KR20210007005A - Immunodetection kit comprising conjugate of single-stranded DNA-binding protein and signal generating material and immunodetective method by using the same - Google Patents
Immunodetection kit comprising conjugate of single-stranded DNA-binding protein and signal generating material and immunodetective method by using the same Download PDFInfo
- Publication number
- KR20210007005A KR20210007005A KR1020210000914A KR20210000914A KR20210007005A KR 20210007005 A KR20210007005 A KR 20210007005A KR 1020210000914 A KR1020210000914 A KR 1020210000914A KR 20210000914 A KR20210000914 A KR 20210000914A KR 20210007005 A KR20210007005 A KR 20210007005A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- present
- aptamer
- conjugate
- antigen
- immunodetection
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/544—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being organic
- G01N33/548—Carbohydrates, e.g. dextran
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
- G01N33/54386—Analytical elements
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/16—Aptamers
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
본 발명은 면역 검출용 접합체, 이를 포함하는 면역 검출 센서, 이를 사용한 면역 검출 방법 및 면역 검출 호 증폭 방법에 관한 것으로서, 구체적으로 압타머와 검출 대상 항원과의 특이적 결합 부위 이외의 영역에서 상기 압타머와 특이적으로 결합하는 단일 가닥 DNA 결합 단백질과 신호발생물질이 결합된 면역 검출용 접합체 및 이를 사용하는 것을 기술적 특징으로 한다.The present invention relates to a conjugate for immunity detection, an immunity detection sensor comprising the same, an immunity detection method using the same, and a method of amplifying an immunity detection call, specifically, the pressure in a region other than the specific binding site between the aptamer and the antigen to be detected. A conjugate for immune detection in which a single-stranded DNA-binding protein that specifically binds to a timer and a signal generating substance are combined, and a technical feature of using the same.
항체-항원 반응을 신속하게 측정하는 방법으로 LFA (lateral flow assay) 시스템이 많이 사용된다. LFA는 일반적으로 액체 시료가 모세관 현상으로 흐를 수 있는 멤브레인에 항체가 고정되어 있고, 멤브레인의 상류층에는 접합체 패드와 시료 패드가 연결되어 있고, 멤브레인의 하류층에 흡수 패드가 연결되어 있다. 상기 접합체 패드에는 시료물질과 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 고정화된 신호발생물질, 예컨데 금 나노입자 접합체가 건조되어 있다. 상기 멤브레인에는 시료물질과 특이적으로 반응하는 항체 및 금 나노입자에 고정화된 항체와 결합할 수 있는 물질이 각각 다른 위치에 고정화되어 있다. 상기 시료물질과 특이적으로 결합할 수 있는, 멤브레인에 고정화된 항체와 금 나노입자에 고정화된 항체는 시료물질에 대해 샌드위치 형태로 결합될 수 있도록 구성된다. 상기 흡수패드는 액체시료를 잘 흡수할 수 있는 물질로 구성된다. 이와 같은 LFA 장치에 액체 시료용액을 샘플 패드에 떨어뜨리면, 시료가 존재할 경우 시료에 선택성을 가지는 항체-금 나노입자와 멤브레인에 고정화된 항체가 샌드위치 형태로 결합되어 상기 항체가 고정화된 멤브레인 위치에 육안으로 확인할 수 있는 밴드를 형성하게 된다. LFA (lateral flow assay) system is widely used as a method to quickly measure the antibody-antigen response. In the LFA, an antibody is generally immobilized on a membrane through which a liquid sample can flow through a capillary phenomenon, a conjugate pad and a sample pad are connected to the upper layer of the membrane, and an absorption pad is connected to the downstream layer of the membrane. In the conjugate pad, a signal generating material, for example, a gold nanoparticle conjugate, to which an antibody capable of specifically binding to a sample material is immobilized, is dried. In the membrane, an antibody specifically reacting with a sample material and a material capable of binding to an antibody immobilized on gold nanoparticles are immobilized at different positions. The antibody immobilized on the membrane and the antibody immobilized on the gold nanoparticles capable of specifically binding to the sample material are configured to be bonded to the sample material in a sandwich form. The absorption pad is made of a material capable of absorbing a liquid sample well. When a liquid sample solution is dropped onto the sample pad in such an LFA device, antibody-gold nanoparticles having selectivity to the sample and the antibody immobilized on the membrane are bonded in a sandwich form when the sample is present, and the antibody is visually placed at the immobilized membrane. A band that can be identified is formed.
그러나, 정교한 기기를 필요로 하는 HPLC, PCR와 같은 다른 방법들과 달리, 종래의 LFA 방법으로 측정할 수 있는 감도는 항원 단백질 약 1ng/mL정도로서, 더 높은 감도를 요구하는 시료의 경우 측정하기 어려운 단점이 있어 특히 초기에 빠른 검출이 필요한 감염성 질병에 대한 사용이 제한적이었다. 또한 검출하고자 하는 타겟물질(항원)을 동물의 몸에 주입하여 생체의 면역시스템을 통해 만들어지는 항체를 확보한 후 정제 과정을 거치기 때문에 시간이 많이 들고 고비용이다. 또한 일반적으로 항체는 그 크기가 100kDa 이상인 매우 큰 단백질이기 때문에 전기화학 기반 등의 바이오센서로 응용 시에 신호 검출 부분에 있어 제약이 있고, 열 안전성이 DNA나 다른 화학물질에 비해 현저히 떨어지는 문제가 있어 일정한 품질 생산이 어렵고 높은 비용이 든다. 그리고 항체와 신호발생물질의 접합 과정에서 항체 기능 약화되고, 항체와 항원의 결합 한계로 인하여 신호 증폭에 한계가 있다. However, unlike other methods such as HPLC and PCR, which require sophisticated equipment, the sensitivity that can be measured by the conventional LFA method is about 1 ng/mL of antigen protein, which is difficult to measure in the case of samples requiring higher sensitivity. Due to its drawbacks, its use was limited, especially for infectious diseases that require rapid detection in the early stages. In addition, since a target substance (antigen) to be detected is injected into the body of an animal to secure an antibody produced through the body's immune system and then undergo a purification process, it is time consuming and expensive. In addition, since antibodies are generally very large proteins with a size of 100 kDa or more, there are limitations in signal detection when applied to biosensors such as electrochemistry, and thermal stability is significantly lower than that of DNA or other chemicals. It is difficult and expensive to produce a certain quality. In addition, the function of the antibody is weakened during the conjugation of the antibody and the signal generating material, and signal amplification is limited due to the limitation of binding between the antibody and antigen.
이러한 문제점들을 개선하기 위한 새로운 감지물질로서 다양한 타겟물질에 대해 특이적으로 높은 친화도를 보이는 기술이 요구된다.As a new sensing material to improve these problems, a technology showing a specific high affinity for various target materials is required.
본 발명은 항체의 생산에 소요되는 시간과 비용을 효과적으로 감소시키면서, 항체와 신호발생물질의 접합 과정에서 발생하는 항체 기능 약화를 방지하고 항체와 항원의 결합 한계로 인한 신호 증폭 한계를 방지하여 효과적으로 항원을 검출할 수 있는 면역 검출 방법을 제공하고자 한다.The present invention effectively reduces the time and cost required for the production of antibodies, prevents the weakening of the antibody function that occurs during the conjugation process of the antibody and the signal generating substance, and prevents the limitation of signal amplification due to the limitation of binding between the antibody and the antigen. To provide an immunity detection method capable of detecting
상기 상술한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 압타머와 검출 대상 항원과의 특이적 결합 부위 이외의 영역에서 상기 압타머와 특이적으로 결합하는 단일 가닥 DNA 결합 단백질과 신호발생물질이 결합된 면역 검출용 접합체를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention is a single-stranded DNA-binding protein that specifically binds to the aptamer in a region other than the specific binding site between the aptamer and the antigen to be detected, and the immunity of the signal generating substance. Provides a conjugate for detection.
본 발명의 일 태양에 따르면, 본 발명의 면역 검출용 접합체의 상기 항원은 자가항체, 리간드, 천연 추출물, 펩타이드, 단백질, 금속 이온, 합성 약물, 천연 약물, 대사체, 유전체, 바이러스 및 바이러스에 의한 생성 물질, 및 박테리아 및 바이러스에 의한 생성 물질로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.According to an aspect of the present invention, the antigen of the conjugate for immune detection of the present invention is an autoantibody, a ligand, a natural extract, a peptide, a protein, a metal ion, a synthetic drug, a natural drug, a metabolite, a genome, a virus and a virus. It may be any one or more selected from the group consisting of a produced substance, and a substance produced by bacteria and viruses.
본 발명의 일 태양에 따르면, 본 발명의 면역 검출용 접합체는 상기 압타머에 복수 개의 면역 검출용 접합체가 결합할 수 있다.According to an aspect of the present invention, in the conjugate for immune detection of the present invention, a plurality of conjugates for immune detection may be bound to the aptamer.
본 발명의 일 태양에 따르면, 본 발명의 면역 검출용 접합체의 상기 압타머는 서열 번호 1 내지 4 중에서 선택된 염기서열로 표시되는 것일 수 있다.According to an aspect of the present invention, the aptamer of the conjugate for immune detection of the present invention may be represented by a nucleotide sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 4.
본 발명의 일 태양에 따르면, 본 발명의 면역 검출용 접합체의 상기 단일 가닥 DNA 결합 단백질은 대장균의 SSB (EcoSSB-WT), 마이코박테리움 투베르쿨로시스, 데이노코커스 라디오두란의 SSB, 써머스 써모필리스의 SSB, 설폴로부스 솔파타리쿠스의 SSB, 인간 복제 단백질 A 70 kDa 서브유닛 (RPA70) 단편, 인간 복제 단백질 A 32 kDa 서브유닛 (RPA32) 단편, 사카로마이세스 세레비지애의 RPA70, 사카로마이세스 세레비지애의 CDC13 SSB, 대장균의 Primosomal 복제 단백질 N (PriB), 애기 장대(Arabidopsis thaliana)의 PriB, 가설 단백질 At4g28440, T4로부터의 SSB (gp32) 및 RB69로부터의 SSB (gp32)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.According to an aspect of the present invention, the single-stranded DNA-binding protein of the conjugate for immune detection of the present invention is SSB of Escherichia coli (EcoSSB-WT), Mycobacterium tuberculosis, SSB of Deinococcus radioduran, and summers. SSB of Thermophilis, SSB of Sulfolobus solpataricus, fragment of human replicating
본 발명의 일 태양에 따르면, 본 발명의 면역 검출용 접합체의 상기 신호발생물질은 금속 나노입자, 퀀텀닷(quantum dot) 나노입자, 자기 나노입자, 효소, 효소 기질, 효소반응 생성물질, 흡광물질, 형광물질 및 발광물질로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상 일 수 있다.According to an aspect of the present invention, the signal generating material of the conjugate for immune detection of the present invention is a metal nanoparticle, a quantum dot nanoparticle, a magnetic nanoparticle, an enzyme, an enzyme substrate, an enzyme reaction product, a light absorbing material. , It may be any one or more selected from the group consisting of a fluorescent material and a light emitting material.
본 발명의 일 태양에 따르면, 본 발명의 면역 검출용 접합체의 상기 신호발생물질은 소 혈청 알부민, 탈지유, 카제인, 대두-생선 유래 성분 및 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상으로 표면이 둘러싸여진 것일 수 있다.According to an aspect of the present invention, the signal generating material of the conjugate for immune detection of the present invention is surrounded by one or more selected from the group consisting of bovine serum albumin, skim milk, casein, soybean-fish-derived components, and polyethylene glycol. Can be.
본 발명의 또 태양에 따르면, 지지체; 상기 지지체에 고정되고 검출 대상 항원에 특이적으로 결합하는 리셉터; 상기 항원에 특이적인 압타머; 및 상기 압타머와 검출 대상 항원과의 특이적 결합 부위 이외의 영역에서 상기 압타머와 특이적으로 결합하는 단일 가닥 DNA 결합 단백질과 신호발생물질이 결합된 면역 검출용 접합체를 포함하는 면역 검출 센서를 제공한다.According to another aspect of the present invention, a support; A receptor immobilized on the support and specifically binding to an antigen to be detected; An aptamer specific for the antigen; And a conjugate for immune detection in which a single-stranded DNA-binding protein specifically binding to the aptamer and a signal generating substance is bound in a region other than a specific binding site between the aptamer and the antigen to be detected. to provide.
본 발명의 일 태양에 따르면, 본 발명의 면역 검출 센서의 상기 항원은 자가항체, 리간드, 천연 추출물, 펩타이드, 단백질, 금속 이온, 합성 약물, 천연 약물, 대사체, 유전체, 바이러스 및 바이러스에 의한 생성 물질, 및 박테리아 및 바이러스에 의한 생성 물질로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.According to one aspect of the present invention, the antigen of the immune detection sensor of the present invention is produced by autoantibodies, ligands, natural extracts, peptides, proteins, metal ions, synthetic drugs, natural drugs, metabolites, genomes, viruses and viruses. It may be any one or more selected from the group consisting of substances, and substances produced by bacteria and viruses.
본 발명의 일 태양에 따르면, 상기 압타머는 서열 번호 1 내지 4 중에서 선택된 염기서열로 표시되는 것일 수 있다.According to one aspect of the present invention, the aptamer may be represented by a nucleotide sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 4.
본 발명의 일 태양에 따르면, 본 발명의 면역 검출 센서의 상기 단일 가닥 DNA 결합 단백질은 대장균의 SSB (EcoSSB-WT), 마이코박테리움 투베르쿨로시스, 데이노코커스 라디오두란의 SSB, 써머스 써모필리스의 SSB, 설폴로부스 솔파타리쿠스의 SSB, 인간 복제 단백질 A 70 kDa 서브유닛 (RPA70) 단편, 인간 복제 단백질 A 32 kDa 서브유닛 (RPA32) 단편, 사카로마이세스 세레비지애의 RPA70, 사카로마이세스 세레비지애의 CDC13 SSB, 대장균의 Primosomal 복제 단백질 N (PriB), 애기 장대(Arabidopsis thaliana)의 PriB, 가설 단백질 At4g28440, T4로부터의 SSB (gp32) 및 RB69로부터의 SSB (gp32)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.According to one aspect of the present invention, the single-stranded DNA-binding protein of the immune detection sensor of the present invention is SSB of Escherichia coli (EcoSSB-WT), Mycobacterium tuberculosis, SSB of Deinococcus radioduran, and thermos thermo Philis SSB, Sulfolobus solpataricus SSB, human replicating
본 발명의 일 태양에 따르면, 본 발명의 면역 검출 센서의 상기 신호발생물질은 금속 나노입자, 퀀텀닷(quantum dot) 나노입자, 자기 나노입자, 효소, 효소 기질, 효소반응 생성물질, 흡광물질, 형광물질 및 발광물질로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.According to an aspect of the present invention, the signal generating material of the immune detection sensor of the present invention is a metal nanoparticle, a quantum dot nanoparticle, a magnetic nanoparticle, an enzyme, an enzyme substrate, an enzyme reaction product, a light absorbing material, It may be any one or more selected from the group consisting of a fluorescent material and a light emitting material.
본 발명의 일 태양에 따르면, 본 발명의 면역 검출 센서의 상기 신호발생물질은 소 혈청 알부민, 탈지유, 카제인, 대두-생선 유래 성분 및 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상으로 표면이 둘러싸여진 것일 수 있다.According to an aspect of the present invention, the signal generating material of the immune detection sensor of the present invention is surrounded by one or more selected from the group consisting of bovine serum albumin, skim milk, casein, soybean-fish-derived components, and polyethylene glycol. I can.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, S1) 검출 대상 항원에 특이적인 압타머와 시료를 혼합하여 시료 내 항원과 압타머를 결합시키는 단계; S2) 검출 대상 항원에 특이적으로 결합하는 리셉터에 상기에서 얻은 항원-압타머 결합체를 접촉시켜 상기 리셉터와 상기 항원-압타머 결합체를 결합시키는 단계; 및 S3) 상기 압타머와 검출 대상 항원과의 특이적 결합 부위 이외의 영역에서 상기 압타머와 특이적으로 결합하는 단일 가닥 DNA 결합 단백질과 신호발생물질이 결합된 면역 검출용 접합체를 상기에서 얻은 리셉터-항원-압타머 결합체에 접촉시켜, 상기 상기 면역 검출용 접합체와 압타머를 결합시키는 단계를 포함하는 면역 검출 방법을 제공한다.According to another aspect of the present invention, S1) mixing the sample with an aptamer specific to an antigen to be detected and binding the antigen and the aptamer in the sample; S2) binding the receptor and the antigen-aptamer conjugate by contacting the antigen-aptamer conjugate obtained above with a receptor that specifically binds to the antigen to be detected; And S3) a receptor obtained above to obtain a conjugate for immune detection in which a single-stranded DNA-binding protein and a signal generating substance specifically binds the aptamer in a region other than the specific binding site between the aptamer and the antigen to be detected. -Provides an immune detection method comprising the step of contacting the antigen-aptamer conjugate, and binding the aptamer and the immune detection conjugate.
본 발명의 일 태양에 따르면, 본 발명의 면역 검출 방법의 상기 항원은 자가항체, 리간드, 천연 추출물, 펩타이드, 단백질, 금속 이온, 합성 약물, 천연 약물, 대사체, 유전체, 바이러스 및 바이러스에 의한 생성 물질, 및 박테리아 및 바이러스에 의한 생성 물질로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.According to one aspect of the present invention, the antigen of the immunodetection method of the present invention is produced by autoantibodies, ligands, natural extracts, peptides, proteins, metal ions, synthetic drugs, natural drugs, metabolites, genomes, viruses and viruses. It may be any one or more selected from the group consisting of substances, and substances produced by bacteria and viruses.
본 발명의 일 태양에 따르면, 상기 S3) 단계는 상기 면역 검출용 접합체의 복수 개를 압타머와 결합시키는 것일 수 있다.According to an aspect of the present invention, the step S3) may be to combine a plurality of conjugates for immune detection with an aptamer.
본 발명의 일 태양에 따르면, 본 발명의 면역 검출 방법의 상기 압타머는 서열 번호 1 내지 4 중에서 선택된 염기서열로 표시되는 것일 수 있다.According to an aspect of the present invention, the aptamer of the immunodetection method of the present invention may be represented by a nucleotide sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 4.
본 발명의 일 태양에 따르면, 본 발명의 면역 검출 방법의 상기 단일 가닥 DNA 결합 단백질은 대장균의 SSB (EcoSSB-WT), 마이코박테리움 투베르쿨로시스, 데이노코커스 라디오두란의 SSB, 써머스 써모필리스의 SSB, 설폴로부스 솔파타리쿠스의 SSB, 인간 복제 단백질 A 70 kDa 서브유닛 (RPA70) 단편, 인간 복제 단백질 A 32 kDa 서브유닛 (RPA32) 단편, 사카로마이세스 세레비지애의 RPA70, 사카로마이세스 세레비지애의 CDC13 SSB, 대장균의 Primosomal 복제 단백질 N (PriB), 애기 장대(Arabidopsis thaliana)의 PriB, 가설 단백질 At4g28440, T4로부터의 SSB (gp32) 및 RB69로부터의 SSB (gp32)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.According to an aspect of the present invention, the single-stranded DNA-binding protein of the immunodetection method of the present invention is SSB of Escherichia coli (EcoSSB-WT), Mycobacterium tuberculosis, SSB of Deinococcus radioduran, and thermos thermo Philis SSB, Sulfolobus solpataricus SSB, human replicating
본 발명의 일 태양에 따르면, 본 발명의 면역 검출 방법의 상기 신호발생물질은 금속 나노입자, 퀀텀닷(quantum dot) 나노입자, 자기 나노입자, 효소, 효소 기질, 효소반응 생성물질, 흡광물질, 형광물질 및 발광물질로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.According to one aspect of the present invention, the signal generating material of the immunodetection method of the present invention is a metal nanoparticle, a quantum dot nanoparticle, a magnetic nanoparticle, an enzyme, an enzyme substrate, an enzyme reaction product, a light absorbing material, It may be any one or more selected from the group consisting of a fluorescent material and a light emitting material.
본 발명의 일 태양에 따르면, 본 발명의 면역 검출 방법의 상기 신호발생물질은 소 혈청 알부민, 탈지유, 카제인, 대두-생선 유래 성분 및 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상으로 표면이 둘러싸여진 것일 수 있다.According to an aspect of the present invention, the signal generating material of the immunodetection method of the present invention is surrounded by one or more selected from the group consisting of bovine serum albumin, skim milk, casein, soybean-fish-derived components, and polyethylene glycol. I can.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 압타머와 검출 대상 항원과의 특이적 결합 부위 이외의 영역에서 상기 압타머와 특이적으로 결합하는 단일 가닥 DNA 결합 단백질과 신호발생물질이 결합된 면역 검출용 접합체를 압타머와 결합시키는 단계를 포함하는 면역 검출 신호 증폭 방법을 제공한다.According to another aspect of the present invention, a conjugate for immune detection in which a single-stranded DNA-binding protein that specifically binds to the aptamer in a region other than a specific binding site between the aptamer and the antigen to be detected and a signal generating material is bound It provides a method of amplifying an immune detection signal comprising the step of combining with an aptamer.
본 발명의 일 태양에 따르면, 본 발명의 면역 검출 신호 증폭 방법의 상기 항원은 자가항체, 리간드, 천연 추출물, 펩타이드, 단백질, 금속 이온, 합성 약물, 천연 약물, 대사체, 유전체, 바이러스 및 바이러스에 의한 생성 물질, 및 박테리아 및 바이러스에 의한 생성 물질로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.According to one aspect of the present invention, the antigen of the method for amplifying the immune detection signal of the present invention is an autoantibody, a ligand, a natural extract, a peptide, a protein, a metal ion, a synthetic drug, a natural drug, a metabolite, a genome, a virus and a virus. It may be any one or more selected from the group consisting of substances produced by, and substances produced by bacteria and viruses.
본 발명의 일 태양에 따르면, 본 발명의 면역 검출 신호 증폭 방법은 상기 면역 검출용 접합체의 복수 개를 압타머와 결합시키는 것일 수 있다.According to an aspect of the present invention, the method of amplifying an immune detection signal of the present invention may be to combine a plurality of the immunity detection conjugates with an aptamer.
본 발명의 일 태양에 따르면, 본 발명의 면역 검출 신호 증폭 방법의 상기 압타머는 서열 번호 1 내지 4 중에서 선택된 염기서열로 표시되는 것일 수 있다.According to an aspect of the present invention, the aptamer of the method for amplifying an immune detection signal of the present invention may be represented by a nucleotide sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 4.
본 발명의 일 태양에 따르면, 본 발명의 면역 검출 신호 증폭 방법의 상기 단일 가닥 DNA 결합 단백질은 대장균의 SSB (EcoSSB-WT), 마이코박테리움 투베르쿨로시스, 데이노코커스 라디오두란의 SSB, 써머스 써모필리스의 SSB, 설폴로부스 솔파타리쿠스의 SSB, 인간 복제 단백질 A 70 kDa 서브유닛 (RPA70) 단편, 인간 복제 단백질 A 32 kDa 서브유닛 (RPA32) 단편, 사카로마이세스 세레비지애의 RPA70, 사카로마이세스 세레비지애의 CDC13 SSB, 대장균의 Primosomal 복제 단백질 N (PriB), 애기 장대(Arabidopsis thaliana)의 PriB, 가설 단백질 At4g28440, T4로부터의 SSB (gp32) 및 RB69로부터의 SSB (gp32)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.According to one aspect of the present invention, the single-stranded DNA binding protein of the method for amplifying the immune detection signal of the present invention is SSB of Escherichia coli (EcoSSB-WT), Mycobacterium tuberculosis, SSB of Deinococcus radioduran, SSB of Thermophilis, SSB of Sulfolobus solpataricus, fragment of human replicating
본 발명의 일 태양에 따르면, 본 발명의 면역 검출 신호 증폭 방법의 상기 신호발생물질은 금속 나노입자, 퀀텀닷(quantum dot) 나노입자, 자기 나노입자, 효소, 효소 기질, 효소반응 생성물질, 흡광물질, 형광물질 및 발광물질로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.According to an aspect of the present invention, the signal generating material of the method for amplifying the immune detection signal of the present invention is a metal nanoparticle, a quantum dot nanoparticle, a magnetic nanoparticle, an enzyme, an enzyme substrate, an enzyme reaction product, and absorbance. It may be any one or more selected from the group consisting of a substance, a fluorescent substance, and a light-emitting substance.
본 발명의 일 태양에 따르면, 본 발명의 면역 검출 신호 증폭 방법의 상기 나노입자는 소 혈청 알부민, 탈지유, 카제인, 대두-생선 유래 성분 및 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상으로 표면이 둘러싸여진 것일 수 있다.According to an aspect of the present invention, the nanoparticles of the method for amplifying the immune detection signal of the present invention are surrounded by one or more selected from the group consisting of bovine serum albumin, skim milk, casein, soybean-fish-derived components, and polyethylene glycol. Can be.
본 발명에 따른 면역 검출용 접합체 및 이를 사용한 면역 검출 방법은 종래 면역 검출용 항체보다 검출 감도 및 특이성이 높아서, 10pg·㎖-1 수준에서도 육안으로 항원이 검출 가능하게 되고, 이를 통해 다양한 항원 및 질병을 간단하고 신속하면서도 경제적으로 진단할 수 있어 유용하게 사용될 수 있다.The conjugate for immune detection according to the present invention and the immunodetection method using the same have higher detection sensitivity and specificity than conventional antibodies for immune detection, so that antigens can be detected visually even at the level of 10 pg·ml -1 , through which various antigens and diseases It can be usefully used because it can be diagnosed simply, quickly and economically.
도 1은 기존의 멤브레인 기반 바이오 센서의 작동 원리를 도식화한 그림이다.
도 2는 본원 발명에 따른 면역 검출용 접합체의 작동 원리를 도식화한 그림이다.
도 3은 본원발명의 일 실시예에 따른 면역 검출용 복합체를 제조하는 사용된 RPA70A 단백질의 (a) 도메인 및 (b) 정제 결과이다.
도 4의 (a)는 카메라로 측정한 발색 이미지이며, (b)는 금 나노입자와 RPA70A 단백질 접합체의 흡광도를 측정한 결과이고, (c)는 나노입자 크기 변화를 나타낸 결과이고, (d)는 타원율 변화 (압타머의 구조 변화)를 나타낸 결과이다.
도 5는 본원발명의 일 실시예에 따른 면역 검출용 복합체가 항원 존재 하에 압타머와 결합된 상태의 TEM 사진이다.
도 6은 (a) 버퍼 내 검출 대상 항원 농도에 따른 검출 확인 결과이고, (b) 비강 액 내 검출 대상 항원 농도에 따른 검출 확인 결과이다. (1) 0, (2) 10, (3) 50, (4) 100, (5) 1000, (6) 10000 pg·mL-1 1 is a diagram schematically illustrating the operating principle of a conventional membrane-based biosensor.
Figure 2 is a diagram schematically showing the operating principle of the immune detection conjugate according to the present invention.
3 is a (a) domain and (b) purification results of the RPA70A protein used to prepare a complex for immune detection according to an embodiment of the present invention.
Figure 4 (a) is a color image measured with a camera, (b) is a result of measuring the absorbance of gold nanoparticles and RPA70A protein conjugate, (c) is a result showing the change in the size of the nanoparticles, (d) Is the result showing the change in the ellipticity (change in the structure of the aptamer).
Figure 5 is a TEM photograph of a state in which the complex for immune detection according to an embodiment of the present invention is bound to an aptamer in the presence of an antigen.
6 is (a) the detection result according to the detection target antigen concentration in the buffer, (b) the detection confirmation result according to the detection target antigen concentration in the nasal fluid. (1) 0, (2) 10, (3) 50, (4) 100, (5) 1000, (6) 10000 pg mL -1
상기 상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명은 압타머와 검출 대상 항원과의 특이적 결합 부위 이외의 영역에서 상기 압타머와 특이적으로 결합하는 단일 가닥 DNA 결합 단백질과 신호발생물질이 결합된 면역 검출용 접합체 및 이를 사용한 면역 검출 방법 등을 제공하는 것을 특징으로 한다. 이하 도면을 참조하여 본 발명을 구체적으로 설명한다.In order to achieve the above-described object, the present invention provides immune detection in which a single-stranded DNA-binding protein that specifically binds to the aptamer and a signal generating substance in a region other than the specific binding site between the aptamer and the antigen to be detected is bound It is characterized by providing a conjugate for use and an immunological detection method using the same. Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to the drawings.
본 발명은, 압타머와 검출 대상 항원과의 특이적 결합 부위 이외의 영역에서 상기 압타머와 특이적으로 결합하는 단일 가닥 DNA 결합 단백질과 신호발생물질이 결합된 면역 검출용 접합체를 제공한다.The present invention provides a conjugate for immune detection in which a single-stranded DNA-binding protein that specifically binds to the aptamer in a region other than a specific binding site between the aptamer and the antigen to be detected and a signal generating substance are bound.
본 발명의 "압타머"는 소정의 표적 분자(예를 들면 항원)에 대한 결합활성을 갖는 핵산 분자를 말한다. 압타머는, 소정의 표적 분자에 대하여 결합함으로써, 소정의 표적 분자의 활성을 저해할 수 있다. 본 발명의 압타머는 DNA, RNA, 변형된(modified) 핵산 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 본 발명의 압타머는 또한, 직쇄상 또는 환상의 형태일 수 있다. 본 발명의 압타머는 이 기술분야에서의 자체 공지의 방법에 의해 화학 합성할 수 있고, 일례로 SELEX 프로세스를 이용하여 선별될 수 있다.The "aptamer" of the present invention refers to a nucleic acid molecule having binding activity to a predetermined target molecule (eg, antigen). The aptamer can inhibit the activity of a predetermined target molecule by binding to a predetermined target molecule. The aptamer of the present invention may be DNA, RNA, modified nucleic acid, or a mixture thereof. The aptamer of the present invention may also be in a linear or cyclic form. The aptamer of the present invention can be chemically synthesized by a method known per se in the art, and for example, can be selected using a SELEX process.
본 명세서에서 언급된 "SELEX 프로세스"란 임의적으로 합성된 DNA 또는 RNA의 집합에서 특정 분자에 대해 높은 결합력을 지니는 DNA 또는 RNA를 선별하여 증폭시킴으로써 해당 분자의 DNA 결합 서열을 알아내는 방법을 말한다 (J.W. Park et al., Chemical Communications, 48:2071, 2012).The term "SELEX process" as referred to herein refers to a method of identifying the DNA binding sequence of the molecule by selecting and amplifying DNA or RNA that has high binding power to a specific molecule from a set of randomly synthesized DNA or RNA (JW Park et al., Chemical Communications, 48:2071, 2012).
본 발명의 압타머의 길이는 특별히 한정되지 않고, 통상 약 15 내지 200 뉴클레오티드일 수 있지만, 예컨대 약 100 뉴클레오티드 이하이고, 바람직하게는 약 80 뉴클레오티드 이하이며, 본 발명의 일 구체예에서 본 발명의 압타머의 길이는 특별히 한정되지 않으나, 대략 70 내지 80 뉴클레오티드 내외로 개발될 수 있다. 총 뉴클레오티드의 수가 적으면, 화학합성 및 대량 생산이 보다 용이하고, 또한 비용면에서의 장점도 크다. 또한 화학수식도 용이하고, 생체내 안정성도 높으며, 독성도 낮다고 생각된다. The length of the aptamer of the present invention is not particularly limited, and may be usually about 15 to 200 nucleotides, but for example, it is about 100 nucleotides or less, preferably about 80 nucleotides or less, and in one embodiment of the present invention, the pressure of the present invention is The length of the timer is not particularly limited, but may be developed in the range of about 70 to 80 nucleotides. When the total number of nucleotides is small, chemical synthesis and mass production are easier, and the cost advantage is also large. In addition, it is considered that chemical formula is easy, stability in vivo is high, and toxicity is low.
본원발명의 일 실시예에 따른 면역 검출용 복합체와 특이적으로 결합하는 압타머는 다음의 서열을 가질 수 있다. The aptamer specifically binding to the complex for immune detection according to an embodiment of the present invention may have the following sequence.
본 발명의 압타머에 포함되는 각 뉴클레오티드는 각각, 동일 또는 상이하여, 리보오스(예, 피리미딘 뉴클레오티드의 리보오스)의 2'부위에서 히드록실기를 포함하는 뉴클레오티드 (즉, 미치환인 뉴클레오티드)이거나, 또는 리보오스의 2'부위에서, 히드록실기가, 임의의 원자 또는 기로 치환되어 있는 뉴클레오티드일 수 있다. 이러한 임의의 원자 또는 기로서는, 예컨대 수소원자, 불소원자 또는 -O- 알킬기(예, -O-Me기), -O-아실기(예,-OCHO기), 아미노기(예,-NH2기)로 치환되어 있는 뉴클레오티드를 들 수 있다. 본 발명의 압타머는 또한 적어도 1 종(예, 1, 2, 3 또는 4종)의 뉴클레오티드가, 리보오스의 2'부위에서, 히드록실기, 또는 전술한 임의의 원자 또는 기, 예컨대 수소원자, 불소원자, 히드록실기 및 -O-Me기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 2종(예, 2, 3 또는 4종)의 기를 포함하는 뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명의 압타머는 또한, 모든 뉴클레오티드가, 리보오스의 2'부위에서, 히드록실기, 또는 전술한 임의의 원자 또는 기, 예컨대 수소원자, 불소원자, 히드록실기 및 -0-Me기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 동일한 기를 포함하는 뉴클레오티드일 수 있다.본 발명의 압타머의 일례는, 단일쇄 부분, 제1 스템 부분, 인터널 루프 부분, 제2 스템 부분, 인터널 루프 부분으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 부분을 포함하는 잠재적 2차 구조를 가질 수 있다. 본 발명의 압타머의 다른 예는, 단일쇄 부분, 제1 스템 부분, 인터널 루프 부분, 제2 스템 부분, 인터널 루프 부분으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 부분을 포함하는 잠재적 2차 구조를 가질 수 있다. 본 명세서에서 기재된 '잠재적 2차 구조'란, 생리 조건하에서 안정적으로 존재할 수 있는 2차 구조를 말하고, 예컨대 잠재적 2차 구조를 갖는지의 여부는, 실시예에 기재한 구조 예측 프로그램에 의해 결정할 수 있다. 스템 부분이란, 2 이상의 연속하는 뉴클레오티드에서의 염기쌍(예, G-C, A-U, A-T)에 의해, 2중쇄가 형성되는 부분을 말한다. 인터널 루프 부분이란, 2개의 상이한 스템 부분 사이에서 형성되는 비스템 부분을 말한다. 헤어핀 루프 부분이란, 하나의 스템 부분에 의해 형성되는 부분 구조로서, 압타머쇄의 5' 말단 및 3' 말단에 대하여 반대측에 형성되는 루프 부분을 말한다. 단일쇄 부분이란, 폴리뉴클레오티드쇄의 말단 부분으로서, 상기한 스템 부분, 인터널 루프 부분 및 헤어핀 루프 부분에 해당하지 않는 부분을 말한다.Each nucleotide included in the aptamer of the present invention is the same or different, and is a nucleotide containing a hydroxyl group at the 2'site of ribose (eg, ribose of a pyrimidine nucleotide) (ie, an unsubstituted nucleotide), or In the 2'portion of ribose, the hydroxyl group may be a nucleotide substituted with an arbitrary atom or group. As such an arbitrary atom or group, for example, a hydrogen atom, a fluorine atom or an -O- alkyl group (eg -O-Me group), -O-acyl group (eg -OCHO group), amino group (eg -NH2 group) And nucleotides substituted with. In the aptamer of the present invention, at least one (e.g., 1, 2, 3 or 4) nucleotide is, at the 2'portion of ribose, a hydroxyl group, or any atom or group described above, such as a hydrogen atom, fluorine It may be a nucleotide containing at least two (eg, 2, 3 or 4) groups selected from the group consisting of an atom, a hydroxyl group and an -O-Me group. In the aptamer of the present invention, all nucleotides are from the group consisting of a hydroxyl group, or any of the aforementioned atoms or groups, such as a hydrogen atom, a fluorine atom, a hydroxyl group, and a -0-Me group at the 2'site of the ribose. It may be a nucleotide containing the same group selected. An example of the aptamer of the present invention is 1 selected from the group consisting of a single chain portion, a first stem portion, an internal loop portion, a second stem portion, and an internal loop portion. It may have a potential secondary structure that includes more than one part. Another example of the aptamer of the present invention is a potential secondary structure comprising at least one portion selected from the group consisting of a single chain portion, a first stem portion, an internal loop portion, a second stem portion, and an internal loop portion. Can have. The term'potential secondary structure' described herein refers to a secondary structure that can stably exist under physiological conditions, for example, whether or not it has a potential secondary structure can be determined by a structure prediction program described in the examples. . The stem portion refers to a portion in which a double chain is formed by base pairs (eg, G-C, A-U, A-T) in two or more consecutive nucleotides. The internal loop portion refers to a bistem portion formed between two different stem portions. The hairpin loop portion is a partial structure formed by one stem portion, and refers to a loop portion formed on the opposite side to the 5'end and the 3'end of the aptamer chain. The single-stranded portion refers to a terminal portion of a polynucleotide chain, which does not correspond to the stem portion, the internal loop portion, and the hairpin loop portion described above.
본 발명의 압타머는, 타겟에 대한 결합성, 안정성 등을 높이기 위해, 각 뉴클레오티드의 당 잔기(예, 리보오스나 디옥시리보스)가 수식된 것이어도 좋다. 당잔기에서 수식되는 부위로서는, 예컨대 당 잔기의 2'부위, 3'부위 및/또는 4'부위의 산소원자를 다른 원자로 치환한 것 등을 들 수 있다. 수식의 종류로서는, 예컨대 플루오로화, O-알킬화(예, O-메틸화, O-에틸화), O-알릴화, S-알킬화(예, S-메틸화, S-에틸화), S-알릴화, 아미노화(예, -NH)를 들 수 있다. 이러한 당 잔기의 변형은, 자체 공지의 방법에 의해 행할 수 있다(예컨대 Sproat et al., Nucle. Acid. Res. 19, 733-738, 1991; Cotton et al., Nucl. Acid. Res. 19, 2629-2635, 1991; Hobbs et al., Biochemistry 12, 5138-5145, 1973).The aptamer of the present invention may have a modified sugar residue (eg, ribose or deoxyribose) of each nucleotide in order to increase the binding properties and stability to the target. Examples of the moiety modified in the sugar moiety include those in which an oxygen atom at the 2', 3', and/or 4'moiety of the sugar residue is substituted with another atom. Examples of the type of formula include fluorination, O-alkylation (eg O-methylation, O-ethylation), O-allylation, S-alkylation (eg S-methylation, S-ethylation), and S-allyl And amination (eg -NH). Such modification of sugar residues can be performed by methods known per se (e.g., Sproat et al., Nucle. Acid. Res. 19, 733-738, 1991; Cotton et al., Nucl. Acid. Res. 19, 2629-2635, 1991; Hobbs et al.,
본 발명의 압타머는 또한 타겟에 대한 결합성 등을 높이기 위해, 핵산염기(예, 푸린, 피리미딘)가 변형(예, 화학적 치환)된 것이어도 좋다. 이러한 변형으로서는, 예컨대 5부위 피리미딘 변형, 6 및/또는 8부위 푸린 변형, 환외(環外) 아민에서의 변형, 4-티오우리딘으로의 치환, 5-브로모 또는 5-요오드-우리실으로의 치환을 들 수 있다. 또한, 뉴클레아제 및 가수분해에 대하여 내성을 갖도록, 본 발명의 압타머에 포함되는 인산기가 변형되어 있어도 좋다. 예컨대 P(0)0기가, P(0)S(티오에이트), P(S)S(디티오에이트), P(O)NR2(아미데이트), P(O)R, R(O)OR', CO 또는 CH2(포름아세탈) 또는 3'-아민(-NH-CH2-CH2-)으로 치환되어 있어도 좋다〔여기서 각각의 R 또는 R'은 독립적으로, H이거나, 또는 치환되어 있거나, 또는 치환되어 있지 않은 알킬(예, 메틸, 에틸)이다〕. 연결기로서는, -O-, -N- 또는 -S-가 예시되고, 이들의 연결기를 통하여 인접하는 뉴클레오티드에 결합할 수 있다.The aptamer of the present invention may also be one in which a nucleic acid base (eg, purine, pyrimidine) is modified (eg, chemically substituted) in order to increase the binding property to the target. Such modifications include, for example, 5-site pyrimidine modifications, 6 and/or 8-site purine modifications, modifications in extra-cyclic amines, substitution with 4-thiouridine, 5-bromo or 5-iodine-uricil Substitution with is mentioned. Further, the phosphate group contained in the aptamer of the present invention may be modified to have resistance to nuclease and hydrolysis. For example, P(0)0 group, P(0)S(thioate), P(S)S(dithioate), P(O)NR2(amidate), P(O)R, R(O)OR May be substituted with', CO or CH2 (formacetal) or 3'-amine (-NH-CH2-CH2-) [wherein each R or R'is independently H, or is substituted, or substituted Is not an alkyl (eg methyl, ethyl)]. As a linking group, -O-, -N-, or -S- is illustrated, and can be bonded to an adjacent nucleotide through these linking groups.
본 발명에서의 변형은 또한, 캡핑과 같은 3' 및 5'의 변형을 포함하여도 좋다. 변형은 또한, 폴리에틸렌글리콜, 아미노산, 펩티드, inverted dT, 핵산, 뉴클레오시드, 미리스토일(Myristoyl), 리쏘콜릭-올레일(Lithocolic-oleyl), 도코사닐(Docosanyl), 라우로일(Lauroyl), 스테아로일(Stearoyl), 팔미토일(Palmitoyl), 올레오일(Oleoyl), 리놀레오일(Linoleoyl), 그 외 지질, 스테로이드, 콜레스테롤, 카페인, 비타민, 색소, 형광물질, 항암제, 독소, 효소, 방사성 물질, 비오틴 등을 말단에 부가함으로써 행해질 수 있다. 이러한 변형에 대해서는, 예컨대 미국특허 제5,660,985호, 미국특허 제5,756,703호를 참조한다.Variations in the present invention may also include variations of 3'and 5'such as capping. Modifications are also polyethylene glycol, amino acids, peptides, inverted dT, nucleic acids, nucleosides, myristoyl, lithocolic-oleyl, docosanyl, lauroyl , Stearoyl, Palmitoyl, Oleoyl, Linoleoyl, Other lipids, steroids, cholesterol, caffeine, vitamins, pigments, fluorescent substances, anticancer agents, toxins, enzymes, It can be done by adding radioactive substances, biotin, or the like to the ends. For such modifications, see, for example, U.S. Patent No. 5,660,985 and U.S. Patent No. 5,756,703.
본 발명의 일 태양에 따르면, 본 발명의 면역 검출용 접합체의 상기 항원은 자가항체, 리간드, 천연 추출물, 펩타이드, 단백질, 금속 이온, 합성 약물, 천연 약물, 대사체, 유전체, 바이러스 및 바이러스에 의한 생성 물질, 및 박테리아 및 바이러스에 의한 생성 물질로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있고, 구체적으로 바이러스, 더 구체적으로 InfA/H1N1 바이러스일 수 있다.According to an aspect of the present invention, the antigen of the conjugate for immune detection of the present invention is an autoantibody, a ligand, a natural extract, a peptide, a protein, a metal ion, a synthetic drug, a natural drug, a metabolite, a genome, a virus and a virus. It may be any one or more selected from the group consisting of a produced substance, and a substance produced by bacteria and viruses, and specifically a virus, more specifically an InfA/H1N1 virus.
본 발명의 면역 검출용 접합체는 물, 토양, 식품, 폐기물, 동식물 장내 및 동식물 조직 중 어느 하나 이상에서 채취된 시료로부터 항원을 검출할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이때, 상기 물은 강수(江水), 해수(海水), 호수(湖水) 및 우수(雨水) 등을 포함하고, 폐기물은 하수, 폐수 등을 포함하며, 상기 동식물은 인체를 포함한다.The conjugate for immune detection of the present invention may detect an antigen from a sample collected from at least one of water, soil, food, waste, animal and plant intestine, and animal and plant tissue, but is not limited thereto. At this time, the water includes precipitation, seawater, lake, and rainwater, and waste includes sewage and wastewater, and the animals and plants include the human body.
본 발명의 일 태양에 따르면, 본 발명의 면역 검출용 접합체는 상기 압타머에 복수 개의 면역 검출용 접합체가 결합할 수 있고, 구체적으로 2 내지 20개, 더 구체적으로 5 내지 15개, 가장 구체적으로 8 내지 10개의 면역 검출용 접합체가 결합할 수 있다.According to one aspect of the present invention, in the conjugate for immune detection of the present invention, a plurality of conjugates for immune detection may be bound to the aptamer, and specifically 2 to 20, more specifically 5 to 15, most specifically Eight to 10 immune detection conjugates can be bound.
본 발명의 일 태양에 따르면, 본 발명의 압타머는 서열 번호 1 내지 4 중에서 선택된 염기서열로 표시되는 것일 수 있다.According to an aspect of the present invention, the aptamer of the present invention may be represented by a nucleotide sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 4.
본 발명의 단일 가닥 DNA 결합 단백질(single stranded DNA binding protein, SSB)은 인간, 생쥐, 쥐, 곰팡이, 원생 동물 또는 식물, 박테리아 및 고세균과 같은 원핵 생물 또는 바이러스와 같은 진핵 생물에서 유래한 것일 수 있다.The single stranded DNA binding protein (SSB) of the present invention may be derived from humans, mice, rats, fungi, protozoa, or prokaryotes such as plants, bacteria and archaea, or eukaryotes such as viruses. .
진핵 생물의 단일 가닥 DNA 결합 단백질은 복제 단백질 A (RPA)로 알려져 있다. 대부분의 경우, 이들은 서로 다른 크기 단위로 형성된 헤테로 삼량체이다. 보다 큰 단위 (예를 들어, 사카로마이세스 세레비지애의 RPA70) 중 일부는 안정하고 단량체 형태로 ssDNA와 결합한다. The eukaryotic single-stranded DNA binding protein is known as replicating protein A (RPA). In most cases, these are hetero trimers formed from different size units. Some of the larger units (eg RPA70 from Saccharomyces cerevisiae) are stable and bind ssDNA in monomeric form.
박테리아의 단일 가닥 DNA 결합 단백질은 DNA를 안정한 동종-사량체 (예 : 대장균, 마이코박테리움 스메그마티스 및 헬리코박터 파일로리) 또는 동종-이량체 (예 : 데이노코커스 라디오두란 및 서모토가 마리티마)로 결합시킨다. 고세균 게놈의 SSB는 진핵 생물 RPA와 관련이 있는 것으로 간주된다. 대부분의 다른 종의 SSB는 진핵 생물의 복제 단백질과 밀접하게 관련되어 있으며 RPA라고 한다. 단일 가닥 DNA 결합 단백질의 예로는 이에 한정되는 것은 아니지만 대장균의 SSB (EcoSSB-WT), 마이코박테리움 투베르쿨로시스, 데이노코커스 라디오두란의 SSB, 써머스 써모필리스의 SSB, 설폴로부스 솔파타리쿠스의 SSB, 인간 복제 단백질 A 70 kDa 서브유닛 (RPA70) 단편, 인간 복제 단백질 A 32 kDa 서브유닛 (RPA32) 단편, 사카로마이세스 세레비지애의 RPA70, 사카로마이세스 세레비지애의 CDC13 SSB, 대장균의 Primosomal 복제 단백질 N (PriB), 애기 장대(Arabidopsis thaliana)의 PriB, 가설 단백질 At4g28440, T4로부터의 SSB (gp32), RB69로부터의 SSB (gp32) 등이 있다. 본 발명의 방법에서 사용되는 SSB는 이들 단백질 중 어느 하나로부터 유도될 수 있으며, 상기 단백질의 전체 또는 일부를 사용할 수 있다.Bacterial single-stranded DNA-binding proteins contain DNA-stable homo-tetramers (e.g. E. coli, Mycobacterium smegmatis and Helicobacter pylori) or homo-dimers (e.g. Deinococcus radioduran and Sumotoga maritima). ). The SSB of the archaeal genome is considered to be associated with eukaryotic RPA. SSBs in most other species are closely related to eukaryotic replication proteins and are called RPAs. Examples of single-stranded DNA binding proteins include, but are not limited to, Escherichia coli SSB (EcoSSB-WT), Mycobacterium tuberculosis, Deinococcus radioduran SSB, Thermophilis SSB, Sulpolobus solpatari Cous' SSB, human replicating
본 발명의 일 태양에 따르면, 본 발명의 면역 검출용 접합체의 상기 단일 가닥 DNA 결합 단백질은 대장균의 SSB (EcoSSB-WT), 마이코박테리움 투베르쿨로시스, 데이노코커스 라디오두란의 SSB, 써머스 써모필리스의 SSB, 설폴로부스 솔파타리쿠스의 SSB, 인간 복제 단백질 A 70 kDa 서브유닛 (RPA70) 단편, 인간 복제 단백질 A 32 kDa 서브유닛 (RPA32) 단편, 사카로마이세스 세레비지애의 RPA70, 사카로마이세스 세레비지애의 CDC13 SSB, 대장균의 Primosomal 복제 단백질 N (PriB), 애기 장대(Arabidopsis thaliana)의 PriB, 가설 단백질 At4g28440, T4로부터의 SSB (gp32) 및 RB69로부터의 SSB (gp32)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있고, 구체적으로 RPA70 (서열번호 5 내지 8 포함)일 수 있고, 더 구체적으로는 RPA70의 A 도메인 (서열번호 6) 일 수 있다(도 3a 참조).According to an aspect of the present invention, the single-stranded DNA-binding protein of the conjugate for immune detection of the present invention is SSB of Escherichia coli (EcoSSB-WT), Mycobacterium tuberculosis, SSB of Deinococcus radioduran, and summers. SSB of Thermophilis, SSB of Sulfolobus solpataricus, fragment of human replicating
본 발명의 일 태양에 따르면, 본 발명의 면역 검출용 접합체의 상기 신호발생물질은 금속 나노입자, 퀀텀닷(quantum dot) 나노입자, 자기 나노입자, 효소, 효소 기질, 효소반응 생성물질, 흡광물질, 형광물질 및 발광물질로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상 일 수 있다.본 발명의 신호발생물질은 그 형상이 특별히 제한되지 않으며, 상기 신호발생물질은 구형 입자, 표면에 다양한 형태의 나노입자가 올라간 딸기형 또는 성게형의 구형 입자, 이방성 입자, 중공 입자, 비대칭형 입자 및 모서리가 있는 입자로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상일 수 있다. 나노입자는 예를 들어 나노 구체, 나노 로드, 나노 큐브 및 다수의 기하학적 및 비기하학적 형태를 가질 수 있다. 특히 막대형, 삼각형, 프리즘, 정육면체와 같은 형태의 이방성 입자나 모서리가 있는 입자의 경우 라만 산란에 있어서 구형 입자와 비교하여 보다 강화된 신호를 제공할 수 있다. 표면 플라즈몬의 극대화를 위해 나노입자의 모양뿐 아니라 크기도 적절히 제어할 수 있다. 상술한 다양한 형태의 나노입자들의 제조방법은 다수의 문헌에 공지되어 있다.According to an aspect of the present invention, the signal generating material of the conjugate for immune detection of the present invention is a metal nanoparticle, a quantum dot nanoparticle, a magnetic nanoparticle, an enzyme, an enzyme substrate, an enzyme reaction product, a light absorbing material. , A fluorescent material and a light-emitting material. The shape of the signal generating material of the present invention is not particularly limited, and the signal generating material is spherical particles, and various types of nanoparticles are mounted on the surface. It may be one or more selected from the group consisting of strawberry-shaped or sea urchin-shaped spherical particles, anisotropic particles, hollow particles, asymmetric particles, and particles with corners. Nanoparticles can have, for example, nanospheres, nanorods, nanocubes and a number of geometric and non-geometric shapes. Particularly, in the case of anisotropic particles in the form of rods, triangles, prisms, and cubes, or particles with edges, it is possible to provide a more enhanced signal in Raman scattering compared to spherical particles. In order to maximize surface plasmon, not only the shape but also the size of the nanoparticles can be properly controlled. Methods for preparing various types of nanoparticles described above are known in a number of documents.
본 발명의 상기 신호발생물질은 신호발생물질로서의 기능도 수행하여, 금속 나노입자일 경우에는 면역 검출용 접합체와 압타머의 선택적인 반응에 의한 금속 나노입자의 색변화를 통해 항원을 검출할 수 있으며, 멤브레인 상에서 압타머와 특이적으로 결합된 면역 검출용 접합체의 결합체의 흡광도, 전기 전도도 등을 측정함으로써 분석대상물질을 정량적으로 분석할 수도 있다. 이러한 금속 나노입자는, 예를 들어, 금, 은, 구리, 팔라듐, 백금, 알루미늄, 니켈, 철, 티타늄 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. The signal generating material of the present invention also functions as a signal generating material, and in the case of metal nanoparticles, the antigen can be detected through color change of the metal nanoparticles by a selective reaction between the conjugate for immune detection and the aptamer. , The analyte may be quantitatively analyzed by measuring the absorbance and electrical conductivity of the conjugate of the immune detection conjugate specifically bound to the aptamer on the membrane. Such metal nanoparticles may be, for example, gold, silver, copper, palladium, platinum, aluminum, nickel, iron, titanium, etc., but are not limited thereto.
본 발명의 일 태양에 따르면, 금속 나노입자는 금 나노입자일 수 있고, 상기 금 나노입자는 크기가 2nm~100nm일 수 있다. 상기 금 나노입자는 금 이온과 환원제를 혼합하여 제조할 수 있으며, Sigma와 같은 시약회사에서도 상업적으로 용이하게 입수 가능하다.According to an aspect of the present invention, the metal nanoparticles may be gold nanoparticles, and the gold nanoparticles may have a size of 2 nm to 100 nm. The gold nanoparticles can be prepared by mixing gold ions and a reducing agent, and can be easily obtained commercially from reagent companies such as Sigma.
상기 신호발생물질이 퀀텀닷 나노입자일 경우에는 리셉터와 분석대상물질의 선택적인 반응에 의한 퀀텀닷 나노입자의 형광을 통해 분석대상물질을 검출할 수 있다. 상기 신호발생물질이 자기 나노입자일 경우에는 리셉터와 분석대상물질의 선택적인 반응에 의한 자기장의 변화를 통해 분석대상물질을 검출할 수 있다.When the signal generating material is a quantum dot nanoparticle, the analyte may be detected through fluorescence of the quantum dot nanoparticle by a selective reaction between the receptor and the analyte. When the signal generating material is a magnetic nanoparticle, the analyte may be detected through a change in a magnetic field due to a selective reaction between the receptor and the analyte.
상기 신호발생물질이 효소, 효소 기질 또는 효소반응 생성물질일 경우에는 리셉터와 분석대상물질의 선택적인 반응에 의해 분석대상물질 또는 리셉터와 상기 효소, 효소 기질 또는 효소반응 생성물질이 반응하여 산화환원 반응 등과 같은 효소반응을 일으키게 되는데, 이 때 상기 효소 반응에 의한 생성물의 흡광, 형광, 발광 등을 측정함으로써 분석대상물질을 검출할 수 있다. 이러한 효소는, 예를 들어 글루코스 옥시다아제, 글루코스 탈수소효소, 알칼리 포스파타제, 퍼옥시다제 등일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 효소 기질은, 예를 들어 글루코스, 과산화수소 등일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.When the signal generating material is an enzyme, an enzyme substrate, or an enzyme reaction product, the analyte or receptor reacts with the enzyme, the enzyme substrate, or the enzyme reaction product by a selective reaction between the receptor and the analyte. An enzymatic reaction, such as, for example, occurs. In this case, the analyte can be detected by measuring absorption, fluorescence, and luminescence of the product by the enzymatic reaction. These enzymes may be, for example, glucose oxidase, glucose dehydrogenase, alkaline phosphatase, peroxidase, etc., but are not limited thereto, and the enzyme substrate may be, for example, glucose, hydrogen peroxide, etc., but is not limited thereto.
이외에도 상기 신호발생물질로서 당업계에 공지된 흡광물질, 형광물질 또는 발광물질을 사용할 수 있으며, 구체적인 종류는 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면 루미놀(luminol)을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In addition, as the signal generating material, a light absorbing material, a fluorescent material, or a light emitting material known in the art may be used, and a specific type may be appropriately selected by a person skilled in the art. According to an embodiment of the present invention, luminol may be used, but is not limited thereto.
본 발명의 일 태양에 따르면, 본 발명의 면역 검출용 접합체의 상기 신호발생물질은 비특이적 결합을 억제하기 위하여 차단제로 표면을 코팅할 수 있고, 예를 들어 소 혈청 알부민(BSA), 탈지유, 카제인, 대두-생선 유래 성분 및 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상으로 표면이 둘러싸여진 것일 수 있다. 이들 차단제는 필요에 따라 열, 산 또는 알칼리에 의한 부분 개질 등의 전처리를 실시할 수 있다. According to an aspect of the present invention, the signal generating material of the conjugate for immune detection of the present invention may be coated with a surface with a blocking agent to inhibit non-specific binding, for example, bovine serum albumin (BSA), skim milk, casein, The surface may be surrounded by one or more selected from the group consisting of soybean-fish-derived components and polyethylene glycol. These barrier agents may be subjected to pretreatment such as partial modification with heat, acid or alkali, if necessary.
본 발명의 면역 검출용 접합체는 항원과의 결합 여부를 확인하기 위하여 표지물질이 간접적 또는 직접적인 방법으로 부착될 수 있으며, 표지물질로는 이로 제한되는 것은 아니나, 형광물질, 양자점, 방사능 표지, 효소, 효소 기질, 및 전기화학적 작용기(electrochemical functional group) 등이 사용될 수 있고, 이때, 형광물질의 종류는 특별히 한정되지 않으나, 예를 들면 Cy3 또는 Cy5와 같은 형광색소나, 루시퍼라아제(luciferase), GFP와 같은 형광 단백질과 같은 공지의 형광물질이 사용될 수 있다.In the conjugate for immunodetection of the present invention, a labeling substance may be attached indirectly or by a direct method to confirm binding to an antigen, and the labeling substance is not limited thereto, but a fluorescent substance, quantum dot, radioactive label, enzyme, An enzyme substrate, an electrochemical functional group, etc. may be used, and in this case, the type of the fluorescent substance is not particularly limited, but, for example, a fluorescent dye such as Cy3 or Cy5, luciferase, GFP and A known fluorescent material such as the same fluorescent protein may be used.
본 발명의 또 태양에 따르면, 지지체; 상기 지지체에 고정되고 검출 대상 항원에 특이적으로 결합하는 리셉터; 상기 항원에 특이적인 압타머; 및 상기 압타머와 검출 대상 항원과의 특이적 결합 부위 이외의 영역에서 상기 압타머와 특이적으로 결합하는 단일 가닥 DNA 결합 단백질과 신호발생물질이 결합된 면역 검출용 접합체를 포함하는 면역 검출 센서를 제공한다.According to another aspect of the present invention, a support; A receptor immobilized on the support and specifically binding to an antigen to be detected; An aptamer specific for the antigen; And a conjugate for immune detection in which a single-stranded DNA-binding protein specifically binding to the aptamer and a signal generating substance is bound in a region other than a specific binding site between the aptamer and the antigen to be detected. to provide.
본 발명의 상기 리셉터는 검출 대상 항원에 특이적으로 결합하는 것으로서, 예컨대, 상기 리셉터를 항체로 하여 항체-항원 결합일 수 있고, 따라서, 실시예에서 예시된 바와 같은 샌드위치법을 이용한 검출이 가능하며, 이러한 리셉터는 항체, DNA, 압타머(aptamer), PNA(peptide nucleic acids) 및 리간드로 구성되는 군에서 선택되는 것일 수 있다.The receptor of the present invention specifically binds to an antigen to be detected, and may be, for example, antibody-antigen binding using the receptor as an antibody, and thus, detection using a sandwich method as exemplified in the Examples is possible. , These receptors may be selected from the group consisting of antibodies, DNA, aptamers, peptide nucleic acids (PNA), and ligands.
본 발명의 일 태양에 따르면, 본 발명의 면역 검출 센서의 상기 항원은 자가항체, 리간드, 천연 추출물, 펩타이드, 단백질, 금속 이온, 합성 약물, 천연 약물, 대사체, 유전체, 바이러스 및 바이러스에 의한 생성 물질, 및 박테리아 및 바이러스에 의한 생성 물질로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있고, 구체적으로 바이러스, 더 구체적으로 InfA/H1N1 바이러스일 수 있다.According to one aspect of the present invention, the antigen of the immune detection sensor of the present invention is produced by autoantibodies, ligands, natural extracts, peptides, proteins, metal ions, synthetic drugs, natural drugs, metabolites, genomes, viruses and viruses. It may be any one or more selected from the group consisting of a substance, and a substance produced by bacteria and viruses, specifically a virus, more specifically an InfA/H1N1 virus.
본 발명의 일 태양에 따르면, 상기 압타머는 서열 번호 1 내지 4 중에서 선택된 염기서열로 표시되는 것일 수 있다.According to one aspect of the present invention, the aptamer may be represented by a nucleotide sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 4.
본 발명의 일 태양에 따르면, 본 발명의 면역 검출 센서의 상기 단일 가닥 DNA 결합 단백질은 대장균의 SSB (EcoSSB-WT), 마이코박테리움 투베르쿨로시스, 데이노코커스 라디오두란의 SSB, 써머스 써모필리스의 SSB, 설폴로부스 솔파타리쿠스의 SSB, 인간 복제 단백질 A 70 kDa 서브유닛 (RPA70) 단편, 인간 복제 단백질 A 32 kDa 서브유닛 (RPA32) 단편, 사카로마이세스 세레비지애의 RPA70, 사카로마이세스 세레비지애의 CDC13 SSB, 대장균의 Primosomal 복제 단백질 N (PriB), 애기 장대(Arabidopsis thaliana)의 PriB, 가설 단백질 At4g28440, T4로부터의 SSB (gp32) 및 RB69로부터의 SSB (gp32)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.According to one aspect of the present invention, the single-stranded DNA-binding protein of the immune detection sensor of the present invention is SSB of Escherichia coli (EcoSSB-WT), Mycobacterium tuberculosis, SSB of Deinococcus radioduran, and thermos thermo Philis SSB, Sulfolobus solpataricus SSB, human replicating
본 발명의 일 태양에 따르면, 본 발명의 면역 검출 센서의 상기 신호발생물질은 금속 나노입자, 퀀텀닷(quantum dot) 나노입자 및 자기 나노입자로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.According to an aspect of the present invention, the signal generating material of the immune detection sensor of the present invention may be any one or more selected from the group consisting of metal nanoparticles, quantum dot nanoparticles, and magnetic nanoparticles.
본 발명의 일 태양에 따르면, 본 발명의 면역 검출 센서의 상기 신호발생물질은 소 혈청 알부민, 탈지유, 카제인, 대두-생선 유래 성분 및 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상으로 표면이 둘러싸여진 것일 수 있다.According to an aspect of the present invention, the signal generating material of the immune detection sensor of the present invention is surrounded by one or more selected from the group consisting of bovine serum albumin, skim milk, casein, soybean-fish-derived components, and polyethylene glycol. I can.
본 발명의 면역 검출 센서는 키트(kit)의 형태로 제공될 수 있다. 상기 키트는 병, 통(tub), 작은봉지(sachet), 봉투(envelope), 튜브, 앰플(ampoule) 등과 같은 형태를 취할 수 있으며 이들은 부분적으로 또는 전체적으로 플라스틱, 유리, 종이, 호일, 왁스 등으로부터 형성될 수 있다. 용기는, 처음에는 용기의 일부이거나 또는 기계적, 접착성, 또는 기타수단에 의해 용기에 부착될 수 있는, 완전히 또는 부분적으로 분리가 가능한 마개를 장착할 수 있다. 용기는 또한 주사 바늘에 의해 내용물에 접근할 수 있는, 스토퍼가 장착될 수 있다. 상기 키트는 외부패키지를 포함할 수 있으며, 외부패키지는 구성요소들의 사용에 관한 사용설명서를 포함할 수 있다.The immune detection sensor of the present invention may be provided in the form of a kit. The kit may take the form of a bottle, tub, sachet, envelope, tube, ampoule, etc., which are partially or entirely from plastic, glass, paper, foil, wax, etc. Can be formed. The container may be equipped with a fully or partially detachable stopper, which is initially part of the container or can be attached to the container by mechanical, adhesive, or other means. The container may also be equipped with a stopper, which allows access to the contents by an injection needle. The kit may include an external package, and the external package may include instructions for use of components.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, S1) 검출 대상 항원에 특이적인 압타머와 시료를 혼합하여 시료 내 항원과 압타머를 결합시키는 단계; S2) 검출 대상 항원에 특이적으로 결합하는 리셉터에 상기에서 얻은 항원-압타머 결합체를 접촉시켜 상기 리셉터와 상기 항원-압타머 결합체를 결합시키는 단계; 및 S3) 상기 압타머와 검출 대상 항원과의 특이적 결합 부위 이외의 영역에서 상기 압타머와 특이적으로 결합하는 단일 가닥 DNA 결합 단백질과 신호발생물질이 결합된 면역 검출용 접합체를 상기에서 얻은 리셉터-항원-압타머 결합체에 접촉시켜, 상기 상기 면역 검출용 접합체와 압타머를 결합시키는 단계를 포함하는 면역 검출 방법을 제공한다.According to another aspect of the present invention, S1) mixing the sample with an aptamer specific to an antigen to be detected and binding the antigen and the aptamer in the sample; S2) binding the receptor and the antigen-aptamer conjugate by contacting the antigen-aptamer conjugate obtained above with a receptor that specifically binds to the antigen to be detected; And S3) a receptor obtained above to obtain a conjugate for immune detection in which a single-stranded DNA-binding protein and a signal generating substance specifically binds the aptamer in a region other than the specific binding site between the aptamer and the antigen to be detected. -Provides an immune detection method comprising the step of contacting the antigen-aptamer conjugate, and binding the aptamer and the immune detection conjugate.
즉, 본 발명의 검출 방법은 압타머와 시료를 혼합하여 압타머와 항원을 결합시킨 후 이를 포획 항체에 접촉시켜 결합시킨 다음, 그 위로 상술한 본원발명의 단일 가닥 DNA 결합 단백질-신호발생물질이 결합된 면역 검출용 접합체를 반응시켜 이의 결합여부를 분석하여 항원을 검출하는 것을 특징으로 할 수 있다. 이때, 상기 면역 검출용 접합체의 결합여부는 그 결합여부를 확인할 수 있는 것이면 어떤 형태의 신호처리 기법도 적용될 수 있는데, 일예로 면역 검출용 접합체에 표지물질을 결합시켜 표지물질 자체 또는 그 반응을 검출함으로서 결합여부를 확인할 수 있다. 아울러, 상기 표지물질 또는 그 반응의 검출은 일반적으로 알려진 표지물질 또는 그 반응의 분석방법에 의하여 이루어질 수 있다. 예컨대 형광물질을 표지물질로서 사용한 경우 타겟 물질의 존재 시 발광 또는 색 변화가 발생하는바, 이를 측정함으로써 타겟물질을 검출할 수 있다. 예시적으로 형광염료를 탐지할 수 있는 이미지 스캐너 등을 통하여 반응을 일으킨 웰을 스캔하여 타겟물질의 검출 여부를 확인할 수 있고, 이미지를 소프트웨어를 통해 진하기 정도를 측정함으로써 검출량을 측정할 수 있다.That is, in the detection method of the present invention, the aptamer and the antigen are combined by mixing the aptamer and the sample, and then contacted with the capture antibody to bind, and then the single-stranded DNA-binding protein-signal generating material of the present invention described above is It may be characterized in that the antigen is detected by reacting the bound immune detection conjugate to analyze whether it is bound. At this time, if the binding of the immune detection conjugate can be confirmed, any type of signal processing technique can be applied.For example, by binding a labeling substance to the immunodetecting conjugate, the labeling substance itself or its reaction is detected. By doing so, you can check whether or not it is combined. In addition, the detection of the labeling substance or its reaction may be performed by a generally known labeling substance or an analysis method of the reaction. For example, when a fluorescent material is used as a labeling material, light emission or color change occurs in the presence of the target material, and the target material can be detected by measuring this. For example, it is possible to check whether a target material is detected by scanning a well that has caused a reaction through an image scanner capable of detecting a fluorescent dye, and the amount of detection by measuring the intensity of the image through software.
본 발명의 일 태양에 따르면, 본 발명의 면역 검출 방법의 상기 항원은 자가항체, 리간드, 천연 추출물, 펩타이드, 단백질, 금속 이온, 합성 약물, 천연 약물, 대사체, 유전체, 바이러스 및 바이러스에 의한 생성 물질, 및 박테리아 및 바이러스에 의한 생성 물질로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.According to one aspect of the present invention, the antigen of the immunodetection method of the present invention is produced by autoantibodies, ligands, natural extracts, peptides, proteins, metal ions, synthetic drugs, natural drugs, metabolites, genomes, viruses and viruses. It may be any one or more selected from the group consisting of substances, and substances produced by bacteria and viruses.
본 발명의 일 태양에 따르면, 상기 S3) 단계는 상기 면역 검출용 접합체의 복수 개를 압타머와 결합시키는 것일 수 있고, 구체적으로 2 내지 20개, 더 구체적으로 5 내지 15개, 가장 구체적으로 8 내지 10개의 면역 검출용 접합체가 결합할 수 있다.According to an aspect of the present invention, the step S3) may be to combine a plurality of conjugates for immune detection with an aptamer, specifically 2 to 20, more specifically 5 to 15, most specifically 8 Up to 10 conjugates for immune detection can be combined.
본 발명의 일 태양에 따르면, 본 발명의 면역 검출 방법의 상기 압타머는 서열 번호 1 내지 4 중에서 선택된 염기서열로 표시되는 것일 수 있다.According to an aspect of the present invention, the aptamer of the immunodetection method of the present invention may be represented by a nucleotide sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 4.
본 발명의 일 태양에 따르면, 본 발명의 면역 검출 방법의 상기 단일 가닥 DNA 결합 단백질은 대장균의 SSB (EcoSSB-WT), 마이코박테리움 투베르쿨로시스, 데이노코커스 라디오두란의 SSB, 써머스 써모필리스의 SSB, 설폴로부스 솔파타리쿠스의 SSB, 인간 복제 단백질 A 70 kDa 서브유닛 (RPA70) 단편, 인간 복제 단백질 A 32 kDa 서브유닛 (RPA32) 단편, 사카로마이세스 세레비지애의 RPA70, 사카로마이세스 세레비지애의 CDC13 SSB, 대장균의 Primosomal 복제 단백질 N (PriB), 애기 장대(Arabidopsis thaliana)의 PriB, 가설 단백질 At4g28440, T4로부터의 SSB (gp32) 및 RB69로부터의 SSB (gp32)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.According to an aspect of the present invention, the single-stranded DNA-binding protein of the immunodetection method of the present invention is SSB of Escherichia coli (EcoSSB-WT), Mycobacterium tuberculosis, SSB of Deinococcus radioduran, and thermos thermo Philis SSB, Sulfolobus solpataricus SSB, human replicating
본 발명의 일 태양에 따르면, 본 발명의 면역 검출 방법의 상기 신호발생물질은 금속 나노입자, 퀀텀닷(quantum dot) 나노입자 및 자기 나노입자로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.According to an aspect of the present invention, the signal generating material of the immunodetection method of the present invention may be any one or more selected from the group consisting of metal nanoparticles, quantum dot nanoparticles, and magnetic nanoparticles.
본 발명의 일 태양에 따르면, 본 발명의 면역 검출 방법의 상기 신호발생물질은 소 혈청 알부민, 탈지유, 카제인, 대두-생선 유래 성분 및 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상으로 표면이 둘러싸여진 것일 수 있다.According to an aspect of the present invention, the signal generating material of the immunodetection method of the present invention is surrounded by one or more selected from the group consisting of bovine serum albumin, skim milk, casein, soybean-fish-derived components, and polyethylene glycol. I can.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 압타머와 검출 대상 항원과의 특이적 결합 부위 이외의 영역에서 상기 압타머와 특이적으로 결합하는 단일 가닥 DNA 결합 단백질과 신호발생물질이 결합된 면역 검출용 접합체를 압타머와 결합시키는 단계를 포함하는 면역 검출 신호 증폭 방법을 제공한다.According to another aspect of the present invention, a conjugate for immune detection in which a single-stranded DNA-binding protein that specifically binds to the aptamer in a region other than a specific binding site between the aptamer and the antigen to be detected and a signal generating material is bound It provides a method of amplifying an immune detection signal comprising the step of combining with an aptamer.
본 발명의 일 태양에 따르면, 본 발명의 면역 검출 신호 증폭 방법의 상기 항원은 자가항체, 리간드, 천연 추출물, 펩타이드, 단백질, 금속 이온, 합성 약물, 천연 약물, 대사체, 유전체, 바이러스 및 바이러스에 의한 생성 물질, 및 박테리아 및 바이러스에 의한 생성 물질로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있고, 구체적으로 바이러스, 더 구체적으로 InfA/H1N1 바이러스일 수 있다.According to one aspect of the present invention, the antigen of the method for amplifying the immune detection signal of the present invention is an autoantibody, a ligand, a natural extract, a peptide, a protein, a metal ion, a synthetic drug, a natural drug, a metabolite, a genome, a virus and a virus. It may be any one or more selected from the group consisting of a substance produced by a substance, and a substance produced by a bacterium and a virus, specifically a virus, more specifically an InfA/H1N1 virus.
본 발명의 일 태양에 따르면, 본 발명의 면역 검출 신호 증폭 방법은 상기 면역 검출용 접합체의 복수 개를 압타머와 결합시키는 것일 수 있고, 구체적으로 2 내지 20개, 더 구체적으로 5 내지 15개, 가장 구체적으로 8 내지 10개의 면역 검출용 접합체가 결합할 수 있다.According to an aspect of the present invention, the method of amplifying the immune detection signal of the present invention may be to combine a plurality of the immunity detection conjugates with an aptamer, specifically 2 to 20, more specifically 5 to 15, Most specifically, 8 to 10 conjugates for immune detection can be combined.
본 발명의 일 태양에 따르면, 본 발명의 면역 검출 신호 증폭 방법의 상기 압타머는 서열 번호 1 내지 4 중에서 선택된 염기서열로 표시되는 것일 수 있다.According to an aspect of the present invention, the aptamer of the method for amplifying an immune detection signal of the present invention may be represented by a nucleotide sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 4.
본 발명의 일 태양에 따르면, 본 발명의 면역 검출 신호 증폭 방법의 상기 단일 가닥 DNA 결합 단백질은 대장균의 SSB (EcoSSB-WT), 마이코박테리움 투베르쿨로시스, 데이노코커스 라디오두란의 SSB, 써머스 써모필리스의 SSB, 설폴로부스 솔파타리쿠스의 SSB, 인간 복제 단백질 A 70 kDa 서브유닛 (RPA70) 단편, 인간 복제 단백질 A 32 kDa 서브유닛 (RPA32) 단편, 사카로마이세스 세레비지애의 RPA70, 사카로마이세스 세레비지애의 CDC13 SSB, 대장균의 Primosomal 복제 단백질 N (PriB), 애기 장대(Arabidopsis thaliana)의 PriB, 가설 단백질 At4g28440, T4로부터의 SSB (gp32) 및 RB69로부터의 SSB (gp32)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.According to one aspect of the present invention, the single-stranded DNA binding protein of the method for amplifying the immune detection signal of the present invention is SSB of Escherichia coli (EcoSSB-WT), Mycobacterium tuberculosis, SSB of Deinococcus radioduran, SSB of Thermophilis, SSB of Sulfolobus solpataricus, fragment of human replicating
본 발명의 일 태양에 따르면, 본 발명의 면역 검출 신호 증폭 방법의 상기 신호발생물질은 금속 나노입자, 퀀텀닷(quantum dot) 나노입자 및 자기 나노입자로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.According to an aspect of the present invention, the signal generating material of the method for amplifying the immune detection signal of the present invention may be at least one selected from the group consisting of metal nanoparticles, quantum dot nanoparticles, and magnetic nanoparticles.
본 발명의 일 태양에 따르면, 본 발명의 면역 검출 신호 증폭 방법의 상기 신호발생물질은 소 혈청 알부민, 탈지유, 카제인, 대두-생선 유래 성분 및 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상으로 표면이 둘러싸여진 것일 수 있다.According to an aspect of the present invention, the signal generating material of the method for amplifying the immune detection signal of the present invention is surrounded by any one or more selected from the group consisting of bovine serum albumin, skim milk, casein, soybean-fish-derived components, and polyethylene glycol. It may be lost.
이하, 실시 예를 통해서 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다. 하지만, 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. However, these are only for describing the present invention in more detail, and the scope of the present invention is not limited thereto.
[실시예 1] 본 발명의 면역 검출용 접합체의 제조[Example 1] Preparation of the conjugate for immune detection of the present invention
RPA70에 A domain을 pET15b 벡터에 서브 클로닝하여 BL21 세포로 형질전환시켰다. RPA70 A domain을 NI-NTA 컬럼 및 크기 배제 컬럼을 사용하여 발현시키고 정제 하였다. 금 콜로이드 용액은 BBI International (EMGC20, Cardiff, UK)에서 구입하였다.The RPA70 A domain was subcloned into the pET15b vector and transformed into BL21 cells. The RPA70 A domain was expressed and purified using an NI-NTA column and a size exclusion column. Gold colloidal solution was purchased from BBI International (EMGC20, Cardiff, UK).
RPA70A-금 나노입자 접합체를 흡광법으로 제조하고, 이를 육안 및 흡광도 피크 변화로 확인하였다. 확인 결과, 도 4에 나타낸 것처럼 단백질이 접합되지 않은 금 나노 입자와 달리, RPA70A가 접합된 금 나노 입자는 단백질 영향으로 인해 흡광도가 적색 쉬프트가 되어, 기존에 관찰되던 파장인 524 nm에서 5~6 nm정도 증가한 530 nm의 파장대가 관찰되었다. 이는 육안으로도 색 변화 관찰이 가능하였다. 또한, 금 나노 입자의 크기 측정 결과는 약 18 nm 증가함을 나타내었다. 이는 금 나노 입자 표면에 BSA (크기 5 nm 추정)와 다수의 RPA70A (크기 1 nm)가 접합됨을 알 수 있다. 본 발명에서 제조한 RPA70A-금 나노 입자 접합체가 안정한 상태로 만들어진 것으로 해석할 수 있다. The RPA70A-gold nanoparticle conjugate was prepared by the absorption method, which was confirmed by the naked eye and the change in the absorbance peak. As a result, unlike gold nanoparticles to which the protein is not conjugated, as shown in FIG. 4, the absorbance of gold nanoparticles to which RPA70A is conjugated due to the protein effect is shifted in red, and is 5 to 6 at the previously observed wavelength of 524 nm. A wavelength band of 530 nm was observed with an increase of about nm. It was possible to observe the color change with the naked eye. In addition, the results of measuring the size of the gold nanoparticles showed an increase of about 18 nm. It can be seen that BSA (estimated
[실시예 2] 본 발명의 면역 검출용 접합체의 결합력 확인 [Example 2] Confirmation of the binding strength of the conjugate for immune detection of the present invention
본 발명의 RPA70A-금 나노입자 접합체의 압타머 결합력에 대한 효과를 확인하기 위해, 탐침의 구조 변화와 금 나노 입자 접합체의 응집을 확인했다. 본 실험에서 사용한 압타머의 서열은 다음과 같다. (서열번호 2)In order to confirm the effect of the RPA70A-gold nanoparticle conjugate of the present invention on the aptamer binding force, the structure change of the probe and the aggregation of the gold nanoparticle conjugate were confirmed. The sequence of the aptamer used in this experiment is as follows. (SEQ ID NO: 2)
:TAGGGAAGAGAAGGACATATGATTGGCTTGCATGCTGGACTTCCTACTGGTTTTCAAGTGGTCATGTACTAGTCAA:TAGGGAAGAGAAGGACATATGATTGGCTTGCATGCTGGACTTCCTACTGGTTTTCAAGTGGTCATGTACTAGTCAA
제작된 RPA70A-금 나노입자 접합체가 타겟과 결합한 상태인 압타머의 구조 변화를 야기하지 않고 결합함을 확인하기 위해 압타머의 구조 변화를 확인하였다. In order to confirm that the fabricated RPA70A-gold nanoparticle conjugate binds without causing a structural change of the aptamer, the structure of the aptamer was confirmed.
확인 결과, 도 4d에 나타낸 것처럼 타겟과 결합한 상태인 압타머의 구조와, 타겟과 결합한 상태인 압타머 솔루션에 추가로 넣어준 RPA70A 실험군의 구조 차이가 관찰되지 않았고, 이로 인해 RPA70A과 압타머의 결합은 압타머의 구조 변화를 야기하지 않으면서 노출된 단일 가닥 부분에 결합함을 알 수 있다. As a result of confirming, as shown in FIG. 4D, a difference in the structure of the aptamer in a state combined with the target and the RPA70A experimental group additionally added to the aptamer solution in a state in which the target is bound was not observed. It can be seen that binds to the exposed single-stranded portion without causing structural changes in the aptamer.
기존의 면역 검출용 접합체 (항체 사용)를 이용한 금 나노 입자의 응집력과 본 발명에서 사용한 RPA70A-금 나노입자 접합체를 사용한 응집력의 비교를 통해, 본 발명에서의 신호 증폭 메커니즘을 규명하고자 하였다. By comparing the cohesive strength of gold nanoparticles using the conventional immunodetection conjugate (using an antibody) and the cohesion using the RPA70A-gold nanoparticle conjugate used in the present invention, it was intended to elucidate the signal amplification mechanism in the present invention.
확인 결과 도 5에 나타낸 것처럼, 항체를 사용한 기존의 면역 검출용 접합체 (Ab-based)의 금 나노입자와 달리, 본 발명에서 사용한 RPA70A-금 나노입자 접합체 (RPA70-based)는 항원이 존재하지 않을 때와 비교하였을 때, 약 8배 가량 더 응집함을 관찰되었고, 이로 인해 신호 향상을 가져옴을 보여주었다. 따라서, RPA70이 압타머의 구조를 변경시키지 않고 금 나노 입자의 응집을 유도하여 신호 향상을 가져옴을 보여주었다(도 5 및 6 참조). As shown in Fig. 5, unlike gold nanoparticles of the conventional immunodetection conjugate (Ab-based) using an antibody, the RPA70A-gold nanoparticle conjugate (RPA70-based) used in the present invention does not contain an antigen. Compared with the time, it was observed that the agglomeration was about eight times more, and this resulted in signal enhancement. Thus, it was shown that RPA70 induces the aggregation of gold nanoparticles without changing the structure of the aptamer, thereby improving the signal (see FIGS. 5 and 6).
[실시예 3] 본 발명의 면역 검출용 접합체의 항원 농도별 검출 확인[Example 3] Confirmation of detection by antigen concentration of the conjugate for immune detection of the present invention
본 발명의 면역 검출용 접합체를 이용하여 항원 농도별 검출 확인을 진행하였다. 또한 제작된 면역 검출용 접합체의 활용 다양성을 관찰하기 위해, 다양한 항원의 농도를 각각 실험용 버퍼와 사람의 비강 액에 희석하여 실험을 진행하였다. Using the conjugate for immune detection of the present invention, detection and confirmation by antigen concentration were performed. In addition, in order to observe the diversity of utilization of the prepared immunodetecting conjugate, the experiment was conducted by diluting the concentrations of various antigens in an experimental buffer and human nasal fluid, respectively.
도 6a에 나타낸 것처럼, 실험용 버퍼에 다양한 농도의 항원 (타겟)과 압타머를 각각 섞은 후, 제작한 RPA70A-금 나노입자 접합체를 멤브레인에 흘려 반응시켰다. 그 결과 농도 경향성에 따라 테스트 라인의 진하기가 관찰되었고, 육안으로 10 pg·mL-1에 해당하는 항원 농도까지 검출이 가능하였다. 마찬가지로 사람의 비강 액에 희석한 항원도 농도별 검출 결과 10 pg·mL-1까지 육안으로 확인 가능하였다 (도 6b 참조). 이는 기존의 면역 검출용 접합체 (항체 사용)를 이용한 방법보다 약 1000배 가량 민감도가 향상됨을 나타내며 (인플루엔자 검출 키트 기준), 본 발명에서 제작된 RPA70A-금 나노입자 접합체가 실험용 버퍼 뿐 아니라 사람의 샘플 내에서도 비슷한 신호 증폭 효과를 나타냄을 의미한다.As shown in Fig. 6a, after mixing various concentrations of antigen (target) and aptamer in the experimental buffer, the prepared RPA70A-gold nanoparticle conjugate was flowed through the membrane to react. As a result, the darkness of the test line was observed according to the concentration trend, and it was possible to detect an antigen concentration corresponding to 10 pg·mL -1 with the naked eye. Similarly, the antigen diluted in human nasal fluid was also visually confirmed up to 10 pg·mL −1 as a result of detection by concentration (see FIG. 6B). This indicates that the sensitivity is improved by about 1000 times compared to the method using the conventional immunodetection conjugate (using antibody) (based on influenza detection kit), and the RPA70A-gold nanoparticle conjugate produced in the present invention is not only an experimental buffer but also a human sample It means that it exhibits a similar signal amplification effect within.
이를 종합하면, RPA70 단백질을 이용한 금 나노입자의 신규한 신호 증폭 방법을 개발하였고, 단일 핵산 가닥과 결합력이 더 좋은 RPA70의 A domain만을 engineering하여 효과적인 증폭 효과를 야기하고, 골드-항체 접합체와는 달리, RPA70은 단일 가닥 핵산 길이에 따라 무한대로 결합이 가능하므로 더욱 효과적인 신호 증폭 효과가 기대되고, 항체-압타머 구조의 센서에서 타겟의 제한 없이 사용 가능하다.Taken together, a novel signal amplification method of gold nanoparticles using RPA70 protein was developed, and only a single nucleic acid strand and the A domain of RPA70 with better avidity were engineered to cause an effective amplification effect, unlike gold-antibody conjugates. , RPA70 can be bound indefinitely according to the length of a single-stranded nucleic acid, so a more effective signal amplification effect is expected, and can be used in a sensor having an antibody-aptamer structure without limitation of a target.
이상에서, 출원인은 본 발명의 바람직한 실시 예들을 설명하였지만, 이와 같은 실시예들은 본 발명의 기술적 사상을 구현하는 일 실시예일 뿐이며 본 발명의 기술적 사상을 구현하는 한 어떠한 변경예 또는 수정예도 본 발명의 범위에 속하는 것으로 해석되어야 한다.In the above, the applicant has described the preferred embodiments of the present invention, but such embodiments are only one embodiment embodying the technical idea of the present invention, and any change or modification of the present invention as long as the technical idea of the present invention is implemented. It should be construed as falling within the scope.
<110> SB BIOSCIENCE CO.Ltd. <120> Conjugate for immunodetection and immunodetective method by using the same <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> INFA-apt1 <400> 1 tagggaagag aaggacatat gatgcacgtg cacccgcaca tgtagcacag ggatcaagtg 60 gtcatgtact agtcaa 76 <210> 2 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> INFA-apt2 <400> 2 tagggaagag aaggacatat gattggcttg catgctggac ttcctactgg ttttcaagtg 60 gtcatgtact agtcaa 76 <210> 3 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> INFA-apt3 <400> 3 tagggaagag aaggacatat gatccattgc agtacgatga cgtgtgtgtg ggatcaagtg 60 gtcatgtact agtcaa 76 <210> 4 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> INFA-apt4 <400> 4 tagggaagag aaggacatat gatggcgtac ggggatgagg tgatcgtagt gggtcaagtg 60 gtcatgtact agtcaa 76 <210> 5 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(120) <223> F domain of Human RPA70 <400> 5 Met Val Gly Gln Leu Ser Glu Gly Ala Ile Ala Ala Ile Met Gln Lys 1 5 10 15 Gly Asp Thr Asn Ile Lys Pro Ile Leu Gln Val Ile Asn Ile Arg Pro 20 25 30 Ile Thr Thr Gly Asn Ser Pro Pro Arg Tyr Arg Leu Leu Met Ser Asp 35 40 45 Gly Leu Asn Thr Leu Ser Ser Phe Met Leu Ala Thr Gln Leu Asn Pro 50 55 60 Leu Val Glu Glu Glu Gln Leu Ser Ser Asn Cys Val Cys Gln Ile His 65 70 75 80 Arg Phe Ile Val Asn Thr Leu Lys Asp Gly Arg Arg Val Val Ile Leu 85 90 95 Met Glu Leu Glu Val Leu Lys Ser Ala Glu Ala Val Gly Val Lys Ile 100 105 110 Gly Asn Pro Val Pro Tyr Asn Glu 115 120 <210> 6 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(123) <223> A domain of Human RPA70 <400> 6 Gln Ser Lys Val Val Pro Ile Ala Ser Leu Thr Pro Tyr Gln Ser Lys 1 5 10 15 Trp Thr Ile Cys Ala Arg Val Thr Asn Lys Ser Gln Ile Arg Thr Trp 20 25 30 Ser Asn Ser Arg Gly Glu Gly Lys Leu Phe Ser Leu Glu Leu Val Asp 35 40 45 Glu Ser Gly Glu Ile Arg Ala Thr Ala Phe Asn Glu Gln Val Asp Lys 50 55 60 Phe Phe Pro Leu Ile Glu Val Asn Lys Val Tyr Tyr Phe Ser Lys Gly 65 70 75 80 Thr Leu Lys Ile Ala Asn Lys Gln Phe Thr Ala Val Lys Asn Asp Tyr 85 90 95 Glu Met Thr Phe Asn Asn Glu Thr Ser Val Met Pro Cys Glu Asp Asp 100 105 110 His His Leu Pro Thr Val Gln Phe Asp Phe Thr 115 120 <210> 7 <211> 138 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(138) <223> B domain of Human RPA70 <400> 7 Gly Ile Asp Asp Leu Glu Asn Lys Ser Lys Asp Ser Leu Val Asp Ile 1 5 10 15 Ile Gly Ile Cys Lys Ser Tyr Glu Asp Ala Thr Lys Ile Thr Val Arg 20 25 30 Ser Asn Asn Arg Glu Val Ala Lys Arg Asn Ile Tyr Leu Met Asp Thr 35 40 45 Ser Gly Lys Val Val Thr Ala Thr Leu Trp Gly Glu Asp Ala Asp Lys 50 55 60 Phe Asp Gly Ser Arg Gln Pro Val Leu Ala Ile Lys Gly Ala Arg Val 65 70 75 80 Ser Asp Phe Gly Gly Arg Ser Leu Ser Val Leu Ser Ser Ser Thr Ile 85 90 95 Ile Ala Asn Pro Asp Ile Pro Glu Ala Tyr Lys Leu Arg Gly Trp Phe 100 105 110 Asp Ala Glu Gly Gln Ala Leu Asp Gly Val Ser Ile Ser Asp Leu Lys 115 120 125 Ser Gly Gly Val Gly Gly Ser Asn Thr Asn 130 135 <210> 8 <211> 175 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(175) <223> C domain of Human RPA70 <400> 8 Trp Lys Thr Leu Tyr Glu Val Lys Ser Glu Asn Leu Gly Gln Gly Asp 1 5 10 15 Lys Pro Asp Tyr Phe Ser Ser Val Ala Thr Val Val Tyr Leu Arg Lys 20 25 30 Glu Asn Cys Met Tyr Gln Ala Cys Pro Thr Gln Asp Cys Asn Lys Lys 35 40 45 Val Ile Asp Gln Gln Asn Gly Leu Tyr Arg Cys Glu Lys Cys Asp Thr 50 55 60 Glu Phe Pro Asn Phe Lys Tyr Arg Met Ile Leu Ser Val Asn Ile Ala 65 70 75 80 Asp Phe Gln Glu Asn Gln Trp Val Thr Cys Phe Gln Glu Ser Ala Glu 85 90 95 Ala Ile Leu Gly Gln Asn Ala Ala Tyr Leu Gly Glu Leu Lys Asp Lys 100 105 110 Asn Glu Gln Ala Phe Glu Glu Val Phe Gln Asn Ala Asn Phe Arg Ser 115 120 125 Phe Ile Phe Arg Val Arg Val Lys Val Glu Thr Tyr Asn Asp Glu Ser 130 135 140 Arg Ile Lys Ala Thr Val Met Asp Val Lys Pro Val Asp Tyr Arg Glu 145 150 155 160 Tyr Gly Arg Arg Leu Val Met Ser Ile Arg Arg Ser Ala Leu Met 165 170 175 <110> SB BIOSCIENCE CO.Ltd. <120> Conjugate for immunodetection and immunodetective method by using the same <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> INFA-apt1 <400> 1 tagggaagag aaggacatat gatgcacgtg cacccgcaca tgtagcacag ggatcaagtg 60 gtcatgtact agtcaa 76 <210> 2 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> INFA-apt2 <400> 2 tagggaagag aaggacatat gattggcttg catgctggac ttcctactgg ttttcaagtg 60 gtcatgtact agtcaa 76 <210> 3 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> INFA-apt3 <400> 3 tagggaagag aaggacatat gatccattgc agtacgatga cgtgtgtgtg ggatcaagtg 60 gtcatgtact agtcaa 76 <210> 4 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> INFA-apt4 <400> 4 tagggaagag aaggacatat gatggcgtac ggggatgagg tgatcgtagt gggtcaagtg 60 gtcatgtact agtcaa 76 <210> 5 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(120) <223> F domain of Human RPA70 <400> 5 Met Val Gly Gln Leu Ser Glu Gly Ala Ile Ala Ala Ile Met Gln Lys 1 5 10 15 Gly Asp Thr Asn Ile Lys Pro Ile Leu Gln Val Ile Asn Ile Arg Pro 20 25 30 Ile Thr Thr Gly Asn Ser Pro Pro Arg Tyr Arg Leu Leu Met Ser Asp 35 40 45 Gly Leu Asn Thr Leu Ser Ser Phe Met Leu Ala Thr Gln Leu Asn Pro 50 55 60 Leu Val Glu Glu Glu Gln Leu Ser Ser Asn Cys Val Cys Gln Ile His 65 70 75 80 Arg Phe Ile Val Asn Thr Leu Lys Asp Gly Arg Arg Val Val Ile Leu 85 90 95 Met Glu Leu Glu Val Leu Lys Ser Ala Glu Ala Val Gly Val Lys Ile 100 105 110 Gly Asn Pro Val Pro Tyr Asn Glu 115 120 <210> 6 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(123) <223> A domain of Human RPA70 <400> 6 Gln Ser Lys Val Val Pro Ile Ala Ser Leu Thr Pro Tyr Gln Ser Lys 1 5 10 15 Trp Thr Ile Cys Ala Arg Val Thr Asn Lys Ser Gln Ile Arg Thr Trp 20 25 30 Ser Asn Ser Arg Gly Glu Gly Lys Leu Phe Ser Leu Glu Leu Val Asp 35 40 45 Glu Ser Gly Glu Ile Arg Ala Thr Ala Phe Asn Glu Gln Val Asp Lys 50 55 60 Phe Phe Pro Leu Ile Glu Val Asn Lys Val Tyr Tyr Phe Ser Lys Gly 65 70 75 80 Thr Leu Lys Ile Ala Asn Lys Gln Phe Thr Ala Val Lys Asn Asp Tyr 85 90 95 Glu Met Thr Phe Asn Asn Glu Thr Ser Val Met Pro Cys Glu Asp Asp 100 105 110 His His Leu Pro Thr Val Gln Phe Asp Phe Thr 115 120 <210> 7 <211> 138 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(138) <223> B domain of Human RPA70 <400> 7 Gly Ile Asp Asp Leu Glu Asn Lys Ser Lys Asp Ser Leu Val Asp Ile 1 5 10 15 Ile Gly Ile Cys Lys Ser Tyr Glu Asp Ala Thr Lys Ile Thr Val Arg 20 25 30 Ser Asn Asn Arg Glu Val Ala Lys Arg Asn Ile Tyr Leu Met Asp Thr 35 40 45 Ser Gly Lys Val Val Thr Ala Thr Leu Trp Gly Glu Asp Ala Asp Lys 50 55 60 Phe Asp Gly Ser Arg Gln Pro Val Leu Ala Ile Lys Gly Ala Arg Val 65 70 75 80 Ser Asp Phe Gly Gly Arg Ser Leu Ser Val Leu Ser Ser Ser Thr Ile 85 90 95 Ile Ala Asn Pro Asp Ile Pro Glu Ala Tyr Lys Leu Arg Gly Trp Phe 100 105 110 Asp Ala Glu Gly Gln Ala Leu Asp Gly Val Ser Ile Ser Asp Leu Lys 115 120 125 Ser Gly Gly Val Gly Gly Ser Asn Thr Asn 130 135 <210> 8 <211> 175 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(175) <223> C domain of Human RPA70 <400> 8 Trp Lys Thr Leu Tyr Glu Val Lys Ser Glu Asn Leu Gly Gln Gly Asp 1 5 10 15 Lys Pro Asp Tyr Phe Ser Ser Val Ala Thr Val Val Tyr Leu Arg Lys 20 25 30 Glu Asn Cys Met Tyr Gln Ala Cys Pro Thr Gln Asp Cys Asn Lys Lys 35 40 45 Val Ile Asp Gln Gln Asn Gly Leu Tyr Arg Cys Glu Lys Cys Asp Thr 50 55 60 Glu Phe Pro Asn Phe Lys Tyr Arg Met Ile Leu Ser Val Asn Ile Ala 65 70 75 80 Asp Phe Gln Glu Asn Gln Trp Val Thr Cys Phe Gln Glu Ser Ala Glu 85 90 95 Ala Ile Leu Gly Gln Asn Ala Ala Tyr Leu Gly Glu Leu Lys Asp Lys 100 105 110 Asn Glu Gln Ala Phe Glu Glu Val Phe Gln Asn Ala Asn Phe Arg Ser 115 120 125 Phe Ile Phe Arg Val Arg Val Lys Val Glu Thr Tyr Asn Asp Glu Ser 130 135 140 Arg Ile Lys Ala Thr Val Met Asp Val Lys Pro Val Asp Tyr Arg Glu 145 150 155 160 Tyr Gly Arg Arg Leu Val Met Ser Ile Arg Arg Ser Ala Leu Met 165 170 175
Claims (1)
b) 면역 검출 센서를 포함하는 면역 검출 키트로서,
상기 면역 검출 센서는
시료 패드;
단일 가닥 DNA 결합 단백질과 신호발생물질이 결합된 접합체를 포함하는 접합체 패드;
검출 대상 물질과 특이적으로 결합하는 리셉터를 포함하는 검출부; 및
흡수 패드를 포함하며,
상기 접합체는 검출 대상 물질과 압타머가 특이적으로 결합하는 부위 이외의 영역에서 상기 압타머와 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는, 면역 검출 키트.a) a container containing an aptamer specifically binding to a substance to be detected; And
b) an immune detection kit comprising an immune detection sensor,
The immune detection sensor
Sample pad;
A conjugate pad comprising a conjugate in which a single-stranded DNA binding protein and a signal generating material are bound;
A detection unit including a receptor that specifically binds to a substance to be detected; And
Including an absorbent pad,
The conjugate is characterized in that it specifically binds to the aptamer in a region other than a region where the substance to be detected and the aptamer specifically bind.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210000914A KR102221169B1 (en) | 2021-01-05 | 2021-01-05 | Immunodetection kit comprising conjugate of single-stranded DNA-binding protein and signal generating material and immunodetective method by using the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210000914A KR102221169B1 (en) | 2021-01-05 | 2021-01-05 | Immunodetection kit comprising conjugate of single-stranded DNA-binding protein and signal generating material and immunodetective method by using the same |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020180128189A Division KR102205032B1 (en) | 2018-10-25 | 2018-10-25 | Conjugate for immunodetection and immunodetective method by using the same |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20210007005A true KR20210007005A (en) | 2021-01-19 |
| KR102221169B1 KR102221169B1 (en) | 2021-02-26 |
Family
ID=74237456
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020210000914A KR102221169B1 (en) | 2021-01-05 | 2021-01-05 | Immunodetection kit comprising conjugate of single-stranded DNA-binding protein and signal generating material and immunodetective method by using the same |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102221169B1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20220159007A (en) * | 2021-05-25 | 2022-12-02 | (주)광림정공 | An environmental sensor for contaminant detection and manufacturing method for the environmental sensor |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3777984B2 (en) | 2001-01-10 | 2006-05-24 | 株式会社島津製作所 | Nucleic acid aptamer self-integrated biosensor and chip device including the same as a detection unit |
| KR20110012353A (en) * | 2009-07-30 | 2011-02-09 | 한국과학기술연구원 | Immunoassay-based antigen detecting kit and method |
| KR20130123766A (en) * | 2012-05-03 | 2013-11-13 | 한국과학기술연구원 | Multiplex assay for target substance with enhanced signal amplification using gold nanoparticles and system for the same |
| US9163048B2 (en) | 2011-10-17 | 2015-10-20 | Research & Business Foundation Sungkyunkwan University | Multi-functional nucleic acid-based anti-cancer drug capable of targeting and therapy, method for preparing same and anti-cancer composition comprising same |
| EP2995300A1 (en) | 2013-02-13 | 2016-03-16 | Chung-Ang University Industry-Academic Cooperation Foundation | Protein transduction domain based on gold nanoparticle-aptamer conjugate and method for producing same |
| US9642805B2 (en) | 2011-11-07 | 2017-05-09 | Northwestern University | Aptamer-loaded, biocompatible nanoconstructs for nuclear-targeted cancer therapy |
-
2021
- 2021-01-05 KR KR1020210000914A patent/KR102221169B1/en active IP Right Grant
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3777984B2 (en) | 2001-01-10 | 2006-05-24 | 株式会社島津製作所 | Nucleic acid aptamer self-integrated biosensor and chip device including the same as a detection unit |
| KR20110012353A (en) * | 2009-07-30 | 2011-02-09 | 한국과학기술연구원 | Immunoassay-based antigen detecting kit and method |
| US9163048B2 (en) | 2011-10-17 | 2015-10-20 | Research & Business Foundation Sungkyunkwan University | Multi-functional nucleic acid-based anti-cancer drug capable of targeting and therapy, method for preparing same and anti-cancer composition comprising same |
| US9642805B2 (en) | 2011-11-07 | 2017-05-09 | Northwestern University | Aptamer-loaded, biocompatible nanoconstructs for nuclear-targeted cancer therapy |
| KR20130123766A (en) * | 2012-05-03 | 2013-11-13 | 한국과학기술연구원 | Multiplex assay for target substance with enhanced signal amplification using gold nanoparticles and system for the same |
| EP2995300A1 (en) | 2013-02-13 | 2016-03-16 | Chung-Ang University Industry-Academic Cooperation Foundation | Protein transduction domain based on gold nanoparticle-aptamer conjugate and method for producing same |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Anal. Chem., vol.84, pp.7203-7211 (2012)* * |
| RSV Adv., vol.7, pp.8381-8387 (2017)* * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20220159007A (en) * | 2021-05-25 | 2022-12-02 | (주)광림정공 | An environmental sensor for contaminant detection and manufacturing method for the environmental sensor |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR102221169B1 (en) | 2021-02-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR102205032B1 (en) | Conjugate for immunodetection and immunodetective method by using the same | |
| US9562907B2 (en) | Aptamers screening method based on graphene without target immobilization and the aptamers obtained from the method | |
| Roh et al. | Quantitative and sensitive detection of SARS coronavirus nucleocapsid protein using quantum dots‐conjugated RNA aptamer on chip | |
| Jiang et al. | A portable visual capillary sensor based on functional DNA crosslinked hydrogel for point-of-care detection of lead ion | |
| EP2812453B1 (en) | Nucleic acid aptamers against plasmodium lactate dehydrogenase and histidine-rich protein ii and uses thereof for malaria diagnosis | |
| Lai et al. | Carbon nanoparticles based electrochemical biosensor strip for detection of Japanese encephalitis virus | |
| KR101841046B1 (en) | Novel reduced graphene oxide-based aptasensor for detecting kanamycin and use thereof | |
| JP2010533867A (en) | Analyte detection assay | |
| Bognár et al. | Aptamers against immunoglobulins: Design, selection and bioanalytical applications | |
| KR102221169B1 (en) | Immunodetection kit comprising conjugate of single-stranded DNA-binding protein and signal generating material and immunodetective method by using the same | |
| Roh et al. | A highly sensitive and selective viral protein detection method based on RNA oligonucleotide nanoparticle | |
| Chen et al. | Visual test paper for on-site polychlorinated biphenyls detection and its logic gate applications | |
| Chowdhury et al. | Use of target-specific liposome and magnetic nanoparticle conjugation for the amplified detection of norovirus | |
| Wang et al. | Sensitive fluorescence aptasensor based on hybridization chain reaction with upconversion nanoparticles by triplex DNA formation for bisphenol A detection | |
| KR102221168B1 (en) | Conjugate for detecting Influenza A virus and method for detecting Influenza A virus using the same | |
| Guo et al. | RNA-cleaving deoxyribozyme-linked immunosorbent assay for the ultrasensitive detection of chloramphenicol in milk | |
| Park et al. | Fast-response electrochemical biosensor based on a truncated aptamer and MXene heterolayer for West Nile virus detection in human serum | |
| KR101569249B1 (en) | Optical based graphene biosensor with aptamers, a preparation method of the same and a method for detecting a target material using the same | |
| He et al. | Personal glucose meters coupled with signal amplification technologies for quantitative detection of non-glucose targets: Recent progress and challenges in food safety hazards analysis | |
| Modh et al. | Specific detection of tetanus toxoid using an aptamer-based matrix | |
| EP2092343B1 (en) | Detection conjugate | |
| KR101327249B1 (en) | DNA aptamers for Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome(PRRS) virus | |
| KR101841262B1 (en) | Nucleic Acid Aptamer Capable of Specifically Binding to AI Virus and Uses Thereof | |
| KR101402316B1 (en) | ELAAS (Enzyme-linked Antibody Aptamer Sandwich) Method of Detecting Adipokines Using Necleic Acid Aptamer and Antibody | |
| Ferreira et al. | Cutting-edge biorecognition strategies to boost the detection performance of COVID-19 electrochemical Biosensors: A review |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A107 | Divisional application of patent | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant |