KR20200144072A

KR20200144072A - 사과 산도 형질과 연관된 단일염기다형성 마커 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20200144072A
Application number: KR1020200073496A
Authority: KR
Inventors: 최철; 한아름; 김기훈; 조혜정
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2019-06-17
Filing date: 2020-06-17
Publication date: 2020-12-28
Also published as: KR20220013444A; KR102359027B1; KR102388021B1

Abstract

본 발명의 사과 산도 형질과 연관된 단일염기다형성 마커 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 사과 산도 형질과 연관된 단일염기다형성 마커는 유전적 유사도가 높아 표현형에 큰 차이를 보이지 않는 산도 형질 및 산도에 따른 품종을 정확하게 판별할 수 있다. 이는 본 발명의 마커를 이용하면, 사과의 과실 없이 유엽만으로도 사과의 산도를 판별할 수 있음을 의미하는바, 본 발명의 산도 형질과 연관된 단일염기다형성 마커는 사과 육종 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.

Description

사과 산도 형질과 연관된 단일염기다형성 마커 및 이의 용도{Single Nucleotide Polymorphism Molecular Marker Related to fruit acidity Characteristic in Apple and uses thereof}

본 발명의 사과 산도 형질과 연관된 단일염기다형성 마커 및 이의 용도에 관한 것이다.

식물 육종은 MAS(marker-assisted selection)에 의해 크게 가속화되고 있다. QTL(Pedigree-based quantitative trait loci) 맵핑 및 GWAS(genome wide association study)는 정성적 특성 및 정량적 특성을 모두 맵핑하는 강력한 도구이다. 최근, 차세대 시퀀싱(next-generation sequencing, NGS) 기반 QTL 맵핑 전략인 BSA-seq가 몇몇 곡물 및 채소에서 유전자를 신속하게 맵핑하는데 성공하였다. MapQTL과 BSA-seq를 결합하면, 오이(Cucumis sativus)에서 각각 내수성 및 조기 개화를 위한 AAA ATPase 유전자인 ARN6.1 및 Ef1.1 유전자; 및 조선상추(Lactuca sativa)의 내열성을 위한 ABA1/ZEP 유전자;를 효율적으로 식별하였다. 그럼에도, MAS는 사과(Malus domestica Borkh.)와 같은 다년생 식물의 육종 프로그램에 실제로 적용하기는 여전히 어렵다.

한편, 사과(Malus domestica Borkh.)은 전세계적으로 생산량이 많기 때문에 경제적으로 중요한 온대 작물이다. 사과는 큰 식물 크기, 자기불화합성(self-incompatibility), 높은 이형접합성(heterozygosity) 및 비교적 긴 유년기(juvenile period)를 가지고 있기 때문에, 한해살이식물(annual crop)에 비해 과일의 특성을 확인하는 것에 어려움이 있다. 또한 사과는 장미과(Rosaceae) 식물의 비교 및 기능적 유전체 연구를 위한 모델 종(model species)으로 여겨진다.

사과 육종 프로그램의 주요 목적은 과일 품질과 질병 저항성을 결합시키는 것이다. 기존 품종에 대한 연구는, 적정 산도(titratable acidity, TA), 용해성 고형분 함량(soluble solids content, SSC) 및 과일 품질의 견고성 등을 포함하는 품질 특성은 소비자의 기호도에 큰 영향을 미친다는 것을 보고하였다. 상기 품질 특성은 사과에서 소비자 중심의 식물 육종의 주요 목표이다. 사과 육종가들은 새롭고 높은 과일 품질의 사과에 대한 소비자의 요구를 충족시키기 위하여, 광범위한 유전자 및 표현형 다양성을 활용하고 있다.

이에 본 발명자들은 사과의 산도 형질을 판별하기 위한 단일염기다형성 마커를 개발하고, 이를 통해 사과의 유엽만으로 산도 형질을 판별할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은, 사과 16번 염색체(NC_024254.1)의 1332163 번째 위치; 또는 사과 16번 염색체(NC_024254.1)의 1545939 번째 위치;의 유전자 좌의 단일염기다형성 마커를 검출할 수 있는 제제를 포함하는 사과 산도 형질 판별용 조성물과, 이를 이용한 사과 산도 형질 판별키트 및 판별방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 사과 16번 염색체(NC_024254.1)의 1332163 번째 위치; 또는 사과 16번 염색체(NC_024254.1)의 1545939 번째 위치;의 유전자 좌의 단일염기다형성 마커를 검출할 수 있는 제제를 포함하는 사과 산도 형질 판별용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 사과 산도 형질 판별용 조성물을 포함하는 사과 산도 형질 판별키트를 제공한다.

또한 본 발명은 (a) 사과의 DNA를 추출하는 단계; (b) 상기 단계 (a)의 DNA를 주형으로 하고, 상기 사과 산도 형질 판별용 조성물을 이용하여 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계; 및 (c) 중합효소연쇄반응 산물을 분석하여 사과의 산도 형질을 판별하는 단계;를 포함하는 사과 산도 형질 판별방법을 제공한다.

본 발명에 따른 사과 산도 형질과 연관된 단일염기다형성 마커는 유전적 유사도가 높아 표현형에 큰 차이를 보이지 않는 산도 형질 및 산도에 따른 품종을 정확하게 판별할 수 있다. 이는 본 발명의 마커를 이용하면, 사과의 과실 없이 유엽만으로도 사과의 산도를 판별할 수 있음을 의미하는바, 본 발명의 산도 형질과 연관된 단일염기다형성 마커는 사과 육종 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.

도 1은 GBS(genotyping by sequencing) 분석을 통해 유의한 SNP를 선별한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 사과 유전자원의 집단 구조 분석 결과(a, b), 주성분 분석(principal component analysis, PCA) 결과(c) 및 계통수(d)를 나타낸 도이다.
도 3은 사과 유전자원의 산도 형질에 따른 GWAS 결과를 토대로 작성한 QQ-plot을 나타낸 도이다.
도 4는 사과 유전자원의 산도 형질에 따른 GWAS 결과를 토대로 작성한 manhattan plot을 나타낸 도이다.
도 5는 HRM(High Resolution Melting) 분석을 통해 본 발명에 따른 프라이머 세트 C16S63를 이용하여 사과의 산도를 판별한 결과를 나타낸 도이다(A : melting curve, B : difference graph).
도 6은 HRM 분석을 통해 본 발명에 따른 프라이머 세트 C16S39B를 이용하여 사과의 산도를 판별한 결과를 나타낸 도이다(A : melting curve, B : difference graph).

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 양태에 따르면, 본 발명은 사과 16번 염색체(NC_024254.1)의 1332163 번째 위치; 또는 사과 16번 염색체(NC_024254.1)의 1545939 번째 위치;의 유전자 좌의 단일염기다형성 마커를 검출할 수 있는 제제를 포함하는 사과 산도 형질 판별용 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)은 DNA 염기서열에서 하나의 염기서열(A, T, G, C)의 차이를 보이는 유전적 변화 또는 변이를 의미하며, DNA 서열 다형성(polymorphism) 중에서 가장 많이 존재하는 형태이다.

본 발명에 있어서, 다형성(polymorphism)은 하나의 유전자 좌위(locus)에 두 가지 이상의 대립유전자(allele)가 존재하는 경우를 말하며 다형성 부위 중에서, 사람에 따라 단일 염기만이 다른 것을 단일염기다형성이라 한다. 바람직한 다형성 마커는 선택된 집단에서 1% 이상, 더욱 바람직하게는 10% 또는 20% 이상의 발생빈도를 나타내는 두 가지 이상의 대립유전자를 가진다.

본 발명에 있어서, 대립유전자(allele)는 상동염색체의 동일한 유전자 좌 위에 존재하는 한 유전자의 여러 타입을 말한다. 대립유전자는 다형성을 나타내는데 사용되기도 하며, 예컨대, SNP는 두 종류의 대립인자(biallele)를 갖는다.

본 발명에 있어서, 마커(marker)는 유전적으로 불특정 연관된 유전자 좌(genetic locus)를 동정할 때 참고 점으로 사용되는 염기서열을 의미하며, 상기 마커의 유전자 지도 상의 위치는 유전자 좌로 표시할 수 있다.

본 발명의 구체예에서, 상기 단일염기다형성 마커는 사과 16번 염색체(NC_024254.1)의 1332163 번째 위치의 염기가 AA, AG 또는 GG인 단일염기다형성 마커; 또는 사과 16번 염색체(NC_024254.1)의 1545939 번째 위치의 염기가 AA, AG 또는 GG인 단일염기다형성 마커;인 것이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 사과 16번 염색체의 1332163 번째 위치의 염기가 AA 또는 AG인 경우 산도 1.0% 이상으로 판별할 수 있으며, GG인 경우 산도 1.0% 미만으로 판별할 수 있다. 또한 상기 사과 16번 염색체의 1545939 번째 위치의 염기가 GG인 경우 산도 1.3% 이상으로 판별할 수 있고, AA 또는 AG인 경우 산도 1.3% 미만으로 판별할 수 있다.

나아가, 상기 산도 형질 판별 결과를 토대로, 사과의 품종을 판별할 수도 있다. 예를 들어, 사과 16번 염색체의 1332163 번째 위치의 염기가 AA 또는 AG인 경우 사과의 품종을 산도 1.0% 이상인 품종, 즉 Asiro8, Akita Tare, Roberts Crab, Asiro3, Dolgo, Spy, Lodi, Jonathan, Noya, Humboldt, Parkland 및 M7로 이루어진 군에서 선택된 1 이상으로 판별할 수 있으며, GG인 경우 산도 1.0% 미만인 품종, 즉 Jonared, Jiguan, Red well, Crimson King, Virginia Gold, Sansa, Hongro, Granny Smith, Fuji, Tsugaru, Picnic 및 Yoko으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상으로 판별할 수 있다. 또한 상기 사과 16번 염색체의 1545939 번째 위치의 염기가 GG인 경우 산도 1.3% 이상인 품종, 즉 Asiro8, Asiro3, Akita Tare, Ottawa8, Maypole 및 Purple wave으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상으로 판별할 수 있고, 판별할 수 있고, AA 또는 AG인 경우 산도 1.3% 미만인 품종, 즉 Ginger gold, Crimson king, Mayqueen, Alps Otome, Hongro, Gamhong, Tallmans sweet 및 Britegold으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상으로 판별할 수 있다.

본 발명의 구체예에서, 상기 단일염기다형성 마커를 검출할 수 있는 제제는 단일염기다형성 마커 부위를 포함하는, 10 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;와 특이적으로 혼성화(hybridization)하는 폴리뉴클레오티드인 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 단일염기다형성 마커를 검출할 수 있는 제제는 폴리뉴클레오티드일 수 있으며, 이는 단일염기다형성 마커를 검출할 수 있는 프라이머, 프로브 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 1 종 이상일 수 있다.

본 발명의 보다 바람직한 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 프라이머일 수 있고, 이는 3‘ 마지막 염기가 단일염기다형성 부위에 상보적으로 결합하는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 프라이머는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 핵산의 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 핵산 주형의 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.

상기 프라이머 설계 시, 프라이머의 A, G, C, T 함량비, 프라이머 결합체(dimer) 형성 방지, 같은 염기서열의 3회 이상 반복금지 등 여러 가지 제약이 따르며, 그 외에 단독 PCR 반응조건에 있어서 주형(template) DNA의 양, 프라이머의 농도, dNTP의 농도, Mg²⁺의 농도, 반응온도, 반응시간 등의 조건이 적정해야 한다.

상기의 프라이머는 기본 성질을 변화시키지 않은 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 즉 핵산 서열이 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형될 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 뉴클레오타이드의 하나 이상의 동족체로의 치환 및 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트 또는 카바메이트 등의 하전되지 않은 연결체나 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 등의 하전된 연결체로의 뉴클레오타이드의 변형이 가능하다. 또한 핵산은 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리 L 리신 등의 단백질, 아크리딘 또는 프소랄렌 등의 삽입제, 금속, 방사성 금속, 철 산화성 금속 등의 킬레이트화제 및 알킬화제 등의 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기를 가질 수 있다.

또한 본 발명의 프라이머 서열은 검출 가능한 시그날을 직접적 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 프라이머는 분광학, 광화학, 생화학, 면역화학 또는 화학적 수단을 이용하여 검출될 수 있는 표지를 포함할 수 있다. 유용한 표지는 ³²P, 형광 염료, 전자 밀집 시약, 효소(일반적으로 ELISA 에 이용되는 것), 바이오틴 또는 합텐 및 항혈청 또는 단일클론성 항체가 이용가능한 단백질을 포함한다.

본 발명의 프라이머들은 적절한 서열의 클로닝 및 제한효소 분해 및 나랭(Narang) 등의 포스포트리에스테르 방법(1979, Meth, Enzymol. 68:90-99), 보카지(Beaucage) 등의 디에틸포스포라미다이트 방법(1981, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862), 및 미국 특허 제4458066호의 고형물 지지 방법과 같은 직접적인 화학적 합성법을 포함하는 임의의 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다.

본 발명의 구체예에서, 상기 사과 산도 형질 판별용 조성물은 과실, 잎, 줄기, 뿌리 또는 종자 시료에서 사과의 산도형질을 판별할 수 있으며, 유엽(young leaves) 시료에서 사과 산도 형질을 판별하는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 사과 산도 형질 판별용 조성물을 포함하는 사과 산도 형질 판별키트를 제공한다.

본 발명에 있어서 판별키트는 단일염기다형성 마커를 검출하여 사과의 산도 형질을 판별할 수 있다. 사과 산도 형질 판별키트는 단일염기다형성 마커를 검출하기 위한 폴리뉴클레오티드, 프라이머 및 프로브 등을 포함할 수 있으며, 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 사과 산도 형질 판별키트는 대립유전자 특이 중합효소연쇄반응을 수행하기 위한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. 대립유전자 특이 중합효소연쇄반응 키트는, 본 발명의 단일염기다형성 마커에 대한 특이적인 폴리뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양함), dNTP(DeoxyriboNucleotide TriPhosphate), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수 및 멸균수 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 사과 산도 형질 판별방법을 제공한다.

상기 사과 산도 형질 판별방법은 (a) 사과의 DNA를 추출하는 단계; (b) 상기 단계 (a)의 DNA를 주형으로 하고, 상기 사과 산도 형질 판별용 조성물을 이용하여 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계; 및 (c) 중합효소연쇄반응 산물을 분석하여 사과의 산도 형질을 판별하는 단계;를 포함한다.

본 발명의 구체예에서, 상기 단계 (a)는 과실, 잎, 줄기, 뿌리 또는 종자 시료에서 사과의 산도형질을 판별할 수 있으며, 유엽 시료에서 사과의 DNA를 추출하는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)은 DNA 사슬 중에서 목적하는 일부분만을 대량으로 증폭시키는 실험법을 의미하며, 그 예로는 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction), 대립유전자 특이 중합효소연쇄반응(Allele Specific Polymerase Chain Reaction), Nested-중합효소연쇄반응(Nested-Polymerase Chain Reaction), 다중 중합효소연쇄반응(multiplex Polymerase Chain Reaction, multiplex PCR), 경쟁적 중합효소연쇄반응(competitive Polymerase Chain Reaction), 실시간 중합효소연쇄반응(real-time Polymerase Chain Reaction), 정량적 중합효소연쇄반응(Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction), DNA 칩(DNA chip) 및 등온증폭법(Loop-mediated isothermal amplification)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 방법일 수 있으며, 바람직하게는 대립유전자 특이 중합효소연쇄반응이나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 구체예에서, 상기 단계 (c)의 사과 산도 형질 판별은 사과 16번 염색체의 1332163 번째 위치의 염기가 AA 또는 AG인 경우 산도 1.0% 이상으로 판별할 수 있으며, GG인 경우 산도 1.0% 미만으로 판별할 수 있다. 또한 상기 사과 16번 염색체의 1545939 번째 위치의 염기가 GG인 경우 산도 1.3% 이상으로 판별할 수 있고, AA 또는 AG인 경우 산도 1.3% 미만으로 판별할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. GWAS(genome-wide association study) 분석용 사과 유전자원 확정

reference set; 차세대바이오그린21 사업 1단계에서 선정한 core collection의 일부; 및 국내 사과 유전자원의 일부;를 포함하는 GWAS 분석을 위한 샘플을 선정하였다. 선정된 사과 유전자원은 308개이며, 표 1에 나타내었다.

No.	Sample	No.	Sample	No.	Sample	No.	Sample
1	Adam's Crab	78	Kile	155	Red well	232	Sinano-red
2	Akane	79	Kingstone Black	156	Reinette du Canada	233	Sinano-gold
3	Akita	80	Kinrei	157	Reinette Grise	234	Tsugaru
4	Akita Tare	81	Lady williams	158	Rescue	235	Arisoo
5	Alome Mills	82	Landsberger Reinette	159	Rev.w Wilks	236	Aikahyang
6	Alps Otome	83	Law Red Delicious	160	Ribston	237	Anhaeng Tare
7	Amere	84	Laxton's Superb	161	Rome beauty	238	Yeohong
8	Amur Naliv	85	Local 10(907583)	162	Rossoshanskoje Polosatoje	239	Yongdonghaedang
9	Anna	86	Local 11(907584)	163	Roter Boskoop	240	Chicheng
10	Antonovka	87	Lura Red	164	Royal jonathan	241	Zaohuang
11	Antonovka karmen	88	M.Darth Manta	165	Royale d'Angleterre	242	Zhongqiu
12	Antonovka Shafran	89	M.prunifolia Sikora	166	Russian	243	Ginger-gold
13	Aori No.13	90	M.transitoria	167	Sakada Tsugaru	244	champion fuji
14	Arlet	91	M.Brevipes SI-22-40	168	Samar Candskoe rannee	245	Chukwang
15	Arthur Turner	92	M.floribunda Sieb	169	Scarlet Sentinel M.11 apple	246	Shuka Tsugaru
16	Asiro3	93	M.John Downie	170	Sekaiichi	247	Cameo
17	Beautiful Arcade	94	M.mandshurica	171	Sensacion	248	Pink Lady
18	Belle De Boskoop	95	M.robusta var electa 88075	172	Senshu	249	Honggeum
19	Beninomai	96	M.sikkimensis	173	SH-6	250	Hongso
20	Bhrens	97	M.Taurensii	174	Shaphran Letnij	251	Hwangtaepyeong
21	Blairmont	98	M3	175	Shengli	252	Fukutami
22	Brettacher	99	M7	176	Smokehouse	253	Himekami
23	Britegold	100	Macfree	177	Smootee golden	254	Asiro8
24	Calvoic Sansover	101	Magnolia Gold	178	Somerset Red Streak	255	Ben Davis
25	Carroll	102	Manshu	179	Spartan	256	Chouyou
26	Champion	103	Marin Onfroy	180	Spigold	257	Cox's orange pippin
27	Chiver's Delight	104	Marshall McIntosh	181	Spur Earliblaze	258	Geneva Black
28	Columbia	105	Maypole	182	Spur Golden Delicious	259	Geneva Early
29	Crimson King	106	Mayqueen	183	Spur Starking	260	Harcourt
30	Dab 325	107	McIntosh	184	Spy	261	Hibernal
31	Dayton	108	McIntosh spur	185	Stafford	262	Humboldt
32	Demir	109	Melrose	186	Succary	263	Idajon
33	Diana	110	Merton Pearmain	187	Summer Rambo	264	Jon Grimes
34	DIR 68T 492	111	Mislimka	188	Sun Gold	265	Jonagold Daliguy
35	Dolgo	112	Misuzu Tsugaru	189	Sun rise	266	King Cole
36	Dorothea	113	Mobb's royal	190	Sundale Sturdee Spur	267	Lodi
37	Dorsett Golden	114	Namangan Skoe Krasnoe	191	Sunlight	268	M.arnoldiana Sarg
38	Double Red Delicious	115	Nico	192	Suntan	269	Merton Ace
39	Dunkerton late	116	Nishtani Jonathan	193	Surpasse Frequin	270	Michelin
40	E559-13	117	Noiphing	194	Sweet Coppin	271	Mollie's Delicious
41	Eikou	118	Norda	195	Sweet Delicious	272	Newtwon pippin
42	Eley purple crab	119	Norfolk Royal	196	Sweet Jonathan	273	Odin
43	Empire	120	Novosibirsk sweet	197	Tale Sweet	274	Parkland
44	Empress spur G.D	121	Nugget	198	Tallmans Sweet	275	Pilot
45	Falla Water	122	Obilnoye	199	Telamon	276	Roberts Crab
46	Fireside	123	Oswego	200	Totem	277	Rome
47	Frequin	124	Ottawa	201	Transcendent	278	Webster
48	Friandise	125	Ottawa 8	202	Treco Red Gala	279	Winter Banana
49	Frostproof	126	Ottawa546	203	Trent	280	Xingiangtianguo
50	Galaxy Gala	127	Parkian Crab 81090HT	204	Virginia Crab K-6	281	Kwansang1
51	George Cave	128	Pearmain de clark	205	Virginia Gold	282	Noya
52	Golden Delicious	129	Pederstrup	206	Wakapingguo	283	Summer Dream
53	Golden Delicious Klon.Bis	130	Pethyre	207	White winter pearmain	284	Suhongsaekbingwa
54	Gravenstein	131	Peypring Cerueuko	208	Wickson	285	Shinano Sweet
55	Hanyae Hanakaidou	132	Piervomaiskoie	209	Wiliams Favourite	286	Picnic
56	Heyer #12	133	Pink pearl	210	Winesap	287	Green Boll
57	Hillwell Red Braeburn	134	Pink Wood	211	Xanthocarpa	288	Jonathan
58	Hokuto	135	Pixie	212	Yantaishaguo	289	Granny Smith
59	Holstein	136	Pomme Cloche	213	Yellow Bell flower	290	Fuji
60	Hordapfel	137	Pomme Royale	214	Yellow Delicious	291	Gamhong
61	Huidobro	138	Prairie Spy	215	Yellow spur golden delicious	292	Ralls Janet
62	Hunter Melba (4*)	139	PRI 17-1	216	Yellow Transparent	293	Sansa
63	Hunter Spartan (4*)	140	67PRI 1279-9(27-55)	217	Yoko	294	Hwahong
64	Idared I	141	Priscilla	218	Young America	295	Gala
65	Ikorocavka Alaja	142	Prof.Grebnicka Renete (Berzi)	219	Zuboff	296	Hongan
66	Indian Magic Crab	143	Pumpkin Sweet	220	Kunmamyeongwol	297	Hongro
67	Indian Summer Crab	144	Puritan	221	Kumhong	298	Indo
68	Ingrid Marie	145	Purple wave	222	Kiou	299	Hwangok
69	Iwakami	146	Quinte	223	Ryoka	300	Summer King
70	Jacquin	147	Radiant	224	Manbok	301	Delicious
71	Jadernicka	148	Radoux	225	Biko Tugaru	302	Vance Delicious
72	James Grieve-2	149	Red Apple	226	Bingwa	303	Orin
73	Jiguan	150	Red Bow	227	Sandongbingwa	304	Red gold
74	Jonafree	151	Red cox's poruona	228	Seokwang	305	Toki
75	Jonared	152	Red Delicious	229	Seohong	306	Nero Rome
76	Jumbo	153	Red Dougherty	230	Sunhong	307	Starking
77	Kamsolmolez	154	Red King	231	SeopsaTsugaru	308	Beverly Hills

후술되는 실시예에서는, 상기 선정된 사과 유전자원 308개의 유엽으로부터 추출된 DNA를 시료로 사용하였다.

실시예 2. GBS(genotyping by sequencing)을 이용한 SNP(single nucleotide polymorphism) 선별

상기 실시예 1의 사과 유전자원 308개의 GBS 분석을 실시하였다. 구체적으로, DNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN, Germany)으로 사과 유엽의 genomic DNA를 추출하였다. 추출된 genomic DNA의 GBS를 실시하였다. 상기 GBS는 Illumina Hiseq 2000 system을 사용하였고, paired-end로 분석하였다. GBS 분석 결과는 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, Raw reads는 최소 88,768부터 최대 20,569,116까지 평균 3,863,262,097 reads가 시퀀싱되었다. 평균 92.8%의 트리밍(trimming) 과정을 거쳐 reference genome으로 사용된 ‘Golden Delicious’ genome(Velasco et al., 2010)에 평균 66%의 reads가 매핑(mapping)되었다. 최종적으로 평균 15.64 depth, 63,380 genome region에 reads가 분포하며 reference genome의 약 2%의 coverage를 가진다. 이를 바탕으로 reference gnome 대비 품종별로 SNP을 선별한 결과, 전체 SNP와 heterozygous SNP은 ‘Roberts Crab’이 143,966개, 29,270개로 가장 많았고 homozygous SNP 및 기타 SNP은 ‘Asiro8’이 각각 94,379개 및 28,606개로 가장 많았다. 평균적으로 43,721개 SNP이 선별되었고 homozygous SNP는 27,481개, heterozygous SNP는 7,929개 및 기타 SNP는 8,312개 확인되었다. 여기서 homozygous SNP은 read들의 90% 이상이 SNP로 확인된 것이고, heterozygous SNP은 40 내지 60%, 기타 SNP는 그 외의 확인하기 애매한 것으로 분류한 것이다. 이를 다음의 조건에서 필터링을 수행하였다.

[조건 A]

- SNP loci of biallelic, missing rate ＜ 10%

- minor allele frequency ＞ 5%

[조건 B]

- SNP loci of biallelic, missing rate ＜ 20%

- minor allele frequency ＞ 5%

필터링을 통해 선별된 SNP는 각각 12,608개(조건 A) 및 51,434개(조건 B)이다.

실시예 3. 사과 유전자원의 Genetic diversity, PCA 및 Population structure 분석

3-1. Population structure 분석

상기 실시예 2에서 조건 A로 선별된 SNP(12,608개)를 이용하여 사과 유전자원 308개의 집단 구조를 분석하였다. 상기 집단 구조 분석은 STRUCTURE v.2.3.4. 프로그램을 이용하였으며, 분석 조건은 다음(Pritchard et al., 2000)과 같다.

- Bayesian model-based approach (MCMC : markov chain monte cario)

- Burn-in period : 10,000

- Number of MCMC Reps : 10,000

- Ancestry Model : Admixture model

- Allele frequency model : correlated allele frequency

- Number of populations (K) : 1 내지 10

- Number of iterations : 2

structure harvester 웹사이트에서 분석 결과를 이용하여 적정 집단 K를 계산하였다(Evanno et al., 2005). 집단 구조 분석 결과는 도 2a 및 2b에 나타내었다.

도 2a 및 2b에 나타낸 바와 같이, 적정 집단 K는 4인 것을 확인하였다.

3-2. PCA

상기 실시예 3-1에서 확인한 적정 집단 K의 값을 토대로, PCA 분석을 실시하였다. 사과 유전자원 308개 샘플의 서열 정보(12,608 SNPs) 및 TASSEL ver.5.2.60 소프트웨어를 이용하여 주성분 분석을 수행하였다(Bradbury et al., 2007). PCA 분석 결과는 도 2c에 나타내었다.

도 2c에 나타낸 바와 같이, 사과 유전자원 308개는 PC1 축에 의해 4개의 그룹 또는 PC1 및 PC2의 2개 축에 의해 최대 6개의 그룹으로 분리되었다. PC1은 Malus domestica와 Malus sp., Malus hybrid 및 crabapples의 분류 기준이 되었다(PCA-Ⅰ, crabapples such as Malus floribunda, Malus sikkimensis, and Malus arnoldiana; PCA-Ⅱ, crabapple, Malus hybrid and Malus sp.; PCA-Ⅲ, PCA-Ⅳ, Malus domestica).

3-3. Genetic diversity 분석

사과 유전자원 308개 샘플의 서열 정보 및 MEGA ver.6.0 프로그램을 이용하여, 계통수(phylogenetic tree)를 작성하였다. 계통수 작성 조건은 다음과 같다(Tamura et al., 2013).

- Statistical method : Neighbor-joining

- Substitution model/method : Maximum composite likelihood

- Gaps/Missing data treatment : Pairwise deletion

작성된 계통수는 도 2d에 나타내었다.

도 2d에 나타낸 바와 같이, 사과 유전자원 308개 샘플은 서로 연관성이 많지 않은 다양한 개체임을 확인하였다. 또한 상기 사과 유전자원 308개는 쓰가루, Golden Delicious, 갈라, 후지, Jonathan, Delicious, McIntosh, 대목 등으로 그룹을 이루는 것을 확인하였으며, 각 그룹에 포함된 품종은 다음과 같다.

- 쓰가루 그룹 : Beninomai, Migwang Tsugaru, Sakada Tsugaru 및 Miszu Tsugaru 등

- Golden Delicious 그룹 : Golden Delicous, Spur Golden Delicious, Empress Spur Golden Delicious 등

- 갈라 그룹 : Galaxy Gala, Treco Red Gala, Sansa 등

- 후지 그룹 : Champion Fuji, Nugget, Iwakami 등

- Jonathan 그룹 : Rome beauty, Rome, Alps Otome, Jonared 등

- Delicious 그룹 : Vance Delicious, Red King, Red Delicious, Double Red Delicious 등

- McIntosh 그룹 : Totem, Macfree, Maypole, Marshall McIntosh 등

- 대목 그룹 : M3, M.Taurensii, M.Pruifolia Sikora, M.John Downie 등

실시예 4. 사과 유전자원을 대상으로 과실 유용 형질에 대한 GWAS 분석

본 실시예에서는, 사과 유전자원 308점 중 표현형 데이터가 있는 301점을 대상으로 실험을 진행하였다.

4-1. 사과 유전자원 301점의 산도 형질에 따른 GWAS 분석_QQ plot

상기 실시예 2에서 조건 B로 선별된 SNP(51,434개)를 이용하여, 사과 유전자원 301점의 (i) 산도 형질 표현형 및 유전자형 분포 비교; 및 (ii) GWAS 분석;을 수행하였다.

(i) 산도 형질 표현형 및 유전자형 분포 비교

GWAS 분석에 앞서, 사과 유전자원에서 산도 형질에 대한 표현형 및 유전자형의 분포를 비교하였다. 상기 비교를 위한 샘플은 1년 마다 채취하였고, 4년 동안 관찰하였다.

그 결과, 1년차에는 산도가 0.0 내지 0.9%인 과실이 70.9%로 가장 많이 차지하였고, 2년차에는 산도가 0.3 내지 1.3%인 과실이 66.6%로 가장 많이 차지하는 것을 확인하였다. 3년차에는 사과 과실의 산도가 0.3 내지 1.0%인 과실이 65.4%, 4년차에는 산도가 0.3 내지 1.1%인 과실이 73.7%를 차지하였다.

(ii) GWAS 분석

표현형 데이터가 있는 사과 유전자원 301점에 대해서 GWAS를 수행하였다. 분석 방법은 산도 형질에 대해 R을 기반으로 한 GAPIT(Genomic Association and Prediction Integrated Tool) 및 PLINK 프로그램을 이용하였다(Lipka et al. 2012, Purcell et al. 2007). GWAS 결과는 QQ-plot으로 시각화하였다. QQ-plot에서 SNP 및 산도 형질 사이에 연관성이 없다는 귀무가설이 옳다면, 모든 p-value는 일양분포(uniform distribution)를 따른다. 그러나 SNP 및 산도 형질 사이에 연관성이 있다고 판단되면 이 분포, 즉 일양분포를 벗어난다. 상기 GWAS 결과를 토대로 작성한 QQ-plot은 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 작성된 QQ-plot을 확인한 결과, 일양분포를 따르지 않는 것을 확인하였고, 이는 SNP 및 산도 형질은 연관성이 있음을 의미한다.

4-2. 사과 유전자원 301점의 산도 형질에 따른 GWAS 분석_manhattan plot

연관성 있는 SNP의 위치를 manhattan plot으로 시각화하였다. 상기 manhattan plot의 가로축은 염색체 번호와 물리적 위치를 의미하며, 세로축은 -log10(P) 값을 의미한다. 이 값은 SNP 및 산도 형질 사이에 연관성이 없다는 귀무가설 하에 F-검정하여 구해진 p-value를 -log10(P)로 바꾼 값이다. 즉 이 값이 클수록 SNP 및 산도 형질 사이에 연관성이 있을 확률이 높다고 판단한다. 작성된 manhattan plot은 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 16번 염색체에서 p-value가 가장 높은 것을 확인하였다. 상기 결과는 16번 염색체에 존재하는 SNP가 산도 형질과 연관성이 높다는 것을 의미한다.

실시예 5. 산도 형질 SNP 선발

전술한 GWAS 결과를 바탕으로, 산도 형질과 가장 유의성이 높은 SNP를 선발하였다. 선발된 산도 형질 SNP는 표 2에 나타내었다.

Trait	Marker	SNP Alleles	P value	Genic/Intergenic	Annotation
산도 (Titratable Acidity, TA)	chr16: 1466019	C/T	8.62×10^-9	LOC103402725 [Exon]	methionine aminopeptidase 1B
	chr16: 1466001	A/G	9.56×10^-9	LOC103402725 [Exon]	methionine aminopeptidase 1B
	chr16: 1350941	G/T	2.36×10^-8	LOC103402717 [Exon]	unknown
	chr16: 1378405	C/T	1.72×10^-7	LOC103402719 [Exon]	CTL-like protein DDB_G0274487
	chr16: 1545939	A/G	9.37×10^-7	LOC103402728 [Exon]	unknown
	chr16: 1348804	A/G	1.31×10^-6	LOC103402717 [Exon]	unknown
	chr16: 1450841	A/C	2.23×10^-6	Intergenic
	chr16: 1316991	A/C	2.59×10^-6	LOC103402710 [Exon]	ACD11 homolog protein
	chr16: 1313364	C/T	4.59×10^-6	LOC103402711 [Exon]	dihydrolipoyllysine-residue acetyltransferase component 4 of pyruvate dehydrogenase complex
	chr16: 1332163	A/G	6.00×10^-6	LOC103402712 [Exon]	aluminum-activated malate transporter 4-like

실시예 6. 선발된 산도 형질 SNP를 이용한 사과의 산도 판별

상기 표 2에 기재된 산도 형질 SNP를 이용하여, 사과의 산도를 판별하였다. 먼저, 상기 표 2에 기재된 산도 형질 SNP에 대한 프라이머 세트를 설계하였다. 본 실시예에서는 설계된 프라이머 세트 중 C16S63 및 C16S39B을 이용한 산도 판별 결과를 개시하였다.

(i) 프라이머 세트 C16S63를 이용한 산도 판별

프라이머 세트 C16S63은 증폭 산물의 크기가 107 bp이며, 어닐링 온도는 60℃이다. 또한 상기 프라이머 세트 C16S63는 16번 염색체의 1335263번 위치의 SNP를 판별하기 위한 것이다. 프라이머 세트 C16S63을 이용하여, 사과 유전자원의 산도를 판별, 즉, SNP 마커를 확인하였다. 추가적으로, HRM(High Resolution Melting) 분석을 수행하였다. 산도 판별 결과는 표 3에 나타내었고, HRM 결과는 도 5에 나타내었다(A : melting curve, B : difference graph).

산도 (%)	품종	판별기준 (%)
1.0 - 3.6	Asiro8, Akita Tare, Roberts Crab, Asiro3, Dolgo, Spy, Lodi, Jonathan, Noya, Humboldt, Parkland, M7 등	1.0 이상
0.1 - 0.9	Jonared, Jiguan, Red well, Crimson King, Virginia Gold, Sansa, Hongro, Granny Smith, Fuji, Tsugaru, Picnic, Yoko 등	1.0 미만

도 5에 나타낸 바와 같이, HRM 분석 결과, melting curve에서 1.0%를 기준으로 구분성이 확인되었다.

표 3에 나타낸 바와 같이, 산도 1.0%를 기준으로 품종을 판별하였다. 산도가 1.0 내지 3.6%인 품종은 Asiro8, Akita Tare 등이 있으며, 산도가 0.1 내지 0.9%인 품종은 Jonared, Jiguan, Red well, Crimson King 등이 있는 것을 확인하였다. 상기 품종들의 SNP를 분석한 결과, 산도가 1.0% 이상인 품종에서는 16번 염색체의 1335263번 위치의 SNP가 AA 또는 AG이며, 산도가 1.0% 미만인 품종에서는 GG인 것을 확인하였다.

(ii) 프라이머 세트 C16S39B를 이용한 산도 판별

프라이머 세트 C16S39B는 증폭 산물의 크기가 125 bp이며, 어닐링 온도가 60℃이다. 또한 상기 프라이머 세트 C16S39B는 16번 염색체의 1545939번 위치의 SNP를 판별하기 위한 것이다. 프라이머 세트 C16S39B를 이용하여, 사과 유전자원의 산도를 판별, 즉, SNP 마커를 확인하였다. 추가적으로, HRM 분석을 수행하였다. 산도 판별 결과는 표 4에 나타내었고, HRM 결과는 도 6에 나타내었다(A : melting curve, B : difference graph).

산도 (%)	품종	판별기준 (%)
1.3 - 3.9	Asiro8, Asiro3, Akita Tare, Ottawa8, Maypole, Purple wave 등	1.3 이상
0.1 - 1.3	Ginger gold, Crimson king, Mayqueen, Alps Otome, Hongro, Gamhong, Tallmans sweet, Britegold 등	1.3 미만

도 6에 나타낸 바와 같이, HRM 분석 결과, melting curve에서 1.3%를 기준으로 구분성이 확인되었다.

표 4에 나타낸 바와 같이, 산도 1.3%를 기준으로 품종을 판별하였다. 산도가 1.4 내지 3.9% 이상인 품종은 Asiro8, Asiro3, Akita Tare 등이 있으며, 산도가 0.1 내지 1.3%인 품종은 Ginger gold, Crimson king, Mayqueen 등이 있는 것을 확인하였다. 상기 품종들의 SNP를 분석한 결과, 산도가 1.3% 이상인 품종에서는 16번 염색체의 1545939번 위치의 SNP가 GG이며, 산도가 1.3% 미만인 품종에서는 AA 또는 AG인 것을 확인하였다.

종합적으로 본 발명자들은 본 발명의 선발된 SNP 마커 및 이를 증폭하는 프라이머 세트를 이용 시, 유전적 유사도가 높아 표현형에 큰 차이를 보이지 않는 산도 형질 및 산도에 따른 품종을 정확하게 판별할 수 있다. 이는 본 발명의 SNP 마커를 이용하면, 사과의 과실 없이 유엽만으로도 사과의 산도를 판별할 수 있음을 의미하는바, 본 발명의 SNP 마커는 사과 육종 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.

이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

Claims

사과 16번 염색체(NC_024254.1)의 1332163 번째 위치; 또는
사과 16번 염색체(NC_024254.1)의 1545939 번째 위치;의 유전자 좌의 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 마커를 검출할 수 있는 제제를 포함하는 사과 산도 형질 판별용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 단일염기다형성 마커는
사과 16번 염색체(NC_024254.1)의 1332163 번째 위치의 염기가 AA, AG 또는 GG인 단일염기다형성 마커; 또는
사과 16번 염색체(NC_024254.1)의 1545939 번째 위치의 염기가 AA, AG 또는 GG인 단일염기다형성 마커;인, 사과 산도 형질 판별용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 단일염기다형성 마커를 검출할 수 있는 제제는 단일염기다형성 마커 부위를 포함하는, 10 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;와 특이적으로 혼성화(hybridization)하는 폴리뉴클레오티드인, 사과 산도 형질 판별용 조성물.
제3항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 단일염기다형성 마커를 검출할 수 있는 프라이머, 프로브 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 종 이상인, 사과 산도 형질 판별용 조성물.
제4항에 있어서,
상기 프라이머는 3’ 마지막 염기가 단일염기다형성 부위에 상보적으로 결합하는 것인, 사과 산도 형질 판별용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 유엽(young leaves) 시료에서 사과 산도 형질을 판별하는 것인, 사과 산도 형질 판별용 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 사과 산도 형질 판별키트.
(a) 사과의 DNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 단계 (a)의 DNA를 주형으로 하고, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 이용하여 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계; 및
(c) 중합효소연쇄반응 산물을 분석하여 사과의 산도 형질을 판별하는 단계;를 포함하는 사과 산도 형질 판별방법.
제8항에 있어서,
상기 단계 (a)는 사과의 유엽(young leaves) 시료에서 사과의 DNA를 추출하는 것인, 사과 산도 형질 판별방법.
제8항에 있어서,
상기 단계 (b)의 중합효소연쇄반응은 대립유전자 특이 중합효소연쇄반응인, 사과 산도 형질 판별방법.