KR20200132253A - Chitosan-carbon nanotube core-shell nanohybrid based electrochemical glucose sensor - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 키토산-다중벽 탄소나노튜브 글루코즈 측정을 위한 바이오센서의 제조방법, 키토산-다중벽 탄소나노튜브를 포함하는 나노하이브리드, 및 이를 포함하는 글루코즈 측정을 위한 바이오센서에 관한 것이다.The present invention relates to a method for manufacturing a biosensor for measuring chitosan-multi-walled carbon nanotube glucose, a nanohybrid including chitosan-multi-walled carbon nanotubes, and a biosensor for measuring glucose comprising the same.
전도성 고분자에 항원, 항체, 효소 또는 약리적 작용을 갖는 단백질을 접합시킬 경우 이들 단백질의 기능을 감시하거나, 기능상태의 전기적인 조절이 가능하므로 생체감응기구(Biosensor)에 전도성 고분자와 단백질 복합체가 이용되고 있다.When conjugating antigens, antibodies, enzymes, or proteins with pharmacological action to a conductive polymer, the function of these proteins can be monitored or electrical control of the functional state is possible, so a conductive polymer and a protein complex are used in a biosensor. have.
글루코즈 (Glucose)는 대부분 유기체의 광범위한 영양 공급원이며 에너지 공급, 탄소 저장, 생합성 및 탄소 골격 및 세포벽 형성의 기초적인 역할을 수행한다. 지금까지 연구 및 개발된 생체감응기구 중 당뇨병 환자의 혈중 글루코즈 농도를 측정하는데 쓰이는 글루코즈 측정을 위한 센서는 글루코즈 효소 전극[Analyst, 117, 1657(1992)]이 제안된 이래로 많은 연구 및 개발이 진행되어 왔다.Glucose is a broad source of nutrients for most organisms and plays a fundamental role in energy supply, carbon storage, biosynthesis, and formation of the carbon skeleton and cell walls. Among the biosensitizing devices researched and developed so far, the glucose sensor used to measure the blood glucose concentration of diabetic patients is a glucose enzyme electrode [Analyst, 117, 1657 (1992)]. come.
글루코즈 옥시다제(β-D-Glucose: oxygen oxidoreductase, EC 1.1.3.4)는 2분자의 플라빈(Flavin)을 함유하는 볼모양의 당단백으로서 베타-디-글루코즈를 산소와 반응시켜 글루코즈-델타-락톤(Glucono-δ-lactone)으로 산화시키는 촉매효소이다.Glucose oxidase (β-D-Glucose: oxygen oxidoreductase, EC 1.1.3.4) is a ball-shaped glycoprotein containing two molecules of flavin, and is a glucose-delta-lactone by reacting beta-di-glucose with oxygen. It is a catalytic enzyme that oxidizes to (Glucono-δ-lactone).
글루코즈 검출에 글루코즈 옥시다제를 이용하는 전기화학적 방법들이 개발되어왔는데, 1세대 글루코즈 측정을 위한 센서는 글루코즈 옥시다제 (GOx)가 글루코즈의 선택적 산화를 일으켜, 산소를 환원시켜 수소를 생성하는 전자를 생성한다. 그러나, 이는 전기-활성 간섭 물질의 존재에 민감하고 촉매 매개체로서 자유 산소에 의존하는 단점을 가지고 있다. 이를 극복하기 위해, 2세대 글루코즈 측정을 위한 센서가 개발되었으나, 여전히 과산화수소 처리 문제가 남아 있고, 매개체의 전극으로의 합성 및 변형이 어렵다는 단점이 있었다. 뿐만 아니라 산화 환원 전압이 높기 때문에 아스코르빈산과 요산과 같은 간섭을 피하는 것이 어렵다. 이러한 단점을 극복하기 위해 3세대 센서가 개발되었다. 3세대 센서는 직접 전자 전달 (DET) 반응을 기반으로, 전자가 글루코즈로부터 매개체 또는 화학 반응없이 직접 전극으로 전달된다. 이렇게 효소를 생체 적합성 물질에 고정하여 전자 전달력을 높이기 위한 다양한 기능화 방법들이 개발되고 있다.Electrochemical methods using glucose oxidase for glucose detection have been developed. In the first-generation sensor for glucose measurement, glucose oxidase (GOx) causes selective oxidation of glucose, reducing oxygen to generate electrons that generate hydrogen. . However, it is sensitive to the presence of electro-active interfering substances and has the disadvantage of relying on free oxygen as a catalyst medium. In order to overcome this, a sensor for measuring the second-generation glucose has been developed, but there is a disadvantage in that the problem of hydrogen peroxide treatment still remains, and it is difficult to synthesize and transform a medium into an electrode. In addition, the high redox voltage makes it difficult to avoid interference such as ascorbic acid and uric acid. To overcome these shortcomings, a third-generation sensor was developed. The third generation sensor is based on a direct electron transfer (DET) reaction, where electrons are transferred directly from glucose to the electrode without mediators or chemical reactions. In this way, various functionalization methods have been developed to increase electron transfer power by immobilizing enzymes on biocompatible materials.
탄소나노튜브(Carbon nanotube: CNT)는 탄소끼리 육각형으로 결합하여 원통형 튜브구조를 이룬 탄소 동소체의 일종으로, 직경이 수 ㎚ 정도의 작은 튜브모양을 하고 있어 나노튜브로 지칭된다. 이러한 탄소나노튜브는 속이 비어 있어 가볍고, 동일한 굵기의 강철 대비 최대 100배 이상의 인장강도 및 손상 없이 90°까지 휘는 물성으로 인해 신소재로 주목받고 있다. 또한, 높은 열전도성 및 전기전도성을 가지며, 탄소층이 감겨 있는 각도에 따라 도체와 반도체의 성격을 나타낸다. 또한, 탄소나노튜브는 벽의 개수에 따라 단일벽 탄소나노튜브(single walled carbon nanotube: SWNT), 다중벽 탄소나노튜브(multi-walled carbon nanotube: MWNT)로 구분되기도 한다. 최근, 탄소나노튜브(이하, CNT라고도 줄임)는 나노테크놀로지의 유력한 소재로서, 광범위한 분야에서 응용의 가능성이 검토되고 있다.Carbon nanotube (CNT) is a type of carbon allotrope in which carbons are bonded in a hexagonal shape to form a cylindrical tube structure, and is referred to as a nanotube because it has the shape of a tube as small as several nm in diameter. These carbon nanotubes are light because they are hollow, and are attracting attention as a new material because of their tensile strength up to 100 times higher than that of steel of the same thickness, and their properties that bend up to 90° without damage. In addition, it has high thermal conductivity and electrical conductivity, and shows the characteristics of conductors and semiconductors depending on the angle at which the carbon layer is wound. In addition, carbon nanotubes are also classified into single walled carbon nanotubes (SWNT) and multi-walled carbon nanotubes (MWNTs) according to the number of walls. Recently, carbon nanotubes (hereinafter, also abbreviated as CNTs) are a powerful material for nanotechnology, and the possibility of application in a wide range of fields is being studied.
최근, 탄소나노튜브(carbon nonotube: CNT)는 높은 전기전도율(electrical conductivity), 공동 형태(hollow geometry), 강한 흡착력(adsorptive ability), 좋은 기계적 강도 및 우수한 생체접합성으로 인하여 상당한 흥미를 끌었다. CNT 기반 개질된 전극은 도파민(Britto, P.J. et al., 1996. Bioelectrochem. Bioener. 41, 121- 125), 단백질(Chen, R.J. et al., 2001. J. Am. Chem. Soc. 123, 3838-3839), β-NAD (β-nicotinamide adenine dinucleotide) (Musameh, M. et al., 2002. Electochem. Commun. 4, 743-746), 글루코즈 (Wang, S. G. et al., 2003. Electrochem. Commun. 5, 800-803)등과 같은 생체분자의 산화를 위한 우수한 전자 전달반응을 나타내었다. 최근, CNT는 바이오센서의 제조에 효과적으로 사용되고 있다 (Manesh, K.M. et al., 2008. Biosens. Bioelectron. 23, 771-779; Elie, A.G. et al., 2002. Nanotechnology 13, 559-564; Shobha et al., 2008; Deng, C. et al., 2008. Biosens. Bioelectronics, 23, 1272-1277; Zou, Y. et al., 2008. Biosens. Bioelectron. 23, 1010-1016).Recently, carbon nanotubes (CNT) have attracted considerable interest due to their high electrical conductivity, hollow geometry, strong adsorptive ability, good mechanical strength, and excellent biocompatibility. CNT-based modified electrodes are dopamine (Britto, PJ et al., 1996. Bioelectrochem. Bioener. 41, 121-125), protein (Chen, RJ et al., 2001. J. Am. Chem. Soc. 123, 3838) -3839), β-NAD (β-nicotinamide adenine dinucleotide) (Musameh, M. et al., 2002. Electochem. Commun. 4, 743-746), glucose (Wang, SG et al., 2003. Electrochem. Commun. 5, 800-803) showed excellent electron transfer reactions for oxidation of biomolecules. Recently, CNTs have been effectively used in the manufacture of biosensors (Manesh, KM et al., 2008. Biosens. Bioelectron. 23, 771-779; Elie, AG et al., 2002. Nanotechnology 13, 559-564; Shobha et al.; al., 2008; Deng, C. et al., 2008. Biosens. Bioelectronics, 23, 1272-1277; Zou, Y. et al., 2008. Biosens. Bioelectron. 23, 1010-1016).
키토산은 생체적합적이고, 생분해가능한 비독성의 천연 생체폴리머이다. 지구상에 두 번째로 풍부한 천연 폴리머인 키틴으로부터 얻어지며, 선형이고 부분적 아세틸화된 (1- 4)-2-amino-2-deoxy-β-D-glucan 중합체이다. 그동안 분리막, 인공피부, 뼈 대체물, 수처리와 같은 다양한 분야에서 사용하기 위한 연구가 있어왔다. 키토산은 우수한 필름 형성능, 높은 물 투과성, 우수한 접착 및 화학적 개질에 대한 민감성을 가지고 있으며 효소 고정을 위한 편리한 폴리메릭 스카폴드(polymeric scaffold)를 제공한다. 키토산은 바이오센서와 바이오촉매의 고정화 매트릭스로 성공적으로 사용된다(Huang, H. et al., 2002. Anal.Biochem. 308, 141-151; Guerente, L.C. et al., 2005. Electrochem.Acta 50, 2865-2877). 그러나, 키토산은 낮은 전도성 때문에 전기화학적 바이오센서를 제조하기 위하는 데에 많은 어려움이 존재하였다.Chitosan is a biocompatible, biodegradable, non-toxic natural biopolymer. It is obtained from chitin, the second most abundant natural polymer on Earth, and is a linear, partially acetylated (1- 4)-2-amino-2-deoxy-β-D-glucan polymer. There have been studies for use in various fields such as separation membranes, artificial skin, bone substitutes, and water treatment. Chitosan has excellent film forming ability, high water permeability, excellent adhesion and sensitivity to chemical modification, and provides a convenient polymeric scaffold for enzyme fixation. Chitosan is successfully used as an immobilization matrix for biosensors and biocatalysts (Huang, H. et al., 2002. Anal. Biochem. 308, 141-151; Guerente, LC et al., 2005. Electrochem. Acta 50, and 2865-2877). However, since chitosan has low conductivity, there are many difficulties in manufacturing an electrochemical biosensor.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 글루코즈 측정을 위한 바이오센서의 재료로서 높은 전기 전도성과 친수성 표면을 가지는 키토산 코팅 다중벽 탄소나노튜브 나노하이브리드 섬유를 제조하고, 이를 기초로 매우 빠른 전자-전달 속도를 가지는 글루코즈 측정을 위한 바이오센서를 완성하였다.Under this background, the present inventors have prepared chitosan-coated multi-walled carbon nanotube nanohybrid fibers having a high electrical conductivity and hydrophilic surface as a material for a biosensor for glucose measurement, and based on this, glucose having a very fast electron-transfer rate. A biosensor for measurement was completed.
본 발명의 목적은 키토산-다중벽 탄소나노튜브 나노하이브리드가 활성제로 글루코즈 옥시다제와 결합된 글루코즈 측정을 위한 바이오센서의 제조방법을 제공하는 것이다.An object of the present invention is to provide a method of manufacturing a biosensor for measuring glucose in which a chitosan-multi-walled carbon nanotube nanohybrid is combined with glucose oxidase as an active agent.
본 발명의 목적은 상기 제조방법에 따른 글루코즈 측정을 위한 바이오센서를 제공하는 것이다.An object of the present invention is to provide a biosensor for glucose measurement according to the above manufacturing method.
본 발명의 목적은 직경이 20 내지 30 nm이고 길이가 10 내지 30 μm인 다중벽 탄소나노튜브 및 탈아세틸화도가 75 내지 85%이고 분자량이 5만 내지 19만 달톤인 키토산을 포함하며, 키토산이 다중벽 탄소나노튜브를 감싸고 있는 형태인 키토산-다중벽 탄소나노튜브 나노하이브리드; 및 글루코즈 옥시다제를 포함하는 전극을 포함하는 글루코즈 측정을 위한 바이오센서를 제공하며, 여기서 키토산-다중벽 탄소나노튜브 나노하이브리드는 활성제를 통해 글루코즈 옥시다제와 결합된 것이다.An object of the present invention is to include multi-walled carbon nanotubes having a diameter of 20 to 30 nm and a length of 10 to 30 μm and chitosan having a deacetylation degree of 75 to 85% and a molecular weight of 50,000 to 190,000 Daltons, and the chitosan is Chitosan-multi-walled carbon nanotube nanohybrids surrounding the multi-walled carbon nanotubes; And it provides a biosensor for glucose measurement comprising an electrode comprising a glucose oxidase, wherein the chitosan-multi-walled carbon nanotube nanohybrid is bound to glucose oxidase through an activator.
본 발명은 (a) 키토산을 산성 용액에 용해하여 키토산 용액을 제조하는 단계;The present invention comprises the steps of (a) dissolving chitosan in an acidic solution to prepare a chitosan solution;
(b) 다중벽 탄소나노튜브를 상기 키토산 용액에 균질화시키는 단계;(b) homogenizing the multi-walled carbon nanotubes in the chitosan solution;
(c) 상기 (b)에서 제조된 산성 키토산-다중벽 탄소나노튜브 용액을 중화하고 투석하여 키토산-다중벽 탄소나노튜브 용액을 제조하는 단계;(c) neutralizing the acidic chitosan-multi-walled carbon nanotube solution prepared in (b) and dialysis to prepare a chitosan-multi-walled carbon nanotube solution;
(d) 상기 (c)에서 제조된 키토산-다중벽 탄소나노튜브 용액을 전극에 캐스팅하고 건조시켜 키토산-다중벽 탄소나노튜브 나노하이브리드를 전극에 고정시키는 단계;(d) casting the chitosan-multi-walled carbon nanotube solution prepared in (c) on an electrode and drying the chitosan-multi-walled carbon nanotube nanohybrid to the electrode;
(e) 상기 (d)에서 제조된 전극에 활성제를 첨가하여 글루코즈 옥시다제의 표면을 활성화시키는 단계; 및(e) adding an activator to the electrode prepared in (d) to activate the surface of glucose oxidase; And
(f) 상기 (e)에서 활성화된 글루코즈 옥시다제를 전극의 표면에 캐스팅하는 단계;(f) casting the glucose oxidase activated in (e) on the surface of the electrode;
를 포함하는 글루코즈 측정을 위한 바이오센서 제조방법을 제공한다.It provides a biosensor manufacturing method for measuring glucose comprising a.
본 발명에 따른 글루코즈 측정을 위한 바이오센서는 기존의 직접-전자-전달 방식 (DET: Direct-Electorn-Transfer)을 이용하는 제3세대 바이오센서들이 효소의 산환환원센터와 전극 간의 저항이 높아 낮은 전자 전달 효율을 가지는 것과 대비하여 빠른 전자-전달 속도를 가지는 점에서 우수한 장점을 가진다.In the biosensor for glucose measurement according to the present invention, the third generation biosensors using the conventional direct-electron-transfer method (DET) have low electron transfer due to high resistance between the redox center of the enzyme and the electrode. Compared to having efficiency, it has an excellent advantage in that it has a fast electron-transfer speed.
또한, 본 발명에 따른 글루코즈 측정을 위한 바이오센서는 간섭 및 산소 포화에 관계없이 사용할 수 있다는 점에서 우수한 장점을 가진다.In addition, the biosensor for glucose measurement according to the present invention has an excellent advantage in that it can be used regardless of interference and oxygen saturation.
본 발명에 따른 글루코즈 측정을 위한 바이오센서 제조방법은 (a) 키토산을 산성 용액에 용해하여 키토산 용액을 제조하는 단계를 포함한다.The method for manufacturing a biosensor for glucose measurement according to the present invention includes the step of (a) dissolving chitosan in an acidic solution to prepare a chitosan solution.
본 발명에서 용어 키토산 (CS)은 키틴을 탈아세틸화한 고분자 화합물을 지칭한다. 바람직하게 본 발명에 따른 키토산은 탈아세틸화도가 75 내지 85%이고, 분자량이 5만 내지 19만 달톤일 수 있으나, 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 범위 내라면 이에 제한되지 않는다. 이러한 키토산은 상업적으로 판매되는 것을 구매하여 사용할 수도 있고 직접 제조하여 사용할 수도 있다.In the present invention, the term chitosan (CS) refers to a polymer compound obtained by deacetylating chitin. Preferably, chitosan according to the present invention has a degree of deacetylation of 75 to 85%, and a molecular weight of 50,000 to 190,000 Daltons, but is not limited thereto as long as it is within the range capable of achieving the object of the present invention. Such chitosan may be purchased and used commercially, or may be prepared and used directly.
본 발명에서 산성 용액은 아세트산 수용액, 포름산 수용액, TFA (trifluoracetic acid), 염산, 황산, 인산, 질산, 및 빙초산으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 바람직하게는 빙초산이다. 본 발명에서 키토산을 산성 용액에 용해함으로써 키토산 용액을 제공한다.In the present invention, the acidic solution may be any one or more selected from the group consisting of an aqueous acetic acid solution, an aqueous formic acid solution, trifluoracetic acid (TFA), hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, nitric acid, and glacial acetic acid. It is preferably glacial acetic acid. In the present invention, a chitosan solution is provided by dissolving chitosan in an acidic solution.
본 발명에 따른 글루코즈 측정을 위한 바이오센서 제조방법은 (b) 다중벽 탄소나노튜브를 상기 키토산 용액에 균질화시키는 단계를 포함한다.The method of manufacturing a biosensor for glucose measurement according to the present invention includes the step of (b) homogenizing the multi-walled carbon nanotubes in the chitosan solution.
본 발명에서 용어 탄소나노튜브는 탄소 동소체로서 하나의 탄소가 다른 탄소 원자와 육각형 벌집무늬로 결합되어 튜브형태를 이루고 있는 물질이며, 튜브의 직경이 나노미터 수준으로 극히 작은 영역의 탄소 동소체를 의미한다.In the present invention, the term carbon nanotube is a carbon allotrope, a material in which one carbon is bonded to another carbon atom in a hexagonal honeycomb pattern to form a tube, and refers to a carbon allotrope with a very small area at the level of nanometers in diameter of the tube. .
또한, 본 발명에서 용어 다중벽 탄소나노튜브 (MWCNT)는 상기 탄소나노튜브를 구성하는 튜브가 2개 이상의 벽으로 구성되어 있는 탄소 동소체를 의미한다. 바람직하게 본 발명에 따른 다중벽 탄소나노튜브는 다중벽 탄소나노튜브는 직경이 20 내지 30 nm이고, 길이가 10 내지 30 μm의 특징을 가지는 것이다.In addition, in the present invention, the term multi-walled carbon nanotube (MWCNT) refers to a carbon allotrope in which a tube constituting the carbon nanotube is composed of two or more walls. Preferably, the multi-walled carbon nanotube according to the present invention is characterized by a diameter of 20 to 30 nm and a length of 10 to 30 μm.
본 발명에서 키토산-다중벽 탄소나노튜브 나노하이브리드는 총 중량을 기준으로 탄소나노튜브를 80 내지 90 중량%로 포함하는 것이 바람직하다. 탄소나노튜브 함량이 이보다 많을 경우 글루코즈 옥시다제와 탄소나노튜브 사이의 전자 전달이 일어나기 충분하지 않을 수 있으며, 이보다 적을 경우 많은 양의 키토산이 탄소나노튜브와 글루코즈 옥시다제 사이의 전자 전달을 방해할 수 있다. 본 발명에 따른 키토산-다중벽 탄소나노튜브는 키토산이 다중벽 탄소나노튜브를 감싸는 형태로, 즉, 다중벽 탄소나노튜브가 코어로 키토산이 이를 감싸는 쉘로 이루어질 수 있다. 이러한 키토산-다중벽 탄소나노튜브 나노하이브리드는 직경이 22 nm 내지 35 nm이다. 쉘 층의 키토산이 코어 층의 다중벽 탄소나노튜브를 매우 고르고 일정하게 감싸주고 있는 형태로, 쉘 층의 키토산으로 인해 여러 재료들에 손쉽고 간편하게 코팅할 수 있으며 매우 우수한 물성을 갖는다. 또한 수많은 나노포어 (nanopore)들과 마이크로포어 (micropore)들로 인해 매우 높은 표면적을 갖는다.In the present invention, the chitosan-multi-walled carbon nanotube nanohybrid preferably contains 80 to 90% by weight of carbon nanotubes based on the total weight. If the content of carbon nanotubes is higher than this, electron transfer between glucose oxidase and carbon nanotubes may not be sufficient, and if it is less than this, a large amount of chitosan may interfere with electron transfer between carbon nanotubes and glucose oxidase. have. Chitosan-multi-walled carbon nanotubes according to the present invention may be formed in a form in which chitosan surrounds the multi-walled carbon nanotubes, that is, the multi-walled carbon nanotubes are a core and chitosan surrounds the shell. This chitosan-multi-walled carbon nanotube nanohybrid has a diameter of 22 nm to 35 nm. The chitosan of the shell layer covers the multi-walled carbon nanotubes of the core layer very evenly and uniformly. Due to the chitosan of the shell layer, it can be easily and conveniently coated on various materials and has very excellent physical properties. It also has a very high surface area due to numerous nanopores and micropores.
본 발명에서 다중벽 탄소나노튜브를 키토산 용액에 균질화시키는 것은 기계적 교반, 또는 초음파 처리 등을 수행하는 것이며, 이는 당업계에 알려진 장치를 이용하여 종래의 방법에 따라 수행될 수 있다. 바람직하게는 호모지나이저를 이용하여 균질화한다. 본 발명에서 다중벽 탄소나노튜브를 키토산 용액에 균질화시킴으로써 키토산-다중벽 탄소나노튜브 용액을 제공한다.In the present invention, homogenizing the multi-walled carbon nanotubes in the chitosan solution is to perform mechanical stirring or ultrasonic treatment, and this may be performed according to a conventional method using an apparatus known in the art. It is preferably homogenized using a homogenizer. In the present invention, a chitosan-multi-walled carbon nanotube solution is provided by homogenizing the multi-walled carbon nanotubes in a chitosan solution.
본 발명에 따른 글루코즈 측정을 위한 바이오센서 제조방법은 (c) 상기 (b)에서 제조된 산성 키토산-다중벽 탄소나노튜브 용액을 중화하고 투석하여 키토산-다중벽 탄소나노튜브 용액을 제조하는 단계를 포함한다.The method for manufacturing a biosensor for glucose measurement according to the present invention comprises the steps of (c) neutralizing the acidic chitosan-multi-walled carbon nanotube solution prepared in (b) and dialysis to prepare a chitosan-multi-walled carbon nanotube solution. Include.
본 발명에서 상기 (c) 단계에서의 중화는, 염기성 용액, 바람직하게는, 암모니아 용액, 수산화나트륨 용액, 수산화칼륨 및 수산화칼슘으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 용액을 처리하여 중화하는 것일 수 있다. 바람직하게는 암모니아 용액을 처리하여 중화하는 것일 수 있다.In the present invention, the neutralization in step (c) may be neutralization by treatment with at least one solution selected from the group consisting of a basic solution, preferably, ammonia solution, sodium hydroxide solution, potassium hydroxide and calcium hydroxide. Preferably, it may be neutralized by treating an ammonia solution.
본 발명에서 투석은 10,000 내지 15,000 Da의 분자량, 바람직하게는 12,000 내지 14,000 Da의 분자량을 기준으로 수행할 수 있다.Dialysis in the present invention may be performed based on a molecular weight of 10,000 to 15,000 Da, preferably 12,000 to 14,000 Da.
본 발명에서 산성 키토산-다중벽 탄소나노튜브 용액을 중화하고 투석하여 중화되고 일정 분자량 범위 내 키토산-다중벽탄소나노튜브를 포함하는 용액을 제공한다.In the present invention, an acidic chitosan-multi-walled carbon nanotube solution is neutralized and dialyzed to provide a solution containing chitosan-multi-walled carbon nanotubes within a certain molecular weight range.
본 발명에 따른 글루코즈 측정을 위한 바이오센서 제조방법은 (d) 상기 (c)에서 제조된 키토산-다중벽 탄소나노튜브 용액을 전극에 캐스팅하고 건조시켜 키토산-다중벽 탄소나노튜브 나노하이브리드를 전극에 고정시키는 단계를 포함한다.The method of manufacturing a biosensor for glucose measurement according to the present invention includes (d) casting the chitosan-multi-walled carbon nanotube solution prepared in (c) on an electrode and drying the chitosan-multi-walled carbon nanotube nanohybrid to the electrode. It includes the step of fixing.
본 발명에서 전극은 상기 키토산-다중벽 탄소나노튜브 나노하이브리드가 코팅될 수 있는 모든 전극을 포함한다. 상기 전극은 바람직하게는 철, 금, 은, 동, 백금, 티타늄, 알루미늄, 팔라듐, 및 인듐 주석 산화물로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하며, 특히 인듐 주석 산화물인 것이 바람직하다.In the present invention, the electrode includes all electrodes to which the chitosan-multi-walled carbon nanotube nanohybrid can be coated. The electrode is preferably selected from the group consisting of iron, gold, silver, copper, platinum, titanium, aluminum, palladium, and indium tin oxide, and particularly preferably indium tin oxide.
본 발명에서 상기 (d) 단계 이전에 전극을 피라냐 용액에 1분 내지 10분간 담그고, 10분 내지 30분간 초음파처리하여 건조시키는 단계가 더 포함될 수 있다. 바람직하게는 5분간 담그고, 20분간 증류수에서 초음파처리하는 것일 수 있다. 이와 같은 공정을 통하여 전극으로 사용되는 금속, 예컨대 인듐 주석 산화물 (ITO) 전극을 세척할 수 있다.In the present invention, before step (d), the electrode is immersed in a piranha solution for 1 minute to 10 minutes, and ultrasonic treatment for 10 minutes to 30 minutes to dry it may be further included. Preferably, it may be soaked for 5 minutes and sonicated in distilled water for 20 minutes. Through such a process, a metal used as an electrode, such as an indium tin oxide (ITO) electrode, may be cleaned.
상기 (d) 단계에서 캐스팅은 통상의 키토산-다중벽 탄소나노튜브 용액의 금속 입자에 고정화 방법에 따른 것으로, 캐스팅 후 건조함으로써 금속 입자를 코팅할 수 있다. In the step (d), the casting is performed according to a method of immobilizing the metal particles in a conventional chitosan-multi-walled carbon nanotube solution, and the metal particles may be coated by drying after casting.
또한, 전극 위에 키토산-다중벽 탄소나노튜브 용액을 캐스팅하고 건조하여 전극 위에 키토산-다중벽 탄소나노튜브의 멤브레인을 형성할 수도 있다.In addition, a chitosan-multi-walled carbon nanotube solution may be cast on the electrode and dried to form a chitosan-multi-walled carbon nanotube membrane on the electrode.
본 발명에 따른 글루코즈 측정을 위한 바이오센서 제조방법은 (e) 상기 (d)에서 제조된 전극에 활성제를 첨가하여 글루코즈 옥시다제의 표면을 활성화시키는 단계를 포함한다.The method of manufacturing a biosensor for glucose measurement according to the present invention includes the step of (e) activating the surface of glucose oxidase by adding an activator to the electrode prepared in (d).
본 발명에서 상기 (e) 단계에서의 활성제는 EDC-NHS 또는 DCC 일 수 있다. 바람직하게는 EDC-NHS이다. 본 발명에서 EDC-NHS 용액을 첨가하여 글루코즈 옥시다제의 카르복실기를 활성화시켜 키토산 층의 아민기에 효소가 부착할 수 있는 기반을 제공한다.In the present invention, the active agent in step (e) may be EDC-NHS or DCC. It is preferably EDC-NHS. In the present invention, the EDC-NHS solution is added to activate the carboxyl group of glucose oxidase to provide a basis for the enzyme to attach to the amine group of the chitosan layer.
본 발명에 따른 글루코즈 측정을 위한 바이오센서 제조방법은 (f) 상기 (e)에서 활성화된 글루코즈 옥시다제를 전극의 표면에 캐스팅하는 단계를 포함한다.The method of manufacturing a biosensor for measuring glucose according to the present invention includes the step of (f) casting the activated glucose oxidase in (e) onto the surface of an electrode.
본 발명에서 용어 글루코즈 옥시다제는 2분자의 플라빈(Flavin)을 함유하는 볼모양의 당단백으로서 베타-디-글루코즈를 산소와 반응시켜 글루코즈-델타-락톤(Glucono-δ-lactone)으로 산화시키는 촉매효소를 의미한다. 글루코즈 옥시다제는 다수의 곰팡이로부터 분리 정제할 수 있는데 페니킬리움 노타툼, 아스퍼질러스 나이거 등으로부터 분리 정제할 수 있다. 이러한 글루코즈 옥시다제는 상업적으로 판매되는 것을 구매하여 사용할 수도 있고 곰팡이 등으로부터 정제하여 사용할 수도 있다.In the present invention, the term glucose oxidase is a ball-shaped glycoprotein containing two molecules of flavin, and is a catalyst that reacts beta-di-glucose with oxygen to oxidize to glucose-delta-lactone (Glucono-δ-lactone). Means enzyme. Glucose oxidase can be isolated and purified from a number of fungi, and it can be separated and purified from Penicillium notatum, Aspergillus Niger, and the like. Such glucose oxidase may be purchased and used commercially, or may be purified from mold and the like.
본 발명에서 글루코즈 옥시다제의 농도는 10.0 mgmL-1 내지 80.0 mgmL-1인 것이 바람직하다. 글루코즈 옥시다제의 농도가 이보다 작을 경우, 글루코즈 옥시다제와 탄소나노튜브 사이의 전자 전달이 일어나기 충분하지 않을 수 있으며, 이보다 많을 경우 글루코즈 옥시다제 자체는 전자 전달을 방해하는 성질을 가지고 있어 탄소나노튜브와 글루코즈 옥시다제 사이의 전자 전달이 방해될 수 있다. 본 발명의 글루코즈 옥시다제의 카복실기는 활성제로 인해 활성화되어 키토산 층의 아민기와 결합하여 고정되는 형태일 수 있다.In the present invention, the concentration of glucose oxidase is preferably 10.0 mgmL -1 to 80.0 mgmL -1 . If the concentration of glucose oxidase is lower than this, electron transfer between glucose oxidase and carbon nanotubes may not be sufficient. If the concentration of glucose oxidase is higher than this, glucose oxidase itself has a property of interfering with electron transfer. The transfer of electrons between glucose oxidase can be disturbed. The carboxyl group of the glucose oxidase of the present invention may be activated due to an activator and bonded to the amine group of the chitosan layer to be fixed.
본 발명은 상기 방법에 의하여 제조된 글루코즈 측정을 위한 바이오센서를 제공한다.The present invention provides a biosensor for measuring glucose prepared by the above method.
본 발명에서 글루코즈 측정을 위한 바이오센서는 바람직하게는 직접 전자 전달 (direct electron transfer, DET) 반응을 기반으로 글루코즈를 검출하는 글루코즈 측정을 위한 바이오센서다. 예컨대, 글루코즈 옥시다제는 글루코즈와 접촉하여 산화 환원 반응을 일으키고, 이 산화환원센터와 본 발명의 전극이 매개채없이 직접적으로 전자를 주고받아 전자의 이동과 전류를 감지하여 글루코즈 농도를 측정할 수 있다.In the present invention, the biosensor for glucose measurement is preferably a biosensor for glucose measurement that detects glucose based on a direct electron transfer (DET) reaction. For example, glucose oxidase causes a redox reaction by contacting glucose, and the redox center and the electrode of the present invention directly exchange electrons without intermediary to detect the movement and current of electrons to measure the glucose concentration. .
본 발명에 따른 DET 글루코즈 측정을 위한 바이오센서는 키토산-다중벽 탄소나노튜브 하이브리드에 자체적으로 전자전달이 원활하며 안정적이어서 매개자나 화학 반응 없이 효소부착만으로도 전자가 전달될 수 있기 때문에 안정성이 높다. 또한, 높은 전도성으로 동작 전압이 낮아 반응이 손쉽게 일어날 수 있으며, 반응 속도가 매우 빠르고, 방해요소인자들에 둔감하여 간섭 및 산소 포화에 관계없이 사용할 수 있다.The biosensor for DET glucose measurement according to the present invention has high stability because electrons can be transferred to the chitosan-multi-walled carbon nanotube hybrid by itself and stable, so electrons can be transferred only by attaching enzymes without mediators or chemical reactions. In addition, due to its high conductivity, the reaction can easily occur due to low operating voltage, the reaction rate is very fast, and it is insensitive to interference factors, so it can be used regardless of interference and oxygen saturation.
본 발명은 글루코즈 측정을 위한 바이오센서 직경이 20 내지 30 nm이고 길이가 10 내지 30 μm인 다중벽 탄소나노튜브 및 탈아세틸화도가 75 내지 85%이고 분자량이 5만 내지 19만 달톤인 키토산을 포함하며, 키토산이 다중벽 탄소나노튜브를 감싸고 있는 형태인 키토산-다중벽 탄소나노튜브 나노하이브리드;및 글루코즈 옥시다제를 포함하는 전극을 포함하는 글루코즈 측정을 위한 바이오센서를 제공하며, 여기서 키토산-다중벽 탄소나노튜브 나노하이브리드는 활성제를 통해 글루코즈 옥시다제와 결합된 것이다.The present invention includes multi-walled carbon nanotubes having a diameter of 20 to 30 nm and a length of 10 to 30 μm and chitosan having a deacetylation degree of 75 to 85% and a molecular weight of 50,000 to 190,000 Daltons for glucose measurement. And chitosan-multi-walled carbon nanotube nanohybrid in a form in which chitosan surrounds the multi-walled carbon nanotubes; and a biosensor for glucose measurement comprising an electrode comprising glucose oxidase, wherein chitosan-multi-walled Carbon nanotube nanohybrids are combined with glucose oxidase through an activator.
본 발명에 따른 상기 글루코즈 측정을 위한 바이오센서는 위 구성을 포함하여 앞서는 제조방법을 통해 제조되는 키토산-다중벽 탄소나노튜브를 이용하는 것일 수 있다. 앞서 살핀 바와 같이 키토산-다중벽 탄소나노튜브는 키토산이 다중벽 탄소나노튜브를 감싸는 형태로, 즉, 다중벽 탄소나노튜브가 코어로 키토산이 이를 감싸는 쉘로 이루어질 수 있다.The biosensor for glucose measurement according to the present invention may be one using chitosan-multi-walled carbon nanotubes manufactured through the above manufacturing method including the above configuration. As previously mentioned, the chitosan-multi-walled carbon nanotube may be formed in a form in which chitosan surrounds the multi-walled carbon nanotube, that is, the multi-walled carbon nanotube is a core and the chitosan surrounds it.
본 발명에서 상기 글루코즈 측정을 위한 바이오센서의 키토산-다중벽 탄소나노튜브는 10,000 내지 15,000 Da의 분자량을 가질 수 있다. 키토산-다중벽 탄소나노튜브의 FT-IR 스펙트럼 및 XPS 스펙트럼은 키토산 및 다중벽 탄소나노튜브가 가지고 있는 FT-IR 스펙트럼의 특성을 모두 포함하는 특징을 가진다.In the present invention, the chitosan-multi-walled carbon nanotube of the biosensor for glucose measurement may have a molecular weight of 10,000 to 15,000 Da. The FT-IR spectrum and XPS spectrum of chitosan-multi-walled carbon nanotubes are characterized by including all of the characteristics of the FT-IR spectrum of chitosan and multi-walled carbon nanotubes.
또한, 본 발명의 글루코즈 측정을 위한 바이오센서는 키토산 분자가 강력한 수소 결합을 통해 결합할 수 있으며, 키토산-다중벽 탄소나노튜브 하이브리드 나노 입자가 추가적인 수소 결합으로 서로 단단하게 결합할 수 있는 특징을 가진다.In addition, the biosensor for glucose measurement of the present invention has characteristics that chitosan molecules can be bonded through strong hydrogen bonding, and chitosan-multi-walled carbon nanotube hybrid nanoparticles can be tightly bonded to each other through additional hydrogen bonding. .
본 발명은 전극 층, 키토산-다중벽 탄소나노튜브 및 글루코즈 옥시다제를 포함하고,The present invention includes an electrode layer, chitosan-multi-walled carbon nanotubes and glucose oxidase,
키토산-다중벽 탄소나노튜브 및 글루코즈 옥시다제가 활성제를 통해 고정되고 키토산-다중벽 탄소나노튜브가 전극의 표면 층에 전기 화학적 결합에 의해 고정된 것을 특징으로 하는 글루코즈 측정을 위한 바이오센서를 제공한다. 여기서 전기 화학적 결합은 키토산-다중나노튜브가 전위의 인가 등과 같은 전기적 방법에 의해 전극 층 표면과 화학적으로 결합되어 고정된 상태이다. 상기 전극 층은 복수의 전극을 포함할 수 있다.Provides a biosensor for glucose measurement, characterized in that chitosan-multi-walled carbon nanotubes and glucose oxidase are immobilized through an activator, and chitosan-multi-walled carbon nanotubes are fixed by electrochemical bonding to the surface layer of an electrode. . Here, the electrochemical bonding is a state in which the chitosan-multi-nanotube is chemically bonded to the surface of the electrode layer by an electric method such as application of an electric potential, and is fixed. The electrode layer may include a plurality of electrodes.
바람직하게 상기 전극 층은 철, 금, 은, 동, 백금, 티타늄, 알루미늄, 팔라듐, 및 인듐 주석 산화물로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하며, 특히 인듐 주석 산화물인 것이 바람직하다.Preferably, the electrode layer is preferably selected from the group consisting of iron, gold, silver, copper, platinum, titanium, aluminum, palladium, and indium tin oxide, and particularly preferably indium tin oxide.
도 8은, 본 발명의 일 실시예에 따른, 글루코즈 측정을 위한 바이오센서의 모식도이다.8 is a schematic diagram of a biosensor for measuring glucose according to an embodiment of the present invention.
도 8을 참조하면, 본 발명의 바이오센서는, 전극 층(100) 및 키토산-다중벽 탄소나노튜브 나노하이브리드 층(200)을 포함하고, 상기 키토산-다중벽 탄소나노튜브 층(200) 위에 글루코스 옥시다제(300)가 캐스팅된다. 위 글루코스 옥시다제는 활성제(400)를 통해 키토산-다중벽 탄소나노튜브 나노하이브리드 층과 결합된다.Referring to FIG. 8, the biosensor of the present invention includes an
상기 전극들은 전기화학적 반응을 측정하기 위한 것으로서, 전원을 인가하는 기준 전극과 작동 전극으로 구성되며, 필요에 따라서는, 분석에 필요한 시료의 양을 확인하는 한 쌍의 인식 전극을 추가로 포함할 수 있다. 즉, 한 쌍의 상기 인식 전극에 시료가 확인되면, 상기 기준 전극과 상기 작용 전극에 전원을 인가하여 전기화학적 반응을 측정한다. 상기 전극의 개수와 구조는 필요에 따라 변경될 수 있다.The electrodes are for measuring the electrochemical reaction, and are composed of a reference electrode and a working electrode for applying power, and if necessary, may further include a pair of recognition electrodes for confirming the amount of sample required for analysis. have. That is, when a sample is identified to the pair of recognition electrodes, power is applied to the reference electrode and the working electrode to measure the electrochemical reaction. The number and structure of the electrodes may be changed as needed.
상기 키토산-다중벽 탄소나노튜브 나노하이브리드 층은 상기 전극들을 덮을 수 있도록 전극들의 상면에 부착되어, 글루코즈를 포함하는 물질(예컨대 혈액 등)이 바로 전극에 접촉되는 것이 아니라, 나노하이브리드 층을 통과한 후에 전극에 접촉될 수 있도록 한다.The chitosan-multi-walled carbon nanotube nanohybrid layer is attached to the upper surfaces of the electrodes to cover the electrodes, so that a substance containing glucose (such as blood) does not directly contact the electrode, but passes through the nanohybrid layer. Make it possible to contact the electrode later.
상기 키토산-다중벽 탄소나노튜브 나노하이브리드 층은 글루코스 옥시다제가 캐스팅(또는 코팅)된다. 상기 글루코스 옥시다제는 혈액 등에 존재하는 글루코즈와 접촉하여 산화 환원 반응을 일으키고, 글루코즈 옥시다제의 산화환원센터와 전극이 매개체없이 직접적으로 전자를 주고받는다. 바이오센서 전극은 이로 인한 전자의 이동과 전류를 감지하여 글루코즈 농도를 측정할 수 있다.The chitosan-multi-walled carbon nanotube nanohybrid layer is cast (or coated) with glucose oxidase. The glucose oxidase contacts glucose present in blood and the like to cause a redox reaction, and the redox center of the glucose oxidase and an electrode directly exchange electrons without a medium. The biosensor electrode can measure the glucose concentration by detecting the movement and current of electrons.
본 발명에 따른 글루코즈 측정을 위한 바이오센서는 기존의 직접-전자-전달 방식 (DET: Direct-Electorn-Transfer)을 이용하는 제3세대 바이오센서들이 효소의 산환환원센터와 전극 간의 저항이 높아 낮은 전자 전달 효율을 가지는 것과 대비하여 빠른 전자-전달 속도를 가지는 점에서 우수한 장점을 가진다.In the biosensor for glucose measurement according to the present invention, the third generation biosensors using the conventional direct-electron-transfer method (DET) have low electron transfer due to high resistance between the redox center of the enzyme and the electrode. Compared to having efficiency, it has an excellent advantage in that it has a fast electron-transfer speed.
또한, 본 발명에 따른 DET 글루코즈 측정을 위한 바이오센서는 키토산-다중벽 탄소나노튜브 하이브리드에 자체적으로 전자전달이 원활하며 안정적이어서 매개자나 화학 반응 없이 효소부착만으로도 전자가 전달될 수 있기 때문에 안정성이 높다. 또한, 높은 전도성으로 동작 전압이 낮아 반응이 손쉽게 일어날 수 있으며, 반응 속도가 매우 빠르고, 방해요소인자들에 둔감하여 간섭 및 산소 포화에 관계없이 사용할 수 있다.In addition, the biosensor for measuring DET glucose according to the present invention has high stability because electrons can be transferred to the chitosan-multi-walled carbon nanotube hybrid by itself and stable, so electrons can be transferred only by attaching enzymes without mediators or chemical reactions. . In addition, due to its high conductivity, the reaction can easily occur due to low operating voltage, the reaction rate is very fast, and it is insensitive to interference factors, so it can be used regardless of interference and oxygen saturation.
도 1은 본 발명 실시예 1에서 제조한 DET 전극의 제조과정을 도식화한 도이다.
도 2는 순수 (pristine) CNT, Chit, 및 본 발명 실시예 1에서 제조한 Chit-CNT85의 FT-IR, XPS, 및 XRD 스펙트럼을 나타낸 것이다. 구체적으로 (a)는 FT-IR 스펙트럼이며, (b)는 XPS 스펙트럼, (c)는 XRD 스펙트럼이다.
도 3은 본 발명 실시예 1에서 제조한 Chit-CNT85 하이브리드 샘플의 FE-SEM 및 HR-TEM 이미지를 나타낸 것으로, 구체적으로 (a)는 FE-SEM 이미지, (b)는 HR-TEM 이미지를 나타낸 것이다. 이는 CS-쉘/CNT-코어 구조를 보여준다.
도 4는 순환전압전류 (CV)그림을 나타낸 도로, (a)는 Chit-CNT80 (검은색), Chit-CNT85 (붉은색), 및 Chit-CNT90 (푸른색)의 CV 그림을, (b)는 비피복 (bare) ITO 전극 (검은색), GOx/ITO 전극 (붉은색), Chit-CNT85/ITO 전극 (녹색), 및 GOx-Chit-CNT85/ITO 전극 (푸른색)의 CV 그림, (c)는 비피복 (bare) ITO 전극 (검은색), GOx/ITO 전극 (붉은색), Chit-CNT85/ITO 전극 (녹색), 및 GOx-Chit-CNT85/ITO 전극 (푸른색)의 나이퀴스트 (Nyquist) 플롯을 나타낸다.
도 5의 (a)는 상이한 GOx의 농도에 따른 순환전압전류 (CV) 그림, (b)는 상이한 pH에 따른 순환전압전류 (CV) 그림을 나타낸다.
도 6의 (a)는 상이한 스캔 속도에 따른 GOx-Chit-CNT85/ITO 전극의 순환전압전류 (CV) 그림, (b)는 GOx-Chit-CNT85/ITO 전극의 피크 전위 분리 대 Log (스캔 속도)를 나타낸다.
도 7의 (a)는 스캔 속도가 0.02 Vs-1에서 GOx-Chit-CNT85/ITO 전극의 상이한 글루코즈 농도 (0.0, 0.1, 1.0, 5.0, 10.0, 및 20.0 nM)에 따른 순환전압전류 (CV) 그림을, (b)는 상이한 글루코즈 농도 (0.0, 0.1, 1.0, 5.0, 10.0, 및 20.0 nM)에 따른 GOx-Chit-CNT85/ITO 전극의 전류 밀도/Log 글루코즈 농도 곡선이다. 삽도된 데이터는 원래의 글루코즈 농도 곡선이다. (c)는 글루코즈가 있을 때 (5.0 mM)와 없을 때 (0.0 mM)의 AA (0.2 mM) 및 UA (0.5 mM)의 간섭 효과, (d)는 AA (0.2 mM) 및 UA (0.5 mM)와 글루코즈 (0.5 mM) 반응을 나타내는 도이다.
도 8은 글루코즈 측정을 위한 바이오센서의 모식도이다.1 is a diagram schematically illustrating a manufacturing process of a DET electrode manufactured in Example 1 of the present invention.
Figure 2 shows the FT-IR, XPS, and XRD spectra of pristine CNT, Chit, and Chit-CNT85 prepared in Example 1 of the present invention. Specifically, (a) is an FT-IR spectrum, (b) is an XPS spectrum, and (c) is an XRD spectrum.
3 shows the FE-SEM and HR-TEM images of the Chit-CNT85 hybrid sample prepared in Example 1 of the present invention, specifically (a) is an FE-SEM image, (b) is an HR-TEM image will be. This shows the CS-shell/CNT-core structure.
4 is a road showing a cyclic voltage current (CV) diagram, (a) is a CV diagram of Chit-CNT80 (black), Chit-CNT85 (red), and Chit-CNT90 (blue), (b) Figures CV of bare ITO electrodes (black), GOx/ITO electrodes (red), Chit-CNT85/ITO electrodes (green), and GOx-Chit-CNT85/ITO electrodes (blue), ( c) Niequi of bare ITO electrode (black), GOx/ITO electrode (red), Chit-CNT85/ITO electrode (green), and GOx-Chit-CNT85/ITO electrode (blue). The Nyquist plot is shown.
Fig. 5 (a) shows a circulating voltage current (CV) according to different concentrations of GOx, and (b) shows a circulating voltage current (CV) according to different pH.
Figure 6 (a) is a plot of the cyclic voltage current (CV) of the GOx-Chit-CNT85/ITO electrode according to different scan rates, and (b) is the peak potential separation vs. Log (scan speed) of the GOx-Chit-CNT85/ITO electrode. ).
Figure 7 (a) shows the circulating voltage current (CV) according to the different glucose concentrations (0.0, 0.1, 1.0, 5.0, 10.0, and 20.0 nM) of the GOx-Chit-CNT85/ITO electrode at a scan rate of 0.02 Vs -1 . In the figure, (b) is the current density/Log glucose concentration curve of the GOx-Chit-CNT85/ITO electrode for different glucose concentrations (0.0, 0.1, 1.0, 5.0, 10.0, and 20.0 nM). The data inserted are the original glucose concentration curve. (c) is the interference effect of AA (0.2 mM) and UA (0.5 mM) with and without (0.0 mM) glucose, (d) is AA (0.2 mM) and UA (0.5 mM) It is a diagram showing the reaction with glucose (0.5 mM).
8 is a schematic diagram of a biosensor for measuring glucose.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. However, these examples are for illustrative purposes only, and the scope of the present invention is not limited to these examples.
실시예 1. 코어-쉘 키토산-다중벽 탄소나노튜브 글루코즈 측정을 위한 바이오센서의 제조Example 1. Fabrication of a biosensor for glucose measurement of core-shell chitosan-multi-walled carbon nanotubes
실시예 1-1. 재료Example 1-1. material
다중벽 탄소나노튜브 (이하에서 CNT로 표기, > 95%, 20 - 30 nm 외경, 10 - 30 μm 길이)와 키토산 (이하에서 Chit로 표기, 저분자량, 탈아세틸화도 75 - 85%, 50,000 - 190,000 Da)은 M-Power (한국) 및 Sigma-Aldrich (미국)로부터 각각 구매하였다. 사용하기 전에 순수 (pristine) CNT를 5 N HCl 용액에서 정제하였다. Spectrum Laboratories (Savannah, GA, 미국)로부터 투석 멤브레인 튜브 (분자량 컷-오프 = 12,000 - 14,000 Da)를 얻었다. Sigma-Aldrich로부터 구입한 빙초산, 암모니아 용액 및 유기 용매를 포함한 모든 보충 화학 물질은 분석 등급이었으며 추가 정제 없이 사용하였다. Aspergillus Niger로부터의 글루코즈 옥시다제 (이하에서 GOx로 표기; 243 U/mg)은 Amano Enzyme Inc. (일본)으로부터 구입하였다. 에틸(디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 (EDC), N-하이드록시숙신이미드 (NHS), 포타슘 헥사시아노페레이트 (Ⅲ), 및 포타슘 헥사시아노페레이트 (Ⅱ) 트리하이드레이트는 Sigma Aldrich Co. (밀워키, WI, 미국)로부터 구입하였다. 인산염완충용액 (PBS, 4.3 mM NaH2PO4, 15.1 mM Na2HPO4, 및 140 mM NaCl) 및 모든 다른 용액을 탈이온화 Milli-Q 물 (DW) (Millipore, 일본)을 사용하여 제조하였다.Multi-walled carbon nanotubes (hereinafter referred to as CNT,> 95%, 20-30 nm outer diameter, 10-30 μm length) and chitosan (hereinafter referred to as Chit, low molecular weight, degree of deacetylation 75-85%, 50,000- 190,000 Da) were purchased from M-Power (Korea) and Sigma-Aldrich (USA), respectively. Prior to use, pristine CNTs were purified in 5 N HCl solution. Dialysis membrane tubes (molecular weight cut-off = 12,000-14,000 Da) were obtained from Spectrum Laboratories (Savannah, GA, USA). All supplemental chemicals, including glacial acetic acid, ammonia solution and organic solvents purchased from Sigma-Aldrich were of analytical grade and were used without further purification. Glucose oxidase (hereinafter referred to as GOx; 243 U/mg) from Aspergillus Niger is manufactured by Amano Enzyme Inc. Purchased from (Japan). Ethyl (dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC), N -hydroxysuccinimide (NHS), potassium hexacyanoferrate (III), and potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate are Sigma Aldrich Co. . (Milwaukee, WI, USA). Phosphate buffer solutions (PBS, 4.3 mM NaH 2 PO 4 , 15.1 mM Na 2 HPO 4, and 140 mM NaCl) and all other solutions were prepared using deionized Milli-Q water (DW) (Millipore, Japan).
실시예 1-2. 키토산-다중벽 탄소나노튜브 나노하이브리드 용액의 제조Example 1-2. Preparation of chitosan-multi-walled carbon nanotube nanohybrid solution
DW에서 CNT의 분산을 위한 키토산의 농도는 중요하다. 코어-쉘 구조에서 개별 CNT 분자가 상이한 양의 키토산 분자로 싸여진 (wrapped), Chit-CNT 하이브리드를 수용액에서 다음과 같이 제조하였다: Chit (0.4, 0.3 또는 0.2 g)을 빙초산 (250 mL)에 용해하여, 상이한 키토산 농도의 Chit 용액을 만들었다. 그 다음, CNT (각각 1.6, 1.7, 또는 1.8 g)를 호모지나이저 (NanoDeBee 45-3, Bee International, 미국)로 각 키토산 용액에 균질화하여 상이한 CNT 질량비 (Chit-CNT80, Chit-CNT85, 및 Chit-CNT90으로 각각 지정된, 80, 85, 또는 90 중량%)를 함유하는 Chit-CNT 하이브리드 용액을 생성하였다(표 1).The concentration of chitosan for the dispersion of CNTs in DW is important. Chit-CNT hybrids, in which individual CNT molecules in a core-shell structure were wrapped with different amounts of chitosan molecules, were prepared in aqueous solution as follows: Chit (0.4, 0.3 or 0.2 g) was dissolved in glacial acetic acid (250 mL). Thus, Chit solutions of different chitosan concentrations were made. Then, CNTs (1.6, 1.7, or 1.8 g, respectively) were homogenized in each chitosan solution with a homogenizer (NanoDeBee 45-3, Bee International, USA) to obtain different CNT mass ratios (Chit-CNT80, Chit-CNT85, and Chit Chit-CNT hybrid solutions containing 80, 85, or 90% by weight, designated as -CNT90, respectively) were generated (Table 1).
수득된 산성 Chit-CNT 용액을 2 N 암모니아 용액을 첨가하여 서서히 중화시킨 다음 멤브레인 튜브로 탈이온수 (DW)에 대해 3일 동안 투석하여 무기 부생성물을 포함하여 가능한 한 작은 분자를 제거하였다. 검은색 Chit-CNT 하이브리드 용액은 DET 전극 제조를 위해 사용되었다.The obtained acidic Chit-CNT solution was slowly neutralized by adding a 2N ammonia solution, and then dialyzed against deionized water (DW) for 3 days with a membrane tube to remove as small molecules as possible, including inorganic by-products. The black Chit-CNT hybrid solution was used to prepare the DET electrode.
실시예 1-3. DET 전극의 제조Example 1-3. Preparation of DET electrode
ITO 전극을 피라냐 용액 (H2SO4:H2O2:H2O = 1:3:3, v/v)에 5분간 침지함으로써 세척한 후, 헹군 후 DW에서 20분간 초음파 처리하여, 최종적으로 실온에서 N2의 흐름 하에서 완벽히 건조시켰다. 샘플 제조로서, 코어-쉘 Chit-CNT85 (50 μL, 1.0 mg mL-1)을 캐스팅 및 건조에 의해 ITO 전극에 흡착시켰다. 에틸(디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 (EDC, 0.4 M) 및 N-하이드록시숙신이미드 (NHS, 0.2 M)의 혼합 용액 (20 μL)을 카복실산을 활성화시키기 위해 Chit-CNT85/ITO 전극의 표면에 30분 동안 가한 다음, DW를 사용하여 헹구었다. GOx (40 μL, 40 mg mL-1)를 활성화된 Chit-CNT85/ITO 전극 위로 실온에서 1시간 동안 캐스팅하였다. 제조된 GOx-Chit-CNT85/ITO 전극은 글루코즈의 결정에 사용하기 전에 4℃에서 저장하였다. 상이한 GOx 농도 (10.0, 20.0, 40.0 및 80.0 mg mL-1)를 갖는 전극을 유사하게 제조하였다.After washing the ITO electrode by immersing it in piranha solution (H 2 SO 4 :H 2 O 2 :H 2 O = 1:3:3, v/v) for 5 minutes, after rinsing, ultrasonic treatment in DW for 20 minutes, finally It was completely dried under the flow of N 2 at room temperature. As a sample preparation, core-shell Chit-CNT85 (50 μL, 1.0 mg mL -1 ) was adsorbed to the ITO electrode by casting and drying. A mixed solution (20 μL) of ethyl (dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC, 0.4 M) and N -hydroxysuccinimide (NHS, 0.2 M) was added to the surface of the Chit-CNT85/ITO electrode to activate the carboxylic acid. Was added for 30 minutes and then rinsed with DW. GOx (40 μL, 40 mg mL -1 ) was cast onto the activated Chit-CNT85/ITO electrode for 1 hour at room temperature. The prepared GOx-Chit-CNT85/ITO electrode was stored at 4° C. before use for determination of glucose. Electrodes with different GOx concentrations (10.0, 20.0, 40.0 and 80.0 mg mL -1 ) were prepared similarly.
코어-쉘 구조의 키토산-다중벽 탄소나노튜브 글루코즈 측정을 위한 바이오센서의 제조과정을 도 1에 도시하였다.A manufacturing process of a biosensor for measuring glucose of a core-shell structured chitosan-multi-walled carbon nanotube is shown in FIG. 1.
실시예 2. 키토산-다중벽 탄소나노튜브 나노하이브리드의 정성 분석Example 2. Qualitative analysis of chitosan-multi-walled carbon nanotube nanohybrid
순수 (pristine) CNT, Chit, 및 Chit-CNT 하이브리드의 물리화학적 성질을 FT-IR 분광분석법 (JASCO 470 PLUS), X-선 광전자 분광법 (XPS; AES-XPS ESCA 2000, Thermo Fisher Scientifc, 미국), 및 X-선 회절 (XRD, Rigaku)로 검사하였다. 제조된 Chit-CNT 하이브리드 (여기에서 전형적으로 Chit-CNT85를 사용하였음)를 특성화하고 나노하이브리드에서 두 성분의 존재를 확인하기 위하여, FT-IR, XPS, 및 XRD 스펙트럼을 순수 (pristine) CNT 및 Chit의 스펙트럼과 비교하였다.The physicochemical properties of pristine CNT, Chit, and Chit-CNT hybrids were evaluated by FT-IR spectroscopy (JASCO 470 PLUS), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS; AES-
그 결과를 도 2에 나타내었다.The results are shown in FIG. 2.
도 2의 (a)에서 확인할 수 있는 바와 같이, Chit-CNT85의 FT-IR 스펙트럼은 하기와 같이 두 종류 모두에 특징적인 피크를 나타낸다:As can be seen in (a) of Figure 2, the FT-IR spectrum of Chit-CNT85 shows characteristic peaks for both types as follows:
3200-3630 cm-1 (Chit 및 CNT의 -OH 및 -NH 신장), 2915 및 2865 cm-1 (Chit의 -CH2 그룹의 -CH 신장), 1648 cm-1 (pristine CNT의 C=C 신장), 및 1643 cm-1 (주로 Chit의 카보닐 그룹의 C=O 신장).3200-3630 cm -1 (-OH and -NH elongation of Chit and CNT), 2915 and 2865 cm -1 (-CH elongation of Chit's -CH 2 group), 1648 cm -1 (C=C elongation of pristine CNTs ), and 1643 cm -1 (mainly C=O elongation of the carbonyl group of Chit).
여기서, C=O 작용기가 분자간 수소결합 네트워크에 집중적으로 관여할 수 있는 Chit-CNT 코어-쉘 단위의 증가로 인해 1736 cm-1의 순수한 Chit의 C=O 신장 밴드는 1634 cm-1로 이동하였다.Here, the C=O elongation band of pure Chit of 1736 cm -1 shifted to 1634 cm -1 due to the increase of the Chit-CNT core-shell unit, where the C=O functional group can be intensively involved in the intermolecular hydrogen bonding network. .
도 2의 (b)에서 확인할 수 있는 바와 같이, Chit-CNT85 하이브리드 샘플의 XPS 스펙트럼은 CNT 성분의 특성 피크를 284.6 eV (C 1s) 및 533.2 eV (O 1s)에서 보이고, Chit 성분의 특성 피크를 286.8eV (C 1s), 400.0 eV (N 1s) 및 533.2 eV (O 1s)에서 보인다. Chit-CNT85의 스펙트럼에 나타나는 2개의 C-관련 피크, 및 N-관련 피크는 참조로 사용되는 순수 (pristine) CNT 및 순수한 Chit의 스펙트럼과 비교하여, 하이브리드 샘플에서 CNT와 Chit 분자의 존재를 강하게 나타낸다.As can be seen in (b) of Figure 2, the XPS spectrum of the Chit-CNT85 hybrid sample shows the characteristic peaks of the CNT component at 284.6 eV (
도 2의 (c)에서 확인할 수 있는 바와 같이, XRD를 통해 Chit-CNT85 나노하이브리드에서 CNT 및 Chit 상 (phase)을 확인하였다. Chit-CNT85 나노하이브리드의 CNT 및 Chit 상은 각각 25.8° 및 20.5°의 2θ 값에서 넓은 피크로서 관찰되었다. 2θ = 26.4°에서 순수 (pristine) CNT-관련 피크는 개별 CNT 섬유의 Chit 분자로 인한 표면 변형 후 25.8°로 약간 이동하였는데, 이는 다중벽 탄소나노튜브 상의 탄소 결정화도에 매우 미세한 변화가 있음을 나타낸다.As can be seen in (c) of FIG. 2, CNT and Chit phase were confirmed in the Chit-CNT85 nanohybrid through XRD. The CNT and Chit phases of the Chit-CNT85 nanohybrid were observed as broad peaks at 2θ values of 25.8° and 20.5°, respectively. At 2θ = 26.4°, the pristine CNT-related peak slightly shifted to 25.8° after surface modification due to the Chit molecules of individual CNT fibers, indicating that there is a very small change in the carbon crystallinity on the multi-walled carbon nanotubes.
실시예 3. 키토산-다중벽 탄소나노튜브 나노하이브리드의 형태학적 특성 확인Example 3. Confirmation of morphological properties of chitosan-multi-walled carbon nanotube nanohybrid
순수 (pristine) CNT, Chit, 및 Chit-CNT 하이브리드의 형태학적 및 물리화학적 성질을 고해상도 투과 전자 현미경 (HR-TEM; JEM 3010, JEOL, 일본), 및 분야 방사 스캐닝 전자 현미경 (field emission scanning electron microscopy, FE-SEM; MIRA II LMH 현미경)으로 검사하였다. SEM 분석에 앞서, 샘플을 약 10 nm의 금으로 스퍼터-코팅했다. 적외선 스펙트럼은 400 내지 4000 cm-1 범위의 고체 조건에서 기록하였다.The morphological and physicochemical properties of pristine CNT, Chit, and Chit-CNT hybrids were investigated in high resolution transmission electron microscopy (HR-TEM; JEM 3010, JEOL, Japan), and field emission scanning electron microscopy. , FE-SEM; MIRA II LMH microscope). Prior to SEM analysis, the samples were sputter-coated with about 10 nm of gold. Infrared spectra were recorded in solid conditions ranging from 400 to 4000 cm -1 .
이를 도 3에 나타내었다.This is shown in FIG. 3.
도 3의 (a)에서 확인할 수 있는 바와 같이, SEM 이미지는 Chit-CNT85 하이브리드 섬유의 거친 표면을 명확하게 보여주며, CNT 섬유 표면에 Chit 껍질 (skin)의 존재를 나타낸다. Chit 분자는 탄소나노튜브를 감싸기 위해, 주로 강력한 수소 결합을 통해 쉽게 자가-조립할 수 있다. 수성 Chit-CNT 하이브리드 용액이 증발에 의해 응축될 때, Chit-CNT 하이브리드 나노 입자는 그들의 증착된 (deposited) Chit 껍질 사이의 추가적인 수소 결합에 의해 그들의 증착된 접촉 지점에서 서로 네트워크할 수 있다.As can be seen in (a) of FIG. 3, the SEM image clearly shows the rough surface of the Chit-CNT85 hybrid fiber, and indicates the presence of a Chit skin on the CNT fiber surface. Chit molecules can be easily self-assembled to wrap around carbon nanotubes, mainly through strong hydrogen bonding. When the aqueous Chit-CNT hybrid solution is condensed by evaporation, the Chit-CNT hybrid nanoparticles can network with each other at their deposited contact points by additional hydrogen bonds between their deposited Chit shells.
이러한 특징적인 형태 및 시멘트와 같은 성질은 전기 전도성 물질로서 다양한 플랫폼 상에 캐스팅함으로써 Chit-CNT 나노하이브리드 분자가 고밀도, 조밀, 및 3차원적으로 뚜렷이 다른 구조물들을 형성하는 것을 가능하게 한다.These characteristic morphology and cement-like properties enable Chit-CNT nanohybrid molecules to form highly dense, dense, and three-dimensionally distinct structures by casting on various platforms as an electrically conductive material.
도 3의 (b)에 도시된 바와 같이, TEM 이미지는 ~2 nm 두께의 Chit 층 및 다중벽 CNT의 외벽에 걸쳐 균등한 Chit 분포를 갖는 CNT-코어/Chit-쉘 구조를 명확하게 나타낸다.As shown in (b) of FIG. 3, the TEM image clearly shows a CNT-core/Chit-shell structure having a Chit layer of ~2 nm thickness and a uniform Chit distribution over the outer wall of the multi-walled CNT.
실시예 4.Example 4. 코어-쉘 키토산-다중벽 탄소나노튜브 글루코즈 측정을 위한 바이오센서의 전기화학적 특성 확인Confirmation of electrochemical properties of biosensor for glucose measurement of core-shell chitosan-multi-walled carbon nanotubes
실시예 4-1. 코어-쉘 키토산-다중벽 탄소나노튜브 글루코즈 측정을 위한 바이오센서의 전기화학적 특성 확인 실험예Example 4-1. Experimental example of checking electrochemical properties of biosensor for measuring core-shell chitosan-multi-walled carbon nanotube glucose
모든 전기화학적 실험은 컴퓨터와 인터페이스된 전기화학 워크스테이션 (workstation)(CHI660B, CH Instruments Inc., Austin, TX, 미국)을 사용하여 수행하였다. 6.0 mm 직경의 ITO 전극을 작업 전극 (working electrode)으로 사용하였다. 직경 0.5 mm의 백금 와이어로 스크롤된 (scrolled) 마이크로 Ag/AgCl (3.0 M KCl, Cypress, Lawrence, KS, 미국) 전극을 기준 전극 및 상대 전극으로 각각 사용하였다. ITO 전극의 전기적 응답은 1X PBS에 용해된 40 μL 글루코즈에서 CV와 전류 측정법으로 측정하였다.All electrochemical experiments were performed using an electrochemical workstation (CHI660B, CH Instruments Inc., Austin, TX, USA) interfaced with a computer. A 6.0 mm diameter ITO electrode was used as a working electrode. A micro Ag/AgCl (3.0 M KCl, Cypress, Lawrence, KS, USA) electrode scrolled with a platinum wire of 0.5 mm in diameter was used as a reference electrode and a counter electrode, respectively. The electrical response of the ITO electrode was measured by CV and amperometry at 40 μL glucose dissolved in 1X PBS.
실시예 4-2.Example 4-2. 코어-쉘 키토산-다중벽 탄소나노튜브 글루코즈 측정을 위한 바이오센서의 전기화학적 특성 확인 결과Core-shell chitosan-multi-walled carbon nanotubes The results of checking the electrochemical properties of a biosensor for glucose measurement
Chit 비율을 최적화하기 위해, Chit 부하가 증가된 하이브리드인 Chit-CNT80, Chit-CNT85 및 Chit-CNT90을 제조하고 검사하여 이를 도 4의 (a)에 나타내었다.In order to optimize the Chit ratio, Chit-CNT80, Chit-CNT85, and Chit-CNT90 hybrids with increased Chit load were prepared and tested, and the results are shown in FIG. 4(a).
도 4의 (a)에서 확인할 수 있는 바와 같이, GOx-Chit-CNT85/ITO 전극은 GOx의 산화 환원 피크가 다른 함량보다 더 잘 나타났다. 많은 양의 Chit (Chit-CNT80)는 CNT와 GOx 사이의 전자 전달을 방해한다. 반면, 적은 양의 Chit (Chit-CNT90)은 CNT와 GOx 사이의 전달에 있어 충분하지 않다. 최고 성능은 Chit-CNT85에서 관찰되었다.As can be seen in (a) of Figure 4, the GOx-Chit-CNT85/ITO electrode showed better redox peaks of GOx than other contents. Large amounts of Chit (Chit-CNT80) interfere with electron transfer between CNT and GOx. On the other hand, a small amount of Chit (Chit-CNT90) is not sufficient for the transfer between CNT and GOx. The best performance was observed with Chit-CNT85.
GOx에 의한 전자 전달에 대해서, GOx-Chit-CNT85/ITO 전극을 N2-포화된 1X PBS 용액에서 CV (스캔 범위: -0.8 내지 0 V, 스캔 속도: 0.1 Vs-1)로 평가하여 도 4의 (b)에 나타내었다.For electron transfer by GOx, the GOx-Chit-CNT85/ITO electrode was evaluated as CV (scan range: -0.8 to 0 V, scan rate: 0.1 Vs -1 ) in an N 2- saturated 1X PBS solution, and FIG. 4 It is shown in (b).
도 4의 (b)는 비피복 (bare) ITO (검은색 선), GOx/ITO (적색 파선), Chit-CNT85/ITO (녹색 점선), 및 GOx-Chit-CNT85/ITO (파란 1점 쇄선) 전극에 대한 결과를 나타낸다. 비피복 ITO, GOx/ITO, 및 Chit-CNT85/ITO 전극은 바인딩 메커니즘이 없기 때문에 GOx에 대한 산화 환원 피크를 나타내지 않는다. 그러나 GOx-Chit-CNT85/ITO 전극은 GOx 보조 인자와 친수성 Chit-CNT85 기판 사이의 와이어 때문에 효소로부터 전자를 잘 전달한다.(B) of FIG. 4 is a bare ITO (black line), GOx/ITO (red dashed line), Chit-CNT85/ITO (green dotted line), and GOx-Chit-CNT85/ITO (blue 1-dot chain line). ) Shows the results for the electrode. The bare ITO, GOx/ITO, and Chit-CNT85/ITO electrodes do not exhibit redox peaks for GOx because there is no binding mechanism. However, the GOx-Chit-CNT85/ITO electrode transfers electrons well from the enzyme because of the wire between the GOx cofactor and the hydrophilic Chit-CNT85 substrate.
비피복 ITO, GOx/ITO, Chit-CNT85/ITO 및 GOx-Chit-CNT85/ITO 전극의 임피던스 스펙트럼을 2.0 mM K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]을 함유한 0.5 M KCl (pH = 7.4) 용액에서 수득하여 EIS 데이터의 나이퀴스트 (Nyquist) 플롯으로 도 4의 (c)에 도시하였다. 고주파수에서의 반원형 부분은 전자-전달-제한 (electron-transfer-limited) 과정에 상응하고, 저주파수에서의 선형 부분은 확산-제어 (diffusion-controlled) 과정에 상응하는 변형된 전극의 계면 특성을 확인하였다. 반원 직경은 전자-전달 저항 (Ret)을 나타낸다.Impedance spectra of bare ITO, GOx/ITO, Chit-CNT85/ITO and GOx-Chit-CNT85/ITO electrodes containing 2.0 mM K 3 [Fe(CN) 6 ]/K 4 [Fe(CN) 6 ] A Nyquist plot of EIS data obtained from 0.5 M KCl (pH = 7.4) solution is shown in (c) of FIG. 4. The semicircular part at high frequency corresponds to the electron-transfer-limited process, and the linear part at low frequency corresponds to the diffusion-controlled process. . The semicircle diameter represents the electron-transfer resistance (R et ).
도 4의 (c)에 도시된 바와 같이, GOx/ITO의 Ret (적색 원)은 280 내지 1420 Ω에서, 비피복 ITO (검은색 사각형)의 것보다 극적으로 증가한다. 대조적으로, Chit-CNT85/ITO의 Ret (녹색 삼각형)은 전도성 CNT의 효과로 인해, 26 Ω의 보다 낮은 저항을 나타낸다. 마지막으로 GOx-Chit-CNT85/ITO (파란색 역삼각형)는 780 Ω의 저항을 제공한다. 이 결과는 효소가 전자 전달을 방해하고, Chit-CNT85가 전자 전달을 도왔다는 것을 시사한다.As shown in Fig. 4(c), R et (red circle) of GOx/ITO increases dramatically from 280 to 1420 Ω, compared to that of uncovered ITO (black square). In contrast, R et (green triangle) of Chit-CNT85/ITO shows a lower resistance of 26 Ω, due to the effect of conductive CNTs. Finally, the GOx-Chit-CNT85/ITO (blue inverted triangle) provides a resistance of 780 Ω. This result suggests that the enzyme interfered with electron transfer, and that Chit-CNT85 helped electron transfer.
실시예 5. 코어-쉘 키토산-다중벽 탄소나노튜브 글루코즈 측정을 위한 바이오센서의 글루코즈 옥시다제 농도 및 pH에 따른 전기화학적 특성 확인Example 5. Identification of electrochemical properties according to glucose oxidase concentration and pH of biosensor for measuring core-shell chitosan-multi-walled carbon nanotube glucose
Chit-CNT85/ITO 전극 상의 GOx 농도의 효과는 N2-포화된 1X PBS 용액에서 CV (스캔 범위: -0.8 내지 0 V, 스캔 속도: 0.05 Vs-1)로 측정하여 도 5의 (a)에 나타내었다.The effect of the GOx concentration on the Chit-CNT85/ITO electrode was measured by CV (scan range: -0.8 to 0 V, scan rate: 0.05 Vs -1 ) in an N 2 -saturated 1X PBS solution, as shown in Fig. 5(a). Indicated.
도 5의 (a)에 확인할 수 있는 바와 같이, GOx에 대한 최대 산화 환원 피크는 GOx-변형된 Chit-CNT85/ITO 전극에서 40 mgmL-1에서 포화된다.As can be seen in (a) of Figure 5, the maximum redox peak for GOx is saturated at 40 mgmL -1 in the GOx-modified Chit-CNT85/ITO electrode.
표면 커버리지(ΓT app)는 산화파 또는 환원파 하에서 전하 (Qc)를 측정함으로써 GOx (FAD) 및 GOx (FADH2)의 CV 파로 결정하였다:The surface coverage (Γ T app ) was determined as the CV waves of GOx (FAD) and GOx (FADH 2 ) by measuring the charge (Qc) under an oxidation or reduction wave:
명백한 표면 커버리지의 계산은 GOx 환원파의 면적을 기반으로 하였다. n이 분자당 환원된 전자의 수일 때(본원에서 GOx에 대해 n = 2), F는 패러데이 상수를 나타내고, A는 작업 전극의 면적을 cm2로 나타낸다. ΓT app는 4.368 ± 0.15 x 10-9 mol/cm2였다.The calculation of the apparent surface coverage was based on the area of the GOx reduction wave. When n is the number of reduced electrons per molecule (n = 2 for GOx here), F denotes the Faraday constant, and A denotes the area of the working electrode in cm 2 . Γ T app was 4.368 ± 0.15 x 10 -9 mol/cm 2 .
일반적으로 알려진 바와 같이, 하기와 같이 GOx의 DET 반응은 두 개의 전자와 두 개의 수소 이온이 필요하다:As is generally known, the DET reaction of GOx requires two electrons and two hydrogen ions as follows:
GOx-FAD + 2e- + 2H + ↔ GOx-FADH2 GOx-FAD + 2e- + 2H + ↔ GOx-FADH 2
따라서, GOx-Chit-CNT85/ITO 전극 상의 GOx의 전기화학적 거동은 용액의 pH에 좌우된다. 도 5의 (b)에 도시된 바와 같이, 증가하는 pH 값에 따라 산화 환원 전위 피크의 음의 이동이 발생한다. GOx의 산화 환원 전위 E0는 3에서 9까지의 용액 pH의 함수로서 -55.2 mVpH-1 (r2 = 0.9471)의 기울기로 선형적으로 변화한다. 이러한 기울기는 2007년 리우 그룹이 제안한 이론적인 -58.6 mVpH-1과 유사하다. 이 반응은 가역적 전자-전달 과정에서 두 개의 양성자와 두 개의 전자가 참여함을 나타낸다. 또한, GOx의 산화 환원 전위가 가역적임을 보여주었다.Thus, the electrochemical behavior of GOx on the GOx-Chit-CNT85/ITO electrode depends on the pH of the solution. As shown in (b) of FIG. 5, a negative shift of the redox potential peak occurs according to the increasing pH value. The redox potential E0 of GOx varies linearly with a slope of -55.2 mVpH -1 (r 2 = 0.9471) as a function of solution pH from 3 to 9. This slope is similar to the theoretical -58.6 mVpH -1 proposed by Rio Group in 2007. This reaction indicates that two protons and two electrons participate in the reversible electron-transfer process. In addition, it was shown that the redox potential of GOx is reversible.
실시예 6. 코어-쉘 키토산-다중벽 탄소나노튜브 글루코즈 측정을 위한 바이오센서의 글루코즈 농도에 따른 전기화학적 특성 및 전자-전달 속도의 확인Example 6. Identification of electrochemical properties and electron-transfer rates according to glucose concentration of biosensor for measuring core-shell chitosan-multi-walled carbon nanotube glucose
GOx-Chit-CNT85/ITO 전극은 GOx의 산화 환원 전위를 평가하기 위해 사용되었다. 0.1 내지 2.0 Vs-1의 범위에서의 다양한 스캔속도에서 -0.8 내지 0.0 V 사이의 스캔 범위로부터 다양한 글루코즈 농도 (0, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0 및 20.0 mM)에 대한 응답을 조사하기 위해 Ag/AgCl과 비교하여 CV 실험을 수행하였다.The GOx-Chit-CNT85/ITO electrode was used to evaluate the redox potential of GOx. Ag/to investigate the response to various glucose concentrations (0, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0 and 20.0 mM) from the scan range between -0.8 to 0.0 V at various scan rates in the range of 0.1 to 2.0 Vs -1 . CV experiments were performed in comparison with AgCl.
그 결과를 도 6에 나타내었다.The results are shown in FIG. 6.
도 6의 (a)에서 확인할 수 있는 바와 같이, CV 전류 밀도는 pH 7.4에서 스캔 속도 (Vs-1)가 상승함에 따라 증가한다. 0.1 내지 2.0 Vs-1의 범위에서의 다양한 스캔 속도에서 산화 및 환원 동안 피크 전류의 선형 비례 변화가 관찰되었다.As can be seen in (a) of FIG. 6, the CV current density increases as the scan rate (Vs −1 ) increases at pH 7.4. A linear proportional change in peak current was observed during oxidation and reduction at various scan rates in the range of 0.1 to 2.0 Vs -1 .
피크-피크 분리 (peak-to peak separations) (Ep)의 그래프를 도 6의 (a)의 CV 데이터를 사용하여 플롯하여 도 6의 (b)에 나타내었다. 이로부터, GOx-Chit-CNT85/ITO 전극에 대한 전자-전달 속도 상수 (ks)는 Laviron 방정식을 통해 하기와 같이 계산되었다:A graph of peak-to peak separations (E p ) was plotted using the CV data of FIG. 6(a) and shown in FIG. 6(b). From this, the electron-transfer rate constant (k s ) for the GOx-Chit-CNT85/ITO electrode was calculated as follows through the Laviron equation:
Epa는 음극 피크 전위, Epc는 양극 피크 전위, v는 스캔 속도 (Vs-1), R은 범용 가스 상수 (8.314 Jmol-1K-1), T는 23℃ (296.15 K), n은 전자 전달 수 (2), 및 F는 패러데이 상수 (96,485 Cmol-1)이다. 여기서, α와 ks는 각각 0.48과 8.2 s-1를 가리킨다.E pa is the cathode peak potential, E pc is the anode peak potential, v is the scan rate (Vs -1 ), R is the universal gas constant (8.314 Jmol -1 K -1 ), T is 23°C (296.15 K), n is The electron transfer number (2), and F are Faraday constants (96,485 Cmol -1 ). Here, α and k s indicate 0.48 and 8.2 s -1 , respectively.
전자-전달 키네틱 과정을 나타내는 본원의 ks는 표 2에 제시된 것처럼 키토산-기반의 탄소 동소체를 사용하는 다른 DET 글루코즈 측정을 위한 바이오센서와 비교할 때 매우 빠르다.The k s of the present application, representing the electron-transfer kinetic process, is very fast compared to other biosensors for DET glucose measurement using chitosan-based carbon allotropes as shown in Table 2.
이러한 결과는 MWCNT의 표면에 최적화된 본원 발명에 따른 방법이 이 다른 방법보다 GOx와 전극 사이에 더 효율적인 전자 전달을 제공함을 시사한다. 이러한 결과는 균질화 방법이 CNT 위에 키토산 층을 균일하게 합성할 수 있기 때문이다.These results suggest that the method according to the present invention, which is optimized for the surface of MWCNTs, provides more efficient electron transfer between GOx and the electrode than this other method. This result is because the homogenization method can uniformly synthesize the chitosan layer on the CNT.
실시예 7. 코어-쉘 키토산-다중벽 탄소나노튜브 글루코즈 측정을 위한 바이오센서의 글루코즈 농도 및 간섭 물질에 따른 전기화학적 특성 확인Example 7. Core-shell chitosan-multi-walled carbon nanotubes Confirmation of electrochemical properties according to glucose concentration and interference substance of biosensor for glucose measurement
0.02 Vs-1의 스캔 속도에서 -0.8 내지 0.0 V 사이의 스캔 범위로부터 다양한 글루코즈 농도 (0, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0 및 20.0 mM)에 대한 응답을 조사하기 위해 Ag/AgCl과 비교하여 주위 온도 (ambient temperature)에서 CV 실험을 수행하였다. 또한, 전기화학적 감지의 성공에 선택성이 중요하기 때문에, UA (0.5 mM)와 AA (0.2 mM)에 의한 가능한 간섭을 결정하기 위해 글루코즈 측정과 동일한 조건에서 5.0mM 및 0.0 mM 글루코즈에서의 CV를 조사하였다.Ambient temperature compared to Ag/AgCl to investigate the response to various glucose concentrations (0, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0 and 20.0 mM) from a scan range between -0.8 to 0.0 V at a scan rate of 0.02 Vs -1 . CV experiments were performed at (ambient temperature). In addition, since selectivity is important to the success of electrochemical detection, CV at 5.0 mM and 0.0 mM glucose was investigated under the same conditions as glucose measurement to determine possible interference by UA (0.5 mM) and AA (0.2 mM). I did.
그 결과를 도 7에 나타내었다.The results are shown in FIG. 7.
도 7의 (a)에서 확인할 수 있는 바와 같이, GOx에 의한 음극 피크는 글루코즈 농도가 연속적으로 증가함에 따라 감소하며, 이는 글루코즈가 GOx-Chit-CNT85/ITO 전극 상에서 산화됨을 암시한다.As can be seen in (a) of FIG. 7, the cathode peak by GOx decreases as the glucose concentration continuously increases, suggesting that glucose is oxidized on the GOx-Chit-CNT85/ITO electrode.
글루코즈의 산화 메커니즘은 하기와 같다:The mechanism of oxidation of glucose is as follows:
GOx(FADH2) + O2 -> GOx(FAD) + H2O2 GOx(FADH 2 ) + O 2 -> GOx(FAD) + H 2 O 2
GOx(FAD) + 글루코즈 -> GOx(FADH2) + 글루코노락톤.GOx(FAD) + glucose -> GOx(FADH 2 ) + gluconolactone.
전류 신호는 -0.431 V에서 Ag/AgCl과 비교하여 수집하여 이를 도 7의 (b)에 나타내었다.The current signal was collected in comparison with Ag/AgCl at -0.431 V and shown in FIG. 7(b).
도 7의 (b)에서 확인할 수 있는 바와 같이, 글루코즈의 증가 동안, 전류 밀도의 결과가 일치하였다. 반응 속도는 Vmax의 절반인 반응 속도에서의 기질의 농도인 km 값은 3.45 mM로 나타났다. 이러한 결과는 Lineweaver-Burk double reciprocal plot으로 계산한 것이다.As can be seen in (b) of FIG. 7, during the increase of glucose, the results of the current density were consistent. The k m value, which is the concentration of the substrate at the reaction rate, which is half of V max , was 3.45 mM. These results were calculated with Lineweaver-Burk double reciprocal plot.
AA 및 UA와 같은 종에 의한 간섭의 가능성을 도시한 도 7의 (c)에서 확인할 수 있는 바와 같이, 5.0 mM 글루코즈의 음극 피크는 감소되었지만, GOx는 글루코즈에만 반응할 수 있기 때문에, 0.0 mM 글루코즈 피크와 비교하여 AA 및 UA는 반응하지 않았다.As can be seen in Figure 7 (c) showing the possibility of interference by species such as AA and UA, the negative peak of 5.0 mM glucose was reduced, but because GOx can only react with glucose, 0.0 mM glucose Compared to the peak, AA and UA did not react.
도 7의 (d)에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본원발명에 따른 전극에는 간섭 효과가 나타나지 않았다. 이러한 결과는 글루코즈와의 구체적인 반응을 보여주었고 Chit-CNT85가 산소 포화 없이 사용될 수 있음을 나타내었다.As can be seen in (d) of FIG. 7, the interference effect did not appear in the electrode according to the present invention. These results showed a specific reaction with glucose and indicated that Chit-CNT85 can be used without oxygen saturation.
위 결과들을 기초로 본 발명에 따른 글루코즈 측정을 위한 바이오센서는 빠른 전자-전달 속도를 가지고, 간섭 및 산소 포화에 관계없이 사용 가능하다.Based on the above results, the biosensor for glucose measurement according to the present invention has a fast electron-transfer rate and can be used regardless of interference and oxygen saturation.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.From the above description, those skilled in the art to which the present invention pertains will understand that the present invention can be implemented in other specific forms without changing the technical spirit or essential features thereof. In this regard, it should be understood that the embodiments described above are illustrative in all respects and not limiting. The scope of the present invention should be construed that all changes or modifications derived from the meaning and scope of the claims to be described later rather than the above detailed description and equivalent concepts are included in the scope of the present invention.
Claims (14)
(b) 다중벽 탄소나노튜브를 상기 키토산 용액에 균질화시키는 단계;
(c) 상기 (b)에서 제조된 산성 키토산-다중벽 탄소나노튜브 용액을 중화하고 투석하여 키토산-다중벽 탄소나노튜브 용액을 제조하는 단계;
(d) 상기 (c)에서 제조된 키토산-다중벽 탄소나노튜브 용액을 전극에 캐스팅하고 건조시켜 키토산-다중벽 탄소나노튜브 나노하이브리드를 전극에 고정시키는 단계;
(e) 상기 (d)에서 제조된 전극에 활성제를 첨가하여 글루코즈 옥시다제의 표면을 활성화시키는 단계; 및
(f) 상기 (e)에서 활성화된 글루코즈 옥시다제를 전극의 표면에 캐스팅하는 단계;
를 포함하는 글루코즈 측정을 위한 바이오센서 제조방법.(a) dissolving chitosan in an acidic solution to prepare a chitosan solution;
(b) homogenizing the multi-walled carbon nanotubes in the chitosan solution;
(c) neutralizing the acidic chitosan-multi-walled carbon nanotube solution prepared in (b) and dialysis to prepare a chitosan-multi-walled carbon nanotube solution;
(d) casting the chitosan-multi-walled carbon nanotube solution prepared in (c) on an electrode and drying the chitosan-multi-walled carbon nanotube nanohybrid to the electrode;
(e) adding an activator to the electrode prepared in (d) to activate the surface of glucose oxidase; And
(f) casting the glucose oxidase activated in (e) on the surface of the electrode;
Biosensor manufacturing method for measuring glucose comprising a.
상기 다중벽 탄소나노튜브는 직경이 20 내지 30 nm이고, 길이가 10 내지 30 μm이며,
상기 키토산은 탈아세틸화도가 75 내지 85%이고, 분자량이 5만 내지 19만 달톤인, 글루코즈 측정을 위한 바이오센서 제조방법.The method of claim 1,
The multi-walled carbon nanotube has a diameter of 20 to 30 nm, a length of 10 to 30 μm,
The chitosan has a degree of deacetylation of 75 to 85% and a molecular weight of 50,000 to 190,000 Daltons, a biosensor manufacturing method for glucose measurement.
상기 (b) 단계에서 키토산 및 다중벽 탄소나노튜브의 중량비가 20:80 내지 10:90인, 글루코즈 측정을 위한 바이오센서 제조방법.The method of claim 1,
In the step (b), the weight ratio of chitosan and multi-walled carbon nanotubes is 20:80 to 10:90, a biosensor manufacturing method for glucose measurement.
상기 (f) 단계에서 글루코즈 옥시다제의 농도가 10.0 mgmL-1 내지 80.0 mgmL-1인, 글루코즈 측정을 위한 바이오센서 제조방법.The method of claim 1,
In the step (f), the concentration of glucose oxidase is 10.0 mgmL -1 to 80.0 mgmL -1 , a biosensor manufacturing method for measuring glucose.
상기 (a) 단계에서 산성 용액은 아세트산 수용액, 포름산 수용액, TFA (trifluoracetic acid), 염산, 황산, 인산, 질산, 및 빙초산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 용매인 것인, 글루코즈 측정을 위한 바이오센서 제조방법.The method of claim 1,
In the step (a), the acidic solution is one or more solvents selected from the group consisting of an aqueous acetic acid solution, an aqueous formic acid solution, a trifluoracetic acid (TFA), hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, nitric acid, and glacial acetic acid. Sensor manufacturing method.
상기 (b) 단계에서의 균질화는,
기계적 교반, 초음파 처리, 호모지나이저로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 방법에 따라 수행되는 것인, 글루코즈 측정을 위한 바이오센서 제조방법.The method of claim 1,
Homogenization in step (b),
Mechanical agitation, ultrasonic treatment, which is performed according to any one or more methods selected from the group consisting of a homogenizer, a biosensor manufacturing method for glucose measurement.
상기 (c) 단계에서의 중화는,
암모니아 용액, 수산화나트륨 용액, 수산화칼륨, 및 수산화칼슘으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 용액을 처리하여 중화하는 것인, 글루코즈 측정을 위한 바이오센서 제조방법.The method of claim 1,
The neutralization in step (c),
Ammonia solution, sodium hydroxide solution, potassium hydroxide, and neutralizing by treating any one or more solutions selected from the group consisting of calcium hydroxide, a method for producing a biosensor for glucose measurement.
상기 전극은 철, 금, 은, 동, 백금, 티타늄, 알루미늄, 팔라듐 및 인듐 주석 산화물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상으로 이루어지는 전극인, 글루코즈 측정을 위한 바이오센서 제조방법.The method of claim 1,
The electrode is an electrode consisting of at least one selected from the group consisting of iron, gold, silver, copper, platinum, titanium, aluminum, palladium, and indium tin oxide, a biosensor manufacturing method for glucose measurement.
상기 (d) 단계 이전에 전극을 피라냐 용액에 1분 내지 10분간 담그고, 10분 내지 30분간 초음파처리하여 건조시키는 것을 포함하는 것인, 글루코즈 측정을 위한 바이오센서 제조방법.The method of claim 1,
Before the step (d), the electrode is immersed in a piranha solution for 1 minute to 10 minutes, and sonicated for 10 minutes to 30 minutes to dry the biosensor for glucose measurement.
상기 (e) 단계에서 전극에 첨가되는 활성제는, EDC-NHS 또는 DCC인 것인, 글루코즈 측정을 위한 바이오센서 제조방법.The method of claim 1,
The active agent added to the electrode in step (e) is EDC-NHS or DCC, a biosensor manufacturing method for glucose measurement.
상기 글루코즈 측정을 위한 바이오센서는 직접 전자 전달을 이용하는 것인, 글루코즈 측정을 위한 바이오센서.The method of claim 11,
The biosensor for glucose measurement is to use direct electron transfer, a biosensor for glucose measurement.
글루코즈 옥시다제를 포함하는 전극을 포함하는 글루코즈 측정을 위한 바이오센서로서, 여기서 키토산-다중벽 탄소나노튜브 나노하이브리드는 활성제를 통해 글루코즈 옥시다제와 결합된 것인, 글루코즈 측정을 위한 바이오센서.Multi-walled carbon nanotubes having a diameter of 20 to 30 nm and a length of 10 to 30 μm and chitosan having a deacetylation degree of 75 to 85% and a molecular weight of 50,000 to 190,000 Daltons, and chitosan is a multi-walled carbon nanotube Chitosan-multi-walled carbon nanotube nanohybrid in the form surrounding the; And
A biosensor for glucose measurement comprising an electrode comprising glucose oxidase, wherein the chitosan-multi-walled carbon nanotube nanohybrid is coupled with glucose oxidase through an activator.A biosensor for glucose measurement.
키토산-다중벽 탄소나노튜브 및 글루코즈 옥시다제가 활성제를 통해 고정되고 키토산-다중벽 탄소나노튜브가 전극의 표면 층에 전기 화학적 공유 결합에 의해 고정된 것을 특징으로 하는 글루코즈 측정을 위한 바이오센서.
An electrode layer, chitosan-multi-walled carbon nanotubes, and glucose oxidase,
A biosensor for glucose measurement, characterized in that chitosan-multi-walled carbon nanotubes and glucose oxidase are fixed through an activator, and chitosan-multi-walled carbon nanotubes are fixed by electrochemical covalent bonding to the surface layer of the electrode.
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