KR20200085752A

KR20200085752A - 생세포 시각화 및 분석

Info

Publication number: KR20200085752A
Application number: KR1020207012646A
Authority: KR
Inventors: 다니엘 애플던; 에릭 엔슬리; 네빈 홀츠; 브래드 니글; 데이비드 록; 커크 슈뢰더
Original assignee: 에센 인스트루먼츠, 인크. 디/비/에이/ 에센 바이오사이언스, 인크.
Priority date: 2017-11-10
Filing date: 2018-10-30
Publication date: 2020-07-15
Also published as: US11790527B2; US11481895B2; US20230005143A1; JP7407107B2; EP3707721A1; WO2019094230A1; CN111295712A; EP3707721A4; CN111295712B; US20210065362A1; JP2021502055A

Abstract

배양기 내 세포 샘플들을 자동으로 이미징 및 분석하기 위한 시스템들 및 방법들이 제공된다. 구동 현미경이 수 일, 수 주 또는 수 개월에 걸쳐 샘플 용기의 웰들 내 샘플들의 이미지들을 생성하도록 동작한다. 특정 웰의 각 스캔마다 복수의 이미지가 생성되고, 그러한 스캔 내 이미지들을 사용하여 웰 내 대사 활성 세포들이 이미징 및 분석된다. 이러한 분석은 스캔에 걸쳐 각 픽셀 마다 최대 강도 값에서 최소 강도 값을 뺀 값으로 "레인지 이미지(range image)"를 생성하는 것을 포함한다. 그에 따라 이러한 레인지 이미지는 이미징할 때 지속적으로 높은 강도들을 보이는 영역들(예를 들어, 셀 활성과 관련되지 않는 다량의 자가 형광을 보이는 영역들)을 덜 강조하여 스캔 기간에 걸쳐 활성의 변화를 보이는 세포들 또는 세포들의 부분들(예를 들어, 신경들, 근세포들, 심장 근육 세포들)을 강조한다.

Description

생세포 시각화 및 분석

관련 출원 상호 참조

본 출원은 2017년 1월 10일에 출원된 미국 가 특허 출원 번호 62/584,388에 대한 우선권을 주장하며, 이는 여기에 참고로 통합된다.

세포들(예를 들어, 배양된 세포들, 체외 이식된 조직 샘플들)은 다양한 매체에서 배양되고 다양한 조건(예를 들어, 온도, 용존 가스 레벨, 방사선, 습도, 첨가된 물질들, 전기장 또는 자기장, 바이러스, 미생물)에 노출되어 적용된 조건들에 대한 세포들의 반응이 평가될 수 있다. 적용된 조건들에 대한 세포들의 반응은 약물 또는 치료의 효능을 평가, 물질(예를 들어, 실험 약물 또는 치료의)의 독성을 평가, 세포들의 유전자 조작의 효과를 조사, 세포들의 대사체학, 구조 또는 다른 속성들 및/또는 그로부터 형성되는 조직을 조사, 또는 몇몇 다른 정보를 결정하기 위해 측정될 수 있다. 이러한 평가는 인큐베이터에서 샘플을 제거하고 그것을 이미징하는 것(예를 들어, 형광 현미경 또는 몇몇 다른 이미징 장치를 사용하는 것)을 포함할 수 있다. 이러한 이미징은 대조 작용제 또는 화학 시약의 첨가를 포함할 수 있으며, 이는 샘플을 파괴시킬 수 있다. 그러나, 이러한 방법은 이미징되고 있는 샘플을 교란시키므로, 시간에 따른 샘플들의 모집단의 반응을 평가하기 위해 각각의 상이한 시간 지속 시간들 동안 다수의 샘플 세트가 배양될 것을 필요로 한다.

본 개시의 일 양태는 (i) 세포 배양 용기의 동영상을 캡처하는 단계; 및 (ii) 상기 동영상으로부터 정적 레인지 이미지를 생성하는 단계로서, 상기 레인지 이미지는 완전한 스캔 기간에 걸쳐 각 픽셀 위치에서 최대 형광 강도에서 최소 형광 강도를 뺀 값을 나타내는 픽셀들로 구성되는, 상기 정적 레인지 이미지를 생성하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.

본 개시의 다른 양태는 하나 이상의 시간 기간 동안 생활성 세포들을 식별하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은, 상기 하나 이상의 시간 기간의 각 시간 기간마다: (i) 샘플 용기 내에 함유된 샘플의 복수의 형광 활성 이미지를 생성하는 단계로서, 상기 샘플은 생활성 세포들을 포함하고, 상기 복수의 형광 활성 이미지의 각 이미지는 각 복수의 픽셀 값을 포함하며, 각 픽셀 값은 이미지 프레임 내 각각의 픽셀 위치에 대응하는, 상기 복수의 형광 활성 이미지를 생성하는 단계; (ii) 상기 형광 레인지 이미지에 대한 복수의 픽셀 값을 결정함으로써 상기 복수의 형광 활성 이미지로부터 형광 레인지 이미지를 생성하는 단계로서, 상기 형광 레인지 이미지에 대한 소정의 픽셀 값을 결정하는 단계는 상기 복수의 형광 활성 이미지 각각으로부터, 상기 이미지 프레임 내 상기 소정의 픽셀 값의 픽셀 위치에 대응하는 픽셀 위치들을 갖는 픽셀 값 세트의 레인지를 결정하는 단계를 포함하는, 상기 복수의 형광 활성 이미지로부터 형광 레인지 이미지를 생성하는 단계; (iii) 상기 형광 레인지 이미지에 기초하여, 대응하는 시간 기간 동안 상기 샘플 용기 내 하나 이상의 활성 개체의 위치를 상기 이미지 프레임에 관해 결정하는 단계로서, 상기 하나 이상의 활성 개체 각각은 상기 대응하는 시간 기간 동안 상기 샘플 내에 존재하는 적어도 하나의 각 생활성 세포의 일 부분인, 상기 활성 개체의 위치를 결정하는 단계; 및 (iv) 상기 대응하는 시간 기간 동안 상기 샘플 용기 내 상기 하나 이상의 활성 개체의 각 활성 개체마다, 상기 대응하는 시간 기간에 걸쳐 상기 하나 이상의 활성 개체의 각 시변 활성 레벨을 결정하는 단계를 포함한다. 상기 대응하는 시간 기간에 걸쳐 상기 하나 이상의 활성 개체의 각 시변 활성 레벨을 결정하는 단계는 상기 복수의 형광 활성 이미지 각각으로부터, 대응하는 활성 개체의 결정된 상기 위치에 근접한 픽셀 위치들을 갖는 픽셀 값 세트에 기초하여 각 시변 활성 레벨을 결정하는 단계를 포함할 수 있다.

본 개시의 또 다른 양태는 하나 이상의 시간 기간 동안 생활성 세포들을 식별하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은, 상기 하나 이상의 시간 기간의 각 시간 기간마다: (i) 샘플 용기 내에 함유된 샘플의 복수의 형광 활성 이미지를 생성하는 단계로서, 상기 샘플은 생활성 세포들을 포함하고, 상기 복수의 형광 활성 이미지의 각 이미지는 각 복수의 픽셀 값을 포함하며, 각 픽셀 값은 이미지 프레임 내 각각의 픽셀 위치에 대응하는, 상기 복수의 형광 활성 이미지를 생성하는 단계; (ii) 대응하는 시간 기간 동안 상기 샘플 용기 내 하나 이상의 활성 개체의 위치를 상기 이미지 프레임에 관해 결정하는 단계로서, 상기 하나 이상의 활성 개체 각각은 상기 대응하는 시간 기간 동안 상기 샘플 내에 존재하는 적어도 하나의 각 생활성 세포의 일 부분인, 상기 활성 개체의 위치를 결정하는 단계; (iii) 상기 대응하는 시간 기간 동안 상기 샘플 용기 내 상기 하나 이상의 활성 개체의 각 활성 개체마다, 상기 대응하는 시간 기간에 걸쳐 각 시변 활성 레벨을 결정하는 단계; 및 (iv) 상기 하나 이상의 활성 개체에 대해 결정되는 상기 시변 활성 레벨들에 기초하여, 상기 특정 활성 개체에 대해 결정된 상기 시변 활성 레벨이 적어도 하나의 버스트를 보인다고 결정함으로써 상기 하나 이상의 활성 개체로부터 활성 개체들의 서브 세트를 선택하는 단계를 포함한다. 상기 대응하는 시간 기간에 걸쳐 각 시변 활성 레벨을 결정하는 단계는 상기 복수의 형광 활성 이미지 각각으로부터, 상기 하나 이상의 활성 개체의 결정된 각각의 상기 위치에 근접한 픽셀 위치들을 갖는 픽셀 값들의 각 세트에 기초하여 상기 각 시변 활성 레벨을 결정하는 단계를 포함할 수 있다.

본 개시의 또 다른 양태는 컴퓨팅 디바이스의 하나 이상의 프로세서에 의해 실행될 때, 상기 컴퓨팅 디바이스로 하여금 여기에 설명된 상기 방법들 중 하나 이상의 방법을 수행하는 컴퓨터 동작들을 수행하게 하는 적어도 컴퓨터 판독 가능한 명령들을 저장하도록 구성된 비일시적 컴퓨터 판독 가능한 매체에 관한 것이다.

본 개시의 또 다른 양태는 (i) 하나 이상의 프로세서; 및 (ii) 상기 하나 이상의 프로세서에 의해 실행될 때, 상기 시스템으로 하여금 여기에 설명된 상기 방법들 중 하나 이상의 방법을 수행하게 하는 적어도 컴퓨터 판독 가능한 명령들을 저장하도록 구성된 비일시적 컴퓨터 판독 가능한 매체에 관한 것이다.

이러한 뿐만 아니라 다른 양태들, 이점들 및 대안 예들이 적절한 경우 첨부 도면들을 참조하여 다음의 상세한 설명을 읽음으로써 해당 기술분야의 통상의 기술자들에게 명백해질 것이다. 또한, 본 발멸의 내용 섹션 및 본 문서의 다른 곳에서 제공되는 설명은 청구된 기술 요지를 제한하려는 것이 아니라 예로서 예시하기 위한 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 세포들을 함유하는 예시적인 샘플을 도시한다.
도 2a는 도 1의 샘플의 제1 시점에 얻어진 이미지를 도시한다.
도 2b는 도 1의 샘플의 제2 시점에 얻어진 이미지를 도시한다.
도 2c는 도 1의 샘플의 제3 시점에 얻어진 이미지를 도시한다.
도 2d는 도 1의 샘플의 제4 시점에 얻어진 이미지를 도시한다.
도 3은 도 2a 내지 도 2d의 이미지들로부터 생성된 "레인지 이미지(range image)"를 도시한다.
도 4는 도 3의 "레인지 이미지"의 세그먼트화를 도시한다.
도 5a는 세포 또는 세포의 일 부분에 대해 결정된 예시적인 시변 활성 트레이스를 도시한다.
도 5b는 세포 또는 세포의 일 부분에 대해 결정된 예시적인 시변 활성 트레이스를 도시한다.
도 5c는 샘플의 일련의 이미지에 대해 결정된 예시적인 시변 광표백 곡선을 도시한다.
도 6은 예시적인 자동 샘플 이미징 디바이스의 요소들을 도시한다.
도 7은 예시적인 방법의 흐름도이다.
도 8은 예시적인 방법의 흐름도이다.
도 9는 예시적인 이미징 및 분석 시스템의 이미지이다.
도 10은 예시적인 방법의 흐름도이다.
도 11은 예시적인 방법의 흐름도이다.
도 12는 시간이 흐르면서 샘플의 발달의 예시적인 진행을 도시한다.
도 13a는 여기에 도시된 시스템들 및 방법들을 사용하여 획득된 예시적인 실험 결과들을 도시한다.
도 13b는 여기에 도시된 시스템들 및 방법들을 사용하여 획득된 예시적인 실험 결과들을 도시한다.
도 13c는 여기에 도시된 시스템들 및 방법들을 사용하여 획득된 예시적인 실험 결과들을 도시한다.
도 13d는 여기에 도시된 시스템들 및 방법들을 사용하여 획득된 예시적인 실험 결과들을 도시한다.
도 13e는 여기에 도시된 시스템들 및 방법들을 사용하여 획득된 예시적인 실험 결과들을 도시한다.
도 13f는 여기에 도시된 시스템들 및 방법들을 사용하여 획득된 예시적인 실험 결과들을 도시한다.
도 13g는 여기에 도시된 시스템들 및 방법들을 사용하여 획득된 예시적인 실험 결과들을 도시한다.
도 13h는 여기에 도시된 시스템들 및 방법들을 사용하여 획득된 예시적인 실험 결과들을 도시한다.
도 13i는 여기에 도시된 시스템들 및 방법들을 사용하여 획득된 예시적인 실험 결과들을 도시한다.
도 13j는 여기에 도시된 시스템들 및 방법들을 사용하여 획득된 예시적인 실험 결과들을 도시한다.
도 14는 세포들의 분화를 도시한다.
도 15는 여기에 설명된 바와 같은 시스템들의 성능들을 도시한다.
도 16a는 여기에 도시된 시스템들 및 방법들을 사용하여 획득된 예시적인 실험 결과들을 도시한다.
도 16b는 여기에 도시된 시스템들 및 방법들을 사용하여 획득된 예시적인 실험 결과들을 도시한다.
도 16c는 여기에 도시된 시스템들 및 방법들을 사용하여 획득된 예시적인 실험 결과들을 도시한다.
도 16d는 여기에 도시된 시스템들 및 방법들을 사용하여 획득된 예시적인 실험 결과들을 도시한다.
도 17a는 여기에 도시된 시스템들 및 방법들을 사용하여 획득된 예시적인 실험 결과들을 도시한다.
도 17b는 여기에 도시된 시스템들 및 방법들을 사용하여 획득된 예시적인 실험 결과들을 도시한다.
도 18a는 여기에 도시된 시스템들 및 방법들을 사용하여 획득된 예시적인 실험 결과들을 도시한다.
도 18b는 여기에 도시된 시스템들 및 방법들을 사용하여 획득된 예시적인 실험 결과들을 도시한다.
도 18c는 여기에 도시된 시스템들 및 방법들을 사용하여 획득된 예시적인 실험 결과들을 도시한다.
도 18d는 여기에 도시된 시스템들 및 방법들을 사용하여 획득된 예시적인 실험 결과들을 도시한다.
도 18e는 여기에 도시된 시스템들 및 방법들을 사용하여 획득된 예시적인 실험 결과들을 도시한다.
도 18f는 여기에 도시된 시스템들 및 방법들을 사용하여 획득된 예시적인 실험 결과들을 도시한다.
도 19는 여기에 도시된 시스템들 및 방법들을 사용하여 획득된 예시적인 실험 결과들을 도시한다.
도 20은 여기에 도시된 시스템들 및 방법들을 사용하여 획득된 예시적인 실험 결과들을 도시한다.
도 21은 여기에 도시된 시스템들 및 방법들을 사용하여 획득된 예시적인 실험 결과들을 도시한다.
도 22는 여기에 도시된 시스템들 및 방법들을 사용하여 획득된 예시적인 실험 결과들을 도시한다.
특허 또는 출원 파일은 컬러로 실행된 적어도 하나의 도면을 포함한다. 요청 및 필요한 요금 지불시 특허청이 컬러 도면(들)의 본 특허 또는 본 특허 출원 공보 사본들을 제공할 것이다.

방법들 및 시스템들이 여기에 설명된다. "대표적인", "예시적인" 및 "예증적인"이라는 단어들은 여기서 "예, 사례 또는 예증의 역할을 하는"을 의미하기 위해 사용되는 것으로 이해되어야 한다. 여기서 대표적인", "예시적인" 또는 "예증적인"으로 설명되는 임의의 실시 예 또는 특징은 반드시 다른 실시 예들 또는 특징들에 비해 바람직하거나 유리한 것으로 해석되는 것은 아니다. 또한, 여기에 설명되는 대표적인 실시 예들은 제한적인 것으로 여겨지지 않는다. 개시된 시스템들 및 방법들의 특정 양태들은 매우 다양한 상이한 구성으로 배열 및 조합될 수 있다는 것이 쉽게 이해될 것이다.

I. 개요

다양한 적용으로 시간에 따른(예를 들어, 시간, 일, 주 또는 월 또는 임의의 다른 적합한 시간 기간들) 조직 및/또는 세포 샘플들의 거동을 측정 및 분석하는 것이 바람직하다. 그러한 검출 및 분석은 시간에 따른 다양한 치료법, 환경 조건, 유전자 조작, 전염성 질병 또는 기타 특정 조건의 평가를 가능하게 하여 치료의 효능을 평가, 물질의 독성을 결정 또는 몇몇 다른 관심 정보를 결정할 수 있다. 이러한 검출 및 분석은 세포 및/또는 조직 샘플들의 이미징을 포함할 수 있다. 그러한 이미징은 복수의 상이한 시간 기간(예를 들어, 매시, 매일, 매주, 매일 2회 또는 다른 적합한 시간 기간 세트) 동안 각 시간 기간에 걸쳐 샘플들의 구조 및/또는 활성을 도시하는 동영상들 또는 다른 이미지들의 시퀀스들을 생성하는 것을 포함할 수 있다. "동영상(movie)"은 특정 시간 기간 동안 샘플의 취해진 모든 이미지를 포함할 수 있거나, 그러한 이미지들의 서브 세트를 포함할 수 있다.

이러한 이미지 시퀀스들은 샘플 내 세포들의 활성 패턴 또는 구조에 대한 정보를 제공할 수 있다. 샘플 내 세포들, 세포들의 부분들 또는 다른 "활성 개체들"의 쌍 간의 연결성의 정도는 활성 개체 쌍에 대해 결정되는 시변 활성 레벨들 간의 상관관계 또는 일관성, 존재, 세포 쌍들의 활성 간의 관계를 기술하는 측정된 확률 함수의 피크 또는 다른 특징의 존재, 크기, 폭 또는 몇몇 다른 척도, 또는 샘플 내 활성 개체 쌍들의 시간에 따라 측정된 활성 레벨들 간의 유사성 및/또는 인과성의 정도의 몇몇 다른 메트릭으로 결정될 수 있다. 샘플 내 활성 개체들의 모집단의 연결성의 정도는 그러한 쌍별 척도들의 평균 또는 다른 요약 메트릭으로 결정될 수 있다. 샘플 내 활성 개체들 간 연결성의 패턴은 샘플 내 활성 개체들에 대해 결정된 쌍별 메트릭스에 기초하여, 샘플 내 활성 개체들 간 연결성의 세기, 방향 또는 다른 척도의 그래프 또는 다른 표시로 결정될 수 있다.

그러한 연결성의 척도들은 신경 세포들, 근세포들 또는 서로 전기적으로 신호를 보낼 수 있거나 그 외 제1 세포의 활성 변화가 초 내지 분의 시간 단위로, 제1 세포에 연결된 제2 세포에서의 활성을 측정 가능할 정도로 변화시킬 수 있도록 기능적으로 연결된 세포들 간에 결정될 수 있다.

그러한 이미징을 가능하게 하기 위해, 시간 기간들 동안, 샘플들은 자동 이미징 시스템 내에 또는 그것에 근접하여 배치될 수 있다. 그러한 자동 이미징 시스템은 이미징 디바이스(예를 들어, 현미경, 형광 이미저, 하나 이상의 광원 및/또는 샘플들의 이미징을 가능하게 하도록 구성된 다른 요소들) 및 갠트리 또는 이미징 디바이스를 샘플들을 포함한 샘플 용기에 관해(예를 들어, 각 웰이 배양된 세포들, 체외 외식된 조직, 또는 몇몇 다른 생물학적 관심 물질을 포함하는 복수의 웰을 갖는 샘플 용기에 관해) 이동시키도록 구성된 다른 액추에이터를 포함할 수 있다. 액추에이터는 각각의 샘플들을 이미징하기 위해 자동 방식으로, 이미징 디바이스를 특정 시점들에(예를 들어, 스캔 스케줄에 따라) 이동시키도록 작용할 수 있다. 그에 따라, 복수의 스캔 기간 각각 동안 각각의 샘플들에 대해 하나 이상의 이미지가 자동으로 생성될 수 있다. 샘플 용기(들) 내 샘플들 및 자동 이미징 시스템은 둘 다 그것들을 이미징하기 위해 인큐베이터로부터 샘플들을 제거할 필요가 없도록 인큐베이터 내에 배치될 수 있다. 그러한 실시 예에서, 샘플들은 샘플들을 인큐베이터로부터 이미징 시스템으로 전달하는 동요를 방지하면서 보다 '자연스럽게' 전개될 수 있다.

그러한 시스템을 그러한 방식으로 작동시키면 시간에 따라 특정 샘플에 대한 복수의 이미지를 생성할 수 있다. 분석의 특정 양태들을 자동화하는 것은 유익할 수 있다. 예를 들어, 자동 시스템들(예를 들어, 여기에 설명되는 방법들 중 하나 이상을 구현하는 서버 또는 다른 제어기)은 샘플의 이미지들에 기초하여, 샘플 내 "활성 개체들(active objects)"을 식별하고 위치를 찾도록 작동될 수 있다. 그러한 활성 개체들은 활성에 대하여(예를 들어, 칼슘 농도, 막 통과 전압, 인산화 및/또는 유비퀴틴화 상태, 전사 또는 번역 활성, 또는 관심 활성에 대한 몇몇 다른 이미징 가능 프록시에 대하여) 시간에 따라 달라지는 세포들 또는 세포들의 부분들(예를 들어, 핵, 미토콘드리아 또는 다른 소기관, 세포질 및/또는 이의 구획, 수지상 세그먼트들 또는 신경 세포의 다른 구획들)을 포함할 수 있다. 그러한 세포들은 신경 세포, 평활근 세포, 횡문근 세포들, 심장 근육 세포들 또는 분비 세포들 또는 관심 활성 레벨의 이미징 가능한 증가 및 감소를 보일 수 있는 몇몇 다른 다양한 세포를 포함할 수 있다.

이미지 내에서 상기한 개체들을 식별하고 그것들의 위치를 찾는 것(또는 "세그먼트화"), 특히 시간이 흐르면서 변화를 식별하는 것은 어려울 수 있다.. 상기한 개체들을 식별하고 그것들의 위치를 찾으려면, 샘플의 스캔으로부터의 이미지들의 시퀀스를 사용하여 스캔 기간 동안 샘플에 대한 "레인지 이미지"를 생성할 수 있다. 상기한 레인지 이미지는 시퀀스의 모든 이미지에 걸쳐 이미지들의 시퀀스의 이미지 프레임 내 각 위치마다, 최대와 최소 강도 값들 간 차이를 결정함으로써 결정된다. 그에 따라, 이미지들의 시퀀스에 걸쳐, 레인지 이미지의 '밝은( bright)' 픽셀은 이미징된 활성 레벨에 대해(예를 들어, 형광성으로 검출된 세포 내 칼륨 농도에 대해) 변화된 위치(예를 들어, 세포의 위치 또는 세포의 일 부분의 위치)에 대응한다. 그 다음 레인지 이미지로부터 샘플 내 "활성 개체들"(예를 들어, 세포들, 세포들의 부분들)에 대한 위치, 규모 또는 다른 정보가 결정될 수 있다(예를 들어, 경계화, 템플릿 매칭 등을 통해). 그러한 방법은 '항상 활성'인 영역들(예를 들어, 지속적으로 높지만 변하지 않는 인공물 레벨들의 자가 형광을 보이는 영역들)은 폐기하는 한편 활성에 대하여 다양하지만 드물고/거나 약하게 활성인 영역들(예를 들어, 활성이 스캔 동안 한 번만 버스트하는 신경 세포)을 강조하는 이점들을 갖는다.

식별된 활성 개체들에 대한 위치, 규모 또는 다른 정보는 활성 개체들에 대한 정보를 결정하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 스캔에 걸친 시변 활성 트레이스가 각각의 활성 개체들에 대해 결정될 수 있다. 이러한 시변 활성 트레이스는 활성 개체에 대한 정보(예를 들어, 버스트 속도, 평균 버스트 지속 긴간 또는 강도, 전체 평균 강도, 버스트/활성 증가를 보이는데 걸린 시간량), 활성 개체들의 모집단에 대한 정보(예를 들어, 전체 평균 버스트 지속 기간, 평균 버스트 비율) 및/또는 활성 개체들 간의 관계들에 대한 정보(예를 들어, 시변 활성 트레이스들 간 상관관계, 활성 개체 세트의 시변 활성 트레이스들 간 상관 관계의 정도 또는 패턴)를 결정하는데 사용될 수 있다. 추가 또는 대안으로, 그러한 시변 활성 트레이스들은 적어도 하나의 버스트를 보이지 않는 식별된 개체들을의 추가 분석을 거부함으로써 활성 개체들로 잘못 식별된(예를 들어, 상술한 레인지 이미지 방법들을 사용하여 식별된) 개체들을 필터링하는데 사용될 수 있다.

II. 예시적인 이미지 처리

여기에 설명된 시스템들 및 방법들 및/또는 샘플 용기 내에 포함된 샘플의 몇몇 다른 장치 또는 방법을 사용하여 복수의 이미지가 생성될 수 있다. 이미지들은 생성된 시간들에 따라 불연속 "스캔들(scans)"로 조직될 수 있다. 각 스캔은 다른 스캔들과 시간이 특정 시간량(예를 들어, 수 시간, 수 일, 수 주, 수 개월)만큼 떨어져 있고, 각 스캔은 하나 이상의 이미지를 포함할 수 있다. 예를 들어, 각 스캔은 초당 세 개의 이미지 비율(또는 몇몇 다른 적합한 비율)로 취해진 샘플의 3분 분량의 이미지(또는 몇몇 다른 적합한 지속 기간)을 포함할 수 있다. 스캔 기간 동안 샘플에 대한 몇몇 정보를 결정하기 위해 특정 스캔에 대응하는 이미지들이 분석될 수 있다. 이는 샘플 내 세포들 및/또는 그것들의 부분들이 스캔 동안 일부의 활성(그것들이 "활성 개체들"임)을 나타내었다고 결정하는 것 그리고/또는 그러한 세포들 및/또는 그것들의 활성 부분들의 공간적 규모를 결정하는 것, 또는 샘플에 대한 몇몇 다른 정보를 결정하는 것이 포함할 수 있다. 예를 들어, 그러한 식별되고/되거나 위치가 찾아진 개체 각각에 대해, 스캔에 걸친 개체들의 활성 레벨을 기술하는 시변 활성 트레이스들이 결정될 수 있다. 그러한 활성 레벨들(또는 "트레이스들")은 세포들에 대한 정보, 세포들의 모집단들에 대한 정보, 세포들 간의 상호 관계들에 대한 정보 또는 샘플에 대한 몇몇 다른 정보를 결정하는데 사용될 수 있다. 그러한 정보는 시간에 따라 취해진 다수의 상이한 스캔의 각 스캔마다 결정될 수 있고, 시간에 따른(예를 들어, 수 시간, 수 일, 수 주 또는 수 개월에 동안) 샘플의 거동에 대한 몇몇 정보를 결정하는데 사용될 수 있다.

샘플 내 세포들 또는 다른 관심 개체들의 이미지 내에서 규모를 식별하고, 위치를 찾고/거나 또는 결정하기 위해, 단일 스캔 동안 취해진 샘플의 가시 및/또는 비가시광 이미지들에 다양한 이미지 처리 기술이 적용될 수 있다. 단일 스캔 동안 취해진 이미지들은 스캔 동안 활성 레벨의 변화에 대응하는 강도의 변화를 나타내는 개체들(예를 들어, 세포들, 세포들의 부분들)을 강조하는 "레인지 이미지"를 생성하는데 사용된다. 예를 들어, 이미지들은 관심 활성에 대응하는 샘플 내 형광 물질을 검출하기 위해 취해진 형광 이미지들일 수 있다. 그러한 형광 물질은 칼슘 민감성 형광단(예를 들어, 세포 내 칼슘의 농도가 활성을 대표하는 지수로 선택되는 경우), 전압 민감성 형광단(예를 들어, 막 통과 전압의 변화가 활성을 대표하는 지수로 선택되는 경우) 또는 몇몇 관심 활성 메트릭(예를 들어, 인산화/유비퀴틴화 상태, 전사/번역 활성, 세포 내 칼슘 농도, 막 통과 전압)과 상관되는 형광 속성(예를 들어, 형광 강도, 여기 파장, 방출 파장)을 갖는 몇몇 다른 물질를 포함할 수 있다. 추가 또는 대안으로, 염료, 발색단, 화학 발광 물질, 또는 몇몇 관심 활성 메트릭과 상관되는 광학적 속성(예를 들어, 색상, 불투명도, 강도)을 갖는 다른 물질들이 스캔 동안 이미징 활성을 가능하게 하는데 사용될 수 있다.

그러한 레인지 이미지는, 레인지 이미지의 소정의 픽셀에 대해, 스캔에서의 이미지들에 걸쳐, 스캔 이미지들의 이미지 프레임 내 레인지 이미지의 소정의 픽셀의 위치에 대응하는 픽셀 값 세트의 레인지를 결정함으로써 스캔에 대해 생성될 수 있다. 이는 스캔 이미지들에 걸쳐, 레인지 이미지 픽셀의 위치에 정확히 대응하는 픽셀들만을 비교하는 것을 포함할 수 있다. 대안으로, 레인지를 생성하기 위해 각각의 이미지들의 주변 픽셀 세트가 사용될 수 있다(예를 들어, 레인지 이미지를 결정할 때 평활화 또는 필터링 기능을 제공하기 위해). 그러한 픽셀 값 세트의 레인지를 결정하는 것은 픽셀 값들에서 최대와 픽셀 값들에서 최소 간의 차이를 결정하는 것을 포함할 수 있거나, 또는 다른 방법들(예를 들어, 특이치 픽셀 값들을 폐기하기 위해, 픽셀 값들에서 5번째 백분위 수와 픽셀 값들에서 95번째 백분위 수 간의 차이를 결정하는 것)을 포함할 수 있다. 여기에 설명된 방법들을 사용하여 생성된 레인지 이미지는 스캔 기간에 걸쳐 강도에 대해 달라져 스캔 이미지 세트 내에 나타나는 개체들이 스캔 기간 내 드물게 그리고/또는 매우 짧은 시간 기간(들) 동안 활성화되었을 때에도 그러한 개체들을 강조할 수 있다. 또한, 그러한 레인지 이미지는 스캔 기간에 걸쳐 일관되게 높은 강도를 보인(예를 들어, 교란 자가 형광 물질들 또는 샘플 내 형광단 또는 다른 활성 민감성 대조 작용제를 잘못 활성시키는 물질들의 존재로 인해), 그러나 달라지지 않고 그에 따라 활성 세포들, 세포들의 부분들 또는 다른 관심 활성 개체들을 나타낼 가능성이 없는 개체들 및/또는 영역들을 리젝트하고/거나 덜 강조할 수 있다.

도 1은 예시적인 샘플 용기의 내용물(100)(예를 들어, 웰 어레이를 포함하는 샘플 용기의 그러한 웰의 내용물)을 도시한다. 내용물(100)은 제1 세포(110a) 및 제2 세포(110b)(예를 들어, 제1 및 제2 신경 세포들)를 포함한다. 세포들(110a, 110b)은 스캔 기간에 걸쳐 여러 번 이미징될 경우, 세포들로부터 수신된 광(예를 들어, 세포들에 의해 발현되거나 그 외 세포들 내에 달리 존재하는 칼슘 민감성 형광단으로부터 수신된 형광)의 강도가 스캔 기간에 걸쳐 이미지마다 달라지게 되는 활성 세포들이다. 세포들(110a, 110b)은 여기에 설명된 방법들을 사용하여 각각의 활성 개체들로서 검출될 수 있는 활성 영역들을 포함한다. 도시된 바와 같이, 제1 세포(110a)는 제1 활성 개체(120a)(예를 들어, 핵)를 포함하는 한편, 제2 세포(110a)는 제2 활성 개체(120b)(예를 들어, 핵) 및 제3 활성 물체(120c)(예를 들어, 시간이 따라 칼슘 농도 또는 몇몇 다른 활성 관련 이미징 가능 속성의 변화를 보이는 수상 돌기망의 일 부분)를 포함한다.

샘플 용기의 내용물(100)은 여기에 설명된 시스템들 및 방법들에 따라 및/또는 몇몇 다른 장치 또는 프로세스를 통해 스캔 기간에 걸쳐 여러 번 이미징될 수 있다. 세포들 및/또는 그것들의 활성 부분들의 강도는 스캔 기간에 걸쳐 그러한 세포들 및/또는 부분들의 다양한 활성에 따라 달라질 수 있다. 그에 따라, 그러한 세포들 및/또는 세포들의 부분들로부터 수신된 광의 강도는 스캔 기간에 걸쳐 달라질 수 있고, 이러한 변화는 스캔 기간에 걸쳐 취해진 이미지들에 의해 캡처될 수 있다. 그 다음 이러한 변화들은 차례로 샘플 용기의 내용물을 식별하거나 위치를 찾거나 관련된 몇몇 다른 분석을 수행하는데 사용될 수 있는 레인지 이미지를 생성하는데 사용될 수 있다.

도 2a, 도 2b, 도 2c 및 도 2d는 스캔 기간 내의 각각의 상이한 제1, 제2, 제3 및 제4 시점들에서 각각 취해진 내용물(100)의 제1 예시적인 이미지(200a), 제2 예시적인 이미지(200b), 제3 예시적인 이미지(200c) 및 제4 예시적인 이미지(200d)를 도시한다. 제1 활성 개체(120a)는 제1 및 제2 시점들 동안 활성화되고, 그에 따라 제1 이미지(200a) 및 제2 이미지(200b)는 대응하는 고강도 영역들을 나타내는 한편, 제3 이미지(200c) 및 제4 이미지(200d)의 대응하는 위치들은 상대적으로 더 어둡다. 제2 활성 개체(120b)는 제4 시점 동안에만 활성화되었지만, 제3 활성 개체(120c)는 제1, 제3 및 제4 시점들 동안 활성화되었다. 추가로, 인공물(130)은 모든 네 시점에 걸쳐 일관된 강도로 광을 방출했다. 그에 따라, 모든 네 개의 이미지(200a-d)는 대응하는 고강도 영역을 보여준다. 그러한 인공물은 간섭 자가 형광을 보이는(예를 들어, 샘플 내 활성을 이미징하는데 사용되는 형광단과 여기 스펙트럼 및/또는 방출 스펙트럼에 대해 겹치는 형광단을 포함하는) 영역, 고농도의 대조 작용제를 포함하고/거나 대조 작용제의 형광을 증가시키는(예를 들어, 칼슘 민감성 형광단에 결합하여 이를 활성화시키는) 물질을 포함하는 영역, 또는 몇몇 다른 메커니즘을 통해 교란 광을 방출하는 영역일 수 있다.

그 다음 레인지 이미지(300)가 예시적인 이미지들(200a-d) 및/또는 스캔 기간 동안 샘플 내용(100)의 추가 이미지들로부터 생성될 수 있다. 이러한 레인지 이미지(300)는 활성 개체들(120a, 120b, 120c)이 레인지 이미지(300)에서 강조되도록(밝은 영역들) 여기에 설명된 시스템들 및/또는 방법들에 따라 생성될 수 있다. 반대로, 스캔 기간에 걸쳐 강도의 변화를 보이지 않는 영역들은 레인지 이미지에서 강조되지 않는다(예를 들어, 인공물(130)에 대응하는 영역). 그 다음 레인지 이미지(300)는 샘플 내 활성 게체들을 식별하고/거나, 위치를 찾고/거나 범위를 결정하는데 사용될 수 있다.

그러한 식별, 위치 또는 다른 세그먼트화 작업들은 다양한 방법을 통해 여기에 설명된 바에 따라 생성된 레인지 이미지에 기초하여 실현될 수 있다. 예를 들어, 배경 이미지 내에서 활성 개체들(예를 들어, 세포들, 세포들의 부분들)의 위치를 식별하기 전에 배경 제거, 노이즈 필터링 또는 몇몇 다른 전처리 방법이 레인지 이미지에 적용될 수 있다. 그 다음 레인지 이미지의 이미지 프레임 내에서 활성 개체들의 위치를 찾기 위해 경계화, 템플릿 매칭 또는 다른 방법들이 레인지 이미지 및/또는 이의 사전 처리된 버전에 적용될 수 있다.

활성 개체의 위치(예를 들어, 스캔 기간에 걸쳐 세포 내 칼슘 농도 또는 관심 생물학적 활성의 몇몇 다른 이미징 가능 메트릭의 변화를 보이는 세포 또는 세포의 일 부분의 위치)를 결정하는 것은 단일 위치(예를 들어, 중심, 활성 개체의 경계 내 임의의 지점), 유효 반경, 영역(예를 들어, 활성 개체의 결정된 둘레들에 의해 획정되는 영역), 픽셀 세트, 이미지 프레임 내 다른 불연속 서브 영역들을 결정하는 것, 또는 각각의 활성 개체들에 대한 몇몇 다른 위치 정보를 결정하는 것을 포함할 수 있다. 도 4는 도 2a 내지 도 2d에 도시된 이미지들(200a-d)의 이미지 프레임(400) 내, 도 1에 도시된 활성 개체들(120a, 120b, 120c)에 대해 결정된 다양한 위치를 도시한다. 위치를 결정하는 것은 각 활성 개체에 대한 단일 지점(예를 들어, 410a, 410b, 410c)의 위치(예를 들어, 대응하는 레인지 이미지에서 불연속 또는 그 외 다르게 구별 가능한 고강도 영역들의 중심)를 결정하는 것을 포함할 수 있다. 추가 또는 대안으로, 위치를 결정하는 것은 각 활성 개체가 차지하는 이미지 프레임 내 규모(예를 들어, 420a, 420b, 420c)를 결정하는 것을 포함할 수 있다. 이는 각 활성 개체가 연장되는 레인지 이미지의 픽셀 및/또는 픽셀 위치 세트를 결정하는 것을 포함할 수 있다.

그 다음 활성 개체들의 결정된 위치들은 각각의 활성 개체들에 대한 정보를 결정하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 시변 활성 레벨들이 각각의 활성 개체들에 대해 결정된 위치들에 기초하여 결정될 수 있다. 특정 활성 개체들에 대한 시변 활성 레벨은 활성 개체를 포함하는 샘플의 취해진 이미지들에서 강도(예를 들어, 세포 내 칼슘 농도)에 의해 나타나는 바에 따라, 스캔에 걸쳐 활성 개체의 활성 레벨을 나타낸다. 그에 따라, 시변 활성 레벨은 활성 개체의 활성(예를 들어, 신경 세포 또는 그것의 부분의 활성 전위의 발생)의 전체 레벨, 패턴 및 타이밍(예를 들어, 다른 활성 개체들에 관한)을 평가하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 버스트 비율 또는 빈도, 버스트 지속 기간, 버스트 강도, 평균 활성 레벨, 활성 레벨의 변동성, 또는 활성 개체의 활성에 대한 몇몇 다른 정보 및/또는 그 분배는 활성 개체에 대해 결정된 시변 활성 레벨로부터 결정될 수 있다. 그러한 정보는 또한 샘플에 대한 전체 메트릭스를 결정하는데 사용될 수 있으며, 예를 들어 샘플 내 활성 개체들에 대한 시변 활성 레벨들로부터 샘플 내 활성 개체들의 평균 전체 활성이 결정될 수 있다.

결정된 시변 활성 레벨들은 또한 샘플 내 활성 개체들(예를 들어, 신경 세포들) 간의 기능적 연결성에 대한 정보를 결정하는데 사용될 수도 있다. 예를 들어, 샘플 내 활성 개체들의 각 쌍에 대해 쌍별 상관관계들이 결정될 수 있다. 그러한 상관관계는보고되고/되거나 샘플 내 활성 개체들의 활성들 간의 패턴 또는 전체적인 조정도를 결정하는데 사용될 수 있다.

특정 활성 개체에 대해 다양한 방법으로 시변 활성 레벨이 생성될 수 있다. 활성 개체의 위치를 결정하는 것이 이미지 프레임 내 활성 개체의 픽셀 세트 또는 규모에 대한 몇몇 다른 정보를 결정하는 것을 포함한 예들에서, 활성 개체에 대한 시변 활성 레벨을 결정하는 것은 스캔에 걸쳐 각 형광 강도 이미지마다, 활성 개체의 규모에 대응하는 픽셀들(예를 들어, 활성 개체에 대응하는 결정된 픽셀 세트)의 전체 강도의 합, 평균 또는 몇몇 다른 척도를 결정하는 것을 포함할 수 있다. 다른 예에서는, 활성 개체의 결정된 지점 위치의 특정 거리 내 픽셀들의 가중 평균이 스캔에 걸쳐 활성 개체의 시변 활성 레벨을 결정하는데 사용될 수 있다.

샘플의 형광 이미징은 샘플의 광표백을 초래할 수 있다. 그러한 광표백은 샘플의 취해진 형광 이미지들에서 시간에 따라 샘플 및/또는 그 안의 활성 개체들의 검출된 형광 강도의 점진적인 감소로서 나타날 수 있다. 이러한 광표백은 검출 및/또는 정량화될 수 있고 그 효과들(예를 들어, 그러한 형광 이미지들로부터 생성된 시변 활성 트레이스들에 미치는)은 다양한 방식으로 감소 또는 제거된다. 도 5a는 광표백을 보인 활성 개체에 대해 결정된 시변 활성 트레이스(500)의 일례를 도시한다. 광표백에 의해 야기된 시변 활성 트레이스(500)의 하향 추세는 점선(510)으로 표기된다. 이러한 광표백 효과의 레벨은 시변 활성 트레이스(500)로부터, 예를 들어 저역 통과 필터를 적용하거나, 이동 창 최소값을 적용하거나, 불연속 버스트들을 식별 및 제거하거나, 또는 몇몇 다른 방법을 채용함으로써 결정될 수 있다. 그 다음 결정된 광표백 레벨은 광표백의 효과들을 보상하기 위해 적용되어, 활성 개체에 대해 보다 정확한 시변 활성 레벨을 생성할 수 있다(도 5b에 예로서 교정된 시변 활성 레벨(520)로서 도시됨). 추가 또는 대안으로, 시간에 따른 광표백 레벨은 다른 방법으로(예를 들어, 스캔의 각 형광 활성 이미지에 대해, 각 광표백 레벨을 결정함으로써) 결정될 수 있고 하나 이상의 시변 활성 레벨을 교정하기 위해 적용될 수 있다(도 5c에 예로서 광표백 레벨(530)로서 도시됨).

상술한 레인지 이미지 방법은 샘플 내 활성 개체들을 식별하고/거나 위치를 찾는데 사용될 수 있다. 추가 또는 대안으로, 그러한 개체들은 스캔에 걸쳐 하나 이상의 별개의 버스트를 보이는 것에 기초하여 식별될 수 있다. 예를 들어, 추정 활성 개체의 위치가 결정될 수 있고(예를 들어, 상술한 레인지 방법 및/또는 몇몇 다른 세그먼트화 방법을 사용하여) 이렇게 결정된 위치는 추정 활성 개체에 대한 시변 활성 레벨을 결정하는데 사용된다. 그 다음 이러한 시변 활성 레벨은 시변 활성 레벨이 적어도 하나의 버스트를 포함하는지 여부를 결정하기 위해 분석될 수 있다. 만약 그렇다면, 추정 활성 개체가 확인될 수 있고 추가 분석(예를 들어, 평균 버스트 비율들, 전체 모집단 버스트 비율들, 샘플 내 확인된 활성 개체들 간의 연결성의 정도 및/또는 패턴 결정)을 위해 사용될 수 있다. 버스트가 검출되지 않을 경우, 추정 활성 개체는 리젝트될 수 있고 그것의 시변 활성 트레이스가 추가 분석으로부터 폐기된다. 그에 따라 추정 활성 개체들의 모집단으로부터, 버스트들을 보이고 그에 따라 실제 활성 세포들 및/또는 그것들의 부분들을 나타낼 경향이 더 높은 활성 개체들의 서브 세트가 선택될 수 있다. 그러한 선택 프로세스는 예를 들어, 하나 이상의 추정 활성 개체가 레인지 이미지에서, 버스트를 보이지 않으나 그 대신 스캔에 걸쳐 인공물의 높은 광표백 레벨들을 보이고 그에 따라 레인지 이미지 내에서 고강도 영역들로서 나타날 수 있는 하나 이상의 추정 활성 개체가 검출되는 이점들을 가질 수 있다.

버스트들은 스캔 기간 동안 세포, 세포의 일 부분 또는 다른 활성 개체의 검출된 활성의 임의의 빠른 변화를 포함한다. 예를 들어, 버스트는 기록된 비디오 시퀀스에서 활성 개체의 검출된 형광 강도의 빠른 변화를 초래할 수 있다. 그러한 버스트는 활성 개체에 대해 결정된 시변 강도 레벨 트레이스에 피크를 초래한다. 버스트들은 소정의 시변 활성 레벨 내에서, 다양한 상이한 방법으로 식별될 수 있다. 몇몇 예에서, 버스트는 시변 활성 레벨 내에서 시변 활성 레벨이 임계값을 초과하는 어느 곳 그리고/또는 시변 활성 레벨이 베이스라인 레벨(예를 들어, 이동 창 최소값을 사용하여 시변 활성 레벨 트레이스로부터 결정되는) 임계 레벨을 넘어 증가하고/거나 임계 비율보다 많이 증가하는 어느 곳에서든 식별될 수 있다. 추가 또는 대안으로, 템플릿 매칭, 고역 필터링 또는 다른 방법들이 여기에 설명된 바에 따라 결정된 시변 활성 레벨 내에서 버스트드릉ㄹ 식별하는데 사용될 수 있다. 그러한 버스트 피크들의 세기 및 지속 기간 속성들은 활성 개체의 시변 활성 레벨 트레이스로부터 계산될 수 있다. 평균 버스트 속성들은 활성 개체당 계산될 수 있고 그 다음 스캔 동안 샘플 내 모든 활성 개체에 대해 종합된다.

III. 예시적인 시스템들

샘플 용기의 각각의 웰들에서 시간에 따라 복수의 상이한 스캔 기간 동안 복수의 생물학적 샘플의 이미지들(예를 들어, 형광 활성 이미지들)을 자동 방식으로 생성하기 위해 자동 이미징 시스템이 채용될 수 있다. 각각의 스캔 기간들 동안 각 샘플의 이미지 세트가 자동 이미징 시스템에 의해 취해질 수 있으며, 예를 들어 3분 스캔 기간 동안 초당 세 개의 이미지 비율로 이미지 세트가 취해진다.. 그 다음 이미지들은 예를 들어 여기에 설명된 방법들에 따라, 샘플들에 대한 몇몇 정보를 결정하기 위해 분석될 수 있다.

그러한 자동 이미징 시스템의 사용은 수동 이미징과 비교할 때 생성된 이미지들의 타이밍, 위치 결정 및 이미지 파라미터들에 대한 일관성을 증가시킬 뿐 아니라 생물학적 샘플들을 이미징하는 인건비를 유의하게 감소시킬 수 있다. 또한, 그러한 자동 이미징 시스템은 인큐베이터 내에서 작동하여, 이미징을 위해 인큐베이터로부터 샘플들을 제거할 필요를 없대도록 구성될 수 있다. 그에 따라, 샘플들에 대한 성장 환경이 보다 일관되게 유지될 수 있다. 추가로, 자동 이미징 시스템이 (예를 들어, 정적 이미징 장치에 의해 이미징될 샘플 용기를 이동시키는 대신) 현미경 또는 다른 이미징 장치를 샘플 용기들에 관해 이동시키도록 작용하는 경우, 샘플들의 이동 관련 동요가 감소될 수 있다. 이는 샘플들의 성장 및 발달을 개선하고 이동 관련 교란을 감소시킬 수 있다.

그러한 자동 이미징 시스템은 24시간 넘게, 3일 넘게, 30일 넘게, 또는 더 긴 시간 기간만큼 떨어진 스캔들 동안 하나 이상의 이미지를 생성하도록 동작할 수 있다. 스캔들은 특정 비율로, 예를 들어 매일 한 번, 매일 한 번 넘게, 매일 두 번 넘게 또는 매일 세 번 넘게 발생하도록 특정될 수 있다. 스캔들은 24 시간 내에 2회 이상, 3회 이상 또는 몇몇 더 많은 횟수가 발생하도록 특정될 수 있다. 일부 예에서, 하나 이상의 스캔으로부터의 데이터는 (예를 들어, 여기에 설명된 방법들에 따라) 분석될 수 있고 추가 스캔들의 타이밍을 결정하는데 사용될 수 있다(예를 들어, 샘플 내에서 발생할 것으로 예상되는 불연속 이벤트의 발생을 검출하기 위해 비율, 지속 기간, 이미지 캡처 비율 또는 스캔들의 몇몇 다른 속성을 증가시키도록).

그러한 자동 이미징 시스템의 사용은 장시간 기간에 걸쳐 다수의 시점에서 동일한 생물학적 샘플의 이미징을 가능하게 할 수 있다.. 그에 따라, 개개의 세포들 및/또는 세포들의 망들의 발달 및/또는 거동이 시간에 따라 분석될 수 있다. 예를 들어, 단일 샘플 내에서 세포들, 세포들의 부분들 또는 다른 활성 개체들의 세트가 폭넓게 상이한 간격의 시간 동안 취해진 스캔들 내에서 식별될 수 있다. 식별된 개체들의 이러한 세트들은 스캔들에 걸쳐 동일한 활성 개체(들)를 식별하기 위해 스캔들 간에 비교할 수 있다. 그에 따라, 개개의 세포들 또는 세포들의 부분들의 거동이 수 시간, 수 일, 수 주 또는 수 개월에 걸쳐 추적 및 분석될 수 있다.

도 6은 그러한 자동 이미징 시스템(600)의 요소들을 도시한다. 자동 이미징 시스템(600)은 자동 이미징 시스템(600)의 다른 요소들이 부착되는 프레임(610)을 포함한다. 프레임(610)은 인큐베이터 내에 맞도록 구성(예를 들어, 크기 조정)될 수 있다. 자동 이미징 시스템(600)은 프레임(610)에 결합되는 샘플 용기 트레이(630) 내에 제거 가능하게 배치되는 샘플 용기(620)를 포함한다. 샘플 용기 트레이(630)는 제거 가능할 수 있고/있거나 다양한 상이한 샘플 용기(예를 들어, 다양한 산업 표준 샘플 용기)의 홀딩을 가능하게 하기 위해 제거 가능한 삽입물을 포함할 수 있다. 시스템(600)은 이미징 장치(640)가 샘플 용기(620)의 개개의 웰들(예를 들어, 예시적인 웰(625))의 내용물의 이미지들을 생성하도록 동작할 수 있도록 이미징 장치(640)를 샘플 용기(620)에 관해 위치시키도록 구성되는 구동 갠트리(650)를 추가로 포함한다.

이미징 장치(640)는 현미경, 형광 이미저, 2-광자 이미징 시스템, 위상차 이미징 시스템, 하나 이상의 조명원, 하나 이상의 광학 필터 및/또는 샘플 용기(620) 내에 포함된 이미징 샘플들을 가능하게 하도록 구성된 다른 요소들을 포함할 수 있다. 몇몇 예에서, 이미징 장치(640)는 샘플 용기(620)의 양측 상에 배치되는 요소들(예를 들어, 생물학적 샘플들의 예를 들어 위상차 이미징을 가능하게 하기 위한 예를 들어, 간섭성, 편광, 단색 또는 다른 특정 조명광)을 포함한다. 그러한 예들에서, 샘플 용기(620)의 양측 상의 요소들은 각각의 상이한 갠트리들에, 동일한 갠트리에 결합될 수 있고/있거나, 샘플 용기(620)의 일측 상의 요소가 샘플 용기(620)에 관해 이동 가능하지 않을 수 있다.

구동 갠트리(650)는 샘플 용기(620) 내 복수의 상이한 샘플의 이미징을 가능하게 하기 위해, 프레임(610) 및 이미징 장치(640)에 결합되고 장치(640)의 위치를 샘플 용기(620)에 관해 적어도 두 방향으로 제어하도록 구성된다. 구동 갠트리(650)는 또한 이미징 장치(640)를 사용하여 생성되는 이미지들의 초점을 제어하는 것을 가능하게 하기 위해 그리고/또는 샘플 용기(620) 내에서 이미징 장치(640)를 사용하여 이미징될 수 있는 물질의 깊이를 제어하기 위해, 이미징 장치(640)의 위치를 제3 방향으로, 샘플 컨테이너(620)를 향해 그리고 그로부터 멀어지게 제어하도록 구성될 수 있다. 추가 또는 대안으로, 이미징 장치(640)는 이미징 장치(640)의 초점 거리를 제어하기 위한 하나 이상의 액추에이터를 포함할 수 있다.

구동 갠트리(650)는 샘플 용기(620)(예를 들어, 샘플 용기(620)의 특정 웰(들))에 관해 이미징 장치(640)의 절대 및/또는 상대 위치의 검출을 가능하게 하도록 구성된 요소들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 구동 갠트리(650)는 인코더, 리밋 스위치 및/또는 다른 위치 감지 요소들을 포함할 수 있다. 추가 또는 대안으로, 이미징 장치(640) 또는 시스템의 다른 요소들은 샘플 용기(620)에 관한 이미징 장치(640)의 절대 및/또는 상대 위치를 결정하기 위해 샘플 용기(620) 및/또는 샘플 용기 트레이(630)의 기표들 또는 다른 특징들을 검출하도록 구성될 수 있다.

컴퓨터 기능들(예를 들어, 구동 갠트리(650) 및/또는 이미징 장치(640)를 작동하여 특정 시간 기간 동안 샘플 용기(620) 내 샘플들을 이미징하는 기능, 레인지 이미지를 생성하는 기능 및/또는 여기에 설명된 몇몇 다른 방법을 수행하는 기능)은 하나 이상의 컴퓨팅 시스템에 의해 수행된다. 그러한 컴퓨팅 시스템은 자동 이미징 시스템(예를 들어, 600)에 통합될 수 있고/거나, 그러한 자동 이미징 시스템과 연관될 수 있으며/거나(예를 들어, 직접 유선 또는 무선 연결을 통해, 로컬 네트워크를 통해 그/또는 인터넷을 통한 보안 연결을 통해) 몇몇 다른 형태(예를 들어, 자동 이미징 시스템과 통신하고/하거나 생물학적 샘플들의 이미지들의 저장소에 액세스할 수 있는 클라우드 컴퓨팅 시스템)를 취할 수 있다. 그러한 컴퓨팅 시스템은 통신 인터페이스, 사용자 인터페이스, 프로세서 및 데이터 스토리지를 포함할 수 있으며, 이들 모두는 시스템 버스, 네트워크 또는 다른 연결 메커니즘에 의해 함께 통신 가능하게 링크될 수 있다.

통신 인터페이스는 컴퓨팅 시스템이 다른 디바이스들, 액세스 네트워크들 및/또는 전송 네트워크들과 전기, 자기, 전자기, 광 또는 다른 신호들의 아날로그 또는 디지털 변조를 사용하여 통신할 수 있게 하는 기능을 할 수 있다. 그에 따라, 통신 인터페이스는 기존 전화 서비스(POTS, plain old telephone service) 통신 및/또는 인터넷 프로토콜(IP) 또는 다른 패킷 화된 통신과 같은 회로 교환 및/또는 패킷 교환 통신을 가능하게 할 수 있다. 예를 들어, "통신 인터페이스"는 무선 액세스 네트워크 또는 액세스 포인트와의 무선 통신을 위해 배열된 칩셋 및 안테나를 포함할 수 있다. 또한, 통신 인터페이스는 이더넷, USB(Universal Serial Bus, 범용 직렬 버스) 또는 HDMI(High-Definition Multimedia Interface, 고화질 멀티미디어 인터페이스) 포트와 같은 유선 인터페이스의 형태를 취하거나 이를 포함할 수 있다. 통신 인터페이스(402)는 또한 WiFi, BLUETOOTH®, GPS(global positioning system, 위성 항법 시스템) 또는 광역 무선 인터페이스(예를 들어, WiMAX 또는 3GPP LTE(Long-Term Evolution, 롱 텀 에볼루션))와 같은 무선 인터페이스의 형태를 취하거나 이를 포함할 수 있다. 그러나, 통신 인터페이스를 통해 다른 형태들의 물리 계층 인터페이스들 다른 유형들의 표준 또는 특허 통신 프로토콜들이 사용될 수도 있다. 또한, 통 인터페이스는 다수의 물리적 통신 인터페이스(예를 들어, WiFi 인터페이스, BLUETOOTH® 인터페이스 및 광역 무선 인터페이스)를 포함할 수 있다.

몇몇 실시 예에서, 통신 인터페이스는 컴퓨팅 시스템이 다른 디바이스들, 원격 서버들, 액세스 네트워크들 및/또는 전송 네트워크들과 통신할 수 있게 하는 기능을 할 수 있다. 예를 들어, 통신 인터페이스는 생물학적 샘플들의 이미지(예를 들어, 형광 활성 이미지들)의 표시를 송신 및/또는 수신하는 기능, 레인지 이미지, 그러한 이미지들 내 활성 개체들의 위치 세트 및/또는 여기에 설명된 방법들을 사용하여 그러한 이미지들로부터 생성된 그러한 활성 개체들로부터 결정된 시변 활성 트레이스들의 표시 또는 몇몇 다른 정보를 송신하는 기능을 할 수 있다.

그러한 컴퓨팅 시스템의 사용자 인터페이스는 컴퓨팅 시스템이 사용자와 상호 작용할 수 있게, 예를 들어 사용자로부터 입력을 수신하고/거나 사용자에게 출력을 제공할 수 있게 하는 기능을 할 수 있다. 그에 따라, 사용자 인터페이스는 키패드, 키보드, 터치 감지 또는 존재 감지 패널, 컴퓨터 마우스, 트랙볼, 조이스틱, 마이크로폰 등과 같은 입력 구성요소들을 포함할 수 있다. 사용자 인터페이스는 또한 예를 들어 존재 감지 패널과 조합될 수 있는 디스플레이 스크린과 같은 하나 이상의 출력 구성요소를 포함할 수 있다. 디스플레이 스크린은 CRT, LCD 및/또는 LED 기술들, 또는 현재 알려져 있거나 장차 개발될 다른 기술들에 기초할 수 있다. 사용자 인터페이스는 또한 스피커, 스피커 잭, 오디오 출력 포트, 오디오 출력 디바이스, 이어폰 및/또는 다른 유사한 디바이스들을 통해 가청 출력(들)을 생성하도록 구성될 수 있다.

일부 실시 예에서, "사용자 인터페이스" 는 비디오 또는 다른 이미지들(예를 들어, 특정 생물학적 샘플의 특정 스캔 동안 생성된 이미지들의 비디오)을 사용자에게 제시하는 역할을 하는 디스플레이를 포함할 수 있다. 추가로, 사용자 인터페이스는 컴퓨팅 장치의 구성 및 동작을 가능하게 하는 하나 이상의 버튼, 스위치, 노브 및/또는 다이얼을 포함할 수 있다. 이러한 버튼들, 스위치들, 노브들 및/또는 다이얼들 중 일부 또는 전부는 터치 또는 존재 감지 패널 상의 기능들로 구현되는 것이 가능할 수 있다. 사용자 인터페이스는 사용자가 자동 이미징 시스템 내에 포함된 샘플들의 유형들을 특정하거나, 샘플들의 이미징 스케줄을 특정하거나, 시스템에 의해 수행될 이미지 세그먼트화 및/또는 분석의 파라미터들을 특정하거나, 또는 자동 이미징 시스템의 동작을 위한 몇몇 다른 명령 또는 파라미터를 입력하게 할 수 있다.

몇몇 예에서, 여기에 설명된 방법들의 부분들은 적용에 따라 다른 디바이스들에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 시스템의 상이한 디바이스들은 상이한 양의 컴퓨터 자원들(예를 들어, 메모리, 프로세서 사이클들) 및 디바이스들 간의 통신을 위한 상이한 정보 대역폭을 가질 수 있다. 예를 들어, 제1 디바이스는 복수의 상이한 스캔 기간 동안 생물학적 샘플들의 이미지들을 생성하기 위해 구동 갠트리, 이미징 장치 또는 다른 요소를 작동시킬 수 있는 내장 프로세서(들)일 수 있다. 그 다음 제2 디바이스는 제1 디바이스로부터 (예를 들어, 인터넷을 통해, 전용 유선 링크를 통해) 이미지 정보를 수신하고 수신된 이미지 데이터에 관해 여기에 설명된 이미지 처리 및 분석 방법들을 수행할 수 있다. 여기에 설명된 방법들의 상이한 부분들은 그러한 고려 사항들에 따라 배분될 수 있다.

IV. 예시적인 방법들

도 7은 하나 이상의 시간 기간 동안 생활성 세포들을 식별하기 위한 방법(700)의 흐름도이다. 방법(700)은, 하나 이상의 시간 기간의 각 시간 기간마다, 샘플 용기 내에 포함된 샘플의 복수의 형광 활성 이미지를 생성하는 단계(710)를 포함한다. 샘플은 생활성 세포들을 포함하고, 복수의 형광 활성 이미지의 각 이미지는 각 복수의 픽셀 값을 포함하며, 각 픽셀 값은 이미지 프레임 내 각 픽셀 위치에 대응한다. 방법(700)은, 하나 이상의 시간 기간의 각 시간 기간마다, 복수의 형광 활성 이미지로부터 형광 레인지 이미지를 생성하는 단계(720)를 추가로 포함한다. 복수의 형광 활성 이미지로부터 형광 레인지 이미지를 생성하는 단계는 형광 레인지 이미지에 대한 복수의 픽셀 값을 결정하는 단계 를 포함하고 형광 레인지 이미지에 대한 소정의 픽셀 값을 결정하는 단계는 복수의 형광 활성 이미지 각각으로부터, 이미지 프레임 내 소정의 픽셀 값의 픽셀 위치에 대응하는 픽셀 위치들을 갖는 픽셀 값 세트의 레인지를 결정하는 단계를 포함한다.

방법(700)은, 하나 이상의 시간 기간의 각 시간 기간마다, 형광 레인지 이미지에 기초하여, 대응하는 시간 기간 동안 샘플 용기 내 하나 이상의 활성 개체의 위치를 이미지 프레임에 관해 결정하는 단계(730)를 추가로 포함한다. 하나 이상의 활성 개체 각각은 대응하는 시간 기간 동안 샘플 내에 존재하는 적어도 하나의 각 생활성 세포의 일 부분이다. 방법(700)은, 하나 이상의 시간 기간의 각 시간 기간마다 그리고 각 대응하는 시간 기간 동안 샘플 용기 내 하나 이상의 활성 개체의 각 활성 객체마다, 대응하는 시간 기간에 걸쳐 하나 이상의 활성 개체의 각 시변 활성 레벨을 결정하는 단계(740)를 더 포함한다. 이는 복수의 형광 활성 이미지 각각으로부터, 대응하는 활성 개체의 결정된 위치에 근접한 픽셀 위치들을 갖는 픽셀 값 세트에 기초하여 각 시변 활성 레벨을 결정하는 단계를 포함할 수 있다.

도 8은 하나 이상의 시간 기간 동안 생활성 세포들을 식별하기 위한 방법(800)의 흐름도이다. 방법(800)은 하나 이상의 시간 기간의 각 시간 기간마다, 샘플 용기 내에 포함된 샘플의 복수의 형광 활성 이미지를 생성하는 단계(810)를 포함한다. 샘플은 생활성 세포들을 포함하고, 복수의 형광 활성 이미지의 각 이미지는 각 복수의 픽셀 값을 포함하며, 각 픽셀 값은 이미지 프레임 내 각 픽셀 위치에 대응한다. 방법(800)은, 하나 이상의 시간 기간의 각 시간 기간마다, 대응하는 시간 기간 동안 샘플 용기 내 하나 이상의 활성 개체의 위치를 이미지 프레임에 관해 결정하는 단계(820)를 추가로 포함한다. 하나 이상의 활성 개체 각각은 대응하는 시간 기간 동안 샘플 내에 존재하는 적어도 하나의 각 생활성 세포의 일 부분이다.

방법(800)은, 하나 이상의 시간 기간의 각 시간 기간마다 그리고 각 대응하는 시간 기간 동안 샘플 용기 내 하나 이상의 활성 개체의 각 활성 객체마다, 대응하는 시간 기간에 걸쳐 각 시변 활성 레벨을 결정하는 단계(830)를 추가로 포함한다. 이는 복수의 형광 활성 이미지 각각으로부터, 하나 이상의 활성 개체의 결정된 각각의 위치들에 근접한 픽셀 위치들을 갖는 픽셀 값들의 각 세트들에 기초하여 각 시변 활성 레벨들을 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 방법(800)은 하나 이상의 시간 기간의 각 시간 기간마다 그리고 하나 이상의 활성 개체에 대해 결정되는 시변 활성 레벨들에 기초하여, 하나 이상의 활성 개체로부터 활성 개체들의 서브 세트를 선택하는 단계(840)를 추가로 포함한다. 하나 이상의 활성 개체로부터 특정 활성 개체를 선택하는 단계는 특정 활성 개체에 대해 결정된 시변 활성 레벨이 적어도 하나의 버스트를 보인다고 결정하는 단계를 포함한다.

방법들(700, 800) 중 어느 하나는 추가 요소들 또는 특징들을 포함할 수 있다.

V. 예시적인 실시 예들

신경계에 영향을 미치는 인간 질병을 연구하는데 있어 주요 장애는 인간 표현형들을 정확하게 나타내는 신경 세포들의 활성을 모니터링, 분석 및 정량화할 수 있는 능력이다.

현재, 다양한 유형의 배양된 신경 세포들이 병에 걸린 상태 및 병에 걸리지 않은 상태 둘 다에서 포유 동물 신경 세포 기능의 모델들로서 유망한 것으로 고려된다. 그러나, 포유 동물 신경 세포계들은 복잡하고, 배양된 신경 세포들을 특징 짓고, 그것들의 기능을 분석하고, 배양시 신경 세포들에 의해 형성된 신경망들을 분석하고, 배양된 신경 세포들에 대한 질 관리를 제공하며 유도 만능 줄기 세포(iPSC, induced pluripotent stem cell)-유래 신경 세포 모델들을 개선하기 위한 시약, 하드웨어, 소프트웨어 및 가이드 프로토콜들을 비롯한 도구들에 대한 지속적인 요구가 있다.

예를 들어, 본 개시에 의해 제공된 신경 세포 분석을 위해 개선된 도구들은 이에 제한되지는 않지만 배양된 신경 세포들이 기능적으로 활성인지 여부, 신경 세포들이 배양시 기능적으로 활성이 되는 때 그리고 기능적 활성이 배양시 다양한 실험적 조건 하에서 시간이 흐르면서 어떻게 변화하는지, 배양시 다양한 실험적 조건 하에서 시간이 흐르면서 어떤 신경 세포들의 물리적 특성들이 그리고 그러한 물리적 특성들이 어떻게 변화하는지와 같은 파라미터를 결정하기 위해 보다 우수한 기능적 세포 모델들을 생성한다. 본 개시에 따라 제공된 방법들 및 시스템들은 수천 개의 세포로부터의 측정이 가능하고 실용적이기 때문에 사용자가 통계적으로 강력한 신경 세포 배양의 다수의 관련 측정을 수행할 수 있게 한다. 본 개시에 따라 제공된 방법들 및 시스템들은 사용자가 이전 시스템들보다 더 높은 처리량으로 장기간 배양 변화를 분석할 수 있게 한다.

여기서 사용되는 과학적 및 기술적 용어들은 해당 기술분야의 통상의 기술자들에게 공통적으로 이해되는 의미를 갖는 것으로 의도된다. 그러한 용어들은 예증적으로 J. Sambrook 및 D.W. Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 3판., 2001; F.M. Ausubel, 편집, Short Protocols in Molecular Biology, Current Protocols; 5판, 2002; B. Alberts 외, Molecular Biology of the Cell, 4판, Garland, 2002; D.L. Nelson 및 M.M. Cox, Lehninger Principles of Biochemistry, 4판., W.H. Freeman & Company, 2004; 및 Kursad Turksen(편집자), Embryonic stem cells: methods and protocols in Methods Mol Biol. 2002;185, Humana Press; Current Protocols in Stem Cell Biology, ISBN: 9780470151808을 비롯한 다양한 표준 참고서에 정의 및 사용어 재록되어 있다.

IncuCyte S3 생세포 분석 시스템

IncuCyte S3 하드웨어는 두 개의 구성요소: 1) 갠트리 및 2) 제어기로 구성된다. 갠트리는 생세포 배양의 자동 이미지 획득을 가능하게 하는 현미경, 카메라 및 소모품 트레이들을 하우징하고 표준 조직 배양 인튜베이터 내부에 설치된다. 자발적 신경 세포 활성에 적용시, 현미경 시스템은 오렌지 스펙트럼(예: 540 nm; 통과 대역: [513, 568 nm; em: 609 nm; 통과 대역: [577, 684] nm) 및 근적외선 스펙트럼(예: 661 nm; 통과 대역: [648, 674]; em: 727 nm; 통과 대역: [641, 771] nm)에서 형광 이미지들을 수집하도록 맞춤화된 필터 모듈을 포함한다. 제어기는 이미지 저장, 데이터 처리, 데이터베이스 저장, 파일 시스템, 자동 이미지 처리, 그래픽 및 그래픽 사용자 인터페이스(GUI)를 통한 클라이언트 컴퓨터로부터의 네트워크 간 상호 작용을 가능하게 하는 프로세서들, 메모리 및 데이터 저장 드라이브들을 포함한다. 제어기 상의 소프트웨어는: 1) 서버 상호 작용 및 2) 기구 제어의 두 가지 용도로 사용된다.

갠트리는 인큐베이터에 설치되고 현미경과 카메라를 하우징한다.

제어기는 현미경 시스템을 제어하고 서버로 기능한다.

제어기는 이에 제한되지는 않지만 이더넷 포트와 같은 통신 포트에 연결된다.

그래픽 사용자 인터페이스(GUI)는 컴퓨터 상에 로딩되고 제어기(즉 서버)와 상호 작용하여 현미경 시스템을 제어하고 데이터와 상호 작용한다. 본 개시의 양태들에 따라 모든 자동 이미지 처리가 제어기 상에서 완료된다.

자동 동영상 캡처

Incucyte S3 현미경은 세포 배양 용기들, 이를테면 이에 제한되지는 않지만 96-웰 플레이트들의 사용자 정의 위치들로 이동되고, 적절한 LED를 턴 온하며 목적하는 현미경 대물렌즈를 사용하여 목적하는 속도로, 이를테면 4x 대물렌즈를 사용하여 3 프레임/초(fps)로 동영상들을 캡처한다.

본 개시의 특정 양태들에 따르면, 획득된 데이터는 압축 포맷으로 저장되고, 그러한 동영상으로부터 정적 "레인지(Range)" 이미지가 생성된다. 레인지 이미지는 완전한 스캔 기간에 걸쳐 각 픽셀 위치에서 최대 형광 강도에서 최소 형광 강도를 뺀 값을 나타내는 픽셀들로 구성된다. 배경 제거(톱-햇(top-hat)), 최소 세포 폭 획정, 형광 경계화를 비롯한 다수의 파라미터를 최적화하여 레인지 이미지 상에서 이미지 세분화가 완료된다. 개체들이 획정되면, 추가 사용자 정의 최소 버스트 강도 필터를 사용하여 버스트를 추가로 획정한다. 각 개체는 통상적으로 신경 세포이지만, 예를 들어 수상 돌기들, 축삭들 및/또는 시냅스들 같은 신경 세포 부분들도 개체들로서 획정될 수 있다.

이러한 세그먼트화된 개체들로부터, 다음 데이터가 3분 스캔으로부터 도출된다: 1) 상관관계 - 스캔 기간 동안 모든 개체 트레이스의 쌍별 상관관계 분석, 2) 평균 개체 평균 강도들 - 스캔 기간 동안 모든 개체의 평균 강도들의 평균, 3) 버스트 지속 기간 - 스캔 기간 동안 모든 개체의 평균 버스트 지속 기간의 평균, 5) 버스트 비율 - 스캔 기간 동안 모든 개체의 버스트 비율의 평균, 6) 버스트 세기 - 각 버스트의 세기는 강도 곡선 아래의 영역을 버스트 지속 시간으로 나눈 값으로 계산된다. 그 다음 전체 버스트 세기 메트릭은 스캔 기간 동안 모든 개체의 평균 버스트 세기의 평균이다. 마지막으로 활성 개체 수는 총 활성 개체들, 즉 스캔 기간 내에 세그먼트화된 개체들의 수로 정의된다. 선택적으로, 이러한 메트릭스 중 7개 모두 또는 그것의 서브 세트, 또는 하나 이상의 추가 메트릭스 단독 또는 조합은 각 개체, 각 웰 또는 각 웰 세트에 대해 계산되어, 데이터베이스에 저장되고, 그래픽 사용자 인터페이스를 통해 클라이언트 컴퓨터에서 데이터를 획득한 직후 사용자에게 디스플레이된다.

통상적으로 웰들은 24시간마다 스캔되지만, 보다 많거나 보다 적은 빈도로 스캔하는 것은 선택이다. 각 스캔 후에는, 해당 시점들에서 메트릭스가 계산되어 예를 들어 데이터베이스에 저장된다. 예를 들어, 30일 실험 동안, 각 메트릭에 대해 30개의 시점이 수집되고 시계열로 연관되며 전체 실험 시간 프레임(즉 시간, 일, 주, 월) 동안 그래프로 표시될 수 있다.

여기에 설명된 바와 같이 본 개시의 시스템들 및 방법들은 사용자들이 자동 중간 처리량 방식으로 장시간 기간에 걸쳐 신경망 활성 변화를 모니터링할 수 있게 한다. 그에 반해, 이전 방법들은 다음과 같다: 1) 종말점 방법들(다양한 측정된 파라미터를 한 번만 읽어 얻을 수 있다), 2) 극도로 파괴적인 방법들(칼슘 염료 대 유전자 부호화된 칼슘 지표 사용, 3) 분석/시각화를 위해 세포들을 인큐베이터 밖으로 이동시킬 것을 사용자에게 요구, 4) 통계적으로 관련이 없음(매우 소수의 세포로 측정하기 때문에), 5) 매우 수동적(자동화되지 않음) 또는 6) 처리량이 적음(한 번에 웰 하나, 수동).

본 개시의 양태들에 따르면, 신경 세포들 또는 신경 세포-유사 세포들은 칼슘 단백질, 특히 이에 제한되지는 않지만 칼슘 지표 단백질 GCaMP 또는 이의 변이체, 이를테면 Ca²⁺ 지표 jRCaMP1b 및 이의 변이체를 발현하도록 유전자 조작되며, 이는 레드 스펙트럼 대역의 Ca(2+)-종속 형광을 방출한다.

본 발명의 조성물들 및 방법들의 실시 양태들이 하기 예들로 예증된다. 이러한 예들은 예증적인 목적으로 제공되고 본 발명의 조성물들 및 방법들의 범위에 관한 제한으로 고려되지 않는다.

자발적 신경 세포 활성에 대한 IncuCyte S3 이미징

실험 방법들: 세포들 및 시약들

신경 세포 활성을 측정하기 위한 기기/시스템의 유용성은 쥐 성상 세포들과 함께 일차 및 iPSC-유래 신경 세포들의 공동 배양을 이용하는 장기 이미징 실험들로 예증된다. 세포 내 Ca²⁺의 시간적 변화는 신경 세포 활성의 척도로 사용된다. 세포 내 Ca²⁺의 이러한 장기 측정을 위해, 신경 세포들을 렌티 바이러스 전달계를 통해 유전자 부호화된 Ca²⁺ 지표(GECI, genetically encoded Ca²⁺ indicator), jRCaMP1b와 혼입하였다. jRCaMP1b는 Howard Hughes Medical Institute - 미국 특허: US2016/0176931 A1로부터 라이센스를 받았고 Dana 외, eLife 2016;5:e12727에 설명되어 있다. 샘플 데이터는 일차 쥐 전뇌 신경 세포들 뿐만 아니라 iPSC-유래 신경 세포들 의 세 가지 조제용 물질: iCell GlutaNeurons(Cellular Dynamics International), Peri.4U 신경 세포들(Ncardia) 및 iNeurons(University of Michigan)로부터의 실험들을 포함한다.

모든 실험은 신경 세포들 및 성상 세포들의 부착성을 향상시키기 위해 폴리-D-리신(쥐 전뇌 신경 세포들), 폴리에틸렌이민/라미닌(iGlutaNeurons 및 Peri. 4U) 또는 매트리젤(iNeurons) 중 어느 하나로 코팅된 96개의 웰 마이크로 플레이트에서 이루어졌다. 모든 준비는 15,000 세포/웰의 밀도로 일차 쥐 성상 세포들(MTI-Global Stem)와 공동 배양하였다. 플레이팅후 2일 내지 3일에 분열 세포들의 증식을 감소시키기 위해 유사 분열 억제제(5-플루오로-2'-데옥시우리딘/우리딘 조합, Sigma Aldrich)를 첨가하였다. 배양은 매주 2회 매체를 50% 변화시키면서 최대 30일 기간 동안 유지시켰다.

일차 신경 세포 실험들에서, 쥐 전뇌 신경 세포들(E-18 배아들에서 얻음(MTI-Global Stem))을 Neurobasal™ 매체(Thermo Fisher)와 NeuroCult™ SM1 신경 세포 보충제(Stem Cell Technology) 및 2 mM 글루타민에 5,000 내지 40,000 신경 세포/웰의 밀도 범위로 플레이팅하였다. 플레이팅후 1일 신경 세포들에 GECI jRCaMP1b를 혼입하였다. 플레이팅후 3일에 이미징을 개시하였다. 실험 조건으로서, 유지 매체를 플레이트의 일 부분에서 BrainPhys™ 신경 세포 매체(줄기 세포 기술)와 NeuroCult™ SM1 신경 세포 보충제(Stem Cell Technologies)로 변경하였다.

iCell GlutaNeurons 실험에서, iCell GlutaNeurons는 BrainPhys™ 신경 세포 매체(Stem Cell Technology)와 iCell 신경 세포 보충제 B(Cellular Dynamics International), iCell 신경계 보충제(Cellular Dynamics International) 및 N2 보충제(ThermoFisher)에 30,000 신경 세포/웰의 밀도로 플레이팅하였다. 플레이팅후 1일 신경 세포들에 GECI jRCaMP1b를 혼입하였다. 플레이팅후 3일에 이미징을 개시하고 27일 동안 지속하였다.

Peri.4U 신경 세포 실험에서, Peri.4U 신경 세포는 Neuro. 4U 기본 매체(Ncardia) 및 신경 세포 보충제 1(Ncardia)에 25,000 신경 세포/웰의 밀도로 플레이팅하였다. 플레이팅후 1일 신경 세포들에 GECI jRCaMP1b를 혼입하였다. 플레이팅후 3일에 이미징을 개시하였다. 실험 조건으로서, 유지 매체를 플레이트의 일 부분에서 BrainPhys™ 신경 세포 매체(줄기 세포 기술)와 NeuroCult™ SM1 신경 세포 보충제(Stem Cell Technologies)로 변경하였다.

iNeuron 실험에서, iNeuron은 3N 매체(DMEM/F12 매체 및 Neurobasal™ 매체의 조합, 인슐린, 비필수 아미노산, ThermoFisher)에 10,000 신경 세포/웰의 밀도로 플레이팅하였다. 플레이팅후 21일 신경 세포들에 GECI jRCaMP1b를 혼입하였다. 실험 조건으로서, 유지 매체를 플레이트의 일 부분에서 BrainPhys™ 신경 세포 매체(줄기 세포 기술)와 NeuroCult™ SM1 신경 세포 보충제(Stem Cell Technologies)로 변경하였다. GECI 혼입 이후 이미징을 개시하고 10일 동안 지속하였다.

명확성을 위해 별개의 실시 예들의 상황으로 설명된 본 발명의 특정 특징들은 또한 단일 실시 예로 조합하여 제공될 수 있는 것으로 이해된다. 반대로, 간결성을 위해 단일 실시 예의 상황으로 설명된 본 발명의 다양한 특징은 또한 별개로 또는 임의의 적합한 서브 조합으로 제공될 수 있다.

본 명세서에 언급된 임의의 특허 공보들 또는 공개 공보들은 참고로 통합되기 위해 각 개별적인 간행물이 구체적이고 개별적으로 표기되는 것과 동일한 정도로 여기에 참고로 통합된다.

여기에 설명된 조성물들 및 방법들은 현재 바람직한 실시 예들을 대표하는 것이고, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 그 변경 및 다른 용도들이 해당 기술분야의 통상의 기술자들에 떠오를 것이다. 그러한 변경 및 다른 용도들은 청구범위에 제시된 바와 같은 본 발명의 범위에서 벗어나지 않고 이루어질 수 있다.

VI. 결론

상기한 상세한 설명은 첨부 도면들을 참조하여 개시된 시스템들, 디바이스들 및 방법들의 다양한 특징 및 기능을 설명한다. 도면들에서, 문맥상 달리 나타내지 않는 한, 유사한 부호들은 통상적으로 유사한 구성요소들을 식별한다. 상세한 설명, 도면 및 청구범위에 설명된 예증적인 실시 예들은 제한적인 것으로 의도되지 않는다. 여기에 제시된 기술 요지의 범위에서 벗어나지 않고 다른 실시 예들이 이용될 수 있고 다른 변경들이 이루어질 수 있다. 여기에 일반적으로 설명되고 도면에 도시된 바와 같이 본 개시의 양태들은 매우 다양한 상이한 구성으로 배열, 치환, 조합, 분리 및 설계될 수 있으며, 이들 모두는 여기에 명시적으로 고려된다는 것을 쉽게 이해할 것이다.

도면의 임의의 또는 모든 메시지 흐름도, 시나리오 및 흐름도에 대하여 여기서 논의된 바와 같이, 각 단계, 블록 및/또는 통신은 예시적인 실시 예들에 따라 정보의 처리 및/또는 정보의 전송을 나타낼 수 있다. 대안적인 실시 예들이 이러한 예시적인 실시 예들의 범위 내에 포함된다. 이러한 대안적인 실시 예들에서, 예를 들어, 단계, 블록, 전송, 통신, 요청, 응답 및/또는 메시지로 설명된 기능들은 수반되는 기능에 따라, 실질적으로 동시 또는 역순을 비롯하여 제시되거나 논의된 것과 다른 순서로 실행될 수 있다. 또한, 보다 많거나 보다 적은 단계, 블록 및/또는 기능이 여기서 논의된 임의의 메시지 흐름도들, 시나리오들 및 흐름도들과 함께 사용될 수 있고, 이러한 메시지 흐름도들, 시나리오들 및 흐름도들은 서로 부분이 또는 전체가 조합될 수 있다.

정보 처리를 나타내는 단계 또는 블록은 여기에 설명된 방법 또는 기술의 특정 논리 기능들을 수행하도록 구성될 수 있는 회로에 대응할 수 있다. 대안 또는 추가로, 정보의 처리를 나타내는 단계 또는 블록은 모듈, 세그먼트 또는 프로그램 코드의 일 부분(관련 데이터 포함)에 대응할 수 있다. 프로그램 코드는 방법 또는 기술의 특정 논리 기능들 또는 동작들을 구현하기 위한 프로세서에 의해 실행 가능한 하나 이상의 명령을 포함할 수 있다. 프로그램 코드 및/또는 관련 데이터는 임의의 유형의 컴퓨터 판독 가능한 매체, 이를테면 디스크 드라이브, 하드 드라이브 또는 다른 저장 매체를 비롯한 저장 디바이스 상에 저장될 수 있다.

또한 컴퓨터 판독 가능한 매체는 짧은 시간 기간 동안 데이터를 저장하는 컴퓨터 판독 가능한 매체와 같은 비일시적 컴퓨터 판독 가능한 매체, 이를테면 레지스터 메모리, 프로세서 캐시 및/또는 랜덤 액세스 메모리(RAM)를 포함할 수 있다. 또한 컴퓨터 판독 가능한 매체는 더 오랜 시간 기간 동안 프로그램 코드 및/또는 데이터를 저장하는 비일시적 컴퓨터 판독 가능한 매체, 이를테면 판독 전용 메모리(ROM), 광학 또는 자기 디스크들 및/또는 컴팩트-디스크 판독 전용 메모리(CD-ROM)와 같은 이차 또는 영구 장기 스토리지를 포함할 수 있다. 또한 컴퓨터 판독 가능한 매체는 임의의 다른 휘발성 또는 비휘발성 저장 시스템들일 수 있다. 컴퓨터 판독 가능한 매체는 예를 들어 컴퓨터 판독 가능한 저장 매체 또는 유형의 저장 장치로 고려될 수 있다.

또한, 하나 이상의 정보 전송을 나타내는 단계 또는 블록은 동일한 물리적 디바이스에서의 소프트웨어 및/또는 하드웨어 모듈들 간의 정보 전송에 대응할 수 있다. 그러나, 상이한 물리적 디바이스들에서의 소프트웨어 모듈 및/또는 하드웨어 모듈들 간에 다른 정보 전송도 이루어질 수 있다.

여기에 다양한 양태 및 실시 예가 개시되었지만, 다른 양태들 및 실시 예들이 해당 기술분야의 통상의 기술자들에게 명백할 것이다. 여기에 개시된 다양한 양태 및 실시 예는 예증을 위한 것이고 제한하기 위한 것이 아니며, 진정한 범위는 다음의 청구범위로 나타난다.

Claims

방법으로서,
세포 배양 용기의 동영상을 캡처하는 단계; 및
상기 동영상으로부터 정적 레인지 이미지를 생성하는 단계로서, 상기 레인지 이미지는 완전한 스캔 기간에 걸쳐 각 픽셀 위치에서 최대 형광 강도에서 최소 형광 강도를 뺀 값을 나타내는 픽셀들로 구성되는, 상기 정적 레인지 이미지를 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
청구항 1에 있어서,
상기 레인지 이미지를 세그먼트화함으로써 개체들을 획정하는 단계를 더 포함하는, 방법.
청구항 2에 있어서,
상기 개체들로부터, 상기 완전한 스캔 기간으로부터 평균 개체 평균 강도들을 도출하는 단계를 더 포함하는, 방법.
청구항 2 또는 3에 있어서,
상기 개체들로부터, 상기 완전한 스캔 기간에 걸쳐 모든 개체 트레이스들의 쌍별 상관 분석을 도출하는 단계를 더 포함하는, 방법.
청구항 2 내지 4 중 어느 한 항에 있어서,
상기 개체들로부터, 상기 완전한 스캔 기간으로부터 모든 개체 평균 버스트 지속 기간의 평균을 도출하는 단계를 더 포함하는, 방법.
청구항 2 내지 5 중 어느 한 항에 있어서,
상기 개체들로부터, 상기 완전한 스캔 기간으로부터 모든 개체의 각 버스트의 세기를 도출하는 단계를 더 포함하는, 방법.
청구항 6에 있어서,
전체 버스트 세기 메트릭을 상기 완전한 스캔 기간으로부터 모든 개체 평균 버스트 세기의 평균으로서 도출하는 단계를 더 포함하는, 방법.
하나 이상의 시간 기간 동안 생활성 세포들을 식별하는 방법으로서, 상기 하나 이상의 시간 기간의 각 시간 기간마다:
a. 샘플 용기 내에 함유된 샘플의 복수의 형광 활성 이미지를 생성하는 단계로서, 상기 샘플은 생활성 세포들을 포함하고, 상기 복수의 형광 활성 이미지의 각 이미지는 각 복수의 픽셀 값을 포함하며, 각 픽셀 값은 이미지 프레임 내 각각의 픽셀 위치에 대응하는, 상기 복수의 형광 활성 이미지를 생성하는 단계;
b. 상기 복수의 형광 활성 이미지로부터 형광 레인지 이미지를 생성하는 단계로서, 복수의 형광 활성 이미지로부터 형광 레인지 이미지를 생성하는 단계는 상기 형광 레인지 이미지에 대한 복수의 픽셀 값을 결정하는 단계를 포함하고, 상기 형광 레인지 이미지에 대한 소정의 픽셀 값을 결정하는 단계는 상기 복수의 형광 활성 이미지 각각으로부터, 상기 이미지 프레임 내 상기 소정의 픽셀 값의 픽셀 위치에 대응하는 픽셀 위치들을 갖는 픽셀 값 세트의 레인지를 결정하는 단계를 포함하는, 상기 복수의 형광 활성 이미지로부터 형광 레인지 이미지를 생성하는 단계;
c. 상기 형광 레인지 이미지에 기초하여, 대응하는 시간 기간 동안 상기 샘플 용기 내 하나 이상의 활성 개체의 위치를 상기 이미지 프레임에 관해 결정하는 단계로서, 상기 하나 이상의 활성 개체 각각은 상기 대응하는 시간 기간 동안 상기 샘플 내에 존재하는 적어도 하나의 각 생활성 세포의 일 부분인, 상기 활성 개체의 위치를 결정하는 단계; 및
d. 상기 대응하는 시간 기간 동안 상기 샘플 용기 내 상기 하나 이상의 활성 개체의 각 활성 개체마다, 상기 대응하는 시간 기간에 걸쳐 상기 하나 이상의 활성 개체의 각 시변 활성 레벨을 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
하나 이상의 시간 기간 동안 생활성 세포들을 식별하는 방법으로서, 상기 하나 이상의 시간 기간의 각 시간 기간마다:
a. 샘플 용기 내에 함유된 샘플의 복수의 형광 활성 이미지를 생성하는 단계로서, 상기 샘플은 생활성 세포들을 포함하고, 상기 복수의 형광 활성 이미지의 각 이미지는 각 복수의 픽셀 값을 포함하며, 각 픽셀 값은 이미지 프레임 내 각각의 픽셀 위치에 대응하는, 상기 복수의 형광 활성 이미지를 생성하는 단계;
b. 상기 복수의 형광 활성 이미지로부터 형광 레인지 이미지를 생성하는 단계로서, 복수의 형광 활성 이미지로부터 형광 레인지 이미지를 생성하는 단계는 상기 형광 레인지 이미지에 대한 복수의 픽셀 값을 결정하는 단계를 포함하고, 상기 형광 레인지 이미지에 대한 소정의 픽셀 값을 결정하는 단계는 상기 복수의 형광 활성 이미지 각각으로부터, 상기 이미지 프레임 내 상기 소정의 픽셀 값의 픽셀 위치에 대응하는 픽셀 위치들을 갖는 픽셀 값 세트의 레인지를 결정하는 단계를 포함하는, 상기 복수의 형광 활성 이미지로부터 형광 레인지 이미지를 생성하는 단계;
c. 상기 형광 레인지 이미지에 기초하여, 대응하는 시간 기간 동안 상기 샘플 용기 내 하나 이상의 활성 개체의 위치를 상기 이미지 프레임에 관해 결정하는 단계로서, 상기 하나 이상의 활성 개체 각각은 상기 대응하는 시간 기간 동안 상기 샘플 내에 존재하는 적어도 하나의 각 생활성 세포의 일 부분인, 상기 활성 개체의 위치를 결정하는 단계; 및
d. 상기 대응하는 시간 기간 동안 상기 샘플 용기 내 상기 하나 이상의 활성 개체의 각 활성 개체마다, 상기 대응하는 시간 기간에 걸쳐 상기 하나 이상의 활성 개체의 각 시변 활성 레벨을 결정하는 단계로서, 각 시변 활성 레벨은 상기 복수의 형광 활성 이미지 각각으로부터, 대응하는 활성 개체의 결정된 상기 위치에 근접한 픽셀 위치들을 갖는 픽셀 값 세트에 기초하여 결정되는, 상기 시변 활성 레벨을 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
청구항 8 또는 9에 있어서, 상기 샘플 용기는 배양기 내에 위치되는, 방법.
청구항 8 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, 특정 시간 기간 동안 특정 활성 개체의 시변 활성 레벨을 검출하는 단계는:
상기 특정 시간 기간 동안 생성된 상기 복수의 형광 활성 이미지 각각으로부터, 상기 특정 활성 개체의 결정된 상기 위치에 근접한 픽셀 위치들을 갖는 픽셀 값 세트에 기초하여 정확하지 않은 시변 활성 레벨을 결정하는 단계;
정확하지 않은 시변 활성 레벨에 기초하여, 상기 특정 시간 기간에 걸쳐 상기 특정 활성 개체의 시변 광표백 레벨을 결정하는 단계; 및
상기 정확하지 않은 시변 활성 레벨로부터 상기 시변 광표백 레벨을 제거함으로써 상기 특정 시간 기간 동안 상기 특정 활성 개체의 상기 시변 활성 레벨을 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
청구항 8 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 시간 기간의 제1 시간 기간 및 상기 하나 이상의 시간 기간의 마지막 시간 기간은 시간이 24시간 넘게 떨어져 있는, 방법.
청구항 8 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 시간 기간의 제1 시간 기간 및 상기 하나 이상의 시간 기간의 마지막 시간 기간은 시간이 3일 넘게 떨어져 있는, 방법.
청구항 8 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 시간 기간의 제1 시간 기간 및 상기 하나 이상의 시간 기간의 마지막 시간 기간은 시간이 30일 넘게 떨어져 있는, 방법.
청구항 8 내지 14 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 시간 기간은 특정 비율로 시간에 따라 규칙적 간격을 갖는, 방법.
청구항 15에 있어서, 상기 특정 비율은 매일을 초과하는, 방법.
청구항 15에 있어서, 상기 특정 비율은 매일 두 번을 초과하는, 방법.
청구항 8 내지 14 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 시간 기간의 적어도 두 개의 시간 기간이 24시간 기간 내에 발생하는, 방법.
청구항 8 내지 14 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 시간 기간의 적어도 세 개의 시간 기간이 24시간 기간 내에 발생하는, 방법.
청구항 8 내지 19 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 시간 기간의 제1 시간 기간 동안 위치되는 활성 개체 및 상기 하나 이상의 시간 기간의 상이한 시간 기간 동안 위치되는 활성 개체는 상기 샘플 내 동일한 생활성 세포의 부분들인, 방법.
청구항 8 내지 20 중 어느 한 항에 있어서,
상기 하나 이상의 시간 기간의 특정 시간 기간 동안 상기 샘플 용기 내 상기 하나 이상의 활성 개체에 대해 결정되는 상기 시변 활성 레벨들에 기초하여, 상기 특정 시간 기간 동안 상기 샘플 용기 내 활성 개체들의 각 쌍 사이 패턴 또는 조정도 중 적어도 하나를 결정하는 단계; 및
상기 특정 시간 기간 동안 상기 샘플 용기 내 활성 개체들의 각 쌍 사이 패턴 또는 조정도 중 결정된 상기 적어도 하나를 디스플레이하는 단계를 더 포함하는, 방법.
청구항 8 내지 21 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생활성 세포들은 신경 세포들, 평활근 세포들, 횡문근 세포들, 심장 근육 세포들 또는 분비 세포들 중 적어도 하나를 포함하는, 방법.
청구항 8 내지 22 중 어느 한 항에 있어서,
상기 하나 이상의 시간 기간의 상기 특정 시간 기간 동안 상기 샘플 용기 내 상기 하나 이상의 활성 개체에 대해 결정되는 상기 시변 활성 레벨들에 기초하여, 활성 개체들의 서브 세트를 선택하는 단계를 더 포함하며, 상기 특정 시간 기간 동안 상기 샘플 용기 내 상기 하나 이상의 활성 개체로부터 특정 활성 개체를 선택하는 단계는 상기 특정 활성 개체에 대해 결정된 상기 시변 활성 레벨이 적어도 하나의 버스트를 보인다고 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
청구항 23에 있어서,
선택된 상기 활성 개체들의 서브 세트에 대해 결정된 상기 시변 활성 레벨들에 기초하여, 선택된 상기 활성 개체들 내 활성 개체들의 각 쌍 사이 패턴 또는 조정도 중 적어도 하나를 결정하는 단계; 및
선택된 상기 활성 개체들 내 활성 개체들의 각 쌍 사이 패턴 또는 조정도 중 결정된 상기 적어도 하나를 디스플레이하는 단계를 더 포함하는, 방법.
청구항 8 내지 24 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플 용기 내 상기 하나 이상의 활성 개체의 위치를 상기 이미지 프레임에 관해 결정하는 단계는 상기 픽셀 위치들의 하나 이상의 세트를 결정하는 단계를 포함하며, 각 세트는 상기 하나 이상의 활성 개체의 각 활성 개체의 상기 이미지 프레임 내 규모에 대응하는, 방법.
청구항 25에 있어서, 상기 하나 이상의 시간 기간의 특정 시간 기간 동안 특정 활성 개체에 대한 시변 활성 레벨을 결정하는 단계는 상기 특정 시간 기간에 걸쳐, 상기 특정 활성 개체에 대응하는 결정된 상기 픽셀 위치들의 세트에 대응하는 픽셀 값들의 총 활성 레벨을 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
청구항 8 내지 26 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 시간 기간의 특정 시간 기간 동안 복수의 형광 이미지를 생성하는 단계는 현미경을 작동시켜 상기 복수의 형광 활성 이미지를 생성하는 단계를 포함하고, 상기 방법은:
상기 특정 시간 기간 동안 복수의 형광 이미지를 생성하는 단계 이전에, 구동 갠트리를 작동시켜 상기 현미경이 상기 특정 시간 기간 동안 상기 샘플의 상기 복수의 형광 활성 이미지를 생성할 수 있도록 상기 현미경을 상기 샘플 용기에 관해 위치시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
청구항 8 내지 27 중 어느 한 항에 있어서,
상기 하나 이상의 시간 기간의 특정 시간 기간에 대응하는 특정 복수의 형광 활성 이미지의 상기 형광 활성 이미지들 각각에 나타나는 상기 샘플의 각 광표백도를 결정하는 단계; 및
상기 특정 시간 기간 동안 상기 형광 레인지 이미지를 생성하는 단계 이전에, 결정된 상기 각 광표백도에 따라 상기 특정 복수의 형광 활성 이미지의 상기 형광 활성 이미지들 각각을 교정하는 단계를 더 포함하는, 방법.
청구항 8 내지 28 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생활성 세포들은 상기 생활성 세포들의 활성 레벨과 관련되는 형광 속성을 갖는 형광단을 포함하고, 상기 샘플의 소정의 형광 활성 이미지를 생성하는 단계는 상기 형광단의 여기 파장으로 상기 샘플을 조명하는 단계 및 상기 형광단의 방출 파장에 반응하여 상기 샘플로부터 방출되는 광을 이미징하는 단계를 포함하는, 방법.
청구항 29에 있어서, 상기 형광단은 칼슘 민감성 형광단을 포함하는, 방법.
청구항 8 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, 각 결정된 시변 활성 레벨들에 기초하여, 상기 하나 이상의 시간 기간 중 적어도 하나의 시간 기간 동안 상기 개체들 중 하나 이상의 개체에 대한 각 평균 세기 레벨들을 결정하는 단계를 더 포함하는, 방법.
청구항 8 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, 각 결정된 시변 활성 레벨들에 기초하여, 상기 하나 이상의 시간 기간 중 적어도 하나의 시간 기간 동안 상기 개체들 중 하나 이상의 개체에 대한 각 버스트 비율들을 결정하는 단계를 더 포함하는, 방법.
하나 이상의 시간 기간 동안 생활성 세포들을 식별하는 방법으로서, 상기 하나 이상의 시간 기간의 각 시간 기간마다:
a. 샘플 용기 내에 함유된 샘플의 복수의 형광 활성 이미지를 생성하는 단계로서, 상기 샘플은 생활성 세포들을 포함하고, 상기 복수의 형광 활성 이미지의 각 이미지는 각 복수의 픽셀 값을 포함하며, 각 픽셀 값은 이미지 프레임 내 각각의 픽셀 위치에 대응하는, 상기 복수의 형광 활성 이미지를 생성하는 단계;
b. 대응하는 시간 기간 동안 상기 샘플 용기 내 하나 이상의 활성 개체의 위치를 상기 이미지 프레임에 관해 결정하는 단계로서, 상기 하나 이상의 활성 개체 각각은 상기 대응하는 시간 기간 동안 상기 샘플 내에 존재하는 적어도 하나의 각 생활성 세포의 일 부분인, 상기 활성 개체의 위치를 결정하는 단계;
c. 상기 대응하는 시간 기간 동안 상기 샘플 용기 내 상기 하나 이상의 활성 개체의 각 활성 개체마다, 상기 대응하는 시간 기간에 걸쳐 각 시변 활성 레벨을 결정하는 단계; 및
d. 상기 하나 이상의 활성 개체에 대해 결정되는 상기 시변 활성 레벨들에 기초하여, 상기 하나 이상의 활성 개체로부터 활성 개체들의 서브 세트를 선택하는 단계로서, 상기 하나 이상의 활성 개체로부터 특정 활성 개체를 선택하는 단계는 상기 특정 활성 개체에 대해 결정된 상기 시변 활성 레벨이 적어도 하나의 버스트를 보인다고 결정하는 단계를 포함하는, 상기 활성 개체들의 서브 세트를 선택하는 단계를 포함하는, 방법.
하나 이상의 시간 기간 동안 생활성 세포들을 식별하는 방법으로서, 상기 하나 이상의 시간 기간의 각 시간 기간마다:
a. 샘플 용기 내에 함유된 샘플의 복수의 형광 활성 이미지를 생성하는 단계로서, 상기 샘플은 생활성 세포들을 포함하고, 상기 복수의 형광 활성 이미지의 각 이미지는 각 복수의 픽셀 값을 포함하며, 각 픽셀 값은 이미지 프레임 내 각각의 픽셀 위치에 대응하는, 상기 복수의 형광 활성 이미지를 생성하는 단계;
b. 대응하는 시간 기간 동안 상기 샘플 용기 내 하나 이상의 활성 개체의 위치를 상기 이미지 프레임에 관해 결정하는 단계로서, 상기 하나 이상의 활성 개체 각각은 상기 대응하는 시간 기간 동안 상기 샘플 내에 존재하는 적어도 하나의 각 생활성 세포의 일 부분인, 상기 활성 개체의 위치를 결정하는 단계;
c. 상기 대응하는 시간 기간 동안 상기 샘플 용기 내 상기 하나 이상의 활성 개체의 각 활성 개체마다, 상기 복수의 형광 활성 이미지 각각으로부터, 상기 하나 이상의 활성 개체의 결정된 각각의 상기 위치들에 근접한 픽셀 위치들을 갖는 픽셀 값들의 각 세트들에 기초하여 상기 대응하는 시간 기간에 걸쳐 각 시변 활성 레벨을 결정하는 단계; 및
d. 상기 하나 이상의 활성 개체에 대해 결정되는 상기 시변 활성 레벨들에 기초하여, 상기 하나 이상의 활성 개체로부터 활성 개체들의 서브 세트를 선택하는 단계로서, 상기 하나 이상의 활성 개체로부터 특정 활성 개체를 선택하는 단계는 상기 특정 활성 개체에 대해 결정된 상기 시변 활성 레벨이 적어도 하나의 버스트를 보인다고 결정하는 단계를 포함하는, 상기 활성 개체들의 서브 세트를 선택하는 단계를 포함하는, 방법.
청구항 33 또는 34에 있어서, 상기 샘플 용기는 배양기 내에 위치되는, 방법.
청구항 33 내지 35 중 어느 한 항에 있어서, 특정 시간 기간 동안 특정 활성 개체의 시변 활성 레벨을 검출하는 단계는:
상기 특정 시간 기간 동안 생성된 상기 복수의 형광 활성 이미지 각각으로부터, 상기 특정 활성 개체의 결정된 상기 위치에 근접한 픽셀 위치들을 갖는 픽셀 값 세트에 기초하여 정확하지 않은 시변 활성 레벨을 결정하는 단계;
정확하지 않은 시변 활성 레벨에 기초하여, 상기 특정 시간 기간에 걸쳐 상기 특정 활성 개체의 시변 광표백 레벨을 결정하는 단계; 및
상기 정확하지 않은 시변 활성 레벨로부터 상기 시변 광표백 레벨을 제거함으로써 상기 특정 시간 기간 동안 상기 특정 활성 개체의 상기 시변 활성 레벨을 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
청구항 33 내지 35 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 시간 기간의 제1 시간 기간 및 상기 하나 이상의 시간 기간의 마지막 시간 기간은 시간이 24시간 넘게 떨어져 있는, 방법.
청구항 33 내지 35 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 시간 기간의 제1 시간 기간 및 상기 하나 이상의 시간 기간의 마지막 시간 기간은 시간이 3일 넘게 떨어져 있는, 방법.
청구항 33 내지 35 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 시간 기간의 제1 시간 기간 및 상기 하나 이상의 시간 기간의 마지막 시간 기간은 시간이 30일 넘게 떨어져 있는, 방법.
청구항 33 내지 39 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 시간 기간은 특정 비율로 시간에 따라 규칙적 간격을 갖는, 방법.
청구항 40에 있어서, 상기 특정 비율은 매일을 초과하는, 방법.
청구항 40에 있어서, 상기 특정 비율은 매일 두 번을 초과하는, 방법.
청구항 33 내지 39 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 시간 기간의 적어도 두 개의 시간 기간이 24시간 기간 내에 발생하는, 방법.
청구항 33 내지 39 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 시간 기간의 적어도 세 개의 시간 기간이 24시간 기간 내에 발생하는, 방법.
청구항 33 내지 44 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 시간 기간의 제1 시간 기간 동안 위치되는 활성 개체 및 상기 하나 이상의 시간 기간의 상이한 시간 기간 동안 위치되는 활성 개체는 상기 샘플 내 동일한 생활성 세포의 부분들인, 방법.
청구항 33 내지 45 중 어느 한 항에 있어서,
상기 하나 이상의 시간 기간의 특정 시간 기간 동안 상기 샘플 용기 내 상기 하나 이상의 활성 개체에 대해 결정되는 상기 시변 활성 레벨들에 기초하여, 상기 특정 시간 기간 동안 상기 샘플 용기 내 활성 개체들의 각 쌍 사이 패턴 또는 조정도 중 적어도 하나를 결정하는 단계; 및
상기 특정 시간 기간 동안 상기 샘플 용기 내 활성 개체들의 각 쌍 사이 패턴 또는 조정도 중 결정된 상기 적어도 하나를 디스플레이하는 단계를 더 포함하는, 방법.
청구항 33 내지 46 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생활성 세포들은 신경 세포들, 평활근 세포들, 횡문근 세포들, 심장 근육 세포들 또는 분비 세포들 중 적어도 하나를 포함하는, 방법.
청구항 33 내지 47 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플 용기 내 상기 하나 이상의 활성 개체의 위치를 상기 이미지 프레임에 관해 결정하는 단계는 상기 픽셀 위치들의 하나 이상의 세트를 결정하는 단계를 포함하며, 각 세트는 상기 하나 이상의 활성 개체의 각 활성 개체의 상기 이미지 프레임 내 규모에 대응하는, 방법.
청구항 48에 있어서, 상기 하나 이상의 시간 기간의 특정 시간 기간 동안 특정 활성 개체에 대한 시변 활성 레벨을 결정하는 단계는 상기 특정 시간 기간에 걸쳐, 상기 특정 활성 개체에 대응하는 결정된 상기 픽셀 위치들의 세트에 대응하는 픽셀 값들의 총 활성 레벨을 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
청구항 33 내지 49 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 시간 기간의 특정 시간 기간 동안 복수의 형광 이미지를 생성하는 단계는 현미경을 작동시켜 상기 복수의 형광 활성 이미지를 생성하는 단계를 포함하고, 상기 방법은:
상기 특정 시간 기간 동안 복수의 형광 이미지를 생성하는 단계 이전에, 구동 갠트리를 작동시켜 상기 현미경이 상기 특정 시간 기간 동안 상기 샘플의 상기 복수의 형광 활성 이미지를 생성할 수 있도록 상기 현미경을 상기 샘플 용기에 관해 위치시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
청구항 33 내지 50 중 어느 한 항에 있어서,
상기 하나 이상의 시간 기간의 특정 시간 기간에 대응하는 특정 복수의 형광 활성 이미지의 상기 형광 활성 이미지들 각각에 나타나는 상기 샘플의 각 광표백도를 결정하는 단계; 및
상기 특정 시간 기간 동안 상기 형광 레인지 이미지를 생성하는 단계 이전에, 결정된 상기 각 광표백도에 따라 상기 특정 복수의 형광 활성 이미지의 상기 형광 활성 이미지들 각각을 교정하는 단계를 더 포함하는, 방법.
청구항 33 내지 51 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생활성 세포들은 상기 생활성 세포들의 활성 레벨과 관련되는 형광 속성을 갖는 형광단을 포함하고, 상기 샘플의 소정의 형광 활성 이미지를 생성하는 단계는 상기 형광단의 여기 파장으로 상기 샘플을 조명하는 단계 및 상기 형광단의 방출 파장에 반응하여 상기 샘플로부터 방출되는 광을 이미징하는 단계를 포함하는, 방법.
청구항 52에 있어서, 상기 형광단은 칼슘 민감성 형광단을 포함하는, 방법.
청구항 33 내지 53 중 어느 한 항에 있어서, 각 결정된 시변 활성 레벨들에 기초하여, 상기 하나 이상의 시간 기간 중 적어도 하나의 시간 기간 동안 상기 개체들 중 하나 이상의 개체에 대한 각 평균 세기 레벨들을 결정하는 단계를 더 포함하는, 방법.
청구항 33 내지 53 중 어느 한 항에 있어서, 각 결정된 시변 활성 레벨들에 기초하여, 상기 하나 이상의 시간 기간 중 적어도 하나의 시간 기간 동안 상기 개체들 중 하나 이상의 개체에 대한 각 버스트 비율들을 결정하는 단계를 더 포함하는, 방법.
컴퓨팅 디바이스의 하나 이상의 프로세서에 의해 실행될 때, 상기 컴퓨팅 디바이스로 하여금 청구항 1 내지 55 중 어느 한 항의 방법을 수행하는 컴퓨터 동작들을 수행하게 하는 적어도 컴퓨터 판독 가능한 명령들을 저장하도록 구성된 비일시적 컴퓨터 판독 가능한 매체.
시스템으로서,
하나 이상의 프로세서; 및
상기 하나 이상의 프로세서에 의해 실행될 때, 상기 시스템으로 하여금 청구항 1 내지 55 중 어느 한 항의 방법을 수행하는 적어도 컴퓨터 판독 가능한 명령들을 저장하도록 구성된 비일시적 컴퓨터 판독 가능한 매체를 포함하는, 시스템.