KR20200114885A - 쉬와넬라 속에 대한 세포 표면 발현 벡터 및 이의 용도 - Google Patents

쉬와넬라 속에 대한 세포 표면 발현 벡터 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 쉬와넬라 속에 세포 표면 발현 시스템 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명에 따르면, 표면 발현 벡터는 산업적으로 활용도가 높은 쉬와넬라 속 미생물에서 발현가능하고, 접합을 통해 형질전환을 용이하게 할 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터를 이용한 형질전환 쉬와넬라 미생물은 야생형 쉬와넬라 보다 개선된 전기 생산능을 가질 수 있고, 목표 단백질의 방출을 쉽게 조절할 수 있어, 바이오 재생, 바이오 약물 및 미생물 연료 전지 산업분야에서 그 활용도가 매우 높다.

Description

쉬와넬라 속에 대한 세포 표면 발현 벡터 및 이의 용도{A CELL SURFACE DISPLAY VECTOR FOR SHEWANELLA SP. AND A USE THEREOF}
본 발명은 쉬와넬라 속에 세포 표면 발현 시스템 및 이의 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 상기 벡터에 의한 쉬와넬라 속 형질전환체; 상기 벡터를 이용한 쉬와넬라 속 미생물의 형질전환 방법; 상기 형질전환체를 포함하는 미생물연료지; 및 상기 형질전환체를 포함하는 전기생산용 조성물에 관한 것이다.
세포 표면 발현 시스템(Cell surface display system)은 세포 표면에 단백질이나 펩타이드를 발현하고 노출시키는 것으로, 이 기능은 표시된 단백질이 세포 외 공간에서 자유롭게 접근할 수 있게 한다. 세포 표면에 단백질을 표시하는 것은 백신 개발, 전세포 생-촉매학, 생흡수(bioabsorbant) 및 바이오 센서와 같은 생물 공학 및 산업 응용 분야에서 중요하게 여겨지고 있다1.
다양한 박테리아 발현 시스템은 외막 단백질(outer membrane protein), 세포벽 지방단백질(cell wall lipoprotein) 또는 오토-트랜스포터(auto-transporter)를 발현 스캐폴드로 사용하여 개발되었다2. 이러한 알려진 플랫폼 중에서, 오토-트랜스포터(AT)는 과발현에 의한 독성을 피하면서 세포 표면에 기능적으로 다양한 표적 단백질을 발현 시킬 수 있다는 점에서 다른 시스템과 비교해서 장점을 갖는다3. 오토 트랜스포터가 다양하지만, 스캐폴드 단백질은 3개의 공통-특징 영역으로 나뉠 수 있다: i) 막을 통과하여 단백질을 전달하는 신호 펩타이드, ii) N-터미널 패신져 도메인(발현 영역), 및 iii) C-터미널 수송체(β-barrel) 도메인(정착 영역)3 -4. 수송체 도메인은 헤어핀 모델을 기반으로 전송 프로세스를 시작하기 위한 접이식 코어(folding core)를 갖는 패신져 도메인의 분비에 역할을 한다. 분비 및 발현 메커니즘을 기초로 패신져 도메인을 교체하여 다양한 POI가 발현될 수 있고 세포 표면에 이종 단백질을 기능적으로 나타낼 수 있다.
YfaL 오토-트랜스포터를 이용한 단백질 표면 발현 벡터가 보고된 바 있으나, 이러한 표면발현 벡터는 단백질의 발현을 위해서 아라비노오즈(arabinose)와 같은 화합물로 단백질 발현을 유도(induction)하는 단계를 거처야하고, 대장균에서만 작동을 확인하여 대장균 이외의 그람음성균 미생물에서는 작동여부를 알 수 없다. 따라서, 다양한 그람 음성 세균에서 범용적으로 적용될 수 있는 세포 표면 발현 시스템에 대한 요구가 여전히 지속되고 있다.
그람음성균(Gram-negative bacteria)은 세균 중 하나로 외막을 가지며 지질다당류, 포린 단백질 등을 포함한다는 점에서 그람양성균과 구별되는 특성을 갖는다. 종래 E. coli에 대한 세포 표면 단백질 발현 시스템에 대해 연구가 진행되고 있었으나, E. coli에서 작동하는 시스템이 다른 세균에서 작동하지 않거나 작동여부를 확인할 수 없기 때문에, 산업적으로 광범위하게 적용되기 어려운 문제가 있다.
한편, 미생물연료전지(microbial fuel cell; MFC)는 미생물을 이용한 연료(유기물)을 전기에너지로 바꾸는 장치를 의미하는데, 연료인 유기물에 의해 산화 분해될 때 발생하는 전자를 전극으로 회수하는 방식으로 무한히 이용가능하기 때문에, 제4차 산업혁명 시대 전기에너지 분야에서 새로운 그린에너지로서 각광받고 있다.
쉬와넬라는 혐기조건에서 금속호흡이 가능한 금속염환원세균 중 하나로, 미생물 연료 전지 분야 및 미생물 환경복원(Bioremediation) 분야에서 산업적으로 폭넓은 연구가 진행되고 있다. 그러나, 충분한 전기 생산효과를 얻기 위해서는 이전 수준 이상의 세포량 및 세포 활성이 필요하나, 현재 쉬와넬라 미생물을 이용하는 전기생산은 실험실 규모에서 연구되는 수준에 머물러 있어, 산업적 규모로 활용을 높이기 위해서 전기 생산능을 개선하기 위한 방안에 대한 연구가 여전히 요구되고 있다.
본 발명은 상기 문제점을 해결하고자 하는 것으로, 쉬와넬라 속 미생물에서 발현 가능한 세포 표면 발현 벡터를 제공하는데 그 목적이 있다. 또한, 본 발명은 상기 세포 표면 발현 벡터에 형질전환된 쉬와넬라 속 형질전환체와 상기 형질전환체의 표면에서 단백질을 발현시키는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다. 또한, 다른 목적으로 본 발명은 상기 벡터를 이용해서 접합 방법을 통해 쉬와넬라 속 미생물을 형질전환 시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 쉬와넬라 형질전환체는 세포 표면에서 단백질을 발현하는 특성에 의하여 종래 야생형 균주와 비교해서 더 우수한 전기 생산능을 가지며, 특히 시토크롬환원효소 단백질을 표면 발현하는 형질전환체는 개선된 전기 생산능을 가짐을 본 발명의 일 실시예에서 실험적으로 확인되었다. 이러한 측면에서, 본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 벡터로 형질전환된 형질전환체를 포함하는 미생물연료전지; 및 전기 생산용 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.
본 발명은, 상기한 목적을 달성하기 위해서, 미생물의 세포 표면에서 발현되는 단백질을 코딩하는 목표 유전자; 박테리아의 오토트랜스포터 단백질 코딩 유전자; pBBR1 또는 pMB1 복제 오리진; 및 상기 오토트랜스포터 단백질 코딩 유전자에 작동 가능하게 연결된 상시 발현 프로모터를 포함하는 쉬와넬라 속(Shewanella sp.) 미생물의 세포 표면에서 단백질을 발현하기 위한 벡터를 제공한다.
상기 발현벡터는 pBBR1MCS2 벡터에서 Lac 프로모터 및 다중 클로닝 사이트(MCS)를 제거한 것을 골격벡터로 하는 것일 수 있다.
상기 벡터는 재조합 DNA 선별마커를 더 포함하는 것일 수 있다.
상기 벡터는 접합에 의하여 쉬와넬라 속 미생물을 형질전환하기 위해 mob 유전자를 더 포함하는 것일 수 있다.
상기 상시 발현 프로모터는 aga 프로모터, arcA 프로모터, lac 프로모터, cel 프로모터, xyn 프로모터, J23112 프로모터, J23103 프로모터, J23113 프로모터, J23109 프로모터, J23117 프로모터, J23114 프로모터, J23115 프로모터, J23116 프로모터, J23105 프로모터, J23110 프로모터, J23107 프로모터, J23106 프로모터, J23108 프로모터, J23118 프로모터, J23111 프로모터, J23101 프로모터, J23104 프로모터, J23102 프로모터 및 J23100 프로모터로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
상기 오토트랜스포터는 신호 서열, 패신져 도메인, 링커 부위 및 오토트랜스포터 슈퍼패밀리 부위로 구성된 오토트랜스포터 단백질로부터 패신져 도메인 부위가 제거된 클로닝 부위를 가지는 것일 수 있다.
상기 오토트랜스포터 단백질은 YfaL(NP_416736.1), 또는 유전자은행 등록번호 NP_416736.1, CBJ01870.1, ZP_07247471.1, YP_001459034.1, ZP_07121532.1, ZP_02999058.1, YP_003045352.1, EGB57147.1, EGB37260.1, ZP_07146751.1, ZP_07498247.1, ZP_07787684.1, YP_001724408.1, YP_003035675.1, ZP_03068365.1, Z P_07523028.1, ZP_07102820.1, EGB90124.1, YP_002403506.1, EFZ69526.1, YP_002293769.1, ZP_07590844.1, ZP_06662998.1, ZP_07135193.1, YP_001463580.1, ZP_07687541.1, ZP_03028301.1, BAI31473.1, ZP_03043348.1, ZP_07098380.1, Y P_002387709.1, NP_288807.1, EFW74417.1, BAI26434.1, ZP_07142137.1, BAI36814.1, YP_003078961.1, ZP_07614097.1, EFZ47577.1, ZP_06658169.1, ZP_07186279.1, EFX25099.1, ZP_06654172.1, ZP_02786344.1, EGC11783.1, EGB41107.1, ZP_02812144.1, ZP_02823402.1, ZP_07508510.1, ZP_02774656.1, YP_002413282.1, EFX30437.1, ZP_07619499.1, ZP_07518131.1, YP_001744429.1, YP_002408332.1, YP_002329881.1, NP_754661.1, YP_002398608.1, EGB75831.1, EGB51754.1, YP_541512.1, ZP_07175432.1, YP_670171.1, CAP76735.1, ZP_07624785.1, ZP_07503047.1, EFZ73335.1, ZP_07781748.1, ADN70533.1, ZP_03031601.1, ADR27681.1, ZP_07448816.1, ZP_02901808.1, YP_002382104.1, EGC06746.1, ZP_05431470.1 및 YP_004212039.1로 이루어진 군에서 선택된 하나일 수 있다.
상기 쉬와넬라 속 미생물은 쉬와넬라 오네이덴시스(Shewanella oneidensis) 및 쉬와넬라 퓨트리파시엔스(Shewanella putrefaciens)로 이루어신 군에서 선택된 것일 수 있다.
상기 벡터는 도 1에 개시된 개열 지도를 갖는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 벡터에 의해 형질전환된 쉬와넬라 속(Shewanella sp.) 형질전환체를 제공한다.
상기 형질전환체는 시토크롬환원효소(cytochrome reductase) 단백질을 쉬와넬라 속 미생물의 세포 표면에서 발현하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 쉬와넬라 속 미생물;과 상기 벡터를 접합시키는 것; 및 상기 접합을 통해서 벡터 구조체가 도입된 쉬와넬라 속 형질전환체를 제조하는 것을 포함하는 쉬와넬라 속(Shewanella sp.) 미생물의 형질전환 방법을 제공한다.
상기 형질전환 방법은 형질전환체를 항생제 선별을 이용해서 분리하는 것을 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 쉬와넬라 속(Shewanella sp.) 형질전환체를 포함하는 미생물연료전지(microbial fuel cell;MFC)를 제공한다.
상기 형질전환체는 세포 표면에서 시토크롬환원효소(cytochrome reductase) 단백질을 발현하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 쉬와넬라 속(Shewanella sp.) 형질전환체; 및 상기 형질전환체의 기질을 포함하는 전기생산용 조성물을 제공한다.
상기 형질전환체는 세포 표면에서 시토크롬환원효소(cytochrome reductase) 단백질을 발현하는 것일 수 있다.
본 발명의 표면 발현 벡터는 산업적으로 활용도가 높은 쉬와넬라 속 미생물에서 발현가능하고, 접합을 통한 형질전환 방법에 의하여 쉬와넬라 미생물의 형질전환을 용이하게 할 수 있으며, 다른 박테리아와 비교해서 쉬와넬라 미생물에서 더 높은 발현 효율을 갖는다는 점에 특징이 있다. 또한, 본 발명의 벡터를 이용한 형질전환 쉬와넬라 미생물은 전자 운반능이 야생형 쉬와넬라 보다 우수하여, 개선된 전기 생산능을 가질 수 있고, 목표 단백질의 방출을 쉽게 조절할 수 있어, 바이오 재생, 바이오 약물 및 미생물 연료 전지 산업분야에서 그 활용도가 매우 높다.
도 1은 본 발명에 따른 항시적 표면발현 벡터 p12CYL의 플라스미드 지도를 나타내는 것이다.
도 2는 세포 표면 발현 시스템의 도식적 표현으로, A는 표면발현 벡터 p12CYL 구축 과정을 나타내고, B는 완성된 p12CYl 표면발현 벡터의 플라스미드 지도를 나타내며, C는 표면 발현되는 YfaL 오토트랜스포터 부분의 부위별 명칭을 보여준다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 E. coli DH10B와 S. oneidensis MR-1의 목표 단백질들의 표면 발현을 확인한 사진이다; E: E. coli DH10B, M: S. oneidensis MR-1, D: p12CYL, DT: p12CYL-β-아가레이즈 YM01-3,
도 4는 세포 분획별 아가 분해능을 정량화한 그래프이다; A: 상이한 세포 분획에서의 아가레이즈 활성 수준, B, C: 상이한 세포 분획에서의 상대적 아가레이즈 활성. WC: 세포 전체; TC: 전체 세포 추출물; Ly: 세포 분해물, M: 세포막 분획, TS: 전체 가용성 분획.
도 5는 TEV 프로테이즈 처리를 통한 표면발현된 목표 단백질 분리 실험결과를 보여주는 그래프이다: S: 세포가 없는 상등액, P: 세포 존재 펠렛, X: 처리되지 않은 것, TEV: TEV 프로테아제 처리된 것,
도 6 는 S. oneidensis MR-1 및 E. coli DH10B에서 다양한 단백질(Amy13B, Amy13D, Aga16B, Aga50D, Cel5F, Cel5G, Cel5H, Cel5J)의 표면 발현을 확인한 사진이다.
도 7a 및 7b는 세포 성장 곡선과 성장단계별 표면 발현 효율을 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 8은 세포 별 NADH 처리에 따른 DCIP 환원 능력 결과를 보여주는 그래프이다. 파랑: S. oneidensis MR-1 Host only, 노랑: S. oneidensis MR-1 YfaL 단백질 표면발현, 주황: NADH cytochrome b5 reductase를 표면 발현하는 S. oneidensis MR-1.
도 9a 및 9b는 CV(Cyclic Voltammetry) 곡선을 통한 전극 표면상 전기활성을 보여주는 그래프이다. MD: S. oneidensis MR-1 YfaL 단백질 표면발현, MDCD: NADH cytochrome b5 reductase를 표면 발현하는 S. oneidensis MR-1.
이하에서, 본 발명의 에 대하여 상세히 설명한다.
다만, 본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 이하에서 기술하는 특정 실시예 및 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니다. 본 발명의 범위는 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명은, 미생물의 세포 표면에서 발현되는 단백질을 코딩하는 목표 유전자; 박테리아의 오토트랜스포터 단백질 코딩 유전자; pBBR1 또는 pMB1 복제 오리진; 및 상기 오토트랜스포터 단백질 코딩 유전자에 작동 가능하게 연결된 상시 발현 프로모터를 포함하는 쉬와넬라 속(Shewanella sp.) 미생물의 세포 표면에서 단백질을 발현하기 위한 벡터를 제공한다.
본 발명에서 쉬와넬라 속 미생물은 쉬와넬라 속에 속하는 미생물을 모두 포함하는 의미이다. 본 발명의 벡터는 쉬와넬라 속 미생물에서 효과적으로 발현될 수 있음을 실험적으로 확인하였다.
상기 쉬와넬라 속 미생물은 종에 의하여 한정되지 않으나, 일 예로 쉬와넬라 오네이덴시스(Shewanella oneidensis) 및 쉬와넬라 퓨트리파시엔스(Shewanella putrefaciens)일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 쉬와넬라 오네이덴시스 MR-1에서 본 발명의 벡터가 잘 발현됨을 실험적으로 확인하였다.
본 발명의 쉬와넬라 미생물이 갖는 대장균과 구별되는 발현 프로파일의 일 예로, 구체적인 실시예에서 β-아가레이즈 YM01-1을 사용하여 세포 표면에 발현된 단백질의 수를 측정한 결과 S. oneidensis는 세포 표면에 최대 1160개의 단백질 분자를 발현했으며, 이는 세포 표면적의 0.3%에 해당한다. 총 표적 단백질 중에서 표출된 단백질 중 세포 표면에 10%의 단백질 분자가 존재함을 확인하였다.
본 발명에서 벡터는 미생물에 서열을 주입하는 일반적인 운반체를 의미하며, 특정한 서열로 한정되는 것은 아니다. 벡터 자체가 유전자를 활성화하는 뉴클레오타이드 일 수 있고, 유전자를 활성화하는 서열을 함유하는 것 일 수 있다. 따라서, 벡터는 유전자를 활성화하는데 필요한 서열을 함유하는 간단한 선형 또는 원형 폴리뉴클레오타이드 이거나, 큰 폴리뉴클레오타이드 또는 DNA와 RNA 바이러스 게놈, 완전한 비리온(virion) 또는 중요한 뉴클레오타이드 서열을 세포에 주입하는데 사용되는 그 밖의 생물학적 구조체와 같은 다른 구조체의 서열일 수 있다.
상기 벡터는 pBBR1 또는 pMB1 복제 오리진을 포함하는 벡터일 수 있다.
본 발명의 일 실예에 따라, 상기 발현벡터는 pBBR1MCS2 벡터에서 Lac 프로모터 및 다중 클로닝 사이트(MCS)를 제거한 것을 골격벡터로 하는 것일 수 있다. 상기 제거된 MCS 부위에 발현 프로모터 서열 및 오토트랜스포터 단백질 코딩 유전자가 삽입될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따라, pBBR1MCS2 벡터에서 Lac 프로모터 및 다중 클로닝 사이트(MCS)를 제거하고, 이를 골격벡터로 하여 상시 발현 프로모터 서열 및 오토트랜스포터 단백질을 코딩하는 유전자를 삽입한 벡터를 제조하여, p12CYL이라 명명하였다.
본 발명에서 목표 유전자는 형질전환 미생물에서 발현되어 그 기능을 나타내도록 하기 위해서 발현 벡터에 삽입되는 유전자를 의미하는 것으로, 형질전환 대상 미생물이 갖고 있으나 그 발현을 증가시키기 위한 것 또는 형질전환 대상 미생물이 갖지 않는 외래의 유전자 일 수 있다.
본 발명의 발현 벡터는 상기 목표 유전자가 형질대상체로 전달되어 세포 표면 발현되도록 하기 위한 구성에 기술적 특징이 있으므로, 상기 목표 유전자는 본 발명의 발현 벡터에 삽입되어 형질대상 미생물에 전달될 수 있는 것이라면 그 종류를 불문하고 본 발명에 포함될 수 있다. 일 예로, 상기 목표 유전자는 시토크롬 환원효소(cytochrome reductase)를 코딩하는 유전자; 또는 서열번호 5 또는 서열번호 6의 유전자 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 목표 유전자에 의해 코딩되어 쉬와넬라 미생물의 표면에 발현되는 목표 단백질은 시토크롬을 전자수용체로 삼는 효소인 시토크롬 환원효소 일 수 있다. 상기 시토크롬 환원효소는 본 발명의 기술분야에서 공지된 것이라면 모두 본 발명에 포함될 수 있다. 일 예로 서열번호 7의 단백질일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 목표 유전자는 오토트랜스포터 단백질을 코딩하는 유전자 내에 삽입되는 형태로 포함될 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 오토트랜스포터 단백질은 라이게이션 독립적인 클로닝(Ligation independent cloning; LIC) 부위를 포함할 수 있고, 상기 목표 유전자는 LIC 부위에 삽입될 수 있다. 상기 LIC 부위는 라이게이션 독립적으로 클로닝이 가능하게 하므로, 형질전환 과정에서 많은 시간이 투여되었던 라이게이션 단계를 생략할 수 있다는 점에서 이점이 있다.
본 발명의 목표 유전자는 오토트랜스포터 단백질을 코딩하는 유전자 내에 삽입된 형태로 본 발명의 벡터에 포함될 수 있고, 형질전환된 미생물에서 목표 유전자에 의해 코딩되는 목표 단백질은 오토트랜스포터 단백질과 결합된 형태로 상기 미생물 세포의 표면에서 발현될 수 있다.
본 발명의 박테리아의 오토트랜스포터 단백질 코딩 유전자는 프로모터 하에서 작동 가능하게 연결된 것 이다. 상기 오토트랜스포터는 신호 서열, 패신져 도메인, 링커 및 오토트랜스포터 슈퍼패밀리로 구성된 오토트랜스포터 단백질로부터 패신져 도메인 부위가 제거된 클로닝 부위를 가지는 것 일 수 있다.
본 발명에서 오토트랜스포터 단백질은 목표 단백질이 세포의 표면에 발현되기 위한 스캐폴드 단백질로서, 운반체 부위와 링커부위를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 오토트랜스포터 단백질은 신호 부위; 목표 유전자 삽입부위; 링커 부위; 및 운반체 부위를 포함할 수 있다. 또한, 링커부위 뒤 쪽으로 라이게이션 독립적인 클로닝을 위한 절단부위(LIC 부위)와 TEV 프로테아제로 절단 가능한 분비조절 부위를 더 포함할 수 있다.
보다 구체적인 예로, 상기 오토트랜스포터 단백질은 YfaL(NP_416736.1)일 수 있고, 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열에 의해서 코딩되는 YfaL 단백질일 수 있다. 상기 YfaL은 예측된 신호 펩타이드(1-28 잔기), 링커 부위(786-916 잔기) 및 운반체 부위(917-1250 잔기)로 구성될 수 있다.
본 발명의 발현 벡터는 본래의 패신저 도메인의 크기의 절반에서 두 배 정도의 크기를 가지는 이종 단백질을 세포 표면으로 발현할 수 있다. 일 실시예에 따라, YfaL에서 유추된 패신저 도메인의 크기는 약 75kDa인 반면에 성공적으로 발현된 여섯 종의 단백질의 크기는 42 kDa에서 88.6kDa까지의 범위임을 확인하였고, 이는 YfaL 기반 세포 표면 발현 시스템이 다양한 크기의 이종 단백질들을 세포 표면으로 발현 시킬 수 있음을 의미한다. 추가적으로, 여러 목표 유전자들을 클로닝할 때 가장 시간 소모적인 과정인 제한 효소의 사용 및 라이게이션 과정을 제거함으로써 보다 효율적인 클로닝 제공을 위해 LIC 방법을 적용시켰으며, 이러한 LIC 서열(LIC 부위)은 신호서열과 운반체 지역 사이에 삽입될 수 있다.
또한, 상기 오토트랜스포터 단백질은 쉬와넬라 세포 표면으로 발현된 단백질의 방출을 쉽게 조절하기 위해, LIC 클로닝 부위 뒤로 TEV 프로테이즈 절단 부위를 추가로 포함할 수 있다.
상기 오토트랜스포터 단백질은 또한 TEV 처리에 의하여 쉬와넬라 균의 세포 표면으로 발현된 단백질들을 방출시키기 위해서, TEV 프로테이즈 절단 부위를 더 포함할 수 있다. 최종적으로 쉬와넬라에서 세포 표면 발현 및 분비를 위한 벡터를 제공할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 표면 발현된 단백질이 TEV 프로테아제 처리에 의해 방출 될 수 있으며, S. oneidensis MR-1에서 발현 및 방출된 다양한 단백질(아가레이즈, 아밀라아제 및 셀룰라아제)이 기능성을 유지함을 실험적으로 확인했다.
상기 오토트랜스포터 단백질은 NP_416736.1(YfaL), CBJ01870.1, ZP_07247471.1, YP_001459034.1, ZP_07121532.1, ZP_02999058.1, YP_003045352.1, EGB57147.1, EGB37260.1, ZP_07146751.1, ZP_07498247.1, ZP_07787684.1, YP_001724408.1, YP_003035675.1, ZP_03068365.1, Z P_07523028.1, ZP_07102820.1, EGB90124.1, YP_002403506.1, EFZ69526.1, YP_002293769.1, ZP_07590844.1, ZP_06662998.1, ZP_07135193.1, YP_001463580.1, ZP_07687541.1, ZP_03028301.1, BAI31473.1, ZP_03043348.1, ZP_07098380.1, Y P_002387709.1, NP_288807.1, EFW74417.1, BAI26434.1, ZP_07142137.1, BAI36814.1, YP_003078961.1, ZP_07614097.1, EFZ47577.1, ZP_06658169.1, ZP_07186279.1, EFX25099.1, ZP_06654172.1, ZP_02786344.1, EGC11783.1, EGB41107.1, ZP_02812144.1, ZP_02823402.1, ZP_07508510.1, ZP_02774656.1, YP_002413282.1, EFX30437.1, ZP_07619499.1, ZP_07518131.1, YP_001744429.1, YP_002408332.1, YP_002329881.1, NP_754661.1, YP_002398608.1, EGB75831.1, EGB51754.1, YP_541512.1, ZP_07175432.1, YP_670171.1, CAP76735.1, ZP_07624785.1, ZP_07503047.1, EFZ73335.1, ZP_07781748.1, ADN70533.1, ZP_03031601.1, ADR27681.1, ZP_07448816.1, ZP_02901808.1, YP_002382104.1, EGC06746.1, ZP_05431470.1 및 YP_004212039.1로 이루어진 군에서 선택된 하나일 수 있다.
상기 오토트랜스포터 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 것 일 수 있고, 상기 패신져 도메인부위는 상기 서열번호 2에 기재된 단백질의 29째 내지 785째에 위치하는 것 일 수 있다.
일 실시예에 따라, 상기 오토트랜스포터 단백질은 YfaL(NP_416736.1) 단백질 일 수 있고, 바람직하게는 서열번호 1의 서열에 의해 코딩되는 YfaL 단백질 일 수 있다. 본 발명의 쉬와넬라 속 미생물에서 세포 표면 발현을 위한 벡터 시스템은 공지된 바 없고, 특히 오토트랜스포터 단백질 중 YfaL 단백질에 의한 표면 발현 시스템이 쉬와넬라 속 미생물에서 발현 가능함은 확인된 바 없었다.
본 발명에서 상시 발현 프로모터(constitutive promoter)는 관련 유전자(즉, 목표 유전자)의 계속적인 전사를 허용하는 조절되지 않은 프로모터를 의미한다.
상기 상시 발현 프로모터는 오토트랜스포터 앞에 위치하는 것일 수 있다. 본 발명에서 상시 발현 프로모터는 종래에 단백질의 표면 발현을 위해서 필요했던 유도과정을 거치지 않고도 단백질의 세포 표면 발현을 가능하게 하므로, 경제적으로 대량생산에 적용 가능성을 실현한다는 점에서 특징이 있다.
상기 상시 발현 프로모터는 쉬와넬라 속 미생물에서 작동할 수 있는 것이라면, 그 종류에 제한되지 않고 사용될 수 있다. 상기 상시 발현 프로모터는 쉬와넬라 속 미생물에서 작동할 수 있는 것이라면 공지된 프로모터를 적용하여 본 발명을 이용할 수 있으므로, 그 종류에 한정되지 않는다.
구체적인 예로, aga 프로모터, arcA 프로모터, lac 프로모터, cel 프로모터, xyn 프로모터, J23112 프로모터, J23103 프로모터, J23113 프로모터, J23109 프로모터, J23117 프로모터, J23114 프로모터, J23115 프로모터, J23116 프로모터, J23105 프로모터, J23110 프로모터, J23107 프로모터, J23106 프로모터, J23108 프로모터, J23118 프로모터, J23111 프로모터, J23101 프로모터, J23104 프로모터, J23102 프로모터 및 J23100 프로모터로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직한 예로 iGEM part#: Bba_J23113 프로모터를 사용할 수 있고, 서열번호 3의 상시 발현 프로모터일 수 있다.
본 발명의 벡터는 상기 벡터는 접합에 의하여 쉬와넬라 속 미생물을 형질전환하기 위해 mob 유전자를 더 포함할 수 있다. 상기 mob 유전자는 접합과정에서 mob 유전자를 갖는 벡터의 DNA가 공여 균주에서 형질전환 대상 균주(수여 균주), 즉, 본 발명에서는 쉬와넬라 속 미생물로 옮겨가게 해주고, 수여 균주 내에서 복제되도록 해준다. 상기 mob 유전자는 서열번호 4의 염기서열을 갖는 또는 이로 이루어진 것 일 수 있다.
본 발명의 상기 발현 벡터는 도 1의 개열 지도를 갖는 것일 수 있다.
벡터로부터 미생물의 형질전환 과정에서 사용되는 형질 주입방법은 본 발명의 공지된 것을 본 발명에 적용할 수 있다. 일 예로, 화학적 형질전환 방법, 전기천공(electroporation)법 등이 모두 본 발명의 벡터로 쉬와넬라 속 미생물을 형질전환하는데 적용될 수 있다.
가장 바람직한 예로, 본 발명의 벡터는 쉬와넬라 미생물과 접합에 의하여 목표 유전자를 미생물 내부로 주입할 수 있다. 접합에 의해서 미생물을 형질전환 시키는 방법은, 특히, 쉬와넬라 오네이덴시스 MR-1의 형질전환 효율 측면에서 가장 우수한 장점을 갖는다.
이러한 측면에서, 본 발명은 또한 상기 벡터에 의해서 형질전환된 쉬와넬라 속(Shewanella sp.) 형질전환체를 제공한다.
상기 쉬와넬라 속 미생물은 쉬와넬라 오네이덴시스(Shewanella oneidensis) 또는 쉬와넬라 퓨트리파시엔스(Shewanella putrefaciens)일 수 있고, 상기 형질전환체는 본 발명의 벡터를 포함하는 쉬와넬라 오네이덴시스 및 쉬와넬라 퓨트리파시엔스일 수 있다. 그러나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 형질전환체는 본 발명의 세포 표면 발현 벡터로 형질전환되어 쉬와넬라 세포의 표면에서 목표 단백질을 발현하는 능력을 갖는 점에 기술적 특징이 있다.
특히, 상기 목표 단백질은 그 종류에 상관없이 본 발명에 포함될 수 있고, 일 예로, 상기 쉬와넬라 속 형질전환체 시토크롬환원효소(cytochrome reductase) 단백질을 세포 표면에서 발현하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따라, NADH cytochrome b5 reductase를 표면 발현하는, 즉 슈와넬라균의 형질전환 능을 종래의 균과 비교해서 향상시키기 위해서, S. oneidensis MR-1 균주가 시토크롬환원효소(NADH cytochrome b5 reductase)를 표면발현하도록, 본 발명의 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제조하였다. 상기에 따라 제조된 형질전환체는 기질인 NADH가 시토크롬환원효소(NADH cytochrome b5 reductase)에 의해서 산화되면 2개 전자를 생성하게 된다.
종래 전기 생산능을 갖는다고 알려진 쉬와넬라 속 미생물은 세포 내부에서 환원하므로, 세포막을 통과하는 매개체(mediator)를 통해서만 미생물과 전극간 전자전달이 가능하였다. 그러나 이러한 매개체의 100% 회수가 어려워 지속적인 공급이 요구되고, 세포 내 매개체 축적이 미생물에 독성으로 작용하여 대사가 중지되는 문제가 있었으므로, 산업적 규모로 미생물연료전지를 활용할 수 없는 문제가 있었다.
이를 해결하기 위해, 세포 외막에 존재하는 전자수용체에서 직접 전자를 전달하는 기작을 이용하는 것이 제안되었으나, 이러한 효율적으로 대사작용을 나타내는 균주를 찾는데 어려움이 있었고, 산업적 규모의 전기 생산을 위해서는 세포량이 부족하여, 효율이 떨어지는 어려움이 있었다.
그러나, 본 발명의 벡터는 종에 관계없이 쉬와넬라 미생물의 표면에서 단백질이 발현하는 쉬와넬라 균주를 대량생산할 수 있게 해주므로, 세포막에서 시토크롬환원효소를 발현하는 균주의 제공을 용이하게 하고, 표면 발현되는 단백질의 종류 및 서열 등을 쉽게 조절할 수 있어, 효과적이고 우수한 전기 생산능을 갖는다는 점에서 본 발명은 의의를 갖는다.
본 발명의 구체적인 일 실시예로서, β-아가레이즈 YM01-1을 사용하여 세포 표면에 발현된 단백질의 수를 측정한 결과 S. oneidensis는 세포 표면에 최대 1160개의 단백질 분자를 발현했으며, 이는 세포 표면적의 0.3%에 해당한다. 총 표적 단백질 중에서 표출된 단백질 중 세포 표면에 10%의 단백질 분자가 존재함을 확인하였다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해, 쉬와넬라 속 미생물과 본 발명의 벡터를 접합시키는 것; 및 상기 접합을 통해서 벡터 구조체가 도입된 쉬와넬라 속 형질전환체를 제조하는 것을 포함하는 쉬와넬라 속(Shewanella sp.) 미생물의 형질전환 방법을 제공한다.
벡터로부터 미생물의 형질전환 과정은 본 발명의 공지된 것을 본 발명에 적용하여 본 발명을 이용할 수 있다. 일 예로, 화학적 형질전환 방법, 전기천공(electroporation)법 등이 모두 본 발명의 벡터로 쉬와넬라 속 미생물을 형질전환하는데 적용될 수 있다. 그러나 가장 바람직한 예로, 본 발명의 벡터는 쉬와넬라 미생물과 접합에 의하여 목표 유전자를 미생물 내부로 주입할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 전기천공법에 의해서 1차 유전자 주입을 시도하였고, 이에 형질전환되지 않은 미생물에 대하여 접합에 의해서 2차로 형질전환 되도록 하여, 쉬와넬라 오네이덴시스 MR-1을 형질전환 시키는 방법을 개시하고 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 벡터로 형질전환된 쉬와넬라 속 미생물을 포함하는 미생물연료전지(microbial fuel cell;MFC), 및 전기생산용 조성물을 더 포함한다.
상기 미생물연료전지 또는 전기생산용은 형질전환된 쉬와넬라 속 미생물이 대사에 사용하는 기질을 더 포함할 수 있다. 상기 기질은 NADH를 포함할 수 있다. 또한, 상기 기질은 당 등의 유기물질을 포함하는 것 일 수 있다.
본 발명에 미생물연료전지(Microbial fuel cell; MFC)는 생물 또는 그의 일부를 사용하여 생물의 에너지 대사에서 발생하는 환원력을 전기에너지로 전환하는 장치로서, 본 발명의 쉬와넬라 형질전환체를 포함하는 미생물 연료전지는 통상의 미생물 연료전지의 구조에 적용될 수 있다. 참고로서 한국특허출원 제10-2008-0079847호는 참조로서 본 특허에 삽입된다.
미생물연료전지는 전기화학적 활성 미생물(electrochemically active bacteria 또는 EAB)을 이용하며 이 미생물들은 먹이로부터 전자를 얻어서 전극으로 직접 전달하는 능력을 갖는다. 이때 전극에 모인 전자를 전기에너지로 사용할 수 있다.
전기화학적 활성 미생물로부터 전기를 생산하는 방법은 다음과 같다. 미생물은 생존과 번식을 위해 필요한 에너지를 얻기 위해 먹이를 섭취 후 분해하는 과정에서 전자를 얻는다. 이때 얻은 전자를 전자 전달자(예를 들어 NADH)에게 맡겨두는 방식으로 에너지를 저장할 수 있다. 이 전자 전달자는 높은 에너지 레벨을 가지는데, 세포벽의 더 낮은 에너지 레벨을 가지는 곳으로 전자를 전달해 주면서 에너지를 만들며, 본 발명의 벡터를 포함하는 쉬와넬라 형질전환체는 표면에서 단백질을 발현하여 더 효과적으로 전자를 공여할 수 있으므로 미생물 연료전지 또는 전기생산의 효율을 더욱 높일 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 벡터로 형질전환된 쉬와넬라 속 미생물을 기질에서 배양하여 전기를 생산하는 방법 또는 기질의 대사과정에서 발생하는 전자를 외부 금속 이온에 전달하여 외부 금속이온을 환원시키는 방법을 제공한다.
상기 금속이온에 대한 구체적인 종류는 제한이 없으나, 구체적인 예로 기 금속이온은 Mn(VI), Fe(III), Cr(VI),또는 U(VI)일 수 있다.
본 발명의 명세서에서 반복된 설명을 피하기 위해서 발현 벡터; 형질전환체; 형질전환방법; 미생물연료전지; 전기 생산용 조성물 및 전기 생산방법에 각각에 기재된 설명은 각 카테고리에 서로 준용되는 것으로 해석된다.
본 발명의 벡터 시스템은 대장균에만 적용되었던 표면 발현 시스템의 한계를 극복하고, 쉬와넬라 속 미생물에도 적용될 수 있다는 점에서 큰 의의가 있고, 미생물을 이용한 단백질 생산, 연료전지, 재생 등의 다양한 산업분야에서 효과적으로 활용될 수 있다.
이하, 본 발명을 제조예 및 실험예를 통해 상세히 설명한다. 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들에 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
<실험의 준비 및 방법>
1. 균주 및 플라스미드의 준비
플라스미드 구축을 위한 클로닝 호스트로서 E. coli DH10B를 사용하였고, 세포 표면 상에 단백질을 발현하기 위한 실험을 표시하기 위한 시험을 실시하였다. 단백질의 세포질 과발현을 위해 E. coli BL21(DE3) Codon Plus RIL host(Agilent Technologies, USA)와 변형된 pET21a 벡터 시스템을 사용했다. 이종 유전자를 전달하기 위한 박테리아 접합 시험에는 호스트로 E. coli BW19851를 사용하였다. 모든 E. coli 세포를 Luria-Bertani(LB) 배지(BD Difco, USA)에서 37℃, 180rpm 속도의 회전식 진탕 기에서 배양하였다. S. oneidensis MR-1은 암피실린(100 ㎍/ml)을 첨가 한 것을 제외하고는 E. coli와 동일한 조건으로 LB 배지에서 30℃로 배양하였다. 구체적으로 실험에 사용한 박테리아 균주, 플라스미드 및 PCR 프라이머는 표 1 내지 표 3에 나타낸 바와 같다.
균주 종류 설명 비고
E. coli DH10B F-Φ80lacZ△M15 △(lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17(rk-, mk+) phoA supE44 thi-1 gyrA96 relA1 λ- Invitrogen
E. coli BW19851 RP4-2(Km::Tn7,Tc::Mu-1) △uidA3::pir+ recA1 endA1 thiE1 hsdR17 creC510 CGSC
E. coli BL21-CodonPlus (DE3) - RIL E. coli B F- ompT hsdS(rB-mB-) dcm+ Tetr gal λ (DE3) endA Hte [argU ileY leuW Camr] Agilent Technology
S. oneidensis MR-1
플라스미드 종류 설명
pET21a vector Vector for over-expression
pBBR1MCS2 vector Backbone vector for constructing p12CYL vector
p12CYL pBBR1MCS2 vector carrying YfaL gene with constitutive promoter
pET21a-YM01-3 pET21a vector for over-expressing β-agarase YM01-3, expression in the cytoplasm
p12CYL-YM01-3 p12CYL carrying β-agarase YM01-3 gene, surface display of β-agarase YM01-3
p12CYL-Amy13B p12CYL carrying Amy13B gene
p12CYL-Amy13D p12CYL carrying Amy13D gene
p12CYL-Aga16B p12CYL carrying Aga16B gene from S. degradans
p12CYL-Aga50D p12CYL carrying Aga50D gene from S. degradans
p12CYL-Cel5F p12CYL carrying Cel5F gene
p12CYL-Cel5G p12CYL carrying Cel5G gene
p12CYL-Cel5H p12CYL carrying Cel5H gene
p12CYL-Cel5J p12CYL carrying Cel5J gene
p12CYL-Diaphorase p12CYL carrying NADH Cytochrome b5 reductase gene
프라이머 종류 서열 (5'-3')
Tagarase_F CGGTGTCGCGCCCTATGCAGCAGATTGGGATGGTG
Tagarase_R CGGTCGTTGGCCCCTGAAATTTCCACTGCTGATTATTAC
pB_Tagarase_F GGTGGCGGCAAAATCAAATATGCAGCAGATTGGGATGGT
pB_Tagarase_R GTTCTTCTCCTTTGCGCCCCTAAAACTGAAATTTCCACTGCTGATTATT
YfaL_gibson_F CTGATGGCTAGCTCAGTCCTAGGGATTATGCTAGCATGCGGATTATCTTTCTACGCAAG
YfaL_gibson_R ACGACCGGGTCGAATTTGCTTCAGTGATGATGGTGATGGTGC
pBBR1MCS2_gibson_F ACCATCACCATCATCACTGAAGCAAATTCGACCCGGTCGTC
pBBR1MCS2_gibson_R CGCATGCTAGCATAATCCCTAGGACTGAGCTAGCCATCAGACTGTTGTAATTCATTAAGCATTCTG
amy13B_F CGGTGTCGCGCCCGCAACCGAACAAAATCAATCTAGC
amy13B_R GGTTTTCGGTCGTTGGCCCAAAATCTACAATCGTGGCGTTTG
amy13D_F CGGTGTCGCGCCCCAACCGCGAACCGCGTTC
amy13D_R GGTTTTCGGTCGTTGGCCCAAAGCTTCCCGTTGGGTAC
amy16B_F CGGTGTCGCGCCCGATTGGGACGGAATTCCTGTC
amy16B_R CGGTCGTTGGCCCGTTGCTAAGCGTGAACTTATCTAG
aga50D_F CGGTGTCGCGCCCGGTGCAATTGGAGGTCTCGT
aga50D_R CGGTCGTTGGCCCTTTGCTGCCTAGCCTTTCGG
cel5F_F CGGTGTCGCGCCCGCAAATAACAGCGCCCCATC
cel5F_R CGGTCGTTGGCCCGCGTTTTTTAGCTTCTAGCATAAC
cel5G_F CGGTGTCGCGCCCGACGTAGCGCCGTTAACCG
cel5G_R CGGTCGTTGGCCCATAAGCACGAACTTTAACGTACTTAC
cel5H_F CGGTGTCGCGCCCGATGTAGCCCCGCTAACCG
cel4H_R CGGTCGTTGGCCCCCAGCTACCAAATTGCAGGG
cel5J_F CGGTGTCGCGCCCGACGTGCCAGCAATGTCCG
cel5J_R CGGTCGTTGGCCCGTGAATTGCCTCGACTTTTATCC
Diaphorase_F CGGTGTCGCGCCCAGCACACCGGCAATTACCCTG
Diaphorase_R CGGTCGTTGGCCCAAATGCAAAACAACGTTCTTTCGGATG

2. β- 아가레이즈 YM01-3의 클로닝 , 과발현 및 정제
E. coli DH10B의 변형된 pET21a 벡터로 β-아가레이즈 YM01-3 유전자(GenBank accession No. KF413621)를 클로닝하였다. 변형된 pET21a 벡터는 삽입 유전자의 N-말단에 6개의 히스티딘 태그를 가졌다. β-아가레이즈 YM01-3 유전자(pET21a-YM01-3)를 갖는 클론을 단백질 발현을 위해 E. coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL 세포(Aligent Technologies, USA)로 형질전환시켰다. E. coli 세포는 암피실린(100㎍/mL)이 첨가된 LB 배지에서 37℃, 180rpm으로 성장되었다. 600nm(OD600)에서 광 밀도가 0.5에 도달하면, 최종 농도 0.5 mM가 되도록 IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 첨가하고 세포를 16℃, 150 rpm에서 14-16 시간 동안 성장시켰다. 유도된 E. coli을 원심분리(3000 x g, 4℃, 20분)한 후 나머지 세포 펠렛을 25mM Tris-HCl(pH 7.5)에 재현탁하여 농축된 세포 혼합물(OD600 ~ 30)을 만들었다. 재현탁된 세포 펠렛 혼합물을 초음파 처리(1㎖의 농축된 세포 혼합물(OD600 ~ 30)에 대하여 200J, 총 초음파 처리 시간 20초, 4℃)하고 원심 분리(10,000 x g, 50분, 4℃)하여 파쇄하였다. 가용성 단백질을 포함하는 상등액을 히스티딘 친 화성 컬럼(HiTrap HP 1 mL; GE Healthcare, USA)에 놓았다. β-아가레이즈 YM01-3을 LP 시스템(Bio-Rad, USA)에서 이미다졸 선형 구배(0 내지 500mM)에 의해 용리하여 정제하였다. 정제된 단백질을 10% SDS-PAGE 겔에서 확인한 후 탈염시켰다.
3. 아가레이즈 활성 검사(요오드 염색, DNS 분석)
아가레이즈(agarase) 활성의 정성분석을 위해, 요오드 염색을 실시했다. 세포 콜로니를 스트라이킹시키고, LB 아가 플레이트상에서 최적 성장 온도(S. oneidensis: 30℃, E. coli: 37℃)로 3일 동안 배양하였다. 배양 후, 아가 플레이트를 요오드 용액(4% KI, 1.25% I2)으로 5 분 동안 염색 한 다음, 라이트 플레이트(light plate) 상에서 관찰하였다.
아가분해(agarolytic) 활성의 정량적 검증을 위해, 변형? DNS(3,5-dinitrosalicyclic acid) 분석을 사용했다. 모든 세포 또는 효소를 2%(w/v) 아가(Bacto Agar, Becton, Dickinson and Company, USA) 혼합물을 함유한 25mM Tris-HCl 완충액(pH 7.5) 100㎕에 재현탁하고 30℃에서 12시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 이후, 1%(w/v) DNS 100㎕를 아가 혼합물에 첨가하고 10분 동안 끓였다. 환원당 농도를 검출하기 위해, 분광계(Synergy HT, Biotek, USA)를 사용하여 575nm에서의 흡광도를 측정하였다.
4. 표면 발현 벡터 p12CYL의 구축
PCR을 통해, pBBR1MCS2 벡터의 Lac 프로모터 및 다중 클로닝 사이트(MCS)를 제거하였고, 나머지 부분을 증폭시켰다. PCR 산물은 깁슨 어셈블리(Gibson assembly)의 골격벡터로 사용되었다. 삽입유전자 단편으로, pATLIC 벡터로부터 YfaL 유전자를 PCR 증폭시키고, 상시 발현 프로모터(iGEM part#: Bba_J23113)가 프라이머에 삽입되었다. 깁슨 어셈블리의 모든 프라이머는 동종의 쌍(pair) 영역을 갖는다(표 3). 깁슨 어셈블리 방법을 사용하여 골격벡터와 Pcon-YfaL 유전자 단편을 결합시키고 발현 벡터를 만들었고 최종 생성물을 p12CYL(p: 플라스미드, 12: pBBR1MCS2, C: 상시 프로모터, YL: YfaL)로 명명하였다. 깁슨 어셈블리의 경우 깁슨 어셈블리® 마스터 믹스(NEB, 영국)를 사용하였고, 설명서의 지침을 따랐다.
p12CYL 시스템은 카나마이신 내성을 가지며 박테리아 접합을 통해 수평 유전자 전달이 가능하다. 또한 라이게이션 독립적인 복제를 위한 SmaI 제한 사이트를 포함하고 있다(도 1).
5. p12CYL 시스템에서 다양한 단백질의 클로닝 및 발현
세포 표면에 POI를 상시적으로 발현하기 위해 p12CYL 벡터에 목표 유전자를 클로닝하였다. 복제 방법으로 LIC(Ligation Independent Cloning)를 사용했습니다. 선형화된 LIC 준비 벡터를 제조하기 위해, p12CYL 및 변형된 pET21a 벡터를 SmaI 제한효소(영국, NEB)로 처리하였다. 삽입 유전자로서, pfu DNA 중합효소(NEB, United Kingdom)를 이용하여 목표 유전자를 증폭시켰다. 삽입 유전자는 LIC 클로닝 영역과 중첩되는 오버행(overhang)을 갖는다(프라이머는 표 3에 기재). 선형화된 LIC 준비 벡터(ready vector)를 T4 DNA 중합효소(NEB, United Kingdom)와 dATP(Promega, USA)로 20 분 동안 25℃에서 처리하였다. dTTP(Promega, USA)로 처리한 것 외에, PCR 산물을 동일한 반응 조건 하에서 T4 DNA 중합효소로 처리하였다. 벡터와 삽입 유전자를 1 : 2 몰비로 혼합하고 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. LIC 후, 클론을 E. coli DH10B로 화학적 형질전환시켰다. 모든 재조합 클론을 DNA 시퀀싱으로 확인하였다.
6. S. oneidensis MR - 1에 대한 형질전환 방법(전기천공법, 접합법)
빠른 형진전환 방법으로, 전기천공법(electroporation)을 사용하였다. S. oneidensis는 항생제(암피실린 또는 리팜피신)가 함유된 LB에서 30℃에서 밤새 배양되었다. 종균 배양(starter culture)을 시작하기 전에, 밤새 배양된 배양물 1 mL를 원심 분리하여, 세포 펠렛의 색(핑크 레드)을 확인하였다. 전기-컴피턴트(competent) 세포의 초기 또는 중간 로그기를 만들기 위해, 밤새 배양한 혼합물을 항생제를 함유 한 LB로 1 내지 100배 희석하고, 600nm에서의 광학밀도가 0.5가 될 때까지 배양하였다. 2차 종균 배양을 위해, 1차 종균 배양물을 다시 1 내지 100 희석 배율로 LB 배지로 희석하고 600nm에서의 광학밀도가 0.25가 될 때까지 배양하였다. 2차 종균 배양의 세포를 3,000 x g에서 15분간 원심분리하여 수확하였다. 원심분리 중, 콜드 쇼크를 피하기 위해 온도는 30℃로 유지되었다. 수확된 세포를 1M 소르비톨 200㎕로 2회 세척하였고, 모든 세척 단계에서 4,000 x g 속도로 1분간 원심분리를 가했다. 세척 후, 수확된 세포 펠릿을 1M 소르비톨(OD600 ~ 20)에 재현탁시켰다. 150ng 내지 200ng의 플라스미드를 50㎕의 전기-컴피턴트 세포에 첨가하고 실온에서 GenePulseXcell(Biorad)의 1mm 큐벳을 사용하여 1300V, 220Ω, 25μF를 가했다. 500㎕의 LB를 즉시 첨가 한 후 30℃, 180rpm에서 2시간 동안 배양하였다. 회수된 세포를 선별 마커가 있는 LB 아가(1.5% 아가)에 도말하고 30℃에서 인큐베이션하였다. 평균 형질 전환 효율은 1.3 x 103CFU/㎍이었다.
전기청공법에 대안적인 형질전환 방법으로서 접합법을 사용하였다. 접합법에서, E. coli BW19851 및 S. oneidensis MR-1을 각각 공여 및 수여 세포로 사용하였다. 37℃, 180rpm에서 항생제(카나마이신, 최종 농도 50㎕/mL)와 함께 형질전환된 공여 세포를 배양하였다. 하루 밤 동안 수용 세포의 콜로니 배양은 암피실린(100 ㎕/mL 최종 농도) 또는 리팜피신(50 ㎕/mL 최종 농도)을 함유한 LB에서 30℃, 180rpm으로 준비하였다. 배양물을 세척하고, 25mM Tris-HCl(pH 7.5)에 재현탁시켰다. 공여세포와 수여세포를 1 : 1 비율의 세포수로 혼합하고, 상기 세포 혼합물 5㎕를 LB 아가 평판에 넣고 30℃에서 30시간 동안 배양하였다. 단일의 접합된 수여세포 콜로니를 분리하기 위해, 연속 희석을 실시하였고, 플라스미드와 S. oneidensis MR-1 둘 모두를 선택하기 위해 2개의 항생제(카나마이신 및 리팜피신)를 함유하는 LB 아가에서 인큐베이션하였다.
7. 생존 가능한 세포 수 계수
신뢰할 수 있는 정량분석을 위해서, 선택 조건에서 생존 가능한 세포 수를 측정하는 것이 중요합니다. p12CYL-β-agarase YM01-3을 형질 전환시킨 후, 12시간 동안 콜로니 배양하고 25mM Tris-HCl(pH 7.5) 완충 용액으로 OD600 ~ 1.0에 상당하는 세포 혼합물을 희석시켰다. 단일 콜로니를 분리하고 세포 수를 세기 위해, 세포 혼합물을 항생제(카나마이신 50 ㎍/mL)가 함유된 LB 아가(1.5% 아가)에 1 : 104 내지 1 : 107 희석 비율로 연속 희석하여 도말했다. 선택적 세포 배양 조건(OD600 = 1.0, 1 mL)에서, S. oneidensis와 E. coli의 생존 세포 수는 각각 2.28x107과 6.27x107이었다.
8. CSD 검출을 위한 차동 세포 분획( Differential cell fractionation )
Li et al(11)에 의해 기술된 변형된 차동 세포 분획 방법을 사용했다. 단백질을 발현하는 세포를 수집하고 8x106 세포/㎕로 희석하여, 세척한 후, 25mM Tris-HCl(pH 7.5) 12mL 재현현탁시켰다. 전체 세포 시료는 초음파 처리 전에 수집되었다. 세포 현탁액은 초음파 처리하여 용해시켰다(5 초 초음파 처리, 15 초 휴식, 50% 진폭(~ 33 와트), 총 초음파 처리 시간 90초). 총 세포 추출물 시료는 초음파 처리 후 수집되었다. 초음파 처리된 전체 세포 용해물을 10,000 x g에서 15분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 원심분리 후, 펠렛 및 상등액을 파쇄되지 않은 세포(unbroken cell)/큰 찌꺼기(large debris) 및 맑은 세포 용해물(clarified cell lysate)로 각각 샘플링하였다. 맑은 세포 용 해물을 초원심분리기(Optima L-90K, Beckman)를 사용하여 100,000 x g에서 1 시간 동안 원심분리하였다. 생성된 상등액을 총 용해성(세포질 및 주변질) 분획으로 수집하였다. 나머지 펠릿을 25 mM Tris-HCl(pH 7.5) 완충액 10 mL로 세척하여 세포막에 존재하지 않는 단백질을 제거하였다. 세척 후, 펠렛을 25mM Tris-HCl(pH 7.5) 완충액에 재현탁시켰다. DNS 분석에서 각 분획 샘플의 동일한 부피(50 ㎕)로 아가분해 활성(agarolytic activity) 수준 측정에 사용했다. 1 x 세포 밀도를 약 6.66x105세포/㎕로 정의했다. 모든 분획 샘플은 총 막 분획을 제외하고 1 x 세포 밀도로 제조하였다.
1 x 세포 밀도 조건에서, 전체 막 분획으로부터의 아가분해 활성은 적절한 검출 범위(A575 = 0.1 미만)에 있지 않았다. DNS 분석에서 신뢰할 수 있는 검출 범위의 결과를 얻기 위해 전체 막 분획을 보다 높은 농도(12 x 세포 밀도 ~ 약 8x106 세포/㎕)로 준비했다.
9. TEV 프로테아제에 의해 표시된 단백질의 조절된 방출
β-아가레이즈 YM01-3을 발현하는 8x109 세포는 최적 성장 온도에서 12시간 동안 150rpm의 진탕 속도로 인큐베이션된 후에 수집되었다. 수집된 세포를 50U의 TEV 프로테아제를 함유하는 1mL 반응 혼합물(25mM Tris-HCl, pH 7.5)에 재현탁시켰다. 반응 혼합물을 25℃에서 6시간 동안 인큐베이션하였다. TEV 프로테아제를 처리한 후, 무-세포 상등액과 세포 펠렛은 10,000 x g에서 20분간(4℃) 원심 분리 한 후 채취하였다. 수집된 상층액 및 펠렛에 대해 아가분해 활성을 확인하였다.
10. 발현된 아가레이즈 , 아밀라아제 및 셀룰라아제의 기능 분석
다양한 효소의 기능적 활성을 조사하기 위해, 42 내지 88.6kDa의 다양한 크기의 단백질, 아가로오즈(Aga16B, Aga50D)17, 아밀라아제(Amy13B, Amy13D) 18 및 셀룰라아제(Cel5F, Cel5G, Cel5H, Cel5J)19를 발현시켰다(표 4).
효소 기능 크기(kDa)
Amy13B α-amylase 65.6
Amy13D α-amylase 62.3
Aga16B Endo-agarase 64.5
Aga50D Exo-agarase 88.6
Cel5F Endo-glucanase 42
Cel5G Endo-glucanase 67.9
Cel5H Endo-glucanase 66.9
Cel5J Endo-glucanase 65.2
모든 세포는 목표 단백질의 활성을 시험할 때까지 2일 동안 인큐베이션되었다. 아가레이즈 활성을 검출하기 위해, 아가레이즈를 발현하는 세포를 증류수(DW)로 세척한 다음 요오드 용액(4% KI, 1.25% I2)으로 5 분 동안 염색하였다. 아밀라아제 활성을 시험하기 위해, 세포를 0.5% 가용성 전분을 함유하는 LB 아가 평판에서 배양한 다음 요오드 용액으로 염색하였다. 셀룰라아제의 경우, 0.5% CMC(Carboxymethylcellose)를 함유한 LB 아가에서 세포를 성장시켰다. 배양 후, LB 아가 플레이트를 0.1% 콩고 레드 용액으로 30분 동안 염색하였다. 이어서, 플레이트를 DW로 세척하고 1M NaCl을 첨가하고 5분 동안 방치하였다. 마지막으로, 플레이트를 DW로 다시 세척하고 5% 아세트산을 5분 동안 처리하고 플레이트의 색상을 확인하였다. 모든 세포를 최적 성장 온도에서 48 시간 동안 배양하였다.
11. 다양한 성장 단계에서의 표면 표시 효율 시험
β-아가레이즈 YM01-3을 발현한 모든 세포를 카나마이신을 합유하는 LB 배지에서 30℃, 180rpm으로 배양하였다. 1시간마다 배양 세포 샘플(OD600 ~ 1.0에 상당)을 채취하여 원심분리하여 세포 펠릿을 제조하였다. 채취된 세포 펠릿을 2% 아가(25mM Tris-HCl, pH 7.5) 용액 100㎕에 현탁시키고, 30℃에서 2일간 인큐베이션하였다. 배양 후 DNS 분석을 실시했다.
<시험 결과>
1. Shewanella oneidensis MR -1의 표면 발현을 위한 벡터 디자인
Shewanella oneidensis에서 작동하는 표면 발현 시스템을 구축하기 위해, 골격벡터의 소스를 선택하기 위한 2 가지 기준을 고려했다. Shewanella oneidensis에서 일할 때, 광범위한 숙주 범위의 복제 기점이 바람직했다. 본 발명의 시스템은 형질전환이 전기천공에 의해 성공하기 어려운 형질전환 케이스를 해결하기 위해서 접합법을 통해 수평적 유전자 전달도 가능하게 한다.
최종적으로, oriV와 mob 유전자를 모두 사용하기 위해 pBBR1MCS2를 선택했다. 세포 표면 발현을 위한 스캐 폴드 단백질로서, 세포에 해로운 영향을 미치지 않으면서 다양한 이종 단백질을 발현하는 것으로 알려진 YfaL 오토트랜스포터를 추가했다. 또한, 발현된 단백질을 쉽게 관리하고 방출을 조절하기 위해서 상시적 프로모터 및 TEV 프로테아제 절단 부위를 추가하였다(도 1 및 도 2)
2. 표면 발현 리포터로서 아가라아제 발현 확인
해양 박테리아 Catenovulum agarivorans YM01T 유래의 β-아가레이즈가 활성이 높다고 알려져 있고(Vmax 값: 1.14 x 104 U mg-1), E. coli 및 S. oneidensis의 세포 배양 조건 하에서도 활성을 갖는다고 알려져 있는 β-아가레이즈 YM01-3로 실험을 수행하였다20. 우리는 β-아가레이즈 YM01-3의 높은 아가분해 활성이 표면 발현 활성의 민감한 검출을 가능하게 한다고 가정했다. 아가레이즈를 표면 발현 연구에 사용하기 전에 질적 및 양적 특성을 테스트하는 단계가 필요했다. 이전의 연구에서, β-아가레이즈 YM01-3 활성의 최적 조건은 pH 6과 60℃로 알려져 있다20. 그러나 세포 배양 조건에서 아가분해 활성을 시험하기 위해, pH 7.5, 30℃에서 12시간의 반응조건을 적용하였다. 요오드 염색 분석에서, β-아가레이즈 YM01-3을 과발현하는 E. coli는 세포 수준에서 아가 분해 활성을 보였다(보충 그림 2A). 또한, 세포질 내 기능성 단백질을 포함하는 가용성 분획도 동일한 아가분해 활성을 보였다(보충 그림 2B). 정성 분석 후, β-아가레이즈 YM01-3(보충 그림 2C)을 정제하고 정량적 특성을 연구하기 위한 DNS 분석을 수행했다.
DNS 분석 결과를 토대로 아가분해 활성을 측정한 결과, 1㎍의 정제 β-아가레이즈 YM01-3은 반응 조건(30℃, 12h) 하에서 891.68㎍의 아가분해 산물을 생산하였다.
3. CSD 입증을 위한 차동 세포 분획.
아가는 다당류 아가로오스에서 유래한 것으로 그람 음성 세포 외막을 통과 할 수 없다. E. coli 및 S. oneidensis MR-1 야생형은 아가 분해능을 갖지 않는다. 우리는 박테리아가 아가레이즈를 발현하면, 총 세포막 분획에서 아가분해 활성을 보일 것으로 가정하였다.
표면 발현 활성을 설명하기 위해, β-아가레이즈 YM01-3을 발현시켰고, 세포 분획 실험을 실시하였다. 아가분해 활성을 확인하기 위해 (i) 정성 분석을 위한 요오드 염색(도 3)과 정량분석을 위한 DNS 분석(도 4)을 수행했다.
정성 분석에서, 2개의 대조군(숙주 만; 벡터 만)은 어떠한 아가분해 활성도 나타내지 않았다. 우리는 β-아가레이즈 YM01-3을 발현하는 세포 만이 아가분해 활성을 나타냄을 확인했다.
세포 분획 실험에서, 전체 세포 상태와 총 세포 추출물 상태 간에는 아가 분해 활성 수준의 차이가 없다는 결과를 예상하였으나, 총 세포 추출물이 E. coli과 S. oneidensis 모두에서 전체 세포 상태보다 약 2 배 높은 아가분해 활성을 보였다. 이는 세포 내부에 존재하는 아가레이즈가 세포 외 공간으로 빠져 나가는 것이 가능할 것이다.
세포에서 아가레이즈의 위치와 비율을 조사하기 위해, 6개의 다른 분획물(전체 세포, 총 세포 추출물, 용해물, 펠렛, 막, 총 가용성부)을 시험하였다(도 4). 각 분획의 아가분해 활성을 계산하기 위해, 0 시간 반응에서의 활성 수준 값에서 12 시간 반응에서의 활성 수준 값을 뺐다. 펠렛 부분(세포 파편 및 사균)을 제외하고는, 다른 분획에서 아가분해 활성의 증가가 관찰되었다. 총 아가레이즈 활성에서, S. oneidensis 및 E. coli는 멤브레인 부분에서 각각 10.6% 및 5.9%의 비율로 아가레이즈 활성을 갖는다. 잔여 아가레이즈 활성은 전체 가용 분획에서 모두 발견되었으며, 아가레이즈의 대다수(> 90 %)가 세포 내부에 존재 함을 확인했다. 막 분획과 비교하여, 전체 세포 분획은 보다 높은 아가분해 활성을 나타내었다. 죽은 세포에서 일부 탈락한 아가레이즈는 전체 세포 부분에서 추가의 아가분해 활성을 보이게 했다.
아가 분해의 총량의 측면에서, S. oneidensis는 E. coli보다 2.5 배 높은 아가레이즈 활성을 보였다. 특히, S. oneidensis의 막 부분은 E. coli보다 4.3 배 높은 아가레이즈 활성을 보였다. 이러한 결과를 종합 해 볼 때, S. oneidensis가 세포막에 아가레이즈를 발현할 수 있으며 E. coli보다 높은 발현 활성을 나타냄을 알 수 있다.
4. 표면 발현
β-아가레이즈 YM01-3은 46.87kDa에 해당하는 420개의 아미노산으로 이루어져있다. 이 단백질 분자의 질량은 약 1.0x10-13 ㎍이다. 이 값을 이용한 1㎍의 β-아가레이즈 YM01-3에서 단백질의 수는 1.29x1013이다. 막 분획으로부터 아가레이즈 활성 수준을 바탕으로 세포 표면에 발현된 단백질의 수를 계산했다. 발현된 β-아가레이즈 YM01-3의 수는 S. oneidensis에서 1160 및 E. coli에서 270이었다. 이 수치는 S. oneidensis와 E. coli 각각에서 세포 표면 면적의 0.3%와 0.1%에 해당한다.
5. 표시된 단백질의 제어된 일정한 방출
p12CYL 표면 발현 시스템에서, TEV 절단 부위는 운반체(translocator) 도메인과 발현된 단백질 사이에 삽입되었다(도 2). 이 디자인은 TEV 프로테아제를 처리하여 발현된 단백질이 방출될 수 있도록 허용했다. TEV 프로테아제를 처리하기 전에, 세포-존재 펠릿 부분에서 아가레이즈 활성을 검출하였다. TEV 프로테아제를 처리한 후, 무-세포 상등액에서 대부분의 아가레이즈 활성이 검출되었다. TEV 프로테아제 처리 그룹에서 무-세포 상등액으로부터의 아가레이즈 활성이 비처리 그룹에서 세포-존재 펠릿보다 증가된 아가레이즈 활성을 나타냄을 확인했다(도 4). 이 현상은 표면에 새롭게 발현된 단백질이 TEV 프로테아제 반응 조건(25℃, 6h) 하에서 TEV 프로테아제에 의해 지속적으로 방출된다는 것을 설명할 수 있다. 종합하여 보면, 발현된 단백질은 제어 가능한 방식으로 TEV 프로 테아제의 존재 하에서 지속적으로 방출될 수 있다.
6. S. oneidensis MR -1에 다양한 단백질을 발현 확인
p12CYL 시스템을 사용하여 다른 유형 및 크기의 단백질을 발현할 수 있는지, 해당 단백질이 활성을 갖는지 시험하였다. S. oneidensis의 p12CYL 시스템의 융통성과 다양성을 증명하는 것이 다양한 응용 분야의 가능성을 열 수 있다는 점에서 중요하다.
2 가지 기준에 따라 8 가지 단백질을 선택했다:
첫째, 단백질은 표적 유기체에서 보이지 않는 활성을 가져야 한다.
둘째, 정성분석이 가능한 단백질 활성 검사 방법이 확립되어야 한다.
여러 단백질을 검사했기 때문에, 검출 방법은 비색 분석법을 기반으로 했고, 과는 짧은 시간 내에 확인되었다(10분 미만).
이러한 기준을 바탕으로, 2개의 아밀라아제, 2개의 아가레이즈 및 4개의 셀룰라아제(표 4)를 발현시키고, 테스트 하였다. 단백질 크기는 42 kDa에서 88.6kDa로 다양했다. 최적 성장 온도(E. coli: 37℃, S. oneidensis: 30℃)에서, 8 개의 단백질 중 7 개의 단백질이 두 균주 모두에서 활성을 보였다. 염색되지 않은 부위의 크기에 기초하여, 우리는 상대 활동 수준을 추정 할 수 있었다(도 6a 및 도 6b). 두 균주 모두 Amy13B의 활성을 나타내지 않았고, 다른 단백질은 상대적으로 강하거나 약한 활성을 보였다. 이러한 현상은 다른 세균 종에서 다른 전사/번역 시스템, 또는 코돈 최적화 문제와 같은 이유 때문에 발생할 수 있다고 생각했다. 종합하면, 이 결과는 E. coli와 S. oneidensis가 p12CYL 시스템을 적용하여 다양한 크기와 다양한 기능을 가진 단백질을 표면에 발현할 수 있음을 의미한다.
7. 표면 발현 효율 및 성장 단계
12시간 시점(도 3)과 다양한 시점(데이터가 표시되지 않음)에서의 요오드 염색 결과를 바탕으로, S. oneidensis가 E. coli보다 빠르고 더 높은 표면 발현 효율을 가질 수 있다고 가정했다. 세포 성장 및 유전자 발현은 조절될 수 있고, 단백질 발현은 세포 성장과 관련된다. 따라서 다른 성장 단계에서 다른 패턴의 표면 발현 수준을 보여주는 것이 가능할 것이다. 이러한 가설을 증명하기 위해서는 성장 단계에 따른 표면 발현 효율의 정량화를 실시하였다.
그 결과, S. oneidensis는 초기 성장 단계(OD600 ~ 0.2)에서 최대 효율을 보였으나, E. coli는 OD600 ~ 1.5에 도달했다(도 7a 및 도 7b). 또한, 48시간의 배양은 발현 효율의 최대 수준을 변화시키지 않았고, 이는 E. coli 및 S. oneidensis에서 p12CYL 시스템의 안정성을 입증하는 것이다.
8. NADH cytochrome b5 reductase 표면발현 및 추가 전기 생성능력 확인
S. oneidensis MR-1가 가진 전기생성 능력을 향상시키기 위해 NADH cytochrome b5 reductase를 표면발현 하였다. 기질인 NADH가 NADH cytochrome b5 reductase에 의해서 산화되면 2개 전자를 생성하게 된다. 이를 정량적으로 측정하기 위해 DCIP(Dichlorophenolindophenol) 검사를 실시했다. 표면발현 한 세균(OD600=1.0, 2mL)을 원심분리한 후 상등액을 버리고 25mM Tris-HCl(pH7.5)용액 50㎕에 재부유했다. DCIP 반응 용액(50mM Tris-HCl: 750㎕, 6mM NADH: 100㎕, 20mM DCIP: 100㎕, 세포부유액: 50㎕)을 만들고 시간별로 600nm 흡광도를 측정했다. 표면 발현된 효소가 기질인 NADH를 산화하면서 나오는 전자는 DCIP를 환원하게 되며, 600nm 흡광도 감소로 이어진다. 감소하는 정도를 그래프상 기울기로 표현하여 세균시료의 DCIP 환원 능력을 측정했다(도 8).
S. oneidensis MR-1가 기본적으로 가진 전기 생산량을 확인하기 위해 대조군으로 S. oneidensis MR-1를 설정하였고, YfaL 오토트랜스포터가 가질 수 있는 전기 생성 효과를 확인하기 위해 YfaL 오토트랜스포터만 발현하는 S. oneidensis MR-1를 대조군으로 설정했다. 측정결과를 토대로 전기발생량을 이론적으로 계산하였으며, NADH cytochrome b5 reductase를 표면 발현한 S. oneidensis MR-1 세균 한 개는 대조군보다 1.14pA 추가 전기를 생성했다.
전극 표면상 반응을 확인하기 위해 전기화학적 검증법 중 하나인 순환전압전류법(Cyclic voltammetry)을 실시하였다. 전압-전류 그래프(도 9a 및 9b)를 통해 NADH cytochrome b5 reductase가 발현된 S. oneidensis MR-1 만이 NADH를 산화시킴과 동시에 전류를 생성하였다. 도 9a 및 9b을 보면 매개체(Mediator) 첨가와 함께 NADH의 표준산화환원 전위 값(-0.28V)과 산화환원 피크(peak)가 증가하기 시작하는 전위 값(약 -0.25V)이 거의 일치한다. 이는 생성되는 전류가 표면 발현된 NADH cytochrome b5 reductase가 NADH를 산화해서 나타나는 현상임을 의미한다.
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<400> 2 Met Arg Ile Ile Phe Leu Arg Lys Glu Tyr Leu Ser Leu Leu Pro Ser 1 5 10 15 Met Ile Ala Ser Leu Phe Ser Ala Asn Gly Val Ala Pro Gly Pro Thr 20 25 30 Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Leu Ser Asn Val Thr Val Asn Gly Asn 35 40 45 Leu Thr Asn Thr Ser Gly Ala Val Ser Leu Gln Asn Gly Val Ala Gly 50 55 60 Asp Thr Leu Thr Val Asn Gly Asp Tyr Thr Gly Gly Gly Thr Leu Leu 65 70 75 80 Leu Asp Ser Glu Leu Asn Gly Asp Asp Ser Val Ser Asp Gln Leu Val 85 90 95 Met Asn Gly Asn Thr Ala Gly Asn Thr Thr Val Val Val Asn Ser Ile 100 105 110 Thr Gly Ile Gly Glu Pro Thr Ser Thr Gly Ile Lys Val Val Asp Phe 115 120 125 Ala Ala Asp Pro Thr Gln Phe Gln Asn Asn Ala Gln Phe Ser Leu Ala 130 135 140 Gly Ser Gly Tyr Val Asn Met Gly Ala Tyr Asp Tyr Thr Leu Val Glu 145 150 155 160 Asp Asn Asn Asp Trp Tyr Leu Arg Ser Gln Glu Val Thr Pro Pro Ser 165 170 175 Pro Pro Asp Pro Asp Pro Thr Pro Asp Pro Asp Pro Thr Pro Asp Pro 180 185 190 Asp Pro Thr Pro Asp Pro Glu Pro Thr Pro Ala Tyr Gln Pro Val Leu 195 200 205 Asn Ala Lys 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His Ser Glu Trp Arg Thr Ala Val His Val Ile Pro Thr 420 425 430 Leu Asp Leu Asn Tyr Tyr His Asp Pro His Ser Thr Glu Ile Glu Glu 435 440 445 Asp Gly Ser Thr Ile Ser Asp Asp Ala Val Lys Gln Arg Gly Glu Ile 450 455 460 Lys Val Gly Val Thr Gly Asn Ile Ser Gln Arg Val Ser Leu Arg Gly 465 470 475 480 Ser Val Ala Trp Gln Lys Gly Ser Asp Asp Phe Ala Gln Thr Ala Gly 485 490 495 Phe Leu Ser Met Thr Val Lys Trp His His His His His His 500 505 510 <210> 3 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Bba_J23113 promoter <400> 3 ctgatggcta gctcagtcct agggattatg ctagc 35 <210> 4 <211> 999 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 4 atggcggcat acgcgatcat gcgatgcaag aagctggcga aaatgggcaa cgtggcggcc 60 agtctcaagc acgcctaccg cgagcgcgag acgcccaacg ctgacgccag caggacgcca 120 gagaacgagc actgggcggc cagcagcacc gatgaagcga tgggccgact gcgcgagttg 180 ctgccagaga agcggcgcaa ggacgctgtg ttggcggtcg agtacgtcat gacggccagc 240 ccggaatggt ggaagtcggc cagccaagaa cagcaggcgg cgttcttcga gaaggcgcac 300 aagtggctgg cggacaagta 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Glu Ala Trp Asp Tyr Ser Gln Gly Phe Val 210 215 220 Asn Glu Glu Met Ile Arg Asp His Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Pro 225 230 235 240 Leu Val Leu Met Cys Gly Pro Pro Pro Met Ile Gln Tyr Ala Cys Leu 245 250 255 Pro Asn Leu Glu Arg Val Gly His Pro Lys Glu Arg Cys Phe Ala Phe 260 265 270

Claims (17)

  1. 미생물의 세포 표면에서 발현되는 단백질을 코딩하는 목표 유전자;
    박테리아의 오토트랜스포터 단백질 코딩 유전자;
    pBBR1 또는 pMB1 복제 오리진; 및
    상기 오토트랜스포터 단백질 코딩 유전자에 작동 가능하게 연결된 상시 발현 프로모터를 포함하는 쉬와넬라 속(Shewanella sp.) 미생물의 세포 표면에서 단백질을 발현하기 위한 벡터.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 발현벡터는 pBBR1MCS2 벡터에서 Lac 프로모터 및 다중 클로닝 사이트(MCS)를 제거한 것을 골격벡터로 하는 것인, 쉬와넬라 속 미생물의 세포 표면에서 단백질을 발현하기 위한 벡터.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 벡터는 재조합 DNA 선별마커를 더 포함하는 것인, 쉬와넬라 속 미생물의 세포 표면에서 단백질을 발현하기 위한 벡터.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 벡터는 접합에 의하여 쉬와넬라 속 미생물을 형질전환하기 위해 mob 유전자를 더 포함하는 것인, 쉬와넬라 속 미생물의 세포 표면에서 단백질을 발현하기 위한 벡터.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 상시 발현 프로모터는 aga 프로모터, arcA 프로모터, lac 프로모터, cel 프로모터, xyn 프로모터, J23112 프로모터, J23103 프로모터, J23113 프로모터, J23109 프로모터, J23117 프로모터, J23114 프로모터, J23115 프로모터, J23116 프로모터, J23105 프로모터, J23110 프로모터, J23107 프로모터, J23106 프로모터, J23108 프로모터, J23118 프로모터, J23111 프로모터, J23101 프로모터, J23104 프로모터, J23102 프로모터 및 J23100 프로모터로 이루어진 군에서 선택된 것인, 쉬와넬라 속 미생물의 세포 표면에서 단백질을 발현하기 위한 벡터.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 오토트랜스포터는 신호 서열, 패신져 도메인, 링커 부위 및 오토트랜스포터 슈퍼패밀리 부위로 구성된 오토트랜스포터 단백질로부터 패신져 도메인 부위가 제거된 클로닝 부위를 가지는 것인, 쉬와넬라 속 미생물의 세포 표면에서 단백질을 발현하기 위한 벡터.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 오토트랜스포터 단백질은 NP_416736.1(YfaL), CBJ01870.1, ZP_07247471.1, YP_001459034.1, ZP_07121532.1, ZP_02999058.1, YP_003045352.1, EGB57147.1, EGB37260.1, ZP_07146751.1, ZP_07498247.1, ZP_07787684.1, YP_001724408.1, YP_003035675.1, ZP_03068365.1, Z P_07523028.1, ZP_07102820.1, EGB90124.1, YP_002403506.1, EFZ69526.1, YP_002293769.1, ZP_07590844.1, ZP_06662998.1, ZP_07135193.1, YP_001463580.1, ZP_07687541.1, ZP_03028301.1, BAI31473.1, ZP_03043348.1, ZP_07098380.1, Y P_002387709.1, NP_288807.1, EFW74417.1, BAI26434.1, ZP_07142137.1, BAI36814.1, YP_003078961.1, ZP_07614097.1, EFZ47577.1, ZP_06658169.1, ZP_07186279.1, EFX25099.1, ZP_06654172.1, ZP_02786344.1, EGC11783.1, EGB41107.1, ZP_02812144.1, ZP_02823402.1, ZP_07508510.1, ZP_02774656.1, YP_002413282.1, EFX30437.1, ZP_07619499.1, ZP_07518131.1, YP_001744429.1, YP_002408332.1, YP_002329881.1, NP_754661.1, YP_002398608.1, EGB75831.1, EGB51754.1, YP_541512.1, ZP_07175432.1, YP_670171.1, CAP76735.1, ZP_07624785.1, ZP_07503047.1, EFZ73335.1, ZP_07781748.1, ADN70533.1, ZP_03031601.1, ADR27681.1, ZP_07448816.1, ZP_02901808.1, YP_002382104.1, EGC06746.1, ZP_05431470.1 및 YP_004212039.1로 이루어진 군에서 선택된 하나인, 쉬와넬라 속 미생물의 세포 표면에서 단백질을 발현하기 위한 벡터.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 쉬와넬라 속 미생물은 쉬와넬라 오네이덴시스(Shewanella oneidensis) 및 쉬와넬라 퓨트리파시엔스(Shewanella putrefaciens)로 이루어신 군에서 선택된 것인, 쉬와넬라 속 미생물의 세포 표면에서 단백질을 발현하기 위한 벡터.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 벡터는 도 1의 개열 지도를 갖는 것인, 쉬와넬라 속 미생물의 세포 표면에서 단백질을 발현하기 위한 벡터.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 벡터에 의해 형질전환된 쉬와넬라 속(Shewanella sp.) 형질전환체.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 형질전환체는 시토크롬환원효소(cytochrome reductase) 단백질을 쉬와넬라 속 미생물의 세포 표면에서 발현하는 것인, 형질전환체.
  12. 쉬와넬라 속 미생물과 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 벡터를 접합시키는 것; 및
    상기 접합을 통해서 벡터 구조체가 도입된 쉬와넬라 속 형질전환체를 제조하는 것을 포함하는 쉬와넬라 속(Shewanella sp.) 미생물의 형질전환 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 형질전환체를 항생제 선별을 이용해서 분리하는 것을 더 포함하는, 쉬와넬라 속 미생물의 형질전환 방법.
  14. 제10항 또는 제11항의 쉬와넬라 속(Shewanella sp.) 형질전환체를 포함하는 미생물연료전지(microbial fuel cell;MFC).
  15. 제14항에 있어서,
    상기 형질전환체는 세포 표면에서 시토크롬환원효소(cytochrome reductase) 단백질을 발현하는 것인, 미생물연료전지(microbial fuel cell;MFC).
  16. 제10항 또는 제11항의 쉬와넬라 속(Shewanella sp.) 형질전환체; 및 상기 형질전환체의 기질을 포함하는 전기생산용 조성물.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 형질전환체는 세포 표면에서 시토크롬환원효소(cytochrome reductase) 단백질을 발현하는 것인, 전기생산용 조성물.
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