KR20200112199A - 대장암 선택적 항암 치료진단제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 하기 [화학식 1]로 표시되는 화합물을 포함하는 대장암 선택적 항암 치료진단제에 관한 것이다:
[화학식 1]

.

Description

대장암 선택적 항암 치료진단제{Anticancer theranostic compound having colorectal cancer specificity}

본 발명은 대장암에 대하여 선택성을 갖는 항암 치료진단제에 관한 것이다.

대장암(또는 직장암)은 암 관련 사망 원인 중 3위에 해당하는 암으로서, 유럽과 미국에서 매년 백만명이 넘는 환자가 발생하고 있다. 또한 대장암은 여성에게는 유방암 다음으로, 남성에게는 전립선 암과 폐암 다음으로 흔한 암으로 대장암의 발병 위험도는 대략 20분의 1이다. 일반적으로 대장(직장)에 국한된 암은 치료 가능하지만, 제대로 치료를 하지 않았을 경우, 가까운 림프절로 퍼져 다른 기관으로 전이될 수 있다. 대개 초기 단계에서는 외과 절제술과 화학요법으로 치료할 수 있으나, 대장암을 초기에 치료한 환자들 중 상당한 비율의 환자들에게는 오랜 시간이 지난 후에 50% 정도의 재발률과 함께 전이가 일어나기도 한다. 외과적 요법은 다리에 혈전 생성, 수술 부위 출혈, 주변 장기의 손상 등의 문제들이 생길 수 있다. 따라서, 대장암 치료에 더 효과적인 새로운 치료방법의 개발이 요구되고 있다.

항암제 시스템적 전달을 포함한 기존의 치료 전략들은 정상 세포와 종양세포를 구분하지 못하여 건강한 조직 또한 손상시킨다. 이런 심각한 문제를 해결하기 위하여 소형 분자 기반 약물 전달, 리포솜, 중합체 시스템, 앱타머, 무기 나노분자를 포함한 타겟팅 전달 요법 (targeted delivery systems)들이 개발되었다(비특허문헌 1). 성공적인 약물 전달 시스템을 만들기 위해서는 몇가지 조건을 만족해야 하는데, 그 조건들은 다음과 같다: 1. 종양세포에 특이적일 것. 2. In vivo에서 종양에 최대한 축적될 것 3. 고효율의 약물 방출 프로파일과 인접한 정상세포로의 최소한의 누출. 나노 약물 형성 (Nano formulation)은 흔히 종양체 내 느슨한 맥관을 최대한 활용하여 최대한의 축적을 할 수 있게 하는데, 이런 현상은 EPR 효과(enhanced permeability and retention effects, EPR)라 불린다. 하지만 이것은 종양의 혈관 신생(angiogenesis, vascularization) 상태에 크게 좌우된다는 문제가 있다. 지난 몇 년간 암 치료에서의 나노 약물은 종양에 과발현된 수용체에 특이적으로 결합하는 리간드와의 융합을 통해 더욱 발전하였다. 하지만, 효율적인 비용, 약동학, 질병에 의한 약물 형성을 포함한 정밀 의료의 궁극적인 목표를 실현하기 위해서는 넘어야 할 장애물들이 여전히 존재한다(비특허문헌 2). 이 지점에서 소형 분자 기반 진단/치료가 중요한 역할을 할 수 있다. 지난 20년간, 초기 진단, 바이오 이미징 및 치료를 위한 여러 소형 분자 기반 약물 전달 시스템이 개발되었다. 약물 전달 시스템에는 보통 특이적으로 암을 타겟팅 하는 부분과 약물 활성화를 촉발하는 부분이 실제 화학 요법을 위한 약물에 연결되어 있다. 약물 활성화를 위한 여러 자극-반응 방식들이 보고되었는데 그 방법에는 pH, 높은 효소 활성, 산화환원 상태, 빛, 온도 등이 있다. 약리경제학적 관점에서 적절한 타겟팅 단위체와 약물 활성화 방식은 암의 종류와 합성의 난이도에 따라 선정된다. 이것은 더 좋은 접근성과 유망한 약동학을 가진, 환자들에게 더 우수한 치료법을 확립할 수 있도록 하는 새로운 약물 전달 시스템의 동시 개발을 필요로 한다.

P.T. Wong, S.K. Choi, Mechanisms of drug release in nanotherapeutic delivery systems, Chem. Rev. 115 (2015) 3388-3432. J.I. Hare, T. Lammers, M.B. Ashford, S. Puri, G. Storm, S.T. Barry, Challenges and strategies in anti-cancer nanomedicine development: An industry perspective, Adv. Drug. Deliv. Rev. 108 (2017) 25-38.

본 발명에서는 대장암 세포에 고선택적으로 축적 및 활성화되어 약물을 방출함으로써 대장암을 효과적으로 치료 진단할 수 있는 항암 치료진단제를 제공하고자 한다.

본 발명은 상기 과제를 해결하기 위하여,

하기 [화학식 1]로 표시되는 화합물을 포함하는 대장암 선택적 항암 치료진단제를 제공한다:

[화학식 1]

.

본 발명에 따르면, 상기 화합물은 asialoglycoprotein(ASGP) 수용체에 의해 대장암 세포에 선택적으로 축적되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 따르면, 상기 화합물은 β-galactosidase에 의해 활성화되어 DOX를 방출하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 따르면, 정상 세포에 비해서 암 세포(특히 대장암 세포)에 대해서만 높은 선택성을 가지며, β-galactosidase에 의해 활성화됨으로써 약물 방출 효율이 현저히 향상될 뿐만 아니라, 약물이 축적되는 장소와 활성화 되는 위치를 동시에 모니터링 할 수 있는 항암 치료진단제를 제공하는바, 광범위한 소분자 암 화학치료제 개발에 새로운 접근 방법을 제시할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 [화학식 1]로 표시되는 화합물(Gal-Dox)의 화학적 구조, 형광 반응과 활성화 방식을 나타낸 것으로, A는 Gal-Dox의 화학적 구조를 나타내고, B는 Gal-Dox의 β-galactosidase(β-gal) 효소와의 분자적 결합을 나타내며, C는 β-gal 효소(1 U/mL)에 노출 후 Gal-Dox (10 μM)의 형광 증가(여기 파장 λ_{exc .} = 480 nm)를 나타낸다. D는 β-gal 작용 후 시간 의존적 형광 증가(10 μM, 1 U/mL 효소, 37 ℃)를 나타낸다. 이때, 형광 증가는 누적되는 Dox 방출과 직접적으로 관련되어 있다. E는 β-gal (1 U/mL)로 37 ℃에서 2시간 동안 처리된 Gal-Dox (10 μM)의 RP-HPLC 곡선을 나타낸다.
도 2는 asialoglycoprotein (ASGP) 수용체 매개 엔도시토시스를 통한 Gal-Dox의 표적화된 세포 흡수를 나타낸 것이다. HT-29, HepG, HeLa 세포주는 10 μM Gal-Dox와 2시간 동안 배양하였고, 4% paraformaldehyde로 고정되었으며, 핵(파란색)과 F-actin (초록색)을 시각화하기 위하여 각각 DAPI와 Alexa Fluor 488-Phalloidin 으로 대조염색하였다. Gal-Dox (붉은색)의 공초점 현미경 이미지들은 480nm의 여기 파장과 560~590nm의 방출 파장을 사용하는 레이저를 통해 수득하였다. 스케일바: 20 μm.
도 3은 β-galactosidase 매개 절단(cleavage)을 통한 Gal-Dox 활성화를 나타낸 것이다. (A)는 siRNA에 의한 β-gal 넉다운의 Western blot 분석 결과를 나타낸다. HT-29 세포를 β-gal siRNA (25 nM and 50 nM)로 48시간 동안 형질 감염시켰다. siRNA의 사일런싱 효과는 로딩 대조군으로서 anti-β-gal 항체와 β-actin 항체를 사용하여 western blot으로 분석되었다. (B)는 48시간에 걸친 β-gal에 대한 siRNA (50 nM)의 형질감염 후 HT-29 세포를 0.5시간 동안 10 μM Gal-Dox로 처리한 후 공초점 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸다. Filter sets: Doxorubicin (λ_ex: 480 / λ_em: 560~590), F-actin (λ_ex: 495 / λ_em: 518) 및 DAPI (λ_ex: 358 / λ_em: 461), Scale bar: 20 μm. (C)는 50 nM의 β-gal siRNA 형질감염 후 10 μM Gal-Dox로 처리한 HT-29 세포를 이용한 유세포 분석 결과를 나타낸다.
도 4는 HT-29 암세포주(A) 와 HeLa (B) 세포주에서 Gal-Dox의 항암 효과를 나타낸 것이다. 두 세포주는 모두 여러 농도의 Gal-Dox 와 Dox (양성 대조군)로 24시간 동안 처리하였다. 세포 생존율은 MTT 분석을 통해 확인하였다.
도 5는 HT-29 암 이종이식된 누드 마우스 내 Gal-Dox의 종양 표적 축적과 in vivo 항종양 활성을 나타낸 것이다. (A)는 Gal-Dox 처리된 HT-29 이종이식 누드 마우스의 in vivo 형광 이미징 결과이다. HT-29 피하 이종이식된 마우스에 5 mg/kg의 Gal-Dox를 정맥 주사하였고, Maestro in vivo imaging system을 이용하여 처리 48시간 후 in vivo 형광 이미지를 수득하였다. (B) Paraffin-embedded 종양 조직의 형광 이미지를 나타낸다. Scale bar: 20 μm. (C)는 다양한 그룹들에서 종양 성장 억제 분석 결과를 나타낸 것이다. HT-29가 이식된 마우스들에 생리 식염수, Dox 또는 Gal-Dox를 1일 2회 3mg/kg의 용량으로 정맥 주사하였다. 종양의 부피는 일주일에 두 번 측정하였다. 데이터는 평균±표준 오차로 표기하였다. *: P < 0.05 versus Dox; ***: P < 0.001 versus saline, Student's t test를 통해 결정. (D)는 36일 동안 Dox와 Gal-Dox 처리 후 종양 성장 억제를 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 β-galactosidase와 Gal-Dox 사이의 상호 작용에 상응하는 분해된 결합 자유 에너지를 나타낸다.
도 7은 금속(a) Na⁺ b) Mg^{2 +})과 결합 잔기 사이의 거리를 나타낸 것이다.
도 8은 Gal-Dox의 안정성 프로파일을 나타낸 것으로, 0 시간 및 24 시간 후 Gal-Dox의 역-HPLC 곡선(PBS 37 ℃에서 배양)이다.
도 9는 β-galactosidase (1U / mL)의 존재 또는 부재, 및 아미노산 (100μM), 다양한 티올 (각각 10mM) 및 반응성 산소 (ROS) (각각 200μM)를 비롯한 다양한 생물학적 분석 물(pH 7.4의 PBS (0.1 % DMSO)에 용해)들의 조건 하에 2 시간 인큐베이션 후, 590nm에서 Gal-Dox (5μM)의 형광 응답을 나타낸 막대그래프이다(470 nm에서 여기): 1) Gal-Dox only, 2) L-ascorbic acid, 3) L-Glutamic acid, 4) NADH, 5) Pepsin, 6) Esterase 7) L-Glutathione, 8) H₂O₂, 9) hypochlorite ion (OCl^-) 10) Gal-Dox + β-galactosidase.
도 10은 다양한 pH 범위에서 Gal-Dox 안정성을 나타낸 것이다. Gal-Dox (5 μM)를 다양한 시간동안 다양한 범위의 pH 용액에서 인큐베이션하고 형광을 측정 하였다.
도 11은 PBS에서 Gal-Dox (5uM)를 β-galactosidase (1U / mL)로 처리했을 때 방출 된 Dox의 ESI-MS 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 12는 HT-29 세포에서 Gal-Dox의 세포 형광 이미지를 나타낸 것이다. 세포를 Gal-Dox 10 μM로 0.5, 2, 4, 6, 12 시간 동안 처리하였다. Filter sets: Doxorubicin (Red λ_ex:480 / λ_em: 560~590) 및 DAPI (Blue, λ_ex:358 / λ_em:461) Scale bar: 20 μm.
도 13은 Gal-Dox로 처리 한 HT-20 세포와 리소좀의 공동 국부화(Co-localization)를 나타낸 것이다. 세포를 Gal-Dox 10 μM과 함께 2 시간 동안 배양 하였다. 그리고 나서, 세포를 PBS로 세척 한 후 4% 파라 포름 알데히드로 고정시키고 DAPI 및 Lyso Tracker로 염색하였다. Filter sets: Doxorubicin (Red λ_ex: 480 / λ_em: 560~590), Lysotracker (Green λ_ex: 504 / λ_em: 511) 및 DAPI (Blue, λ_ex: 358 / λ_em: 461) Scale bar: 5 μm.
도 14는 HT-29 (A) 및 HeLa 세포 (B) 각각에서 유세포 분석에 의해 평가된 Gal-Dox의 세포 흡수 효율을 나타낸 것이다. Galactose (red line) 100 mM의 전처리에 이어 두 개의 세포를 Gal-Dox 10 μM로 4 시간 동안 처리하였다 (blueline).
도 15는 β-galactosidase-mediated cleavage를 통한 Gal-Dox 활성화를 나타낸 것이다. 48 시간 동안 β-gal에 대한 siRNA (50nM)의 형질 감염(transfection) 후, HT-29 세포를 10μM Gal-Dox로 12 시간 동안 처리하고 공초점 현미경으로 측정하였다. Filter sets: Doxorubicin (Red λ_ex: 480 / λ_em: 560~590), F-actin (Green λ_ex: 495 / λ_em: 518 및 DAPI (Blue, λ_ex: 358 / λ_em: 461). Scale bar: 10 μm.
도 16은 HT-29 종양 이종 이식을 갖는 마우스에서 전신 (A) 및 해부된 종양 조직(B)의 형광 이미지를 나타낸 것이다. HT-29 종양 이종 이식을 갖는 쥐에게 free Dox와 Gal-Dox (3 mg / kg)를 정맥 주사하였다. In vivo 생체 영상 시스템을 사용하여 생체 내 형광 이미지를 수집하고 48시간 후에 ex vivo 형광 이미지를 얻었다.

이하에서는 바람직한 실시예 등을 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 등은 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.

실험 방법

재료, 방법 및 기기 장치

모든 시약 및 용매는 Sigma Aldrich, Alfa Aesar, TCI Korea 및 Merck에서 구매하여 사용하였다. 컬럼 크로마토 그래피 정제는 실리카 겔 60 (70 ~ 230 메쉬)을 고정상으로 사용하여 수행하고, 분석용 박층 크로마토 그래피는 실리카 겔 60(0.25 mm 두께를 갖는 미리 코팅된 시트)을 사용하여 수행하였다. 질량 스펙트럼은 IonSpecHiResESI 질량 분석기로 측정하였다. 1H NMR 스펙트럼, 13C NMR 스펙트럼은 Bruker NMR 분광기를 사용하여 얻었다. 모든 형광 스펙트럼 연구는 RF-5301PC 분광 광도계로 수행하였다. Gal-Dox의 원액 (1 mM)을 DMSO에서 제조하였으며, 형광 연구를 위해 1 % DMSO가 함유된 PBS 완충액 내 Gal-Dox 10 μM 용액을 사용하였다. 모든 실험에서, 여기 파장은 480 nm이었고 여기 및 방출 슬릿 폭은 모두 5 nm였다.

세포 배양

인간 대장암 세포(HT-29), 인간 간암 세포(HepG2) 및 인간 자궁 경부암 세포(HeLa)를 RPMI 1640 배양액 (Gibco, CA, USA), 알파 최소 필수 영양배지 (a-MEM, Gibco) 및 둘베코 변형이글 배지 (DMEM 10 % 태아 소 혈청 (FBS, Gibco) 및 1 % 페니실린/스트렙토 마이신 (Gibco)을 함유하는 배지에서 배양하였다. 세포는 가습 된 공기와 37 ℃, 5 % CO2 대기에서 배양하였다. 또한, 세포는 3 내지 4 일마다 계대 배양하였다.

UV/ vis , 형광 분광학 및 고성능 액체 크로마토그래피( HPLC )

Gal-Dox의 스톡 용액을 DMSO에서 준비하고, 예비 용액 연구를 위해 1% DMSO를 함유한 PBS 완충액(pH 7.4, 37 ℃)에서 10 uM의 작업 용액(working solution)을 사용하였다. 여기(excitation)는 480nm에서 이루어졌고 모든 여기 및 방출 슬릿폭은 5nm였다. β-gal 반응과 pH 의존적 반응 테스트의 총 부피는 3.0ml로 고정하였다. HPLC 분석에서는 reverse-phase column (C18, 5mm, Waters)이 장착된 YL9101S (YL-Clarity) 장비를 사용하였고, 또한 UV-vis 검출기(480 nm)를 사용하였다. 각 분석에 사용된 용리액으로는 물과 섞은 acetonitrile 농도 구배액(0-30 분, 5%에서 85%까지의 acetonitrile)이 1.0mL/분의 유속으로 사용되었다.

형광 이미징과 유세포 분석법(flow cytometry)를 이용한 세포 흡수 연구

Gal-Dox의 세포 내 전달을 평가하기 위하여 HT-29, HepG2, and HeLa 세포에 대한 공초점 레이저 스캐닝 현미경 (confocal laser scanning microscopy, CLSM)과 유세포 분석법이 사용되었다. 세포들은 well 당 1Х10⁴개의 밀도로 μ-slide 8 well chamber (ibidi, Munich, Germany)에 시딩 및 배양되었다. 하룻밤 배양 후에 10 μM Gal-Dox를 시간별로 분리된 배양액들의 well에 처리하였다. 모든 세포들은 PBS에 녹인 4% paraformaldehyde에 20분간 실온에서 고정한 후 PBS로 세번 세척하였다. 세포 핵과 F-actin은 각각 DAPI (Invitrogen, Molecular Probe, Eugene, OR, USA)와 20분간 3% BSA에 희석된 Alexa Fluor 488 phalloidin (Invitrogen, Molecular Probe)으로 비교염색 하였다. 더 나아가 Gal-Dox와 리소좀과의 공동 국부화를 조사 하기 위해 Lysotracker (Invitrogen, Molecular Probe)를 HT-29에 30분간 50 nM의 농도로 첨가하였다. 형광 이미지는 CLSM (LSM 710, Carl Zeiss, Germany)를 이용하여 수득하였다. Gal-Dox가 ASGP 수용체를 가진 세포주를 타겟팅하는 것을 추가적으로 확인하기 위해 유세포 분석법 (FACS Calibur, BD Biosciences, USA)으로 세포로의 흡수를 분석하였다. HT-29와 HeLa는 12-well plate에 4Х10⁵/well의 밀도로 배양하였으며, 1 mM의 D-galactose (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)로 전처리하였다. 4시간의 배양 후, 배양액의 세포를 배지에서 분리하였고 10 μM Gal-Dox에 2시간 처리 후 유동 분석법으로 분석하였다. 히스토그램은 FlowJo software (TreStar, Olten, Switzerland)를 이용해 만들었으며 평균 형광 강도의 값은 막대 그래프로 나타내었다.

In vitro 항암 분석

HT-29와 HeLa 세포를 96 well plate에 1 Х 10⁴ cells/ well의 밀도로 12시간 동안 플레이팅한 후, 다양한 농도의 Dox와 Gal-Dox로 24시간 동안 처리하였다. 이어서, 배양 배제를 새로운 배지로 교체하고, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) 비색분석법을 이용하여 항암 효과 분석을 진행하였다. MTT를 첨가하고 37 ℃에서 2시간 동안 더 배양하였다. MTT의 흡광도는 formazan 결정을 용해시키기 위해 가용화 완충제(Roche Diagnostics)로 처리한 후, 마이크로플레이트 리더(EL800, Bio-Tek Instruments, Winooski, VT, USA)를 이용하여 570nm에서 측정하였다. 모든 실험은 3회 반복하였다.

In vivo 종양 타겟팅 및 항암 효과

In vivo 종양 표적 이미징과 항종양 활성 측정을 위해 6주령의 수컷 BALB/c 누드 마우스 (Orient Bio, Sungnam, Korea)의 피하에 HT-29 세포를 피하 접종하여 대장암 이종 이식을 수행하였다. 동물 실험과 관련된 모든 in vivo 실험 절차들은 Korea University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC)의 승인을 받았다. 마취 후 누드 마우스들의 옆구리에 총 1Х10⁶개의 HT-29 세포를 주사하였다. 종양이 직경 5-10mm에 도달하였을 때, Dox 또는 Gal-Dox를 꼬리 정맥을 통해 1회당 5 mg/kg 정맥 주사하였다. 전신 형광 이미지를 지속적으로 모니터링하고, 절개된 종양은 48시간 후에 in vivo 이미징 시스템(Maestro, CRi Inc., Woburn, MA, USA)을 이용해 시각화하였다. 더불어 종양들은 4% paraformaldehyde 용액에 고정되었고, paraffin에 규칙적으로 고정되었고, 5 μm 두께로 절개되었으며 DAPI를 포함한 Vecta shield (Vector Laboratories, CA, USA)를 이용해 마운팅 (mounting)되었다. Gal-Dox의 치료 효능을 확인하기 위해, HT-29 접종된 이종이식 마우스들에 식염수, 3 mg/kg의 free Dox와 Gal-Dox (xenografts, n=5)를 2일 마다 4회 정맥주사하였다. 종양 부피는 caliper를 이용해 3일 마다 측정하였으며, 36일 후에 종료하였다.

화합물 합성

하기 합성경로에 따라 본 발명에 따른 [화학식 1]로 표시되는 화합물(Gal-Dox)을 합성하였다.

[합성경로]

시약 및 조건: a) NaBH₄, THF, 0 ℃. b) 1. p-Nitrophenylchloroformate, MC, pyridine, 0 ℃ 2. DMF, TEA, DOX·HCl. c) NaOMe, MeOH, 0 ℃.

화합물 1의 합성

무수 아세토니트릴 (15 mL) 중 Acetobromo-α-D-galactose(1.2 g, 2.91 mmol) 및 4-hydroxy-3-nitrobenzaldehyde(0.5 g, 2.99 mmol)가 교반된 용액에 silver(I)oxide (0.69g, 2.98 mmol)를 첨가하여 생성된 혼합물을 불활성 대기 하에 어두운 곳에서 4시간 동안 교반하였다. 완료 (TLC) 후, 조 생성물을 셀 라이트를 통해 여과 후 세척하고, NaHCO₃ (30 ml)로 희석, 에틸 아세테이트 (50 mL)로 추출한 후, 건조 및 농축시켜 회백색의 고체 화합물 1(1.0 g, 75 %)을 수득하였다.

¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz); 1.96 (s, 3H), 2.03 (s, 6H), 2.15 (s, 3H), 4.13 (m, 2H), 4.54 (m, 1H), 5.28 (m, 2H), 5.39 (m, 1H), 5.78 (m, 1H), 7.58 (d, 1H, J 7 Hz), 8.24 (m, 1H), 8.44 (m, 1H), 9.97 (s, 1H).

MS (ESI): m/z calcd. forC₂₁H₂₃NO₁₃: 497.12 Found: 520.15 [M⁺+23].

화합물 2의 합성

화합물 1 (1.0g, 2.01mmol)을 i-PrOH:CHCl₃ (1:3) 혼합물 및 0 ℃에서 용해시킨 후, NaBH₄ (0.08g, 2.10 밀리몰)를 첨가하고 혼합물을 추가로 1시간 동안 교반하였다. 반응 완료 후, 혼합물을 여과하고, 염수 (10 mL)로 세척, 에틸 아세테이트 (50 mL)로 추출한 후, 건조 및 감압 농축시켜 회백색의 고체 화합물 2(0.90 g, 90%)를 수득하였다.

¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz); 1.94 (s, 3H), 2.03 (s, 6H), 2.14 (s, 3H), 4.13 (m, 2H), 4.46 (m, 1H), 4.51 (m, 1H), 5.20-5.75 (m, 5H), 7.36 (m, 1H), 7.62 (m, 1H), 7.78 (s, 1H).

¹³C NMR (CDCl₃, 125 MHz); 20.5, 20.6, 61.3, 63.3, 66.7, 67.9, 71.4, 100.8, 119.8, 123.1, 131.7, 137.2, 137.2, 141.2, 148.3, 169.5, 170.1, 170.2, 170.3.

MS (ESI): m/z calcd. forC₂₁H₂₅NO₁₃: 499.13 Found: 522.20 [M⁺+23].

화합물 3의 합성

화합물 2 (0.2 g, 0.41 mmol)를 0 ℃에서 anhydrous MC(10 mL)에 용해시켰다. p-Nitrophenylchloroformate (0.088 g, 0.44 mmol)를 첨가한 후, 무수 피리딘 (200 uL)을 적가하였다. 혼합물을 추가로 1시간 동안 교반한 후, NaHCO₃ (20 mL)을 첨가하고 혼합물을 MC (3 X 100 mL)로 추출하였다. 유기 상을 건조 및 농축시켜 다음 단계에 사용하였다. 실온에서 무수 DMF (10 mL) 중의 활성 카보네이트 중간체에 약물 DOX·HCl (0.17 g, 0.30 mmol)을 첨가한 후 무수 TEA (0.5 mL)를 첨가한 후 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 반응 완료 후 용매를 감압하에 증발시키고, MC에 용해시킨 후, 디에틸에테르를 첨가하여 침전시켰다. 적색의 침전물을 분리하고, 건조시켜 화합물 3 (0.30 g)을 71% 수율로 수득하였다.

¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz); 1.28 (d, 3H, J 5.24 Hz), 1.73 (s, 1H), 1.80 (m, 1H), 1.87 (m, 1H), 2.00 (s, 3H), 2.04 (s, 3H), 2.10 (s, 3H), 2.17 (s, 3H), 2.30 (m, 1H), 2.97 (m, 1H), 3.04 (s, 1H), 3.24 (m, 1H), 3.65 (m, 1H), 3.85 (m, 1H), 4.05 (m, 1H), 4.07 (s, 3H), 4.14 (m, 1H), 4.21 (m, 1H), 4.52 (s, 1H), 4.74 (m, 2H), 5.02 (m, 3H), 5.09 (m, 1H), 5.28 (m, 2H), 5.44 (m, 1H), 5.51 (m, 2H), 7.29 (m, 1H), 7.39 (m, 1H), 7.44 (m, 1H), 7.76 (m, 2H), 8.01 (m, 1H), 13.1 (s, 1H), 13.9 (s, 1H).

₁₃C NMR (CDCl₃, 125 MHz); 14.5, 16.8, 20.5, 20.6, 20.6, 30.1, 30.9, 33.9, 35.6, 47.1, 56.6, 61.3, 64.8, 65.5, 66.7, 67.2, 67.8, 69.4, 69.7, 70.5, 71.4, 76.6, 100.6, 100.7, 111.3, 111.5, 118.5, 119.7, 119.8, 120.7, 124.5, 124.6, 32.7, 133.1, 133.5, 135.4, 135.8, 141.1, 148.9, 155.0, 155.5, 156.1, 161.0, 169.3, 170.1, 170.2, 186.6, 187.0.

MS (ESI): m/z calcd. forC₄₉H₅₂N₂O₂₅: 1068.29 Found: 1067.0 [M⁺-1].

Gal- Dox의 합성

0 ℃에서 메탄올 (10 mL) 중 화합물 3 (0.100 g, 0.09 mmol)이 교반된 용액에 불활성 대기하 sodium methoxide(0.05 g, 0.93 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 1시간 더 교반하고, 양이온 교환 수지인 amberlite ir120 (0.1g)을 첨가하고 혼합물을 30분 동안 더 교반하였다. 혼합물을 여과하고 감압하에 농축시키고 칼럼 크로마토 그래피 (10-15% MeOH/MC)로 정제하여 적색 분말의 화합물 Gal-Dox를 수득하였다(0.065 g, 수율 77%).

¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz); 1.12 (d, 3H, J 5 Hz), 1.48 (m, 1H), 2.11 (m, 2H), 2.93 (m, 2H), 3.17 (s, 1H), 3.37 (m, 2H), 3.45 (m, 3H), 3.53 (m, 4H), 3.66 (m, 2H), 3.69 (m, 5H), 4.13 (m, 2H), 4.57 (m, 2H), 4.96 (m, 6H), 5.22 (m, 1H), 7.01 (m, 1H), 7.39 (m, 1H), 7.55 (m, 2H), 7.83 (m, 3H).

¹³C NMR (DMSO-d₆, 125 MHz); 17.5, 22.6, 22.7, 30.2, 31.1, 47.7, 49.0, 60.6, 64.1, 64.2, 67.1, 68.3, 70.4, 73.8, 73.9, 76.2, 76.7, 101.4, 117.5, 117.6, 124.2, 124.3, 131.2, 133.7, 140.2, 149.5, 149.6, 155.5, 166.6, 190.6.

MS (ESI): m/z calcd. forC₄₁H₄₄N₂O₂₁: 900.24 Found: 923.30 [M⁺+23].

결과 및 고찰

합성, 형광 반응 및 Gal- Dox 활성화의 메커니즘

본 발명에 따른 [화학식 1]로 표시되는 화합물(Gal-Dox)은 상기 [합성 경로]에 따른 절차를 통해 합성하였다. 구체적으로, galactosidase 연결부위 중간물질 화합물 2를 합성하고, p-nitrobenzyl chloroformate에 의한 추가적인 알코올 활성화와 염기 매개를 이용한 free Dox로의 치환을 통해 중간물질 화합물 4를 형성하였다. 아세틸 그룹을 무수 메탄올에 녹인 sodium methoxide으로 디프로텍션 (deprotection)한 후 양이온 교환 레진으로 처리하여 최종 산물인 Gal-Dox를 수득하였다. 모든 합성된 중간 생성물과 산물은 ¹H/¹³C 핵자기공명 (nuclear magnetic resonance, NMR)과 전기분무 이온화 질량 분석(electrospray ionization mass spectrometry)을 통해 확인하였다.

결합 부위에 대한 원자 수준 분석을 위해, β-gal과 Gal-Dox의 상호 작용을 포함하여 도킹 및 분자 역학(MD) 시뮬레이션을 수행하였다. Gal-Dox와 β-gal 간의 결합부위와 분해된 결합 자유 에너지는 각각 도 1B 및 도 6에 나타내었다. 계산된 결합 자유 에너지는 -20.22 kcal/mol로 측정되었다. 결합 상호작용 계산에 따르면, N90(빨간색), P501(오렌지색), H528(파란색), W987(분홍색)로 명시된 β-gal의 4가지 중요한 상호작용 잔기가 관찰되었다. 전체 상호작용 잔기의 계산된 결합 자유 에너지를 고려하면 W987이 Gal-Dox와 가장 강한 상호작용을 보여주었다(도 6-7).

Gal-Dox의 예비 안정성(preliminary stability)과 활성 방식에 대한 통찰을 얻기 위하여 Gal-Dox를 인산염 완충액(PBS, pH 7.4, 37 ℃)에서 24시간 동안 배양하였다. 이 시간동안 유의미한 분해는 관찰되지 않았으며 (형광 현미경과 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정), 이는 충분한 화학적 안정성을 제시한다(도 1 및 도 8). Gal-Dox는 590nm의 약한 형광 방출을 보였다(여기 파장 λ_{exc .} = 480 nm). 흥미롭게도 β-gal (1 U/mL)에 대한 Gal-Dox (10 μM)의 노출은 galactosidase 부분의 절단이라는 결과를 가져왔으며 잇따른 자유 Dox를 방출하는 1,6-제거 경로와 동반된 590nm에서의 형광 증가를 가져왔다(도 1C). 결과적으로 본 발명에서는 이후 실시예에서 직접적인 Dox 방출을 관찰하기 위해 이 형광 증가를 활성화 반응으로 사용하였다. Gal-Dox 활성화와 약물 방출 매커니즘은 MS와 HPLC를 이용하여 확인하였다(도 1E 및 도 11). HPLC 프로파일은 Gal-Dox에 상응하는 20.4분의 용리 시간 (elution time)을 갖는 피크 (peak)가 나타났다. β-gal로 처리하자 15.3분에 새로운 피크가 나타났으며 이는 free Dox에 해당한다. 종합하면 Gal-Dox를 β-gal로 처리하면 두시간에 걸쳐 활성 Dox가 완전히 방출되었다. 암세포와 정상 세포의 pH 차이와 다른 생체분석물의(bioanalyte)의 존재를 고려하여 다양한 바이오 분석물들이 존재할 때와 일정 pH 범위에서의 Gal-Dox의 형광 거동을 평가하였다. 다양한 pH에서나 GSH, H₂O₂, 아미노산 등의 여러 바이오 분석물이 존재할 때, Gal-Dox의 형광 신호에서 주목할만한 변화는 관찰되지 않았다(도 9-10). 이러한 결과는 Gal-Dox가 생물학적 조건에서 높은 안정성을 보인다는 것을 암시한다. Gal-Dox의 뚜렷한 형광 증가(590nm)는 β-gal 효소로 처리했을 경우에만 나타났다.

Gal- Dox의 대장암 세포 내로의 ASGP 수용체 표적 전달

ASGP 수용체가 과발현된 대장암 세포 내로의 Gal-Dox의 선택적 전달을 확인하기 위해 대장암 세포주인 HT-29와 ASGP 수용체를 가진 잘 알려진 세포주인 HepG2에 대한 Gal-Dox의 타겟팅 능력을 평가하였다. 도 2에 나타난 바와 같이, HT-29와 HepG2 세포들은 확연한 세포 내 형광을 보였으며 ASGP 수용체가 없는 세포주인 HeLa 세포에서는 2시간의 배양 후에도 상대적으로 약한 형광 신호가 탐지되었다 (대조군).

공동 국부화 실험(Co-localization)을 통해 Gal-Dox가 HT-29 세포의 β-gal 활성이 나타나는 리소좀에 특이적으로 국부화된다는 것을 확인하였으며(도 12-13), 6시간 이후에 형광의 안정기에 도달하였다(도 12). Gal-Dox의 ASGP 수용체 타겟팅 세포 흡수를 추가적으로 증명하기 위하여 유세포 분석 (flow cytometry)을 이용한 경쟁 분석 (competition assay)을 수행하였다. 처음에는 HT-20 세포를 경쟁자인 free galactose로 100회 전처리한 후, 10 μM 농도의 Gal-Dox를 첨가한 후 2시간 동안 배양하였다. HeLa 세포의 경우, 과량의 galactose로 처리된 세포들과 대조군으로 사용된 미처리 세포들 간의 형광 강도에 유의미한 차이가 없었으나 HT-29 세포의 경우 galactose로 전처리된 세포의 형광 강도가 크게 감소하였다(도 14). 종합하면, 이러한 결과들은 Gal-Dox의 세포로의 흡수가 ASGP 수용체 매개 엔도시토시스에 의해 특이적으로 이루어진다는 것을 뒷받침한다.

Gal- Dox의 β- Galactosidase 매개 활성

Gal-Dox가 β-gal에 의해 촉발된 Dox 방출을 보여줌에 따라, 세포 내 β-gal 활성의 감소를 통해 효소 특이적 Gal-Dox 활성화를 확인하였다. HT-29 세포에서 내생 β-gal이 적은 양으로 존재할 때의 Gal-Dox의 활성을 조사하기 위해서는 β-gal 의 발현을 넉다운 (knock down)해야 했으며 이를 위해 siRNA 전략을 시도하였다. 이를 위해, HT-29 세포를 다양한 농도의 β-gal siRNA 로 48시간 동안 처리하였으며, 추가 연구를 위해 western blot 분석을 통해 최적의 siRNA 농도(50 nM)를 결정하였다(도 3A). siRNA (50nM)의 48시간 전처리를 통해 β-gal 발현을 저해한 후에 HT-29 세포를 10μM의 Gal-Dox와 함께 2시간 및 12시간 동안 배양하였다. 낮은 β-gal 발현으로 HT-29 세포에서 형광이 감소하는 동안, siRNA로 처리되지 않은 대조군에서 상대적으로 강한 형광이 관찰되었다(도 3B). Gal-Dox의 효소 특이적 활성화는 siRNA 넉다운 된 Gal-Dox 처리 HT-29 세포들과 siRNA 넉다운이 되지 않은 Gal-Dox 처리 HT-29 세포들 간의 평균 형광 강도를 비교하는 유세포 분석에 의해 추가적으로 확인되었다(도 3C). 종합적으로 이러한 siRNA 사일런싱(silencing) 결과는 Gal-Dox의 활성화가 상향 조절된 β-gal의 반응성 유발에 의해 달성될 수 있음을 시사한다. 본 발명에 따른 이러한 시스템은 약물 활성화 및 장소를 더 정확하게 관찰하기 위한 Dox 방출과 형광 활성화 기반 이미징의 동시 발생을 가능하게 한다.

세포 선택도와 Gal- Dox의 항암효과

Gal-Dox의 항증식적(anti-proliferative) 활성은 ASGP 수용체 매개 세포 내 섭취을 통한 선택적 세포 흡수에 의해 결정될 수 있기 때문에, Gal-Dox의 세포독성을 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) 분석을 이용하여 HT-29와 HeLa 세포에서 평가하였다. 두 세포주 모두 1-200μM의 농도 범위의 free Dox와 Gal-Dox로 24시간 동안 처리하였다. 두 세포주 모두에서 공통적으로 Gal-Dox는 최대 농도에서조차 크게 생존률을 낮추지 않았다. HT-29에서는 free Dox 또는 Gal-Dox를 처리한 모든 경우에서 유사한 행태가 관찰되었다(도 4A). 하지만 free Dox 또는 Gal-Dox를 처리한 HeLa 세포들 간에는 세포 독성의 현저한 차이가 측정되었다(도 4B). 이러한 결과들은 대장암 세포에서 과발현된 ASGP 수용체를 통한 표적화된 Gal-Dox 전달이 세포 흡수를 향상시킬뿐 아니라 항암 효과 또한 증대시킨다는 것을 입증한다.

이종이식 마우스 모델에서의 In vivo /ex vivo 진단과 화학치료

Gal-Dox의 항암 활성을 조사하기 위하여 HT-29 종양을 지닌 마우스에서 in vivo 종양 표적화 능력을 우선적으로 확인해야 한다. In vivo 형광 이미징 시스템을 이용한 생체 내 분포 연구를 위해 식염수, free Dox, Gal-Dox를 마우스에 1회 3 mg/kg 씩 정맥 주사하였으며, 투여 2일 후에 실시간 전신 형광 이미징을 수행하였다. 종양 표적 Gal-Dox의 축적은 HT-29 종양에서 최대 48시간 까지 향상된 형광 신호에 의해 지속적으로 시각화된 반면, free Dox는 24시간의 주사 후 종양 부위로부터 약간 투명하게 관찰되었다(도 5 및 도 16A). 48시간 후에 마우스를 죽인 후, 종양 조직을 수확하여 ex vivo 형광 이미징에 사용하였다(도 16B). 종합적으로, 전신 형광 이미징 결과는 식염수, free Dox, Gal-Dox 처리된 마우스에서 해부된 종양 조직의 형광 이미징 결과와 비슷하였다(도 5B). Gal-Dox의 in vivo 치료 효과 또한 HT-29 접종 종양을 지닌 누드 마우스를 이용하여 평가하였다(5 mg/kg 씩 2일마다 4회씩 정맥 투약, 식염수와 free Dox를 포함한 대조군). 도 5C에 나타난 바와 같이, 식염수가 주사된 마우스에 비해 Dox 및 Gal-Dox가 주사된 이종이식 마우스에서 종양 성장이 유의미하게 지연되었다. 하지만 free Dox 처리(34.9%)에 비해 Gal-Dox의 주사는 놀라운 종양 성장 억제(53.1%)를 보였다(도 5D). 이러한 Gal-Dox의 치료 반응은 galactosidase 단위체에 의한 효율적인 종양의 흡수 행태를 반영하는 것이며, 이는 암 표적화를 향상시킬 뿐 아니라 활성 Dox를 전달하기 위한 효율적인 전구 약물 활성화 방식으로서 기능할 수 있다.

Claims (3)

1. 하기 [화학식 1]로 표시되는 화합물을 포함하는 대장암 선택적 항암 치료진단제:
   [화학식 1]
   

   

   .
2. 제1항에 있어서,
   상기 화합물은 asialoglycoprotein(ASGP) 수용체에 의해 대장암 세포에 선택적으로 축적되는 것을 특징으로 하는 대장암 선택적 항암 치료진단제.
3. 제1항에 있어서,
   상기 화합물은 β-galactosidase에 의해 활성화되어 DOX를 방출하는 것을 특징으로 하는 대장암 선택적 항암 치료진단제.

Images