KR20200145777A - 핵산-펩타이드 이종 결합체 구성을 위한 핵염기 매개의 천연 화학연결법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 핵산-펩타이드 이종 결합체 구성을 위한 핵염기 매개의 천연 화학연결법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 생분자의 화학적 손상 우려가 없어서 재현성과 정밀성이 요구되는 핵산-펩타이드 기반의 생분자 복합체 제작에 널리 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 핵산-펩타이드 이종 결합체 구성을 위한 핵염기 매개의 천연 화학연결법에 관한 것으로서, 구체적으로 본 발명은 옥사닌 염기와 시스테이닐기의 특이적 반응을 확인하고 이를 이용한 핵산-펩타이드 이종 결합체 제조방법에 관한 것이다.
<위치 특이적인 핵산-펩타이드 연결기술의 필요성>
바이오 센서 및 약물 전달체 구성 시 핵산 (DNA, RNA)과 펩타이드의 이중 기능을 활용하는 사례가 늘고 있다. 예를 들어 세포 내 유전자 검출을 위해 DNA 프로브에 세포 투과용 펩타이드를 부착하거나 펩타이드 항원의 표면 배열을 위해 DNA를 사용하는 경우 등이 보고되었다. 상기와 같은 복합 물질을 이용한 시스템 구성 시, 화학적 가교 결합을 통해 핵산-펩타이드 이종 결합체 형태로 이용하는 것이 일반적이다. 시스템의 작동 재현성과 정밀성을 위해 위치 특이적이고 생분자의 화학적 손상이 없는 가교 결합기술이 요구된다.
<천연 화학연결법 (native chemical ligation; NCL)>
일반적인 천연 화학연결법은 주로 분자량이 커서 화학합성하기 어려운 거대 펩타이드를 만들 때 사용된다. 이 경우 두 펩타이드의 말단을 서로 연결하기 위해 각 펩타이드의 C말단과 N말단에 위치한 활성 이스터 (ester)와 시스테이닐기 (cysteinyl group)의 자연적인 결합반응을 이용한다. 반응 순서는 다음과 같다.
1. 높은 반응성을 가지는 시스테이닐기의 티올이 먼저 이스터와 반응하여 티오이스터 (thioester) 결합을 형성한다.
2. 시스테이닐기의 아민이 기 형성된 티오이스터를 공격하여 S-N 아실 전이 반응 (S-N acyl transfer)을 일으킨다.
3. 화합물은 아마이드 결합(amide bond)을 형성하고 안정화 된다.
천연 화학연결법은 위치 특이적인 결합이 가능하고 수율이 높아서 핵산-펩타이드 결합 방법으로 개발되었다. 원리는 마찬가지로 각 핵산과 펩타이드의 말단에 위치한 활성 이스터와 시스테이닐기의 반응을 응용하는 것이다.
그러나 현존 방법은 핵산 또는 펩타이드에 활성 이스터기를 도입하는 추가 반응이 필요하고 천연 화학연결 반응을 진행하기 전까지 활성 상태를 유지해야하는 어려움이 존재한다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 옥사닌 염기로 표지된 핵산과 N-말단에 시스테이닐기가 포함된 펩타이드를 반응시키는 단계를 포함하는 핵산-펩타이드 이종 결합체 제조방법과 상기 방법으로 제조된 핵산-펩타이드 이종 결합체를 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 상기 과제를 해결하기 위하여, 옥사닌 염기(oxanine nucleobase)로 표지된 핵산과 N-말단 시스테이닐(cysteinyl) 펩타이드을 반응시키는 단계를 포함하는, 핵산-펩타이드 이종 결합체 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 핵산은 올리고뉴클레오타이드를 구성하는 1 이상의 뉴클레오타이드일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 핵산은 RNA 또는 DNA일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 반응은 Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)의 존재하에서 수행되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 반응은 호기성 조건에서 수행되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 핵산-펩타이드 이종 결합체를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 이종 결합체는 우수한 안정성을 가져 보관과 유통이 용이할 수 있다.
본 발명의 핵산-펩타이드 이종 결합체 제조방법은 최초로 제공되는 핵염기 매개의 천연 화학연결법으로서, 본 발명에 의하면 핵산 또는 펩타이드에 활성 이스터기를 도입하는 공정이 필요하지 아니하고 옥사닌의 온도 및 pH와 같은 외부 자극에 대한 높은 안정성 특성으로 인하여 보관과 유통이 유리한 이종 결합체의 제공이 가능하다. 또한, 본 발명의 방법에 의한 핵산과 펩타이드의 결합은 위치 특이적이고 활성화 과정이 불요하여 생분자의 화학적 손상 우려가 없는바, 재현성과 정밀성이 요구되는 핵산-펩타이드 기반의 생분자 복합체 제작에 널리 활용될 것으로 기대된다.
도 1의 A)는 NbCL (nucleobase-associated native chemical ligation)이라고 불리는, Oxa-Cys 반응에서 NCL의 새로운 루트를 나타낸 것이고, B)는 새로운 올리고뉴클레오타이드-펩타이드 접합체를 나타낸다: NbCL을 통한 Oxa-함유 올리고 뉴클레오타이드와 펩타이드의 N- 말단 시스테인 사이의 N-아마이드 결합 접합을 나타낸 것이다.
도 2의 A)는 호기성 상태에서의 NbCL을 나타낸다. TCEP는 과도한 N-말단 시스테인 펩타이드와의 반응에서 티올 산화에 의한 반응 바이패스를 방지한다. 도 2의 B)는 12% denaturing PAGE (7M Urea) 결과를 나타낸다; Lane 3, 올리고 데옥시 뉴클레오티드 (ODN)를 TdT 폴리머라제를 사용하여 rOTP로 표지하였다; Lane4-5, one-to-one adduct (ODN.O-C.TAT)는 MES 완충액 (pH 6.4)에서 DNA 올리고머 (ODN.O)와 펩타이드 (C.TAT)를 혼합하고 310K에서 2시간 배양하여 얻었다. 반응액 상 TCEP의 첨가로 인해 on-to-one adduct의 수율이 증가하는 것을 알 수 있다 (Lane 3). Oxa 비함유 올리고뉴클리오티드는 펩타이드와 반응하지 않는다 (Lane 1-2).
도 3의 A)는 Oxo의 구조를 나타내고, B)는 티오에스테르(Thioester) 중간체의 구조를 나타내며, C) Oxo와 Cys의 반응에 의한 최종 아마이드 생성물의 구조를 나타낸다. D)는 310 K 및 pH 7.4에서 10 mM Cys와 10 mM Oxo의 반응에 대한 시간 경과 분석 결과를 나타낸 것이다. Oxo (○는 Cys와 반응하여 티오에스테르 결합 중간체(□와 아마이드 결합 최종 생성물(◇을 생성한다. E)는 pH 7.4, 310 K에서 2차 속도 분석(Second-order rate analysis) 플롯을 나타낸다. 각 화합물의 농도는 각각의 H1 '적분 값으로부터 계산하였다.
도 4는 dOxo 단량체와 N- 말단 Cys를 함유하는 짧은 펩타이드의 반응을 나타낸 것으로, A)는 dOxo와 CRAEYS 펩티드 간의 상호 작용의 가능한 구조를 나타내고, B)는 dOxo-CRAEYS 반응 (네가티브 모드)의 반응 생성물의 ESI-TOF MS 스펙트럼을 나타낸다.
도 5는 dOxo과 CRAEYS 결합 반응의 최종 결과물이 시스테인에 포함된 아민에 의한 결합으로 이루어짐을 보여주는 NMR 결과이다. CRAEYS 펩타이드에 위치한 시스테인 잔기 속 아민의 NH 수소이온은 S-N 아실전이 반응에 의해 아마이드 결합 (amide bond)을 이루면서 NMR 결과에 의해 검출된다 (붉은 원으로 표시).
도 2의 A)는 호기성 상태에서의 NbCL을 나타낸다. TCEP는 과도한 N-말단 시스테인 펩타이드와의 반응에서 티올 산화에 의한 반응 바이패스를 방지한다. 도 2의 B)는 12% denaturing PAGE (7M Urea) 결과를 나타낸다; Lane 3, 올리고 데옥시 뉴클레오티드 (ODN)를 TdT 폴리머라제를 사용하여 rOTP로 표지하였다; Lane4-5, one-to-one adduct (ODN.O-C.TAT)는 MES 완충액 (pH 6.4)에서 DNA 올리고머 (ODN.O)와 펩타이드 (C.TAT)를 혼합하고 310K에서 2시간 배양하여 얻었다. 반응액 상 TCEP의 첨가로 인해 on-to-one adduct의 수율이 증가하는 것을 알 수 있다 (Lane 3). Oxa 비함유 올리고뉴클리오티드는 펩타이드와 반응하지 않는다 (Lane 1-2).
도 3의 A)는 Oxo의 구조를 나타내고, B)는 티오에스테르(Thioester) 중간체의 구조를 나타내며, C) Oxo와 Cys의 반응에 의한 최종 아마이드 생성물의 구조를 나타낸다. D)는 310 K 및 pH 7.4에서 10 mM Cys와 10 mM Oxo의 반응에 대한 시간 경과 분석 결과를 나타낸 것이다. Oxo (○는 Cys와 반응하여 티오에스테르 결합 중간체(□와 아마이드 결합 최종 생성물(◇을 생성한다. E)는 pH 7.4, 310 K에서 2차 속도 분석(Second-order rate analysis) 플롯을 나타낸다. 각 화합물의 농도는 각각의 H1 '적분 값으로부터 계산하였다.
도 4는 dOxo 단량체와 N- 말단 Cys를 함유하는 짧은 펩타이드의 반응을 나타낸 것으로, A)는 dOxo와 CRAEYS 펩티드 간의 상호 작용의 가능한 구조를 나타내고, B)는 dOxo-CRAEYS 반응 (네가티브 모드)의 반응 생성물의 ESI-TOF MS 스펙트럼을 나타낸다.
도 5는 dOxo과 CRAEYS 결합 반응의 최종 결과물이 시스테인에 포함된 아민에 의한 결합으로 이루어짐을 보여주는 NMR 결과이다. CRAEYS 펩타이드에 위치한 시스테인 잔기 속 아민의 NH 수소이온은 S-N 아실전이 반응에 의해 아마이드 결합 (amide bond)을 이루면서 NMR 결과에 의해 검출된다 (붉은 원으로 표시).
핵산-펩타이드 이종 결합체 구성을 위한 현존 천연 화학연결 방법은 핵산 또는 펩타이드에 활성 이스터기를 도입하는 추가 반응이 필요하고 천연 화학연결 반응을 진행하기 전까지 활성 상태를 유지해야하는 어려움이 있다. 이에, 본 발명에서는 옥사닌과 시스테이닐기의 특이적 반응을 확인하고 이를 핵산-펩타이드 복합체 제작 방법으로 도입하여, 옥사닌 핵염기 특성인 높은 안정성과 시스테이닐기에 대한 높은 반응성을 이용하여 정밀성과 재현성이 우수한 핵산-펩타이드 연결체의 제조 방법과 이로 제조된 핵산-펩타이드 이종 결합체를 제공하고자 한다.
본 발명에서 옥사닌(Oxanine)은 활성 이스터를 내재한 고리 형태의 핵염기이다. 옥사닌의 형태는 온도, pH와 같은 외부 자극에 대해 높은 안정성을 유지하게 만든다. 한편, 옥사닌은 핵염기의 일종 이므로 효소를 이용한 핵산 내 도입이 수월하다. 상기 정보를 바탕으로 본 발명자는 옥사닌이 도입된 반응성 핵산을 제작한 바 있다. 옥사닌 도입 핵산은 안정성이 높으므로 보관, 유통이 유리하다. 본 발명은 옥사닌과 시스테이닐기의 특이적 반응을 발굴하고 이를 핵산-펩타이드 복합체 제작 방법으로 도입한 것이다. 본 반응은 위치 특이적이고 활성화 과정이 없기 때문에 생분자의 화학적 손상 우려가 없어서 재현성과 정밀성이 요구되는 핵산-펩타이드 기반의 생분자 복합체 제작에 널리 활용될 수 있을 것이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 생체 유래 고분자 접합에 널리 활용되는 천연 화학연결법 (native chemical ligation) 에 관한 것이다. 본 발명에서는 천연 화학연결법의 새로운 유형으로서 핵염기 매개의 천연 화학연결법을 정의하며 옥사닌 핵염기와 시스테이닐 그룹 (cysteinyl group) 간의 화학 반응을 기술적 특징으로 한다. DNA 올리고머 상에 도입된 옥사닌 반응성 핵염기와 펩타이드의 N 말단에 도입된 시스테인 간의 새로운 화학 반응 특성을 활용하여 기존 방법보다 적은 공정으로 DNA-펩타이드 화학적 가교 결합체를 간단하게 구성할 수 있다.
따라서, 본 발명은 옥사닌 염기와 시스테이닐 (cysteinyl) 그룹의 반응을 이용한 화학결합 방법을 제공한다.
구체적으로 본 발명은 옥사닌 염기로 표지된 핵산과 N-말단에 시스테이닐기가 포함된 펩타이드(N-말단 시스테이닐 펩타이드)를 반응시키는 단계를 포함하는, 핵산-펩타이드 이종 결합체 제조방법을 제공한다.
본 발명에서 옥사닌 염기로 표지된 핵산이란 옥사닌을 염기로 포함하는 RNA(리보핵산) 또는 DNA(디옥시리보핵산)을 의미하고, 상기 옥사닌 염기로 표지된 핵산은 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide)를 구성하는 일 뉴클레오타이드(nucleotide)로서 제공될 수 있다.
이때, 호기성 조건에서 옥사닌과 시스테이닐기의 반응을 위한 TCEP 환원제를 사용하며, 핵염기 매개의 천연 화학연결법을 위한 옥사닌이 포함된 핵산 (RNA, DNA)을 사용하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 이하 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
[실시예]
실시예 1. 서열과 펩타이드의 준비
DNA 올리고머는 상용 서비스 (Integrated DNA Technologies Co., Coralville, IA, USA)를 이용하여 다음과 같이 제작하였다: F-20dN (5′TdT는 New England BioLabs (NEB, Ipswich, MA)사의 제품을 구입하여 사용하였다. N 말단 시스테이닐 펩타이드 (C.TAT CGRKKRRQRRRPQ, PI12.30)는 펩트론 (대전, 한국)에서 주문 제작하였다.
실시예 2. 옥사닌이 포함된 서열의 제작
먼저, DNA 올리고머 (최종 4 μM), 옥사닌의 효소기질 형태인 rOTP (ribooxanosine triphosphate) (최종 120 μM), CoCl 2 [최종 0.25 mM (1×), NEB 사 제공], 10× TdT 반응 버퍼(Tris Acetate)(최종 1×, NEB 제공), TdT (10 units)의 혼합물 25 μL를 37 ℃에서 90분 동안 TdT 반응시켜, DNA 올리고머의 3' 말단에 옥사닌을 도입하였다. 반응물은 에탄올 침전법을 이용하여 정제하였다.
실시예 3. 핵염기 매개의 천연 화학연결
옥사닌 표지 DNA 올리고머 (최종 4 μM), N 말단 시스테이닐 펩타이드 (최종 200 μM), TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine) (최종 4 mM)를 50 mM MES 버퍼 (pH 6.4) 상에서 녹이고 37 ℃에서 2 시간동안 반응시켰다. 반응물은 7M Urea 포함 변성 PAGE에서 확인하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (6)
- 옥사닌 염기(oxanine nucleobase)로 표지된 핵산과 N-말단 시스테이닐(cysteinyl) 펩타이드을 반응시키는 단계를 포함하는, 핵산-펩타이드 이종 결합체 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 핵산은 올리고뉴클레오타이드에 포함된 것을 특징으로 하는, 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 핵산은 리보핵산 또는 디옥시리보핵산인 것을 특징으로 하는, 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 핵산과 펩타이드 반응은 트리스(2-클로로에틸)인산염 (Tris(2-carboxyethyl)phosphine: TCEP)이 포함된 버퍼 내에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 핵산과 펩타이드 반응은 호기성 조건에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 제조방법. - 제1항의 방법으로 제조된 핵산-펩타이드 이종 결합체.
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