz로 처리하였을 때, 다수의 DMCNs 20은 주로 세포 표면 막에서 관찰되었다. 이는 외인성으로 제공된 DMCNs 20이 생물직교 클릭 화학을 통해 대사 조작된 hMSCs(N3-hMSCs)의 표면 상의 아자이드 그룹에 인위적으로 결합할 수 있는 것고, 그 결과로서 hMSCs의 표면에서 DMCNs 20의 양이 증가하는 것에 기인한다. 또한, DMCNs 20에 의해 대사 표지된 N3-hMSCs의 ICP-MS 데이터 역시 표지 후 48시간에 hMSCs 내에 70.7%의 Fe3O4 NPs가 유지됨을 나타내었다(도 5F). 그러나, hMSCs를 Fe3O4 NPs로 또는 대사 조작없이 DMCNs 20으로 처리했을 때에는, 각각 38.7% 및 42.6%의 Fe3O4 NPs가 hMSCs 내에 잔류하였다. 이는 세포 표면의 시알산-함유 글리칸 상의 아자이드 그룹에 인위적으로 결합된 DMCNs 20이 세포의 막 전환 기전(membrane turnover mechanism)을 통해 hMSCs의 세포질로의 내면화(internalization)에 기인한다. 다음으로, 대사 표지된 hMSCs의 수를 변화시키면서 T2-가중된 MR 신호를 측정하고, 대사 조작없이 DMCNs 20 처리한 hMSCs에 대한 값과 비교하였다. 도 5G에 나타난 바와 같이, 시험관 내(in vitro) T2-가중된 팬텀 이미지는 대사 조작없이 DMCNs 20 처리한 hMSCs와 비교하여 대사 표지된 hMSCs에서 T2-가중된 MR 신호의 hMSCs 농도-의존적 증강을 명확히 나타내었다. 대사 표지된 hMSCs의 상대적인 T2-가중된 MR 신호는, 대사 표지된 hMSCs의 수가 1×105, 3×105, 5×105, 및 1×106일 때, PBS의 그것에 비해 각각 58.4%, 21.3%, 10.6%, 및 8.66%까지 향상되었다. 이는 This is because DMCNs 20이 대사 조작을 통해 외인적으로 생성된(exogenically generated) hMSCs의 표면 상의 아자이드 그룹에 결합할 수 있어 그 결과로서 hMSCs의 표지 효율이 증가하는데 기인한다. 그러나, 대사 조작없이 DMCNs 20 처리한 hMSCs의 상대적인 T2-가중된 MR 신호는 5×105 세포 농도에서 43.3%까지 감소하였으며, 1×106 세포 농도에서 조차 포화(42%)되었다(도 6).
실험예 4: 마우스 뇌졸중 모델에서 대사 표지된 hMSCs의 생체 내 광학/MR 이중 이미징
광학적/MR 이중 이미징을 통해 대사 표지된 hMSCs의 생체 내 추적 효율을 확인하기 위하여, 미리-주사한 광감응제(photosensitizer), 로즈벵갈(Rose Bengal)의 광활성화(photoactivation)에 의해 좌뇌 피질 영역(left cortical area)에 허혈성 손상(ischemic damage)을 유도한 마우스 광혈전성 뇌졸중(photothrombotic stroke; PTS) 모델을 사용하였다(도 7A). 마우스 PTS 모델의 절제된 뇌로부터의 2,3,5-트리페닐테트라졸리움 클로라이드(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride; TTC) 염색 이미지는, 정상 마우스 뇌와 비교하여, 좌측 피질(cortex)에서 TTC-음성 영역을 명확히 나타내었다(도 7B). hMSCs를 추적하기에 앞서, 다양한 농도로 대사 표지된 hMSCs를 주입한 후, 마우스 PTS 모델에서 NIRF 신호 민감도를 확인하고 최적화하였다. 각각 5×104, 1×105, 5×105, 및 1×106개의 대사 표지된 hMSCs를 마우스 PTS 모델의 우측 해마(hippocampus)에 주입하고, NIRF 신호를 14일 동안 모니터하였다(도 7C). 염수 처리한 마우스 PTS 모델과 비교하여, 상기 마우스를 각각 5×104 또는 1×105개의 대사 표지된 hMSCs로 처리하였을 때, 3일 동안 두부에서 강한 NIRF 신호가 모니터되었다. 흥미롭게도, 상기 각각 5×104 또는 1×105개의 대사 표지된 hMSCs로 처리한 마우스 PTS 모델의 두부에서의 NIRF 신호는 주입 후 14일까지 연장된 강한 NIRF 신호를 나타내었다. 나아가, 뇌졸중 병변으로의 NIRF 신호의 이동이 5×104 또는 1×105개의 대사 표지된 hMSCs의 주입 후 7일차로부터 관찰되었다.
NIRF 민감성 결과에 기초하여, 마우스 PTS 모델 및 정상 마우스 모델의 우측 해마에 1×106개 세포를 주입 후 대사 표지된 hMSCs로부터의 NIRF 신호 추적을 수행하였다. 마우스 PTS 모델에 주입 후 1일차에, 대사 표지된 hMSCs로부터의 강한 NIRF 신호가 주입 부위에서 관찰되었다. 상기 NIRF 신호는 주입 후 3일차에 점차 뇌졸중 병변으로 이동하여 대사 표지된 hMSCs 주입 후 7일, 10일 및 14일 후에는 뇌졸중 병변에서 강한 NIRF 신호가 나타났다. 이는 뇌졸중 병변에서 과발현되는(upregulated) 간질세포 유도 인자-1α(stromal cells derived factor-1α; SDF-1 α, CXCL 12) 단백질이 뇌졸중 병변으로 hMSC 이동을 유도할 수 있음을 나타내는 것이다. 그러나, 대사 표지된 hMSCs가 정상 마우스 모델에 주입되었을 때, NIRF 신호는 어떠한 이동도 없이 주입 부위에서 점차 감소하였다(도 8A). 도 8B에 나타난 바와 같이, 마우스 PTS 모델에서 상대적인 NIRF 신호는 뇌졸중 병변에서 점차 증가하는 반면, 주입 부위에서는 점차 감소하였다. 마우스 PTS 모델의 뇌에서 대사 표지된 hMSCs의 추가적인 관찰을 위하여, 대사 표지된 hMSCs 주입 후 14일차에 모든 뇌를 절제하였다. 정상 뇌에서 대사 표지된 hMSCs로부터의 NIRF 신호는 주입된 부위에 집중되었다. 뿐만 아니라, 대사 표지된 hMSCs를 처리하지 않은 뇌졸중 유도된 뇌 조직으로부터의 NIRF 신호는 단지 뇌 조직의 바탕 신호만을 나타내었다(도 9A). 그러나, 대사 표지된 hMSCs를 뇌졸중 유도된 뇌에 주입하였을 때, 강한 NIRF 신호가 주입 부위는 물론 뇌졸중 병변에서 관찰되었다(도 8C).
상기 NIRF 신호가 뇌졸중 유도된 뇌에서 대사 표지된 hMSCs로부터 유래한 것인지 확인하기 위하여, 뇌졸중 유도된 뇌 조직을 플루오레신 이소티오시아네이트 결합된-인간 핵 항체(fluorescein isothiocyanate conjugated-human nucleic antibody; FITC-HNA)로 염색하였다. 도 8D에 나타난 바와 같이, 공초점 현미경 이미지는 FITC-HNA의 형광신호가 뇌졸중 병변 및 주입 부위에서 모두 관찰될 뿐만 아니라 DMCNs 20의 NIRF 신호와 공동-국부화(co-localized)되었음을 나타내었다. 이러한 결과는 뇌 조직에서 대사 표지된 hMSCs가 주입 후 14일 동안 생존하고 뇌졸중 병변으로 이동할 수 있음을 나타내는 것이다. 그러나, DMCNs 20 및 FITC-HNA로부터의 어떠한 형광 신호도 대사 표지된 hMSCs가 없는 뇌졸중 유도된 뇌 조직에서는 관찰되지 않았다(도 9B). 이후, 대사 표지된 hMSCs 주입 후 뇌졸중 유도된 뇌 조직의 주입 자리 및 뇌졸중 병변 모두에서 NIRF 신호의 왜곡(distortion)을 FITC-결합된 F4/80 항체를 이용한 대식세포(macrophages)의 직접 염색을 통해 확인하였다(도 8E). 뇌졸중 유도된 뇌 조직 내의 대사 표지된 hMSCs의 주입 자리는 대사 표지된 hMSCs로부터 DMCNs 20의 NIRF 신호가 대식세포로부터의 형광과 부분적으로 공동-국부화되어 나타났다. 그러나, 뇌졸중 병변에서 대사 표지된 hMSCs로부터 DMCNs 20의 NIRF 신호는 FITC-F4/80의 형광과 거의 공동-국부화되지 않았으며, 이는 대식세포가 뇌졸중 병변에서 대사 표지된 hMSCs의 식균작용(phagocytosis)에 의한 의사신호(false signal)를 전혀 나타내지 않음을 나타낸다.
DMCNs 20으로부터의 T2-가중된 MR 신호에 기초하여, 주입 후 1일, 3일, 7일, 10일 및 14일차에 4-테슬라 MR 이미징을 사용하여 대사 표지된 hMSCs의 시공간적 추적(spatiotemporal tracking)을 수행하였다. 도 10A에 나타난 바와 같이, 마우스 PTS 모델 및 정상 마우스 모델 모두에서 주입 1일차에 주입 부위에서 대사 표지된 hMSCs로부터 강한 T2-가중된 MR 신호가 관찰되었다. 이후 마우스 PTS 모델에서 대사 표지된 hMSCs 주입 3일차에 상기 T2-가중된 MR 신호는 점차 뇌졸중 병변으로 이동하였으며, 주입 후 7일, 10일 및 14일에 뇌졸중 병변에서 강한 T2-가중된 MR 신호가 나타났다. 그러나, 정상 마우스 모델에서 대사 표지된 hMSCs로부터의 T2-가중된 MR 신호는 어떠한 이동도 없이 주입 부위에서 점차 감소하였다. 마우스 PTS 모델에서 상대적인 T2-가중된 MR 신호 또한 T2-가중된 MR 신호가 뇌졸중 병변에서 점차 증가하였으며, 주입 후 7일, 10일 및 14일에는 뇌졸중 병변에 주로 국부화되었다(도 8B). 종합적으로, 마우스 PTS 모델의 주입 자리로부터의 T2-가중된 MR 신호는 주입 후 7일, 10일 및 14일에 주입 부위에서 점차 감소하였다. 이는 NIRF 이미징 결과와 고도로 관련되었으며, 대사 표지된 hMSCs가 생체 내 NIRF 이미징은 물론 MR 이미징에 의해 성공적으로 추적될 수 있음을 뒷받침한다.
마지막으로, 뇌졸중-유도된 뇌 조직을 프러시안 블루 염색 키트로 염색하여 T2-가중된 MR 신호가 뇌졸중-유도된 뇌 내의 대사 표지된 hMSCs로부터 유래하는지 여부를 확인하였다. 대사 표지된 hMSCs를 처리하지 않은 뇌졸중-유도된 뇌 조직과 비교하여(도 9C), 대사 표지된 hMSCs로 처리한 뇌졸중-유도된 뇌의 프러시안 블루 염색 이미지는 뇌 조직 내에서 Fe3O4 NPs의 존재를 나타내었다(도 10C 및 10D). 또한, 뇌 조직의 확대된 프러시안 블루 염색 이미지는 Fe3O4 NPs가 뇌졸중 병변(도 10C 및 10D의 #1), 해마(도 10C 및 10D의 #2) 및 주입 부위(도 10C 및 10D의 #3)에 분포되었음을 명확히 나타내었다. 대사 표지 방법에 기초한 hMSCs의 성공적인 비침습적 및 정확한 추적은 생체 내 NIRF 이미징 및 T2-가중된 MR 이미징과 조합하여 비독성(non-toxic), 높은 감도(high sensitivity) 및 높은 공간 분해능(high spatial resolution)을 제공하므로 유망한 잠재력을 나타낸다.
<결론>
본 발명에서, hMSCs의 대사 표지 전략은 마우스 PTS 모델의 뇌 내에 주입 후 NIRF 및 T2-가중된 MR 이중 모드 이미징에 기초한 hMSCs의 이동 및 분포를 정확히 모니터할 수 있도록 허용하였다. 최적의 Ac4ManNAz 농도에서, hMSCs는 Ac4ManNAz 처리에 의해 대사 조작되어 세포 표면에 아자이드 그룹을 형성하였다. 이후, Ac4ManNAz 처리에 의해 외생적으로 형성된 이들 아자이드 그룹은 생물직교 클릭 화학을 통해 DMCNs 20으로 화학적으로 표지되었다. 대사 표지 전략은 세포 배양 조건에서 Ac4ManNAz 및 DMCNs 20의 처리 농도 의존적으로 hMSCs의 표지 효율을 조절할 수 있었다. 나아가, DMCNs 20으로 대사 표지된 hMSCs는, 세포 생존율, 증식, 및 분화와 같은 줄기 세포 성질에 어떠한 유의미한 변화없이, 막 전환 기전을 통해 섭취된 DMCNs 20에 의한 연장된 표지 효과를 나타내었다. 최종적으로, 마우스 PTS 모델의 뇌 내의 주입된 대사 표지된 hMSCs는 주입 부위에서 높은 대비를 나타내었으며, 이는 이중 NIRF 및 T2-가중된 MR 이미징에 의해 14일 동안 비침습적으로 hMSCs를 추적할 수 있도록 허용하였다. 나아가, 이중 NIRF 및 T2-가중된 MR 이미징을 사용하여 14일 동안 뇌 내에서 주입된 부위로부터 뇌졸중 병변으로의 대사 표지된 hMSCs의 이동을 추적할 수 있었다. 이는 hMSCs의 대사 표지 전략이 줄기 세포 치료법에 기초하여 뇌졸중 뿐만 아니라 파킨슨 질환을 포함한 다양한 신경퇴행성 질환을 위한 차세대 치료법을 최적화하는데 가치있는 정보를 제공할 수 있음을 나타내는 것이다.

Claims (23)

  1. 올레산으로 표면 개질된, 평균 직경 15 내지 25 nm 크기를 갖는 2개 이상의 산화철 나노입자가 2개 이상의 키토산 글리콜 나노입자에 의해 둘러싸여(encapsulated) 형성된, 평균 직경 200 내지 300 nm의 크기를 가지며 산화철 함량은 13 내지 18%인, 복합 나노입자.
  2. 제1항에 있어서,
    생리활성용액 조건에서 14일까지 편차 10% 이내의 크기 변화를 나타내는 것인, 복합 나노입자.
  3. 제1항에 있어서,
    평균 직경 15 nm 미만 또는 25 nm 초과의 크기를 갖는 산화철 나노입자를 동등 또는 ±10% 함량으로 포함하는 복합 나노입자에 비해 증가된 자기공명영상(magnetic resonance imaging; MRI) 신호를 나타내는 것인, 복합 나노입자.
  4. 제1항에 있어서,
    동일 크기의 산화철 나노입자를 동일한 양으로 사용하는 것에 비해 10 내지 30배 증가된 T2-가중된 신호 크기를 나타내는 것인, 복합 나노입자.
  5. 올레산으로 표면 개질된, 평균 직경 15 내지 25 nm 크기를 갖는 2개 이상의 산화철 나노입자가 2개 이상의 키토산 글리콜 나노입자에 의해 둘러싸여(encapsulated) 형성된, 평균 직경 200 내지 300 nm의 크기를 가지며 산화철 함량은 13 내지 18%인, 복합 나노입자를 포함하는 줄기세포 표지용 조성물로서,
    상기 키토산 글리콜 나노입자는, 표면에 결합된 사이클로알킨기를 포함하여, 대사 당쇄 조작을 통해 도입된 아지드기를 표면에 포함하는 줄기세포에 생물 직교성 무동 클릭화학을 통해 결합 가능한 것인, 줄기세포 표지용 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 키토산 글리콜 나노입자는 표면에 하기 화학식 4 내지 16의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물이 결합된 것인, 조성물:
    [화학식 4]
    Figure pat00017

    [화학식 5]
    Figure pat00018

    [화학식 6]
    Figure pat00019

    [화학식 7]
    Figure pat00020

    [화학식 8]
    Figure pat00021

    [화학식 9]
    Figure pat00022

    [화학식 10]
    Figure pat00023

    [화학식 11]
    Figure pat00024

    [화학식 12]
    Figure pat00025

    [화학식 13]
    Figure pat00026

    [화학식 14]
    Figure pat00027

    [화학식 15]
    Figure pat00028

    [화학식 16]
    Figure pat00029
    .
  7. 올레산으로 표면 개질된, 평균 직경 15 내지 25 nm 크기를 갖는 2개 이상의 산화철 나노입자가 2개 이상의 키토산 글리콜 나노입자에 의해 둘러싸여(encapsulated) 형성된, 평균 직경 200 내지 300 nm의 크기를 가지며 산화철 함량은 13 내지 18%인, 복합 나노입자; 및
    분리된 줄기세포;를 포함하는 뇌졸중 병변 검출용 조성물로서,
    상기 키토산 글리콜 나노입자는 표면에 결합된 사이클로알킨기를 포함하며, 분리된 줄기세포는 대사 당쇄 조작을 통해 도입된 아지드기를 표면에 포함하여 생물 직교성 무동 클릭화학을 통해 서로 결합가능한 것인, 뇌졸중 병변 검출용 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 키토산 글리콜 나노입자는 형광분자로 추가로 표지되어 다중 검출 가능한 것인, 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 형광분자는 450 내지 800 nm 파장 범위에서 흡수 피크를, 550 내지 1000 nm 파장 범위에서 형광 피크를 갖는 것인, 조성물.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 줄기세포는 하기 화학식 1 내지 3의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물로 처리하여 표면에 아지드기가 도입된 것인, 조성물:
    [화학식 1]
    Figure pat00030

    [화학식 2]
    Figure pat00031

    [화학식 3]
    Figure pat00032
    .
  11. 제7항에 있어서,
    상기 줄기세포는 테트라아세틸화 N-아지도아세틸-D-만노스아민(Ac4ManNAz)를 처리하여 세포의 표면에 생성된 아지드기를 갖는 비천연 시알산을 포함하는 것인, 조성물.
  12. 생체 내 주입 시, 추적이 가능한 줄기세포로서,
    올레산으로 표면 개질된, 평균 직경 15 내지 25 nm 크기를 갖는 2개 이상의 산화철 나노입자가 2개 이상의 키토산 글리콜 나노입자에 의해 둘러싸여(encapsulated) 형성된, 평균 직경 200 내지 300 nm의 크기를 가지며 산화철 함량은 13 내지 18%인, 복합 나노입자; 및 분리된 줄기세포;를 포함하며,
    상기 키토산 글리콜 나노입자는 표면에 결합된 사이클로알킨기를 포함하고, 분리된 줄기세포는 대사 당쇄 조작을 통해 도입된 아지드기를 표면에 포함하여 생물 직교성 무동 클릭화학을 통해 서로 결합된 것인, 줄기세포.
  13. 제12항에 있어서,
    생체 내 주입 시 뇌졸중 병변을 특이적으로 표적화하는 것인, 줄기세포.
  14. 제12항에 있어서,
    복합 나노입자와 결합되지 않은 줄기세포와 동일한 수준의 세포적 특성을 유지하는 것인, 줄기세포.
  15. 올레산으로 표면 개질된, 평균 직경 15 내지 25 nm 크기를 갖는 2개 이상의 산화철 나노입자가 2개 이상의 키토산 글리콜 나노입자에 의해 둘러싸여(encapsulated) 형성된, 평균 직경 200 내지 300 nm의 크기를 가지며 산화철 함량은 13 내지 18%인, 복합 나노입자; 및
    분리된 줄기세포;를 포함하는 뇌졸중 병변 검출용 조성물로서,
    상기 키토산 글리콜 나노입자는 표면에 결합된 사이클로알킨기를 포함하며, 분리된 줄기세포는 대사 당쇄 조작을 통해 도입된 아지드기를 표면에 포함하여 생물 직교성 무동 클릭화학을 통해 서로 결합가능한 것인, 뇌졸중 병변 검출용 조성물.
  16. 올레산으로 표면 개질된, 평균 직경 15 내지 25 nm 크기를 갖는 2개 이상의 산화철 나노입자가 2개 이상의 키토산 글리콜 나노입자에 의해 둘러싸여(encapsulated) 형성된, 평균 직경 200 내지 300 nm의 크기를 가지며 산화철 함량은 13 내지 18%인, 복합 나노입자를 줄기세포에 처리하여 표지하는 단계를 포함하는, 자기공명영상에 의해 추적 가능한 줄기세포의 제조방법으로서,
    상기 키토산 글리콜 나노입자는 표면에 결합된 사이클로알킨기를 포함하며, 줄기세포는 대사 당쇄 조작을 통해 도입된 아지드기를 표면에 포함하여 생물 직교성 무동 클릭화학을 통해 서로 결합하는 것인, 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 키토산 글리콜 나노입자는 형광분자로 추가로 표지되어 다중 검출 가능한 것인, 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 형광분자는 450 내지 800 nm 파장 범위에서 흡수 피크를, 550 내지 1000 nm 파장 범위에서 형광 피크를 갖는 것인, 방법.
  19. 제16항에 있어서,
    상기 줄기세포는 하기 화학식 1 내지 3의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물로 처리하여 표면에 아지드기가 도입된 것인, 방법:
    [화학식 1]
    Figure pat00033

    [화학식 2]
    Figure pat00034

    [화학식 3]
    Figure pat00035
    .
  20. 제16항에 있어서,
    상기 줄기세포는 테트라아세틸화 N-아지도아세틸-D-만노스아민(Ac4ManNAz)를 처리하여 세포의 표면에 생성된 아지드기를 갖는 비천연 시알산을 포함하는 것인, 방법.
  21. 제16항에 있어서,
    상기 키토산 글리콜 나노입자는 표면에 하기 화학식 4 내지 16의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물이 결합된 것인, 방법:
    [화학식 4]
    Figure pat00036

    [화학식 5]
    Figure pat00037

    [화학식 6]
    Figure pat00038

    [화학식 7]
    Figure pat00039

    [화학식 8]
    Figure pat00040

    [화학식 9]
    Figure pat00041

    [화학식 10]
    Figure pat00042

    [화학식 11]
    Figure pat00043

    [화학식 12]
    Figure pat00044

    [화학식 13]
    Figure pat00045

    [화학식 14]
    Figure pat00046

    [화학식 15]
    Figure pat00047

    [화학식 16]
    Figure pat00048
    .
  22. 제16항에 있어서,
    상기 줄기세포에 표지된 복합 나노입자로부터 측정된 MR 팬텀 이미지에 기초하여 산출된 r2 완화도는 200 내지 1000 /mM·sec인 것인, 방법.
  23. 올레산으로 표면 개질된, 평균 직경 15 내지 25 nm 크기를 갖는 2개 이상의 산화철 나노입자가 2개 이상의 키토산 글리콜 나노입자에 의해 둘러싸여(encapsulated) 형성된, 평균 직경 200 내지 300 nm의 크기를 가지며 산화철 함량은 13 내지 18%인, 복합 나노입자를 주입하고자 하는 줄기세포에 처리하여 표지하는 단계;
    상기 복합 나노입자로 표지된 줄기세포를 개체에 주입하는 단계; 및
    상기 줄기세포를 주입한 개체로부터 자기공명영상(magnetic resonance imaging; MRI) 신호를 측정하는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 개체의 생체 내 주입된 줄기세포를 추적하는 방법으로서,
    상기 키토산 글리콜 나노입자는 표면에 결합된 사이클로알킨기를 포함하며, 줄기세포는 대사 당쇄 조작을 통해 도입된 아지드기를 표면에 포함하여 생물 직교성 무동 클릭화학을 통해 서로 결합하는 것인, 방법.
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