KR20200094105A - Method for isolating exosomes and composition used thereto - Google Patents

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KR20200094105A
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Abstract

One aspect provides an exosome extraction method capable of improving delivery efficiency of exosomes, and an exosome extraction composition comprising a cobalt chloride (CoCl_2) solution therefor.

Description

엑소좀을 추출하는 방법 및 이에 이용되는 조성물{Method for isolating exosomes and composition used thereto} Method for isolating exosomes and composition used therein

엑소좀을 추출하는 방법 및 이에 이용되는 조성물에 관한 것이다. It relates to a method for extracting exosomes and compositions used therein.

엑소좀은 세포의 RNA 및 단백질을 운반하는 물질들이 들어있는 미세한 크기의 소포이다. 엑소좀은 여러 종류의 세포들로부터 분비되는 막 구조의 소낭체이며, 다른 세포 및 조직에 결합하여 막 구성요소, 단백질, RNA를 전달하는 등 다양한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 본래 엑소좀은 적혈구가 성숙되는 마지막 단계에서 세포 내 단백질을 배출하여 제거함으로써 적혈구 내에 헤모글로빈만 남기는 과정에서 발견되었다. 또한, 전자 현미경을 통한 연구에서 엑소좀이 원형질막(plasma membrane)으로부터 직접 떨어져 나가는 것이 아니라, 다낭체(Multivesicular bodies: MVBs)라고 불리는 세포 내 특정 구획에서 기원하여 세포 밖으로 방출, 분비되는 것으로 관찰되었다. 다낭체와 원형질막의 융합이 일어나면, 소낭들이 세포 밖 환경으로 방출되는데, 이것을 엑소좀이라 부른다.Exosomes are microscopic vesicles containing substances that carry cellular RNA and proteins. Exosomes are membrane vesicles secreted from various types of cells, and are known to play a variety of roles, such as delivering membrane components, proteins, and RNA by binding to other cells and tissues. Originally, exosomes were found in the process of leaving only hemoglobin in the red blood cells by removing and removing intracellular proteins in the final stages of maturation of the red blood cells. In addition, in studies through electron microscopy, it was observed that exosomes originated from specific compartments within cells called multivesicular bodies (MVBs), and are not released directly from the plasma membrane, but are released and secreted out of the cells. When fusion of polycysts and plasma membranes occurs, vesicles are released into the extracellular environment, which are called exosomes.

최근 연구에 따르면 엑소좀은 세포 간 신호 전달 및 폐기 관리와 같은 과정에서 중요한 역할을 한다고 보고 되었다(Edwin van der pol et al., Pharmacological Reviews July 2012, 64 (3) 676-705). 엑소좀은 질병에 대한 예후, 치료 및 건강과 질병을 위한 바이오 마커로 사용될 수 있는 잠재력을 갖고 있고, 최근 임상 적용에 대한 관심이 증가하고 있다. 하지만, 세포가 생성하는 엑소좀이 미량이므로 엑소좀 추출 및 전달 방법의 개선이 필요한 반면에, 엑소좀 전달 효율을 증가시킬 수 있는 방법에 대한 연구가 부족하다. Recent studies have reported that exosomes play an important role in processes such as cell-to-cell signaling and waste management (Edwin van der pol et al., Pharmacological Reviews July 2012, 64 (3) 676-705). Exosomes have the potential to be used as biomarkers for disease prognosis, treatment and health and disease, and there is increasing interest in clinical applications in recent years. However, since the exosomes produced by the cells are very small, it is necessary to improve the exosome extraction and delivery method, while studies on methods to increase the exosome delivery efficiency are insufficient.

본 발명자들은 엑소좀 전달 효율을 개선시킬 수 있는 엑소좀 추출 방법 및 이에 사용되는 추출 조성물을 개발하였다. The present inventors have developed an exosome extraction method and an extraction composition used therein that can improve the exosome delivery efficiency.

Edwin van der pol et al., Pharmacological Reviews July 2012, 64 (3) 676-705 Edwin van der pol et al., Pharmacological Reviews July 2012, 64 (3) 676-705

일 양상은 엑소좀의 전달 효율을 향상시킬 수 있는 엑소좀의 추출 방법을 제공하는 것이다. One aspect is to provide a method for extracting exosomes that can improve the delivery efficiency of exosomes.

다른 일 양상은 엑소좀 추출 방법에 사용되는 엑소좀 추출 조성물을 제공하는 것이다.Another aspect is to provide an exosome extraction composition used in the exosome extraction method.

일 양상은 엑소좀을 포함하는 시료에 염화코발트(CoCl2) 용액을 첨가하여 혼합 용액을 제조하는 단계;One aspect is to prepare a mixed solution by adding a solution of cobalt chloride (CoCl 2 ) to a sample containing exosomes;

혼합 용액을 배양하는 단계; 및Culturing the mixed solution; And

배양된 용액을 분리하여 엑소좀을 추출하는 단계를 포함하는, 시료로부터 엑소좀을 추출하는 방법을 제공한다. It provides a method of extracting an exosome from a sample, comprising the step of extracting the exosome by separating the cultured solution.

다른 일 양상은 상기 엑소좀의 추출 방법에 사용되는 염화코발트(CoCl2) 용액을 포함하는 엑소좀 추출 조성물을 제공한다. Another aspect provides an exosome extraction composition comprising a cobalt chloride (CoCl 2 ) solution used in the method for extracting the exosomes.

일 양상에 따른 엑소좀 추출 방법과 추출 조성물은 엑소좀의 전달 효율을 높일 수 있다. The exosome extraction method and the extraction composition according to one aspect may increase the delivery efficiency of exosomes.

도 1은 일 구체예에 따른 엑소좀 전달 방법을 도식화한 그림이다.
도 2는 대조군(Nomal Exo), 염화칼슘 처리군(Cacl2), 염화코발트(Cocl2) 처리군, 염화마그네슘(Mgcl2) 처리군, 및 염화구리(Cucl2) 처리군 각각에서 심장 세포주에 대한 엑소좀 전달 정도를 보여주는 공초점 형광 현미경 이미지이다.
도 3은 대조군(Nomal Exo), 염화칼슘 처리군(Cacl2), 염화코발트(Cocl2) 처리군, 염화마그네슘(Mgcl2) 처리군, 및 염화구리(Cucl2) 처리군 각각에서 심장 세포주의 엑소좀 전달 정도를 보여주는 형광 강도를 나타낸 그래프이다.
도 4는 대조군(Nomal Exo), 염화칼슘 처리군(Cacl2), 염화코발트(Cocl2) 처리군, 염화마그네슘(Mgcl2) 처리군, 및 염화구리(Cucl2) 처리군 각각에서 심장 세포주의 세포 생존률(viability)(%)을 보여주는 그래프이다.
도 5는 대조군(Nomal Exo), 아세트산코발트(C4H6CoO4) 처리군, 질산코발트(Co(NO3)2) 처리군, 황산코발트수화물(CoSO4·7H2O) 처리군 각각에서 심장 세포주에 대한 엑소좀 전달 정도를 보여주는 공초점 형광 현미경 이미지이다.
도 6은 대조군(Nomal Exo), 아세트산코발트(C4H6CoO4) 처리군, 질산코발트(Co(NO3)2) 처리군, 황산코발트수화물(CoSO4·7H2O) 처리군 각각에서 심장 세포주의 엑소좀 전달 정도를 보여주는 형광 강도를 나타낸 그래프이다.
도 7은 대조군(Nomal Exo), 아세트산코발트(C4H6CoO4) 처리군, 질산코발트(Co(NO3)2) 처리군, 및 황산코발트수화물(CoSO4·7H2O) 처리군 각각에서 심장 세포주의 세포 생존률(viability)(%)을 보여주는 그래프이다. 도 7에서와 같이, 각 처리군이 유사한 생존률을 보였다.1 is a diagram schematically illustrating an exosome delivery method according to an embodiment.
Figure 2 is a control (Nomal Exo), calcium chloride treatment group (Cacl 2 ), cobalt chloride (Cocl 2 ) treatment group, magnesium chloride (Mgcl 2 ) treatment group, and copper chloride (Cucl 2 ) treatment group, respectively, for the heart cell line This is a confocal fluorescence microscope image showing the degree of exosome delivery.
Figure 3 is a control (Nomal Exo), calcium chloride treatment group (Cacl 2 ), cobalt chloride (Cocl 2 ) treatment group, magnesium chloride (Mgcl 2 ) treatment group, and copper chloride (Cucl 2 ) treatment group exo in the heart cell line, respectively It is a graph showing the fluorescence intensity showing the degree of delivery.
Figure 4 is a control (Nomal Exo), calcium chloride treatment group (Cacl 2 ), cobalt chloride (Cocl 2 ) treatment group, magnesium chloride (Mgcl 2 ) treatment group, and copper chloride (Cucl 2 ) treatment group, respectively, cells of the heart cell line It is a graph showing the viability (%).
5 is a control group (Nomal Exo), cobalt acetate (C 4 H 6 CoO 4 ) treatment group, cobalt nitrate (Co(NO 3 ) 2 ) treatment group, cobalt sulfate hydrate (CoSO 4 · 7H 2 O) treatment group, respectively Confocal fluorescence microscopy image showing the extent of exosome delivery to the heart cell line.
6 is a control group (Nomal Exo), cobalt acetate (C 4 H 6 CoO 4 ) treatment group, cobalt nitrate (Co(NO 3 ) 2 ) treatment group, cobalt sulfate hydrate (CoSO 4 · 7H 2 O) treatment group, respectively It is a graph showing the fluorescence intensity showing the degree of exosome delivery of the heart cell line.
7 is a control group (Nomal Exo), cobalt acetate (C 4 H 6 CoO 4 ) treatment group, cobalt nitrate (Co(NO 3 ) 2 ) treatment group, and cobalt sulfate hydrate (CoSO 4 ·7H 2 O) treatment group, respectively Is a graph showing the cell viability (%) of the heart cell line. As shown in Figure 7, each treatment group showed a similar survival rate.

일 양상은 엑소좀을 포함하는 시료에 염화코발트(CoCl2) 용액을 첨가하여 혼합 용액을 제조하는 단계;One aspect is to prepare a mixed solution by adding a solution of cobalt chloride (CoCl 2 ) to a sample containing exosomes;

혼합 용액을 배양하는 단계; 및Culturing the mixed solution; And

배양된 용액을 분리하여 엑소좀을 추출하는 단계를 포함하는, 시료로부터 엑소좀을 추출하는 방법을 제공한다. It provides a method of extracting an exosome from a sample, comprising the step of extracting the exosome by separating the cultured solution.

본 명세서에서 엑소좀(Exosome)은 신체의 모든 세포에 의해 방출되는 엔도솜 유래의 지질 이중층을 갖는 작은 막 소포를 말한다. 엑소좀은 세포 간 신호를 전달하기 위하여, 단백질, DNA, RNA 등을 가지고 세포 밖으로 분비되는 작은 소낭을 가리킬 수 있으며, 예컨대 단백질, 지질, mRNA, 마이크로RNA (miRNA) 및 게놈 DNA를 포함할 수 있다. 또한, 엑소좀은 다른 세포 및 조직에 결합하여 막 구성요소, 단백질, RNA를 전달하는 등의 다양한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.Exosome herein refers to a small membrane vesicle with an endosomal-derived lipid bilayer released by all cells of the body. Exosomes can refer to small vesicles that are secreted out of the cell with proteins, DNA, RNA, etc., to deliver intercellular signals, such as proteins, lipids, mRNA, microRNA (miRNA) and genomic DNA. . In addition, exosomes are known to play a variety of roles, such as delivering membrane components, proteins, and RNA by binding to other cells and tissues.

일 구체예에서, 엑소좀은 제한되지는 않으나, 사람 혈액으로부터 유래, 추출 또는 분리된 것일 수 있다. 또는, 엑소좀은 줄기세포로부터 추출된 것일 수 있으며, 예를 들어 지방 유래 줄기세포, 제대 유래 줄기세포 또는 골수 유래 줄기세포로부터 추출된 것일 수 있다. In one embodiment, the exosome is not limited, but may be derived from human blood, extracted or isolated. Alternatively, the exosomes may be extracted from stem cells, for example, fat-derived stem cells, cord-derived stem cells, or bone marrow-derived stem cells.

일 구체예에서, 상기 엑소좀은 약 50 내지 200 nm의 직경, 또는 약 40 내지 150 nm, 또는 약 50 내지 150nm의 직경을 갖는 것일 수 있다. 상기 엑소좀의 직경은 예를 들어, 약 50 내지 130nm, 50 내지 110nm, 50 내지 90nm, 50 내지 70 nm, 70 내지 130 nm, 70 내지 110nm, 70 내지 90nm, 90 내지 130nm, 또는 90 내지 110nm일 수 있다. In one embodiment, the exosome may have a diameter of about 50 to 200 nm, or a diameter of about 40 to 150 nm, or about 50 to 150 nm. The diameter of the exosomes may be, for example, about 50 to 130 nm, 50 to 110 nm, 50 to 90 nm, 50 to 70 nm, 70 to 130 nm, 70 to 110 nm, 70 to 90 nm, 90 to 130 nm, or 90 to 110 nm. Can.

일 구체예에서, 상기 염화코발트(CoCl2)용액은 약 0.1 내지 0.3 M 염화코발트 용액일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 염화코발트(CoCl2)용액의 농도는 약 0.1, 0.15, 0.2, 0.25, 또는 0.3 M일 수 있다. 상기 염화코발트(CoCl2)용액의 농도는 약 0.1 내지 0.3 M일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 염화코발트(CoCl2)용액의 농도는 약 0.2 M일 수 있다. In one embodiment, the cobalt chloride (CoCl 2 ) solution may be about 0.1 to 0.3 M cobalt chloride solution. In one embodiment, the concentration of the cobalt chloride (CoCl 2 ) solution may be about 0.1, 0.15, 0.2, 0.25, or 0.3 M. The concentration of the cobalt chloride (CoCl 2 ) solution may be about 0.1 to 0.3 M. In one embodiment, the concentration of the cobalt chloride (CoCl 2 ) solution may be about 0.2 M.

상기 염화코발트(CoCl2)용액은 엑소좀을 포함하는 시료에 첨가되어 최종 농도가 약 10 내지 1000uM가 되도록 첨가될 수 있다. 상기 최종 농도는 약 100 내지 1000uM일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 최종 농도는 약 100 내지 800uM, 200 내지 600uM, 250 내지 550 uM, 또는 250 내지 450uM 일 수 있다. The cobalt chloride (CoCl 2 ) solution may be added to a sample containing exosomes such that the final concentration is about 10 to 1000 uM. The final concentration may be about 100 to 1000uM. In one embodiment, the final concentration may be about 100 to 800 uM, 200 to 600 uM, 250 to 550 uM, or 250 to 450 uM.

일 구체예에서, 상기 엑소좀을 포함하는 시료에 첨가하는 염화코발트(CoCl2) 용액은 다른 1종 이상의 금속염을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 금속염은 염화물일 수 있다. 예를 들어, 상기 염화물은 염화칼슘(Cacl2),염화마그네슘(Mgcl2), 염화구리(Cucl2), 또는 이들의 혼합물일 수 있다. In one embodiment, the cobalt chloride (CoCl 2 ) solution added to the sample containing the exosome may further include one or more other metal salts. For example, the metal salt may be chloride. For example, the chloride may be calcium chloride (Cacl 2 ), magnesium chloride (Mgcl 2 ), copper chloride (Cucl 2 ), or a mixture thereof.

일 구체예에서, 상기 시료는 혈장, 혈청, 혈액, 및 타액 중 어느 하나일 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 시료는 혈장, 혈청 또는 혈액일 수 있다. In one embodiment, the sample may be any one of plasma, serum, blood, and saliva. In other embodiments, the sample can be plasma, serum or blood.

일 구체예에서, 상기 엑소좀은 혈액 또는 혈장 유래인 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 엑소좀을 포함하는 시료는 혈장 유래 엑소좀 시료에 엑소퀵(ExoQquick)®을 첨가하여 얻은 것일 수 있다. In one embodiment, the exosome may be from blood or plasma. In one embodiment, the sample containing the exosome may be obtained by adding ExoQquick® to a plasma-derived exosome sample.

혈액은 몸 안의 세포에 산소와 영양소를 공급하고 세포의 신진대사에 의해 발생하는 이산화탄소와 노폐물을 회수하여 운반하는 역할을 하는 체액을 말한다. 혈장(plasma)은 혈액을 구성하는 액체 성분인데, 단백질을 비롯하여 다종 다양한 유기물이나 무기물이 녹아 있는 용매 역할을 한다.　혈청 또는 수액(serum)은 혈액의 일부 성분으로　혈장에서　피브리노겐이 제거된 나머지 노란색 액체 성분을 말한다. Blood refers to a body fluid that supplies oxygen and nutrients to cells in the body and recovers and transports carbon dioxide and waste products generated by cell metabolism. Plasma (plasma) is a liquid component that makes up the blood, and serves as a solvent in which various organic and inorganic substances, including proteins, are dissolved. Serum or serum is a part of the blood that refers to the remaining yellow liquid component from which blood fibrinogen has been removed from the blood plasma.

상기 엑소좀을 포함하는 시료는 엑소좀을 시료로부터 조추출한 것일 수 있다. 상기 엑소좀을 포함하는 시료는 예컨대 사람의 혈액 또는 혈장으로부터 엑소좀을 조추출하여 인산완충식염수(phosphate-buffered saline: PBS)에 푼 것일 수 있다. The exosome-containing sample may be a crude extract of the exosome from the sample. The exosome-containing sample may be, for example, crude exosomes extracted from human blood or plasma, and then released into phosphate-buffered saline (PBS).

일 구체예에서, 상기 엑소좀을 시료로부터 조추출하는 방법은 예컨대 시판 엑소좀 단리 시약을 첨가하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 시약으로는 엑소퀵(ExoQquick)®(미국 특허 제2013/0337440　A1호)을 첨가하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 시약은 예를 들어, 시료 250 ㎕를 기준으로 1 내지 200 ㎕, 예컨대 10 내지 100 ㎕, 50 내지 70 ㎕의 양으로 첨가할 수 있다. In one embodiment, a method for crudely extracting the exosomes from a sample may be, for example, adding a commercially available exosome isolation reagent. For example, the reagent may be to add ExoQquick® (US Patent No. 2013/0337440#A1). For example, the reagent may be added in an amount of 1 to 200 μl, for example, 10 to 100 μl, 50 to 70 μl based on 250 μl of the sample.

일 구체예에 따른 엑소좀 조추출물은 시료를 원심분리하고, 단리 시약을 첨가한 후에, 저온에 보관하고, 이어서 원심분리하여 얻을 수 있다. The crude exosome extract according to one embodiment may be obtained by centrifuging a sample, adding an isolation reagent, storing at a low temperature, and then centrifuging.

일 구체예에서, 상기 혼합 용액의 배양 단계는 35℃ 내지 40℃에서 배양하고, 이어서 0℃ 내지 5℃에서 배양하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 혼합 용액의 배양 단계는 37℃에서 배양하고, 이어서 4℃에서 배양하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 혼합 용액의 배양 단계는 37℃에서 5 내지 20분간 배양하고, 이어서 4℃에서 20분 내지 1시간 동안 배양하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. In one embodiment, the step of culturing the mixed solution may include culturing at 35°C to 40°C, and then culturing at 0°C to 5°C. In one embodiment, the step of culturing the mixed solution may include culturing at 37°C, and then culturing at 4°C. In one embodiment, the step of culturing the mixed solution may include culturing at 37°C for 5 to 20 minutes, and then culturing at 4°C for 20 minutes to 1 hour.

일 구체예에서, 상기 엑소좀을 추출하는 단계는 10,000 내지 20,000rpm의 원심분리기를 이용하여 분리하는 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 엑소좀을 추출하는 단계는 10,000 내지 15,000rpm, 예를 들어 13,000 rpm 원심분리기를 이용하여 분리하는 것일 수 있다. In one embodiment, the step of extracting the exosome may be to separate using a centrifuge of 10,000 to 20,000rpm. In one embodiment, the step of extracting the exosomes may be to separate using 10,000 to 15,000 rpm, for example, 13,000 rpm centrifuge.

다른 일 양상은 상기 엑소좀의 추출 방법에 사용되는 염화코발트(CoCl2) 용액을 포함하는 엑소좀 추출 조성물을 제공한다. Another aspect provides an exosome extraction composition comprising a cobalt chloride (CoCl 2 ) solution used in the method for extracting the exosomes.

일 구체예에 따른 엑소좀 추출 조성물에서 상기 염화코발트(CoCl2)용액은 약 0.1 내지 0.3 M 염화코발트 용액일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 염화코발트(CoCl2)용액의 농도는 약 0.1, 0.15, 0.2, 0.25, 또는 0.3 M일 수 있다. 상기 염화코발트(CoCl2)용액의 농도는 약 0.1 내지 0.3 M일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 염화코발트(CoCl2)용액의 농도는 약 0.2 M일 수 있다. In the exosome extraction composition according to an embodiment, the cobalt chloride (CoCl 2 ) solution may be a solution of about 0.1 to 0.3 M cobalt chloride. In one embodiment, the concentration of the cobalt chloride (CoCl 2 ) solution may be about 0.1, 0.15, 0.2, 0.25, or 0.3 M. The concentration of the cobalt chloride (CoCl 2 ) solution may be about 0.1 to 0.3 M. In one embodiment, the concentration of the cobalt chloride (CoCl 2 ) solution may be about 0.2 M.

일 구체예에 따른 엑소좀 추출 조성물에서 상기 염화코발트(CoCl2)용액은 엑소좀을 포함하는 시료에 첨가되어 최종 농도가 약 10 내지 1000uM가 되도록 첨가될 수 있다. 상기 최종 농도는 약 100 내지 1000uM일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 최종 농도는 약 100 내지 800uM, 200 내지 600uM, 250 내지 550 uM, 또는 250 내지 450uM 일 수 있다. In the exosome extraction composition according to one embodiment, the cobalt chloride (CoCl 2 ) solution may be added to a sample containing exosomes to have a final concentration of about 10 to 1000 uM. The final concentration may be about 100 to 1000uM. In one embodiment, the final concentration may be about 100 to 800 uM, 200 to 600 uM, 250 to 550 uM, or 250 to 450 uM.

또 다른 일 양상은 상기 엑소좀 추출 방법을 이용하여 추출된 엑소좀을 포함하는 약물 전달체를 제공할 수 있다. 상기 엑소좀을 포함하는 약물 전달체는 추출된 엑소좀을 정맥 내로 투여(정맥주사)하거나, 대상체의 폐 또는 기관 내로 투여(국소 투여)하거나, 흡입(inhalation)의 방법으로 투여될 수 있다. 상기 엑소좀을 포함하는 약물 전달체는 약물을 목표 부위에 효율적으로 전달할 수 있는 약물 전달 시스템으로서 이용될 수 있다. 상기 엑소좀을 포함하는 약물 전달체는 심장질환, 피부질환의 치료 등을 위한 재생의학치료 기술로서 이용될 수 있다. Another aspect may provide a drug delivery system including exosomes extracted using the exosome extraction method. The drug delivery system containing the exosomes may be administered by intravenous administration (intravenous injection) of the extracted exosomes, administration into the lungs or organs of the subject (local administration), or by inhalation. The drug delivery system containing the exosome may be used as a drug delivery system capable of efficiently delivering a drug to a target site. The drug delivery system containing the exosome may be used as a regenerative medicine treatment technology for the treatment of heart disease and skin disease.

또 다른 일 양상은 상기 엑소좀 추출 방법을 이용하여 추출된 엑소좀을 이용한 질병 진단 방법, 또는 여기에 이용되는 진단 키트를 제공할 수 있다. Another aspect may provide a method for diagnosing a disease using an exosome extracted using the exosome extraction method, or a diagnostic kit used therein.

이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.It will be described in more detail through the following examples. However, these examples are intended to illustrate one or more embodiments by way of example, and the scope of the present invention is not limited to these examples.

제조예 1: 엑소좀 조추출물의 제조Preparation Example 1: Preparation of crude exosome extract

사람의 혈장(Plasma)에서 엑소좀을 조추출하였다. 조추출 방법으로는 사람의 혈장을 3000g로 15분 동안 원심분리하여 파편(debris)을 제거하고, 그 다음 ExoQquick®(SBI(System Biosciene), EXOQ20A-1)을 혈장 250 ㎕ 당 63 ㎕의 양으로 첨가하여 30분 간 ice에 보관하였다. 그 다음 1500g로 30분 동안 원심분리하여 제조하였다. Exosomes were crudely extracted from human plasma (Plasma). As a crude extraction method, human plasma was centrifuged at 3000 g for 15 minutes to remove debris, and then ExoQquick® (SBI (System Biosciene), EXOQ20A-1) was added in an amount of 63 μl per 250 μl of plasma. It was added and stored on ice for 30 minutes. It was then prepared by centrifugation at 1500 g for 30 minutes.

실시예 1: 염화코발트를 첨가한 혼합물로부터 엑소좀 추출물의 제조Example 1: Preparation of exosome extract from a mixture with cobalt chloride added

사람의 혈장(Plasma)에서 엑소좀을 ExoQquick®을 사용하여 조추출한 뒤 인산완충용액(phosphate buffer saline, PBS) 1 mL에 풀어 준비하였다. 0.2 M 염화코발트(CoCl2) 스탁(stock)을 준비하였다. 0.2 M 염화코발트(CoCl2) 스탁을 최종 농도가 400uM로 되도록 첨가한 혼합물을 제조하였다. Exosomes were extracted from human plasma (Plasma) using ExoQquick® and prepared by releasing them in 1 mL of phosphate buffer saline (PBS). A 0.2 M cobalt chloride (CoCl 2 ) stock was prepared. A mixture was prepared in which 0.2 M cobalt chloride (CoCl 2 ) stock was added to a final concentration of 400 uM.

염화코발트(CoCl2)를 첨가한 혼합물을 37℃ 진탕(shaker) 배양기에 넣어 10분 동안 배양하였다. 그런 다음 엑소좀 추출 용액(Exo-Quick)을 첨가하여 30분간 4℃(ice)에서 보관하였다. 30분 경과 후 13,000rpm로 3분 동안 원심분리를 시행하여 엑소좀을 추출하였다. 추출한 엑소좀을 새로 PBS에 풀어 여과기(filter)를 이용하여 세척(washing)하여, 엑소좀 추출물을 제조하였다. The mixture to which cobalt chloride (CoCl 2 ) was added was placed in a 37°C shaker incubator and incubated for 10 minutes. Then, exosome extraction solution (Exo-Quick) was added and stored at 4°C (ice) for 30 minutes. After 30 minutes, exosomes were extracted by centrifugation at 13,000 rpm for 3 minutes. The extracted exosomes were newly washed with PBS and washed using a filter to prepare exosome extracts.

도 1은 일 구체예(염화코발트 처리군)에 따른 엑소좀 전달 방법을 도식화한 그림이다. 도 1에서는 엑소좀을 조추출한 뒤 0.2 M 염화코발트(CoCl2) 용액을 포함하는 PBS에 풀고; 이를 37℃에서 10분간 진탕 배양; ice (4℃냉장고)에서 30분간 배양; 엑소좀을 추출; 및 세척하여, 세포에 처리하는 단계를 포함하는, 엑소좀 전달 방법을 나타낸다. 0.2 M 염화코발트(CoCl2) 용액 대신 동일한 농도의 다른 염소계열(Cocl2, Mgcl2, Cucl2) 용액을 사용한 시험군을 동일한 방법으로 제조하였다. 1 is a diagram showing a method for delivering exosomes according to an embodiment (cobalt chloride treatment group). In Figure 1, the crude exosomes were extracted and then unpacked in PBS containing 0.2 M cobalt chloride (CoCl 2 ) solution; This was incubated with shaking at 37°C for 10 minutes; incubate for 30 minutes on ice (4°C refrigerator); Exosome extraction; And washing, and treating the cells. A test group using different chlorine-based (Cocl 2 , Mgcl 2 , Cucl 2 ) solutions of the same concentration instead of the 0.2 M cobalt chloride (CoCl 2 ) solution was prepared in the same manner.

비교예 1 : 염화칼슘을 첨가한 혼합물로부터 엑소좀 추출물의 제조Comparative Example 1: Preparation of exosome extract from a mixture added with calcium chloride

0.2 M 염화코발트 대신에 0.2 M 염화칼슘(Cacl2)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 엑소좀 추출물을 제조하였다.Exosomal extracts were prepared in the same manner as in Example 1, except that 0.2 M calcium chloride (Cacl 2 ) was used instead of 0.2 M cobalt chloride.

비교예 2 : 염화마그네슘을 첨가한 혼합물로부터 엑소좀 추출물의 제조Comparative Example 2: Preparation of exosome extract from a mixture added with magnesium chloride

0.2 M 염화코발트 대신에 0.2 M 염화마그네슘(Mgcl2)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 엑소좀 추출물을 제조하였다.Exosomal extracts were prepared in the same manner as in Example 1, except that 0.2 M magnesium chloride (Mgcl 2 ) was used instead of 0.2 M cobalt chloride.

비교예 3 : 염화구리를 첨가한 혼합물로부터 엑소좀 추출물의 제조Comparative Example 3: Preparation of exosome extract from a mixture of copper chloride

0.2 M 염화코발트 대신에 0.2 M 염화구리(Cucl2)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 엑소좀 추출물을 제조하였다.Exosomal extract was prepared in the same manner as in Example 1, except that 0.2 M copper chloride (Cucl 2 ) was used instead of 0.2 M cobalt chloride.

대조예 : 엑소좀 추출물의 제조Control Example: Preparation of exosome extract

0.2 M 염화코발트를 첨가하지 않는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 엑소좀 추출물을 제조하였다. 구체적으로는 사람의 혈장에서 엑소좀을 조추출한 뒤 인산완충용액 1mL에 풀어 준비하였다. 이를 37℃진탕 배양기에 넣어 10분 동안 배양하였다. 그런 다음 엑소좀 추출 용액(Exo-Quick)을 첨가하여 30분간 4℃(ice)에서 보관하였다. 30분 경과 후 13,000rpm로 3분 동안 원심분리를 시행하여 엑소좀을 추출하였다. 추출한 엑소좀을 새로 PBS에 풀어 여과기를 이용하여 세척하여, 엑소좀 추출물을 제조하였다. Exosomal extract was prepared in the same manner as in Example 1, except that 0.2 M cobalt chloride was not added. Specifically, exosomes were extracted from human plasma and prepared by releasing them in 1 mL of a phosphate buffer solution. This was put in a 37°C shaking incubator and incubated for 10 minutes. Then, exosome extraction solution (Exo-Quick) was added and stored at 4°C (ice) for 30 minutes. After 30 minutes, exosomes were extracted by centrifugation at 13,000 rpm for 3 minutes. The extracted exosomes were newly washed with PBS and washed using a filter to prepare exosome extracts.

시험예 1: 엑소좀의 전달 효율 측정 (1)Test Example 1: Measurement of delivery efficiency of exosomes (1)

엑소좀을 처리하기 2일 전, H9C2 쥐 심장근육모 세포주를 6-웰 배양 접시에 배양하였다. 상기 세포에 실시예 1, 비교예 1 내지 3, 및 대조예에서 추출 및 세척하여 제조한 각각의 엑소좀 추출물을 처리하였다. Two days before treatment with exosomes, H9C2 rat cardiomyocyte cell lines were cultured in 6-well culture dishes. Each exosome extract prepared by extracting and washing in Example 1, Comparative Examples 1 to 3, and the control cells was treated with the cells.

배양된 H9C2 쥐 심장근육모 세포주에 각각 50 ㎍의 실시예 1, 또는 비교예 1 내지 3을 처리한 군을 시험군으로 하였다. 또한, 배양된 H9C2 쥐 심장근육모 세포주에 50 ㎍의 대조예를 처리한 군을 대조군으로 하였다. The cultured H9C2 rat cardiomyocyte cell line was treated with 50 μg of Example 1 or Comparative Examples 1 to 3, respectively, as a test group. In addition, the group treated with the control example of 50 µg in the cultured H9C2 rat cardiomyocyte cell line was used as a control.

도 2 및 도 3에서 실시예 1의 엑소좀 추출물을 처리한 군을 염화코발트(CoCl2) 처리군으로 나타내고, 비교예 1 내지 3의 엑소좀 추출물을 처리한 군을 각각 염화칼슘(Cacl2) 처리군, 염화마그네슘(Mgcl2) 처리군, 및 염화구리(Cucl2) 처리군으로 나타내었다. 또한, 대조예를 처리한 군을 대조군(Nomal Exo)으로 나타내었다.The groups treated with the exosome extract of Example 1 in FIGS. 2 and 3 are shown as cobalt chloride (CoCl 2 ) treated groups, and the groups treated with the exosome extracts of Comparative Examples 1 to 3 are treated with calcium chloride (Cacl 2 ), respectively. Group, magnesium chloride (Mgcl 2 ) treatment group, and copper chloride (Cucl 2 ) treatment group. In addition, the group treated with the control example was shown as a control (Nomal Exo).

(1) 공초점 형광 현미경 관찰(1) Confocal fluorescence microscopy observation

실시예 1, 비교예 1 내지 3, 및 대조예로 각각 처리한 H9C2 쥐 심장근육모 세포주를 공초점 형광 현미경(Zeiss, LSM710)을 이용하여 관찰하고, 형광 이미지를 얻었다. Example 1, Comparative Examples 1 to 3, and H9C2 rat cardiomyocyte cell lines, respectively, treated as a control example were observed using a confocal fluorescence microscope (Zeiss, LSM710) to obtain fluorescence images.

도 2는 대조군(Nomal Exo), 염화칼슘 처리군(Cacl2), 염화코발트(Cocl2) 처리군, 염화마그네슘(Mgcl2) 처리군, 및 염화구리(Cucl2) 처리군 각각에서 심장 세포주에 대한 엑소좀 전달 정도를 보여주는 공초점 형광 현미경 이미지이다.Figure 2 is a control (Nomal Exo), calcium chloride treatment group (Cacl 2 ), cobalt chloride (Cocl 2 ) treatment group, magnesium chloride (Mgcl 2 ) treatment group, and copper chloride (Cucl 2 ) treatment group, respectively, for the heart cell line This is a confocal fluorescence microscope image showing the degree of exosome delivery.

(2) 형광 강도 측정 (2) Fluorescence intensity measurement

실시예 1, 비교예 1 내지 3, 및 대조예로 각각 처리한 H9C2 쥐 심장근육모 세포주로부터 산출되는 형광 강도를 405nm와 543nm의 형광필터를 통해 측정하여, 형광 강도를 정량화하여 나타내었다. The fluorescence intensities calculated from the H9C2 murine cardiomyocyte cell lines treated with Example 1, Comparative Examples 1 to 3, and Comparative Examples were measured through 405 nm and 543 nm fluorescence filters, and the fluorescence intensity was quantified.

도 3은 대조군(Nomal Exo), 염화칼슘 처리군(Cacl2), 염화코발트(Cocl2) 처리군, 염화마그네슘(Mgcl2) 처리군, 및 염화구리(Cucl2) 처리군 각각에서 심장 세포주의 엑소좀 전달 정도를 보여주는 형광 강도를 나타낸 그래프이다.Figure 3 is a control (Nomal Exo), calcium chloride treatment group (Cacl 2 ), cobalt chloride (Cocl 2 ) treatment group, magnesium chloride (Mgcl 2 ) treatment group, and copper chloride (Cucl 2 ) treatment group exo in the heart cell line, respectively It is a graph showing the fluorescence intensity showing the degree of delivery.

도 2 및 도 3에서와 같이, H9C2 쥐 심장근육모 세포주에서는 대조군에 비하여, 염화코발트(Cocl2) 처리군 또는 염화칼슘(Cacl2) 처리군에서 엑소좀의 세포 내 흡수율이 유의하게 증가하였음을 확인하였다(p<0.05). 2 and 3, in the H9C2 rat cardiomyocyte cell line, it was confirmed that the intracellular uptake of exosomes was significantly increased in the cobalt chloride (Cocl 2 ) treated group or the calcium chloride (Cacl 2 ) treated group compared to the control group. Was done (p<0.05).

시험예 2: 세포 생존률 측정 (1)Test Example 2: Cell viability measurement (1)

실시예 1, 비교예 1 내지 3, 및 대조예로 각각 처리한 H9C2 쥐 심장근육모 세포주의 세포 생존률(Cell viability)(%)를 MTS [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium] 분석(assay)을 사용하여 측정하였다. 이 분석은 효소 결합 면역 흡착 검정 플레이트 리더기(Molecular Devices)를 통해 측정되었다. 도 4에서 실시예 1의 엑소좀 추출물을 처리한 군을 염화코발트(CoCl2) 처리군으로 나타내고, 비교예 1 내지 3의 엑소좀 추출물을 처리한 군을 각각 염화칼슘(Cacl2) 처리군, 염화마그네슘(Mgcl2) 처리군, 및 염화구리(Cucl2) 처리군으로 나타내었다. 또한, 대조예를 처리한 군을 대조군(Nomal Exo)으로 나타내었다.Cell viability (%) of H9C2 murine cardiomyocyte cell lines treated with Example 1, Comparative Examples 1 to 3, and Comparative Examples, respectively, was MTS [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)- 5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium] was measured using the assay. This assay was measured via an enzyme-linked immunosorbent assay plate reader (Molecular Devices). In FIG. 4, the group treated with the exosome extract of Example 1 is shown as a cobalt chloride (CoCl 2 ) treated group, and the groups treated with the exosome extracts of Comparative Examples 1 to 3 are treated with calcium chloride (Cacl 2 ) and chloride respectively. Magnesium (Mgcl 2 ) treatment group and copper chloride (Cucl 2 ) treatment group. In addition, the group treated with the control example was shown as a control (Nomal Exo).

도 4는 대조군(Nomal Exo), 염화칼슘 처리군(Cacl2), 염화코발트(Cocl2) 처리군, 염화마그네슘(Mgcl2) 처리군, 및 염화구리(Cucl2) 처리군 각각에서 심장 세포주의 세포 생존률(viability)(%)을 보여주는 그래프이다.Figure 4 is a control (Nomal Exo), calcium chloride treatment group (Cacl 2 ), cobalt chloride (Cocl 2 ) treatment group, magnesium chloride (Mgcl 2 ) treatment group, and copper chloride (Cucl 2 ) treatment group, respectively, cells of the heart cell line It is a graph showing the viability (%).

도 4에서와 같이, 염화마그네슘(Mgcl2) 처리 군에서는 낮은 세포 생존률을 보였으며, 염화코발트(Cocl2) 처리군에서는 염화칼슘(Cacl2)과 비슷하거나 다소 낮은 정도의 세포 생존률을 보였다. As shown in FIG. 4, the magnesium chloride (Mgcl 2 ) treated group showed a low cell survival rate, and the cobalt chloride (Cocl 2 ) treated group showed a similar or somewhat lower cell survival rate than calcium chloride (Cacl 2 ).

염화칼슘(Cacl2) 용액에서의 칼슘 이온의 경우 세포 내로 다량 흡수되면 세포 독성을 나타내거나, 인체 내 존재하는 칼슘 이온 농도와 중첩으로 인한 오차 발생이 커지고, 세포나 동물에서의 칼슘을 측정하는 실험에 있어서는 사용이 불가하여, 측정 방법으로 사용하기에 무리가 있으므로, 비슷한 정도의 세포 생존률을 보이는 염화코발트(Cocl2) 용액을 사용할 수 있다. In the case of calcium ions in the calcium chloride (Cacl 2 ) solution, when a large amount is absorbed into the cell, it shows cytotoxicity, or an error occurs due to the concentration and overlap of calcium ions present in the human body. Since it cannot be used, it is difficult to use it as a measurement method, so a cobalt chloride (Cocl 2 ) solution showing similar cell viability can be used.

비교예 4 : 아세트산코발트를 첨가한 혼합물로부터 엑소좀 추출물의 제조Comparative Example 4: Preparation of exosome extract from mixture added with cobalt acetate

0.2 M 염화코발트 대신에 0.2 M 아세트산코발트(C4H6CoO4)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 엑소좀 추출물을 제조하였다.Exosomal extract was prepared in the same manner as in Example 1, except that 0.2 M cobalt acetate (C 4 H 6 CoO 4 ) was used instead of 0.2 M cobalt chloride.

비교예 5 : 질산코발트를 첨가한 혼합물로부터 엑소좀 추출물의 제조Comparative Example 5: Preparation of exosome extract from mixture added with cobalt nitrate

0.2 M 염화코발트 대신에 0.2 M 질산코발트(Co(NO3)2)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 엑소좀 추출물을 제조하였다.Exosomes extracts were prepared in the same manner as in Example 1, except that 0.2 M cobalt nitrate (Co(NO 3 ) 2 ) was used instead of 0.2 M cobalt chloride.

비교예 6 : 황산코발트수화물을 첨가한 혼합물로부터 엑소좀 추출물의 제조Comparative Example 6: Preparation of exosome extract from mixture added with cobalt sulfate hydrate

0.2 M 염화코발트 대신에 0.2 M 황산코발트수화물(CoSO4·7H2O)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 엑소좀 추출물을 제조하였다.An exosome extract was prepared in the same manner as in Example 1, except that 0.2 M cobalt sulfate hydrate (CoSO 4 ·7H 2 O) was used instead of 0.2 M cobalt chloride.

시험예 3: 엑소좀의 전달 효율 측정 (2)Test Example 3: Measurement of delivery efficiency of exosomes (2)

엑소좀을 처리하기 2일 전, H9C2 쥐 심장근육모 세포주를 6-웰 배양 접시에 배양하였다. 상기 세포에 실시예 1, 비교예 4 내지 6, 및 대조예에서 추출 및 세척하여 제조한 각각의 엑소좀 추출물을 처리하였다. Two days before treatment with exosomes, H9C2 rat cardiomyocyte cell lines were cultured in 6-well culture dishes. Each exosome extract prepared by extracting and washing in Example 1, Comparative Examples 4 to 6, and the control cells was treated with the cells.

배양된 H9C2 쥐 심장근육모 세포주에 각각 50 ㎍의 실시예 1, 또는 비교예 4 내지 6을 처리한 군을 시험군으로 하였다. 또한, 배양된 H9C2 쥐 심장근육모 세포주에 50 ㎍의 대조예를 처리한 군을 대조군으로 하였다. The cultured H9C2 rat cardiomyocyte cell line was treated with 50 µg of Example 1 or Comparative Examples 4 to 6, respectively, as a test group. In addition, the group treated with the control example of 50 µg in the cultured H9C2 rat cardiomyocyte cell line was used as a control.

도 5 및 도 6에서 실시예 1의 엑소좀 추출물을 처리한 군을 염화코발트(CoCl2) 처리군으로 나타내고, 비교예 4 내지 6의 엑소좀 추출물을 처리한 군을 각각 아세트산코발트(C4H6CoO4) 처리군, 질산코발트(Co(NO3)2) 처리군, 황산코발트수화물(CoSO4·7H2O) 처리군으로 나타내었다. 또한, 대조예를 처리한 군을 대조군(Nomal Exo)으로 나타내었다.The groups treated with the exosome extract of Example 1 in FIGS. 5 and 6 are shown as cobalt chloride (CoCl 2 ) treated groups, and the groups treated with the exosome extracts of Comparative Examples 4 to 6 are cobalt acetate (C 4 H), respectively. 6 CoO 4 ) treatment group, cobalt nitrate (Co(NO 3 ) 2 ) treatment group, cobalt sulfate hydrate (CoSO 4 ·7H 2 O) treatment group. In addition, the group treated with the control example was shown as a control (Nomal Exo).

(1) 공초점 형광 현미경 관찰(1) Confocal fluorescence microscopy observation

실시예 1, 비교예 4 내지 6, 및 대조예로 각각 처리한 H9C2 쥐 심장근육모 세포주를 공초점 형광 현미경(Zeiss, LSM710)을 이용하여 관찰하고, 형광 이미지를 얻었다. Example 1, Comparative Examples 4 to 6, and each of the H9C2 rat cardiomyocyte cell line treated as a control example was observed using a confocal fluorescence microscope (Zeiss, LSM710) to obtain a fluorescence image.

도 5는 대조군(Nomal Exo), 아세트산코발트(C4H6CoO4) 처리군, 질산코발트(Co(NO3)2) 처리군, 황산코발트수화물(CoSO4·7H2O) 처리군 각각에서 심장 세포주에 대한 엑소좀 전달 정도를 보여주는 공초점 형광 현미경 이미지이다.5 is a control group (Nomal Exo), cobalt acetate (C 4 H 6 CoO 4 ) treatment group, cobalt nitrate (Co(NO 3 ) 2 ) treatment group, cobalt sulfate hydrate (CoSO 4 · 7H 2 O) treatment group, respectively Confocal fluorescence microscopy image showing the extent of exosome delivery to the heart cell line.

(2) 형광 강도 측정 (2) Fluorescence intensity measurement

실시예 1, 비교예 4 내지 6, 및 대조예로 각각 처리한 H9C2 쥐 심장근육모 세포주로부터 산출되는 형광 강도를 405nm와 543nm의 형광필터를 통해 측정하여, 형광 강도를 정량화하여 나타내었다. The fluorescence intensities calculated from the H9C2 murine cardiomyocyte cell lines treated with Example 1, Comparative Examples 4 to 6, and Comparative Examples were measured through 405 nm and 543 nm fluorescence filters to quantify the fluorescence intensity.

도 6은 대조군(Nomal Exo), 아세트산코발트(C4H6CoO4) 처리군, 질산코발트(Co(NO3)2) 처리군, 황산코발트수화물(CoSO4·7H2O) 처리군 각각에서 심장 세포주의 엑소좀 전달 정도를 보여주는 형광 강도를 나타낸 그래프이다.6 is a control group (Nomal Exo), cobalt acetate (C 4 H 6 CoO 4 ) treatment group, cobalt nitrate (Co(NO 3 ) 2 ) treatment group, cobalt sulfate hydrate (CoSO 4 · 7H 2 O) treatment group, respectively It is a graph showing the fluorescence intensity showing the degree of exosome delivery of the heart cell line.

도 5 및 도 6에서와 같이, H9C2 쥐 심장근육모 세포주에서는 대조군, 또는 아세트산코발트(C4H6CoO4) 처리군, 질산코발트(Co(NO3)2) 처리군, 또는 황산코발트수화물(CoSO4·7H2O)에 비하여, 염화코발트(Cocl2) 처리군에서 엑소좀의 세포 내 흡수율이 유의하게 증가하였음을 확인하였다(p<0.05).5 and 6, in the H9C2 rat cardiomyocyte cell line, the control group, or cobalt acetate (C 4 H 6 CoO 4 ) treated group, cobalt nitrate (Co(NO 3 ) 2 ) treated group, or cobalt sulfate hydrate ( Compared to CoSO 4 ·7H 2 O), it was confirmed that the intracellular uptake of exosomes was significantly increased in the cobalt chloride (Cocl 2 ) treated group (p<0.05).

시험예 4: 세포 생존률 측정 (2)Test Example 4: Cell viability measurement (2)

실시예 1, 비교예 4 내지 6, 및 대조예로 각각 처리한 H9C2 쥐 심장근육모 세포주의 세포 생존률(Cell viability)(%)를 MTS 분석을 사용하여 측정하였다. 이 분석은 효소 결합 면역 흡착 검정 플레이트 리더기(Molecular Devices)를 통해 측정되었다. 도 7에서 실시예 1의 엑소좀 추출물을 처리한 군을 염화코발트(CoCl2) 처리군으로 나타내고, 비교예 4 내지 6의 엑소좀 추출물을 처리한 군을 각각 아세트산코발트(C4H6CoO4) 처리군, 질산코발트(Co(NO3)2) 처리군, 황산코발트수화물(CoSO4·7H2O) 처리군으로 나타내었다. 또한, 대조예를 처리한 군을 대조군(Nomal Exo)으로 나타내었다.Cell viability (%) of the H9C2 murine cardiomyocyte cell lines treated with Examples 1, Comparative Examples 4 to 6, and Control Examples, respectively, was measured using MTS analysis. This assay was measured via an enzyme-linked immunosorbent assay plate reader (Molecular Devices). In FIG. 7, the group treated with the exosome extract of Example 1 is represented by a group treated with cobalt chloride (CoCl 2 ), and the groups treated with the exosome extracts of Comparative Examples 4 to 6 are each treated with cobalt acetate (C 4 H 6 CoO 4 ). ) Treatment group, cobalt nitrate (Co(NO 3 ) 2 ) treatment group, cobalt sulfate hydrate (CoSO 4 ·7H 2 O) treatment group. In addition, the group treated with the control example was shown as a control (Nomal Exo).

도 7은 대조군(Nomal Exo), 아세트산코발트(C4H6CoO4) 처리군, 질산코발트(Co(NO3)2) 처리군, 및 황산코발트수화물(CoSO4·7H2O) 처리군 각각에서 심장 세포주의 세포 생존률(viability)(%)을 보여주는 그래프이다. 도 7에서와 같이, 각 처리군이 유사한 생존률을 보였다.7 is a control group (Nomal Exo), cobalt acetate (C 4 H 6 CoO 4 ) treatment group, cobalt nitrate (Co(NO 3 ) 2 ) treatment group, and cobalt sulfate hydrate (CoSO 4 ·7H 2 O) treatment group, respectively Is a graph showing the cell viability (%) of the heart cell line. As shown in Figure 7, each treatment group showed a similar survival rate.

도 2 내지 도 7의 결과로부터 실시예 1에서 얻은 엑소좀 추출물로 처리한 염화코발트(CoCl2) 처리군이 엑소좀의 전달 효율과 세포 생존률 모두를 고려할 때 대조군, 코발트 이외 다른 양이온을 포함하는 염 처리군, 또는 염소 이외 다른 음이온을 포함하는 염 처리군보다 우수한 효과를 나타냄을 알 수 있다.From the results of FIGS. 2 to 7, when the cobalt chloride (CoCl 2 ) treated group treated with the exosome extract obtained in Example 1 considered both delivery efficiency and cell viability of exosomes, a salt containing a cation other than the control group and cobalt It can be seen that the treatment group, or a salt treatment group containing anions other than chlorine, exhibits superior effects.

이제까지 본 발명에 대하여 그 구체예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로, 상기 개시된 구체예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다. So far, the present invention has been focused on the specific examples. Those skilled in the art to which the present invention pertains will understand that the present invention can be implemented in a modified form without departing from the essential characteristics of the present invention. Therefore, the embodiments disclosed above should be considered from an explanatory point of view rather than a restrictive point of view. The scope of the present invention is shown in the claims rather than the foregoing description, and all differences within the equivalent range should be interpreted as being included in the present invention.

Claims (9)

엑소좀을 포함하는 시료에 염화코발트(CoCl2) 용액을 첨가하여 혼합 용액을 제조하는 단계;
혼합 용액을 배양하는 단계; 및
배양된 용액을 분리하여 엑소좀을 추출하는 단계를 포함하는, 시료로부터 엑소좀을 추출하는 방법. Preparing a mixed solution by adding a solution of cobalt chloride (CoCl 2 ) to a sample containing exosomes;
Culturing the mixed solution; And
A method of extracting exosomes from a sample, comprising separating the cultured solution to extract exosomes. 청구항 1에 있어서, 상기 염화코발트(CoCl2)용액은 0.1 내지 0.3 M 염화코발트 용액인 것인, 엑소좀을 추출하는 방법. The method of claim 1, wherein the cobalt chloride (CoCl 2 ) solution is a 0.1 to 0.3 M cobalt chloride solution. 청구항 1에 있어서, 상기 시료는 혈장, 혈청, 혈액, 및 타액 중 어느 하나인 것인, 엑소좀을 추출하는 방법. The method of claim 1, wherein the sample is any one of plasma, serum, blood, and saliva. 청구항 1에 있어서, 상기 혼합 용액의 배양 단계는 35℃ 내지 40℃에서 배양하고, 이어서 0 내지 5℃에서 배양하는 단계를 포함하는 것인, 엑소좀을 추출하는 방법. The method according to claim 1, wherein the step of culturing the mixed solution comprises culturing at 35°C to 40°C and then culturing at 0 to 5°C. 청구항 1에 있어서, 상기 혼합 용액의 배양 단계는 37℃에서 5 내지 20분간 배양하고, 이어서 4℃에서 20분 내지 1시간 동안 배양하는 단계를 포함하는 것인, 엑소좀을 추출하는 방법. The method according to claim 1, wherein the step of culturing the mixed solution comprises culturing at 37°C for 5 to 20 minutes, and then culturing at 4°C for 20 minutes to 1 hour. 청구항 1에 있어서, 상기 엑소좀을 추출하는 단계는 10,000 내지 20,000rpm의 원심분리기를 이용하여 분리하는 것인, 엑소좀을 추출하는 방법. The method according to claim 1, The step of extracting the exosomes is to separate using a centrifuge of 10,000 to 20,000rpm, a method for extracting the exosomes. 청구항 1에 있어서, 상기 엑소좀은 혈액 또는 혈장 유래인 것인, 엑소좀을 추출하는 방법. The method according to claim 1, The exosomes will be derived from blood or plasma, a method for extracting the exosomes. 청구항 1에 있어서, 상기 엑소좀을 포함하는 시료는 혈장 유래 엑소좀 시료에 엑소퀵(ExoQquick)®을 첨가하여 얻은 것인, 엑소좀을 추출하는 방법.The method of claim 1, wherein the sample containing the exosome is obtained by adding ExoQquick® to a plasma-derived exosome sample. 청구항 1의 엑소좀의 추출 방법에 사용되는 염화코발트(CoCl2) 용액을 포함하는 엑소좀 추출 조성물.
Exosome extraction composition comprising a solution of cobalt chloride (CoCl 2 ) used in the method for extracting exosomes of claim 1.
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Edwin van der pol et al., Pharmacological Reviews July 2012, 64 (3) 676-705

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