KR20210003826A - CD8αβ 및 클래스 1 제한된 T 세포 수용체의 강제 발현에 의한 CD4 T 세포의 세포독성 CD8 세포로의 재프로그래밍 - Google Patents

CD8αβ 및 클래스 1 제한된 T 세포 수용체의 강제 발현에 의한 CD4 T 세포의 세포독성 CD8 세포로의 재프로그래밍 Download PDF

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바쓰 캐롤라인 에바 아버
가간 바와
말콤 케이. 브레너
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베이롤 칼리지 오브 메드신
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Abstract

본 개시 내용의 실시 형태는 T 세포 요법의 개선과 관련된 방법 및 조성물을 포함한다. 특정 실시 형태에서, CD8+ T 세포 요법은 CD8+ T 세포에서 형질 전환 CD8αβ 공동 수용체의 발현시 증진된다. 특정 실시 형태에서, CD4+ T 세포는 CD4+ T 세포에서 형질 전환 CD8αβ 공동 수용체의 발현시 입양 전이을 위한 세포독성 세포 기능을 갖도록 한다. 특정 실시 형태에서, TCR 발현 및 CD8αβ 공동 수용체 발현 CD4+ 및 CD8+ T 세포는 입양 전이에 이용된다.

Description

CD8αβ 및 클래스 1 제한된 T 세포 수용체의 강제 발현에 의한 CD4 T 세포의 세포독성 CD8 세포로의 재프로그래밍
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2018년 4월 19일 목요일자로 출원된 미국 가출원 US 62/659,971에 대한 0우선권을 주장하며, 그 전문은 본 명세서에 참조로 포함된다.
기술분야
본 개시 내용의 실시 형태는 적어도 암 의학을 비롯한 면역학, 세포 생물학, 생물학, 분자 생물학, 세포 요법 및 의학 분야에 관한 것이다.
다발성 골수종과 같은 혈액학적 악성 종양에 대한 T 세포 수용체 (T cell receptor: TCR) 조작된 입양 T 세포 요법은 고무적인 결과를 낳았다1. 그러나, 종양 관련 자기 항원을 표적화하는 대부분의 TCR은 자가 레퍼토리로부터 단리되고, 낮은 기능적 결합 활성 (avidity)을 가지며; 높은 친화성 TCR을 갖는 대부분의 T 세포는 흉선 선택 과정에서 제거되고, 생존한 클론은 자가 면역 질환을 피하기 위해 말초 미세 조정을 거친다2,3. 이러한 보통의 결합 친화성은 악성 세포에서 낮은 수준의 종양 관련 항원 (tumor associated antigen: TAA)을 인식하는 TCR 형질 전환 T 세포의 능력을 제한할 수 있다. 이러한 한계를 극복하기 위한 전략으로는 동종이계 레퍼토리로부터의 높은 친화성 TCR 분리4 또는 높은 친화성 합성 TCR의 생성 및 선택5,6이 포함된다. 이러한 전략들은 성공할 수 있지만1,5,6, 이들은 잠재적으로 치명적인 오프 표적 효과 (off-target effect)를 갖는 심각한 원치 않는 교차 반응성을 초래할 수 있다7-9. 따라서, 본 발명자들은 이제 대체 접근법을 조사하였다. TAA로부터 유래된 에피토프를 표적화하는 대부분의 TCR은 HLA-클래스 I 제한되며, 생리학적 조건하에, CD8αβ 공동 수용체는 HLA 클래스 I 제한된 TCR을 발현하는 T 세포의 기능적 결합 활성을 증가시킨다10,11. CD8 T 세포에서, 제한된 내인성 공동 수용체 이용 가능성은 도입된 TCR과 내인성 CD8 사이의 카피 수의 불균형으로 인해 완전하고 지속적인 활성화를 방해할 수 있다. 바이러스 벡터로 조작된 T 세포는 도입된 전이 유전자의 초생리학적 카피 수를 발현하는 반면, CD8 공동 수용체는 생리학적 수준으로 발현된다. CD8αβ 공동 수용체의 강제 발현은 형질 전환 TCR과 함께 전체 TCR+ T 세포:표적 세포 상호 작용을 증가시켜 증가된 항종양 기능을 초래하는 것으로 본 출원에 나타나 있다.
CD8+와 CD4+ T 세포 사이의 상호 작용은 효과적인 면역 반응의 조정에 중요하다13. 따라서, 결과는 형질 전환 HLA-클래스 I 제한된 TCR을 발현하는 CD4+ T 세포에서 CD8αβ 공동 수용체의 발현을 강제하는 것으로 결정되었다. CD4+ T 세포는 바이러스 감염에 대한 항원 특이적 면역에 다면적인 기여를 하며, 장기 종양 제어의 개시 및 유지에 필수 불가결하다4. 예를 들어, 골수 이식 후 감염을 치료하기 위한 사이토메갈로바이러스 특이적 CD8+ T 세포 클론의 주입은 바이러스 혈증을 제어하지만, 추가의 CD4+ 헬퍼 T 세포의 존재하에서만 이러한 전달된 CD8+ T 세포는 지속된다.15 종양 표적화 T 세포 요법이 사용될 때, 유사한 중요성이 CD4+ T 세포에 전가된다. 예를 들어, 전이성 담관 암종 환자 유래의 신생 항원 반응성 종양 침윤 림프구는 주로 CD4+ TH1 구획에 포함되어 있으며, 이러한 세포들의 입양 전이는 종양 퇴행을 초래하였다16. CD19 표적화 키메라 항원 수용체 (chimeric antigen receptor: CAR) T 세포의 항종양 활성의 상승적 증진은 규정된 CD4:CD8 비율을 갖는 CAR T 세포를 사용하는 버킷 림프종 이종 이식 마우스 모델에서 보고되었으며17, 림프종 환자에 대한 최종 생성물에서 1:1의 CD4:CD8 CD19-CAR T 세포 비율을 갖는 임상 시험은 CD4+와 CD8+ 서브 세트 모두의 T 세포 확장 및 지속성과 관련된 높은 비율의 종양 반응을 나타냈는데18, 이는 CD4+ 및 CD8+ 종양 특이적 T 세포 모두가 악성 제어에 최적이다는 것을 나타낸다.
상기 결과는 (1) TCR+ CD8+ T 세포 기능이 CD8 공동 수용체의 증가된 이용 가능성에 의해 증진될 수 있으며, (2) CD8αβ 및 형질 전환 MHC 클래스 I 제한된 TAA 특이적 TCR 모두의 강제 발현을 갖는 CD4+ T 세포가 CD4+ TH 세포의 헬퍼 기능을 보존하면서 다기능 하이브리드 세포독성 이펙터 세포로 재프로그래밍된다는 것을 나타낸다. 이러한 하이브리드 세포들은 TCR-펩타이드-MHC 복합체 및 TCR 신호 전달의 증가된 안정성과 관련된 감소된 기능적 고갈 및 개선된 확장으로 시험관내 및 생체내에서 증진된 항종양 기능을 갖는다.
따라서, 본 개시 내용은 공동 수용체 의존적 TCR 형질 전환 CD8+ T 세포의 기능을 증진시키고 입양 전이를 위한 세포독성 및 헬퍼 기능 모두 갖는 하이브리드 CD4+ T 세포의 사용을 가능하게 하는 접근법을 제공함으로써 입양 전이 분야에서의 요구를 다룬다.
간략한 개요
본 개시 내용의 실시 형태는 이를 필요로 하는 포유 동물 개체를 위한 세포 요법과 관련된 방법 및 조성물을 포함한다. 상기 세포 요법은 암과 같은 의학적 병태에 대한 요법으로서 효과적이도록 사람의 손에 의해 조작되는 세포를 포함한다. 상기 세포 요법은 항원을 표적화하는 수용체를 갖는 T 세포 또는 NK 세포와 같은 면역 이펙터 세포를 포함하고, 상기 수용체는 내인성이고 세포에 대해 본래의 것일 수 있거나 사람의 손에 의해 조작될 수 있다. 특정 실시 형태에서, 상기 세포 요법의 세포는 상기 요법을 위한 세포의 효능을 증진시키는 단백질을 발현하도록 변형되고, 특히, 상기 세포는 또한 특정 항원을 표적화하는 수용체 (세포에 대해 본래의 것이거나 아님)를 발현한다. 수용체가 표적화되는 항원은 특정 실시 형태에서 암 항원이다. 수용체가 적어도 일부 경우에서 T 세포 수용체 (TCR)이지만, 대안적인 경우에서는 수용체가 키메라 항원 수용체 (CAR)이거나, 세포는 둘 다를 발현할 수 있다.
특별한 실시 형태에서, 상기 요법을 위한 세포의 효능을 증진시키는 단백질은 CD8-α 및/또는 CD8-β 쇄를 포함하는 분화 클러스터 8 (CD8)이다. T 세포는 CD4+ T 세포든지 또는 CD8+ T 세포든지 여부에 관계 없이 CD8αβ를 발현하도록 변형된다. CD8+ T 세포의 경우, CD8+ T 세포에서 CD8αβ 공동 수용체의 발현 수준의 증가는 세포에서 본래의 TCR의 효과적인 능력을 증진시키고, 또한 형질 전환 CD8+ T 세포에서 조작된 TCR의 효과적인 능력을 증진시킨다. 자연적인 헬퍼 T 세포인 CD4+ T 세포가 CD8αβ를 발현하도록 변형되는 경우, 형질 전환 발현은 CD4+ T 세포가 또한 세포독성 활성을 갖도록 한다.
본 개시 내용의 실시 형태는 다음 중 하나 또는 둘 다를 유효량으로 개체에게 제공하는 단계를 포함하는, 개체에 대한 면역 이펙터 세포 요법을 증진시키는 방법을 포함한다: 외인성 CD8αβ 공동 수용체를 발현하고, 임의로, 하나 이상의 외인성 조작된 항원 수용체를 발현하는 CD8+ 세포; 및 외인성 CD8αβ 공동 수용체 및 하나 이상의 외인성 조작된 항원 수용체를 발현하는 CD4+ 세포. 특정한 경우에서, 상기 조작된 항원 수용체는 T 세포 수용체 (TCR), 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 둘 다이다. 상기 CD8+ 세포, CD4+ 세포 또는 둘 다는 개체에 대해 자가 또는 동종이계이다. 일부 경우에서, 상기 외인성 조작된 항원 수용체 및 상기 외인성 CD8αβ 공동 수용체는 상기 세포에서 동일한 벡터로부터 발현되고, 상기 벡터는 상기 외인성 조작된 항원 수용체 및 상기 외인성 CD8αβ 공동 수용체를 개별적으로 발현하는 하나 이상의 발현 작제물을 포함할 수 있다. 특정 실시 형태에서, 상기 외인성 조작된 항원 수용체를 발현하는 발현 작제물 및 상기 외인성 CD8αβ 공동 수용체를 발현하는 발현 작제물은 2A 요소 또는 IRES 요소에 의해 분리된다. 일부 경우에서, 상기 외인성 조작된 항원 수용체 및 상기 외인성 CD8αβ 공동 수용체는 상기 세포에서 상이한 벡터로부터 발현된다. 임의의 경우에서, 상기 벡터는 바이러스 벡터 (아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터) 또는 비-바이러스 벡터일 수 있다.
상기 방법의 특별한 실시 형태에서에서, 상기 항원은 종양 항원 또는 병원체 항원이다. 종양 항원의 예로는 서바이빈, PRAME, CD19, CD20, CD22, 카파 또는 경쇄, CD30, CD33, CD123, CD38, ROR1, ErbB2, ErbB3/4, EGFR vIII, 암배아 항원, EGP2, EGP40, 메소텔린, TAG72, PSMA, NKG2D 리간드, B7-H6, IL-13 수용체 cc2, IL-11 수용체 R a, MUC1, MUC16, CA9, GD2, GD3, HMW-MAA, CD171, 루이스 Y, G250/CAIX, HLA-AI MAGE Al, HLA-A2 NY-ESO-1, PSC1, 폴레이트 수용체-a, CD44v7/8, 8H9, NCAM, VEGF 수용체, 5T4, 태아 AchR, NKG2D 리간드, HER2, BCMA, CD44v6 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것들이 포함된다.
본 개시 내용의 방법은 유효량의 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 또는 이들의 혼합물을 상기 개체에게 제공하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 경우, 상기 방법은 추가의 암 요법을 상기 개체에게 제공하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 개시 내용의 실시 형태는 CD4+ T 세포를 외인성 CD8αβ 공동 수용체 및 외인성 조작된 항원 수용체로 형질 감염시키는 단계를 포함하는, 세포독성 이펙터 세포 기능 및 헬퍼 기능을 갖는 CD4+ T 세포를 생산하는 방법을 포함한다. 상기 조작된 항원 수용체는 T 세포 수용체 (TCR), 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 둘 다일 수 있다. 상기 외인성 조작된 항원 수용체 및 상기 외인성 CD8αβ 공동 수용체는 상기 세포에서 동일한 벡터로부터 발현될 수 있거나 발현될 수 없다. 특히, 상기 벡터는 상기 외인성 조작된 항원 수용체 및 상기 외인성 CD8αβ 공동 수용체를 개별적으로 발현하는 하나 이상의 발현 작제물을 포함한다. 상기 외인성 조작된 항원 수용체를 발현하는 발현 작제물 및 상기 외인성 CD8αβ 공동 수용체를 발현하는 발현 작제물은 2A 요소 또는 IRES 요소에 의해 분리될 수 있다. 벡터는 바이러스 벡터 (아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터) 또는 비-바이러스 벡터를 포함한다.
상기 항원은 종양 항원 또는 병원체 항원일 수 있다. 일부 경우에서, 상기 종양 항원은 서바이빈, PRAME, CD19, CD20, CD22, 카파 또는 경쇄, CD30, CD33, CD123, CD38, ROR1, ErbB2, ErbB3/4, EGFR vIII, 암배아 항원, EGP2, EGP40, 메소텔린, TAG72, PSMA, NKG2D 리간드, B7-H6, IL-13 수용체 cc2, IL-11 수용체 R a, MUC1, MUC16, CA9, GD2, GD3, HMW-MAA, CD171, 루이스 Y, G250/CAIX, HLA-AI MAGE Al, HLA-A2 NY-ESO-1, PSC1, 폴레이트 수용체-a, CD44v7/8, 8H9, NCAM, VEGF 수용체, 5T4, 태아 AchR, NKG2D 리간드, HER2, BCMA, CD44v6 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본 개시 내용의 방법은 유효량의 CD4+ T 세포를 이를 필요로 하는 개체, 예를 들어, 암을 갖는 사람에게 제공하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 외인성 CD8αβ 공동 수용체, 외인성 조작된 항원 수용체 또는 둘 다를 발현하는 유효량의 CD8+ T 세포는 상기 개체에게 제공되며, 상기 개체체는 또한 추가의 암 요법을 제공받을 수 있다.
본 개시 내용의 실시 형태는 CD8+ T 세포를 외인성 CD8αβ 공동 수용체로 형질 감염시키는 단계를 포함하는, CD8+ T 세포의 세포독성을 증진시키는 방법을 포함한다. 상기 CD8+ T 세포는 또는 T 세포 수용체 (TCR), 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 둘 다와 같은 외인성 조작된 항원 수용체를 발현할 수 있다. 상기 외인성 조작된 항원 수용체 및 상기 외인성 CD8αβ 공동 수용체는 상기 세포에서 동일한 벡터로부터 발현된다. 상기 벡터는 상기 외인성 조작된 항원 수용체 및 상기 외인성 CD8αβ 공동 수용체를 개별적으로 발현하는 하나 이상의 발현 작제물을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 상기 외인성 조작된 항원 수용체를 발현하는 발현 작제물 및 상기 외인성 CD8αβ 공동 수용체를 발현하는 발현 작제물은 2A 요소 또는 IRES 요소에 의해 분리된다. 상기 외인성 조작된 항원 수용체 및 상기 외인성 CD8αβ 공동 수용체는 상기 세포에서 상이한 벡터로부터 발현될 수 있다. 바이러스 벡터 (아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터) 또는 비-바이러스 벡터가 이용될 수 있다.
항원은 종양 항원 또는 병원체 항원을 포함한다. 종양 항원으로는 CD19, CD20, CD22, 카파 또는 경쇄, CD30, CD33, CD123, CD38, ROR1, ErbB2, ErbB3/4, EGFR vIII, 암배아 항원, EGP2, EGP40, 메소텔린, TAG72, PSMA, NKG2D 리간드, B7-H6, IL-13 수용체 cc2, IL-11 수용체 R a, MUC1, MUC16, CA9, GD2, GD3, HMW-MAA, CD171, 루이스 Y, G250/CAIX, HLA-AI MAGE Al, HLA-A2 NY-ESO-1, PSC1, 폴레이트 수용체-a, CD44v7/8, 8H9, NCAM, VEGF 수용체, 5T4, 태아 AchR, NKG2D 리간드, HER2, BCMA, CD44v6 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것들이 포함된다. 상기 방법은 유효량의 CD8+ T 세포를 이를 필요로 하는 개체에게 제공하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 유효량의 CD4+ T 세포를 이를 필요로 하는 개체에게 제공하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 CD4+ T 세포는 외인성 CD8αβ 공동 수용체, 외인성 조작된 항원 수용체 또는 둘 다를 발현하도록 조작될 수 있다. 상기 개체는 암을 가질 수 있으며, 상기 방법은 추가의 암 요법을 상기 개체에게 제공하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 개시 내용의 실시 형태는 CD8αβ 공동 수용체를 형질 전환으로 발현하는 CD4+ T 세포를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 상기 CD4+ T 세포는 또는 TCR, CAR 또는 둘 다와 같은 하나 이상의 외인성 조작된 항원 수용체를 형질 전환으로 발현할 수 있다. 상기 조성물은 CD8αβ 공동 수용체, 하나 이상의 외인성 조작된 항원 수용체 또는 둘 다를 형질 전환으로 발현하는 CD8+ T 세포를 비롯하여 임의의 종류의 CD8+ T 세포를 추가로 포함할 수 있다.
본 개시 내용의 실시 형태는 CD8αβ 공동 수용체, 및 임의로, 하나 이상의 외인성 조작된 항원 수용체를 형질 전환으로 발현하는 CD8+ T 세포를 포함하는 조성물을 포함한다. 상기 조작된 항원 수용체는 TCR, CAR 또는 둘 다일 수 있다. 상기 조성물은 CD8αβ 공동 수용체, 하나 이상의 외인성 조작된 항원 수용체 또는 둘 다를 형질 전환으로 발현하는 CD4+ T 세포를 비롯하여 임의의 종류의 CD4+ T 세포를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 하나의 실시 형태와 관련하여 논의된 임의의 제한이 본 발명의 임의의 다른 실시 형태에 적용될 수 있는 것으로 특별히 고려된다. 또한, 본 발명의 임의의 조성물은 본 발명의 임의의 방법에 사용될 수 있으며, 본 발명의 임의의 방법은 본 발명의 임의의 조성물을 생산하거나 이용하는데 사용될 수 있다. 실시예에 제시된 실시 형태의 양태는 또한 다른 실시예의 다른 곳에서 또는 본 출원의 다른 곳에서, 예를 들어, 본 발명의 개요, 실시 형태의 상세한 설명, 청구범위 및 도면 범례의 설명에서 논의된 실시 형태의 맥락에서 실시될 수 있는 실시 형태이다.
상기한 내용은, 후술하는 상세한 설명이 보다 잘 이해될 수 있도록, 본 개시 내용의 특징 및 기술적 이점을 다소 광범위하게 개략적으로 서술하였다. 본 출원의 청구항들의 주제를 형성하는 추가의 특징 및 이점이 이하에서 설명될 것이다. 당해 분야의 통상의 기술자들은, 개시되는 개념 및 구체적인 실시 형태가 본 설계의 동일한 목적을 수행하기 위해 다른 구조를 변형 또는 설계하기 위한 기초로서 용이하게 이용될 수 있다는 것을 인식해야 한다. 또한, 당해 분야의 통상의 기술자들은, 이러한 균등한 구성이 첨부된 청구항들에 기재된 사상 및 범위를 벗어나지 않는다는 것을 이해해야 한다. 추가의 목적 및 이점과 함께 구성 및 조작 방법 모두에 대해 본 출원에 개시된 설계의 특징인 것으로 믿어지는 신규한 특징은 첨부된 도면과 관련하여 고려될 때 하기의 설명으로부터 보다 잘 이해될 것이다. 그러나, 각 도면은 예시 및 설명의 목적으로만 제공되며 본 개시 내용의 범위의 정의로서 의도되지 않는다는 것을 명백하게 이해해야 한다. 본 발명의 추가의 목적들, 특징들, 양태들 및 이점들은 후술하는 설명에서 부분적으로 제시될 것이며, 부분적으로는 당해 설명으로부터 명백할 것이거나, 본 발명의 실시에 의해 학습될 수 있다. 본 개시 내용의 다양한 실시 형태가 당해 분야의 통상의 기술자들이 본 발명을 실시할 수 있도록 충분히 상세하게 설명될 것이며, 다른 실시 형태가 이용될 수 있고 변경이 본 발명의 범위를 벗어나지 않고도 이루어질 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 하기의 상세한 설명은 제한적인 의미로 간주되지 않으며, 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위에 의해 가장 잘 정의된다.
본 개시 내용을 보다 완전하게 이해하기 위해, 이하에서는 첨부된 도면과 관련하여 주어진 하기 설명을 참조한다:
도 1a~1e: CD4+ T 세포는 클래스 I TCR 및 CD8αβ에 의한 형질 도입시 하이브리드 표현형으로 전환된다.(도 1a) 레트로바이러스 벡터의 도식. (도 1b) NT 대조군과 비교하여 TCR 또는 T8 벡터를 갖는 CD4+ (적색 사각형) 또는 CD8+ (흑색 원형) T 세포의 형질 도입 효율, n = 6. CD4+ 및 CD8+ T 세포 (상부 패널) 및 MFI 요약 (하부 패널)에서 CD8α 발현 (도 1c), CD8β 발현 (도 1d) 및 서바이빈 LML 덱스트라머 염색 (도 1e)의 대표적인 히스토그램, n = 5~7명의 공여자. (도 1c, 1d, 1e) NT: 회색선, TCR+: 청색선, T8+: 녹색선. 평균±SD, NS: 유의하지 않음, *p≤0.05, **p≤0.01, ***p≤0.001, ****p≤0.0001.
도 2: T8+ CD4+ T 세포는 TCR+ 또는 T8+ CD8+ T 세포와 유사한 기능적 결합 활성을 나타낸다. IFN-γ ELISpot (SFUs/105 형질 전환 세포)에 의한 서바이빈 LML 또는 PRAME NLT 펩타이드에 대한 형질 전환 서바이빈 특이적 (s24, 상단 좌측; s16 하단 좌측) 또는 PRAME 특이적 (p28, 상단 우측; p11, 하단 우측) TCR+ (속이 빈 막대) 또는 T8+ (속이 찬 막대) CD4+ (적색 막대) 또는 CD8+ T 세포의 결합 활성 (흑색 막대). 1명의 대표 공여자의 데이터가 각 TCR에 대해 테스트된 3명의 공여자와 함께 표시되어 있다. 검출 한계: 흑색 점선.
도 3a~3f. CD8αβ와 TCR의 공동 발현은 CD4+ T 세포에 순차 사멸 능력을 부여하고 CD8+ T 세포 기능을 개선시킨다. (도 3a) NT, TCR+ 또는 T8+ CD4+ (적색 막대) 또는 CD8+ (흑색 막대) T 세포와 BV173 백혈병 세포 (HLA-A2*02:01+서바이빈+)의 공동 배양; 1:5의 E:T 비율, 3일째에 정량화된 잔류 BV173 세포, n = 7. (도 3b) NT, TCR+ 또는 T8+ CD4+ (좌측) 또는 CD8+ (우측) T 세포와 야생형 (WT) BV173 (속이 찬 막대) 또는 β2-마이크로글로불린 녹아웃 (B2M-KO) BV173 세포 (속이 빈 막대); 1:5의 E:T 비율, 3일째에 정량화된 잔류 BV173 세포, n = 3. (도 3c) 순차 공동 배양의 실험 설정. (도 3d) CD4+ (좌측) 또는 CD8+ (우측) T 세포의 순차 공동 배양. 종양 세포 재 시험 감염 (re-challenge) (+)과 함께 시간 경과에 따른 종양 (상단 패널) 및 T 세포 (하부 패널)의 정량화, n = 7. T 세포 확장: TCR+ 대 T8+ CD4: p<0.0001; TCR+ 대 T8+ CD8: p=NS; T8+ CD4 대 TCR+ CD8: p=0.002; T8+ CD4 대 CD8, p=0.015, 로그 AUC에 대한 t 검정. (도 3e) 제1 종양 시험 감염 (challenge) (D1) 후 24 시간째 및 제3 종양 시험 감염 (D10) 후 24 시간째에 공동 배양 상청액의 사이토카인 정량화, n = 6. (도 3f) HLA-A*02+ (상단 패널) 또는 HLA-A*02- (하단 패널) 공여자로부터의 NT, TCR+ 또는 T8+ CD4+ (적색) 및 CD8+ (흑색) T 세포의 배수 T 세포 확장, n = 3~4. (도 3a, 3b, 3e, 3f) 평균±SD, NS: 유의하지 않음, *p≤0.05, **p≤0.01, ***p≤0.001, ****p≤0.0001.
도 4a~4b: TCR-CD8αβ 공동 발현은 단일 CD8+ T 세포의 순차 사멸 능력을 개선키고 단일 CD4+ T 세포를 세포독성 CD8+ T 세포로 전환시킨다. (도 4a) 시기별로 T 세포와 표적 세포 사이의 상호 작용의 동력학의 단일 세포 정량화. t탐색: 이펙터와 표적 세포의 첫 접촉까지의 시간, t접촉: 이펙터와 표적 세포 사이의 컨쥬게이션 시간, t사멸: 첫 번째 접촉에서부터 표적 세포 아폽토시스까지의 시간. (도 4b) 1개 (좌측, 1:1의 E:T) 또는 2개 (우측, 1:2의 E:T)의 표적 세포 (상단 행)를 발견할 때 (t탐색), 표적과 안정한 시냅스를 형성할 때 (t접촉, 중간 행) 또는 표적을 사멸시킬 때 (t사멸) 단일 이펙터 세포의 누적 발생률. TCR+ CD4+ T 세포 (적색 점선), T8+ CD4+ T 세포 (적색 실선), TCR+ CD8+ T 세포 (흑색 점선) 및 T8+ CD8+ T 세포 (흑색 실선). NS: 유의하지 않음, *p≤0.05, **p≤0.01, ***p≤0.001, ****p≤0.0001, 로그 순위 테스트.
도 5a~5b: 초기 TCR 신호 이벤트의 분석. (도 5a) pLck Y394 인산화 NT (회색), TCR+ (청색) 및 T8+ (녹색) CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 대표적인 FACS 히스토그램. (도 5b) NT 대조군 세포에서 MFI로 정규화된 pLCK MFI의 요약. n = 4명의 공여자, 평균±SD, CD4 TCR+ 대 T8+: 104±11 대 173±35%, CD8 TCR+ 대 T8+: 106±7 대 126±13%, T8+ CD8 대 CD4: 126±13 대 173±35%. NS: 유의하지 않음, *p≤0.05, **p≤0.01, ***p≤0.001, ****p≤0.0001.
도 6a~6e: 형질 전환 CD8αβ는 TCR 형질 전환 CD8+ 및 CD4+ T 세포의 생체내 항종양 기능을 증진시킨다. (도 6a) 실험 설정. (도 6b, 6d) CD8+ T 세포 (도 6b) 또는 CD4+ T 세포 (도 6d)로 처리된 마우스로부터의 BLI 데이터의 요약. 비-형질 도입된 (NT) 대조군 T 세포 (n = 5, 회색), TCR+ T 세포 (n = 5, 청색), T8+ T 세포 (n = 5, 녹색). (도 6b) CD8: NT 대 TCR+: p=0.0002, NT 대 T8+: p<0.0001, TCR+ 대 T8+: p=0.01, 0일째와 비교한 28일째에 로그 AUC에 대한 t 검정. (도 6d) CD4: TCR+ 대 T8+: p=0.001, 0일째와 비교한 35일째에 log AUC에 대한 t 검정. (도 6c, 6e) CD8+ T 세포 (도 6c) 및 CD4+ T 세포 (도 6e)에 대해 BLI, 5×103 내지 5×104 p/초/cm2/sr의 색 척도에 의해 시간 경과에 따라 이미지화된 3 마리의 대표적인 마우스/그룹.
I. 정의의 예
오랫동안 유지되어 온 특허법 협약에 따르면, 청구항을 비롯하여 본 명세서에서 포함하는이라는 단어와 협력하여 사용될 때의 단수 형태의 단어는 "하나 이상"을 의미한다. 본 개시 내용의 일부 실시 형태는 본 개시 내용의 하나 이상의 요소, 방법 단계 및/또는 방법으로 이루어지거나 본질적으로 이루어질 수 있다. 본 출원에서 기재된 임의의 방법 또는 조성물은 개시되어 있고 본 개시 내용의 사상 및 범위를 벗어나지 않고도 여전히 비슷하거나 유사한 결과를 수득할 수 있는 본 출원의 실시 형태에서 기재된 임의의 다른 방법 또는 조성물과 관련하여 실시될 수 있는 것으로 고려된다. 청구항에서 "또는" 이라는 용어의 사용은, 명백하게 대안만을 지칭하는 것으로 명시되지 않거나, 본 개시 내용이 대안 및 "및/또는"만을 지칭하는 정의를 뒷받침하고 있다고 하더라도 그 대안이 상호 배타적이지 않는다면, "및/또는"을 의미하는 것으로 사용된다. 본 출원에서 사용되는 "또 다른"은 적어도 제2 또는 그 이상을 의미할 수 있다.
오랫동안 유지되어 온 특허법 협약에 따르면, 청구항을 비롯하여 본 명세서에서 포함하는이라는 단어와 협력하여 사용될 때의 단수 형태의 단어는 "하나 이상"을 의미한다. 본 개시 내용의 일부 실시 형태는 본 개시 내용의 하나 이상의 요소, 방법 단계 및/또는 방법으로 이루어지거나 본질적으로 이루어질 수 있다. 본 출원에서 기재된 임의의 방법 또는 조성물은 본 출원에서 기재된 임의의 다른 방법 또는 조성물과 관련하여 실시될 수 있으며 상이한 실시 형태들이 조합될 수 있는 것으로 고려된다.
본 출원 전체에 걸쳐, "약"이라는 용어는 값이 당해 값을 결정하는데 이용되는 장치 또는 방법에 대한 오차의 표준 편차를 포함한다는 것을 명시하기 위해 세포 및 분자 생물학 분야에서의 평범하고 통상적인 의미에 따라 사용된다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 문맥이 달리 요구하지 않는다면, "포함하다", "포함한다" 또는 "포함하는"이라는 단어는 명시된 단계 또는 요소, 또는 단계들 또는 요소들의 그룹을 포함하지만 임의의 다른 단계 또는 요소, 또는 단계들 또는 요소들의 그룹을 배제하지는 않는다는 것을 암시하는 것으로 이해될 것이다. "~로 이루어지는"이란, "~로 이루어진"이라는 문구 다음에 오는 모든 것을 포함하고 이에 제한되는 것을 의미한다. 따라서, "~로 이루어지는"이라는 문구는, 나열된 요소들이 필요하거나 필수적이며 다른 요소들이 존재할 수 없다는 것을 나타낸다. "~로 본질적으로 이루어지는"이란, 문구 다음에 나열된 임의의 요소들을 포함하고 나열된 요소들에 대해 개시 내용에 명시된 활동 또는 행동을 방해하지 않거나 이에 기여하지 않는 다른 요소로 제한된다는 것을 의미한다. 따라서, "~로 본질적으로 이루어지는"이라는 문구는, 나열된 요소들이 필요하거나 필수적이지만, 다른 요소들이 선택 사항이 아니며 나열된 요소들의 활동 또는 행동에 영향을 미치는지 여부에 따라 존재할 수도 있고 존재하지 않을 수도 있다는 것을 나타낸다.
본 명세서 전체에 걸친 "하나의 실시 형태", "한 실시 형태", "특별한 실시 형태", "관련 실시 형태", "특정 실시 형태", "추가적 실시 형태" 또는 "추가의 실시 형태" 또는 이들의 조합에 대한 언급은, 당해 실시 형태와 관련하여 기재된 특별한 특징, 구조 또는 특성이 본 발명의 적어도 하나의 실시 형태에 포함된다는 것을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 장소에서의 상기 문구의 출현은 반드시 전부 동일한 실시 형태를 지칭하는 것은 아니다. 또한, 특별한 특징, 구조 또는 특성은 하나 이상의 실시 형태에서 임의의 적합한 방식으로 조합될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 "조작된 항원 수용체"라는 용어는 특정 항원에 결합하고 사람의 손에 의해 생성된 합성 세포 표면 단백질을 지칭한다.
예를 들어, 세포와 관련하여 본 출원에서 사용되는 "외인성"이라는 용어는 사람의 손으로부터 재조합 조작 방법에 의해 세포에 제공되는 분자를 지칭한다. 상기 용어는 자연에서 발견되는 세포에 대해 본래의 것인 내인성 분자와 구별된다.
질병 또는 병태의 "치료하는" 또는 치료는 당해 질병의 적어도 하나의 징후 또는 증상을 완화시키려는 노력으로 환자에게 하나 이상의 약물 또는 요법 (세포 포함)을 투여하는 단계를 포함할 수 있는 프로토콜을 실행하는 것을 지칭한다. 치료의 바람직한 효과는 질병 진행률의 감소, 질병 상태의 개선 또는 완화, 적어도 하나의 증상의 발병의 지연, 및 완화 또는 예후 개선을 포함한다. 완화는 질병 또는 병태의 징후나 증상이 출현하기 전 뿐만 아니라 출현한 후 또는 둘 다에 발생할 수 있다. 따라서, "치료하는" 또는 "치료"는 질병 또는 바람직하지 않은 병태의 "예방하는" 또는 "예방"을 포함할 수 있다. 또한, "치료하는" 또는 "치료"는 하나 이상의 징후 또는 증상의 완전한 완화를 요구하지 않으며, 치유를 요구하지 않으며, 특히, 환자에 대해 한계 효과만 갖는 프로토콜을 포함한다.
본 출원 전체에 걸쳐 사용되는 "치료학적 이득" 또는 "치료학적으로 유효한"이라는 용어는 병태의 의학적 치료와 관련하여 대상체의 복지를 촉진하거나 증진시키는 모든 것을 지칭한다. 이것은 질환의 하나 이상의 징후 또는 증상의 빈도 또는 중증도의 감소를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 암 치료는, 예를 들어, 종양 크기의 감소, 종양 침습의 감소, 암 성장 속도의 감소 또는 전이의 예방을 포함할 수 있다. 암 치료는 또한 암을 갖는 대상체의 생존 연장을 지칭할 수 있다.
"대상체" 및 "환자" 및 "개체"는 영장류, 포유 동물 및 척추 동물과 같은 사람 또는 비-사람을 지칭한다. 특별한 실시 형태에서, 상기 대상체는 사람, 개, 고양이, 말, 소 등이다.
"약제학적으로 허용되는 또는 약리학적으로 허용되는"이라는 문구는, 경우에 따라, 사람과 같은 동물에게 투여될 때 부정적인, 알러지성 또는 다른 유해 반응을 생성하지 않는 분자 독립체 및 조성물을 지칭한다. 항체 또는 추가의 활성 성분을 포함하는 약제학적 조성물의 제제는 본 개시 내용에 비추어 당해 분야의 통상의 기술자들에게 공지되어 있을 것이다. 또한, 동물 (예를 들어, 사람) 투여의 경우, 제제는 생물학적 표준의 FDA 사무국에 의해 요구되는 바와 같은 멸균성, 발열원성, 일반적인 안전성 및 순도 표준을 충족시켜야 하는 것으로 이해될 것이다.
본 출원에서 사용되는 "약제학적으로 허용되는 담체"로는, 당해 분야의 통상의 기술자에게 공지되는 바와 같이, 임의의 및 모든 수성 용매 (예를 들어, 물, 알코올성 용액/수용액, 생리 식염수, 비경구 비히클, 예를 들어, 염화 나트륨, 링거 덱스트로오스 등), 비수성 용매 (예를 들어, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 및 주사 가능한 유기산 에스테르, 예를 들어, 에틸올레이트), 분산매, 코팅제, 계면 활성제, 산화 방지제, 보존제 (예를 들어, 항균제 또는 항진균제, 산화 방지제, 킬레이트화제 및 불활성 가스, 등장화제, 흡수 지연제, 염, 약물, 약물 안정화제, 겔, 결합제, 부형제, 붕해제, 윤활제, 감미료, 풍미제, 염료, 유체 및 영양소 보충물, 이와 유사한 물질 및 이들의 조합이 포함된다. 약제학적 조성물 중 다양한 구성 요소의 pH 및 정확한 농도는 널리 공지된 파라미터에 따라 조정된다.
II. 일반적인 실시 형태
본 개시 내용의 실시 형태는 수용체 조작된 입양 T 세포 요법에 대한 개선을 포함한다. 본 개시 내용의 방법은 이의 사용으로 유해 효과를 초래할 수 있는 높은 친화성 수용체를 이용해야 하지 않고도 조작된 수용체로 낮은 결합 활성 항원을 표적화할 수 있도록 요법의 세포를 변형시킴으로써 입양 T 세포 요법에 대한 효과적인 옵션에 대해 부연한다.
A. CD4+ T 세포
본 개시 내용의 방법은 CD8αβ 쇄의 형질 전환 발현시 입양 전이를 위한 헬퍼 기능과 세포독성 둘 다를 갖는 CD4+ T 세포의 생산을 포함한다. 구체적인 경우에서, 표적화된 pMHC 클래스 I 복합체를 인식하고 결합하는 능력을 포함하는 CD4+ T 세포를 생산하기 위한 목적으로 CD8αβ 쇄의 표면 발현을 갖는 CD4+ T 세포를 생산하는 방법이 존재한다.
클래스 I 에피토프를 인식하는 활성을 갖는 본 개시 내용의 CD4+ T 세포가 본 출원에서 생산된다. 따라서, 본 출원에 포함되는 방법은 CD8αβ를 형질 전환으로 발현한 결과로서 CD4+ 세포를 클래스 I 제한된 에피토프로 재지시한다. 클래스 I 에피토프를 인식할 수 있는 세포에 추가하여, 상기 세포는 또한 TH2를 발현하는 자연적 활성에 추가하여 TH1 사이토카인, 예를 들어, IFNγ, TNFα, 퍼포린 및/또는 그랜자임 B를 발현하는 활성을 갖는다.
본 개시 내용의 실시 형태는, CD8αβ의 형질 전환 발현이 없는 확장에서 T 세포와 비교하여, CD4+ T 세포 (및 CD8+ T 세포)가 당해 세포의 유의한 살해 활성을 결여시키도록 하는 CD8αβ 형질 전환 발현을 포함하는 방법 및 조성물을 포함한다.
특별한 실시 형태에서, 충분한 수준의 CD8αβ를 발현하는 형질 전환 CD4+ T 세포는 단일 세포 수준에서 효과적으로 CD8+ 및 CD4+ T 세포 기능을 모두 효과적으로 갖는 클래스 I pMHC 표적화된 하이브리드 세포독성 및 헬퍼 T 세포가 된다. 이와 같이, CD8αβ는 낮은 결합 활성 클래스 I TCR을 갖는 단일 CD4+ T 세포를 증진된 생체내 기능을 갖는 하이브리드 세포독성 및 헬퍼 T 세포로 재프로그래밍한다.
본 개시 내용의 실시 형태는 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 활성을 갖도록 하는 CD4+ T 세포의 재프로그래밍을 포함한다. 구체적인 실시 형태에서, CD4+ T 세포는 세포독성 활성에 추가하여 헬퍼 T 세포 활성을 포함한다. 따라서, 구체적인 경우에서는 CD4+ T 세포가 하이브리드와 다기능 둘 다이다. 구체적인 경우에서, CD4+ T 세포는 외인성으로 제공된 CD8 공동 수용체를 형질 전환으로 발현함으로써 이러한 특성들을 갖도록 조작되며, 이러한 세포는 TH1 및 TH2 사이토카인을 모두 생산할 수 있다. 상기 세포는 또한 연쇄 살해 활성을 포함하며 항종양 기능을 포함한다.
세포독성을 포함하는 CD8 공동 수용체 발현성 CD4+ 세포의 능력은 TCR 및 CAR을 비롯한 하나 이상의 외인성 조작된 항원 수용체와 관련하여 이용될 수 있다.
B. CD8+ T 세포
구체적인 실시 형태에서, 방법 및 조성물은 세포의 유효성을 증가시키기 위한 CD8+ T 세포에서 외인성 CD8αβ 공동 수용체의 이용에 관한 것이다. 구체적인 경우에서, 상기 CD8+ T 세포는 외인성 조작된 항원 수용체 (예를 들어, HLA 클래스 I 제한된 TCR)를 발현하고, 세포에서 CD8αβ 공동 수용체의 공동 발현은 세포의 기능적 결합 활성을 개선시킨다. 다른 경우에서, CD8+ T 세포는 내인성 TCR의 활성을 증진시키는 외인성 CD8αβ 공동 수용체를 발현하도록 변형된다.
상기 방법 및 조성물은 세포에 자연적으로 존재하는 수준에 비해 CD8αβ의 세포 표면 수준을 증가시키는 것을 포함하여, 적어도 CD8+ T 세포에서 CD8αβ 공동 수용체의 이용 가능성을 증가시킴으로써 CD8+ T 세포 요법의 진전을 가능하게 한다. 따라서, 임의의 종류의 세포 요법을 위해 CD8+ T 세포를 이용함에 있어서, 구체적인 실시 형태에서는 상기 CD8+ T 세포가 외인성 CD8αβ 공동 수용체를 발현한다.
실시 형태는 CD8+ T 세포 집단의 적어도 일부 세포에서 CD8 공동 수용체의 이용 가능성을 증가시킴으로써 CD8+ T 세포 집단의 기능을 증진시키는 것을 포함한다. 본 개시 내용의 방법은, 예를 들어, 입양 전이 적용을 위한 CD8+ T 세포에 내인성 CD8 공동 수용체가 너무 적다는 제한 인자를 극복한다. 따라서, 본 개시 내용의 특별한 실시 형태에서는 CD8+ T 세포의 기능을 증진시키기 위해 CD8+ T 세포에서 CD8 공동 수용체의 이용 가능성을 증가시키는 방법이 있다.
CD8 공동 수용체는 세포가 인공 항원 수용체에 대해 형질 전환인지 여부에 관계 없이 CD8+ T 세포에서 이용될 수 있다. 구체적인 실시 형태에서, 본 개시 내용의 방법 및 조성물은 수용체 형질 전환 (예를 들어, TCR 및/또는 CAR) CD8+ T 세포의 기능을 증진시킨다.
C. CD4+ 및 CD8+ T 세포
본 개시 내용의 실시 형태는 개체에 대해 T 세포를 사용하는 입양 전이시 개선을 포함한다. 입양 전이를 위한 세포독성 T 세포로서 CD8+ T 세포를 이용하는 공지된 방법은 이제 비-자연 세포독성 활성을 갖는 CD4+ T 세포의 이용을 또한 허용함으로써 개선되었다. 본 개시 내용의 실시 형태는 CD4+ 또는 CD8+인 낮은 결합 활성 TCR 형질 전환 T 세포, 또는 이의 기능적 하이브리드를 비롯하여 TCR 형질 전환 T 세포에 의한 면역 요법을 위한 CD8 공동 수용체 기능을 이용하는 것을 포함한다.
본 개시 내용의 실시 형태는 CD8 세포에서 천연 및/또는 외인성으로 제공된 TCR 또는 다른 항원 수용체에 대한 CD8 T 세포 기능의 증진을 제공한다. 상기 증진은, 각각 외인성 제공된 CD8αβ의 발현이 결여된 T 세포와 비교하여, 연속적 종양 사멸 능력을 증가시키는 것과 같은 이점을 포함할 수 있다.
특별한 실시 형태에서, 충분한 수준의 CD8αβ 공동 수용체 및 외인성 조작된 항원 수용체를 발현하는 CD4+ T 세포와 충분한 수준의 CD8αβ 공동 수용체 및 임의로 외인성 조작된 항원 수용체를 발현하는 CD8+ 세포의 혼합물이 특정 방법에서 이용된다. 상기 혼합물은 10:1, 5:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:5, 1:10, 1:25, 1:50, 1:100, 1:500, 1:1000, 1:10,000 등과 같은 CD4+ T 세포 대 CD8+ T 세포의 특정 비율을 이용할 수 있다.
본 출원의 다른 곳에서 제공된 예는 효과적이고 안전한 TCR 발현 세포에 대한 필요성을 다룬다. 과발현된 종양 관련 자기 항원 (tumor-associated self-antigen: TAA)을 표적화하는 대부분의 자연 발생 클래스 I 제한된 TCR은, 숙주에서의 선택 및 내성 때문에 낮은 결합 활성을 가지며 CD8 공동 수용체 의존적이다. 따라서, TCR 조작된 T 세포에 의한 입양 T 세포 전이는 CD8+ T 세포의 기능에 완전히 의존하며 유익한 CD4+ T 세포 기능을 이용할 수 없다. 따라서, 본 개시 내용은 TAA 특이적 낮은 결합 활성 TCR의 발현을 CD8αβ 공동 수용체와 결합하는 신규한 전략에 관한 것이며, 정제된 형질 전환 CD8+ 및 CD4+ T 세포의 특성은 개별적으로 특성화되었다. CD8αβ 공동 전이는 연속적 종양 사멸 능력을 증가시킴으로써 TCR+ CD8+ T 세포 기능을 증진시키는 것으로 확인되었으며, 이는 내인성 CD8 공동 수용체의 제한된 이용 가능성이 기능적 잠재력의 완전한 전개를 방해한다는 것을 나타낸다. 조작된 CD4+ T 세포는 단일 세포 수준에서 하이브리드 다기능 세포독성 및 헬퍼 T 세포로 효율적으로 재프로그래밍되었다: 이들은 동족 클래스 I 제한된 종양 항원을 발현하는 세포를 인식하고 사멸시켰으며, 연쇄 살해자가 되어 주로 TH1을 생산하였고, 일부 TH2 사이토카인을 보존하였으며, 생체내에서 우수한 항종양 기능을 나타냈다. 따라서, 본 개시 내용의 실시 형태는 적어도 (1) TCR 형질 전환 CD8+ T 세포의 기능 증진 및 (2) 단일 세포 수준에서 용이하게 이용 가능한 CD8+ 및 CD4+ T 세포 기능 모두를 갖는 클래스 I pMHC 표적화된 하이브리드 세포독성 및 헬퍼 T 세포의 제조에 관한 것이다.
III. 조성물의 예
본 개시 내용은 입양 전이에 사용하기 위한 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포에 관한 것이다. 본 개시 내용의 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포는 적어도 하나의 외인성 제공된 단백질: CD8αβ 공동 수용체를 개별적으로 발현하기 때문에 자연에서 발견되지 않는다. 특별한 경우에서, CD8의 α 및 β 쇄는 모두 동일한 세포에서 발현된다. 상기 CD8αβ 공동 수용체는 상기 세포에서 일시적으로 발현될 수 있거나 발현될 수 없다. CD8αβ 공동 수용체를 형질 전환으로 발현하는 CD8+ 세포는, 적어도 CD8αβ 공동 수용체 분자의 수준이 자연에서 이것을 자연적으로 발현하는 세포보다 크기 때문에, CD8αβ 공동 수용체의 자연적 발현을 갖는 자연에서의 CD8+ 세포가 아니며, 발현 수준에서의 이러한 차이는 본래의 CD8+ T 세포 보다 더 큰 효능을 갖는 형질 전환 CD8+ T 세포의 기능적 차이를 초래한다.
특별한 실시 형태에서, CD8αβ 공동 수용체를 발현하는 것에 추가하여 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포는 또한 하나 이상의 조작된 항원 수용체를 발현한다. 하나 이상의 조작된 항원 수용체는 임의의 종류일 수 있지만, 구체적인 경우에는 이들이 HLA 클래스 I 제한된 TCR 또는 키메라 항원 수용체 (CAR)이다.
A. T 세포 수용체 (TCR)
일부 실시 형태에서, 조작된 항원 수용체는 재조합 TCR 및/또는 자연 발생 T 세포로부터 클로닝된 TCR을 포함한다. "T 세포 수용체" 또는 "TCR"은 가변 α 및 β 쇄 (각각 TCRα 및 TCRβ로서도 또한 공지됨) 또는 가변 γ 및 δ 쇄 (각각 TCRγ 및 TCRδ로서도 또한 공지됨)를 함유하고 MHC 수용체에 결합된 항원 펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있는 분자를 지칭한다. 일부 실시 형태에서, TCR은 αβ 형태이다.
전형적으로, αβ 및 γδ 형태로 존재하는 TCR은 일반적으로 구조적으로 유사하지만, 이들을 발현하는 T 세포는 특유의 해부학적 위치 또는 기능을 가질 수 있다. TCR은 세포의 표면 상에서 또는 가용성 형태로 발견될 수 있다. 일반적으로, TCR은 T 세포 (또는 T 림프구)의 표면 상에서 발견되며, 여기서, 이것은 일반적으로 주요 조직적합성 복합체 (major histocompatibility complex: MHC) 분자에 결합된 항원을 인식하는 역할을 담당한다. 일부 실시 형태에서, TCR은 또한 불변 도메인, 막관통 도메인 및/또는 짧은 세포질 꼬리를 함유할 수 있다. 예를 들어, 일부 양태에서, TCR의 각 쇄는 하나의 N-말단 면역글로불린 가변 도메인, 하나의 면역글로불린 불변 도메인, 막관통 영역 및 C-말단의 짧은 세포질 꼬리를 가질 수 있다. 일부 실시 형태에서, TCR은 신호 전달을 매개하는데 관여하는 CD3 복합체의 불변 단백질과 연관된다. 달리 명시되지 않는다면, "TCR"이라는 용어는 이의 기능적 TCR 단편을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 상기 용어는 또한 αβ 형태 또는 γδ 형태의 TCR을 비롯하여 온전한 또는 전장 TCR을 포함한다.
따라서, 본 출원의 목적상, TCR에 대한 언급은 임의의 TCR 또는 기능성 단편, 예를 들어, MHC 분자, 즉, MHC-펩타이드 복합체에 결합된 특정 항원성 펩타이드에 결합하는 TCR의 항원 결합 부분을 포함한다. 상호 교환적으로 사용될 수 있는 TCR의 "항원 결합 부분" 또는 항원 결합 단편"은, TCR의 구조적 도메인의 일부를 함유하지만 완전한 TCR이 결합하는 항원 (예를 들어, MHC-펩타이드 복합체)에 결합하는 분자를 지칭한다. 일부 경우에서, 항원 결합 부분은 TCR의 가변 도메인, 예를 들어, 특정 MHC-펩타이드 복합체에 대한 결합을 위한 결합 부위를 형성하기에 충분한 TCR의 가변 α 쇄 및 가변 β 쇄와 같은 TCR의 가변 도메인을 함유하며, 여기서, 일반적으로, 각각의 쇄는 3개의 상보성 결정 영역을 함유한다.
일부 실시 형태에서, TCR 쇄의 가변 도메인은 연합하여, TCR 분자의 결합 부위를 형성함으로써 항원 인식을 부여하고 펩타이드 특이성을 결정하는, 면역글로불린과 유사한 루프 또는 상보성 결정 영역 (complementarity determining region: CDR)을 형성한다. 전형적으로, 면역글로불린 처럼, CDR은 프레임워크 영역 (framework region: FR)에 의해 분리된다. 일부 실시 형태에서, CDR3은 가공된 항원을 인식하는 역할을 하는 주요 CDR이지만, 알파 쇄의 CDR1은 또한 항원성 펩타이드의 N-말단부와 상호 작용하는 것으로 나타난 반면 베타 쇄의 CDR1은 펩타이드의 C-말단부와 상호 작용한다. CDR2는 MHC 분자를 인식하는 것으로 생각된다. 일부 실시 형태에서, β 쇄의 가변 영역은 초가변 (HV4) 영역을 추가로 함유할 수 있다.
일부 실시 형태에서, TCR 쇄는 불변 도메인을 함유한다. 예를 들어, 면역글로불린 처럼, TCR 쇄 (예를 들어, α 쇄, β 쇄)의 세포외 부분은 N-말단에서 2개의 면역글로불린 도메인, 가변 도메인 (예를 들어, Va 또는 Vp; 전형적으로 카뱃 넘버링 (문헌 [Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, Public Health Service National Institutes of Health, 1991, 5th ed.])을 기준으로 아미노산 1 내지 116), 및 세포막에 인접한 하나의 불변 도메인 (예를 들어, α 쇄 불변 도메인 또는 Ca, 전형적으로 카뱃을 기준으로 아미노산 117 내지 259, β 쇄 불변 도메인 또는 Cp, 전형적으로 카뱃을 기준으로 아미노산 117 내지 295)을 함유할 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에서, 2개의 쇄에 의해 형성되는 TCR의 세포외 부분은 CDR을 함유하는 2개의 막 근위 불변 도메인 및 2개의 막 원위 가변 도메인을 함유한다. TCR 도메인의 불변 도메인은 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 형성하는 짧은 연결 서열을 함유하며, 이는 2개의 쇄 사이를 연결한다. 일부 실시 형태에서, TCR은 α 및 β 쇄 각각에서 추가의 시스테인 잔기를 가지므로 TCR은 불변 도메인에서 2개의 디설파이드 결합을 함유한다.
일부 실시 형태에서, TCR 쇄는 막관통 도메인을 함유할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 막관통 도메인은 양으로 하전되어 있다. 일부 경우에서, TCR 쇄는 세포질 꼬리를 함유한다. 일부 경우에서, 상기 구조는 TCR이 CD3과 같은 다른 분자와 연합할 수 있게 한다. 예를 들어, 막관통 영역을 갖는 불변 도메인을 함유하는 TCR은 세포막에 단백질을 고정시키고 CD3 신호 전달 장치 또는 복합체의 불변 서브 유닛과 연합할 수 있다.
일반적으로, CD3은 포유 동물 및 ζ 쇄에서 3개의 특유의 쇄 (γ, δ 및 ε)를 가질 수 있는 다중 단백질 복합체이다. 예를 들어, 포유 동물에서, 상기 복합체는 CD3γ 쇄, CD3δ 쇄, 2개의 CD3ε 쇄, 및 CD3ζ 쇄의 동종이량체를 함유할 수 있다. CD3γ 쇄, CD3δ 쇄 및 CD3ε 쇄는 단일 면역글로불린 도메인을 함유하는 면역글로불린 수퍼패밀리의 높은 관련 세포 표면 단백질이다. CD3γ 쇄, CD3δ 쇄 및 CD3ε 쇄의 막관통 영역은 음으로 하전되어 있으며, 이는 이러한 쇄들이 양으로 하전된 T 세포 수용체 쇄와 연합하도록 하는 특징이다. CD3γ 쇄, CD3δ 쇄 및 CD3ε 쇄의 세포내 꼬리 각각은 면역 수용체 타이로신 기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로서 공지된 단일의 보존된 모티프를 함유하는 반면, 각각의 CD3ζ 쇄는 3개를 갖는다. 일반적으로, ITAM은 TCR 복합체의 신호 전달 능력에 관여한다. 이러한 보조 분자들은 음으로 하전된 막관통 영역을 가지며 신호를 TCR로부터 세포로 전파하는 역할을 수행한다. CD3 쇄 및 ζ 쇄는 TCR과 함께 T 세포 수용체 복합체로서 공지된 것을 형성한다.
일부 실시 형태에서, TCR은 2개의 쇄 α 및 β (또는 임의로 γ 및 δ)의 이종이량체일 수 있거나, 이것은 단일쇄 TCR 작제물일 수 있다. 일부 실시 형태에서, TCR은, 예를 들어, 디설파이드 결합 또는 다설파이드 결합들에 의해 연결된 2개의 별개의 쇄 (α 및 β 쇄 또는 γ 및 δ 쇄)를 함유하는 이종이량체이다. 일부 실시 형태에서, 표적 항원 (예를 들어, 암 항원)에 대한 TCR을 동정하고 세포에 도입한다. 일부 실시 형태에서, TCR을 인코딩하는 핵산은, 예를 들어, 공중에게 이용 가능한 TCR DNA 서열의 폴리머라아제 연쇄 반응 (polymerase chain reaction: PCR) 증폭에 의해 다양한 공급원으로부터 수득될 수 있다. 일부 실시 형태에서, TCR은 생물학적 공급원으로부터, 예를 들어, T 세포 (예를 들어, 세포독성 T 세포), T 세포 하이브리도마 또는 다른 공중에게 이용 가능한 공급원과 같은 세포로부터 수득된다. 일부 실시 형태에서, T 세포는 생체내 단리된 세포로부터 수득될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 높은 친화성 T 세포 클론은 환자 및 단리된 TCR로부터 단리될 수 있다. 일부 실시 형태에서, T 세포는 배양된 T 세포 하이브리도마 또는 클론일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 표적 항원에 대한 TCR 클론은 사람 면역계 유전자 (예를 들어, 사람 백혈구 항원 시스템 또는 HLA)로 조작된 형질 전환 마우스에서 생성되었다. 일부 실시 형태에서, 파지 디스플레이를 사용하여 표적 항원에 대한 TCR을 단리한다. 일부 실시 형태에서, TCR 또는 이의 항원 결합 부분은 TCR의 서열에 대한 지식으로부터 합성으로 생성될 수 있다.
B. 키메라 항원 수용체
일부 실시 형태에서, 조작된 항원 수용체는 활성화 또는 자극 CAR, 공동 자극 CAR (국제공개공보 WO 2014/055668 참조) 및/또는 억제 CAR을 비롯한 CAR을 포함한다. CAR은 일반적으로 일부 양태에서는 링커(들) 및/또는 막관통 도메인(들)을 통해 하나 이상의 세포내 신호 전달 성분에 연결된 세포외 항원 (또는 리간드) 결합 도메인을 포함한다. 이러한 분자들은 전형적으로 천연 항원 수용체를 통한 신호, 공동 자극 수용체와 조합된 이러한 수용체를 통한 신호, 및/또는 공동 자극 수용체 단독을 통한 신호를 모방하거나 근사한다. CAR은 1 세대, 2 세대 또는 3 세대 또는 후속 세대일 수 있다.
일부 실시 형태에서, CAR은 벡터에 의해 코딩되며 적어도 다음을 포함한다: a) 세포내 신호 전달 도메인, b) 막관통 도메인 및 c) 적어도 하나의 항원 결합 영역을 포함하는 세포외 도메인.
본 개시 내용의 특정 실시 형태는 세포내 신호 전달 도메인, 막관통 도메인 및 하나 이상의 신호 전달 모티프를 갖는 세포외 도메인을 포함하는, 면역원성을 감소시키기 위해 사람화된 CAR (hCAR)을 비롯하여 항원 특이적 CAR 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 비롯한 핵산의 용도에 관한 것이다. 특정 실시 형태에서, CAR은 하나 이상의 항원들 사이의 공유된 공간을 포함하는 에피토프를 인식할 수 있다. 특정 실시 형태에서, 결합 영역은 단클론 항체의 상보성 결정 영역, 단클론 항체의 가변 영역 및/또는 이의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 또 다른 실시 형태에서, 상기 특이성은 수용체에 결합하는 펩타이드 (예를 들어, 사이토카인)로부터 유래한다.
사람 CAR 핵산은 사람 환자에 대한 세포 면역 요법을 증진시키는데 사용되는 사람 유전자로부터 유래될 수 있는 것으로 고려된다. 구체적인 실시 형태에서, 본 개시 내용은 벡터에 의해 인코딩된 전장 CAR cDNA 또는 코딩 영역을 포함한다. 항원 결합 영역 또는 도메인은 본 출원에 참조로 포함되는 미국 특허 7,109,304에 기재된 것들과 같은 특별한 사람 단클론 항체로부터 유래된 단일 쇄 가변 단편 (scFv)의 VH 및 VL 쇄의 단편을 포함할 수 있다. 상기 단편은 또한 사람 항원 특이적 항체의 다수의 상이한 항원 결합 도메인일 수 있다. 더 구체적인 실시 형태에서, 상기 단편은 사람 세포에서 발현을 위한 사람 코돈 용법에 최적화된 서열에 의해 인코딩된 항원 특이적 scFv이다.
정렬은 디아바디 또는 다량체와 같은 다량체일 수 있다. 다량체는 경쇄 및 중쇄의 가변 부분의 교차 페어링에 의해 디아바디로 형성될 가능성이 높다. 작제물의 힌지 부분은, 완전히 결실된 것에서부터, 제1 시스테인이 유지된 것, 세린 보다는 프롤린 치환, 제1 시스테인까지 절단된 것까지, 여러 대체물을 가질 수 있다. Fc 부분은 결실될 수 있거나 결실되지 않을 수 있다. 안정하고/하거나 이량체화하는 임의의 단백질은 이러한 목적을 제공할 수 있다. Fc 도메인, 예를 들어, 사람 면역글로불린 유래의 CH2 또는 CH3 도메인 중 단지 하나를 사용할 수 있다. 또한, 이량체화를 개선시키기 위해 변형된 사람 면역글로불린의 힌지, CH2 및 CH3 영역을 사용할 수 있다. 또한 단지 면역글로불린의 힌지 부분을 사용할 수 있다. 또한 CD8알파의 일부를 사용할 수 있다.
일부 실시 형태에서, CAR 핵산은 막관통 도메인 및 하나 이상의 세포내 신호 전달 도메인, 예를 들어, CD28 세포내 신호 전달 도메인과 같은 다른 공동 자극 수용체를 인코딩하는 서열을 포함한다. 다른 공동 자극 수용체로는 CD28, CD27, OX-40 (CD134), DAP10, DAP12 및 4-1BB (CD137) 중 하나 이상이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. CD3에 의해 개시된 원발성 신호에 추가하여, 사람 CAR에 삽입된 사람 공동 자극 수용체에 의해 제공된 추가의 신호는 NK 세포의 완전한 활성화를 위해 이용될 수 있으며, 입양 면역 요법의 생체내 지속성 및 치료학적 성공의 개선을 보조할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 입양 요법에 의해 표적화되는 특별한 세포 유형에서 발현되는 항원, 예를 들어, 암 마커 및/또는 약화된 반응을 유도하도록 의도되는 항원, 예를 들어, 정상 또는 비-질병 세포 유형 상에 발현되는 항원과 같은 특별한 항원 (또는 마커 또는 리간드)에 대한 특이성을 갖는 CAR이 작제된다. 따라서, CAR은 전형적으로 이의 세포외 부분에서 하나 이상의 항원 결합 분자, 예를 들어, 하나 이상의 항원 결합 단편, 도메인 또는 부분, 또는 하나 이상의 항체 가변 도메인 및/또는 항체 분자를 포함한다. 일부 실시 형태에서, CAR은 단클론 항체 (mAb)의 가변 중쇄 (VH) 및 가변 경쇄 (VL)로부터 유래된 단일 쇄 항체 단편 (scFv)와 같은 항체 분자의 항원 결합 부분 또는 부분들을 포함한다.
CAR의 특정 실시 형태에서, 수용체의 항원 특이적 부분 (항원 결합 영역을 포함하는 세포외 도메인으로서 지칭될 수 있음)은 종양 관련 항원 결합 도메인 또는 병원체 특이적 항원 결합 도메인을 포함한다. 항원은 패턴 인식 수용체에 의해 인식되는 탄수화물 항원을 포함한다. 종양 관련 항원은 종양 세포의 세포 표면 상에서 발현되는 한 임의의 종류일 수 있다.
키메라 수용체를 인코딩하는 오픈 리딩 프레임의 서열은 게놈 DNA 공급원, cDNA 공급원으로부터 수득될 수 있거나, 합성될수 있거나 (예를 들어, PCR을 통해), 이의 조합일 수 있다. 게놈 DNA의 크기 및 인트론의 수에 따라, 인트론이 mRNA를 안정화시키는 것으로 밝혀켰기 때문에, cDNA 또는 이의 조합을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 또한, mRNA를 안정화시키기 위해 내인성 또는 외인성 비-코딩 영역을 사용하는 것이 추가로 유리할 수 있다.
키메라 작제물은 네이키드 (naked) DNA로서 또는 적합한 벡터에서 면역 세포로 도입될 수 있는 것으로 고려된다. 네이키드 DNA를 사용하는 전기 천공에 의해 세포를 안정하게 형질 감염시키는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 6,410,319를 참조한다. 네이키드 DNA는 일반적으로 발현을 위한 적당한 배향으로 플라스미드 발현 벡터 내에 함유된 키메라 수용체를 인코딩하는 DNA를 지칭한다. 본 개시 내용의 다시스트론성 모듈식 벡터는 바이러스 벡터일 수 있거나, 플라스미드와 같은 바이러스 벡터가 아닐 수 있다. 예시적인 실시 형태에 대해서는 본 출원에서 상세히 설명된 벡터가 레트로바이러스 벡터이지만, 다른 경우에서는 상기 벡터가 또한 바이러스 벡터이지만 대신에, 예를 들어, 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터이다.
임의의 벡터를 사용하여 키메라 작제물을 면역 세포에 도입할 수 있다. 본 개시 내용의 방법에 따라 사용하에 적합한 벡터는 면역 세포에서 비복제성이다. 예를 들어, HIV, SV40, EBV, HSV 또는 BPV를 기반으로 하는 벡터와 같은, 세포에 유지되는 바이러스의 카피 수가 세포의 생존력을 유지하기에 충분히 낮은 바이러스를 기반으로 하는 다수의 벡터가 공지되어 있다. 구체적인 경우에서, 상기 벡터는 몰로니 쥐과 동물 백혈병 바이러스를 기반으로 한다.
일부 양태에서, 항원 특이적 결합 또는 인식 성분은 하나 이상의 막관통 및 세포내 신호 전달 도메인에 연결된다. 일부 실시 형태에서, CAR은 CAR의 세포외 도메인에 융합된 막관통 도메인을 포함한다. 하나의 실시 형태에서, 자연적으로 CAR 내 도메인 중 하나와 연합된 막관통 도메인이 사용된다. 일부 경우에서, 막관통 도메인은 수용체 복합체의 다른 구성원과의 상호 작용을 최소화하기 위해 이러한 도메인이 동일하거나 상이한 표면 막 단백질의 막관통 도메인에 결합하는 것을 회피하도록 아미노산 치환에 의해 선택되거나 변형된다.
일부 실시 형태에서는 막관통 도메인이 천연으로부터 또는 합성 공급원으로부터 유래한다. 상기 공급원이 천연인 경우, 일부 양태에서는 도메인이 임의의 막결합 또는 막관통 단백질로부터 유래한다. 막관통 영역으로는 T-세포 수용체, CD28, CD3 제타, CD3 엡실론, CD3 감마, CD3 델타, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, ICOS/CD278, GITR/CD357, NKG2D 및 DAP 분자의 알파, 베타 또는 제타 쇄 (즉, 이들의 적어도 막관통 영역(들) 포함)로부터 유래된 것들을 포함한다. 대안으로, 일부 실시 형태에서는 막관통 도메인이 합성이다. 일부 양태에서, 합성 막관통 도메인은 주로 소수성 잔기들, 예를 들어, 류신 및 발린을 포함한다. 일부 양태에서, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 트리플렛은 합성 막관통 도메인의 각 말단에서 발견될 것이다.
특정 실시 형태에서, T, NK, iNKT, B 또는 MSC 세포와 같은 면역 세포를 유전적으로 변형시키기 위해 본 출원에서 기재된 플랫폼 기술은 (i) 전기 천공 장치 (예를 들어, 뉴클레오펙터)를 사용하는 비-바이러스 유전자 전달, (ii) 엔도도메인 (예를 들어, CD28/CD3-ζ, CD137/CD3-ζ 또는 다른 조합)을 통해 신호를 전달하는 CAR, (iii) 항원 인식 도메인을 세포 표면에 연결하는 다양한 길이의 세포외 도메인을 갖는 CAR, 및 일부 경우에는 (iv) CAR+ 면역 세포를 강력하고 수적으로 확장시킬 수 있도록 K562로부터 유래된 인공 항원 제시 세포 (artificial antigen presenting cell: aAPC)를 포함한다.
단일 벡터는 2개의 별개의 CAR 분자를 인코딩할 수 있거나, 단일 벡터는 하나 이상의 CAR 분자를 인코딩할 수 있으며, 이들 중 적어도 하나는 이중 특이적 CAR, 이중 특이적 TCR 또는 이중 특이적 CAR/TCR이다. 본 개시 내용의 벡터에 의해 인코딩된 항원 수용체, 벡터 자체 및 벡터 보유 세포는 사람의 손에 의해 생성되며 자연에서 존재하지 않는다.
일부 실시 형태에서, CAR은 항원에 특이적으로 결합하는 세포외 항원 인식 도메인을 포함한다. CAR은 특정 조직 또는 세포 유형의 항원을 표적화하도록 특별히 설계될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 항원은 세포 표면 상에서 발현되는 단백질이다. 일부 실시 형태에서, CAR은 TCR 유사 CAR이며, 상기 항원은 가공된 펩타이드 항원, 예를 들어, TCR과 같이 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 분자의 맥락에서 세포 표면 상에서 인식되는 세포내 단백질의 펩타이드 항원이다.
C. 항원
유전적으로 조작된 항원 수용체에 의해 표적화된 항원들 중에서, 입양 세포 요법을 통해 표적화되는 질환, 병태 또는 세포 유형의 맥락에서 발현되는 것들이 있다. 질환 및 병태 중에서, 고형 종양, 혈액학적 암, 면역계의 암, 예를 들어, 림프종, 백혈병 및/또는 골수종, 예를 들어, B, T 및 골수성 백혈병, 림프종 및 다발성 골수종을 포함한 암 및 종양 뿐만 아니라 자가 면역 또는 동종 면역 병태를 비롯한 증식성, 신생물성 및 악성 질환 및 장애가 있다. 일부 실시 형태에서, 항원은, 정상 또는 비표적화된 세포 또는 조직과 비교하여, 질환 또는 병태의 세포, 예를 들어, 종양 또는 병원성 세포 상에서 선택적으로 발현되거나 과발현된다. 다른 실시 형태에서, 항원은 정상 세포 상에서 발현되고/되거나 조작된 세포 상에서 발현된다. 일부 경우에서, 항원은 면역 관련 장애와 관련이 있다. 질병이 병원성 질병인 경우, 항원은 바이러스, 진균, 원생 동물 또는 세균과 같은 병원체의 종양일 것이다.
임의의 적합한 항원은 본 방법에서 사용될 수 있다. 예시적인 항원으로는 감염체, 자가/자기 항원, 종양/암 관련 항원 및 종양 신생 항원으로부터의 항원 분자가 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다 (문헌 [Linnemann et al., 2015]). 특별한 양태에서, 상기 항원으로는 서바이빈, PRAME, NY-ESO, EGFRvIII, Muc-1, Her2, CA-125, WT-1, Mage-A3, Mage-A4, Mage-A10, TRAIL/DR4 및 CEA가 포함된다. 특별한 양태에서, 2개 이상의 항원 수용체에 대한 항원으로는 CD19, EBNA, WT1, CD123, NY-ESO, EGFRvIII, MUC1, HER2, CA-125, WT1, Mage-A3, Mage-A4, Mage-A10, TRAIL/DR4 및/또는 CEA가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 이러한 항원들의 서열, 예를 들어, CD19 (수탁 번호 NG_007275.1), EBNA (수탁 번호 NG_002392.2), WT1 (수탁 번호 NG_009272.1), CD123 (수탁 번호 NC_000023.11), NY-ESO (수탁 번호 NC_000023.11), EGFRvIII (수탁 번호 NG_007726.3), MUC1 (수탁 번호 NG_029383.1), HER2 (수탁 번호 NG_007503.1), CA-125 (수탁 번호 NG_055257.1), WT1 (수탁 번호 NG_009272.1), Mage-A3 (수탁 번호 NG_013244.1), Mage-A4 (수탁 번호 NG_013245.1), Mage-A10 (수탁 번호 NC_000023.11), TRAIL/DR4 (수탁 번호 NC_000003.12) 및/또는 CEA (수탁 번호 NC_000019.10)는 당해 분야에 공지되어 있다.
종양 관련 항원은 전립선암, 유방암, 대장암, 폐암, 췌장암, 신장암, 중피종, 난소암 또는 흑색종 암 또는 혈액학적 악성 종양으로부터 유래될 수 있다. 예시적인 종양 관련 항원 또는 종양 세포 유래 항원으로는 MAGE 1, 3, 및 MAGE 4 (또는 국제공개공보 WO 99/40188에 개시된 것들과 같은 다른 MAGE 항원); PRAME; 서바이빈, BAGE; RAGE, Lage (NY ESO 1로도 또한 공지됨); SAGE; 및 HAGE 또는 GAGE가 포함된다. 종양 항원의 이러한 비제한적인 예들은 흑색종, 폐 암종, 육종 및 방광 암종 또는 혈액학적 악성 종양과 같은 광범위한 종양 유형에서 발현된다. 예를 들어, 미국 특허 6,544,518을 참조한다. 전립선암 종양 관련 항원으로는, 예를 들어, 전립선 특이적 막항원 (prostate specific membrane antigen: PSMA), 전립선 특이적 항원 (prostate-specific antigen: PSA), 전립선 산 포스파타아제, NKX3.1, 및 전립선의 6개 막관통 상피 항원 (six-transmembrane epithelial antigen of the prostate: STEAP)이 포함된다.
기타 종양 관련 항원으로는 Plu-1, HASH-1, HasH-2, Cripto 및 Criptin이 포함된다. 추가로, 종양 항원은 다수의 암 치료에 유용한, 전장 고나도트로핀 호르몬 방출 호르몬 (GnRH)과 같은 자가 펩타이드 호르몬, 짧은 10개 아미노산 길이의 펩타이드일 수 있다.
종양 항원으로는 HER-2/neu 발현과 같은 종양 관련 항원 발현을 특징으로 하는 암에서 유래된 종양 항원이 포함된다. 관심 대상 종양 관련 항원은 계통 특이적 종양 항원, 예를 들어, 멜라닌 세포 흑색종 계통 항원 MART-1/Melan-A, gp100, gp75, mda-7, 타이로시나아제 및 타이로시나아제 관련 단백질을 포함한다. 예시적인 종양 관련 항원으로는 p53, Ras, c-Myc, 세포질 세린/트레오닌 키나아제 (예를 들어, A-Raf, B-Raf 및 C-Raf, 사이클린 의존적 키나아제), MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A10, MAGE-A12, MART-1, BAGE, DAM-6, -10, GAGE-1, -2, -8, GAGE-3, -4, -5, -6, -7B, NA88-A, MART-1, MC1R, Gp100, PSA, PSM, 타이로시나아제, TRP-1, TRP-2, ART-4, CAMEL, CEA, Cyp-B, hTERT, hTRT, iCE, MUC1, MUC2, 포스포이노시타이드 3-키나아제 (Phosphoinositide 3-kinase: PI3K), TRK 수용체, PRAME, P15, RU1, RU2, SART-1, SART-3, 윌름스 종양 항원 (WT1), AFP, -카테닌/m, 카스파아제-8/m, CEA, CDK-4/m, ELF2M, GnT-V, G250, HSP70-2M, HST-2, KIAA0205, MUM-1, MUM-2, MUM-3, 미오신/m, RAGE, SART-2, TRP-2/INT2, 707-AP, 아넥신 II, CDC27/m, TPI/mbcr-abl, BCR-ABL, 인터페론 조절 인자 4 (IRF4), ETV6/AML, LDLR/FUT, Pml/RAR, 종양 관련 칼슘 신호 전달자 1 (Tumor-associated calcium signal transducer 1: TACSTD1), TACSTD2, 수용체 타이로신 키나아제 (예를 들어, 상피 세포 성장 인자 수용체 (Epidermal Growth Factor receptor: EGFR) (특히, EGFRvIII), 혈소판 유래 성장 인자 수용체 (platelet derived growth factor receptor: PDGFR), 혈관 내피 세포 성장 인자 수용체(vascular endothelial growth factor receptor: VEGFR)), 세포질 타이로신 키나아제 (예를 들어, src 계열, syk-ZAP70 계열), 인테그린 연결 키나아제 (integrin-linked kinase: ILK), 신호 전달자 및 전사 활성 인자 (signal transducer and activator of transcription) STAT3, STATS, 및 STATE, 저산소증 유발 인자 (hypoxia inducible factor: HIF) (예를 들어, HIF-1 및 HIF-2), 핵 인자-카파 B (NF-B), 노치 수용체 (예를 들어, 노치 1-4), c-Met, 라파마이신의 포유 동물 표적 (mammalian targets of rapamycin: mTOR), WNT, 세포외 신호 조절 키나아제 (extracellular signal-regulated kinase: ERK), 및 이의 조절 서브 유닛, PMSA, PR-3, MDM2, 메소텔린, 신세포 암종-5T4, SM22-알파, 탄산 무수화효소 I (carbonic anhydrases I: CAI) 및 IX (CAIX) (G250으로도 또한 공지됨), STEAD, TEL/AML1, GD2, 프로테이나아제3, hTERT, 육종 전위 변곡점, EphA2, ML-IAP, EpCAM, ERG (TMPRSS2 ETS 융합 유전자), NA17, PAX3, ALK, 안드로겐 수용체, 사이클린 B1, 폴리시알산, MYCN, RhoC, GD3, 푸코실 GM1, 메소텔린 (mesothelian), PSCA, sLe, PLAC1, GM3, BORIS, Tn, GLoboH, NY-BR-1, RGsS, SART3, STn, PAX5, OY-TES1, 정자 단백질 17, LCK, HMWMAA, AKAP-4, SSX2, XAGE 1, B7H3, 레구메인, TIE2, Page4, MAD-CT-1, FAP, MAD-CT-2, fos 관련 항원 1, CBX2, CLDN6, SPANX, TPTE, ACTL8, ANKRD30A, CDKN2A, MAD2L1, CTAG1B, SUNC1, LRRN1 및 유전형이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
이의 항원이 본 출원에서 기재된 방법에서 사용하기 위해 고려되는 예시적인 병원체로는 사람 면역 결핍 바이러스 (human immunodeficiency virus: HIV), 단순 헤르페스 바이러스 (herpes simplex virus: HSV), 호흡기 세포 융합 바이러스 (respiratory syncytial virus: RSV), 사이토메갈로바이러스 (cytomegalovirus: CMV), 엡스타인-바 바이러스 (Epstein-Barr virus: EBV), 인플루엔자 A, B 및 C, 수포성 구내염 바이러스 (vesicular stomatitis virus: VSV), 폴리오마바이러스 (예를 들어, BK 바이러스 및 JC 바이러스), 아데노바이러스, 메티실린 내성 스태필로코커스 아우레우스 (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus: MRSA)를 비롯한 스태필로코커스 종, 및 스트렙토코커스 뉴모니아에 (Streptococcus pneumoniae)를 비롯한 스트렙토코커스 종이 포함된다. 통상의 기술자가 이해하는 바와 같이, 본 출원에서 기재된 바와 같은 항원으로서 사용하기 위해 이들 및 다른 병원성 미생물로부터 유래된 단백질 및 당해 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은, 간행물 및 공개 데이터베이스, 예를 들어, GENBANK®, SWISS-PROT® 및 TREMBL®에서 확인될 수 있다.
사람 면역 결핍 바이러스 (HIV)로부터 유래된 항원은 HIV 비리온 구조 단백질 (예를 들어, gp120, gp41, p17, p24), 프로테아제, 역전사 효소, 또는 tat, rev, nef, vif, vpr 및 vpu로 인코딩된 HIV 단백질 중 임의의 것을 포함한다.
단순 헤르페스 바이러스 (예를 들어, HSV 1 및 HSV2)로부터 유래된 항원은 HSV 후기 유전자로부터 발현된 단백질을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 후기 유전자 그룹은 대부분 비리온 입자를 형성하는 단백질을 인코딩한다. 이러한 단백질은, 각각 본 출원에서 기재된 바와 같은 항원으로서 사용될 수 있는, 바이러스 캡시드: UL6, UL18, UL35, UL38 및 주요 캡시드 단백질 UL19, UL45 및 UL27을 형성하는 (UL) 중 5개의 단백질을 포함한다. 본 출원에서 항원으로서 사용하기 위해 고려되는 다른 예시적인 HSV 단백질로는 ICP27 (H1, H2), 당단백질 B (gB) 및 당단백질 D (gD) 단백질이 포함된다. HSV 게놈은 적어도 74개의 유전자를 포함하며, 각각은 항원으로서 잠재적으로 사용될 수 있는 단백질을 인코딩한다.
사이토메갈로바이러스 (CMV)로부터 유래된 항원으로는 CMV 구조 단백질, 바이러스 복제의 급초기 및 초기 중에 발현되는 바이러스 항원, 당단백질 I 및 III, 캡시드 단백질, 피막 단백질, 저급 기질 단백질 pp65 (ppUL83), p52 (ppUL44), IE1 및 1E2 (UL123 및 UL122), UL128~UL150 유래의 유전자 클러스터로부터 수득된 단백질 산물 (문헌 [Rykman, et al., 2006]), 외피성 당단백질 B (gB), gH, gN 및 pp150이 포함된다. 통상의 기술자가 이해하는 바와 같이, 본 출원에서 기재된 항원으로서 사용하기 위한 CMV 단백질은 GENBANK®, SWISS-PROT® 및 TREMBL®과 같은 공개 데이터베이스에서 확인될 수 있다 (예를 들어, 문헌[Bennekov et al., 2004], [Loewendorf et al., 2010], [Marschall et al., 2009] 참조).
특정 실시 형태에서 사용하기 위해 고려되는 엡스타인-바 바이러스 (EBV)로부터 유래된 항원으로는 EBV 용균 단백질 gp350 및 gp110, 엡스타인-바 핵 항원 (Epstein-Ban nuclear antigen: EBNA)-1, EBNA-2, EBNA-3A, EBNA-3B, EBNA-3C, EBNA-선도 단백질 (EBNALP)을 비롯한 잠복기 감염 중에 생산된 EBV 단백질, 및 잠재성 막 단백질(latent membrane protein: LMP)-1, LMP-2A 및 LMP-2B가 포함된다 (예를 들어, 문헌 [Lockey et al., 2008] 참조).
본 출원에서 사용하기 위해 고려되는 호흡기 세포 융합 바이러스 (RSV)로부터 유래된 항원으로는 RSV 게놈에 의해 인코딩되는 11개의 단백질 또는 이들의 항원 단편 중 임의의 것이 포함된다: NS1, NS2, N (뉴클레오캡시드 단백질), M (기질 단백질) SH, G 및 F (바이러스 피막 단백질), M2 (제2 기질 단백질), M2-1 (연장 인자), M2-2 (전사 조절), RNA 폴리머라아제 및 인단백질 P.
사용하기 위해 고려되는 수포성 구내염 바이러스 (VSV)로부터 유래된 항원으로는 VSV 게놈에 의해 인코딩되는 5개의 주요 단백질 또는 이들의 항원 단편 중 임의의 것이 포함된다: 거대 단백질 (L), 당단백질 (G), 핵단백질 (N), 인단백질 (P) 및 기질 단백질 (M) (예를 들어, 문헌 [Rieder et al., 1999] 참조).
특정 실시 형태에서 사용하기 위해 고려되는 인플루엔자 바이러스로부터 유래되는 항원으로는 헤마글루티닌 (HA), 뉴라미니다아제 (NA), 핵단백질 (NP), 기질 단백질 M1 및 M2, NS1, NS2 (NEP), PA, PB1, PB1-F2 및 PB2가 포함된다.
또한, 예시적인 바이러스 항원으로는 아데노바이러스 폴리펩타이드, 알파바이러스 폴리펩타이드, 칼리시바이러스 폴리펩타이드 (예를 들어, 칼리시바이러스 캡시드 항원), 코로나바이러스 폴리펩타이드, 디스템퍼 바이러스 폴리펩타이드, 에볼라 바이러스 폴리펩타이드, 엔테로바이러스 폴리펩타이드, 플라비바이러스 폴리펩타이드, 간염 바이러스 (AE) 폴리펩타이드 (B형 간염 코어 또는 표면 항원, C형 간염 바이러스 E1 또는 E2 당단백질, 코어 또는 비구조 단백질), 헤르페스바이러스 폴리펩타이드 (단순 헤르페스 바이러스 바이러스 또는 수두 대상포진 바이러스 당단백질 포함), 전염성 복막염 바이러스 폴리펩타이드, 백혈병 바이러스 폴리펩타이드, 마르부르크 바이러스 폴리펩타이드, 오르토믹소바이러스 폴리펩타이드, 유두종 바이러스 폴리펩타이드, 파라인플루엔자 바이러스 폴리펩타이드 (예를 들어, 헤마글루티닌 및 뉴라미니다아제 폴리펩타이드), 파라믹소바이러스 폴리펩타이드, 파보바이러스 폴리펩타이드, 페스티바이러스 폴리펩타이드, 피코르나 바이러스 폴리펩타이드 (예를 들어, 폴리오바이러스 캡시드 폴리펩타이드), 폭스 바이러스 폴리펩타이드 (예를 들어, 백시니아 바이러스 폴리펩타이드), 광견병 바이러스 폴리펩타이드 (예를 들어, 광견병 바이러스 당단백질 G), 레오바이러스 폴리펩타이드, 레트로바이러스 폴리펩타이드 및 로타바이러스 폴리펩타이드가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
특정 실시 형태에서, 항원은 세균 항원일 수 있다. 특정 실시 형태에서, 관심 대상 세균 항원은 분비된 폴리펩타이드일 수 있다. 다른 특정 실시 형태에서, 세균 항원은 세균의 외부 세포 표면 상에 노출된 폴리펩타이드의 부분 또는 부분들을 가지는 항원을 포함한다.
사용하기 위해 고려되는 메티실린 내성 스태필로코커스 아우레우스 (MRSA)를 비롯한 스태필로코커스 종으로부터 유래된 항원으로는 병독성 조절 인자, 예를 들어, Agr 시스템, Sar 및 Sae, Arl 시스템, Sar 동족체 (Rot, MgrA, SarS, SarR, SarT, SarU, SarV, SarX, SarZ 및 TcaR), Srr 시스템 및 TRAP가 포함된다. 항원의 역할을 할 수 있는 다른 스태필로코커스 단백질로는 Clp 단백질, HtrA, MsrR, 아코니타아제, CcpA, SvrA, Msa, CfvA 및 CfvB가 포함된다 (예를 들어, 문헌 [Staphylococcus: Molecular Genetics, 2008 Caister Academic Press, Ed. Jodi Lindsay] 참조). 2종의 스태필로코커스 아우레우스 (N315 및 Mu50)에 대한 게놈은 서열 분석되었으며, 예를 들어, PATRIC (문헌 [PATRIC: The VBI PathoSystems Resource Integration Center, Snyder et al., 2007])에서 공개적으로 이용 가능하다. 통상의 기술자가 이해하는 바와 같이, 항원으로서 사용하기 위한 스태필로코커스 단백질은 또한 다른 공개 데이터베이스, 예를 들어, GenBank®, Swiss-Prot® 및 TrEMBL®에서 확인될 수 있다.
본 출원에서 기재된 특정 실시 형태에서 사용하기 위해 고려되는 스트렙토코커스 뉴모니아에로부터 유래된 항원으로는 뉴몰리신, PspA, 콜린 결합 단백질 A (choline-binding protein A: CbpA), NanA, NanB, SpnHL, PavA, LytA, Pht 및 필린 단백질 (RrgA; RrgB; RrgC)이 포함된다. 스트렙토코커스 뉴모니아에의 항원성 단백질은 또한 당해 분야에 공지되어 있으며, 일부 실시 형태에서 항원으로서 사용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Zysk et al., 2000] 참조). 스트렙토코커스 뉴모니아에의 병독성 균주의 완전한 게놈 서열은 서열 분석되었으며, 통상의 기술자가 이해하는 바와 같이, 본 출원에서 사용하기 위한 스트렙토코커스 뉴모니아에 단백질은 또한 다른 공개 데이터베이스, 예를 들어, GENBANK®, SWISS-PROT® 및 TREMBL®에서 확인될 수 있다. 본 개시 내용에 따른 항원에 대한 특별한 관심 대상 단백질은 뉴모코커스의 표면에서 노출되는 것으로 예상되는 병독성 인자 및 단백질을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Frolet et al., 2010] 참조).
항원으로서 사용될 수 있는 세균 항원의 예로는 액티노마이세스 (Actinomyces) 폴리펩타이드, 바실러스 (Bacillus) 폴리펩타이드, 박테로이데스 (Bacteroides) 폴리펩타이드, 보르데텔라 (Bordetella) 폴리펩타이드, 바르토넬라 (Bartonella) 폴리펩타이드, 보렐리아 (Borrelia) 폴리펩타이드 (예를 들어, 보렐리아 부르그도르페리 (B. burgdorferi) OspA), 브루셀라 (Brucella) 폴리펩타이드, 캄필로박터 (Campylobacter) 폴리펩타이드, 카프노사이토파가 (Capnocytophaga) 폴리펩타이드, 클라미디아 (Chlamydia) 폴리펩타이드, 코리네박테리움 (Corynebacterium) 폴리펩타이드, 콕시엘라 (Coxiella) 폴리펩타이드, 더마토필러스 (Dermatophilus) 폴리펩타이드, 엔테로코커스 (Enterococcus) 폴리펩타이드, 에를리히아 (Ehrlichia) 폴리펩타이드, 에세리키아 (Escherichia) 폴리펩타이드, 프란시셀라 (Francisella) 폴리펩타이드, 푸소박테리움 (Fusobacterium) 폴리펩타이드, 헤모바르토넬라 (Haemobartonella) 폴리펩타이드, 헤모필러스 (Haemophilus) 폴리펩타이드 (예를 들어, b형 헤모필러스 인플루엔자 (H. influenzae) 외막 단백질), 헬리코박터 (Helicobacter) 폴리펩타이드, 클렙시엘라 (Klebsiella) 폴리펩타이드, L형 세균 폴리펩타이드, 렙토스피라 (Leptospira) 폴리펩타이드, 리스테리아 (Listeria) 폴리펩타이드, 마이코박테리아 (Mycobacteria) 폴리펩타이드, 마이코플라스마 (Mycoplasma) 폴리펩타이드, 나이세리아 (Neisseria) 폴리펩타이드, 네오리케차 (Neorickettsia) 폴리펩타이드, 노카르디아 (Nocardia) 폴리펩타이드, 파스퇴렐라 (Pasteurella) 폴리펩타이드, 펩토코커스 (Peptococcus) 폴리펩타이드, 펩토스트렙토코커스 (Peptostreptococcus) 폴리펩타이드, 뉴모코커스 (Pneumococcus) 폴리펩타이드 (즉, 스트렙토코커스 뉴모니아에 폴리펩타이드) (본 출원의 설명 참조), 프로테우스 (Proteus) 폴리펩타이드, 슈도모나스 (Pseudomonas) 폴리펩타이드, 리케차 (Rickettsia) 폴리펩타이드, 로칼리마에아 (Rochalimaea) 폴리펩타이드, 살모넬라 (Salmonella) 폴리펩타이드, 시겔라 (Shigella) 폴리펩타이드, 스태필로코커스 (Staphylococcus) 폴리펩타이드, A군 스트렙토코커스 (streptococcus) 폴리펩타이드 (예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스 (S. pyogenes) M 단백질), B군 스트렙토코커스 아갈락티아에 (S. agalactiae) 폴리펩타이드, 트레포네마 (Treponema) 폴리펩타이드 및 여시니아 (Yersinia) 폴리펩타이드 (예를 들어, 여시니아 페스티스 (Y. pestis) F1 및 V 항원)가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
진균 항원의 예로는 압시디아 (Absidia) 폴리펩타이드, 아크레모늄 (Acremonium) 폴리펩타이드, 알터나리아 (Alternaria) 폴리펩타이드, 아스퍼질러스 (Aspergillus) 폴리펩타이드, 바시디오볼루스 (Basidiobolus) 폴리펩타이드, 비폴라리스 (Bipolaris) 폴리펩타이드, 블라스토마이세스 (Blastomyces) 폴리펩타이드, 칸디다 (Candida) 폴리펩타이드, 콕시디오이데스 (Coccidioides) 폴리펩타이드, 코니디오볼루스 (Conidiobolus) 폴리펩타이드, 크립토코커스 (Cryptococcus) 폴리펩타이드, 쿠르발라리아 (Curvalaria) 폴리펩타이드, 에피더모파이톤 (Epidermophyton) 폴리펩타이드, 엑소피알라 (Exophiala) 폴리펩타이드, 게오트리쿰 (Geotrichum) 폴리펩타이드, 히스토플라스마 (Histoplasma) 폴리펩타이드, 마두렐라 (Madurella) 폴리펩타이드, 말라세지아 (Malassezia) 폴리펩타이드, 마이크로스포룸 (Microsporum) 폴리펩타이드, 모닐리엘라 (Moniliella) 폴리펩타이드, 모르티에렐라 (Mortierella) 폴리펩타이드, 무코르 (Mucor) 폴리펩타이드, 패실로마이세스 (Paecilomyces) 폴리펩타이드, 페니실리움 (Penicillium) 폴리펩타이드, 피알레모니움 (Phialemonium) 폴리펩타이드, 피알로포라 (Phialophora) 폴리펩타이드, 프로토테카 (Prototheca) 폴리펩타이드, 슈달레세리아 (Pseudallescheria) 폴리펩타이드, 슈도마이크로도키움 (Pseudomicrodochium) 폴리펩타이드, 피시움 (Pythium) 폴리펩타이드, 리노스포리듐 (Rhinosporidium) 폴리펩타이드, 리조푸스 (Rhizopus) 폴리펩타이드, 스콜레코바시디움 (Scolecobasidium) 폴리펩타이드, 스포로트릭스 (Sporothrix) 폴리펩타이드, 스템파일리움 (Stemphylium) 폴리펩타이드, 트리코파이톤 (Trichophyton) 폴리펩타이드, 트리코스포론 (Trichosporon) 폴리펩타이드 및 자일로히파 (Xylohypha) 폴리펩타이드가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
원생 기생충 항원의 예로는 바베시아 (Babesia) 폴리펩타이드, 발란티디움 (Balantidium) 폴리펩타이드, 베스노이티아 (Besnoitia) 폴리펩타이드, 크립토스포리디움 (Cryptosporidium) 폴리펩타이드, 에이메리아 (Eimeria) 폴리펩타이드, 엔세팔리토준 (Encephalitozoon) 폴리펩타이드, 엔타모에바 (Entamoeba) 폴리펩타이드, 지아르디아 (Giardia) 폴리펩타이드, 함몬디아 (Hammondia) 폴리펩타이드, 헤파토준 (Hepatozoon) 폴리펩타이드, 이소스포라 (Isospora) 폴리펩타이드, 라이슈마니아 (Leishmania) 폴리펩타이드, 마이크로스포리디아 (Microsporidia) 폴리펩타이드, 네오스포라 (Neospora) 폴리펩타이드, 노세마 (Nosema) 폴리펩타이드, 펜타트리코모나스 (Pentatrichomonas) 폴리펩타이드, 플라스모디움 (Plasmodium) 폴리펩타이드가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 연충 기생충 항원의 예로는 아칸토케일로네마 (Acanthocheilonema) 폴리펩타이드, 아엘루로스트롱질루스 (Aelurostrongylus) 폴리펩타이드, 안실로스토마 (Ancylostoma) 폴리펩타이드, 안지오스트롱질루스 (Angiostrongylus) 폴리펩타이드, 아스카리스 (Ascaris) 폴리펩타이드, 브루기아 (Brugia) 폴리펩타이드, 부노스토뭄 (Bunostomum) 폴리펩타이드, 카필라리아 (Capillaria) 폴리펩타이드, 차베르티아 (Chabertia) 폴리펩타이드, 쿠페리아 (Cooperia) 폴리펩타이드, 크레노소마 (Crenosoma) 폴리펩타이드, 딕티오카울루스 (Dictyocaulus) 폴리펩타이드, 디옥토파임 (Dioctophyme) 폴리펩타이드, 디페탈로네마 (Dipetalonema) 폴리펩타이드, 디파일로보트리움 (Diphyllobothrium) 폴리펩타이드, 디플라이디움 (Diplydium) 폴리펩타이드, 디로필라리아 (Dirofilaria) 폴리펩타이드, 드라쿤쿨루스 (Dracunculus) 폴리펩타이드, 엔테로비우스 (Enterobius) 폴리펩타이드, 필라로이데스 (Filaroides) 폴리펩타이드, 헤몬쿠스 (Haemonchus) 폴리펩타이드, 라고킬라스카리스 (Lagochilascaris) 폴리펩타이드, 로아 (Loa) 폴리펩타이드 폴리펩타이드, 만소넬라 (Mansonella) 폴리펩타이드, 무엘레리우스 (Muellerius) 폴리펩타이드, 나노파이터스 (Nanophyetus) 폴리펩타이드, 네카토르 (Necator) 폴리펩타이드, 네마토디루스 (Nematodirus) 폴리펩타이드, 외소파고스토뭄 (Oesophagostomum) 폴리펩타이드, 온코세르카 (Onchocerca) 폴리펩타이드, 오피스토르키스 (Opisthorchis) 폴리펩타이드, 오스테르타기아 (Ostertagia) 폴리펩타이드, 파라필라리아 (Parafilaria) 폴리펩타이드, 파라고니무스 (Paragonimus) 폴리펩타이드, 파라스카리스 (Parascaris) 폴리펩타이드, 파이살로프테라 (Physaloptera) 폴리펩타이드, 프로토스트롱질루스 (Protostrongylus) 폴리펩타이드, 세타리아 (Setaria) 폴리펩타이드, 스피로세르카 (Spirocerca) 폴리펩타이드, 스피로메트라 (Spirometra) 폴리펩타이드, 스테파노필라리아 (Stephanofilaria) 폴리펩타이드, 스트롱질로이데스 (Strongyloides) 폴리펩타이드, 스트롱질루스 (Strongylus) 폴리펩타이드, 텔라지아 (Thelazia) 폴리펩타이드, 톡사스카리스 (Toxascaris) 폴리펩타이드, 톡소카라 (Toxocara) 폴리펩타이드, 트리키넬라 (Trichinella) 폴리펩타이드, 트리코스트롱질루스 (Trichostrongylus) 폴리펩타이드, 트리쿠리스 (Trichuris) 폴리펩타이드, 운시나리아 (Uncinaria) 및 우케레리아 (Wuchereria) 폴리펩타이드 (예를 들어, 플라스모디움 팔시파룸 포자소체 (P. falciparum circumsporozoite: PfCSP)), 포자소체 표면 단백질 2 (P. falciparum sporozoite surface protein 2: PfSSP2), 간 상태 항원 1의 카복시 말단 (P. falciparum carboxyl terminus of liver state antigen 1: PfLSA1 c-말단) 및 외수송 단백질 1 (P. falciparum exported protein 1: PfExp-1), 뉴모시스티스 (Pneumocystis) 폴리펩타이드, 사코시스티스 (Sarcocystis) 폴리펩타이드, 시스토소마 (Schistosoma) 폴리펩타이드, 테일레리아 (Theileria) 폴리펩타이드, 톡소플라스마 (Toxoplasma) 폴리펩타이드, 트립파노소마 (Trypanosoma) 폴리펩타이드가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
외부 기생충 항원의 예로는 벼룩; 진드기, 예를 들어, 참 진드기 및 물렁 진드기; 파리, 예를 들어, 깔따구, 모기, 모래파리, 먹파리, 말파리, 뿔파리, 사슴파리, 체체파리, 침파리, 구더기증 유발 파리 및 각다귀; 개미; 거미, 이; 진드기; 및 노린재, 예를 들어, 빈대 및 침노린재 유래의 폴리펩타이드 (알러지원 뿐만 아니라 항원 포함)가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
D. CD8αβ 공동 수용체
구체적인 실시 형태에서, 본 개시 내용의 CD4+ 및 CD8+ 세포는 외인성 CD8αβ 공동 수용체를 발현한다. CD8αβ 공동 수용체는 구체적인 실시 형태에서 포유 동물 공급원으로부터 유래되며, 사람, 래트, 마우스 등일 수 있다.
CD8α 핵산 분자의 하나의 예는 NCBI GenBank® 데이터베이스 (수탁 번호 BC025715)에 있으며, 이의 서열은 하기에서 제공된다:
Figure pct00001
Figure pct00002
CD8α 단백질 분자의 하나의 예는 NCBI GenBank® 데이터베이스 (수탁 번호 AAH25715)에 있으며, 이의 서열은 하기에서 제공된다:
Figure pct00003
CD8β 핵산 분자의 하나의 예는 NCBI GenBank® 데이터베이스 (수탁 번호 BC100912)에 있으며, 이의 서열은 하기에서 제공된다:
Figure pct00004
CD8β 단백질 분자의 하나의 예는 NCBI GenBank® 데이터베이스 (수탁 번호 AAI00913)에 있으며, 이의 서열은 하기에서 제공된다:
Figure pct00005
E. 제조용 세포
CD4+ 및 CD8+ 세포는 1명 이상의 개체의 샘플로부터 선택될 수 있다. 샘플은 치료되는 개체로부터 유래될 수 있으므로 치료되는 개체에 대해 자가이다. 다른 경우에서, 샘플은 세포로 치료되는 개체 이외의 개체로부터 유래되므로 치료되는 개체에 대해 동종이계이다. CD4+ 및 CD8+ 세포는 대상체, 특히, 요법을 필요로 하는 개체를 비롯한 사람 대상체로부터 단리된 면역 세포로부터 선택될 수 있다. 면역 세포는 혈액, 제대혈, 비장, 흉선, 림프절 및 골수를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 대상체에 있는 임의의 장소로부터 수집될 수 있다. 단리된 면역 세포는 직접 사용될 수 있거나, 예를 들어, 냉동에 의해 일정 기간 동안 보관될 수 있다.
면역 세포는, 혈액 (혈액 은행 또는 제대혈 은행에 의해 수집된 혈액 포함), 비장, 골수, 수술 절차 동안 제거되고/되거나 노출된 조직, 및 생검 절차를 통해 수득된 조직을 포함하지만 이들에 한정되지 않고 면역 세포가 있는 임의의 조직으로부터, 농축/정제될 수 있다. 면역 세포가 농축, 단리 및/또는 정제되는 조직/장기는 살아있는 대상체와 살아있지 않은 대상체 둘 다로부터 분리될 수 있으며, 여기서, 상기 살아있지 않은 대상체는 장기 공여자이다. 특별한 실시 형태에서, 면역 세포는 혈액, 예를 들어, 말초 혈액 또는 제대혈로부터 단리된다. 일부 양태에서, 제대혈로부터 단리된 면역 세포는 면역 조절 능력을 증진시켰다. 구체적인 양태에서, 면역 세포는 증진된 면역 조절 능력을 위해 풀링된 혈액 (pooled blood), 특히, 풀링된 제대혈로부터 단리된다. 풀링된 혈액은 2개 이상의 공급원, 예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 공급원 (예를 들어, 공여자 대상체)으로부터 유래할 수 있다.
CD4+ 및 CD8+ 세포가 유래되는 면역 세포의 집단은 요법을 필요로 하거나 질환을 앓고 있는 대상체로부터 수득될 수 있다. 따라서, 세포는 요법을 필요로 하는 대상체에 대해 자가일 것이다. 대안으로, 면역 세포의 집단은 공여자, 바람직하게는 조직접합성 일치된 공여자로부터 수득될 수 있다. 면역 세포 집단은, 면역 세포가 상기 대상체 또는 공여자에 있는 말초 혈액, 제대혈, 골수, 비장, 또는 임의의 다른 장기/조직으로부터 수확될 수 있다. 면역 세포는 대상체 및/또는 공여자의 풀로부터, 예를 들어, 풀링된 제대혈에서 단리될 수 있다.
면역 세포의 집단이 대상체와는 완전히 다른 공여자로부터 수득될 때, 수득된 세포가 대상체에 도입될 수 있다는 점에서 대상체와 상용 가능한 경우, 공여자는 바람직하게는 동종이계이다. 동종이계 공여자 세포는 사람 림프구 항원 (HLA)과 상용 가능할 수 있거나 상용 가능하지 않을 수 있다. 대상체와 상용 가능하기 위해서, 동종이계 세포는 면역원성을 감소시키도록 처리될 수 있다 (문헌 [Fast et al., 2004]).
F. 제조 방법
당해 분야의 통상의 기술자는 본 개시 내용의 형질 전환 분자의 발현을 위해 표준 재조합 기술 (예를 들어, 둘 다 본 출원에 참조로 포함되는 문헌 [Sambrook et al., 2001] 및 [Ausubel et al., 1996] 참조)을 통해 벡터를 작제할 준비가 잘 되어 있을 것이다. 형질 전환 분자는 바이러스 벡터 또는 비-바이러스 벡터를 비롯한 벡터 내 또는 벡터 상의 수용 세포에 제공될 수 있다. 바이러스 벡터의 예로는 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 렌티바이러스 또는 레트로바이러스가 포함된다. 비-바이러스 벡터의 예로는 플라스미드, 리포좀, 나노 입자 등이 포함된다. 구체적인 실시 형태에서, 벡터는 레트로바이러스이다.
1. 조절 요소
본 개시 내용에서 유용한 벡터에 포함되는 발현 카세트는, 특히 (5'에서 3' 방향으로) 단백질 코딩 서열에 작동 가능하게 연결되는 진핵 생물의 전사 프로모터, 개재 서열을 포함하는 스플라이스 신호 및 전사 종결/폴리아데닐화 서열을 함유한다. 진핵 세포에서 단백질 인코딩 유전자의 전사를 조절하는 프로모터 및 인핸서는 여러 유전자 요소로 구성될 수 있다. 세포 기구는, 상이한 유전자가 전사 조절의 특유의 종종 복잡한 패턴을 진전시키도록 하는, 각각의 요소에 의해 운반된 조절 정보를 모으고 통합할 수 있다. 본 개시 내용의 맥락에서 사용되는 프로모터로는, 예를 들어, 항시성, 유도성 및 조직 특이적 프로모터가 포함된다. 벡터가 암 요법의 생성에 이용되는 경우, 프로모터는 저산소의 상태하에 효과적 일 수 있다.
a. 프로모터/인핸서
본 출원에서 제공되는 발현 작제물은 항원 수용체 및 다른 시스트론 유전자 산물의 발현을 구동시키기 위한 프로모터를 포함한다. 프로모터는 일반적으로 RNA 합성을 위한 개시 부위를 위치시키는 기능을 하는 서열을 포함한다. 이의 가장 잘 공지된 예는 TATA 박스이지만, 예를 들어, 포유 동물의 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라아제 유전자를 위한 프로모터 및 SV40 후기 유전자를 위한 프로모터와 같은 TATA 박스가 결여된 일부 프로모터에서는 개시 부위 위에 놓이는 별개의 요소 자체가 개시 장소의 고정을 보조한다. 추가의 프로모터 요소는 전사 개시의 빈도를 조절한다. 전형적으로, 다수의 프로모터가 개시 부위의 다운스트림에도 기능 요소를 함유하는 것으로 밝혀졌지만, 이들은 개시 부위의 업스트림의 영역에 위치한다. 프로모터"의 제어하에" 코딩 서열을 가져오기 위해서, 선택된 프로모터의 "다운스트림" (즉, 3')에 전사 리딩 프레임의 전사 개시 부위의 5' 말단을 위치시킨다. "업스트림" 프로모터는 DNA의 전사를 자극하고 인코딩된 RNA의 발현을 촉진시킨다.
프로모터 요소들 사이의 간격은 종종 유연하므로, 프로모터 기능은 요소가 서로에 대해 역위이거나 이동될 때 보존된다. tk 프로모터에서, 예를 들어, 프로모터 요소들 사이의 간격은, 활성이 감소하기 시작하기 전에, 50 bp 간격으로 증가할 수 있다. 프로모터에 따라, 개별 요소는 전사를 활성화시키기 위해 협력적으로 또는 독립적으로 기능할 수 있는 것으로 보인다. 프로모터는 핵산 서열의 전사 활성화에 관여하는 시스-작용성 조절 서열을 나타내는 "인핸서"와 함께 사용되거나 사용되지 않을 수 있다.
프로모터는, 코딩 분절 및/또는 엑손의 업스트림에 위치하는 5' 비-코딩 서열을 단리함으로써 수득될 수 있기 때문에, 핵산 서열과 자연적으로 결합된 것일 수 있다. 이러한 프로모터는 "내인성"으로서 지칭될 수 있다. 유사하게, 인핸서는 해당 서열의 다운스트림 또는 업스트림에 위치한 핵산 서열과 자연적으로 결합된 것일 수 있다. 대안으로, 특정 이점은 자연 환경에서 핵산 서열과 정상적으로 결합되지 않은 프로모터를 지칭하는 재조합 또는 이종 프로모터의 제어하에 코딩 핵산 분절을 위치시킴으로써 수득될 것이다. 재조합 또는 이종 인핸서는 또한 이의 자연 환경에서 핵산 서열과 정상적으로 결합하지 않은 인핸서를 지칭한다. 이러한 프로모터 또는 인핸서는 다른 유전자의 프로모터 또는 인핸서, 임의의 다른 바이러스, 또는 원핵 생물 또는 진핵 생물 세포로부터 단리된 프로모터 또는 인핸서, 및 "자연 발생"이 아닌 프로모터 또는 인핸서, 즉, 상이한 전사 조절 영역의 상이한 요소, 및/또는 발현을 변경시키는 돌연변이를 함유하는 프로모터 또는 인핸서를 포함할 수 있다. 예를 들어, 재조합 DNA 작제에서 가장 흔히 사용되는 프로모터로는 β-락타마아제 (페니실리나아제), 락토오스 및 트립토판 (trp-) 프로모터 시스템이 포함된다. 프로모터 및 인핸서의 핵산 서열을 합성으로 생성하는 것에 추가하여, 서열들은 본 출원에 개시된 조성물과 관련하여 PCR™을 포함하는 재조합 클로닝 및/또는 핵산 증폭 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 또한, 미토콘드리아, 엽록체 등과 같은 비핵 소기관 내에서 서열의 전사 및/또는 발현을 지시하는 제어 서열도 또한 사용될 수 있는 것으로 고려된다.
당연히, 발현을 위해 선택된 소기관, 세포 유형, 조직, 장기 또는 유기체에서 DNA 분절의 발현을 효과적으로 지시하는 프로모터 및/또는 인핸서를 사용하는 것은 중요할 것이다. 분자 생물학 분야의 통상의 기술자는 단백질 발현을 위한 프로모터, 인핸서 및 세포 유형 조합의 용도를 일반적으로 알고 있다 (예를 들어, 본 출원에 참조로 포함되는 문헌 [Sambrook et　al. 1989] 참조). 사용되는 프로모터는, 재조합 단백질 및/또는 펩타이드의 대규모 생산에 유리한 바와 같이, 도입된 DNA 분절의 높은 수준의 발현을 지시하기 위한 적절한 조건하에 항시성, 조직-특이적, 유도성 및/또는 유용성일 수 있다. 프로모터는 이종 또는 내인성일 수 있다.
추가로, 임의의 프로모터/인핸서 조합 (예를 들어, epd.isb-sib.ch/의 월드 와이드 웹을 통한 진핵 생물의 프로모터 데이터베이스 EPDB에 따름)은 또한 발현을 구동시키기 위해 사용될 수 있다. T3, T7 또는 SP6 세포질 발현 시스템의 사용은 또 다른 가능한 실시 형태이다. 적절한 세균 폴리머라아제가 전달 복합체의 일부로서 또는 추가의 유전자 발현 작제물로서 제공되는 경우, 진핵 생물 세포는 특정 세균 프로모터로부터의 세포질 전사를 지원할 수 있다.
프로모터의 비제한적인 예로는 초기 또는 후기 바이러스 프로모터, 예를 들어, SV40 초기 또는 후기 프로모터, 사이토메갈로바이러스 (CMV) 급초기 프로모터, 라우스 육종 바이러스 (Rous Sarcoma Virus: RSV) 초기 프로모터; 진핵 세포 프로모터, 예를 들어, 베타 액틴 프로모터, GADPH 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터; 및 연쇄 반응 요소 프로모터, 예를 들어, 사이클릭 AMP 반응 요소 프로모터 (cre), 혈청 반응 요소 프로모터 (sre), 포르볼 에스테르 프로모터 (TPA) 및 최소 TATA 박스 근처의 반응 요소 프로모터 (tre)가 포함된다. 사람 성장 호르몬 프로모터 서열 (예를 들어, Genbank® 수탁 번호 X05244의 뉴클레오타이드 283~341에 기술된 사람 성장 호르몬 최소 프로모터) 또는 마우스 유선 종양 프로모터 (ATCC로부터 입수 가능, 카탈로그 번호 ATCC 45007)도 또한 사용 가능하다. 특정 실시 형태에서, 프로모터는 CMV IE, 덱틴-1, 덱틴-2, 사람 CD11c, F4/80, SM22, RSV, SV40, Ad MLP, 베타-액틴, MHC 클래스 I 또는 MHC 클래스 II 프로모터이지만, 치료학적 유전자의 발현을 구동시키는데 유용한 임의의 다른 프로모터가 본 개시 내용의 실시에 적용 가능하다.
특정 양태에서, 본 개시 내용의 방법은 또한 인핸서 서열, 즉, 프로모터의 활성을 증가시키는 핵산 서열 및 심지어 상대적으로 긴 거리 (표적 프로모터로부터 수 킬로베이스 (kilobase) 이하)에 걸쳐서도 이들의 배향에 관계없이 시스로 작용하는 잠재력을 갖는 핵산 서열에 관한 것이다. 그러나, 인핸서 기능은 주어진 프로모터와 매우 근접하게 기능할 수도 있으므로 이러한 긴 거리에 반드시 제한되는 것은 아니다.
b. 개시 신호 및 연계 발현
특정 개시 신호는 또한 코딩 서열의 효율적인 번역을 위해 본 개시 내용의 방법에서 제공되는 발현 작제물에서 사용될 수 있다. 이들 신호는 ATG 개시 코돈 또는 인접한 서열을 포함한다. ATG 개시 코돈을 포함하는 외인성 번역 제어 신호가 제공될 필요가 있을 수 있다. 당해 분야의 통상의 기술자는 용이하게 이것을 결정하고 필요한 신호를 제공할 수 있을 것이다. 개시 코돈은 전체 삽입물의 번역을 보장하기 위해 목적하는 코딩 서열의 리딩 프레임과 "프레임 내에서" 존재해야 한다는 것은 잘 공지되어 있다. 외인성 번역 제어 신호 및 개시 코돈은 천연 또는 합성일 수 있다. 발현 효율은 적절한 전사 인핸서 요소를 포함시켜 증진될 수 있다.
특정 실시 형태에서, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES) 요소의 사용은 다중 유전자 또는 다시스트론성 메시지를 생성하는데 사용된다. IRES 요소는 5' 메틸화된 Cap 의존적 번역의 리보솜 스캐닝 모델을 우회하고 내부 부위에서 번역을 시작할 수 있다. 피코르나바이러스 계열의 2개의 구성원 (소아마비 및 뇌 심근염)으로부터의 IRES 요소 뿐만 아니라 포유 동물 메시지로부터의 IRES도 기재되어 있다. IRES 요소는 이종 오픈 리딩 프레임과 연결될 수 있다. 다중 오픈 리딩 프레임들은 함께 전사될 수 있으며, 각각은 IRES에 의해 분리되어 다시스트론성 메세지를 생성한다. IRES 요소 때문에, 각각의 오픈 리딩 프레임은 효율적인 번역을 위해 리보솜에 접근 가능하다. 다중 유전자는 단일 메시지를 전사하기 위해 단일 프로모터/인핸서를 사용하여 효율적으로 발현될 수 있다.
특정 2A 서열 요소는 본 개시 내용에서 제공되는 작제물에서 유전자의 연계 발현 또는 공동 발현을 생성하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 절단 서열은 오픈 리딩 프레임들을 연결하여 단일 시스트론을 형성함으로써 유전자를 공동 발현시키는데 사용될 수 있다. 예시적인 절단 서열은 에퀴네 비염 A 바이러스 (E2A) 또는 F2A (구제역 바이러스 2A) 또는 "2A 유사" 서열 (예를 들어, 토세아 아시그나 (Thosea asigna) 바이러스 2A; T2A) 또는 돼지 테스코바이러스-1 (P2A)이다. 구체적인 실시 형태에서, 단일 벡터에서는 다중 2A 서열이 동일하지 않지만, 대안적인 실시 형태에서는 동일한 벡터가 동일한 2A 서열 중 2개 이상을 이용한다. 2A 서열의 예는 그 전체가 본 출원에 참조로 포함되는 미국 출원공개 US 2011/0065779에 제공되어 있다.
자가 절단 2A 펩타이드가 이용되는 실시 형태에서, 2A 펩타이드는 진핵 세포에서 번역 동안 폴리펩타이드의 "절단"을 매개하는 18~22개 아미노산 (aa) 길이의 바이러스 올리고펩타이드일 수 있다. "2A"라는 명칭은 바이러스 게놈의 특정 영역을 지칭하며, 상이한 바이러스 2A는 일반적으로 이들이 유래된 바이러스의 이름을 따서 명명되었다. 최초로 발견된 2A는 F2A (구제역 바이러스)이었으며, 이후 E2A (에퀴네 비염 A 바이러스), P2A (돼지 테스코바이러스-1 2A) 및 T2A (토세아 아시그나 바이러스 2A)도 또한 확인되었다. 2A 매개성 "자기 절단"의 메커니즘은 2A의 C-말단에서 글리실-프롤릴 펩타이드 결합의 형성을 스키핑 (skipping)하는 리보솜인 것으로 밝혀졌다. 고도로 보존된 서열 GDVEXNPGP는 C-말단에서 상이한 2A에 의해 공유되며, 입체 장애 및 리보솜 스키핑의 생성에 유용하다. 번역의 성공적인 스키핑 및 재개는 2개의 "절단된" 단백질을 생성한다. 2A 서열의 예는 다음과 같다:
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c. 복제 원점
숙주 세포에서 벡터를 증식시키기 위해, 이것은 하나 이상의 복제 기원 부위 (종종 "ori"라고 칭함), 예를 들어, 상기에서 기재된 바와 같은 EBV의 oriP 또는 프로그래밍에서 유사하거나 상승된 기능을 갖는 유전적으로 조작된 oriP에 상응하는 핵산 서열을 함유할 수 있으며, 상기 핵산 서열은 복제가 개시되는 특정 핵산 서열이다. 대안으로, 상기에서 기재된 바와 같은 다른 염색체외성 복제 바이러스 또는 자율 복제성 서열 (autonomously replicating sequence: ARS)의 복제 원점이 사용될 수 있다.
d. 선택 및 스크리닝 가능한 마커
특정 실시 형태에서, 본 개시 내용의 작제물을 함유하는 세포는 발현 벡터에 마커를 포함시켜 시험관내에서 또는 생체내에서 확인될 수 있다. 이러한 마커는 발현 벡터를 함유하는 세포의 용이한 확인을 허용하는 세포에 확인 가능한 변화를 부여할 것이다. 일반적으로, 선택 마커는 선택을 허용하는 특성을 부여하는 것이다. 양성 선택 마커는 마커의 존재가 선택을 허용하는 것이고, 한편 음성 선택 마커는 마커의 존재가 선택을 방해하는 것이다. 양성 선택 마커의 한 예는 약물 내성 마커이다.
일반적으로, 약물 선택 마커의 함유는 형질 전환체의 클로닝 및 확인을 보조하며, 예를 들어, 네오마이신, 퓨로마이신, 하이그로마이신, DHFR, GPT, 제오신 및 히스티디놀에 대한 내성을 부여하는 유전자는 유용한 선택 마커이다. 조건의 실시에 기초한 형질 전환체의 식별을 허용하는 표현형을 부여하는 마커에 추가하여, 비색 분석에 기초하는 GFP와 같은 스크리닝 가능한 마커를 포함하는 다른 유형의 마커도 또한 고려된다. 대안으로, 단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나아제 (tk) 또는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제 (chloramphenicol acetyltransferase: CAT)와 같은 음성 선택 마커로서 스크리닝 가능한 효소가 이용될 수 있다. 당해 분야의 통상의 기술자는 또한 면역학적 마커를 가능하게는 FACS 분석과 함께 사용하는 방법을 알고 있을 것이다. 사용되는 마커는 유전자 산물을 인코딩하는 핵산과 동시에 발현될 수 있는 한 중요한 것으로 여겨지지 않는다. 선택 및 스크리닝 가능한 마커의 추가 예는 당해 분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.
e. 자살 유전자
본 개시 내용에 의해 포함되는 벡터를 보유하도록 변형된 본 개시 내용의 세포는 하나 이상의 자살 유전자를 포함할 수 있다. 본 출원에서 사용되는 "자살 유전자"라는 용어는, 프로드럭 또는 다른 제제의 투여시, 유전자 산물을 숙주 세포를 사멸시키는 화합물로 전이시키는 유전자로서 정의된다. 사용될 수 있는 자살 유전자/프로드럭 조합의 예로는 단순 헤르페스 바이러스-티미딘 키나아제 (HSV-tk) 및 간시클로비르, 아시클로비르 또는 FIAU; 옥시도리덕타아제 및 사이클로헥시미드; 사이토신 데아미나아제 및 5-플루오로사이토신; 티미딘 키나아제 티미딜레이트 키나아제 (Tdk::Tmk) 및 AZT; 및 데옥시시티딘 키나아제 및 사이토신 아라비노사이드이다.
프로드럭 6-메틸퓨린 데옥시리보사이드를 독성 퓨린 6-메틸퓨린으로 전환시키는 소위 자살 유전자로 불리는 이. 콜라이 (E.coli) 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라아제가 사용될 수 있다. 프로드럭 요법과 함께 사용되는 자살 유전자의 다른 예로는 이. 콜라이 사이토신 데아미나아제 유전자 및 HSV 티미딘 키나아제 유전자가 있다.
예시적인 자살 유전자로는 CD20, CD52, EGFRv3 또는 유도성 카스파아제 9가 포함된다. 하나의 실시 형태에서, 절단된 버전의 EGFR 변이체 III (EGFRv3)은 세툭시맙에 의해 제거될 수 있는 자살 항원으로서 사용될 수 있다. 본 개시 내용에서 사용될 수 있는 당해 분야에 공지된 추가의 자살 유전자로는 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라아제 (Purine nucleoside phosphorylase: PNP), 시토크롬 p450 효소 (CYP), 카복시펩티다아제 (CP), 카복실에스테라아제 (CE), 니트로디럭타아제 (NTR), 구아닌 리보실트랜스퍼라아제 (XGRTP), 글리코시다아제 효소, 메티오닌-α,γ-리아제 (MET) 및 티미딘 포스포릴라아제 (TP)가 포함된다. 구체적인 실시 형태에서, 모두가 그 전체가 본 출원에 참조로 포함되는 2018년 11월 19일자로 출원된 미국 가특허 출원 US 62/769,405, 2018년 11월 30일자로 출원된 미국 가특허 출원 US 62/773,372, 및 2019년 1월 11일자로 출원된 미국 가특허 출원 US 62/791,464에서 기재된 바와 같이, 세포막 상에서 발현되는 비분비성 TNF 알파 단백질을 인코딩하는 돌연변이체 TNF-알파 자살 유전자가 이용되는데, 이는 이것을 항체와 같은 억제제에 의해 표적화될 수 있도록 한다.
IV. 치료 방법
일부 실시 형태에서, 본 개시 내용는 CD8αβ 공동 수용체를 발현하도록 조작되는 본 개시 내용에 의해 포함되는 유효량의 면역 세포를 투여하는 단계를 포함하는, 면역 요법을 비롯한 요법을 위한 방법을 제공한다. 일부 실시 형태에서, 의학적 질환 또는 장애는 세포를 수여자 개체에게 전달함으로써 치료된다. 본 개시 내용의 특정 실시 형태에서, 암은 항원을 표적화하는 세포 집단의 전달에 의해 치료된다. 유효량의 항원 특이적 세포 요법 (하나 이상의 항원에 대해 특이적임)을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 암의 진행을 치료하거나 지연시키는 방법이 본 출원에서 제공된다.
오법을 필요로 하는 개체가 암을 앓고 있는 경우, 암은 혈액암일 수 있거나 고형 종양을 포함할 수 있다. 본 치료 방법이 유용한 종양은 임의의 악성 세포 유형, 예를 들어, 고형 종양 또는 혈액학적 악성 종양에서 발견되는 것들을 포함한다. 예시적인 고형 종양으로는 췌장, 결장, 맹장, 위장, 뇌, 머리, 목, 난소, 신장, 후두, 육종, 폐, 방광, 흑색종, 전립선, 피부, 갑상선, 담낭, 비장, 간, 뼈, 자궁내막, 고환, 자궁 경부, 식도, 전립선 및 유방으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 장기 또는 조직의 종양이 포함될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 예시적인 혈액학적 종양으로는 골수 종양, T 또는 B 세포 악성 종양, 백혈병, 림프종, 모세포종, 골수종 등이 포함된다. 본 출원에서 제공되는 방법을 사용하여 치료될 수 있는 암의 추가의 예로는 폐암 (소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종, 폐의 편평 세포 암종 포함), 복막암, 위암 또는 위장암 (위장관암, 위장관 기질암 포함), 췌장암, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막암 또는 자궁 암종, 침샘 암종, 신장암 또는 신암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 다양한 유형의 두경부암 및 흑색종이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
상기 암은 구체적으로는 다음과 같은 조직학적 유형일 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다: 신생물, 악성; 암종; 암종, 미분화형; 거대 및 방추 세포 암종; 소세포 암종; 유두상 암종; 편평 세포 암종; 림프 상피 암종; 기저 세포 암종; 모기질 암종; 이행 세포 암종; 유두상 이행 세포 암종; 선암종; 가스트린종, 악성; 담관 암종; 간 세포 암종; 조합된 간 세포 암종 및 담관 암종; 섬유주 선암종; 선양 낭성 암종; 선종 폴립 내의 선암종; 선암종, 가족성 대장 폴립증; 고형 암종; 카르시노이드 종양, 악성; 기관세지-폐포성 선암종; 유두상 선암종; 혐색소성 암종; 호산성 암종; 호산성 선암종; 호염구 암종; 투명 세포 선암종; 과립 세포 암종; 여포성 선암종; 유두상 및 여포성 선암종; 비캡슐화 경화성 암종; 부신 피질 암종; 자궁내막 암종; 피부 부속 기관 암종; 아포크린 선암종; 피지 선암종; 귀지 선암종; 점액표피양 암종; 낭선암종; 유두상 낭선암종; 유두상 장액 낭선암종; 점액성 낭선암종; 점액성 선암종; 인환 세포 암종; 침윤성 유관 암종; 수질 암종; 소엽 암종; 염증성 암종; 파제트병, 유선; 세엽 세포 암종; 선편평 세포 암종; 선암종 w/편평 세포 화생; 흉선종, 악성; 난소 기질 종양, 악성; 난포막종, 악성; 과립막 세포 종양, 악성; 남성 모세포종, 악성; 세르톨리 세포 암종; 라이디히 세포 종양, 악성; 지질 세포 종양, 악성; 부신경절종, 악성; 유방외 부신경절종, 악성; 크롬친화세포종; 사구맥관육종; 악성 흑색종; 무색소성 흑색종; 표재 확장성 흑색종; 흑점 악성 흑색종; 말단 흑자 흑색종; 결절성 흑색종; 거대 착색 모반 내의 악성 흑색종; 상피모양 세포 흑색종; 청색 모반, 악성; 육종; 섬유육종; 섬유질 조직구종, 악성; 점액육종; 지방육종; 평활근육종; 횡문근육종; 배아 횡문근육종; 폐포성 횡문근육종; 기질 육종; 혼합 종양, 악성; 뮬레리안 혼합 종양; 신아세포종; 간모세포종; 암육종; 간엽세포종, 악성; 브레너 종양, 악성; 엽상 종양, 악성; 활막 육종; 중피종, 악성; 미분화배세포종; 배아 암종; 기형종, 악성; 난소 갑상선종, 악성; 융모막 암종; 중신종, 악성; 혈관육종; 혈관내피종, 악성; 카포시 육종; 혈관주위세포종, 악성; 림프관육종; 골육종; 피질주위 골육종; 연골육종; 연골모세포종, 악성; 간엽 연골육종; 골의 거대 세포 종양; 유잉 육종; 치원성 종양, 악성; 법랑아세포성 치아육종; 사기질모세포종, 악성; 법랑아세포성 섬유육종; 송과체종, 악성; 척색종; 신경아교종, 악성; 뇌실막세포종; 별아교세포종; 원형질 별아교세포종; 원섬유성 별아교세포종; 성상모세포종; 교모세포종; 희소돌기아교세포종; 희소돌기모세포종; 원시 신경외배엽성; 소뇌 육종; 신경절신경교세포종; 신경교세포종; 망막모세포종; 후각 신경인성 종양; 수막종, 악성; 신경섬유육종; 신경집종, 악성; 과립 세포 종양, 악성; 악성 림프종; 호지킨 질환; 호지킨; 파라육아종; 악성 림프종, 소림프구성; 악성 림프종, 대세포, 확산; 악성 림프종, 여포성; 균상식육종; 다른 특정 비-호지킨 림프종; B-세포 림프종; 저등급/여포성 비-호지킨 림프종 (non-Hodgkin's lymphoma: NHL); 소림프구 (small lymphocytic: SL) NHL; 중간 등급/여포성 NHL; 중간 등급 미만성 NHL; 고등급 면역아구성 NHL; 고등급 림프아구성 NHL; 고등급 소 비-분할 세포 NHL; 큰 부피 질병 NHL; 외투 세포 림프종; AIDS 관련 림프종; 발덴스트룀 거대글로불린혈증; 악성 조직구증; 다발성 골수종; 비만 세포 육종; 면역증식성 소장 질환; 백혈병; 림프양 백혈병; 형질 세포 백혈병; 적백혈병; 림프육종 세포 백혈병; 골수 백혈병; 호염기성 백혈병; 호산구성 백혈병; 단구성 백혈병; 비만 세포 백혈병; 거핵모구성 백혈병; 골수 육종; 모발 세포 백혈병; 만성 림프구성 백혈병 (chronic lymphocytic leukemia: CLL); 급성 림프아구성 백혈병 (acute lymphoblastic leukemia: ALL); 급성 골수성 백혈병 (acute myeloid leukemia: AML); 및 만성 골수아구성 백혈병.
특별한 실시 형태는 백혈병의 치료 방법에 관한 것이다. 백혈병은 혈액 또는 골수의 암이며, 혈액 세포, 일반적으로는 백혈구의 비정상적 증식 (증식에 의한 생성) (백혈병)을 특징으로 한다. 이것은 혈액학적 신생물로 호칭되는 질환의 광범위한 그룹의 일부이다. 백혈병은 다양한 질환을 포함하는 광범위한 용어이다. 백혈병은 임상적으로 및 병리학적으로 급성 및 만성 형태로 나누어진다
본 개시 내용의 특정 실시 형태에서, 형질 전환 CD4+ 및/또는 CD8+ 세포는 이를 필요로 하는 개체, 예를 들어, 암을 앓고 있는 개체에게 전달된다. 그 다음, 세포는 각각의 암을 공격하도록 개체의 면역계를 증진시킨다. 일부 경우에서, 상기 세포의 1개 이상의 투여량이 개체에게 제공된다. 상기 세포의 2개 이상의 투여량이 개체에게 제공되는 경우, 투여 사이의 기간은 개체에서 증식을 위한 시간을 허용하기에 충분해야 하며, 특정 실시 형태에서는 투여 사이의 기간이 l, 2, 3, 4, 5, 6, 7일 또는 그 이상이다.
특정 실시 형태에서, 세포의 성장 및 활성화를 촉진시키는 성장 인자가 대상체에게 세포에 부수적으로 또는 세포에 이어서 투여된다. 면역 세포 성장 인자는 면역 세포의 성장 및 활성화를 촉진시키는 임의의 적합한 성장 인자일 수 있다. 적합한 면역 세포 성장 인자의 예로는 인터루킨 (IL)-2, IL-7, IL-15 및 IL-12가 포함되며, 이들은 단독으로 또는 다양한 조합, 예를 들어, IL-2와 IL-7, IL-2와 IL-15, IL-7과 IL-15, IL-2, IL-7 및 IL-15, IL-12와 IL-7, IL-12와 IL-15, 또는 IL-12와 IL-2로 사용될 수 있다.
치료학적 유효량의 세포는 비경구 투여, 예를 들어, 정맥내, 복강내, 근육내, 흉골내 또는 관절내 주사 또는 주입을 비롯하여 다수의 경로에 의해 투여될 수 있다.
입양 세포 요법에 사용하기 위한 변형된 CD4+ 및/또는 CD8+ 세포의 치료학적 유효량은 치료되는 대상체에서 목적하는 효과를 달성하는 양이다. 예를 들어, 이것은 암의 진행을 억제하거나 이의 퇴행을 유발하기 위해 필요하한 면역 세포의 양일 수 있다.
면역 세포 집단은 질환에 맞는 치료 요법, 예를 들어, 질환 상태를 개선하기 위해 1일 내지 수일에 걸쳐 1회 또는 수회 용량, 또는 질환 진행을 억제하고 질환 재발을 예방하기 위해 연장된 기간에 걸쳐 주기적 용량으로 투여될 수 있다. 제형 중에 사용될 정확한 용량은 또한 투여 경로, 및 질환 또는 장애의 중증도에 의존하고 임상의의 판단 및 각각의 환자의 상황에 따라 결정되어야만 한다. 세포의 치료학적 유효량은 치료되는 대상체, 고통의 중증도 및 유형 및 투여 방식에 좌우될 것이다. 일부 실시 형태에서, 사람 대상체의 치료에 사용될 수 있는 용량은 적어도 3.8×104, 적어도 3.8×105, 적어도 3.8×106, 적어도 3.8×107, 적어도 3.8×108, 적어도 3.8×109 또는 적어도 3.8×1010개 면역 세포/m2의 범위이다. 특정 실시 형태에서, 사람 대상체의 치료에 사용되는 용량은 약 3.8×109 내지 약 3.8×1010개 면역 세포/m2의 범위이다. 추가의 실시 형태에서, 면역 세포의 치료학적 유효량은 체중 kg 당 약 5×106개 세포 내지 체중 kg 당 약 7.5×108개 세포, 예를 들어, 체중 kg 당 약 2×107개 세포 내지 약 5×108개 세포, 또는 체중 kg 당 약 5×107개 세포 내지 약 2×108개 세포로 다양할 수 있다. 면역 세포의 정확한 양은 대상체의 연령, 체중, 성별 및 생리학적 병태를 기준으로 당해 분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정된다. 유효한 용량은 시험관내 또는 동물 모델 테스트 시스템으로부터 유래된 용량-반응 곡선으로부터 외삽될 수 있다.
V. 약제학적 조성물
변형된 CD4+ 및/또는 CD8+ 세포 (예를 들어, T 세포 또는 NK 세포) 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물 및 제형도 또한 본 출원에서 제공된다.
본 출원에서 기재된 바와 같은 약제학적 조성물 및 제형은 목적하는 정도의 순도를 갖는 활성 성분 (예를 들어, 세포)을 하나 이상의 임의의 약제학적으로 허용되는 담체 (문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 22nd edition, 2012])와 혼합하여 감압 동결 건조된 제형 또는 수용액의 형태로 제조될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 일반적으로 사용되는 투약량 및 농도에서 수여자에게 비독성이며, 다음을 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다: 완충제, 예를 들어, 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 산화 방지제, 예를 들어, 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제 (예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예를 들어, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩타이드; 단백질, 예를 들어, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신; 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물, 예를 들어, 글루코오스, 만노오스 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예를 들어, EDTA; 당류, 예를 들어, 수크로오스, 만니톨, 트레할로오스 또는 소르비톨; 염 형성 반대 이온, 예를 들어, 나트륨; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 비이온성 계면 활성제, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG). 본 출원의 예시적인 약제학적으로 허용되는 담체로는 간질성 약물 분산제, 예를 들어, 가용성 중성 활성 히알루로니다아제 당단백질 (sHASEGP), 예를 들어, 사람 가용성 PH-20 히알루로니다아제 당단백질, 예를 들어, rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.)이 추가로 포함된다. rHuPH20을 비롯한 특정한 예시적인 sHASEGP 및 사용 방법은 미국 공개출원 US 2005/0260186 및 US 2006/0104968에 기재되어 있다. 하나의 양태에서, sHASEGP는 하나 이상의 추가의 글리코사미노글리카나아제, 예를 들어, 콘드로이티나아제와 조합된다.
VI. 조합 요법
특정 실시 형태에서, 본 실시 형태의 조성물 및 방법은 적어도 하나의 추가의 요법과 조합하여 변형된 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포 집단을 포함한다. 추가의 요법은 방사선 요법, 수술 (예를 들어, 종양절제술 및 유방절제술), 화학 요법, 유전자 요법, DNA 요법, 바이러스 요법, RNA 요법, 면역 요법, 골수 이식, 나노 요법, 단클론 항체 요법 또는 상기한 것들의 조합일 수 있다. 추가의 요법은 아쥬반트 (adjuvant) 또는 네오아쥬반트 (neoadjuvant) 요법의 형태일 수 있다.
일부 실시 형태에서, 추가의 요법은 소분자 효소 억제제 또는 항전이제의 투여이다. 일부 실시 형태에서, 추가의 요법은 부작용 제한제 (side-effect limiting agent) (예를 들어, 치료의 부작용의 발생 및/또는 중증도를 감소시키는 제제, 예를 들어, 항구역제 등)의 투여이다. 일부 실시 형태에서, 추가의 요법은 방사선 요법이다. 일부 실시 형태에서, 추가의 요법은 수술이다. 일부 실시 형태에서, 추가의 요법은 방사선 요법과 수술의 조합이다. 일부 실시 형태에서, 추가의 요법은 감마선 조사이다. 일부 실시 형태에서, 추가의 요법은 PBK/AKT/mTOR 경로를 표적화하는 요법, HSP90 억제제, 튜불린 억제제, 아폽토시스 억제제 및/또는 화학 예방제이다. 추가의 요법은 당해 분야에 공지된 화학 요법제 중 하나 이상일 수 있다.
세포 요법은 면역 체크포인트 요법과 같은 추가의 암 요법 전에, 중에, 후에 또는 이에 대한 다양한 조합으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 동시 내지 수분, 수일, 수주의 범위의 간격으로 이루어질 수 있다. 면역 세포 요법이 추가의 치료제와 완전히 별개로 환자에게 제공되는 실시 형태에서, 2개의 화합물이 여전히 환자에게 유리하게 조합된 효과를 발휘할 수 있도록, 상당한 기간이 각각의 전달 시간 사이에 경과하지 않았다는 것을 일반적으로 보장할 것이다. 이러한 경우에서, 환자에게 항체 요법 및 항암 요법을 서로 약 12 내지 24 또는 72 시간 이내에, 보다 구체적으로는 서로 약 6~12 시간 이내에 제공할 수 있는 것으로 고려된다. 일부 상황에서, 수일 (2, 3, 4, 5, 6 또는 7일) 내지 수주 (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8주)가 각각의 투여 사이에 경과하는 경우, 치료 기간을 유의미하게 연장하는 것이 바람직할 수 있다.
환자에 대한 본 실시 형태의 임의의 화합물 또는 요법의 투여는, 존재하는 경우, 제제의 독성을 고려하여 이러한 화합물의 투여에 대한 일반적인 프로토콜을 따를 것이다. 따라서, 일부 실시 형태에서는 조합 요법에 기인할 수 있는 독성을 모니터링하는 단계가 존재한다. 개체가 암을 갖는 실시 형태에 관한 구체적인 예가 따른다.
A. 화학 요법
매우 다양한 화학 요법제가 본 실시 형태에 따라 사용될 수 있다. "화학 요법"이라는 용어는 암을 치료하기 위한 약물의 사용을 지칭한다. "화학 요법제"는 암 치료에 투여되는 화합물 또는 조성물을 함축하기 위해 사용된다. 이러한 제제 또는 약물은 세포 내에서의 이들의 활성 방식, 예를 들어, 이들이 세포 주기에 영향을 미치는지 여부 및 단계에 의해 분류된다. 대안으로, 제제는 DNA를 직접 가교하는 능력, DNA에 삽입되는 능력, 또는 핵산 합성에 영향을 미침으로써 염색체 및 유사 분열을 유도하는 능력에 기초하여 특성화될 수 있다.
화학 요법제의 예로는 알킬화제, 예를 들어, 티오테파 및 사이클로포스파마이드; 알킬 설포네이트, 예를 들어, 부설판, 임프로설판 및 피포설판; 아지리딘, 예를 들어, 벤조도파, 카보쿠온, 메투레도파 및 우레도파; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸올멜라민을 비롯한 에틸렌이민 및 메틸아멜라민; 아세토게닌 (특히, 불라타신 및 불라타시논); 캄프토테신 (합성 유사체 토포테칸 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (이의 아도젤레신, 카르젤레신 및 바이젤레신 합성 유사체 포함); 크립토파이신 (특히, 크립토파이신 1 및 크립토파이신 8); 돌라스타틴; 듀오카르마이신 (합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘류테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰지스타틴; 질소 머스타드, 예를 들어, 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파마이드, 에스트라무스틴, 이포스파마이드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파마이드 및 우라실 머스타드; 나이트로스우레아, 예를 들어, 카무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴 및 라님무스틴; 항생제, 예를 들어, 에네다인 항생제 (예를 들어, 칼리키아마이신, 특히 칼리키아마이신 감마lI 및 칼리키아마이신 오메가I1); 다이네마이신 A를 포함하는 다이네마이신; 비스포스포네이트, 예를 들어, 클로드로네이트; 에스페라마이신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 색소단백질 에네다인 항생제 발색단, 아클라시노마이신, 악티노마이신, 오트라르니신 (authrarnycin), 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이시니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신 (모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예를 들어, 미토마이신 C, 마이코페놀산, 노갈라르니신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴 및 조루비신; 항-대사 물질, 예를 들어, 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체, 예를 들어, 데노프테린, 프테로프테린 및 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예를 들어, 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린 및 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예를 들어, 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카모푸르, 사이타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈 및 플록스우리딘; 안드로겐, 예를 들어, 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄 및 테스토락톤; 항-부신, 예를 들어, 미토탄 및 트릴로스탄; 엽산 보충물, 예를 들어, 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파마이드 글리코사이드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비스안트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 갈륨 나이트레이트; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드, 예를 들어, 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 나이트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 포도필린산; 2-에틸하이드라자이드; 프로카바진; PSK다당류 복합체; 라족산; 라이족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히, T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신; 다카바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노사이드 ("Ara-C"); 사이클로포스파마이드; 탁소이드, 예를 들어, 파클리탁셀 및 도세탁셀 겜시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 백금 배위 착물, 예를 들어, 시스플라틴, 옥살리플라틴 및 카보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포사이드 (VP-16); 이포스파마이드; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 노반트론; 테니포사이드; 데다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; 이리노테칸 (예를 들어, CPT-11); 토포아이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드, 예를 들어, 레티노산; 카페시타빈; 카보플라틴, 프로카바진, 플리코마이신, 겜시타빈, 나벨빈, 파르네실-단백질 트랜스퍼라아제 억제제, 트랜스플라티눔, 및 상기 중 임의의 것의 약제학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체가 포함된다.
B. 방사선 요법
DNA 손상을 초래하고 광범위하게 사용되는 다른 인자는 γ선, X선으로서 흔히 공지된 것 및/또는 방사선 동위 원소의 종양 세포로의 유도된 전달을 포함한다. 다른 형태의 DNA 손상 인자, 예를 들어, 마이크로파, 양성자 빔 조사 (미국 특허 US 5,760,395 및 US 4,870,287) 및 UV 조사도 또한 고려된다. 이러한 인자 모두는 DNA의 전구체, DNA의 복제 및 복구, 및 염색체의 조립 및 유지에 대한 광범위한 의미의 손상에 영향을 미칠 수 있다. X선에 대한 선량 범위는 장기간 동안 (3 내지 4주) 동안의 50 내지 200 뢴트겐의 1일 선량으로부터 2000 내지 6000 뢴트겐의 1회 선량까지의 범위이다. 방사선 동위 원소의 선량 범위는 매우 다양하며, 동위 원소의 반감기, 방출되는 방사선의 강도 및 유형, 및 신생 세포에 의한 흡수에 좌우된다.
C. 면역 요법
통상의 기술자는 추가의 면역 요법이 본 실시 형태의 방법과 조합으로 또는 함께 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 암 치료의 맥락에서, 면역 요법제는 일반적으로 암 세포를 표적화하고 파괴하기 위한 면역 이펙터 세포 및 분자의 사용에 의존한다. 리툭시맙 (리툭산®)은 이러한 예이다. 면역 이펙터는, 예를 들어, 종양 세포의 표면 상의 일부 마커에 대해 특이적인 항체이다. 상기 항체 단독은 요법의 이펙터의 역할을 할 수 있거나, 세포 사멸에 실제로 영향을 미치기 위해 다른 세포를 동원할 수 있다. 상기 항체는 또한 약물 또는 독소 (화학 요법제, 방사성 핵종, 리신 A 쇄, 콜레라 독소, 백일해 독소 등)에 컨쥬게이트될 수 있으며, 표적화제의 역할을 할 수 있다. 대안으로, 상기 이펙터는 종양 세포 표적과 직접적으로 또는 간접적으로 상호 작용하는 표면 분자를 운반하는 림프구일 수 있다. 다양한 이펙터 세포는 세포독성 T 세포 및 NK 세포를 포함한다.
항체-약물 컨쥬게이트는 암 요법의 발달에 대한 돌파구 접근법으로서 나타났다. 암은 세계에서 주요 사망 원인 중 하나이다. 항체-약물 컨쥬게이트 (antibody-drug conjugate: ADC)는 세포 사멸 약물과 공유적으로 연결되는 단클론 항체 (MAb)를 포함한다. 이러한 접근법은 항원 표적에 대한 MAb의 높은 특이성을 매우 강력한 세포독성 약물과 조합하여, 페이로드 (약물)를 농축된 수준의 항원을 갖는 종양 세포에 전달하는 "무장한 (armed)" MAb를 생성한다. 약물의 표적화된 전달은 또한 정상 조직에서의 노출을 최소화하여 독성을 감소시키고 치료 지수를 개선시킨다. 2개의 ADC 약물, 즉, 2011년의 ADCETRIS® (브렌툭시맙 베도틴) 및 2013년의 KADCYLA® (트라스투주맙 엠탄신 또는 T-DM1)의 FDA 승인은 본 접근법을 입증하였다. 현재 30개 초과의 ADC 약물 후보가 암 치료에 대한 임상 시험의 다양한 단계에 있다. 항체 조작 및 링커-페이로드 최적화가 점점 더 성숙해짐에 따라, 신규한 ADC의 발견 및 개발은 이러한 접근법 및 표적화 MAb의 생성에 적합한 신규한 표적의 확인 및 검증에 점점 더 의존한다. ADC 표적에 대한 2개의 기준은 종양 세포에서의 발현 및 강력한 내재화의 상향 조절된/높은 수준이다.
면역 요법의 하나의 양태에서, 종양 세포는 표적화를 잘 받아 들이는 일부 마커, 즉, 다른 세포의 대부분에 존재하지 않는 일부 마커를 보유해야 한다. 다수의 종양 마커가 존재하며, 이들 중 임의의 것은 본 실시 형태의 맥락에서 표적화에 적합할 수 있다. 흔한 종양 마커로는 CD20, 암배아 항원, 타이로시나아제 (p97), gp68, TAG-72, HMFG, 시알릴 루이스 항원, MucA, MucB, PLAP, 라미닌 수용체, erb B 및 p155가 포함된다. 면역 요법의 대안적인 양태는 면역 자극 효과와 항암 효과를 조합하는 것이다. 다음을 포함하는 면역 자극 분자도 또한 존재한다: 사이토카인, 예를 들어, IL-2, IL-4, IL-12, GM-CSF, 감마-IFN, 케모카인, 예를 들어, MIP-1, MCP-1, IL-8, 및 성장 인자, 예를 들어, FLT3 리간드.
조사하에 또는 사용시 현재 면역 요법의 예로는 면역 아쥬반트, 예를 들어, 마이코박테리움 보비스 (Mycobacterium bovi), 플라스모디움 팔시파룸 (Plasmodium falciparum), 디니트로클로로벤젠 및 방향족 화합물 (미국 특허 US 5,801,005 및 US 5,739,169호); 사이토카인 요법, 예를 들어, 인터페론 α, β 및 γ, IL-1, GM-CSF 및 TNF; 유전자 요법, 예를 들어, TNF, IL-1, IL-2 및 p53 (미국 특허 US 5,830,880 및 US 5,846,945); 및 단클론 항체, 예를 들어, 항-CD20, 항-강글리오사이드 GM2 및 항-p185 (미국 특허 US 5,824,311)가 있다. 1종 이상의 항암 요법이 본 출원에서 기재된 항체 요법과 함께 이용될 수 있는 것으로 고려된다.
일부 실시 형태에서, 상기 면역 요법은 면역 체크포인트 억제제이다. 면역 체크 포인트는 신호 (예를 들어, 공동 자극 분자)를 높이거나 신호를 낮춘다. 면역 체크 포인트 차단에 의해 표적화될 수 있는 억제 면역 체크 포인트로는 아데노신 A2A 수용체 (adenosine A2A receptor: A2AR), B7-H3 (CD276으로도 또한 공지됨), B 및 T 림프구 감쇠자 (B and T lymphocyte attenuator: BTLA), 세포독성 T 림프구 관련 단백질 4 (cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4: CTLA-4, CD152로도 또한 공지됨), 인돌아민 2,3-디옥시게나아제 (indoleamine 2,3-dioxygenase: IDO), 살해 세포 면역글로불린 (killer-cell immunoglobulin: KIR), 림프구 활성화 유전자-3 (lymphocyte activation gene-3: LAG3), 프로그램된 사멸 1 (programmed death 1: PD-1), T 세포 면역글로불린 도메인 및 뮤신 도메인 3 (T-cell immunoglobulin domain and mucin domain 3: TIM-3) 및 T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제 인자 (V-domain Ig suppressor of T cell activation: VISTA)가 포함된다. 특히, 면역 체크 포인트 억제제는 PD-1 축 및/또는 CTLA-4를 표적화한다.
D. 수술
암을 갖는 사람 중 대략 60%는 예방, 진단 또는 병기 결정 (staging), 근치 및 완화 수술을 비롯한 일부 유형의 수술을 받을 것이다. 근치 수술은, 모두 또는 일부의 암성 조직이 물리적으로 제거되고, 절개되고/되거나 파괴되는 절제를 포함하며, 본 발명의 실시 형태의 치료, 화학 요법, 방사선 요법, 호르몬 요법, 유전자 요법, 면역 요법 및/또는 대체 요법과 같은 다른 요법과 함께 사용될 수 있다. 종양 절제는 적어도 일부의 종양의 물리적 제거를 지칭한다. 종양 절제에 추가하여, 수술 치료로는 레이저 수술, 냉동 수술, 전기 수술 및 현미경 제어 수술 (모스 수술)이 포함된다.
일부 또는 모든 암성 세포, 조직 또는 종양의 절개시, 공동이 체내에 형성될 수 있다. 치료는 관류, 직접 주사, 또는 추가의 항암 요법에 의한 부위의 국소 적용에 의해 달성될 수 있다. 이러한 치료는, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 마다, 또는 1, 2, 3, 4 및 5주 마다, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개월 마다 반복될 수 있다. 이러한 치료는 또한 투약량을 다양하게 할 수 있다.
E. 기타 제제
기타 제제가 치료제의 치료학적 효능을 개선하기 위해 본 발명의 실시 형태의 특정 양태와 조합하여 사용될 수 있는 것으로 고려된다. 이러한 추가의 제제로는 세포 표면 수용체와 GAP 결합의 상향 조절에 영향을 미치는 제제, 세포 증식 억제 및 분화 제제, 세포 접착 억제제, 아폽토시스 유발제에 대한 과다 증식성 세포의 감수성을 증가시키는 제제, 또는 다른 생물학적 제제가 포함된다. GAP 결합 수의 증가에 의한 세포간 신호 전달의 증가는 인접하는 과다 증식성 세포 집단에 대한 항-과다 증식성 효과를 증가시킬 것이다. 다른 실시 형태에서, 세포 증식 억제 또는 분화 제제는 치료제의 항-과다 증식성 효능을 개선하기 위해 본 발명의 실시 형태의 특정 양태와 조합하여 사용될 수 있다. 세포 접착 억제제는 본 발명의 실시 형태의 효능을 개선하는 것으로 고려된다. 세포 접착 억제제의 예로는 초점 접착 키나아제 (focal adhesion kinase: FAK) 억제제 및 로바스타틴이 있다. 아폽토시스에 대한 과다 증식성 세포의 감수성을 증가시키는 기타 제제, 예를 들어, 항체 c225가 치료 효능을 개선하기 위해 본 발명의 실시 형태의 특정 양태와 조합하여 사용될 수 있는 것으로 추가로 고려된다.
VII. 제조 물품 또는 키트
CD4+ 및/또는 CD8+ 세포, 또는 당해 CD4+ 및/또는 CD8+ 세포가 생성될 수 있는 세포를 포함하는 제조 물품 또는 키트도 또한 본 출원에서 제공된다. 제조 물품 또는 키트는 개체에서 암의 진행을 치료하거나 지연시키는데 또는 암을 갖는 개체의 면역 기능을 증진시키는데 면역 세포를 사용하기 위한 설명서를 포함하는 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 본 출원에서 기재된 임의의 항원 특이적 세포가 제조 물품 또는 키트에 포함될 수 있다. 적합한 용기는, 예를 들어, 병, 바이알, 백 및 주사기를 포함한다. 용기는 다양한 재료, 예를 들어, 유리, 플라스틱 (예를 들어, 폴리비닐 클로라이드 또는 폴리올레핀) 또는 금속 합금 (예를 들어, 스테인리스 스틸 또는 하스텔로이)으로부터 형성될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 용기는 제형을 보유하고, 용기 상에 부착된 라벨 또는 용기와 관련된 라벨은 사용상의 주의 사항을 명시할 수 있다. 제조 물품 또는 키트는, 기타 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 주사기, 및 사용상 설명서를 갖는 패키지 삽입물을 비롯하여, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 기타 물질을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 제조 물품은 1종 이상의 또 다른 제제 (예를 들어, 화학 요법제 및 항신생물제)를 추가로 포함한다. 1종 이상의 제제에 적합한 용기는, 예를 들어, 병, 바이알, 백 및 주사기를 포함한다.
실시예
하기 실시예들은 본 개시 내용의 특별한 실시 형태를 입증하기 위해 포함된다. 하기 실시예들에 개시된 기술은 본 개시 내용의 방법의 실시에서 잘 기능하도록 발명자에 의해 발견된 기술을 나타내며, 따라서 이의 실시를 위해 특별한 방식을 구성하도록 고려될 수 있다는 것을 당해 분야의 통상의 기술자가 인식해야 한다. 그러나, 본 개시 내용에 비추어, 개시되는 특정 실시형태에서 다수의 변화가 이루어질 수 있으며 본 개시 내용의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 유사하거나 비슷한 결과를 여전히 얻을 수 있다는 것을 당해 분야의 통상의 기술자가 인식해야 한다.
실시예 1
낮은 결합 활성 TCR 형질 전환 T 세포에 의한 면역 요법을 위한 CD8 공동 수용체 기능의 이용
형질 도입 TCR 및 CD8αβ의 공동 형질 도입은 CD8+ 및 CD4+ T 세포 표현형을 모두 변형한다. 자가 TCR 레퍼토리로부터 단리될 때, 과발현된 종양 관련 자기 항원을 표적화하는 대부분의 TCR은 낮은 결합 활성을 특징으로 하며 CD8 공동 수용체에 의존한다2,11. TCR-펩타이드-MHC 상호 작용을 특성화하기 위해 다양한 유형의 측정을 수행할 수 있다30. 형질 전환 CD8α 및 CD8β 쇄가 종양 표적화된 TCR을 포함하는 다시스트론성 벡터로부터 효율적으로 발현될 수 있는지 여부를 테스트하기 위해서, 서바이빈 특이적 TCR (s24), CD8αβ 및 선택 마커 (ΔCD271)를 코딩하는 레트로바이러스 벡터 (T8, 도 1a) 뿐만 아니라 TCR (서바이빈 s24 및 s16, PRAME p28 및 p11) 또는 CD8αβ 단독을 인코딩하는 벡터를 작제하였다. CD4+ 및 CD8+ 선택된 T 세포를 s24-TCR 또는 s24-T8로 형질 도입하고, 형질 도입 효율에 대해 분석하였다. CD4+ 및 CD8+ 세포 모두는 동일하게 잘 형질 도입되었다 (%TCR+ CD4 대 CD8: 82±9 대 84±4, p=NS; %T8+ CD4 대 CD8: 52±10 대 45±8%, p=NS; n=6, 평균±SD, 도 1b). 그러나, 형질 도입 효율은 TCR 단독과 비교하여 다시스트론성 T8 벡터에 의해 상당히 낮았다 (CD4 TCR+ 대 T8+: p<0.001, CD8 TCR+ 대 T8+: p<0.001, n=6, 도 1b). CD8+ T 세포에서, CD8α 수준은 NT, TCR+ 및 T8+ 세포를 비교할 때 변하지 않았다 (도 1c). 흥미롭게도, CD8β 수준은 TCR+ CD8+ T 세포와 비교하여 T8+에서 유의하게 보다 높았다 (CD8β MFI: 6.3±2.7×103 대 1.9±0.6×103, n=7, 평균±SD, p=0.008, 도 1d). CD4+ T 세포에서, CD8αβ에 의한 공동 형질 도입은 하이브리드 표현형을 생성하였다. T8+ CD4+ T 세포에서의 CD8α 세포 표면 수준은 TCR+ CD8+ T 세포와 비슷하였지만 (CD8α MFI: 4.6±1.7×103 대 4.3±1.3×103, n=6, 평균±SD, p=NS) (도 1c), T8+ CD4+ T 세포에서의 CD8β 세포 표면 수준은 TCR+ CD8+ T 세포와 비교하여 유의하게 보다 낮았다 (CD8β MFI: 1.0±0.6×103 대 1.9±0.6×103, n=7, 평균±SD, p=0.002). CD4+ T 세포는 CD8αβ가 TCR과 공동 발현되었을 때 표적화된 서바이빈 에피토프만 인식하였다 (덱스트라머 MFI, CD4 TCR+ 대 T8+: 0.1±0.08×103 대 2.3±2.5×103, p=0.02; CD8 TCR+ 대 T8+: 3.4±0.6×103 대 4.2±2.6×103, p=NS; n=5, 평균±SD) (도 1e). 덱스트라머 결합은 TCR+ 및 T8+ CD8+ T 세포에서 동등하였으며, T8+ CD4+ T 세포와 TCR+ CD8+ T 세포 사이에도 비슷하였다 (덱스트라머 MFI 2.3±2.5×103 대 3.4±0.6×103, p=NS). 따라서, CD8αβ 및 클래스 I 제한된 TCR의 강제 발현은 (1) CD8β의 증가된 세포 표면 수준을 갖는 CD8+ T 세포, 및 (2) 본래의 CD8+ T 세포와 유사한, CD8αβ 쇄의 표면 발현 및 표적화된 pMHC 클래스 I 복합체를 인식하고 이에 결합하는 신규한 능력을 갖는 하이브리드 CD4+ T 세포를 생성하였다.
T8+ CD4+ T 세포는 TCR+ 또는 T8+ CD8+ T 세포와 유사한 표적화된 클래스 I 제한된 에피토프에 대한 결합 활성을 갖는다. 선택된 CD8+ 및 CD4+ T 세포에서 CD8αβ 공동 발현의 효과를 결정하기 위해서, 4개의 상이한 TCR을 사용하여 형질 전환 T 세포 결합 활성을 측정하였는데; 2개는 서바이빈 ELT/LML 에피토프를 표적화하며 (s24 및 s16), 2개는 PRAME NLT 에피토프를 표적화한다 (p28 및 p11). 모든 TCR 작제물은 마우스 불변 영역을 사용하여 내인성 TCR 쇄와의 교차 페어링을 최소화하고 (도 1a), 형질 도입 효율을 조정하였다2. T 세포를 동족 펩타이드의 연속 희석물에 노출시키고, 생성된 IFNγ ELIspot을 계수하였다. CD8αβ의 공동 형질 도입은 CD8+ T 세포 결합 활성에 영향을 미치지 않았지만, 이것은 CD4+ T 세포가 CD8+ T 세포와 유사한 결합 활성을 갖는 표적화된 클래스 I 에피토프를 인식하도록 재프로그래밍하였다 (도 2). 제한적 펩타이드 농도에서 및 테스트된 4개의 모든 TCR에 대해, IFN-γ 스폿 형성 단위 (spot forming unit: SFU)의 수는 TCR 단독으로 형질 도입된 CD8+ T 세포와 비교하여 T8로 형질 도입된 CD4+ T 세포에서 유사하였다. 따라서, CD8 공동 전달은 CD4+ T 세포를 클래스 I 제한된 에피토프로 재지시하는 일반적인 전략으로서 사용될 수 있다.
CD8αβ와 TCR의 공동 발현은 CD8+ 및 CD4+ T 세포에 순차 사멸 능력을 전달한다. T 세포를 낮은 E:T 비율 (1:5)로 서바이빈+HLA-A*02:01+ BV173 백혈병 세포와 공동 배양하고 HLA 클래스 I 제한된 표적 세포 사멸을 평가하였다. 예상되는 바와 같이, TCR+ 및 T8+ CD8+ T 세포는 이들의 표적을 용이하게 사멸시켰다. CD4+ T 세포는 T8로 형질 도입될 때만 사멸되지만 TCR 단독으로는 사멸되지 않았으며, T8+ CD4+ T 세포에 의한 사멸은 TCR+ 또는 T8+ CD8+ T 세포와 동등하였다 (CD4: T8+ 대 TCR+, p=0.0004; T8+ CD4 대 TCR+ CD8 또는 T8+ CD8, p=NS, n=7) (도 3a). TCR+ 또는 T8+ CD8+ T 세포는 표면 HLA-A*02:01 음성인 B2M-KO BV173 세포 (도 3b)가 아닌 야생형만 사멸하였기 때문에, 이러한 세포독성은 HLA 클래스 I 제한되었다. 동일한 효과가 T8+ CD4+ T 세포에서도 관찰되었다. 항종양 기능이 종양 부하가 높을 때 빠르게 고갈되는지를 평가하기 위해, 본 발명자들은 TCR, T8 또는 NT 대조군으로 형질 도입된 CD8+ 및 CD4+ T 세포를 낮은 E:T 비율의 새로운 서바이빈+HLA-A*02:01+BV173 백혈병 세포로 최대 4회까지 시험 감염시켰다 (도 3c). 아주 흥미롭게도, T8+ CD8+ T 세포에 대한 연속 종양 사멸 능력이 TCR+과 비교하여 상당히 증가하였다 (T8+ 대 TCR+ 사멸 수: 2±1.4 대 1.3±1.1, p=0.04, n=7, 도 3d, 상단 우측 패널). CD4+ T 세포는 T8로 형질 도입될 때만 사멸되지만 TCR 단독으로는 사멸되지 않았으며 (T8+ 대 TCR+ 사멸 수: 3.3±0.5 대 0±0, p<0.0001, n=7, 도 3d, 상부 좌측 패널), T8+ CD4+ T는 연속 사멸에서 T8+ CD8+ T 세포 만큼 효율적이었다 (T8+ CD4 대 CD8 사멸 수: 3.3±0.5 대 2±1.4, p=NS, n=7). 마지막으로, CD8αβ의 강제 발현은 또한 다수의 종양 시험 감염 (도 3d, 하부 패널, 점선)에 걸쳐 변형된 T 세포 확장을 초래하였다. CD8+ T 세포 확장은 CD8αβ 공동 전달 후 유의하게 변화되지 않았다 (CD8 TCR+ 대 T8+: p=NS, 로그 AUC에 대한 t 검정). 그러나, T8+ CD4+ T 세포는 TCR+ CD4+ T 세포 (p<0.0001), TCR+ CD8+ T 세포 (p<0.002) 및 T8+ CD8+ T 세포 (p<0.02) 보다 유의하게 보다 잘 확장되었다.
CD8αβ 공동 전달에 의해 생성된 세포독성 표현형을 추가로 특성화하기 위해, 초기 플레이팅 (D1) 후 및 3차 종양 시험 감염 (D10) 후 24 시간 공동 배양 상청액에서 사이토카인 생성을 조사하였다. 사이토카인 생성 프로파일은 TCR+ 대 T8+ CD8+ T 세포에서 유의하게 변경되지 않았다. 그러나, CD4+ T 세포로의 CD8αβ 공동 전달은 TH1 우세한 세포독성 사이토카인 패턴을 생성하였다. T8+ CD4+ T 세포는 TCR+ 또는 T8+ CD8+ T 세포에 필적하는 수준으로 IFNγ, TNFα, 퍼포린 또는 그랜자임 B를 포함하는 다중 세포독성 사이토카인을 분비하였다 (도 3e). 또한, T8+ CD4+ T 세포만이 IL10과 같은 일부 TH2 사이토카인을 생성하였다 (도 3e). 따라서, 세포독성 CD8+ T 세포 기능은 TCR과 CD8αβ의 공동 전달에 의해 증진되는 반면, CD8αβ의 강제 발현은 TCR+ CD4+ T 세포에 세포독성 기능을 부여하고 이의 자연적인 헬퍼 기능을 보존한다. 또한, HLA-A*02+ 및 A*02- 공여자에서의 T 세포 확장은 모든 작제물과 비슷하였는데 (도 3f), 이는 CD8 공동 전달이 낮은 수준의 내인성 서바이빈 발현에 의한 활성화된 T 세포에서 TCR 매개성 온-표적 독성 (살해라고도 또한 호칭됨)을 생성할 확률을 증가시키지 않았다는 것을 나타낸다4.
TCR-CD8αβ 발현은 단일 CD8+ T 세포의 순차 사멸 능력을 개선키고 단일 CD4+ T 세포를 세포독성 CD8+ T 세포로 전환시킨다. 단일 세포 수준에서 TCR 형질 전환 CD8+ 및 CD4+ T 세포의 사멸 동력학에 대한 형질 전환 CD8αβ 발현의 영향을 평가하기 위해, 고 처리량의 나노웰 그리드에서의 시간 경과 이미징 현미경 검사 (time-lapse imaging microscopy in nanowell grid: TIMING)를 수행하였다22. 표적과 안정한 컨쥬게이션을 확립하는데 필요한 시간 (t탐색), 컨쥬게이션의 총 지속 기간 (t접촉) 및 첫 번째 접촉과 종양 세포 아폽토시스 사이의 시간 (t사멸)을 9 시간에 걸쳐 측정하였다 (도 4a). CD8+ T 세포는 표적을 발견하고 안정한 컨쥬게이션을 확립하는데 효율적이었다. TCR+ CD8+ T 세포는 1:1의 E:T에서 표적을 발견하는데 T8+ CD8+ T 세포 보다 더 효율적이었으나 (도 4b 상단 패널, t탐색 CD8 TCR+ 대 T8+, p=0.01), 동일하게 안정한 접촉을 확립하였다 (도 4b 중간 패널, t접촉 p=NS). 이들의 사멸 능력은 1:1의 E:T에서 동등하였지만 (웰 당 단일 T 세포 및 단일 표적 세포, 도 4b 하단 좌측, p=NS), 순차 사멸 능력은 1:2의 E:T의 T8+ CD8+ T 세포에서 유의하게 증진되었다 (웰 당 단일 T 세포 및 2개의 표적 세포, 도 4b 하단 우측, p=0.0002). 예상되는 바와 같이, TCR+ CD4+ T 세포는 표적을 적극적으로 탐색하고 접촉을 발견한 사실에도 불구하고 안정한 컨쥬게이트를 형성하고 표적 세포를 사멸할 수 없었다 (도 4b, t탐색 및 t접촉, CD4: TCR+ 대 T8+; p<0.0001). 그러나, T8+ CD4+ T 세포는 이의 표적을 효율적으로 사멸시켰다. 1:1의 E:T에서, T8+ CD4+ T 세포는 TCR+ 또는 T8+ CD8+ T 세포 만큼 효율적으로 이들의 표적을 발견, 접합 및 사멸시켰다 (도 4b, p=NS). 1:2의 E:T에서, T8+ CD4+ T 세포는 T8+ CD8+ T 세포 만큼 효율적으로 사멸시키고 (도 4b, 하단 우측, p=NS), TCR+ CD8+ T 세포 보다 더 잘 사멸시켰다 (도 4b, 하단 우측, p<0.0001). 이러한 TIMING 분석 결과로부터, (1) 단일 CD8+ T 세포에서 CD8αβ 공동 전달은 연속 사멸 능력을 상당히 증진시키고 (2) T8+ CD4+ T 세포의 단일 세포 표적 탐색, 컨쥬게이션 및 사멸 동력학은 TCR+ 또는 T8+ CD8+ T 세포에 필적하는 것으로 측정된다.
형질 전환 CD8αβ는 초기 TCR 신호 전달 이벤트를 증진시킨다. 형질 전환 CD8αβ가 초기 TCR 신호 전달 이벤트를 증진시켰는지를 평가하기 위해, 본 발명자들은 BV173 백혈병 세포에 의한 T 세포의 짧은 자극 후 활성화 Y394 부위에서 Lck 인산화를 분석하였다. CD8αβ의 공동 전달은 T8+ CD8+ T 세포 뿐만 아니라 T8+ CD4+ T 세포 (도 5a 및 5b)에서 활성화 pLCK Y394 수준을 유의하게 증가시켰으며, 이는 CD8 공동 수용체의 형질 전환 발현이 TCR-pMHC 복합체에 대한 안정성을 제공 할 뿐만 아니라 CD8+ 및 CD4+ T 세포 서브 세트 모두에서 초기 TCR 신호 전달 이벤트를 증진시킨다는 것을 나타낸다.
형질 전환 CD8αβ는 TCR 형질 전환 CD8+ 및 CD4+ T 세포의 생체내 항종양 기능을 증진시킨다. 마지막으로, BV173.ffLuc 백혈병 세포가 생착된 NSG 마우스로 이전에 확립된 백혈병 이종 이식 모델에서 생체내 항종양 기능을 형질 전환 T 세포에 대해 테스트하였다2. 간단히 말하자면, 거의 치사량에 가깝게 조사된 NSG 마우스를 BV173.ffLuc 세포로, 이어서 NT, TCR 또는 T8 형질 전환 CD8+ 또는 CD4+ T 세포를 갖는 3개의 T 세포 주입물로 i.v. 주사하였다 (도 6a). 종양 성장을 생체내 BLI로 측정하였다. NT 대조군과 비교하여, TCR+ CD8+ T 세포로 처리된 마우스에서 유의 한 백혈병 대조군, 및 T8+ CD8+ T 세포로 처리된 마우스에서 추가의 증진이 있었다 (도 6b 및 6c, n=5/군, NT 대 TCR: p=0.0002, NT 대 T8: p<0.0001, TCR 대 T8: p=0.01, 0일째와 비교하여 28일째에 로그 AUC에 대한 t 검정). 예상되는 바와 같이, NT 대조군 T 세포도 TCR+ CD4+ T 세포도 백혈병 성장을 제어하지 못하였다. 대조적으로, T8+ CD4+ T 세포는 35일째까지 백혈병 진행을 유의하게 지연시켰다 (도 6d 및 6e, n=5/군, p=0.001, 0일째와 비교하여 35일째에 로그 AUC에 대한 t 검정). 따라서, 종양 표적화된 클래스 I TCR과 함께 CD8αβ의 형질 전환 발현은 CD8+ T 세포 기능을 증진시키고 CD4+ T 세포에 항종양 기능을 부여한다.
특정 실시 형태의 유의성
CD8 공동 수용체 기능을 이용하고 종양 표적화된 HLA-클래스 I 제한된 TCR로 입양 T 세포 요법을 증진시킬 목적으로, 본 발명자들은 TAA 특이적 TCR을 단독으로 또는 CD8αβ 공동 수용체와의 조합으로 발현하도록 조작되는 정제된 CD8+ 및 CD4+ T 세포 집단의 특성을 탐구하였다. 특성화된 2가지 주요 문제는 (1) TCD8+ T 세포 기능이 CR 및 CD8αβ에 의한 형질 도입시 공동 수용체 분자의 이용 가능성을 증가시킴으로써 증진될 수 있는지 여부와 (2) TCR 및 CD8αβ의 형질 전환 공동 발현이 이의 T 헬퍼 기능을 보존하면서 CD4+ T 세포를 표적화된 클래스 I 에피토프로 재지정할 수 있는지 여부이었다. CD8 공동 전달이 순차 살해 능력을 비롯하여 시험관내 및 생체내에서 CD8+ T 세포의 세포독성을 증진시킨 것으로 결정되었다. 형질 전환 CD4+ T 세포는 CD4 및 CD8의 공동 발현을 갖는 하이브리드 표현형, 본래의 CD8+ T 세포와 유사한 결합 활성을 갖는 동족 항원의 인식, 클래스 I 제한된 방식에서의 사멸된 표적을 나타냈다. 하이브리드 CD4+ T 세포는 연속 사멸 분석 및 단일 세포 수준에서 백혈병 세포를 용이하게 사멸시켰으며, TH 사이토카인 뿐만 아니라 세포 독성을 생성하였다. 하이브리드 CD4+ T 세포는 또한 마우스 이종 이식에서 백혈병 성장을 조절할 수 있었다.
클래스 I 제한된 TAA 특이적 TCR의 강제 발현 및 입양 T 세포 전달은 특정 고형 종양 및 혈액학적 악성 종양에 대한 성공적인 요법 전략이다1,24,25. 대부분의 자가 TAA 특이적 TCR은 낮은 결합 활성을 갖고 CD8 공동 수용체의 존재에 의존하는 반면, 높은 결합 활성을 갖는 희귀한 자연 발생 또는 생체외 조작된 TAA 특이적 TCR만이 CD8 독립적이다11,26,27. 따라서, 대부분의 입양 전이 프로토콜은 목적하는 생체내 항종양 기능을 생성하기 위해 CD8+ T 세포에 의존한다. 생리학적으로, 이종 이량체 형태 (αβ)의 CD8 공동 수용체는 성숙한 말초 T 세포에서 클래스 I 제한된 항원 인식 및 T 세포 활성화에 중요한 역할을 한다. 2가지 주요 기능은 면역 시냅스에서 TCR-pMHC 복합체를 안정화시키고, 지질 래프트 (lipid raft)에서 Lck Y394 인산화에 의한 초기 TCR 신호 전달 이벤트를 증진시키는 것이다28,29. 따라서, 형질 전환 TCR은 이의 기능을 위한 세포의 CD8αβ 공동 수용체 분자의 내인성 이용 가능성에 의존한다. 구체적인 실시 형태에서 CD8+ T 세포에서의 이용 가능한 CD8 분자의 수는 TCR 형질 전환 CD8+ T 세포의 면역 시냅스 형성 및 항종양 기능에 대한 제한 인자일 수 있다는 것이 본 출원에서 고려되는데, 이는 형질 전환 TCR의 카피 수가 초생리학적이기 때문이다12. 따라서, 공동 수용체 과발현의 기능적 결과는 낮은 결합 활성 TAA 특이적 TCR이 구비된 CD8+ T 세포에서 평가되었으며, TCR-CD8αβ 분자 불균형의 교정시 개선된 TCR 특이적 세포독성, 연쇄 살해 능력 및 생체내 항종양 기능이 발견되었다.
CD4+ T 세포는 감염 및 암에 대한 효율적인 면역 반응을 조정하는데 매우 다양한 기능을 발휘하며, CD8+ T 세포와 이의 상호 작용은 최근 종양 신생 항원을 표적화하는 CD4+ TH1 종양 침윤 림프구의 입양 전이에 의해 또는 정의된 비율의 CD4:CD8 T 세포를 갖는 CD19-CAR T 세포의 주입에 의해 입증된 바와 같이 매우 중요하다16,18. 따라서, CD4+ T 세포는 입양 전이 후 종양 조절 및 CD8+ T 세포 지속성에 크게 기여할 수 있기 대문에, 기능적 CD4+ T 세포를 입양 전이를 위한 TCR 형질 전환 T 세포 생성물에 혼입해야 한다. CD8 독립적 클래스 I 제한된 TCR은 세포독성 및 헬퍼 세포 기능 모두와 이종 이식 모델에서 생체내 종양 성장을 제어하는 능력을 갖는 다기능 CD4+ T 세포를 생성하는 CD4+ T 세포에서 효율적으로 과발현 될 수 있는 것으로 이전에 밝혀졌다26,27. 따라서, 본 발명자들은 형질 전환 CD8 공동 발현이 낮은 결합 활성 클래스 I 제한된 TCR을 발현하는 무반응성 CD4+ T 세포를 세포독성 및 헬퍼 기능 모두를 갖는 다기능 하이브리드 T 세포로 재프로그래밍할 수 있는지 여부를 평가하였다. 실제로, CD4+ T 세포에서의 CD8αβ 공동 발현은 단일 세포 수준에서 시험관내 연속 살해 능력 및 생체내 백혈병 조절을 비롯하여 입양 전이를 위한 증진된 특성을 갖는 다기능 하이브리드 세포독성 및 헬퍼 세포를 생성하였다.
입양 T 세포 요법을 위한 최적의 TAA 특이적 TCR의 선택은 종양 세포를 제거하기 위한 최적의 결합 활성과 오프-표적 독성을 생성할 가능성 사이에 미세한 경계가 있기 때문에 어려운 작업이다1,2,4,6-9. 종양 관련 자기 항원은 암에서 과발현되지만 특정한 정상적인 건강한 조직에서는 낮은 수준으로도 또한 존재하기 때문에, TCR 결합 활성이 너무 높고 TCR이 매우 낮은 수준의 pMHC가 세포 표면 상에 나타난다면, 온-표적 오프-종양 (on-target off-tumor) 독성이 발생할 수 있다. 그러나, CD8 공동 수용체의 공동 발현에 의해 낮은 결합 활성 TAA 특이적 TCR의 TCR-pMHC 상호 작용을 안정화시키는 본 개시 내용의 전략은, 살해에 대한 증거가 T 세포 확장 배양에서 나타나지 않았기 때문에, 전체 TCR+ T 세포와 표적 세포 상호 작용을 안전하게 증진시켰다.
전체적으로, CD8αβ 공동 수용체의 형질 전환 공동 발현은 시험관내 및 생체내 TCR 형질 전환 CD8+ 및 CD4+ T 세포의 기능에 유리한 효과를 갖는다. CD4+ T 세포는 동시 세포독성 이펙터 기능과 보존된 본래의 헬퍼 기능을 갖는 클래스 I TCR 및 CD8에 의해 다기능 하이브리드 T 세포로 재프로그래밍될 수 있다. 입양 T 세포 전달을 위한 이러한 하이브리드 세포의 사용은 CD8 및 CD4 기능 모두가 단일 세포 수준에서 용이하게 이용 가능한 신규한 전략을 나타낸다.
실시예 2
재료 및 방법의 예
세포주. BV173 세포를 German Cell Culture Collection (DSMZ)으로부터 구입하였으며, K562, CEM-T2 (TAP 수송체 결핍) 및 293T를 American Type Culture Collection (ATCC)으로부터 구입하였다. 세포를 10% 또는 20% 소 태아 혈청 (FBS, Hyclone), 1% 페니실린-스트렙토 마이신 (Gibco) 및 1% 글루타맥스 (Gibco)로 보충된 완전 RPMI 1640 또는 IMDM 배지 (Hyclone; Thermo Scientific)에서 유지하였다. 이전에 기재된 바와 같이, CRISPR/Cas9 기술을 사용하여 베타-2 마이크로글로불린 녹아웃 (B2M-KO) BV173 세포를 생성하였다1. 간단히 말하자면, B2M 단일 가이드 RNA (sgRNA, 55'-GGCCACGGAGCGAGACAUCU-3' (서열 번호 1), Synthego) 및 재조합 Cas9 단백질 (CP01, PNA Bio) 각각 1μg을 실온에서 혼합하고, 이를 사용하여 0.15×106 BV173 세포 (10 ms 동안 1600V의 3 펄스, Neon Transfection System, Invitrogen)를 전기 천공하였다. 전기 천공된 세포를 항생제 무함유 배지에서 확장하고, FACS를 HLA-A2 음성 세포에 대해 98% 이상의 순도로 분류하였다. 생체내 이종 이식 실험의 경우, 반딧불이 루시퍼라아제 (BV173.ffLuc) 세포를 발현하도록 변형된 BV173 세포를 이전에 기재된 바와 같이 사용하였다2.
건강한 공여자로부터의 혈액 샘플. 백혈구 연층을 Gulf Coast Regional Blood Center (Houston, TX, USA)의 식별 정보 제거된 건강한 사람 지원자로부터 수득하였다.
레트로바이러스 벡터 및 상청액의 생성. HLA-A*02:01 제한된 서바이빈 ELTLGEFLKL 에피토프 (서열 번호 2) (s24 또는 s16) 및 PRAME NLTHVLYPV 에피토프 (서열 번호 3) (p11 또는 p28) 특이적 TCR을 발현하는 레트로바이러스 벡터를 이전에 기재하였다2. 2A 서열로 분리된 사람 CD8α (Uniprot P01732) 및 CD8β 이소형 1 (βM1, Uniprot P10966-1) 쇄를 인코딩하는 유전자를 Geneart (Invitrogen)로 합성하였다. 이들을 SFG 레트로바이러스 벡터 백본에 그 자체로서 또는 s24 서바이빈 특이적 TCR과의 조합으로 클로닝하여 상이한 2A 서열로 분리된 4개의 유전자 모두를 발현하는 다시스트론성 벡터를 생성하였다 (In-Fusion HD Cloning Kit , Clontech) (도 1). 기재된 바와 같이 293T의 형질 감염에 의해 일시적 레트로바이러스 상청액을 제조하였다.
형질 전환 T 세포의 생성. Lymphoprep (Accurate Chemical and Scientific Corporation)에 의한 밀도 구배 원심 분리를 사용하여 말초 혈액 단핵 세포 (peripheral blood mononuclear cell: PBMC)를 백혈구 연층으로부터 분리하였다. 다클론 CD4 및 CD8 T 세포를 마이크로 비드 (Miltenyi Biotech 또는 StemCell Technologies)로 PBMC로부터 양성으로 선택하고, 3일 동안 OKT3 (하이브리도마 CRL-8001로부터 정제됨; ATCC) 및 항-CD28 항체 (BD Biosciences), 및 IL7 및 IL15 (각각 10 ng/mL, R&D Systems)로 코팅된 비조직 배양 처리된 24 웰 플레이트 (Corning)에서 활성화하고, 기재된 바와 같이 형질 도입시켰다3. 세포를 실험에 사용하기 전에 IL7 및 IL15에서 레트로바이러스 형질 도입 후 7~10일 동안 확장하였다. T 세포를 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 1% 글루타맥스로 보충된 RPMI 1640 및 Click 배지 (Hyclone)의 1:1 혼합물에서 배양하였다.
면역 표현형 형성. 세포를 CD4, CD8, CD271, CD19 (모두 BD Biosciences), FITC 또는 APC 컨쥬게이트된 쥐과 동물 TCR β 불변 영역 (ebiosciences, 클론# H57-597) 또는 PE-컨쥬게이트된 LML 서바이빈 특이적 덱스트라머 (Immudex)에 대한 FITC-, 피코에리트린 (PE-), 알로피코시아닌 (APC), V450- 또는 Krome Orange-컨쥬게이트된 항체 (Ab)로 4℃에서 30분 동안 표면 염색하였다. 7-AAD (BD Biosciences)를 사용하여 죽은 세포를 배제하였다. LCK 인산화를 평가하기 위해, T 세포를 BV173 세포 (1:1 비율) 또는 스태필로코커스 아우레우스 장독소 B (0.1 μg/ml, Millipore Sigma, 양성 대조군으로서)로 37℃에서 30분 동안 자극하였다. 제조업자의 권고 사항에 따라 항-사람 포스포-LCK (Y394) (클론 #755103) 및 항-마우스 IgG-NL557 Ab (R&D Systems)를 사용하여 간접 세포내 염색을 수행하였다. BD FACSDiva 소프트웨어에 의해 FACSCanto 상에서 샘플을 획득하고 FlowJo 소프트웨어 (Tree Star Inc.)로 분석하였다.
펩타이드 및 IFN-γ ELISpot. 서바이빈 ELTLGEFLKL ((서열 번호 2), 이의 불규칙 변화성 변이체 LMLGEFLKL (서열 번호 4) 및 PRAME NLTHVLYPV (서열 번호 5) 펩타이드를 Genemed Synthesis으로부터 수득하였다. T 세포 (105)를 삼중으로 플레이팅하고, BV173 세포 또는 배지 단독으로 동족 펩타이드 (10-4 내지 10-10 M)의 연속 희석물을 사용하여 펩타이드 펄스된 CEM-T2 세포로 1:1 자극하였다. 플레이트를 밤새 37℃/5% CO2하에 인큐베이션하고, 이전에 기재된 바와 같이 현상하였다2. 스폿 형성 단위 (SFU)를 ZellNet에 의해 계수수하였다.
순차적 공동 배양 분석. T 세포 및 BV173 세포를 외인성 사이토카인 없이 1:5의 E:T 비율로 4개의 복제 웰에서 공동 배양하였다. 공동 배양 상청액을 초기 플레이팅 24 시간 후 수확하고, 사이토카인 분석을 위해 -80℃에서 보관하였다. 공동 배양 3~4 일마다, 잔류 T 세포 및 BV173 세포를 FACS 및 CountBright Beads (Life Technologies)에 의해 계수하였다. 잔류 T 세포의 순차 사멸 능력을 평가하기 위해, 웰 당 1×105개 미만의 잔류 종양 세포가 잔류하는 경우, 새로운 BV173 세포 (1×106)를 손대지 않은 복제 웰에 다시 첨가하였다.
사이토카인 복합 분석. 공동 배양 상청액의 사이토카인 농도는 MILLIPLEX Human CD8+ T 세포 Magnetic Bead Panel (EMD Millipore)을 사용하여 중복으로 정량화하고, Luminex 200 기기 (Luminex)로 분석하였다.
나노웰 그리드에서의 시간 경과 이미징 현미경 검사 (TIMING). 나노웰 어레이의 제작 및 단일 세포 세포독성 분석을 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다5,6. 간단히 말하자면, 나노웰 어레이를 50 mm 유리 바닥 페트리 접시 (Ted Pella) 상에 고정하였다. T 세포 (이펙터) 및 BV173 세포 (표적)를 각각 PKH67 Green 및 PKH26 Red 염료 (2 μM, Sigma-Aldrich)로 라벨링하였다. 그 다음, 이펙터 및 표적을 나노웰 어레이 (106개 세포/mL) 상에 순차적으로 로딩하고, 어레이를 Annexin V-Alexa Fluor 647 (Invitrogen)을 함유하는 페놀 레드 무함유 배지에서 37℃/5% CO2하에 배양하였다. 9 시간 동안 5분 간격으로 20x 0.8 NA 대물 렌즈를 사용하는 Hamamatsu 디지털 과학 CMOS 카메라가 장착된 Axio Observer (Carl Zeiss)를 사용하여 세포를 모니터링하였다. 수동 추적과 세포 추적 및 분할을 위한 사내 알고리즘의 실시의 조합을 사용하여 이미지를 처리하였다7.
마우스 이종 이식 모델. 암컷 NOD-SCID-γc-/- (NSG) 마우스 (6~8 주령)를 Jackson Laboratory로부터 구입하여 베일러 의과 대학 동물 시설 (Baylor College of Medicine Animal Facility)에 수용하였다. 거의 치사량에 가깝게 조사된 (120 cGy) 마우스를 4~6 시간 후에 3×106개 BV173.ffluc 세포/마우스로 정맥내 (꼬리 정맥)에 주입하였다. 제노겐 생체내 이미징 시스템 (in vivo imaging system: IVIS) (Caliper Life Sciences)을 사용하여 백혈병 부담을 생체 발광 이미징 (bioluminescent imaging: BLI) (광자/초/cm2/sr)으로 모니터링하였다. 종양 주사 후 24 시간에 시작하여 3개의 T 세포 주입물 (5×106개 형질 전환 세포 또는 대조군/마우스, 2~3 일마다)을 i.v. (꼬리 정맥 또는 안와후) 투여하였다. 백혈병 성장을 BLI에 의해 매주 모니터링하였다.
통계. 기술 통계량을 사용하여 데이터를 요약하였다. 시간 경과에 따른 T 세포 빈도 및 생체 발광 강도에 대한 사다리꼴 규칙을 사용하여 곡선하 면적 (area under the curve: AUC)을 계산하였다. 윌콕슨의 순위합 검정 (Wilcoxon rank-sum test) 또는 t 검정 중 적절한 것을 사용하여 그룹간 비교를 연속 변수에 대해 수행하였다. 정규성 가정을 검사하고, 정규성을 달성하기 위해 필요한 경우에는 로그 변환을 수행하였다. 카플란-마이어 (Kaplan-Meier) 방법을 사용하여 생존 분석을 수행하였다. 윌콕슨 검정을 사용하여 마우스 그룹 간의 통계상으로 유의한 차이를 평가하였다. 로그 순위법을 사용하여 TIMING 분석 결과를 분석하였다. GraphPad Prism 5 소프트웨어 (GraphPad software, Inc., La Jolla, CA), SAS 9.4 및 R 3.3.2를 통계 분석에 사용하였다. <0.05의 P 값은 통계상으로 유의한 것으로 간주되었다.
연구 승인. 모든 동물 연구는 베일러 의과 대학의 IACUC에 의해 검토되고 승인되었다.
본 발명의 실시예를 위한 참고 문헌은 다음과 같다:
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5. Romain G, Senyukov V, Rey-Villamizar N, et al. Antibody Fc engineering improves frequency and promotes kinetic boosting of serial killing mediated by NK cells. Blood. 2014;124(22):3241-3249.
6. Liadi I, Singh H, Romain G, et al. Individual Motile CD4(+) T Cells Can Participate in Efficient Multikilling through Conjugation to Multiple Tumor Cells. Cancer Immunol Res. 2015;3(5):473-482.
7. Merouane A, Rey-Villamizar N, Lu Y, et al. Automated profiling of individual cell-cell interactions from high-throughput time-lapse imaging microscopy in nanowell grids (TIMING). Bioinformatics. 2015;31(19):3189-3197.
참고 문헌
본 출원의 모든 참고 문헌들은, 본 출원에서 기재된 내용을 보완하는 예시적인 절차 또는 기타 세부 사항을 제공하는 정도로, 본 출원에 참조로서 구체적으로 포함된다.
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본 개시 내용 및 이의 이점이 상세하게 설명되었지만, 첨부된 청구들에 의해 정의되는 바와 같은 본 설계의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 변경, 대체 및 변형이 본 명세서에서 이루어질 수 있다는 것을 이해해야 한다. 본 출원의 범위는 본 명세서에 기재되는 공정, 기계, 제조, 물질의 조성물, 수단, 방법들 및 단계들의 특정 실시 형태에 한정하려는 것은 아니다. 당해 분야의 통상의 기술자는 본 개시 내용으로부터 용이하게 인식할 것이기 때문에, 본 명세서에 기재된 상응하는 실시 형태와 동일한 결과를 실질적으로 달성하거나 동일한 기능을 실질적으로 수행하는 현재 존재하거나 나중에 개발되는 공정, 기계, 제조, 물질의 조성물, 수단, 방법들 또는 단계들이, 본 개시 내용에 따라 이용될 수 있다. 따라서, 첨부된 청구항들은 이러한 공정, 기계, 제조, 물질의 조성물, 수단, 방법들 또는 단계들을 청구 범위내에 포함시키고자 한다.
<110> BAYLOR COLLEGE OF MEDICINE <120> REPROGRAMMING CD4 T CELLS INTO CYTOTOXIC CD8 CELLS BY FORCED EXPRESSION OF CD8AB AND CLASS 1 RESTRICTED T CELL RECEPTORS <130> BAYM.P0258WO-1001068755 <140> PCT/US2019/028202 <141> 2019-04-18 <150> 62/659,971 <151> 2018-04-19 <160> 14 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1 ggccacggag cgagacaucu 20 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 2 Glu Leu Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu 1 5 10 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 3 Asn Leu Thr His Val Leu Tyr Pro Val 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 4 Leu Met Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> 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<213> Homo sapiens <400> 11 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Ser Gln Phe Arg Val Ser Pro Leu Asp Arg Thr 20 25 30 Trp Asn Leu Gly Glu Thr Val Glu Leu Lys Cys Gln Val Leu Leu Ser 35 40 45 Asn Pro Thr Ser Gly Cys Ser Trp Leu Phe Gln Pro Arg Gly Ala Ala 50 55 60 Ala Ser Pro Thr Phe Leu Leu Tyr Leu Ser Gln Asn Lys Pro Lys Ala 65 70 75 80 Ala Glu Gly Leu Asp Thr Gln Arg Phe Ser Gly Lys Arg Leu Gly Asp 85 90 95 Thr Phe Val Leu Thr Leu Ser Asp Phe Arg Arg Glu Asn Glu Gly Cys 100 105 110 Tyr Phe Cys Ser Ala Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His Phe 115 120 125 Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg 130 135 140 Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg 145 150 155 160 Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly 165 170 175 Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr 180 185 190 Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His 195 200 205 Arg Asn Arg Arg Arg Val Cys Lys Cys Pro Arg Pro Val Val Lys Ser 210 215 220 Gly Asp Lys Pro Ser Leu Ser Ala Arg Tyr Val 225 230 235 <210> 12 <211> 705 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 gcgactgtct ccgccgagcc cccggggcca ggtgtcccgg gcgcgccacg atgcggccgc 60 ggctgtggct cctcttggcc gcgcagctga cagttctcca tggcaactca gtcctccagc 120 agacccctgc atacataaag gtgcaaacca acaagatggt gatgctgtcc tgcgaggcta 180 aaatctccct cagtaacatg cgcatctact ggctgagaca gcgccaggca ccgagcagtg 240 acagtcacca cgagttcctg gccctctggg attccgcaaa agggactatc cacggtgaag 300 aggtggaaca ggagaagata gctgtgtttc gggatgcaag ccggttcatt ctcaatctca 360 caagcgtgaa gccggaagac agtggcatct acttctgcat gatcgtcggg agccccgagc 420 tgaccttcgg gaagggaact cagctgagtg tggttgattt ccttcccacc actgcccagc 480 ccaccaagaa gtccaccctc aagaagagag tgtgccggtt acccaggcca gagacccaga 540 agggcctcaa ggggaaggtg tatcaggaac ctttgtcccc caatgcctgc atggatacta 600 cagcaatact acaacctcac agaagctgct taacccatgg atcctgaaaa cataggcaag 660 aagcacaggt cctgatgagt ggatctttac tacttttacc agatt 705 <210> 13 <211> 198 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Met Arg Pro Arg Leu Trp Leu Leu Leu Ala Ala Gln Leu Thr Val Leu 1 5 10 15 His Gly Asn Ser Val Leu Gln Gln Thr Pro Ala Tyr Ile Lys Val Gln 20 25 30 Thr Asn Lys Met Val Met Leu Ser Cys Glu Ala Lys Ile Ser Leu Ser 35 40 45 Asn Met Arg Ile Tyr Trp Leu Arg Gln Arg Gln Ala Pro Ser Ser Asp 50 55 60 Ser His His Glu Phe Leu Ala Leu Trp Asp Ser Ala Lys Gly Thr Ile 65 70 75 80 His Gly Glu Glu Val Glu Gln Glu Lys Ile Ala Val Phe Arg Asp Ala 85 90 95 Ser Arg Phe Ile Leu Asn Leu Thr Ser Val Lys Pro Glu Asp Ser Gly 100 105 110 Ile Tyr Phe Cys Met Ile Val Gly Ser Pro Glu Leu Thr Phe Gly Lys 115 120 125 Gly Thr Gln Leu Ser Val Val Asp Phe Leu Pro Thr Thr Ala Gln Pro 130 135 140 Thr Lys Lys Ser Thr Leu Lys Lys Arg Val Cys Arg Leu Pro Arg Pro 145 150 155 160 Glu Thr Gln Lys Gly Leu Lys Gly Lys Val Tyr Gln Glu Pro Leu Ser 165 170 175 Pro Asn Ala Cys Met Asp Thr Thr Ala Ile Leu Gln Pro His Arg Ser 180 185 190 Cys Leu Thr His Gly Ser 195 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Any amino acid <400> 14 Gly Asp Val Glu Xaa Asn Pro Gly Pro 1 5

Claims (53)

  1. 하기 중 하나 또는 둘 다를 유효량으로 개체에게 제공하는 단계를 포함하는, 개체에 대한 면역 이펙터 세포 요법을 증진시키는 방법:
    외인성 CD8αβ 공동 수용체를 발현하고, 임의로, 하나 이상의 외인성 조작된 항원 수용체를 발현하는 CD8+ 세포; 및
    외인성 CD8αβ 공동 수용체 및 하나 이상의 외인성 조작된 항원 수용체를 발현하는 CD4+ 세포.
  2. 제1항에 있어서, 상기 조작된 항원 수용체가 T 세포 수용체 (T cell receptor: TCR), 키메라 항원 수용체 (chimeric antigen recepto: CAR) 또는 둘 다인, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 CD8+ 세포, CD4+ 세포 또는 둘 다가 개체에 대해 자가인, 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 CD8+ 세포, CD4+ 세포 또는 둘 다가 개체에 대해 동종이계인, 방법.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 외인성 조작된 항원 수용체 및 상기 외인성 CD8αβ 공동 수용체가 상기 세포에서 동일한 벡터로부터 발현되는, 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 벡터가 상기 외인성 조작된 항원 수용체 및 상기 외인성 CD8αβ 공동 수용체를 개별적으로 발현하는 하나 이상의 발현 작제물을 포함하는, 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 외인성 조작된 항원 수용체를 발현하는 발현 작제물 및 상기 외인성 CD8αβ 공동 수용체를 발현하는 발현 작제물이 2A 요소 또는 IRES 요소에 의해 분리되는, 방법.
  8. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 외인성 조작된 항원 수용체 및 상기 외인성 CD8αβ 공동 수용체가 상기 세포에서 상이한 벡터로부터 발현되는, 방법.
  9. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터가 바이러스 벡터 또는 비-바이러스 벡터인, 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터인, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원이 종양 항원인, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 종양 항원이 서바이빈, PRAME, CD19, CD20, CD22, 카파 또는 경쇄, CD30, CD33, CD123, CD38, ROR1, ErbB2, ErbB3/4, EGFR vIII, 암배아 항원, EGP2, EGP40, 메소텔린, TAG72, PSMA, NKG2D 리간드, B7-H6, IL-13 수용체 cc2, IL-11 수용체 R a, MUC1, MUC16, CA9, GD2, GD3, HMW-MAA, CD171, 루이스 Y, G250/CAIX, HLA-AI MAGE Al, HLA-A2 NY-ESO-1, PSC1, 폴레이트 수용체-a, CD44v7/8, 8H9, NCAM, VEGF 수용체, 5T4, 태아 AchR, NKG2D 리간드, HER2, BCMA, CD44v6 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 유효량의 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 또는 이들의 혼합물을 상기 개체에게 제공하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 추가의 암 요법을 상기 개체에게 제공하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  15. CD4+ T 세포를 외인성 CD8αβ 공동 수용체 및 외인성 조작된 항원 수용체로 형질 감염시키는 단계를 포함하는, 세포독성 이펙터 세포 기능 및 헬퍼 기능을 갖는 CD4+ T 세포를 생산하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 조작된 항원 수용체가 T 세포 수용체 (TCR), 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 둘 다인, 방법.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 외인성 조작된 항원 수용체 및 상기 외인성 CD8αβ 공동 수용체가 상기 세포에서 동일한 벡터로부터 발현되는, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 벡터가 상기 외인성 조작된 항원 수용체 및 상기 외인성 CD8αβ 공동 수용체를 개별적으로 발현하는 하나 이상의 발현 작제물을 포함하는, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 외인성 조작된 항원 수용체를 발현하는 발현 작제물 및 상기 외인성 CD8αβ 공동 수용체를 발현하는 발현 작제물이 2A 요소 또는 IRES 요소에 의해 분리되는, 방법.
  20. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 외인성 조작된 항원 수용체 및 상기 외인성 CD8αβ 공동 수용체가 상기 세포에서 상이한 벡터로부터 발현되는, 방법.
  21. 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터가 바이러스 벡터 또는 비-바이러스 벡터인, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터인, 방법.
  23. 제15항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원이 종양 항원인, 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 종양 항원이 서바이빈, PRAME, CD19, CD20, CD22, 카파 또는 경쇄, CD30, CD33, CD123, CD38, ROR1, ErbB2, ErbB3/4, EGFR vIII, 암배아 항원, EGP2, EGP40, 메소텔린, TAG72, PSMA, NKG2D 리간드, B7-H6, IL-13 수용체 cc2, IL-11 수용체 R a, MUC1, MUC16, CA9, GD2, GD3, HMW-MAA, CD171, 루이스 Y, G250/CAIX, HLA-AI MAGE Al, HLA-A2 NY-ESO-1, PSC1, 폴레이트 수용체-a, CD44v7/8, 8H9, NCAM, VEGF 수용체, 5T4, 태아 AchR, NKG2D 리간드, HER2, BCMA, CD44v6 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  25. 제15항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 유효량의 CD4+ T 세포를 이를 필요로 하는 개체에게 제공하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 개체가 암을 갖는, 방법.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 외인성 CD8αβ 공동 수용체, 외인성 조작된 항원 수용체 또는 둘 다를 발현하는 유효량의 CD8+ T 세포가 상기 개체에게 제공되는, 방법.
  28. 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 추가의 암 요법을 상기 개체에게 제공하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  29. CD8+ T 세포를 외인성 CD8αβ 공동 수용체로 형질 감염시키는 단계를 포함하는, CD8+ T 세포의 세포독성을 증진시키는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 CD8+ T 세포가 또한 외인성 조작된 항원 수용체를 발현하는, 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 조작된 항원 수용체가 T 세포 수용체 (TCR), 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 둘 다인, 방법.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 외인성 조작된 항원 수용체 및 상기 외인성 CD8αβ 공동 수용체가 상기 세포에서 동일한 벡터로부터 발현되는, 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 벡터가 상기 외인성 조작된 항원 수용체 및 상기 외인성 CD8αβ 공동 수용체를 개별적으로 발현하는 하나 이상의 발현 작제물을 포함하는, 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 외인성 조작된 항원 수용체를 발현하는 발현 작제물 및 상기 외인성 CD8αβ 공동 수용체를 발현하는 발현 작제물이 2A 요소 또는 IRES 요소에 의해 분리되는, 방법.
  35. 제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 외인성 조작된 항원 수용체 및 상기 외인성 CD8αβ 공동 수용체가 상기 세포에서 상이한 벡터로부터 발현되는, 방법.
  36. 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터가 바이러스 벡터 또는 비-바이러스 벡터인, 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터인, 방법.
  38. 제30항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원이 종양 항원인, 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 종양 항원이 CD19, CD20, CD22, 카파 또는 경쇄, CD30, CD33, CD123, CD38, ROR1, ErbB2, ErbB3/4, EGFR vIII, 암배아 항원, EGP2, EGP40, 메소텔린, TAG72, PSMA, NKG2D 리간드, B7-H6, IL-13 수용체 cc2, IL-11 수용체 R a, MUC1, MUC16, CA9, GD2, GD3, HMW-MAA, CD171, 루이스 Y, G250/CAIX, HLA-AI MAGE Al, HLA-A2 NY-ESO-1, PSC1, 폴레이트 수용체-a, CD44v7/8, 8H9, NCAM, VEGF 수용체, 5T4, 태아 AchR, NKG2D 리간드, HER2, BCMA, CD44v6 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  40. 제29항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 유효량의 CD8+ T 세포를 이를 필요로 하는 개체에게 제공하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  41. 제29항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 유효량의 CD4+ T 세포를 이를 필요로 하는 개체에게 제공하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  42. 제40항에 있어서, 상기 CD4+ T 세포가 외인성 CD8αβ 공동 수용체, 외인성 조작된 항원 수용체 또는 둘 다를 발현하도록 조작되는, 방법.
  43. 제40항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체가 암을 갖는, 방법.
  44. 제43항에 있어서, 추가의 암 요법을 상기 개체에게 제공하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  45. CD8αβ 공동 수용체를 형질 전환으로 발현하는 CD4+ T 세포를 포함하는 조성물.
  46. 제45항에 있어서, 상기 CD4+ T 세포가 또한 하나 이상의 외인성 조작된 항원 수용체를 형질 전환으로 발현하는, 조성물.
  47. 제46항에 있어서, 상기 조작된 항원 수용체가 TCR, CAR 또는 둘 다인, 조성물.
  48. 제45항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 CD8+ T 세포를 추가로 포함하는, 조성물.
  49. 제48항에 있어서, 상기 CD8+ T 세포가 CD8αβ 공동 수용체, 하나 이상의 외인성 조작된 항원 수용체 또는 둘 다를 형질 전환으로 발현하는, 조성물.
  50. CD8αβ 공동 수용체, 및 임의로, 하나 이상의 외인성 조작된 항원 수용체를 형질 전환으로 발현하는 CD8+ T 세포를 포함하는 조성물.
  51. 제50항에 있어서, 상기 조작된 항원 수용체가 TCR, CAR 또는 둘 다인, 조성물.
  52. 제50항 또는 제51항에 있어서, 상기 조성물이 CD4+ T 세포를 추가로 포함하는, 조성물.
  53. 제52항에 있어서, 상기 CD4+ T 세포가 CD8αβ 공동 수용체, 하나 이상의 외인성 조작된 항원 수용체 또는 둘 다를 형질 전환으로 발현하는, 조성물.
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