KR20200115511A - 메디토프-이용 가능한 t 세포 - Google Patents

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KR20200115511A
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recombinant protein
cells
cancer
intracellular
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KR1020207021809A
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존 씨 윌리엄스
크리스틴 브라운
커트 젠킨스
이치우 쿠오
쳉-푸 쿠오
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시티 오브 호프
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Abstract

본원에는 신규한 치료 능력을 나타내고 치료 항체의 표적외 효과를 감소시킬 수 있는 조성물이 제공된다. 조성물은 T 세포에 의해 발현되는 경우 그들의 작용 부위에 치료 항체를 효율적으로 모집할 수 있는 재조합 단백질을 포함한다.

Description

메디토프-이용 가능한 T 세포
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2017년 12월 29일에 출원된 미국 가출원 번호 62/611,924 및 2018년 6월 4일에 출원된 미국 가출원 번호 62/680,442에 대한 우선권을 주장하며, 이들은 전체가 모든 목적으로 참조로 본원에 포함된다.
ASCII 파일로 제출된 "서열 목록", 표 또는 컴퓨터 프로그램 목록 부록에 대한 참조
2018년 12월 31일에 29,672 바이트, 기계 형식 IBM-PC, MS 윈도우 운영 체제로 작성된 파일 048440-621001WO_Sequence_Listing_ST25에 기록된 서열 목록은 참조로 본원에 포함된다.
발명의 요약
일 측면에서, 제1 재조합 단백질이 제공된다. 제1 재조합 단백질은 (i) 제1 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인; (ii) 제1 세포내 T 세포 신호전달 도메인; 및 (iii) 제1 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인을 제1 세포내 T 세포 신호전달 도메인에 연결하는 제1 막횡단 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 제1 재조합 단백질은 제1 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인을 제1 막횡단 도메인에 연결하는 제1 스페이서 영역을 포함한다. 실시양태에서, 제1 스페이서 영역은 제1 CH3 영역이다.
일 측면에서, 그의 실시양태를 포함하여 본원에 제공된 제1 재조합 단백질을 코딩하는 단리된 핵산이 제공된다.
일 측면에서, 그의 실시양태를 포함하여 본원에 제공된 핵산을 포함하는 발현 벡터가 제공된다. 실시양태에서, 벡터는 렌티바이러스 또는 온코-레트로바이러스이다.
일 측면에서, 그의 실시양태를 포함하여 본원에 제공된 발현 벡터를 포함하는 T 림프구가 제공된다.
일 측면에서, 그의 실시양태를 포함하여 본원에 제공된 제1 재조합 단백질을 포함하는 T 림프구가 제공된다.
일 측면에서, 그의 실시양태를 포함하여 본원에 제공된 제1 재조합 단백질을 포함하는 T 림프구가 제공되며, 여기서 막횡단 도메인은 T 림프구의 세포막 내에 있다.
일 측면에서, 암을 치료하는 방법이 제공된다. 방법은 유효량의 그의 실시양태를 포함하여 본원에 제공된 T 림프구를 암의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 제1 항원 결합 도메인 및 제2 항원 결합 도메인은 독립적으로 항암 항원 결합 도메인이다.
일 측면에서, 재조합 단백질이 제공된다. 재조합 단백질은 (i) 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인; (ii) 세포내 T 세포 신호전달 도메인; 및 (iii) 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인을 세포내 T 세포 신호전달 도메인에 연결하는 막횡단 도메인을 포함한다.
일 측면에서, 그의 실시양태를 포함하여 본원에 제공된 재조합 단백질을 코딩하는 단리된 핵산이 제공된다.
일 측면에서, 그의 실시양태를 포함하여 본원에 제공된 핵산을 포함하는 발현 벡터가 제공된다.
일 측면에서, 그의 실시양태를 포함하여 본원에 제공된 발현 벡터를 포함하는 T 림프구가 제공된다.
일 측면에서, 그의 실시양태를 포함하여 본원에 제공된 재조합 단백질을 포함하는 T 림프구가 제공된다.
일 측면에서, 그의 실시양태를 포함하여 본원에 제공된 재조합 단백질을 포함하는 T 림프구가 제공되며, 여기서 막횡단 도메인은 T 림프구의 세포막 내에 있다.
일 측면에서, 암을 치료하는 방법이 제공된다. 방법은 유효량의 그의 실시양태를 포함하여 본원에 제공된 T 림프구 및 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인에 결합할 수 있는 항원 결합 도메인을 암의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 항원 결합 도메인은 암 항원 결합 도메인이다.
도 1a-1c. 도 1a) 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포는 전형적으로 항원 특이적 단일쇄 Fab 가변부(예컨대, mAb의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인)를 CD3 제타 쇄에 융합시킴으로써 생성된다. 이와 같이, 각각의 CAR T 세포는 표적 특이성을 변화시키기 위해 새로운 유전자의 생성을 요구한다. 도 1b) 이 제한을 제거하기 위해, 출원인은 메디토프 기술을 이용하여 항체 단편을 조작된 T 세포에 '스냅(snap)'시켰다. 구체적으로, 출원인은 scFv를 cQFD 메디토프로 대체하였다. 도 1c) 단일 항원 특이적 CAR T 세포에 대한 현재 기술 및 메디토프 기술이 보편적 CAR을 생성하는 데 어떻게 사용될 수 있는지에 대한 만화적 설명.
도 2a-2c. 도 2a) CHO-S 세포를 벡터 없이(Mock), 부모(parental) CAR(1), 메디토프-CH3(3), 또는 메디토프-CD28(2)로 형질감염시켜, 형광 염료 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 647에 접합된 메디토프-이용 가능한(meditope-enabled) I83E 트라스투주맙 IgG(647^183E IgG), 형광 염료 알렉사 플루오르 647에 접합된 메디토프-이용 가능한 I83E 트라스투주맙 Fab(647^I83E Fab), 형광 염료 알렉사 플루오르 647에 접합된 비-메디토프-이용 가능한 이필리무맙 IgG(647^Ipi IgG)의 결합을 시험한다. 살아 있는 형질감염된 세포는 FSC/SSC → PI- → CD19+ 게이팅을 이용하여 확인되었다(도 3a 참조). 세포는 APC 신호의 평균 형광 강도(MFI)에 대해 분석되었다. 도 2b) 벡터 없이(Mock), 부모 CAR(1) 또는 메디토프-CD28(2)로 형질감염된 세포는 647^183E IgG, 647^I83E Fab 또는 647^Ipi IgG로의 염색 시 MFI의 이동을 나타내지 못하였다. 도 2c) 메디토프-CH3(3)으로 형질감염된 세포는 647^183E IgG 또는 647^I83E Fab로의 염색 시에는 MFI에서 상당한 이동을 나타내었지만, 647^Ipi IgG로의 염색 시에는 최소 이동만 나타내었다.
도 3a-3b. 유동 세포측정 분석을 위한 게이팅 전략. 도 3a) 세포를 FSC/SSC(좌측 패널), PI 염색(살아 있는 세포를 나타냄; 중간 패널) 및 CD19 발현(형질감염 마커; 우측 패널)에 의해 게이팅하였다. 도 3b) 게이팅된 세포의 추가 분석은 각각 항체 및 Her2 결합을 나타내는 647(좌측 패널) 및 VioBlue(우측 패널) 신호를 측정하였다.
도 4a-4c. 메디토프-이용 가능한 IgG 및 Fab는 메디토프-CH3 CAR에 결합한다. 도 4a) 살아 있는 형질감염된 세포는 FSC/SSC → PI- → CD19+ 게이팅을 이용하여 확인되었다. 세포는 APC 신호의 평균 형광 강도(MFI)에 대해 분석되었다. 염색이 없는 세포를 사용하여 APC+ 세포에 대한 게이트를 설정하였다. 비-메디토프-이용 가능한 647^Ipi IgG로 염색된 세포는 APC MFI에서 최소 이동을 나타내었다. 메디토프-이용 가능한 647^I83E IgG 및 Fab로 염색된 세포는 APC MFI에서 상당한 이동을 나타내었으며, 647-접합된 단백질의 메디토프-CH3 발현 세포에 대한 결합을 입증한다. 도 4b)이 경향은 메디토프-CD28 구축물에서는 보이지 않았다. 도 4c) 647^IgG 또는 647^Fab에 양성인 살아 있는 CD19+ 세포의 백분율(게이팅된 세포: FSC/SSC → PI- → CD19+ → APC+; 부모 집단의 APC+ 세포 빈도).
도 5a-5b. 메디토프-CH3 발현 세포는 메디토프-이용 가능한 항체에 결합하고, 이어서 항원에 결합할 수 있다. 도 5a) APC+인 메디토프-CH3 CAR 세포에서의 Her2 평균 형광 강도(MFI)의 히스토그램(게이팅된 세포: FSC/SSC → PI- → CD19+ → APC+). 도 5b) Her2에 대해 양성인 살아 있는 CD19+ 647+ 세포의 백분율(조부모 집단의 Her2+ 세포 빈도, 상기와 동일한 게이팅 전략).
도 6a-6c. 647+ Her2+ 이중-양성 세포의 확인. 살아 있는 형질감염된 세포는 FSC/SSC → PI- → CD19+ 게이팅을 이용하여 확인되었다(도 3a 참조). 이어서, 세포를 647(x-축) 및 Her2 수준(VioBlue)에 대해 분석하였다. 특히, 많은 647- 세포가 y-축에 있다. 도 6a) 메디토프-이용 가능한 647^I83E Fab로 염색된 세포의 분석. 도 6b) 메디토프-이용 가능한 647^I83E IgG로 염색된 세포의 분석. 도 6c) 비-메디토프-이용 가능한 647^Ipi IgG로 염색된 세포의 분석.
도 7. Her2+ 세포의 확인. 살아 있는 형질감염된 세포는 FSC/SSC → PI- → CD19+ 게이팅을 이용하여 확인되었다. 이어서, 게이트는 Her2+ 세포를 확인하기 위해 PacBlue^Her이 없는 샘플로부터의 분석을 이용하여 도출되었다. 이어서, 세포는 Her2(VioBlue) 수준에 대해 분석되었다.
도 8a-8b. 메디토프-이용 가능한 세툭시맙 및 트라스투주맙 Fab는 메디토프-CH3 CAR에 결합한다. 도 8a) 647^Fab에 대해 양성인 살아 있는 CD19+ 세포의 백분율 게이팅된 세포: FSC/SSC → PI- → CD19+ → APC+; 부모 집단의 APC+ 세포 빈도). 도 8b) 메디토프-CH3로 형질감염된 살아 있는 세포는 FSC/SSC → PI- → CD19+ 게이팅을 이용하여 확인되었다. 세포는 APC 신호의 평균 형광 강도(MFI)에 대해 분석되었다. 염색이 없는 세포를 사용하여 APC+ 세포에 대한 게이트를 설정하였다. 비-메디토프-이용 가능한 647^Ipi Fab로 염색된 세포는 APC MFI에서 최소 이동을 나타내었다. 메디토프-이용 가능한 647^I83E 세툭시맙(cetux) Fab 및 647^I83E 트라스투주맙(tras) Fab로 염색된 세포는 APC MFI에서 상당한 이동을 나타내었으며, 647-접합된 단백질의 메디토프-CH3 발현 세포에 대한 결합을 입증한다.
도 9a-9b. 647+ Her2+ 이중-양성 세포의 확인. 살아 있는 형질감염된 세포는 FSC/SSC → PI- → CD19+ 게이팅을 이용하여 확인되었다. 이어서, 세포는 647(x-축) 및 Her2 수준(퍼시픽 블루)에 대해 분석되었다. 도 9a) 메디토프-이용 가능한 647^I83E 세툭시맙(cetux) Fab로 염색된 세포의 분석. 도 9b) 메디토프-이용 가능한 647^I83E 트라스투주맙(tras) Fab로 염색된 세포의 분석.
도 10. 도면은 상이한 농도의 메디토프-이용 가능한 Her2를 사용한 난소암 세포주에서의 종양 사멸 검정을 나타낸다.
도 11. 도면은 상이한 농도의 메디토프-이용 가능한 Her2를 사용한 유방암 세포주에서의 종양 사멸 검정을 나타낸다.
도 12. 도면은 FabRack T 세포를 나타낸다.
도 13. 도면은 전환 가능한 Fab CAR-T 세포를 나타낸다.
도 14. 저캇(Jurkat) 세포는 메디토프-CAR로 형질도입되었고 말단절단된 CD19는 마커로서 공동 발현되었다. 형질도입 후, CD19 양성 세포는 하기 실험을 위해 분류되고 확장되었다.
도 15. 메디토프-CAR 발현 저캇 세포를 메디토프 부위가 있는 또는 없는 트라스투주맙과 함께 인큐베이션한 후, 2차 항-카파-647(Abcam #202832) 또는 항-인간-IgG Fc-488(ThermoFisher #H10120)로 염색하였다. 결과는 세포가 유동 세포측정에 의해 분석된 후 memAb 트라스투주맙만이 메디토프-CAR 발현 저캇 세포에 결합할 수 있음을 나타내었다.
도 16. 좌측: 암세포, Jurkat-NFAT-Luc 메디토프-CAR 세포 및 memAb 트라스투주맙을 백색 벽 96-웰 플레이트에서 공동 인큐베이션하였다. 도면에서 가장 높은 농도는 15 nM이며 4배 연속 희석이 뒤따른다. 6시간 인큐베이션한 후, 루시페라제 기질을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트 판독기를 사용하여 발광을 즉시 측정하였다. memAb 트라스투주맙의 존재 하에, 저캇 세포 활성화는 15 nM에서 후크(hook) 효과 설정에도 불구하고 용량 의존적으로 증가하였다. 각각의 세포주에 대한 EC50은 0.35 nM(SKOV3), 0.83 nM(SKBR3), 0.42 nM(MCF7), 0.27 nM(OVCAR3) 및 0.26 nM(BT474)이다. 저캇 세포 활성화 수준은 BT474 세포주를 제외한 암세포에서의 HER2 발현과 양적으로 연관되어 있다. BT474는 높은 HER2 발현을 갖지만, 다른 높은 HER2 발현 세포(SKOV3 및 SKBR3)와 동일한 수준으로 저캇 세포를 활성화시키지는 않는다. 우측: 5x105개 세포를 PBS 중의 1% FBS 중의 100 nM memAb 트라스투주맙으로 30분 동안 처리하였다. 3회 세척한 후, 세포를 2차 항-카파-647 항체로 30분 동안 표지하였다. 세포의 형광단 강도를 BD Accuri C6 유동 세포측정기로 분석하였다. 적색 피크는 2차 항-카파-647 항체 단독으로 처리된 세포이다. 녹색 피크는 memAb 트라스투주맙 및 2차 항-카파-647 항체로 처리된 세포이다. 유동 세포측정을 이용하여 2차 항체 단독으로 또는 memAb 트라스투주맙 및 2차 항체로 염색된 세포를 비교함으로써 HER2 발현 수준을 분석하였다. 중앙 형광 강도(MFI)는 MCF7 세포의 경우 338 및 985이고; SKBR3 세포의 경우 330 및 34405; BT474 세포의 경우 392 및 31720; SKOV3 세포의 경우 370 및 43191; OVCAR3 세포의 경우 307 및 1436이다. 높은 발현에서 낮은 발현까지의 HER2 발현을 갖는 세포는 SKOV3, SKBR3, BT474, OVCAR3 및 MCF7이다.
도 17. 좌측: 암세포, FabRack Jurkat-NFAT-Luc 세포 및 세툭시맙을 백색 벽 96-웰 플레이트에서 공동 인큐베이션하였다. 도면에서 가장 높은 농도는 60 nM이며 4배 연속 희석이 뒤따른다. 6시간 인큐베이션한 후, 루시페라제 기질을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트 판독기를 사용하여 발광을 즉시 측정하였다. 각각의 세포주에 대한 EC50은 0.14 nM(SKOV3), 0.12 nM(SKBR3), 0.12 nM(MCF7), 0.11 nM(OVCAR3) 및 1.1 nM(BT474)이다. 우측: 5*105개 세포를 1% FBS PBS 중의 100 nM 세툭시맙으로 30분 동안 처리하였다. 3회 세척한 후, 세포를 2차 항-카파-647 항체로 30분 동안 표지하였다. 세포의 형광단 강도를 BD Accuri C6 유동 세포측정기로 분석하였다. 적색 피크는 2차 항-카파-647 항체 단독으로 처리된 세포이다. 녹색 피크는 세툭시맙 및 2차 항-카파-647 항체로 처리된 세포이다. 중앙 형광 강도는 높은 발현에서 낮은 발현까지의 EGFR 발현을 갖는 세포가 OVCAR3(4819), SKOV3(4479), SKBR3(2865), BT474(651) 및 MCF7(480)임을 나타내었다.
도 18. 도면은 memAb 트라스투주맙 사전 혼합(pre-mix) 및 세척을 갖는 저캇 또는 암세포를 나타낸다. memAb 트라스투주맙 사전 결합에 이어 세척을 갖는 저캇 또는 암세포. 암세포(2.5 x 104/100 ul)를 96-웰 백색 벽 플레이트에 시딩하였다. 밤새 세포 부착 후, 플레이트의 배지를 제거하고 Jurkat-NFAT-Luc 메디토프-CAR 세포(1 x 105/60 ul)를 각각의 웰에 첨가하였다. memAb 트라스투주맙은 지속적으로 존재하거나 세척과 함께 Jurkat-NFAT-Luc medi-CAR 또는 암세포에 사전 결합되었다. (그래프의 막대는 좌측에서 우측으로 하기를 나타낸다: 처리 없음; 헤르셉틴(4 nM)이 지속적으로 존재; memAb 트라스투주맙(4 nM)이 지속적으로 존재; 사전 결합되고 이어서 세척된 memAb 트라스투주맙(100 nM)을 갖는 FabRack Jurkat-NFAT-Luc 세포; 사전 결합되고 이어서 세척된 memAb 트라스투주맙(100 nM)을 갖는 암세포.) 세포를 37℃에서 6시간 동안 인큐베이션한 다음, 50 ul 루시페라제 기질(Invivogen #rep-qlc2)을 각각의 웰에 첨가하였다. 발광은 바이오텍(Biotek)의 시너지(Synergy) 4 다중-검출 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 즉시 측정되었다.
도 19. 도면은 memAb 사전 결합을 갖는 T 세포(좌측) 및 memAb 사전 결합을 갖는 암세포(우측)를 나타낸다.
도 20. 도면은 헤르셉틴이 I83E 매개된 Jurkat-NFAT-Luc 활성화를 차단함을 나타낸다. memAb 트라스투주맙 및 헤르셉틴이 지속적으로 존재하였다. 암세포(2.5 x 104/100 ul)를 96-웰 백색 벽 플레이트에 시딩하였다. 밤새 세포 부착 후, 플레이트의 배지를 제거하고 Jukat-NFAT-Luc me-CAR 세포(1 x 105/60 ul)를 각각의 웰에 첨가하였다. memAb 트라스투주맙은 지속적으로 존재하거나 세척과 함께 저캇 또는 암세포에 사전 결합되었다. (그래프의 막대는 좌측에서 우측으로 하기를 나타낸다: memAb 트라스투주맙(4 nM)이 지속적으로 존재; memAb 트라스투주맙(4 nM) 및 헤르셉틴(40 nM)이 지속적으로 존재; memAb 트라스투주맙(4 nM) 및 헤르셉틴(400 nM)이 지속적으로 존재.) 세포를 37℃에서 6시간 동안 인큐베이션한 다음, 50 ul 루시페라제 기질(Invivogen #rep-qlc2)을 각각의 웰에 첨가하였다. 발광은 바이오텍의 시너지 4 다중-검출 마이크로플레이트 판독기에 의해 즉시 판독되었다. 4 nM memAb 트라스투주맙의 지속적 존재 하에서, Jurkat-NFAT-Luc medi-CAR 세포는 memAb 트라스투주맙에 의해 암세포에 결합함으로서 활성화되었다. 인큐베이션 동안 헤르셉틴의 지속적인 존재는 저캇 세포 활성화를 차단할 수 있으며, 이는 헤르셉틴이 우리의 memAb 트라스투주맙과 동일한 에피토프를 가지며 HER2 상의 동일한 결합 부위를 경쟁할 수 있기 때문이다. memAb 트라스투주맙(4 nM)의 100배 농도를 갖는 헤르셉틴(400 nM)은 저캇 세포 활성화를 거의 완전히 차단하며, 이는 저캇 세포 활성화가 헤르셉틴에 의해 인식되는 동일한 HER2 에피토프에 대한 memAb 트라스투주맙 결합에 의해 야기됨을 입증하였다.
도 21. 도면은 헤르셉틴이 저캇 세포의 memAb 트라스투주맙과의 사전 혼합 및 세척 후 memAb 매개된 Jurkat-NFAT-Luc 활성화를 차단함을 나타낸다. memAb 트라스투주맙은 먼저 저캇 세포에 사전 결합되고 세척된다. 헤르셉틴은 지속적으로 존재하였다. 암세포(2.5 x 104/100 ul)를 96-웰 백색 벽 플레이트에 시딩하였다. 밤새 세포 부착 후, 플레이트의 배지를 제거하고 Jukat-NFAT-Luc me-CAR 세포(1 x 105/60 ul)를 각각의 웰에 첨가하였다. memAb 트라스투주맙은 지속적으로 존재하거나 세척과 함께 Jurkat-NFAT-Luc medi-CAR 세포에 사전 결합되었다. (그래프의 막대는 좌측에서 우측으로 하기를 나타낸다: memAb 트라스투주맙(4 nM)이 지속적으로 존재; 사전 결합되고 이어서 세척된 memAb 트라스투주맙(100 nM)을 갖는 Jurkat-NFAT-Luc medi-CAR 세포; 사전 결합되고 이어서 세척된 memAb 트라스투주맙(100 nM)을 갖는 Jurkat-NFAT-Luc medi-CAR 세포 + 지속적으로 존재하는 헤르셉틴(40 nM); 사전 결합되고 이어서 세척된 memAb 트라스투주맙(100 nM)을 갖는 Jurkat-NFAT-Luc medi-CAR 세포 + 지속적으로 존재하는 헤르셉틴(400 nM).) 세포를 37℃에서 6시간 동안 인큐베이션한 다음, 50 ul 루시페라제 기질(Invivogen #rep-qlc2)을 각각의 웰에 첨가하였다. 발광은 바이오텍의 시너지 4 다중 검출 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 즉시 측정되었다. memAb 트라스투주맙 사전 결합에 이어서 세척된 Jurkat-NFAT-Luc medi-CAR 세포는, memAb이 지속적으로 존재하는 세포와 비교하여, 높은 HER2 발현 세포(SKBR3, BT474 및 SKOV3)와 공동 인큐베이션되는 경우 발광 활성이 상당히 감소되었지만, 낮은 HER2 발현 세포(MCF7 및 OVCAR3)에서는 그렇지 않았다. 인큐베이션 동안 헤르셉틴의 지속적인 존재는 저캇 세포 활성화를 차단할 수 있다. 각각의 저캇 세포 상의 medi-CAR 또는 각각의 암세포 상의 표적 분자의 수는 각각의 T 세포에서 얼마나 많은 활성화가 나타나는지 또는 얼마나 많은 T 세포가 활성화되는지를 결정할 수 있다.
도 22. 도면은 헤르셉틴이 암세포의 memAb과의 사전 혼합 및 세척 후 memAb 트라스투주맙 매개된 Jurkat-NFAT-Luc 활성화를 거의 차단하지 않았음을 나타낸다. memAb 트라스투주맙은 먼저 암세포에 사전 결합되고 세척된다. 헤르셉틴은 지속적으로 존재하였다. memAb 트라스투주맙 사전 결합에 이어서 세척을 갖는 암세포는 memAb이 지속적으로 존재하는 세포와 비교하여 발광 활성을 크게 감소시키지 않았다. 인큐베이션 동안 헤르셉틴의 지속적인 존재는 저캇 세포 활성화에 전혀 차단 효과를 갖지 않거나 일부 차단 효과를 가졌다. 이 데이터는 일단 memAb 트라스투주맙이 암세포 상의 HER2에 결합되면, 메디토프-결합 부위 없이는 트라스투주맙과 경쟁하기 어렵다는 것을 입증하였다. 암세포(2.5 x 104/100 ul)를 96-웰 백색 벽 플레이트에 시딩하였다. 밤새 세포 부착 후, 플레이트의 배지를 제거하고 Jukat-NFAT-Luc me-CAR 세포(1 x 105)를 각각의 웰에 첨가하였다. memAb 트라스투주맙은 지속적으로 존재하거나 세척과 함께 암세포에 사전 결합되었다. (그래프의 막대는 좌측에서 우측으로 하기를 나타낸다: memAb 트라스투주맙(4 nM)이 지속적으로 존재; memAb 트라스투주맙(100 nM)이 사전 결합되고 이어서 세척된 암세포; memAb 트라스투주맙(100 nM)이 사전 결합되고 이어서 세척된 암세포 + 지속적으로 존재하는 헤르셉틴(40 nM); memAb 트라스투주맙(100 nM)이 사전 결합되고 이어서 세척된 암세포 + 지속적으로 존재하는 헤르셉틴(400 nM).) 세포를 37℃에서 6시간 동안 인큐베이션한 다음, 50 ul 루시페라제 기질(Invivogen #rep-qlc2)을 각각의 웰에 첨가하였다. 발광은 바이오텍의 시너지 4 다중 검출 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 즉시 측정되었다.
도 23. 도면은 T 세포가 memAb 트라스투주맙 사전 혼합 및 세척을 갖는 암세포를 사멸시킨다는 것을 나타낸다. 생존률(%) = [Luc(암세포 + T 세포 + 항체) -Luc(T 세포 + 항체)]/[Luc(암세포 + T mock 세포) - Luc(T mock 세포)]. 0.1 nM 또는 0.5 nM mem 항체의 지속적 존재 하에서, FabRack T 세포 공동 인큐베이션을 갖는 암세포의 생존력은 mock T 세포 공동 인큐베이션을 갖는 암세포의 생존력에 비해 감소하였다. 세포 생존력은 유방암 세포에서는 0.1 및 0.5 nM에서 용량 의존적으로 감소한 반면, 난소암 세포에서는 이들 두 농도에서 유사한 생존력을 나타낸다. 항체 사전 결합 및 세척을 갖는 암세포는 지속적인 항체 처리를 갖는 암세포에 비해 생존력이 5-18% 역전됨에도 불구하고 인간 FabRack T 세포에 의해 여전히 사멸될 수 있다. 종양 사멸 검정을 위해, 암세포(2.5 x 104/100 ul) 및 인간 T 세포(6,250/100 ul)를 항체의 존재 또는 부재 하에 96-웰 둥근-바닥 플레이트에 시딩하였다. 72시간 인큐베이션한 후, 세포를 250 xg에서 5분 동안 원심분리하고, 각각의 웰에서 100 ul의 배지를 제거하였다. 세포 생존력을 시험하기 위해, 프로메가 셀타이터(Promega CellTiter) 키트로부터의 시약 100 ul을 각각의 웰에 첨가하였다. 2분 인큐베이션한 후, 100 ul의 혼합물을 백색 벽 96-웰 플레이트로 옮기고 바이오텍의 시너지 4 다중 검출 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 측정하였다.
도 24. 도면은 FabRack T 세포가 저용량의 memAb 트라스투주맙에서 암세포를 효과적으로 사멸시킨다는 것을 나타낸다. 암세포를 memAb 트라스투주맙의 존재 하에 3일 동안 mock T 세포 또는 FabRack T 세포와 함께 인큐베이션하였다. 이 데이터는 FabRack T 세포가 memAb 트라스투주맙을 통해 암세포에 결합하기 때문에 HER2 양성 암세포를 효과적으로 사멸시켰음을 나타내었다. memAb 트라스투주맙 및 FabRack T 세포와 함께 공동 인큐베이션된 암세포의 IC50은 0.33 nM(BT474), 0.11 nM(SKBR3), 0.069 nM(MCF7), 0.046 nM(SKOV3) 및 0.027 nM(OVCAR3)이다. 사멸 효과는 암세포 상에서의 HER2 발현 수준과 연관되지 않았다. 종양 사멸 검정을 위해, 암세포(2.5 x 104/100 ul) 및 인간 T 세포(6,250/100 ul)를 항체의 존재 또는 부재 하에 96-웰 둥근-바닥 플레이트에 시딩하였다. 72시간 인큐베이션한 후, 세포를 250 xg에서 5분 동안 원심분리하고, 각각의 웰에서 100 ul의 배지를 제거하였다. 세포 생존력을 시험하기 위해, 프로메가 셀타이터 키트의 시약 100 ul을 각각의 웰에 첨가하였다. 2분 인큐베이션한 후, 100 ul의 혼합물을 백색 벽 96-웰 플레이트로 옮기고 바이오텍의 시너지 4 다중 검출 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 측정하였다.
도 25. 도면은 scFv CAR 및 Fab CAR T 세포와 비교하여 메디토프-CAR(그의 실시양태를 포함하여 본원에 제공된 재조합 단백질을 발현하는 T 세포)의 종양 사멸을 나타낸다.
도 26. 도면은 난소암에서의 종양 사멸 검정을 나타낸다(FACS). 유동 세포측정을 이용하여, 양성 대조군으로서 HER2 scFv CAR 또는 HER2 Fab CAR T 세포와 인큐베이션된 암세포와 비교하여, FabRack T 세포 및 memAb 트라스투주맙과 공동 인큐베이션한 후에 얼마나 많은 암세포가 여전히 살아 있는지를 분석하였다. 3일 동안 인큐베이션한 후, FabRack T 세포 및 memAb 트라스투주맙과 공동 인큐베이션하는 경우 생존 가능한 암세포가 급격히 감소하였다. FabRack T 세포의 사멸 효과는 HER2 scFv CAR 또는 HER2 Fab CAR T 세포와 유사하거나 심지어 더 우수하였다.
도 27. 도면은 유방암에서의 종양 사멸 검정을 나타낸다(FACS). 유동 세포측정을 이용하여, 양성 대조군으로서 HER2 scFv CAR 또는 HER2 Fab CAR T 세포와 인큐베이션된 암세포와 비교하여, FabRack T 세포 및 memAb 트라스투주맙과 공동 인큐베이션한 후에 얼마나 많은 암세포가 여전히 살아 있는지를 분석하였다. 3일 동안 인큐베이션한 후, FabRack T 세포 및 memAb 트라스투주맙과 공동 인큐베이션하는 경우 생존 가능한 암세포가 급격히 감소하였다. FabRack T 세포의 사멸 효과는 HER2 scFv CAR 또는 HER2 Fab CAR T 세포와 유사하거나 심지어 더 우수하였다.
도 28. 도면은 T 세포에서 CD107a 및 IFN-g 발현의 히스토그램을 나타낸다. 유동 세포측정은 인간 T 세포의 약 40%가 메디토프-CAR로 성공적으로 형질도입되었음을 나타내었다. FabRack T 세포는 암세포가 memAb 트라스투주맙 사전 혼합 및 세척과 함께 또는 memAb 트라스투주맙의 지속적인 존재 하에 인큐베이션될 때 CD107a 및 IFNγ의 발현을 증가시켰다. CD107a 및 IFNγ 발현을 분석하기 위해, 암세포(5 x 104/100 ul)를 96-웰 둥근-바닥 플레이트에 시딩하고 인간 T Mock 또는 FabRack 세포(5 x 104/100 ul)를 기존의 암세포를 갖는 각각의 웰에 첨가하였다. 이펙터 대 표적의 비율은 1:1이다. CD107a-FITC(BD #555800) 항체 및 수송체 억제제 골기스톱(Golgistop)(BD #554724)을 인큐베이션 동안 각각의 웰에 첨가하였다. 5시간 인큐베이션한 후, 세포를 어둠 속에서 30분 동안 4℃에서 고정성 생존 염료(Thermo Fisher Scientific #L34965)로 염색하였다. 2회 세척한 후, 세포를 어둠 속에서 4℃에서 30분 동안 CD4-PerCP(BD #347324), CD8-APCCy7(BD #348793) 및 CD19-PECy7(BD #557835)로 염색하였다. 2회 세척한 후, 세포를 고정시키고 BD 시토픽스/시토펌(Cytofix/Cytoperm) 키트(BD 554714)로 투과시킨 후, 어둠 속에서 실온에서 30분 동안 IFN-APC(BD #554702)에 의해 세포내 IFN을 염색하였다. 2회 세척한 후, 세포를 100 ul 최종 부피로 재현탁시키고 40 ul의 샘플을 유동 세포측정기로 분석하였다.
도 29. 도면은 CD107a 및 IFN-γ를 나타낸다.
도 30. 도면은 I83E 트라스투주맙이 표적 세포 없이 FabRack T 세포를 활성화시킬 수 없음을 나타낸다. 시험에 이용 가능한 활성화 마커: 상향 조절 CD69(짧은 수명), CD137(4-1BB), CD44, CD27, CD45RO, CD154; 하향 조절 CD62L, CCR7(CD197) (CD25, CD69, CD137(4-1BB), KLRG, CD62L, CD45RO, CD27, CD28). FabRack T 세포는 5시간 동안 0.5 nM memAb 트라스투주맙과 인큐베이션하는 경우 CD107a 및 IFNγ의 발현 증가를 나타내지 않았다.
도 31. 4개의 구축물이 생성되었다. 상단의 2개 구성도는 형질전환된 세포에 대한 마커로서 사용될 말단절단된 CD19 유전자를 포함한다. 이들 둘은 공동 자극 신호, C28 또는 41BB이 다르다. 하단의 2개의 구성도는 CD19 판독 마커를 뺀 것과 동일하다.
도 32. 분류 전후의 Jurkat-NFAT-Luc 세포에서 말단절단된 CD19(CD19t) 발현의 히스토그램. 세포를 CD19-PE-Cy7로 염색하고 CD19t 양성을 BD Aria SORP 유동 세포측정기로 분류하였다. 형질전환된 세포의 균질 집단을 말단절단된 CD19 마커를 사용하여 세포 분류에 의해 단리하였다.
도. 33a-33c. 홈으로 가져가기: 도 33a) 메디토프-이용 가능한 IgG는 4개의 변이체(CD19t 및 CD28 또는 41BB 공동 자극 신호의 존재 또는 부재) 중 하나에만 결합한다. 도 33b) 비-형질전환된 저캇 세포는 IgG에 결합하지 않는다. 도 33c) 마찬가지로, 부모 항체(예컨대, 메디토프-이용 가능하지 않은 것)는 FabRack 저캇 세포에 결합하지 않는다. 다시 말해서, 상이한 memAb는 상이한 Fabrack 변이체와 조합될 수 있다.
도 34. 유방(MCF7, SKBR3 및 BT474) 또는 난소(SKOV3 및 OVCAR3) 암세포주는 HER2 또는 EGFR에 대한 memAb 결합을 나타내었다. memAb 결합이 존재 또는 부재하는 세포의 중앙 형광 강도(MFI)는 각각의 그래프 아래에 나타나 있다. Her2, EGFR 및 CD20 항원 밀도는 분석 세포측정을 이용하여 일련의 세포주에 대해 독립적으로 정량화되었으며, 우리는 이후 Fabrack의 항원 특이성 및 효능을 전환하는 능력을 광범위하게 시험하기 위해 사용한다.
도 35. 유방암 또는 난소암 세포(2.5 E4)를 96-웰 백색 벽 플레이트에 시딩하였다. 밤새 세포 부착 후, 플레이트의 배지를 제거하고 다양한 용량의 memAb(항-HER2 또는 항-EGFR)과 함께 Jukat-NFAT-Luc Fabrack 세포(CD28 버전, 1E5)를 각각의 웰에 첨가하였다. 세포를 37℃에서 6시간 동안 인큐베이션한 다음, 루시페라제 기질(Invivogen #rep-qlc2)을 각각의 웰에 첨가하였다. 발광은 바이오텍의 시너지 4 다중 검출 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 즉시 측정되었다. 'EC50'은 모든 세포에서 1 nM 미만이지만 플래토우는 크게 상이하였다. 증가는 BT474 세포를 제외하고 항원 발현과 상관관계가 있다. 이 예외는 추가 연구가 필요하다(Her3 또는 기타 분자 간섭?). 유사한 경향이 우측 패널에서 EGFR에 대해서도 관찰된다. 세툭시맙을 사용하는 경우, MFI는 BT474의 경우 651이고; MCF7의 경우 480; OVCAR3의 경우 4819; SKBR3의 경우 2865; SKOV3의 경우 4479이다. BT474는 MCF7보다 약간 더 많은 EGFR을 발현하지만, 플래토우에서의 경향은 항원 밀도를 따르는 경향이 있다. BT474 세포주의 특성 중 일부는 웹 사이트 ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3236329/에서 찾을 수 있다.
도 36. CD19 발현 암세포(5 E4)를 96-웰 백색 벽 플레이트에 시딩하고 다양한 용량의 CD19 memAb과 함께 Jukat-NFAT-Luc Fabrack 세포(41BB 또는 CD28 버전, 1E5)와 공동배양하였다. 세포를 37℃에서 6시간 동안 인큐베이션한 다음, 루시페라제 기질(Invivogen #rep-qlc2)을 각각의 웰에 첨가하였다. 발광은 바이오텍의 시너지 4 다중 검출 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 즉시 측정되었다. 좌측 패널은 상이한 CD19 발현 세포가 표적화될 수 있음을 나타낸다. 플래토우는 항원 밀도에 따라 다르다. Raji에 대한 MFI는 21566이고; Daudi의 경우 12263이고; Sup-B15의 경우 12617이다. 우측 패널은 CD28 활성화 신호가 41BB보다 강하다는 것을 나타낸다.
도 37. memAb 및 표적 세포의 존재 하에 FabRack 저캇 세포의 활성화. 상이한 용량의 memAb 트라스투주맙 IgG 또는 Fab가 6시간 동안 FabRack 저캇 세포 및 표적 세포를 함유하는 웰에 존재한다. 인큐베이션 종료 시, 루시페라제 기질을 각각의 웰에 첨가하고, 발광을 플레이트 판독기로 즉시 판독하였다. 유방암 또는 난소암 세포(2.5 E4)를 96-웰 백색 벽 플레이트에 시딩하였다. 밤새 세포 부착 후, 플레이트의 배지를 제거하고 다양한 용량의 memAb 트라스투주맙 또는 비-memAb 페르투주맙과 함께 Jukat-NFAT-Luc Fabrack 세포(CD28 버전, 1E5)를 각각의 웰에 첨가하였다. 세포를 37℃에서 6시간 동안 인큐베이션한 다음, 루시페라제 기질(Invivogen #rep-qlc2)을 각각의 웰에 첨가하였다. 발광은 바이오텍의 시너지 4 다중 검출 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 즉시 측정되었다. 우리의 FACS 데이터에 기초하는 경우, MCF7은 가장 적은 양의 Her2를 나타낸다(MFI = 985). OvCAR3은 약간 더 발현한다(MFI = 1435). SKBR3(MFI = 34405) 및 SKOV3(MFI = 43191)은 MCF7 및 OvCAR3보다 훨씬 더 많이 발현한다. Her2에 또한 결합하는 페르투주맙은 메디토프 이용 가능하지 않지만 Fc를 함유한다. (예상된 바와 같이) 그것이 않는다는 사실은 메디토프-이용 가능한 Fab/Mab이 필요하다는 것을 나타낸다. 후크 효과는 IgG 형식을 사용하는 모든 세포주에서 효과가 있다. 이 효과는 '낮은' 항원 밀도를 가진 세포에서 초기에 설정된다('피트'의 피크는 MCF7 및 OvCAR3의 경우 10 nm 미만이고, SKBR3 및 SKOV3의 경우 10 nM 초과이다). 이 발견은 낮은 농도에서 포화되는 세포 유래된 항원과 일치한다. 원자가는 강력한 영향을 미친다(예컨대, 후크 효과는 Fab {1가}에 비해 IgG {2가} 사용 시 더 낮은 농도에서 설정된다). 흥미롭게도,'플래토우'는 Fab을 사용하면 훨씬 더 높다. 차이가 있다는 사실은 memAb의 특성을 조정하여 영향을 최적화할 수 있음을 나타낸다. 또한, 후크 효과를 안전 메커니즘으로 사용할 수 있다고 제안한다. N.b., 도 8 및 도 9에서 후크 효과는 명확하지 않았다. 이것은 부분적으로 그들 연구에서 사용된 농도의 범위가 더 낮기 때문이다(항체 농도는 10 nM까지만 되었고, 여기서는 1 uM으로 간다). 후크 효과에 대한 정보는 웹사이트 en.wikipedia.org/wiki/Hook_effect에서 찾을 수 있다.
도 38. 4 nM memAb 트라스투주맙, 표적 세포에 대한 memAb 트라스투주맙 사전 결합 또는 FabRack 저캇 세포에 대한 memAb 트라스투주맙 사전 결합의 존재 하에서 암세포와의 공동배양으로 FabRack 저캇 세포의 활성화. 100 nM memAb 트라스투주맙 사전 결합을 갖는 암세포 또는 FabRack 저캇 세포는 잇달아 세척되었다. 4 nM 헤르셉틴 처리를 갖는 FabRack 저캇 세포의 활성화 수준은 처리 없음과 유사하다. 방법: 암세포(2.5 x 104/100 ul)를 96-웰 백색 벽 플레이트에 시딩하였다. 밤새 세포 부착 후, 플레이트의 배지를 제거하고 Jurkat-NFAT-Luc 메디토프-CAR 세포(1 x 105/60 ul)를 각각의 웰에 첨가하였다. memAb 트라스투주맙은 지속적으로 존재하거나 세척과 함께 Jurkat-NFAT-Luc medi-CAR 또는 암세포에 사전 결합되었다. 그래프의 막대는 좌측에서 우측으로 하기를 나타낸다: memAb 트라스투주맙(4 nM)이 지속적으로 존재, memAb 트라스투주맙(100 nM) 사전 결합에 이어 세척된 FabRack Jurkat-NFAT-Luc 세포, memAb 트라스투주맙(100 nM) 사전 결합에 이어 세척된 암세포, 헤르셉틴(4 nM)이 지속적으로 존재, 및 처리 없음. 세포를 37℃에서 6시간 동안 인큐베이션한 다음, 50 ul 루시페라제 기질(Invivogen #rep-qlc2)을 각각의 웰에 첨가하였다. 발광은 바이오텍의 시너지 4 다중 검출 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 즉시 측정되었다. 모든 경우에서, Jurkat-NFAT-Luc,'메디토프 CAR'와 혼합된 종양 세포에 4 nM의 memAb 트라스투주맙의 첨가가 가장 큰 신호를 생성하였다. 다른 2개의 샘플을 사전 인큐베이션하고, 세척한 다음, 제3 성분에 첨가하였다. 하나의 경우에, memAB 트라스투주맙를 종양 세포에 첨가하고, 세척한 다음, Jurkat-NFAT-Luc,'메디토프 CAR'에 노출시켰다. 다른 경우에, memAB 트라스투주맙를 Jurkat-NFAT-Luc,'메디토프 CAR'에 첨가하고, 세척한 다음, 종양 세포에 첨가하였다. 항원 발현이 높은 세포의 경우, 종양 세포의 사전처리는 보다 높은 활성화를 유도하였다. 항원 발현이 낮은 세포(MCF7 및 OVCAR3)의 경우, Jurkat-NFAT-Luc,'메디토프 CAR' 세포의 사전 인큐베이션은 더 높은 수준의 활성화를 유도하였다. 세포를 '세척'한 후 memAb의 농도는 알려져 있지 않지만 확실히 4 nM 미만임을 주목하는 것이 중요하다. 이러한 상이한 처리가 4 nM 처리에서 더 높은 신호를 설명할 가능성이 있다.
도 39. 헤르셉틴은 암세포 및 4 nM memAb 트라스투주맙과 공동 인큐베이션된 FabRack 저캇 세포의 활성화를 차단하였다. 헤르셉틴 및 memAb 트라스투주맙은 전체 처리 기간 동안 지속적으로 존재하였다. 방법: 암세포(2.5 x 104/100 ul)를 96-웰 백색 벽 플레이트에 시딩하였다. 밤새 세포 부착 후, 플레이트의 배지를 제거하고 Jukat-NFAT-Luc me-CAR 세포(1 x 105/60 ul)를 각각의 웰에 첨가하였다. 그래프의 막대는 좌측에서 우측으로 하기를 나타낸다: memAb 트라스투주맙(4 nM)이 지속적으로 존재, memAb 트라스투주맙(4 nM) 및 헤르셉틴(40 nM)이 지속적으로 존재, 및 memAb 트라스투주맙(4 nM) 및 헤르셉틴(400 nM)이 지속적으로 존재. 세포를 37℃에서 6시간 동안 인큐베이션한 다음, 50 ul 루시페라제 기질(Invivogen #rep-qlc2)을 각각의 웰에 첨가하였다. 발광은 바이오텍의 시너지 4 다중 검출 마이크로플레이트 판독기에 의해 즉시 판독되었다. 결과: 4 nM memAb 트라스투주맙이 지속적으로 존재하는 경우, memAb 트라스투주맙에 의한 암세포에 대한 결합으로 인해 Jurkat-NFAT-Luc medi-CAR 세포가 활성화되었다. 인큐베이션 동안 헤르셉틴의 지속적인 존재는 저캇 세포 활성화를 차단할 수 있으며, 이는 헤르셉틴이 우리의 memAb 트라스투주맙과 동일한 에피토프를 갖고 HER2 상의 동일한 결합 부위를 경쟁할 수 있기 때문이다. memAb 트라스투주맙(4 nM)의 100배 농도를 갖는 헤르셉틴(400 nM)은 저캇 세포 활성화를 거의 완전히 차단하며, 이는 저캇 세포 활성화가 헤르셉틴에 의해 인식되는 동일한 HER2 에피토프에 대한 memAb 트라스투주맙 결합에 의해 야기됨을 입증하였다. Fabrack T 세포의 활성화는 메디토프 상호작용을 필요로 하며, 제안된 작용 메카니즘의 추가 증거를 제공한다.
도 40. 암세포에 대한 헤르셉틴 사전 결합은 암세포 및 4 nM memAb 트라스투주맙과 공동 인큐베이션된 FabRack 저캇 세포의 활성화를 차단하였다. 40 nM 또는 400 nM 헤르셉틴 사전 결합을 갖는 암세포를 잇달아 세척하였다. 헤르셉틴과 memAb 트라스투주맙의 유일한 차이점은 나중에 메디토프가 이용 가능하게 되었다는 것이다. 헤르셉틴으로 세포를 사전 처리함으로써 항원에 대한 접근이 차단된다. memAb 트라스투주맙/Fabrack 저캇 처리 전에 헤르셉틴 처리된 세포를 세척하면 결합되지 않은 헤르셉틴이 제거된다. 그러나, 결합된 헤르셉틴은 시간이 지남에 따라 세포로부터 분리될 것이다. 따라서, 활성화 감소는 이 실험에서 극적이지 않다(도 41과 비교됨).
도 41. 헤르셉틴은 memAb 사전 결합을 갖는 암세포와의 공동배양에서 FabRack 저캇 세포의 활성화를 거의 차단하지 않는다. 100 nM memAb 트라스투주맙 사전 결합을 갖는 암세포를 잇달아 세척하였다. memAb 트라스투주맙 사전 결합에 이어서 세척을 갖는 암세포는 발광 활성을 급격히 감소시키지 않았다. 인큐베이션 동안 헤르셉틴의 지속적인 존재는 저캇 세포 활성화에 대해 적은 차단 효과를 가졌다. 이 데이터는 일단 memAb 트라스투주맙이 암세포 상의 HER2에 결합되면, 임상 트라스투주맙에 의해 결합이 미미하게 차단됨을 입증하였다. 방법: 암세포(2.5 x 104/100 ul)를 96-웰 백색 벽 플레이트에 시딩하였다. 밤새 세포 부착 후, 플레이트의 배지를 제거하고 Jukat-NFAT-Luc me-CAR 세포(1 x 105)를 각각의 웰에 첨가하였다. memAb 트라스투주맙은 지속적으로 존재하거나 세척과 함께 암세포에 사전 결합되었다. (그래프의 막대는 좌측에서 우측으로 하기를 나타낸다: memAb 트라스투주맙(4 nM)이 지속적으로 존재; memAb 트라스투주맙(100 nM)이 사전 결합되고 이어서 세척된 암세포; memAb 트라스투주맙(100 nM)이 사전 결합되고 이어서 세척된 암세포 + 지속적으로 존재하는 헤르셉틴(40 nM); memAb 트라스투주맙(100 nM)이 사전 결합되고 이어서 세척된 암세포 + 지속적으로 존재하는 헤르셉틴(400 nM).) 세포를 37℃에서 6시간 동안 인큐베이션한 다음, 50 ul 루시페라제 기질(Invivogen #rep-qlc2)을 각각의 웰에 첨가하였다. 발광은 바이오텍의 시너지 4 다중 검출 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 즉시 측정되었다. memAb 트라스투주맙이 세포에 결합되면, 헤르셉틴이 세포 유래된 항원과 결합하는 것을 차단한다.
도 42. FabRack T 세포의 활성화 마커 및 시토카인의 발현. FabRack T 세포를 0.5 nM memAb 트라스투주맙 존재 하에 5시간 동안 난소암 세포, SKOV3 및 OVCAR3, 또는 유방암 세포, SKBR3, BT474 및 MCF7과 공동 인큐베이션하였다. 이펙터 대 표적 세포의 비는 1:1이다. HER2 scFv 및 Fab CAR을 양성 대조군으로 사용하였다. 5시간 인큐베이션한 후, 활성화 마커를 유동 세포측정으로 분석하였다. 이 실험에는 많은 대조군이 사용되었다. 여기에 사용된 scFv CAR 및 Fab CAR의 CDR 루프는 Fabrack에 사용된 memAb와 동일하다. mock는 비-형질전환된 T 세포이다. 세포 측정을 이용하여 T 세포 활성화에 대한 마커인 CD69 및 CD25의 수준을 측정하였다. 종양 세포의 부재 하에 어떠한 변이체의 활성화도 관찰되지 않았다. 또한, 항원 보유 종양 세포의 존재 하에 Fabrack T 세포(memAb 없음), mock 또는 mock 및 I83E memAb 트라스투주맙에 대해 활성화가 거의 또는 전혀 관찰되지 않는다. 마지막으로, Fabrack T 세포 + I83E memAb 트라스투주맙 및 scFV CAR T 세포에 대해 T 세포 활성화의 상당한 증가가 관찰되었다. Fab-CAR T 세포도 활성화되었지만 더 많은 가변성을 나타내었다.
도 43. FabRack T 세포를 0.5 nM memAb 트라스투주맙 존재 하에 5시간 동안 난소암 세포, SKOV3 및 OVCAR3, 또는 유방암 세포, SKBR3, BT474 및 MCF7과 공동 배양하였다. 이펙터 대 표적 세포의 비는 1:1이다. HER2 scFv CAR을 양성 대조군으로 사용하였다. 5시간 인큐베이션한 후, 탈과립화 마커 CD107a 및 IFNγ를 유동 세포측정에 의해 분석하였다. Fab T 세포는 종래의 CAR T 세포와 유사한 방식으로 행동한다.
도 44. 암세포를 3일 동안 다양한 용량의 memAb 트라스투주맙의 존재 하에 mock T 세포 또는 FabRack T 세포와 함께 인큐베이션하였다. 이펙터 대 표적 세포의 비는 1:4이다. 인큐베이션 종료 시, 프로메가 셀타이터 키트의 지침에 기초하여 세포 생존력을 측정하였다. 결과: 암세포를 memAb 트라스투주맙의 존재 하에 3일 동안 mock T 세포 또는 FabRack T 세포와 함께 인큐베이션하였다. 이 데이터는 FabRack T 세포가 memAb 트라스투주맙을 통해 암세포에 결합하기 때문에 HER2 양성 암세포를 효과적으로 사멸시켰음을 나타낸다. memAb 트라스투주맙 및 FabRack T 세포와 공동 인큐베이션된 암세포의 IC50은 0.33 nM(BT474), 0.11 nM(SKBR3), 0.069 nM(MCF7), 0.046 nM(SKOV3) 및 0.027 nM(OVCAR3)이다. 사멸 효과는 암세포 상에서의 HER2 발현 수준과 연관되지 않았다. 방법: 종양 사멸 검정을 위해, 암세포(2.5 x 104/100 ul) 및 인간 T 세포(6,250/100 ul)를 항체의 존재 또는 부재 하에 96-웰 둥근-바닥 플레이트에 시딩하였다. 72시간 인큐베이션한 후, 세포를 250 xg에서 5분 동안 원심분리하고, 각각의 웰에서 100 ul의 배지를 제거하였다. 세포 생존력을 시험하기 위해, 프로메가 셀타이터 키트로부터의 시약 100 ul을 각각의 웰에 첨가하였다. 2분 인큐베이션한 후, 100 ul의 혼합물을 백색 벽 96-웰 플레이트로 옮기고 바이오텍의 시너지 4 다중 검출 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 측정하였다.
도 45. memAb 트라스투주맙 및 FabRack T 세포와 공동 인큐베이션된 암세포의 IC50은 0.33 nM(BT474), 0.11 nM(SKBR3), 0.069 nM(MCF7), 0.046 nM(SKOV3) 및 0.027 nM(OVCAR3)이다.
도 46. 결과: 0.1 nM 또는 0.5 nM memAb 항체가 지속적으로 존재하는 경우 FabRack T 세포 공동 인큐베이션을 갖는 암세포의 생존력(중앙 막대)은 mock T 세포 공동 인큐베이션을 갖는 것(좌측 막대)에 비해 감소하였다. 유방암 세포에서 세포 생존율은 0.1 및 0.5 nM에서 용량 의존적으로 감소한 반면, 난소암 세포는 이들 두 농도에서 유사한 생존력을 나타낸다. 항체 사전 결합 및 세척을 갖는 암세포(우측 막대)는 지속적인 항체 처리를 갖는 암세포와 비교하여 생존력이 5-18% 역전됨에도 불구하고 인간 FabRack T 세포에 의해 여전히 사멸될 수 있다. 방법: 종양 사멸 검정을 위해, 암세포(2.5 x 104/100 ul) 및 인간 T 세포(6,250/100 ul)를 memAb 항체의 존재 또는 부재 하에 96-웰 둥근-바닥 플레이트에 시딩하였다. 72시간 인큐베이션한 후, 세포를 250 xg에서 5분 동안 원심분리하고, 각각의 웰에서 100 ul의 배지를 제거하였다. 세포 생존력을 시험하기 위해, 프로메가 셀타이터 키트로부터의 시약 100 ul을 각각의 웰에 첨가하였다. 2분 인큐베이션한 후, 100 ul의 혼합물을 백색 벽 96-웰 플레이트로 옮기고 바이오텍의 시너지 4 다중 검출 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 측정하였다.
도 47. 유동 세포측정을 이용하여 DAPI 염색 후 암세포의 생존을 분석하였다. HER2 scFv CAR 및 HER2 Fab CAR을 양성 대조군으로 사용하였다. 결과: 유동 세포측정을 이용하여 양성 대조군으로서 HER2 scFv CAR 또는 HER2 Fab CAR T 세포와 인큐베이션된 암세포와 비교하여 FabRack T 세포 및 memAb 트라스투주맙와 공동 인큐베이션 후 얼마나 많은 암세포가 여전히 생존하는지를 분석하였다. 3일 동안 인큐베이션한 후, FabRack T 세포 및 memAb 트라스투주맙과 공동 인큐베이션한 경우 생존 가능한 암세포가 급격히 감소하였다. FabRack T 세포의 사멸 효과는 HER2 scFv CAR 또는 HER2 Fab CAR T 세포와 유사하거나 심지어 더 우수하였다. 대안적인 방법을 이용하여 세포 생존력을 판독하면 비슷한 결과가 나온다
도 48. 유동 세포측정을 이용하여 DAPI 염색 후 암세포의 생존을 분석하였다. HER2 scFv CAR 및 HER2 Fab CAR을 양성 대조군으로 사용하였다. 결과: 유동 세포측정을 이용하여 양성 대조군으로 HER2 scFv CAR 또는 HER2 Fab CAR T 세포와 인큐베이션된 암세포와 비교하여 FabRack T 세포 및 memAb 트라스투주맙과 공동 인큐베이션된 후 얼마나 많은 암세포가 여전히 생존하는지를 분석하였다. 3일 동안 인큐베이션한 후, FabRack T 세포 및 memAb 트라스투주맙과 공동 인큐베이션한 경우 생존 가능한 암세포가 급격히 감소하였다. FabRack T 세포의 사멸 효과는 HER2 scFv CAR 또는 HER2 Fab CAR T 세포와 유사하거나 심지어 더 우수하였다.
도 49. 표적 세포 및 상이한 농도의 memAb 트라스투주맙과의 공동 배양에서 T 세포수의 배수 변화. 인큐베이션 동안 이펙터 대 표적 세포의 비는 1:4이다. 이들 실험은 T 세포의 활성화를 나타내며, memAb의 존재에 의존하는 세포 증식을 초래한다.
도 50. 유방암 세포(2.5 x104)를 96-웰 백색 벽 플레이트에 시딩하였다. 밤새 세포 부착 후, 플레이트의 배지를 제거하고, 다양한 용량의 2N1 memAb와 함께 Jukat-NFAT-Luc Fabrack 세포(41BB 버전, 1 x 105)를 각각의 웰에 첨가하였다. 세포를 37℃에서 6시간 동안 인큐베이션한 다음 루시페라제 기질을 각각의 웰에 첨가하였다. 발광은 바이오텍의 시너지 4 다중 검출 마이크로플레이트 판독기에 의해 즉시 판독되었다.
정의
본 발명의 다양한 실시양태 및 측면이 본원에서 제시되고 설명되었지만, 이러한 실시양태 및 측면이 단지 예로서 제공된다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 다수의 변형, 변화 및 치환이 이제 본 발명을 벗어나지 않으면서 당업자에게 일어날 것이다. 본원에 기재된 본 발명의 실시양태에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실시하는 데 사용될 수 있음을 이해해야 한다.
본원에서 사용된 섹션 제목은 단지 조직 목적을 위한 것이며 기재된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 특허, 특허 출원, 기사, 서적, 매뉴얼 및 논문을 포함하지만 이에 제한되지 않는 본 출원에 인용된 모든 문서 또는 문서의 일부는 임의의 목적을 위해 전체가 참고로 명백하게 포함된다.
본원에 사용된 약어는 화학 및 생물 분야에서 통상적인 의미를 갖는다. 본원에 기재된 화학 구조 및 화학식은 화학 분야에 공지된 화학 원자가 표준 규칙에 따라 구성된다.
치환기가 좌측에서 우측으로 작성된 통상적인 화학식에 의해 특정되는 경우, 이들은 우측에서 좌측으로 구조를 작성함으로써 야기되는 화학적으로 동일한 치환기를 동일하게 포함한다. 예컨대, -CH2O-는 -OCH2-와 동일하다.
용어 "알킬"은 그 자체로 또는 다른 치환기의 일부로서, 달리 언급되지 않는 한, 완전히 포화, 일불포화 또는 다불포화될 수 있는 선형(즉, 비분지형) 또는 분지형 비환식 탄소쇄 (또는 탄소) 또는 그의 조합을 의미하고, 지정된 탄소 원자 수를 갖는 이가 및 다가 라디칼을 포함할 수 있다(즉, C1-C10은 1 내지 10개의 탄소를 의미함). 포화 탄화수소 라디칼의 예는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, t-부틸, 이소부틸, sec-부틸, (시클로헥실)메틸, 예컨대 n-펜틸, n-헥실, n-헵틸, n-옥틸 등의 상동체 및 이성체와 같은 기를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 불포화된 알킬기는 하나 이상의 이중 결합 또는 삼중 결합을 갖는 것이다. 불포화된 알킬기의 예는 비닐, 2-프로페닐, 크로틸, 2-이소펜테닐, 2-(부타디에닐), 2,4-펜타디에닐, 3-(1,4-펜타디에닐), 에티닐, 1- 및 3-프로피닐, 3-부티닐, 및 더 높은 상동체 및 이성체를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 알콕시는 산소 링커(-O-)를 통해 분자의 나머지 부분에 부착된 알킬이다. 알킬 모이어티는 알케닐 모이어티일 수 있다. 알킬 모이어티는 알키닐 모이어티일 수 있다. 알킬 부분은 완전히 포화될 수 있다.
용어 "알킬렌"은 그 자체로 또는 다른 치환기의 일부로서, 달리 언급되지 않는 한, -CH2CH2CH2CH2-로 예시되나 이에 제한되지 않는 알킬로부터 유도된 이가 라디칼을 의미한다. 전형적으로, 알킬 (또는 알킬렌)기는 1 내지 24개의 탄소 원자를 가질 것이며, 10개 이하의 탄소 원자를 갖는 기가 본 발명에서 바람직하다. "저급 알킬" 또는 "저급 알킬렌"은 일반적으로 8개 이하의 탄소 원자를 갖는 단쇄 알킬 또는 알킬렌기이다. 용어 "알케닐렌"은 그 자체로 또는 다른 치환기의 일부로서, 달리 언급되지 않는 한 알켄으로부터 유도된 이가 라디칼을 의미한다.
용어 "헤테로알킬"은 그 자체로 또는 다른 용어와 조합하여, 달리 언급되지 않는 한, 적어도 하나의 탄소 원자 및 적어도 하나의 헤테로원자(예컨대, O, N, P, Si 또는 S)를 포함하는 안정한 비환식 직쇄 또는 분지쇄 또는 그의 조합을 의미하며, 여기서 질소 및 황 원자는 임의적으로 산화될 수 있고, 질소 헤테로원자는 임의적으로 4급화될 수 있다. 헤테로원자(들) O, N, P, S 및 Si는 헤테로알킬기의 임의의 내부 위치에 또는 알킬기가 분자의 나머지 부분에 부착되는 위치에 배치될 수 있다. 예는 -CH2-CH2-O-CH3, -CH2-CH2-NH-CH3, -CH2-CH2-N(CH3)-CH3, -CH2-S-CH2-CH3, -CH2-CH2, -S(O)-CH3, -CH2-CH2-S(O)2-CH3, -CH=CH-O-CH3, -Si(CH3)3, -CH2-CH=N-OCH3, -CH=CH-N(CH3)-CH3, -O-CH3, -O-CH-2-CH3, 및 -CN을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 예컨대, -CH2-NH-OCH3 및 -CH2-O-Si(CH3)3과 같이 최대 2개 또는 3개의 헤테로원자가 연속적일 수 있다. 헤테로알킬 모이어티는 하나의 헤테로원자(예컨대, O, N, S, Si 또는 P)를 포함할 수 있다. 헤테로알킬 모이어티는 2개의 임의적으로 상이한 헤테로원자(예컨대, O, N, S, Si 또는 P)를 포함할 수 있다. 헤테로알킬 모이어티는 3개의 임의적으로 상이한 헤테로원자(예컨대, O, N, S, Si 또는 P)를 포함할 수 있다. 헤테로알킬 모이어티는 4개의 임의적으로 상이한 헤테로원자(예컨대, O, N, S, Si 또는 P)를 포함할 수 있다. 헤테로알킬 모이어티는 5개의 임의적으로 상이한 헤테로원자(예컨대, O, N, S, Si 또는 P)를 포함할 수 있다. 헤테로알킬 모이어티는 최대 8개의 임의적으로 상이한 헤테로원자(예컨대, O, N, S, Si 또는 P)를 포함할 수 있다.
마찬가지로, 용어 "헤테로알킬렌"은 그 자체로 또는 다른 치환기의 일부로서, 달리 언급되지 않는 한, -CH2-CH2-S-CH2-CH2- 및 -CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-로 예시되지만 이에 제한되지는 않는 헤테로알킬로부터 유도된 이가 라디칼을 의미한다. 헤테로알킬렌기의 경우, 헤테로원자는 또한 쇄 말단 중 하나 또는 둘 모두를 차지할 수 있다(예컨대, 알킬렌옥시, 알킬렌디옥시, 알킬렌아미노, 알킬렌디아미노 등). 또한, 알킬렌 및 헤테로알킬렌 연결기의 경우, 연결기의 배향이 연결기의 화학식이 작성되는 방향에 의해 암시되지 않는다. 예컨대, 화학식 -C(O)2R'-은 -C(O)2R'- 및 -R'C(O)2- 둘 다를 나타낸다. 전술된 바와 같이, 본원에 사용된 헤테로알킬기는 헤테로원자를 통해 분자의 나머지에 부착된 기, 예컨대 -C(O)R', -C(O)NR', -NR'R'', -OR', -SR', 및/또는 -SO2R'를 포함한다. "헤테로알킬"이 언급되고 이어서 NR'R''등과 같은 특정 헤테로알킬기가 언급되는 경우, 용어 헤테로알킬 및 NR'R''는 중복되거나 상호 배타적이지 않은 것으로 이해될 것이다. 오히려, 특정 헤테로알킬기는 명료성을 추가하기 위해 언급된다. 따라서, 용어 "헤테로알킬"은 본원에서 NR'R'' 등과 같은 특정 헤테로알킬기를 배제하는 것으로 해석되어서는 안된다.
용어 "시클로알킬" 및 "헤테로시클로알킬"은 그 자체로 또는 다른 용어와 조합하여, 달리 언급되지 않는 한, 각각 "알킬" 및 "헤테로알킬"의 비-방향족 시클릭 버전을 의미하며, 여기서 고리 또는 고리들을 구성하는 탄소는 비-수소원자와의 결합에 참여하는 모든 탄소 원자가로 인해 반드시 수소에 결합될 필요는 없다. 또한, 헤테로시클로알킬의 경우, 헤테로원자는 헤테로사이클이 분자의 나머지 부분에 부착되는 위치를 차지할 수 있다. 시클로알킬의 예는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 1-시클로헥세닐, 3-시클로헥세닐, 시클로헵틸, 3-히드록시-시클로부트-3-에닐-1,2, 디온, 1H-1,2,4-트리아졸릴-5(4H)-온, 4H-1,2,4-트리아졸릴 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 헤테로시클로알킬의 예는 1-(1,2,5,6-테트라히드로피리딜), 1-피페리디닐, 2-피페리디닐, 3-피페리디닐, 4-모르폴리닐, 3-모르폴리닐, 테트라히드로푸란-2-일, 테트라히드로푸란-3-일, 테트라히드로티엔-2-일, 테트라히드로티엔-3-일, 1-피페라지닐, 2-피페라지닐 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. "시클로알킬렌" 및 "헤테로시클로알킬렌"은 단독으로 또는 다른 치환기의 일부로서, 각각 시클로알킬 및 헤테로시클로알킬로부터 유도된 이가 라디칼을 의미한다. 헤테로시클로알킬 모이어티는 하나의 고리 헤테로원자(예컨대, O, N, S, Si 또는 P)를 포함할 수 있다. 헤테로시클로알킬 모이어티는 2개의 임의적으로 상이한 고리 헤테로원자(예컨대, O, N, S, Si 또는 P)를 포함할 수 있다. 헤테로시클로알킬 모이어티는 3개의 임의적으로 상이한 고리 헤테로원자(예컨대, O, N, S, Si 또는 P)를 포함할 수 있다. 헤테로시클로알킬 모이어티는 4개의 임의적으로 상이한 고리 헤테로원자(예컨대, O, N, S, Si 또는 P)를 포함할 수 있다. 헤테로시클로알킬 모이어티는 5개의 임의적으로 상이한 고리 헤테로원자(예컨대, O, N, S, Si 또는 P)를 포함할 수 있다. 헤테로시클로알킬 모이어티는 최대 8개의 임의적으로 상이한 고리 헤테로원자(예컨대, O, N, S, Si 또는 P)를 포함할 수 있다.
용어 "할로" 또는 "할로겐"은 그 자체로 또는 다른 치환기의 일부로서, 달리 언급되지 않는 한, 불소, 염소, 브롬 또는 요오드 원자를 의미한다. 또한, "할로알킬"과 같은 용어는 모노할로알킬 및 폴리할로알킬을 포함하는 것을 의미한다. 예컨대, 용어 "할로(C1-C4)알킬"은 플루오로메틸, 디플루오로메틸, 트리플루오로메틸, 2,2,2-트리플루오로에틸, 4-클로로부틸, 3-브로모프로필 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
용어 "아실"은 달리 언급되지 않는 한 -C(O)R을 의미하고, 여기서 R은 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 시클로알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 또는 치환 또는 비치환된 헤테로아릴이다.
용어 "아릴"은, 달리 언급되지 않는 한, 함께 융합되거나(즉, 융합된 고리 아릴) 공유적으로 연결된 단일 고리 또는 다수의 고리 (바람직하게는 1 내지 3개의 고리)일 수 있는 다불포화된 방향족 탄화수소 치환기를 의미한다. 융합된 고리 아릴은 함께 융합된 다수의 고리를 지칭하며, 여기서 융합된 고리 중 적어도 하나는 아릴 고리이다. 용어 "헤테로아릴"은 N, O 또는 S와 같은 적어도 하나의 헤테로원자를 함유하는 아릴기 (또는 고리)를 지칭하며, 여기서 질소 및 황 원자는 임의적으로 산화되고, 질소 원자(들)는 임의적으로 4급화된다. 따라서, 용어 "헤테로아릴"은 융합된 고리 헤테로아릴기(즉, 융합된 고리 중 적어도 하나가 헤테로방향족 고리인 함께 융합된 다수의 고리)를 포함한다. 5,6-융합된 고리 헤테로아릴렌은 함께 융합된 2개의 고리를 지칭하며, 여기서 하나의 고리는 5개의 구성원을 갖고 다른 고리는 6개의 구성원을 가지며, 적어도 하나의 고리는 헤테로아릴 고리이다. 마찬가지로, 6,6-융합된 고리 헤테로아릴렌은 함께 융합된 2개의 고리를 지칭하며, 여기서 하나의 고리는 6개의 구성원을 갖고 다른 고리는 6개의 구성원을 가지며, 여기서 적어도 하나의 고리는 헤테로아릴 고리이다. 6,5-융합된 고리 헤테로아릴렌은 함께 융합된 2개의 고리를 지칭하며, 여기서 하나의 고리는 6개의 구성원을 갖고 다른 고리는 5개의 구성원을 가지며, 하나 이상의 고리는 헤테로아릴 고리이다. 헤테로아릴기는 탄소 또는 헤테로원자를 통해 분자의 나머지에 부착될 수 있다. 아릴 및 헤테로아릴의 비제한적인 예는 페닐, 1-나프틸, 2-나프틸, 4-비페닐, 1-피롤릴, 2-피롤릴, 3-피롤릴, 3-피라졸릴, 2-이미다졸릴, 4-이미다졸릴, 피라지닐, 2-옥사졸릴, 4-옥사졸릴, 2-페닐-4-옥사졸릴, 5-옥사졸릴, 3-이속사졸릴, 4-이속사졸릴, 5-이속사졸릴, 2-티아졸릴, 4-티아졸릴, 5-티아졸릴, 2-푸릴, 3-푸릴, 2-티에닐, 3-티에닐, 2-피리딜, 3-피리딜, 4-피리딜, 2-피리미딜, 4-피리미딜, 5-벤조티아졸릴, 푸리닐, 2-벤즈이미다졸릴, 5-인돌릴, 1-이소퀴놀릴, 5-이소퀴놀릴, 2-퀴녹살리닐, 5-퀴녹살리닐, 3-퀴놀릴, 및 6-퀴놀릴을 포함하다. 상기 언급된 아릴 및 헤테로아릴 고리 시스템 각각에 대한 치환기는 하기 기재된 허용 가능한 치환기의 군으로부터 선택된다. "아릴렌" 및 "헤테로아릴렌"은 단독으로 또는 다른 치환기의 일부로서, 각각 아릴 및 헤테로아릴로부터 유도된 이가 라디칼을 의미한다. 아릴 및 헤테로아릴기의 비제한적인 예는 피리디닐, 피리미디닐, 티오페닐, 티에닐, 푸라닐, 인돌릴, 벤족사디아졸릴, 벤조디옥솔릴, 벤조디옥사닐, 티아나프타닐, 피롤로피리디닐, 인다졸릴, 퀴놀리닐, 퀴녹살리닐, 피리도피라지닐, 퀴나졸리노닐, 벤조이속사졸릴, 이미다조피리디닐, 벤조푸라닐, 벤조티에닐, 벤조티오페닐, 페닐, 나프틸, 비페닐, 피롤릴, 피라졸릴, 이미다졸릴, 피라지닐, 옥사졸릴, 이속사졸릴, 티아졸릴, 푸릴티에닐, 피리딜, 피리미딜, 벤조티아졸릴, 푸리닐, 벤즈이미다졸릴, 이소퀴놀릴, 티아디아졸릴, 옥사디아졸릴, 피롤릴, 디아졸릴, 트리아졸릴, 테트라졸릴, 벤조티아디아졸릴, 이소티아졸릴, 피라졸로피리미디닐, 피롤로피리미디닐, 벤조트리아졸릴, 벤즈옥사졸릴, 또는 퀴놀릴을 포함한다. 상기 예는 치환 또는 비치환될 수 있고 상기 각각의 헤테로아릴 예의 이가 라디칼은 헤테로아릴렌의 비제한적인 예이다. 헤테로아릴 모이어티는 하나의 고리 헤테로원자(예컨대, O, N 또는 S)를 포함할 수 있다. 헤테로아릴 모이어티는 2개의 임의적으로로 상이한 고리 헤테로원자(예컨대, O, N 또는 S)를 포함할 수 있다. 헤테로아릴 모이어티는 3개의 임의적으로 상이한 고리 헤테로원자(예컨대, O, N 또는 S)를 포함할 수 있다. 헤테로아릴 모이어티는 4개의 임의적으로 상이한 고리 헤테로원자(예컨대, O, N 또는 S)를 포함할 수 있다. 헤테로아릴 모이어티는 5개의 임의적으로 상이한 고리 헤테로원자(예컨대, O, N 또는 S)를 포함할 수 있다. 아릴 모이어티는 단일 고리를 가질 수 있다. 아릴 모이어티는 2개의 임의적으로 상이한 고리를 가질 수 있다. 아릴 모이어티는 3개의 임의적으로 상이한 고리를 가질 수 있다. 아릴 모이어티는 4개의 임의적으로 상이한 고리를 가질 수 있다. 헤테로아릴 모이어티는 하나의 고리를 가질 수 있다. 헤테로아릴 모이어티는 2개의 임의적으로 상이한 고리를 가질 수 있다. 헤테로아릴 모이어티는 3개의 임의적으로 상이한 고리를 가질 수 있다. 헤테로아릴 잔기는 4개의 임의적으로 상이한 고리를 가질 수 있다. 헤테로아릴 모이어티는 5개의 임의적으로 상이한 고리를 가질 수 있다.
융합된 고리 헤테로시클로알킬-아릴은 헤테로시클로알킬에 융합된 아릴이다. 융합된 고리 헤테로시클로알킬-헤테로아릴은 헤테로시클로알킬에 융합된 헤테로아릴이다. 융합된 고리 헤테로시클로알킬-시클로알킬은 시클로알킬에 융합된 헤테로시클로알킬이다. 융합된 고리 헤테로시클로알킬-헤테로시클로알킬은 또 다른 헤테로시클로알킬에 융합된 헤테로시클로알킬이다. 융합된 고리 헤테로시클로알킬-아릴, 융합된 고리 헤테로시클로알킬-헤테로아릴, 융합된 고리 헤테로시클로알킬-시클로알킬 또는 융합된 고리 헤테로시클로알킬-헤테로시클로알킬은 각각 독립적으로 비치환되거나 본원에 기재된 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "옥소"는 탄소 원자에 이중 결합된 산소를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "알킬술포닐"은 화학식 -S(O2)-R'을 갖는 모이어티를 의미하고, 여기서 R'는 상기 정의된 바와 같은 치환 또는 비치환된 알킬기이다. R'는 특정 개수의 탄소(예컨대, "C1-C4 알킬술포닐")를 가질 수 있다.
상기 용어(예컨대, "알킬", "헤테로알킬", "시클로알킬", "헤테로시클로알킬", "아릴" 및 "헤테로아릴") 각각은 지시된 라디칼의 치환 및 비치환된 형태 둘 다를 포함한다. 각각의 유형의 라디칼에 대한 바람직한 치환기는 하기에 제공된다.
알킬 및 헤테로알킬 라디칼(종종 알킬렌, 알케닐, 헤테로알킬렌, 헤테로알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 시클로알케닐 및 헤테로 시클로알케닐로 지칭되는 기를 포함)에 대한 치환기는, 0 내지 (2m'+1) 범위의 수로, 비제한적으로 -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R'', -SR', -할로겐, -SiR'R''R''', -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R'', -OC(O)NR'R'', -NR''C(O)R', -NR'-C(O)NR''R''', -NR''C(O)2R', -NR-C(NR'R'')=NR''', -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2N(R)('R''-NRSO2R'), -CN, 및 -NO2로부터 선택된 다양한 군 중 하나 이상일 수 있으며, 여기서 m'은 이러한 라디칼에서 총 탄소 원자 수이다. R', R'', R''' 및 R''''은 각각 바람직하게는 독립적으로 수소, 치환 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 시클로알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환 또는 비치환된 아릴(예컨대, 1-3 할로겐으로 치환된 아릴), 치환 또는 비치환된 알킬, 알콕시 또는 티오알콕시기 또는 아릴 알킬기를 지칭한다. 본 발명의 화합물이 하나 초과의 R기를 포함하는 경우, 예컨대 각각의 R기는, 하나 초과의 R', R'', R''' 및 R''''기가 존재하는 경우의 각각의 R', R'', R''' 및 R''''기와 같이, 독립적으로 선택된다. R' 및 R''이 동일한 질소 원자에 부착될 때, 이들은 질소 원자와 조합하여 4-, 5-, 6- 또는 7-원 고리를 형성할 수 있다. 예컨대, -NR'R''은 1-피롤리디닐 및 4-모르폴리닐을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 치환기의 상기 논의로부터, 당업자는 용어 "알킬"이 할로알킬(예컨대, -CF3 및 -CH2CF3) 및 아실(예컨대, -C(O)CH3, -C(O)CF3, -C(O)CH2OCH3 등)과 같은 수소 기 이외의 기에 결합된 탄소 원자를 포함하는 기를 포함하는 것을 의미한다는 것을 이해할 것이다.
알킬 라디칼에 대해 기재된 치환기와 마찬가지로, 아릴 및 헤테로아릴기의 치환기는 다양하고, 0 내지 방향족 고리 시스템의 개방 원자가의 총 수의 범위의 수로, 예컨대 -OR', -NR'R'', -SR', -할로겐, -SiR'R''R''', -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R'', -OC(O)NR'R'', -NR''C(O)R', -NR'-C(O)NR''R''', NR''C(O)2R', NRC(NR'R'')=NR''', S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2N(R')(R'', -NRSO2R'), -CN, -NO2, -R', -N3, -CH(Ph)2, 플루오로(C1-C4)알콕시, 및 플루오로(C1-C4)알킬로부터 선택되고, 여기서 R', R'', R''' 및 R''''은 바람직하게는 수소, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 시클로알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환 또는 비치환된아릴, 및 치환 또는 비치환된 헤테로아릴 중에서 독립적으로 선택되는 것이 바람직하다. 본 발명의 화합물이 하나 초과의 R기를 포함하는 경우, 예컨대 각각의 R기는, 하나 초과의 R', R'', R''' 및 R'''' 기가 존재하는 경우 각각의 R', R'', R''' 및 R'''' 기와 같이, 독립적으로 선택된다.
모이어티가 R 치환기로 치환되는 경우, 기는 "R-치환된"으로 지칭될 수 있다. 모이어티가 R-치환된 경우, 모이어티는 적어도 하나의 R 치환기로 치환되고, 각각의 R 치환기는 임의적으로 상이하다. 예컨대, 본원에서 모이어티가 R1A-치환 또는 비치환된 알킬인 경우, 복수의 R1A 치환기가 알킬 잔기에 부착될 수 있으며, 여기서 각각의 R1A 치환기는 임의적으로 상이하다. R-치환된 모이어티가 복수의 R 치환기로 치환된 경우, 각각의 R-치환기는 본원에서 R', R'' 등과 같은 프라임 기호(')를 사용하여 차별될 수 있다. 예컨대, 모이어티가 R3A-치환 또는 비치환된 알킬이고, 모이어티가 복수의 R3A 치환기로 치환된 경우, 복수의 R3A 치환기는 R3A', R3A'', R3A''' 등으로 차별될 수 있다. 일부 실시양태에서, 복수의 R 치환기는 3이다. 일부 실시양태에서, 복수의 R 치환기는 2이다.
2개 이상의 치환기가 임의적으로 연결되어 아릴, 헤테로아릴, 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬기를 형성할 수 있다. 이러한 소위 고리-형성 치환기는 반드시 필수적이지는 않지만 전형적으로 시클릭 기본 구조에 부착된 것으로 발견된다. 일 실시양태에서, 고리-형성 치환기는 기본 구조의 인접한 구성원에 부착된다. 예컨대, 시클릭 기본 구조의 인접 구성원에 부착된 2개의 고리-형성 치환기는 융합된 고리 구조를 생성한다. 또 다른 실시양태에서, 고리-형성 치환기는 기본 구조의 단일 구성원에 부착된다. 예컨대, 시클릭 기본 구조의 단일 구성원에 부착된 2개의 고리-형성 치환기는 스피로시클릭 구조를 생성한다. 또 다른 실시양태에서, 고리-형성 치환기는 기본 구조의 비-인접 구성원에 부착된다.
아릴 또는 헤테로아릴 고리의 인접 원자 상의 2개의 치환기는 임의적으로 화학식 -T-C(O)-(CRR')q-U-의 고리를 형성할 수 있고, 여기서 T 및 U는 독립적으로 -NR-, -O-, -CRR'-, 또는 단일 결합이고, q는 0 내지 3의 정수이다. 대안적으로, 아릴 또는 헤테로아릴 고리의 인접 원자 상의 2개의 치환기는 임의적으로 화학식 -A-(CH2)r-B-의 치환기로 치환될 수 있고, 여기서 A 및 B는 독립적으로 -CRR'-, -O-, -NR-, -S-, -S(O) -, -S(O)2-, -S(O)2NR'-, 또는 단일 결합이며, r은 1 내지 4의 정수이다. 이렇게 형성된 새로운 고리의 단일 결합 중 하나는 임의적으로 이중 결합으로 대체될 수 있다. 대안적으로, 아릴 또는 헤테로아릴 고리의 인접 원자 상의 2개의 치환기는 임의적으로 화학식 -(CRR')s-X'-(C''R''R''')d-의 치환기로 치환될 수 있으며, 여기서 변수 s 및 d는 독립적으로 0 내지 3의 정수이고, X'는 -O-, -NR'-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, or -S(O)2NR'-이다. 치환기 R, R', R'' 및 R'''은 바람직하게는 수소, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환 또는 비치환된 시클로알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 및 치환 또는 비치환된 헤테로아릴로부터 독립적으로 선택된다.
본원에 사용된 용어 "헤테로원자" 또는 "고리 헤테로원자"는 산소(O), 질소(N), 황(S), 인(P) 및 규소(Si)를 포함하는 것을 의미한다.
본원에 사용된 "치환기"는 하기 모이어티로부터 선택된 기를 의미한다:
(A) 옥소, 할로겐, -CF3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO2Cl, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC=(O)NHNH2, -NHC=(O) NH2, -NHSO2H, -NHC=(O)H, -NHC(O)-OH, -NHOH, -OCF3, -OCHF2, 비치환된 알킬, 비치환된 헤테로알킬, 비치환된 시클로알킬, 비치환된 헤테로시클로알킬, 비치환된 아릴, 비치환된 헤테로아릴, 및
(B) 하기로부터 선택된 적어도 하나의 치환기로 치환된, 알킬, 헤테로알킬, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴:
(i) 옥소, 할로겐, -CF3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO2Cl, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC=(O)NHNH2, -NHC=(O) NH2, -NHSO2H, -NHC=(O)H, -NHC(O)-OH, -NHOH, -OCF3, -OCHF2, 비치환된 알킬, 비치환된 헤테로알킬, 비치환된 시클로알킬, 비치환된 헤테로시클로알킬, 비치환된 아릴, 비치환된 헤테로아릴, 및
(ii) 하기로부터 선택된 적어도 하나의 치환기로 치환된, 알킬, 헤테로알킬, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴:
(a) 옥소, 할로겐, -CF3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO2Cl, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC=(O)NHNH2, -NHC=(O) NH2, -NHSO2H, -NHC=(O)H, -NHC(O)-OH, -NHOH, -OCF3, -OCHF2, 비치환된 알킬, 비치환된 헤테로알킬, 비치환된 시클로알킬, 비치환된 헤테로시클로알킬, 비치환된 아릴, 비치환된 헤테로아릴, 및
(b) 하기로부터 선택된 적어도 하나의 치환기로 치환된, 알킬, 헤테로알킬, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴: 옥소, 할로겐, -CF3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO2Cl, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC=(O)NHNH2, -NHC=(O) NH2, -NHSO2H, -NHC=(O)H, -NHC(O)-OH, -NHOH, -OCF3, -OCHF2, 비치환된 알킬, 비치환된 헤테로알킬, 비치환된 시클로알킬, 비치환된 헤테로시클로알킬, 비치환된 아릴, 비치환된 헤테로아릴.
본원에 사용된 "크기-제한된 치환기(size-limited substituent)" 또는 "크기-제한된 치환기(size-limited substituent group)"는 "치환기"에 대해 상기 기재된 모든 치환기로부터 선택된 기를 의미하며, 여기서 각각의 치환 또는 비치환된 알킬은 치환 또는 비치환된 C1-C20 알킬이고, 각각의 치환 또는 비치환된 헤테로알킬은 치환 또는 비치환된 2 내지 20원 헤테로알킬이고, 각각의 치환 또는 비치환된 시클로알킬은 치환 또는 비치환된 C3-C8 시클로알킬이고, 각각의 치환 또는 비치환된 헤테로시클로알킬은 치환 또는 비치환된 3 내지 8원 헤테로시클로알킬이고, 각각의 치환 또는 비치환된 아릴은 치환 또는 비치환된 C6-C10 아릴이고, 각각의 치환 또는 비치환된 헤테로아릴은 치환 또는 비치환된 5 내지 10원 헤테로아릴이다.
본원에 사용된 "저급 치환기(lower substituent)" 또는 "저급 치환기(lower substituent group)"는 "치환기"에 대해 상기 기재된 모든 치환기로부터 선택된 기를 의미하며, 여기서 각각의 치환 또는 비치환된 알킬은 치환 또는 비치환된 C1-C8 알킬이고, 각각의 치환 또는 비치환된 헤테로알킬은 치환 또는 비치환된 2 내지 8원 헤테로알킬이고, 각각의 치환 또는 비치환된 시클로알킬은 치환 또는 비치환된 C3-C7 시클로알킬이고, 각각의 치환 또는 비치환된 헤테로시클로알킬은 치환 또는 비치환된 3 내지 7원 헤테로시클로알킬이고, 비치환된 아릴은 치환 또는 비치환된 C6-C10 아릴이고, 각각의 치환 또는 비치환된 헤테로아릴은 치환 또는 비치환된 5 내지 9원 헤테로아릴이다.
일부 실시양태에서, 본원의 화합물에 기재된 각각의 치환기는 하나 이상의 치환기로 치환된다. 보다 구체적으로, 일부 실시양태에서, 본원의 화합물에 기재된 각각의 치환된 알킬, 치환된 헤테로알킬, 치환된 시클로알킬, 치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 아릴, 치환된 헤테로아릴, 치환된 알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 치환된 시클로알킬렌, 치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 아릴렌 및/또는 치환된 헤테로아릴렌은 적어도 하나의 치환기로 치환된다. 다른 실시양태에서, 이들 기 중 적어도 하나 또는 모두는 적어도 하나의 크기-제한된 치환기로 치환된다. 다른 실시양태에서, 이들 기 중 적어도 하나 또는 모두는 적어도 하나의 저급 치환기로 치환된다.
본원의 화합물의 다른 실시양태에서, 각각의 치환 또는 비치환된 알킬은 치환 또는 비치환된 C1-C20 알킬일 수 있고, 각각의 치환 또는 비치환된 헤테로알킬은 치환 또는 비치환된 2 내지 20원 헤테로알킬이고, 각각의 치환 또는 비치환된 시클로알킬은 치환 또는 비치환된 C3-C8 시클로알킬이고, 각각의 치환 또는 비치환된 헤테로시클로알킬은 치환 또는 비치환된 3 내지 8원 헤테로시클로알킬이고, 각각의 치환 또는 비치환된 아릴은 치환 또는 비치환된 C6-C10 아릴이고, 및/또는 각각의 치환 또는 비치환된 헤테로아릴은 치환 또는 비치환된 5 내지 10원 헤테로아릴이다. 본원의 화합물의 일부 실시양태에서, 각각의 치환 또는 비치환된 알킬렌은 치환 또는 비치환된 C1-C20 알킬렌이고, 각각의 치환 또는 비치환된 헤테로알킬렌은 치환 또는 비치환된 2 내지 20원 헤테로알킬렌이고, 각각의 치환 또는 비치환된 시클로알킬렌은 치환 또는 비치환된 C3-C8 시클로알킬렌이고, 각각의 치환 또는 비치환된 헤테로시클로알킬렌은 치환 또는 비치환된 3 내지 8원 헤테로시클로알킬렌이고, 각각의 치환 또는 비치환된 아릴렌은 치환 또는 비치환된 C6-C10 아릴렌이고, 및/또는 각각의 치환 또는 비치환된 헤테로아릴렌은 치환 또는 비치환된 5 내지 10원 헤테로아릴렌이다.
일부 실시양태에서, 각각의 치환 또는 비치환된 알킬은 치환 또는 비치환된 C1-C8 알킬이고, 각각의 치환 또는 비치환된 헤테로알킬은 치환 또는 비치환된 2 내지 8원 헤테로알킬이고, 각각의 치환 또는 비치환된 시클로알킬은 치환 또는 비치환된 C3-C7 시클로알킬이고, 각각의 치환 또는 비치환된 헤테로시클로알킬은 치환 또는 비치환된 3 내지 7원 헤테로시클로알킬이고, 각각의 치환 또는 비치환된 아릴은 치환 또는 비치환된 C6-C10 아릴이고, 및/또는 각각의 치환 또는 비치환된 헤테로아릴은 치환 또는 비치환된 5 내지 9원 헤테로아릴이다. 일부 실시양태에서, 각각의 치환 또는 비치환된 알킬렌은 치환 또는 비치환된 C1-C8 알킬렌이고, 각각의 치환 또는 비치환된 헤테로알킬렌은 치환 또는 비치환된 2 내지 8원 헤테로알킬렌이고, 각각의 치환 또는 비치환된 시클로알킬렌은 치환 또는 비치환된 C3-C7 시클로알킬렌이고, 각각의 치환 또는 비치환된 헤테로시클로알킬렌은 치환 또는 비치환된 3 내지 7원 헤테로시클로알킬렌이고, 각각의 치환 또는 비치환된 아릴렌은 치환 또는 비치환된 C6-C10 아릴렌이고, 및/또는 각각의 치환 또는 비치환된 헤테로아릴렌은 치환 또는 비치환된 5 내지 9원 헤테로아릴렌이다. 일부 실시양태에서, 화합물은 하기 실시예 섹션, 도면 또는 표에 제시된 화학 종이다.
본원에 사용된 용어 "접합체"는 원자 또는 분자 사이의 회합을 지칭한다. 회합은 직접적이거나 간접적일 수 있다. 예컨대, 핵산과 단백질 사이의 접합체는, 예컨대 공유 결합에 의해 직접적이거나, 예컨대 비공유 결합(예컨대, 정전기적 상호작용(예컨대, 이온 결합, 수소 결합, 할로겐 결합), 반 데르 발스 상호작용(예컨대, 쌍극자-쌍극자, 쌍극자-유도된 쌍극자, 런던 분산), 고리 스태킹(pi 효과), 소수성 상호작용 등)에 의해 간접적일 수 있다. 실시양태에서, 접합체는 친핵성 치환(예컨대, 아민 및 알콜과 아실 할라이드와의 반응, 활성 에스테르와의 반응), 친전자성 치환(예컨대, 엔아민 반응) 및 탄소-탄소 및 탄소-헤테로원자 다수 결합(예컨대, 미카엘 반응, 딜스-알더 첨가)를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 접합체 화학을 이용하여 형성된다. 이들 및 다른 유용한 반응은, 예컨대 문헌(March, ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY, 3rd Ed., John Wiley & Sons, New York, 1985; Hermanson, BIOCONJUGATE TECHNIQUES, Academic Press, San Diego, 1996; and Feeney et al., MODIFICATION OF PROTEINS; Advances in Chemistry Series, Vol. 198, American Chemical Society, Washington, D.C., 1982)에서 논의된다. 실시양태에서, 미세입자는 미세입자의 성분과 고체 지지체의 성분 사이의 비공유적 화학 반응을 통해 고체 지지체에 비공유적으로 부착된다. 다른 실시양태에서, 미세입자는 하나 이상의 반응성 모이어티, 예컨대 본원에 기재된 바와 같은 공유 반응성 모이어티(예컨대, 아민 반응성 모이어티)를 포함한다. 다른 실시양태에서, 미세입자는 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 반응성 모이어티, 예컨대 공유 반응성 모이어티(예컨대, 아민 반응성 부분)을 갖는 링커를 포함한다.
본원에서 접합체 화학(당해 분야에 공지된 "클릭 화학"을 포함)에 사용되는 유용한 반응성 모이어티 또는 작용기는, 예컨대 하기를 포함한다:
(a) N-히드록시숙신이미드 에스테르, N-히드록시벤즈트리아졸 에스테르, 산 할라이드, 아실 이미다졸, 티오에스테르, p-니트로페닐 에스테르, 알킬, 알케닐, 알키닐 및 방향족 에스테르를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 카르복실기 및 그의 다양한 유도체;
(b) 에스테르, 에테르, 알데히드 등으로 전환될 수 있는 히드록실기
(c) 할라이드가 나중에, 예컨대 아민, 카르복실레이트 음이온, 티올 음이온, 탄소음이온, 또는 알콕시드 이온과 같은 친핵성 그룹으로 치환되어 할로겐 원자의 부위에서 새로운 기의 공유적 부착을 초래할 수 있는 할로알킬기;
(d) 예컨대, 말레이미도기와 같은 딜스-알더 반응에 참여할 수 있는 친디엔체기;
(e) 카르보닐 유도체, 예컨대 이민, 히드라존, 세미카르바존 또는 옥심의 형성을 통해 또는 그리냐드 첨가 또는 알킬리튬 첨가와 같은 메커니즘을 통해 후속 유도체화가 가능한 알데히드 또는 케톤기;
(f) 예컨대, 술폰아미드를 형성하기 위한 아민과의 후속 반응을 위한 술포닐 할라이드기;
(g) 이황화물로 전환되거나 아실 할라이드와 반응하거나 금과 같은 금속에 결합될 수 있는 티올기;
(h) 예컨대, 아실화, 알킬화 또는 산화될 수 있는 아민 또는 술프히드릴기;
(i) 예컨대, 고리 첨가, 아실화, 마이클 첨가 등을 겪을 수 있는 알켄;
(j) 예컨대, 아민 및 히드록실 화합물과 반응할 수 있는 에폭시드;
(k) 포스포르아미디트 및 핵산 합성에 유용한 다른 표준 작용기;
(l) 금속 산화규소 결합;
(m) 예컨대, 포스페이트 디에스테르 결합을 형성하기 위한 반응성 인 기(예컨대, 포스핀)에 결합하는 금속; 및
(n) 술폰, 예컨대 비닐 술폰.
접합체("클릭") 화학을 이용하여 작은 모듈 단위를 결합하는 것에 의한 조성물의 화학적 합성은 널리 공지되어 있으며, 예컨대 하기 문헌에 기재되어 있다: H. C. Kolb, M. G. Finn and K. B. Sharpless ((2001). "Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions". Angewandte Chemie International Edition 40 (11): 2004-2021); R. A. Evans ((2007). "The Rise of Azide-Alkyne 1,3-Dipolar'Click' Cycloaddition and its Application to Polymer Science and Surface Modification". Australian Journal of Chemistry 60 (6): 384-395; W.C. Guida et al. Med. Res. Rev. p 3 1996; Spiteri, Christian and Moses, John E. ((2010). "Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition: Regioselective Synthesis of 1,4,5-Trisubstituted 1,2,3-Triazoles". Angewandte Chemie International Edition 49 (1): 31-33); Hoyle, Charles E. and Bowman, Christopher N. ((2010). "Thiol-Ene Click Chemistry". Angewandte Chemie International Edition 49 (9): 1540-1573); Blackman, Melissa L. and Royzen, Maksim and Fox, Joseph M. ((2008). "Tetrazine Ligation: Fast Bioconjugation Based on Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Reactivity". Journal of the American Chemical Society 130 (41): 13518-13519); Devaraj, Neal K. and Weissleder, Ralph and Hilderbrand, Scott A. ((2008). "Tetrazine Based Cycloadditions: Application to Pretargeted Live Cell Labeling". Bioconjugate Chemistry 19 (12): 2297-2299); Stokmann, Henning; Neves, Andre; Stairs, Shaun; Brindle, Kevin; Leeper, Finian ((2011). "Exploring isonitrile-based click chemistry for ligation with biomolecules". Organic & Biomolecular Chemistry)(모두 전체가 모든 목적으로 참조로 본원에 포함된다).
반응성 작용기는 이들이 본원에 기재된 단백질 또는 핵산의 화학적 안정성에 참여하거나 방해하지 않도록 선택될 수 있다. 예컨대, 핵산은 비닐 술폰 또는 다른 반응성 모이어티(예컨대, 말레이미드)를 포함할 수 있다. 임의적으로, 핵산은 화학식 -S-S-R을 갖는 반응성 모이어티를 포함할 수 있다. R은, 예컨대 보호기일 수 있다. 임의적으로, R은 헥산올이다. 본원에 사용된 용어 헥산올은 화학식 C6H13OH을 갖는 화합물을 포함하고, 1-헥산올, 2-헥산올, 3-헥산올, 2-메틸-1-펜탄올, 3-메틸-1-펜탄올, 4-메틸-1-펜탄올, 2-메틸-2-펜탄올, 3-메틸-2-펜탄올, 4-메틸-2-펜탄올, 2-메틸-3-펜탄올, 3-메틸-3-펜탄올, 2,2-디메틸-1-부탄올, 2,3-디메틸-1-부탄올, 3,3-디메틸-1-부탄올, 2,3-디메틸-2-부탄올, 3,3-디메틸-2-부탄올, 및 2-에틸-1-부탄올을 포함한다. 임의적으로, R은 1-헥산올이다.
본원에 사용된 용어 "약"은 특정 값을 포함하는 값의 범위를 의미하며, 당업자는 특정 값과 상당히 유사한 것으로 간주할 것이다. 실시양태에서, 용어 "약"은 당업계에서 일반적으로 허용되는 측정을 이용하여 표준 편차 내를 의미한다. 실시양태에서, 약은 특정 값의 +/-10%까지 확장되는 범위를 의미한다. 실시양태에서, 약은 특정 값을 의미한다.
본원에서 사용된 단수 형태의 용어는 하나 이상을 의미한다. 또한, 본원에 사용된 어구 "로 치환된"은 특정 기가 임의의 또는 모든 명명된 치환기 중 하나 이상으로 치환될 수 있음을 의미한다. 예컨대, 알킬 또는 헤테로아릴기와 같은 기가 "비치환된 C1-C20 알킬, 또는 비치환된 2 내지 20원 헤테로알킬로 치환된" 경우, 기는 하나 이상의 비치환된 C1-C20 알킬, 및/또는 하나 이상의 비치환된 2 내지 20원 헤테로알킬을 함유할 수 있다. 또한, 모이어티가 R 치환기로 치환된 경우, 그 기는 "R-치환된"으로 지칭될 수 있다. 모이어티가 R-치환된 경우, 모이어티는 적어도 하나의 R 치환기로 치환되고 각각의 R 치환기는 임의적으로 상이하다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 기술 및 과학 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 예컨대, 문헌(Singleton et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 1994); Sambrook et al., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, NY 1989))을 참조한다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법, 장치 및 재료가 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. 이하의 정의는 본원에서 자주 사용되는 특정 용어의 이해를 돕기 위해 제공되며 본 개시의 범위를 제한하려는 것은 아니다.
생물학적 샘플" 또는 "샘플"은 대상체 또는 환자로부터 수득되거나 유래된 물질을 지칭한다. 생물학적 샘플은 생검 및 부검 샘플과 같은 조직의 절편, 및 조직 검사를 위해 취한 냉동 절편을 포함한다. 이러한 샘플은 체액, 예컨대 혈액 및 혈액 분획 또는 생성물(예컨대, 혈청, 혈장, 혈소판, 적혈구 등), 가래, 조직, 배양 세포(예컨대, 일차 배양물, 체외이식편 및 형질전환된 세포), 대변, 소변, 윤활액, 관절 조직, 윤활 조직, 윤활막세포, 섬유모세포-유사 윤활막세포, 대식세포-유사 윤활막세포, 면역 세포, 조혈 세포, 섬유모세포, 대식세포, T 세포 등을 포함한다. 생물학적 샘플은 전형적으로 진핵생물 유기체, 예컨대 영장류, 예컨대 침팬지 또는 인간과 같은 포유동물; 소; 개; 고양이; 설치류, 예컨대 기니아 피그, 래트, 마우스; 토끼; 또는 새; 파충류; 또는 물고기로부터 수득된다.
본원에 사용된 "세포"는 그의 게놈 DNA를 보존 또는 복제하기에 충분한 대사 또는 다른 기능을 수행하는 세포를 지칭한다. 세포는, 예컨대 온전한 막의 존재, 특정 염료에 의한 염색, 자손을 생성하는 능력, 또는 생식세포의 경우에 제2 생식세포와 조합하여 생존 가능한 자손을 생성하는 능력을 포함하여 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 확인될 수 있다. 세포는 원핵생물 및 진핵생물 세포를 포함할 수 있다. 원핵생물 세포는 박테리아를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 진핵생물 세포는 효모 세포 및 식물 및 동물, 예컨대 포유동물, 곤충(예컨대, 스포도프테라) 및 인간 세포로부터 유래된 세포를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 세포는 자연적으로 비부착성이거나, 예컨대 트립신처리에 의해 표면에 부착되지 않도록 처리된 경우에 유용할 수 있다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 여기서 중합체는 임의적으로 아미노산으로 이루어지지 않은 모이어티에 접합될 수 있다. 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생 아미노산의 인위적인 화학적 모방체인 아미노산 중합체 뿐만 아니라 자연 발생 아미노산 중합체 및 비천연 아미노산 중합체에도 적용된다. "융합 단백질"은 단일 모이어티로서 재조합적으로 발현되는 2개 이상의 개별 단백질 서열을 코딩하는 키메라 단백질을 지칭한다.
용어 "펩티딜" 및 "펩티딜 부분"은 분자의 나머지에 부착된 펩티드(예컨대, 본원에 제공된 재조합 단백질 또는 본원에 제공된 재조합 단백질의 펩티드 도메인 형성 부분)를 지칭한다. 펩티딜 모이어티는 펩티딜 모이어티를 재조합 단백질의 나머지(예컨대, 막횡단 도메인, 스페이서 영역 또는 펩티딜 링커)에 부착시키는 역할을 하는 화학적 링커로 치환될 수 있다. 펩티딜 모이어티는 또한 추가의 화학적 모이어티(예컨대, 추가의 R 치환기)로 치환될 수 있다. 실시양태에서, 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인은 펩티딜 모이어티를 포함한다. 실시양태에서, 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인은 펩티딜 모이어티이다. 본원에 사용된 용어 "메디토프"는 본원에 기재된 펩티드 도메인에 포함된 펩티딜 모이어티를 지칭한다. 따라서, 실시양태에서, 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인은 메디토프이다. 실시양태에서, 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인은 메디토프를 포함한다.
펩티딜 모이어티(예컨대, 메디토프)는 선형 또는 시클릭 펩티드 모이어티일 수 있다. 펩티드 모이어티의 고리화를 위한 다양한 방법이, 예컨대 생체내 안정성을 다루고 후속 접합 화학에 대한 화학선택적 제어를 가능하게 하기 위해 이용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 고리화 전략은 머리-대-꼬리(머리-꼬리) 락탐 고리화(비환식 펩티드의 말단 잔기 사이) 및/또는 다른 잔기 사이의 락탐 연결을 포함하는 락탐 고리화 전략이다. 락탐 형성은 또한 상이한 락탐 고리 크기 및 연결 방식을 생성하기 위해 글리신, β-Ala 및/또는 7-아미노헵탄산 등과 같은 잔기를 비환식 펩티드 고리화 전구체에 편입함으로써 영향을 받을 수 있다. "클릭" 화학 및 올레핀 복분해와 같은 추가 고리화 전략이 또한 이용될 수 있다. 이러한 펩티드 및 펩티도미메틱 고리화 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 실시양태에서, 펩티딜 모이어티(예컨대, 메디토프)는 선형 펩티딜 부분(예컨대, 선형 메디토프)이다. 실시양태에서, 펩티딜 모이어티(예컨대, 메디토프)는 시클릭 펩티딜 모이어티(예컨대, 시클릭 메디토프)이다.
"표지", "검출 가능한 도메인" 또는 "검출 가능한 모이어티"는 분광학적, 광 화학적, 생화학적, 면역화학적, 화학적 또는 다른 물리적 수단에 의해 검출 가능한 조성물이다. 예컨대, 유용한 표지는 32P, 형광 염료, 전자-밀집 시약, 효소(예컨대, ELISA에서 일반적으로 사용되는 것), 비오틴, 디곡시게닌, 또는 합텐 및 단백질 또는, 예컨대 방사성표지를 표적 펩티드와 특이적으로 반응적인 펩티드 또는 항체에 편입함으로써 검출 가능하게 될 수 있는 다른 실체를 포함한다. 항체를 표지에 접합시키기 위해 당업계에 공지된 임의의 적절한 방법, 예컨대 문헌(Hermanson, Bioconjugate Techniques 1996, Academic Press, Inc., San Diego)에 기재된 방법이 이용될 수 있다.
"표지된 단백질 또는 폴리펩티드"는 표지된 단백질 또는 폴리펩티드의 존재가 표지된 단백질 또는 폴리펩티드에 결합된 표지의 존재를 검출함으로써 검출될 수 있도록 표지에 링커 또는 화학적 결합을 통해 공유적으로, 또는 이온, 발 데르 발스, 또는 수소 결합을 통해 비공유적으로 결합된 것이다. 대안적으로, 한쌍의 결합 파트너 중 하나가 다른 것, 예컨대 비오틴, 스트렙트아비딘에 결합하는 고친화성 상호작용을 이용하는 방법이 동일한 결과를 달성할 수 있다.
용어 "아미노산"은 자연 발생 및 합성 아미노산 뿐만 아니라 자연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 지칭한다. 자연 발생 고리 아미노산은 유전자 코드에 의해 코딩된 것 뿐만 아니라 나중에 변형되는 아미노산, 예컨대 히드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트 및 O-포스포세린이다. 아미노산 유사체는 천연 아미노산, 즉 수소, 카르복실기, 아미노기 및 R기에 결합된 α 탄소와 동일한 기본 화학 구조를 갖는 화합물, 예컨대 호모세린, 노르류신, 메티오닌 술폭시드, 메티오닌 메틸 술포늄을 지칭한다. 이러한 유사체는 변형된 R기(예컨대, 노르류신) 또는 변형된 펩티드 골격을 갖지만, 자연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 유지한다. 아미노산 모방체는 아미노산의 일반적인 화학 구조와는 다른 구조를 가지나 자연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 화학적 화합물을 지칭한다.
아미노산은 통상적으로 공지된 3문자 기호 또는 IUPAC-IUB 생화학적 명명법 위원회에 의해 권장되는 1문자 기호에 의해 본원에서 지칭될 수 있다. 마찬가지로, 뉴클레오티드는 일반적으로 허용되는 단일 문자 코드로 지칭될 수 있다.
아미노산 또는 뉴클레오티드 염기 "위치"는 N-말단 (또는 5'-말단)에 대한 위치에 기초하여 참조 서열에서 각각의 아미노산 (또는 뉴클레오티드 염기)을 순차적으로 확인하는 숫자로 표시된다. 최적의 정렬을 결정할 때 고려될 수 있는 결실, 삽입, 말단절단, 융합 등으로 인해, 일반적으로 N-말단으로부터 단순히 카운팅함으로써 결정된 시험 서열의 아미노산 잔기 번호는 참조 서열에서 그의 상응하는 위치의 번호와 반드시 동일하지는 않을 것이다. 예컨대, 변이체가 정렬된 참조 서열에 비해 결실을 갖는 경우, 결실 부위에서 참조 서열의 위치에 상응하는 변이체에는 아미노산이 없을 것이다. 정렬된 참조 서열에 삽입이 있는 경우, 그 삽입은 참조 서열의 번호가 매겨진 아미노산 위치에 상응하지 않을 것이다. 말단절단 또는 융합의 경우, 상응하는 서열의 임의의 아미노산에 상응하지 않는 참조 또는 정렬된 서열에서 아미노산의 스트레치가 있을 수 있다.
주어진 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 넘버링과 관련하여 사용된 용어 "참조하여 넘버링된" 또는 "상응하는"은, 주어진 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열이 참조 아미노산 서열과 비교될 때의 특정 참조 서열의 잔기의 넘버링을 지칭한다. 단백질의 아미노산 잔기는 주어진 잔기와 동일한 단백질 내의 필수 구조적 위치를 차지할 때 주어진 잔기에 "상응"한다. 예컨대, 선택된 항체 (또는 Fab 도메인)에서 선택된 잔기는, 선택된 잔기가 카바트 위치 40에서 경쇄 트레오닌과 동일한 필수 공간 또는 다른 구조적 관계를 차지할 때 카바트 위치 40에서 경쇄 트레오닌에 상응한다, 일부 실시양태에서, 선택된 단백질이 항체 (또는 Fab 도메인)의 경쇄와 최대 상동성을 위해 정렬되는 경우, 트레오닌 40과 정렬된 선택된 단백질의 위치는 트레오닌 40에 상응하는 것으로 언급된다. 일차 서열 정렬 대신, 예컨대, 선택된 단백질의 구조가 카바트 위치 40에서 경쇄 트레오닌과 최대한 상응하도록 정렬되고 전체 구조가 비교되는, 3차원 구조적 정렬이 또한 이용될 수 있다. 이 경우, 구조 모델에서 트레오닌 40과 동일한 필수 위치를 차지하는 아미노산은 트레오닌 40 잔기에 상응한다고 한다.
"보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산 및 핵산 서열 모두에 적용된다. 특정 핵산 서열과 관련하여, 보존적으로 변형된 변이체는 동일하거나 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산, 또는 핵산이 아미노산 서열을 코딩하지 않는 경우, 본질적으로 동일한 서열을 지칭한다. 유전자 코드의 축퇴성으로 인해, 다수의 기능적으로 동일한 핵산 서열은 임의의 주어진 아미노산 잔기를 코딩한다. 예컨대, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 코딩한다. 따라서, 알라닌이 코돈에 의해 특정되는 모든 위치에서, 코돈은 코딩된 폴리펩티드를 변경하지 않고 기재된 임의의 상응하는 코돈으로 변경될 수 있다. 이러한 핵산 변이는 "침묵 변이"이며, 이는 보존적으로 변형된 변이의 일종이다. 폴리펩티드를 코딩하는 본원의 모든 핵산 서열은 또한 핵산의 모든 가능한 침묵 변이를 기술한다. 당업자는 핵산의 각각의 코돈(메티오닌의 유일한 코돈인 AUG 및 통상 트립토판의 유일한 코돈인 TGG 제외)이 기능적으로 동일한 분자를 생성하도록 변형될 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 각각의 침묵 변이는 발현 생성물에 대해서는 각각의 기재된 서열에 내포되어 있지만, 실제 프로브 서열에 대해서는 그렇지 않다.
아미노산 서열에 대해, 당업자는 코딩된 서열의 단일 아미노산 또는 적은 백분률의 아미노산을 변경, 첨가 또는 결실시키는 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 서열에 대한 개별적 치환, 결실 또는 첨가는 "보존적으로 변형된 변이체"이며, 이 변경으로 인해 아미노산이 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환된다는 것을 인식할 것이다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당업계에 널리 공지되어 있다. 이러한 보존적으로 변형된 변이체는 본 발명의 다형성 변이체, 종간 상동체 및 대립유전자에 추가되고 이를 배제하지 않는다.
하기 8개 그룹은 각각 서로에 대한 보존적 치환인 아미노산을 함유한다: 1) 알라닌(A), 글리신(G); 2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E); 3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q); 4) 아르기닌(R), 리신(K); 5) 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V); 6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W); 7) 세린(S), 트레오닌(T); 및 8) 시스테인(C), 메티오닌(M)(예컨대, 문헌(Creighton, Proteins (1984)) 참조).
"핵산"은 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 및 그의 중합체, 및 그의 상보체를 지칭한다. 용어 "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드의 선형 서열을 지칭한다. 용어 "뉴클레오티드"는 전형적으로 폴리뉴클레오티드의 단일 단위, 즉 단량체를 지칭한다. 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 그의 변형된 버전일 수 있다. 본원에서 고려되는 폴리뉴클레오티드의 예는 단일 및 이중 가닥 DNA, 단일 및 이중 가닥 RNA(siRNA 포함), 및 단일 및 이중 가닥 DNA 및 RNA의 혼합물을 갖는 하이브리드 분자를 포함한다. 본원에 사용된 핵산은 또한 자연 발생 핵산과 동일한 기본 화학 구조를 갖는 핵산을 지칭한다. 이러한 유사체는 변형된 슈가 및/또는 변형된 고리 치환기를 갖지만 자연 발생 핵산과 동일한 기본 화학 구조를 유지한다. 핵산 모방체는 핵산의 일반적인 화학 구조는 다르지만 자연 발생 핵산과 유사한 방식으로 기능하는 구조를 갖는 화학적 화합물을 지칭한다. 이러한 유사체의 예는 포스포로티올레이트, 포스포르아미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오티드 및 펩티드-핵산(PNA)을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
"서열 동일성 백분율"은 비교 창에 걸쳐 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교함으로써 결정되며, 여기서 비교 창에서 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 일부는 (첨가 또는 결실을 포함하지 않는) 참조 서열과 비교하여 두 서열의 최적 정렬을 위해 첨가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 백분율은 두 서열에서 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 발생하는 위치의 수를 결정하여 일치하는 위치의 수를 산출하고, 일치된 위치의 수를 비교 창의 총 위치의 수로 나누고, 100을 곱하여 서열 동일성 백분율을 산출함으로서 계산된다.
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열과 관련하여 용어 "동일한" 또는 "동일성" 백분율은, 비교 창 또는 지정된 영역에 걸쳐 최대 대응으로 비교되고 정렬될 때, 하기 서열 비교 알고리즘 중 하나를 이용하거나 수동 정렬 및 육안 검사에 의해 측정되는, 동일하거나 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 특정 백분율(즉, 예컨대 본 발명의 전체 폴리펩티드 서열 또는 본 발명의 폴리펩티드의 개별 도메인의 특정 영역에 대해 60% 동일성, 임의적으로 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 동일성)을 갖는 2개 이상의 서열 또는 서브서열을 지칭한다. 이 경우, 이러한 서열은 "실질적으로 동일하다"고 한다. 이 정의는 또한 시험 서열의 상보체를 지칭한다. 임의적으로, 동일성은 적어도 약 50개의 뉴클레오티드 길이의 영역, 또는 보다 바람직하게는 100 내지 500개 또는 1000개 이상의 뉴클레오티드 길이의 영역에 걸쳐 존재한다. 본 발명은 서열번호 1 내지 35 중 임의의 것과 실질적으로 동일한 폴리펩티드를 포함한다.
서열 비교를 위해, 전형적으로 하나의 서열은 시험 서열이 비교되는 참조 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우 시험 및 참조 서열이 컴퓨터에 입력되고, 필요한 경우 서브서열 코디네이트가 지정되며, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터가 지정된다. 디폴트 프로그램 파라미터가 사용되거나 대안적 파라미터가 지정될 수 있다. 이어서, 서열 비교 알고리즘은 프로그램 파라미터에 기초하여 참조 서열에 대비한 시험 서열에 대한 서열 동일성 백분율을 계산한다.
본원에 사용된 "비교 창"은, 예컨대 전장 서열 또는 20 내지 600, 약 50 내지 약 200개, 또는 약 100 내지 약 150개 아미노산 또는 뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 인접 위치의 수 중 어느 하나의 분절에 대한 참조를 포함하며, 여기서 서열은 2개의 서열을 최적으로 정렬한 후 동일한 수의 인접 위치의 참조 서열과 비교될 수 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 당업계에 널리 공지되어 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은, 예컨대 문헌(Smith and Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c)의 국소 상동성 알고리즘에 의해, 문헌(Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443)의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, 문헌(Pearson and Lipman (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444)의 유사성 검색 방법에 의해, 이들 알고리즘(GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA, Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI)의 전산화된 구현에 의해, 또는 수동 정렬 및 육안 검사(예컨대, 문헌(Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995 supplement)) 참조)에 의해 수행될 수 있다.
서열 동일성 백분율 및 서열 유사성을 결정하는 데 적합한 알고리즘의 예는 각각 문헌(Altschul et al. (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, and Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410)에 기재된 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생명공학 정보 센터(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)를 통해 공개적으로 이용 가능하다. 이 알고리즘은 먼저 데이터베이스 서열에서 동일한 길이의 워드와 정렬될 때 일부 양의 임계값 스코어 T와 일치하거나 만족하는 쿼리 서열에서 길이 W의 짧은 워드를 확인함으로써 높은 스코어링 서열 쌍(HSP)을 확인한다. T는 이웃 워드 스코어 임계값으로 지칭된다(Altschul et al., supra). 이러한 초기 인접 워드 히트는 검색을 시작하여 이를 함유하는 더 긴 HSP를 찾기 위한 시드로서 작용한다. 누적 정렬 스코어가 증가될 수 있는 한, 워드 히트는 각각의 서열을 따라 양방향으로 확장된다. 뉴클레오티드 서열에 대해, 파라미터 M(한쌍의 일치하는 잔기에 대한 보상 스코어; 항상> 0) 및 N(부적합한 잔기에 대한 페널티 스코어; 항상 <0)을 사용하여 누적 스코어를 계산한다. 아미노산 서열의 경우, 스코어링 매트릭스를 사용하여 누적 스코어를 계산한다. 각각의 방향으로의 워드 히트의 확장은 다음과 같은 경우 중지된다: 누적 정렬 스코어가 최대 달성 값에서 수량 X로 떨어짐; 하나 이상의 음의 스코어링 잔기 정렬의 축적으로 인해 누적 스코어가 0 이하로 됨; 또는 어느 하나의 서열의 말단에 도달함. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T 및 X는 정렬의 감도 및 속도를 결정한다. (뉴클레오티드 서열의 경우) BLASTN 프로그램은 디폴트로 워드길이(W) 11, 기대치(E) 또는 10, M=5, N=-4 및 두 가닥의 비교를 사용한다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 디폴트로 워드길이 3, 기대값(E) 10 및 BLOSUM62 스코어링 매트릭스(문헌(Henikoff and Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915) 참조) 정렬(B) 50, 기대값(E) 10, M=5, N=-4, 두 가닥의 비교를 사용한다.
BLAST 알고리즘은 또한 두 서열 사이의 유사성에 대한 통계적 분석을 수행한다(예컨대, 문헌(Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787) 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 하나의 척도는 가장 작은 합 확률(P(N))이며, 이는 두 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 일치가 우연히 발생할 확률의 표시를 제공한다. 예컨대, 시험 핵산과 참조 핵산의 비교에서 가장 작은 합 확률이 약 0.2 미만, 보다 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만인 경우, 핵산은 참조 서열과 유사한 것으로 간주된다.
2개의 핵산 서열 또는 폴리펩티드가 실질적으로 동일하다는 표시는 하기 기재된 바와 같이 제1 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드가 제2 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드에 대해 생성된 항체와 면역학적으로 교차 반응성이라는 것이다. 따라서, 폴리펩티드는 전형적으로, 예컨대 2개의 펩티드가 보존적 치환에 의해서만 상이한 제2 폴리펩티드와 실질적으로 동일하다. 2개의 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 또 다른 표시는 하기 기재된 바와 같이 2개의 분자 또는 그의 상보체가 엄격한 조건 하에서 서로 하이브리드화한다는 것이다. 2개의 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 또 다른 표시는 동일한 프라이머를 사용하여 서열을 증폭시킬 수 있다는 것이다.
유전자와 관련하여 본원에 사용된 표현 "발현" 또는 "발현된"은 그 유전자의 전사 및/또는 해독 산물을 의미한다. 세포에서 DNA 분자의 발현 수준은 세포 내에 존재하는 상응하는 mRNA의 양 또는 세포에 의해 생성된 DNA에 의해 코딩된 단백질의 양에 기초하여 결정될 수 있다. 비-코딩 핵산 분자(예컨대, siRNA)의 발현 수준은 당업계에 널리 공지된 표준 PCR 또는 노던 블롯 방법에 의해 검출될 수 있다. 문헌(Sambrook et al., 1989 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 18.1-18.88)을 참조한다.
형질감염된 유전자의 발현은 세포에서 일시적으로 또는 안정적으로 발생할 수 있다. "일시적 발현" 동안, 형질감염된 유전자는 세포 분열 동안 딸 세포로 전달되지 않는다. 이의 발현은 형질감염된 세포로 제한되기 때문에, 유전자의 발현은 시간이 지남에 따라 상실된다. 대조적으로, 형질감염된 유전자의 안정한 발현은 유전자가 형질감염된 세포에 대해 선별 이점을 부여하는 또 다른 유전자와 공동 형질감염될 때 발생할 수 있다. 이러한 선별 이점은 세포에 제공되는 특정 독소에 대한 내성일 수 있다. 형질감염된 유전자의 발현은 숙주 게놈으로의 트랜스포손-매개된 삽입에 의해 추가로 달성될 수 있다. 트랜스포손-매개된 삽입 동안, 유전자는 숙주 게놈으로의 삽입 뿐만 아니라 후속 절단을 허용하는 2개의 트랜스포손 링커 서열 사이에 예측 가능한 방식으로 위치된다. 형질감염된 유전자의 안정한 발현은 추가로 렌티바이러스 벡터로 세포를 감염시킴으로써 달성될 수 있으며, 이는 감염 후 세포 게놈의 일부를 형성하여 (세포 게놈으로 통합되어) 유전자의 안정적인 발현을 초래한다.
용어 "플라스미드", "벡터" 또는 "발현 벡터"는 유전자 및/또는 유전자의 발현에 필요한 조절 요소를 코딩하는 핵산 분자를 지칭한다. 플라스미드로부터 유전자의 발현은 시스 또는 트랜스로 발생할 수 있다. 유전자가 시스로 발현되는 경우, 유전자 및 조절 요소는 동일한 플라스미드에 의해 코딩된다. 트랜스로의 발현은 유전자 및 조절 요소가 별개의 플라스미드에 의해 코딩되는 경우를 지칭한다.
용어 "형질감염", "형질도입", "형질감염하는" 또는 "형질도입하는"은 상호교환적으로 사용될 수 있으며 핵산 분자 또는 단백질을 세포에 도입하는 과정으로 정의된다. 핵산은 비-바이러스 또는 바이러스-기반 방법을 이용하여 세포에 도입된다. 핵산 분자는 완전한 단백질 또는 그의 기능적 부분을 코딩하는 유전자 서열일 수 있다. 형질감염의 비-바이러스 방법은 핵산 분자를 세포에 도입하기 위해 전달 시스템으로서 바이러스 DNA 또는 바이러스 입자를 사용하지 않는 임의의 적절한 형질감염 방법을 포함한다. 예시적인 비-바이러스 형질감염 방법은 인산칼슘 형질감염, 리포좀 형질감염, 뉴클레오펙션, 소노포레이션, 열 충격을 통한 형질감염, 자기감염(magnetifection) 및 전기천공을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 당업계에 널리 공지된 표준 절차에 따라 전기천공을 이용하여 세포에 도입된다. 바이러스-기반 형질감염 방법의 경우, 임의의 유용한 바이러스 벡터가 본원에 기재된 방법에 사용될 수 있다. 바이러스 벡터의 예는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 렌티바이러스 및 아데노-연관된 바이러스 벡터를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 당업계에 널리 공지된 표준 절차에 따라 레트로바이러스 벡터를 사용하여 세포에 도입된다. 용어 "형질감염" 또는 "형질도입"은 외부 환경으로부터 세포에 단백질을 도입하는 것을 지칭한다. 전형적으로, 단백질의 형질도입 또는 형질감염은 관심 단백질에 세포막을 통과할 수 있는 펩티드 또는 단백질의 부착에 의존한다. 예컨대, 문헌(Ford et al. (2001) Gene Therapy 8:1-4 and Prochiantz (2007) Nat. Methods 4:119-20)을 참조한다.
"항체"는 항원에 특이적으로 결합하고 인식하는 면역글로불린 유전자 또는 그의 단편으로부터의 프레임워크 영역을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 인식된 면역글로불린 유전자는 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 엡실론 및 뮤 불변 영역 유전자 뿐만 아니라 무수한 면역글로불린 가변 영역 유전자를 포함한다. 경쇄는 카파 또는 람다로 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론으로 분류되며, 이는 차례로 각각 면역글로불린 부류, IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE를 정의한다. 전형적으로, 항체의 항원 결합 영역은 결합의 특이성 및 친화성을 결정하는 데 중요한 역할을 한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항체의 단편은 인간, 마우스, 래트, 햄스터, 낙타 등을 포함하는 상이한 유기체로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 항체는 항체의 원하는 기능(예컨대, 글리코실화, 발현, 항원 인식, 이펙터 기능, 항원 결합, 특이성 등)을 개선 또는 조절하기 위해 하나 이상의 아미노산 위치에서 변형 또는 돌연변이된 항체를 포함할 수 있다.
항체는 복잡한 내부 구조를 갖는 크고 복잡한 분자(~150,000 Da의 분자량 또는 약 1320개 아미노산)이다. 천연 항체 분자는 2개의 동일한 쌍의 폴리펩티드 쇄를 함유하며, 각각의 쌍은 하나의 경쇄 및 하나의 중쇄를 갖는다. 각각의 경쇄 및 중쇄는 차례로 2개의 영역: 표적 항원 결합에 관여하는 가변("V") 영역 및 면역계의 다른 성분과 상호작용하는 불변("C") 영역으로 이루어진다. 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 3차원 공간에서 모여 항원(예컨대, 세포 표면의 수용체)에 결합하는 가변 영역을 형성한다. 각각의 경쇄 또는 중쇄 가변 영역 내에, 상보성 결정 영역("CDR")으로 불리는 3개의 짧은 절편(평균 10개 아미노산 길이)가 존재한다. 항체 가변 도메인의 6개의 CDR(경쇄에서 3개 및 중쇄에서 3개)은 3차원 공간에서 함께 접혀서 표적 항원(에피토프)에 도킹되는 실제 항체 결합 부위(파라토프)를 형성한다. CDR의 위치 및 길이는 문헌(Kabat, E. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1983, 1987)에 의해 정확하게 정의되었다. CDR에 함유되지 않은 가변 영역의 부분은 CDR의 환경을 형성하는 프레임워크("FR")를 지칭한다.
본원에 제공된 "항체 변이체"는 항원에 결합할 수 있고 항체 또는 그의 단편의 하나 이상의 구조 도메인(예컨대, 경쇄 가변 도메인, 중쇄 가변 도메인)을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 항체 변이체의 비제한적 예는 단일-도메인 항체 또는 나노바디, 단일특이적 Fab2, 이중특이적 Fab2, 삼중특이적 Fab3, 1가 IgG, scFv, 이중특이적 디아바디, 삼중특이적 트리아바디, scFv-Fc, 미니바디, IgNAR, V-NAR, hcIgG, VhH, 또는 펩티바디를 포함한다. 본원에 제공된 "펩티바디"는 (공유 또는 비공유 링커를 통해) 항체의 Fc 도메인에 부착된 펩티드 모이어티를 지칭한다. 당업계에 공지된 항체 변이체의 추가의 비제한적인 예는 연골 어류 또는 낙타에 의해 생성된 항체를 포함한다. 낙타로부터의 항체 및 그의 가변 영역 및 그의 생성, 단리 및 사용 방법에 대한 일반적인 설명은 본원에 전체가 모든 목적으로 참조로 포함된 WO97/49805 및 WO97/49805에서 찾을 수 있다. 마찬가지로, 연골 어류로부터의 항체 및 그의 가변 영역 및 그의 생산, 단리 및 사용 방법은 본원에 전체가 모든 목적으로 참조로 포함된 WO2005/118629에서 발견될 수 있다.
본원에 제공된 용어 "CDR L1", "CDR L2" 및 "CDR L3"은 항체의 가변 경쇄(L)의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 2 및 3을 지칭한다. 실시양태에서, 본원에 제공된 가변 경쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로 CDR L1, CDR L2 및 CDR L3을 포함한다. 마찬가지로, 본원에 제공된 용어 "CDR H1", "CDR H2" 및 "CDR H3"은 항체의 가변 중쇄(H)의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 2 및 3을 지칭한다. 실시양태에서, 본원에 제공된 가변 중쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로 CDR H1, CDR H2 및 CDR H3을 포함한다.
본원에 제공된 용어 "FR L1", "FR L2", "FR L3" 및 "FR L4"는 당업계에서의 일반적 의미에 따라 사용되며 항체의 가변 경쇄(L)의 프레임워크 영역(FR) 1, 2, 3 및 4를 지칭한다. 실시양태에서, 본원에 제공된 가변 경쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로 FR L1, FR L2, FR L3 및 FR L4를 포함한다. 마찬가지로, 본원에 제공된 용어 "FR H1", "FR H2", "FR H3" 및 "FR H4"는 당업계에서의 일반적 의미에 따라 사용되며 항체의 가변 중쇄(H)의 프레임워크 영역(FR) 1, 2, 3 및 4를 지칭한다. 실시양태에서, 본원에 제공된 가변 중쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로 FR H1, FR H2, FR H3 및 FR H4를 포함한다.
용어 "항체"는 당업계에서 일반적으로 공지된 의미에 따라 사용된다. 항체는, 예컨대 온전한 면역글로불린 또는 다양한 펩티다제로의 분해에 의해 생성된 다수의 잘 특성화된 단편으로서 존재한다. 따라서, 예컨대, 펩신은 힌지 영역의 이황화 결합 아래에서 항체를 분해하여 이황화 결합에 의해 VH-CH1에 결합된 경쇄인 Fab의 이량체인 F(ab)'2를 생성한다. F(ab)'2는 온화한 조건 하에서 환원되어 힌지 영역에서 이황화 결합을 파괴함으로써 F(ab)'2 이량체를 Fab' 단량체로 전환시킬 수 있다. Fab' 단량체는 본질적으로 힌지 영역의 일부를 갖는 Fab이다(문헌(Fundamental Immunology (Paul ed., 3rd ed. 1993)) 참조). 다양한 항체 단편은 온전한 항체의 분해 측면에서 정의되지만, 당업자는 이러한 단편은 화학적으로 또는 재조합 DNA 방법론을 이용하여 드 노보 합성될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 본원에 사용된 용어 항체는 또한 전체 항체의 변형에 의해 생성된 항체 단편, 또는 재조합 DNA 방법론을 이용하여 합성된 것(예컨대, 단일쇄 Fv) 또는 파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 확인된 것을 포함한다(예컨대, 문헌(McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990)) 참조).
예시적인 면역글로불린(항체) 구조 단위는 사량체를 포함한다. 각각의 사량체는 2개의 동일한 쌍의 폴리펩티드 쇄로 구성되며, 각각의 쌍은 하나의 "경쇄"(약 25kD) 및 하나의 "중쇄"(약 50-70kD)을 갖는다. 각각의 쇄의 N-말단은 항원 인식을 주로 담당하는 약 100 내지 110개 또는 그 초과의 아미노산의 가변 영역을 정의한다. 용어 가변 경쇄(VL) 또는 경쇄 가변 영역 및 가변 중쇄(VH) 또는 중쇄 가변 영역은 각각 이들 경쇄 및 중쇄 영역을 지칭한다. 본원에서 언급된 가변 경쇄(VL) 및 경쇄 가변 영역이라는 용어는 상호교환적으로 사용될 수 있다. 본원에 언급된 용어 가변 중쇄(VH) 및 중쇄 가변 영역은 상호교환적으로 사용될 수 있다. Fc(즉, 단편 결정화 가능 영역)는 면역글로불린의 "베이스" 또는 "테일"이고, 전형적으로 항체의 부류에 따라 2개 또는 3개의 불변 도메인에 기여하는 2개의 중쇄로 구성된다. 특정 단백질에 결합함으로써 Fc 영역은 각각의 항체가 주어진 항원에 대해 적절한 면역 반응을 생성하도록 보장한다. Fc 영역은 또한 Fc 수용체와 같은 다양한 세포 수용체 및 보체 단백질과 같은 다른 면역 분자에 결합한다.
본원에 제공된 용어 "항원"은 본원에 제공된 항체 결합 도메인에 결합할 수 있는 분자를 지칭한다. 본원에 제공된 "항원 결합 도메인"은 항원(에피토프)에 결합하는 항체의 영역이다. 전술된 바와 같이, 항원 결합 도메인은 일반적으로 중쇄 및 경쇄 각각의 하나의 불변 도메인 및 하나의 가변 도메인으로 구성된다(각각 CH, CL, VH 및 VL). 파라토프 또는 항원 결합 부위는 항원 결합 도메인의 N-말단에 형성된다. 항원 결합 도메인의 2개의 가변 도메인은 전형적으로 항원 상의 에피토프에 결합한다.
항체는, 예컨대 온전한 면역글로불린으로 또는 다양한 펩티다제로 분해함으로써 생성된 다수의 잘 특성화된 단편으로서 존재한다. 따라서, 예컨대, 펩신은 힌지 영역의 이황화 결합 아래에서 항체를 분해하여 이황화 결합에 의해 VH-CH1에 결합된 경쇄인 Fab의 이량체인 F(ab)'2를 생성한다. F(ab)'2는 온화한 조건 하에서 환원되어 힌지 영역에서 이황화 결합을 끊어 F(ab)'2 이량체를 Fab' 단량체로 전환시킬 수 있다. Fab' 단량체는 본질적으로 힌지 영역의 일부를 갖는 항원 결합 부분이다(문헌(Fundamental Immunology (Paul ed., 3rd ed. 1993)) 참조). 다양한 항체 단편은 온전한 항체의 분해 측면에서 정의되지만, 당업자는 이러한 단편은 화학적으로 또는 재조합 DNA 방법론을 이용하여 드 노보 합성될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 본원에 사용된 용어 항체는 또한 전체 항체의 변형에 의해 생성된 항체 단편, 또는 재조합 DNA 방법론을 이용하여 합성된 것(예컨대, 단일쇄 Fv) 또는 파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 확인된 것을 포함한다(예컨대, 문헌(McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990)) 참조).
단일쇄 가변 단편(scFv)은 전형적으로 10 내지 약 25개 아미노산의 짧은 링커 펩티드로 연결된 면역글로불린의 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)의 가변 영역의 융합 단백질이다. 링커는 일반적으로 유연성을 위해 글리신이 풍부하고 용해도를 위한 세린 또는 트레오닌이 풍부할 수 있다. 링커는 VH의 N-말단을 VL의 C-말단과 연결하거나 그 반대일 수 있다.
mAb의 에피토프는 mAb가 결합하는 항원의 영역이다. 2개의 항체는, 각각이 항원에 대한 다른 항체의 결합을 경쟁적으로 억제(차단)하는 경우, 동일하거나 중첩되는 에피토프에 결합한다. 즉, 1x, 5x, 10x, 20x 또는 100x 초과의 하나의 항체는 경쟁적 결합 검정에서 측정된 바와 같이 적어도 30%, 바람직하게는 50%, 75%, 90% 또는 심지어 99%로 다른 항체의 결합을 억제한다(예컨대, 문헌(Junghans et al., 암 Res. 50:1495, 1990) 참조). 대안적으로, 하나의 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 항원의 본질적으로 모든 아미노산 돌연변이가 다른 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 경우, 두 항체는 동일한 에피토프를 갖는다. 하나의 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 일부 아미노산 돌연변이가 다른 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 경우, 두 항체는 중첩 에피토프를 갖는다.
본 발명 및 본 발명에 따른 사용에 적합한 항체, 예컨대 재조합, 모노클로날, 또는 폴리클로날 항체의 제조를 위해, 당업계에 공지된 많은 기술이 이용될 수 있다(예컨대, 문헌(Kohler & Milstein, Nature 256:495-497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4: 72 (1983); Cole et al., pp. 77-96 in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985); Coligan, Current Protocols in Immunology (1991); Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988); and Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2d ed. 1986)) 참조). 관심 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자는 세포로부터 클로닝될 수 있으며, 예컨대, 모노클로날 항체를 코딩하는 유전자는 하이브리도마로부터 클로닝될 수 있고 재조합 모노클로날 항체를 생성하는 데 사용될 수 있다. 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자 라이브러리는 또한 하이브리도마 또는 형질 세포로부터 제조될 수 있다. 중쇄 및 경쇄 유전자 생성물의 무작위 조합은 상이한 항원 특이성을 갖는 다수의 항체 풀을 생성한다(예컨대, 문헌(Kuby, Immunology (3rd ed. 1997)) 참조). 단일쇄 항체 또는 재조합 항체(U.S. Patent 4,946,778, U.S. Patent No. 4,816,567)의 생성 기술은 본 발명의 폴리펩티드에 대한 항체를 생성하도록 개조될 수 있다. 또한, 트랜스제닉 마우스, 또는 다른 포유동물과 같은 다른 유기체는 인간화 또는 인간 항체를 발현시키는 데 사용될 수 있다(예컨대, 문헌(U.S. Patent Nos. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016, Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368:856-859 (1994); Morrison, Nature 368:812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14:845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14:826 (1996); and Lonberg & Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)) 참조). 대안적으로, 파지 디스플레이 기술은 선택된 항원에 특이적으로 결합하는 항체 및 이종체 Fab 단편을 확인하는 데 이용될 수 있다(예컨대, 문헌(McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990); Marks et al., Biotechnology 10:779-783 (1992)) 참조). 항체는 또한 이중특이적으로 만들어질 수 있는데, 즉 2개의 상이한 항원을 인식할 수 있다(예컨대, 문헌( WO 93/08829, Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659 (1991); and Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986)) 참조). 항체는 또한 이종접합체, 예컨대 2개의 공유 결합된 항체 또는 면역독소일 수 있다(예컨대, 문헌(U.S. Patent No. 4,676,980 , WO 91/00360; WO 92/200373; and EP 03089) 참조).
비-인간 항체를 인간화 또는 영장류화하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다(예컨대, 문헌(U.S. Patent Nos. 4,816,567; 5,530,101; 5,859,205; 5,585,089; 5,693,761; 5,693,762; 5,777,085; 6,180,370; 6,210,671; and 6,329,511; WO 87/02671; EP Patent Application 0173494; Jones et al. (1986) Nature 321:522; and Verhoyen et al. (1988) Science 239:1534) 참조). 인간화 항체는, 예컨대 문헌(Winter and Milstein (1991) Nature 349: 293)에 추가로 기술되어 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 비-인간인 공급원으로부터 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 종종 임포트(import) 잔기로 지칭되며, 이는 전형적으로 임포트 가변 도메인으로부터 취해진다. 인간화는 본질적으로 설치류 CDR 또는 CDR 서열을 인간 항체의 상응하는 서열로 치환함으로써 윈터 및 공동 연구자의 방법(예컨대, 문헌(Morrison et al., PNAS USA, 81:6851-6855 (1984), Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988), Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988) and Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992), Padlan, Molec. Immun., 28:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun., 31(3):169-217 (1994)) 참조)에 따라 수행될 수 있다. 따라서, 이러한 인간화 항체는 키메라 항체(U.S. Patent No. 4,816,567)이며, 온전한 인간 가변 도메인보다 실질적으로 적은 것이 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열로 대체된다. 실제로, 인간화 항체는 전형적으로 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사한 부위로부터의 잔기로 치환된 인간 항체이다. 예컨대, 인간화 면역글로불린 프레임워크 영역을 코딩하는 제1 서열 및 원하는 면역글로불린 상보성 결정 영역을 코딩하는 제2 서열 세트를 포함하는 폴리뉴클레오티드는 합성적으로 또는 적절한 cDNA 및 게놈 DNA 절편을 조합함으로써 생성될 수 있다. 인간 불변 영역 DNA 서열은 다양한 인간 세포로부터 공지된 절차에 따라 단리될 수 있다.
"키메라 항체"는 (a) 불변 영역 또는 그의 일부가 변경, 대체 또는 교화되어 항원 결합 부위(가변 영역)이 상이한 또는 변경된 부류의 불변 영역, 이펙터 기능 및/또는 종, 또는 키메라 항체에 새로운 특성을 부여하는 완전히 상이한 분자, 예컨대 효소, 독소, 호르몬, 성장 인자, 약물 등에 연결되거나; (b)가변 영역 또는 그의 일부가 상이한 또는 변경된 항원 특이성을 갖는 가변 영역으로 변경, 교체 또는 교환된 항체 분자이다. 본 발명에 따라 사용하기에 바람직한 항체는 인간화 및/또는 키메라 모노클로날 항체를 포함한다.
본원에 제공된 "치료 항체"는 암, 자가면역 질환, 이식 거부, 심혈관 질환 또는 본원에 기재된 것과 같은 다른 질환 또는 병태를 치료하는 데 사용되는 임의의 항체 또는 그의 기능적 단편을 지칭한다. 치료 항체의 비제한적 예는, 에르비툭스(세툭시맙), 레오프로(아브식시맙), 시물렉트(바실릭시맙), 레미카데(인플릭시맙); 오르토클론 OKT3(무로모납-CD3); 리툭산(리툭시맙), 벡사르(토시투모맙) 후미라(아달리무맙), 캄파쓰(알렘투주맙), 시물렉트(바실릭시맙), 아바스틴(베바시주맙), 심지아(세르톨리주맙 페골), 제나팍스(다클리주맙), 솔리리스(에쿨리주맙), 랍티바(에팔리주맙), 밀로타르그(겜투주맙), 제발린(이브리투모맙 티욱세탄), 티사브리(나탈리주맙), 졸레어(오말리주맙), 시나기스(팔리비주맙), 벡티빅스(파니투무맙), 루센티스(라니비주맙), 및 헤르셉틴(트라스투주맙)을 포함하지만 이에 제한되지는 않는, 뮤린 항체, 뮤린화 또는 인간화 키메라 항체 또는 인간 항체를 포함한다.
치료제를 항체에 접합시키는 기술은 널리 공지되어 있다(예컨대, 문헌(Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery"in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review" in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); and Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982)) 참조). 본원에 사용된 용어 "항체-약물 접합체" 또는 "ADC"는 항체에 접합되거나 달리 공유 결합된 치료제를 지칭한다. 본원에 언급된 "치료제"는 암과 같은 질환을 치료 또는 예방하는 데 유용한 조성물이다.
단백질 또는 펩티드를 언급할 때, 항체에 "특이적으로 (또는 선택적으로) 결합하는" 또는 "특이적으로 (또는 선택적으로) 면역반응하는"이란 어구는 종종 단백질 및 다른 생물의약품의 이질 집단에서 단백질의 존재를 결정하는 결합 반응을 지칭한다. 따라서, 지정된 면역검정 조건 하에서, 특정 항체는 배경의 적어도 2배, 보다 전형적으로 배경의 10 내지 100배 초과로 특정 단백질에 결합한다. 이러한 조건 하에서 항체에 대한 특이적 결합은 전형적으로 특정 단백질에 대한 그의 특이성에 대해 선택된 항체를 필요로 한다. 예컨대, 폴리클로날 항체는 다른 단백질이 아닌 선택된 항원과 특이적으로 면역반응하는 항체의 서브세트만을 수득하도록 선택될 수 있다. 이 선택은 다른 분자와 교차 반응하는 항체를 빼냄으로써 달성될 수 있다. 특정 단백질과 특이적으로 면역반응하는 항체를 선택하기 위해 다양한 면역검정 방식이 이용될 수 있다. 예컨대, 고체상 ELISA 면역검정은 단백질과 특이적으로 면역반응하는 항체를 선택하기 위해 일상적으로 사용된다(예컨대, 특이적 면역반응성을 결정하기 위해 사용될 수 있는 면역검정 방식 및 조건의 설명을 위해 문헌(Harlow & Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual (1998)) 참조).
"리간드"는 수용체에 결합할 수 있는 작용제, 예컨대 폴리펩티드 또는 다른 분자를 지칭한다.
용어 "재조합"은, 예컨대 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터와 관련하여 사용되는 경우, 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터가 실험실 방법에 의해 변형되었거나 그의 결과임을 나타낸다. 따라서, 예컨대 재조합 단백질은 실험실 방법에 의해 생성된 단백질을 포함한다. 재조합 단백질은 단백질의 천연(비-재조합) 형태에서 발견되지 않는 아미노산 잔기를 포함할 수 있거나, 변형된, 예컨대 표지된 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
용어 "이종"은, 핵산의 부분과 관련하여 사용되는 경우, 핵산이 자연적으로는 서로 동일한 관계에서 발견되지 않는 2개 이상의 서브서열을 포함함을 나타낸다. 예컨대, 새로운 기능적 핵산, 예컨대 하나의 공급원으로부터의 프로모터 및 또 다른 공급원으로부터의 코딩 영역을 만들기 위해 배열된 관련되지 않은 유전자로부터의 2개 이상의 서열을 갖는 핵산은 전형적으로 재조합적으로 생산된다. 마찬가지로, 이종 단백질은 단백질이 자연적으로는 서로 동일한 관계에서 발견되지 않는 2개 이상의 서브서열을 포함함을 나타낸다(예컨대, 융합 단백질).
용어 "단리된"은, 핵산 또는 단백질에 적용되는 경우, 핵산 또는 단백질에 자연 상태에서는 연합된 다른 세포 성분이 본질적으로 없음을 나타낸다. 이는, 예컨대 균질한 상태로 존재할 수 있고 건조 또는 수용액으로 존재할 수 있다. 순도 및 균질성은 전형적으로 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 고성능 액체 크로마토그래피와 같은 분석 화학 기술을 이용하여 결정된다. 제제에 존재하는 우세한 종인 단백질은 실질적으로 정제된다.
"접촉"은 그의 명백한 일반적인 통상적인 의미에 따라 사용되며, 적어도 2개의 별개의 종(예컨대, 생체 분자 또는 세포를 포함하는 화학적 화합물)이 반응, 상호작용 또는 물리적으로 접촉하기에 충분히 근접하게 되는 과정을 지칭한다. 그러나, 생성된 반응 생성물은 첨가된 시약 사이의 반응으로부터 또는 반응 혼합물에서 생성될 수 있는 하나 이상의 첨가된 시약으로부터의 중간체로부터 직접 생성될 수 있다.
용어 "접촉"은 2개의 종이 반응, 상호작용 또는 물리적으로 접촉하게 하는 것을 포함할 수 있으며, 여기서 2개의 종은, 예컨대 본원에 기재된 재조합 단백질 및 항원 결합 도메인일 수 있다. 실시양태에서, 접촉은, 예컨대 본원에 기재된 재조합 단백질이 항원 결합 도메인과 상호작용하게 하는 것을 포함한다.
"대조군" 샘플 또는 값은 시험 샘플과 비교하기 위해 참조, 일반적으로 공지된 참조로 사용되는 샘플을 지칭한다. 예컨대, 시험 샘플은 시험 조건, 예컨대 시험 화합물의 존재 하에 시험 조건으로부터 취해질 수 있고, 공지된 조건, 예컨대 시험 화합물의 부재(음성 대조군) 하에서 또는 공지된 화합물의 존재(양성 대조군) 하에서의 샘플과 비교될 수 있다. 대조군은 또한 다수의 시험 또는 결과에서 수집된 평균 값을 나타낼 수도 있다. 당업자는 대조군이 임의의 수의 파라미터의 평가를 위해 설계될 수 있음을 인식할 것이다. 예컨대, 대조군은 약리학적 데이터(예컨대, 반감기) 또는 치료 측정치(예컨대, 부작용의 비교)에 기초하여 치료 이익을 비교하기 위해 고안될 수 있다. 당업자는 주어진 상황에서 어떤 대조군이 유용한 지 이해하고 대조군 값과의 비교에 기초하여 데이터를 분석할 수 있다. 대조군은 또한 데이터의 유의성을 결정하는 데 유용하다. 예컨대, 주어진 파라미터의 값이 대조군에서 광범위하게 변화된다면, 시험 샘플의 변동은 유의한 것으로 간주되지 않을 것이다.
"환자" 또는 "치료가 필요한 대상체"는 본원에 제공된 조성물 또는 약제학적 조성물의 투여에 의해 치료될 수 있는 질환 또는 병태를 앓고 있거나 앓기 쉬운 살아 있는 유기체를 지칭한다. 비제한적인 예는 인간, 다른 포유동물, 소, 래트, 마우스, 개, 원숭이, 염소, 양, 소, 사슴 및 다른 비-포유동물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 환자는 인간이다.
용어 "질환" 또는 "병태"는 본원에 제공된 화합물, 약제학적 조성물 또는 방법으로 치료될 수 있는 환자 또는 대상체의 상태 또는 건강 상태를 지칭한다. 실시양태에서, 질환은 암(예컨대, 폐암, 난소암, 골육종, 방광암, 자궁경부암, 간암, 신장암, 피부암(예컨대, 메르켈 세포 암종), 고환암, 백혈병, 림프종, 두경부암, 결장직장암, 전립선암, 췌장암, 흑색종, 유방암, 신경모세포종)이다.
용어 "치료하는" 또는 "치료"는 경감; 완화; 증상의 감소 또는 환자가 부상, 병리 또는 병태를 더 잘 견딜 수 있게 하는 것; 퇴행 또는 저하 속도의 지연; 퇴행의 최종 지점을 덜 쇠약하게 하는 것; 환자의 신체적 또는 정신적 안녕을 증진시키는 것과 같은 임의의 객관적 또는 주관적 파라미터를 포함하여, 부상, 질환, 병리 또는 병태의 치료 또는 개선에서의 임의의 성공 표시를 지칭한다. 증상의 치료 또는 개선은 신체 검사, 신경정신과 검사 및/또는 정신과 평가의 결과를 포함하는 객관적 또는 주관적 파라미터에 기초할 수 있다. 용어 "치료하는" 및 그의 활용은 부상, 병리, 병태 또는 질환의 예방을 포함한다. 실시양태에서, "치료하는"은 암의 치료를 지칭한다.
"유효량"은 화합물이 화합물의 부재와 관련하여 (예컨대, 화합물이 투여되는 효과를 달성하거나, 질환을 치료하거나, 효소 활성을 감소시키거나 효소 활성을 증가시키거나, 신호전달 경로를 감소시키거나, 또는 질환 또는 병태의 하나 이상의 증상을 감소시키는) 언급된 목적을 달성하기에 충분한 양이다. "치료적 유효량"의 예는 질환의 증상 또는 증상들의 치료, 예방 또는 감소에 기여하기에 충분한 양이며, "치료적 유효량"으로도 지칭될 수 있다. 증상 또는 증상들 (및 이 어구의 문법적 등가물)의 "감소"는 증상(들)의 중증도 또는 빈도의 감소 또는 증상(들)이 제거를 의미한다. 정확한 양은 치료의 목적에 의존할 것이며, 공지된 기술을 이용하여 당업자에 의해 확인될 수 있을 것이다(예컨대, 문헌(Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Pickar, Dosage Calculations (1999); and Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, 2003, Gennaro, Ed., Lippincott, Williams & Wilkins) 참조).
본원에 사용된 용어 "Her2 단백질" 또는 "Her2"는 CD340(분화 클러스터 340), 원발암유전자 Neu, Erbb2(설치류), 또는 ERBB2(인간)로도 공지된 임의의 재조합 또는 자연 발생 형태의 수용체 티로신-단백질 키나제 erbB-2, 또는 Her2 활성을 (예컨대, Her2와 비교하여 적어도 50%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 활성 내에서) 유지하는 그의 변이체 또는 상동체를 포함한다. 일부 측면에서, 변이체 또는 상동체는, 자연 발생 Her2 단백질과 비교하여, 전체 서열 또는 서열의 일부(예컨대, 50, 100, 150 또는 200개 연속 아미노산 부분)에 걸쳐 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 실시양태에서, Her2 단백질은 UniProt 참조 번호 P04626에 의해 확인된 단백질 또는 그와 실질적으로 동일성을 갖는 변이체 또는 상동체와 실질적으로 동일하다.
본원에 사용된 용어 "EGFR 단백질" 또는 "EGFR"은 인간에서 ErbB-1 또는 HER1으로도 공지된 임의의 재조합 또는 자연 발생 형태의 표피 성장 인자 수용체(EGFR), 또는 EGFR 활성을 (예컨대, EGFR과 비교하여 적어도 50%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 활성 내에서) 유지하는 그의 변이체 또는 상동체를 포함한다. 일부 측면에서, 변이체 또는 상동체는, 자연 발생 EGFR 단백질과 비교하여, 전체 서열 또는 서열의 일부(예컨대, 50, 100, 150 또는 200개 연속 아미노산 부분)에 걸쳐 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 실시양태에서, EGFR 단백질은 UniProt 참조 번호 P00533에 의해 확인된 단백질 또는 그와 실질적으로 동일성을 갖는 변이체 또는 상동체와 실질적으로 동일하다.
본원에 사용된 용어 "CD19 단백질" 또는 "CD19"는 CD19 분자(분화 클러스터 19), B-림프구 표면 항원 B4, T 세포 표면 항원 Leu-12 및 CVID3으로도 공지된 임의의 재조합 또는 자연 발생 형태의 B-림프구 항원 CD19, 또는 CD19 활성을 (예컨대, CD19와 비교하여 적어도 50%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 활성 내에서) 유지하는 그의 변이체 또는 상동체를 포함한다. 일부 측면에서, 변이체 또는 상동체는, 자연 발생 CD19 단백질과 비교하여, 전체 서열 또는 서열의 일부(예컨대, 50, 100, 150 또는 200개 연속 아미노산 부분)에 걸쳐 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 실시양태에서, CD20 단백질은 UniProt 참조 번호 P15391에 의해 확인된 단백질 또는 그와 실질적으로 동일성을 갖는 변이체 또는 상동체와 실질적으로 동일하다.
본원에 사용된 용어 "CD20 단백질" 또는 "CD20"은 임의의 재조합 또는 자연 발생 형태의 B-림프구 항원 CD20 또는 분화 클러스터 20(CD20), 또는 CD20 활성을 (예컨대, CD20과 비교하여 적어도 50%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 활성 내에서) 유지하는 그의 변이체 또는 상동체를 포함한다. 일부 측면에서, 변이체 또는 상동체는, 자연 발생 CD20 단백질과 비교하여, 전체 서열 또는 서열의 일부(예컨대, 50, 100, 150 또는 200개 연속 아미노산 부분)에 걸쳐 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 실시양태에서, CD20 단백질은 UniProt 참조 번호 P11836에 의해 확인된 단백질 또는 그와 실질적으로 동일성을 갖는 변이체 또는 상동체와 실질적으로 동일하다.
재조합 단백질 조성물
특히, 항원 결합 도메인(예컨대, 항체, 변이체 또는 그의 단편)에 결합하여 T 세포를 항원 결합 도메인에 의해 결합된 항원을 발현하는 세포(예컨대, 종양 세포)에 표적화할 수 있는 T 세포에 의해 발현되는 재조합 단백질이 본원에 제공된다. T 세포에 의해 발현된 재조합 단백질의 항원 결합 도메인에의 결합 및 항원 결합 도메인의 표적 세포에 의해 발현된 항원에의 결합을 통해, T 세포가 활성화되고, 세포독성이 되어, 표적 세포(예컨대, 암세포)를 제거한다. 본원에 제공된 재조합 단백질은 특히 입양 면역 요법에 기능성을 빠르게 추가할 수 있게 하며, 특히 광범위한 치료 및 진단 목적에 유용하다. 예컨대, 그의 실시양태를 포함하여 본원에 제공된 재조합 단백질은 이펙터 T 세포(예컨대, 자가 T 세포) 및 치료 항체를 그의 작용 부위로 유도하여 표적외 효과를 감소시키는 수단으로서 사용될 수 있다. 본원에 제공된 조성물은 개별 CAR T 세포를 생성 및 최적화하지 않고 표적 특이성을 신속하고 효율적으로 변경할 수 있게 한다.
본원에 제공된 재조합 단백질은, 예컨대 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인, 세포내 T 세포 신호전달 도메인, 및 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인을 세포내 T 세포 신호전달 도메인에 연결하는 막횡단 도메인을 포함하는 연속 단일쇄 폴리펩티드이다. 본원에 제공된 재조합 단백질은 추가의 요소, 예컨대 스페이서 영역, 펩티드 링커, 세포내 공동 자극 신호전달 도메인을 포함할 수 있으며, 이들 모두는 상기 연속 단일쇄 폴리펩티드의 일부를 형성한다. 본원에 제공된 연속 단일쇄 폴리펩티드는 서로 공유적으로 부착되어 연속적인 폴리펩티드 쇄를 형성하는 요소를 포함하는 폴리펩티드 쇄를 지칭한다.
따라서, 일 측면에서, 재조합 단백질이 제공된다. 재조합 단백질은 (i) 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인; (ii) 세포내 T 세포 신호전달 도메인; 및 (iii) 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인을 세포내 T 세포 신호전달 도메인에 연결하는 막횡단 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 세포내 T 세포 신호전달 도메인은 CD3ζ 세포내 T 세포 신호전달 도메인이다.
본원에 제공된 "비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인"은 항체, 항체 변이체 또는 그의 단편의 비-CDR 결합 부위에 결합할 수 있는 펩티드를 포함하는 펩티드 또는 펩티드 도메인을 지칭한다. 실시양태에서, 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인은 펩티드이다. 실시양태에서, 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인은 펩티드를 포함한다. 실시양태에서, 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인은 비-CDR 결합 부위에 결합한다. 실시양태에서, 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인은 펩티딜 모이어티이다. 실시양태에서, 펩티딜 모이어티는 전체가 모든 목적으로 참조로 포함된 공개된 미국 출원 US20120301400 A1에 기재된 모이어티이다.
실시양태에서, 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인은 하기 서열식의 펩티드 모이어티를 포함한다:
X0-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12 (I).
서열식 (I)에서, X0은 Ser 또는 null이다. X1은 Ser, Cys, Gly, β-알라닌, 디아미노프로피온산, β-아지도알라닌 또는 null이다. X2는 Gln 또는 null이다. X3은 Phe, Tyr, β,β'-디페닐-Ala, His, Asp, 2-브로모-L-페닐알라닌, 3-브로모-L-페닐알라닌, 4-브로모-L-페닐알라닌, Asn, Gln, 변형된 Phe, 수화성 카르보닐-함유 잔기, 또는 보론산-함유 잔기이다. X4는 Asp 또는 Asn이다. X5는 Leu, β,β'-디페닐-Ala, Phe, Trp, Tyr; 페닐알라닌, 트립토판 또는 티로신의 비천연 유사체, 수화 가능한 카르보닐-함유 잔기, 또는 보론산-함유 잔기이다. X6은 Cys 또는 Ser이다. X7은 Cys, Thr 또는 Ser이다. X8은 보호된 Arg, Arg 또는 Ala이다. X9는 Cys, Arg 또는 Ala이다. X10은 Leu, Gln, Glu, β,β'-디페닐-Ala, Phe, Trp, Tyr; 페닐알라닌, 트립토판 또는 티로신의 비천연 유사체, 수화 가능한 카르보닐-함유 잔기, 또는 보론산 함유 잔기이다. X11은 Cys, Gln, Lys 또는 Arg이다. X12는 Ser, Cys, Gly, 7-아미노헵탄산, β-알라닌, 디아미노프로피온산, 프로파르길글리신, 이소아스파르트산, 또는 null이다. X1 및 X12는 임의적으로 함께 연결되어 시클릭 펩티드 모이어티를 형성한다.
실시양태에서, 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인은 하기 서열식의 펩티드 모이어티를 포함한다:
X0-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12 (I).
서열식 (I)에서, X0은 Ser 또는 null이다. X1은 Ser, Cys, Gly, β-알라닌 또는 null이다. X2는 Gln 또는 null이다. X3은 Phe, Tyr, His, Asp, Asn 또는 Gln이다. X4는 Asp 또는 Asn이다. X5는 Leu, Phe, Trp, Tyr, 트립토판 또는 티로신이다. X6은 Cys 또는 Ser이다. X7은 Cys, Thr 또는 Ser이다. X8은 Arg 또는 Ala이다. X9는 Cys, Arg 또는 Ala이다. X10은 Leu, Gln, Glu, Phe, Trp, Tyr, 트립토판 또는 티로신이다. X11은 Cys, Gln, Lys 또는 Arg이다. X12는 Ser, Cys, Gly 또는 null이다. X1 및 X12는 임의적으로 함께 연결되어 시클릭 펩티드 모이어티를 형성한다.
실시양태에서, 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인은 서열번호 32의 서열을 포함한다. 실시양태에서, 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인은 서열번호 32의 서열을 갖는다. 실시양태에서, 재조합 단백질은 서열번호 37의 서열을 갖는 신호전달 펩티드를 추가로 포함한다. 실시양태에서, 신호전달 펩티드는 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인의 N-말단에 결합된다.
본원에 제공된 용어 "비-CDR 결합 부위"는 항체의 중쇄의 CDR 잔기 및 경쇄이 CDR 잔기를 포함하지 않는 항원 결합 도메인(예컨대, 항체의 Fab 도메인, 항체 변이체 또는 그의 단편)의 결합 부위를 지칭한다. "비-CDR 펩티드 결합 부위"는 본원에 제공된 재조합 단백질의 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인에 비공유적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인의 영역이다. 실시양태에서, 비-CDR 결합 부위는 골격 영역 아미노산 잔기를 포함한다. 실시양태에서, 비-CDR 결합 부위는 중쇄 또는 경쇄의 FR 잔기를 포함한다. 실시양태에서, 비-CDR 결합 부위는 중쇄 및 경쇄의 FR 잔기를 포함한다. 실시양태에서, 비-CDR 결합 부위는 카바트 위치 83에 상응하는 위치의 잔기, 카바트 위치 30에 상응하는 위치의 잔기 또는 카바트 위치 52에 상응하는 위치의 잔기를 포함한다. 실시양태에서, 비-CDR 결합 부위는 카바트 위치 40에 상응하는 위치의 잔기, 카바트 위치 41에 상응하는 위치의 잔기, 카바트 위치 30에 상응하는 위치의 잔기, 카바트 위치 52에 상응하는 위치의 잔기, 카바트 위치 83에 상응하는 위치의 잔기, 또는 카바트 위치 85에 상응하는 위치의 잔기를 포함한다. 실시양태에서, 비-CDR 결합 부위는 카바트 위치 40에 상응하는 위치에 잔기를 포함한다. 실시양태에서, 비-CDR 결합 부위는 카바트 위치 41에 상응하는 위치의 잔기를 포함한다. 실시양태에서, 비-CDR 결합 부위는 카바트 위치 30에 상응하는 위치의 잔기를 포함한다. 실시양태에서, 비-CDR 결합 부위는 카바트 위치 52에 상응하는 위치의 잔기를 포함한다. 실시양태에서, 비-CDR 결합 부위는 카바트 위치 83에 상응하는 위치의 잔기를 포함한다. 실시양태에서, 비-CDR 결합 부위는 카바트 위치 85에 상응하는 위치에 잔기를 포함한다. 실시양태에서, 비-CDR 결합 부위를 형성하는 잔기는 전체가 모든 목적으로 참조로 포함된 공개된 미국 출원 US20120301400 A1에 기재된 잔기이다.
본원에 제공된 비-CDR 결합 부위는 또한 "메디토프 결합 부위"로 지칭될 수 있다. 실시양태에서, 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인을 통해 비-CDR 결합 부위에 결합하는 결합하는 단백질은 에피토프에 대한 항원 결합 도메인의 결합에 영향을 미치지 않는다(예컨대, 측정 가능하게 영향을 미치지 않는다). 다시 말해서, 실시양태에서, 비-CDR 결합 부위는 항원 결합에 영향을 미치지 않는다. 실시양태에서, 비-CDR 결합 부위는 그의 실시양태를 포함한 본원에 제공된 재조합 단백질의 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인(예컨대, 메디토프)와 비공유적으로 상호작용한다. 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인(예컨대, 메디토프)과 상호작용할 수 있는 아미노산 잔기는 항체, Fab, 항체 카리안트(cariant) 또는 그의 임의의 단편의 일부를 형성할 수 있다. 비-CDR 결합 부위는 임의의 적절한 항체, 변이체 또는 그의 단편으로 조작되어 비-CDR 결합 부위를 갖는 항원 결합 도메인(항원 결합 도메인)을 형성할 수 있다. 비-CDR 결합 부위를 포함하는 항원 결합 도메인은 또한 본원에서 "메디토프-이용 가능한 항체", "메디토프-이용 가능한 도메인" 또는 "메디토프-이용 가능한 항체 영역"으로 지칭된다.
본원에 제공된 "항원 결합 도메인"은 항원(에피토프)에 결합하는 항체, 변이체 또는 그의 단편의 영역이다. 본원에 기재된 바와 같이, 항원 결합 도메인은 일반적으로 각각 중쇄 및 경쇄의 하나의 불변 및 하나의 가변 도메인(각각 VL, VH, CL 및 CH1)으로 구성된다. 파라토프 또는 항원 결합 부위는 항원 결합 도메인의 N-말단에 형성된다. 항원 결합 도메인의 2개의 가변 도메인은 전형적으로 항원 상의 에피토프에 결합한다. 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 항체의 일부를 형성한다. 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 치료 항체의 일부를 형성한다. 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 Fab의 일부를 형성한다. 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 Fab이다.
실시양태에서, 항원 결합 도메인은 중쇄 불변 영역(CH) 및 경쇄 불변 영역(CL)을 포함한다. 실시양태에서, 중쇄 불변 영역(CH)은 항체 또는 그의 단편의 중쇄의 불변 영역이다. 실시양태에서, 경쇄 불변 영역(CL)은 항체 또는 그의 단편의 경쇄의 불변 영역이다. 실시양태에서, 중쇄 불변 영역(CH)은 Fab의 불변 영역이다. 실시양태에서, 경쇄 불변 영역(CL)은 Fab의 경쇄 불변 영역이다. 실시양태에서, 중쇄 불변 영역(CH)은 F(ab)'2 이량체의 불변 영역이다. 실시양태에서, 경쇄 불변 영역(CL)은 F(ab)'2 이량체의 경쇄 불변 영역이다. 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 Fc 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 인간화된 항원 결합 도메인이다. 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 인간화된 마우스 항원 결합 도메인이다.
실시양태에서, 항원 결합 도메인은 트라스투주맙 메디토프-이용 가능한 도메인, 페르투주맙 메디토프-이용 가능한 도메인, M5A 메디토프-이용 가능한 도메인 또는 리툭시맙 메디토프-이용 가능한 도메인이다. 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 인간화된 리툭시맙 메디토프-이용 가능한 도메인이다.
실시양태에서, 그의 실시양태를 포함하여 본원에 제공된 항원 결합 도메인은, 예컨대 하기와 같은 임의의 시판되는 항체를 포함하는 하나 이상의 공지된 항체의 중쇄 CDR 1, 2, 및/또는 3 및/또는 경쇄 CDR1, 2, 및/또는 3을 포함하여 하나 이상 또는 전체 CDR (또는 CDR과 적어도 약 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%의 동일성을 포함하는 CDR)과 항원 결합에 대해 경쟁, 이와 동일한 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합, 및/또는 이를 함유한다: 아바고보맙, 아브식시맙, 아달리무맙, 아데카투무맙, 알렘투주맙, 알투모맙, 알투모맙 펜테테이트, 아나투모맙, 아나투모맙 마펜나톡스, 아르시투모맙, 아틸리주맙, 바실릭시맙, 벡투모맙, 엑투모맙, 벨리무맙, 벤랄리주맙, 베바시주맙, 브렌툭시맙, 카나키누맙, 카프로맙, 카프로맙 펜데티드, 카투막소맙, 세르톨리주맙, 클리바투주맙 테트락세탄, 다클리주맙, 데노수맙, 에쿨리주맙, 에드레콜로맙, 에팔리주맙, 에타라시주맙, 에르투막소맙, 파놀레소맙, Fbta05, 폰톨리주맙, 겜투주맙, 기렌툭시맙, 롤리무맙, 이브리투모맙, 이고보맙, 인플릭시맙, 이필리무맙, 라베투주맙, 메폴리주맙, 무로모납, 무로모납-CD3, 나탈리주맙, 메시투무맙, 니모투주맙, 오파투무맙, 오말리주맙, 오레고보맙, 팔리비주맙, 파니투무맙, 라니비주맙, 리툭시맙, 사투모맙, 술레소맙, 이브리투모맙, 이브리투모맙 티욱세타, 토실리주맙, 토시투모맙, 트라스투주맙, Trbs07, 우스테키누맙, 비실리주맙, 보투무맙, 잘루투무맙, 및/또는 브로달루맙; 및/또는 안루킨주맙, 바피네우주맙, 달로투주맙, 뎀시주맙, 가니투맙, 이노투주맙, 마브릴리무맙, 목세투모맙 파수도톡스, 릴로투무맙, 시팔리무맙, 타네주맙, 트랄로키누맙, 트레멜리무맙, 우렐루맙, 하이브리도마 10B5에 의해 생성된 항체(Edelson & Unanue, Curr Opin Immunol, 2000 Aug;12(4):425-31), B6H12.2 (abcam) 또는 다른 항-CD47 항체(Chao et al., Cell, 142, 699-713, September 3, 2010).
실시양태에서, 항원 결합 도메인은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원에 특이적으로 결합한다: CA-125, 당단백질(GP) IIb/IIIa 수용체, TNF-알파, CD52, TAG-72, 암배아 항원(CEA), 인터류킨-6 수용체(IL-6R), IL-2, 인터류킨-2 수용체 a-쇄(CD25), CD22, B 세포 활성화 인자, 인터류킨-5 수용체(CD125), VEGF, VEGF-A, CD30, IL-1베타, 전립선 특이적 막 항원(PSMA), CD3, EpCAM, EGF 수용체(EGFR), MUC1, 인간 인터류킨-2 수용체, Tac, RANK 리간드, 보체 단백질, 예컨대 C5, EpCAM, CD11a, 예컨대 인간 CD11a, 인테그린, 예컨대 알파-v 베타-3 인테그린, 비트로넥틴 수용체 알파 v 베타 3 인테그린, HER2, neu, CD3, CD15, CD20(작은 루프 및/또는 큰 루프), 인터페론 감마, CD33, CA-IX, TNF 알파, CTLA-4, 암배아 항원, IL-5, CD3 epsilon, CAM, 알파-4-인테그린, IgE, 예컨대 IgE Fc 영역, RSV 항원, 예컨대 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)의 F 단백질, TAG-72, NCA-90(과립구 세포 항원), IL-6, GD2, GD3, IL-12, IL-23, IL-17, CTAA16.88, IL13, 인터류킨-1 베타, 베타-아밀로이드, IGF-1 수용체(IGF-1R), 델타-유사 리간드 4(DLL4), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 수용체의 알파 서브유닛, 간세포 성장 인자, IFN-알파, 신경 성장 인자, IL-13, CD326, 프로그램된 세포사 1 리간드 1(PD-L1, a.k.a. CD274, B7-H1), CD47, 및 CD137.
실시양태에서, 항원 결합 도메인은 항-CD19 단백질, 항-CD20 단백질, 항-CD22 단백질, 항-CD30 단백질, 항-CD33 단백질, 항-CD44v6/7/8 단백질, 항-CD123 단백질, 항-CEA 단백질, 항-EGP-2 단백질, 항-EGP-40 단백질, 항-erb-B2 단백질, 항-erb-B2,3,4 단백질, 항-FBP 단백질, 항-태아 아세틸콜린 수용체 단백질, 항-GD2 단백질, 항-GD3 단백질, 항-Her2/neu 단백질, 항-IL-13R-a2 단백질, 항-KDR 단백질, 항 k-경쇄 단백질, 항-LeY 단백질, 항-L1 세포 부착 분자 단백질, 항-MAGE-A1 단백질, 항-메소텔린 단백질, 항-뮤린 CMV 감염된 세포 단백질, 항-MUC2 단백질, 항-NKGD2 단백질, 항, 종양태아 항원 단백질, 항-PCSA 단백질, 항-PSMA 단백질, 항-TAA(mAb IfE에 의해 표적화됨) 단백질, 항-EGFR 단백질, 항-TAG-72 단백질 또는 항-VEGF-72 단백질이다. 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 세툭시맙이 아니다.
또한, 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인에 대한 비공유적 결합 이외에, 항원 결합 도메인은 치료 모이어티 또는 영상화 또는 검출 가능한 모이어티를 포함하도록 (예컨대, 유 전적으로 또는 화학적으로) 변형될 수 있다. 따라서, 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 치료 모이어티 또는 검출 가능한 모이어티를 포함한다.
본원에 제공된 용어 "치료 모이어티"는 그의 명백한 일반적인 의미에 따라 사용되며, 치료가 필요한 대상체에게 제공될 때 치료 이점(예컨대, 치료되는 근본적인 장애의 예방, 근절, 완화)을 갖는 1가 화합물을 지칭한다. 본원에 제공된 치료 모이어티는, 제한 없이, 리신, 디옥소루비신, 다우노루비신, 탁솔, 에티디움 브로마이드, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 디히드록시 안쓰라신 디온, 악티노마이신 D, 디프테리아 독소, 슈도모나스 외독소(PE) A, PE40, 아브린, 및 글루코코르티코이드을 포함하지만 이에 제한되지 않는 펩티드, 단백질, 핵산, 핵산 유사체, 소분자, 항체, 나노바디, 효소, 프로드럭, 세포독성제(예컨대, 독소)를 포함할 수 있다. 실시양태에서, 치료 모이어티는 본원에 기재된 항암제 또는 화학요법제이다. 실시양태에서, 치료 모이어티는 핵산 모이어티, 펩티드 모이어티 또는 소분자 약물 모이어티이다. 실시양태에서, 치료 모이어티는 핵산 모이어티이다. 실시양태에서, 치료 모이어티는 항체 모이어티이다. 실시양태에서, 치료 모이어티는 펩티드 모이어티이다. 실시양태에서, 치료 모이어티는 소분자 약물 모이어티이다. 실시양태에서, 치료 모이어티는 뉴클레아제이다. 실시양태에서, 치료 모이어티는 면역 자극제이다. 실시양태에서, 치료 모이어티는 독소이다. 실시양태에서, 치료 모이어티는 뉴클레아제이다. 실시양태에서, 치료 모이어티는 시토카인(예컨대, IL-2)이다. 실시양태에서, 치료 모이어티는 비천연 아미노산을 포함한다. 실시양태에서, 치료 모이어티는 siRNA를 포함한다. 실시양태에서, 치료 모이어티는 siRNA이다. 실시양태에서, 치료 모이어티는 안티센스 핵산을 포함한다. 실시양태에서, 치료 모이어티는 안티센스 핵산이다.
본원에 제공된 "영상화 또는 검출 가능한 모이어티"는 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 화학적 또는 다른 물리적 수단에 의해 검출 가능한 1가 화합물이다. 실시양태에서, 영상화 모이어티는 펩티드 화합물에 공유적으로 부착된다. 예시적인 영상화 모이어티는, 제한 없이, 32P, 방사성핵종, 양전자 방출 동위원소, 형광 염료, 형광단, 항체, 생물발광 분자, 화학발광 분자, 광활성 분자, 금속, 전자 밀도 시약, 효소(예컨대, ELISA에서 일반적으로 사용되는 것), 자기 조영제, 양자점, 나노 입자, 비오틴, 디곡시게닌, 합텐 및 단백질 또는, 예컨대 표적 표지와 특이적으로 반응성인 펩티드 또는 항체에 방사성 표지를 도입함으로써 검출 가능하게 될 수 있는 다른 실체이다. 예컨대, 문헌(Hermanson, Bioconjugate Techniques 1996, Academic Press, Inc., San Diego)에 기재된 방법을 이용하는, 항체를 모이어티에 접합시키기 위해 당업계에 공지된 임의의 방법이 이용될 수 있다. 예시적인 형광단은 플루오레세인, 로다민, GFP, 코우마린, FITC, 알렉사 플루오르, Cy3, Cy5, BODIPY 및 시아닌 염료를 포함한다. 예시적인 방사성핵종은 불소-18, 갈륨-68 및 구리-64를 포함한다. 예시적인 자기 조영제는 가돌리늄, 산화철 및 철 백금, 및 망간을 포함한다. 실시양태에서, 영상화 모이어티는 생물발광 분자이다. 실시양태에서, 영상화 모이어티는 광활성 분자이다. 실시양태에서, 영상화 모이어티는 금속이다. 실시양태에서, 영상화 모이어티는 나노 입자이다.
본원에 제공된 재조합 단백질은 다수의 도메인(예컨대, 세포내 T 세포 신호전달 도메인, 막횡단 도메인, 스페이서 영역, 세포내 공동 자극 신호전달 도메인)을 포함하고, 이들 모두는 하나의 연속 단일쇄 폴리펩티드의 일부를 형성한다.
본원에 제공된 "세포내 T 세포 신호전달 도메인"은 그의 실시양태를 포함하여 본원에 제공된 항체 영역에 대한 항원의 결합에 반응하여 1차 신호전달을 제공할 수 있는 아미노산 서열을 포함한다. 실시양태에서, 세포내 T 세포 신호전달 도메인의 신호전달은 이를 발현하는 T 세포의 활성화를 초래한다. 실시양태에서, 세포내 T 세포 신호전달 도메인의 신호전달은 이를 발현하는 T 세포의 증식(세포 분할)을 초래한다. 실시양태에서, 세포내 T 세포 신호전달 도메인의 신호전달은 상기 T 세포에 의한 활성화된 T 세포의 특징인 것으로 당업계에 공지된 단백질(예컨대, CTLA-4, PD-1, CD28, CD69)의 발현을 초래한다. 실시양태에서, 세포내 T 세포 신호전달 도메인은 인간 CD3 복합체의 제타 쇄의 신호전달 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 세포내 T 세포 신호전달 도메인은 CD3ζ 세포내 T 세포 신호전달 도메인이다.
실시양태에서, 세포내 T 세포 신호전달 도메인은 서열번호 34의 서열을 포함한다. 실시양태에서, 세포내 T 세포 신호전달 도메인은 서열번호 34의 서열이다. 실시양태에서, 세포내 T 세포 신호전달 도메인은 서열번호 11의 서열을 포함한다. 실시양태에서, 세포내 T 세포 신호전달 도메인은 서열번호 11의 서열이다.
본원에 제공된 재조합 단백질의 경우, 막횡단 도메인은 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인을 세포내 T 세포 신호전달 도메인에 연결한다. 실시양태에서, 막횡단 도메인은 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인과 세포내 T 세포 신호전달 도메인 사이에 있다. 다시 말해서, 막횡단 도메인은 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인의 C-말단에 직접 또는 (예컨대, 스페이서를 통해) 간접적으로 연결되고 세포내 T 세포 신호전달 도메인의 N-말단에 직접 또는 (예컨대, 공동자극 신호전달 도메인을 통해) 간접적으로 연결된다.
본원에 제공된 "막횡단 도메인"은 생물학적 막의 일부를 형성하는 폴리펩티드를 지칭한다. 본원에 제공된 막횡단 도메인은 막의 한 측면으로부터 막의 다른 측면을 통해 생물학적 막(예컨대, 세포막)에 걸쳐 있을 수 있다. 실시양태에서, 막횡단 도메인은 세포막의 세포내 측면에서 세포외 측면에 걸쳐 있다. 막횡단 도메인은 비-극성의 소수성 잔기를 포함할 수 있으며, 이는 생물학적 막(예컨대, T 세포의 세포막)에 그의 실시양태를 포함하여 본원에 제공된 단백질을 고정시킨다. 그의 실시양태를 포함하여 본원에 제공된 단백질을 고정시킬 수 있는 임의의 막횡단 도메인이 고려된다. 실시양태에서, 막횡단 도메인은 L-셀렉틴이다. 본원에 제공된 용어 "L-셀렉틴"은 CD62L로도 공지된 L-셀렉틴 단백질의 재조합 또는 자연 발생 형태, 또는 L-셀렉틴 활성을 (예컨대, L-셀렉틴과 비교하여 적어도 50%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 활성 내에서) 유지하는 그의 변이체 또는 상동체를 포함한다. 실시양태에서, 변이체 또는 상동체는, 자연 발생 L-셀렉틴 폴리펩티드와 비교하여, 전체 서열 또는 서열의 일부(예컨대, 50, 100, 150 또는 200개 연속 아미노산 부분)에 걸쳐 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 실시양태에서, L-셀렉틴은 NCBI 서열 참조 GI:262206315, 그의 상동체 또는 기능적 단편에 의해 확인된 단백질이다. 막횡단 도메인의 비제한적 예는 CD8α, CD4 또는 CD3-제타의 막횡단 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 막횡단 도메인은 CD8α 막횡단 도메인, CD28 막횡단 도메인, CD4 막횡단 도메인 또는 CD3-제타 막횡단 도메인이다. 실시양태에서, 막횡단 도메인은 CD28 막횡단 도메인이다.
본원에 제공된 용어 "CD28 막횡단 도메인"은 임의의 재조합 또는 자연 발생 형태의 CD28의 막횡단 도메인, 또는 CD28 막횡단 도메인 활성을 (예컨대, CD28 막횡단 도메인과 비교하여 적어도 50%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 활성 내에서) CD28의 막횡단 도메인의 활성을 유지하는 그의 변이체 또는 상동체를 포함한다. 일부 측면에서, 변이체 또는 상동체는 자연 발생 CD28 막횡단 도메인 폴리펩티드와 비교하여, 전체 서열 또는 서열의 일부(예컨대, 50, 100, 150 또는 200개 연속 아미노산 부분)에 걸쳐 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 실시양태에서, CD28 막횡단 도메인은 서열번호 18 또는 서열번호 2에 의해 확인된 단백질, 그의 변이체, 상동체 또는 기능적 단편이다. 실시양태에서, CD28은 NCBI 서열 참조 GI:340545506, 그의 상동체 또는 그의 기능적 단편에 의해 확인된 단백질이다.
실시양태에서, 막횡단 도메인은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 18, 그의 상동체 또는 기능성 단편에 의해 확인된 단백질 도메인이다. 실시양태에서, 막횡단 도메인은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 18, 그의 상동체 또는 기능성 단편에 의해 확인된 단백질 도메인을 포함한다.
마찬가지로, 본원에 제공된 용어 "CD8α 막횡단 도메인"은 임의의 재조합 또는 자연 발생 형태의 CD8α의 막횡단 도메인, 또는 CD8α 막횡단 도메인 활성을 (예컨대, CD8α 막횡단 도메인과 비교하여 적어도 50%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 활성 내에서) CD8α의 막횡단 도메인의 활성을 유지하는 그의 변이체 또는 상동체를 포함한다. 일부 측면에서, 변이체 또는 상동체는 자연 발생 CD8α 막횡단 도메인 폴리펩티드와 비교하여, 전체 서열 또는 서열의 일부(예컨대, 50, 100, 150 또는 200개 연속 아미노산 부분)에 걸쳐 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는다.
본원에 제공된 용어 "CD4 막횡단 도메인"은 임의의 재조합 또는 자연 발생 형태의 CD4의 막횡단 도메인, 또는 CD4 막횡단 도메인 활성을 (예컨대, CD4 막횡단 도메인과 비교하여 적어도 50%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 활성 내에서) CD4의 막횡단 도메인의 활성을 유지하는 그의 변이체 또는 상동체를 포함한다. 일부 측면에서, 변이체 또는 상동체는 자연 발생 CD4 막횡단 도메인 폴리펩티드와 비교하여, 전체 서열 또는 서열의 일부(예컨대, 50, 100, 150 또는 200개 연속 아미노산 부분)에 걸쳐 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는다.
본원에 제공된 용어 "CD3-제타 막횡단 도메인"은 임의의 재조합 또는 자연 발생 형태의 CD3-제타의 막횡단 도메인, 또는 CD3-제타 막횡단 도메인 활성을 (예컨대, CD3-제타 막횡단 도메인과 비교하여 적어도 50%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 활성 내에서) CD3-제타의 막횡단 도메인의 활성을 유지하는 그의 변이체 또는 상동체를 포함한다. 일부 측면에서, 변이체 또는 상동체는 자연 발생 CD3-제타 막횡단 도메인 폴리펩티드와 비교하여, 전체 서열 또는 서열의 일부(예컨대, 50, 100, 150 또는 200개 연속 아미노산 부분)에 걸쳐 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는다.
실시양태에서, 재조합 단백질은 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인을 막횡단 도메인에 연결하는 스페이서 영역을 포함한다. 실시양태에서, 스페이서 영역은 막횡단 도메인과 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인 사이에 있다. 다시 말해서, 스페이서 영역은 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인의 C-말단에 직접적으로 또는 (예컨대, 펩티드 링커를 통해) 간접적으로 연결되고 막횡단 도메인의 N-말단에 직접적으로 또는 (예컨대, 다른 펩티드 링커를 통해) 간접적으로 연결된다. 따라서, 본원에 제공된 재조합 단백질은 제1 펩티드 링커 및 제2 펩티드 링커를 포함할 수 있으며, 여기서 제1 펩티드 링커는 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인의 C-말단을 스페이서 영역의 N-말단에 연결하고 제2 펩티드 링커는 스페이서 영역의 C-말단을 막횡단 도메인의 N-말단에 연결한다.
본원에 제공된 "스페이서 영역"은 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인을 막횡단 도메인과 연결하는 폴리펩티드이다. 실시양태에서, 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인의 항원 결합 도메인(예컨대, Fab)에 대한 결합 친화력은 스페이서 영역의 부재와 비교하여 증가된다. 실시양태에서, 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인과 항원 결합 도메인(예컨대, Fab) 사이의 입체 장애는 스페이서 영역의 존재 하에 감소된다.
실시양태에서, 스페이서 영역은 Fc 영역을 포함한다. 본원에 제공된 조성물 및 방법에 대해 고려되는 스페이서 영역의 예는 면역글로불린 분자 또는 그의 단편(예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) 및 Fc 수용체 결합에 영향을 미치는 돌연변이를 포함하는 면역글로불린 분자 또는 그의 단편(예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4)을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 실시양태에서, 스페이서 영역은 IgG(예컨대, IgG4)의 단편이며, 여기서 상기 단편은 CH2 도메인의 결실을 포함한다. 실시양태에서, 스페이서 영역은 IgG(예컨대, IgG4)의 단편이며, 여기서 상기 단편은 CH3 영역을 포함한다. 실시양태에서, 스페이서 영역은 CH3 영역이다. 실시양태에서, 스페이서 영역은 CH3 영역을 포함한다. 실시양태에서, 스페이서 영역은 CH2 영역이다. 실시양태에서, 스페이서 영역은 CH2 영역을 포함한다. 스페이서 영역은 펩티드 링커일 수 있다. 실시양태에서, 스페이서 영역은 세린-글리신 링커이다. 실시양태에서, 스페이서 영역은 서열 GGSG를 갖는다. 스페이서 영역은 서열 GGSG를 포함한다. 실시양태에서, 스페이서 영역은 서열 GSGSGSGS(서열번호 24)를 갖는다. 실시양태에서, 스페이서 영역은 서열 GSGSGSGS(서열번호 24)를 포함한다. 실시양태에서, 스페이서 영역은 적어도 4개의 아미노산 길이이다. 실시양태에서, 스페이서 영역은 약 4개의 아미노산 길이이다. 실시양태에서, 스페이서 영역은 4 내지 250개의 아미노산 길이이다. 스페이서 영역은 본원에 제공된 단백질의 생체내(예컨대, 혈장) 반감기를 연장할 수 있는 잔기를 포함할 수 있다. 실시양태에서, 스페이서 영역은 10개의 아미노산 길이이다. 실시양태에서, 스페이서 영역은 229개의 아미노산 길이이다. 실시양태에서, 스페이서 영역은 GGGSSGGGSG(서열번호 31)이다. 실시양태에서, 스페이서 영역은 서열 GGGSSGGGSG(서열번호 31)를 포함한다. 스페이서 영역은 "파실화"될 수 있다. 용어 "파실화된" 또는 "파실화"는 그의 통상적인 의미로 사용되며, 프롤린, 알라닌 및 세린의 함량이 높기 때문에 가용성이 높은 생물학적 중합체를 형성하는 아미노산 서열을 지칭한다. 따라서, 실시양태에서, 스페이서 영역은 조합된 약 200개의 프롤린, 알라닌 및 세린 잔기를 포함한다. 실시양태에서, 스페이서 영역은 조합된 약 10 내지 약 200개의 프롤린, 알라닌 및 세린 잔기를 포함한다. 실시양태에서, 스페이서 영역은 친수성 잔기를 포함한다. 실시양태에서, 재조합 단백질은 스페이서 영역을 포함하지 않는다.
실시양태에서, 스페이서 영역은 서열번호 33의 서열을 포함한다. 실시양태에서, 스페이서 영역은 서열번호 33의 서열을 갖는다.
실시양태에서, 재조합 단백질은 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인을 스페이서 영역에 연결하는 펩티드 링커를 포함한다. 실시양태에서, 펩티드 링커는 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인과 스페이서 영역 사이에 있다. 다시 말해서, 펩티드 링커는 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인의 C-말단에 직접적으로 또는 (예컨대, 펩티드 링커를 통해) 간접적으로 연결되고 스페이서 영역의 N-말단에 직접적으로 또는 (예컨대, 다른 펩티드 링커를 통해) 간접적으로 연결된다. 본원에 제공된 펩티드 링커(예컨대, 제1 또는 제2 펩티드 링커)는 5-50개의 아미노산 길이일 수 있다. 실시양태에서, 펩티드 링커(예컨대, 제1 또는 제2 펩티드 링커)는 5-45개의 아미노산 길이이다. 실시양태에서, 펩티드 링커(예컨대, 제1 또는 제2 펩티드 링커)는 5-40개의 아미노산 길이이다. 실시양태에서, 펩티드 링커(예컨대, 제1 또는 제2 펩티드 링커)는 5-35개의 아미노산 길이이다. 실시양태에서, 펩티드 링커(예컨대, 제1 또는 제2 펩티드 링커)는 5-30개의 아미노산 길이이다. 실시양태에서, 펩티드 링커(예컨대, 제1 또는 제2 펩티드 링커)는 5-25개의 아미노산 길이이다. 실시양태에서, 펩티드 링커(예컨대, 제1 또는 제2 펩티드 링커)는 5-20개의 아미노산 길이이다. 실시양태에서, 펩티드 링커(예컨대, 제1 또는 제2 펩티드 링커)는 5-15개의 아미노산 길이이다. 실시양태에서, 펩티드 링커(예컨대, 제1 또는 제2 펩티드 링커)는 5-10개의 아미노산 길이이다. 실시양태에서, 펩티드 링커(예컨대, 제1 또는 제2 펩티드 링커)는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 34, 35 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개의 아미노산 길이이다. 실시양태에서, 펩티드 링커(예컨대, 제1 또는 제2 펩티드 링커)는 18개의 아미노산 길이이다. 실시양태에서, 펩티드 링커는 서열번호 25의 서열을 갖는다. 실시양태에서, 펩티드 링커는 서열번호 25의 서열을 포함한다. 실시양태에서, 펩티드 링커는 서열 SAPASSASAPSAASAPAG(서열번호 26)이다.
실시양태에서, 펩티드 링커는 제1 펩티드 링커이고, 재조합 단백질은 제2 펩티드 링커를 포함하고, 여기서 제2 펩티드 링커는 스페이서 영역을 막횡단 도메인과 연결시킨다. 따라서, 실시양태에서, 제2 펩티드 링커는 스페이서 영역과 막횡단 도메인 사이에 있다. 다시 말해서, 제1 펩티드 링커는 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인의 C-말단에 연결되고 스페이서 영역의 N-말단에 연결되고; 제2 펩티드 링커는 스페이서 영역의 C-말단에 연결되고 막횡단 도메인의 N-말단에 연결된다.
실시양태에서, 본원에 제공된 재조합 단백질은 막횡단 도메인을 세포내 T 세포 신호전달 도메인에 연결하는 세포내 공동 자극 신호전달 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 세포내 공동 자극 신호전달 도메인은 막횡단 도메인과 세포내 T 세포 신호전달 도메인 사이에 있다. 다시 말해서, 세포내 공동 자극 신호전달 도메인은 막횡단 도메인의 C-말단에 직접 또는 (예컨대, 펩티드 링커를 통해) 간접적으로 연결되고 세포내 T 세포 신호전달 도메인의 N-말단에 연결된 직접적으로 또는 (예컨대, 다른 펩티드 링커를 통해) 간접적으로 연결된다.
본원에 제공된 "세포내 공동 자극 신호전달 도메인"은 그의 실시양태를 포함하여 본원에 제공된 항체 영역에 대한 항원의 결합에 반응하여 공동 자극 신호전달을 제공할 수 있는 아미노산 서열을 포함한다. 실시양태에서, 공동 자극 신호전달 도메인의 신호전달은 시토카인의 생성 및 이를 발현하는 T 세포의 증식을 초래한다. 실시양태에서, 세포내 공동 자극 신호전달 도메인은 CD28 세포내 공동 자극 신호전달 도메인, 4-1BB 세포내 공동 자극 신호전달 도메인, ICOS 세포내 공동 자극 신호전달 도메인, 또는 OX-40 세포내 공동 자극 신호전달 도메인이다. 실시양태에서, 세포내 공동 자극 신호전달 도메인은 CD28 세포내 공동 자극 신호전달 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 세포내 공동 자극 신호전달 도메인은 CD28 세포내 공동 자극 신호전달 도메인이다. 실시양태에서, 세포내 공동 자극 신호전달 도메인은 4-1BB 세포내 공동 자극 신호전달 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 세포내 공동 자극 신호전달 도메인은 4-1BB 세포내 공동 자극 신호전달 도메인이다. 실시양태에서, 세포내 공동 자극 신호전달 도메인은 CD28 세포내 공동 자극 신호전달 도메인, 4-1BB 세포내 공동 자극 신호전달 도메인, ICOS 세포내 공동 자극 신호전달 도메인, OX-40 세포내 공동 자극 신호전달 도메인 또는 그의 임의의 조합이다.
서열 및 수탁 번호를 포함하는 예시적인 세포내 공동 자극 신호전달 도메인은 표 2에 열거되어 있다. 실시양태에서, 세포내 공동 자극 신호전달 도메인은 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15 또는 서열번호 16. 실시양태에서, 세포내 공동 자극 신호전달 도메인은 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15 또는 서열번호 16으로 확인된 단백질을 포함한다. 실시양태에서, 세포내 공동 자극 신호전달 도메인은 서열번호 13이다. 실시양태에서, 세포내 공동 자극 신호전달 도메인은 서열번호 14이다.
실시양태에서, 재조합 단백질은 세포내 T 세포 신호전달 도메인의 C-말단에 결합된 검출 가능한 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 검출 가능한 도메인은 말단절단된 CD19(CD19t) 도메인이다. 용어 "CD19t"는 세포내 신호전달 능력이 없는 말단절단된 CD19 단백질을 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 말단절단된 CD19는 본원에 제공된 재조합 단백질을 포함하는 T 세포를 확인하기 위한 검출 가능한 도메인으로서 기능하는 불활성 분자이다. 실시양태에서, 검출 가능한 도메인은 서열번호 22의 서열을 포함한다. 실시양태에서, 검출 가능한 도메인은 서열번호 22의 서열이다.
실시양태에서, 재조합 단백질은 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 검출 가능한 도메인에 연결하는 자가-절단 펩티딜 서열을 포함한다. 실시양태에서, 자가-절단 펩티딜 링커 서열은 T2A 서열 또는 2A 서열이다. 실시양태에서, 자가-절단 펩티딜 서열은 세포내 T 세포 신호전달 도메인과 검출 가능한 도메인 사이에 있다. 다시 말해서, 자가-절단 펩티딜 서열은 세포내 T 세포 신호전달 도메인의 C-말단에 직접적으로 또는 (예컨대, 펩티드 링커를 통해) 간접적으로 연결되고, 검출 가능한 도메인의 N-말단에 직접적으로 또는 (예컨대, 다른 펩티드 링커를 통해) 간접적으로 연결된다.
실시양태에서, 자가-절단 펩티딜 링커는 서열 PVKQLLNFDLLKLAGDVESNPGP(서열번호 27)를 갖는다. 실시양태에서, 자가-절단 펩티딜 링커는 말 비염 A 바이러스 서열의 서열을 갖는다. 실시양태에서, 자가-절단 펩티딜 링커는 서열 QCTNYALLKLAGDVESNPGP(서열번호 28)를 갖는다. 실시양태에서, 자가-절단 펩티딜은 돼지 테스코바이러스 1 서열의 서열을 갖는다. 실시양태에서, 자가-절단 펩티딜은 서열 ATNFSLLKQAGDVEENPGP(서열번호 29)를 갖는다. 실시양태에서, 자가-절단 펩티딜 링커는 토세아 아시그나 바이러스(Thosea asigna virus) 서열의 서열을 갖는다. 실시양태에서, 자가-절단 펩티딜 링커는 서열 EGRGSLLTCGDVESNPGP(서열번호 30)를 갖는다. 실시양태에서, 자가-절단 펩티딜 링커는 서열번호 21의 서열을 갖는다. 실시양태에서, 자가-절단 펩티딜 링커는 서열번호 21의 서열이다.
실시양태에서, 재조합 단백질은 세포의 일부를 형성한다. 실시양태에서, 재조합 단백질은 T 세포의 일부를 형성한다. 실시양태에서, 막횡단 도메인은 T 세포의 세포막의 일부를 형성한다.
상기 기재된 바와 같이, 본원에 제공된 재조합 단백질은 항원 결합 도메인에 결합할 수 있다. 그의 실시양태를 포함하여 본원에 제공된 재조합 단백질의 요소(예컨대, 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인, 막횡단 도메인, 세포내 T 세포 신호전달 도메인, 세포내 공동 자극 신호전달 도메인)는 서로 공유적으로 결합하여 연속 단일쇄 폴리펩티드를 형성하지만, 재조합 단백질은 항원 결합 도메인에 비공유적으로 결합한다. 실시양태에서, 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인은 항원 결합 도메인에 결합된다. 실시양태에서, 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인은 항원 결합 도메인에 비공유적으로 결합된다.
전술된 바와 같이, 항원 결합 도메인은 Fab, IgG 또는 이중특이적 항체일 수 있다. 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 세툭시맙 메디토프-이용 가능한 도메인, 트라스투주맙 메디토프-이용 가능한 도메인, 페르투주맙 메디토프-이용 가능한 도메인, M5A 메디토프-이용 가능한 도메인 또는 리툭시맙 메디토프-이용 가능한 도메인이다. 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 암 항원에 결합할 수 있다. 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 암 항원에 결합할 수 있다. 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 암항원에 비공유적으로 결합할 수 있다. 실시양태에서, 암 항원은 Her2, EGFR, CD19 또는 CD20이다. 실시양태에서, 암 항원은 세포의 일부를 형성한다. 실시양태에서, 암 항원은 세포의 표면에서 발현된다. 실시양태에서, 세포는 암 세포이다. 실시양태에서, 암은 난소암, 신장 세포 암종, B 세포 악성종양, 백혈병, 림프종, 유방암, 결장직장암, 전립선암, 신경모세포종, 흑색종, 속질모세포종, 폐암, 골육종, 아교모세포종 또는 신경아교종이다.
본원에 제공된 조성물은 그의 실시양태를 포함하여 본원에 제공된 복수의(즉, 하나 초과, 적어도 2개) 재조합 단백질을 포함할 수 있다. 조성물이 그의 실시양태를 포함하여 본원에 제공된 하나 초과의 재조합 단백질을 포함하는 경우, 재조합 단백질은 본원에서 제1, 제2, 제3, 제4 등의 재조합 단백질로 지칭된다. 따라서, 상기 제1, 제2, 제3, 제4 등의 재조합 단백질의 일부를 형성하는 요소는 본원에서 각각 제1, 제2, 제3 또는 제4의 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인, 제1, 제2, 제3 또는 제4의 세포내 T 세포 신호전달 도메인, 제1, 제2, 제3 또는 제4의 막횡단 도메인, 제1, 제2, 제3 또는 제4의 스페이서 영역 또는 제1, 제2, 제3 또는 제4의 세포내 공동 자극 신호전달 도메인을 지칭한다. 조성물이 그의 실시양태를 포함하여 본원에 제공된 복수의 재조합 단백질을 포함하는 경우, 재조합 단백질은 상이하거나 동일할 수 있다. 다시 말해서, 재조합 단백질은 동일한 도메인 또는 상이한 도메인(예컨대, 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인, 세포내 T 세포 신호전달 도메인, 막횡단 도메인, 스페이서 영역, 세포내 공동 자극 신호전달 도메인)을 포함할 수 있거나 또는 동일하거나 상이한 항원 결합 도메인에 결합할 수 있다.
본원에 제공된 조성물이 본원에 제공된 복수의 재조합 단백질을 포함하는 경우, 재조합 단백질은 그들의 각각의 스페이서 영역의 비-공유 결합을 통해 서로 이량체화될 수 있다. 예컨대, 제1 재조합 단백질은 제2 재조합 단백질의 제2 CH3 도메인에 비공유적으로 결합하는 제1 CH3 도메인을 포함할 수 있다. 따라서, 실시양태에서, 재조합 단백질은 제1 재조합 단백질이고, 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인은 제1 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인이고, 세포내 T 세포 신호전달 도메인은 제1 세포내 T 세포 신호전달 도메인이고, 막횡단 도메인은 제1 막횡단 도메인이고, 스페이서 영역은 제1 스페이서 영역이고, 세포내 공동 자극 신호전달 도메인은 제1 세포내 공동 자극 신호전달 도메인이다.
실시양태에서, 제1 재조합 단백질은 제2 재조합 단백질에 비공유적으로 결합되며, 제2 재조합 단백질은 (i) 제2 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인; (ii) 제2 세포내 T 세포 신호전달 도메인; (iii) 제2 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인을 제2 세포내 T 세포 신호전달 도메인에 연결하는 제2 막횡단 도메인; 및 (iv) 제2 스페이서 영역을 포함하고, 여기서 제2 스페이서 영역은 제2 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인을 제2 막횡단 도메인에 연결하고, 여기서 제1 스페이서 영역은 제2 스페이서 영역에 비공유적으로 결합된다. 실시양태에서, 제1 스페이서 영역 및 제2 스페이서 영역은 제1 불변 중쇄 3(CH3) 도메인 및 제2 불변 중쇄 3(CH3) 도메인이다.
실시양태에서, 제1 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인 및 제2 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인은 화학적으로 상이하다. 실시양태에서, 제1 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인 및 제2 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인은 화학적으로 동일하다.
실시양태에서, 제1 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인은 제1 항원 결합 도메인에 비공유적으로 결합된다. 실시양태에서, 제2 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인은 제2 항원 결합 도메인에 비공유적으로 결합된다. 실시양태에서, 제1 항원 결합 도메인 및 제2 항원 결합 도메인은 화학적으로 상이하거나 동일하다. 실시양태에서, 제1 항원 결합 도메인 및 제2 항원 결합 도메인은 독립적으로 세툭시맙 메디토프-이용 가능한 도메인, 트라스투주맙 메디토프-이용 가능한 도메인, 페르투주맙 메디토프-이용 가능한 도메인, M5A 메디토프-이용 가능한 도메인 또는 리툭시맙 메디토프-이용 가능한 도메인이다.
일 실시양태에서, 재조합 단백질은 서열 32의 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인, 서열 33의 스페이서 영역, 서열 18의 CD28 막횡단 도메인, 서열번호 13의 CD28 세포내 공동 자극제 신호전달 도메인, 서열번호 34의 CD3ζ 세포내 T 세포 신호전달 도메인, 서열번호 21의 자가 절단 펩티딜 링커 서열 및 서열번호 22의 검출 가능한 도메인을 포함한다.
일 실시양태에서, 재조합 단백질은 서열 32의 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인, 서열 33의 스페이서 영역, 서열 18의 CD28 막횡단 도메인, 서열번호 14의 4-1BB 세포내 공동 자극 신호전달 도메인, 서열번호 34의 CD3ζ 세포내 T 세포 신호전달 도메인, 서열번호 21의 자가 절단 펩티딜 링커 서열 및 서열번호 22의 검출 가능한 도메인을 포함한다.
일 실시양태에서, 재조합 단백질은 서열 32의 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인, 서열 33의 스페이서 영역, 서열 18의 CD28 막횡단 도메인, 서열번호 13의 CD28 세포내 공동 자극제 신호전달 도메인, 및 서열번호 34의 CD3ζ 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 포함한다.
일 실시양태에서, 재조합 단백질은 서열 32의 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인, 서열 33의 스페이서 영역, 서열 18의 CD28 막횡단 도메인, 서열번호 14의 4-1BB 세포내 동시 자극 신호전달 도메인, 및 서열번호 34의 CD3ζ 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 포함한다.
일 실시양태에서, 재조합 단백질은 서열번호 32의 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인, 서열번호 25의 펩티드 링커, 서열번호 33의 스페이서 영역, 서열번호 18의 CD28 막횡단 도메인, 서열번호 13의 CD28 세포내 공동 자극 신호전달 도메인, 서열번호 34의 CD3ζ 세포내 T 세포 신호전달 도메인, 서열번호 21의 자가 절단 펩티딜 링커 서열, 서열번호 22의 검출 가능한 도메인을 포함한다.
일 실시양태에서, 재조합 단백질은 서열번호 32의 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인, 서열번호 25의 펩티드 링커, 서열번호 33의 스페이서 영역, 서열번호 18의 CD28 막횡단 도메인, 서열번호 14의 4-1BB 세포내 공동 자극 신호전달 도메인, 서열번호 34의 CD3ζ 세포내 T 세포 신호전달 도메인, 서열번호 21의 자가 절단 펩티딜 링커 서열 및 서열번호 22의 검출 가능한 도메인을 포함한다.
실시양태에서, 재조합 단백질은 서열번호 37의 신호 펩티드를 포함한다. 실시양태에서, 신호 펩티드는 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인의 N-말단에 결합된다.
일 실시양태에서, 재조합 단백질은 서열 32의 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인, 서열 25의 펩티드 링커, 서열 33의 스페이서 영역, 서열번호 18의 CD28 막횡단 도메인, 서열번호 13의 CD28 세포내 공동 자극 신호전달 도메인, 및 서열번호 34의 CD3ζ 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 포함한다.
일 실시양태에서, 재조합 단백질은 서열번호 32의 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인, 서열번호 25의 펩티드 링커, 서열번호 33의 스페이서 영역, 서열번호 18의 CD28 막횡단 도메인, 서열번호 14의 4-1BB 세포내 공동 자극 신호전달 도메인, 및 서열번호 34의 CD3ζ 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 포함한다.
일 실시양태에서, 재조합 단백질은 서열번호 35의 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 재조합 단백질은 서열번호 35의 서열이다. 일 실시양태에서, 재조합 단백질은 서열번호 36의 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 재조합 단백질은 서열번호 36의 서열이다.
실시양태에서, 재조합 단백질은 N-말단에서 C-말단으로 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인, 스페이서 영역, CD28 막횡단 도메인, CD28 세포내 공동 자극 신호전달 도메인, CD3ζ 세포내 T 세포 신호전달 도메인, 자가 절단 펩티딜 링커 서열 및 검출 가능한 도메인을 포함한다.
실시양태에서, 재조합 단백질은 N-말단에서 C-말단으로 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인, 스페이서 영역, CD28 막횡단 도메인, 4-1BB 세포내 공동 자극 신호전달 도메인, CD3ζ 세포내 T 세포 신호전달 도메인, 자가 절단 펩티딜 링커 서열 및 검출 가능한 도메인을 포함한다.
실시양태에서, 재조합 단백질은 N-말단에서 C-말단으로 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인, 스페이서 영역, CD28 막횡단 도메인, CD28 세포내 공동 자극 신호전달 도메인 및 CD3ζ 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 포함한다.
실시양태에서, 재조합 단백질은 N-말단에서 C-말단으로 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인, 스페이서 영역, CD28 막횡단 도메인, 4-1BB 세포내 공동 자극 신호전달 도메인, 및 CD3ζ 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 포함한다.
실시양태에서, 재조합 단백질은 N-말단에서 C-말단으로 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인, 펩티드 링커, 스페이서 영역, CD28 막횡단 도메인, CD28 세포내 공동 자극 신호전달 도메인, CD3ζ 세포내 T 세포 신호전달 도메인, 자가 절단 펩티딜 링커 서열 및 검출 가능한 도메인을 포함한다.
실시양태에서, 재조합 단백질은 N-말단에서 C-말단으로 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인, 펩티드 링커, 스페이서 영역, CD28 막횡단 도메인, 4-1BB 세포내 공동 자극 신호전달 도메인, CD3ζ 세포내 T 세포 신호전달 도메인, 자가 절단 펩티딜 링커 서열 및 검출 가능한 도메인을 포함한다.
실시양태에서, 재조합 단백질은 N-말단에서 C-말단으로 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인, 펩티드 링커, 스페이서 영역, CD28 막횡단 도메인, CD28 세포내 공동 자극 신호전달 도메인, 및 CD3ζ 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 포함한다.
실시양태에서, 재조합 단백질은 N-말단에서 C-말단으로 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인, 펩티드 링커, 스페이서 영역, CD28 막횡단 도메인, 4-1BB 세포내 공동 자극 신호전달 도메인, 및 CD3ζ 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 포함한다. 핵산 조성물
그의 실시양태를 포함하여 본원에 제공된 재조합 단백질을 코딩하는 핵산이 본원에 제공된다. 따라서, 일 측면에서, 그의 실시양태를 포함하여 본원에 제공된 재조합 단백질을 코딩하는 핵산이 제공된다. 또 다른 측면에서, 그의 실시양태를 포함하여 본원에 제공된 핵산을 포함하는 발현 벡터가 제공된다. 실시양태에서, 발현 벡터는 렌티바이러스 또는 온코-레트로바이러스이다. 실시양태에서, 발현 벡터는 렌티바이러스이다. 실시양태에서, 발현 벡터는 온코-레트로바이러스이다.
세포 조성물
본원에 제공된 재조합 단백질 및 핵산은 세포의 일부를 형성할 수 있다(즉, 세포에 의해 포함되고/되거나 발현된다). 따라서, 일 측면에서, 그의 실시양태를 포함하여 본원에 제공된 발현 벡터를 포함하는 T 림프구가 제공된다.
또 다른 측면에서, 그의 실시양태를 포함하여 본원에 제공된 재조합 단백질을 포함하는 T 림프구가 제공된다. 본원에 제공된 재조합 단백질의 일부는 이것이 발현되는 세포의 세포막의 일부를 형성할 수 있다. 막횡단 도메인은, 예컨대 막의 한 측면으로부터 막의 다른 측면을 통해 T 세포의 세포막에 걸쳐 있을 수 있다. 실시양태에서, 막횡단 도메인은 세포막의 세포내 측면에서 세포외 측면에 걸쳐 있다. 따라서, 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인 및 스페이서 영역은 세포막의 세포외 측면에 위치하고, 세포내 T 세포 신호전달 도메인은 세포의 세포내 측면에 위치된다. 실시양태에서, 막횡단 도메인은 T 림프구의 세포막 내에 있다. 실시양태에서, T 림프구는 자가 T 림프구이다. 실시양태에서, T 림프구는 이종 T 림프구이다.
실시양태에서, 이어서 CDR상의 결합 펩티드 도메인은 항원 결합 도메인에 결합된다. 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 Fab, IgG 또는 이중특이적 항체이다. 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 암 항원에 결합된다.
항원 결합 도메인은 제1 Fab 도메인 및 제2 Fab 도메인을 포함하는 항체일 수 있고 재조합 단백질은 제1 Fab 도메인의 비-CDR 결합 부위에 결합할 수 있고 제2 Fab 도메인은 암 항원에 결합할 수 있다. 실시양태에서, 재조합 단백질은 제1 Fab 도메인의 비-CDR 결합 부위에 결합하고 제1 Fab 도메인은 암 항원에 결합한다. 실시양태에서, 재조합 단백질은 제1 Fab 도메인의 비-CDR 결합 부위에 결합하고, 제1 Fab 도메인은 제1 암 항원에 결합하고 제2 Fab 도메인은 제2 암 항원에 결합한다. 실시양태에서, 제1 재조합 단백질은 제1 Fab 도메인의 비-CDR 결합 부위에 결합하고, 제2 재조합 단백질은 제2 Fab 도메인의 비-CDR 결합 부위에 결합한다. 추가의 실시양태에서, 제1 Fab 도메인은 제1 암 항원에 결합하고 제2 Fab 도메인은 제2 암 항원에 결합한다.
실시양태에서, 암 항원은 Her2, EGFR, CD19 또는 CD20이다. 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 암 항원 결합 도메인이다. 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 세툭시맙 메디토프-이용 가능한 도메인, 트라스투주맙 메디토프-이용 가능한 도메인, 페르투주맙 메디토프-이용 가능한 도메인, M5A 메디토프-이용 가능한 도메인 또는 리툭시맙 메디토프-이용 가능한 도메인이다.
치료 방법
그의 실시양태를 포함하여 본원에 제공된 조성물은 특히 암과 같은 질환에 대한 효과적인 치료를 제공하는 데 유용하다. 따라서, 일 측면에서, 암을 치료하는 방법이 제공된다. 방법은 암 치료가 필요한 대상체에게 그의 실시양태를 포함한 본원에 제공된 T 림프구의 유효량 및 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인에 결합할 수 있는 항원 결합 도메인의 유효량을 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 항원 결합 도메인은 암 항원 결합 도메인이다.
실시양태에서, T 림프구 및 항원 결합 도메인은 동시에 또는 순차적으로 투여된다. 실시양태에서, T 림프구 및 항원 결합 도메인은 동시에 투여된다.
T 림프구 및 항원 결합 도메인은 조합하여 (예컨대, 혼합물로서) 공동으로, (예컨대, 개별적인 정맥 내 라인을 통해) 개별적으로 그러나 동시에, 또는 (예컨대, 하나의 작용제가 먼저 투여되고 이어서 제2 작용제가 투여되는) 순차적으로 투여될 수 있다. 따라서, 용어 조합은 T 림프구 및 항원 결합 도메인의 공동, 동시 또는 순차적 투여를 지칭하기 위해 사용된다. 실시양태에서, T 림프구 및 항원 결합 도메인이 순차적으로 투여되는 경우, T 림프구는 제1 시점에 투여되고 항원 결합 도메인은 제2 시점에 투여되며, 여기서 제1 시점은 제2 시점에 선행한다. 치료 과정은 대상체의 특정 특성 및 선택된 치료 유형에 따라 개별적으로 가장 잘 결정된다. 본원에 개시된 것들과 같은 치료는 매일, 1일 2회, 격주, 매월 또는 치료적으로 효과적인 임의의 적용 가능한 기준으로 대상체에게 투여될 수 있다. 치료는 단독으로 또는 본원에 개시되거나 당업계에 공지된 임의의 다른 치료와 함께 투여될 수 있다. 추가 치료는 제1 치료와 동시에, 다른 시간에, 또는 완전히 다른 치료 스케줄에 따라 투여될 수 있다(예컨대, 제1 치료는 매일 투여될 수 있지만 추가 치료는 매주 투여됨). 따라서, 실시양태에서, T 림프구 및 항원 결합 도메인은 동시에 또는 순차적으로 투여된다.
실시양태에서, T 림프구는 제1 시점에 투여되고 항원 결합 도메인은 제2 시점에 투여되며, 여기서 제1 시점은 제2 시점에 선행한다. 실시양태에서, 제2 시점은 제1 시점으로부터 약 120, 90, 60, 50, 40, 30, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 10, 11, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1일 미만 이내이다. 실시양태에서, 제2 시점은 제1 시점으로부터 약 120일 미만 이내이다. 실시양태에서, 제2 시점은 제1 시점으로부터 약 90일 미만 이내이다. 실시양태에서, 제2 시점은 제1 시점으로부터 약 60일 미만 이내이다. 실시양태에서, 제2 시점은 제1 시점으로부터 약 50일 미만 이내이다. 실시양태에서, 제2 시점은 제1 시점으로부터 약 40일 미만 이내이다. 실시양태에서, 제2 시점은 제1 시점으로부터 약 30일 미만 이내이다. 실시양태에서, 제2 시점은 제1 시점으로부터 약 20일 미만 이내이다.
실시양태에서, 항원 결합 도메인은 제1 시점에 투여되고 T 림프구는 제2 시점에 투여되며, 여기서 제1 시점은 제2 시점에 선행한다. 실시양태에서, 제2 시점은 제1 시점으로부터 약 120, 90, 60, 50, 40, 30, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 10, 11, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1일 미만 이내이다. 실시양태에서, 제2 시점은 제1 시점으로부터 약 120일 미만 이내이다. 실시양태에서, 제2 시점은 제1 시점으로부터 약 90일 미만 이내이다. 실시양태에서, 제2 시점은 제1 시점으로부터 약 60일 미만 이내이다. 실시양태에서, 제2 시점은 제1 시점으로부터 약 50일 미만 이내이다. 실시양태에서, 제2 시점은 제1 시점으로부터 약 40일 미만 이내이다. 실시양태에서, 제2 시점은 제1 시점으로부터 약 30일 미만 이내이다. 실시양태에서, 제2 시점은 제1 시점으로부터 약 20일 미만 이내이다.
실시양태에서, T 림프구 및 항원 결합 도메인은 투여 전에 혼합된다. 실시양태에서, 방법은 (i) 투여 전에, 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인을 시험관내에서 항원 결합 도메인에 결합시켜 T 림프구-재조합 단백질 복합체를 형성하는 단계; 및 (ii) T 림프구-재조합 단백질 복합체를 대상체에게 투여하여 대상체에서 암을 치료하는 단계를 포함한다.
실시양태에서, T 림프구 및 항원 결합 도메인은 순차적으로 투여된다. 실시양태에서, T 림프구는 제1 시점에 투여되고 상기 항원 결합 도메인은 제2 시점에 투여되며, 여기서 제1 시점은 제2 시점에 선행한다. 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 제1 시점에 투여되고 상기 T 림프구는 제2 시점에 투여되며, 여기서 제1 시점은 제2 시점에 선행한다.
실시양태에서, 암은 난소암, 신장 세포 암종, B 세포 악성종양, 백혈병, 림프종, 유방암, 결장직장암, 전립선암, 신경모세포종, 흑색종, 속질모세포종, 폐암, 골육종, 아교모세포종 또는 신경아교종이다. 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 세툭시맙 메디토프-이용 가능한 도메인, 트라스투주맙 메디토프-이용 가능한 도메인, 페르투주맙 메디토프-이용 가능한 도메인, M5A 메디토프-이용 가능한 도메인 또는 리툭시맙 메디토프-이용 가능한 도메인이다.
본원에 사용된 용어 "암"은 백혈병, 림프종, 흑색종, 신경내분비 종양, 암종 및 육종을 포함하는 포유동물에서 발견되는 모든 유형의 암, 신생물 또는 악성 종양을 지칭한다. 본원에 제공된 화합물, 약제학적 조성물, 또는 방법으로 치료될 수 있는 예시적인 암은 림프종, 육종, 방광암, 골암, 뇌종양, 자궁경부암, 결장암, 식도암, 위암, 두경부암, 신장암, 골수종, 갑상선암, 백혈병, 전립선암, 유방암(예컨대, 삼중 음성, ER 양성, ER 음성, 화학요법 내성, 헤르셉틴 내성, HER2 양성, 디옥소루비신 내성, 타목시펜 내성, 관암종, 소엽 암종, 원발성, 전이성), 난소암, 췌장암, 간암(예컨대, 간세포 암종), 폐암(예컨대, 비소세포 폐암종, 편평 세포 폐암종, 선암종, 대세포 폐암종, 소세포 폐암종, 카르시노이드, 육종), 다형 아교모세포종, 신경아교종, 흑색종, 전립선암, 거세-내성 전립선암, 유방암, 삼중 음성 유방암, 아교모세포종, 난소암, 폐암, 편평 세포 암종(예컨대, 머리, 목, 또는 식도), 결장직장암, 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 림프종, B 세포 림프종, 또는 다발성 골수종. 추가의 예는 갑상선, 내분비계, 뇌, 가슴, 경부, 결장, 머리 & 목, 식도, 간, 신장, 폐, 비소세포 폐의 암, 흑색종, 중피종, 난소, 육종, 위, 자궁 또는 속질모세포종, 호지킨 질환, 비-호지킨 림프종, 다발성 골수종, 신경모세포종, 신경아교종, 다형 아교모세포종, 난소암, 횡문근육종, 원발성 혈소판증가증, 원발성 고분자글로불린혈증, 원발성 뇌종양, 암, 악성 췌장 인슐린종, 악성 카르시노이드, 비뇨기 방광암, 전암성 피부 병변, 고환암, 림프종, 갑상선암, 신경모세포종, 식도암, 비뇨생식관암, 악성 고칼슘혈증, 자궁내막암, 부신피질암, 내분비 또는 외분비 췌장의 신생물, 갑상선수질암, 갑상선수질암종, 흑색종, 결장직장암, 유두갑상선암, 간세포 암종, 유두의 파제트 질환, 엽상 종양, 소엽 암종, 관암종, 췌장 성상 세포의 암, 간 성상 세포의 암, 또는 전립선암을 포함한다.
용어 "백혈병"은 광범위하게는 혈액-형성 기관의 진행성 악성 질환을 지칭하며, 일반적으로 혈액 및 골수에서 백혈구 및 그들의 전구체의 기형적 증식 및 발달을 특징으로 한다. 백혈병은 일반적으로 (1) 질환-급성 또는 만성 질환의 지속기간 및 특징; (2) 관여된 세포의 종류, 골수성(골수형성), 림프성(림프형성) 또는 단핵구성; 및 (3) 혈액-백혈병 또는 무백혈병(서브백혈병성)의 이상세포 수의 증가 또는 비-증가에 기초하여 임상적으로 분류된다. 본원에 제공된 화합물, 약제학적 조성물, 또는 방법으로 치료될 수 있는 예시적인 백혈병은, 예컨대 급성 비림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 급성 과립구성 백혈병, 만성 과립구성 백혈병, 급성 전골수구성 백혈병, 성숙 T 세포 백혈병, 무백혈성 백혈병, 백혈구증가 백혈병, 호염기성 백혈병, 모세포 백혈병, 소 백혈병, 만성 골수구성 백혈병, 백혈병 cutis, 배아 백혈병, 호산구성 백혈병, 그로쓰(Gross) 백혈병, 유모세포 백혈병, 혈모구성 백혈병, 혈구모구성 백혈병, 조직구성 백혈병, 줄기 세포 백혈병, 급성 단핵구성 백혈병, 백혈구감소 백혈병, 림프 백혈병, 림프모구성 백혈병, 림프구성 백혈병, 림프형성 백혈병, 림프구성 백혈병, 림프육종 세포 백혈병, 비만 세포 백혈병, 거대핵세포성 백혈병, 마이크로골수모구성 백혈병, 단핵구성 백혈병, 골수모구성 백혈병, 골수구성 백혈병, 골수성 과립구성 백혈병, 골수단핵구성 백혈병, 네겔리 백혈병, 혈장 세포 백혈병, 다발성 골수종, 형질세포성 백혈병, 전골수구성 백혈병, 리이더 세포 백혈병, 실링백혈병, 줄기 세포 백혈병, 아백혈성 백혈병, 또는 미분화된 세포 백혈병을 포함한다.
용어 "육종"은 일반적으로 배아 결합 조직과 같은 물질로 조직되고 일반적으로 섬유상 또는 균질 물질에 매몰된 밀집된 세포로 구성된 종양을 지칭한다. 본원에 제공된 화합물, 약제학적 조성물, 또는 방법으로 치료될 수 있는 육종은 연골육종, 섬유육종, 림프육종, 흑색육종, 점액육종, 골육종, 아베메티(Abemethy's) 육종, 지방 육종, 지방육종, 포상연부 육종, 사기질모세포 육종, 포도 육종, 녹색종 육종, 육모막 암종, 배아 육종, 윌름즈 종양 육종, 자궁내막 육종, 기질 육종, 유잉 육종, 근막 육종, 섬유모세포 육종, 거대세포 육종, 과립구성 육종, 호지킨 육종, 특발 다발성 색소 출혈 육종, B 세포의 면역모세포 육종, 림프종, T 세포의 면역모세포 육종, 옌센 육종, 카포시 육종, 쿠퍼 세포 육종, 혈관육종, 백혈육종, 악성 중간엽종 육종, 골주위 육종, 망상구 육종, 로우즈 육종, 장액 낭종 육종, 윤활액 육종, 또는 혈관확장골육종을 포함한다.
용어 "흑색종"은 피부 및 다른 기관의 멜라닌 세포에서 발생하는 종양을 의미하는 것으로 여겨진다. 본원에 제공된 화합물, 약제학적 조성물, 또는 방법으로 치료될 수 있는 예시적인 흑색종은, 예컨대 말단 흑색점 흑색종, 멜라닌 결핍 흑색종, 양성 소아 흑색종, 클라우드만(Cloudman) 흑색종, S91 흑색종, 하딩-파쎄이(Harding-Passey) 흑색종, 소아 흑색종, 악성 흑색점 흑색종, 악성 흑색종, 결절 흑색종, 조갑하 흑색종, 또는 표면 확산흑색종을 포함한다.
용어 "암종"은 주변 조직에 침윤하여 전이를 일으키는 경향이 있는 상피 세포로 구성된 악성 신규 성장을 지칭한다. 본원에 제공된 화합물, 약제학적 조성물 또는 방법으로 치료될 수 있는 예시적인 암종은, 예컨대 갑상선속질 암종, 가족성 갑산선속질 암종, 선방 암종, 선방상 암종, 선낭성 암종, 선암종, 부신피질 암종, 페포 암종, 폐포 세포 암종, 기저 세포 암종(basal cell carcinoma), 기저 세포 암종(carcinoma basocellulare), 기저양 암종, 바닥편평 세포 암종, 기간지폐포 암종, 세기관지 암종, 기관지원성 암종, 대뇌모양 암종, 담관세포 암종, 융모막 암종, 콜로이드 암종, 면포 암종, 자궁체부암종, 체모상 암종, 갑옷 암종, 피부(cutaneum) 암종, 원주 암종, 원주 세포 암종, 관 암종(duct carcinoma), 관 암종(ductal carcinoma), 경성 암종, 배아 암종, 뇌모양 암종, 표피모양 암종, 상피 선양 암종, 엑스 울세레 암종(carcinoma ex ulcere), 섬유성 암종, 젤라틴모양 암종, 젤라틴성 암종, 거대 세포 암종(giant cell carcinoma), 거대 세포 암종(carcinoma gigantocellulare), 샘 암종, 과립층 세포 암종, 털기질 암종, 헤마토이드 암종, 간세포 암종, 휘르틀레 세포 암종, 유리질 암종, 부신모양 암종, 영아 배아 암종, 상피내 암종, 표피내 암종, 상피내 암종, 크롬페처 암종(Krompecher's carcinoma), 쿨키츠키-세포 암종(Kulchitzky-cell carcinoma), 큰 세포 암종(large-cell carcinoma), 수정체 암종(lenticular carcinoma), 수정체양 암종(carcinoma lenticulare), 지방종 암종, 소엽 암종, 림프상피 암종, 수질 암종(carcinoma medullare), 수질 암종(medullary carcinoma), 멜라닌 암종, 연성 암종, 점액 암종(mucinous carcinoma), 무시파룸 암종(carcinoma muciparum), 점액세포 암종(carcinoma mucocellulare), 점막표피양 암종, 점막 암종(carcinoma mucosum), 점액성 암종(mucous carcinoma), 점액종성 암종, 코인두암종, 귀리 세포 암종, 골화 암종, 유골 종양, 유두 암종, 문맥주위 암종, 침습전 암종, 가시 세포 암종, 수상 암종, 신장의 신장 세포 암종, 예비 세포 암종, 육종성 암종, 쉬나이더 암종(schneiderian carcinoma), 경성 암종, 음낭 암종(carcinoma scroti), 반지 세포 암종, 단순 암종, 소세포 암종, 솔라노이드 암종, 구형 암종, 방추 세포 암종, 해면 골종, 편평 암종, 편평 세포 암종, 선 암종(string carcinoma), 모세혈관 확장성 암종(carcinoma telangiectaticum), 모세혈관 확장성 암종(carcinoma telangiectodes), 이행 세포 암종, 결절성 암종(carcinoma tuberosum), 관 암종(tubular carcinoma), 결절성 암종(tuberous carcinoma), 사마귀모양 암종, 또는 빌로섬 암종(carcinoma villosum)을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "전이", "전이성" 및 "전이암"은 상호교환적으로 사용될 수 있고 하나의 기관 또는 다른 비-인접한 기관 또는 신체 부분으로부터의 증식 질환 또는 장애, 예컨대 암의 확산을 지칭한다. 암은 발생 부위, 예컨대 유방에서 발생하며, 이 부위는 원발성 종양, 예컨대 원발성 유방암으로 지칭된다. 원발성 종양 또는 발생 부위의 일부 암세포는 국소 부위에서 주변 정상 조직을 침투 및 침윤하는 능력 및/또는 시스템을 통해 체내의 다른 부위 및 조직으로 순환하는 림프계 또는 혈관계의 벽을 침투하는 능력을 획득한다. 원발성 종양의 암세포로부터 형성된 제2의 임상적으로 검출 가능한 종양은 전이 또는 2차 종양으로 지칭된다. 암세포가 전이될 때, 전이 종양 및 그의 세포는 원래 종양의 세포와 유사한 것으로 추정된다. 따라서, 폐암이 유방으로 전이되면, 유방 부위의 2차 종양은 비정상적인 폐 세포로 구성되며 비정상적인 유방 세포로 구성되지 않는다. 유방의 2차 종양은 전이 폐암으로 지칭된다. 따라서, 전이암의 어구는 대상체가 원발성 종양을 갖거나 가졌었고 하나 이상의 2차 종양을 갖는 질환을 지칭한다. 전이성이 아닌 암을 갖는 대상체의 비-전이암의 어구는 대상체가 원발성 종양은 갖지만 하나 이상의 2차 종양을 갖지 않는 질환을 지칭한다. 예컨대, 전이 폐암은 원발성 폐 종양의 병력을 갖고 제2 위치 또는 다수의 위치, 예컨대 유방에서 하나 이상의 2차 종양을 갖는 대상체의 질환을 지칭한다.
"항암제"는 그의 명백한 일반적인 의미에 따라 사용되며, 항신생물 특성 또는 세포의 성장 또는 증식을 억제하는 능력을 갖는 조성물(예컨대, 화합물, 약물, 길항제, 억제제, 조정제)을 지칭한다. 실시양태에서, 항암제는 화학요법제이다. 실시양태에서, 항암제는 암 치료 방법에서 유용성을 갖는 본원에서 확인된 작용제이다. 실시양태에서, 항암제는 암 치료를 위해 FDA 또는 미국 이외의 국가의 유사한 규제 기관에 의해 승인된 작용제이다.
질환(예컨대, 암(예컨대, 전립선암, 신장암, 전이암, 흑색종, 거세-내성 전립선암, 유방암, 삼중 음성 유방암, 아교모세포종, 난소암, 폐암, 편평 세포 암종(예컨대, 머리, 목, 또는 식도), 결장직장암, 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 림프종, B 세포 림프종, 또는 다발성 골수종))과 연관된 물질 또는 물질 활성 또는 기능과 관련하여 용어 "연관된" 또는 "와 연관된"은, 질환(예컨대, 폐암, 난소암, 골육종, 방광암, 자궁경부암, 간암, 신장암, 피부암(예컨대, 메르켈 세포 암종), 고환암, 백혈병, 림프종, 두경부암, 결장직장암, 전립선암, 췌장암, 흑색종, 유방암, 신경모세포종) 또는 질환의 증상이 (전부 또는 부분적으로) 물질 또는 물질 활성 또는 기능에 의해 유발된다는 것을 의미한다.
"화학요법제(chemotherapeutic)" 또는 "화학요법제(chemotherapeutic agent)"는 그의 명백한 일반적인 의미에 따라 사용되며, 항신생물 특성 또는 세포의 성장 또는 증식을 억제하는 능력을 갖는 화학적 조성물 또는 화합물을 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "이상(aberrant)"은 정상과 다른 것을 지칭한다. 효소 활성을 설명하는 데 사용되는 경우, 이상은 정상 대조군 또는 정상 비-질환 대조군 샘플의 평균보다 크거나 작은 활성을 지칭한다. 이상 활성은 질환을 초래하는 활성의 양을 지칭할 수 있으며, 여기서 (예컨대, 본원에 기재된 방법을 이용하여) 이상 활성을 정상 또는 비-질환 연관된 양으로 되돌리면 질환 또는 하나 이상의 질환 증상이 감소된다.
실시예
CAR T 세포는 액체 종양을 치료하는 데 현저한 성공을 나타내었으며 고형 종양 및 다른 질환을 치료하기 위해 급속히 확장되고 있다. 현재의 접근법은 단일 항원을 표적화하는 CAR T 세포를 생성하는 것이다. 특정 항원을 발현하는 종양 세포를 제거하는 데는 효과적이지만, 항원을 발현하지 않는 종양 세포는 모면하게 되고 증식할 수 있으며, 종종 더욱 공격적이게 된다. 따라서, 이들 세포를 표적화하기 위해, 상이한 종양 표적화 scFv를 발현하는 완전히 새로운 CAR T 세포가 생성될 필요가 있다. 여기서, 출원인은 메디토프 기술을 이용하여 이 문제를 해결한다. 구체적으로, 출원인은 종양 표적화 scFv를 초고도의 친화도 메디토프(비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인)로 대체한다. 종양 특이성은 항원 특이적이고 메디토프-이용 가능한 Fab 또는 mAb(항원 결합 도메인)를 사용하여 후속적으로 추가된다.
출원인은 메디토프 상호작용을 이용하여 보편적인 CAR T 세포를 생성한다. 구체적으로, 출원인은 항원 표적화 영역을 메디토프(비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인)로 대체하였으며, 메디토프-이용 가능한 Fab/mAb를 추가할 수 있고, Fab에 특이적인 항원에 결합할 수 있음을 입증하였다. 본원의 이점은 출원인이 메디토프-제타 쇄 T 세포를 만들고 질환에 특이적이거나 다수의 항원을 커버할 메디토프-이용 가능한 Fab를 바꿔 넣을 수 있다는 것이다.
CAR T 세포 분야는 빠르게 발전하고 있으며 임상 결과가 이용 가능해짐에 따라 CAR T 세포의 특이성을 변경시킬 필요성이 입증되었다. 출원인은 보편적인 CAR T 세포 플랫폼을 제공하며, 여기서 출원인은 CAR T 세포 내의 scFv를 메디토프(예컨대, 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인)로 대체하고 메디토프-이용 가능한 mAb/Fab(항원 결합 도메인)를 사용하여 항원 특이성을 추가한다. 이 플랫폼 기술을 통해 출원인은 개별 CAR T 세포를 생성하고 최적화하지 않고도 표적 특이성을 빠르고 효율적으로 변경할 수 있다. 출원인은 2개의 상이한 메디토프-이용 가능한 mAb를 사용하여 FACs를 통해 개념 증명을 보여준다. 출원인은 링커 설계 및 도킹을 최적화할 수 있고 제자리에서 메디토프-CAR의 항원 특이성을 변경함으로써 동물 모델에서의 효능을 입증할 것이다.
메디토프를 발현하는 단일 T 세포는 종양 내의 상이한 항원/에피토프를 표적화하는 Fabs/Mab와 혼합 및 매칭될 수 있으며, 잠재적으로 다수 형태의 암에 적용될 수 있는 우수한 생성물을 생성할 수 있다. Fab/mAb는 일반적으로 scFv보다 더 안정적이고, 일반적으로 scFv보다 항원에 대한 친화력이 더 높으며, 항원 상의 상이한 에피토프에 결합하는 Fab 패널이 용이하게 생성되어 신속한 최적화를 가능하게 한다(예컨대, 본 분야의 현재 문제는 수용체 에피토프와 종양 막 사이의 거리가 효능에 어떻게 영향을 미치는가 하는 것이다).
출원인은 렌티바이러스에 메디토프를 패킹하여 FabRack(본원에 제공된 재조합 단백질)를 생성하고 시험관내 및 생체내에서 종양 근절을 특성화할 수 있다. 출원인은 제자리에서 특이성을 변경하고 특성화할 수 있다. 출원인은 링커(예컨대, 리무버 CH3 도메인)를 변경하여 1가 FabRack를 생성하고, 특이성을 생성, 특성화 및 변경할 수 있다.
기존의 CAR 및 메디토프 CAR: 기본 개념. scFv 변이체는 클리닉에서 사용된다. '가장 단순한' FabRack은 메디토프-이용 가능한 IgG 또는 Fab 단편에 결합된다. 주목할 것은 이는 IgG 또는 Fab에 제한되지 않으며, 우리는 이중-특이적 IgG 또는 바이오닉스 또는 단일 아암 fab를 만들 수 있다. 기본적으로, 우리가 Fab에 융합할 수 있는 것은 무엇이든 메디토프-이용 가능하였다.
Fabrack-T 세포는 메디토프-이용 가능한 IgG에 의해 매개 시 종양 세포에 결합될 수 있다. 생산적인 상호작용으로 이어질 수 있는 다수의 조합/상호작용이 있다. 하나의 Fab 아암은 Fabrack T 세포에 결합하고 다른 아암은 종양 세포에 결합한다. 동일한 Fab 아암이 FABrack T 세포 및 종양 항원에 결합한다. Fab 아암 둘 다 종양에 결합하고 하나 또는 다른 Fab 아암이 Fabrack T 세포에 결합한다. Fab 아암 둘 다 Fabrack T 세포 및 종양에 결합한다. 기타 등.
메디토프 CAR 구축물은 렌티바이러스 벡터에 패키징될 수 있다. 세포외 도메인은 메디토프(비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인), 링커(펩티드 링커) 및 IgG의 CH3 도메인(스페이서 영역)을 포함하고 CD28 막횡단 도메인(CD28tm), CD28 공동자극 도메인(CD28) 및 CD3ζ 세포용해 도메인(본원에서 세포내 T 세포 신호전달 도메인으로도 지칭됨)(CD3ζ)이 뒤따른다. CD3ζ 및 CD19t는 T2A 서열에 의해 분리된다. memAb(메디토프-이용 가능한 모노클로날 항체)는 표적 세포 및 NFAT 반응성 루시페라제를 보유하는 FabRack 발현 저캇 세포에 결합될 수 있다. 이는 T 세포로 이동하기 전에 개념을 시험하기 위한 간단한 정보이다.
memAb(메디토프-이용 가능한 모노클로날 항체; 항원 결합 도메인)가 FabRack 세포(본원에 제공된 재조합 단백질을 발현하는 T 세포)에 사전 결합될 수 있거나 memAb(항원 결합 도메인)가 표적 세포(예컨대, 암세포)에 사전 결합될 수 있다. 표적 세포 상의 항원 발현 수준은 T 세포의 활성화에 영향을 미친다. T 세포 활성화는, 암세포 상의 항원 발현은 낮은 경우, memAb 사전 결합을 갖는 T 세포 및 memAb 사전 결합을 갖는 암세포가 유사하였다. 암세포가 memAb와 사전 결합되고 암 상의 항원 발현이 높은 경우, 가장 높은 T 세포 활성화가 달성될 수 있다. 마찬가지로, 암 상의 높은 항원 발현 수준에서, T 세포가 memAb(메디토프-이용 가능한 모노클로날 항체, 항원 결합 도메인)에 사전 결합되는 경우, T 세포의 활성화가 높다. 도 19를 참조한다.
재료 및 방법
클로닝. 부모의 항-Her2 scFv_IgG4op(HL-CH3)_CD28gg_op-Zeta_op-T2A-CD19t_epHIV7 벡터는 씨. 브라운 박사(Dr. C. Brown)에 의해 친절하게 제공되었다. GM-CSFr secretion signal_meditope_PASlinker17 유전자 카세트를 DNA2.0에 의해 합성하고 NheI 및 SbfI 제한 부위를 사용하여 IgG4op(HL-CH3) 도메인(각각 메디토프-CH3 및 메디토프-CD28)과 함께 또는 없이 CAR 벡터에 삽입하였다. 클로닝된 플라스미드를 막시프렙(MaxiPrep) 키트(Qiagen)를 사용하여 정제하였다.
가용성 단백질의 형광단 표지화. 알렉사 플루오르 염료(ThermoFisher)를 제조사의 프로토콜에 따라 아민 접합을 이용하여 가용성 단백질에 부착하였다. 간략하게, 알렉사 플루오르 647 NHS 에스테르 염료를 트라스투주맙 I83E IgG 및 Fab 및 이필리무맙 IgG에 접합시켰다. A280 및 Amax를 이용하여 분자당 1≤ DOL ≤ 3 염료인 표지도(DOL)를 계산하였다. 퍼시픽 블루 NHS 에스테르 염료를 sHer2에 접합시켰다. 단백질 상호작용은 결합 활성을 평가하기 위해 FACS 검정 전에 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 특성화되었다.
형질감염. 제0일에, 계대 9에서의 CHO-S 세포(Invitrogen)를 벡터 없이(Mock) 또는 부모 CAR, 메디토프-CH3 또는 메디토프-CD28 벡터로 형질감염시켰다. 제조사의 프로토콜에 따라 프리스타일 MAX 형질감염 키트(ThermoFisher)를 사용하여 세포를 형질감염시켰다.
유동 세포측정. 제5일에, 세포를 수거하고 계수하였다. 3E6 세포를 5 mL FACS 튜브(VWR)에 첨가하고 QS를 FACS 염색 용액(행크스 평형 염 용액 중 2% FCS, 0.5% NaN3, 배치 #05092016)과 함께 1E6 세포/mL에 첨가하였다. 0.1E6 세포를 조건 당 3개의 웰로 V-바닥 96-웰 플레이트(Corning Costar)의 각각의 웰에 첨가하였다. 세포를 100 μL 염색 용액으로 2회 세척하고, 4℃에서 3분 동안 300 g로 회전시키고, 상청액을 따라내었다. 세포를 빛으로부터 보호된 4℃에서 30분 동안 100 μL 1차 염색 용액(1:100으로 희석된 PE-Cy7^CD-19 및 100 nM 647^IgG, 100 nM 647^Ipi 또는 200 nM 647^Fab)에 재현탁시켰다. 세포를 100 μL 염색 용액으로 2회 세척하고, 빛으로부터 보호된 4℃에서 30분 동안 2차 염색 용액(200 nM PacBlue^Her2)에 재현탁시켰다. 세포를 100 μL 염색 용액으로 2회 세척하고 150 μL PI 용액(염색 용액에 1:100으로 희석된 PI)에 재현탁시켰다. 세포 샘플을 샘플 당 40 μL를 사용하여 MACSQuant 기기(#2, West side of Brown lab)를 사용하여 분석하였다. 하기와 같은 전압: FSC = 358V, SSC = 520V. 분석 채널: PE(PI), PE-Cy7(CD19), APC(647) 및 VioBlue(Her2). 게이팅 전략:
FSC/SSC → PE-→ PE-Cy7+ → APC+ → VioBlue+
FSC/SSC → PI- → CD19+ → 647+ → Her2+
동물 계획. 각각의 그룹은 4마리의 마우스를 갖는다.
1. 종양 단독: OVCAR3-luc 또는 SKOV3-luc가 우수하다.
2. HER-2 CAR T 세포를 갖는 종양: Fab CAR 또는 scFv CAR T 세포가 우수하다. 각각의 마우스에서 1E7 양성 세포.
3. mock T 세포를 갖는 종양: 각각의 마우스에서 1E7 mock T 세포.
4. 메디토프-CAR T 세포를 갖는 종양: 각각의 마우스에서 1E7 양성 CAR T 세포.
5. 사전 혼합된 mock T 세포 + HER2 항체를 갖는 종양: 각각의 마우스에서 1E7 mock T 세포. T 세포 주사 1일 전에 HER2 항체 ip 4mg/kg. T 세포는 100 nM 항체와 사전 혼합되고 세척된다. 항체는 2주 동안 주당 2회 ip 4mg/kg 제공된다.
6. 사전 혼합된 메디토프-CAR T 세포 + HER2 항체를 갖는 종양: 각각의 마우스에서 1E7 CAR T 세포. T 세포 주사 1일 전에 HER2 항체 ip 4mg/kg. T 세포는 100 nM 항체와 사전 혼합되고 세척된다. 항체는 2주 동안 주당 2회 ip 4mg/kg 제공된다.
7. 사전 혼합 없이 메디토프-CAR T 세포 + HER2 항체를 갖는 종양: 각각의 마우스에서 1E7 CAR T 세포. T 세포 주사 1일 전에 HER2 항체 ip 4mg/kg. T 세포는 항체와 사전 혼합되지 않는다. 항체는 2주 동안 주당 2회 ip 4mg/kg 제공된다.
Figure pct00001
FabRack 동물 데이터
방법(OVCAR3)
제1일에 5,000,0000개의 OVCAR3-gfp-luc 세포를 마우스에 복강내(ip) 주사하였다. Fabrack T 세포(그룹 6 및 7)로 처리된 마우스에서, 마우스에게 3일마다 4mg/kg memAb 트라스투주맙(총 5회 용량)을 제공하였으며, Ab의 제1 용량은 제8일에 제공하였다. 제9일에 10,0000,0000개의 인간 T 세포를 마우스에 ip 주사하였다. 그룹 6에서, Fabrack T 세포를 memAb와 사전 혼합하고 세척하였다. 150 μl의 루시페린(28.57 mg/ml)을 마우스에 ip 주사한 후 마우스의 종양 부담을 발광에 의해 측정하였다. (그룹 1: 종양 단독; 그룹 2: mock T 세포; 그룹 3: Fabrack T 세포 단독; 그룹 4: mock T 세포 + Ab; 그룹 5: HER2 scFv CAR; 그룹 6: Fabrack T 세포(사전 혼합) + Ab; 그룹 7: Fabrack T 세포 + Ab)
결과(OVCAR3)
마우스는 Fabrack T 세포 및 memAb(그룹 6 및 7)가 제공되는 경우 Fabrack T 세포가 memAb와 사전 혼합되었는지의 여부와 무관하게 종양 크기의 실질적인 감소를 나타낸다. 그러나, 종양은 14일경에 재발하였다. 종양의 재발은, 마우스 복부액에서 HER2+ 종양 세포를 나타내는 유동 세포측정 결과에 기초 시, HER2 항원 손실에 기인하지 않았다. 마우스의 혈액 및 복부액에는 Fabrack T 세포가 거의 남아있지 않기 때문에 종양의 재발은 T 세포의 비-지속성으로 인한 것일 수 있다. 종양 근절을 최적화하기 위한 투약 일정이 진행 중이다.
방법(MCF7)
제1일에 5,000,0000개의 MCF7-gfp-luc 세포를 마우스에 복강내(ip) 주사하였다. Fabrack 그룹에서, 마우스에게 약 4일마다 4mg/kg memAb 트라스투주맙을 제공하였으며, Ab의 제1 용량을 T 세포를 함께 ip 주사하였다. 제8일에 2,000,000개의 인간 T 세포의 제1 용량을 마우스에 ip 주사하였다. 약 6일마다 2,000,000개의 Fabrack T 세포를 추가로 제공하였다. 150 μl의 루시페린(28.57mg/ml)을 마우스에 ip 주사한 후 마우스의 종양 부담을 발광에 의해 측정하였다.
결과(MCF7)
종양 크기의 감소는 d11 및 d14에서 Fabrack T 세포 및 memAb가 제공된 마우스에서 나타났다. 그러나, 제16일에 종양 재발이 나타났다. 제22일에 마우스 혈액의 분석은 Fabrack T 세포가 존재하고 memAb가 Fabrack T 세포에 결합되어 있음을 나타내었다. 제45일에 마우스 복부액의 분석은 종양 세포의 항원 이탈을 나타내지 않았다. 종양의 재발은 Ab로부터의 후크 효과에 기인할 수 있고, 그의 용량은 종양 및 T 세포 상의 Ab-결합 부위를 포화시킬 수 있다. Fabrack T 세포의 용량은, OVCAR3 연구에서의 10,000,000에 비교하여, MVC7 이종이식 연구에서 2,000,000이었으므로, Ab 결합에 대해 Fabrack T 세포가 더 적었다. 또한, MCF7 및 OVCAR3은 HER2 발현이 낮기 때문에 HER2는 Ab에 의해 쉽게 포화된다. 종양 근절을 최적화하기 위한 투약 일정이 진행 중이다.
Figure pct00002
Figure pct00003
P 실시양태
실시양태 P1. 하기를 포함하는 제1 재조합 단백질: (i) 제1 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인; (ii) 제1 세포내 T 세포 신호전달 도메인; 및 (iii) 상기 제1 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인을 상기 제1 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 연결하는 제1 막횡단 도메인.
실시양태 P2. 실시양태 P1에 있어서, 상기 제1 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인을 상기 제1 막횡단 도메인에 연결하는 제1 스페이서 영역을 추가로 포함하는 것인 제1 재조합 단백질.
실시양태 P3. 실시양태 P2에 있어서, 상기 제1 스페이서 영역이 제1 CH3 영역인 제1 재조합 단백질.
실시양태 P4. 실시양태 P3에 있어서, 상기 제1 재조합 단백질이 제2 재조합 단백질에 비공유적으로 결합되고, 상기 제2 재조합 단백질이 (i) 제2 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인; (ii) 제2 세포내 T 세포 신호전달 도메인; (iii) 상기 제2 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인을 상기 제2 세포내 T 세포 신호전달 도메인에 연결하는 제2 막횡단 도메인; 및 (iv) 제2 스페이서 영역을 포함하고, 여기서 상기 제2 스페이서 영역은 상기 제2 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인을 상기 제2 막횡단 도메인에 연결하고, 여기서 상기 제2 스페이서 영역은 제2 CH3 영역을 포함하고, 여기서 상기 제1 CH3 영역은 상기 제2 CH3 영역에 결합되는 것인 제1 재조합 단백질.
실시양태 P5. 실시양태 P1 내지 P5 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인 및 상기 제2 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인이 화학적으로 상이한 것인 제1 재조합 단백질.
실시양태 P6. 실시양태 P1 내지 P5 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인 및 상기 제2 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인이 화학적으로 동일한 것인 제1 재조합 단백질.
실시양태 P7. 실시양태 P1 내지 P6 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 및 상기 제2 세포내 T 세포 신호전달 도메인이 독립적으로 CD3ζ T 세포 신호전달 도메인인 제1 재조합 단백질.
실시양태 P8. 실시양태 P1 내지 P7 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인이 제1 항원 결합 도메인에 비공유적으로 결합되는 것인 제1 재조합 단백질.
실시양태 P9. 실시양태 P1 내지 P8 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인이 제2 항원 결합 도메인에 비공유적으로 결합되는 것인 제1 재조합 단백질.
실시양태 P10. 실시양태 1 내지 3 중 어느 하나의 제1 재조합 단백질을 코딩하는 단리된 핵산.
실시양태 P11. 실시양태 P10의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
실시양태 P12. 실시양태 P11에 있어서, 상기 바이러스가 렌티바이러스 또는 온코-레트로바이러스인 발현 벡터.
실시양태 P13. 실시양태 P11 또는 P12의 발현 벡터를 포함하는 T 림프구.
실시양태 P14. 실시양태 P1 내지 P9 중 어느 하나의 제1 재조합 단백질을 포함하는 T 림프구.
실시양태 P15. 실시양태 P1 내지 P9 중 어느 하나의 제1 재조합 단백질을 포함하고, 여기서 상기 막횡단 도메인은 상기 T 림프구의 세포막 내에 있는 것인 T 림프구.
실시양태 P16. 유효량의 실시양태 P15의 T 림프구를 암의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 제1 항원 결합 도메인 및 상기 제2 항원 결합 도메인이 독립적으로 항암 항원 결합 도메인인 것인, 암을 치료하는 방법.
실시양태
실시양태 1. 하기를 포함하는 재조합 단백질: (i) 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인; (ii) 세포내 T 세포 신호전달 도메인; 및 (iii) 상기 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인을 상기 세포내 T 세포 신호전달 도메인에 연결하는 막횡단 도메인.
실시양태 2. 실시양태 1에 있어서, 상기 세포내 T 세포 신호전달 도메인이 CD3ζ 세포내 T 세포 신호전달 도메인인 재조합 단백질.
실시양태 3. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 상기 막횡단 도메인이 CD8α 막횡단 도메인, CD28 막횡단 도메인, CD4 막횡단 도메인 또는 CD3-제타 막횡단 도메인인 재조합 단백질.
실시양태 4. 실시양태 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 상기 막횡단 도메인이 CD28 막횡단 도메인인 재조합 단백질.
실시양태 5. 실시양태 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 상기 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인을 상기 막횡단 도메인에 연결하는 스페이서 영역을 추가로 포함하는 것인 재조합 단백질.
실시양태 6. 실시양태 5에 있어서, 상기 스페이서 영역이 불변 중쇄 3(CH3) 도메인인 재조합 단백질.
실시양태 7. 실시양태 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 상기 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인을 상기 스페이서 영역에 연결하는 펩티드 링커를 추가로 포함하는 것인 재조합 단백질.
실시양태 8. 실시양태 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 상기 막횡단 도메인을 상기 세포내 T 세포 신호전달 도메인에 연결하는 세포내 공동 자극 신호전달 도메인을 추가로 포함하는 것인 재조합 단백질.
실시양태 9. 실시양태 8에 있어서, 상기 세포내 공동 자극 신호전달 도메인이 CD28 세포내 공동 자극 신호전달 도메인, 4-1BB 세포내 공동 자극 신호전달 도메인, ICOS 세포내 공동 자극 신호전달 도메인, 또는 OX-40 세포내 공동 자극 신호전달 도메인인 재조합 단백질.
실시양태 10. 실시양태 8 또는 9에 있어서, 상기 세포내 공동 자극 신호전달 도메인이 CD28 세포내 공동 자극 신호전달 도메인인 재조합 단백질.
실시양태 11. 실시양태 8 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포내 공동 자극 신호전달 도메인이 4-1BB 세포내 공동 자극 신호전달 도메인인 재조합 단백질.
실시양태 12. 실시양태 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포내 T 세포 신호전달 도메인의 C-말단에 결합된 검출 가능한 도메인을 추가로 포함하는 것인 재조합 단백질.
실시양태 13. 실시양태 12에 있어서, 상기 검출 가능한 도메인이 말단절단된 CD19 단백질인 재조합 단백질.
실시양태 14. 실시양태 1 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 상기 검출 가능한 도메인에 연결하는 자기-절단 펩티딜 서열을 추가로 포함하는 것인 재조합 단백질.
실시양태 15. 실시양태 14에 있어서, 상기 자기-절단 펩티딜 링커 서열이 T2A 서열 또는 2A 서열인 재조합 단백질.
실시양태 16. 실시양태 1 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 단백질이 세포의 일부를 형성하는 것인 재조합 단백질.
실시양태 17. 실시양태 1 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 단백질이 T 세포의 일부를 형성하는 것인 재조합 단백질.
실시양태 18. 실시양태 1 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 상기 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인이 항원 결합 도메인에 결합되는 것인 재조합 단백질.
실시양태 19. 실시양태 18에 있어서, 상기 항원 결합 도메인이 Fab, IgG, 또는 이중특이적 항체인 재조합 단백질.
실시양태 20. 실시양태 18 또는 19에 있어서, 상기 항원 결합 도메인이 세툭시맙 메디토프-이용 가능한 도메인, 트라스투주맙 메디토프-이용 가능한 도메인, 페르투주맙 메디토프-이용 가능한 도메인, M5A 메디토프-이용 가능한 도메인 또는 리툭시맙 메디토프-이용 가능한 도메인인 재조합 단백질.
실시양태 21. 실시양태 18 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 상기 항원 결합 도메인이 암 항원에 결합할 수 있는 것인 재조합 단백질.
실시양태 22. 실시양태 18 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 상기 항원 결합 도메인이 암 항원에 결합할 수 있는 것인 재조합 단백질.
실시양태 23. 실시양태 21 또는 22에 있어서, 상기 암 항원이 Her2, EGFR, CD19 또는 CD20인 재조합 단백질.
실시양태 24. 실시양태 21 또는 22에 있어서, 상기 암 항원이 세포의 일부를 형성하는 것인 재조합 단백질.
실시양태 25. 실시양태 24에 있어서, 세포가 암세포인 단백질.
실시양태 26. 실시양태 25에 있어서, 상기 암이 난소암, 신장 세포 암종, B 세포 악성종양, 백혈병, 림프종, 유방암, 결장직장암, 전립선암, 신경모세포종, 흑색종, 속질모세포종, 폐암, 골육종, 아교모세포종 또는 신경아교종인 재조합 단백질.
실시양태 27. 실시양태 1 내지 26 중 어느 하나의 재조합 단백질을 코딩하는 단리된 핵산.
실시양태 28. 실시양태 27의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
실시양태 29. 실시양태 28에 있어서, 상기 바이러스가 렌티바이러스 또는 온코-레트로바이러스인 발현 벡터.
실시양태 30. 실시양태 28 또는 29의 발현 벡터를 포함하는 T 림프구.
실시양태 31. 실시양태 1 내지 26 중 어느 하나의 재조합 단백질을 포함하는 T 림프구.
실시양태 32. 실시양태 1 내지 26 중 어느 하나의 재조합 단백질을 포함하는 T 림프구로서, 여기서 상기 막횡단 도메인은 상기 T 림프구의 세포막 내에 있는 것인 T 림프구.
실시양태 33. 실시양태 30 내지 32 중 어느 하나에 있어서, 상기 T 림프구가 자가 T 림프구인 T 림프구.
실시양태 34. 실시양태 30 내지 32 중 어느 하나에 있어서, 상기 T 림프구가 이종 T 림프구인 림프구.
실시양태 35. 실시양태 30 내지 34 중 어느 하나에 있어서, 상기 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인이 항원 결합 도메인에 결합하는 것인 T 림프구.
실시양태 36. 실시양태 35에 있어서, 상기 항원 결합 도메인이 Fab, IgG, 또는 이중특이적 항체인 T 림프구.
실시양태 37. 실시양태 35 또는 36에 있어서, 상기 항원 결합 도메인이 암 항원에 결합하는 것인 T 림프구.
실시양태 38. 실시양태 37에 있어서, 상기 암 항원인 Her2, EGFR, CD19 또는 CD20인 T 림프구.
실시양태 39. 실시양태 35 내지 38 중 어느 하나에 있어서, 상기 항원 결합 도메인이 암 항원 결합 도메인인 T 림프구.
실시양태 40. 실시양태 35 내지 39 중 어느 하나에 있어서, 상기 항원 결합 도메인이 세툭시맙 메디토프-이용 가능한 도메인, 트라스투주맙 메디토프-이용 가능한 도메인, 페르투주맙 메디토프-이용 가능한 도메인, M5A 메디토프-이용 가능한 도메인 또는 리툭시맙 메디토프-이용 가능한 도메인인 T 림프구.
실시양태 41. 유효량의 실시양태 30 내지 34 중 어느 하나의 T 림프구 및 상기 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인에 결합할 수 있는 항원 결합 도메인을 암 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 항원 결합 도메인은 암 항원 결합 도메인인, 암을 치료하는 방법.
실시양태 42. 실시양태 41에 있어서, 상기 T 림프구 및 상기 항원 결합 도메인이 동시에 또는 순차적으로 투여되는 것인 방법.
실시양태 43. 실시양태 41 또는 42에 있어서, 상기 T 림프구가 제1 시점에 투여되고 상기 항원 결합 도메인이 제2 시점에 투여되며, 여기서 제1 시점이 제2 시점에 선행하는 것인 방법.
실시양태 44. 실시양태 41 또는 42에 있어서, 상기 항원 결합 도메인이 제1 시점에 투여되고 상기 T 림프구가 제2 시점에 투여되며, 여기서 제1 시점이 제2 시점에 선행하는 것인 방법.
실시양태 45. 실시양태 41에 있어서, 상기 방법이 (i) 상기 투여 전에, 상기 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인을 시험관내에서 상기 항원 결합 도메인에 결합시켜 T 림프구-재조합 단백질 복합체를 형성하는 단계; 및 (ii) 상기 T 림프구-재조합 단백질 복합체를 상기 대상체에게 투여하여 상기 대상체에서 암을 치료하는 단계를 포함하는 것인 방법.
실시양태 46. 실시양태 41 내지 45 중 어느 하나에 있어서, 상기 암이 난소암, 신장 세포 암종, B 세포 악성종양, 백혈병, 림프종, 유방암, 결장직장암, 전립선암, 신경모세포종, 흑색종, 속질모세포종, 폐암, 골육종, 아교모세포종 또는 신경아교종인 방법.
실시양태 47. 실시양태 41 내지 46 중 어느 하나에 있어서, 상기 항원 결합 도메인이 세툭시맙 메디토프-이용 가능한 도메인, 트라스투주맙 메디토프-이용 가능한 도메인, 페르투주맙 메디토프-이용 가능한 도메인, M5A 메디토프-이용 가능한 도메인 또는 리툭시맙 메디토프-이용 가능한 도메인인 방법.
실시양태 48. 실시양태 1 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 단백질이 제1 재조합 단백질이고, 상기 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인이 제1 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인이고, 상기 세포내 T 세포 신호전달 도메인이 제1 세포내 T 세포 신호전달 도메인이고, 상기 막횡단 도메인이 제1 막횡단 도메인이고, 상기 스페이서 영역이 제1 스페이서 영역이고, 상기 세포내 공동 자극 신호전달 도메인이 제1 세포내 공동 자극 신호전달 도메인인 재조합 단백질.
실시양태 49. 실시양태 48에 있어서, 상기 제1 재조합 단백질이 제2 재조합 단백질에 비공유적으로 결합되고, 상기 제2 재조합 단백질이 (i) 제2 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인; (ii) 제2 세포내 T 세포 신호전달 도메인; (iii) 상기 제2 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인을 상기 제2 세포내 T 세포 신호전달 도메인에 연결하는 제2 막횡단 도메인; 및 (iv) 제2 스페이서 영역을 포함하고, 여기서 상기 제2 스페이서 영역은 상기 제2 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인을 상기 제2 막횡단 도메인에 연결하고, 여기서 상기 제1 스페이서 영역은 상기 제2 스페이서 영역에 비공유적으로 결합되는 것인 재조합 단백질.
실시양태 50. 실시양태 49에 있어서, 상기 제1 스페이서 영역 및 상기 제2 스페이서 영역이 제1 불변 중쇄 3(CH3) 도메인 및 제2 불변 중쇄 3(CH3) 도메인인 재조합 단백질.
실시양태 51. 실시양태 48 내지 50 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인 및 상기 제2 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인이 화학적으로 상이한 것인 재조합 단백질.
실시양태 52. 실시양태 48 내지 50 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인 및 상기 제2 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인이 화학적으로 동일한 것인 재조합 단백질.
실시양태 53. 실시양태 48 내지 52 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인이 제1 항원 결합 도메인에 비공유적으로 결합되는 것인 재조합 단백질.
실시양태 54. 실시양태 49 내지 53 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인이 제2 항원 결합 도메인에 비공유적으로 결합되는 것인 재조합 단백질.
실시양태 55. 실시양태 53 또는 54에 있어서, 상기 제1 항원 결합 도메인 및 상기 제2 항원 결합 도메인이 화학적으로 상이하거나 동일한 것인 재조합 단백질.
실시양태 56. 실시양태 53 내지 55 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 항원 결합 도메인 및 상기 제2 항원 결합 도메인이 독립적으로 세툭시맙 메디토프-이용 가능한 도메인, 트라스투주맙 메디토프-이용 가능한 도메인, 페르투주맙 메디토프-이용 가능한 도메인, M5A 메디토프-이용 가능한 도메인 또는 리툭시맙 메디토프-이용 가능한 도메인인 재조합 단백질.
비형식인 서열 목록
CD3z; GI:623041(서열번호 1)
Figure pct00004
CD28; GI:340545506(서열번호 2)
Figure pct00005
CD4; GI:179143(서열번호 3)
Figure pct00006
CD8; GI:225007534(서열번호 4)
Figure pct00007
CD8; GI:225007534(서열번호 5)
Figure pct00008
CD8; GI:225007534(서열번호 6)
Figure pct00009
41BB; GI:315259099(서열번호 7)
Figure pct00010
OX40; GI:315360637(서열번호 8)
Figure pct00011
ICOS; GI:251823951(서열번호 9)
Figure pct00012
CD62L; GI:262206314(서열번호 10)
Figure pct00013
CD3ζ; GI:623041; 서열번호 11:
Figure pct00014
CD28; GI:340545506; 서열번호 12:
Figure pct00015
CD28gg*; GI:340545506; 서열번호 13:
Figure pct00016
41BB; GI:315259099; 서열번호 14:
Figure pct00017
OX40; GI:315360637; 서열번호 15:
Figure pct00018
ICOS; GI:251823951; 서열번호 16:
Figure pct00019
스페이서(IgG4-CH3 포함) 서열번호 17:
Figure pct00020
CD28 막횡단 서열번호 18:
Figure pct00021
CD28cyto(LLmGG) 서열번호 19:
Figure pct00022
세포내 T 세포 신호전달 도메인(CD3-제타) 서열번호 20:
Figure pct00023
자기-절단 펩티딜 링커(T2A) 서열번호 21:
Figure pct00024
마커 펩티드(CD19t) 서열번호 22:
Figure pct00025
자기-절단 펩티딜 링커(2A) 서열번호 23:
Figure pct00026
스페이서 영역 서열번호 24
Figure pct00027
펩티드 링커 서열번호 25
Figure pct00028
서열번호 26
Figure pct00029
자기-절단 펩티딜 링커 서열번호 27
Figure pct00030
자기-절단 펩티딜 링커 서열번호 28
Figure pct00031
자기-절단 펩티딜 링커 서열번호 29
Figure pct00032
자기-절단 펩티딜 링커 서열번호 30
Figure pct00033
스페이서 영역 서열번호 31
Figure pct00034
서열번호 32; 메디토프(비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인)
Figure pct00035
서열번호 33; CH3(스페이서 영역)
Figure pct00036
서열번호 34; CD3 제타 쇄(세포내 T 세포 신호전달 도메인)
Figure pct00037
서열번호 35; 전체 4-1BB FabRack 서열
Figure pct00038
Figure pct00039
서열번호 36; 전체 CD28 FabRack 서열
Figure pct00040
서열번호 37; 신호 펩티드
Figure pct00041
SEQUENCE LISTING <110> City of Hope Williams, John Brown, Christine Jenkins, Kurt <120> Meditope-Enabled T Cells <130> 048440-621001WO <150> 62/611,924 <151> 2017-12-29 <150> 62/680,442 <151> 2018-06-04 <160> 37 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 1 Leu Cys Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu 1 5 10 15 Thr Ala Leu Phe Leu 20 <210> 2 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 2 Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu 1 5 10 15 Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val 20 25 <210> 3 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 3 Met Ala Leu Ile Val Leu Gly Gly Val Ala Gly Leu Leu Leu Phe Ile 1 5 10 15 Gly Leu Gly Ile Phe Phe 20 <210> 4 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 4 Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu 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<211> 112 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 34 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 50 55 60 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 65 70 75 80 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 85 90 95 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 100 105 110 <210> 35 <211> 692 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 35 Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro 1 5 10 15 Ala Phe Leu Leu Ile Pro Cys Gln Phe Asp Leu Ser Thr Arg Arg Leu 20 25 30 Gln Cys Ser Ala Pro Ala Ser Ser Ala Ser Ala Pro Ser Ala Ala Ser 35 40 45 Ala Pro Ala Gly Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 50 55 60 Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 65 70 75 80 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 85 90 95 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 100 105 110 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 115 120 125 Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 130 135 140 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Met 145 150 155 160 Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu 165 170 175 Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys 180 185 190 Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr 195 200 205 Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu 210 215 220 Gly Gly Cys Glu Leu Gly Gly Gly Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala 225 230 235 240 Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu 245 250 255 Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly 260 265 270 Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu 275 280 285 Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser 290 295 300 Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly 305 310 315 320 Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu 325 330 335 His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg 340 345 350 Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Thr 355 360 365 Arg Met Pro Pro Pro Arg Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Leu Thr Pro 370 375 380 Met Glu Val Arg Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly 385 390 395 400 Asp Asn Ala Val Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr 405 410 415 Gln Gln Leu Thr Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys 420 425 430 Leu Ser Leu Gly Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala 435 440 445 Ile Trp Leu Phe Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr 450 455 460 Leu Cys Gln Pro Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp 465 470 475 480 Thr Val Asn Val Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser 485 490 495 Asp Leu Gly Gly Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly 500 505 510 Pro Ser Ser Pro Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp 515 520 525 Ala Lys Asp Arg Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Val Pro 530 535 540 Pro Arg Asp Ser Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala 545 550 555 560 Pro Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val 565 570 575 Ser Arg Gly Pro Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys 580 585 590 Ser Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met 595 600 605 Trp Val Met Glu Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp 610 615 620 Ala Gly Lys Tyr Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His 625 630 635 640 Leu Glu Ile Thr Ala Arg Pro Val Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Thr 645 650 655 Gly Gly Trp Lys Val Ser Ala Val Thr Leu Ala Tyr Leu Ile Phe Cys 660 665 670 Leu Cys Ser Leu Val Gly Ile Leu His Leu Gln Arg Ala Leu Val Leu 675 680 685 Arg Arg Lys Arg 690 <210> 36 <211> 690 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 36 Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro 1 5 10 15 Ala Phe Leu Leu Ile Pro Cys Gln Phe Asp Leu Ser Thr Arg Arg Leu 20 25 30 Gln Cys Ser Ala Pro Ala Ser Ser Ala Ser Ala Pro Ser Ala Ala Ser 35 40 45 Ala Pro Ala Gly Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 50 55 60 Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 65 70 75 80 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 85 90 95 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 100 105 110 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 115 120 125 Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 130 135 140 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Met 145 150 155 160 Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu 165 170 175 Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser 180 185 190 Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly 195 200 205 Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala 210 215 220 Ala Tyr Arg Ser Gly Gly Gly Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp 225 230 235 240 Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn 245 250 255 Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg 260 265 270 Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly 275 280 285 Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu 290 295 300 Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu 305 310 315 320 Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His 325 330 335 Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly 340 345 350 Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg Met 355 360 365 Pro Pro Pro Arg Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Leu Thr Pro Met Glu 370 375 380 Val Arg Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp Asn 385 390 395 400 Ala Val Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln Gln 405 410 415 Leu Thr Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu Ser 420 425 430 Leu Gly Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile Trp 435 440 445 Leu Phe Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu Cys 450 455 460 Gln Pro Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr Val 465 470 475 480 Asn Val Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp Leu 485 490 495 Gly Gly Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro Ser 500 505 510 Ser Pro Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala Lys 515 520 525 Asp Arg Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Val Pro Pro Arg 530 535 540 Asp Ser Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro Gly 545 550 555 560 Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser Arg 565 570 575 Gly Pro Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser Leu 580 585 590 Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp Val 595 600 605 Met Glu Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala Gly 610 615 620 Lys Tyr Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu Glu 625 630 635 640 Ile Thr Ala Arg Pro Val Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly Gly 645 650 655 Trp Lys Val Ser Ala Val Thr Leu Ala Tyr Leu Ile Phe Cys Leu Cys 660 665 670 Ser Leu Val Gly Ile Leu His Leu Gln Arg Ala Leu Val Leu Arg Arg 675 680 685 Lys Arg 690 <210> 37 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 37 Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro 1 5 10 15 Ala Phe Leu Leu Ile Pro 20

Claims (57)

  1. 하기를 포함하는 재조합 단백질:
    (i) 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인;
    (ii) 세포내 T 세포 신호전달 도메인; 및
    (iii) 상기 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인을 상기 세포내 T 세포 신호전달 도메인에 연결하는 막횡단 도메인.
  2. 제1항에 있어서, 상기 세포내 T 세포 신호전달 도메인이 CD3ζ 세포내 T 세포 신호전달 도메인인 재조합 단백질.
  3. 제1항에 있어서, 상기 막횡단 도메인이 CD8α 막횡단 도메인, CD28 막횡단 도메인, CD4 막횡단 도메인 또는 CD3-제타 막횡단 도메인인 재조합 단백질.
  4. 제3항에 있어서, 상기 막횡단 도메인이 CD28 막횡단 도메인인 재조합 단백질.
  5. 제4항에 있어서, 상기 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인을 상기 막횡단 도메인에 연결하는 스페이서 영역을 추가로 포함하는 것인 재조합 단백질.
  6. 제5항에 있어서, 상기 스페이서 영역이 불변 중쇄 3(CH3) 도메인인 재조합 단백질.
  7. 제6항에 있어서, 상기 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인을 상기 스페이서 영역에 연결하는 펩티드 링커를 추가로 포함하는 것인 재조합 단백질.
  8. 제7항에 있어서, 상기 막횡단 도메인을 상기 세포내 T 세포 신호전달 도메인에 연결하는 세포내 공동 자극 신호전달 도메인을 추가로 포함하는 것인 재조합 단백질.
  9. 제8항에 있어서, 상기 세포내 공동 자극 신호전달 도메인이 CD28 세포내 공동 자극 신호전달 도메인, 4-1BB 세포내 공동 자극 신호전달 도메인, ICOS 세포내 공동 자극 신호전달 도메인, 또는 OX-40 세포내 공동 자극 신호전달 도메인인 재조합 단백질.
  10. 제9항에 있어서, 상기 세포내 공동 자극 신호전달 도메인이 CD28 세포내 공동 자극 신호전달 도메인인 재조합 단백질.
  11. 제10항에 있어서, 상기 세포내 공동 자극 신호전달 도메인이 4-1BB 세포내 공동 자극 신호전달 도메인인 재조합 단백질.
  12. 제11항에 있어서, 상기 세포내 T 세포 신호전달 도메인의 C-말단에 결합된 검출 가능한 도메인을 추가로 포함하는 것인 재조합 단백질.
  13. 제12항에 있어서, 상기 검출 가능한 도메인이 말단절단된 CD19 단백질인 재조합 단백질.
  14. 제13항에 있어서, 상기 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 상기 검출 가능한 도메인에 연결하는 자기-절단 펩티딜 서열을 추가로 포함하는 것인 재조합 단백질.
  15. 제14항에 있어서, 상기 자기-절단 펩티딜 링커 서열이 T2A 서열 또는 2A 서열인 재조합 단백질.
  16. 제1항에 있어서, 상기 재조합 단백질이 세포의 일부를 형성하는 것인 재조합 단백질.
  17. 제1항에 있어서, 상기 재조합 단백질이 T 세포의 일부를 형성하는 것인 재조합 단백질.
  18. 제17항에 있어서, 상기 막횡단 도메인이 상기 T 세포의 세포막의 일부를 형성하는 것인 재조합 단백질.
  19. 제1항에 있어서, 상기 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인이 항원 결합 도메인에 결합되는 것인 재조합 단백질.
  20. 제19항에 있어서, 상기 항원 결합 도메인이 Fab, IgG, 또는 이중특이적 항체인 재조합 단백질.
  21. 제20항에 있어서, 상기 항원 결합 도메인이 세툭시맙 메디토프-이용 가능한 도메인, 트라스투주맙 메디토프-이용 가능한 도메인, 페르투주맙 메디토프-이용 가능한 도메인, M5A 메디토프-이용 가능한 도메인 또는 리툭시맙 메디토프-이용 가능한 도메인인 재조합 단백질.
  22. 제19항에 있어서, 상기 항원 결합 도메인이 암 항원에 결합할 수 있는 것인 재조합 단백질.
  23. 제19항에 있어서, 상기 항원 결합 도메인이 암 항원에 비공유적으로 결합할 수 있는 것인 재조합 단백질.
  24. 제22항에 있어서, 상기 암 항원이 Her2, EGFR, CD19 또는 CD20인 재조합 단백질.
  25. 제22항에 있어서, 상기 암 항원이 세포의 일부를 형성하는 것인 재조합 단백질.
  26. 제25항에 있어서, 상기 세포가 암세포인 재조합 단백질.
  27. 제26항에 있어서, 상기 암이 난소암, 신장 세포 암종, B 세포 악성종양, 백혈병, 림프종, 유방암, 결장직장암, 전립선암, 신경모세포종, 흑색종, 속질모세포종, 폐암, 골육종, 아교모세포종 또는 신경아교종인 재조합 단백질.
  28. 제1항의 재조합 단백질을 코딩하는 단리된 핵산.
  29. 제28항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  30. 제29항에 있어서, 상기 벡터가 렌티바이러스 또는 온코-레트로바이러스인 발현 벡터.
  31. 제29항의 발현 벡터를 포함하는 T 림프구.
  32. 제1항의 재조합 단백질을 포함하는 T 림프구.
  33. 제1항의 재조합 단백질을 포함하는 T 림프구로서, 여기서 상기 막횡단 도메인은 상기 T 림프구의 세포막 내에 있는 것인 T 림프구.
  34. 제31항에 있어서, 상기 T 림프구가 자가 T 림프구인 T 림프구.
  35. 제31항에 있어서, 상기 T 림프구가 이종 T 림프구인 T 림프구.
  36. 제31항에 있어서, 상기 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인이 항원 결합 도메인에 결합되는 것인 T 림프구.
  37. 제36항에 있어서, 상기 항원 결합 도메인이 Fab, IgG, 또는 이중특이적 항체인 T 림프구.
  38. 제36항에 있어서, 상기 항원 결합 도메인이 암 항원에 결합되는 것인 T 림프구.
  39. 제38항에 있어서, 상기 암 항원이 Her2, EGFR, CD19 또는 CD20인 T 림프구.
  40. 제36항에 있어서, 상기 항원 결합 도메인이 암 항원 결합 도메인인 T 림프구.
  41. 제36항에 있어서, 상기 항원 결합 도메인이 세툭시맙 메디토프-이용 가능한 도메인, 트라스투주맙 메디토프-이용 가능한 도메인, 페르투주맙 메디토프-이용 가능한 도메인, M5A 메디토프-이용 가능한 도메인 또는 리툭시맙 메디토프-이용 가능한 도메인인 T 림프구.
  42. 유효량의 제31항의 T 림프구 및 상기 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인에 결합할 수 있는 항원 결합 도메인을 암의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 항원 결합 도메인은 암 항원 결합 도메인인, 암의 치료 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 T 림프구 및 상기 항원 결합 도메인이 동시에 또는 순차적으로 투여되는 것인 치료 방법.
  44. 제42항에 있어서, 상기 T 림프구가 제1 시점에 투여되고 상기 항원 결합 도메인이 제2 시점에 투여되며, 여기서 제1 시점이 제2 시점에 선행하는 것인 치료 방법.
  45. 제42항에 있어서, 상기 항원 결합 도메인이 제1 시점에 투여되고 상기 T 림프구가 제2 시점에 투여되며, 여기서 제1 시점이 제2 시점에 선행하는 것인 치료 방법.
  46. 제42항에 있어서, 상기 방법이
    (i) 상기 투여 전에, 상기 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인을 시험관내에서 상기 항원 결합 도메인에 결합시켜 T 림프구-재조합 단백질 복합체를 형성하는 단계; 및
    (ii) 상기 T 림프구-재조합 단백질 복합체를 상기 대상체에게 투여하여 상기 대상체에서 암을 치료하는 단계
    를 포함하는 것인 치료 방법.
  47. 제42항에 있어서, 상기 암이 난소암, 신장 세포 암종, B 세포 악성종양, 백혈병, 림프종, 유방암, 결장직장암, 전립선암, 신경모세포종, 흑색종, 속질모세포종, 폐암, 골육종, 아교모세포종 또는 신경아교종인 치료 방법.
  48. 제42항에 있어서, 상기 항원 결합 도메인이 세툭시맙 메디토프-이용 가능한 도메인, 트라스투주맙 메디토프-이용 가능한 도메인, 페르투주맙 메디토프-이용 가능한 도메인, M5A 메디토프-이용 가능한 도메인 또는 리툭시맙 메디토프-이용 가능한 도메인인 치료 방법.
  49. 제1항에 있어서, 상기 재조합 단백질이 제1 재조합 단백질이고, 상기 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인이 제1 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인이고, 상기 세포내 T 세포 신호전달 도메인이 제1 세포내 T 세포 신호전달 도메인이고, 상기 막횡단 도메인이 제1 막횡단 도메인이고, 상기 스페이서 영역이 제1 스페이서 영역이고, 상기 세포내 공동 자극 신호전달 도메인이 제1 세포내 공동 자극 신호전달 도메인인 재조합 단백질.
  50. 제49항에 있어서, 상기 제1 재조합 단백질이 제2 재조합 단백질에 비공유적으로 결합되고, 상기 제2 재조합 단백질은,
    (i) 제2 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인;
    (ii) 제2 세포내 T 세포 신호전달 도메인;
    (iii) 상기 제2 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인을 상기 제2 세포내 T 세포 신호전달 도메인에 연결하는 제2 막횡단 도메인; 및
    (iv) 제2 스페이서 영역
    을 포함하고, 여기서 상기 제2 스페이서 영역은 상기 제2 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인을 상기 제2 막횡단 도메인에 연결하고, 여기서 상기 제1 스페이서 영역은 상기 제2 스페이서 영역에 비공유적으로 결합되는 것인 재조합 단백질.
  51. 제50항에 있어서, 상기 제1 스페이서 영역 및 상기 제2 스페이서 영역이 제1 불변 중쇄 3(CH3) 도메인 및 제2 불변 중쇄 3(CH3) 도메인인 재조합 단백질.
  52. 제49항에 있어서, 상기 제1 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인 및 상기 제2 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인이 화학적으로 상이한 것인 재조합 단백질.
  53. 제49항에 있어서, 상기 제1 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인 및 상기 제2 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인이 화학적으로 동일한 것인 재조합 단백질.
  54. 제49항에 있어서, 상기 제1 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인이 제1 항원 결합 도메인에 비공유적으로 결합되는 것인 재조합 단백질.
  55. 제50항에 있어서, 상기 제2 비-CDR Fab 결합 펩티드 도메인이 제2 항원 결합 도메인에 비공유적으로 결합되는 것인 재조합 단백질.
  56. 제54항에 있어서, 상기 제1 항원 결합 도메인 및 상기 제2 항원 결합 도메인이 화학적으로 상이하거나 동일한 것인 재조합 단백질.
  57. 제54항에 있어서, 상기 제1 항원 결합 도메인 및 상기 제2 항원 결합 도메인이 독립적으로 세툭시맙 메디토프-이용 가능한 도메인, 트라스투주맙 메디토프-이용 가능한 도메인, 페르투주맙 메디토프-이용 가능한 도메인, M5A 메디토프-이용 가능한 도메인 또는 리툭시맙 메디토프-이용 가능한 도메인인 재조합 단백질.
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