KR20200120261A - Itih1을 표적으로 하는 고혈당 관련 질환 치료용 저분자 화합물 기재 물질의 스크리닝 방법 - Google Patents

Itih1을 표적으로 하는 고혈당 관련 질환 치료용 저분자 화합물 기재 물질의 스크리닝 방법 Download PDF

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Abstract

본원은 ITIH1을 표적으로 하는 저분자 화합물 기재의 혈당 조절 물질의 스크리닝 방법을 개시한다. 본원에 따른 방법은 고혈당 상태에서 G13의 감소에 따른 OGT의 증가가 ITIH1의 안정성을 증가시켜 그 발현량이 증가한다는 발견에 근거한 것으로, ITIH1은 히알루론산에 결합하여 근육 및 지방세포에 침착하여 세포의 인슐린 민감성을 떨어뜨린다. 따라서 ITIH1를 표적으로 하여 이의 발현을 억제하는 물질을 혈당 조절이 필요한 질환의 치료제로 효과적으로 사용할 수 있다.

Description

ITIH1을 표적으로 하는 고혈당 관련 질환 치료용 저분자 화합물 기재 물질의 스크리닝 방법 {Method of screening nucleic acid based material targeting ITIH1 for treating disease related with hyperglycemia}
본 발명은 ITIH1을 표적으로 하는 고혈당 관련 질환 치료용 저분자 화합물 기재 물질의 분석 또는 스크리닝과 관련된 기술이다.
고혈당은 세포 또는 조직에 미치는 각종 스트레스, 독성 자극 및 염증으로 인해 빈번히 발생되며, 또는 비만 또는 당뇨를 포함한 전신 대사성 질환의 진행에도 수반된다. 고혈당은 간에서의 과도한 포도당 생성과 말초조직에서의 당 이용 저하 등 병리상황에 의하여 유도된다.
현재까지 고혈당 상황을 지표하는 정교하고 재현성 높은 바이오마커를 특정하기 어려웠으므로 특별한 타겟에 작용하는 고혈당 개선효능을 갖는 물질 탐색법이 미흡했다.
대한민국 특허 공개 공보 2013-0118658 (2013.10.30. 공개)는 폐경 후 여성의 당뇨병 치료를 위한 약학적 조성물에 관한 것으로, 에스트로겐에 인한 포도당불내인성을 개선하기 위해 타겟으로 PDK4 유전자를 표적으로하는 siRNA를 개시한다.
미국 특허 공개 공보 2005-0261223 (2005.11.24. 공개)는 RIP140를 이용한 글루코스 수송 조절에 관한 것으로 RIP140의 억제는 포도당 수송을 증가시켜 비정상적 포도당 대사 질병을 치료하기 위한 방법을 개시하며, 특정 표적의 제어에 siRNA의 사용을 개시한다.
따라서 고혈당을 유발하는 생물학적 기전에 근거하여, 이에 관여하는 분자의 활성을 효과적으로 조절함으로써 고혈당을 조절할 수 있는 물질의 효능 검증 또는 선별 방법이 절실하다.
본원은 신규한 표적 기반의 고혈당이 수반되는 질환 치료용 물질의 세포 기반 테스트 방법을 및 이를 이용한 ITIH1를 표적으로 하는 저분자 화합물 기반 물질의 스크리닝 방법을 제공하고자 한다.
한 양태에서 본원은 ITIH1을 발현하는 세포, 특히 간세포를 제공하는 단계; 상기 세포를 배양하는 단계; 상기 세포에 상기 ITIH1의 단백질 발현을 억제할 것으로 기대되는 저분자 화합물을 처리하는 단계; 및 상기 세포의 배양액 또는 상기 세포의 파쇄물(lysate)에서 ITIH1 단백질의 농도를 측정하는 단계; 및 상기 저분자 화합물로 처리된 세포의 배양액 또는 파쇄물에서 상기 IT1H1의 농도가 저분자 화합물로 처리되지 않은 대조군과 비교하여 감소한 경우, 상기 저분자 화합물을 혈당조절 후보물질로 선별하는 단계를 포함하는, 혈당조절이 필요한 질환 치료용의 저분자 화합물 기재 약물 스크리닝 방법을 제공한다.
일 구현예에 따른 방법에서 상기 세포는 고농도의 포도당에서 배양되고, 본원에서 규명된 기전에 따라 ITIH1 농도가 증가한다.
일 구현예에 따른 방법에서 상기 ITIH1은 세포가 배양된 배지 또는 상기 세포가 융해된(lysis) 파쇄물에서 검출될 수 있다.
일 구현예에 따른 방법에서 본원의 방법에 사용되는 간세포는 ITIH1의 상위조절자인 G13 유전자가 결손되거나 또는 G13 단백질을 발현하지 못하는 세포; 또는 상기 간세포는 OGT를 과발현하는 세포가 사용될 수 있으며, 이 경우, 상기 간세포는 정상 포도당 농도의 배지에서 배양되고, 정상 농도의 포도당에서도 상기 유전자의 결손으로 인해 ITIH1이 과발현된다.
일 구현예에 따른 방법에서 일차로 선별된 후보물질은 기능적 분석과정을 거칠 수 있으며, 상기 방법은 상기 ITIH1의 농도가 감소한 세포 파쇄물 또는 그 배양액을 근육 또는 지방세포에 처리하는 단계; 및 상기 근육 또는 지방세포의 인슐린 민감성을 측정하는 단계; 및 상기 처리된 세포에서 상기 인슐린 민감성이 증가한 경우, 상기 저분자 화합물을 혈당조절 후보물질로 선별하는 단계를 추가로 포함한다. 일 구현예에서 상기 기능적 분석결과 일차로 선별된 후보물질이 인슐린 민감성을 증가시키지 못한 경우, 상기 후보물질은 후보물질에서 제외될 수 있다.
다른 구현예에 따른 방법에서 일차로 선별된 후보물질은 기능적 분석과정을 거칠 수 있으며, 상기 ITIH1의 농도가 감소한 세포 파쇄 또는 융해물 또는 그 배양액에서 ITIH1의 OGT (O-GlcNAc transferase) 효소에 의한 O-GlcNAcylation 변형을 측정하는 단계를 추가로 포함하며, 예를 들면 서열번호 1의 서열을 기준으로 ITIH1의 590번, 608번, 788번, 820번, 또는 824번째 세린 잔기 중 하나 이상의 잔기가 상기 처리된 세포에서 상기 ITIH1의 O-GlcNAcylation 변형이 증가한 경우, 상기 저분자 화합물을 혈당조절 후보물질로 선별하는 단계를 추가로 포함한다. 일 구현예에서 상기 기능적 분석결과 일차로 선별된 후보물질이 인슐린 민감성을 증가시키지 못한 경우, 상기 후보물질은 후보물질에서 제외될 수 있다. 상기 두 가지 기능적 분석은 선택적으로 또는 모두 사용될 수 있다.
일 구현예에 따른 방법에서 상기 기능적 분석에서 상기 세포의 인슐린 민감성은 PKB (Protien Kinase B)의 인산화 및/또는 데옥시글루코스의 업테이크로 측정되며, 상기 인산화의 증가 및/또는 데옥시글루코스 업테이크 증가는 인슐린 민감성의 증가를 나타내며, 혈당조절이 필요한 질환의 치료제로서 개발될 수 있다.
일 구현예에서 본원에 따른 방법에서 세포의 배지에 사용되는 포도당 농도과 관련하여 고농도 및 저농도는 본원의 실시예, 당업계의 지식 및 본원의 효과를 고려하여 적절하게 결정될 수 있을 것이다. 일 구현예에서 상기 고농도의 포도당은 최소 25 mM 이다.
일 구현예에서 본원의 방법에 사용되는 간세포는 일차 배양 세포, 확립된 세포 또는 실험동물의 형태로 제공될 수 있다.
일 구현예에서는 확립된 세포주가 사용되며, 이는 Huh7, AML12, 또는 HepG2를 포함한다.
일 구현예에서 상기 혈당 조절용 저분자 화합물 기재 약물은 혈당의 조절이 필요한 다양한 질환 예를 들면 대사성 질환, 제 1 형 당뇨병, 제 2 형 당뇨병, 또는 당뇨병성 신증, 신경병증, 또는 망막병증을 포함하는 당뇨에 수반되는 합병증, 또는 염증성장질환(Inflammatory Bowl Disease)의 치료제로 사용되나, 이로 제한하는 것은 아니다.
상기 혈당 조절용 저분자 화합물 기재 약물은 대사성 질환, 제 1 형 당뇨병, 제 2 형 당뇨병, 또는 당뇨병성 신증, 신경병증, 또는 망막병증을 포함하는 당뇨에 수반되는 합병증, 또는 염증성장질환(Inflammatory Bowl Disease)의 치료제로 사용되는 것인, 혈당조절이 필요한 질환 치료용의 저분자 화합물 기재 약물 스크리닝 방법이다.
다른 양태에서 본원은 우고닌(Wogonin), 바이칼린(Baicalin), 바이칼레인(Baicalein), 우르솔산(Ursolic acid), 하이퍼사이드(Hyperoside), 퀘르세틴(Quercetin), 코리녹세신(Corynoxeine), 이소르힌초필린(Isorhynchophylline), 또는 린초필린(Rhynchophylline), 또는 그 약학적으로 유효한 염을 유효성분으로 포함하는 ITIH1를 표적으로 하는 혈당강하용 약학 조성물을 제공한다.
다른 양태에서 본원은 우고닌(Wogonin), 바이칼린(Baicalin), 바이칼레인(Baicalein), 우르솔산(Ursolic acid), 하이퍼사이드(Hyperoside), 퀘르세틴(Quercetin), 코리녹세신(Corynoxeine), 이소르힌초필린(Isorhynchophylline), 및/또는 린초필린(Rhynchophylline)을 인비트로의 간세포 또는 인간을 제외한 동물의 간세포에 처리하는 단계를 포함하는, 간세포에서 ITIH1의 농도를 감소시키는 방법을 제공한다.
본원에 따른 세포 기재 방법은 ITIH1을 타겟으로 활용함으로써 대사성 질환 등에서 야기되는 고혈당을 초기에 진단하고, ITIH1을 제어하여 고혈당을 수반하는 질병을 치료할 수 있는 후보물질의 효능 평가 또는 후보 물질의 스크리닝에 효과적으로 사용될 수 있다.
본원에 제사된 방법은 세포기반 분석법으로써 실험조건의 다변화가 용이하며, 선택 세포주, 설정한 실험조건 하에서 효율성 및 재현성이 높게 ITIH1을 타겟하는 물질의 효과를 평가하고, 선별된 물질에 대한 생화학적 기능분석을 통해 대상 질환의 치료효과를 검증할 수 있다. 따라서 이후 전임상 또는 임상시험 도입을 위해 추가검증 목적으로 동물 모델(예를 들면 고농도의 포도당 단회 투여)을 연계 활용할 수 있으므로 대상 물질을 선별적하는 분석 방법이 될 수 있다.
도 1은 고지질식이를 5주간 섭취한 마우스 간에서 분리한 일차 간세포를 배양하면서 배양액에 25mM 포도당 자극을 24시간 가하고, 이후 채취한 간세포에서 ITIH1의 O-GlcNAc 변형 정도를 CTD110.6 클론의 항체를 이용하여 분석한 결과이다. 이는 ITIH1을 도출하기 이전에 ITIH1의 상위조절자로서 고포도당 상황에서 그 활성이 증가한다고 알려진 O-GlcNAc 변형이 전반적으로 잘 유도됨을 보여줌으로써 실험조건이 잘 설정되었음을 나타낸다.
도 2는 Huh7 간세포주 또는 마우스의 간에서 분리하여 배양한 일차 간세포를 이용하여 약물을 각 30μM의 농도로 1시간 동안 전처치한 후(A1:Wogonin, A2:Baicalin, A3:Baicalein, B1:Ursolic acid, B2:Hyperoside, B3:Quercetin, C1:Corynoxeine, C2:Isorhynchophylline, C3:Rhynchophylline) 저농도(5mM, 12시간) 또는 고농도(25mM, 12시간)의 포도당 자극을 상기와 유사한 방법으로 가하여 세포내 ITIH1 증가를 억제하는 화합물의 효능을 평가한 결과이다. 상기 각 약물은 혈당강하 또는 간기능 개선작용이 있는 대표 약제들의 유효성분으로, 고농도 포도당 자극을 가하기 직전 한 시간에 30μM 농도로 가한 이후 12시간 추가 배양하였다. 해당 웨스턴블랏 실험에서 1차 항체로 사용한 ITIH1 항체(Biorbyt사, 영국) 및 ß-actin 항체(Sigma사, 미국)는 시중에서 상업적으로 구매가능한 항체를 사용하여 제조사의 실험법에 따라 분석하였다.
도 3a는 ITIH1의 O-GlcNAc 변형을 분석하기 위한 이중질량분석 실험방법의 모식도(좌)이고, ITIH1의 세린 590번, 608번, 788번, 820번, 및 824잔기에서 O-GlcNAc 변형이 일어나는 현상을 찾는 과정을 보여주는 도면과 해당 스펙트럼 실시예의 실험결과(우)이다. Inset, ITIH1 플라스미드를 형질 도입한 HEK293A 세포의 균질액으로부터 FLAG 표식한 단백질 발현을 웨스턴블랏으로 분석하였다. 해당 웨스턴블랏 실험에서 1차 항체로 사용한 FLAG 항체(Cell Signaling Technology사, 미국) 및 ß-actin 항체(Sigma사, 미국)는 시중에서 상업적으로 구매가능한 항체를 사용하여 제조사의 실험법에 따라 분석하였다.
도 3b는 정상 또는 간선택적 Gna13 유전자 결손 동물로부터 분리하여 일차 배양한 간세포에 siRNA 방법으로 ITIH1을 결손시키고, 이후 추가로 24시간 배양한 이들 세포로부터 얻은 조정배지(conditioned media)를 3T3-L1 또는 C2C12 세포주에 각각 12시간 처리하여 수득한 결과이다. 이들 세포에서 Akt 인산화(좌)와 당흡수능(우)의 변화를 분석하였다. Inset, 정상 또는 간선택적 Gna13 결손 마우스의 일차 배양 간세포에서 ITIH1 발현량 변화를 분석한 결과이다. 인산화된 Akt(Cell Signaling Technology사, 미국) 또는 ITIH1(Biorbyt사, 영국)의 발현은 각각 Akt 발현(Cell Signaling Technology사, 미국) 또는 베타-actin 발현량(Sigma사, 미국)과 대조하여 보정(normalized) 정량하였다. 또한 Ga13 발현은 Ga13 항체(Santa Cruz사, 미국)를 구매하여 분석에 사용하였다.
도 4는 마우스(군당 각 2마리)에 고농도 포도당(2g/kg body weight)을 투여하고 이후 표기한 시간별로 각 동물에서 혈청 ITIH1 발현량을 웨스턴블랏으로 분석하였다. 알부민은 혈청 시료가 동일양 사용되었음을 보여주는 대조평가용으로 사용하였다. 해당 웨스턴블랏 실험에서 1차 항체로 사용한 ITIH1 항체(Biorbyt사, 영국) 및 Albumin 항체(Cusabio사, 미국)는 시중에서 상업적으로 구매가능한 항체를 사용하여 제조사의 실험법에 따라 분석하였다.
도 5는 ITIH1을 억제하여 혈당강하효능을 갖는 후보물질의 효능을 평가하는 스크리닝 방법의 모식도이다.
도 6은 G13이 간세포 선택적으로 결손된 마우스를 구축하여 고지질식이를 9주 내지 13주간 섭취한 마우스로부터 당 내인성 및 인슐린 내인성 실험을 수행한 결과로, 고지질식이를 섭취한 마우스에서 정상 대비 간세포 선택적 G13 결손 마우스의 공복시 혈당이 유의적으로 증가해 있었고(좌), 포도당 내인성 실험(가운데) 및 인슐린 내인성 실험(우) 결과이다.
도 7은 고지질식이를 섭취한 정상 또는 간세포 선택적 G13 결손 마우스의 간조직 및 혈청에서 ITIH1의 발현을 웨스턴블랏으로 분석하였다. 해당 웨스턴블랏 실험에서 1차 항체로 사용한 ITIH1 항체(Biorbyt사, 영국), 베타-actin 항체(Sigma사, 미국) 및 Albumin 항체(Cusabio사, 미국)는 시중에서 상업적으로 구매가능한 항체를 사용하여 제조사의 실험법에 따라 분석하였다.
도 8은 정상 또는 간세포 선택적 G13 결손 마우스에 고농도 포도당(2g/kg body weight)을 경구투여시킨 후 6시간 지나 간 시료를 확보하여 해당 표적들의 발현을 웨스턴블랏으로 분석하였다. 해당 웨스턴블랏 실험에서 1차 항체로 사용한 ITIH1 항체(Biorbyt사, 영국), OGT 항체(Sigma사, 미국), Ga13 항체(Santa Cruz사, 미국), 및 베타-actin 항체(Sigma사, 미국)는 시중에서 상업적으로 구매가능한 항체를 사용하여 제조사의 실험법에 따라 분석하였다.
도 9는 고지질식이를 섭취한 정상 및 간세포 선택적 G13 결손 마우스의 간조직 및 분리한 일차 간세포에서 웨스턴블랏으로 분석하였다.해당 웨스턴블랏 실험에서 1차 항체로 사용한 OGT 항체(Sigma사, 미국), Ga13 항체(Santa Cruz사, 미국), 및 베타-actin 항체(Sigma사, 미국)는 시중에서 상업적으로 구매가능한 항체를 사용하여 제조사의 실험법에 따라 분석하였다.
도 10은 OGT 과발현 플라스미드 또는 OGT를 표적하는 shRNA(shOGT)와 각 대조군 플라스미드를 유체역학 주사법(hydrodynamic injection)을 통해 정상 마우스에 주입 후 해당 표적 단백의 발현을 웨스턴블랏으로 분석하였다. 해당 웨스턴블랏 실험에서 1차 항체로 사용한 ITIH1 항체(Biorbyt사, 영국), OGT 항체(Sigma사, 미국) 및 베타-actin 항체(Sigma사, 미국)는 시중에서 상업적으로 구매가능한 항체를 사용하여 제조사의 실험법에 따라 분석하였다.
본원은 포도당 자극에 의한 ITIH1(Inter-alpha Trypsin Inhibitor Heavy chain 1)의 간조직과 혈중 농도 증가 및 그 기전의 발견에 근거한 것이다. 구체적으로 본원은 고혈당에서 G13의 감소에 따른 OGT의 증가가 ITIH1의 안정성을 증가시켜 그 분비량이 증가한다는 발견에 근거한 것으로, ITIH1은 히알루론산에 결합하여 근육 및 지방세포에 침착하여 세포의 인슐린 민감성을 떨어뜨린다. 이에 본원에서는 포도당 자극에 의해 변화하는 ITIH1의 고혈당 수반 질환 치료제로서의 표적 효용성을 검증하였고, 이를 활용하여 상기 선택적으로 제어하는 화합물 기재의 효능을 평가 또는 선별할 수 있는 세포 기반 분석 기술을 제공한다.
이에 한 양태에서 본원은 ITIH1을 발현하는 간세포를 제공하는 단계; 상기 세포를 고농도 포도당 배지에서 배양하는 단계; 상기 세포에 상기 ITIH1의 단백질 발현을 억제할 것으로 기대되는 저분자 화합물을 처리하는 단계; 및 상기 세포의 배양액에서 ITIH1 단백질의 함량을 측정하는 단계; 및 상기 저분자 화합물로 처리된 세포의 배지에서 상기 IT1H1의 농도가 비교군과 비교하여 감소한 경우, 상기 저분자 화합물을 혈당조절 후보물질로 선별하는 단계를 포함하는, 혈당조절이 필요한 질환 치료에 사용되는 저분자 화합물 기재 약물 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본원에서는 고혈당에서 G13(G protein alpha-13)의 감소에 따른 OGT(O-GlcNAc transferase)의 증가가 ITIH1의 안정성을 증가시켜 세포내 농도 및 그 분비량이 증가한다는 발견에 근거한 것이다.
ITIH1은 IaI(Inter-alpha-trypsin inhibitor complex)를 이루는 중쇄의 하나로서 SHAP(serum-derived hyaluronan-associated protein)라고도 하며 간세포에서 생성되어 혈중으로 분비되는 단백질이다. 류마티스 관절염 또는 과민성대장증후군(Inflammatory Bowel Disease) 환자의 체내 염증반응이 일어나는 부위에서 SHAP의 발현이 높게 관찰된다. 그러나 현재까지 국소 염증 환경 이외에 고혈당 또는 전신 염증 및 스트레스 상황에서 ITIH1의 발현 조절, 기전 및 역할 등에 대해서는 알려지지 않았다. 생리 또는 질병 상황에서 체내 혈중 포도당 농도는 가변적으로 조절된다. 특히 각종 스트레스나 인슐린 저항성을 동반하는 대사성 질환에서는 과도한 혈당증가가 생기며 이러한 상황이 지속될 경우 간 및 여러 장기에 병리 반응이 수반되어 조직 손상 및 기능 장애를 유발한다. 고농도 포도당 자극은 인슐린 저항성 및 글루코스 독성과 직접 연관이 있으며, 이는 포도당을 기질로 하여 형성되는 O-GlcNAc 변형(O-GlcNAcylation)을 촉진할 수 있다. O-GlcNAcylation은 OGT 효소에 의해 매개되어 표적 단백질의 세린/쓰레오닌 잔기에 결합하여 GlcNAcylation 변형을 유도하여 표적의 양과 기능에 변화를 초래한다.
본원에 사용되는 ITIH1는 분석 또는 스크리닝을 하는 구체적 방법에 따라 다양한 유래의 것이 본 방법에 사용될 수 있으며, 예를 들면 포유류, 특히 인간유래 또는 마우스 유래의 것이 사용될 수 있다. 또한 동일한 숙주, 예를 들면 인간에서 유래된 것이라도 특정 개인, 지역, 환경 등에 따라 서열변이가 있을 수 있으며, 이러한 것은 물론 일부 서열이 변형(결실, 치환, 부가)되었으나, 기능적으로 동등한 변이체가 모두 본 발명에 사용될 수 있다.
본원에서 ITIH1의 단백질 및 유전자 서열은 공지된 것으로 예를 들면, 인간의 경우, NCBI(미국국립생물공학정보센터)의 유전자 및 단백질 접근 번호는 각각 NM_002215.4; NP_002206.2, 마우스의 경우, NCBI의 유전자 및 단백질 접근 번호는 각각 NM_008406.3; NP_032432.2로 공지되어 있다. 단 상기 서열로 한정하는 것은 아니며, 이의 기능적 동등체를 포함하는 것이다.
본원의 방법에 사용될 수 있는 ITIH1은 분리된 형태 또는 특히 이를 발현하는 세포 또는 상기 세포를 포함하는 동물의 형태로 제공될 수 있다. 세포의 경우 본원의 방법에 채용되는 단백질을 내인적으로 발현하거나, 또는 이를 발현하는 플라스미드의 도입(transient 또는 stable 전달이입)에 의해 이를 발현 또는 과발현하는 세포주일 수 있다.
또한 본원의 방법에서 ITIH1를 발현하는 간세포는 일차 배양 세포, 확립된 세포 또는 실험동물의 형태일 수 있다.
일 구현예에서는 동물모델이 사용된다. 동물모델의 경우, 특히 전임상 또는 임상시험 도입을 위해 추가검증을 위해 예를 들면 고농도의 포도당 단회 투여를 수행하는 방식으로 연계 활용할 수 있으므로 대상 물질의 선별적 분석에 효과적이다.
다른 구현예에서는 확립된 세포주 예를 들면 Huh7, AML12, 또는 HepG2를 포함하는 확립된 세포주가 사용될 수 있다. 단, 이로 제한하는 것은 아니며, 당업자라면 본원의 실시예 등을 참조하여 적절한 것을 선택할 수 있을 것이다.
또 다른 측면에서는 ITIH1을 발현하지만, G13 유전자가 결손되거나 또는 G13 단백질을 발현하지 못하는 세포 또는 동물이 사용될 수 있다. 앞서 언급한 바와 같이 본원에서는 G13가 OGT를 억제하여 ITIH1의 농도가 정상으로 유지되나, 고포도당 농도 조건에서는 G13이 억제되고, OGT의 활성화로 ITIH1의 농도가 증가하기 때문에, G13이 결손된 세포 또는 동물의 경우, 정상 농도의 포도당 조건에서도 ITIH1 농도가 증가하기 때문에, 본원에 따른 방법에 사용될 수 있다. G13이 결손된 세포는 본원의 실시예에 개시된 내용을 참조로 당업자라면 제조할 수 있다. 인간 및 마우스 G13 단백질 서열은 각각 NCBI에 인간 GNA13 단백질(NP_006563.2), 마우스 Gna13 단백질(NP_034433.3)로 공지되어 있다.
또 다른 측면에서는 ITIH1을 발현하지만, OGT(O-GlcNAc transferase)를 과발현하는 세포가 또한 사용될 수 있다. 앞서 언급한 바와 같이 OGT의 증가는 ITIH1의 안정성을 증가시켜 세포내 양을 증가시키고 그 결과 세포의 인슐린 민감성을 떨어뜨리기 ?문에, 이러한 세포가 또한 본원의 방법에 사용될 수 있다. 인간의 OGT 단백질 서열은 UNIPROTKB-P19827로 공지되어 있다. 당업자라면, 본원의 실시예에 개시된 내용을 참조로 OGT를 과발현하는 세포를 제조할 수 있을 것이다.
본원에 따른 방법에서 ITIH1를 발현하는 간세포는 고농도의 포도당을 포함하는 배지에서 일정 시간 배양된다. 일정 시간은 고농도의 포도당에서 본원에서 규명된 기전 즉 G13의 감소에 의한 OGT의 활성화와 이에 의한 ITIH1 단백질의 안정화로 인한 농도 증가를 가져오기에 충분한 시간이다. 일 구현예에서는 24시간 배양된다.
인체 기준으로 공복 시 혈당이 5.6mM 내지 7mM (100 - 126mg/dl)의 경우 당뇨전단계, 7mM (126mg/dl) 이상일 경우 당뇨 소견을 가지는 것으로 분류되며 랜덤하게 혈당을 측정했을 때 11.1mM (200mg/dl)을 초과했을 경우에도 당뇨로 분류한다. 단, 고혈당으로 인한 병리적 증상은 15mM 내지 20mM (250 - 300mg/dl) 이상 도달했을 때 인지가능하다. 본원에서 고농도의 포도당이란 본원에서 규명된 기전 즉 G13의 감소에 의한 OGT의 활성화와 이에 의한 ITIH1 단백질의 안정화로 인한 농도 증가를 가져오기에 충분한 농도를 의미한다. 예를 들면 약 15mM 내지 약 35mM 이고, 특히 약 25mM이다. 정상 농도의 포도당이란 인체 기준으로 공복 시 혈당인 약 3.9mM 내지 7.1mM (70 - 130mg/dl)에 해당하되, 정상인의 평균 공복 시 혈당은 약 5.5mM (100mg/dl)이다.
본원에서는 또한 본원에 따른 방법을 이용하여 기존의 물질 우고닌(Wogonin), 바이칼린(Baicalin), 바이칼레인(Baicalein), 우르솔산(Ursolic acid), 하이퍼사이드(Hyperoside), 퀘르세틴(Quercetin), 코리녹세신(Corynoxeine), 이소르힌초필린(Isorhynchophylline), 또는 린초필린(Rhynchophylline)을 시험물질로서 사용한 결과 간세포에서 ITIH1의 농도를 효과적으로 감소시킬 수 있음을 발견하였다. 이는 본원에 따른 방법이 ITIH1를 표적으로 하는 혈당 조절 물질의 테스트 및 선별에 효과적으로 사용될 수 있음을 나타낸다(도 2). 또한 Wogonin, Baicalin, 및 Baicalein은 기존에 혈당 강하효과가 있는 것으로 알려진 물질이나, 그 기전은 정확하게 규명되지 않았으나 본 실험을 통해 이러한 물질이 ITIH1을 표적으로 하여 혈당을 강하시킬 수 있음을 나타낸다, 또한 특히 코리녹세신(Corynoxeine), 이소르힌초필린(Isorhynchophylline), 또는 린초필린(Rhynchophylline)을 기존에 혈당 강하 효과는 물론 그 기전이 전혀 알려지지 않았으나, 본 실험을 통해 ITIH1을 표적으로 하여 혈당을 강하조절제로 효과적으로 사용될 수 있음을 나타낸다.
본원에 따른 방법은 기능적 분석 단계를 추가로 포함할 수 있다. 앞서 언급한 바와 같이, 고포도당 농도에서 G13의 감소에 따른 OGT의 증가가 ITIH1의 안정성을 증가시키고, ITIH1은 히알루론산에 결합하여 근육 및 지방세포에 침착하여 세포의 인슐린 민감성을 떨어뜨린다. 따라서 본원에 따른 방법에서는 기능적 분석으로서 저분자 화합물이 처리된 세포의 파쇄물 또는 그 배양액을 근육 또는 지방세포에 처리하고, 저분자 화합물의 처리에 의해 ITIH1의 농도가 감소한 세포의 파쇄물 또는 그 배양액으로 처리된 세포에서 상기 인슐린 민감성이 증가한 경우, 상기 저분자 화합물을 혈당조절 후보물질로 선별하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
세포의 인슐린 민감성을 측정하는 방법은 당업계에 공지된 것으로 본원의 실시예에 개시된 바와 같이, 예를 들면 Akt(Protien Kinase B)의 인산화 및 데옥시글루코스의 업테이크로 측정되며, 상기 인산화의 증가 및 데옥시글루코스 업테이크 증가는 인슐린 민감성의 증가를 나타낸다.
또 다른 구현예에서, 본원에 따른 방법은 다음과 같은 기능적 분석 단계를 추가로 포함할 수 있다. 앞서 언급한 바와 같이 고농도의 포도당 조건에서 OGT의 증가는 ITIH1의 세린(Ser) 및 쓰레오닌(Thr) 잔기에 O-linked N-acetylglucosamine(O-GlcNAc) 모이어티를 붙이는 O-GlcNAcylation 변형의 증가를 가져온다. 따라서 상기 변형을 측정하여, 상기 시험물질로 처리된 세포에서 상기 ITIH1의 O-GlcNAcylation 변형이 증가한 경우, 상기 저분자 화합물을 혈당조절 후보물질로 선별할 수 있다.
일 구현예에서 ITIH1의 OGT 효소에 의한 O-GlcNAcylation 변형은 서열번호 1의 서열을 기준으로 ITIH1의 733번, 590번, 608번, 820번, 824번째 세린 잔기의 변형을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다.
일 구현예에서 상기 인슐린에 대한 민감성 증가 및 O-GlcNAcylation 변형 증가는 ITIH1 농도 증가가 선행되어야 하는 것으로서, 상기 기능적 분석은 저분자화합물 후보물질로 처리된 세포의 ITIH1의 농도가 증가한 화합물에 대하여 수행하는 것이 바람직하다.
본원에서 시험물질은 ITIH1의 단백질 발현을 억제할 것으로 기대되는 저분자 화합물이다. 상기 시험물질은 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리로부터 얻을 수 있으며 이러한 화합물의 라이브러리를 얻는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 합성 화합물 라이브러리는 Maybridge Chemical Co.(UK), Comgenex(USA), Brandon Associates(USA), Microsource(USA) 및 Sigma-Aldrich(USA)에서 구입 가능하며, 천연 화합물의 라이브러리는 Pan Laboratories(USA) 및 MycoSearch(USA)에서 구입 가능하다. 시험 물질은 당업계에 공지된 다양한 조합 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있으며, 예를 들어, 생물학적 라이브러리, 공간 어드레서블 패러럴 고상 또는 액상 라이브러리(spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries), 디컨볼루션이 요구되는 합성 라이브러리 방법, “1-비드 1-화합물” 라이브러리 방법, 그리고 친화성 크로마토그래피 선별을 이용하는 합성 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있다. 분자 라이브러리의 합성 방법은, DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6909, 1993; Erb et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 11422, 1994; Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37, 2678, 1994; Cho et al., Science 261, 1303, 1993; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2059, 1994; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2061; Gallop et al., J. Med. Chem. 37, 1233, 1994 등에 개시되어 있다.
다른 구현예에서 상기 시험물질은 천연물의 추출물, 또는 상기 추출물에서 분리된 유효성분이다.
예를 들면 본원에 따른 약물의 스크리닝 목적을 위해서는 화합물은 저분자량의 치료효과를 갖는 것이 사용될 수 있다. 예를 들면 중량이 400 Da, 600 Da 또는 800 Da과 같은 약 1000 Da 내외의 화합물이 사용될 수 있다. 목적에 따라 이러한 화합물은 화합물 라이브러리의 일부를 구성할 수 있으며, 라이브러리를 구성하는 화합물의 숫자도 수십개부터 수백만개까지 다양하다. 이러한 화합물 라이브러리는 펩타이드, 펩토이드 및 기타 환형 또는 선형의 올리고 머성 화합물, 및 주형을 기본으로 하는 저분자 화합물, 예컨대 벤조디아제핀, 하이단토인, 바이아릴, 카보사이클 및 폴리사이클 화합물(예컨대 나프탈렌, 페노티아진, 아크리딘, 스테로이드 등), 카보하이드레이트 및 아미노산 유도체, 디하이드로피리딘, 벤즈하이드릴 및 헤테로사이클(예컨대 트리아진, 인돌, 티아졸리딘 등)을 포함하는 것일 수 있으나, 이는 단지 예시적인 것으로 이로 한정되는 것은 아니다.
본 방법에서 사용되는 세포의 종류 및 시험물질의 양 및 종류 등은 사용하는 구체적인 실험방법 및 시험물질의 종류에 따라 달라지며, 당업자라면 적절한 양을 선택할 수 있을 것이다.
본원에 따른 방법에서 실험결과 시험물질과 접촉되지 않은 대조군과 비교하여 시험물질의 존재하에서 ITIH1 발현 억제 또는 감소를 가져오는 물질을 후보물질로 선별한다. 감소의 경우 대조군과 비교 약 99% 이하 감소, 약 95% 이하 감소, 약 90% 감소, 약 85% 감소, 약 80% 감소, 약 75% 감소, 약 70% 감소, 약 65% 이하 감소, 약 60% 이하 감소, 약 55% 감소, 약 50% 이하 감소, 약 45% 이하 감소, 약 40% 이하 감소, 약 30% 이하 감소, 약 20% 이하 감소를 의미하나, 이를 벗어나는 범위를 제외하는 것은 아니다.
본원에 따른 세포 기반 방법은 또한 ITIH1을 제어할 수 있는 저분자 화합물 기재 후보물질의 효능의 평가/분석에 사용될 수 있다.
본원에 따른 방법은 세포 기반의 분석법으로, ITIH1를 표적으로 하여 이의 발현을 억제하는 물질은 고혈당이 수반되는 질환의 치료제로 효과적으로 사용될 수 있다.
고혈당이 수반되는 질환은 대사성 질환, 제 1 형 당뇨병, 제 2 형 당뇨병 또는 당뇨병성 신증, 신경병증, 망막병증을 포함하는 당뇨에 수반되는 합병증, 또는 염증성장질환(Inflammatory Bowl Disease) 예를 들면, 크론병(Crohn's disease) 또는 궤양성 대장염(ulcerative colitis)을 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다.
본원에서 대사성 질환은 대사 증후군(metabolic syndrome)은 각종 심혈관 질환과 제 2 형 당뇨병의 위험 요인들이 서로 군집을 이루는 현상의 한 가지 질환군을 일컫는 것이다. 인슐린 저항성(Insulin Rersistance) 및 이와 관련된 복잡하고 다양한 여러 대사이상 및 임상양상을 모두 포괄하여 설명할 수 있는 유용한 개념이다. 대사증후군을 가질 경우 심혈관 질환 혹은 제 2 형 당뇨병의 발병 위험도가 증가된다. 대사증후군 환자 수는 비만인구 증가와 함께 폭발적으로 증가함이 보고되어 있다. 과체중/비만으로 발생하는 인슐린 저항성은 에너지 대사이상(당뇨병)의 만성 이환에 중요 결정요인이고, 만성적 염증상태 및 심혈관계 이상을 유도한다. 따라서 대사이상은 심혈관 질환 발병을 촉진하며, 간조직에서는 지방축적과 중증 간질환 발병의 위험성을 증가시키는 만성 난치성 질환의 근본적 원인 요소로 작용한다(Anstee et al., Gastroenterology & Hepatology, 2013, Vol 10:330-344).
앞서 언급한 바와 같이 본원에서 테스트한 물질은 우고닌(Wogonin), 바이칼린(Baicalin), 바이칼레인(Baicalein), 우르솔산(Ursolic acid), 하이퍼사이드(Hyperoside), 퀘르세틴(Quercetin), 코리녹세신(Corynoxeine), 이소르힌초필린(Isorhynchophylline), 또는 린초필린(Rhynchophylline)은 ITIH1을 표적으로 하여 이의 농도를 효과적으로 감소시키고, 그 결과 혈당을 강하할 수 있다.
이에 다른 양태에서 본원은 ITIH1을 표적으로하는 우고닌(Wogonin), 바이칼린(Baicalin), 바이칼레인(Baicalein), 우르솔산(Ursolic acid), 하이퍼사이드(Hyperoside), 퀘르세틴(Quercetin), 코리녹세신(Corynoxeine), 이소르힌초필린(Isorhynchophylline), 또는 린초필린(Rhynchophylline)을 유효성분으로 포함하는 혈당강하용 약학조성물 또는 ITIH1 농도 감소용 약학조성물에 관한 것이다.
또 다른 양태에서는 우고닌(Wogonin), 바이칼린(Baicalin), 바이칼레인(Baicalein), 우르솔산(Ursolic acid), 하이퍼사이드(Hyperoside), 퀘르세틴(Quercetin), 코리녹세신(Corynoxeine), 이소르힌초필린(Isorhynchophylline), 또는 린초필린(Rhynchophylline)을 인비트로에서 간세포 또는 인간을 제외한 동물의 간세포에 처리하는 단계를 포함하는, 간세포에서 ITIH1의 농도를 감소시키는 방법에 관한 것이다.
본원에는 간세포에서 ITIH1을 표적으로 하는 효과적으로 혈당이 감소될 수 있음이 개시되어 있기 때문에, ITIH1을 농도를 감소시키는 물질은 혈당강하제, 또는 당뇨병 치료제, 또는 합병증의 예방 또는 치료제/방법으로서 효과적으로 사용될 수 있음을 나타낸다.
본원의 조성물은 또한 약학적으로 허용되는 부가 염을 포함할 수 있으며, 예컨대 암모늄 염, 알칼리 및 알칼리 토금속 염으로 예를 들면 리튬, 소듐, 포타슘, 마그네슘 및 칼슘 염 등이고, 또한 벤자틴, N-메틸-D-글루카민, 히드라바민 염과 같은 유기 염기와의 염, 및 아르기닌, 리신 등과 같은 아미노산과의 염을 포함한다.
본원에서 용어 "치료"란 본원 조성물의 투여로 과련 질환의 증세를 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 본원이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 대한의학협회 등에서 제시된 자료를 참조하여 본원의 조성물이 효과가 있는 질환의 정확한 기준을 알고, 개선, 향상 및 치료된 정도를 판단할 수 있을 것이다.
본 명세서에서 사용된 용어 "예방"은 본원 조성물의 투여로 과련 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 대사질환에 치료효과가 있는 본원의 본원 조성물은 고지혈증 등과 같은 질환의 초기 증상, 또는 나타나기 전에 복용할 경우 이러한 질환을 예방할 수 있다는 것은 당업자에게 자명할 것이다.
본원의 조성물은 약제학적 분야에서 통상적인 방법에 따라 투여에 적합한 단위투여형의 제제 및 주사제로 제형화시켜 투여할 수 있다. 이러한 목적에 적합한 경구투여용 제형에는 경질 및 연질 캅셀제, 정제, 산제, 현탁제, 시럽제 등이 포함된다. 이러한 경구투여용 제제에는 두 가지 또는 그 이상의 약물학적 활성 성분이외에 하나 또는 그 이상의 약제학적으로 불활성인 통상적인 담체, 예를 들면 전분, 락토스, 카복시메틸셀룰로오즈, 카올린 등의 부형제, 물, 젤라틴, 알코올, 글루코즈, 아라비아 고무, 트라가칸타 고무 등의 결합제, 전분, 덱스트린, 나트륨 알기네이트 등의 붕해제, 탈크, 스테아르산, 마그네슘 스테아레이트, 유동 파라핀 등의 활탁제와 같은 추가의 첨가제 성분들이 포함될 수 있다. 본 발명에서는 또한 용해를 위한 용해보조제등을 첨가할 수 있다.
본 발명의 조성물의 1일 투여 용량은 투여하고자 하는 대상의 질병의 진행 정도, 발병시기, 연령, 건강상태, 합병증 등의 다양한 요인에 따라 달라지지만 성인을 기준으로 할 때 일반적으로는 상기 조성물 1 내지 500mg, 바람직하게는 30 내지 300mg을 1일 1회 또는 수회 분할하여 투여할 수 있다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실 시 예
실험방법
동물실험
모든 동물실험은 서울대학교에서 제정하는 동물실험법에 근거하여 수행되었다. 동물은 12시간 주기로 명암이 교차되는 환경을 유지시켜 주었으며, 자유롭게 사료에 접근하게 하며 사육시켰다. 모든 실험에는 C57BL/6 계통의 수컷 마우스를 사용하였다. 식이유도성 비만모델 실험에서는 8-12주령 마우스에 고지질식이(섭취하는 식이칼로리의 60%가 지질로부터 유래) 또는 정상식이를 5주간 섭취시켰다. 포도당 경구투여모델 실험에서는 10주령의 C57BL/6 마우스를 밤새 절식시킨 후 경구로 포도당(2g/kg body weight)을 투여한 후 제시한 시간에 안락사시키고 시료를 채취하였다.
웨스턴블롯
각 시료마다 동일한 양 단백질을 도데실황산소듐-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동법(SDS-PAGE)으로 분자량에 따라 분리한 뒤 나이트로셀룰로오스 막(GE healthcare)에 전이시켰음. 이 막을 5% 탈지유 용액에 1시간 반응시킨 뒤 각 단백질을 인식하는 1차 항체와 최소 12시간 반응 시키고, 이후 HRP-conjugated IgG (Zymed Laboratories)를 추가로 한 시간 반응시켰으며 Amersham ECL western blotting detection reagent(GE Healthcare)로 발색하였다.
이중질량분석법을 활용한 ITIH1의 O-GlcNAcylation 변형 분석
ITIH1 단백질을 내인적으로 대량 발현시킬 목적으로 HEK293A 세포에 FLAG이 표식된 human ITIH1을 발현하는 플라스미드(FLAG-hITIH1, Origene) 또는 대조용 공플라스미드를 세포에 도입한 이후 최소 24시간 후에 시료를 확보하였다. 각 반응물로부터 ITIH1의 번역후 변형 상태를 LTQ-Orbitrap Velos ETD(Thermo Fischer Scientific)로 측정하여 Proteome Discoverer(Thermo Fischer Scientific)로 분석하였다.
마우스에 유체역학 주사법을 활용한 플라스미드 주입
OGT를 표적하는 shRNA(shOGT) 또는 대조군 플라스미드(shCon)를 대량으로 확보하여, 마우스 몸무게의 8%에 해당하는 부피의 PBS에 녹인 후 8주령의 정상 또는 간세포 선택적 Gna13 결손 마우스의 꼬리에 주입하였다. 각 마우스당 25ug 플라스미드를 5초 이내에 주사하였다.
인슐린 민감성 지표(Akt 인산화) 실험
일반식이를 섭취한 정상 또는 Ga13 결손 동물의 간으로부터 일차 간세포를 분리 후 ITIH1을 타겟하는 siRNA 또는 그 대조군을 처치하여 얻은 조정배지(conditioned media)를 각각 3T3-L1 및 C2C12 세포주에 24시간 동안 배양하였다. 이후 인슐린(100nM)을 처치하고 15분 후 세포 균질액을 시료화하여 인슐린 수용체 하위 신호로서 Akt 인산화된 정도를 phospho-Akt항체(Cell Signaling Technology사, 미국)를 활용하여 면역화학법으로 분석하였으며 전체 Akt 단백을 인식하는 Akt 항체(Cell Signaling Technology사, 미국)를 사용하여 전체 Akt의 발현량으로 인산화된 Akt의 발현량을 보정하여 정량하였다.
2-deoxyglucose 흡수능 실험
세포에 흡수된 2-deoxyglucose 함량은 당흡수능 측정용 키트를 활용하여 제조사가 제시한 사용법에 따라 효소 재사용 증폭반응법으로 세포 균질액에서 측정하였다.
당 내인성 실험(Glucose tolerance test)
당 내인성 실험을 실시하기 전날부터 해당 마우스들의 식이섭취를 16시간 가량 제한하되(fasting) 음수(drinkikng water)에는 자유롭게 접근할 수 있도록 하였다. 이후 공복혈당을 측정하고(time 0) 포도당을 2g/kg body weight의 농도로 경구투여시킨 후 각 15분, 30분, 60분 및 90분이 경과한 시점마다 꼬리에 작은 상처를 내어 얻은 소량의 혈액으로부터 glucometer(Accuchek Active glucose detection apparatus, Roche)를 활용하여 혈중 포도당 농도를 측정하였다.
인슐린 내인성 실험(Insulin tolerance test)
인슐린 내인성 실험을 실시하는 당일 해당 마우스들의 식이섭취를 4시간 내지 6시간 가량 제한하되(fasting) 음수(drinkikng water)에는 자유롭게 접근할 수 있도록 하였다. 이후 공복혈당을 측정하고(time 0) 인슐린을 1.5 IU/kg body weight의 농도로 복강투여 시킨 후 각 30분, 60분, 90분 및 120분이 경과한 시점마다 꼬리에 작은 상처를 내어 얻은 소량의 혈액으로부터 glucometer(Accuchek Active glucose detection apparatus, Roche)를 활용하여 혈중 포도당 농도를 측정하였다.
통계분석
면역화학적 분석으로 시각화한 단백질 띠를 Image J 프로그램으로 정량하였다. 데이터는 평균±표준오차로 표기하였으며 그룹간 통계적 유의성은 Student’s t-test를 이용하여 P < .05 또는 P < .01로 분류하였다. 다중평균비교는 ANOVA로 분석 후 Bonferroni 법을 활용하여 사후검증하여 통계적 유의성을 계산하였다.
실시예 1. ITIH1의 상위 조절인자인 G13이 간 선택적 결손된 마우스 유래의 간세포를 이용한 고혈당 자극 모방 시스템 확립
본원에서는 ITIH1의 상위 조절인자인 G13이 간 선택적으로 유전자 결손된 마우스로부터 일차 배양 간세포를 분리한 후 저농도(Euglycemia) 또는 고농도(Hyperglycemia) 포도당이 함유된 배양배지에 12시간 배양함으로써 고혈당 자극을 모방하는 세포 기반 분석법을 고안하였다(도 1). 이때 고혈당 상황에서 활성이 증가하는 O-GlcNAc modification(CTD110.6 clone)은 저농도의 조건과 비교할 때 고농도 포도당 자극에 의해 증가하였으며, 핵심 타겟인 ITIH1 발현이 현저히 높아졌다. 이러한 결과는 생체의 고혈당 상황을 모방하는 세포 기반 분석법이 성공적으로 확립되었음을 나타내는 것으로 본 시험법을 ITIH1를 표적으로 하는 저분자 화합물 후보물질의 효능 검색에 활용할 수 있음을 나타내는 것이다.
실시예 2. 화합물을 이용한 ITIH1 생성 제어
실시예 1의 분석 방법을 이용하여, 본 실시예에서는 세포보호 효능을 갖는다고 알려진 화합물의 효과를 평가하였다. 각 화합물 Wogonin (Sigma, Cat no.632-85-9), Baicalin (Sigma, Cat no.21967-41-9), Baicalein (Sigma, Cat no.491-67-8), Ursolic acid (Sigma, Cat no.77-52-1), Hyperoside (Sigma, Cat no.482-36-0), Quercetin (Sigma, Cat no.117-39-5), Corynoxeine (ChemFaces, Cat no.630-94-4), Isorhynchophylline (ChemFaces, Cat no.6859-1-4), Rhynchophylline (ChemFaces, Cat no.76-66-4)을 30μM 농도로 전처치한 후 간세포 기원 세포주 또는 일차 간세포에 고농도 포도당 자극을 가하였을 때 고농도 포도당 자극에 의해 증가하는 ITIH1 발현이 억제되는 정도를 관찰한 결과, ITIH1 농도를 억제하는 것으로 나타났다. 이는 본원에 따른 방법이 ITIH1를 표적으로 하는 혈당 조절 물질의 테스트 및 선별에 효과적으로 사용될 수 있음을 나타낸다(도 2). 또한 Wogonin, Baicalin, 및 Baicalein은 기존에 혈당 강하효과가 있는 것으로 알려진 물질로서, 본 실험을 통해 이러한 물질이 ITIH1을 표적으로 하여 혈당을 강하시킬 수 있음을 나타낸다. 또한 특히 코리녹세신(Corynoxeine), 이소르힌초필린(Isorhynchophylline), 또는 린초필린(Rhynchophylline)을 기존에 혈당 강하 효과로는 알려지지 않았으나, 본 실험을 통해 ITIH1을 표적으로 하여 혈당을 강하조절제로 효과적으로 사용될 수 있음을 나타낸다.
실시예 3. 포도당 자극에 의한 ITIH1의 생리활성 분석
OGT는 표적 단백질의 Serine 또는 Threonine 잔기에 O-GlcNAc 잔기를 결합시켜 해당 단백질의 발현과 기능을 변화시킨다. 본 발명에서는 ITIH1의 O-GlcNAcylation 여부를 검증하기 위해 유전자변형 효율이 우수한 HEK293A 세포에 ITIH1 과발현 플라스미드를 도입한 후, 액체크로마토그래피 질량분석법(LC-MS/MS)을 응용하여 ITIH1 여러 잔기를 분석한 결과, 세린 590, 세린 608, 세린 788, 세린 820, 및 세린 824 잔기에서 O-GlcNAcylation의 발생을 확인하였다(도 3a). 이는 포도당 자극으로 증가하는 OGT 효소에 의해 ITIH1의 O-GlcNAc화가 발생한다는 결과를 나타낸다. O-GlcNAcylation(OGT) 회로와 ITIH1 발현 간의 이러한 관련성은 ITIH1 가 고혈당을 지표하는 신규 바이오마커로 사용될 수 있으며, ITIH1 발현, 활성 등을 억제하는 물질을 스크리닝하는데 지표로서 사용될 수 있음을 나타낸다.
또한 ITIH1의 상위 억제 조절인자인 G13이 유전자 결손된 마우스의 간세포에 ITIH1 siRNA(Santa Cruz사, 미국)를 도입하여 72시간 동안 배양하여 ITIH1 생성을 억제한 후, 이 세포로부터 조정배지를 확보하고 microcentrifuge 기기를 활용하여 조정배지로부터 debris를 제거한 후, 이를 다시 지방세포(3T3L1) 또는 근육 세포(C2C12)에 24시간 동안 배양한 후 인슐린 수용체 하위 신호로서 Akt 인산화와 및 당흡수능의 변화(2-deoxyglucose uptake assay)을 측정하였다. 결과는 도 3b에 기재되어 있다. 이에 나타난 바와 같이 대조군과 비교할 때 G13 유전자 결손 간세포로부터 얻은 조정배지를 처리할 경우 Akt 인산화가 감소하였으며, ITIH1 siRNA(siITIH1)를 함께 처리한 조정배지로 처리된 세포에서는 이러한 현상이 둔화되었다. 당흡수능 변화에서도 유사한 결과를 얻었다. 종합하면, 상기 결과는 포도당 자극에서 ITIH1를 억제하는 물질의 기능적 분석에 효과적으로 사용될 수 있음을 나타낸다.
실시예 4. ITIH1 타겟을 활용한 고혈당 조절물질 스크리닝 실험동물 모델
본원에서 제안하는 세포 기반 분석법에서 사용하는 물질의 효능 검증을 위한 실험동물 모델을 제시하였다. 본 실시예에서는 고혈당 자극을 급성으로 단회 가한 후 ITIH1 생성과 분비 변화 여부를 관찰하였다. 결과는 도 4에 기재되어 있다. 정상 마우스 또는 G13 결손 마우스(G13LKO)에 포도당을 경구투여(2g/kg)한 후 6시간 후에 간조직 및 혈청에서 ITIH1 함량을 측정하였다. 도 1에서 제시한 일차 간세포배양 실험 결과와 유사하게 포도당 자극을 가하였을 때 마우스의 간조직과 혈액에서 ITIH1의 함량이 증가했으며, G13유전자 결손 마우스에서는 정상 마우스의 경우와 비교할 때 포도당 자극이 없는 상태에서도 ITIH1 발현이 높은 것으로 나타났다. 여기에 포도당 자극을 가할 경우에는 ITIH1 함량이 매우 높아졌다. 이는 종래 방법인 고지질식이 12-16주 투여 모델에 비하여 현저히 개선된 효과적 방법으로서 ITIH1 타겟을 활용한 본 발명에서 제안하는 동물실험방법이다.
종합하면, 본 발명은 1) 고혈당(포도당) 자극에 의하여 증가하는 본원에서 규명된 ITIH1 발현량 및 O-GlcNAcylation 변형을 세포 기반 시험법으로 측정한 후, 2) 당대사능의 지표 기능 분석과 연계함으로써 저분자 화합물의 효과를 검증하는 분석에 효과적으로 사용될 수 있다. 이 방법은 고혈당을 수반하는 여러 질환의 치료용의 저분자 화합물기재 약물 개발에 활용할 수 있는 새로운 타겟을 활용한 고효율 신속 평가방법을 제공할 수 있다(도 5).
실시예 5. 고혈당 상태에서 G13의 감소에 따른 OGT의 증가가 ITIH1의 안정성을 증가시키는 기전 규명
G13이 간세포 선택적으로 결손된 마우스를 구축하여 고지질식이를 9주 내지 13주간 섭취한 마우스로부터 당 내인성 및 인슐린 내인성 실험을 수행하였고, 그 결과는 도 6에 기재되어 있다. 고지질식이를 섭취한 마우스에서 정상 대비 간세포 선택적 G13 결손 마우스의 공복시 혈당이 유의적으로 증가해 있었고(좌), 포도당 내인성 실험(가운데) 및 인슐린 내인성 실험(우)을 실시했을 때에도 G13 결손 마우스가 정상 마우스 대비 당대사기능이 저하되어 있음을 확인하였다.
고지질식이를 섭취한 정상 또는 간세포 선택적 G13 결손 마우스의 간조직 및 혈청에서 ITIH1의 발현을 면역화학법으로 분석하였다. 결과는 도 7에 기재되어 있다. 정상 마우스 대비 G13 결손 마우스의 간 및 혈청에서 ITIH1의 발현이 현저히 증가하였음을 확인하였다.
정상 또는 간세포 선택적 G13 결손 마우스에 고농도 포도당(2g/kg body weight)을 경구투여시킨 후 6시간 지나 간 시료를 확보하여 해당 표적들의 발현을 면역화학법으로 분석하였다. 결과는 도 8에 기재되어 있다. 정상 마우스에서 고농도 포도당을 투여했을 때 G13의 감소와 함께 ITIH1 및 OGT의 발현이 증가하였고 G13 결손 마우스의 간에서는 훨씬 더 유의적으로 발현이 증폭되었다.
고지질식이를 섭취한 정상 및 간세포 선택적 G13 결손 마우스의 간조직 및 분리한 일차 간세포에서 면역화학법으로 분석하였다. 결과는 도 9에 기재되어 있다. G13이 결손되었을 때 OGT의 발현이 증가하였음을 확인하였다. 이는 G13이 OGT의 발현을 억제하고 있음을 시사하는 결과로 해석할 수 있다.
OGT 과발현 플라스미드 또는 OGT를 표적하는 shRNA(shOGT)와 각 대조군 플라스미드를 유체역학 주사법(hydrodynamic injection)을 통해 정상 마우스에 주입 후 해당 표적 단백의 발현을 면역화학법을 통해 분석하였다. 결과는 도 10에 기재되어 있다. OGT가 과발현되었을 때 ITIH1의 발현이 증가하고 OGT 발현이 억제되었을 때는 ITIH1의 발현이 감소되었다. 이는 OGT의 발현 또는 활성이 ITIH1의 발현을 촉진하고 있음을 시사한다.
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Claims (12)

  1. ITIH1(Inter-alpha Trypsin Inhibitor Heavy chain 1)을 발현하는 간세포를 제공하는 단계;
    상기 세포를 고농도 포도당 배지에서 배양하는 단계;
    상기 세포에 상기 ITIH1의 단백질 발현을 억제할 것으로 기대되는 저분자화합물을 처리하는 단계;
    상기 세포의 배양액 또는 상기 세포의 파쇄물(lysate)에서 ITIH1 단백질의 농도를 측정하는 단계; 및
    상기 저분자 화합물로 처리된 세포의 배양액 또는 파쇄물에서 상기 IT1H1의 농도가 상기 저분자 화합물로 처리되지 않은 대조군과 비교하여 감소한 경우, 상기 저분자 화합물을 혈당조절 후보물질로 선별하는 단계를 포함하는, 혈당조절이 필요한 질환 치료용의 저분자 화합물 기재 약물 스크리닝 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 간세포는 ITIH1의 상위조절자인 G13 유전자가 결손되거나 또는 G13 단백질을 발현하지 못하는 세포이거나; 또는
    상기 간세포는 OGT(O-GlcNAc transferase)를 과발현하는 세포이고,
    이 경우, 상기 간세포는 고농도 대신에 정상 포도당 농도의 배지에서 배양되는, 혈당조절이 필요한 질환 치료용의 저분자 화합물 기재 약물 스크리닝 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 방법은 상기 ITIH1의 농도가 감소한 세포의 파쇄물 또는 그 배양액을 근육 또는 지방세포에 처리하는 단계; 및
    상기 근육 또는 지방세포의 인슐린 민감성을 측정하는 단계; 및
    상기 처리된 세포에서 상기 인슐린 민감성이 증가한 경우, 상기 저분자 화합물을 혈당조절 후보물질로 선별하는 단계를 추가로 포함하는, 혈당조절이 필요한 질환 치료용의 저분자 화합물 기재 약물 스크리닝 방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 세포의 인슐린 민감성은 PKB(Protien Kinase B 또는 Akt)의 인산화 및/또는 데옥시글루코스의 업테이크로 측정되며, 상기 인산화의 증가 및 데옥시글루코스 업테이크 증가는 인슐린 민감성의 증가를 나타내는 것인, 혈당조절이 필요한 질환 치료용의 저분자 화합물 기재 약물 스크리닝 방법.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 방법은 상기 ITIH1의 농도가 감소한 세포 파쇄물 또는 그 배양액에서 ITIH1의 OGT 효소에 의한 O-GlcNAcylation 변형을 측정하는 단계를 추가로 포함하며,
    상기 처리된 세포에서 상기 ITIH1의 O-GlcNAcylation 변형이 증가한 경우, 상기 저분자 화합물을 혈당조절 후보물질로 선별하는 단계를 추가로 포함하는, 혈당조절이 필요한 질환 치료용의 저분자 화합물 기재 약물 스크리닝 방법.
  6. 제 1 항 또는 제 2 항에
    상기 ITIH1의 OGT 효소에 의한 O-GlcNAcylation 변형은 서열번호 1의 서열을 기준으로 상기 ITIH1의 590번, 608번, 788번, 820번, 또는 824번째 세린 잔기 중 하나 이상의 변형인, 저분자 화합물 기재 약물 스크리닝 방법.
  7. 제 1 항 또는 제 2 항에
    상기 고농도의 포도당은 최소 25mM 인, 혈당조절이 필요한 질환 치료용의 저분자 화합물 기재 약물 스크리닝 방법.
  8. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 간세포는 일차 배양 세포, 확립된 세포 또는 실험동물의 형태로 제공되는 것인, 혈당조절이 필요한 질환 치료용의 저분자 화합물 기재 약물 스크리닝 방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 확립된 세포는 Huh7, AML12, 또는 HepG2인, 혈당 조절용 저분자 화합물 기재 약물 스크리닝 방법.
  10. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 혈당 조절용 저분자 화합물 기재 약물은 대사성 질환, 제 1 형 당뇨병, 제 2 형 당뇨병, 또는 당뇨병성 신증, 신경병증, 또는 망막병증을 포함하는 당뇨에 수반되는 합병증, 또는 염증성장질환(Inflammatory Bowl Disease)의 치료제로 사용되는 것인, 혈당조절이 필요한 질환 치료용의 저분자 화합물 기재 약물 스크리닝 방법.
  11. 코리녹세신(Corynoxeine), 이소르힌초필린(Isorhynchophylline), 또는 린초필린(Rhynchophylline)을 유효성분으로 포함하는 ITIH1를 표적으로 하는 혈당강하용 약학 조성물.
  12. 우고닌(Wogonin), 바이칼린(Baicalin), 바이칼레인(Baicalein), 우르솔산(Ursolic acid), 하이퍼사이드(Hyperoside), 퀘르세틴(Quercetin), 코리녹세신(Corynoxeine), 이소르힌초필린(Isorhynchophylline), 또는 린초필린(Rhynchophylline)을 인비트로의 간세포 또는 인간을 제외한 동물의 간세포에 처리하는 단계를 포함하는, 간세포에서 ITIH1의 농도를 감소시키는 방법.
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