KR20200132052A

KR20200132052A - 생체 적합성 하이드록시아파타이트 결정 및 이의 제조 방법

Info

Publication number: KR20200132052A
Application number: KR1020190056878A
Authority: KR
Inventors: 김해원; 이정환; 파텔카필데브
Original assignee: 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단
Priority date: 2019-05-15
Filing date: 2019-05-15
Publication date: 2020-11-25
Also published as: KR102243103B1

Abstract

본 발명은 생체 적합성 하이드록시아파타이트 결정 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 상세하게는 a) 계면활성제 및 질산칼슘을 증류수에 용해시키는 단계; b) 상기 a) 결과물의 pH를 3.5 내지 10.5의 범위 내에서 조절하는 제1용액 제조 단계; c) 인산암모늄을 탈이온수에 첨가하는 제2용액 제조 단계; 및 d) 상기 제1용액과 제2용액을 혼합하여 얻은 혼합물을 세척 및 건조하여 하이드록시아파타이트 결정을 수득하는 단계; 를 포함하는 생체 적합성 하이드록시아파타이트 결정 제조방법 및 이에 의해 제조된 하이드록시아파타이트 결정을 제공한다.

Description

생체 적합성 하이드록시아파타이트 결정 및 이의 제조 방법 {Biocompatible hydroxyapatite crystal and preparation method thereof}

본 발명은 생체 적합성 하이드록시아파타이트 결정 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

의료용 임플란트, 인공 고관절, 골지지체 등 생체 이식용 임플란트의 재료로, 티타늄, 스테인레스 스틸 합금, 코발트-크롬 합금과 같은 금속 재료, 알루미나, 지르코니아와 같은 생체 불활성 세라믹 재료가 널리 사용되고 있다. 이러한 생체 이식용 임플란트의 재료 중에서, 생체 이식용 금속 또는 합금은 세라믹스와 같은 다른 재료에 비해 강도, 피로저항성 및 성형가공성이 우수하여 현재까지도 골 결손 및 회손 부위의 재생 및 치료를 목적으로, 치과, 정형외과 및 성형외과에서 가장 널리 사용되고 있는 생체 재료이다. 금속 또는 합금 중 에서도 다른 금속재료에 비해 내식성이 우수하고 인체 조직 내에서도 안정한 티타늄 및 티타늄 합금 등이 치과용, 정형외과 및 성형외과용 임플란트 소재로 가장 널리 사용되고 있다.

지난 수년간 체내에 삽입시 조직 내에서의 적합성을 향상시키기 위하여, 금속 또는 합금의 표면적을 늘리고 표면 형상을 변화시키거나 물리적, 화학적, 생물학적 표면처리를 통해 골융합을 향상시키고자 하는 시도가 이루어지고 있다.

전기 영동 증착(EPD, electrophoretic deposition) 기술은 금속 임플란트 표면의 생물 의학적 코팅에 널리 사용되어왔다. 금속 표면 개질을 위한 EPD 재료에는 무기 입자(탄소 나노 튜브(A.R. Boccaccini et al., Carbon 44(15), 2006, 3149-3160; K.D. Patel et al., ACS Appl. Mater. Interfaces 6(22), 2014, 20214-20224), 생체 활성 유리(F. Pishbin et al., J. Eur. Ceram. Soc. 30(14), 2010, 2963-2970), 하이드록시아파타이트(R. Drevet et al., Surf. Coat. Technol. 301, 2016, 94-99; X.F. Xiao et al., Mater. Lett. 60(21-22), 2006, 2627-2632), 인산 칼슘(R. Damodaran et al., Colloids Surf. A: Physicochem. Eng. Aspects 80(2), 1993, 191-195)와 천연 고분자(키토산(A. Simchi et al., Mater. Lett. 63(26), 2009, 2253-2256), 젤라틴(Z. Zhang et al., J. Mater. Chem. B 4(47), 2016, 7584-7595), 실크피브로인(silk fibroin)(R. Elia et al., J. Biomed. Mater. Res.: Part B, Appl. Biomater. 103(8), 2015, 1602-1609)이 사용되어 왔다. EPD 코팅은 세포의 반응에 영향을 줄 수있는 마이크로-나노 범위의 구조를 갖는 다양한 표면을 생성한다(D. Zhitomirsky et al, J. Mater. Process. Technol. 209(4), 2009, 1853-1860; J. Cho et al, J. Nanopart. Res. 10(1), 2008, 99-105; Z. Zhang et al., MRS Proc. 703, 2011). 생체 물질의 나노 구조 표면은 세포-기질 상호작용 통해 세포 행동을 제어하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(K.D. Patel et al, ACS Appl. Mater. Interfaces 7(48), 2015, 26850-26859; P.P. Lee et al., Nano Lett. 14(9), 2014, 5021-5028). EPD의 장점 중 하나는 시작 입자의 특성(모양 및 크기)을 이용하여 코팅의 나노/마이크로 구조를 제어하는 것이다. 예를 들어, 실리카 나노 튜브와 CNTs의 나노 튜브 형태는 EPD 공정에 의해 티타늄에 구현된 바 있다(K.D. Patel et al., ACS Appl. Mater. Interfaces 6(22), 2014, 20214-20224; K.D. Patel et al., ACS Appl. Mater. Interfaces 7(48), 2015, 26850-26859; P.P. Lee et al., Nano Lett. 14(9), 2014, 5021-5028). 또한, 하이드록시아파타이트 및 키토산-티타니아 나노 입자 복합체의 나노 구조화 된 코팅 또한 EPD에 의해 생의학 응용을 위해 생산되었다(L. Cordero-Arias et al., RSC Adv. 3(28), 2013, 11247-11254; R. Rojaee et al., Appl. Surf. Sci., Part B 285, 2013, 664-673). 최근, 다양한 모양과 크기의 하이드록시아파타이트(HA) 나노 입자가 중요한 관심 대상이 되고있다. HA 코팅이 골 유착을 크게 개선하고 뼈 대체물로 사용될 수 있기 때문에 티타늄과 티타늄 합금은 HA 나노 입자에 의한 표면 개질에 사용된 바 있다. HA 코팅에 의한 약물전달의 정형외과적 적용에 대한 여러 연구가 보고된 바 있다(M.T. Islam et al., J. Tissue Eng. 8, 2017, 2041731417719170;K. Dashnyam et al., J. Tissue Eng. 8, 2017, 20417314177073390). 반코마이신(vancomycin)(J. Tu et al., J. Mater. Sci., Mater. Med. 23(10), 2012, 2413-2423). 토브라마이신(tobramycin)(M. Stigter et al., Biomaterials 23(20), 2002, 4143-4153), 암피실린(ampicillin)(K.D. Patel et al., J. Mater. Chem. 22(47), 2012, 24945-24956), 젠타마이신(gentamicin)(V. Alt et al., Biomaterials 27(26), 2006, 4627-4634)과 같은 항균제가 HA 코팅에 의한 약물전달에 사용되었다. 또한, 최근의 다른 추세는 HA 나노 입자에 금속/이온을 결합시킨 것으로 임플란트 표면 개질에 사용된다. 금속/이온의 결합의 주된 장점은 뼈 임프란트 골 유착, 항균 활성(Ag 이온)(X. Lu wt al., J. R. Soc. Interface 8(57), 2011, 529-539; A.A. Yanovska et al., Mater. Sci. Eng. C 36, 2014, 215-220), 혈관 신생(Cu, Co, Si 및 Sr 이온)과 같은 생체 기능을 향상시키는 것이다(K. Dashnyam et al., Tissue Eng. 8 (2017), 2041731417707339; J.H. Sorensen et al., Curr. Drug Deliv. 11(4), 2014, 501-510; J.V. Rau et al., J. Biomed. Mater. Res. Part B: Appl. Biomater. 103(8), 2015, 1621-1631; C. Capuccini et al., Acta Biomater. 4(6), 2008, 1885-1893; J.H. Lee et al., Acta Biomater. 60, 2017, 93-108). 또한, HA 나노 결정질에 비해 이트륨 도핑 된 나노결정질 하이드록시아파타이트 코팅된 티타늄에 증가된 조골 기능을 발견했다. 또한, 전통적인 HA 나노 결정질 코팅과 비교하여 이트륨을 도핑한 나노 결정질 HA 코팅에서 조골 세포에 의한 칼슘 침착량이 증가했다(M. Sato et al., Biomaterials 27(11), 2006, 2358-2369). 다공성 티타늄 표면에 키토산/하이드록시아파타이트 복합 코팅이 당뇨병 상태에서 골 유착을 촉진한다는 것이 밝혀진 바 있다(X.Y. Ma et al., Biomaterials 35(26), 2014, 7259-72700). HA 코팅을 포함하는 은의 또 다른 연구는 세포 독성에 대한 유의한 변화없이 생체 내(in vivo) 실험에서 항균활성 잠재력을 나타냈다. 경조직으로 잘 알려진 무기 나노성분인 HA는 EPD를 포함한 다양한 기법의 임플란트 코팅재로 널리 사용되고 있다(R. Rojaee et al., IEEE Trans. NanoBiosci. 13(4), 2014, 409-414; M. Hadidi et al., Surf. Coat. Technol. 321, 2017, 171-179).

그러나, 현재까지 HA의 결정 형태에 따른 생체 적합성 또는 HA 결정형을 이용한 금속 코팅의 생체 적합성에 대해 보고된 바 없다.

본 발명자들은 HA 생산 과정에 pH를 조절하여 3가지의 HA 결정 형태를 얻었다. 작은 크기의 구형태 HA(이하, SHA), 중간 크기의 막대 형태 HA(이하, MHA) 및 큰 크기의 와이어 형태 HA(이하, LHA)를 발견하여, 이들 HA 나노 결정을 EPD에 의한 금속 코팅에 사용하는 경우, 세포 증식, 세포 부착 및 세포 확산의 측면에서 높은 생체 적합성을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 생체 적합성 하이드록시아파타이트 결정을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 생체 적합성 하이드록시아파타이트 결정의 생산방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 생체 적합성 하이드록시아파타이트 결정을 이용하여 금속을 코팅하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 되나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 a) 계면활성제 및 질산칼슘을 증류수에 용해시키는 단계; b) 상기 a) 결과물의 pH를 3.5 내지 4.5 또는 9.5 내지 10.5로 조절하는 제1용액 제조 단계; c) 인산암모늄을 탈이온수에 첨가하는 제2용액 제조 단계; 및 d) 상기 제1용액과 제2용액을 혼합하여 얻은 혼합물을 세척 및 건조하여 하이드록시아파타이트 결정을 수득하는 단계; 를 포함하는 생체 적합성 하이드록시아파타이트 결정 제조방법을 제공한다.

본 발명의 하이드록시아파타이트 결정은 골 형성 세포를 증식 및 확산시키고 하이드록시아파타이트 코팅에 세포가 잘 융합될 수 있는 표면을 갖도록 하며, 이는 본 발명엥서 rMSC 세포의 증식, 세포 확산, 세포 부착 등의 효과를 통해 확인하였다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 b) 단계의 pH는 9.5 내지 10.5 이다 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 b) 단계의 pH는 10이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 방법에 의해 제조된 하이드록시아파타이트 결정은 와이어(wire) 형태를 갖는다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 와이어(wire) 형태 하이드록시아파타이트의 직경은 25nm 내지 35nm이고, 제타전위는 -9mV 내지 ―6mV이고, 표면적은 13m²/g 내지 15m²/g이다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 와이어(wire) 형태 하이드록시아파타이트의 직경은 30±5nm이고, 제타전위는 -7.5±0.8mV이고, 표면적은 13.5m²/g이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 b) 단계의 pH는 9.5 내지 10.5이고, 상기 c) 단계의 제2용액 제조에 있어서 상기 탈이온수에 인산암모늄과 함께 추가적으로 구연산나트륨을 첨가하고, 상기 d) 단계의 제1용액과 제2용액의 혼합물은 구연산: 칼슘의 몰비가 1:1인 생체 적합성 하이드록시아파타이트 결정 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 방법에 의해 제조된 하이드록시아파타이트 결정은 막대(rod) 형태를 갖는다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 막대(rod) 형태 하이드록시아파타이트의 직경은 22nm 내지 28nm이고, 제타전위는 -8mV 내지 ―6mV이고, 표면적은 49m²/g 내지 51m²/g이다. 본 발멸의 다른 구현예에 따르면 상기 막대(rod) 형태 하이드록시아파타이트의 직경은 25±3nm이고, 제타전위는 -7.2±0.5mV이고, 표면적은 50.2m²/g이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 b) 단계의 pH는 3.5 내지 4.5이며, 상기 c) 단계의 제2용액 제조에 있어서 상기 탈이온수에 추가적으로 구연산나트륨을 첨가하며, 상기 d) 단계의 제1용액과 제2용액의 혼합물은 구연산: 칼슘의 몰비가 1:1인 생체 적합성 하이드록시아파타이트 결정 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 방법에 의해 제조된 하이드록시아파타이트 결정은 구형 형태를 갖는다.

본 발명의 일 구현예에 따르면 상기 구형 형태 하이드록시아파타이트의 직경은 40nm 내지 50nm이고, 제타전위는 -8mV 내지 ―6mV이고, 표면적은 98 내지 99m²/g이다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면 상기 구형 형태 하이드록시아파타이트의 직경은 45±5nm이고, 제타전위는 -7.3±0.7mV이고, 표면적은 98.62m²/g이다.

본 발명의 다른 양태는 상기 하이드록시아파타이트 결정 수득 단계 후에 a) 상기 하이드록시아파타이트 결정의 에탄올 용액을 제조하는 단계; b) 상기 하이드록시아파타이트 결정 용액과 키토산 용액을 혼합 후 pH를 3 내지 4로 유지시켜 현탁액을 제조하는 단계; 및 c) 상기 현탁액을 이용하여 EPD를 수행하여 금속 코팅을 수행하는 단계;를 추가적으로 포함하는 생체 적합성 하이드록시아파타이트의 금속 코팅 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 b)에서 하이드록시아파타이트 결정 용액의 농도는 0.15 내지 0.25mg/ml이고, 키토산 용액의 농도는 0.08 내지 0.15mg/ml이다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 하이드록시아파타이트 결정이 구 형태인 경우 하이드록시아파타이트 용액의 농도는 0.15mg/ml이고, 키토산 용액의 농도는 0.08mg/ml이다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 하이드록시아파타이트 결정이 막대(rod) 형태인 경우 하이드록시아파타이트 용액의 농도는 0.2mg/ml이고, 키토산 용액의 농도는 0.1mg/ml이다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 하이드록시아파타이트 결정이 와이어(wire) 형태인 경우 하이드록시아파타이트 용액의 농도는 0.25mg/ml이고, 키토산 용액의 농도는 0.15mg/ml이다.

본 발명은 하이드록시아파타이트 결정 및 이의 제조방법을 제공한다. 본 발명은 상기 하이드록시아파타이트 결정으로 금속을 코팅하는 방법을 제공하여 생체 적합한 금속 코팅을 제공한다.

도 1은 HA 나노결정의 특징을 나타냈다. (a)는 SHA, MHA, LHA의 TEM 이미지를 나타낸다. (b)는 XRD 패턴을 나타낸다. (c)는 제타 전위를 나타낸다. (d)는 N2-흡착 및 탈착 등온선을 나타낸다.
도 2(a)는 SHA, MHA 및 LHA 코팅의 표면 형태를 SEM 고배율 및 저배율 이미지로 나타낸다. (b)는 5분 간격으로 EPD 동안 중량 증가를 나타낸다. (c)는 25V의 전압을 가하였을 때 EPD 동안 중량 증가를 나타낸다.
도 3은 1일, 4일, 7일 동안 CCK 분석을 통해 HA 코팅 표면에서 rMSC의 세포 생존을 나타낸다.
도 4는 HA 코팅 표면에서 세포 부착 및 세포 확산을 포함하는 rMSC의 초기 반응을 나타낸다. (a)는 HA 코팅 표면에 부착된 세포의 형광 이미지를 DAPI-핵(청색), F-actin(녹색)으로 염색하여 4, 12, 24 시간 동안 관찰한 결과이다. (b)는 세포 부착 수를 나타내며, (c)는 총 세포 확산 면적을 나타낸다. *는 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다(*p<0.05).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명한 것이다,

실시예 1 : 재료 및 방법

재료

순수 티타늄(Ti, Senulbio Biotech, Korea), CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide, Sigma-Aldrich, India), 수산화 암모늄(NH₄OH, 28 %, Sigma, USA), 질산칼슘(Ca(NO₃)₂ → 4H₂O, Sigma 미국, Aldrich), 제2인산암모늄((NH₄)₂HPO₄); 구연산나트륨(trisodium citrate, Sigma-Aldrich, 독일), 아세트산(98%, Sigma-Aldrich, Germany), 키토산(MW = 200kDa, 85 %, Sigma-Aldrich, 미국)을 사용하였다. 모든 화학 물질은 시약 등급이며 추가 정제 없이 사용하였다.

실험 방법

HA 나노 결정은 수열 공정(hydrothermal process)으로 합성되었다. 0.1g CTAB 및 2mM 질산칼슘을 60㎖ 증류수에 실온에서 용해시켰다. 다음으로, 소량의 NH₄OH 또는 HCl을 사용하여 pH 값을 4 내지 10으로 조정하여 용액 A를 형성시켰다. 이어서, 2mM의 구연산나트륨 및 1.2mM의(NH₄)₂HPO₄를 15mL의 탈 이온수에 첨가하여 용액 B를 형성시켰다. 10분 동안 격렬히 교반한 후, 두 용액 A 및 B를 혼합하여 구연산/칼슘 몰 비를 1로 만들었다. 추가로 1 시간 동안 교반 한 후, 용액을 테플론 병에 옮기고 스테인레스 오토 클레이브 밀봉하고, 190℃에서 24시간 동안 유지시켰다. 침전물을 자연 냉각시킨 후 원심 분리로 분리하고 순차적으로 탈 이온수와 에탄올로 세척한 다음 80℃에서 24시간 동안 건조시켜 추가로 사용할 수 있도록 HA 나노 결정 시료를 얻었다.

구체적으로, 본 발명에 사용된 크기, 모양 및 형태가 상이한 LHA, MHA, SHA 나노 결정을 얻기 위하여 pH 범위를 조절하였다. 구연산염이 없는 경우 pH10에서 나노 와이어(wire) 형태의 HA(LHA) 결정을 형성하고, 구연산염(구연산/칼슘 몰비 1)이 존재하는 경우 동일한 pH에서 막대(rod) 형태의 HA(MHA) 결정을 형성하였다. 마지막으로, 작은 크기의 HA(SHA)가 구연산염의 존재하에 pH4에서 합성되었다. 결정 형태의 변화는 pH 변화에 기초하여 설명될 수 있으며, 핵심생성(nucleation)에 관여하는 OH 이온의 양은 c 축 방향을 따라 결정 성장을 유도하는 것으로 알려져 있다한다고 여겨진다(Y. Huang et al., Nanoscale 4(7), 2012, 2484-2490).

또한 준비된 HA 나노 결정은 투과 전자 현미경(TEM, JEOL7100), X-선 회절(XRD, Rigaku, 일본), 제타-전위(Zetasizer Nano; Malvern Instrument, 영국) 및 Brunauer-Emmett-Teller(BET, Quantachrom Instruments, UK)에 의해 특성화하였다.

EPD 현탁액은 25vol% 에탄올 50mL에 SHA, MHA 및 LHA 나노 입자 7.5, 10.0 및 12.5mg을 각각 첨가하여 제조하였다. 30분 초음파 처리 후 균질 현탁액을 수득하였다. 또한, SHA, MHA 및 LHA 용액에 농도 1mg/mL의 키토산 용액 4.0mL, 5.0mL 및 7.5mL를 각각 첨가하였다. 최종 현탁액의 pH3.7은 아세트산의 첨가에 의해 유지되었다. HA의 EPD 동안, 전극 거리는 10mm의 간격으로 유지되었다. HA 및 키토산 농도의 세부 사항은 표 1에 열거되어있다. 초기에는 HA 나노 입자가 음전하를 띠고 키토산 첨가 후 양전하를 띠게되므로 음극 EPD가 수행되었다.

실험군	HA 농도(mg/mL)	Chi 농도(mg/mL)
SHA	0.15	0.08
MHA	0.20	0.10
LHA	0.25	0.15

티타늄(Ti)과 스테인레스 스틸(SS) 전극은 각각 음극과 양극으로 사용되었다. EPD를 수행하기 전에 티타늄 기판을 2000-그릿 탄화 규소 연마지에서 연마하고 증류수, 에탄올 및 아세톤에서의 초음파 처리로 각각 세정했다. 2개의 전극 사이의 거리는 10mm에서 고정되었고 시간과 전압과 같은 다양한 변수에서 증착이 수행되었다. EPD 공정은 DC 필드(N5771A, 300V / 5A, Agilent Tech.) 전원 공급 장치에서 수행되었다. 코팅의 표면 형태는 2분 동안 백금 코팅 후 동안 주사 전자 현미경(SEM; Tescan Mira II LMH, 체코)으로 특성화하였다. 일정한 전압 및 일정한 증착 시간에서의 변화하는 증착 시간 및 인가된 전압에서의 EPD 동안의 중량 증가를 각각 EPD 전후의 중량을 측정함으로써 추가로 분석하였다. 쥐 중간엽 줄기 세포(rMSCs, Rat mesenchymal stem cells)는 이전에 기술된 대로 분리되고 배양되었다(J.E. Mate Sanchez de Val et al., Clin. Oral Implants Res. 27(11), 2016, 1331-1338). rMSC의 세포 생존력은 세포 계수 키트(CCK-8) 분석에 의해 수행되었다. 한 샘플 당 1×10⁴개의 세포를 각 샘플에 분주하고, 성장 배지(1% PS 및 10% FBS를 함유하는 a-MEM)가 있는 5% CO₂로 습윤시킨 37℃의 배양기에서 1, 4 및 7일 동안 배양하였다. 모든 세포 실험에서, 4 번째 계대의 rMSC를 사용하였고, 배양 배지는 수확할 때까지 2일마다 갈아주었다. 1일, 4일 및 7일 후, 샘플을 24 웰 플레이트의 새로운 웰로 옮기고 CCK-8 분석을 수행하였다(J.J. Kim et al., ACS Appl. Mater. Interfaces 9(3), 2017, 2059-2073). 다양한 배양 기간, 즉, 4, 12 및 24시간에서의 초기 세포 부착 형태는 형광 현미경(IX7151 Olympus, Japan)에 의해 관찰되었다. 이를 위해 4 % 파라포름알데히드로 세포 배양된 시료를 10분 및 5분 동안 0.1 % Triton X-100으로 처리하였다. 그런 다음 비특이적 단백질 결합을 방지하기 위해 30분 동안 PBS 중 1 %(w/v) BSA로 블록킹한 다음 PBS로 희석한 20nM Alexa Fluor 546-conjugated Phalloidin(녹색)으로 처리하여 F-액틴을 염색하였다. 핵은 또한 4',6 diamidino-2-phenylindole(DAPI;파란색)로 염색되었다. 마지막으로, 초기 세포 부착 수(4, 12 및 24시간) 및 확산 면적을 ImageJ 소프트웨어(NIH)에 의해 평가하였다.모든 데이터는 평균±표준 편차로 표시하였으며, 통계 분석은 ANOVA(one-way analysis of variance)를 사용하여 수행하였고, 유의수준은 *p <0.05에서 고려되었다.

실시예 2: HA 나노 결정의 특성 확인

다양한 크기의 HA 나노 결정의 TEM 이미지가 도 1(a)에 제시되어있다. HA의 세 가지 다른 유형; 소형 HA(SHA), 중형 HA(MHA) 및 대형 HA(LHA) 결정이 각각 나노 구 형태, 나노 막대(rod) 형태 및 나노 와이어(wire) 형태로 표시된다. SHA 결정의 크기 분포는 평균 길이 80nm±10nm, 직경 45nm±5nm로 나타났다. MHA 결정의 크기 분포는 평균 길이 300±50nm, 직경 25±3nm로 나타났다. LHA 결정의 평균 길이는 900±100nm와 직경 30±5nm이다. 또한, 3 종의 HA 나노 결정은 모두 증류수에 잘 분산되어 있었다. HA의 결정의 전형적인 X 선 회절(XRD) 패턴은 도 1(b)에 나타냈다. XRD 결과는 HA 입자의 결정상을 확인하였다. 2θ~39.8 에서 피크 팽창에 변화가 있었으며(K. Venkateswarlu et al., Physica B: Condensed Matter 405(20), 2010, 4256-4261), 피크 팽창에서의 이러한 변화는 주로 입자 크기의 변화에 기인하며, 강도의 변화는 입자의 결정질 및 비정질 성질에 기인한다(J.E. Matι Sαnchez de Val wt al., Clin. Oral Implants Res. 27(11), 2016, 1331-1338). 모든 HA 나노 결정의 표면 전하는 도 1(c)에 나타낸 바와 같이 제타 전위 측정에 의해 특성화되었다. HA 나노 결정의 물리적 특성을 표 2에 나타내었다.

실험군	길이(nm)	직경(nm)	제타전위(mV)	표면적(m²/g)	형태
SHA	80±10	45±5	-7.3±0.7	98.62	나노스피어-유사
MHA	300±50	25±3	-7.2±0.5	50.2	나노막대-유사
LHA	900±100	30±5	-7.5±0.8	13.5	나노와이어-유사

제조 된 HA 나노 결정의 표면전하, 즉 제타 전위는 약 -5.2 내지 -5.8mV이었다. 또한, 도 1(d)에 나타낸 바와 같이, EPD 및 코팅 밀도 동안 키토산 흡착에 중요한 매개 변수인 HA 나노 결정의 표면적은 BET 방법으로 분석하였다. 모든 HA 샘플은 거의 무시할 만한 / 좁은 히스테리시스 루프(hysteresis loop) 면적을 갖는 전형적인 타입 IV 등온선을 나타냈다. 주어진 압력 영역에서 SHA 샘플에서 흡수된 체적에 유의한 증가가 측정되었다. 샘플의 표면적은 입자 크기가 LHA에서 MHA에서 SHA로 감소함에 따라 증가했다. SHA의 표면적은 이들 3 가지 샘플 중에서 최대(98.62㎡/g)이고 LHA는 최소(13.5m²/g)이며 MHA 표면적은 50.2m²/g이다.

실시예 3: HA 나노 결정 코팅의 특성

HA 코팅의 SEM 표면 형태는 도 2(a)에 나타내었다. LHA 코팅의 고배율 SEM 이미지는 입자가 키토산 접착제를 통해 서로 강하게 연결되어 있음을 나타낸다. 높은 표면 다공성도 LHA 코팅에서 관찰될 수 있다. 한편, MHA 및 SHA 코팅은 LHA 코팅에 비해 치밀하고 고도로 나노 구조화된 표면을 나타낸다. HA 코팅의 3 가지 다른 유형의 SEM 관찰은 침전물의 입자 크기가 TEM 크기와 유사하다는 것을 보여 주어, pH 3.7에서 EPD 동안 HA의 분해가 없었음을 나타낸다. 나노 구조 코팅에 키토산의 역할도 중요하며, 키토산은 현탁액 중의 HA 나노 결정의 표면 전하를 조정함으로써 EPD 동안 중요한 역할을 했다. 또한, 키토산의 존재는 성공적인 음극 EPD를 위한 HA의 표면 전하를 조정할 뿐만 아니라 코팅의 높은 기계적 안정성을 제공한다는 것에서 중요한 요소이다. 이러한 결과는 뼈 조직 재생 응용을 위한 HA 나노 입자의 제어 된 나노 구조 코팅의 생성에 중요한 의미를 갖는다.

증착 속도는 일정한 인가 전압 및 시간에서 각각 증착 시간 및 인가 전압을 변화시켜 EPD 동안 얻은 중량을 측정함으로써 분석하였다. 도 2(b)는 일정한 증착 시간 동안 5분 간격으로 인가된 전압에 대한 전극의 중량 침적을 보여준다. 증착 중량은 인가된 전압에 따라 선형 증가를 보여, HA의 EPD 반응이 전압에 선형적으로 관련되고 균일한 필름 성장을 나타냄을 암시한다. 40V에서 전압 강하를 일으키는 필름 형성으로 인해 증착 중량이 포화된다. 다음으로, 도 2(c)에 나타낸 바와 같이, 일정한 인가 전압 25V에서의 증착 시간 변화에 대한 중량 증가를 측정하였다. 증착 시간이 증가하면 증착 중량이 증가하고 증착 6 분 후에는 증착 속도가 느려졌다. 증착 속도는 두꺼운 코팅층의 형성으로 인해 시간이 증가함에 따라 감소한다. 일정한 증착 시간 후, 코팅층은 절연체로 작용할만큼 충분히 두껍게 되어 잠재적으로 전위 강하를 일으켰다. SHA 현탁액에서의 높은 증착 수율은 현탁액 안정성의 향상 및 작은 크기의 밀집한 막 형성에 기인한 것이다. SHA의 표면적이 크면 표면에 키토산 분자의 상호 작용 /흡착이 높아져 궁극적으로 높은 증착 수율을 얻을 수 있다. 키토산 흡착 메카니즘은 EPD 동안 산성(pH 3.7) 환경에서 HA의 OH그룹과 관계된다(I.S. Harding et al., Biomaterials 26(34), 2005, 6818-6826). 따라서, HA 표면 상에 키토산 분자의 흡착은 EPD 현탁액의 제타 전위를 양으로 변화시키고 음극 침착을 달성하게 한다.

실시예 4: HA 나노 입자 코팅에 대한 세포 생존 및 증식 분석

랫트 중간엽 줄기 세포(rmsC)는 HA 코팅에서 세포 증식와 세포 확산을 연구하기 위해 사용되었다. rMSC의 세포 증식은 CCK-8 분석에 의해 평가되었다. 1, 4, 7 일 동안 HA 코팅을 한 세포 배양에서 세포 증식을 측정하였다. 1일 후에는 코팅 사이에 차이를 보이지 않았다(도 3). 그러나, 세포 배양 4일 동안 SHA 및 MHA 코팅에서 유의하게 높은 세포 증식이 관찰되었다. SHA 및 MHA 코팅에 대한 유사한 세포 증식 추세도 7 일 동안 측정하였다. SHA 및 MHA 코팅 표면에서 보다 높은 세포 증식은 Ca 이온 방출에 기초하여 설명될 수 있다. SHA의 높은 표면적은 MHA와 LHA의 중간 및 낮은 표면적에 비해 더 높은 Ca 이온의 방출을 허용할 수 있었다(A.C. Durham et al., Biosci. Rep. 2(1), 1982, 15-30). SHA와 MHA 코팅 표면에서 높은 세포 증식이 가능한 또 다른 이유는 나노 구체와 나노 막대(rod) 형태의 HA 결정 구조의 높은 표면적 때문일 수 있다. 입자에 대한 높은 단백질 흡착을 가능하게 하는 것은 표면적과 양의 상관 관계가 있다(S. Pezzatini et al., J. Biomed. Mater. Res. Part A 76A(3), 2006, 656-663). 나노 크기의 입자가 단백질을 많이 흡착하고 후속 세포 부착 및 증식을 촉진한다는 보고도 있다(M. Rouahi et al., Colloids Surf.B: Biointerfaces 47(1), 2006, 10-19; Y. Cai et al., J. Mater. Chem. 17(36), 2007, 3780-3787). 따라서 이러한 결과는 SHA 및 MHA 코팅 티타늄 표면은 4 일 후에 rMSC 세포 증식을 향상시킬 수 있음을 나타낸다.

실시예 5: HA 나노 입자 코팅에 대한 세포 확산 및 부착 분석

초기 세포-물질 상호 작용을 이해하기 위해 코팅 상에 rMSC를 배양하고 세포 고정 및 확산 행동을 비롯한 초기 세포 현상을 분석했다. 도 4(a)는 4시간, 12 시간 및 24시간에 HA 코팅에 부착 된 세포의 형광 이미지를 나타낸다. 세포는 DAPI(청색, 핵) 및 phalloidin(녹색, F-actin)으로 염색하였다. 세포 분주 4시간 이후 대부분의 세포는 구형 형태를 나타내지만 SHA 및 MHA 코팅과 비교하여 LHA에서 유의한 높은 세포 확산 면적을 측정하였다. 그러나, 세포 배양 12 시간 후에 MHA 및 LHA 코팅에 높은 확산 형태가 나타났다. SHA 코팅의 세포는 둥근 모양이었고 일부 세포가 확산되기 시작했다. 24 시간 후에, 거의 모든 세포가 MHA 및 LHA 코팅에 부착되고 확장된 세포 골격 및 사상위족 연장(filopodia extension)을 나타냈다. 24시간 세포 배양 시 세포 골격의 발현 차이는 SHA 표면과 비교하여 다른 형태(polygonal shape)를 보였으며, MHA와 LHA 표면은 연장된 사상위족이 있는 방추형 및 스파이크형을 나타냈다.

또한, 초기 세포 부착 수와 세포 확산 면적은 ImageJ 소프트웨어(NIH)에 의해 정량화하여 도 4(b)와(c)에 나타내었다. 세포 배양 4시간 후 대부분의 세포는 유사한 구형 형태를 보였으나 LHA 코팅과 비교하여 MHA에서 더 높은 세포 부착 수를 측정 하였다. 4 시간 배양 후 SHA와 LHA 코팅 표면 사이에 세포 부착 수의 유의한 차이는 없었다. MHA 코팅에 고정된 세포 수는 SHA 코팅뿐만 아니라 LHA에 비해 현저히 높았다. 그러나, SHA 코팅은 세포 배양 12 시간 후에 LHA와 비교하여 높은 세포 부착을 나타내었다. 유사한 경향이 세포 배양 24 시간 후에 관찰되었다. HA 코팅의 세포 부착 수치는 MHA>SHA>LHA 순서로 나타났다. SHA 및 LHA에 비해 MHA에서의 높은 세포 부착력은 크기 의존적인 나노형태-세포 상호 작용에 기초하여 설명될 수 있다(C.W. Kuo et al., J. Nanobiotechnol. 12, 2014, 54; N. Anh Tuan et al., J. Phys.: Condensed Matter 28(18), 2016, 183001). 300±50nm 크기의 HA(MHA)로 코팅된 표면이 세포 부착에 더 유리하다는 것을 확인할 수 있었다.

총 세포 확산 결과는 4 시간의 세포 배양에서 SHA 및 MHA 코팅 표면과 비교하여 LHA에서 현저히 높은 세포 면적을 보였다. 그러나 12시간 후 MHA 코팅의 세포 확산 면적은 SHA와 LHA에 비해 높았으며, LHA의 세포는 SHA 코팅에 비해 높은 확산 면적을 나타냈다. 또한, SHA 코팅의 세포는 세포 확산 면적이 가장 낮았으며, 세포 배양 24 시간 후 MHA가 가장 큰 확산을 나타내었다. SHA 코팅의 총 세포 확산 면적은 모든 시점에서 가장 낮았다. MHA와 LHA에서 더 넓은 세포 확산 영역은 코팅 표면에 개방 공간(open-spaced)의 기공 구조가 존재하기 때문일 수 있으며, 이는 세포 이동과 세포 확산을 위해 더 큰 표면적을 제공한다. HA의 나노 복합체 코팅에 대한 초기 세포 부착 효과는 다른 곳에서도 보고된 바있다(A.C. Durham et al., Biosci. Rep. 2(1), 1982, 15-30; T.J. Webster et al., Biomaterials 20(13), 1999, 1221-1227; H.W. Kim et al., Biomaterials 26(25), 2005, 5221-5230) 이러한 결과는 MHA 및 LHA의 금속 표면 코팅이 세포 부착 및 확산에 유리하다는 것을 시사한다.

Claims

a) 계면활성제 및 질산칼슘을 증류수에 용해시키는 단계;
b) 상기 a) 결과물의 pH를 3.5 내지 4.5 또는 pH9.5 내지 10.5로 조절하는 제1용액 제조 단계;
c) 인산암모늄을 탈이온수에 첨가하는 제2용액 제조 단계; 및
d) 상기 제1용액과 제2용액을 혼합하여 얻은 혼합물을 세척 및 건조하여 하이드록시아파타이트 결정을 수득하는 단계; 를 포함하는 생체 적합성 하이드록시아파타이트 결정 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 b) 단계의 pH는 9.5 내지 10.5인 생체 적합성 하이드록시아파타이트 결정 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 b) 단계의 pH는 9.5 내지 10.5이고, 상기 c) 단계의 제2용액 제조에 있어서 상기 탈이온수에 추가적으로 구연산나트륨을 첨가하고, 상기 d) 단계의 제1용액과 제2용액의 혼합물은 구연산 : 칼슘의 몰비가 1:1인 것인 생체 적합성 하이드록시아파타이트 결정 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 b) 단계의 pH는 3.5 내지 4.5이며, 상기 c) 단계의 제2용액 제조에 있어서 상기 탈이온수에 추가적으로 구연산나트륨을 첨가하며, 상기 d) 단계의 제1용액과 제2용액의 혼합물은 구연산: 칼슘의 몰비가 1:1인 것인 생체 적합성 하이드록시아파타이트 결정 제조방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 생체 적합성 하이드록시아파타이트 결정.
제2항의 방법에 의해 제조된 와이어(wire) 형태를 갖는 하이드록시아파타이트 결정.
제6항에 있어서 직경이 25nm 내지 35nm이고, 제타전위가 -9mV 내지 ―6mV이고, 표면적인 13m²/g 내지 15m²/g인 하이드록시아파타이트 결정.
제4항의 방법에 의해 제조된 구형의 형태를 갖는 하이드록시아파타이트 결정.
제8항에 있어서 직경이 40nm 내지 50nm이고, 제타전위가 -8mV 내지 ―6mV이고, 표면적인 98 내지 99m²/g인 하이드록시아파타이트 결정.
제3항의 방법에 의해 제조된 막대(rod) 형태를 갖는 하이드록시아파타이트 결정.
제10항에 있어서 직경이 22nm 내지 28nm이고, 제타전위가 -8mV 내지 ―6mV이고, 표면적인 49m²/g 내지 51m²/g인 하이드록시아파타이트 결정.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서 상기 하이드록시아파타이트 결정 수득 단계 후에 다음의 단계를 추가적으로 포함하는 금속 코팅 방법:
a) 상기 하이드록시아파타이트 결정의 에탄올 용액을 제조하는 단계;
b) 상기 하이드록시아파타이트 결정 용액과 키토산 용액을 혼합 후 pH를 3 내지 4로 유지시켜 현탁액을 제조하는 단계; 및
c) 상기 현탁액을 이용하여 EPD를 수행하여 금속 코팅을 수행하는 단계;를 포함하는 생체 적합성 하이드록시아파타이트 결정의 금속 코팅 방법.