KR20200134523A - 마이크로 나노패턴의 전기적 지형학적 조절을 통한 세포 증식 및 분화 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 마이크로 패턴과 나노 패턴이 함께 형성된 세포 배양용 기판과 그 기판을 이용한 세포의 배양 방법에 관한 것이다. 본 발명의 세포 배양용 기판을 이용 하는 경우, 세포 배양을 촉진 할 수 있다.

Description

마이크로 나노패턴의 전기적 지형학적 조절을 통한 세포 증식 및 분화 방법{METHOD FOR CELL PROLIFERATION AND DIFFERENTIATION BY ELECTRICAL AND TOPOGRAPHICAl CONTROL OF MICRO/NANOPATTERN}

본 발명은 마이크로 패턴과 나노 패턴이 함께 형성된 세포 배양용 기판과 그 기판을 이용한 세포의 배양 방법에 관한 것이다.

기존의 줄기세포 분화를 위한 패턴에서는 세포가 성장하고 분화하는 substrate의 특성에 따른 분석만 진행하거나 전기적 특성에 따른 세포의 거동 분석만 진행하는 등 패턴과 전기적 특성을 분리하여 진행하였다. 줄기세포는 다양하고 복잡한 미세환경에 의하여 성장 및 분화가 조절되기 때문에, 다양한 조건에 대한 환경 변화와 그에 따른 분석이 필요하다. 본 발명에서는 시뮬레이션을 통해 나노필라의 어떤 특성이 세포의 성장과 분화에 영향을 주는지 확인하여 나노패턴을 최적화하였으며, 마이크로 패턴의 전기전도도를 최적화하여 전기적 자극을 줄 수 있는 마이크로패턴과 세포의 접착을 높이기 위한 나노패턴을 결합하였다. 따라서, 전기적 자극을 위한 마이크로패턴과 지형학적 이점을 가하기 위한 나노패턴을 함께 구성하여 줄기세포 분화를 효과적으로 촉진하는 기술을 개발하였다. 특별히, 마이크로패턴은 생체적합한 하이드로젤을 주성분으로 하며, rGO와 AgNW을 캡슐화하여 전기전도성을 증가하였다. 종래기술에서 한가지의 재료를 사용하여 전기전도성을 획득한 사례도 있으나, 본 발명에서는 두 재료(rGO, AgNW)를 모두 첨가하여 향상된 전기전도성을 확보하였다. 또한 컴퓨터 시뮬레이션을 통해서, 마이크로패턴이 세포에 전기적 자극을 균일하게 줄 수 있으며 높은 전기전도성을 갖는 것을 최적화하였다. 또한 나노필라의 설계 수치의 변화에 따른 역학적 특성을 분석하였고, 최적화된 설계 수치를 얻을 수 있었으며, 그 이후 실험을 통해서 나노패턴의 효과를 검증하였다.

대한민국 등록특허 10-1905269

본 발명자들은 세포 증식 및 분화 제어를 효과적으로 조절하기 위한 세포 배양방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 마이크로/나노패턴의 전기적 지형학적 조절을 최적화함으로써 세포의 성장 및 분화 촉진을 규명하여, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 마이크로 패턴과 나노 패턴이 함께 형성된 세포 배양용 기판을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 마이크로 패턴과 나노 패턴이 함께 형성된 세포 배양용 기판을 이용한 세포의 배양 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 마이크로 패턴과 나노 패턴이 함께 형성된 세포 배양용 기판 및 그 기판을 이용한 세포의 배양 방법을 제공한다.

본 발명자들은 세포 증식 및 분화 제어를 효과적으로 조절하기 위한 세포 배양방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 마이크로/나노패턴의 전기적 지형학적 조절을 최적화함으로써 세포의 성장 및 분화 촉진을 규명하여, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 일 구현예인 마이크로 패턴과 나노 패턴이 함께 형성된 세포 배양용 기판을 이용하여, 세포들을 배양함으로써 세포들의 분화 및/또는 성장을 촉진할 수 있다. 본 발명은 세포가 성장하는 환경의 지형학적 요소를 제어함으로써 세포의 분화와 성장을 촉진시키는 원리를 이용하고 있고, 특히 나노패턴을 사용하는 경우 표면적이 넓어지기 때문에 세포의 분화와 성장을 촉진시킬 수 있다. 따라서 본 발명의 세포 배양용 기판을 사용함으로써 발휘되는 효과는 특정 세포를 선택함으로써 발휘되는 효과는 아니며, 세포의 종류는 크게 제한되지 않는다. 본 발명의 세포 배양용 기판을 이용하여 배양할 수 있는 세포에 대하여 구체적으로 예를 들면, 줄기세포, 암세포, 근육세포, 혈액세포, 면역세포, 골세포, 혈관내피세포, 섬유아세포, 상피세포 등으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 세포일 수 있다. 더욱 상세하게, 줄기세포란 신경줄기세포(neural stem cell; NSC), 배아 줄기세포(embryonic stem cell; ESC), 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSC), 조혈모세포 (haematopoietic stem cell;HSC), 조혈전구세포(haemopoietic precursor cell; HPC), 림프 선조 세포(lymphoid progenitor cell) 및 흉선선조 세포(thymic progenitor cell)를 의미한다. 본 발명의 근육세포란 구체적으로 예를 들면, 골격근 세포, 심근 세포, 및 민무늬근 세포를 의미한다. 본 발명의 암세포란 구체적으로 예를 들면, 유방암세포, 전립선암세포, 직장암세포, 폐암세포, 췌장암세포, 난소암세포, 방광암세포, 자궁내막암세포, 자궁경부암세포, 간암세포, 신장암세포, 갑상선암세포, 골암세포, 림프종암세포 및 피부암세포를 의미한다.

보다 구체적으로는 근육세포 또는 신경줄기세포의 성장 및/또는 분화 유도를 위해 마이크로 패턴과 나노 패턴이 함께 형성된 세포 배양용 기판을 이용할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 나노 패턴은 동일한 간격으로 형성된 복수의 돌기 형상이다.

본 발명에서 용어 '나노 패턴 기판'은 상술한 나노 패턴이 표면 상에 형성된 기판을 의미한다. 구체적으로 예를 들면, 본 발명의 나노 패턴 기판은 포토리소그래피 공정에 의해 나노패턴화 된 단위 구조체의 집합이 표면상에 형성되도록 제작될 수 있다.

본 발명의 나노 패턴을 이루는 돌기 형상은 세포 배양용 기판의 표면적을 증가시킴으로서 세포부착성을 향상시키는 역할을 하고, 이로 인해 세포 성장 또는 분화를 촉진하는 효과가 발휘되는 바, 돌기의 형상에는 특별한 제한이 없고, 기판의 표면적을 증가시킬 수 있도록 표면상에 돌출된 형상이라면 어떠한 형상이라도 적용이 가능하다. 구체적으로 예를 들면, 본 발명의 나노 패턴을 이루는 돌기 형상은 원통형, 원뿔형, 원뿔대형, 반구형, 다각 기둥형으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상일 수 있고, 복수의 돌기 형상이 집합을 이루어 나노 패턴을 구성한다.

본 발명에서 용어 '원통형'은 밑면이 원인 기둥 형상의 돌기 형상이다.

본 발명에서 용어 '원뿔대형'은 원뿔을 밑면에 평행한 평면으로 잘랐을 때, 잘린 면으로 나뉜 원뿔의 두 부분 중에서 원뿔의 꼭짓점을 포함하지 않는 아랫부분 및 잘린 면으로 이루어진 돌기 형상이다.

본 발명에서 용어 '다각기둥형'은 밑면이 다각형인 기둥 모양의 형상으로서 예를 들면, 밑면이 삼각형이면 삼각기둥형, 밑면이 사각형이면 사각기둥형이다.

본 명세서 전반에 걸쳐, 본 발명의 나노 패턴을 이루는 각각의 돌기는 '나노 필라'로 지칭할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 돌기 형상은 형태(shape), 크기(size) 등에 특별한 제한이 없으며, 돌기 형상이 기판 상에 형성되는 것 자체로 세포 배양용 기판의 표면적을 넓히는 작용 효과가 발휘되어 기판에 대한 배양 세포의 부착성이 증가되는 효과가 발휘된다.

구체적으로 예를 들면, 상술한 돌기 형상은 반지름이 200 nm 내지 300 nm 및 높이가 650 nm 내지 850 nm 인 원통형의 돌기 형상이다.

본 발명의 일 구체예에 있어서 상기 돌기 형상은 반지름이 225 nm 내지 275 nm 및 높이가 675 nm 내지 825 nm 인 원통형의 돌기 형상이다. 더욱 구체적으로 돌기 형상은 반지름이 240 nm 내지 260 nm 및 높이가 690 nm 내지 810 nm 인 원통형의 돌기 형상 일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 나노 패턴은 표면이 친수성 물질로 코팅될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 나노 패턴의 표면에 코팅된 친수성 물질은 금, 은, 티타늄 옥사이드, 크롬 옥사이드, 구리 옥사이드, 및 알루미늄 옥사이드 일 수 있고 보다 구체적으로 예를 들면 이산화 규소(SiO₂)이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 나노 패턴은 UV 경화형 수지에 의해 형성되는 것이다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 UV 경화형 수지는 폴리우레탄, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리카보네이트, 폴리우레탄 아크릴레이트, 실리콘, 또는 폴리다이메틸실록세인로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질로 구성되는 고분자를 포함하는 것으로, 보다 구체적으로 예를 들면 폴리우레탄 아크릴레이트로 구성되는 고분자를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 마이크로 패턴은 전도성 하이드로젤에 의해 형성되는 것이다. 본 발명에서의 전도성 하이드로젤이란 친수성 고분자로 이루어진 삼차원 구조체로서 전도성을 갖는 구조체를 의미한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 전도성 하이드로젤은 (i) 생체적합성 고분자 및 (ii) 환원된 산화 그래핀 및 금속 나노와이어 중 어느 하나 이상을 포함하는 것이다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 전도성 하이드로젤을 구성하는 일 성분인 생체적합성 고분자는 본래의 세포, 조직 또는 기관 등에 도입되더라도 세포, 조직 또는 기관에 유의한 염증 반응, 면역원성 또는 세포 독성을 유도하지 않는 기능을 가지는 고분자로써, 당업계에 공지된 어떠한 생체적합성 고분자도 사용 가능하다. 구체적인 예로는, 상기 생체적합성 고분자는 폴리에틸렌글리콜(PEG), 덱스트란, 알부민, 폴리비닐알코올, 폴리에틸렌이민, 폴리락틱글라이코릭산(PLGA), 폴리락틱산, 폴리락타이드, 폴리글라이콜릭산, 폴리아미노산, 폴리아세탈, 폴리오써칼본에이트, 폴리칼본에이트, 폴리칼보락톤 폴리아크릴산, 폴리메타아크릴산, 폴리사카라이드, 폴리케탈, 폴리에테르, 폴리아마이드, 폴리말레익안하드라이드, 폴리메틸비닐에테르 및 상기 고분자의 공중합체로 구성된 군으로부터 선택되는 생체적합성 고분자이고, 보다 구체적으로 예를 들면 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 사용가능하다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 전도성 하이드로젤을 구성하는 일 성분인 금속 나노와이어는 금속으로 이루어진 나노미터 단위의 크기를 가지는 와이어 구조체를 말한다. 나노 와이어의 종류는 제한되지 않으나 구체적인 예를 들면, 은 나노와이어, 구리 나노와이어, 금 나노와이어 또는 알루미늄 나노와이어를 이용할 수 있고, 보다 구체적으로 은 나노와이어를 이용할 수 있다.

본 명세서에서 용어 '환원된 산화 그래핀'이란 전기 전도도를 포함하는 그래핀 고유의 물리적 특징을 복원하기 위해 산화 그래핀을 환원시킨 그래핀의 한 종류이다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 하이드로젤은 (i) 생체적합성 고분자 및 (ii) 환원된 산화 그래핀 및 금속 나노와이어가 2:1 내지 10:1 비율(w/w)로 포함될 수 있다. 더욱 구체적으로 (i) 과 (ii)의 함량비는 2:1 내지 10:1, 3:1 내지 10:1, 4:1 내지 10:1, 5:1 내지 10:1, 2:1 내지 9:1, 3:1 내지 9:1, 4:1 내지 9:1, 5:1 내지 9:1, 2:1 내지 8:1, 3:1 내지 8:1, 4:1 내지 8:1, 5:1 내지 8:1, 2:1 내지 7:1, 3:1 내지 7:1, 4:1 내지 7:1, 5:1 내지 7:1, 2:1 내지 6:1, 3:1 내지 6:1, 4:1 내지 6:1, 또는 5:1 내지 6:1 비율로 구성 될 수 있고 보다 구체적으로는 3:1 내지 7:1 비율로 구성 될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 마이크로 패턴은 기판에 형성된 나노패턴 상부에 형성되는 것을 특징으로 하는 것이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 나노 패턴은 상기 마이크로 패턴에 의해 구획되고 마이크로 패턴이 형성되지 않은 영역 내에 형성되는 것이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 마이크로 패턴은 일정한 형상의 구조체가 반복되는 패턴을 갖는 3차원 구조체로서, 상기 마이크로 패턴은 일 방향으로 연장되는 복수 개의 선형 구조를 포함하며, 상기 복수 개의 선형 구조는 소정의 간격을 사이에 두고 서로 이격되도록 기판상에 배치되어 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서 상기 소정의 간격은 100 μm 내지 600 μm 로 이루어져 있다. 본 발명의 일 구체예에 있어서, 마이크로 패턴의 간격은 100 μm 내지 550 μm 로 구성될 수 있고, 더욱 구체적으로 100 μm 내지 550 μm, 150 μm 내지 550 μm, 200 μm 내지 550 μm, 250 μm 내지 550 μm, 300 μm 내지 550 μm, 100 μm 내지 500 μm, 150 μm 내지 500 μm, 200 μm 내지 500 μm, 250 μm 내지 500 μm, 300 μm 내지 500 μm,, 100 μm 내지 450 μm, 150 μm 내지 450 μm, 200 μm 내지 450 μm, 250 μm 내지 450 μm, 300 μm 내지 450 μm, 100 μm 내지 400 μm, 150 μm 내지 400 μm, 200 μm 내지 400 μm, 250 μm 내지 400 μm, 300 μm 내지 400 μm, 100 μm 내지 350 μm, 150 μm 내지 350 μm, 200 μm 내지 350 μm, 250 μm 내지 350 μm, 또는 300 μm 내지 350 μm으로 구성될 수 있고 보다 구체적으로는 100 μm 내지 500 μm 로 이루어 질 수 있다.

본 발명의 일 구현예인 전도성 하이드로젤로 구성된 마이크로 패턴을 이용하여, 상기 기판은 전기 전도성을 갖고, 기판에 대한 전기적 자극을 통해 세포 배양에 유의한 상승작용을 일으킨다. 또한 상기 나노패턴에 의한 지형학적 작용과의 조합에 의해 세포 배양을 촉진 할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 세포 배양용 기판은 세포 배양을 위해 전압이 인가(apply)되는 것인 세포 배양용 기판인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 세포 배양을 위해 인가되는 전압은 교류형태의 전압이 인가 될 수 있으며, 보다 구체적으로는 예를 들면 DC 서플라이(DC supply)를 이용하여 직류를 발생하고 DC 서플라이(DC supply)를 함수 발생기(function generator)와 연결하여 교류형태로 전압을 인가할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 전압을 인가하는 방식은 구리선을 마이크로 패턴에 접촉시켜 세포 배양을 위한 전압을 인가한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 전압의 인가는 마이크로 패턴이 배열된 방향에 수직방향으로 인가되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 전압은 1 V 내지 15 V 로 인가 되는 것이다. 본 발명의 일 구체예에 있어서, 세포 배양용 기판에 인가될 수 있는 전압은 2 V 내지 15 V, 3 V 내지 15 V, 4 V 내지 15 V, 5 V 내지 15 V, 1 V 내지 14 V, 2 V 내지 14 V, 3 V 내지 14 V, 4 V 내지 14 V, 5 V 내지 14 V, 1 V 내지 13 V, 2 V 내지 13 V, 3 V 내지 13 V, 4 V 내지 13 V, 5 V 내지 13 V, 1 V 내지 12 V, 2 V 내지 12 V, 3 V 내지 12 V, 4 V 내지 12 V, 5 V 내지 12 V, 1 V 내지 11 V, 2 V 내지 11 V, 3 V 내지 11 V, 4 V 내지 11 V, 5 V 내지 11 V, 1 V 내지 10 V, 2 V 내지 10 V, 3 V 내지 10 V, 4 V 내지 10 V, 또는 5 V 내지 10 V 로 인가 될 수 있고, 보다 구체적으로는 5 V 내지 10 V로 인가 될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 세포 배양용 기판은 ECM(extracellular matrix) 기질로 코팅된 것을 특징으로 하는 것이다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 세포 배양용 기판에 코팅 될 수 있는 ECM 기질은, 피브린(fibrin), 매트리젤(Matrigel), 피브로넥틴(fibronectin), 콜라겐(collagen), 라미닌(laminin) 또는 poly-L-ornithine(PLO)으로 구성된 군으로부터 선택되는 ECM 기질이고 보다 구체적으로 예를 들면 라미닌 및 Poly-L-ornithine (PLO)을 사용가능하다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 세포를 배양하는 방법은 상기 세포 배양용 기판에 세포를 배양하는 단계를 포함하는 세포 배양 방법이다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명에서 이용될 수 있는 근육세포의 배양방법은 근육세포를 배양액이 포함된 배지에서 배양하는 단계; 근육세포를 세포 배양용 기판에 씨딩하는 단계; 세포 배양용 기판에 전압을 인가하여 근육세포를 배양하는 단계를 포함한다.

근육세포는 fetal bovine serum 및 penicillin-streptomycin 이 포함된 high-serum DMEM 또는 low-serum DMEM 배양액을 첨가하여 배양할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명에서 이용될 수 있는 신경세포의 배양방법은 신경줄기세포를 배양하여 신경구를 유도하는 단계; 신경구를 세포 배양 기판상에 씨딩하는 단계; 세포 배양용 기판에 전압을 인가하여 신경세포로 분화시키는 단계를 포함한다.

신경줄기세포는 BFGF(basic fibroblast growth factor), EGF(epidermal growth factor) 또는 FGF(fibroblast growth factor)의 생장 인자를 적합 농도 범위로 배지에 첨가하여 배양할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 마이크로 패턴과 나노 패턴이 함께 형성된 세포 배양용 기판을 제공한다.

(b) 본 발명은 전압이 인가된 세포 배양용 기판을 이용한 세포배양방법을 제공한다.

(c) 본 발명의 세포 배양용 기판을 이용하는 경우, 세포 배양을 촉진 할 수 있다.

도 1a는 나노패턴의 제작 과정을 나타낸다.
도 1b는 나노패턴과 마이크로 패턴 결합 모식도이다. A) 는 나노필라 생성 후 전도성 하이드로 젤을 마이크로 패턴하고 세포 부착에 대한 것이고 B)는 지형학적 나노패턴과 전기적 자극을 위한 마이크로패턴을 나타낸다.
도 2a는 나노 패턴에 대한 시뮬레이션 결과로써 A) 나노필라의 3차원 모델링 B) 설계 수치에 대한 지시 C) 나노필라의 높이에 따른 변위 D) 반지름에 따른 변위 E) 탄성률에 따른 변위 F) 반지름과 높이의 비율에 따른 변위를 나타낸다.
도 2b는 나노필라의 전자현미경 사진과 접촉각을 분석한 결과로써 A) 나노필라의 전자현미경 사진 B) 표면 처리된 전자현미경 사진 C) 각각의 접촉각 사진 D) 접촉각 분석 그래프를 나타낸다.
도 3은 마이크로 패터닝 소재의 전자 현미경 사진으로써 A) AgNW의 전자현미경 사진 B) rGO의 전자현미경사진 C) PEG의 전자현미경 사진 D) AgNW-PEG-rGO의 전자현미경 사진 E) AgNW-PEG-rGO의 성분 분석한 표를 나타낸다.
도 4는 마이크로 패턴의 시뮬레이션 결과로써 A) 마이크로 패턴의 모델링 및 전류 밀도 B) 근육 세포와 신경 세포에 인가된 전압 및 주파수 (C) 하이드로젤에 첨가된 재료에 따른 전류 밀도 D) 패턴의 간격에 따른 전류 밀도를 나타낸다.
도 5a는 나노 패턴에 따른 근육세포 증식 및 신경세포 분화 공초점 현미경 사진으로써 A) 나노 패턴에 따른 근육세포 증식 사진 B) 나노 패턴에 따른 신경세포 분화 사진을 나타낸다.
도 5b는 마이크패턴과 전기적 자극에 따른 근육세포 증식 및 신경세포 분화 공초점 현미경 사진으로써 A) 마이크패턴과 전기적 자극에 따른 근육세포 증식 사진 B) 마이크패턴과 전기적 자극에 따른 신경세포 분화 사진을 나타낸다.
도 6은 마이크패턴과 전기적 자극에 따른 근육세포 증식 및 신경세포 분화 분석한 결과로써 A) 마이크패턴과 전기적 자극에 따른 근육세포 증식 그래프 B) 마이크패턴과 전기적 자극에 따른 신경세포 분화 그래프를 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 지형학적 요소

1-1. 나노 필라 최적화 설계

나노 패턴 제작에 앞서, 컴퓨터 시뮬레이션을 통하여 나노필라를 구성하는 각종 설계 수치의 변화에 따른 나노필라의 굽힘을 관찰하였다. 필라의 굽힘은 일반적으로 다음과 같은 공식으로 설명된다.

(y는 필라 끝의 변위, x는 필라의 시작점에서부터 해당 지점까지의 거리, M 은 해당 지점에 작용하는 회전 모멘트, E는 young's modulus, I는 필라에 수직한 평면의 면적 관성 모멘트) 또한, 유동에서 필라가 받는 힘은 유체의 점성에 기원한다.

(C_D는 항력계수, A_P는 물체의 단면적)

점성 저항력은 위와 같은 식으로 표현되며, C_D의 값은 레이놀즈 수에 따라 달라진다. 흐르는 유체 내부에서 각 지점마다 유속이 다르고 레이놀즈 수도 다르다. 따라서 유체에 안에서 작용하는 힘들은 선형적으로 표현될 수 없으며, 해당 미분방정식을 풀기에는 어려움이 있다. 본 발명에서는 컴퓨터 시뮬레이션을 이용하여 그 값을 최적화하였다. COMSOL 소프트웨어에 내장된 Geometry 기능을 이용하여 나노필라와 유체의 유동을 구현하였고, Fine Mesh를 설정하였다. 전체 모델은 Laminar flow를 가정하였고 비압축성 유체를 가정하였다. 지형학적 시뮬레이션을 통하여 다음과 같은 결과를 얻을 수 있었다. 1) 나노필라의 반지름이 작을수록 나노필라 끝의 변위가 증가했다. 2) 나노필라의 높이가 높을수록 나노필라 끝의 변위가 증가했다. 3) 나노필라의 탄성률이 작을수록 나노필라 끝의 변위가 증가했다. 시뮬레이션 결과 돌기 형상은 반지름이 250 nm 및 높이가 750 nm 인 원통형의 돌기 형상이 최적의 조건임을 발견하였고, 그 결과를 반영하여 제작된 나노필라를 기판에 패터닝하여 제작하였다.

1-2. 나노 패터닝된 기판의 제조

본 발명에서 전기전도성을 갖는 전도성 하이드로젤 마이크로패터닝 기술과 지형학적 조건을 제어하는 나노패터닝 기술을 융합하여 줄기세포의 분화를 유도하고 촉진하는 기술을 개발하였다. 일반적으로 세포가 성장하는 기판의 지형학적 요소는 세포의 분화와 성장에 영향을 주는 것으로 알려져 있다. 따라서, 지형학적 조건을 제어하기 위하여 본 발명에서는 나노필라 설계를 기반으로 제작된 포토마스크를 제작하고 실리콘 웨이퍼 위에 감광제를 코팅하고 포토마스크를 사용하여 UV에 조사하여 패턴을 형성한 후 실리콘 웨이퍼를 에칭하여 나노홀을 가지는 실리콘 웨이퍼를 제작하였다. 이후 표면에 폴리우레탄 아크릴레이트를 도포한 후 UV를 조사하여 경화시켜 나노필라를 가지는 폴리머 기판을 제작하였다. 친수성을 높이기 위하여 SiO₂를 사용하여 표면을 코팅하였다.

1-3. 패터닝된 하이드로젤의 제조

세포에 가해지는 전기적 자극은 줄기세포의 신경세포 분화와 성장을 촉진하는 것으로 알려져 있으며, 마이크로패턴은 분화 방향에도 영향을 주는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 발명에서는 세포의 성장을 촉진하기 위하여, 하이드로젤을 주성분으로 하는 마이크로패턴을 앞서 기술한 나노패턴 기판 위에 패터닝하였다. 그 과정에서 반도체 제조 공정인 포토리소그래피 기술을 이용하였다. Photoresist가 패턴 된 실리콘 웨이퍼를 이용하여 polydimethylsiloxane(PDMS)으로 마이크로 몰드를 제작하였고, 높은 전기전도성을 획득하기 위해 polyethylene glycol(PEG)에 환원된 산화 그래핀(rGO)과 은 나노와이어(AgNW)를 각각 10:1:1의 비율로 혼합하여 앞서 제작된 PDMS 마이크로 몰드를 사용하여 기판에 패터닝하였다. 1w/v% 광개시제(photoinitiator)인 2-하이드록시-2-메틸 프로피오페논(2-hydroxy-2-methyl propiophenone,Sigma-Aldrich Co., MO, 미국)을 10w/v% PEG-diacrylate(1000 Da)와 혼합한 뒤 은 나노와이어 수용액과 rGO 파우더와 10:1:1 의 비율로 혼합하여 패터닝에 PDMS 마이크로몰드에 주입한다. 제작된 PDMS 마이크로몰드를 사용하여 유연한(flexible) 나노 패턴이 있는 PUNO 필름위에 위에 패터닝하여 디바이스를 제작하였다. 제작방법은 PDMS 마이크로몰드에 인렛(inlet) 및 아웃렛(outlet) 홀을 펀치로 뚫어주고 PDMS와 나노 패턴 필름을 접착시킨 뒤 파이펫을 이용하여 PEG/AgNW/rGO가 혼합된 물질을 인렛 홀에 주입하고 UV를 조사하여 광가교결합(photocrosslink)을 하여 패터닝을 진행하였다. 상기 패터닝된 하이드로젤은 바닥면은 나노패턴이고 벽면은 전도성 물질인 은나노와이어와 rGO가 포함된 하이드로젤로 이루어지게 된다. 이 후 패터닝 된 디바이스 표면에 ECM(extracellular matrix) 기질인 라미닌(laminin)과 폴리-L-오리니틴(poly-L-orinithine; PLO)을 사용하여 줄기세포의 분화를 유도하도록 코팅처리를 진행하였다. 상세하게는, 마이크로피펫을 이용하여 200 ㎖의 PLO 0.1 ㎎/㎖를 패턴 위에 처리한 뒤 37℃ 인큐베이터에 6시간 이상 항온반응 하였다. 세포분화를 유도하기 위해 PLO가 처리된 패턴 위에 0.02 ㎎/㎖ 라미닌을 200 ㎖ 처리하여 37℃ 인큐베이터에 2시간 이상 항온반응 하였다. 또한 마이크로 패턴의 기술 개발 및 특성 평가를 진행하기 위해 100 μm, 300 μm, 500 μm의 간격을 갖는 마이크로 패턴에 대하여 컴퓨터 시뮬레이션을 진행하였다. 각각의 모델에 대하여, 전류 밀도가 거의 같다는 것을 확인하였고, 본 발명에서는 세포의 크기를 고려하여 300 μm의 간격을 채택하였다.

실시예 2: 전기적 요소

나노패턴과 마이크로패턴이 결합된 조건에서 전기적 자극을 위하여 근육세포에는 5 V에 1 Hz의 교류를 인가하였고, 신경 세포에는 10 V에 139 μHz를 인가하여 세포의 생리를 관찰하였다.

배양용 기판에 전압을 인가하기 위하여 DC 서플라이(DC supply)를 이용하여 직류를 발생하고 DC 서플라이(DC supply)를 함수 발생기(function generator)와 연결하여 교류형태로 전압을 인가하였으며, 구리선을 마이크로 패턴에 접촉시켜 세포 배양을 위한 전압을 인가하였다.

실시예 3: 세포의 배양 방법

3-1. 근육세포의 배양

C2C12 세포는 10% 소 태아 혈청 (fetal bovine serum) (Gibco, USA), 1% 페니실린-스트렙토마이신 (Gibco, USA)이 포함된 high-serum DMEM (Gibco, USA) 배양액을 통해 배양된다. C2C12 세포를 마이크로 패턴위에 올리고 하루동안 배양한 다음 2% 소태아 혈청 (fetal bovine serum) (Gibco, USA), 1% 페니실린-스트렙토마이신 (Gibco, USA)이 포함된 low-serum DMEM 배양액으로 교체한다.

3-2. 신경줄기세포의 배양

BFGF 및 EGF를 포함하는 N2 배지(1% 무혈청 N2, 2% B27 보충물 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 포함하는 DMEM/F12)에 신경줄기세포(Pregnant female C57BL/6 mice cerebral cortex from brain at E12 (DAEHAN BIOLINK, 대한민국))를 3일 동안 배양하여 세포가 신경구를 형성하도록 하였다. 3일 동안 세포 배양 디시에서 배양을 하게 되면 신경줄기세포들은 서로 뭉쳐 자연스럽게 신경구 형태를 갖게 된다. 3일 동안 배양했을 경우 신경구의 크기는 약 100 μm - 150 μm이다.

상기 신경구를 패터닝된 하이드로젤 상에 씨딩한다. 6 웰 플레이트에 3일 동안 배양된 신경구들을 파이펫을 이용하여 패터닝된 하이드로젤 상에 씨딩을 한 후 가볍게 플레이트를 흔들어 패턴 사이로 신경구들이 부착될 수 있도록 한다.

실험 결과

C2C12 세포의 부착 증가를 확인하기 위하여, 컨트롤과 SiO₂가 코팅된 나노패턴을 비교하였다. 2 x 10⁶의 C2C12 세포를 나노필라 필름이 있는 6 웰 플레이트에서 7일동안 배양하고 phalloidin을 marker를 통해 확인한 결과, SiO₂가 코팅된 나노패턴 위에서 C2C12 세포의 부착이 확연하게 증가한 것을 확인할 수 있었다 (도 5a의 A). 또한 NSC의 세포 부착을 확인하였다. C2C12와 같은 방법으로 7일동안 SiO₂가 코팅된 나노패턴 위에서 세포를 배양하고 Tuj1 항체(Stem cell technology, CANADA)와 Nestin 항체(abcam, UK)로 확인한 결과, 부유해서 자라는 신경구(neurosphere) 형태의 신경줄기세포가 뭉치지 않고 부착되어 신경돌기(neurite)를 형성하는 것을 확인하였다 (도 5a의 B). 이를 통해 본 발명의 나노필라가 세포의 부착을 증가시켜 분화를 촉진할 수 있다는 것을 확인하였다.

나노필라가 세포의 부착을 증가시킨 다는 것을 확인하고 세포의 분화를 촉진하기 위하여 세포를 마이크로/나노패턴 위에서 배양하고 전기자극이 있을 때와 없을 때를 비교하였다. 도 5b의 C2C12세포의 경우 세포를 염색하고 공초점 현미경으로 관찰한 결과 마이크로나노패턴 위에서 세포가 근육다발을 형성한 것을 확인할 수 있었다 (도 5b의 A). 신경줄기세포의 경우에는 대조군에 비하여 신경줄기세포 마커인 Tuj1의 발현이 증가하였으며, 신경돌기가 많이 형성된 것을 확인하여 신경세포로의 분화가 증가한 것을 확인하였다 (도 5b의 B)

	공간 대비 근육 세포 (도 5b의 A)		신경세포 신경돌기 길이 (도 5b의 B)
도 6	대조군	전기 자극	대조군	전기 자극
	40.24%	80.54%	54.69㎛	486.12㎛

Claims (18)

1. 마이크로 패턴과 나노 패턴이 함께 형성된 세포 배양용 기판.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 나노 패턴은 동일한 간격으로 형성된 복수의 돌기 형상인, 세포 배양용 기판.
   
3. 제 1 항에 있어서, 상기 나노 패턴은 표면이 친수성 물질로 코팅된 것인, 세포 배양용 기판.
   
4. 제 3 항에 있어서, 상기 친수성 물질은 금, 은, 티타늄 옥사이드, 크롬 옥사이드, 구리 옥사이드, 알루미늄 옥사이드 및 이산화 규소로 이루어진 군에서 선택되는 물질인 것인, 세포 배양용 기판.
   
5. 제 1 항에 있어서, 상기 나노 패턴은 UV 경화형 수지에 의해 형성되는 것인, 세포 배양용 기판.
   
6. 제 5 항에 있어서, 상기 UV 경화형 수지는 폴리우레탄, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리카보네이트, 폴리우레탄 아크릴레이트, 실리콘 및 폴리다이메틸실록세인로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질로 구성되는 고분자인 것인, 세포 배양용 기판.
   
7. 제 1 항에 있어서, 상기 마이크로 패턴은 전도성 하이드로젤에 의해 형성되는 것인, 세포 배양용 기판.
   
8. 제 7 항에 있어서, 상기 전도성 하이드로젤은 (i) 생체적합성 고분자 및 (ii) 환원된 산화 그래핀 및 금속 나노와이어 중 어느 하나 이상을 포함하는 것인, 세포 배양용 기판.
   
9. 제 7 항에 있어서, 상기 마이크로 패턴은 기판에 형성된 나노패턴 상부에 형성되는 것인, 세포 배양용 기판.
   
10. 제 9 항에 있어서, 상기 마이크로 패턴은 일 방향으로 연장되는 복수 개의 선형 구조를 포함하며, 상기 복수 개의 선형 구조는 소정의 간격을 사이에 두고 서로 이격되도록 기판상에 배치되는 것인, 세포 배양용 기판.
    
11. 제 10 항에 있어서, 상기 소정의 간격은 100 μm 내지 500 μm 인, 세포 배양용 기판.
    
12. 제 1 항에 있어서, 상기 세포 배양용 기판은 전압이 인가(apply)되는 것인, 세포 배양용 기판.
    
13. 제 12 항에 있어서, 상기 전압은 5 V 내지 10 V로 인가 되는 것인, 세포 배양용 기판.
    
14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 배양용 기판은 ECM(extracellular matrix) 기질로 코팅된 것인, 세포 배양용 기판.
    
15. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항의 세포 배양용 기판에 세포를 배양하는 단계를 포함하는 세포 배양 방법.
    
16. 제 15 항에 있어서, 상기 세포를 배양하는 단계는 상기 세포 배양용 기판에 전압을 인가하여 세포를 배양하는 것인, 세포 배양 방법.
    
17. 제 16 항에 있어서, 상기 전압의 인가는 마이크로 패턴이 배열된 방향에 수직방향으로 인가되는 것인, 세포 배양 방법.
    
18. 제 16 항에 있어서, 상기 전압은 5 V 내지 10 V 로 인가 되는 것인, 세포 배양 방법.
    

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