KR20200142537A - 비-뉴런 세포의 뉴런으로의 리프로그래밍 및 신경퇴행성 질환 및 장애를 치료하기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

비-뉴런 세포의 뉴런으로의 리프로그래밍 및 신경퇴행성 질환 및 장애를 치료하기 위한 방법 및 조성물 Download PDF

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KR20200142537A
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샹-동 푸
하오 치안
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더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
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Abstract

본원에서는 비-뉴런 세포를 뉴런으로 리프로그래밍하는 방법을 제공한다. 본 개시내용의 측면은 세포 리프로그래밍 작용제를 사용하여 PTB의 발현 또는 활성을 억제시켜 비-뉴런 세포를 뉴런으로 전환시키는 것에 관한 것이다. 본원에서는 또한 생체내에서 비-뉴런 세포를 기능성 뉴런으로 리프로그래밍하여 신경퇴행성 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

Description

비-뉴런 세포의 뉴런으로의 리프로그래밍 및 신경퇴행성 질환 및 장애를 치료하기 위한 방법 및 조성물
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 35 U.S.C. §119하에 2018년 4월 11일 출원된 가출원 시리얼 번호 62/656,322, 및 2018년 8월 14일 출원된 가출원 시리얼 번호 62/718,774로부터 우선권을 주장하고, 그의 개시내용이 본원에서 참조로 포함된다.
정부 허가 권리
본 발명은 수여 번호 5R01GM052872 및 5R01HG004659하에 미국 국립 보건원(National Institutes of Health)으로부터 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 특정 권리를 갖는다.
기술 분야
본 개시내용은 비-뉴런 세포를 뉴런 세포로 분화시키기 위한 방법 및 조성물, 및 신경퇴행성 질환 및 장애를 치료하기 위한 방법에 관한 것이다.
참조로 서열 목록 포함
본 첨부 파일링은 IBM-PC, MS-윈도우즈 운영 체계로 기계 포맷되고, 2019년 4월 11일 작성되고, 1,595 바이트의 데이터를 갖는, 파일명 "Sequence_ST25.txt"의 서열 목록이다. 서열 목록은 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에서 참조로 포함된다.
배경
재생 의학은 세포 손실 장애를 다루는 데 있어 큰 가능성을 갖고 있다. 한 접근법은 세포 대체를 이용하는 반면, 또 다른 것은 세포 전환-분화(trans-differentiation)를 이용한다. 세포 대체는 조혈 장애를 치료하는 데에서는 놀라운 성공을 누렸지만; 다른 질환에서 상기 접근법은 제한된 효능을 보이거나, 또는 면역 반응 및/또는 종양 형성의 위험과 연관이 있다. 그에 반해, 전환-분화는 내인성 세포의 현 세포 유연성을 이용하여 새로운 세포 타입을 생성할 수 있다. 도전과제는 배양물에서 뿐만 아니라, 더욱 중요하게는, 그의 생체내 천연 환경에서도 세포를 한 세포 타입에서 또 다른 세포 타입으로 전환시키는 효율적인 전략법을 확인하는 것이다.
요약
본 개시내용은 성상세포를, 폴리피리미딘-트랙-결합 (PTB) 단백질의 발현을 억제시키는 억제 핵산 분자와 접촉시킴으로써 성상세포의 뉴런 세포로의 전환에 의해 생산된 뉴런 세포를 제공한다. 상기의 한 실시양태 또는 추가 실시양태에서, 뉴런 세포는 시험관내에서 생산된다. 상기의 한 실시양태 또는 추가 실시양태에서, 뉴런 세포는 생체내에서 생산된다. 상기의 한 실시양태 또는 추가 실시양태에서, 억제 핵산 분자는 RNAi 분자이다. 상기의 한 실시양태 또는 추가 실시양태에서, RNAi 분자는 shRNA이다. 상기의 한 실시양태 또는 추가 실시양태에서, 억제 핵산 분자는 안티센스 분자이다. 상기의 한 실시양태 또는 추가 실시양태에서, 억제 핵산 분자는 바이러스 또는 바이러스 벡터 내에 존재한다. 상기의 한 실시양태 또는 추가 실시양태에서, 바이러스 또는 바이러스 벡터는 아데노바이러스, AAV, 레트로바이러스, 또는 렌티바이러스이다. 상기의 한 실시양태 또는 추가 실시양태에서, 성상세포는 인간 성상세포이다.
본 개시내용은 신경퇴행성 질환 또는 장애를 앓는 대상체에서의 성상세포를 PTB의 발현을 억제시키는 억제 핵산과 접촉시켜 성상세포를 뉴런으로 분화시키고, 신경퇴행성 질환 또는 장애를 치료하는 단계를 포함하는, 신경퇴행성 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 상기의 한 실시양태 또는 추가 실시양태에서, 억제 핵산은 대상체 뇌의 중추 신경계 중 신경퇴행성 질환 또는 장애와 연관된 부위로 전달한다. 상기의 한 실시양태 또는 추가 실시양태에서, 대상체는 포유동물이다. 상기의 한 실시양태 또는 추가 실시양태에서, 포유동물은 인간이다. 상기의 한 실시양태 또는 추가 실시양태에서, 신경퇴행성 질환 또는 장애는 허혈성 및 출혈성 뇌졸중, 척수 손상, 뇌 손상(brain injury), 헌팅톤병, 알츠하이머병, 파킨슨병, 조현병, 자폐증, 운동 실조증, 근위축성 측경화증, 루게릭병, 라임병(Lyme Disease), 수막염, 편두통, 운동 뉴런증, 신경병증, 동통, 뇌 손상(brain damage), 뇌 기능장애, 척수 장애, 말초 신경계 장애, 뇌 신경 장애, 자율 신경계 장애, 발작 장애, 예컨대, 간질, 운동 장애, 예컨대, 파킨슨병, 수면 장애, 두통, 하부 요통 및 경부 동통, 신경성 동통, 섬망(delirium) 및 치매, 예컨대, 알츠하이머병, 현기증(dizziness) 및 어지럼증(vertigo), 혼수상태(stupor) 및 코마, 두부 손상, 뇌졸중, 신경계 종양, 다발성 경화증 및 다른 탈수초성 질환(demyelinating diseases), 뇌 또는 척수 감염, 및 프리온 질환(prion disease)으로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 개시내용은 또한 성상세포를 뉴런으로 분화시키는 단계, 및 뉴런을 대상체의 신경퇴행 부위에 이식하는 단계를 포함하고, 여기서, 성상세포는 PTB의 발현을 억제시킴으로써 뉴런으로 전환되는 것인, 신경퇴행성 질환 또는 장애를 앓는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 상기의 한 실시양태 또는 추가 실시양태에서, 성상세포는 대상체로부터 신경퇴행성 질환 또는 장애 부위에서 수득되고, 생체외에서 분화된다.
본 개시내용은 또한 신경퇴행성 질환 또는 장애를 앓는 대상체로부터 성상세포를 수득하는 단계, 및 성상세포를, PTB 발현을 억제시키는 억제 핵산과 접촉시켜 성상세포를 뉴런 세포로 분화시키는 단계, 및 뉴런 세포를 약물 또는 화합물과 접촉시키는 단계, 및 약물 또는 화합물이 신경퇴행성 질환 또는 장애의 임의의 질환 마커의 발현을 억제시키는지 여부를 측정하는 단계를 포함하는, 신경퇴행성 질환 또는 장애를 치료 또는 억제시키는 활성에 대해 약물 또는 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
상기의 한 실시양태 또는 추가 실시양태에서, 억제 핵산은 서열 번호: 1 또는 2와 적어도 80-100% 동일하고/거나, 여기서, T가 U인 서열을 포함한다.
본 개시내용은 또한 서열 번호: 2와 적어도 98% 동일하고, PTB 발현을 억제시키고/거나, 여기서, T가 U인 서열을 포함하는 안티센스 분자를 제공한다.
본 개시내용은 또한 서열 번호: 1 또는 2에 기재된 바와 같은 서열, 또는 상기 서열과 적어도 80-99% 동일하고/거나, 여기서, T가 상기 서열에서 U인 서열 (예컨대, DNA 또는 RNA)을 포함하는 벡터로서, 여기서, 벡터는 PTB 발현을 억제시키는 것인 벡터를 제공한다.
특정 실시양태에서, 본원에서는 인간 비-뉴런 세포를 성숙한 뉴런으로 리프로그래밍하는 방법을 개시한다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 인간 성인 섬유모세포에서 발현되는 것보다 더 높은 수준으로 miR-9 또는 Brn2를 발현하는 인간 비-뉴런 세포를 제공하는 단계; 및 상기 세포를, 인간 비-뉴런 세포에서 PTB의 발현 또는 활성을 억제시키는 세포-프로그래밍 작용제를 포함하는 조성물과 접촉시켜 인간 비-뉴런 세포를 성숙한 뉴런으로 리프로그래밍하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 인간 비-뉴런 세포는 인간 성인 섬유모세포에서 발현되는 것보다 적어도 2배 더 높은 수준으로 miR-9 또는 Brn2를 발현한다. 일부 실시양태에서, 인간 비-뉴런 세포는 인간 성인 섬유모세포에서 발현되는 것보다 적어도 10배 더 높은 수준으로 miR-9 또는 Brn2를 발현한다. 일부 실시양태에서, 인간 비-뉴런 세포는 인간 성인 섬유모세포에서 발현되는 것보다 더 높은 수준으로 miR-9 및 Brn2를 발현한다.
특정 실시양태에서, 본원에서는 리프로그래밍하고자 하는 인간 신경교 세포를 제공하는 단계; 및 인간 신경교 세포를 적어도 1일 동안, 인간 신경교 세포에서 PTB의 발현 또는 활성을 억제시키는 세포-프로그래밍 작용제를 포함하는 조성물과 접촉시켜 인간 신경교 세포를 성숙한 뉴런으로 리프로그래밍하는 단계를 포함하는, 인간 신경교 세포를 성숙한 뉴런으로 리프로그래밍하는 방법을 개시한다.
일부 실시양태에서, 인간 신경교 세포는 성상세포, 희소돌기아교세포, 뇌실막 세포, 슈반 세포, 소교세포, 및 위성 세포로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 인간 신경교 세포는 GFAP (신경교 섬유질 산성 단백질) 또는 ALDH1L1 (알데히드 데히드로게나제 1 패밀리 구성원 L1)에 대해 양성이다.
특정 실시양태에서, 본원에서는 리프로그래밍하고자 하는 성상세포를 제공하는 단계; 및 성상세포를 적어도 1일 동안, 성상세포에서 PTB의 발현 또는 활성을 억제시키는 세포-프로그래밍 작용제를 포함하는 조성물과 접촉시켜 성상세포를 성숙한 뉴런으로 리프로그래밍하는 단계를 포함하는, 성상세포를 성숙한 뉴런으로 리프로그래밍하는 방법을 개시한다.
일부 실시양태에서, 성상세포는 마우스 성상세포이다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 복수의 마우스 성상세포를 리프로그래밍하고, 여기서, 마우스 성상세포 중 적어도 60%가 Tuj1 양성인 성숙한 뉴런으로 전환된다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 복수의 마우스 성상세포를 리프로그래밍하고, 여기서, 마우스 성상세포 중 포 중 적어도 40%가 Map2 양성인 성숙한 뉴런으로 전환된다.
일부 실시양태에서, 성상세포는 인간 성상세포이다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 복수의 인간 성상세포를 리프로그래밍하고, 여기서, 인간 성상세포 중 적어도 40%, 적어도 60%, 또는 적어도 80%가 Tuj1 양성인 성숙한 뉴런으로 전환된다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 복수의 인간 성상세포를 리프로그래밍하고, 여기서, 인간 성상세포 중 적어도 20%, 적어도 40% 또는 적어도 60%가 Map2 양성인 성숙한 뉴런으로 전환된다.
일부 실시양태에서, 조성물은 PTB의 발현 또는 활성을 특이적으로 억제시키는 단일 세포-프로그래밍 작용제를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에서는 리프로그래밍하고자 하는 인간 비-뉴런 세포를 제공하는 단계; 및 인간 비-뉴런 세포를 적어도 3일 동안, 인간 비-뉴런 세포에서 PTB의 발현 또는 활성을 억제시키는 단일 세포-프로그래밍 작용제를 포함하는 조성물과 접촉시켜 인간 비-뉴런 세포를 성숙한 뉴런으로 리프로그래밍하는 단계를 포함하는, 인간 비-뉴런 세포를 성숙한 뉴런으로 리프로그래밍하는 방법을 개시한다.
특정 실시양태에서, 본원에서는 리프로그래밍하고자 하는 인간 비-뉴런 세포를 제공하는 단계; 및 인간 비-뉴런 세포를, 인간 비-뉴런 세포에서 PTB의 발현 또는 활성을 감소시키고, PTB의 발현 또는 활성의 감소 후, nPTB의 발현 또는 활성을 감소시키는 단일 세포-프로그래밍 작용제를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 인간 비-뉴런 세포를 리프로그래밍하는 방법을 개시한다.
일부 실시양태에서, 초기 nPTB 발현 수준은, PTB의 발현 또는 활성이 억제됨에 따라 높은 nPTB 발현 수준까지 증가한다. 일부 실시양태에서, nPTB 발현은 높은 nPTB 발현 수준에서, PTB의 발현 또는 활성의 억제 후, 초기 nPTB 발현 수준보다 더 높은, 낮은 nPTB 발현 수준으로 감소한다. 일부 실시양태에서, 인간 비-뉴런 세포는 인간 성인 섬유모세포에서 발현되는 것보다 더 높은 수준으로 miR-9 또는 Brn2를 발현한다. 일부 실시양태에서, 인간 비-뉴런 세포는 인간 성인 섬유모세포에서 발현되는 것보다 더 높은 수준으로 miR-9 및 Brn2를 발현한다.
일부 실시양태에서, 본 방법은 복수의 인간 비-뉴런 세포, 인간 신경교 세포, 또는 성상세포를 리프로그래밍하고, 여기서, 인간 비-뉴런 세포, 인간 신경교 세포, 또는 성상세포 중 적어도 40%가, NeuN (뉴런 핵 항원), Map2 (미세소관-연합 단백질 2), NSE (뉴런 특이적 에놀라제), 160 kDa 신경필라멘트 중간 쇄, 200 kDa 신경필라멘트 중쇄, PDS-95 (시냅스후 치밀질 단백질 95), 시냅신 I, 시냅토피신, GAD67 (글루타메이트 데카르복실라제 67), GAD65 (글루타메이트 데카르복실라제 67), 파르브알부민, DARPP32 (도파민- 및 cAMP-조절 뉴런 인단백질 32), vGLUT1 (소포 글루타메이트 수송체 1), vGLUT2 (소포 글루타메이트 수송체 1), 아세틸콜린, 및 TH (티로신 히드록실라제)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 뉴런 마커의 발현을 특징으로 하는 성숙한 뉴런으로 리프로그래밍된다.
일부 실시양태에서, 본 방법은 복수의 인간 비-뉴런 세포, 인간 신경교 세포, 또는 성상세포를 리프로그래밍하고, 여기서, 인간 비-뉴런 세포, 인간 신경교 세포, 또는 성상세포 중 적어도 20%가, 활동 전위, 시냅스 연결, 시냅스전 신경전달물질 방출, 및/또는 시냅스후 반응을 확립시킬 수 있는 그의 능력을 특징으로 하는 기능성 뉴런으로 리프로그래밍된다.
일부 실시양태에서, 세포-프로그래밍 작용제는 항-PTB 억제제이다. 일부 실시양태에서, 항-PTB 억제제는 항-PTB 안티센스 올리고뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 항-PTB 억제제는 항-PTB shRNA, 항-PTB miRNA, 항-PTB 안티센스 올리고뉴클레오티드, 항-PTB 항체, PTB의 소분자 억제제, 우성 음성 PTB 돌연변이체, 및 폴리피리미딘 트랙을 함유하는 스펀지 폴리리보뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 세포-프로그래밍 작용제는 적어도 5일 동안 PTB의 발현 또는 활성을 억제시킨다. 일부 실시양태에서, 세포-프로그래밍 작용제는 적어도 10일 동안 PTB의 발현 또는 활성을 억제시킨다. 일부 실시양태에서, 세포-프로그래밍 작용제는 적어도 15일 동안 PTB의 발현 또는 활성을 억제시킨다.
일부 실시양태에서, 인간 비-뉴런 세포, 인간 신경교 세포, 또는 성상세포를 배지 중에서 배양한다. 일부 실시양태에서, 배지는 ALK5의 억제제, GSK3b의 억제제, PKA의 활성인자, 및 그의 임의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 작용제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 활성인자 ALK5는 SB431542를 포함한다. 일부 실시양태에서, 억제제 GSK3b는 CHIR99021을 포함한다. 일부 실시양태에서, PKA의 활성인자는 디부티릴아데노신 3',5'-시클릭 모노포스페이트 (Db-cAMP)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포-프로그래밍 작용제는 렌티바이러스 벡터로 전달된다.
특정 실시양태에서, 본원에서는 뇌 중 성상세포에서 PTB의 발현 또는 활성을 억제시키는 세포-프로그래밍 작용제를 포함하는 조성물을 대상체의 뇌에 투여하는 단계, 및 성상세포가 기능성 뉴런으로 리프로그래밍될 수 있도록 허용하는 단계를 포함하는, 생체내에서 기능성 뉴런을 생성하는 방법을 개시한다.
특정 실시양태에서, 본원에서는 중뇌 중 비-뉴런 세포에서 PTB의 발현 또는 활성을 억제시키는 세포-프로그래밍 작용제를 포함하는 조성물을 대상체의 중뇌에 투여하는 단계, 및 비-뉴런 세포가 기능성 뉴런으로 리프로그래밍될 수 있도록 허용하는 단계를 포함하는, 생체내에서 기능성 뉴런을 생성하는 방법을 개시한다.
특정 실시양태에서, 본원에서는 뇌 중 비-뉴런 세포에서 PTB의 발현 또는 활성을 억제시키는 세포-프로그래밍 작용제를 포함하는 조성물을 대상체의 뇌에 투여하는 단계, 및 비-뉴런 세포가 도파민성 뉴런으로 리프로그래밍될 수 있도록 허용하는 단계를 포함하는, 생체내에서 도파민성 뉴런을 생성하는 방법을 개시한다.
일부 실시양태에서, 도파민성 뉴런은 티로신 히드록실라제 (TH), 도파민 수송체 (DAT/SLC6A3), 소포 모노아민 수송체 2 (VMAT2), 엔그레일드 호메오박스 1(engrailed homeobox 1: En1), FoxA2, 및/또는 LIM 호메오박스 전사 인자 1 알파 (Lmx1a)를 발현한다.
일부 실시양태에서, 본 방법은 뇌 중 복수의 비-뉴런 세포를 리프로그래밍하고, 여기서, 비-뉴런 세포 중 적어도 10%가 도파민성 뉴런으로 전환된다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 뇌 중 복수의 비-뉴런 세포를 리프로그래밍하고, 여기서, 비-뉴런 세포 중 적어도 30%가 도파민성 뉴런으로 전환된다.
일부 실시양태에서, 기능성 뉴런 또는 도파민성 뉴런의 축삭돌기 말단은 대상체의 선조체에 도달한다.
일부 실시양태에서, 세포-프로그래밍 작용제는 대상체의 흑색질에 투여된다.
일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
일부 실시양태에서, 대상체는 비-인간 동물이다.
특정 실시양태에서, 본원에서는 뇌 중 비-뉴런 세포에서 PTB의 발현 또는 활성을 억제시키는 세포-프로그래밍 작용제를 인간 대상체의 뇌에 투여하는 단계, 및 비-뉴런 세포가 기능성 뉴런으로 리프로그래밍될 수 있도록 허용하는 단계를 포함하는, 생체내에서 기능성 뉴런을 생성하는 방법을 개시한다.
일부 실시양태에서, 비-뉴런 세포는 신경교 세포이다. 일부 실시양태에서, 신경교 세포는 성상세포이다.
일부 실시양태에서, 세포-프로그래밍 작용제는 인간 대상체의의 중뇌, 선조체, 또는 피질에 투여된다. 일부 실시양태에서, 세포-프로그래밍 작용제는 인간 대상체의 흑색질에 투여된다.
일부 실시양태에서, 기능성 뉴런은 도파민성 뉴런이다. 일부 실시양태에서, 기능성 뉴런은 티로신 히드록실라제 (TH), 도파민 수송체 (DAT), 소포 모노아민 수송체 2 (VMAT2), 엔그레일드 호메오박스 1 (En1), 포크헤드 박스 A2(Forkhead Box A2: FoxA2) 및/또는 LIM 호메오박스 전사 인자 1 알파 (Lmx1a)를 발현한다.
일부 실시양태에서, 기능성 뉴런 또는 도파민성 뉴런은 시냅스전 신경전달물질을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 기능성 뉴런 또는 도파민성 뉴런은 뇌 중 현존 뉴런 회로망으로 통합된다.
일부 실시양태에서, 본 방법은 뇌 중 복수의 비-뉴런 세포 또는 성상세포를 리프로그래밍하고, 여기서, 비-뉴런 세포 또는 성상세포 중 적어도 30%가 뉴런 핵 항원 (NeuN), 미세소관-연합 단백질 2 (Map2), 뉴런 특이적 에놀라제 (NSE), 160 kDa 신경필라멘트 중간 쇄, 200 kDa 신경필라멘트 중쇄, 시냅스후 치밀질 단백질 95(PDS-95), 시냅신 I, 시냅토피신, 글루타메이트 데카르복실라제 67 (GAD67), 글루타메이트 데카르복실라제 67 (GAD65), 파르브알부민, 도파민- 및 cAMP-조절 뉴런 인단백질 32 (DARPP32), 소포 글루타메이트 수송체 1 (vGLUT1), 소포 글루타메이트 수송체 2 (vGLUT2), 아세틸콜린, 및 티로신 히드록실라제 (TH)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 뉴런 마커의 발현을 특징으로 하는 성숙한 뉴런으로 리프로그래밍된다.
일부 실시양태에서, 본 방법은 뇌 중 복수의 비-뉴런 세포 또는 성상세포를 리프로그래밍하고, 여기서, 비-뉴런 세포 또는 성상세포 중 적어도 20%가 활동 전위, 시냅스 연결, 시냅스전 신경전달물질, 및/또는 시냅스후 반응을 확립시킬 수 있는 그의 능력을 특징으로 하는 기능성 뉴런으로 리프로그래밍된다.
일부 실시양태에서, 세포-프로그래밍 작용제는 항-PTB 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포-프로그래밍 작용제는 항-PTB shRNA, 항-PTB miRNA, 항-PTB 안티센스 올리고뉴클레오티드, 항-PTB 항체, PTB의 소분자 억제제, 우성 음성 PTB 돌연변이체, 폴리피리미딘 트랙을 함유하는 스펀지 폴리리보뉴클레오티드, 및 그의 임의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 세포-프로그래밍 작용제는 적어도 5일 동안 PTB의 발현 또는 활성을 억제시킨다. 일부 실시양태에서, 세포-프로그래밍 작용제는 적도 105일 동안 PTB의 발현 또는 활성을 억제시킨다. 일부 실시양태에서, 세포-프로그래밍 작용제는 적어도 15일 동안 PTB의 발현 또는 활성을 억제시킨다. 일부 실시양태에서, 세포-프로그래밍 작용제는 AAV 벡터로 전달된다.
특정 실시양태에서, 본원에서는 뇌 영역 중 기능성 뉴런의 퇴행과 연관된 신경 병태 치료를 필요로 하는 대상체의 뇌 영역에 뇌 영역 중 비-뉴런 세포에서 PTB의 발현 또는 활성을 억제시키는 세포-프로그래밍 작용제를 포함하는 조성물을 투여하는 단계, 및 비-뉴런 세포가 기능성 뉴런으로 리프로그래밍될 수 있도록 허용하여 뇌 영역 중 퇴행된 기능성 뉴런을 보충해 주는 단계를 포함하는, 뇌 영역 중 기능성 뉴런의 퇴행과 연관된 신경 병태를 치료하는 방법을 개시한다.
일부 실시양태에서, 신경 병태는 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅톤병, 조현병, 우울증, 및 약물 중독으로 구성된 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 본원에서는 뇌 영역 중 도파민성 뉴런의 퇴행과 연관된 신경 병태 치료를 필요로 하는 대상체의 뇌 영역에 뇌 영역 중 비-뉴런 세포에서 PTB의 발현 또는 활성을 억제시키는 세포-프로그래밍 작용제를 포함하는 조성물을 투여하는 단계, 및 비-뉴런 세포가 도파민성 뉴런으로 리프로그래밍될 수 있도록 허용하여 뇌 영역 중 퇴행된 도파민성 뉴런을 보충해 주는 단계를 포함하는, 뇌 영역 중 도파민성 뉴런의 퇴행과 연관된 신경 병태를 치료하는 방법을 개시한다.
특정 실시양태에서, 본원에서는 정상 수준과 비교하여 감소된 양의 도파민을 갖는 대상체의 뇌 영역에 뇌 영역 중 비-뉴런 세포에서 PTB의 발현 또는 활성을 억제시키는 세포-프로그래밍 작용제를 포함하는 조성물을 투여하는 단계, 및 비-뉴런 세포가 도파민성 뉴런으로 리프로그래밍될 수 있도록 허용하여 도파민의 감소된 양 중 적어도 50%를 회복시키는 단계를 포함하는, 정상 수준과 비교하여 감소된 양의 도파민을 갖는 대상체에서 도파민 생물발생을 회복시키는 방법을 개시한다.
일부 실시양태에서, 비-뉴런 세포는 신경교 세포이다. 일부 실시양태에서, 비-뉴런 세포는 성상세포이다.
일부 실시양태에서, 세포-프로그래밍 작용제는 항-PTB 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 세포-프로그래밍 작용제는 항-PTB shRNA, 항-PTB miRNA, 항-PTB 안티센스 올리고뉴클레오티드, 항-PTB 항체, PTB의 소분자 억제제, 우성 음성 PTB 돌연변이체, 폴리피리미딘 트랙을 함유하는 스펀지 폴리리보뉴클레오티드, 및 그의 임의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 기능성 뉴런 또는 도파민성 뉴런은 뇌 영역 중 현존 뉴런 회로망으로 통합된다.
일부 실시양태에서, 기능성 뉴런 또는 도파민성 뉴런은 활동 전위, 시냅스전 신경전달물질, 및/또는 시냅스후 반응을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 세포-프로그래밍 작용제는 대상체의 중뇌, 선조체, 또는 피질에 투여된다. 일부 실시양태에서, 세포-프로그래밍 작용제는 대상체의 흑색질에 투여된다.
일부 실시양태에서, 기능성 뉴런 또는 도파민성 뉴런의 축삭돌기 말단은 대상체의 선조체에 도달한다.
일부 실시양태에서, 신경 질환은 파킨슨병이다. 일부 실시양태에서, 세포-프로그래밍 작용제의 투여는 파킨슨병의 하나 이상의 증상을 호전시킨다. 일부 실시양태에서, 파킨슨병의 하나 이상의 증상은 떨림, 경직, 서동, 균형 장애, 발을 질질 끄는 보행(shuffling gait), 자세의 불안정, 후각 기능장애, 인지 기능장애, 우울증, 수면 장애, 자율신경계 장애, 동통, 및 피로로 구성된 군으로부터 선택된다.
본원에 제공된 바와 같은 본 방법의 일부 실시양태에서, 세포-프로그래밍 작용제는 표적 세포에서 PTB의 발현 또는 활성을 억제시키도록 구성된, 세포-표적화 모이어티와 접합된 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포-표적화 모이어티는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 표적 세포로 전달하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 표적 세포는 비-뉴런 세포, 신경교 세포, 또는 성상세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포-표적 모이어티는 폴리펩티드를 포함한다.
본원에 제공된 바와 같은 본 방법의 일부 실시양태에서, 세포-프로그래밍 작용제는 서열 번호: 1 또는 2와 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에서는 비-뉴런 세포에서 PTB의 발현 또는 활성을 억제시킴으로써 포유동물의 비-뉴런 세포를 성숙한 뉴런으로 리프로그래밍하는 데 효과적인 양으로 세포-프로그래밍 작용제를 포함하는 제약 조성물을 개시한다.
특정 실시양태에서, 본원에서는 주사, 흡입, 비경구적 투여, 정맥내 투여, 피하 투여, 근육내 투여, 진피내 투여, 국소 투여, 또는 경구적 투여용으로 제제화된, 본원에 제공된 바와 같은 제약 조성물을 개시한다.
특정 실시양태에서, 본원에서는 비-뉴런 세포에서 PTB의 발현 또는 활성을 억제시키도록 구성된 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하는 주사용 조성물을 개시한다. 일부 실시양태에서, 비-뉴런 세포는 신경교 세포이다. 일부 실시양태에서, 신경교 세포는 성상세포이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열 번호: 1 또는 2와 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에서는 비-뉴런 세포에서 PTB의 발현 또는 활성을 억제시키도록 구성된 렌티바이러스-shRNA를 포함하는 조성물을 개시한다. 일부 실시양태에서, 비-뉴런 세포는 신경교 세포이다. 일부 실시양태에서, 신경교 세포는 성상세포이다. 일부 실시양태에서, 구축물은 서열 번호: 1 또는 2와 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에서는 비-뉴런 세포에서 PTB의 발현 또는 활성을 억제시키도록 구성된 AAV-shRNA 구축물을 포함하는 주사용 조성물을 개시한다. 일부 실시양태에서, 비-뉴런 세포는 신경교 세포이다. 일부 실시양태에서, 신경교 세포는 성상세포이다. 일부 실시양태에서, 구축물은 서열 번호: 1 또는 2와 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에서는 비-뉴런 세포에서 PTB의 발현 또는 활성을 억제시키도록 구성된, 세포-표적화 모이어티와 접합된 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 여기서, 세포-표적화 모이어티는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 비-뉴런 세포로 전달하도록 구성된 것인, 비-뉴런 세포를 뉴런으로 전환시키기 위한 조성물을 개시한다.
일부 실시양태에서, 세포-표적화 모이어티는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포-표적화 모이어티는 구체적으로, 비-뉴런 세포를 특이적으로 표적화하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 비-뉴런 세포는 신경교 세포, 성체 1차 섬유모세포, 배아 섬유모세포, 상피 세포, 멜라노사이트, 케라티노사이트, 아디포사이트, 혈액 세포, 골수 기질 세포, 랑게르한스 세포, 근육 세포, 직장 세포, 및 콘드로사이트로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 비-뉴런 세포는 신경교모세포종 세포, Hela 세포주, NT2 세포주, ARPE19 세포주, 및 N2A 세포주로 구성된 군으로부터 선택되는 세포주로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 비-뉴런 세포는 신경교 세포이다. 일부 실시양태에서, 신경교 세포는 성상세포, 희소돌기아교세포, 뇌실막 세포, 슈반 세포, NG2 세포, 및 위성 세포로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 신경교 세포는 성상세포이다. 일부 실시양태에서, 조성물은 뇌 영역 중 기능성 뉴런의 퇴행과 연관된 신경 병태를 치료하기 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 신경 병태는 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅톤병, 조현병, 우울증, 및 약물 중독으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 신경 병태는 파킨슨병이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열 번호: 1 또는 2와 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에서는 뇌 영역 중 리프로그래밍된 뉴런을 포함하는 동물로서, 여기서, 리프로그래밍된 뉴런은 본원에 개시된 바와 같은 임의의 방법에 의해 제조된 것인 동물을 개시한다. 일부 실시양태에서, 동물은 포유동물이다. 일부 실시양태에서, 동물은 인간이다. 일부 실시양태에서, 동물은 설치류이다. 일부 실시양태에서, 동물은 돼지이다.
특정 실시양태에서, 본원에서는 리프로그래밍된 뉴런을 포함하는, 본원에 개시된 바와 같은 임의 동물의 뇌 조직을 개시한다.
특정 실시양태에서, 본원에서는 본원에 개시된 방법들 중 하나에 의해 생산된 리프로그래밍된 뉴런을 개시한다.
도면 설명
도 1은 뉴런 유도를 위해 PTB, 및 뉴런 성숙화를 위해 nPTB에 의해 제어되는 2개의 연속 조절 루프의 개략적 도해이다.
도 2A-F는 마우스 성상세포, 마우스 배아 섬유모세포 (MEF) 및 마우스 뉴런에서 (도 2A, 2C, 및 2E) 및 인간 성상세포, 인간 성인 섬유모세포 (HDF) 및 인간 뉴런에서 (도 2B, 2D 및 2F)의 웨스턴 블롯에 의한 Brn2, 및 RT-qPCR에 의한 miR-124 및 miR-9의 발현 수준을 보여주는 것이다. 통계로 나타낸 결과는 평균 ± SEM으로 제시되어 있고; 여기서, **p<0.01, ***p<0.001은 사후 터키 검정과 함께 ANOVA에 기초한 것이다 (n=3 생물학적 반복).
도 3A는 HDF (좌측), 마우스 (중간) 및 인간 성상세포 (우측)에서의 PTB 하향조절에 대한 반응으로 나타나는 nPTB 수준에 대하여 웨스턴 블롯에 의해 이루어진 시간-추이 분석을 보여주는 것이다.
도 3B는 데이터 정량화를 보여주는 것이다.
도 4는 단리된 마우스 및 인간 성상세포의 특징화를 보여주는 것이다: 뉴런 마커 (Tuj1, NSE, NeuN, GAD67, VGluT1, TH), 희소돌기아교세포 마커 (희소돌기아교세포 전사 인자 2, OLIG2), 소교세포 마커 (CD11 항원-유사 패밀리 구성원 B, CD11b), NG2 세포 마커 (신경/신경교 항원 2, NG2), 신경 전구체 마커 (네스틴(Nestin)) 만능성 마커 (NANOG) 및 섬유모세포 마커 (피브로넥틴)의 음성 염색에 의해 표시되는 바와 같이, 배양물 중 대다수의 마우스 및 인간 성상세포는 검출가능한 다른 세포 타입 없이, 성상세포 마커 (GFAP 및 ALDH1L1)에 대해 면역양성이었다. 스케일 바: 30 um.
도 5A는 마우스 성상세포로부터의 PTB 넉다운-유도 뉴런은 범용(pan)-뉴런 마커 Tuj1 (적색) 및 MAP2 (녹색)에 대해 면역양성이었다는 것을 보여주는 것이다. 대조군 바이러스 (shCtrl)로 감염된 마우스 성상세포는 동일한 배양 조건하에서 뉴런 마커의 양성 염색을 보이지 않았다. 우측은 5 생물학적 반복에 기초한 정량화. 스케일 바: 100 um.
도 5B는 성숙한 뉴런의 마커 (NeuN, NSE) 및 글루타메이트성 뉴런 (VGlut1), GABA성 뉴런 (GAD67) 및 도파민성 뉴런 (TH)의 마커를 비롯한, 상이한 뉴런 서브타입의 마커에 의한, 유도 뉴런의 특징화를 보여주는 것이다. 스케일 바: 30 um.
도 5C는 마우스 성상세포로부터 전환된 뉴런의 서브타입에 대한 정량화를 보여주는 것이다. 4 생물학적 반복으로부터의 데이터.
도 5D는 마우스 성상세포의 유도 뉴런의 전기생리학적 분석을 보여주는 것으로서, 반복 활동 전위 (좌측, 조사된 세포 18개 중 12개가 기록된 활성을 보였다) 및 전압 의존성 나트륨 및 칼륨 채널의 큰 전류 (중간, 조사된 세포 17개 중 13개가 기록된 활성을 보였다)를 제시하고 있다. 래트 성상세포와의 공동 배양 후, 자발적 시냅스후 전류 또한 기록하였다 (우측, 조사된 세포 15개 중 10개가 기록된 활성을 보였다). 스케일 바: 100 um.
도 5E는 인간 성상세포에서의 PTB 넉다운에 의한 Tuj1 (적색) 및 MAP2 (녹색)의 유도 발현을 보여주는 것이다. 우측 패널은 4 생물학적 반복으로부터의 정량화를 보여주는 것이다.
도 5F는 성숙한 뉴런 (NeuN, NSE)의 마커, 및 상이한 신경 서브타입 (VGlut1, GAD67 및 TH)의 마커를 발현하는 인간 성상세포로부터의 유도 뉴런을 보여주는 것이다. 스케일 바: 40 um.
도 5G는 인간 성상세포로부터 전환된 뉴런의 서브타입에 대한 정량화를 보여주는 것이다. 5 생물학적 반복으로부터의 데이터.
도 5H는 인간 성상세포로부터의 유도 뉴런의 전기생리학적 분석을 보여주는 것으로서, 반복 활동 전위 (좌측, 조사된 세포 11개 중 9개가 기록된 활성을 보였다), 전압 의존성 나트륨 및 칼륨 채널의 큰 전류 (중간, 조사된 세포 20개 중 17개가 기록된 활성을 보였다) 및 자발적 시냅스후 전류 (우측, 조사된 세포 17개 중 13개가 기록된 활성을 보였다)를 제시하고 있다.
도 5I는 AAV-shPTB를 이용한 뉴런으로의 전환 이전 및 이후에 마우스 피질 성상세포에서 RT-qPCR에 의해 측정된 SLC6A3 (좌측) 및 FoxA2 (우측)의 발현 수준을 정량화하는 그래프를 보여주는 것이다.
도 5J-K는 DAT (J) 및 VMAT2 (K)에 대한 면역염색에 의해 특징화된 유도 도파민성 뉴런의 예시적인 영상을 보여주는 것이다. 스케일 바: 20 um.
도 5L은 TH와 비교하여 DAP 및 VMAT2를 발현하는 전환된 뉴런의 비율(%)의 정량화 (3 생물학적 반복에 기초)를 보여주는 것이다.
도 6A 및 6C는 각각 PTB 넉다운-유도 뉴런 전환 후, 마우스 (도 6A) 및 인간 (도 6C) 성상세포 상에서 검출된 자발적 흥분성 및 억제성 시냅스후 전류를 보여주는 것으로서, 이는 또한 순차적으로 흥분성 (NBQX+APV) 및 억제성 (PiTX) 수용체에 대해 억제제에 의해 차단된다는 것을 입증하였다.
도 6B 및 6D는 모의 마우스 (도 6B) 및 인간 성상세포 (도 6D)는 뉴런 전기생리학적 특성, 예컨대, 각각 활동 전위 (상단), 전압-의존성 채널의 전류 (중간) 및 시냅스후 이벤트 (하단)를 나타내지 않았다는 것을 보여주는 것이다.
도 6E는 중뇌로부터 유래된 성상세포로부터의 shPTB-전환된 Tuj1-양성 뉴런의 TH 염색을 보여주는 것이다.
도 6F는 피질 및 중뇌로부터 유래된 성상세포 사이의 뉴런 전환 효율 비교를 보여주는 것으로서, Tuj1-양성 뉴런은 높은 비율로 유사하였지만 (좌측), 피질로부터의 것과 비교하였을 때, 중뇌 유래 성상세포로부터 전환된 도파민성 뉴런의 비율이 유의적으로 더 높았다 (우측). ***p<0.001 (스튜던츠 t 검정) (3 생물학적 반복에 기초).
도 6G는 피질 및 중뇌로부터의 성상세포-유래 뉴런 중 범용-뉴런 마커 (Tuj1) 및 도파민성 뉴런에 대한 2개의 특이적 마커 (TH, VMAT2)의 발현을 입증하는 웨스턴 블롯 결과를 보여주는 것이다.
도 7A-7K는 마우스 중뇌에서의 PTB 하향조절에 의한 성상세포에서 기능성 뉴런으로의 전환을 예시하는 것이다. (A)는 정지 신호를 브래킷하는 2개의 loxP 부위, 이어서, RFP 및 PTB에 대한 shRNA를 함유하는 AAV 벡터의 디자인의 개략적 도해이다. (B)는 공벡터 감염된 성상세포는 GFAP 양성 염색을 보였지만, NeuN 염색보이지 않은 반면 (상부 패널), 그에 반해, shPTB-발현 벡터로 감염된 성상세포는 대부분 감염 후 10주째 NeuN 양성이었다 (하부 패널)는 것을 보여주는 것이다. 마우스 3마리로부터의 정량화된 데이터는 우측에 제시되어 있다. 스케일 바: 30 um. (C)는 전환된 뉴런이 Tuj1, MAP2, NSE 및 PSD95를 비롯한 다중 뉴런 마커에 대하여 면역양성이었다는 것을 보여주는 것이다. 스케일 바: 10 um. (D)는 중뇌 중 전환된 뉴런의 주요 집단이 TH를 발현하였다는 것을 보여주는 것이다. 우측 패널은 전환된 도파민성 뉴런의 서브군에 대한 정량화를 보여주는 것이다. 데이터는 마우스 3마리로부터의 것이었다. 스케일 바: 20 um. (E-G)는 상이한 뇌 영역에서의 계내 전환된 도파민성 뉴런의 특이성 및 효율을 시사하는 예시적인 결과를 보여주는 것이다. (E) 및 (F)는 중뇌, 선조체 및 피질에서의 shPTB-유도 성숙한 뉴런 (NeuN) 및 도파민성 뉴런 (TH)의 면역염색 영상을 보여주는 것이다. 화살촉 표시는 RFP 및 NeuN (A) 또는 TH (B)에 대한 중복 신호를 갖는 수개의 전환된 뉴런 세포체를 나타낸다. 스케일 바: 30 um. (G)는 (E) 및 (F)에서의 염색 결과l 정량화를 보여주는 것이다. 데이터는 마우스 3마리로부터의 것이었다. 유의적인 차이는 사후 터키 검정과 함께 ANOVA로부터의 p-값으로 표시되어 있다. (H)는 전환된 뉴런의 예시적인 패치 클램프 기록을 보여주는 것이다. 패치된 세포를 기록 피펫에 충전된 뉴로비오틴 488(Neurobiotin 488)에 의해 표지하였다. 패치 기록 후의 면역염색은 추적된 세포가 TH 양성이었다는 것을 보여주었다. 스케일 바: 20 um. (I-K)는 뇌 절편 상의 예시적인 전환된 뉴런은 전압-의존성 나트륨 및 칼륨 채널의 전류 (I, 조사된 세포 12개 중 11개가 기록된 활성을 보였다), 반복 활동 전위 (J, 조사된 세포 12개 중 9개가 기록된 활성을 보였다), 및 자발적 시냅스후 전류 (K, 조사된 세포 11개 중 9개가 기록된 활성을 보였다)을 보였다는 것을 입증한다.
도 8A-8F는 마우스 중뇌에서의 예시적인 AAV-shPTB 유도 뉴런 전환의 특징화를 보여주는 것이다. (A)는 주사맞은 WT 마우스에서의 LoxP-Stop-LoxP AAV 발현 단위의 비검출가능한 누출을 보여주는 것이다. RFP 양성 세포는, 동일한 바이러스 주사를 받은 GFAP-Cre 트랜스제닉 마우스와 비교하여 (우측), AAV-공 및 AAV-shPTB 바이러스의 주사 후 야생형 마우스 (좌측)의 중뇌에서는 거의 관찰되지 않았다. 스케일 바: 150 um. (B)는 RFP-양성 세포가 중뇌에서 점진적으로 뉴런으로 전환되었다는 것을 보여주는 것이다. RFP-표지된 NeuN 양성 세포의 비율(%)은 AAV-shPTB 주사 후 3주부터 10주까지 점진적으로 증가되었다. 스케일 바: 50 um. (C)는 각각 마우스 3마리에 기초한 (B)의 데이터 및 제시되지 않은 다른 지점의 데이터의 정량화를 보여주는 것이다. (D)는 AAV-공 형질도입된 중뇌의 동일한 절편 중, NG2 세포는 RFP-양성 세포 주위에서는 거의 검출되지 않았지만 (좌측 패널), NG2-양성 세포는 일반적으로 RFP-양성 세포에 의해 둘러싸여 있지 않았다는 것을 보여주는 것이다. 스케일 바: 15 um. (E)는 글루타메이트성 뉴런 마커 (VGluT2) 및 GABA성 뉴런 마커 (GAD65)의 면역염색이 상이한 서브타입의 전환된 뉴런을 보였다는 것을 보여주는 것이다. 스케일 바: 20 um. (F) A9 도파민성 뉴런 마커 Girk2의 면역염색을 보여주는 것이다. 화살표 표시는 Girk2와 RFP 및 TH 염색된 신호와의 공동 국재화를 가리킨다. 스케일 바: 20 um.
도 8G는 A10 도파민성 뉴런 마커 칼빈딘의 면역염색을 보여주는 것이다. 화살표 표시는 칼빈딘과 RFP 및 TH 신호와의 공동 국재화를 가리킨다. 별표 표시는 칼빈딘에 대해 음성으로 염색된 전환된 도파민성 뉴런 (RFP 및 TH 양성)을 가리킨다. 스케일 바: 20 um.
도 8H는 흑색질 뇌 영역에서 RFP-양성 세포와 비교하여 TH에 대해 염색된, 새로 전환된 뉴런을 모니터링하기 위한, RFP 또한 발현하는, AAV-shPTB를 주사맞은 흑색질의 저배율 도면을 보여주는 것이다. 스케일 바: 100 um. 이들 데이터는 병변이 없는 뇌로부터의 것으로서, 이는 다수의 내인성 TH-양성 도파민성 뉴런 (녹색)을 나타낸다. RFP-양성 세포는 흑색질 내에서 (파선으로 대략적으로 표시) 뿐만 아니라, 주변 영역에서도 검출되었다.
도 8I는 흑색질 중 TH- 및 RFP-양성 세포체의 확대도를 보여주는 것이다. RFP 및 TH 이중 양성 세포체는 z-스택 영상의 직교 도면으로 강조표시되어 있고, 이는 각 패널에서 주요 영상의 우측 및 하단에 첨부되어 있다. 화살촉 표시는 TH 및 RFP, 둘 모두에 대하여 양성인 뉴런 돌기를 가리킨다. 스케일 바: 10 um.
도 8J는 흑색질 및 주변 영역, 둘 모두에서 RFP 및 TH, 둘 모두를 발현하는 전환된 도파민성 뉴런과 비교한 전체 RFP-양성 세포의 정량화를 보여주는 것이다. 데이터는 마우스 3마리로부터의 것이다.
도 9A-9I는 흑색질부터 선조체까지 예시적인 PTB 넉다운-유도 도파민성 뉴런의 돌출부의 특징화를 보여주는 것이다. (A)는 마우스 중뇌 중 예시적인 전환된 뉴런으로부터의 RFP-양성 섬유의 개요이며, 이는 등측부터 복측까지 3개의 연속 절편을 보여주는 것이다. 상단의 흰색 화살표 표시: 격막핵; 중간 검은색 화살표 표시: 측중격핵; 하단 노란색 화살표 표시: 후각 결절. (B)는 DAT (도파민 수송체), VMAT2 (소포 모노아민 수송체 2), En1 (엔그레일드 호메오박스 1) 및 Lmx1a (LIM 호메오박스 전사 인자 1 알파)를 비롯한, 도파민성 뉴런의 마커에 대한 전환된 세포의 염색을 보여주는 것이다. 스케일 바: 20 um. (C)는 흑색질 중 TH 및 RFP 양성 세포체를 보여주는 것이다. 화살표 표시는 RFP 및 TH 이중 양성 세포를 가리킨다. (D)는 RFP-양성 섬유의 선조체으로의 돌출부를 보여주는 것으로, 상기 섬유 중 일부는 또한 TH에 대해서도 양성으로 염색되었다. 스케일 바: 20 um (좌측); 10 um (우측). (E)는 조기에 AAV-shPTB로 처리된 마우스 내로의 형광성 역행 축삭돌기 추적 비드의 선조체 주사에 대한 방식을 보여주는 것이다. (F)는 역행 비드를 이용한 흑색질 중 TH/RFP-양성 세포의 표지화를 보여주는 것이다. 화살촉 표시는 비드 표지된 전환된 세포를 가리키고, 화살표 표시는 비드 표지된 내인성 도파민성 뉴런 (TH는 양성이되, RFP는 음성)을 가리킨다. 스케일 바: 20 um. (G) RFP-양성 돌출부에 의해 신경지배된 선조체의 저배율 도면을 보여주는 것이다. 스케일 바: 300 um. 삽입된 패널은 상이한 영역 중의 RFP-양성 돌출부의 확대된 도면을 보여주는 것이다. 스케일 바: 15 um. (H)는 RFP-양성 섬유 중 일부는 TH와 공동 염색을 보인 반면 (화살촉 표시), 그 나머지는 TH-음성인 (화살표 표시) 영상을 보여주는 것이다. 스케일 바: 5 um. (I)는 야생형 마우스 뇌에서의 AAV-shPTB의 형질도입 후 전체 FP-양성 섬유 및 RFP/TH-이중 양성 섬유의 밀도 정량화를 보여주는 것이다. 데이터는 마우스 3마리로부터 영상에 기초하는 것이다.
도 10은 파킨슨병을 앓는 마우스 모델 구축을 도시한 것이다. 상단 패널은 6-OHDA를 마우스의 흑색질 내로 주사한 후, 이어서, 마우스 내를 고정 및 염색시키는 것에 관한 타임라인을 보여주는 것이다. 하단의 형광성 영상은 6-OHDA 주사를 맞지 않은 마우스로부터의 선조체 (좌측), 및 6-OHDA 주사를 맞은 마우스로부터의 선조체 (우측)의 면역염색 결과를 보여주는 것이다. 좌측 영상과 우측 영상의 비교를 통해, 6-OHDA 주사 후, 병변이 있는 섬유속을 따라 진행되는 TH-양성 섬유의 손실, 및 GFAP-양성 성상세포의 증가가 입증된다.
도 11A-11E는 화학적으로 유도된 마우스 PD 모델에서의 흑색질 선조체 경로의 복원 및 PD 표현형 구제를 예시하는 것이다. (A)는 흑색질 (SN)에서의 6-OHDA-유도 병변, 이어서, AAV-PTB를 이용한 리프로그래밍 및 행동 분석에 대한 실험 스케줄의 개략도이다. (B)는 중뇌 중 6-OHDA-유도 병변 중 TH-양성 세포체 (상단, 스케일 바: 500 um) 및 선조체 중 TH-염색된 섬유속 (하단, 스케일 바: 500 um)의 편측 손실 유도를 보여주는 것이다. (D)는 GFAP-양성 성상세포 집단이 병변이 있는 흑색질에서 현저히 증가하였다는 것을 보여주는 것이다. 스케일 바: 50 um. (D)는 대조군 (상단)과 6-OHDA 병변이 있는 흑색질 (중간) 사이의 비교를 보여주는 것으로서, 이는 AAV-shPTB에 의한 전환된 도파민성 뉴런 (황색, 화살표 표시)의 증가를 입증하는 보이고 (하단), 여기서, 별표 표시는 내인성 도파민성 뉴런 (녹색)을 나타낸다. 스케일 바: 50 um. (E)는 선조체에서 재생된 RFP 및 TH 양성 섬유의 예시적인 영상을 보여주는 것이다. 스케일 바: 50 um (상단); 10 um (하단).
도 11F-11J는 shPTB-전환된 뉴런이 흑색질에서 손실된 도파민성 뉴런 중 상당부를 보충하였다는 것을 입증하는 예시적인 결과를 보여주는 것이다. (F)는 TH에 대해 염색된 병변이 없는 흑색질의 저배율 도면을 보여주는 것이다. 스케일 바: 80 um. (G)는 6-OHDA에 의한 병변이 있고, AAV-shPTB가 형질도입된 흑색질을 보여주는 것이다. 스케일 바: 80 um. 6-OHDA에 의한 병변은 있지만, 공 바이러스 벡터로 처리된 흑색질은 병변은 있지만, 비처리된 흑색질 (제시되지 않음)과 동일한 것으로 보였다. (H)는 흑색질에서 TH를 공동 발현하는 RFP-양성 세포의 확대도를 보여주는 것이다. 스케일 바: 10 um. 두 RFP/TH-이중 양성 세포체는 z-스택 영상의 직교 도면으로 강조표시되어 있고, 이는 각 패널에서 주요 영상의 우측 및 하단에 첨부되어 있다. (I)는 흑색질 중 RFP/TH-이중 양성 돌기 (화살촉 표시) 또는 RFP-양성, TH-음성 돌기 (화살표 표시)의 영상을 보여주는 것이다. 스케일 바: 10 um. (J)는 병변이 없는 쪽 부위 내의 도파민성 뉴런 (청색), 공벡터로 처리된, 병변이 있는 쪽 부위 내의 나머지 내인성 도파민성 뉴런 집단 (녹색), 및 병변이 있는 쪽 부위 내의 전환된 RFP-양성 도파민성 뉴런 (오렌지색)의 정량화를 보여주는 것이다. 데이터는 각각이 AAV-shPTB 또는 공벡터로부터 처리된 마우스 3마리로부터의 것인 두 세트의 영상으로부터의 것이다.
도 11K는 AAV-shPTB 형질도입 후 6-OHDA 병변이 있는 뇌 중 전체 RFP-양성 섬유 및 RFP/TH-이중 양성 섬유의 밀도를 정량화하는 그래프를 보여주는 것이다.
도 11L은 병변이 없는 마우스, 및 AAV-shPTB가 형질도입된 병변이 있는 마우스의 선조체 중 전체 TH-양성 섬유의 광학 밀도를 정량화하는 그래프를 보여주는 것으로서, 이는 병변이 있는 뇌에서 TH-양성 도파민성 뉴런이 회복되었음을 나타낸다. 데이터는 각 군당 마우스 3마리에 대한 분석에 기초한 것이다.
도 12A-12C는 6-OHDA 처리, AAV-shPTB 리프로그래밍된 마우스에서 행동이 WT 수준으로 회복되었음을 입증하는 것이다. (A)는 모의-처리, 6-OHDA-처리, AAV-shPTB 리프로그래밍된 마우스에서의 행동 회복을 보여주는 것이다. 암페타민 (좌측, 마우스 6마리로부터의 데이터에 기초) 또는 아포모르핀 (우측, 마우스 7마리로부터의 데이터에 기초)에 의해 회전을 유도하였다. (B) 및 (C)는 모의-처리, 6-OHDA-처리, AAV-shPTB 리프로그래밍된 마우스에서의 시간 경과에 따른 행복 회복 분석을 도시한 것이다. 아포모르핀에 의해 회전을 유도하였고 (B), 편측 병변이 있는 마우스에서의 동측성 터치 비율(%) (C)을 비록하였다. n = 각 군당 분석된 마우스 마리수. 통계적 결과는 평균 ± SEM로 제시되었고; 유의차는 사후 터키 검정과 함께 ANOVA에 기초한 p 값으로 표시되어 있다. * p<0.05; **p<0.01.
도 13A는 PTB를 표적화하는 효율적인 안티센스 올리고뉴클레오티드에 대한 스크린을 보여주는 것이다. 상이한 ASO로 처리된 마우스 성상세포에서 웨스턴 블롯에 의해 PTB 수준을 조사하였다. ASO 4#는 실험 휴식을 위해 선택하였다.
도 13B는 예시적인 PTB-ASO가 마우스 성상세포로부터 뉴런을 유도하였다는 것을 보여주는 것으로서, 여기서, 뉴런은 Tuj1 및 MAP2 (좌측), NSE 및 NeuN (중간) 뿐만 아니라, 도파민성 뉴런 마커 TH (우측)에 대해서 양성으로 염색되었다. GFP-ASO로 처리된 마우스 성상세포는 동일한 배양 조건하에서 뉴런 마커 중 어느 것에 대해서도 양성 염색을 보이지 않았다 (제시되지 않음). 스케일 바: 20 um.
도 13C는 GFP-ASO가 아닌 PTB-ASO가 6-OHDA 병변이 있는 마우스에서 아포모르핀에 의해 유도된 회전 행동을 구제하였다는 것을 보여주는 것이다. 통계적 결과는 평균 ± SEM로 제시되었고; * p<0.01 (비대응 스튜던츠 t 검정에 기초).
도 14A-14D는 예시적인 PTB-ASO가 마우스 중뇌에서 성상세포의 뉴런 전환을 유도하였다는 것을 보여주는 것이다. (A)는 생체내에서 성상세포를 표지하고, 추적하기 위해 사용되는 트랜스제닉 마우스의 개략도이다. (B)는 타목시펜 처리 후 3주째, 트랜스제닉 GFAP-CreER:Rosa-tdTomato 마우스의 중뇌에서 tdTomato-표지된 세포 중 어느 것도 NeuN에 대해서는 양성으로 염색되지 않았지만 (좌측), 그들 대부분은 GFAP 양성이었다 (우측)는 것을 보여주는 것이다, 스케일 바: 50 um. (C)는 tdTomato-표지된 세포 중 일부가 중뇌에서 PTB-ASO 주사 후 8주째 NeuN 양성이 되었다는 것을 보여주는 것이다. 스케일 바: 20 um. (D)는 예시적인 PTB-ASO 전환된 뉴런이 도파민성 뉴런 마커 TH에 대하여 양성으로 염색되었다는 것을 보여주는 것이다. 스케일 바: 15 um.
도 15A-F는 AAV-shPTB 처리가 선조체 도파민 수준을 유의적으로 회복시켰다는 것을 보여주는 것이다. (A)는 2개의 상이한 용량의 "스파이크-인(spike-in)" 도파민"이 야생형 뇌 중의 도파민 범위 내에서 첨가된 후, HPLC에 의해 검출된, 뇌 중 도파민 수준을 도시한 그래프를 보여주는 것이다. (B)는 상이한 수준으로 첨가된 "스파이크-인" 도파민에 의해 작성된 표준 곡선을 보여주는 것이다. (C) 및 (D)는 병변이 없는 뇌 양측 선조체 도파민 수준 비교 (C) 및 편측 6-OHDA 병변에 대한 반응으로 선조체 도파민의 감소 (D)를 도시한 것이다. (E)는 동측성 흑색질에서 AAV-shPTB 주사 후 선조체 도파민의 유의적인 회복을 보여주는 것이다. (F)는 명시된 상이한 조건하에서 선조체 도파민 수준을 정량화하는 그래프이다. n: 각 군에서 분석된 마우스 마리수. 유의차는 사후 터키 검정과 함께 ANOVA에 기초한 p 값으로 표시되어 있다.
도 16A는 전환된 뉴런이 표현형 회복을 직접 담당한다는 것을 입증하는 화학유전학적 접근법을 개략적으로 도시한 개략도이다.
도 16B는 AAV-hM4Di-shPTB 주사 전후 뿐만 아니라, CNO 처리 및 약물 중단 후 3일째 병변이 있는 마우스에서 실린더 테스트를 수행한 결과, 우선적으로 동측성 터치를 보인 것으로 나타난, 화학유전학적 실험의 행동 결과를 정량화한 그래프이다. 병변이 없는 마우스는 대조군으로서의 역할을 하였다. n = 각 군에서 분석된 마우스.
도 17A-F는 전환된 도파민성 뉴런에 의한 흑색질-선조체 경로의 복원을 도시하는 것이다. (A)는 흑색질에서 선조체에 치르는 RFP-양성 돌출부의 영상을 보여주는 것이다. 개략도는 수평 단면의 등측-배측 수준을 보여주는 것이다. 스케일 바: 100 um. CPu, 미상핵-조가비핵; GP, 담창구; IC, 내섬유막; SN, 흑색질. (B)-(E)는 상이한 뇌 영역의 더 높은 고배율 도면을 보여주는 것이다. 스케일 바: 25 um. (F)는 담창구에서 TH (화살촉 표시)와 공동 염색된 RFP-양성 섬유 중 일부에 대한 영상을 보여주는 것이다. 화살표 표시는 내인성 도파민성 섬유를 가리킨다. 스케일 바: 5 um.
상세한 설명
본원 및 첨부에서 사용되는는 바, "하나"("a," "an") 및 "그"라는 단수 형태는 문맥상 달리 분명하게 명시되지 않는 한, 복수의 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "한 억제제"라고 언급하는 것은 복수의 억제제를 포함하고, "그 억제제"라고 언급하는 것은 당업자에게 공지된 하나 이상의 작용제 및 그의 등가물 등에 대해 언급하는 것을 포함한다.
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또한, 달리 언급되지 않는 한, "및"이라고 사용하는 것은 "및/또는"을 의미한다. 유사하게, "포함하다(comprise)," "포함하다(comprises)," "포함하는(comprising)," "포함하다(include)," "포함하다(includes)," "포함하는(including)"은 상호교환적이며, 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
다양한 실시양태의 설명에서 "포함하는"이라는 용어를 사용할 경우, 당업자는 일부 구체적인 경우, 실시양태가 "본질적으로 ~으로 구성된," 또는 "~으로 구성된"이라는 표현을 사용하여 기술될 수 있다는 것도 이해할 것이라는 것도 추가로 이해하여야 한다.
"성상세포"는 뇌 및 척수 중에 존재하는 특징적인 별 형상의 신경교 세포를 지칭할 수 있다. 당업자에게 자명한 바와 같이, 성상세포는 그의 별 형상, 신경교 섬유질 산성 단백질 (GFAP) 및 알데히드 데히드로게나제 1 패밀리 구성원 L1 (ALDH1L1), 흥분성 아미노산 수송체 1/글루타메이트 아스파르테이트 수송체 (EAAT1/GLAST), 글루타민 신테타제, S100 베타, 또는 흥분성 아미노산 수송체 1/글루타메이트 수송체 1 (EAAT2/GLT-1)과 같은 마커 발현, 내피 세포와 함께 혈액-뇌 장벽에 관여 전달물질 흡수 및 방출, 세포외 공간의 이온 농도 조절, 뉴런 손상에의 반응, 및 신경계 손상에의 관여, 및 주변 뉴런의 대사성 지원을 특징화될 수 있다. 본 개시내용의 특정 실시양태에서, 성상세포는 신경교 섬유질 산성 단백질 (GFAP), 알데히드 데히드로게나제 1 패밀리 구성원 L1 (ALDH1L1), 또는 그 둘 모두를 발현하는, 신경계 중의 비-뉴런 세포를 지칭할 수 있다. 특정 실시양태에서, 성상세포는 신경교 섬유질 산성 단백질 (GFAP) 프로모터-구동된 트랜스진 (예컨대, 적색 형광성 단백질 (RFP), Cre 레콤비나제)을 발현하는 신경계 중의 비-뉴런 세포를 지칭할 수 있다.
"POU 도메인, 클래스 3, 전사 인자 2" ("POU3F2") 또는 "Oct-7"로도 명명되는, "BRN2 전사 인자" 또는 "뇌-2 전사 인자"는, 짧은 a-나선형 폴드를 포함하는 링커를 통해 연결된 약 75개의 아미노산으로 이루어진 N-말단 POU-특이적 도메인, 및 약 60개의 아미노산으로 이루어진 C-말단 POU-호메오 도메인으로 구성된 DNA-결합 POU 도메인을 갖고, 주로 중추 신경계에서 발현될 수 있는, 클래스 III POU- 도메인 전사 인자를 지칭할 수 있다. BRN2는 중추 신경계에서 발현될 수 있고, 전신경 염기성-나선-루프-나선 전사 인자 Mash1과 상호작용하여 신경발생, 예컨대, 뉴런 분화의 측면을 조절할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 세포를 본 개시내용의 조성물과 "접촉시키는"이라는 용어는 "접촉된" 세포를 생성하기 위해 조성물 (예컨대, 화합물, 핵산, 바이러스 벡터 등)을 그가 세포와 접촉할 수 있도록 하는 위치에 배치하는 것을 지칭한다. 접촉시키는 것은 임의의 적합한 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 세포 배양물에 화합물을 첨가함으로써 접촉이 이루어진다. 접촉은 또한 조성물이 표적화된 세포 타입에 "접촉"하도록 하는 체내 위치에 조성물을 주사하거나, 또는 그를 전달함으로써 달성될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "분화," 또는 "분화하다," 또는 "전환하다" 또는 "분화를 유도하는"이라는 용어는 상호교환적으로 사용되며, 디폴트 세포 타입 (유전자형 및/또는 표현형)을 비-디폴트 세포 타입 (유전자형 및/또는 표현형)으로 변경하는 것을 지칭한다. 따라서, "성상세포 세포에서 분화를 유도하는"이라는 것은 상기 세포가 그의 형태를 성상세포로부터 뉴런 세포 타입으로 변경하고/거나 (즉, 유전자 분석, 예컨대, 마이크로어레이에 의해 측정되는 바, 유전자 표현형의 변화), 표현형을 변경하는 것 (즉, 단백질 발현 변화)을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, "신경교 세포"라는 용어는 일반적으로 중추 신경계 (예컨대, 뇌 및 척수) 및 말초 신경계 중의 지지 세포 타입을 지칭할 수 있다. 일부 실시양태에서, 뉴런과 달리, 신경교 세포는 전기 자극을 전도하거나, 또는 활동 전위를 보이거나 하지 않는다. 일부 실시양태에서, 신경교 세포는 서로 또는 시냅스 연결 또는 전기적 신호를 통해 뉴런과 정보를 전달하지 않는다. 신경계에서, 또는 시험관내 배양 시스템에서, 신경교 세포는 뉴런을 둘러싸고, 뉴런을 지지하고, 뉴런 사이를 절연시킬 수 있다. 신경교 세포의 비제한적인 예로는 희소돌기아교세포, 성상세포, 뇌실막 세포, 슈반 세포, 소교세포, 및 위성 세포를 포함한다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 "iRNA," "RNAi 작용제," "iRNA 작용제," "RNA 간섭제"라는 용어는 RNA를 함유하는 작용제로서, RNA-유도 침묵화 복합체 (RISC) 경로를 통해 RNA 전사체의 표적화된 절단을 매개하는 작용제를 지칭한다. iRNA는 RNA 간섭 (RNAi)으로 공지된 프로세스를 통해 mRNA의 서열-특이적 분해를 지시한다. iRNA는 세포, 예컨대, 대상체, 예컨대, 포유동물 대상체 내의 세포에서 PTB의 발현을 조정, 예컨대, 억제시킨다. RNAi로는 제한없이, "작은 간섭 RNA (siRNA)," "엔도리보뉴클레아제-제조 siRNA (e-siRNA)," "짧은 헤어핀 RNA (shRNA)," 및 "작은 일시적으로 조절되는 RNA (stRNA)"; "다이스(diced) siRNA (d-siRNA)," 및 적어도 하나의 우라실 염기를 포함하는 압타머, 올리고뉴클레오티드 및 다른 합성 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 RNAi 작용제는 벡터, 예컨대, 그러나, 제한 없이, 복제 결함 또는 복제능이 있는 바이러스 벡터 (예컨대, 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 감마레트로바이러스 벡터 등)에 의해 전달된다.
"마이크로RNA" 또는 "miRNA"는 적어도 부분적으로 상보적인 핵산 서열 (mRNA)에 결합하고, 전사 후 수준에서 표적 mRNA의 발현을 음성적으로 조절하는 비-코딩 핵산 (RNA) 서열을 지칭한다. 마이크로RNA는 전형적으로 이중-가닥, 헤어핀, 루프 구조를 갖는 "전구체" miRNA로부터 "성숙한" 형태로 프로세싱된다. 전형적으로, 성숙한 마이크로RNA 서열의 길이는 약 19-25개의 뉴클레오티드 길이이다.
"miR-9"는 유전자 조절에 관여하고, 초파리(Drosophila) 및 마우스부터 인간까지 고도로 보존되는 짧은 비-코딩 RNA 유전자이다. 성숙한 ~21 nt miRNA는 다이서(Dicer) 효소에 의해 헤어핀 전구체 서열로부터 프로세싱된다. miR-9는 발생 중인 뇌 및 성체 척추동물 뇌에서 가장 고도로 발현되는 마이크로RNA 중 하나일 수 있다. 중요한 전사 조절인자, 예컨대, FoxG1, Hes1 또는 Tlx는 뉴런 전구체 상태를 제어하는 유전자망의 중심에 그를 배치하는, miR-9의 직접적인 표적이 될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 본원에서 사용되는 바, "뉴런" 또는 "뉴런 세포"라는 용어는 당업자가 이해하고 있는 일반적인 의미를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 뉴런은 전기적 신호 (예컨대, 막 전위 방전) 및 화학적 신호 (예컨대, 신경전달물질의 시냅스 전달)를 통해 정보를 받고, 프로세싱하고, 전달할 수 있는, 전기적으로 흥분될 수 있는 세포를 지칭할 수 있다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 뉴런 사이에 신호전달된 (예컨대, 신경전달물질의 방출 및 인식에 기초한) 화학적 신호는 시냅스로 불리는 분화된 연결부를 통해 발생할 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "성숙한 뉴런"이라는 용어는 분화된 뉴런을 지칭할 수 있다. 일부 실시양태에서, 뉴런은 그가 성숙한 뉴런, 예컨대, 미세소관-연합 단백질 2 (MAP2) 및 뉴런 핵 (NeuN), 뉴런 특이적 에놀라제 (NSE), 160 kDa 신경필라멘트 중간 쇄, 200 kDa 신경필라멘트 중쇄, 시냅스후 치밀질 단백질 95 (PDS-95), 시냅신 I, 시냅토피신, 글루타메이트 데카르복실라제 67 (GAD67), 글루타메이트 데카르복실라제 67 (GAD65), 파르브알부민, 도파민- 및 cAMP-조절 뉴런 인단백질 32 (DARPP32), 소포 글루타메이트 수송체 1 (vGLUT1), 소포 글루타메이트 수송체 2 (vGLUT2), 아세틸콜린, 및 티로신 히드록실라제 (TH) 중 하나 이상의 마커를 발현한다면, 성숙한 뉴런일 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "기능성 뉴런"이라는 용어는 화학적 또는 전기적 신호를 통해 정보를 보내거나, 또는 받을 수 있는 뉴런을 지칭할 수 있다. 일부 실시양태에서, 기능성 뉴런은 흥분성 (예컨대, 활동 전위, 예컨대, 세포막을 통한 전압 또는 막 전위의 빠른 상승 후, 이어지는 하락을 나타낼 수 있는 능력), 다른 뉴런과의 시냅스 연결 형성, 시냅스전 신경전달물질 방출, 및 시냅스후 반응 (예컨대, 흥분성 시냅스후 전류 또는 억제성 시냅스후 전류)을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 정상 신경계에 존재하는 성숙한 뉴런의 하나 이상의 기능적 특성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 기능성 뉴런은 시냅신, 시냅토피신, 글루타메이트 데카르복실라제 67 (GAD67), 글루타메이트 데카르복실라제 67 (GAD65), 파르브알부민, 도파민- 및 cAMP-조절 뉴런 인단백질 32 (DARPP32), 소포 글루타메이트 수송체 1 (vGLUT1), 소포 글루타메이트 수송체 2 (vGLUT2), 아세틸콜린, 티로신 히드록실라제 (TH), 도파민, 소포 GABA 수송체 (VGAT), 및 감마-아미노부티르산 (GABA)을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 기능성 뉴런의 하나 이상의 마커를 그가 발현하는 것을 특징으로 한다.
본원에서 사용되는 바, "비-뉴런 세포"라는 용어는 뉴런이 아닌 임의 타입의 세포를 지칭할 수 있다. 예시적인 비-뉴런 세포는 뉴런 계통 이외의 다른 세포 계통 (예컨대, 조혈 계통)의 세포이다. 일부 실시양태에서, 비-뉴런 세포는 뉴런이 아닌 뉴런 계통의 세포, 예를 들어, 신경교 세포이다. 일부 실시양태에서, 비-뉴런 세포는 뉴런이 아닌 체세포, 예컨대, 그러나, 제한 없이, 신경교 세포, 성체 1차 섬유모세포, 배아 섬유모세포, 상피 세포, 멜라노사이트, 케라티노사이트, 아디포사이트, 혈액 세포, 골수 기질 세포, 랑게르한스 세포, 근육 세포, 직장 세포, 또는 콘드로사이트이다. 일부 실시양태에서, 비-뉴런 세포는 비-뉴런 세포주, 예컨대, 그러나, 제한 없이, 신경교모세포종 세포주, Hela 세포주, NT2 세포주, ARPE19 세포주, 또는 N2A 세포주로부터의 것이다. "세포 계통" 또는 "계통"은 수정된 배아로부터 조직 또는 기간의 발생사를 지칭할 수 있다. "뉴런 계통"은 예컨대, 그러나, 제한 없이, 신경 줄기 세포 (신경상피 세포, 방사 신경교 세포), 신경 전구체 (예컨대, 중간 뉴런 전구체), 뉴런, 성상세포, 희소돌기아교세포, 및 소교세포와 같은, (신경발생으로 공지된) 이러한 과정을 따라 진행되는 다양한 단계를 포함하는, 신경 줄기 세포로부터 성숙한 뉴런으로의 발생사를 지칭할 수 있다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드"라는 용어는 단일- 또는 이중-가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 및 그의 중합체를 지칭할 수 있다. 상기 용어는 공지된 뉴클레오티드 유사체 또는 변형된 백본 잔기 또는 연결를 함유하는 핵산으로서, 합성, 자연적으로 발생된 것, 및 비-자연적으로 발생된 것이고, 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 가지며, 참조 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 것을 포함할 수 있다. 상기 유사체의 예로는 제한없이, 포스포로티오에이트, 포스포라미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오티드, 잠금 핵산 (LNA), 및 펩티드-핵산 (PNA)을 포함한다.
"희소돌기아교세포"는 뉴런 축삭돌기를 둘러쌈으로써 중추 신경계에서 축삭돌기를 지지하고, 절연시키는 미엘린초를 생성할 수 있는 신경교 세포 타입을 지칭할 수 있다. 희소돌기아교세포는 또한 PDGF 수용체 알파 (PDGFR-α), SOX10, 신경/신경교 항원 2 (NG2), Olig 1, 2, 및 3, 희소돌기아교세포 특이적 단백질 (OSP), 수초 염기성 단백질 (MBP), 또는 수초 희소돌기아교세포 당단백질 (MOG)을 그가 발현하는 것을 특징으로 할 수 있다.
"폴리피리미딘 트랙 결합 단백질" 또는 "PTB" 및 그의 동족체 신경 PTB (nPTB) 둘 모두 편재성 RNA-결합 단백질이다. PTB는 또한 폴리피리미딘 트랙-결합 단백질 1로 명명될 수 있고, 인간에서, PTBP1 유전자에 의해 코딩된다. PTBP1 유전자는 편재적으로 발현되는 이종성 핵 리보뉴클레오단백질 (hnRNP)의 서브패밀리에 속한다. hnRNP는 RNA-결합 단백질이고, 이종성 핵 RNA (hnRNA)와 복합체를 형성한다. 상기 단백질은 핵에서 프리-mRNA와 회합되고, 프리-mRNA 프로세싱 및 다른 측면의 mRNA 대사 및 수송에 영향을 주는 것으로 보인다. PTB는 RNA에 결합하는 유사-RNA 인식 모티프 (RRM) 4개 반복부를 가질 수 있다. 그의 광범위한 발현과 일관되게, PTB는 다수의 선택적 스플라이싱 이벤트 억제에 기여할 수 있다. PTB는 피리미딘이 풍부한 환경 내에 위치하고, 대개는 구성적 엑손 및 선택적 엑손, 둘 모두의 3' 스플라이스 부위 상류에 위치하는 폴리피리미딘 트랙과 회합되는, 짧은 RNA 모티프, 예컨대, UCUU 및 UCUCU를 인시할 수 있다. 일부 경우에서, PTB에 대한 결합 부위는 엑손 서열 및 조절된 엑손 하류의 인트론내 서열도 포함할 수 있다. PTB에 의해 조절된 대부분의 선택적 스플라이싱 시스템에서, 억제는 선택적 엑손 주변의 다중 PTB 결합 부위와 PTB의 상호작용을 통해 달성될 수 있다. 일부 경우에서, 억제는 단일 PTB 결합 부위를 포함할 수 있다. PTB에 의한 스플라이싱 억제는 PTB 및 U2AF65 사이의 직접적인 경쟁에 의해 일어날 수 있고, 이는 결과적으로는 분지점에서의 U2 snRNP의 어셈블리를 막을 수 있다. 일부 경우에서, PTB에 의한 스플라이싱 억제는 선택적 엑손의 양측 모두에 위치하는 PTB 결합 부위를 포함할 수 있고, RNA 밖으로 루프를 형성하여 스플라이스 부위가 스플라이싱 기구에 접근하지 못하게 만드는, PTB 분자 사이의 협동적인 상호작용으로부터 발생할 수 있다. PTB에 의한 스플라이싱 억제는 또한 선택적 엑손을 커버하고, 그의 인식을 막는 억제 웨이브를 생성할 수 있는 고친화성 결합 부위로부터의 PTB의 다량체화 또한 포함할 수 있다.
PTB는 비-뉴런 세포에서 광범위하게 발현될 수 있는 반면, nPTB는 뉴런으로 제한될 수 있다. PTB 및 nPTB는 뉴런 분화 동안 프로그래밍된 스위치를 경험할 수 있다. 예를 들어, 도 1에 도시된 바와 같이, 뉴런 분화 동안, PTB는 뉴런 유도 단계에서 점진적으로 하향조절되고, 동시에 또는 결과적으로, nPTB 수준은 점진적으로 최고 수준까지 상향조절된다. 추후, 뉴런 분화가 뉴런 성숙화 단계에 진입하였을 때, nPTB 수준은 그의 초기 상승 이후에 감소를 경험하고, 이어서, 세포가 성숙한 뉴런으로 발생할 때, 뉴런 분화 동안 그의 최고 수준과 비교하여 상대적으로 낮은 수준으로 복귀하게 된다.
PTB의 서열은 공지되어 있으며 (예컨대, 문헌 [Romanelli et al. (2005) Gene, August 15:356:11-8]; [Robinson et al., PLoS One. 2008 Mar. 12; 3(3):e1801. doi:10.1371/journal.pone.0001801]; [Makeyev et al., Mol. Cell (2007) August 3; 27(3):435-48] 참조); 따라서, 당업자는 본 개시내용의 방법을 수행하기 위하여 PTB의 발현을 조정, 예컨대, 감소 또는 억제시키는 안티센스, miRNA, siRNA 분자 등을 디자인하고, 구축할 수 있다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 "단백질," "펩티드," 및 "폴리펩티드"라는 용어는 아미노산 중합체, 또는 2개 이상의 상호작용 또는 결합된 아미노산 중합체로 이루어진 세트를 지칭할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "프로모터"라는 용어는 핵산의 전사를 지시하는 핵산 제어 서열의 어레이를 지칭할 수 있다. 본원에서 사용되는 바, 프로모터는 전사 출발 부위 근처에 필요한 핵산 서열, 예컨대, 폴리머라제 II 타입 프로모터의 경우, TATA 요소를 포함한다. 프로모터는 또한 임의적으로 전사 출발 부위로부터 수천 개의 염기쌍 거리만큼 떨어져 위치할 수 있는 원위 인핸서 또는 리프레서 요소를 포함한다. 프로모터는 구성적 및 유도성 프로모터를 포함한다. "구성적" 프로모터는 대부분의 환경 및 발생 조건하에서 활성을 띨 수 있는 프로모터이다. "유도성" 프로모터는 환경 또는 발생 조절하에 활성을 띨 수 있는 프로모터이다. "작동가능하게 연결된"이라는 용어는 핵산 발현 제어 서열 (예컨대, 프로모터, 또는 전사 인자 결합 부위의 어레이)과 제2 핵산 서열 사이의 기능적 결합으로 여기서, 발현 제어 서열은 제2 서열에 상응하는 핵산의 전사를 지시하는 것인 상기와 같은 기능적 결합을 지칭할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "리프로그래밍" 또는 "전환-분화"라는 용어는 세포를 만능 줄기 세포 특징을 보이는 세포로 탈분화시키는 중간 과정 없이, 상이한 타입의 세포 (예컨대, 섬유모세포 세포)로부터 특정 계통의 세포 (예컨대, 뉴런 세포)를 생성하는 것을 지칭할 수 있다. "만능"이란, 모든 계통의 세포체 또는 체세포를 형성할 수 있는 세포 (즉, 완전 배아)의 능력을 지칭할 수 있다. 예시적인 "만능 줄기 세포"는 배아 줄기 세포 및 유도 만능 줄기 세포를 포함할 수 있다.
상호교환적으로 사용되는 "대상체" 및 "환자"라는 용어는 명시되는 경우를 제외하면, 포유동물 예컨대, 인간 및 비-인간 영장류 뿐만 아니라, 토끼, 래트, 마우스, 염소, 돼재, 및 다른 포유동물 종을 지칭할 수 있다. 상기 용어는 대상체가 특정 질환의 진단을 받은 대상체라는 것을 반드시 명시하는 것은 아니지만, 대신 의학적 감시하에 있는 개체를 지칭할 수 있다. 예를 들어, 개시된 방법 및 조성물이 도움이 되는 포유동물 종으로는 영장류, 예컨대, 유인원, 침팬지, 오랑우탄, 인간, 원숭이, 가축 (예컨대, 애완동물), 예컨대, 개, 고양이, 기니아 피그, 햄스터, 베트남 포트 벨리 돼지, 토끼, 및 흰담비; 농장용 가축, 예컨대, 소, 버펄로 바이슨스, 말, 당나귀, 돼지, 양, 및 염소; 전형적으로는 동물에서 볼 수 있는 외래종 동물, 예컨대, 곰, 사자, 호랑이, 표범, 코끼리, 하마, 코뿔소, 기린 영양, 나무늘보, 가젤, 얼룩말, (뿔이 휘어져 있는 큰) 영양, 프레리 도그, 코알라 곰, 캥거루 주머니쥐, 너구리, 판다, 하이에나, 물개, 바다 사자, 코끼리 물범, 수달, 알락돌고래, 돌고래, 및 고래를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
"벡터"는 또 다른 핵산을 세포 내로 수송할 수 있는 핵산이다. 벡터는 그가 적절한 환경에 존재할 때, 벡터가 보유하는, 하나 이상의 유전자, 또는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 마이크로RNA에 의해 코딩되는 단백질 또는 단백질들의 발현을 지시할 수 있다.
"바이러스 벡터"는 또 다른 핵산을 세포 내로 수송할 수 있는 바이러스-유래된 핵산이다. 바이러스 벡터는, 적절한 환경에 존재할 때, 벡터에 의해 운반되는, 하나 이상의 유전자에 의해 코딩되는 단백질 또는 단백질들, 또는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 마이크로RNA의 발현을 지시할 수 있다. 바이러스 벡터의 예로는레트로바이러스, 아데노바이러스, 렌티바이러스 및 아데노-연관 바이러스 벡터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 개시내용은 폴리피리미딘 트랙 결합 단백질 (PTB)의 넉다운에 의해 비-뉴런 포유동물 세포 또는 성상세포를 기능성 뉴런으로 전환 또는 분화시키기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 개시내용의 일부 측면은 비-뉴런 세포를 성숙한 뉴런으로 리프로그래밍하는 방법을 제공한다. 예시적인 방법은 비-뉴런 세포를 제공하는 단계, 및 비-뉴런 세포를, 비-뉴런 세포에서 PTB의 발현 또는 활성을 억제시키는 세포-프로그래밍 작용제를 포함하는 조성물과 접촉시켜 비-뉴런 세포를 성숙한 뉴런으로 리프로그래밍하는 단계를 포함한다. 본 방법 및 조성물은 시험관내에서 뿐만 아니라, 생체내에서 직접 뇌에서 세포를 전환시킨다.
본 개시내용의 일부 실시양태에 따라, 인간 비-뉴런 세포가 인간 성인 섬유모세포에서 발현되는 것보다 더 높은 수준으로 miR-9 또는 Brn2를 발현할 때, 인간 비-뉴런 세포에서 PTB의 발현 또는 활성을 억제시키는 단일 세포-프로그래밍 작용제는 비-뉴런 세포를 성숙한 뉴런으로 직접 전환시킬 수 있다. 본 개시내용의 일부 실시양태에서, 단일 세포-프로그래밍 작용제에 의한 비-뉴런 세포에서 뉴런으로의 직접적인 전환이란, 비-뉴런 세포에서 뉴런으로의 전환이 단일 세포-프로그래밍 작용제와의 접촉 이외의 다른 개입은 필요로 하지 않는다는 것을 의미할 수 있다.
예시적인 방법은 인간 성인 섬유모세포에서 발현되는 것보다 더 높은 수준으로 miR-9 또는 Brn2를 발현하는 인간 비-뉴런 세포를 제공하는 단계; 및 비-뉴런 세포를, 인간 비-뉴런 세포에서 PTB의 발현 또는 활성을 억제시키는 세포-프로그래밍 작용제를 포함하는 조성물과 접촉시켜 인간 비-뉴런 세포를 성숙한 뉴런으로 리프로그래밍하는 단계를 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에 따라, 인간 신경교 세포는 인간 성인 섬유모세포에서 발현되는 것보다 더 높은 수준으로 miR-9 또는 Brn2를 발현할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 인간 신경교 세포를 성숙한 뉴런으로 리프로그래밍하는 방법을 제공한다. 예시적인 방법은 리프로그래밍하고자 하는 인간 신경교 세포를 제공하는 단계; 및 인간 신경교 세포를 적어도 1일 동안, 인간 신경교 세포에서 PTB의 발현 또는 활성을 억제시키는 세포-프로그래밍 작용제를 포함하는 조성물과 접촉시켜 인간 신경교 세포를 성숙한 뉴런으로 리프로그래밍하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 성상세포를 성숙한 뉴런으로 리프로그래밍하는 방법을 제공한다. 예시적인 방법은 리프로그래밍하고자 하는 성상세포를 제공하는 단계; 및 성상세포를 적어도 1일 동안, 성상세포에서 PTB의 발현 또는 활성을 억제시키는 세포-프로그래밍 작용제를 포함하는 조성물과 접촉시켜 성상세포를 성숙한 뉴런으로 리프로그래밍하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 성상세포에서 PTB의 발현 또는 활성을 억제시키는 단일 세포-프로그래밍 작용제는 성상세포를 뉴런으로 직접 전환시킬 수 있다.
본 개시내용에 따라, 일부 경우에서, PTB 감소는 다수의 중요한 뉴런 분화 인자를 유도할 수 있다. 예를 들어, 특정 이론으로 제한하고자 하지 않으면서, PTB 및 nPTB는 각자 별개로 뉴런 분화에서 중요할 수 있는 두 별개의, 그러나, 밀접하게 관련된 루프에 관여할 수 있다. 도 1에 도시되어 있는 바와 같이, PTB는 마이크로RNA miR-124가 전사 억제인자 RE1-침묵화 전사 인자 (REST)를 억제시킬 수 있고, 차례로 miR-124 및 다수의 뉴런-특이적 유전자의 유도를 차단할 수 있는 뉴런 유도 루프 (루프 I)를 억제시킬 수 있다. 정상적인 뉴런 분화 프로세스에서, PTB는 점진적으로 하향조절될 수 있고, 따라서, PTB 하향조절은, 전사 활성인자 Brn2 및 miR-9를 포함하는 뉴런 성숙화를 위한 제2 루프(도 1, 루프 II)의 일부인, nPTB의 발현을 유도할 수 있다. 도 1에 도시되어 있는 바와 같이, 루프 II에서, nPTB는 Brn2를 억제시킬 수 있고, 결과적으로, miR-9를 억제시킬 수 있고, 그 결과, miR-9는 nPTB를 억제시킬 수 있다.
본 개시내용의 일부 실시양태에 따라, 비-뉴런 세포에서 miR-9 또는 Brn2의 발현 수준이 비-뉴런 세포에서 PTB의 발현 또는 활성을 억제시키는 세포-프로그래밍 작용제에 의한 비-뉴런 세포에서 성숙한 뉴런으로의 전환에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, 인간 성인 섬유모세포 세포는 miR-9 및 Brn2를 낮은 발현 수준으로 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 인간 성인 섬유모세포 세포에서 PTB의 발현 또는 활성을 억제시키는 단일 작용제는 인간 성인 섬유모세포 세포가, 성숙한 뉴런, 예컨대, NeuN 단백질 또는 성숙한 뉴런의 다른 마커의 발현이 아닌, 뉴런-유사 세포로 분화되는 것, 예컨대, Tuj1 단백질의 발현을 유도할 수 있다. 특정 이론에 의해 제한하고자 하지 않으면서, 일부 실시양태에서, 본 대상 방법 및 조성물은 특히, 비-뉴런 세포의 뉴런으로의 전환을 지시하는 분자적 변화에서 강화 피드백 루프를 생성하는 데 특히 효과적이다. 특정 이론에 의해 제한하고자 하지 않으면서, 먼저 PTB 발현 또는 활성이 외인성 항-PTB 작용제에 의해 하향조절되었을 때, REST 수준이 하향조절될 수 있고, 이는 결국 miR-124 수준을 상향조절시킬 수 있다. 특정 이론에 의해 제한하고자 하지 않으면서, 일부 경우에서, 도 1에 제시된 바와 같이, miR-124는 PTB의 발현을 표적화하고, 억제시킬 수 있기 때문에, 따라서, 상향조절된 miR-124는 세포에서 PTB의 억제를 강화시킬 수 있고; 비록 일부 경우에서, 항-PTB 작용제, 예컨대, PTB에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드는 세포에 존재하고, 단지 일시적으로 활성을 보일 수 있지만, 상기 양성 강화 효과는 장기간 지속될 수 있다.
본 개시내용의 일부 실시양태에 따라, 인간 비-뉴런 세포가 인간 성인 섬유모세포에서 발현되는 것보다 더 높은 수준으로 miR-9 또는 Brn2를 발현할 때, 인간 비-뉴런 세포에서 PTB의 발현 또는 활성을 억제시키는 단일 세포-프로그래밍 작용제는 비-뉴런 세포를 성숙한 뉴런으로 직접 전환시킬 수 있다. 본원에서 제공되는 방법에서 사용될 수 있는 예시적인 인간 비-뉴런 세포는 인간 성인 섬유모세포에서 발현되는 것보다 적어도 2배 더 높은 수준으로 miR-9 또는 Brn2를 발현한다. 일부 실시양태에서, 인간 비-뉴런 세포는 인간 성인 섬유모세포에서 발현되는 것보다 적어도 약 1.2배, 적어도 약 1.5배, 적어도 약 1.6배, 적어도 약 1.8배, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 3배, 적어도 약 3.5배, 적어도 약 4배, 적어도 약 4.5배, 적어도 약 5배, 적어도 약 5.5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 6.5배, 적어도 약 7배, 적어도 약 7.5배, 적어도 약 8배, 적어도 약 8.5배, 적어도 약 9배, 적어도 약 9.5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 11배, 적어도 약 12배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 또는 적어도 약 50배 더 높은 수준으로 miR-9 또는 Brn2를 발현한다. 일부 실시양태에서, 인간 비-뉴런 세포는 인간 성인 섬유모세포에서 발현되는 것보다 약 1.2배, 약 1.5배, 약 1.6배, 약 1.8배, 약 2배, 약 2.5배, 약 3배, 약 3.5배, 약 4배, 약 4.5배, 약 5배, 약 5.5배, 약 6배, 약 6.5배, 약 7배, 약 7.5배, 약 8배, 약 8.5배, 약 9배, 약 9.5배, 약 10배, 약 11배, 약 12배, 약 15배, 약 20배, 또는 약 50배 더 높은 수준으로 miR-9 또는 Brn2를 발현한다.
일부 실시양태에서, 인간 비-뉴런 세포가 인간 성인 섬유모세포에서 발현되는 것보다 더 높은 수준으로 miR-9 및 Brn2를 발현할 때, 인간 비-뉴런 세포에서 PTB의 발현 또는 활성을 억제시키는 단일 세포-프로그래밍 작용제는 비-뉴런 세포를 성숙한 뉴런으로 직접 전환시킬 수 있다. 본원에서 제공되는 방법에서 사용될 수 있는 예시적인 인간 비-뉴런 세포는 인간 성인 섬유모세포에서 발현되는 것보다 적어도 2배 더 높은 수준으로 miR-9 및 Brn2를 발현한다. 일부 실시양태에서, 인간 비-뉴런 세포는 인간 성인 섬유모세포에서 발현되는 것보다 적어도 약 1.2배, 적어도 약 1.5배, 적어도 약 1.6배, 적어도 약 1.8배, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 3배, 적어도 약 3.5배, 적어도 약 4배, 적어도 약 4.5배, 적어도 약 5배, 적어도 약 5.5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 6.5배, 적어도 약 7배, 적어도 약 7.5배, 적어도 약 8배, 적어도 약 8.5배, 적어도 약 9배, 적어도 약 9.5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 11배, 적어도 약 12배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 또는 적어도 약 50배 더 높은 수준으로 miR-9 및 Brn2를 발현한다.
일부 실시양태에서, 인간 비-뉴런 세포가 인간 성인 섬유모세포에서 발현되는 것보다 더 높은 수준으로 내인성 miR-9 또는 내인성 Brn2를 발현할 때, 인간 비-뉴런 세포에서 PTB의 발현 또는 활성을 억제시키는 단일 세포-프로그래밍 작용제는 비-뉴런 세포를 성숙한 뉴런으로 직접 전환시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 어떤 외인성 miR-9도 인간 비-뉴런 세포 내로 도입되지 않는다. 일부 실시양태에서, 어떤 외인성 Brn2도 인간 비-뉴런 세포 내로 도입되지 않는다.
일부 실시양태에서, 비-뉴런 세포에서 miR-9 또는 Brn 2의 발현 수준은 당업자가 알 수 있는 임의의 기술에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 세포에서 miR-9의 발현 수준은 역전사 (RT)-중합효소 연쇄 반응 (PCR), miRNA 어레이, RNA 서열분석 (RNA-seq), 및 멀티플렉스 miRNA 검정법에 의해 측정될 수 있다. miR-9의 발현 수준은 또한 예컨대, 계내 하이브리드화와 같은 계내 방법에 의해 검정될 수 있다. 단백질로서 Brn2의 발현 수준은 통상의 기술, 예컨대, 웨스턴 블롯, 효소-결합 면역흡착 검정법 (ELISA), 및 면역염색에 의해, 또는 다른 기술, 예컨대, 그러나, 제한 없이, 단백질 마이크로어레이, 및 질량분석법 방법 (예컨대, 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 및 액체 크로마토그래피-질량분석법 (LC/MS))에 의해 검정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 또는 특정 타입의 조직/세포에서의 miR-9의 발현 수준에 관한 정보는 마이크로RNA에 대하여 공개적으로 이용가능한 데이터베이스, 예컨대, 그러나, 제한 없이, 휴먼 MiRNA 익스프레션 데이터베이스(Human MiRNA Expression Database: HMED), miRGator 3.0, miRmine, 및 PhenomiR을 참조함으로써 얻을 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 또는 특정 타입의 조직/세포에서의 miR-9의 발현 수준에 관한 정보는 단백질 발현에 대하여 공개적으로 이용가능한 데이터베이스, 예컨대, 그러나, 제한 없이, 더 휴먼 프로테인 아틀라스(The Human Protein Atlas), GeMDBJ 프로테오믹스(geMDBJ Proteomics), 휴먼 프로테인페디아(Human Proteinpedia), 및 칸 다이나믹 프로테오믹스 데이터베이스(Kahn Dynamic Proteomics Database)를 참조함으로써 얻을 수 있다.
본 개시내용의 특정 실시양태에 따라, 예시적인 방법은 리프로그래밍하고자 하는 인간 비-뉴런 세포를 제공하는 단계; 및 인간 비-뉴런 세포를, 인간 비-뉴런 세포에서 PTB의 발현 또는 활성을 감소시키고, PTB의 발현 또는 활성의 감소 후, nPTB의 발현 또는 활성을 감소시키는 단일 세포-프로그래밍 작용제를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포-프로그래밍 작용제는 특정 타입의 비-뉴런 세포, 예컨대, 인간 비-뉴런 세포, 예컨대, 인간 신경교 세포에서 PTB 및 nPTB의 발현 또는 활성 수준에 관한 순차적인 이벤트를 유도할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포-프로그래밍 작용제과의 접촉의 직접적인 효과는 비-뉴런 세포에서 PTB의 발현 또는 활성의 감소이다. 일부 실시양태에서, 비-뉴런 세포에서, 비-뉴런 세포에서의 PTB의 발현 또는 활성의 감소는 비-뉴런 세포에서 초기 nPTB 발현 수준 증가를 동반한다. 일부 실시양태에서, 초기 nPTB 발현 수준은, PTB의 발현 또는 활성이 억제됨에 따라 높은 nPTB 발현 수준까지 증가한다. 일부 실시양태에서, 초기 증가 후, nPTB 발현은 높은 nPTB 발현 수준에서부터 낮은 nPTB 발현 수준으로 감소한다. 일부 실시양태에서, 낮은 nPTB 발현 수준은 PTB의 발현 또는 활성의 억제 후, 초기 nPTB 발현 수준보다 여전히 더 높다. 일부 실시양태에서, nPTB 발현 수준은 초기 증가 후, PTB의 발현 또는 활성을 억제시키는 세포-프로그래밍 작용제 이외의 다른 외부 개입 없이도 자발적으로 감소한다. 특정 이론에 의해 제한하고자 하지 않으면서, 세포-프로그래밍 작용제에 의해 PTB 발현 또는 활성이 감소된 후에 이어지는, 비-뉴런 세포에서의 nPTB 발현 수준의 후속 감소는 세포-프로그래밍 작용제에 의한 비-뉴런 세포의 성숙한 뉴런으로의 직접적인 전환과 상관관계가 있을 수 있다. 일부 실시양태에 따라, PTB의 발현 또는 활성을 억제시키는 단일 세포-프로그래밍 작용제는 인간 성인 섬유모세포 세포에서 상기 기술된 바와 같이 순차적인 이벤트를 유도하지 않고, 예컨대, nPTB는 발현 수준의 초기 상승을 경험하지만, 특정의 낮은 수준으로의 후속 감소는 경험하지 못한다. 일부 실시양태에서, 인간 성상세포에서, 인간 성상세포에서 PTB의 발현 또는 활성을 억제시키는 단일 세포-프로그래밍 작용제는 PTB의 발현 또는 활성의 즉각적인 감소, 초기의 nPTB의 발현 수준 증가, 및 후속된 nPTB의 발현 수준 감소를 유도한다. 일부 실시양태에서, PTB의 발현 또는 활성을 억제시키는 단일 세포-프로그래밍 작용제는 인간 성상세포에서 성숙한 뉴런으로 직접 전환시킨다. 일부 실시양태에서, 비-뉴런 세포에서 miR-9 또는 Brn2의 발현 수준은 PTB 발현 또는 활성이 세포-프로그래밍 작용제에 의해 억제된 후, 초기 증가 이후에 비-뉴런에서 nPTB 발현 수준이 감소하는지 여부와 상관관계가 있을 수 있다. 예를 들어, miR-9 또는 Brn2가 인간 성인 섬유모세포에서보다 더 높은 수준으로 발현되는 인간 성상세포에서, 비-뉴런에서의 nPTB 발현 수준은 PTB 발현 또는 활성이 세포-프로그래밍 작용제에 의해 억제된 후, 초기 증가 이후에 감소하는 반면, 일부 경우에서, 인간 성인 섬유모세포에서는 상기 기술된 바와 같이, nPTB 발현 수준의 후속 감소는 일어나지 않을 수 있다.
본 개시내용의 일부 실시양태에 따라, 본원에 제공된 방법에서 성숙한 뉴런으로 리프로그래밍될 수 있는 예시적인 비-뉴런 세포로는 신경교 세포, 예컨대, 그러나, 제한 없이, 성상세포, 희소돌기아교세포, 뇌실막 세포, 슈반 세포, NG2 세포, 및 위성 세포를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 신경교 세포는 인간 신경교 세포, 예를 들어, 인간 성상세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 신경교 세포는 마우스 신경교 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 신경교 세포는 임의의 다른 포유동물, 예컨대, 그러나, 제한 없이, 비-인간 영장류 동물, 돼지, 개, 당나귀, 말, 래트, 토끼, 및 낙타로부터의 신경교 세포일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 바와 같은 방법에서 사용될 수 있는 신경교 세포는 뇌로부터 단리된 신경교 세포이다. 일부 실시양태에서, 신경교 세포는 세포 배양물 중의, 예를 들어, 모체 신경교 세포로부터 분열된 신경교 세포이다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 바와 같은 신경교 세포는 외부 유도하에 상이한 유형의 세포로부터 분화된, 예를 들어, 시험관내에서 분화 인자를 함유하는 배양 배지 중 뉴런 줄기 세포로부터 분화된, 또는 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 신경교 세포이다. 일부 다른 실시양태에서, 신경교 세포는 신경계 중의 신경교 세포, 예를 들어, 뇌 영역에 상주하는 성상세포이다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 바와 같은 방법에서 사용될 수 있는 성상세포는 뇌 또는 척수 중 별 형상의 신경교 세포이다. 일부 실시양태에서, 성상세포는 신경교 섬유질 산성 단백질 (GFAP) 및 알데히드 데히드로게나제 1 패밀리 구성원 L1 (ALDH1L1), 흥분성 아미노산 수송체 1/글루타메이트 아스파르테이트 수송체 (EAAT1/GLAST), 글루타민 신테타제, S100 베타, 또는 흥분성 아미노산 수송체 1/글루타메이트 수송체 1 (EAAT2/GLT-1)을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 널리 공지된 성상세포 마커 중 하나 이상의 것을 발현한다. 일부 실시양태에서, 성상세포는 신경교 섬유질 산성 단백질 (GFAP), 알데히드 데히드로게나제 1 패밀리 구성원 L1 (ALDH1L1), 또는 그 둘 모두를 발현한다. 특정 실시양태에서, 성상세포는 신경교 섬유질 산성 단백질 (GFAP) 프로모터-구동된 트랜스진 (예컨대, 적색 형광성 단백질 (RFP), Cre 레콤비나제)을 발현하는 신경계 중의 비-뉴런 세포이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 성상세포는 뉴런 마커, 예컨대, Tuj1, NSE, NeuN, GAD67, VGluT1, 또는 TH에 대해 면역양성이 아니다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 성상세포는 희소돌기아교세포 마커, 예컨대, 희소돌기아교세포 전사 인자 2, OLIG2에 대해 면역양성이 아니다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 성상세포는 소교세포 마커, 예컨대, 막관통 단백질 119 (TMEM119), CD45, 이온화된 칼슘-결합 어댑터 분자 1 (Iba1), CD68, CD40, F4/80, 또는 CD11 항원-유사 패밀리 구성원 B (CD11b)에 대해 면역양성이 아니다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 성상세포는 NG2 세포 마커 (예컨대, 신경/신경교 항원 2, NG2)에 대해 면역양성이 아니다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 성상세포는 신경 전구체 마커, 예컨대, 네스틴, CXCR4, 무사시(Musashi), 노치-1(Notch-1), SRY-박스 1(SRY-Box 1: SOX1), SRY-박스 2 (SOX2), 단계 특이적 배아 항원 1 (SSEA-1, CD15로도 명명됨), 또는 비멘틴(Vimentin)에 대해 면역양성이 아니다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 성상세포는 만능성 마커, 예컨대, NANOG, 옥타머-결합 전사 인자 4 (Oct-4), SOX2, 크루펠 유사 인자 4(Kruppel Like Factor 4: KLF4), SSEA-1, 또는 단계 특이적 배아 항원 4 (SSEA-4)에 대해 면역양성이 아니다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 성상세포는 섬유모세포 마커 (예컨대 피브로넥틴)에 대해 면역양성이 아니다.
성상세포는 상이한 유형 또는 분류를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 방법에 따라 상이한 유형의 성상세포에 적용될 수 있다. 상이한 유형의 성상세포의 비제한적인 예로는 Ran2+, GFAP+, 섬유모세포 성장 인자 수용체 3 양성 (FGFR3+), 및 A2B5-일 수 있는 타입 1 성상세포를 포함한다. 타입 1 성상세포는 삼분화능 신경교 제한 전구체 세포 (GRP)로부터 발생할 수 있다. 타입 1 성상세포는 이분화능 O2A/OPC (희소돌기아교세포, 타입 2 성상세포 전구체) 세포로부터 발생하지 않을 수 있다. 또 다른 비제한적인 예로는 A2B5+, GFAP+, FGFR3-, 및 Ran2-일 수 있는 타입 2 성상세포를 포함한다. 타입 2 성상세포는 시험관내에서 삼분화능 GRP로부터 또는 이분화능 O2A로부터 발생할 수 있거나, 또는 상기 전구체 세포가 병변 부위 내로 이식되었을 때 생체내에서 발생할 수 있다. 본원에서 제공되는 방법에서 사용될 수 있는 성상세포는 예를 들어, 회백질에서 발견될 수 있고, 그의 말단(end-feet)이 시냅스를 인벨럽하는 다수의 분지형 돌기를 갖는 원형질 성상세포; 백질에서 발견될 수 있고, 그의 말단이 란비에르(Ranvier) 결절을 인벨럽하는 길고 얇은 비부진형 돌기를 가질 수 있는 섬유상 성상세포와 같이, 그의 해부학적 표현형에 기초하여 추가로 분류될 수 있다. 본원에 제공된 방법에서 사용될 수 있는 성상세포는 또한 GluT 타입 및 GluR 타입을 포함할 수 있다. GluT 타입 성상세포는 글루타메이트 수송체 (EAAT1/SLC1A3 및 EAAT2/SLC1A2)를 발현할 수 있고, 수송체 전류에 의한 글루타메이트의 시냅스 방출에 대해 반응할 수 있는 반면, GluR 타입 성상세포는 글루타메이트 수용체 (대개는 mGluR 및 AMPA 타입)를 발현할 수 있고, 채널-매개 전류 및 IP3-의존성 Ca2 + 과도 현상에 의한 글루타메이트의 시냅스 방출에 대해 반응할 수 있다.
본원에서 제공되는 바, 세포-프로그래밍 작용제는 PTB의 발현 또는 활성을 내인성 또는 천연 수준의 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%만큼 억제시킨다. 본원에서 제공되는 바, 세포-프로그래밍 작용제는 PTB의 발현 또는 활성을 내인성 또는 천연 수준의 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 100%만큼 억제시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 세포-프로그래밍 작용제는 PTB의 발현 수준을 직접 억제시키고, 예컨대, PTB의 전사, 번역, 또는 단백질 안정성을 억제시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 세포-프로그래밍 작용제는 PTB의 활성을 직접 억제시키고, 예컨대, PTB의 그의 표적 분자에의 결합을 차단한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 세포-프로그래밍 작용제는 다른 세포 신호전달 경로에는 영향을 주지 않으면서, PTB의 발현 또는 활성에 대해 직접적인 영향을 미친다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 세포-프로그래밍 작용제는 또 다른 단백질 또는 마이크로RNA, 예컨대, miR-124, miR-9, 또는 Brn2의 발현 또는 활성 수준을 억제시키거나, 또는 상향조절함으로써 PTB의 발현 또는 활성을 억제시키지 않는다.
본원에서 제공되는 바, PTB의 발현 또는 활성을 억제시키는 세포-프로그래밍 작용제는 PTB의 단백질 발현 또는 단백질 활성을 억제시키거나, 또는 그를 제거하는 임의 타입의 반응물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포-프로그래밍 작용제는 PTB의 발현 또는 활성을 억제시키도록 구성된, 작은 화학 분자, 간섭 RNA, 짧은 헤어핀 RNA, 마이크로RNA, 우성 음성 PTB, 스펀지 폴리뉴클레오티드, 리보자임, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 모노클로날 항체, 또는 폴리클로날 항체일 수 있다.
PTB의 작은 화학 분자 억제제는 유기 또는 무기 화학 화합물일 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "소분자"는 분자량이 약 3,000 달톤 미만인 작은 유기 또는 무기 분자를 지칭할 수 있다. 소분자는 천연 생성물 또는 합성 생성물일 수 있다. PTB의 소분자 억제제는 PTB의 활성 단편에 기초한 구조를 가질 수 있다. 예를 들어, 공지된 컴퓨터 모델링 방법을 사용하여 PTB의 활성 단편과 유사한 구조, 예를 들어, RNA-결합 모티프 (예컨대, 1, 2, 3, 4개 이상의 상이한 RNA-결합 모티프)를 갖는 분자를 합리적으로 디자인할 수 있다.
RNA 간섭은 표적 유전자 PTB의 발현 수준을 감소시키는 데 유용한다. 본원에서 제공되는 바, 본 방법은 비-뉴런 세포에서 PTB의 발현을 억제시키기 위해 RNA 간섭을 사용하는 것을 포함할 수 있다. dsRNA 분자는, 먼저 DICER로 불리는 RNase E-유사 효소 (문헌 [Bernstein et al., Nature 409: 363, 2001])에 의해 프로세싱된 후, 다양한 타입의 세포 중의 mRNA를 2개의 21 nt 가닥으로 구성된 더 작은 dsRNA 분자로 서열-특이적 방식으로 분해하는 것을 유도하는 것으로 간주되며, 여기서, 상기 2개의 가닥은 각각이 5' 포스페이트 기 및 3' 히드록실을 갖고, 그 나머지 다른 하나와 정확하게 상보적인 19 nt 영역을 포함하고, 그 결과로서 이는 2 nt-3' 오버행 측면에 19 nt 이중체 영역이다. 따라서, RNAi는, 전형적으로, 각 가닥에 1-2개의 뉴클레오티드 3' 오버행과 함께, 길이가 대략 19개의 뉴클레오티드 길이인 이중 가닥 영역을 포함을 포함하고, 그 결과, 총 길이는 대략 21 내지 23개의 뉴클레오티드가 되는 짧은 간섭 RNA (siRNA)에 의해 매개될 수 있다.
본원에서 제공되는 방법에서 사용될 수 있는 짧은 간섭 RNA (siRNA)는, 길이가 대략 19개의 염기쌍 길이일 수 있고, 임의적으로 하나 또는 2개의 단일 가닥 오버행 또는 루프를 추가로 포함하며, 그 결과, 총 길이는 대략 21 내지 23개의 뉴클레오티드가 되는 RNA 이중체를 포함할 수 있다. siRNA는 함께 하이브리드화된 2개의 RNA 가닥을 포함할 수 있거나, 또는 자기-하이브리드화 부분을 포함하는 단일 RNA 가닥을 포함할 수 있다. siRNA는 하나 이상의 유리 가닥 단부를 포함할 수 있고, 이는 포스페이트 및/또는 히드록실 기를 포함할 수 있다. siRNA는 엄격한 조건하에서 표적 전사체와 하이브리드화하는 부분을 포함할 수 있다. siRNA의 한 가닥 (또는 siRNA의 자기-하이브리드화 부분)은 표적 전사체 (예컨대, PTB mRNA 전사체)의 영역과 정확하게 상보적일 수 있고, 이는 siRNA가 단일 미스매치 없이 표적 전사체에 하이브리드화한다는 것을 의미한다. 특정 실시양태에서, 완벽한 상보성은 달성되지 않는다. 일부 실시양태에서, 미스매치는 siRNA 말단에 또는 그 근처에 위치한다.
본원에서 사용되는 바, siRNA는 또한 생체내에서 프로세싱되어 상기 분자를 생성할 수 있는 다양한 RNA 구조 (예컨대, 짧은 헤어핀 RNA (shRNA))도 포함한다. shRNA는 서로 하이브리드화하여 스템, 루프, 및 임의적으로, 오버행, 예컨대, 3' 오버행을 형성하는 2개의 상보적인 요소를 함유하는 RNA 가닥을 포함할 수 있다. 스템 길이는 대략 19 bp 길이일 수 있고/거나, 루프 길이는 약 1-20, 예컨대, 약 4-10, 및 약 6-8 nt 길이일 수 있고/거나, 오버행 길이는 약 1-20, 예컨대, 약 2-15 nt 길이일 수 있다. 특정 실시양태에서, 스템 최소 길이는 최소 19개의 뉴클레오티드 길이일 수 있고, 최대 길이는 대략 29개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 본원에서 제공되는 고전적 siRNA는 표적화되는 mRNA (예컨대, PTB mRNA 전사체)를 분해시킬 수 있고, 이로써, 단백질 합성 속도도 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, PTB mRNA 전사체의 3' UTR에 결합하는 특정 siRNA (예컨대, 마이크로RNA)가 고전적 RNA 간섭과 관련은 있지만, 그와는 다른 기전에 의해, 예컨대, 그의 안정성을 감소시키기보다는 전사체의 번역을 감소시킴으로써 주형 전사체에 의해 코딩되는 단백질의 발현을 억제시킬 수 있다. 마이크로RNA 길이는 대략 20 내지 26개의 뉴클레오티드 길이, 예컨대, 22 nt 길이일 수 있다. 마이크로RNA는 표적 전사체를 불안정화시키고/거나, 그의 번역 (예컨대, PTB 발현)을 차단시키는 데 사용될 수 있다.
특정의 원하는 siRNA 서열을 코딩하는 DNA 서열을 함유하는 플라스미드는 형질감염 또는 바이러스 매개 감염을 통해 표적 세포로 전달된다. 일단 세포내에 있게 되면, DNA 서열은 계속해서, 함께 루프를 만들고, 분자내 염기쌍 형성을 통해 헤어핀 구조를 형성하는 RNA 분자로 전사된다. 이러한 헤어핀 구조는 일단 세포에 의해 프로세싱되고 나면, 형질감염된 siRNA 분자와 등가이고, 이는 세포에 의해 원하는 단백질의 RNAi를 매개하는 데 사용된다. shRNA 사용이 siRNA 형질감염보다 이점을 갖는데, 그 이유는 전자의 것이 단백질 발현을 안정적으로 장기간 억제시킬 수 있도록 하기 때문이다. 형질감염된 siRNA에 의한 단백질 발현의 억제는 수일을 초과하는 기간 동안 일어나지 않는 일시적인 현상이다. 일부 경우에서, 이는 바람직하고, 원하는 것일 수 있다. 더욱 긴 장기간의 단백질 억제가 필요한 경우, shRNA-매개 억제가 바람직하다. 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)는 5' 측면 영역, siRNA 영역 세그먼트, 루프 영역, 3' siRNA 영역 및 3' 측면 영역을 함유하도록 디자인된 스템-루프 구조로 구성될 수 있다. shRNA는 표적 서열의 효과적인 넉다운을 가질 수 있다.
표적 RNA 전사체 (예컨대, PTB mRNA 전사체)의 일부 또는 그 모두와 상보적인 염기 서열을 갖는 스펀지 폴리뉴클레오티드 역시 본원에서 제공되는 방법에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 스펀지 폴리뉴클레오티드는 폴리피리미딘 트랙을 함유할 수 있다. 스펀지 폴리뉴클레오티드는 PTB mRNA 전사체를 "포획"하여 그가 정상적으로 스플라이싱, 번역 또는 수송되지 못하게 차단하는 데 사용될 수 있고, 이로써, PTB 단백질의 발현 수준은 감소될 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포-프로그래밍 작용제는 PTB 분자의 활성을 억제시킬 수 있는 우성 음성 돌연변이체일 수 있다. 우성 음성 돌연변이체는 PTB 분자의 활성을 억제시킬 수 있는 펩티드 또는 펩티드 모방체, 또는 PTB 분자의 활성을 억제시킬 수 있는 우성 음성 폴리펩티드를 발현하는 DNA 벡터 또는 유전자 요법 벡터 형태의 핵산 조성물일 수 있다. 우성 음성 돌연변이체는 표적 RNA 또는 RNA의 리간드에 결합하여 그의 표적 상호작용에 영향을 미칠 수 있다. 우성 음성 분자는 예를 들어, 단백질-단백질 상호작용 또는 단백질-RNA 상호작용을 차단함으로써 작용할 수 있다.
폴리펩티드 모방체 조성물은, 전형적으로 3개의 구조적 군: a) 천연 아미드 결합 ("펩티드 결합") 연결 이외의 다른 잔기 연결; b) 자연적으로 발생된 아미노산 잔기 대신의 비-천연 잔기; 또는 c) 예컨대, 2차 구조, 예컨대, 베타 외전부, 감마 회전부, 베타 시트, 알파 나선형 입체구조 등을 유도하거나, 또는 그를 안정화시키기 위하여 2차 구조 모방을 유도하는 잔기로부터의 것인 비-천연 구조 성분의 임의 조합을 함유할 수 있다. 개별 펩티도모방체 잔기는 펩티드 결합, 다른 화학 결합 또는 커플링 수단, 예컨대, 예컨대, 글루타르알데히드, N-히드록시숙신이미드 에스테르, 이작용성 말레이미드, N,N'-디시클로헥실카보디이미드 (DCC) 또는 NN,N'-디이소프로필카보디이미드 (DIC)에 의해 연결될 수 있다. 종래의 아미드 결합 ("펩티드 결합") 연결에 대한 대안일 수 있는 연결로는 예컨대, 케토메틸렌 (예컨대, -C(=O)-NH-의 경우, -C(=O)-CH2-), 아미노메틸렌 (CH2―NH), 에틸렌, 올레핀 (CH-CH), 에테르 (CH2-O), 티오에테르 (CH2―S), 테트라졸 (CN4―), 티아졸, 레트로아미드, 티오아미드, 또는 에스테르를 포함할 수 있다.
세포-프로그래밍 작용제의 또 다른 비제한적인 예는 항-PTB 항체일 수 있다. 항-PTB 항체는 PTB에 특이적으로 결합하는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체일 수 있다. 본원에서 사용되는 바, 항-PTB 항체는 PTB에 그의 활성 단편 또는 불활성 단편에서 결합할 수 있다. 일부 구성에서, PTB의 활성 단편에 결합하는 항-PTB 항체는 PTB가 그의 기능적 표적 (예컨대, 표적 RNA 전사체) 또는 파트너 (예컨대, 단백질 리간드)와 상호작용하지 못하게 차단함으로써 PTB의 활성을 억제시킬 수 있다. 다른 구성에서, PTB의 불활성 단편에 결합하는 항-PTB 항체는 PTB 응집을 유도함으로써, 일부 경우에서는 세포 내부에 PTB를 고정시켜 그가 재배치되지 못하게 막음으로써 그의 표적 또는 파트너와 상호작용하지 못하게 할 수 있다. 일부 경우에서, 항-PTB 항체는 또한 항체에 결합한 것과 같이 PTB의 단백질 분해를 유도할 수 있다.
안티센스 핵산 (예컨대, DNA, RNA, 변형된 DNA, 또는 변형된 RNA)은 일반적으로 표적 핵산 (예컨대, PTB mRNA 전사체)의 일부에 상보적인 단일 가닥 핵산인 바, 그러므로, 표적에 결합하여 이중체를 형성할 수 있다. 항-PTB 안티센스 뉴클레오티드는 예컨대, 세포에서 PTB의 발현 또는 활성을 억제시키도록 구성될 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 (ASO)는 표적 mRNA와 쌍을 형성하여 RNA를 핵내 효소 RNase H에 의한 절단을 위한 기질이 되게 만들 수 있다. 일부 실시양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 뇌 척수액 내로의 주사 후 신경계, 예컨대, 설치류 및 비-인간 영장류 신경계에서 ~3개월 동안 표적 mRNA 분해를 매개할 수 있다. 본원에서 제공되는 바, 본원에서 제공되는 방법에서 사용될 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 길이가 15 내지 35개의 뉴클레오티드 범위이지만, 10개 내지 최대 대략 50개의 뉴클레오티드 범위일 수 있는 길이의 올리고뉴클레오티드이다. 결합은 표적 PTB 핵산의 기능을 감소시키거나, 또는 억제시킬 수 있다. 예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 게놈 DNA (예컨대, PTB 유전자)에 결합하였을 때, 전사체를 차단시킬 수 있고/거나, mRNA (예컨대, PTB mRNA 전사체)에 결합하였을 때, 번역을 억제시킬 수 있고/거나, 핵산의 분해를 유도할 수 있다. PTB 발현 감소는 안티센스 핵산 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA의 것에 상보적인 서열을 포함하는 펩티드 핵산의 투여에 의해 달성될 수 있다. 안티센스 기술 및 그의 적용은 당업계에 널리 공지되어 있고, 문헌 [(Phillips, M. I. (ed.) Antisense Technology, Methods Enzymol., 313 and 314: 2000], 및 상기 문헌에서 언급된 참고문헌에 기술되어 있다. 또한 문헌 [Crooke, S. "ANTISENSE DRUG TECHNOLOGY: PRINCIPLES, STRATEGIES, AND APPLICATIONS" (1st Edition) Marcel Dekker]; 및 상기 문헌에서 인용되는 참고문헌을 참조할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 잠금 핵산 (LNA)을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, LNA는, 리보스 모이어티가 2' 산소 및 4' 탄소를 연결하는 추가 브릿지로 변형되어 있고, 상기 브릿지는 3'-엔도 (노쓰) 입체형태로 리보스를 "잠그는" 것인, 변형된 RNA 뉴클레오티드를 지칭한다. 일부 실시양태에서, LNA는 원하는 경우에는 언제나 올리고뉴클레오티드 중 DNA 또는 RNA 잔기와 혼합되고, 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍 형성 법칙에 따라 DNA 또는 RNA와 하이브리드화한다. 잠긴 리보스 입체형태는 염기 적층 및 백본 사전 조직화를 증진시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 바와 같이 올리고뉴클레오티드 중 LNA를 포함하는 것은 올리고뉴클레오티드의 하이브리드화 특성 (용융 온도)를 증가시킨다. 일부 경우에서, LNA를 포함하는 것은 표적 mRNA의 분해를 유도하지 않고, 표적 mRNA의 번역을 차단한다. LNA를 사용하는 것의 예시적인 기술 및 적용은 PCT/US2013/047157 및 문헌 [Campbell MA et al., Chem . Soc . Rev., 40(12), 5680-9] (이들은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에서 살펴볼 수 있다.
본원에 제공된 세포-프로그래밍 작용제는 또한 RNA 분자의 서열-특이적 절단을 촉매화할 수 있는 리보자임 또는 데옥시리보자임을 포함할 수 있다. 절단 부위는 RNA 또는 DNA 효소 중 뉴클레오티드와 표적 RNA (예컨대, PTB mRNA 전사체) 중 뉴클레오티드 사이의 상보적인 염기쌍 형성에 의해 결정된다. 따라서, RNA 및 DNA 효소는 PTB mRNA 전사체를 절단하여 그의 분해율을 증가시키도록 디자인될 수 있다.
본원에서 제공되는 바, 비-뉴런 세포를 세포-프로그래밍 작용제와 접촉시키는 단계는 리프로그래밍하고자 하는 비-뉴런 세포의 타입, 비-뉴런 세포가 상주하는 환경, 세포-프로그래밍 작용제의 타입, 및 원하는 세포 리프로그래밍 결과에 의존하여 임의의 적절한 방식으로 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포-프로그래밍 작용제가 그 자체가 세포막 투과 능력을 보인다면, 세포-프로그래밍 작용제, 예컨대, PTB의 소분자 억제제 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 비-뉴런 세포에 직접 적용된다. 일부 실시양태에서, 세포-프로그래밍 작용제, 예컨대, shRNA, 항체, 또는 우성 음성 돌연변이체는 원하는 세포-프로그래밍 작용제를 발현하는 핵산 벡터 형태로 도입된다. 이러한 구성에서, 세포-프로그래밍 작용제를 도입하는 데 비-바이러스 형질감염 방법 또는 바이러스 형질도입 방법이 사용된다. 비-바이러스 형질감염은 바이러스를 통해 매개되지 않는 모든 세포 형질감염 방법을 지칭할 수 있다. 비-바이러스 형질감염의 비제한적인 예로는 전기천공, 미량주사, 인산칼슘 침전, 예컨대, DEAE-덱스트란, 이어서, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 양이온성 중합체를 이용하는 형질감염, 덴드리머를 이용하는 형질감염, 리포솜 매개 형질감염 ("리포펙션"), 미세사출 충격 ("유전자 총"), 퓨진(fugene), 직접 초음파 로딩, 세포 압착, 광학적 형질감염, 원형질체 융합, 임페일펙션, 마그네토펙션, 뉴클레오펙션, 및 그의 임의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법은 세포-프로그래밍 작용제를 비-뉴런 세포로 전달하는 데 적절한 매체로서 바이러스 벡터를 이용한다. 적절한 바이러스 벡터의 예로는 아데노바이러스, 렌티바이러스, 아데노-연관 바이러스 (AAV), 폴리오바이러스, 단순 포진 바이러스 (HSV), 또는 뮤린 말로니-기반 바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 벡터는 AAV 벡터이다. 본원에서 제공되는 바, 바이러스 벡터 방법은 DNA 또는 RN바이러스 벡터를 사용하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포-프로그래밍 작용제는 AAV 벡터 형태로 투여된다. 일부 실시양태에서, 세포-프로그래밍 작용제는 렌티바이러스 벡터 형태로 투여된다. 예를 들어, 세포-프로그래밍 작용제는 PTB에 대한 shRNA를 발현하기 위해 렌티바이러스 또는 아데노바이러스 연관 바이러스 (AAV)를 사용하여 비-뉴런 세포로 전달될 수 있다.
본 개시내용의 일부 실시양태에 따라, 본원에 제공된 방법은 비-뉴런 세포를 성숙한 뉴런으로 리프로그래밍하는 데 충분한 양의 세포-프로그래밍 작용제를 통해 비-뉴런 세포에서 PTB의 발현 또는 활성을 억제시키는 단계를 포함한다. 세포-프로그래밍 작용제의 충분량은 당업자가 쉽게 이해할 수 있는 바와 같이 경험적으로 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포-프로그래밍 작용제의 양은 비-뉴런 세포에서 세포-프로그래밍 작용제의 활성을 조사하는 임의 타입의 검정법에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 세포-프로그래밍 작용제가 비-뉴런 세포에서 PTB의 발현을 억제시키도록 구성되었을 때, 세포-프로그래밍 작용제의 충분량은 상기 작용제 투여 후, 예시적인 비-뉴런 세포에서 PTB의 발현 수준을 예컨대, 웨스턴 블롯에 의해 평가함으로써 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 기능적 검정법은 세포-프로그래밍 작용제의 예시적인 비-뉴런 세포로의 전달 후에 PTB의 활성을 평가하는 데 사용된다. 일부 실시양태에서, 세포-프로그래밍 작용제의 충분량을 결정하는 데 하류 뉴런 특성을 조사하는 다른 기능적 검정법, 예컨대, 뉴런에 대한 면역염색, 뉴런 기능적 특성에 대한 전기 기록이 사용된다. 일부 실시양태에서, 세포-프로그래밍 작용제는 바이러스 벡터 형태로 전달된다. 바이러스 벡터는 세포-프로그래밍 작용제, 예컨대, shRNA, 마이크로RNA, 우성 음성 돌연변이체, 또는 항체를 코딩하는 발현 서열을 하나 이상의 카피로, 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 50, 또는 100개의 카피로 포함할 수 있다. 당업자가 결정할 수 있는 바와 같이, 바이러스 벡터는 투여를 위해 임의의 적절한 양으로 적정될 수 있다. 예를 들어, PCR, RT-PCR, 또는 다른 방법에 의해 결정된 역가는 적어도 약 105개의 바이러스 입자/mL, 적어도 약 106개의 입자/mL, 적어도 약 107개의 입자/mL, 적어도 약 108개의 입자/mL, 적어도 약 109개의 입자/mL, 적어도 약 1010개의 입자/mL, 적어도 약 1011개의 입자/mL, 적어도 약 1012개의 입자/mL, 적어도 약 1013개의 입자/mL, 적어도 약 1014개의 입자/mL, 또는 적어도 약 1015개의 입자/mL일 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여되는 바이러스 벡터의 역가는 적어도 약 1010개의 바이러스 입자/mL이다. 일부 실시양태에서, 세포-프로그래밍 작용제는 안티센스 올리고뉴클레오티드이고, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 당업자는 이해하는 바와 같은 임의의 유효량으로 전달될 수 있다. 일부 실시양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 적어도 약 0.05 ㎍, 적어도 약 0.075 ㎍, 적어도 약 0.1 ㎍, 적어도 약 0.125 ㎍, 적어도 약 0.15 ㎍, 적어도 약 0.175 ㎍, 적어도 약 0.2 ㎍, 적어도 약 0.225 ㎍, 적어도 약 0.25 ㎍, 적어도 약 0.275 ㎍, 적어도 약 0.3 ㎍, 적어도 약 0.325 ㎍, 적어도 약 0.35 ㎍, 적어도 약 0.375 ㎍, 적어도 약 0.4 ㎍, 적어도 약 0.425 ㎍, 적어도 약 0.045 ㎍, 적어도 약 0.475 ㎍, 적어도 약 0.5 ㎍, 적어도 약 0.6 ㎍, 적어도 약 0.7 ㎍, 적어도 약 0.8 ㎍, 적어도 약 0.9 ㎍, 적어도 약 1.0 ㎍, 적어도 약 1.2 ㎍, 적어도 약 1.25 ㎍, 적어도 약 1.3 ㎍, 적어도 약 1.4 ㎍, 적어도 약 1.5 ㎍, 적어도 약 1.6 ㎍, 적어도 약 1.7 ㎍, 적어도 약 1.8 ㎍, 적어도 약 1.9 ㎍, 적어도 약 2.0 ㎍, 적어도 약 2.1 ㎍, 적어도 약 2.2 ㎍, 적어도 약 2.3 ㎍, 적어도 약 2.4 ㎍, 적어도 약 2.5 ㎍, 적어도 약 2.75 ㎍, 적어도 약 3 ㎍, 적어도 약 4 ㎍, 적어도 약 5 ㎍, 적어도 약 6 ㎍, 적어도 약 7 ㎍, 적어도 약 8 ㎍, 적어도 약 9 ㎍, 또는 적어도 약 10 ㎍으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 약 0.05 ㎍, 약 0.075 ㎍, 약 0.1 ㎍, 약 0.125 ㎍, 약 0.15 ㎍, 약 0.175 ㎍, 약 0.2 ㎍, 약 0.225 ㎍, 약 0.25 ㎍, 약 0.275 ㎍, 약 0.3 ㎍, 약 0.325 ㎍, 약 0.35 ㎍, 약 0.375 ㎍, 약 0.4 ㎍, 약 0.425 ㎍, 약 0.045 ㎍, 약 0.475 ㎍, 약 0.5 ㎍, 약 0.6 ㎍, 약 0.7 ㎍, 약 0.8 ㎍, 약 0.9 ㎍, 약 1.0 ㎍, 약 1.2 ㎍, 약 1.25 ㎍, 약 1.3 ㎍, 약 1.4 ㎍, 약 1.5 ㎍, 약 1.6 ㎍, 약 1.7 ㎍, 약 1.8 ㎍, 약 1.9 ㎍, 약 2.0 ㎍, 약 2.1 ㎍, 약 2.2 ㎍, 약 2.3 ㎍, 약 2.4 ㎍, 약 2.5 ㎍, 약 2.75 ㎍, 약 3 ㎍, 약 4 ㎍, 약 5 ㎍, 약 6 ㎍, 약 7 ㎍, 약 8 ㎍, 약 9 ㎍, 또는 약 10 ㎍으로 투여된다. 일부 경우에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 시험관내에서 약 0.075 내지 약 0.325 ㎍, 약 0.1 내지 약 0.3 ㎍, 또는 약 0.125 내지 약 0.25 ㎍으로 투여된다. 일부 경우에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 생체내에서 약 1 내지 약 10 ㎍, at 약 1 내지 약 5 ㎍, at 약 1 내지 약 3 ㎍, 약 1.5 내지 약 2.5 ㎍, 또는 약 1.75 내지 약 2.25 ㎍으로 투여된다.
본원에 제공된 방법은 본원에 제공된 방법은 비-뉴런 세포를 성숙한 뉴런으로 리프로그래밍하는 데 충분한 특정 기간 동안 비-뉴런 세포에서 PTB의 발현 또는 활성을 억제시키는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 예시적인 방법은 비-뉴런 세포를, 비-뉴런 세포에서 PTB의 발현 또는 활성을 억제시키는 세포-프로그래밍 작용제와 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 6일, 적어도 7일, 적어도 8일, 적어도 9일, 적어도 10일, 적어도 11일, 적어도 12일, 적어도 13일, 적어도 14일, 적어도 15일, 적어도 3주, 적어도 4주, 적어도 5주, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 4개월, 또는 적어도 5개월 동안 접촉시켜 비-뉴런 세포를 성숙한 뉴런으로 리프로그래밍하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 예시적인 방법은 비-뉴런 세포를, 비-뉴런 세포에서 PTB의 발현 또는 활성을 억제시키는 세포-프로그래밍 작용제와 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 8일, 약 9일, 약 10일, 약 11일, 약 12일, 약 13일, 약 14일, 약 15일, 약 3주, 약 4주, 약 5주, 약 2개월, 약 3개월, 약 4개월, 또는 약 5개월 동안 접촉시켜 비-뉴런 세포를 성숙한 뉴런으로 리프로그래밍하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 예시적인 방법은 비-뉴런 세포를, 비-뉴런 세포에서 PTB의 발현 또는 활성을 억제시키는 세포-프로그래밍 작용제와 최대 2일, 최대 3일, 최대 4일, 최대 5일, 최대 6일, 최대 7일, 최대 8일, 최대 9일, 최대 10일, 최대 11일, 최대 12일, 최대 13일, 최대 14일, 최대 15일, 최대 3주, 최대 4주, 최대 5주, 최대 2개월, 최대 3개월, 최대 4개월, 또는 최대 5개월 동안 접촉시켜 비-뉴런 세포를 성숙한 뉴런으로 리프로그래밍하는 단계를 포함한다. 일부 구성에서, 본원에 제공된 방법은 단 1회 동안 세포-프로그래밍 작용제를 투여하는 단계, 예컨대, 단 1회 동안, 세포-프로그래밍 작용제를 비-뉴런 세포를 포함하는 세포 배양물에 첨가하거나, 또는 세포-프로그래밍 작용제를 비-뉴런 세포를 포함하는 뇌 영역으로 전달하는 단계를 포함하고, 세포-프로그래밍 작용제는 비-뉴런 세포에서 PTB의 발현 또는 활성을 억제시키는 데 있어 원하는 시간 동안, 예컨대, 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 4일, 또는 적어도 10일 동안 그대로 활성을 유지할 수 있다. 예를 들어, 세포-프로그래밍 작용제가 항-PTB shRNA를 발현하는 AAV 벡터를 포함할 때, AAV 벡터 디자인은 AAV 벡터가 연장된 기간 동안 전사 방식으로 그대로 활성을 유지하게 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 예컨대, 적어도 2회, 적어도 3회, 적어도 4회, 적어도 5회, 적어도 6회, 적어도 7회, 적어도 8회, 적어도 9회, 적어도 10회, 적어도 12회, 적어도 15회, 적어도 20회 또는 그 초과 동안 세포-프로그래밍 작용제를 투여하는 단계를 포함한다.
본원에서 제공되는 바, 방법은 시험관내에서 적절한 배양 조건하에서 비-뉴런 세포를 뉴런으로 리프로그래밍하는 단계를 포함할 수 있다. 뉴런 성장을 촉진시키는 데 적절한 세포 배양 조건을 선택할 수 있다는 것을 당업계의 숙련가는 이해할 것이다. 일부 실시양태에서, 비-뉴런 세포, 리프로그래밍되는 세포, 및 리프로그래밍된 뉴런의 생존을 유지시키기 위해 다양한 인자가 배양 배지에 제공될 수 있다. 세포 성장을 지원할 수 있는 임의의 공지된 배양 배지가 사용될 수 있고, 원하는 결과를 위해 최적화될 수 있다. 배양 배지로는 HEM, DMEM, RPMI, F-12 등을 포함할 수 있다. 배양 배지는 세포 대사에 중요할 수 있는 보충제, 예컨대, 글루타민 또는 다른 아미노산, 비타민, 미네랄 또는 유용한 단백질, 예컨대, 트랜스페린 등을 함유할 수 있다. 배지는 또한 효소, 박테리아 및 진균 오염을 막기 위해 항생제, 예컨대, 페니실린, 스트렙토마이신, 겐타마이신 등을 함유할 수 있다. 일부 경우에서, 배지는 소, 말, 닭 등으로부터 유래된 혈청을 함유할 수 있다. 출발 세포로서 성상세포에 대한 예시적인 배양 배지는 DMEM/F12, FBS, 페니실린/스트렙토마이신, B27, 표피 성장 인자 (EGF), 및 섬유모세포 성장 인자 2 (FGF2)를 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 뉴런 분화 배지는 리프로그래밍 동안 및/또는 리프로그래밍된 뉴런을 유지시키는 동안 사용된다. 일부 경우에서, 뉴런 분화 배지는 ALK5의 억제제 (TGFβ 타입 I 수용체 키나제), 예컨대, SB431542, A-77-01, ALK5 억제제 II, RepSox, SB525334, GW788388, SD-208, LY215729, 또는 LY364947을 포함한다. 일부 경우에서, 뉴런 분화 배지는 GSK3b의 억제제 (글리코겐 신타제 키나제 3 베타), 예컨대, CHIR99021, IM-12, TWS119, BIO, 3F8, AR-A014418, AT9283, 또는 2-티오(3-아이오도벤질)-5-(1-피리딜)-[1,3,4]-옥사디아졸을 포함한다. 일부 경우에서, 뉴런 분화 분화 배지는 PKA의 활성인자 (단백질 키나제 A), 예컨대, 디부티릴-cAMP (시클릭 아데노신 모노포스페이트), 8-브로모-cAMP, 8-CPT-cAMP, 탁솔, 벨리노스텟트, 또는 Sp-cAMP를 포함한다. 예시적인 뉴런 분화 배지는 B27, FBS, ChIR99021, SB431542 및 Db-cAMP, 및/또는 신경영양 인자, 예컨대, BDNF, GDNF, NT3 및 CNTF로 보충되고, DMEM/F12, 뉴로베이살(Neurobasal), 인슐린, 트랜스페린, 소듐 셀레나이트, 프로게스테론, 푸트레신을 함유하는 N3/기초 배지를 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에 따라, 본원에 제공된 방법은 복수의 비-뉴런 세포를 성숙한 뉴런으로 고효율로 리프로그래밍하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 방법은 마우스 성상세포를 성숙한 뉴런으로 리프로그래밍하는 단계를 포함하고, 마우스 성상세포 중 적어도 60%가 Tuj1 양성인 성숙한 뉴런으로 전환된다. 일부 실시양태에서, 마우스 성상세포 중 적어도 40%가 Map2 양성인 성숙한 뉴런으로 전환된다. 일부 실시양태에서, 마우스 성상세포 중 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 38%, 적어도 약 40%, 적어도 약 42%, 적어도 약 44%, 적어도 약 46%, 적어도 약 48%, 적어도 약 50%, 적어도 약 52%, 적어도 약 54%, 적어도 약 56%, 적어도 약 58%, 적어도 약 60%, 적어도 약 62%, 적어도 약 64%, 적어도 약 66%, 적어도 약 68%, 적어도 약 70%, 적어도 약 72%, 적어도 약 74%, 적어도 약 76%, 적어도 약 78%, 적어도 약 80%, 적어도 약 82%, 적어도 약 84%, 적어도 약 86%, 적어도 약 88%, 적어도 약 90%, 적어도 약 92%, 적어도 약 94%, 적어도 약 96%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100%가 Tuj1 또는 Map2 양성인 성숙한 뉴런으로 전환된다
일부 실시양태에서, 본 방법은 인간 성상세포를 성숙한 뉴런으로 리프로그래밍하는 단계를 포함하고, 인간 성상세포 중 적어도 40%, 적어도 60%, 또는 적어도 80%가 Tuj1 양성인 성숙한 뉴런으로 전환된다. 일부 실시양태에서, 인간 성상세포 중 적어도 20%, 적어도 40% 또는 적어도 60%가 Map2 양성인 성숙한 뉴런으로 전환된다. 일부 실시양태에서, 인간 성상세포 중 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 38%, 적어도 약 40%, 적어도 약 42%, 적어도 약 44%, 적어도 약 46%, 적어도 약 48%, 적어도 약 50%, 적어도 약 52%, 적어도 약 54%, 적어도 약 56%, 적어도 약 58%, 적어도 약 60%, 적어도 약 62%, 적어도 약 64%, 적어도 약 66%, 적어도 약 68%, 적어도 약 70%, 적어도 약 72%, 적어도 약 74%, 적어도 약 76%, 적어도 약 78%, 적어도 약 80%, 적어도 약 82%, 적어도 약 84%, 적어도 약 86%, 적어도 약 88%, 적어도 약 90%, 적어도 약 92%, 적어도 약 94%, 적어도 약 96%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100%가 Tuj1 또는 Map2 양성인 성숙한 뉴런으로 전환된다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 바와 같은 본 방법은 복수의 비-뉴런 세포, 예컨대, 인간 비-뉴런 세포, 예컨대, 인간 신경교 세포, 또는 성상세포를 리프로그래밍하는 단계를 포함하고, 비-뉴런 세포, 예컨대, 인간 비-뉴런 세포, 예컨대, 인간 신경교 세포, 또는 성상세포 중 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 38%, 적어도 약 40%, 적어도 약 42%, 적어도 약 44%, 적어도 약 46%, 적어도 약 48%, 적어도 약 50%, 적어도 약 52%, 적어도 약 54%, 적어도 약 56%, 적어도 약 58%, 적어도 약 60%, 적어도 약 62%, 적어도 약 64%, 적어도 약 66%, 적어도 약 68%, 적어도 약 70%, 적어도 약 72%, 적어도 약 74%, 적어도 약 76%, 적어도 약 78%, 적어도 약 80%, 적어도 약 82%, 적어도 약 84%, 적어도 약 86%, 적어도 약 88%, 적어도 약 90%, 적어도 약 92%, 적어도 약 94%, 적어도 약 96%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%가 성숙한 뉴런으로 리프로그래밍된다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 바와 같은 본 방법이 리프로그래밍하고, 비-뉴런 세포, 예컨대, 인간 비-뉴런 세포, 예컨대, 인간 신경교 세포, 또는 성상세포 중 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 38%, 약 40%, 약 42%, 약 44%, 약 46%, 약 48%, 약 50%, 약 52%, 약 54%, 약 56%, 약 58%, 약 60%, 약 62%, 약 64%, 약 66%, 약 68%, 약 70%, 약 72%, 약 74%, 약 76%, 약 78%, 약 80%, 약 82%, 약 84%, 약 86%, 약 88%, 약 90%, 약 92%, 약 94%, 약 96%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 100%가 성숙한 뉴런으로 리프로그래밍된다.
일부 실시양태에서, 성숙한 뉴런은 NeuN (뉴런 핵 항원), Map2 (미세소관-연합 단백질 2), NSE (뉴런 특이적 에놀라제), 160 kDa 신경필라멘트 중간 쇄, 200 kDa 신경필라멘트 중쇄, PDS-95 (시냅스후 치밀질 단백질 95), 시냅신 I, 시냅토피신, GAD67 (글루타메이트 데카르복실라제 67), GAD65 (글루타메이트 데카르복실라제 67), 파르브알부민, DARPP32 (도파민- 및 cAMP-조절 뉴런 인단백질 32), vGLUT1 (소포 글루타메이트 수송체 1), vGLUT2 (소포 글루타메이트 수송체 1), 아세틸콜린, 소포 GABA 수송체 (VGAT), 및 감마-아미노부티르산 (GABA), 및 TH (티로신 히드록실라제). 일부 실시양태에서, 비-뉴런 세포, 예컨대, 인간 비-뉴런 세포, 예컨대, 인간 신경교 세포, 또는 성상세포 중 적어도 40%가 성숙한 뉴런으로 리프로그래밍된다.
당업계의 숙련가 쉽게 이해할 수 있는 바와 같이, 상기의 모든 마커의 발현을 임의의 일반 기술에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 특이적인 세포 타입 마커에 대한 항체를 사용하는 면역염색을 통해 관심 세포가 상응하는 세포 타입 마커를 발현하는지 여부를 밝혀낼 수 있다. 특정 조건하에서의 면역염색을 통해서도, 이 역시 관심 세포의 발생 단계를 결정하는 데 중요할 수 있는 세포 타입 마커의 세포하 분포를 밝혀낼 수 있다. 예를 들어, Map2의 발현은 유사분열 후의 성숙한 뉴런 중 다양한 신경돌기 (예컨대, 수상돌기)에서 관찰될 수 있지만, 뉴런의 축삭돌기에는 부재할 수 있다. 전압-개폐 나트륨 채널 (예컨대, α 서브유닛 Nav1.1-1.9) 및 β 서브유닛)의 발현이 또 다른 예일 수 있고, 이는 성숙한 뉴런 중, 활동 전위가 개시될 수 있는 축삭돌기 초기 세그먼트, 및 란비에르 결절에서 클러스터링될 수 있다. 일부 실시양태에서, 다른 기술, 예컨대, 그러나, 제한 없이, 유세포 분석법, 질량분석법, 계내 하이브리드화, RT-PCR, 및 마이크로어레이 또한 본원에 기술된 바와 같은 특이적인 세포 타입 마커의 발현을 평가하는 데 사용될 수 있다.
본 개시내용의 특정 측면은 복수의 비-뉴런 세포를 리프로그래밍하는 단계를 포함하고, 비-뉴런 세포, 예컨대, 인간 비-뉴런 세포, 예컨대, 인간 신경교 세포, 또는 성상세포 중 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 38%, 적어도 약 40%, 적어도 약 42%, 적어도 약 44%, 적어도 약 46%, 적어도 약 48%, 적어도 약 50%, 적어도 약 52%, 적어도 약 54%, 적어도 약 56%, 적어도 약 58%, 적어도 약 60%, 적어도 약 62%, 적어도 약 64%, 적어도 약 66%, 적어도 약 68%, 적어도 약 70%, 적어도 약 72%, 적어도 약 74%, 적어도 약 76%, 적어도 약 78%, 적어도 약 80%, 적어도 약 82%, 적어도 약 84%, 적어도 약 86%, 적어도 약 88%, 적어도 약 90%, 적어도 약 92%, 적어도 약 94%, 적어도 약 96%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%가 기능성 뉴런으로 리프로그래밍되는 것인 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 리프로그래밍하고, 비-뉴런 세포, 예컨대, 인간 비-뉴런 세포, 예컨대, 인간 신경교 세포, 또는 성상세포 중 적어도 20%가 기능성 뉴런으로 리프로그래밍된다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 리프로그래밍하고, 비-뉴런 세포, 예컨대, 인간 비-뉴런 세포, 예컨대, 인간 신경교 세포, 또는 성상세포 중 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 38%, 약 40%, 약 42%, 약 44%, 약 46%, 약 48%, 약 50%, 약 52%, 약 54%, 약 56%, 약 58%, 약 60%, 약 62%, 약 64%, 약 66%, 약 68%, 약 70%, 약 72%, 약 74%, 약 76%, 약 78%, 약 80%, 약 82%, 약 84%, 약 86%, 약 88%, 약 90%, 약 92%, 약 94%, 약 96%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 100%가 기능성 뉴런으로 리프로그래밍된다.
일부 실시양태에서, 기능성 뉴런은 신경망을 형성하고, 뉴런 신호를 보내고, 받을 수 있거나, 또는 그 둘 모두가 가능한 그의 능력을 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 기능성 뉴런은 활동 전위를 발화한다. 일부 실시양태에서, 기능성 뉴런은 다른 뉴런과의 시냅스 연결을 확립한다. 예를 들어, 기능성 뉴런은 예컨대, 또 다른 뉴런과 함께 시냅스 중 시냅스후 구획을 형성하는 그의 수상돌기 말단, 예컨대, 수상돌기 가시를 갖는, 시냅스 중 시냅스후 뉴런일 수 있다. 예를 들어, 기능성 뉴런은 예컨대, 또 다른 뉴런과 함께 시냅스 중 시냅스전 구획을 형성하는 축삭돌기을 갖는, 시냅스 중 시냅스전 뉴런일 수 있다. 기능성 뉴런이 또 다른 뉴런과 함께 형성할 수 있는 시냅스로는 축삭돌기축삭돌기, 축삭돌기수상돌기, 및 축삭세포체 시냅스를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 기능성 뉴런이 또 다른 뉴런과 함께 형성할 수 있는 시냅스는 흥분성 (예컨대, 글루타메이트성), 억제제성 (예컨대, GABA성), 조절성, 또는 그의 임의 조합일 수 있다. 일부 실시양태에서, 기능성 뉴런이 또 다른 뉴런과 함께 형성하는 시냅스는 글루타메이트성, GABA성, 콜린성, 아드레날린성, 도파민성, 또는 임의의 다른 적절한 타입이다. 시냅스전 뉴런으로서, 기능 뉴런은 신경전달물질 예컨대, 그러나, 제한 없이, 글루타메이트, GABA, 아세틸콜린, 아스파르테이트, D-세린, 글리신, 산화질소 (NO), 일산화탄소 (CO), 황화수소 (H2S), 도파민, 노르에피네프린 (노르아드레날린으로도 공지), 에피네프린 (아드레날린), 히스타민, 세로토닌, 펜에틸아민, N-메틸펜에틸아민, 티라민, 3-아이오도티로나민, 옥타파민, 트립타민, 소마토스타틴, 물질 P, 오피오이드 펩티드, 아데노신 트리포스페이트 (ATP), 아데노신, 및 아난다미드를 방출할 수 있다. 시냅스후 뉴런으로서, 기능성 뉴런은 시냅스 틈새로 시냅스전 뉴런에 의해 방출된 신경전달물질에 대한 시냅스후 반응을 유도할 수 있다. 본원에 제공된 방법에서 생성된 바와 같은 기능성 뉴런의 시냅스후 반응은 기능성 뉴런이 발현하는 신경전달물질 수용체의 타입에 의존하여 흥분성, 억제성, 또는 그의 임의 조합일 수 있다. 일부 실시양태에서, 기능성 뉴런은 이온성 신경전달물질 수용체, 예컨대, 이온성 글루타메이트 수용체 및 이온성 GABA 수용체를 발현한다. 이온성 글루타메이트 수용체로는 α-아미노-3-히드록시-5-메틸-4-이속사졸프로피온산 (AMPA)-타입 글루타메이트 수용체 (예컨대, GluA1/GRIA1; GluA2/GRIA2; GluA3/GRIA3; GluA4/GRIA4), 델타 수용체 (예컨대, GluD1/GRID1; GluD2/GRID2), 카이네이트 수용체 (예컨대, GluK1/GRIK1; GluK2/GRIK2; GluK3/GRIK3; GluK4/GRIK4; GluK5/GRIK5) 및 N-메틸-D-아스파르테이트 (NMDA) 수용체 (예컨대, GluN1/GRIN1; GluN2A/GRIN2A; GluN2B/GRIN2B; GluN2C/GRIN2C; GluN2D/GRIN2D; GluN3A/GRIN3A; GluN3B/GRIN3B)를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 이온성 GABA 수용체로는 GABAA 수용체를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 기능성 뉴런은 대사성 신경전달물질 수용체, 예컨대, 대사성 글루타메이트 수용체 (예컨대, mGluR1, mGluR5, mGluR2, mGluR3, mGluR4, mGluR6, mGluR7, mGluR8,), 및 대사성 GABA 수용체 (예컨대, GABAB 수용체)를 발현한다. 일부 실시양태에서, 기능성 뉴런은 도파민 수용체의 한 타입, D1-유사 패밀리 도파민 수용체, 예컨대, D1 및 D5 수용체 (D1R 및 D5R), 또는 D2-유사 패밀리 도파민 수용체, 예컨대, D2, D3, 및 D4 수용체 (D2R, D3R, 및 D4R)를 발현한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 바와 같은 기능성 뉴런은 또 다른 뉴런과 함께 전기적 시냅스를 형성한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 바와 같은 기능 뉴런은 그 자신과 함께, 자기 시냅스로 알려진, 화학적 또는 전기적 시냅스(들)를 형성한다.
기능 뉴런의 특징은 당업자가 이용할 수 있는 일반 기술에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 기능성 뉴런의 전기적 특성, 예컨대, 활동 전위의 발화 및 신경전달물질 방출에 대한 시냅스후 반응은 예컨대, 패치 클램프 기록 (예컨대, 전류 클램프 및 전압 클램프 기록), 세포내 기록, 및 세포외 기록 (예컨대, 4극관 기록, 단일-와이어 기록, 및 장 전위 기록)과 같은 기술에 의해 조사될 수 있다. 기능성 뉴런의 특정 특성 (예컨대, 이온 채널 발현 및 휴지막 전위) 또한 패치 클램프 기록에 의해 조사될 수 있고, 여기서, 예컨대, 세포-부착식 패치, 인사이드-아웃 패치, 아웃사이드-아웃 패치, 전체-세포 기록, 천공식 패치, 느슨한 패치와 같은, 패치 클램프 기록의 상이한 변이형이 다른 목적을 위해 적용될 수 있다. 전기적 방법에 의한 시냅스후 반응 평가는 시냅스전 뉴런의 전기적 자극, 신경전달물질 적용, 또는 수용체 효능제 또는 길항제와 커플링될 수 있다. 일부 경우에서, AMPA-타입 글루타메이트 수용체-매개 시냅스후 전류는 AMPA 수용체 효능제, 예컨대, AMPA, 또는 길항제, 예컨대, 2,3-디히드록시-6-니트로-7-술파모일-벤조퀴녹살린 (NBQX) 또는 6-시아노-7-니트로퀴녹살린-2,3-디온 (CNQX)에 의해 평가될 수 있다. 일부 경우에서, NMDA-타입 글루타메이트 수용체-매개 시냅스후 전류는 NMDA 수용체 효능제, 예컨대, NMDA 및 글리신, 또는 길항제, 예컨대, AP5 및 케타민에 의해 평가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 기능성 뉴런은 전기적 접근법 이외의 다른 기술에 의해 조사된다. 예를 들어, 다양한 형광성 염료 또는 유전적으로 코딩된 형광성 단백질 및 영상화 기술에 대한 최근의 개발은 기능성 뉴런에 의해 전달되거나, 또는 전송되는 전기적 신호를 모니터링하는 데 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 칼슘-의존성 형광성 염료 (예컨대, 칼슘 인디케이터), 예컨대, 그러나, 제한 없이, 푸라(fura)-2, 인도(indo)-1, 플루오(fluo)-3, 플루오-4, 및 칼슘 그린(Calcium Green)-1, 및 칼슘-의존성 형광성 단백질, 예컨대, 그러나, 제한 없이, 카멜레온(Cameleon), FIP-CBSM, 페리캄(Pericam), GCaMP, TN-L15, TN-humTnC, TN-XL, TN-XXL, 및 트위치(Twitch's)가 뉴런 막 전위의 인디케이터로서 칼슘 유입 및 유출을 추적하는 데 사용될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 전압 변화에 대한 반응으로 그의 스펙트럼 특성에 변화를 줄 수 있는 전압-감수성 염료 또한 뉴런 활동을 모니터링하는 데 사용될 수 있다.
신경전달물질 방출은 기능성 뉴런의 중요한 측면일 수 있다. 본원에 제공된 방법은 비-뉴런 세포를, 특정 타입의 신경전달물질을 방출하는 기능성 뉴런으로 리프로그래밍하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 기능성 뉴런은 신경전달물질, 예컨대, 그러나, 제한 없이, 글루타메이트, GABA, 아세틸콜린, 아스파르테이트, D-세린, 글리신, 산화질소 (NO), 일산화탄소 (CO), 황화수소 (H2S), 도파민, 노르에피네프린 (노르아드레날린으로도 공지), 에피네프린 (아드레날린), 히스타민, 세로토닌, 펜에틸아민, N-메틸펜에틸아민, 티라민, 3-아이오도티로나민, 옥타파민, 트립타민, 소마토스타틴, 물질 P, 오피오이드 펩티드, 아데노신 트리포스페이트 (ATP), 아데노신, 및 아난다미드를 방출한다. 일부 실시양태에서, 기능성 뉴런은 주요 신경전달물질로서 도파민을 방출한다. 일부 실시양태에서, 기능성 뉴런은 1 초과의 신경전달물질 타입을 방출한다. 일부 실시양태에서, 기능성 뉴런은 활동 전위에 대한 반응으로 신경전달물질을 방출한다. 일부 실시양태에서, 기능성 뉴런은 차등 전기적 전위 (예컨대, 활동 전위를 유도하기 위한, 임계값을 초과하지 않는 막 전위 변화)에 대한 반응으로 신경전달물질을 방출한다. 일부 실시양태에서, 기능성 뉴런은 기저 수준의 신경전달물질 방출 (예컨대, 자발적 신경전달물질 방출)을 나타낸다. 본원에 기술된 바와 같은, 기능성 뉴런으로부터의 신경전달물질 방출은 당업계의 숙련가가 이용가능한 다양한 기술에 의해 평가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 영상화 접근법은 예를 들어, 소포 단백질을 포함하는 유전적으로 코딩된 형광성 융합 분자를 영상화하여 시냅스전 막에 융합된 시냅스 소포의 프로세스를 모니터링할 수 있으며, 이로써, 기능성 뉴런 신경전달물질 방출을 특징화하는 데 사용될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 특정 신경전달물질의 수준을 직접 모니터링하는 데 다른 방법이 적용될 수 있다. 예를 들어, HPLC 프로브는 배양 디쉬에서, 또는 기능성 뉴런이 그의 축삭돌기를 돌출시키는 뇌 영역 중의 도파민의 양을 측정하는 데 사용될 수 있다. HPLC에 의해 검출된 도파민 수준은 기능성 뉴런의 시냅스전 활동을 나타낼 수 있다. 일부 실시양태에서, 예컨대, 평가는 기능성 뉴런의 막 전위를 변화시키기 위해, 예컨대, 활동 전위를 유도하기 위해 기능성 뉴런의 자극과 커플링될 수 있다.
한 측면에서, 본 개시내용은 생체내에서 기능성 뉴런을 생성하는 방법을 제공한다. 예시적인 방법은 대상체의 신경계 중의 한 영역, 예컨대, 뇌 또는 척수에 신경계 중의 상기 영역, 예컨대, 뇌 또는 척수 중 비-뉴런 세포에서 세포-프로그래밍 작용제를 포함하는 조성물을 투여하는 단계, 및 비-뉴런 세포가 기능성 뉴런으로 리프로그래밍될 수 있도록 허용하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포-프로그래밍 작용제는 PTB의 발현 또는 활성을 억제시킨다. 일부 실시양태에서, 세포-프로그래밍 작용제는 NeuroD1 단백질, 또는 NeuroD1을 코딩하는 발현 구축물을 포함하지 않는다.
본 개시내용의 일부 실시양태에 따라, 본원에 제공된 방법은 대상체의 신경계 중의 한 영역, 예컨대, 뇌 또는 척수에 세포-프로그래밍 작용제를 직접 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포-프로그래밍 작용제는 신경계 중의 한 영역에 국소적으로 전달된다. 한 실시양태에서, 세포-프로그래밍 작용제, 예컨대, 그러나, 제한 없이, 바이러스 벡터, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 소분자 억제제, 또는 발현 카세트를 포함하는 조성물은 뇌 영역으로의 입체정위 또는 대류 강화 전달에 의해 대상체 또는 유기체에게 투여된다. 당업자는 입체정위 체위유지 시스템을 사용하여, 세포-프로그래밍 작용제를 포함하는 조성물을 투여하고자 하는 특정 뇌 영역을 국재화할 수 있을 것이다. 상기 방법 및 장치는 대상체 또는 유기체에게 본원에서 제공되는 바와 같은 조성물을 전달하는 데 쉽게 이용될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본원에서 제공되는 바와 같은 조성물은 전신으로 대상체에게, 또는 신경계 중의 한 영역, 예컨대, 뇌 또는 척수에 전달되고, 예컨대, 뇌척수액 또는 뇌실에 전달되고, 조성물은 대상체의, 신경계 중의 특정 영역으로 또는 신경계 중 특정 타입의 세포로 세포-프로그래밍 작용제를 재국재화하도록 구성된 하나 이상의 작용제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에서 사용되는 세포-프로그래밍 작용제는 항-PTB shRNA, 항-PTB 마이크로RNA, 우성 음성 PTB 돌연변이체, 또는 폴리피리미딘 트랙을 함유하는 스펀지 폴리리보뉴클레오티드를 발현하는 바이러스를 포함하고, 본 방법은 원하는 뇌 영역에 입체정위 방식으로 바이러스를 주사하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 아데노바이러스, 렌티바이러스, 아데노-연관 바이러스 (AAV), 폴리오바이러스, 단순 포진 바이러스 (HSV), 또는 뮤린 말로니-기반 바이러스를 포함한다. 본원에 제공된 방법에서 사용될 수 있는 AAV는 임의의 적절한 혈청형의 AAV, 예컨대, 그러나, 제한 없이, AAV2, AAV5, AAV6, AAV7, 및 AAV8일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 신경계 중의 한 영역, 예컨대, 뇌 또는 척수 중 비-뉴런 세포에서 PTB의 발현 또는 활성을 억제시키는 작용제를 발현하는 AAV2-기반 바이러스 벡터를 전달하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포-프로그래밍 작용제는 PTB의 소분자 억제제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 기술된 바와 같이, 본원에 제공된 방법은 다양한 비-뉴런 세포를 성숙한 뉴런으로 리프로그래밍하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 대상체의 신경계 중의 한 영역, 예컨대, 뇌 또는 척수에 신경계 중의 다양한 비-뉴런 세포, 예컨대, 그러나, 제한 없이, 신경교 세포, 예컨대, 성상세포, 희소돌기아교세포, NG2 세포, 위성 세포, 또는 뇌실막 세포에서 PTB의 발현 또는 활성을 억제시키는 세포-프로그래밍 작용제를 포함하는 조성물을 투여하는 단계, 및 비-뉴런 세포가 기능성 뉴런으로 리프로그래밍될 수 있도록 허용하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 대상체의 신경계 중의 한 영역, 예컨대, 뇌 또는 척수 중의 성상세포를 기능성 뉴런으로 리프로그래밍하는 단계를 포함한다.
상기 논의된 바와 같이, 본원에 제공된 방법은 특정 뇌 영역 중의 비-뉴런 세포를 기능성 뉴런으로 리프로그래밍하는 단계를 포함한다. 본원에 제공된 방법에서 사용될 수 있는 예시적인 뇌 영역은 후뇌, 중뇌, 또는 전뇌 중 임의 부분에 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 대상체의 중뇌, 선조체, 또는 피질에 중뇌 중 비-뉴런 세포에서 PTB의 발현 또는 활성을 억제시키는 세포-프로그래밍 작용제를 포함하는 조성물을 투여하는 단계, 및 비-뉴런 세포가 기능성 뉴런으로 리프로그래밍될 수 있도록 허용하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 대상체의 중뇌에 중뇌 중 비-뉴런 세포에서 PTB의 발현 또는 활성을 억제시키는 세포-프로그래밍 작용제를 포함하는 조성물을 투여하는 단계, 및 비-뉴런 세포가 기능성 뉴런으로 리프로그래밍될 수 있도록 허용하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 비-뉴런 세포를 뇌 영역, 예컨대, 그러나, 제한 없이, 연수, 연수 피라미드, 올리브체, 동측 하올리브핵, 문측 복외측 연수, 미측 복외측 연수, 고립핵, 호흡 중추-호흡군, 등측 호흡군, 복측 호흡군 또는 지속성흡식 중추, 프리-뵈트징어 복합체(pre-botzinger complex), 뵈트징어 복합체(botzinger complex), 역능형체핵, 역안면핵, 역의핵, 주변의핵, 정중곁망상핵, 거대세포 망상핵, 안면주위 영역, 설상핵, 널판핵, 설하신경 주위 핵, 중간핵, 전위치핵, 설하핵, 최하 구역, 수질 뇌 신경 핵, 하부 침전핵, 의핵, 등측 미주 신경 핵, 설하신경핵, 후뇌, 뇌교, 교핵, 뇌교 뇌 신경 핵, 3차 신경 감각 핵의 치프 또는 뇌교 핵, 3차 신경에 대한 운동 핵 (v), 외전신경핵 (vi), 안면 신경 핵 (vii), 전정와우신경핵 (전정신경핵 및 와우신경핵) (viii), 상타액핵, 뇌교 피개, 뇌교 배뇨 중추 (배링턴핵), 청반, 각뇌교핵, 외측등측 피개 핵, 피개 뇌교 망상핵, 팔곁 구역, 내측 팔곁 핵, 외측 팔곁 핵, 부팔곁 핵 (쾰리커-융합 핵), 뇌교 호흡군, 상부 올리브 복합체, 내측 상부 올리브, 외측 상부 올리브, 능형체의 내측 핵, 정중곁뇌교 망상 형성, 소세포 망상핵, 미측 뇌교 망상핵, 소뇌 뇌각, 상부 소뇌 뇌각, 중간 소뇌 뇌각, 하부 소뇌 뇌각, 제4뇌실, 소뇌, 소뇌 충부, 소뇌 반구, 전두엽, 후두엽, 편엽 소절엽, 소뇌 핵, 꼭지 핵, 삽입 핵, 구상핵, 전상핵, 치상핵, 중뇌 (중뇌(mesencephalon)), 중뇌개, 사구체, 하구, 상구, 전개, 피개, 수도관주위회색질, 내측 종속의 문측 간질핵, 중뇌 망상 형성, 등측솔기핵, 적핵, 복측 피개 영역, 팔곁 색소 핵, 주위흑색질 핵, 돌기내측 피개 핵, 미측 선형 핵, 솔기의 문측 선형 핵, 속간 핵, 흑색질, 치밀부, 망상부, 경간핵, 대뇌 뇌각, 대뇌각, 중간 뇌 신경 핵, 동안신경핵 (iii), 에딘거-웨스트팔핵, 활차신경핵 (iv), 중뇌 관 (대뇌 수도, 중뇌 수도), 전뇌 (앞뇌), 간뇌, 시상상부, 송과체, 고삐 핵, 수질선조, 시상띠, 제3뇌실, 맞교차밑기관, 시상, 전측 핵군, 전복측 핵 (별칭: 복측 전측 핵), 전등측핵, 전내측 핵, 내측 핵군, 내측 등측핵, 정중선 핵군, 복막 핵, 재결합핵, 장능형 핵, 판내 핵군, 중심정중 핵, 속곁 핵, 중심옆 핵, 중심 외측 핵, 외측 핵군, 외측 등측핵, 외측 후측 핵, 시상베개, 복측 핵군, 복측 전측 핵, 복측 외측 핵, 복측 후측 핵, 복측 후측 외측 핵, 복측 후측 내측 핵, 시상후부, 내측 슬상체, 외측 슬상체, 시상 망상핵, 시상하부 (변연계) (hpa 축), 전측, 내측 구역, 시각전 구역의 일부분, 내측 시각전 핵, 시교차상핵, 뇌실곁핵, 시신경교차상 핵 (대부분), 전측 시상하부 핵, 외측 구역, 시각전 구역의 일부분, 외측 시각전 핵, 외측 핵의 전측 부, 시신경교차상 핵의 일부분, 시각전 구역의 다른 핵, 중앙 시각전 핵, 뇌실주위 시각전 핵, 융기, 내측 구역, 등내측 시상하부 핵, 복내측 핵, 궁상핵, 외측 구역, 외측 핵 융기부, 외측 융기 핵, 후측, 내측 구역, 유두상 핵, 후측 핵, 외측 구역, 외측 핵의 후측 부분, 시신경교차, 뇌활밑 기관, 뇌실주위 핵, 뇌하수체 줄기, 회백융기, 융기 핵, 융기유두상 핵, 융기 영역, 유두상체, 유두상 핵, 시상하부, 시상하핵, 불확정 구역, 뇌하수체, 신경뇌하수체, 하수체 중간엽 (중간엽), 선뇌하수체, 전두엽, 두정엽, 후두엽, 측두엽, 소뇌, 뇌간, 반란원중심, 방사관, 내섬유막, 외포, 최외포, 피질하부, 해마, 치아이랑, 암몬각 (CA 구역), 암몬각 구역 1 (CA1), 암몬각 구역 2 (CA2), 암몬각 구역 3 (CA3), 암몬각 구역 4 (CA4), 편도체, 편도체의 중심 핵, 편도체의 내측 핵, 편도체의 피질 및 기저내측 핵, 편도체의 외측 및 기저외측 핵, 확장된 편도체, 종말선조, 분계선조 침상 핵, 대상색, 기저핵, 선조체, 등측선조체, 조가비핵, 미상핵 핵, 복측 선조체, 측중격핵, 후각 결절, 담창구, 복측 창백핵, 시상하 핵, 기저 전뇌, 전측 관통질, 무명질, 기저핵, 브로카 대각섬유줄, 격막핵, 내측 격막핵, 종말판, 종말판 혈관 기관, 후각뇌 (옛겉질), 후신경구, 후각로, 전측 후각 핵, 이상 피질, 전측 교련, 구상회, 편도체 주위 피질, 대뇌 피질, 전두엽, 피질, 1차 운동 피질 (중심전회, M1), 보조 운동 피질, 전운동 피질, 전두엽전 피질, 안와전두 피질, 등외측 전두엽전 피질, 이랑, 상전두회, 중간 전두회, 하전두회, 브로드만 영역(Brodmann area) 4, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 24, 25, 32, 33, 44, 45, 46, 및 47, 두정엽, 피질, 1차 체성감각 피질 (S1), 2차 체성감각 피질 (S2), 후측 두정 피질, 이랑, 중심후회 (1차 체성감각 영역), 설전부, 브로드만 영역 1, 2, 3, 5, 7, 23, 26, 29, 31, 39, 및 40, 후두엽, 피질, 1차 시각 피질 (V1), v2, v3, v4, v5/mt, 이랑, 외측 후두엽 이랑, 설상부, 브로드만 영역 17 (V1, 1차 시각 피질); 18, 및 19, 측두엽, 피질, 1차 청각 피질 (A1), 2차 청각 피질 (A2), 하측두 피질, 후측 하측두 피질, 이랑, 상측두 이랑, 중간 측두 이랑, 하측두 이랑, 내후각 피질, 후각주위 피질, 해마곁이랑, 방추형 이랑, 브로드만 영역 20, 21, 22, 27, 34, 35, 36, 37, 38, 41, 및 42, 내측 상측두 영역 (MST), 섬 피질, 대상회 피질, 전측 대상회, 후측 대상회, 팽대후부 피질, 회백초, 슬하 영역 25, 및 브로드만 영역 23, 24; 26, 29, 30 (팽대후부 영역); 31, 및 32 중 기능성 뉴런으로 리프로그래밍하는 단계를 포함한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 생체내에서 도파민성 뉴런을 생성하는 방법을 제공한다. 예시적인 방법은 뇌 중 비-뉴런 세포에서 PTB의 발현 또는 활성을 억제시키는 세포-프로그래밍 작용제를 포함하는 조성물을 대상체의 뇌에 투여하는 단계, 및 비-뉴런 세포가 도파민성 뉴런으로 리프로그래밍될 수 있도록 허용하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 도파민성 뉴런을 생성하기 위해 조성물을 대상체의 중뇌 내로 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 흑색질 (SN) 내로 투여된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 복측 피개 영역 (VTA) 내로 투여된다
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 대상체의 신경계 중의 한 영역, 예컨대, 뇌 또는 척수에 상기 영역 중 비-뉴런 세포에서 PTB의 발현 또는 활성을 억제시키는 세포-프로그래밍 작용제를 포함하는 조성물을 투여하는 단계, 및 비-뉴런 세포가 상기 영역에서 우세한 서브타입의 기능성 뉴런으로 리프로그래밍될 수 있도록 허용하는 단계를 포함한다. 특정 이론으로 제한하고자 하지 않으면서, 본원에 제공된 방법은, 생체내에서 비-뉴런 세포를 기능성 뉴런으로 리프로그래밍할 때, 영역, 예컨대, 특정 뇌 영역에서 국소 유도 신호를 이용할 수 있다. 예를 들어, 도파민성 뉴런은 중뇌 영역, 예컨대, 흑색질 (SN), 복측 피개 영역 (VTA), 또는 후적색핵 영역 (RRF)에 클러스터링되어 있다. 국소 뉴런, 비-뉴런 세포, 예컨대, 성상세포, 소교세포, 또는 그 둘 모두, 또는 중뇌를 이루는 다른 국소 성분이 세포-프로그래밍 작용제의 유도하에 비-뉴런 세포로부터 생성되는 뉴런의 서브타입 분화에 기여할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 대상체의 뇌 영역에 상기 뇌 영역 중 복수의 비-뉴런 세포에서 PTB의 발현 또는 활성을 억제시키는 세포-프로그래밍 작용제를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 본 방법은 추가로 비-뉴런 세포 중 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 38%, 적어도 약 40%, 적어도 약 42%, 적어도 약 44%, 적어도 약 46%, 적어도 약 48%, 적어도 약 50%, 적어도 약 52%, 적어도 약 54%, 적어도 약 56%, 적어도 약 58%, 적어도 약 60%, 적어도 약 62%, 적어도 약 64%, 적어도 약 66%, 적어도 약 68%, 적어도 약 70%, 적어도 약 72%, 적어도 약 74%, 적어도 약 76%, 적어도 약 78%, 적어도 약 80%, 적어도 약 82%, 적어도 약 84%, 적어도 약 86%, 적어도 약 88%, 적어도 약 90%, 적어도 약 92%, 적어도 약 94%, 적어도 약 96%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%를 도파민성 뉴런으로 리프로그래밍하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 대상체의 뇌 영역에 상기 뇌 영역 중 복수의 비-뉴런 세포에서 PTB의 발현 또는 활성을 억제시키는 세포-프로그래밍 작용제를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 본 방법에 의해 생성되는 기능성 뉴런 중 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 38%, 적어도 약 40%, 적어도 약 42%, 적어도 약 44%, 적어도 약 46%, 적어도 약 48%, 적어도 약 50%, 적어도 약 52%, 적어도 약 54%, 적어도 약 56%, 적어도 약 58%, 적어도 약 60%, 적어도 약 62%, 적어도 약 64%, 적어도 약 66%, 적어도 약 68%, 적어도 약 70%, 적어도 약 72%, 적어도 약 74%, 적어도 약 76%, 적어도 약 78%, 적어도 약 80%, 적어도 약 82%, 적어도 약 84%, 적어도 약 86%, 적어도 약 88%, 적어도 약 90%, 적어도 약 92%, 적어도 약 94%, 적어도 약 96%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%는 도파민성 뉴런이다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에서 생성되는 도파민성 뉴런은 도파민, 티로신 히드록실라제 (TH), 도파민 수송체 (DAT), 소포 모노아민 수송체 2 (VMAT2), 엔그레일드 호메오박스 1 (En1), 핵 수용체 관련-1 (Nurr1), G-단백질-조절 내향성 칼륨 채널 2 (Girk2), 포크헤드 박스 A2 (FoxA2), 오르토덴티클 호메오박스 2 (OTX2) 및/또는 LIM 호메오박스 전사 인자 1 알파 (Lmx1a)를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 도파민성 뉴런의 하나 이상의 마커를 발현한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에서 생성되는 도파민 뉴런은 과분극-활성화 시클릭 뉴클레오티드-개폐 (HCN) 채널에 의해 매개될 수 있는 Ih 전류르르 나타낸다. Ih 전류는 과분극화 단계에 의해 활성화될 수 있는, 천천히 활성화되는 내향 전류인 것을 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, 전압 클램프 및 유지 전위하에 Vh는 -40 mV이고, 내향으로 천천히 활성화되는 전류는 도파민 뉴런에서 유발될 수 있고, 여기서, 역전 전위에 -30 mV에 가깝다. 본원에 제공된 방법에서 생성되는 도파민 뉴런의 특징인 Ih 전류의 활성화 곡선은 -50 내지 -120 mV 범위일 수 있고, 중간 활성화 지점은 -84-1 mV이다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에서 생성되는 도파민 뉴런은 천연 도파민성 뉴런과 유사한 유전자 발현 프로파일을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에서 생성되는 도파민 뉴런은 신경전달물질로서 도파민을 방출한다. 본원에 제공된 방법에서 생성되는 도파민 뉴런은 A9 (예컨대, Girk2에 대해 면역양성), A10 (예컨대, 칼빈딘-D28k에 대해 면역양성), A11, A12, A13, A16, Aaq, 및 종뇌 도파민 뉴런을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 도파민성 뉴런의 임의의 서브타입일 수 있다.
본 개시내용의 일부 실시양태에 따라, 본원에 제공된 방법은 대상체의 신경계 중의 한 영역, 예컨대, 뇌 또는 척수 중 비-뉴런 세포를 기능성 뉴런으로 리프로그래밍하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 논의되는 기능성 뉴런은 신경계에서 신경망 내로 통합된다. 본원에 기술된 바와 같이, 리프로그래밍된 기능성 뉴런은 국소 뉴런, 예컨대, 리프로그래밍된 기능성 뉴런에 인접한 뉴런과 시냅스 연결을 형성할 수 있다. 예를 들어, 리프로그래밍된 뉴런과 이웃하는 1차 뉴런 (예컨대, 글루타메이트성 뉴런), GABA성 뉴런간, 또는 다른 이웃하는 뉴런 (예컨대, 도파민성 뉴런, 아드레날린성 뉴런, 또는 콜린성 뉴런) 사이의 시냅스 연결은 리프로그래밍된 뉴런이 생체내에서 성숙화됨에 따라 형성될 수 있다. 국소 뉴런과의 이들 시냅스 연결 중에서, 리프로그래밍된 기능성 뉴런은 시냅스전 뉴런, 시냅스후 뉴런, 또는 그 모두일 수 있다. 일부 실시양태에서, 리프로그래밍된 기능성 뉴런은 축삭돌기 돌출부를 원위의 뇌 영역으로 보낸다. 예를 들어, 본원의 일부 실시양태에 따라 생성된 중뇌 영역 중의 도파민성 뉴런은, 중뇌 영역으로부터의 천연 도파민성 뉴런의 일반 표적인 선조체로 돌출될 수 있다. 본원의 일부 실시양태에 따라 생성된 중뇌 영역 중의 도파민성 뉴런은 미상핵 조가비핵, 측중격핵, 격막핵, 후각 결절, 또는 그의 조합으로 돌출될 수 있다. 본원의 일부 실시양태에 따라 생성된 중뇌 영역 중의 도파민성 뉴런은 중뇌 영역 중의 천연 도파민성 뉴런의 돌출 방향인 뇌 영역으로 돌출될 수 있다. 일부 실시양태에서, 리프로그래밍된 기능성 뉴런은 그 자체가 뇌 또는 척수 내의 하나 이상의 현존 신경 경로, 예를 들어, 제한하는 것은 아니지만, 상종속, 궁상속, 구상속, 관통로, 시상피질 방사, 뇌량, 전측 교련, 편도체원심성 경로, 시상간 유착, 후측 교련, 고삐 교련, 뇌궁, 유두피개속, 불확정시상하부 경로, 대뇌 뇌각, 내측 전뇌속, 내측 종속, 근간대 삼각, 중간피질 경로, 중뇌번연계 경로, 흑색질 선조체 경로, 결절누두 경로, 추체외로 계통, 추체로, 피질척수로 또는 뇌척수 섬유, 외측 피질척수로, 전측 피질척수로, 피질교뇌 섬유, 전두교뇌 섬유, 측두교뇌 섬유, 피질연수로, 피질중뇌로, 시개척수로, 간질척수로, 적색척수로, 적색올리브로, 올리브소뇌로, 올리브척수로, 전정척수로, 외측 전정척수로, 내측 전정척수로, 망상체척수로, 외측 솔기척수로, 후주-내측 섬유대 경로, 박속, 설상속, 내측 섬유대, 척수시상로, 외측 척수시상로, 전측 척수시상로, 척수중뇌로, 척수소뇌로, 척수올리브로, 및 척수망상체로으로 통합될 수 있다. 특정 이론에 의해 제한하고자 하지 않으면서, 국소 세포 환경은 본 개시내용의 일부 실시양태에 따라 생성되는 기능성 뉴런의 돌출부와 상관관계를 가질 수 있다. 예를 들어, 본원에 제공된 방법의 일부 실시양태에 따라 중뇌에서 생성되는 기능성 뉴런은 중뇌의 국소 환경에서 다른 세포, 예를 들어, 다른 천연 도파민성 뉴런, 또는 일반 표적 뇌 영역으로 돌출되는 천연 도파민성 뉴런의 축삭돌기 성장을 위한 가이던스 신호를 방출하는 세포에 의해 영향을 받을 수 있다.
한 측면에서, 본 개시내용은 신경계 중의 한 영역에서 기능성 뉴런의 퇴행과 연관된 신경 병태를 치료하는 방법을 제공한다. 예시적으로 그를 필요로 하는 대상체의 신경계, 예컨대, 뇌 또는 척수 영역에 상기 영역 중 비-뉴런 세포에서 PTB의 발현 또는 활성을 억제시키는 세포-프로그래밍 작용제를 포함하는 조성물을 투여하는 단계, 비-뉴런 세포가 기능성 뉴런으로 리프로그래밍될 수 있도록 허용하여 상기 영역 중 퇴행된 기능성 뉴런을 보충하는 단계를 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에 따라, 본원에 제공된 방법은 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅톤병, 조현병, 우울증, 및 약물 중독을 포함하나, 이에 제한되지 않는 신경 병태를 치료하는 것을 포함한다. 적용가능한 신경 병태는 또한 척수에서의 뉴런 손실과 연관된 장애, 예컨대, 그러나, 제한 없이, 근위축성 측경화증 (ALS) 및 운동 뉴런 질환을 포함할 수 있다. 본원에 제공된 방법은 또한 상염색체 우성 소뇌 운동 실조증, 샬레보익스-사그네(Charlevoix-Saguenay)의 상염색체 열성 강직성 운동 실조증, 피질기저부 퇴행, 피질기저부 증후군, 크로이펠트 야콥병(Creutzfeldt-Jakob disease), 취약 X-연관 떨림/운동 실조증 증후군, 염색체 17 연관 전측두엽 치매 및 파킨슨병, 쿠포르-라벱 증후군(Kufor-Rakeb syndrome), 라임병, 마카도-조셉 병(Machado-Joseph disease), 니만-피크병(Niemann-Pick disease), 교뇌소뇌 저형성증(pontocerebellar hypoplasia), 레프숨병(Refsum disease), 피루베이트 데히드로게나제 복합체 결핍증, 샌드호프병(Sandhoff disease), 샤이-드래거 증후군(Shy-Drager syndrome), 테이-삭스병(Tay-Sachs disease), 및 와블리 헤지호그 증후군(Wobbly hedgehog syndrome)을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 신경퇴행성 질환의 하나 이상의 증상을 치료 또는 호전시키는 데에서의 용도를 찾을 수 있다. 본원에서 제공되는 바, "신경퇴행" 또는 그의 문법상 등가 용어는 뉴런 사멸을 비롯한, 뉴런의 구조, 기능, 또는 그 둘 모두의 점진적인 손실을 지칭할 수 있다. 신경퇴행은 임의 타입의 기전에 기인할 수 있다. 본원에 제공된 방법이 적용될 수 있는 신경 병태의 병인은 임의의 것일 수 있다. 신경 병태는 유전성 또는 산발성일 수 있거나, 유전자 돌연변이, 단백질 미스폴딩, 산화적 스트레스, 또는 환경적 스트레스 (예컨대, 독소 또는 약물 남용)에 기인하는 것이다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 뇌 영역에서 도파민성 뉴런의 퇴행과 연관된 신경 병태를 치료한다. 다른 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 임의 타입의 뉴런, 예컨대, 그러나, 제한 없이, 글루타메이트성 뉴런, GABA성 뉴런, 콜린성 뉴런, 아드레날린성 뉴런, 도파민성 뉴런, 또는 신경전달물질 아스파르테이트, D-세린, 글리신, 산화질소 (NO), 일산화탄소 (CO), 황화수소 (H2S), 노르에피네프린 (노르아드레날린으로도 공지), 히스타민, 세로토닌, 펜에틸아민, N-메틸펜에틸아민, 티라민, 3-아이오도티로나민, 옥타파민, 트립타민, 소마토스타틴, 물질 P, 오피오이드 펩티드, 아데노신 트리포스페이트 (ATP), 아데노신, 또는 아난다미드를 방출하는 임의의 다른 적절한 타입 뉴런의 퇴행과 연관된 신경 병태를 치료한다. 본원에 제공된 방법은 임의 영역, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 중뇌 영역 (예컨대, 흑색질 또는 복측 피개 영역), 전뇌 영역, 후뇌 영역, 또는 척수에서의 뉴런 퇴행과 연관된 신경 병태를 치료하는 데에서의 용도를 찾을 수 있다. 본원에 제공된 방법은 뉴런 퇴행과 연관된 신경 병태를 치료하기 위해 신경계 중 임의의 적절한 영역(들)에서 비-뉴런 세포를 기능성 뉴런으로 리프로그래밍하는 단계를 포함할 수 있다.
본원에 제공된 방법은 파킨슨병과 연관된 하나 이상의 증상을 치료 또는 호전시키는 데에서의 용도를 찾을 수 있다. 파킨슨병은 흑색질 치밀부 (SNpc) 중의 도파민성 뉴런의 기능적 손상 또는 사멸이 조기에 두드러지게 나타나는 신경퇴행성 질환이다. 기저핵 내에서의 생성된 도파민 결핍이 고전적 파킨슨병 운동 증상을 특징으로 하는 운동 장애를 일으킬 수 있다. 파킨슨병은 또한 다수의 비-운동 증상과 연관이 있을 수 있다. 파킨슨병의 한 진단 표준은 사후 병리조직학적 검사에서 SNpc 퇴행 및 루이 병리(Lewy pathology)의 존재일 수 있다. 루이 병리는 루이체(Lewy body) 및 루이 신경돌기로 불리는 α-시누클레인 단백질의 비정상적인 응집체를 포함할 수 있다. 파킨슨병 환자는 운동 증상 및 비-운동 증상을 비롯한 다수의 증상을 나타낼 수 있다. 본원에 제공된 방법은 파킨슨병과 연관된 이들 운도 또는 비-운동 증상 중 하나 이상의 것을 치료 또는 호전시킬 수 있다. 파킨슨병의 운동 증상 (파킨슨병 증상)은 운동느림(bradykinesia) (서동), 경직, 균형 장애, 발을 질질 끄는 보행, 및 자세의 불안정을 포함할 수 있다. 파킨슨병 환자에서의 운동 특징은 불균일할 수 있는데, 이는 상기 질환의 서브타입, 예를 들어, 떨림-우성 파킨슨병 (비교적 다른 운동 증상은 없음), 비-떨림-우성 파킨슨병 (무동성-강직 증후군 및 자세의 불안정 보행 장애로 기술되는 표현형을 포함할 수 있음), 및 중증도가 유사한 여러 운동 증상과의 혼합형 또는 불확정 표현형을 갖는 추가의 서브군으로 분류하고자 하는 시도를 촉발시켰다. 파킨슨병의 비-운동 증상으로는 후각 기능장애, 인지 기능장애, 정신과적 증상 (예컨대, 우울증), 수면 장애, 자율신경계 장애, 동통, 및 피로를 포함할 수 있다. 이러한 증상은 조기 파킨슨병에서 공통된 것일 수 있다. 비-운동 특징은 파킨슨병에서 고전적 운동 증상의 발병 이전에 빈번하게 나타낼 수 있다. 본 질환의 운동전 또는 전조단계는 후각 장애, 변비, 우울증, 과도한 주간 졸음, 및 빠른 눈 운동 수면 행동 장애를 특징으로 할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 파킨슨병을 완화시키거나, 또는 그의 진행을 저속화시킬 수 있다. 파킨슨병의 진행은 운동 특징의 악화를 특징으로 할 수 있다. 상기 질환이 진행됨에 따라, 운동 및 비-운동 요동, 이상운동증(dyskinesia), 및 정신병을 비롯한, 장기간의 증후성 치료와 관련된 합병증이 나타날 수 있다.
파킨슨병의 한 병리적 특징은 흑색질, 예컨대, 흑색질 치밀부 (SNpc) 내에서의 도파민성 뉴런 손실일 수 있다. 일부 실시양태에 따라, 본원에 제공된 방법은 환자의 흑색질 (예컨대, SNpc)에서 기능적 도파민 뉴런을 보충한다. 파킨슨병에서의 뉴런 손실은 청색 반점, 메이너트(Meynert) 기저핵, 각뇌교핵, 솔기핵, 미주신경의 등측 운동 핵, 편도체, 및 시상하부를 비롯한 다수의 다른 뇌 영역에서도 발생할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 바와 같은, 대상체에서 파킨슨병의 하나 이상의 증상을 치료 또는 호전시키는 방법은 파킨슨병 환자에서 뉴런 손실을 경험한 뇌 영역에서 비-뉴런 세포를 기능성 뉴런으로 리프로그래밍하는 단계를 포함한다.
본원에 제공된 방법은 상이한 병인의 파킨슨병을 치료하는 데에서의 용도를 찾을 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 유전자 돌연변이, 예컨대, 그러나, 제한 없이, 유전자 SNCA, LRRK2, VPS35, EIF4G1, DNAJC13, CHCHD2, 파킨(Parkin), PINK1, DJ-1, ATP13A2, C9ORF72, FBXO7, PLA2G6, POLG1, SCA2, SCA3, SYNJ1, RAB39B, 및 가능하게는 22q11.2 미세결실 증후군에서 영향을 받은 하나 이상의 유전자의 돌연변이의 결과로서 파킨슨병이 존재할 수 있다. 또는 유전 형질이 공지되지 않는 파킨슨병도 존재할 수 있다.
본원에서 제공되는 바, 본원에 제공된 방법이 호전시킬 수 있는 파킨슨병의 하나 이상의 증상은 상기 기술된 바와 같은 운동 증상 및 비-증상 뿐만 아니라, 다른 수준의 병리적 특징도 포함할 수 있다. 예를 들어, 파킨슨병 환자의 뇌에서의 도파민 신호전달 감소는 신경 회로망 내로 통합될 수 있고, 도파민 뉴런 돌출부를 적절한 뇌 영역, 예컨대, 선조체로 복원할 수 있는 기능적 도파민 뉴런을 보충함으로써 본원에 제공된 방법에 의해 역전 또는 완화될 수 있다.
한 측면에서, 본 개시내용은 또한 정상 수준과 비교하여 감소된 양의 도파민생물발생을 갖는 대상체에서 도파민 방출을 회복시키는 방법을 제공한다. 예시적인 방법은 대상체의 뇌 영역에서 비-뉴런 세포를 리프로그래밍하는 단계, 및 비-뉴런 세포가 도파민성 뉴런으로 리프로그래밍될 수 있도록 허용하여 감소된 양의 도파민의 적어도 50%를 회복시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 리프로그래밍은 대상체의 뇌 영역에, 뇌 영역 중 비-뉴런 세포에서 PTB의 발현 또는 활성을 억제시키는 세포-프로그래밍 작용제를 포함하는 조성물을 투여함으로써 수행된다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 감소된 양의 도파민의 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 98%를 회복시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 감소된 양의 도파민의 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 98%, 또는 약 100%를 회복시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 감소된 양의 도파민의 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 98%를 회복시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 감소된 양의 도파민의 적어도 약 50%를 회복시킨다.
한 측면에서, 본 개시내용은 비-뉴런 세포에서 PTB의 발현 또는 활성을 억제시킴으로써 포유동물의 비-뉴런 세포를 성숙한 뉴런으로 리프로그래밍하는 데 효과적인 양으로 세포-프로그래밍 작용제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 예시적인 제약 조성물은 제약상 허용되는 담체 또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 기술된 바와 같이, 본원에서 제공되는 바와 같은 세포-프로그래밍 작용제는 작은 화학 분자, 간섭 RNA, 짧은 헤어핀 RNA, 마이크로RNA, 우성 음성 돌연변이체, 리보자임, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 단백질 억제제, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 펩티드, 또는 임의 형태의 변형된 핵산일 수 있다.
본원에서 제공되는 제약 조성물은 하나 이상의 담체 및 부형제 (제한하는 것은 아니지만, 완충제, 탄수화물, 만닛톨, 단백질, 펩티드 또는 아미노산, 예컨대, 글리신, 항산화제, 정균제, 킬레이트화제, 현탁화제, 증점제 및/또는 보존제 포함), 물, 페트롤레움, 동물, 식물 또는 합성 기원의 것, 예컨대, 땅콩유, 대두유, 미네랄 오일, 참깨유 등을 포함하는 오일, 염수 용액, 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액, 향미제, 착색제, 탈점착제 및 다른 허용되는 첨가제, 또는 결합제, 생리 조건과 유사하도록 만들기 위해 필요한 경우, 다른 제약상 허용되는 보조 물질, 예컨대, pH 완충화제, 장성 조절제, 유화제, 습윤화제 등을 포함할 수 있다. 부형제의 예로는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 초크, 실리카겔, 스테아르산나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 탈지분유, 글리세롤, 프로필렌, 글리골, 물, 에탄올 등을 포함한다. 또 다른 경우, 조성물은 실질적으로 보존제를 함유하지 않는다. 다른 실시양태에서, 조성물은 적어도 하나의 보존제를 함유한다. 제약 투여 형태에 관한 일반적인 방법은 문헌 [Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (Lippencott Williams & Wilkins, Baltimore Md. (1999))]에서 살펴볼 수 있다. 본원에 기술된 제약 조성물을 투여하는 데 당업계의 숙련가에게 공지된 임의의 적합한 담체가 사용될 수 있지만, 담체 타입은 투여 모드에 의존하여 달라질 수 있다는 것을 이해할 것이다. 적합한 제제 및 추가 담체는 문헌 [Remington "The Science and Practice of Pharmacy" (20th Ed., Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore Md.)]에 기술되어 있고, 그의 교시는 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다. 예시적인 제약 조성물은 주사, 흡입, 비경구적 투여, 정맥내 투여, 피하 투여, 근육내 투여, 진피내 투여, 국소 투여, 또는 경구적 투여용으로 제제화될 수 있다. 당업계의 숙련가가 이해하는 바와 같이, 제약 조성물은 세포-프로그래밍 작용제의 타입 및 조성물이 디자인되는 용도의 투여 경로에 의존하여 임의의 적절한 담체 또는 부형제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 제공된 세포-프로그래밍 작용제를 포함하는 조성물은 비경구적 투여용으로 제제화될 수 있고, 앰플, 미리 충전된 시린지, 소량의 주입물 중 단위 용량 형태로 또는 보존제가 첨가된 다회 투약용 용기 중에서 제공될 수 있다. 조성물은 오일성 또는 수성 비히클 중 현탁제, 액제, 또는 에멀젼, 예를 들어, 수성 폴리에틸렌 글리콜 중 액제와 같은 형태를 취할 수 있다. 예를 들어, 주사용 제제의 경우, 비히클은 수용액 또는 오일 현탁액, 또는 참깨유, 옥수수유, 면실유, 또는 땅코유 뿐만 아니라, 엘리시르, 만닛톨, 덱스트로스, 또는 멸균 수용액 및 유사한 제약 비히클과 같이, 당업자에게 적합한 것으로 공지된 것으로부터 선택될 수 있다. 제제는 또한 예컨대, 폴리(락틱-코-글리콜)산과 같은, 생체적합성, 생체분행성, 중합체 조성물을 포함할 수 있다. 이러한 물질은 마이크로스피어 또는 나노스피어로 제조될 수 있고, 그에 약물이 적재될 수 있고, 추가로 코팅되거나, 또는 유도체화되어 우수한 지속 방출형 성능을 제공할 수 있다. 안구주위 또는 안구내 주사에 적합한 비히클은 예를 들어, 주사 등급의 물 중 활성제로 이루어진 현탁액, 리포솜, 및 친유성 물질에 적합한 비히클 및 당업계에 공지된 것을 포함한다. 본원에서 제공되는 조성물은 세포-프로그래밍 작용제 및 제약상 허용되는 담체 또는 부형제 이외의 추가 작용제를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 추가 작용제는 뉴런 생존 목적을 촉진시키기 위해 제공될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 추가 작용제는 약력학적 목적을 모니터링하기 위해 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 투과 증진제로서 또는 활성 성분, 예컨대, 세포-프로그래밍 작용제의 지속 방출 또는 방출 조절을 위해 추가 작용제를 포함한다.
본원에서 제공되는 조성물은 약 0.0005, 0.001, 0.002, 0.005, 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.15, 0.2, 0.25, 0.3, 0.35, 0.4, 0.45, 0.5, 0.55, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0 mL 또는 그 초과의 투여량 부피로 대상체에게 투여될 수 있다. 조성물은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10회 또는 그 초과의 투약 과정 요법으로 투여될 수 있다. 때때로, 조성물은 2, 3, 또는 4회 투약 과정 요법으로 투여될 수 있다. 때때로, 조성물은 1회 투약 과정 요법으로 투여될 수 있다.
2회 투약 과정 요법의 제1 용량 및 제2 용량의 투여는 약 0일, 1일, 2일, 5일, 7일, 14일, 21일, 30일, 2개월, 4개월, 6개월, 9개월, 1년, 1.5년, 2년, 3년, 4년, 5년, 10년, 20년, 또는 그 초과의 간격을 두고 진행될 수 있다. 본원에 기술된 조성물은 1일 1회, 주 1회, 2주마다 1회, 월 1회, 매년 1회, 매년 2회, 매년 3회, 매 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10년 또는 그 초과의 기간마다 1회 대상체에게 투여될 수 있다. 때때로, 조성물은 매 2, 3, 4, 5, 6, 7년 또는 그 초과의 기간마다 1회 대상체에게 투여될 수 있다. 때때로, 조성물은 1회 대상체에게 투여될 수 있다.
본 개시내용의 일부 실시양태는 세포 또는 조직 이식을 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 예시적인 방법은 시험관내에서 비-뉴런 세포를 뉴런으로 리프로그래밍하는 단계, 및 리프로그래밍된 뉴런을 대상체에서 뇌 영역 내로 이식하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 시험관내에서 리프로그래밍하는 것은 본원에 제공된 방법에 따라 수행될 수 있다. 예시적인 조성물은 본원에 제공된 방법의 임의의 실시양태에 따라 리프로그래밍된 뉴런을 포함할 수 있다.
다른 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 생체내에서 비-뉴런 세포를 뉴런으로 리프로그래밍하는 단계, 및 리프로그래밍된 뉴런을 외식하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 외식편은 리프로그래밍된 뉴런을 포함하는 뇌 조직을 포함한다. 일부 실시양태에서, 외식편은 대상체의 뇌 영역 내로 이식된다. 본원에서 제공되는 바, 본원에 제공된 방법에 따라 리프로그래밍된 뉴런의 이식을 사용하여 뉴런 손실과 연관된 병태를 앓는 대상체에서 퇴행된 뉴런을 보충할 수 있다.
본 개시내용의 일부 다른 측면은 본원에 제공된 방법의 임의의 실시양태에 따라 리프로그래밍된 뉴런을 포함하는 동물에 관한 것이다. 본원에서 제공되는 바, 동물은 임의의 포유동물일 수 있다. 동물은 인간일 수 있다. 동물은 비-인간 영장류, 예컨대, 그러나, 제한 없이, 레서스 원숭이, 게먹이 원숭이, 짧은 꼬리 원숭이, 돼지 꼬리 원숭이, 다람쥐 원숭이, 올빼미 원숭이, 개코원숭이, 침팬지, 마모셋 및 거미 원숭이일 수 있다. 동물은 연구용 동물, 유전자 변형 동물, 또는 임의의 다른 적절한 타입의 동물일 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 한 실시양태에 따라 리프로그래밍된 하나 이상의 뉴런을 포함하는 마우스 또는 래트가 제공될 수 있다. 본원에서는 또한 본 개시내용의 임의의 실시양태에 따라 리프로그래밍된 하나 이상의 뉴런을 포함하는 동물의 뇌 조직 (예컨대, 외식편)도 제공한다. 상기 뇌 조직은 생 뇌 조직일 수 있다. 일부 실시양태에서, 뇌 조직은 임의의 적절한 고정제에 의해 고정될 수 있다. 뇌 조직은 이식, 의학 연구, 기초 연구, 또는 임의 타입의 목적을 위해 사용될 수 있다.
본 개시내용은 본 방법이 신경퇴행 모델의 질환에 적용될 수 있다는 것을 입증한다. 예를 들어, 본 개시내용은 성상세포에서 뉴런으로의 전환 전략법이 화학적으로 유도된 파킨슨병 모델에서 작용할 수 있다는 것을 보여준다. 본 방법 및 조성물은 성상세포를 도파민성, 글루타메이트성 및 GABA성 뉴런을 비롯한 뉴런으로 전환시킬 수 있고, 이들 뉴런은 뇌에서 시냅스를 형성할 수 있고, 특히, 전환된 뉴런은 병변이 있는 흑색질 선조체 경로를 효율적으로 복원하여 측정가능한 파킨슨병의 표현형을 교정할 수 있다. 본 방법의 효과는 항-PTB ASO의 단일 투약을 이용함으로써 배양물 중 성상세포 (인간 및 마우스) 뿐만 아니라, 생체내 마우스 파킨슨병 모델에서도 입증되었다. 그 뿐만 아니라, 전환된 뉴런은 돌기를 선조체로 확장시킬 수 있다. 그러므로, 이러한 전략법은 파킨슨병을 치유할 수 있는 잠재능이 있으며, 이는 또한 매우 다양한 신경퇴행성 질환 (예컨대, 뉴런 기능장애와 연관된 다른 신경 질환)에도 적용가능하다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 접근법은 일단 PTB 억제제에 의해 리프로그래밍되고 나면, 점진적으로 성숙한 뉴런을 생산하는 두 포유동물의 성상세포 모두에서 이미 존재하고 있지만, 잠복성인 뉴런 성숙화 프로그램의 유전적 기반을 이용한다. 이러한 결과는 항-PTB ASO의 단일 투약 또는 siRNA를 포함하는 벡터의 전달을 이용하여 포유동물의 뇌 중 국소 성상세포로부터 뉴런을 생성할 수 있는, 임상적으로 실현가능한 접근법을 제공한다. PTB 넉다운-유도 뉴런의 표현형은 그가 생산되는 환경 및/또는 그의 유래 기점이 되는 성상세포와 함수관계일 수 있다.
본 개시내용은 성상세포의 뉴런으로의 강력한 전환을 입증한다 (예컨대, 흑색질 중 도파민 뉴런, 그의 일부는 돌출부를 선조체로 보내고, 흑색질 선조체 도파민 경로의 복원에 대한 증거를 제공한다). 더욱 특히, 본 개시내용은 화학적으로 유도된 마우스 파킨슨병 (PD) 모델에서, 본 전략법은 PD 표현형을 효율적으로 교정할 수 있고, 이로써, 생체내 리프로그래밍에 대한 5가지 요소 모두를 충족시킬 수 있다는 것을 보여준다. 본 개시내용은 추가로 PTB에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드 (ASO) 또한 PD 표현형을 교정하는 데 효과적일 수 있다는 것을 보여주며, 이는 PD 및 아마도 다른 신경퇴행성 질환도 치료할 수 있는 일시적인 히트-앤드-런(hit-and-run) 전략법의 실현가능성을 제안한다.
본원에 제공된 데이터는 포유동물 뇌에서 PTB 감소가 성상세포를 뉴런 (예컨대, 새롭게 전환된 뉴런의 흑색질 내에 존재하는 것으로 판단되는, 흑색질 선조체 경로를 복원할 수 있는 도파민성 뉴런)으로 전환시킬 수 있고, (예컨대, 화학적으로 유도된 PD 모델에서) 행동 결함을 역전시킬 수 있다는 것을 보여준다.
본 개시내용의 조성물의 "치료 유효량"은 예컨대, 개체의 질환 상태, 연령, 성별, 체중, 및 개체에서 원하는 반응을 유도할 수 있는 조성물의 능력과 같은 인자에 따라 달라질 것이다. 치료 유효량은 또한 치료학상 유익한 효과가 조성물의 임의의 독성 또는 유해한 효과를 능가하게 되는 것일 수 있다. 특정 이론으로 제한하고자 하지 않으면서, 일부 경우에서, 본원에서 제공되는 세포-프로그래밍 작용제의 치료 유효량은 뉴런 손실을 경험한 뇌 영역 중 특정 비율의 성상세포를 전환시키는 세포-프로그래밍 작용제의 양일 수 있고, 뇌 영역에서 상기 비율의 성상세포의 기능성 뉴런으로의 전환은 뇌 영역에서 뉴런 손실과 연관된 질환 또는 병태를 호전 또는 치료하는 데 충분하고, 한편, 상기 비율의 성상세포는, 예를 들어, 뉴런 전환의 직접적인 결과로서 뇌 영역 중 성장세포의 개수의 과도한 감소에 기인하여 뉴런 전환을 통해 이루어진 유익한 효과를 능가할 수 있는 유해한 효과를 초래할 수 있는 임계 수준을 초과하지 않는다.
하기 실시예는 본 개시내용을 제한하는 것이 아니라, 예시하는 것으로 의도된다. 실시예가 사용될 수 있는 것을 대표하는 것이지만, 당업자에게 공지된 다른 방법도 대안적으로 사용될 수 있다.
실시예
실시예 1. 성상세포에서의 miR -9 및 Brn2 발현
마우스 및 인간 1차 성상세포에서 PTB/nPTB-조절 유전자 발현 프로그램을 시험하였다. 도 2C-2F에서 입증된 바와 같이, miR-124 및 miR-9, 이 둘 모두는 섬유모세포가 아닌 뉴런에서 고도로 발현된다. 상기 두 인간 및 마우스 성상세포 모두에서, miR-124는 낮은 수준으로 존재하는 것으로 나타났지만 (도 2C 및 2D), 이는 상기 비-뉴런 세포 타입에서의 높은 REST 수준을 설명할 수 있고, 성상세포에서의 엄격한 PTB-조절 루프를 제안할 수 있다. 그러나, 예방 밖으로, miR-9는 마우스 및 인간 성상세포, 둘 모두에서 고도로 발현된 것으로 나타났다 (도 2E 및 2F). Brn2는 miR-9와 동일한 발현 패턴을 따랐고, 섬유모세포에서는 낮게, 그러나, 성상세포 및 뉴런 둘 모두에서는 높게 나타났다 (도 2A 및 2B). 이러한 관찰결과는 성상세포 및 뉴런가 공통 전구체를 공유할 수 있다는 개념과 일치한다.
실시예 2. 마우스 및 인간 성상세포에서의 PTB의 넉다운은 nPTB 유도 후, 이어서, nPTB 감소를 초래하였다.
본 개시내용에서 성상세포는 이미 뉴런 성숙화에 중요할 수 있는 인자 (예컨대, miR-9 및 Brn2)를 발현한다는 것이 이해되고 있으며, PTB 넉다운-유도 nPTB가 miR-9에 의해 즉각 상쇄되는지 그 가능성을 시험하였다. 인간 섬유모세포에서의 PTB/nPTB 발현 프로파일과 달리, PTB 넉다운은 마우스 및 인간 성상세포에서 nPTB 유도 후, 이어서, nPTB 감소를 초래한 것으로 나타났다 (도 3A 및 3B). 그러므로, 성상세포에서 PTB만을 단독으로 고갈시킴으로써, 높은 수준의 miR-9는 성상세포의 성숙한 뉴런으로의 안정적인 리프로그래밍을 강화시킬 수 있다.
실시예 3. PTB의 넉다운이 시험관내에서 성상세포를 기능성 뉴런으로 효율적으로 전환시켰다 .
PTB 하향조절이 성상세포를 성숙한 뉴런으로 효율적으로 전환시킬 수 있을 것이라는 가능성을 연구하기 위해, 마우스 성상세포를 생후 4 내지 5일된 (P4-5) 새끼의 대뇌 피질로부터 분리하였고, 인간 태아 성상세포는 상업적 공급원 (사이언셀(ScienCell))으로부터 입수하였다. 상기 두 공급원 모두, 그로부터 입수된 세포는 뉴런 또는 신경능 전구체에 대한 마커의 부재로 표시되는 바와 같이, 뉴런 세포의 검출가능한 오염 없이, 예상된 성상세포 마커 GFAP 및 ALDH1L1을 발현하였다 (도 4).
마우스 성상세포를 PTB에 대한 작은 헤어핀 RNA (shPTB)를 발현하는 렌티바이러스 벡터로 감염시켰다. 형질도입 후 4주째, 소분자 세트를 함유하는 표준 뉴런 분화 배지 중에서 유지된 shPTB 처리된 세포 중 ~50%는 뉴런 형태 및 범용-뉴런 마커 Tuj1 및 MAP2에 대해 양성 염색을 보였지만, 대조군 shRNA로 형질도입된 세포는 그러한 특성을 보이지 않았다 (도 5A). shPTB-유도 뉴런은 또한 NeuN 및 뉴런 특이적 에놀라제 (NSE)를 비롯한, 성숙한 뉴런의 마커를 발현하였다 (도 5B). 전환된 뉴런 타입을 정의하기 위해, 글루타메이트성 뉴런 (VGlut1), GABA성 뉴런 (GAD67), 도파민성 뉴런 (티로신 히드록실라제, TH), 및 다른 것에 대한 마커 (도 5C)를 조사하였다. 유도된 뉴런 대다수는 글루타메이트성 또는 GABA성이었고, 도파민성 마커 (TH)를 발현하는 Tuj-1 양성 세포는 소수 (1 내지 2%)였다 (도 5C). 추가의 도파민성 마커, 예컨대, SLC6A3 및 FoxA2의 발현은 RT-qPCR에 의해서 조사하였고, 그 뿐만 아니라, DAT 및 VMAT2의 발현은 면역염색에 의해서 조사하였고, 그의 유도는 낮은 효율로 관찰되었다 (도 5I-L). 유도된 뉴런 중 어느 것도 콜린 아세틸트랜스퍼라제 또는 트립토판 히드록실라제를 비롯한, 검출가능한 콜린성 또는 세로토닌성 마커를 발현하지 않았다.
PTB 넉다운-전환된 세포의 기능성을 시험하기 위해, shPTB 발현 후 5~6주째 패치 클램프 기록을 수행하였다. 패치된 세포는 대부분 전압-개폐 나트륨/칼륨 채널의 전류 및 반복 활동 전위 발화를 보였는데, 이는 상기 전환된 세포의 뉴런 활동을 시사하는 것이다 (도 5D). 추가로, 전환된 뉴런을 새로 단리된 GFP-마킹된 래트 성상세포와 공동 배양하였을 때, 다양한 빈도의 자발적 시냅스후 이벤트가 검출되었다 (도 5D). 이러한 뉴런 활동은 가능하게는 글루타메이트성 및 GABA성 뉴런, 둘 모두로부터의 시냅스 입력에 대한 반응을 반영하였는데, 그 이유는 2,3-디히드록시-6-니트로-7-술파모일-벤조[f]퀴녹살린-2,3-디온 (NBQX) + D(-)-2-아미노-5-포스포노발레르산 (APV) (글루타메이트성 채널 수용체의 길항제) 및 피크로톡신 (PiTX, GABAA 채널 수용체의 길항제)이 순차적으로 상기 신호를 차단할 수 있기 때문이다 (도 6A). 대조군 shRNA로 형질도입된 세포의 패치 클램프 기록에서는 어떤 뉴런 전기생리학적 특성도 검출되지 않았다 (도 6B).
인간 성상세포는 마우스 성상세포보다 더욱더 효율적으로 리프로그래밍되는 것으로 보였다. shPTB 렌티바이러스 벡터로의 형질도입 후 4주째, Tuj1 항체에 의해 인식되는 뉴런 특이적 β-튜불린에 의해 마킹된 세포 중 ~90%에서 거의 정량적인 성상세포에서의 뉴런으로의 전환이 관찰되었다 (도 5E). 전환된 뉴런은 NeuN 및 NSE를 발현하였고 (도 5F), 마우스 성상세포와 같이, 인간 성상세포는 대체로 글루타메이트성 또는 GABA성 뉴런으로 전환되었고, 작은 비율(%) (1 내지 2%)의 세포만이 TH를 검출가능한 수준으로 발현하였다 (도 5H). 실험 조건하에서 마우스 성상세포와 비교하였을 때, 전환 효율은 인간 성상세포에서 더 높았지만, GAD67 및 VGlut1 뉴런 서브타입의 상대적인 비율(%)은 더 낮았다는 것은 주목할 점이며, 이는 아마도 인간 성상세포-유래 뉴런의 다양화가 더 높다는 것을 시사하는 것일 수 있다. 전기생리학적 연구를 통해 PTB 고갈 후 5~6주째, 대다수의 뉴런에서 전압-개폐 채널에 의해 전달되는 전류 및 반복 활동 전위가 입증되었고, 래트 성상세포와 함께 공동 배양되었을 때, 대부분의 인간 성상세포-전환된 뉴런 또한 자발적 시냅스후 이벤트를 보였다 (도 5H). 상기 시냅스후 활동은 순차적으로 NBQX+APV 및 PiTX에 의해 차단될 수 있고 (도 6C), 대조군 shRNA로 형질도입된 세포의 패치 클램프 기록에서는 어떤 뉴런 전기생리학적 특성도 검출되지 않았다 (도 6D). 상기 데이터는 마우스 및 인간 성상세포, 둘 모두 PTB의 하향조절을 통해 단일 단계로 기능성 뉴런으로 효율적으로 전환될 수 있다는 것을 입증한다.
실시예 4. PTB의 넉다운이 마우스 중뇌에서 성상세포의 뉴런으로의 직접적인 전환을 유도하였다.
생체내 전달을 위해 shPTB를 발현하는 AAV 혈청형 2 벡터를 사용함으로써 AAV-기반 전략법을 디자인하였다 (도 7A). 전환된 뉴런을 계통 추적할 수 있도록 하기 위해, 적색 형광 단백질 (RFP)을 shPTB에 대해 5' 방향에 배치하였다. LoxP-Stop-LoxP 유닛을 RFP에 대해 5' 방향에 삽입하여 RFP 및 shPTB, 둘 모두의 발현이 조절된 방식으로 이루어질 수 있도록 하였다. 상기 AAV-shPTB 벡터를 야생형 (WT) 마우스의 중뇌 내로 주사한 후 10주째 실제로 RFP 양성 세포는 존재하지 않았다 (도 8A). 그에 반해, 동일한 AAV 벡터를 성상세포-특이적 GFAP 프로모터 하에 Cre 레콤비나제를 발현하는 트랜스제닉 마우스의 뇌 내로 주사하였을 때에는 RFP 및 shPTB, 둘 모두 성상세포에서 선택적으로 발현되었다 (하기 참조).
중뇌에서 성상세포가 이미 그의 신경구-생성능을 상실한 것으로 공지된 발생 단계인 P30 내지 P40의 GFAP-Cre 마우스의 흑색질 중 한쪽에 AAV-shPTB를 주사하였다. 음성 대조군으로서, RFP만을 코딩하는 벡터 (AAV-공)를 이용하여 유사한 주사를 수행하였다. AAV-공 주사군에서는 예상대로, RFP 양성 세포 대부분이 GFAP 양성이되, NeuN 음성이었고, 이는 형질되입된 성상세포 중 어느 것도 뉴런으로 전환되지 않았다는 것을 시사하는 것이다 (도 7B, 좌측 상단의 두 패널). 그에 반해, AAV-shPTB 주사 후 3주째까지, 대부분의 형질도입된 세포는 여전히 GFAP 양성을 그대로 유지하였고, 전형적인 성상세포 형태를 가졌지만, RFP 양성 세포 중 ~20%는 성숙한 뉴런 마커 NeuN를 발현하기 시작하였고, 이들 RFP-표지된 NeuN 양성 세포의 비율(%)은 5주째까지 급격히 증가하였다 (도 8B 및 8C). 10주째까지, >80% RFP-양성 세포는 NeuN 양성이 되었고, 검출가능한 GFAP를 더 이상 발현하지 않았다 (도 7B, 좌측 하단의 두 패널, 우측에 정량화된 것 제시). 상기 데이터는 중뇌에서 RFP-양성 세포가 점진적으로 뉴런으로 전환되었다는 것을 시사한다.
Tuj1, MAP2, NSE 및 PSD-95를 포함하는 뉴런 마커 시리즈로 면역염색하여 전환된 뉴런을 조사하였다. 전환된 뉴런 대부분 AAV-shPTB 절단 후 10주째 상기 마커 4개를 모두 발현하였다 (도 7C). 시냅스후 막에 존재하는 막-결합 구아닐레이트 키나제인 PSD-95에 대한 염색은 NeuN/RFP-이중 양성 세포에서 전형적인 반점 패턴을 보였다. 특히, 시험관내에서의 성상세포에서 뉴런으로의 전환에 대한 결과와 달리 (도 5C 참조), RFP-양성 뉴런의 상당부 (30 내지 35%)가, 도파민성 뉴런의 전형적인 마커인 티로신 히드록실라제 (TH)에 대해 양성으로 염색된 반면 (도 7D), 글루타메이트성 및 GABA성 뉴런은 상대적으로 더 낮은 수준으로 검출가능하였다 (도 8E). 대부분의 전환된 세포는 또한 A9 도파민성 뉴런의 마커인 Girk2를 발현하였지만 (도 8F), 소수의 집단은 A10 도파민성 뉴런의 마커인 칼빈딘-D28k에 대해 양성으로 염색되었다 (도 8G). 상기 관찰결과는 성상세포의 상이한 서브타입으로의 전환-분화에서 영역 특이성을 제안한다.
뉴런 서브타입 유도에서 영역 특이성을 추가로 연구하기 위해, 피질로부터의 성상세포의 전환을 시험관내에서 중뇌 대비로 비교하였다. 면역염색 및 면역블롯팅, 둘 모두에 의해 측정된 바, 피질-유래 성상세포 (단지 1-2% 전환)와 비교하였을 때, 중뇌-유래 성상세포가 훨씬 더 높은 효율로 (8 내지 10%) 전환된 것으로 나타났다 (도 6E-G). 상기 데이터는 특정 경우에 상이한 뇌 영역으로부터의 성상세포는 상이한 유전자 발현 프로그램을 나타낼 수 있고, 뇌에서 영역상 상이한 타입의 성상세포가 존재한다는 것을 시사하는 본 개시내용에서 인지하는 것과 일치한다.
이어서, 마우스 뇌의 상이한 부분으로부터의 성상세포로부터 전환된 뉴런의 서브타입을 조사하였다. 피질 또는 선조체로부터의 것은 그렇지 않았지만, 중뇌 성상세포는, 비록 모두가 유사하게 높은 (~80%) 효율로 NeuN-양성 뉴런으로 전환되기는 하였지만 (도 7E-G), 생체내에서 TH-양성 뉴런으로 효율적으로 전환-분화된 것으로 나타났다. 선조체에는 성상세포-유래 TH-양성 뉴런이 거의 존재하지 않는다는 것이 눈에 띄는데, 이는 흑색질 도파민성 뉴런의 축삭돌기에 의해 신경지배되는 영역이기 때문이다. 시험관내에서의 것 (~10%)과 비교하여 생체내에서 전환된 성상세포-유래 TH-양성 뉴런의 비율 (~35%)이 더 높았다는 것은 국소 환경적 단서가 상이한 뇌 영역에서 전환된 뉴런이 특정 서브타입으로 발생하는 것을 추가로 증진시킬 수 있다는 것을 제안한다. 이러한 관찰결과는 다른 뇌 영역이 아닌, 중뇌로부터의 성상세포가 뉴런 줄기 세포에서 도파민성 뉴런으로의 분화를 촉진시킨다는 본 개시내용에서 인지하는 것과 일치한다.
실시예 5. 성상세포 -전환된 뉴런은 뇌 절편에서 특징화된 바와 같이 기능적이었다.
계내에서 성상세포-전환된 뉴런을 기능적으로 특징화하기 위해, AAV-shPTB 형질도입 후 5~6주째, 뇌 절편에서 전기생리학적 연구를 수행하였다. RFP-양성 뉴런에 형광성 염료 뉴로비오틴 488을 주사하여 패치 클램프 기록 측정이 진행되는 세포를 마킹하고, 패치된 세포의 도파민성 서브타입을 기록 후 TH 염색에 의해 확인하였다 (도 7H). Na+ 및 K+ 채널의 전형적인 전압-의존성 전류가 검출되었다 (도 7I). 상기 뉴런은 또한 반복 활동 전위를 발화시킬 수 있는 능력을 보였고 (도 7J), 자발적 시냅스후 전류를 나타내었다 (도 7K). 상기 데이터는 성상세포-전환된 TH-양성 뉴런이 기능적이라는 것을 제안하고, 상기 뉴런이 신경 회로로 도입된다는 것을 제안한다.
실시예 6. 중뇌 성상세포 -유래 뉴런의 흑색질 선 조체 경로로의 통합
정량적 분석 결과, 총 ~4,000개의 RFP-양성 세포가 흑색질 내에서 ~1,300개의 TH-양성 뉴런을 생성한 것으로 밝혀졌다 (도 8H-J). 이들 리프로그래밍된 뉴런의 서브타입 특이성을 뇌 절편에서 도파민 수송체 (DAT), 소포 모노아민 수송체 2 (VMAT2) 뿐만 아니라, 중뇌 도파민성 뉴런에 대해서 특이적인 마커, 예컨대, 엔그레일드 호메오박스 1 (En1) 및 LIM 호메오박스 전사 인자 1 알파 (Lmx1a)에 대해 면역염색에 의해서 추가로 확인하였다 (도 9B). RFP-양성 세포체는 오직 흑색질에만 존재하였지만, 마우스 중뇌에 뉴런 줄기 세포를 이식하여 진행된 조기 연구에서 관찰되었던 바와 같이, RFP-양성 섬유는 미상핵-조가비핵 뿐만 아니라, 측중격핵, 중격 및 후각 결절을 포함하는 다른 표적 영역에서도 검출되었다 (도 9A 및 9G). 상기 섬유 분획 또한 TH-양성이었다 (도 9H). 섬유 밀도 정량화 결과, 비록 중격 (Sept)에 더욱 더 많은 (~3배) RFP-양성 섬유가 존재하였음에도 불구하고 (도 9G 또한 참조), RFP/TH-이중 양성 돌기는 주로 선조체의 미상핵-조가비핵 (CPu) 및 측중격핵 (NAc) 영역에 분포하는 것으로 밝혀졌다 (도 9I). 상기 데이터는 흑색질 선조체 경로에서 환경적 단서가 성상세포-전환된 뉴런에 의한 신경지배 패턴에 영향을 줄 수 있다는 가능성을 뒷받침한다.
새로 전환된 뉴런의 축삭돌기가 선조체까지 이어졌다는 것을 추가로 입증하기 위해, AAV-shPTB 전달 후 10주째에 형광성 역행 축삭돌기 추적 비드를 마우스의 미상핵 조가비핵 내로 주사하였다 (도 9E). 레트로비드 주사 후 1일째, 흑색질 내에서 녹색 비드로 역행 방식으로 표지된 내인성 TH-양성 세포 및 전환된 TH/RFP-이중 양성 세포 둘 모두 검출되었다 (도 9F에서 화살표 표시). 종합해 보면, 이들 데이터는 중뇌 성상세포 내로의 AAV-shPTB 주사가 기능적 도파민성 뉴런으로의 리프로그래밍 및 전환을 일으킬 수 있다는 것을 입증한다.
실시예 7. 보충이 흑색질 선 조체 경로에서 도파민성 뉴런을 상실시켰다.
도파민성 뉴런으로 전환된 성상세포의 개수 및 그의 축삭돌기의 선조체까지로의 비교적 강건한 성장이 PTB-매개 성상세포-전환된 뉴런이 손상된 흑색질 선조체 경로를 복원할 수 있다는 것을 제안하였다. 이러한 가능성을 연구하기 위해, 도파민성 뉴런에 독성인 도파민 유사체인 6-히드록시도파민 (6-OHDA)을 내측 전뇌속 내로 편측 주사하여 도파민성 뉴런을 퇴행시켰다 (도 11A). 예상대로, 6-OHDA 주사 후 1개월째, 중뇌 및 선조체 탈신경에서 TH-양성 세포체의 편측 손실이 관찰되었다 (도 11B). 현저힌 증가된 GFAP-양성 성상세포 집단은 병변이 있는 흑색질 중 도파민성 뉴런 손실을 동반하였고 (도 11C), 이는 예상된 반응성 성상세포 반응을 나타내는 것이다.
6-OHDA에 의해 편측 병변이 생긴 후 1개월째, AAV-shPTB 또는 AAV-공을 중뇌에 주사하였다. AAV-공이 아닌, AAV-shPTB 주사 후 10주째에 병변이 있는 흑색질을 조사한 결과, TH-양성 뉴런 개수는 증가한 것으로 나타났고, 그의 분획 또한 RFP-양성이었다 (도 11D-I). 뉴런 계수 결과, 병변이 없는 흑색질에서 관찰되었던 초기 ~4,500개의 TH-양성 뉴런 세포체는 병변이 있는 쪽에서는 90% 초과로 (~400개로) 감소한 것으로 나타났다. 중요하게는, AAV-PTB 투여가 ~1,000개의 새로운 RFP/TH-이중 양성 뉴런을 유도하였고 (도 11J), 이로써 TH-양성 뉴런은 초기 개수의 ~1/3까지 회복되었다.
상당량의 RFP-양성 섬유 또한 선조체에서 및 흑색질 선조체 경로를 따라 검출되었고, 그의 분획 또한 TH에 대해 양성이었다 (도 11E, 도 17A-F). 섬유 밀도의 정량 분석 결과, 6-OHDA가 TH-양성 섬유를 초기 수준의 ~15%로 감소시켰고, AAV-PTB는 TH-양성 섬유를 병변이 없는 쪽에서 검출된 야생형 수준의 ~40%로 회복시킨 것으로 나타났다 (도 11L). 상이한 선조체 영역에서 RFP-양성 및 RFP/TH-이중 양성 섬유를 정량화함으로써, 미상핵-조가비핵 (CPu) 영역이 RFP/TH-이중 양성 섬유를 가장 높은 비율로 함유하였다는 것을 확인하였다 (도 11K). 비록 유사하고, 부분적으로 재구성된 흑색질 선조체 경로가 마우스 뇌에서 줄기 세포-유래 도파민성 뉴런의 이식에 의해 달성되기는 하였지만, 이들 데이터는 뉴런 서브타입을 특수화시키는 어떤 추가 처리도 없이, AAV-shPTB는 내인성 중뇌 성상세포로부터 전환된 새로운 뉴런이 손상된 도파민성 뉴런을 보충하도록 유도할 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 8. 중뇌에서의 직접적인 리프로그래밍에 의한 파킨슨병 표현형의 역전
회로 기능을 회복할 수 있는 재구성된 흑색질 선조체 경로의 능력을 측정하기 위해, AAV-shPTB 형질도입된 마우스가 편측 6-OHDA 병변 이후에 개선된 운동 기능을 보일 수 있는지 여부를 조사하였다. 3가지 표준 행동 검사를 수행하였는데, 2가지는 약물-유도성 회전에 기반하는 것이고, 3번째 것은 자발적 운동 활동에 기반하는 것이다. 아포모르핀에 의해 유도된 대측성 회전 및 암페타민에 의해 유발된 동측성 회전, 둘 모두, 6-OHDA 유도 병변 이후에 현저히 증가하였다. 특히, 이들 표현형, 둘 모두, AAV-shPTB 처리 후 3개월째에는 거의 야생형 수준으로까지 회복되었지만, AAV-공 형질도입된 마우스에서는 어떤 유의적인 상관관계도 보고되지 않았다 (도 12A). 동일한 마우스 세트에서 시간 경과에 따른 아포모르핀-유도 회전은 2 내지 3개월 동안 점진적인 표현형 회복을 보였다 (도 12B).
자발적 운동 활동을 조사하기 위해, 실린더 테스트를 수행하여 다리 사용 편향성을 점수화하였다. 병변이 없는 마우스는 비교적 동일한 빈도로 양쪽 다리를 사용하였지만, 한쪽에 병변이 있는 마우스는 동측성 터치를 선호하는 것으로 보였고, 이는 대측성 앞다리 기능에 장애가 있음을 시사하는 것이다. AAV-shPTB 형질도입된 마우스에서, 앞다리 사용이 시간에 의존하는 방식으로 크게 개선되었고, 처리 3개월까지 수행능력이 야생형 수준에 도달한 것으로 관찰된 반면, AAV-공 형질도입된 마우스는 어떤 개선도 보이지 못했다 (도 12C).
리프로그래밍된 뉴런이 정상적인 운동 기능의 회복을 직접 담당하는지 여부를 시험하기 위해, 전환된 뉴런에서 (AAV-shPTB 벡터 중 RFP 대신) 억제성 hM4Di 수용체를 발현시킴으로써 화학유전학적 접근법을 수행하였다 (도 16A). hM4Di 수용체를 발현하는 뉴런의 활동 전위는, 주사 후 1 내지 2일 이내에 대사작용이 일어나는 약물인 클로자핀-N-옥시드 (CNO)에 의해 강력하게 억제된다는 것이 잘 확립되어 있다. 실린더 검정법으로 측정된, 6-OHDA 처리된 마우스에서의 운동 수행 회복은 CNO의 복강내 주사 후에 제거되었고, 표현형은 주사 40 min 이내에 재출현하였다. 병변이 없는 마우스 내로의 CNO 주사는 어떤 효과도 없었다. 놀랍게도, 및 약물의 대사와 상관관계를 보이면서, 운동 표현형은 다시 3일 이내에 소멸하였다 (도 16B). 이들 결과를 통해 성상세포-전환된 뉴런이 운동 회복을 직접 담당할 수 있다는 것이 입증되었다.
실시예 9. 리프로그래밍된 뇌에서의 선조체 도파민의 회복.
AAV-shPTB 매개 성상세포 전환이 이루어진 또는 그러한 전환이 이루어지진 않은, 병변이 있는 쪽과 비교하여 병변이 없는 쪽, 둘 모두에서의 도파민에 대한 HPLC 분석을 위해 선조체로부터의 추출물을 제조하였다. 도파민 신호를 확인하기 위해, 범위가 정상적인 도파민 수준인 공지된 양을 선조체 용해물에 스파이킹하였다. 신호는 첨가된 양과 선형의 상관관계를 갖는 것으로 나타났다 (도 15A 및 15B). 이어서, 상이한 조건하에 선조체에서 도파민의 수준을 측정하였고, 6-OHDA 병변이 있는 마우스에서는 도파민의 효과적으로 제거된 것으로 나타났지만, AVV-shPTB 리프로그래밍된 마우스에서는 도파민의 유의적으로 회복된 것으로 나타났다 (도 15C- 15F). 3회의 독립 실험에 기초한 결과의 정량화 결과, 병변이 없는 선조체 기준 대비 도파민의 수준은 AAV-shPTB 처리시 병변이 있는 선조체에서 ~25%에서부터 65%로 상승하는 것으로 나타났다 (도 6F). 도파민 생물발생에서 이러한 ~40%의 순획득은 흑색질에서 RFP/TH-이중 양성 세포체 및 선조체에서 돌기 30 내지 35% 범위 이내의 회복이고, 이는 AAV-shPTB 리프로그래밍된 뉴런이 관찰된 표현형 회복을 담당할 수 있다는 것을 제안하는 것이다.
실시예 10. PTB mRNA에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드가 뉴런 전환을 유도하였고, 화학적으로 유도된 파킨슨병 표현형을 구제하였다.
(주사된 안티센스 올리고뉴클레오티드 (ASO)가 추적될 수 있도록 허용하기 위해) 3' 플루오레세인과 함께 (전체 안정성을 증가시키고, 전달을 지원하기 위해) 포스포로티오에이트 백본을 함유하는, PTB를 표적화하는 21-뉴클레오티드염기 ASO (PTB-ASO) 5개를 합성하였다. GFP를 표적화하는 ASO (gFP-ASO) 또한 음성 대조군으로서 합성하였다. GFP-ASO가 아닌, PTB-ASO 중 3개는 단리된 마우스 성상세포 내로의 형질감염시, PTB 발현을 감소시키는 데 효과적이었다 (도 13A). 표적화 효율이 가장 높은 PTB-ASO (#4)인 PTB-ASO의 도입 후 5주째, 표준 뉴런 분화 배지에서 배양된 마우스 성상세포는 Tuj1, MAP2, NSE 및 NeuN을 비롯한, 뉴런 마커 시리즈의 합성을 보인 반면, 대조군 ASO로 형질감염된 성상세포에서는 합성이 이루어지지 않았고 (도 13B), 따라서, 전환된 뉴런은 시험된 최장 기간인 적어도 3개월 동안 건강한 뉴런 형태를 그대로 유지하였다 (데이터는 나타내지 않음). AAV-shPTB 바이러스 벡터와 유사하게, 양성 TH 염색에 의해 표시된 바와 같이, 소수의 전환된 뉴런이 도파민성이었다 (도 13B).
(타목시펜을 이용하는 처리에 의해 유도가능한) GFAP-CreER™ 트랜스진 및 (Rosa26 유전자좌에 통합되는) tdTomato 코딩 트랜스진, 둘 모두를 보유하며, 그의 발현은 Cre 레콤비나제의 작용에 의해 영구적으로 활성화되는 것인 PTB-ASO는 생체내 마우스의 중뇌에서 뉴런 전환을 유도하는 것으로 나타났다. 생성된 이중 트랜스제닉 마우스를 타목시펜으로 처리하여 상기 마우스의 성상세포에서 Cre가 TdTomato를 활성화시키도록 유도하였다. Cre는 생후 3일째 (P35) 체계적으로 유도되었고 (도 14A), 3주 경과 후, ASO를 상기 마우스의 흑색질 내로 편측으로 입체정위 방식으로 주사하였다. ASO를 주사하지 않은 경우, 모든 tdTomato-표지된 세포는 NeuN 음성인 반면, 상기 세포는 대부분 GFAP 양성이었다 (도 14B). 그러나, PTB-ASO 주사 후 2개월까지, tdTomato-표지된 세포 중 일부는 NeuN 양성이 되었고 (도 14C), 그 중 일부는 또한 TH 양성이었다 (도 14D). 유의적으로는, PTB-ASO 주사를 맞은 6-OHDA-처리된 마우스는 아포모르핀-유도 회전을 보였고, 이는 처리 후 3개월까지 급격히 감소한 반면, 대조군 GFP-ASO는 어떤 구제 효과도 보이지 않았다 (도 13C). 이러한 관찰결과는 PD를 비롯한 신경퇴행성 장애를 올리고뉴클레오티드-기반 (ASO 또는 RNAi) 치료제를 이용하여 치료할 수 있는 가능성을 증가시켜 준다.
실시예 11. 물질 및 방법
본 실시예는 실시예 1-10에서 사용된 수개의 방법을 기술한다.
벡터 및 바이러스 제조
마우스 성상세포에서 shPTB를 발현하는 렌티바이러스 벡터를 구축하기 위해, 표적 서열 (5'-GGGTGAAGATCCTGTTCAATA-3'; 서열 번호: 1)을 pLKO.1- 히그로마이신 벡터 (애드진(Addgene), #24150)에 셔틀링하였다. 인간 성상세포의 경우, 표적 서열 (5'-GCGTGAAGATCCTGTTCAATA-3'; 서열 번호: 2)을 함유하는 유사한 벡터를 사용하였다. 2개의 패키지 플라스미드: pCMV-VSV-G (애드진, #8454) 및 pCMV-dR8.2 dvpr (애드진, #8455)로 바이러스 입자를 렌티-X 293T 세포 (클론테크(Clontech))에서 패키징하였다. SW-28 로터가 장착된 베크(Beckman)만 XL-90 원심분리기 상에서 초원심분리에 의해 바이러스 입자를 농축시켰다.
AAV 벡터를 구축하기 위해, 마우스 PTB에 대한 동일한 표적 서열을 먼저 pTRIPZ-RFP 벡터 내로 EcoR I과 Xho I 부위 사이에 삽입하였다. 이어서, RFP 및 shRNA를 함유하는 세그먼트를 서브클로닝하여 Asc I를 사용함으로써 AAV-CMV-LOX-STOP-LOX-mG-CaMP3.0 벡터 (애드진, #50022) 중 CaMP3.0을 대체하였다. 대조군 벡터를 구축하기 위해, 오직 RFP만을 함유하는 유사한 세그먼트를 AAV-CMV-LOX-STOP-LOX-mG-CaMP3.0 벡터로 클로닝하였다. 생성된 벡터를 AAV-shPTB 또는 AAV-공으로 지칭하였다. AAV-shPTB 중 RFP를 hM4Di의 cDNA로 대체하여 AAV-hM4Di-shPTB 벡터를 구축하였고, 이를 pAAV-CBA-DIO-hM4Di-mCherry 벡터 (애드진, #81008)로부터 서브클로닝하였다.
형질감염된 293T 세포에서 다른 두 플라스미드: pAAV-RC 및 pAAV-Helper (애질런트 게노믹스(Agilent Genomics))로 AAV2의 바이러스 입자를 패키징하였다. 수거 후, 바이러스 입자를 헤파린 칼럼 (GE 헬쓰케어 바이오사이언시스(GE HEALTHCARE BIOSCIENCES))으로 정제한 후, 울트라-4(Ultra-4) 원심분리 필터 유닛 (아미콘(Amicon), 100,000 분자량 컷오프)으로 원심분리하였다. qPCR에 의해 바이러스 입자 역가는 >1 x 1012개의 입자/ml인 것으로 측정되었다.
안티센스 올리고뉴클레오티드 합성
안티센스 올리고뉴클레오티드를 인터그레이티드 DNA 테크놀러지즈(Integrated DNA Technologies)로부터 합성하였다. 마우스 PTB를 표적화하는 ASO (ASO-mPTB)의 서열은 5'-GGGTGAAGATCCTGTTCAATA-3' (서열 번호: 1)이었다. Turbo GFP를 표적화하는 ASO (5'-GTTGGTGCTCTTCATCTTGTT-3') (서열 번호: 3)를 대조군으로서 합성하였다. 모든 ASO의 백본은 포스포로티오에이트 변형을 함유한다. 형광 검출을 위해 상기 ASO의 3' 말단에 플루오레세인 (FAM)을 부착하였다.
웨스턴 블롯 및 RT- PCR
웨스턴 블롯팅에 의한 분석을 위해, 세포를 1xSDS 로딩 완충제 중에서 용해시키고, 정량화한 후, 브롬페놀 블루를 0.1%의 최종 농도로 첨가하였다. 25~30 ug의 전체 단백질을 10% 뉴페이지 비스-트리스(Nupage Bis-Tris)에서 분해하고, 하기 항체를 이용하여 프로빙하였다: 토끼 항-PTBP1 (더글라스 블랙(Douglas Black)으로부터 기증받음, 1:3,000), 마우스 항-PTBP2 (산트 크루즈(Santa Cruz), sc-376316, 1:1000), 마우스 항-베타 액틴 (시그마(Sigma), A2228, 1:10000)，토끼 항-Tuj1 (코방스(Covance), MRB-435P, 1:10,000)，토끼 항-Brn2 (셀 시그널링(Cell Signaling), 12137, 1:1,000), 닭 항-TH (아베스 랩(Aves lab), TYH, 1:1,000) 및 토끼 항-VMAT2 (프로테인테크(Proteintech), 20873-1-AP, 1:500).
RT-qPCR 분석을 위해, RNA를 트리졸(Trizol)(라이프 테크놀러지(Life Technology))을 이용하여 추출하고, 10 ug/ml 글리코겐을 이용하여 작은 RNA의 친전을 증강시켰다. 먼저, 전체 RNA를 DNase I (프로메가(Promega))로 처리한 후, miScript II RT 키트 (퀴아젠(QIAGEN), 218160)로 역전사시켰다. 스텝-원 플러스 PCR 장치(step-one plus PCR machine) (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)) 상에서 miScript SYBR 녹색 PCR 키트 (퀴아젠, 218073)를 이용하여 RT-qPCR을 수행하였다. 사용된 프라이머는 U6-F: 5'-ACGCAAATTCGTGAAGCGTT-3' (서열 번호: 4); miR-124-F: 5'-TAAGGCACGCGGTGAATGCC-3' (서열 번호: 5); 및 miR-9-F: 5'-GCGCTCTTTGGTTATCTAGCTGTATG-3' (서열 번호: 6)이었다.
시험관내에서의 세포 배양 및 전환-분화
마우스 성상세포를 생후 (P4~P5) 새끼로부터 단리시켰다. 피질 조직을 전체 뇌로부터 절개하고, 트립신과 함께 인큐베이션시킨 후, 폴리-D-리신 (시그마)으로 코팅된 디쉬 상에 플레이팅하였다. 단리된 성상세포를 10% 우태아 혈청 (FBS) 및 페니실린/스트렙토마이신 (기브코(GIBCO))이 첨가된 DMEM (기브코) 중에서 배양하였다. 디쉬를 매일 조심스럽게 진탕시켜 비-성상세포를 제거하였다. 전면생장률이 ~90%에 도달한 후, 성상세포를 아큐타제(Accutase) (이노베이티브 셀 테크놀러지즈(Innovative Cell Technologies))로 해리시킨 후, 800 rpm으로 3 min 동안 원심분리한 후, 이어서, DMEM/F12 (기브코), 10% FBS (기브코), 페니실린/스트렙토마이신 (기브코), B27 (기브코), 10 ng/ml 표피 성장 인자 (EGF, 페프로테크(PeproTech)), 및 10 ng/ml 섬유모세포 성장 인자 2 (FGF2, 페프로테크)를 함유하는 배지 중에서 배양하였다.
시험관내에서 전환-분화를 유도하기 위해, 마우스 성상세포를, 마우스 PTB를 표적화하는 렌티바이러스를 함유하는 성상세포 배양 배지로 재현탁시킨 후, 마트리겔 매트릭스(Matrigel Matrix) (코닝(Corning))로 코팅된 커버슬립 (12 mm) 상에 플레이팅하였다. 24 hr 후, 세포를 72 hr 동안 신선한 성상세포 배양 배지 중에서 히그로마이신 B (100 ug/ml, 인비트로겐(Invitrogen))로 선별하였다. 이어서, 배지를, 0.4% B27, 2% FBS, 3개의 소분자 (1 uM ChIR99021, 10 uM SB431542 및 1 mM Db-cAMP)의 칵테일, 및 신경영양 인자 (BDNF, GDNF, NT3 및 CNTF, 모두 10 ng/ml)로 보충된, N3/기초 배지 (DMEM/F12 및 뉴로베이살의 1:1 믹스, 25 ㎍/ml 인슐린, 50 ㎍/ml 트랜스페린, 30 nM 소듐 셀레나이트, 20 nM 프로게스테론, 100 nM 푸트레신)로 교체하였다. 배지를 절반을 이틀에 한 번 교체하였다. 시냅스 전류를 측정하기 위해, 6주 후 전환된 세포를 신선한 GFP-표지된 래트 성상세포와 함께 첨가하고, 공동 배양 추가 3 내지 4주 후, 패치-클램프 기록을 수행하였다.
인간 성상세포는 상업적 공급원 (사이언셀)으로부터 구입하였다. 세포를 성상세포 배지 (사이언셀) 중에서 성장시키고, 전면생장률이 ~80%에 도달할 때까지 서브클로닝하였다. 시험관내에서의 전환-분화를 위해, 배양된 인간 성상세포를 먼저 트립신으로 해리시키고; 인간 PTB를 표적화하는 렌티바이러스를 함유하는 성상세포 배지 중에 재현탁시키고; 마트리겔 코팅된 커버슬립 상에 플레이팅하였다. 24 hr 후, 세포를 72 hr 동안 히그로마이신 B (100 ug/ml, 인비트로겐)로 선별하였다. 이어서, 배지를 0.4% B27, 2% FBS 및 신경영양 인자 (BDNF, GDNF, NT3 및 CNTF, 모두 10 ng/ml)로 보충된, N3/기초 배지로 교체하였다. 배지를 절반을 이틀에 한 번 교체하였다. 시냅스 전류를 측정하기 위해, 3주 후 전환된 세포를 신선한 GFP-표지된 래트 성상세포와 함께 첨가하고, 공동 배양 추가 2 내지 3주 후, 패치-클램프 기록을 수행하였다.
면역세포화학법 .
유리 슬라이드 상에서 성장된 배양된 세포를 실온에서 15 min 동안 4% 파라포름알데히드 (어피메트릭스(Affymetrix))로 고정시킨 후, 얼음 상에서 15 min 동안 PBS 중 0.1% 트리톤(Triton)으로 투과화시켰다. PBS로 2회 세척한 후, 세포를 실온에서 1 hr 동안 3% BSA를 함유하는 PBS 중에서 차단시켰다. 고정된 세포를 4℃에서 밤새도록 3% BSA를 함유하는 PBS 중에서 1차 항체와 함께 인큐베이션시켰다. PBS로 2회 세척한 후, 세포를 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 488, 알렉사 546, 알렉사 594 또는 알렉사 647 (1:500, 몰레큘러 프로브즈(Molecular Probes))에 접합된 2차 항체와 함께 1 hr 동안 인큐베이션시켰다. PBS 중 300 nM DAPI를 실온에서 20 min 동안 세포에 적용시켜 핵을 표지하였다. PBS로 3회에 걸쳐 추가 세척한 후, 플루오로마운트-G(Fluoromount-G) 봉입제를 유리 슬라이드에 적용시키고, 영상을 조사하고, 올림푸스 플루오뷰 FV1000(Olympus FluoView FV1000)하에서 기록하였다.
뇌 절편을 염색하기 위해, 마우스를 CO2로 희생시키고, 즉시 15~20 mL 염수 (0.9% NaCl)로 먼저 관류시킨 후, 이어서, PBS 중 15 mL 4% 파라포름알데히드 (PFA)로 관류시켜 조직을 고정시켰다. 전체 뇌를 추출하고, 4℃에서 밤새도록 4% PFA 중에서 고정시킨 후, 이어서, 크라이오스탯 (레이카(Leica))에 의해 14~18um 절편으로 절단하였다. 염색 전, 항원 검색을 위해 뇌 절편을 시트르산 나트륨 완충제 (10 mM 시트르산 나트륨, 0.05% 트윈 20, pH 6.0)와 함께 95℃에서 15 min 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 슬라이드를 실온에서 1 hr 동안 5% 정상 당나귀 혈청 및 PBS 중 0.3% 트리톤 X-100으로 처리하였다. 나머지 단계는 배양된 세포에서와 같이 수행하였다.
하기 항체를 사용하였다: 토끼 항-Tuj1 (코방스, MRB-435P, 1:1,000), 마우스 항-Tuj1 (코방스, MMS-435P, 1:1,000), 마우스 항-MAP2 (밀리포어(Milipore), MAB3418, 1:1000), 마우스 항-NeuN (밀리포어, MAB377, 1:200), 닭 항-NSE (아베스 랩, NSE, 1:1000), 토끼 항-VGlut1 (시냅틱 시스템즈(Synaptic Systems), 135-303, 1:200), 토끼 항-GAD67 (셀 시그널링, 63080, 1:200), 닭 항-TH (아베스 랩, TYH, 1:1000), 토끼 항-PSD95 (셀 시그널링, 3450, 1:200), 토끼 항-DAT (바이오스(Bioss), bs-1714R, 1:100), 염소 항-VMAT2 (에베레스트 바이오테크(Everest biotech), EB06558, 1:100), 토끼 항-En1 (앱젠트(Abgent), AP7278a, 1:100), 토끼 항-Lmx1a (ProSci, 7087, 1:100), 토끼 항-GFAP (셀 시그널링, 12389, 1:200), 닭 항-GFAP (아베스 랩, GFAP, 1:100), 토끼 항-ALDH1L1 (엔코르 바이오테크놀러지(EnCor Biotechnology), RPCA-ALDH1L1, 1:2000), 마우스 항-OLIG2 (산트 크루즈, sc-293163, 1:100), 닭 항-CD11b (아베스 랩, MAC, 1:1000), 마우스 항-NG2 (산트 크루즈, sc-53389, 1:100), 마우스 항-네스틴 (셀 시그널링, 4760, 1:200), 마우스 항-NANOG (산트 크루즈, sc-293121, 1:100), 마우스 항-피브로넥틴 (DSHB, 1H9, 1:500), 토끼 항-GAD65 (셀 시그널링, 5843, 1:50), 토끼 항-VGlut2 (바이오스, bs-9686R, 1:100), 토끼 항-Girk2 (프로테인테크, 21647-1-AP, 1:100), 토끼 항-칼빈딘 D28K (프로테인테크, 14479-1-AP, 1:100) 및 마우스 항-RFP (써모피셔(ThermoFisher), MA5-15257, 1:200).
뉴런 세포체 및 섬유 밀도 정량화
TH 및 RFP의 면역염색을 위해 중뇌를 가로지르는 관상 절편을 120~140 um 간격으로 샘플링하였다. 앞서 기술된 바와 같이, 공식 Nt = Ns*(St/Ss) (여기서, Ns는 계수된 뉴런의 개수이고, St는 뇌 영역 중 절편의 총 개수이고, Ss는 샘플링된 절편의 개수이다)을 사용하여 관심 세포 타입의 총 개수 (Nt)를 계산하였다. 앞서 공개된 방법을 사용하여 RFP-양성 및 RFP/TH-이중 양성 섬유를 정량화하였다. 분석을 위해 각 뇌로부터 3개의 관상 절편 (A/P +1.3, +1.0 및 +0.70)을 선택하였다. 각각의 선택된 절편에 대해, 3개의 무작위로 선택된 부위를 60x 유침용 대물렌즈를 이용하여 1 ㎛ 간격으로 z-스택 영상의 한 섹션으로부터 포착하였다. 이어서, 프로브로서 스피어 (직경: 14 ㎛)를 생성하여 전체 z-스택 내의 섬유 밀도를 측정하였다. 스피어의 표면을 횡단하는 각 섬유에 1점을 주었다. 같은 절편으로부터 선조체 TH 섬유의 광학 밀도를 측정하였다. 샘플링된 절편의 디지털화된 영상을 10x 대물렌즈로 포착하고, 이미지-J 1.47v(Image-J 1.47v) (웨인 라스밴드(Wayne Rasband: 미국 메릴랜드주 베데스다))에 의해 분석하였다.
전기생리학적 방법
디지데이터1440A(Digidata1440A) 인터페이스 (액손 인스트루먼츠(Axon Instruments))에 연결된 액소패치(Axopatch)-1D 증폭기 또는 액소패치 200B 증폭기 (액손 인스트루먼츠)를 이용하여 패치 클램프 기록을 수행하였다. pClamp 10.0 또는 Igor 4.04 소프트웨어를 이용하여 데이터를 획득하고, MatLab v2009b로 분석하였다. 시험관내에서 마우스 성상세포로부터 전환된 뉴런의 경우, 패치 클램프 기록 1주 전에 배지로부터 소분자를 제거하였다. 배양된 마우스 및 인간 세포, 둘 모두, 먼저 산소화된 (95% O2/5% CO2) 인공 뇌척수액 (150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM 글루코스, 10 mM HEPES, pH 7.4)과 함께 37℃에서 30 min 동안 인큐베이션시키고, 선택된 세포에 대해 전체-세포 패치 클램프를 수행하였다.
생체내에서 전환된 뉴런의 활동을 기록하기 위해, AAV 벡터 주사 후 6~8주째에 피질 절편 (300 ㎛)을 제조하였다. 4℃에서 절편을 산소화된 (95% O2/5% CO2) 절개 완충제 (110.0 mM 염화콜린, 25.0 mM NaHCO3, 1.25 mM NaH2PO4, 2.5 mM KCl, 0.5 mM CaCl2, 7.0 mM MgCl2, 25.0 mM 글루코스, 11.6 mM 아스코르브산, 3.1 mM 피루브산) 중에서 비브라톰으로 절단한 후, 실험 전 1 hr 동안 실온에서 산소화된 ACSF (124 mM NaCl, 3 mM KCl, 1.2 mM NaH2PO4, 26 mM NaHCO3, 2.4 mM CaCl2, 1.3 mM MgSO4, 10 mM 덱스트로스 및 5 mM HEPES; pH 7.4) 중에서 인큐베이션시켰다.
패치 피펫 (5-8 MΩ) 용액은 150 mM KCl, 5 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 2 mM 에틸렌 글리콜 테트라 아세트산 (EGTA)-Na, 및 10 mM Hepes pH 7.2를 함유하였다. 전압-클램프 실험을 위해, 막 전위를 전형적으로 -75 mV로 고정시켰다. 하기 농도의 채널 차단제를 사용하였다: PiTX: 50 uM; NBQX: 20 uM; APV: 50 uM. 상기 차단제 모두 진단 스톡 용액으로부터 외부 용액으로 희석한 후에 배쓰-적용하였다. 모든 실험은 실온에서 수행되었다.
마우스 모델 구축
GFAP-Cre 트랜스제닉 마우스 (B6.Cg-Tg(Gfap-cre)77.6Mvs/2J)를 AAV-shPTB 유도 생체내 리프로그래밍 실험에 사용하였다. 생체내에서의 ASO의 효과를 시험하기 위해, GFAP-CreER™ 마우스 (B6.Cg-Tg(GFAP-cre/ERT2)505Fmv/J)를 Rosa-tdTomato 마우스 (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)와 교배시켰다. 생후 35일된, 상기 이중 GFAP-CreER™;Rosa-tdTomato 트랜스제닉 마우스의 자손에 (옥수수 오일 중에 20 mg/ml 농도로 용해된) 타목시펜을 총 5일 연속 매 24 hr마다 복강내 주사를 통해 주사하였다. 매회 주사 용량은 75 mg/kg이었다. 타목시펜 적용 후 2주째, PTB-ASO 또는 대조군 ASO를 상기 마우스의 흑색질 내로 주사하여 ASO-유도 생체내 리프로그래밍 및 행동상의 이득에 대해 조사하였다. 모든 트랜스제닉 마우스는 더 잭슨 라보라토리(The Jackson Laboratory)로부터 구입하였다.
6- OHDA 및 입체정위 주사를 이용한 동측성 병변
성체 WT, 및 생후 40일된 GFAP-Cre 마우스를 사용하여 수술을 수행함으로써 병변을 유도하였다. 먼저, 케타민 (80-100 mg/kg) 및 크실라진 (8-10 mg/kg)의 믹스를 이용하여 동물을 마취시킨 후, 입체정위 마우스 프레임에 놓았다. 6-히드록시도파민 (6-OHDA, 시그마)을 주사하기 전, 마우스를 먼저 데시프라민 (25 mg/kg) 및 파르길린 (5 mg/kg)의 믹스로 처리하였다. 6-OHDA를 0.02% 빙냉 아스코르베이트/염수 용액 중에 15 mg/ml 농도로 용해시키고, 3 hr 이내에 사용하였다. 독성 용액을 내측 전뇌속 (MFB) 내로 (브레그마 기준으로) 하기 좌표에 주사하였다: 전측-후측 (A/P) = -1.2 mm; 내측-외측 (M/L) = -1.3 mm 및 등-배 (D/V) = -4.75 mm (경막으로부터). 주사를 5 ul 해밀터(Hamilton) 시린지 중에서 33G 니들을 이용하여 0.1 ul/min 속도로 3 min 동안 적용한 후, 니들을 천천히 제거하였다. 병변 후, 상처 부위를 세정하고, 봉합하였다.
AAV 벡터 또는 ASO를 6-OHDA 유도 병변 후 ~30일째에 흑색질 내로 주사하였다. 4 ul의 AAV 벡터 또는 2 ul의 ASO (1 ug/ul)를 병변이 있는 흑색질 내로 하기 좌표 A/P = -3.0 mm; M/L = -1.2 mm 및 D/V = -4.5 mm에 주사하였다. 동일한 시린지 및 니들을 이용하여 0.5 ul/min 속도로 3 min 동안 주사한 후, 니들을 천천히 제거하였다.
역행 추적.
흑색질 선조체 경로의 역행 추적을 위해, 6-OHDA 유도 병변이 있는 GFAP-Cre 마우스 또는 병변이 없는 GFAP-Cre 마우스에 먼저 AAV-shPTB 벡터를 주사하였다. AAV 전달 후 3개월째, 하기 두 좌표: A/P = + 0.5 mm, M/L = + 2.0mm, D/V= + 3.0mm 및 A/P= + 1.2mm, M/L= + 2.0mm, D/V= + 3.0mm를 이용하여, AAV 주사 부위와 같은 쪽 선조체 내로 2개 부위에 녹색 레트로비드 IX (루마플루오르(Lumafluor: 미국 플로리다주 네이플즈))를 편측으로 주사하였다. ~2 ul의 비드를 주사하였다. 24 hr 후, 동물을 희생시키고, 즉시 관류시켰다. 절편화 및 면역염색을 위해, 그의 뇌를 4% PFA로 고정시켰다.
선조체 도파민 측정.
역상 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 마우스 선조체 중의 도파민 수준을 측정하였다. 물/메탄올 구배 (0.1% 포름산 함유)를 이용하여 애질런트 조르박스 SB-C18 세미-프렙(Agilent Zorbax SB-C18 semi-prep) 칼럼 (ID 9.4 x 250 mm, 5 ㎛, 80 Å)과 함께 애질런트 1260 인피니티 HPLC(Agilent 1260 Infinity HPLC) 시스템을 사용하여 HPLC 분석을 수행하였다. 앞서 기술된 바와 같이, 각 물질을 가변 파장 검출기(Variable Wavelength Detector: VWD)하에서 머무름 시간 및 260 nm 흡광도에 의해 특징화한다. 선조체 샘플을 뇌 조직으로부터 직접 제조하였다. 간략하면, 마우스를 안락사시킨 후 즉시 선조체를 절개하였다. 스퀴시 장치(squisher)를 이용하여 200 ㎕ 0.1 M 염산 중에서 균질화한 후, 샘플을 원심분리하였다 (12,000 Х g, 10 min, 4℃). 생성된 상청액을 0.2 um 나노셉 MF (Nanosep MF) 원심분리 장치에 의해 여과한 후, HPLC 분석에 적용시켰다.
행동 검사.
모든 행동 검사는 6-OHDA 유도 병변 후 21-28일째 또는 AAV 벡터 또는 ASO 전달 후 2, 3, 및 5개월째에 수행하였다. 회전 검사를 위해, 마우스에서의 아포모르핀-유도 회전은 아포모르핀 (시그마, 0.5 mg/kg) 복강내 주사 후, 라이브 비디오 시스템하에서 기록하였다. 최종 결과를 모호하게 만들 수 있는 '와인드 업(wind-up)' 효과를 막기 위해, 회전 검사 수행 전 이틀에 나누어 아포모르핀 (0.5 mg/kg)을 마우스에 주사하였다 (예를 들어, 검사를 금요일날 수행하고자 할 경우, 마우스에 먼저 월요일 및 수요일날 주사하게 될 것이다). 앞서 기술된 바와 같이 10 min 동안 주사한 후 5 min째 회전을 측정하고, 오직 전신 회전만은 계수하였다. 데이터는 분당 순 대측성 회전수로 표시하였다. 실린더 테스트를 위해, 앞서 기술된 바와 같이, 모든 터치를 전체 다 보기 위해 뒤쪽에 거울이 배치된 유리 실린더 (직경 19 cm, 높이 25 cm) 안으로 마우스를 개별적으로 배치하였다. 마우스를 5 min 동안 라이브 비디오 시스템하에서 기록하였다. 기록 전에는 실린더에 대한 마우스의 습성화를 수행하지 않았다. 점수화하기 위해 프레임별로 비디오 플레이어 (KM플레이어(KMPlayer) 버전 4.0.7.1)를 사용하였다. 동측성 또는 대측성 앞다리와 독립적으로 오직 벽 터치만을 계수하였다. 본 분석에는 동시 벽 터치 (동시에 양발로 모두로 수행된 터치)는 포함시키지 않았다. 데이터는 전체 터치 중 동측성 터치의 비율로서 표시되어 있다.
화학유전학적 실험을 위해, 6-OHDA 유도 병변 후 21-28일째 및 AAV-hM4Di-shPTB 전달 후 2개월째에 실린더 테스트를 수행하였다. 후자 검사에서, 동물에 먼저 염수를 주사하여 회수 기준선을 기록하였다. 이어서, CNO (바이오몰 인터내셔널(Biomol International), 4 mg/kg) 복강내 주사 후 40 min째, 또는 상기 약물 대사 후 72hr째에 기록을 수행하였다.
실시예12. 단백질 또는 핵산 서열
Figure pct00001
본 개시내용의 바람직한 실시양태가 본원에서 제시되고, 기술되었지만, 상기 실시양태는 단지 예로서 제공되었다는 것은 당업자에게 자명할 것이다. 이제, 당업자는 본 개시내용으로부터 벗어남 없이, 다수의 변형, 변경, 및 치환을 착안해 낼 수 있을 것이다. 본 개시내용을 수행하는 데 본 개시내용의 실시양태에 대한 다양한 대안이 사용될 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 하기 청구범위가 본 개시내용의 범주를 정의하고, 이들 청구범위의 범주 내에 있는 방법 및 구조 및 그의 등가물이 그에 의해 포함되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> The Regents of the University of California <120> REPROGRAMMING OF NON-NEURONAL CELLS INTO NEURONS AND METHODS AND COMPOSITIONS TO TREAT NEURODEGENERATIVE DISEASES AND DISORDERS <130> IPA201280-US <140> PCT/US2019/027027 <141> 2019-04-11 <150> US 62/656,322 <151> 2018-04-11 <150> US 62/718,774 <151> 2018-08-14 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse shPTB <400> 1 gggtgaagat cctgttcaat a 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human shPTB <400> 2 gcgtgaagat cctgttcaat a 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide to Turbo GFP <400> 3 gttggtgctc ttcatcttgt t 21 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> U6-Forward Primer <400> 4 acgcaaattc gtgaagcgtt 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-124 Forward Primer <400> 5 taaggcacgc ggtgaatgcc 20 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-9 Forward Primer <400> 6 gcgctctttg gttatctagc tgtatg 26

Claims (121)

  1. 인간 성인 섬유모세포에서 발현되는 것보다 더 높은 수준으로 miR-9 또는 Brn2를 발현하는 인간 비-뉴런 세포를 제공하는 단계; 및
    상기 세포를, 상기 인간 비-뉴런 세포에서 PTB의 발현 또는 활성을 억제시키는 세포-프로그래밍 작용제를 포함하는 조성물과 접촉시켜 상기 인간 비-뉴런 세포를 성숙한 뉴런으로 리프로그래밍하는 단계를 포함하는, 인간 비-뉴런 세포를 성숙한 뉴런으로 리프로그래밍하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 인간 비-뉴런 세포가 인간 성인 섬유모세포에서 발현되는 것보다 적어도 2배 더 높은 수준으로 miR-9 또는 Brn2를 발현하는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 인간 비-뉴런 세포가 인간 성인 섬유모세포에서 발현되는 것보다 적어도 10배 더 높은 수준으로 miR-9 또는 Brn2를 발현하는 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 비-뉴런 세포가 인간 성인 섬유모세포에서 발현되는 것보다 더 높은 수준으로 miR-9 및 Brn2를 발현하는 것인 방법.
  5. 리프로그래밍하고자 하는 인간 신경교 세포(glial cell)를 제공하는 단계; 및
    상기 인간 신경교 세포를 적어도 1일 동안, 상기 인간 신경교 세포에서 PTB의 발현 또는 활성을 억제시키는 세포-프로그래밍 작용제를 포함하는 조성물과 접촉시켜 상기 인간 신경교 세포를 성숙한 뉴런으로 리프로그래밍하는 단계를 포함하는, 인간 신경교 세포를 성숙한 뉴런으로 리프로그래밍하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 인간 신경교 세포가 성상세포 (astrocyte), 희소돌기아교세포 (oligodendrocyte), 뇌실막 세포 (ependymal cell), 슈반 세포 (Schwan cell), 소교세포 (microglia), 및 위성 세포 (satellite cell)로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 인간 신경교 세포가 GFAP (신경교 섬유질 산성 단백질) 또는 ALDH1L1 (알데히드 데히드로게나제 1 패밀리 구성원 L1)에 대하여 양성인 것인 방법.
  8. 리프로그래밍하고자 하는 성상세포를 제공하는 단계; 및
    상기 성상세포를 적어도 1일 동안, 상기 성상세포에서 PTB의 발현 또는 활성을 억제시키는 세포-프로그래밍 작용제를 포함하는 조성물과 접촉시켜 상기 성상세포를 성숙한 뉴런으로 리프로그래밍하는 단계를 포함하는, 성상세포를 성숙한 뉴런으로 리프로그래밍하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 성상세포가 마우스 성상세포인 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 방법이 복수의 마우스 성상세포를 리프로그래밍하고, 여기서, 상기 마우스 성상세포 중 적어도 60%가 Tuj1 양성인 성숙한 뉴런으로 전환되는 것인 방법.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 방법이 복수의 마우스 성상세포를 리프로그래밍하고, 여기서, 상기 마우스 성상세포 중 적어도 40%가 Map2 양성인 성숙한 뉴런으로 전환되는 것인 방법.
  12. 제8항에 있어서, 상기 성상세포가 인간 성상세포인 것인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 방법이 복수의 인간 성상세포를 리프로그래밍하고, 여기서, 상기 인간 성상세포 중 적어도 40%, 적어도 60%, 또는 적어도 80%가 Tuj1 양성인 성숙한 뉴런으로 전환되는 것인 방법.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 방법이 복수의 인간 성상세포를 리프로그래밍하고, 여기서, 상기 인간 성상세포 중 적어도 20%, 적어도 40% 또는 적어도 60%가 Map2 양성인 성숙한 뉴런으로 전환되는 것인 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 PTB의 발현 또는 활성을 특이적으로 억제시키는 단일 세포-프로그래밍 작용제를 포함하는 것인 방법.
  16. 리프로그래밍하고자 하는 인간 비-뉴런 세포를 제공하는 단계; 및
    상기 인간 비-뉴런 세포를 적어도 3일 동안, 상기 인간 비-뉴런 세포에서 PTB의 발현 또는 활성을 억제시키는 단일 세포-프로그래밍 작용제를 포함하는 조성물과 접촉시켜 상기 인간 비-뉴런 세포를 성숙한 뉴런으로 리프로그래밍하는 단계를 포함하는, 인간 비-뉴런 세포를 성숙한 뉴런으로 리프로그래밍하는 방법.
  17. 리프로그래밍하고자 하는 인간 비-뉴런 세포를 제공하는 단계; 및
    상기 인간 비-뉴런 세포를, 상기 인간 비-뉴런 세포에서 PTB의 발현 또는 활성을 감소시키고, 상기 PTB의 발현 또는 활성의 감소 후, nPTB의 발현 또는 활성을 감소시키는 단일 세포-프로그래밍 작용제를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 인간 비-뉴런 세포를 리프로그래밍하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 초기 nPTB 발현 수준이, PTB의 발현 또는 활성이 억제됨에 따라 높은 nPTB 발현 수준까지 증가하는 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, nPTB 발현이 상기 높은 nPTB 발현 수준에서, PTB의 발현 또는 활성의 억제 후, 상기 초기 nPTB 발현 수준보다 더 높은, 낮은 nPTB 발현 수준으로 감소하는 것인 방법.
  20. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 비-뉴런 세포가 인간 성인 섬유모세포에서 발현되는 것보다 더 높은 수준으로 miR-9 또는 Brn2를 발현하는 것인 방법.
  21. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 비-뉴런 세포가 인간 성인 섬유모세포에서 발현되는 것보다 더 높은 수준으로 miR-9 및 Brn2를 발현하는 것인 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 복수의 상기 인간 비-뉴런 세포, 상기 인간 신경교 세포, 또는 상기 성상세포를 리프로그래밍하고, 여기서, 상기 인간 비-뉴런 세포, 상기 인간 신경교 세포, 또는 상기 성상세포 중 적어도 40%가, NeuN (뉴런 핵 항원), Map2 (미세소관-연합 단백질 2), NSE (뉴런 특이적 에놀라제), 160 kDa 신경필라멘트 중간 쇄 (neurofilament medium), 200 kDa 신경필라멘트 중쇄 (neurofilament heavy), PDS-95 (시냅스후 치밀질 단백질 95), 시냅신 I, 시냅토피신, GAD67 (글루타메이트 데카르복실라제 67), GAD65 (글루타메이트 데카르복실라제 67), 파르브알부민, DARPP32 (도파민- 및 cAMP-조절 뉴런 인단백질 32), vGLUT1 (소포 글루타메이트 수송체 1), vGLUT2 (소포 글루타메이트 수송체 1), 아세틸콜린, 및 TH (티로신 히드록실라제)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 뉴런 마커의 발현을 특징으로 하는 성숙한 뉴런으로 리프로그래밍되는 것인 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 복수의 상기 인간 비-뉴런 세포, 상기 인간 신경교 세포, 또는 상기 성상세포를 리프로그래밍하고, 여기서, 상기 인간 비-뉴런 세포, 상기 인간 신경교 세포, 또는 상기 성상세포 중 적어도 20%가, 활동 전위, 시냅스 연결, 시냅스전 신경전달물질 생물발생(biogenesis), 및/또는 시냅스후 반응을 확립시킬 수 있는 그의 능력을 특징으로 하는 기능성 뉴런으로 리프로그래밍되는 것인 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포-프로그래밍 작용제가 항-PTB 억제제인 것인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 항-PTB 억제제가 항-PTB 안티센스 올리고뉴클레오티드인 것인 방법.
  26. 제24항에 있어서, 상기 항-PTB 억제제가 항-PTB shRNA, 항-PTB miRNA, 항-PTB 안티센스 올리고뉴클레오티드, 항-PTB 항체, PTB의 소분자 억제제, 우성 음성 PTB 돌연변이체, 및 폴리피리미딘 트랙을 함유하는 스펀지 폴리리보뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포-프로그래밍 작용제가 적어도 5일 동안 상기 PTB의 발현 또는 활성을 억제시키는 것인 방법.
  28. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포-프로그래밍 작용제가 적어도 10일 동안 상기 PTB의 발현 또는 활성을 억제시키는 것인 방법.
  29. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포-프로그래밍 작용제가 적어도 15일 동안 상기 PTB의 발현 또는 활성을 억제시키는 것인 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 비-뉴런 세포, 상기 인간 신경교 세포, 또는 상기 성상세포를 배지 중에서 배양하는 것인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 배지가 ALK5의 억제제, GSK3b의 억제제, PKA의 활성인자, 및 그의 임의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 작용제를 포함하는 것인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 활성인자 ALK5가 SB431542를 포함하는 것인 방법.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 상기 억제제 GSK3b가 CHIR99021을 포함하는 것인 방법.
  34. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PKA의 활성인자가 디부티릴아데노신 3',5'-시클릭 모노포스페이트 (Db-cAMP)를 포함하는 것인 방법.
  35. 제30항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포-프로그래밍 작용제가 렌티바이러스 벡터로 전달되는 것인 방법.
  36. 대상체의 뇌에 상기 뇌 중 성상세포에서 PTB의 발현 또는 활성을 억제시키는 세포-프로그래밍 작용제를 포함하는 조성물을 투여하는 단계, 및 상기 성상세포가 기능성 뉴런으로 리프로그래밍될 수 있도록 허용하는 단계를 포함하는, 생체내에서 기능성 뉴런을 생성하는 방법.
  37. 대상체의 중뇌에 상기 중뇌 중 비-뉴런 세포에서 PTB의 발현 또는 활성을 억제시키는 세포-프로그래밍 작용제를 포함하는 조성물을 투여하는 단계, 및 상기 비-뉴런 세포가 기능성 뉴런으로 리프로그래밍될 수 있도록 허용하는 단계를 포함하는, 생체내에서 기능성 뉴런을 생성하는 방법.
  38. 대상체의 뇌에 상기 뇌 중 비-뉴런 세포에서 PTB의 발현 또는 활성을 억제시키는 세포-프로그래밍 작용제를 포함하는 조성물을 투여하는 단계, 및 상기 비-뉴런 세포가 도파민성 뉴런으로 리프로그래밍될 수 있도록 허용하는 단계를 포함하는, 생체내에서 도파민성 뉴런을 생성하는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 도파민성 뉴런이 티로신 히드록실라제 (TH), 도파민 수송체 (DAT), 소포 모노아민 수송체 2 (VMAT2), 엔그레일드 호메오박스 1 (En1), FoxA2, 및/또는 LIM 호메오박스 전사 인자 1 알파 (Lmx1a)를 발현하는 것인 방법.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서, 방법이 상기 뇌 중 복수의 비-뉴런 세포를 리프로그래밍하고, 여기서, 상기 비-뉴런 세포 중 적어도 10%가 도파민성 뉴런으로 전환되는 것인 방법.
  41. 제38항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 상기 뇌 중 복수의 비-뉴런 세포를 리프로그래밍하고, 여기서, 상기 비-뉴런 세포 중 적어도 30%가 도파민성 뉴런으로 전환되는 것인 방법.
  42. 제37항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기능성 뉴런 또는 상기 도파민성 뉴런의 축삭돌기 말단이 상기 대상체의 선조체에 도달하는 것인 방법.
  43. 제37항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기능성 뉴런 또는 상기 도파민성 뉴런의 축삭돌기 말단이 상기 대상체의 미상핵 조가비핵 (caudate putamen), 측중격핵 (nucleus accumbens), 격막핵 (septal nucleus), 또는 후각 결절 (olfactory tubercle)에 도달하는 것인 방법.
  44. 제37항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포-프로그래밍 작용제가 상기 대상체의 흑색질에 투여되는 것인 방법.
  45. 제36항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 인간인 것인 방법.
  46. 제36항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 비-인간 동물인 것인 방법.
  47. 인간 대상체의 뇌에 상기 뇌 중 비-뉴런 세포에서 PTB의 발현 또는 활성을 억제시키는 세포-프로그래밍 작용제를 투여하는 단계, 및 상기 비-뉴런 세포가 기능성 뉴런으로 리프로그래밍될 수 있도록 허용하는 단계를 포함하는, 생체내에서 기능성 뉴런을 생성하는 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 비-뉴런 세포가 신경교 세포인 것인 방법.
  49. 제48항에 있어서, 상기 신경교 세포가 성상세포인 것인 방법.
  50. 제47항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포-프로그래밍 작용제가 상기 인간 대상체의 중뇌, 피질, 또는 선조체에 투여되는 것인 방법.
  51. 제47항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포-프로그래밍 작용제가 상기 인간 대상체의 흑색질에 투여되는 것인 방법.
  52. 제47항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기능성 뉴런이 도파민성 뉴런인 것인 방법.
  53. 제47항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기능성 뉴런이 티로신 히드록실라제 (TH), 도파민 수송체 (DAT), 소포 모노아민 수송체 2 (VMAT2), 엔그레일드 호메오박스 1 (En1), FoxA2, 및/또는 LIM 호메오박스 전사 인자 1 알파 (Lmx1a)를 발현하는 것인 방법.
  54. 제36항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기능성 뉴런 또는 상기 도파민성 뉴런이 시냅스전 신경전달물질의 생물발생을 나타내는 것인 방법.
  55. 제36항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기능성 뉴런 또는 상기 도파민성 뉴런이 상기 뇌 중 현존 뉴런 회로망에 통합되는 것인 방법.
  56. 제36항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 상기 뇌 중 복수의 상기 비-뉴런 세포 또는 상기 성상세포를 리프로그래밍하고, 여기서, 상기 비-뉴런 세포 또는 상기 성상세포 중 적어도 30%가, 뉴런 핵 항원 (NeuN), 미세소관-연합 단백질 2 (Map2), 뉴런 특이적 에놀라제 (NSE), 160 kDa 신경필라멘트 중간 쇄, 200 kDa 신경필라멘트 중쇄, 시냅스후 치밀질 단백질 95(PDS-95), 시냅신 I, 시냅토피신, 글루타메이트 데카르복실라제 67 (GAD67), 글루타메이트 데카르복실라제 67 (GAD65), 파르브알부민, 도파민- 및 cAMP-조절 뉴런 인단백질 32 (DARPP32), 소포 글루타메이트 수송체 1 (vGLUT1), 소포 글루타메이트 수송체 2 (vGLUT2), 아세틸콜린, 및 티로신 히드록실라제 (TH)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 뉴런 마커의 발현을 특징으로 하는 성숙한 뉴런으로 리프로그래밍되는 것인 방법.
  57. 제36항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 상기 뇌 중 복수의 상기 비-뉴런 세포 또는 상기 성상세포를 리프로그래밍하고, 여기서, 상기 비-뉴런 세포 또는 상기 성상세포 중 적어도 20%가, 활동 전위, 시냅스 연결, 시냅스전 신경전달물질 생물발생, 및/또는 시냅스후 반응을 확립시킬 수 있는 그의 능력을 특징으로 하는 기능성 뉴런으로 리프로그래밍되는 것인 방법.
  58. 제36항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포-프로그래밍 작용제가 항-PTB 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것인 방법.
  59. 제36항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포-프로그래밍 작용제가 항-PTB shRNA, 항-PTB miRNA, 항-PTB 안티센스 올리고뉴클레오티드, 항-PTB 항체, PTB의 소분자 억제제, 우성 음성 PTB 돌연변이체, 폴리피리미딘 트랙을 함유하는 스펀지 폴리리보뉴클레오티드, 및 그의 임의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  60. 제36항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포-프로그래밍 작용제가 적어도 5일 동안 상기 PTB의 발현 또는 활성을 억제시키는 것인 방법.
  61. 제36항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포-프로그래밍 작용제가 적어도 10일 동안 상기 PTB의 발현 또는 활성을 억제시키는 것인 방법.
  62. 제36항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포-프로그래밍 작용제가 적어도 15일 동안 상기 PTB의 발현 또는 활성을 억제시키는 것인 방법.
  63. 제36항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포-프로그래밍 작용제가 AAV 벡터로 전달되는 것인 방법.
  64. 뇌 영역 중 기능성 뉴런의 퇴행과 연관된 신경 병태 치료를 필요로 하는 대상체의 뇌 영역에 상기 뇌 영역 중 비-뉴런 세포에서 PTB의 발현 또는 활성을 억제시키는 세포-프로그래밍 작용제를 포함하는 조성물을 투여하는 단계, 및 상기 비-뉴런 세포가 기능성 뉴런으로 리프로그래밍될 수 있도록 허용하여 상기 뇌 영역 중 상기 퇴행된 기능성 뉴런을 보충해 주는 단계를 포함하는, 뇌 영역 중 기능성 뉴런의 퇴행과 연관된 신경 병태를 치료하는 방법.
  65. 제64항에 있어서, 상기 신경 병태가 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅톤병, 조현병, 우울증, 및 약물 중독으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  66. 뇌 영역 중 도파민성 뉴런의 퇴행과 연관된 신경 병태 치료를 필요로 하는 대상체의 뇌 영역에 상기 뇌 영역 중 비-뉴런 세포에서 PTB의 발현 또는 활성을 억제시키는 세포-프로그래밍 작용제를 포함하는 조성물을 투여하는 단계, 및 상기 비-뉴런 세포가 도파민성 뉴런으로 리프로그래밍될 수 있도록 허용하여 상기 뇌 영역 중 상기 퇴행된 도파민성 뉴런을 보충해 주는 단계를 포함하는, 뇌 영역 중 도파민성 뉴런의 퇴행과 연관된 신경 병태를 치료하는 방법.
  67. 정상 수준과 비교하여 감소된 양의 도파민을 갖는 대상체의 뇌 영역에 상기 뇌 영역 중 비-뉴런 세포에서 PTB의 발현 또는 활성을 억제시키는 세포-프로그래밍 작용제를 포함하는 조성물을 투여하는 단계, 및 상기 비-뉴런 세포가 도파민성 뉴런으로 리프로그래밍될 수 있도록 허용하여 상기 도파민의 감소된 양 중 적어도 50%를 회복시키는 단계를 포함하는, 정상 수준과 비교하여 감소된 양의 도파민을 갖는 대상체에서 도파민 생물발생을 회복시키는 방법.
  68. 제64항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-뉴런 세포가 신경교 세포인 것인 방법.
  69. 제64항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-뉴런 세포가 성상세포인 것인 방법.
  70. 제64항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포-프로그래밍 작용제가 항-PTB 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것인 방법.
  71. 제64항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일 세포-프로그래밍 작용제가 항-PTB shRNA, 항-PTB miRNA, 항-PTB 안티센스 올리고뉴클레오티드, 항-PTB 항체, PTB의 소분자 억제제, 우성 음성 PTB 돌연변이체, 폴리피리미딘 트랙을 함유하는 스펀지 폴리리보뉴클레오티드, 및 그의 임의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  72. 제64항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기능성 뉴런 또는 상기 도파민성 뉴런이 상기 뇌 영역 중 현존 뉴런 회로망으로 통합되는 것인 방법.
  73. 제64항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기능성 뉴런 또는 상기 도파민성 뉴런이 활동 전위, 시냅스전 신경전달물질의 생물발생, 및/또는 시냅스후 반응을 나타내는 것인 방법.
  74. 제64항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포-프로그래밍 작용제가 상기 대상체의 중뇌, 피질, 또는 선조체에 투여되는 것인 방법.
  75. 제64항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포-프로그래밍 작용제가 상기 대상체의 흑색질에 투여되는 것인 방법.
  76. 제74항 또는 제75항에 있어서, 상기 기능성 뉴런 또는 상기 도파민성 뉴런의 축삭돌기 말단이 상기 대상체의 선조체에 도달하는 것인 방법.
  77. 제64항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기능성 뉴런 또는 상기 도파민성 뉴런의 축삭돌기 말단이 상기 대상체의 미상핵 조가비핵, 측중격핵, 격막핵, 또는 후각 결절에 도달하는 것인 방법.
  78. 제64항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신경 병태가 파킨슨병인 것인 방법.
  79. 제78항에 있어서, 상기 상기 세포-프로그래밍 작용제의 투여가 파킨슨병의 하나 이상의 증상을 호전시키는 것인 방법.
  80. 제79항에 있어서, 상기 파킨슨병의 하나 이상의 증상이 떨림 (tremor), 경직 (stiffness), 서동 (slowness), 균형 장애 (impaired balance), 발을 질질 끄는 보행 (shuffling gait), 자세의 불안정 (postural instability), 후각 기능장애 (olfactory dysfunction), 인지 기능장애 (cognitive impairment), 우울증 (depression), 수면 장애 (sleep disorders), 자율신경계 장애 (autonomic dysfunction), 동통 (pain), 및 피로 (fatigue)로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  81. 제1항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포-프로그래밍 작용제가 표적 세포에서 PTB의 발현 또는 활성을 억제시키도록 구성된, 세포-표적화 모이어티와 접합된 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 여기서, 상기 표적 세포는 상기 비-뉴런 세포, 상기 신경교 세포, 또는 상기 성상세포를 포함하고, 여기서, 상기 세포-표적화 모이어티는 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드를 상기 표적 세포로 전달하도록 구성된 것인 방법.
  82. 제81항에 있어서, 상기 세포-표적 모이어티가 펩티드를 포함하는 것인 방법.
  83. 제1항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포-프로그래밍 작용제가 서열 번호: 1 또는 2와 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하는 것인 방법.
  84. 포유동물의 비-뉴런 세포에서 PTB의 발현 또는 활성을 억제시킴으로써 상기 비-뉴런 세포를 성숙한 뉴런으로 리프로그래밍하는 데 효과적인 양으로 세포-프로그래밍 작용제를 포함하는 제약 조성물.
  85. 제84항에 있어서, 주사, 흡입, 비경구적 투여, 정맥내 투여, 피하 투여, 근육내 투여, 진피내 투여, 국소 투여, 또는 경구적 투여용으로 제제화된 것인 제약 조성물
  86. 비-뉴런 세포에서 PTB의 발현 또는 활성을 억제시키도록 구성된 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하는 주사용 조성물.
  87. 제86항에 있어서, 상기 비-뉴런 세포가 신경교 세포인 것인 조성물.
  88. 제86항에 있어서, 상기 신경교 세포가 성상세포인 것인 조성물.
  89. 제86항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 서열 번호: 1 또는 2와 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하는 것인 조성물.
  90. 비-뉴런 세포에서 PTB의 발현 또는 활성을 억제시키도록 구성된 AAV-shRNA 구축물을 포함하는 주사용 조성물.
  91. 제90항에 있어서, 상기 비-뉴런 세포가 신경교 세포인 것인 조성물.
  92. 제91항에 있어서, 상기 신경교 세포가 성상세포인 것인 조성물.
  93. 제90항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 구축물이 서열 번호: 1 또는 2와 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하는 것인 조성물.
  94. 비-뉴런 세포에서 PTB의 발현 또는 활성을 억제시키도록 구성된 렌티바이러스-shRNA 구축물을 포함하는 조성물.
  95. 제94항에 있어서, 상기 비-뉴런 세포가 신경교 세포인 것인 조성물.
  96. 제95항에 있어서, 상기 신경교 세포가 성상세포인 것인 조성물.
  97. 제94항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 구축물이 서열 번호: 1 또는 2와 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하는 것인 조성물.
  98. 비-뉴런 세포에서 PTB의 발현 또는 활성을 억제시키도록 구성된, 세포-표적화 모이어티와 접합된 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 여기서, 상기 세포-표적화 모이어티는 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드를 상기 비-뉴런 세포로 전달하도록 구성된 것인, 비-뉴런 세포를 뉴런으로 전환시키기 위한 조성물.
  99. 제98항에 있어서, 상기 세포-표적화 모이어티가 펩티드를 포함하는 것인 조성물.
  100. 제98항 또는 제99항에 있어서, 상기 세포-표적화 모이어티가 구체적으로, 상기 비-뉴런 세포를 특이적으로 표적화하도록 구성된 것인 조성물.
  101. 제98항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-뉴런 세포가 신경교 세포, 성체 1차 섬유모세포, 배아 섬유모세포, 상피 세포, 멜라노사이트, 케라티노사이트, 아디포사이트, 혈액 세포, 골수 기질 세포, 랑게르한스 세포, 근육 세포, 직장 세포, 및 콘드로사이트로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  102. 제98항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-뉴런 세포가 신경교모세포종 세포, Hela 세포주, NT2 세포주, ARPE19 세포주, 및 N2A 세포주로 구성된 군으로부터 선택되는 세포주로부터의 것인 조성물.
  103. 제98항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-뉴런 세포가 신경교 세포인 것인 조성물.
  104. 제103항에 있어서, 상기 신경교 세포가 성상세포, 희소돌기아교세포, 뇌실막 세포, 슈반 세포, NG2 세포, 및 위성 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  105. 제103항에 있어서, 상기 신경교 세포가 성상세포인 것인 조성물.
  106. 제98항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 뇌 영역 중 기능성 뉴런의 퇴행과 연관된 신경 병태를 치료하기 위한 것인 조성물.
  107. 제106항에 있어서, 상기 신경 병태가 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅톤병, 조현병, 우울증, 및 약물 중독으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  108. 제106항에 있어서, 상기 신경 병태가 파킨슨병인 것인 조성물.
  109. 뇌 영역 중 리프로그래밍된 뉴런을 포함하는 동물로서, 여기서, 상기 리프로그래밍된 뉴런은 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 것인 동물.
  110. 제109항에 있어서, 동물이 포유동물인 것인 동물.
  111. 제110항에 있어서, 동물이 인간인 것인 동물.
  112. 제110항에 있어서, 동물이 마우스인 것인 동물.
  113. 제109항 내지 제111항 중 어느 한 항의 동물의 뇌 조직으로서, 상기 리프로그래밍된 뉴런을 포함하는, 뇌 조직.
  114. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 리프로그래밍된 뉴런.
  115. 성상세포를, 폴리피리미딘-트랙-결합 (PTB) 단백질의 발현을 억제시키는 억제 핵산 분자와 접촉시킴으로써 성상세포의 뉴런 세포로의 전환에 의해 생산된 뉴런 세포.
  116. 신경퇴행성 질환 또는 장애를 앓는 대상체에서의 성상세포를 PTB의 발현을 억제시키는 억제 핵산과 접촉시켜 성상세포를 뉴런으로 분화시키고, 신경퇴행성 질환 또는 장애를 치료하는 단계를 포함하는, 신경퇴행성 질환 또는 장애를 치료하는 방법.
  117. 제116항에 있어서, 억제 핵산이 대상체 뇌의 중추 신경계 중 신경퇴행성 질환 또는 장애와 연관된 부위로 전달되는 것인 방법.
  118. 제116항에 있어서, 대상체가 포유동물인 것인 방법.
  119. 제118항에 있어서, 포유동물이 인간인 것인 방법.
  120. 제116항에 있어서, 신경퇴행성 질환 또는 장애가 허혈성 및 출혈성 뇌졸중; 척수 손상; 뇌 손상(brain injury); 헌팅톤병; 알츠하이머병; 파킨슨병; 조현병; 자폐증; 운동 실조증; 근위축성 측경화증; 루게릭병; 라임병(Lyme Disease); 수막염; 편두통; 운동 뉴런증; 신경병증; 동통; 뇌 손상(brain damage); 뇌 기능장애; 척수 장애; 말초 신경계 장애; 뇌 신경 장애; 자율 신경계 장애; 발작 장애 예컨대, 간질; 운동 장애 (movement disorders) 예컨대, 파킨슨병; 수면 장애; 두통; 하부 요통 및 경부 동통; 신경성 동통; 섬망(delirium) 및 치매, 예컨대, 알츠하이머병; 현기증(dizziness) 및 어지럼증(vertigo); 혼수상태(stupor) 및 코마; 두부 손상; 뇌졸중; 신경계 종양; 다발성 경화증 및 다른 탈수초성 질환(demyelinating diseases); 뇌 또는 척수 감염; 및 프리온 질환(prion disease)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  121. 신경퇴행성 질환 또는 장애를 앓는 대상체로부터 성상세포를 수득하는 단계, 및 성상세포를, PTB 발현을 억제시키는 억제 핵산과 접촉시켜 성상세포를 뉴런 세포로 분화시키는 단계, 및 뉴런 세포를 약물 또는 화합물과 접촉시키는 단계, 및 약물 또는 화합물이 신경퇴행성 질환 또는 장애의 임의의 질환 마커의 발현을 억제시키는지 여부를 측정하는 단계를 포함하는, 신경퇴행성 질환 또는 장애를 치료 또는 억제시키는 활성에 대해 약물 또는 화합물을 스크리닝하는 방법.
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