KR20200084804A - 포도당 측정기와 무세포 단백질 합성을 이용한 목적 물질의 정량 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 포도당 측정기와 무세포 단백질 반응을 접목시켜, 목적 물질을 정량하는 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 목적 물질의 정량 방법은 저비용 단시간에 고효율로 목적 물질을 정량할 수 있으므로 다양한 산업에서 유용하게 활용될 수 있다.

Description

포도당 측정기와 무세포 단백질 합성을 이용한 목적 물질의 정량 방법{A method for analysis of target substance using a glucose meter and cell-free protein synthesis}

본 발명은 포도당 측정기와 무세포 단백질 반응을 접목시켜, 목적 물질을 정량하는 방법에 관한 것이다.

무세포 단백질 합성 시스템은 반복적인 세포배양단계 없이 원하는 단백질만을 생산하기 위해 개발되었으며, 목표 유전자서열을 포함하는 DNA, 전사/번역관련 단백질 기구, 핵산, 아미노산, 에너지원, 완충액 등으로 구성되어 있다. 원하는 단백질을 코딩하고 있는 유전자는 RNA 중합효소에 의해 mRNA로 전사되고, 이들은 리보솜, 외부에서 공급된 tRNA, 아미노산 및 에너지원에 의해 단백질로 번역되며, 이러한 세포외 전사와 번역 과정으로 단백질 합성이 진행된다. 이런 무세포 단백질 합성 시스템은 살아있는 세포를 사용하지 않기 때문에 다양한 종류의 단백질을 빠른 시간 내에 얻기에 유리하다.

한편, 무세포 단백질 합성 시스템은 항체, 백신, 펩타이드 등 다양한 생물 분자 합성 (Pardee K et al., Portable, On-Demand Biomolecular Manufacturing, Cell. 2016, 167(1):248-259 등) 뿐만 아니라, 특정 유전자로부터 발현되는 단백질 추적 (Journal of Biomolecular NMR March 2007, Volume 37, Issue 3, pp 225-22 등) 등에도 적용되어 왔으나, 이를 물질 정량에 적용한 연구는 아직 기초 단계에 머물러 있는 수준이다.

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 물질을 간편히 정량하는 방법을 개발하고자 예의 노력 연구한 결과, 특정 물질의 외인성 첨가 여부에 따라 단백질의 합성 반응 진행여부를 의존적으로 결정할 수 있는 무세포 단백질 합성 시스템의 특성과, 포도당 측정기를 접목시켜 분석 시료에 존재하는 목적 물질을 정량적으로 간편하게 분석할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 (a) 무세포 단백질 합성 반응 혼합물에, 목적 물질이 포함된 분석 시료를 혼합하여 단백질 합성을 수행하는 단계; (b) 상기 합성된 단백질을 기질과 반응시켜 포도당을 생성하는 단계; 및 (c) 포도당 측정기를 이용하여 포도당 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 목적 물질의 정량 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 따라 정량한 목적 물질의 농도를 정상 대조군과 비교하는 단계를 포함하는, 질환 진단 정보 제공 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법의 (a) 단계 이전, 분석 시료에 질환의 예방 또는 치료 후보물질을 처리하는 단계를 포함하는, 질환의 예방 또는 치료 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 발명에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.

본 발명의 하나의 양태는, (a) 무세포 단백질 합성 반응 혼합물과, 목적 물질이 포함된 분석 시료를 혼합하여 단백질 합성을 수행하는 단계; (b) 상기 합성된 단백질을 기질과 반응시켜 포도당을 생성하는 단계; 및 (c) 포도당 측정기를 이용하여 포도당 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 목적 물질의 정량 방법을 제공한다.

본 발명에서는 무세포 단백질 합성 반응을 이용한 신호-생성 단백질, 즉 리포터 단백질 합성 반응을 기반으로 한 목적 물질의 정량 방법을 제공한다.

본 발명에서, "목적 물질"은 본 발명에 따른 방법으로 정량하고자 하는 물질을 의미한다. 상기 "목적 물질" 은 대사체 일 수 있다.

본 발명에서, "대사체"란, 생체의 세포, 조직, 기관 또는 생체액 내에 존재하는 대사산물을 의미한다. 상기 대사산물은 동화, 이화작용에서 생기는 물질로서, 모든 생체세포에 포함되는 일차 대사산물인 단백질, 탄수화물, 지질, 핵산뿐 아니라 화합물, 및 2차 대사 산물도 제한없이 포함한다. 상기 대사산물은, 구체적으로 핵산, 화합물(compound), 및/또는 아미노산일 수 있다.

본 발명에서 "목적 핵산"은 본 발명에 따른 방법으로 정량하고자 하는 핵산을 의미한다. 구체적으로, 상기 목적 핵산은 바이러스(virus) 및/또는 진균(fusarium)에 존재하는 서열일 수 있고, 일 예로 지카바이러스, 에볼라바이러스 등일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 "목적 화합물" 은 본 발명에 따른 방법으로 정량하고자 하는 화합물을 의미한다. 상기 화합물은 전사 및/또는 번역 억제자에 결합하거나, 단백질의 올바른 접힘을 유도하는 화합물일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 "목적 아미노산"은 본 발명에 따른 방법으로 정량하고자 하는 아미노산을 의미한다. 아미노산은 화합물의 일종으로 분류되기도 한다. 구체적으로, 상기 목적 아미노산은 아르기닌(arginine), 이소류신(isoleucine), 류신(leucine), 리신(lysine), 메티오닌(methionine), 페닐알라닌(phenylalanine), 타이로신(tyrosine), 발린(valine), 알라닌(alanine), 시스테인(cysteine), 세린(serine), 글라이신(glycine), 히스티딘(histidine), 트레오닌(threonine), 프롤린(proline), 트립토판(tryptophan), 아스파르트산(aspartic acid), 아스파라긴(asparagine), 글루탐산(glutamic acid) 및 글루타민(glutamine)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것일 수 있고, 구체적으로 이소류신, 류신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌 및 트립토판으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

무세포 단백질 합성은 특정 성분의 외인성 첨가에 의존적으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 특정 성분만을 제외한 무세포 합성 반응 혼합액이 정량하고자 하는 목적 물질을 포함하는 시료와 혼합됨으로써, 단백질의 전사 또는 번역, 혹은 올바른 접힘(folding)이 일어나 리포터 단백질이 합성됨으로써 목적하는 물질을 정량할 수 있다. 이러한 외인성 첨가는 무세포 합성 반응 혼합액에 목적 물질인 시료가 첨가되거나 혹은 목적 물질인 시료에 무세포 반응 혼합액이 첨가되는 것 모두 포함한다.

일 구현예로, 상기 목적 물질이 핵산인 경우, RNA-toehole switch sensor의 원리를 이용하여, 정량하고자 하는 핵산과 상보적인 서열이 리포터 단백질의 코딩 영역 상단에 존재하면서 RNA의 전사 또는 번역이 불가능한 특정 이차구조를 형성하도록 하는 것일 수 있고, 이 경우 정량하고자 하는 핵산이 포함된 분석 시료가 무세포 반응 혼합액과 혼합되면 단백질 전사 또는 번역이 일어나 리포터 단백질의 합성이 빠르게 일어날 수 있다. 다른 예로, 상기 목적 물질이 miRNA인 경우 리포터 단백질을 발현할 수 있는 프로모터 서열의 하단 및 이와 단리된 리포터 단백질의 코딩 영역에 각각 타겟으로 하는 miRNA에 상보적인 서열의 일부를 연결할 수 있고, 이 경우 정량하고자 하는 miRNA가 포함된 분석 시료가 무세포 반응 혼합액과 혼합되면 단백질의 전사 및 번역에 의해 리포터 단백질의 합성이 일어날 수 있다.

일 구현예로, 상기 목적 물질이 화합물(compound)인 경우, 화합물은 전사인자 억제자(transcription inhibitor)와 결합하는 화합물이거나, transcription factor의 cofactor이거나, 그 밖에 전사 개시에 영향을 주거나, 또는 단백질의 이차구조 형성 내지 올바른 접힘(folding)에 영향을 주는 화합물일 수 있으며, 이 경우 정량하고자 하는 화합물이 포함된 분석 시료가 무세포 반응 혼합액과 혼합되어 단백질 전사 또는 번역, 혹은 올바른 접힘이 일어나 리포터 단백질 합성이 일어날 수 있다. 예를 들어 상기 목적 물질이 압타머에 결합하는 화합물이라면, 압타머 서열을 리포터 단백질 코딩 영역과 프로모터 서열 사이에 삽입하여 사용함으로써 압타머에 결합하는 화합물의 존재 시 리포터 단백질의 발현량이 감소하는 원리를 이용 할 수 있다. 일 구현예로, 상기 목적 물질이 아미노산인 경우, 정량하고자 하는 목적 아미노산이 포함된 분석 시료를 해당 목적 아미노산이 포함되지 않은 무세포 합성 반응 혼합액과 혼합한 후 인큐베이션(incubation)하면 리포터 단백질의 합성이 빠르게 일어날 수 있다.

일 구현예로, 상기 목적 물질인 대사체가 특정 항체에 대한 항원(antigen)으로 작용하는 경우, ELISA의 원리인 항원에 결합하는 capture antibody 및 detection antibody를 이용할 수 있고, 예를 들어 리포터 단백질을 코딩하는 DNA서열을 컨쥬게이트한 detection antibody를 사용하여 무세포 단백질 합성 반응 혼합물에 의해 리포터 단백질이 발현되도록 할 수 있다.

다만, 전술한 내용은 일 예시일 뿐이며 이에 제한되지 않는다.

본 발명자들은 무세포 단백질 반응이 특정 물질의 존재 여부에 의존적으로 조절될 수 있음에 착안하여 목적 물질의 정량 방법을 개발하였다.

본 발명의 용어, "무세포 단백질 합성"은 세포 내에서 수행되던 단백질 합성을 시험관 등의 생체 외에서 행하는 것으로서, 단백질 생산에 필요한 구성 요소들, 즉 세포 내 단백질 합성기구와 이의 인자들만을 세포에서 추출하여 세포 외부에서 세포의 생리적 조절 기작이 배제된 상태로 단백질의 합성 과정만을 인위적으로 반복시켜 단기간에 목적 단백질을 생산하는 것을 의미한다.

이때, 무세포 단백질 합성에 요구되는 단백질 생합성 기구 즉, 리보좀, 개시인자, 신장인자, 종결인자, 아미노아실티알엔에이(aminoacyl tRNA) 합성효소, RNA 중합효소 등은 세포 추출액에 포함된 것을 이용하거나 별개로 추가하거나, 유전자 재조합 기술에 의해 별도로 생산하여 사용할 수 있다.

본 발명의 용어, "무세포 단백질 합성 반응 혼합물"은 상기 무세포 단백질 합성을 수행하기 위한 구성 요소를 포함하고 있는 물질을 의미한다. 구체적으로, 단백질 생산에 필요한 리보좀, 개시인자, 신장인자, 종결인자, 방출인자, 아미노아실티알엔에이 합성효소 등의 단백질 생합성 기구 등을 포함하는 세포 추출물 또는 재조합 단백질의 혼합물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 리포터 단백질의 합성이나, 목적 물질의 검출에 필요할 수 있는 임의의 성분을 포함할 수 있다.

구체적으로, 상기 세포 추출물은 밀배아(Wheat germ), 토끼 망상적혈구(Rabbit reticulocyte), 효모, 중국 햄스터 난소세포(Chinese Hamster Ovary cell) 또는 헬라 세포(HeLa cell) 추출물, 더욱 구체적으로 대장균 추출물일 수 있으나, 무세포 단백질 합성 반응에 이용될 수 있는 한, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 재조합 단백질은 단백질 생산에 필요한 구성 요소들이 재조합 기술을 통해 제조된 것일 수 있고, 구체적으로 IF1, IF2 및 IF3 등의 개시인자, EF-G, EF-Tu 및 EFTs 등의 신장인자, RF1, RF2 및 RF3 등의 방출인자, RRF 등의 종결인자, 아미노아실-tRNA 합성효소(aminoacyl-tRNA synthetases), 메티오닐-tRNA 포르밀기전달효소(methionyl-tRNA transformylase), RNA 중합효소(RNA polymerase) 또는 리보솜(ribosomes)일 수 있다. 상기 재조합 단백질의 혼합물은 무세포 단백질 합성을 위하여 필요한 구성 요소들을 모두 포함하는 것일 수 있고, 구체적으로 상기 개시인자, 신장인자, 방출인자, 종결인자, 아미노아실-tRNA 합성효소, 메티오닐-tRNA 포르밀기전달효소, RNA 중합효소 및 리보솜으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다.

한편 상기 재조합 단백질 또는 이의 혼합물을 사용하는 경우, 목적 물질을 기질로 사용하는 효소들은 제외하고 사용함으로써 목적하는 물질을 정량할 수 있다.

일 구현예로, 상기 무세포 단백질 합성 반응 혼합물은 상기의 목적 물질을 포함하지 않을 수 있다.

본 발명의 목적상, 상기 무세포 단백질 합성 반응 혼합물은 리포터 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

본 발명의 용어, "리포터 단백질"은 그의 생성 또는 합성을 용이하게 확인할 수 있는 신호를 발생하는 표지 단백질이다. 이때 상기 신호는 발광(luminescence), 형광(fluorescence), 인광(phosphorescence), 발색, 전자의 이동 등 다양한 형태일 수 있고, 이 경우 상기 리포터 단백질은 sfGFP(superfolder green fluorescence protein), GFP(Green fluorescent protein), YFP(Yellow fluorescent protein), RFP(Red fluorescent protein), mCherry 형광 단백질, 락타마아제(lactamase), 갈락토시다아제(galactosidase), HRP(Horseradish peroxidase) 또는 글루코스 옥시다아제(glucose oxidase)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기의 단백질 중 형광단백질들은 무세포 합성 반응액 내에 축적된 형광단백질의 형광을 측정하여 활성을 평가할 수 있다. 또한, 효소들의 경우 각 효소에 해당하는 기질 농도 혹은 생성물의 농도를 확인하여 직접적으로 그 신호를 측정할 수 있다. 그러나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 목적 상, 상기 리포터 단백질은 포도당 생성 효소 일 수 있다. 이 경우 상기 신호의 측정에 전 세계에 개인진단장비로 널리 보급되어 있는 포도당 측정기를 사용할 수 있다.

일 예로, 상기 포도당 생성 효소는 락타아제(lactase), 아밀라아제(amylase), 수크라아제(sucrase), 글루코아밀라아제(glucoamylase), 글리코겐 인산화효소(glycogen phosphorylase) 및/또는 인버타아제(invertase) 등과 같이, 수크로즈 (sucrose), 말토오스 (maltose), 녹말 (starch), 글리코겐(glycogen) 등과 같은 포도당을 포함하는 탄수화물, 이당류 및/또는 다당류로부터 포도당을 해리시키는 효소일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 이와 같이, 탄수화물, 이당류 및/또는 다당류로부터 포도당을 해리시키는 효소는 "포도당 해리 효소"로도 칭할 수 있다. 다른 예로, 상기 포도당 생성 효소는, 탄수화물이 아닌 물질로부터 포도당을 합성하는 포도당신생합성(gluconeogenesis)에 관여하는 효소일 수 있다.

한편 상기 포도당 생성 효소에 대한 기질은 당업계에 공지되어 있는 바, 공지된 기질로부터 포도당을 생성하는 반응에 이용한 후 생성된 포도당의 양을 포도당 측정기를 이용하여 측정함으로써, (목적 물질)-(합성된 효소)-(포도당 농도) 간의 비례적 상관관계를 이용하여 시료 내의 목적 물질을 정량할 수 있다. 예를 들어, 상기 포도당 생성 효소가 인버타아제인 경우 인버타아제의 기질인 수크로오스를 기질로 이용할 수 있다.

본 발명의 용어, "리포터 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드"는 리포터 유전자를 의미하며, 구체적으로 상기 유전자의 DNA(deoxyribonucleic acid) 가닥일 수 있다. 이때, 상기 유전자의 염기서열은 NCBI의 GenBank 등 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있다.

일 구현예로, 목적 물질이 핵산인 경우, 상기 리포터 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 RNA-toehole switch sensor의 조절을 받는 것일 수 있고, 상기 리포터 단백질 코딩 폴리뉴클레오티드 상단부에 목적 핵산과 상보적인 서열이 존재할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 용어, "분석 시료"는 목적 아미노산을 포함하고 있는 것으로서, 본 발명의 방법에 적용 대상이 되는 시료를 의미한다.

구체적으로, 사료, 식품 또는 화학물질로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상에서 유래된 것일 수 있다.

또한, 상기 분석 시료는 생물로부터 분리된 것일 수 있고, 더욱 구체적으로 생물로부터 분리된, 혈액, 혈장, 혈청, 암조직 및 암세포로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있으며, 또한 전처리로서 열처리 및 여과된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, FBS를 열처리하여 무세포 단백질 합성 반응을 방해하는 성분을 제거하고, 생성된 응집체를 여과하여 제거한 후 본 발명의 방법에 적용함으로써, FBS 내에 포함된 대표적인 대사체인 아미노산을 정량할 수 있음을 확인하였다(도 5).

본 발명의 목적상, 상기 분석 시료는 상기 목적 물질을 포함할 수 있다.

또한, 상기 분석 시료는 특정 질환을 가진 환자로부터 분리된 것일 수 있다. 상기 특정 질환은, 예를 들면 바이러스 및 진균 중 어느 하나 이상에 의해 야기되는 질환; 아미노산 대사 이상 질환; 또는 암일 수 있다.

구체적으로 상기 아미노산 대사 장애에 의해 야기되는 질환은, 아미노산 대사 이상 질환 또는 암일 수 있다.

본 발명의 용어, "아미노산 대사 이상 질환"은 체내에서 특정 아미노산의 감소 또는 증가를 유도하는 질환을 의미한다. 이는 특정 아미노산 대사과정에 관여하는 효소의 결손 혹은 활성 저하 때문에 발생한다고 알려져 있으며, 상기 질환을 앓는 환자는 체내 아미노산의 농도가 정상인과는 확연히 구분된다. 구체적으로, 상기 아미노산 대사 이상 질환은 아르기닌 분해효소 결핍증(arginase deficiency), 시스틴뇨증(cystinuria), 단풍당밀뇨증(maple syrup urine disease), 고라이신혈증(hyperlysinemia), 호모시스틴뇨증(homocystinuria), 고메티오닌혈증(hypermethioninemia) 및 페닐케톤뇨증(phenylketonuria)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

더욱 구체적으로, 상기 아르기닌 분해효소 결핍증은 아르기닌; 상기 시스틴뇨증은 아르기닌 또는 리신; 상기 단풍당밀뇨증은 이로류신 또는 발린; 상기 고라이신혈증은 리신; 상기 호모시스틴뇨증은 메티오닌; 상기 고메티오닌혈증은 메티오닌; 상기 페닐케톤뇨증은 페닐알라닌 또는 티로신에 의해 야기되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 암의 성장 또는 발달을 위하여 혈장의 유리 아미노산이 재분배(redistribution) 또는 전위(translocation)되므로, 암 환자는 체내 아미노산의 농도(프로파일)가 정상인과는 확연히 구분된다.

본 발명의 목적 물질 정량 방법은, 각 목적 물질에 대한 표준 농도 곡선과 비교하여 목적 물질의 농도를 산출하는 단계를 추가로 더 포함할 수 있다. 상기 표준 농도 곡선은 표준 시료를 이용하여 작성한 것일 수 있다.

본 발명에서 상기 "표준 시료"는 각 목적 물질을 특정 농도로 포함하고 있는 것일 수 있다. 예를 들어, 0.01 내지 200 μM의 목적 물질을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 표준 시료를 이용하여 무세포 단백질 합성을 하는 경우, 각 목적 물질의 특정 농도에 해당하는 리포터 단백질의 신호를 알 수 있으며, 단백질의 신호에 따른 각 목적 물질의 농도를 알 수 있다. 따라서, 단백질 신호에 따른 각 목적 물질의 표준 농도 곡선은, 목적 물질의 특정 농도에 따른 단백질의 신호 정보를 포함하고 있으므로, 본 발명의 정량 방법에 따라 측정한 신호의 세기를 상기 곡선과 비교하여 목적 물질의 농도를 산출할 수 있다.

본 발명의 다른 하나의 양태는, 본 발명의 정량 방법에 따라 정량한 목적 물질의 농도를 정상 대조군과 비교하는 단계를 포함하는, 질환 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다. 상기 정량 방법, 목적 물질 및 질환에 대해서는 전술한 바와 같다.

예를 들어, 상기 질환이 아미노산 대사 관련 질환인 경우 질환의 직접 또는 간접적인 결과로서 체내 아미노산의 농도(프로파일)가 정상인과 환자에 있어서 차이가 있고, 상기의 질환이 나타내는 특징적인 아미노산의 농도(프로파일)는 당업계에 공지된바, 당업자라면 본 발명에 따른 아미노산 정량 방법을 상기의 질환을 진단 또는 진단을 위한 정보를 제공하는 데 적용할 수 있다.

본 발명의 다른 하나의 양태는, (a) 생물로부터 분리된 분석 시료에 후보물질을 처리하는 단계; (b) 상기 후보 물질이 처리된 분석 시료와, 무세포 단백질 합성 반응 혼합물을 혼합하여 단백질 합성을 수행하는 단계; (c) 상기 합성된 단백질을 기질과 반응시켜 포도당을 생성하고, 포도당 측정기를 이용하여 포도당 수준을 측정하는 단계; 및 (d) 상기 포도당 수준을 정상 대조군과 비교하는 단계를 포함하는, 질환의 예방 또는 치료 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

상기 "후보 물질"은, 전술환 질환을 치료할 수 있을 것으로 예상되는 물질로서, 직접 또는 간접적으로 질환의 호전 또는 개선을 유도할 수 있을 것으로 예상되는 물질이면 제한 없이 포함한다.

본 발명에서, 분석 시료에 질환의 예방 또는 치료 후보물질을 처리하는 상기 (a) 단계는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 구체적인 예로, 분석 시료에 상기 후보물질을 처리하여 함께 배양하거나, 또는 생체 내에 투여함으로써 상기 후보물질을 처리할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 당업자라면 본 발명의 목적에 맞는 방법을 사용할 수 있을 것이다.

또한, (b) 내지 (c) 단계는 본 발명의 정량 방법이 적용될 수 있다. 마지막으로, 상기 (c) 단계는 상기 후보물질을 질환의 예방 또는 치료 물질로서 사용할 수 있는지 판단하는 단계이다. 예를 들어, 아미노산 대사 관련 질환의 경우, 환자는 체내 아미노산의 농도(프로파일)가 정상인과 다르므로, 정상 대조군과 동일하거나 유사한 아미노산 농도를 나타내게 하는 후보물질은 아미노산 대사 관련 질환의 예방 또는 치료 물질로서 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 목적 물질의 정량 방법은 저비용 단시간에 고효율로 목적 물질을 정량할 수 있으므로 다양한 산업에서 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 아미노산이 목적 물질인 경우, 아미노산의 외인성 첨가에 의존하는 무세포 단백질 합성반응의 특징을 이용하여 리포터 단백질을 인버타아제로 하여 포도당 측정기를 이용한 목적 물질의 정량 방법을 간단히 나타낸 것이다.
도 2는 무세포 단백질 합성반응을 통해 합성된 인버타아제의 양을 나타낸 것으로, 흰 막대는 전체 인버타아제의 양을, 검정 막대는 가용성(soluble) 인버타아제의 양을 나타낸다.
도 3은 무세포 단백질 합성반응을 통해 합성된 인버타아제와 50mM 수크로오스 용액을 반응시켜 PGM(포도당 측정기)을 이용하여 확인한 판독값이다. 3회 측정한 평균값을 나타내었다.
도 4는 PGM 판독값 대비 6종의 아미노산 표준곡선을 나타낸 것이다.
도 5는 열처리된 FBS의 양을 변화시키면서 이에 포함된 6종의 아미노산 양을 CCFPS 분석 및 PGM 판독값을 통해 확인한 것이다. ▲는 Ile, △는 Leu, ■는 Lys, □는 Tyr, ●는 Phe, ○는 Met을 나타낸다.
도 6은 PGM을 이용해 측정한 아미노산 농도(흰 막대)를 HPLC 표준 분석을 통해 측정한 아미노산 농도(검은 막대)와 비교한 것이다.
도 7은 분석 물질 내에 존재하는 포도당의 양이 본 발명의 방법을 이용해 목적 물질을 정량하는 데에는 큰 영향을 미치지 않음을 확인한 것으로, 도 7A는 첨가한 포도당 농도와 인버타아제의 양을, 도 7B는 incubation time에 따른 포도당 양을 PGM을 이용해 측정한 결과이다.

이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 무세포 단백질 합성을 위한 세포 추출물 수득

본 발명의 무세포 단백질 합성 시스템을 구축하기 위해 사용한 세포 추출물 S12는 한국 등록특허공보 제10-0733712호 및 Journal of Biotechnology 126 (2006) 554-561에 개시된 방법을 이용하여 수득하였다. 이후, 남아있는 아미노산을 제거하기 위하여, 상기 S12 추출물을 Vivaspin 원심분리 장치(Sartorius Stedim Biotech GmbH, Gottingen, Germany)를 이용하여 원심분리하였다. 18 ㎖의 세척 버퍼(10 mM Tris-acetate pH 8.2, 14 mM magnesium acetate, 80 mM potassium acetate, and 1 mM dithiothreitol)에 2 ㎖의 상기 S12 추출물을 첨가한 후, 2,000×g에서 원심분리하는 과정을 세 번 반복하여 희석된 추출물을 원래 부피인 2mL로 농축하였다. 이렇게 제조된 S12 추출물을 액체질소에 동결시켜 -80℃에서 보관하였다.

실시예 2: 무세포 단백질 합성반응 (CFPS reaction: Cell-free protein synthesis reaction)

인버타아제가 생산되도록 무세포 단백질 합성반응을 수행하였다.

먼저, 무세포 단백질 합성의 반응 혼합물(reaction mixtures) 즉 CFPS 반응 혼합물은 다음과 같이 조성하였다: 57 mM HEPES-KOH, pH 8.2; 1.2 mM ATP; GTP, UTP, 및 CTP 각 0.85 mM; 80 mM 암모늄 아세테이트(ammonium acetate); 12 mM 마그네슘 아세테이트(magnesium acetate); 80 mM 포타슘 아세테이트(potassium acetate); 34 ㎍/㎖ 1,5-포르밀(formyl)-5,6,7,8-테트라하이드로폴릭산(tetrahydrofolic acid); 아미노산 각 2 mM; 2% 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol) 8000; 3.2 U/㎖ 크레아틴 키나제(creatine kinase); 67 mM 크레아틴 인산(creatine phosphate); 24% (v/v) 투석 여과(diafiltrate)한 S12 추출물; 및 6.7 ㎍/㎖ 주형 DNA.

E.coli BL21 균주의 DNA를 PCR로 증폭하여 인버타아제(invertase; EC 3.2.1.26)의 ORF를 수득한 후 pK7 벡터에 클로닝하여 pK7Inv 플라스미드를 제조하여, CFPS 반응의 주형으로 사용하였다.

타겟으로 하는 아미노산을 포함하지 않은 CFPS 반응 혼합물, 즉 보충적 CFPS(Complementary cell-free protein synthesis reaction; CCFPS) 반응 혼합물 26 μL에 4 μL의 타겟 아미노산을 포함한 분석 샘플과 혼합하여 수행하였다. 모든 CFPS 및 CCFPS 반응은 30℃ water bath set에서 1시간 동안 수행되었다.

그 결과, 외부 아미노산 첨가가 없는 경우의 인버타아제 합성량은 pK7Inv 플라스미드가 없는 반응과 유사한 수준으로 나타난 반면, 20종의 아미노산을 포함한 CFPS 반응에서 합성된 인버타아제는 약 640μg/mL 였고 56% 의 용해도를 나타냈다(도 2).

이러한 결과는 인버타아제 합성이 아미노산 유무에 매우 의존적이고, 여과된 추출물에 존재하는 아미노산 수준과 인버타아제의 활성은 아미노산 정량에 영향을 미치지 않을 정도로 미미하다는 것을 나타낸다.

실시예 3: 무세포 합성된 인버타아제를 이용한 아미노산 수준 측정

실시예 2와 마찬가지 방법으로 CCFPS 반응을 완료한 후, 50mM Tris-acetate 버퍼(pH 6.0)에 100mM 수크로오스 용액 15 μL가 포함된 마이크로튜브에 반응 혼합물 15 μL 를 가하였다. 37℃에서 10분간 인큐베이션한 후, 반응 혼합물을 90℃에서 10분간 가열하여 효소 가수분해 반응 즉 수크로오스를 가수분해하여 포도당이 생성되는 반응을 종결하였다.

그 후 3,000g로 원심분리 후 상층액 5μL를 수확하여 포도당 측정기(Accu-Check Inform II, Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) 스트립에 떨어뜨려 생성된 포도당 수준을 측정하였다. 포도당 측정기의 측정값을 표준 곡선과 비교하여 샘플 내 아미노산 농도를 분석하였다.

그 결과 PGM 판독값이 약 200 μg/mL 수준까지 무세포 합성된 인버타아제 농도에 비례하여 증가하는 것을 확인하였다(도 3). 이를 실시예 2의 결과와 조합하면 아미노산 정량에 PGM을 이용할 수 있음을 알 수 있다.

실시예 4: 무세포 합성 인버타아제를 이용한 6종의 아미노산 수준 측정

상기 실험 결과를 토대로, 다양한 대사 장애와 연관이 있는 6종의 아미노산 (이소류신, 류신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌 및 타이로신)을 타겟 아미노산으로 하여 PGM을 FBS내에 포함된 아미노산 정량에 적용하였다.

먼저, 실시예 3과 마찬가지 방법으로 PGM 판독값 대비 6종 아미노산의 표준 곡선을 작성하였다. 각 아미노산은 20 μM 농도까지 PGM 판독값과 정비례하는 결과를 나타냈으며 최소 검출수준(검출 한계)은 0.1 내지 1.5μM였다(도 4).

다음으로, FBS 내 아미노산 분석을 위해, 90℃에서 10분간 가열하여 단백질 합성을 방해하는 효소를 불활성화하고 응집된 단백질을 여과하여 제거한 후, 여과물을 CCFPS 분석 반응 혼합물(즉 분석 대상이 되는 아미노산이 포함되지 않은 CFPS 반응혼합물)에 가하여 Hitachi L-8900 amino acid analyzer (Hitachi High-Technologies, Tokyo, Japan)를 이용해 분석하였다. 그 결과 PGM 판독값이 FBS 양에 비례하여 증가하는 것을 확인하였다(도 5). 이와 같은 아미노산 농도측정 결과는 HPLC 분석 결과와 비교하여도 큰 차이가 나타나지 않는 것을 확인하였다(도 6).

한편 생물학적 샘플에 대부분 포도당이 포함되어 있는 점을 고려하여, 다양한 농도의 포도당(최대 10mM (150mg/dL))을 포함하는 샘플을 이용한 실험을 수행하였다.

그 결과, 무세포 단백질 합성을 위한 incubation 과정에서 포도당이 분해되는 것을 확인하였는 바, 생물학적 샘플에 포도당이 포함되어 있더라도 PGM 측정값에 영향을 미치지 않음을 알 수 있었다(도 7).

실험 결과를 통해, 대표적인 포도당 생성 효소인 인버타아제의 무세포 합성을 이용하여 대사체를 정량할 수 있음을 확인하였는 바, 마찬가지로 다른 대사체, 핵산 및 화합물에 대해서도 본원 명세서 전체적으로 기재한 내용에 의하여 전술한 실시예와 같이 무세포 단백질 합성을 이용해 분석시료 내에 포함된 목적물질의 양을 정량할 수 있다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (15)

1. (a) 무세포 단백질 합성 반응 혼합물과, 목적 물질이 포함된 분석 시료를 혼합하여 단백질 합성을 수행하는 단계;
   (b) 상기 합성된 단백질을 기질과 반응시켜 포도당을 생성하는 단계; 및
   (c) 포도당 측정기를 이용하여 포도당 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 목적 물질의 정량 방법.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 무세포 단백질 합성 반응 혼합물은 포도당 생성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인, 목적 물질의 정량 방법.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 무세포 단백질 합성 반응 혼합물은 락타아제(lactase), 아밀라아제(amylase), 수크라아제(sucrase), 글루코아밀라아제(glucoamylase) 및 인버타아제(invertase) 중에서 선택된 어느 하나 이상의 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인, 방법.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 합성된 단백질은 락타아제(lactase), 아밀라아제(amylase), 수크라아제(sucrase), 글루코아밀라아제(glucoamylase) 및 인버타아제(invertase) 중에서 선택되는 것인, 방법.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 목적 물질은 아미노산, 화합물(compound), 및 핵산 중에서 선택되는 것인, 방법.
   
6. 제1항에 있어서 상기 목적 물질의 정량 방법은, 각 목적 물질에 대한 표준 농도 곡선과 비교하여 목적 물질의 농도를 산출하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
   
7. 제1항에 있어서, 상기 무세포 단백질 합성 반응 혼합물은 세포 추출물 또는 재조합 단백질의 혼합물을 포함하는 것인, 방법.
   
8. 제7항에 있어서,
   (i) 세포 추출물은 대장균, 밀배아(Wheat germ), 토끼 망상적혈구(Rabbit reticulocyte), 효모, 중국 햄스터 난소세포(Chinese Hamster Ovary cell) 또는 헬라 세포(HeLa cell) 추출물 중에서 선택되는 어느 하나이고;
   (ii) 재조합 단백질은 개시 인자, 신장 인자, 방출 인자, 종결 인자, 아미노아실-tRNA 합성효소(aminoacyl-tRNA synthetases), 메티오닐-tRNA 포르밀기전달효소(methionyl-tRNA transformylase), RNA 중합효소(RNA polymerase) 및 리보솜(ribosomes)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것인, 방법.
   
9. 제1항에 있어서, 상기 분석 시료는 사료, 식품 및 화학물질 중에서 선택되는 하나 이상에서 유래된 것인 것인, 방법.
   
10. 제1항에 있어서, 상기 분석 시료는 생물로부터 분리된 것인, 방법.
    
11. 제10항에 있어서, 상기 분석 시료는 열처리 및 여과된 것인, 방법.
    
12. 제10항의 방법에 따라 정량한 목적 물질의 농도를 정상대조군과 비교하는 단게를 포함하는, 질환 진단을 위한 정보 제공 방법.
    
13. 제12항에 있어서, 상기 질환은 바이러스 및 진균 중 어느 하나 이상에 의해 야기되는 질환; 아미노산 대사 이상 질환; 또는 암인, 질환 진단 정보 제공 방법.
    
14. (a) 생물로부터 분리된 분석 시료에 후보물질을 처리하는 단계;
    (b) 상기 후보 물질이 처리된 분석 시료와, 무세포 단백질 합성 반응 혼합물을 혼합하여 단백질 합성을 수행하는 단계;
    (c) 상기 합성된 단백질을 기질과 반응시켜 포도당을 생성하고, 포도당 측정기를 이용하여 포도당 수준을 측정하는 단계; 및
    (d) 상기 포도당 수준을 정상 대조군과 비교하는 단계를 포함하는, 질환의 예방 또는 치료 물질의 스크리닝 방법.
    
15. 제14항에 있어서, 상기 질환은 바이러스 및 진균 중 어느 하나 이상에 의해 야기되는 질환; 아미노산 대사 이상 질환; 또는 암인, 질환의 예방 또는 치료 물질의 스크리닝 방법.
    

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