KR20200095712A - 영장류 뇌 조직 미세투석과 신경전달물질 동시 분석에 의한 신경정신질환 치료제 약효 평가법 - Google Patents
영장류 뇌 조직 미세투석과 신경전달물질 동시 분석에 의한 신경정신질환 치료제 약효 평가법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 영장류 연구에 미세투석(microdialysis)를 적용하여 뇌 특정 타겟 부위 조직에서 신경전달물질들과 그 대사체들을 동시 수집 분석하여 그 조절 알고리즘을 분석하고, 이를 기반으로 신경정신질환 치료제의 유효성과 안전성 및 약물상호작용을 예측할 수 있는 데이터 플랫홈으로 개발하는 평가 기술에 관한 것이다.
본 발명에 따른 분석 방법을 사용하면 뇌 조직에서 미세투석에 의해 수집된 체액 내 신경전달물질들을 동시에 분석할 수 있고, 신경정신 질환 치료제의 개발에 활용할 수 있다.
본 발명에 따른 분석 방법을 사용하면 뇌 조직에서 미세투석에 의해 수집된 체액 내 신경전달물질들을 동시에 분석할 수 있고, 신경정신 질환 치료제의 개발에 활용할 수 있다.
Description
본 발명은 각종 신경정신 질환의 치료제로 개발되는 약물의 약효를 평가하기 위하여 인간과 가장유사한 영장류에서 미세투석에 의한 시료 수집과 바이오마커로서 다종의 신경전달물질을 동시 분석하여 중추신경계를 타겟으로 하는 약물의 효능 평가 플랫폼으로 적용하는 기술에 관한 것이다.
퇴행성 신경질환과 정신병 등 거의 모든 신경정신과 질환에서 신경 조절의 장애가 동반되므로 해당되는 신경전달물질의 유리 조절의 이상이 근본적인 병리적 기전일 것이 확실하고, 많은 신경정신질환 치료를 목적으로 개발된 약물들이 설치류에서는 효과가 있으나 사람에서는 효과가 없어 대부분 임상에서 실패하므로, 사람과 신경계가 비슷한 영장류에서 약물의 작용을 신경전달물질 유리 변동에 미치는 영향을 평가함으로서 이를 바이오마커로 탐색하고 신경정신질환 치료제의 유효성 평가 도구로 활용할 수 있다.
정신 혹은 신경질환의 병인에 대한 이해를 증진시키기 위하여 원인이 되는 신경회로를 정확하게 식별하고 회로의 이상에 의해 유발되는 특이적 행동학적 장애 또는 신경 손상을 신경회로 조절로 회복시켜 주는 것이 이상적임. 그러나, 신경정신학적 질환이나 심지어 정상 신경 회로 기능에 대하여도 회로 수준은 일반적인 실험법으로는 확인이 어려움. 최근 광유전학적 방법으로 선택적 신경 활성 조절이 가능하여졌으나 신경기능은 특정 유전자의 활성뿐 아니라 신경 주위 교세포와 상호 작용으로 조절되므로 궁극적인 표현형은 신경전달물질들, 신경펩티드 및 사이토카인들에 의한 종합적인 작용으로 나타나므로 이들을 통합적으로 해석할 수 있어야 하며, 또한 뇌의 에너지 대사와 신경전달물질의 유리는 사망 후, 마취상태, 깨어있는 상태, 깨어 있더라도 스트레스의 정도에 따라 커다란 차이를 보이므로 신경전달물질의 분석에 가장 적절한 환경은 스트레스가 적고 일상적인 생활을 영위하면서 시료를 채취하는 경우이므로 이러한 조건에 가장 적절한 방법은 미세투석(microdialysis)을 시료 채취에 활용하는 것이다.
미세투석(microdialysis)은 측정하고자 하는 조직 내에 투석막(dialysis membrane)이 달려있는 탐침(probe)의 삽입이 이루어진 상태에서 미세순환 주입기(microdialysis pump)를 이용하여 순환 용액을 지속적으로 주입하여 미세순환체계을 유지하면 측정하고자 하는 체내 혹은 체외의 물질이 순확액과 체액 사이에서 상호 교환이 이루어지고 있는 평형 상태에 도달하게 되고, 이때 체액을 체취하여 물질의 농도를 분석하는 측정법이다. 즉, 미세투석법은 총조직액의 15-20%에 달하는 세포외액(extracellular fluid, ECF)에서 투석막의 미세공(micropore)을 통하여 생체 내 및 생체 외 물질을 수집하여 측정할 수 있는 실험적 기법으로, 미세투석을 결정하는 막은 반투막의 성질로 멤브레인의 분자량을 제한함으로서 저 분자량의 모든 신경전달물질 동시 수집과 측정이 가능해 지며 동일 동물에서 지속적으로 측정될 수 있다.
상기 방법으로 수집된 미세투석액에 분석적인 일반적인 HPLC 방법으로 분석이 어려웠던 신경전달물질들의 분석이 질량분석기(LC-MS/MS)를 사용하여 훨씬 높은 감도로 동시에 정량 분석이 가능하여졌다. 또한, 확립된 방법은 monoamine과 아미노산계 신경전달물질들 뿐 아니라 그 대사체들의 동시 분석도 가능하므로 신경정신질환에서 작용하는 신경경전달물질의 대사률의 영향 평가도 가능하다.
신약개발 및 평가 연구를 위한 동물로써의 마지막 효능 및 독성 평가 모델로서 영장류의 전임상 연구 인프라가 구축되어 활용되고 있으며 바이오약물의 면역독성 평가, 신경영상 평가법, 뇌구조 지도 작성 등의 연구가 활성화되어 최근 10년 사이 영장류를 이용한 연구 결과가 15만 편 이상 출판되고 있으므로 신경정신 질환에 작용하는 약물의 평가는 앞으로 영장류에서 얻어진 결과라야 사람에 대한 약효와 비교하여 신뢰성 있는 결과로 활용될 가능성이 높다.
하지만, 신경질환 치료제에 관련된 약물 평가 기술 및 평가 기준으로서 활용할 수 있는 바이오마커 또는 신경전달물질에 대한 연구는 미비하므로, 이에 대한 대응이 필요한 실정이다.
Richard FM, Douglas MB, Neuroimage, 1996, vol 4, 119-150
Tetsuya S et al., Neuropsychopharmacology, 2005, vol 30, 2154-2161
Babette MF et al., Journal of the American Association for Laboratory Animal Science, 2009, vol , 176-184
이에 본 발명자들은 다른 질환에 비하여 임상에서의 실패율이 높은 신경정신 질환 치료제의 성공율을 높이기 위하여 신경전달물질의 변동성을 각 신경정신 질환의 바이오마커로 개발하여 임상에 적용하고자 하였으며, 이를 위하여 인간과 유사한 영장류의 뇌에서 신경정신질환에 보편적으로 사용될 수 있도록 모든 신경전달물질들과 대사체들을 동시에 수집하고 분석할 수 있는 방법을 확인함으로서 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 사람에 적용될 수 있는 각각의 신경정신질환에서 신경전달물질의 변동에 기초한 바이오마커를 찾고 이를 신경정신질환 치료제의 약효 평가에 활용할 수 있는 실험적 기술을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 영장류를 대상으로 특정 뇌 조직에서 미세투석에 의한 체액 수집 기법과 질량분석기에 의한 높은 예민도의 신경전달물질들의 동시분석법 수행에 의한 신경정신 질환 치료제의 비임상 평가 플랫폼을 제공하는 것이다.
본 발명은 뇌 조직 유래 체액 내 미량의 다수의 신경전달물질들에 대한 동시 분석방법을 제공한다.
뇌에 존재하는 800억 개의 신경(neuron)과 100조 개에 달하는 시냅스(synapse)에 의하여 신경 기능이 조절되며 이는 시냅스로 유리되는 신경전달물질들과 신경조절물질들에 의하여 조절되는데 사람 뇌에서 진행되는 이 과정과 기전을 규명하려면 다른 포유류 동물에서는 불가능하고 가장 유사한 영장류 뇌에서 신경전달물질과 대사체들의 유리 조절을 확인하는 실험이 필수적이다. 영장류는 현존하는 모든 동물들 중에서 유전, 해부생리, 내분비, 골격, 행동패턴 등 많은 분야에서 인간과 가장 유사한 동물 무리로서 분류학상 우리 인간과 같은 영장목에 속하며 영장류는 260종으로 유인원, 구세계원숭이, 신세계원숭이, 원시원숭이로 구분되며, 구세계원숭이 중에서도 붉은 털원숭이와 게잡이원숭이가 실험에 가장 많이 사용되는 종이다. 유럽의 경우 영국, 프랑스, 독립, 네덜란드, 이탈리아 등 EU전역에 8개의 국가에 의해서 관리되고 있는 영장류 연구 시설이 존재함. 특히 미국은 8개의 영장류 센터를 보유하고 있으며, 센터당 평균 2,000마리 이상의 영장류 보존 중이며, 일본은 쯔쿠바 영장류센터와 교토영장류센터가 영장류 연구를 주도하고 있으며, 중국은 연구용 영장류 자원을 전 세계에서 가장 많이 수출하고 있는 최대 수출국으로 전 세계에서 가장 많은 영장류 생산시설을 보유하고 영장류 연구에 집중하고 있으며 국내의 경우 정읍의 국가영장류센터에 현재 약 500두 수용 중으로 3,000 두까지 확장할 예정임. 이외에도 안전성평가연구소, 대구와 오송 첨단의료복합단지의 실험동물센터, 서울대학교 병원, 서울대학교 평창캠퍼스의 디자인동물센터에서 영장류 사육 중이고 오리엔트바이오에서 캄보디아에 영장류 대량 사육시설 구축하고 있다.
본 발명에서 벤라팍신(Venlafaxine hydrochloride)은 세로토닌-노르에피네프린 재흡수 억제제로 항우울제로써 사용되는 약제이다.
본 발명에서 도네페질(Donepezil hydrochloride)은 알츠하이머 병 치료제로 사용되는 약제이다.
본 발명에 따른 분석 방법을 사용하면 뇌 조직에서 미세투석에 의해 수집된 체액 내 신경전달물질들을 동시에 분석할 수 있고, 신경정신 질환 치료제의 개발에 활용할 수 있다.
도 1은 본 발명에서 영장류 뇌정위 고정기로 두개골을 고정하는 모식도에 관한 것이다.
도 2는 본 발명에서 영장류 뇌 피질 내 미세투석 탐침의 타겟 부위에 관한 것이다.
도 3은 본 발명에서 영장류의 뇌 미세투석 실험에 대한 모식도에 관한 것이다.
도 4는 본 발명에서 영장류 뇌 유래 시료에 대한 신경전달물질을 분석한 결과에 관한 것이다.
도 2는 본 발명에서 영장류 뇌 피질 내 미세투석 탐침의 타겟 부위에 관한 것이다.
도 3은 본 발명에서 영장류의 뇌 미세투석 실험에 대한 모식도에 관한 것이다.
도 4는 본 발명에서 영장류 뇌 유래 시료에 대한 신경전달물질을 분석한 결과에 관한 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 실험 동물
게잡이 원숭이(Cynomolgus monkey) 총 10 수(수컷 5수, 암컷 5수, 3-4 ㎏)는 입수 후 약 1 개월 간 검역을 실시하였고, 동물실에서 시험 개시 전에 1개월 이상 순화기간을 거쳤다. 실험군은 결과에 영향을 미치는 증상이 관찰되지 않은 건강한 개체를 선발하였다. 시험기간 동안 스테인리스 사육상자(510W×800L×764H, 단위 ㎜)에 개체 별로 사육하였다. 사육환경은 온도 20-29℃, 습도 30-70%, 조명 12시간 낮/밤 주기, 조도 300-700 Lux의 조건 하에서 사육하였다. 사료는 1일 약 120 g을 오전, 오후로 나누어 제한 급여 시켰고, 음수는 자유급여 하였다. 모든 동물들은 안전성평가연구소 IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) 심의를 준수하여 관리하였다.
실시예 2. 뇌 미세투석 (Microdialysis of monkey brain)
본 발명에서 뇌 미세투석은 하기 단계에 따라 실시하였다.
1) 원숭이용 고정 cage에 원숭이를 앉힌 후 4% isoflurane으로 호흡 전신마취를 유도한다.
2) 마취가 유도된 원숭이를 수술용 table에 옮기고 2% 이소플루란(isoflurane)으로 호흡을 유지하며 혈압 및 심박수, 호흡등이 정상 범위로 유지되는지 확인한다.
3) 외과 수술용 dissector로 두개골을 전두엽(frontal cortex)부터 후두엽(occipital cortex)까지 타원형으로 절개한다.
4) 이소플루란으로 전신 마취된 원숭이는 정위고정기(Stereotaxic instrument)에 머리를 고정한다(도 1 참조).
5) Dura 막과 arachinoid space를 제거한 후 출혈 부위를 모두 지혈한다.
6) 미세투석 탐침은 CMA 사의 CMA 7 microdialysis probe를 사용하였고, 원숭이 뇌 피질을 7개의 영역으로 구분하여 각각 탐침을 삽입하였다. 좌, 우 상전두회(Superior frontal gyrus), 중심전회(Precentral gyrus), 중심후회(Postcentral gyrus), 상두정소엽(Superior parietal lobule), 좌,우 후두회(Occipital gyrus) 순서로 미세투석 탐침을 삽입하였다.
7) 체액 및 혈액의 유입을 방지하기 위해 작은 격자로 이루어져 있는 천을 뇌에 부착 하였고, 삽입 부위 확인 후 미세투석 탐침을 약 1,2 mm 깊이로 45도 내외의 각도로 삽입 후 생체 본드로 그 주변을 얇게 도포하였다. 본드가 마르면 치과의료용 시멘트(Dental cement)로 덧대어 미세투석 탐침 하부를 고정하도록 발라준다. 시멘트가 굳어지면 다음 영역에서 미세투석 탐침을 동일한 방법으로 삽입한다.
8) 7개의 피질 부위에 미세투석 탐침 삽입이 완료되면 탐침의 inlet은 인공 뇌척수액(Artificial cerebrospinal fluid)이 담겨있는 syringe에 각각 연결하고 그 다음에 syringe pump에 연결한다. Outlet은 샘플을 받을 0.6ml 튜브에 놓은 다음 syringe pump의 유속을 1.5 ul/min으로 설정하여 개체 당 20분씩 총 14회 샘플링을 진행한다. 탐침을 삽입한 직후에는 자극으로 인한 신경전달물질 등의 급격한 농도 변화가 생길 수 있으므로 약 2시간 가량 안정화 후 샘플링을 진행한다. 수집한 샘플은 초저온 냉동고에 보관하여 분석 시 쓸 수 있도록 한다.
본 실시예에서 미세투석 실험은 기저 상태에서 20분씩 2회, 벤라팍신 투여 후 1 시간 단위로 총 4회 (수컷 5마리) 또는 벤라팍신 투여 후 1 시간 단위로 2회 그리고 도네페질 투여 후 1 시간 단위로 2회 (암컷 5마리) 샘플링을 진행한 실험 총 2가지로 진행하였다.
실시예 3. 시료 투여
벤라팍신(Venlafaxine hydrochloride)을 생리식염수(0.9% NaCl)에 적정 농도로 용해하여 제조하였다. 또한, 도네페질(Donepezil hydrochloride)은 생리식염수에 용해하여 제조하였다. 제조된 시료는 미세투석 샘플링 시작 40분 후 게잡이 원숭이에 벤라팍신은 2㎎/㎏/1㎖의 용량으로 정맥 주사(intravascular injection)하였으며 도네페질은 500㎍/㎏/1㎖의 용량으로 정맥 주사 하였다.
실시예 4. 분석 방법 (LC-MS/MS)
본 발명에서 사용한 LC는 Waters 社의 ACQUITY UPLC I-Class PLUS System과 MS/MS는 AB SCIEX 社의 Triple Quadrupole 6500+ System으로 구성된 것을 사용하였으며, MS의 이온화 방식은 전자분무이온화 (ESI, electrospray ionization)방법을 사용하여 positive와 negative 이온을 동시에 분석하였다. 이온의 분리 방식으로는 삼중 사중극자 질량 분리관이 부착된 LC-MS/MS를 이용한 역상 액체크로마토그래피에 의하여 분석하였다.
분리조건으로는 ACQUITY UPLC HSS T3 (2.1×100 ㎜, 1.8 ㎛, Waters) 컬럼을 사용하였으며, 이동상은 HPLC Water에 0.1% Formic acid와 5 mM Ammonium formate를 포함한 수용액(A)과 Methanol과 Acetonitrile를 1:1로 혼합한 용액에 5 mM Ammonium formate를 포함한 수용액(B)를 사용하여 초기 시작 0분을 기준으로 B를 0.5%의 조성으로 시작하여 0.5분까지 유지하고, 1분에 B를 5%의 조성으로 2분까지 40%로, 2.5분에 B를 90%로 기울기 조성을 변경하여 4.5분까지 90%를 기울기 조성을 유지하였다. 4.6분에 B를 0.5% 조성으로 7.5분까지 흘려주어 초기 조성 비율로 안정화를 진행하였다. 유속은 0.3 mL/min으로 설정하여 사용하였다. 컬럼 온도는 25℃를 유지하며, 시료는 각 10 ㎕씩 주입하였다. 상기 조건은 하기 표 1(LC 분석 조건)과 동일하게 사용하였다.
| Instrument | Waters ACQUITY UPLC I-Class PLUS System | ||
| Column | Waters ACQUITY UPLC HSS T3 (2.1 x 100 mm, 1.8 μm) |
||
| Mobile phase (A) | Water (0.1% Formic acid, 5 mM Ammonium formate) |
||
| Mobile phase (B) | MeOH:Acetonitrile=1:1 (5 mM Ammonium formate) |
||
| Gradient | Time (min) | A % | B % |
| 0.0 | 99.5 | 0.5 | |
| 0.5 | 99.5 | 0.5 | |
| 1.0 | 95.0 | 5.0 | |
| 2.0 | 60.0 | 40.0 | |
| 2.5 | 10.0 | 90.0 | |
| 4.5 | 10.0 | 90.0 | |
| 4.6 | 99.5 | 0.5 | |
| 7.5 | 99.5 | 0.5 | |
| Column Temp | 25℃ | ||
| Injection volume | 10 ㎕ | ||
| Flow rate | 0.3 mL/min | ||
Mass spectrometer는 ESI로 분석을 하였으며, drying gas는 질소를 사용하였다. 다성분동시분석법인 MRM (Multiple Reaction Monitoring) 하에서 작동하였다. Positive ion과 negative ion spray voltage는 모두 4500 V로 고정하였다. Curtain gas(CUR), Collision gas(CAD), Ion source gas 1(GS1), Ion source gas 2(GS2)는 각각 30, medium, 50, 60으로 유지하였으며, ion transfer tube temperaturesms 550℃로 고정하였다. 상기 조건은 하기 표 2(MS/MS 분석조건)와 동일하게 사용하였다.
| Instrument | AB SCIEX Triple Quadrupole 6500+ |
| Ion Source Type | ESI |
| Positive Ion Spray Voltage (V) | 4500 |
| Negative lon Spray Voltage (V) | -4500 |
| Curtain gas (CUR) | 30 |
| Collision gas(CAD) | Medium |
| Ion source gas 1(GS1) | 50 |
| Ion source gas 2(GS2) | 60 |
| Ion Transfer Tube Temp (℃) | 550 |
뇌신경전달물질의 분석 결과에 대한 크로마토그램은 도 4에 나타낸 바와 같다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 이 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (6)
- 미세투석의 대상으로 영장류를 사용하고 동시에 여러 조직에서 시료를 수집하는 방법.
- 영장류 마취 후 특정 타겟 부위에 미세투석 탐침을 위치하고 시험 중 움직이지 않도록 고정하기 위한 영장류 뇌정위고정기(Stereotaxic instrument)를 활용한 두개골 고정법.
- 체액 및 혈액의 유입을 방지하기 위해 작은 격자로 이루어져 있는 천을 뇌에 부착하고 미세투석 탐침을 삽입 후 생체 본드로 그 주변을 얇게 도포하여 미세투석 탐침을 뇌 조직에 고정하는 방법.
- 제 2항에 있어서,
치과의료용 시멘트(Dental cement)로 덧대어 미세투석 탐침 하부를 뇌 피질에 안정하게 고정하는 단계를 추가하는, 두개골 고정법.
- 미세투석 탐침 고정하고 안정화된 이후 약물 투여에 의하여 신경전달물질과 대사체들의 유리 변동을 유발하는 방법.
- 미세투석에 의해 획득한 시료에서 질량분석기로 신경전달물질(GABA, glutamate, acetylcholine, norepinephrine, dopamine, serotonin) 및 대사체(choline, MHPG, MHPG sulfate, 5-HIAA, DOPAC)의 동시 분석법.
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| KR1020190013405A KR20200095712A (ko) | 2019-02-01 | 2019-02-01 | 영장류 뇌 조직 미세투석과 신경전달물질 동시 분석에 의한 신경정신질환 치료제 약효 평가법 |
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| KR1020190013405A KR20200095712A (ko) | 2019-02-01 | 2019-02-01 | 영장류 뇌 조직 미세투석과 신경전달물질 동시 분석에 의한 신경정신질환 치료제 약효 평가법 |
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| Babette MF et al., Journal of the American Association for Laboratory Animal Science, 2009, vol , 176-184 |
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