KR20200080927A - Medium composition for somatic embryogenesis of Medicago sp. plant and use thereof - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 체세포배 발생용 배지 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로서, 더 상세하게는 메디카고속 식물의 체세포배 발생 효율이 높은 배지 조성물 및 이를 이용하여 메디카고속 식물을 형질전환하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a medium composition for somatic embryogenesis and its use, and more particularly, to a medium composition for high somatic embryogenesis efficiency of a Medica genus plant and a method for transforming a Medica genus plant using the same.
메디카고 트런카툴라(Medicago truncatula)는 콩과 개자리속(genus Medicago) 식물로서, 알팔파(Medicago sativa) 등과 함께 중요한 녹비 및 사료 작물로 사용되고 있다. 특히, 콩과 식물의 유전학 및 유전체학 연구를 위한 모델 식물로서 질소 고정 박테리아와의 뿌리혹 공생 및 균근(mycorrhiza) 공생을 위한 연구와 식량 및 사료작물의 가치를 증진시키기 위한 유전자 기능 연구에서 메디카고 트런카툴라(Medicago truncatula)는 전 세계적으로 이용되고 있다. 또한, 메디카고 트런카툴라 유전체는 A17 계통을 재료로 해독되었고[Young et al (2011). The Medicago genome provides insight into the evolution of rhizobial symbioses, Nature, Nov 16, 480(7378), 520-524.], 이를 바탕으로 다양한 연구 재료와 정보가 축적되어 세계적으로 활용되고 있다. Medicago truncatula ( Medicago truncatula ) is a genus Medicago (genus Medicago ), alfalfa ( Medicago sativa ) and is used as an important green manure and feed crops. In particular, Medicago Trunka is a model plant for the study of genetics and genomics of legumes, for root-knot symbiosis and mycorrhiza symbiosis with nitrogen-fixing bacteria, and for gene function research to enhance the value of food and feed crops. Tula ( Medicago truncatula ) is used worldwide. In addition, the Medicago Trunkatula genome was deciphered with the A17 strain as a material [Young et al (2011). The Medicago genome provides insight into the evolution of rhizobial symbioses, Nature, Nov 16, 480 (7378), 520-524.] Based on this, various research materials and information are accumulated and utilized worldwide.
그러나 메디카고 트런카툴라 기준 유전형인 A17은 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)를 이용한 안정적 형질전환이 매우 어려워 형질전환을 이용한 유전자 기능 연구나 품종 개발이 이루어지지 않고 있다. 그 대안으로서 식물체 재분화가 비교적 쉬운 품종인 메디카고 트런카툴라 R108을 재료로 하여 돌연변이집단이 육성되었고(Trinh et al., 1998, Plant Cell Reports, 17 : 345-355.), 메디카고 트런카툴라 A17 품종과 근연 품종 또는 변이 품종인 메디카고 트런카툴라 2HA 등을 이용하여 식물 형질전환을 실시하고 있으나(Rose et al., 1999, Journal of Plant Physiology 155:788-791.; Araujo et al., 2004, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 78:123-131.), 기준 유전형인 메디카고 트런카툴라 A17과의 유전적 변이 및 유전체 서열의 차이에 따른 문제점이 있는 실정이다.However, the Medicago Trunkatula standard genotype A17 is very difficult to stably transform using Agrobacterium tumefaciens , and thus genetic function research or breed development using transformation has not been conducted. As an alternative, a mutant population was developed using Medicago Truncatula R108, a plant that is relatively easy to re-differentiate plants (Trinh et al., 1998, Plant Cell Reports, 17: 345-355.), Medicago Truncatula Plant transformation is carried out using A17 cultivar and related cultivar or mutant medicago trancatula 2HA (Rose et al., 1999, Journal of Plant Physiology 155:788-791.; Araujo et al., 2004, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 78:123-131.), which has problems with genetic variation and differences in genome sequence with the reference genotype Medicago Truncatula A17.
메디카고속 식물의 안정적 형질전환은 대두 등 콩과식물의 형질전환 방법을 따라 주로 떡잎 기부에 위치하는 정단분열조직 주변에서 새로운 식물체를 직접 유도하는 직접적인 신초기관발생(direct shoot organogenesis) 방법(Trieu et al., 1996, Plant Cell Reports, Volume 16, Issue 1-2, pp 6-11 )과 떡잎이나 잎, 하배축 조직에서 캘러스를 형성시킨 후, 여기에 체세포배발생(indirect somatic embryogenesis)을 유도하는 방법(Cosson et al., Methods Mol Biol. 2006;343:115-27)이 활용되어 왔다. 이중 메디카고 트런카툴라 A17 유전형은 체세포배발생 유도 효율이 낮아 이의 형질전환은 직접 신초기관발생 방법이 이용되고 있으나 시간과 노력에 비해 효율이 매우 낮은 것으로 알려져 있다.Stable transformation of high-speed plants in Medica is direct shoot organogenesis (Trieu et al) that directly induces new plants around the apical division tissue located mainly at the base of the cotyledon following the transformation method of legumes such as soybean (Trieu et al. ., 1996, Plant Cell Reports,
본 발명은 종래의 기술적 배경하에서 도출된 것으로서, 본 발명의 목적은 메디카고속 식물의 체세포배 발생 효율이 높은 배지 조성물 및 이를 이용하여 메디카고속 식물을 형질전환하는 방법을 제공하는데에 있다.The present invention has been derived under a conventional technical background, and an object of the present invention is to provide a medium composition having a high somatic embryogenesis efficiency of a Medica genus plant and a method for transforming a Medica genus plant using the medium composition.
본 발명의 발명자들은 체세포배 발생을 이용한 메디카고 트런카툴라 A17 유전형의 형질전환 과정에서 체세포배 발생에 의한 형질전환 식물체의 재분화 효율을 획기적으로 높이기 위해 체세포배 발생용 배지에 첨가되는 다양한 호르몬 조합을 시험하였고, 그 결과 특정 호르몬 조합 및 소정 범위의 농도에서 체세포배 발생 효율이 현저하게 향상되어 메디카고 트런카툴라 A17 유전형을 안정적으로 형질전환시킬 수 있다는 점을 확인하고 본 발명을 완성하였다.The inventors of the present invention have various hormone combinations added to the medium for somatic embryogenesis in order to dramatically increase the efficiency of redifferentiation of transgenic plants by somatic embryogenesis during the transformation process of the Medicago Truncatula A17 genotype using somatic embryogenesis. As a result, as a result, it was confirmed that the efficiency of somatic embryogenesis was significantly improved at a specific hormone combination and a predetermined range of concentrations, and that the Medicargo Trunkatula A17 genotype could be stably transformed and the present invention was completed.
상기 목적을 해결하기 위하여, 본 발명은 옥신(Auxin)과 사이토키닌(Cytokinin)을 포함하는 배지 조성물로서, 상기 옥신은 1-나프탈아세트산(1-Naphthaleneacetic acid, NAA)이고 상기 사이토키닌은 티디아주론(Thidiazuron, TDZ)이며, 배지 조성물 총 부피를 기준으로 상기 1-나프탈아세트산의 농도는 0.4~5μM이고 티디아주론의 농도는 1.5~5μM인 것을 특징으로 하는 메디카고속(Medicago) 식물의 체세포배 발생용 배지 조성물을 제공한다.In order to solve the above object, the present invention is a medium composition comprising auxin and cytokinin, wherein auxin is 1-naphthaleneacetic acid (NAA) and the cytokinin is T dia juron (Thidiazuron, TDZ), and the medium composition, based on the total volume concentration of the de-1-naphthyl acetate is 0.4 ~ 5μM and tea Medica high speed (Medicago) plants, characterized in that the concentration of dia juron is 1.5 ~ 5μM It provides a medium composition for somatic embryogenesis.
상기 목적을 해결하기 위하여, 본 발명의 일 예는 메디카고속 식물체의 외식편(Explant)을 형질전환 유전자가 도입된 아그로박테리움속 균과 공동배양하는 단계; 상기 공동배양한 외식편을 캘러스 형성용 배지에서 배양하여 캘러스를 형성하는 단계; 상기 캘러스를 전술한 체세포배 발생용 배지 조성물에서 배양하여 체세포배를 발생시키는 단계; 및 상기 체세포배를 식물체로 발달시키는 단계를 포함하는, 메디카고속 식물의 형질전환 방법을 제공한다. 또한, 본 발명의 다른 예는 메디카고속 식물체의 외식편(Explant)을 캘러스 형성용 배지에서 배양하여 캘러스를 형성하는 단계; 상기 캘러스를 형질전환 유전자가 도입된 아그로박테리움속 균과 공동배양하는 단계; 상기 공동배양한 캘러스를 전술한 체세포배 발생용 배지 조성물에서 배양하여 체세포배를 발생시키는 단계; 및 상기 체세포배를 식물체로 발달시키는 단계를 포함하는, 메디카고속 식물의 형질전환 방법을 제공한다.In order to solve the above object, an example of the present invention comprises the steps of co-culturing the explant of a plant of the genus Medica high-speed with Agrobacterium bacteria into which a transgene has been introduced; Culturing the co-cultured explants in a callus forming medium to form a callus; Culturing the callus in the above-described medium composition for somatic embryogenesis to generate somatic embryogenesis; And it provides a method for transforming a plant of the genus Medica, comprising the step of developing the somatic embryos into plants. In addition, another example of the present invention is a step of culturing the callus by culturing the explant (Explant) of the Medica high-speed plant in a culture medium for forming a callus; Co-culturing the callus with Agrobacterium bacteria into which a transforming gene has been introduced; Culturing the co-cultured callus in the above-described medium composition for generating somatic embryos to generate somatic embryos; And it provides a method for transforming a plant of the genus Medica, comprising the step of developing the somatic embryos into plants.
본 발명에 따른 메디카고속 식물의 체세포배 발생용 배지 조성물은 종래의 메디카고 트런카툴라 체세포배 발생용 배지와 비교할 때 새로운 호르몬의 조합을 포함하고, 그로 인해 약 10배 이상 향상된 체세포배 발생 효율을 가진다. 또한, 본 발명에 따른 메디카고속 식물의 형질전환 방법을 사용하면 종래의 방법으로는 형질전환이 매우 어려웠던 메디카고 트런카툴라 기준 유전형 A17을 안정적으로 형질전환시킬 수 있다. 따라서, 본 발명을 이용하면 메디카고 트런카툴라 기준 유전형 A17에 대한 유전체 기반의 유전자 기능 연구 및 유전자 조작이 가능하다.The medium composition for generating somatic embryos of the Medica high-speed plant according to the present invention includes a combination of new hormones compared to the conventional medium for generating Medicago Trunkatula somatic embryos, thereby improving somatic embryogenesis efficiency by about 10 times or more. Have In addition, when the method for transforming a Medica genus plant according to the present invention is used, it is possible to stably transform the Medicago trunctula reference genotype A17, which was very difficult to transform using the conventional method. Therefore, using the present invention, it is possible to study genome-based gene function and genetic manipulation of the Medicara Trunkatula reference genotype A17.
도 1은 메디카고 트런카툴라 유전형 A17 (Medicago truncatula cultivar Jemalong A17) 식물체의 잎 절편을 식물 형질전환용 벡터가 도입된 아그로박테리움 튜메파시엔스로 감염시키고 공동배양 배지 CCM3에서 공동배양한 후, 캘러스 형성용 배지인 CIM3에서 배양하여 캘러스를 형성하고, 형성한 캘러스를 다양한 호르몬 조합의 체세포배 발생용 배지에서 배양하였을 때 체세포배가 발생한 잎 절편의 비율(%)를 나타낸 것이다.
도 2는 메디카고 트런카툴라 유전형 A17 (Medicago truncatula cultivar Jemalong A17) 식물체의 잎 절편을 식물 형질전환용 벡터가 도입된 아그로박테리움 튜메파시엔스로 감염시키고 공동배양 배지 CCM3에서 공동배양한 후, 캘러스 형성용 배지인 CIM3에서 배양하여 캘러스를 형성하고, 형성한 캘러스를 다양한 호르몬 조합의 체세포배 발생용 배지에서 배양하였을 때 잎 절편당 발생한 체세포배의 수를 나타낸 것이다.
도 3은 카나마이신(Kanamycin) 저항성 유전자에 의해 형질전환된 메디카고 트런카툴라(Medicago truncatula) A17 식물체의 생산 과정 중 체세포배 발생 및 식물체로의 발달 과정을 나타낸 것이다.
도 4는 카나마이신(Kanamycin) 저항성 유전자에 의해 형질전환된 메디카고 트런카툴라(Medicago truncatula) A17 식물체의 생산 과정을 단계별로 나타낸 것이다.
도 5는 카나마이신(Kanamycin) 저항성 유전자에 의해 형질전환된 메디카고 트런카툴라(Medicago truncatula) A17 식물체의 녹색형광단백질(Green fluorescent protein, GFP) 형광을 관찰한 결과이다.
도 6은 연쇄중합효소반응(PCR)을 이용하여 카나마이신(Kanamycin) 저항성 유전자에 의해 형질전환된 메디카고 트런카툴라(Medicago truncatula) A17 식물체 내의 녹색형광단백질(Green fluorescent protein, GFP) 유전자를 확인한 결과이다.
도 7은 바스타(Basta) 저항성 유전자에 의해 형질전환된 메디카고 트런카툴라(Medicago truncatula) A17 식물체의 생산 과정을 단계별로 나타낸 것이다.
도 8은 바스타(Basta) 저항성 유전자에 의해 형질전환된 메디카고 트런카툴라(Medicago truncatula) A17 식물체의 녹색형광단백질(Green fluorescent protein, GFP) 형광을 관찰한 결과이다.
도 9는 연쇄중합효소반응(PCR)을 이용하여 바스타(Basta) 저항성 유전자에 의해 형질전환된 메디카고 트런카툴라(Medicago truncatula) A17 식물체 내의 녹색형광단백질(Green fluorescent protein, GFP) 유전자를 확인한 결과이다.
도 10은 Nolan et al.의 캘러스 형성용 배지 및 체세포배 발생용 배지를 사용하여 카나마이신(Kanamycin) 저항성 유전자에 의해 형질전환된 메디카고 트런카툴라(Medicago truncatula) A17 식물체를 생산하였을 때와 본 발명의 캘러스 형성용 배지 및 체세포배 발생용 배지를 사용하여 카나마이신(Kanamycin) 저항성 유전자에 의해 형질전환된 메디카고 트런카툴라(Medicago truncatula) A17 식물체를 생산하였을 때의 체세포배 발생을 나타낸 것이다.1 is Medicago Truncatula genotype A17 ( Medicago truncatula cultivar Jemalong A17) Infect the leaf sections of plants with Agrobacterium tumefaciens introduced with a plant transformation vector, co-culture in co-culture medium CCM3, and incubate in CIM3, a medium for forming callus, to form callus, It shows the ratio (%) of somatic embryonic leaf fragments when the formed callus was cultured in a medium for somatic embryogenesis of various hormone combinations.
FIG. 2 shows Medicargo Trunkatula genotype A17 ( Medicago truncatula cultivar Jemalong A17) Infect the leaf sections of plants with Agrobacterium tumefaciens introduced with a plant transformation vector, co-culture in co-culture medium CCM3, and incubate in CIM3, a medium for forming callus, to form callus, It shows the number of somatic embryos generated per leaf section when the formed callus was cultured in a medium for generating somatic embryos of various hormone combinations.
Figure 3 shows the process of the development of somatic embryos and somatic embryos during the production process of Medicago truncatula A17 plants transformed by Kanamycin resistance gene.
4 illustrates a step-by-step transformed Medi cargo agent reonka Tula production of (Medicago truncatula) A17 plant by kanamycin (Kanamycin) resistance gene.
Figure 5 shows the observed results of kanamycin (Kanamycin) transformed Medi cargo agent reonka by the resistance genes Tula (Medicago truncatula) green fluorescent protein of the plant A17 (Green fluorescent protein, GFP) fluorescence.
Figure 6 is a Medicago trancatula transformed by Kanamycin resistance gene using a chain polymerase reaction (PCR) ( Medicago truncatula ) This is the result of confirming the green fluorescent protein (GFP) gene in A17 plants.
Figure 7 shows the step-by-step production process of a Medicago truncatula A17 plant transformed with a Basta resistance gene.
8 is a result of observing the Basta (Basta) transformed Medi cargo agent reonka by the resistance genes Tula (Medicago truncatula) green fluorescent protein of the plant A17 (Green fluorescent protein, GFP) fluorescence.
Figure 9 is a Medicago trancatula transformed by a Basta resistance gene using a chain polymerase reaction (PCR) ( Medicago truncatula ) This is the result of confirming the green fluorescent protein (GFP) gene in A17 plants.
FIG. 10 shows the present invention and when the Medicago truncatula A17 plant transformed by Kanamycin resistance gene was produced using Nolan et al. callus forming medium and somatic embryogenesis medium. Medicago transformed by Kanamycin resistance gene using Callus formation medium and somatic embryogenesis medium truncatula ) It shows somatic embryogenesis when A17 plants were produced.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명의 일 측면은 메디카고속 식물의 체세포배 발생 효율이 높은 배지 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 메디카고속(Medicago) 식물의 체세포배 발생용 배지 조성물은 옥신(Auxin)으로 1-나프탈아세트산(1-Naphthaleneacetic acid, NAA) 및 사이토키닌으로 티디아주론(Thidiazuron, TDZ)을 포함하는 것을 특징으로 한다. 또한, 본 발명의 메디카고속(Medicago) 식물의 체세포배 발생용 배지 조성물에서 상기 1-나프탈아세트산(1-Naphthaleneacetic acid, NAA)의 농도는 배지 조성물 총 부피를 기준으로 0.4~5μM이고, 체세포배 발생 효율을 고려할 때 배지 조성물 총 부피를 기준으로 0.5~4μM인 것이 바람직하고, 0.8~2μM인 것이 더 바람직하다. 또한, 본 발명의 메디카고속(Medicago) 식물의 체세포배 발생용 배지 조성물에서 상기 티디아주론(Thidiazuron, TDZ)의 농도는 배지 조성물 총 부피를 기준으로 1.5~5μM이고, 체세포배 발생 효율을 고려할 때 배지 조성물 총 부피를 기준으로 1.5~3μM인 것이 바람직하고, 1.8~2.5μM인 것이 더 바람직하다.One aspect of the present invention relates to a medium composition having high somatic embryogenesis efficiency in plants of the genus Medica. The media composition for somatic embryogenesis of Medicago plants of the present invention includes 1-naphthaleneacetic acid (NAA) as auxin and tidiazuron (TDZ) as cytokinin. It is characterized by. In addition, the concentration of 1-naphthaleneacetic acid (NAA) in the medium composition for generating somatic embryos of the Medica plant of the present invention is 0.4 to 5 μM based on the total volume of the medium composition, somatic embryos When considering generation efficiency, it is preferable that it is 0.5 to 4 μM based on the total volume of the medium composition, and more preferably 0.8 to 2 μM. In addition, the concentration of the thidiazuron (Thidiazuron, TDZ) in the medium composition for generating somatic embryos of the Medicago plant of the present invention is 1.5 to 5 μM based on the total volume of the medium composition, when considering the somatic embryogenesis efficiency It is preferably 1.5 to 3 μM based on the total volume of the medium composition, and more preferably 1.8 to 2.5 μM.
본 발명의 메디카고속(Medicago) 식물의 체세포배 발생용 배지 조성물은 1-나프탈아세트산(1-Naphthaleneacetic acid, NAA) 및 티디아주론의 조합 외에 공지의 메디카고속(Medicago) 식물 체세포배 발생용 배지에 포함되는 다양한 성분들을 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 메디카고속(Medicago) 식물의 체세포배 발생용 배지 조성물은 캘러스로부터의 체세포배 발생을 촉진하기 위하여 당 업계에 공지된 화합물인 지베렐린, 예컨대 GA3 혹은 GA4와 앱시스산(ABA), 또는 L-alpha-(2-aminoethoxyvinyl)glycine (AVG)을 0.2~5 μM의 농도로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 메디카고속(Medicago) 식물의 체세포배 발생용 배지 조성물은 아그로박테리움이 계속 생장하는 경우 이를 억제하기 위해 적절한 항생제, 예컨대 Cefotaxime, Augmentin, Timentin, Carbenicillin 등을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 100~900 ㎎/ℓ 농도의 Augmentin을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 메디카고속(Medicago) 식물의 체세포배 발생용 배지 조성물은 아가, 아가로스 또는 Gelrite 등과 같은 검류를 포함할 수 있다.Medica high speed (Medicago) somatic embryo culture medium composition for the generation of the plant of the present invention is a medium for 1-ethyl naphthalimide (1-Naphthaleneacetic acid, NAA) and T Medica high speed (Medicago) plants known somatic embryogenesis in addition to a combination of dia juron Various components included in may be further included. For example, the media composition for somatic embryogenesis of the Medicago plant of the present invention is a compound known in the art to promote somatic embryogenesis from callus, such as gibberellin, such as GA3 or GA4 and abscisic acid (ABA). , Or L-alpha-(2-aminoethoxyvinyl)glycine (AVG) at a concentration of 0.2 to 5 μM. In addition, the media composition for generating somatic embryos of the Medicago plant of the present invention may include appropriate antibiotics, such as Cefotaxime, Augmentin, Timentin, Carbenicillin, etc., to inhibit Agrobacterium when it continues to grow. It may contain augmentin at a concentration of 100-900 mg/ℓ. In addition, the medium composition for generating somatic embryos of Medicago plants of the present invention may include gums such as agar, agarose, or gelrite.
본 발명의 메디카고속(Medicago) 식물의 체세포배 발생용 배지 조성물은 체세포배 발생 효율을 고려할 때 1-나프탈아세트산(1-Naphthaleneacetic acid, NAA) 및 티디아주론 외에 (NH4)H2PO4·H2O, KNO3, CaCl2·2H2O, MgSO4·7H2O, Fe-EDTA·3H2O, MnSO4·H2O, H3BO3, KI, ZnSO4·7H2O, CuSO4·5H2O, Na2MoO4·2H2O, CoCl2·6H2O, 미오이노시톨(myo-inositol), 니코틴산(Nicotinic acid), 피리독신염산염(Pyridoxine HCl), 티아민염산염(Thiamine HCl), 수크로스(Sucrose), 카제인 가수분해물(Casein hydrolysate), MES[2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid], 글루콘산칼슘(Calcium gluconate), AVG[L-α-(2-aminoethoxyvinyl)glycine], 오그멘틴(Augmentin; Amoxicillin clavulanate) 및 젤란검(Gellan gum)을 더 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 메디카고속(Medicago) 식물의 체세포배 발생용 배지 조성물은 체세포배 발생 효율을 고려할 때 배지 조성물 총 부피를 기준으로 0.5~4μM 농도의 1-나프탈아세트산(1-Naphthaleneacetic acid, NAA), 1.5~3μM 농도의 티디아주론, 200~400 ㎎/ℓ 농도의 (NH4)H2PO4·H2O, 2000~3000 ㎎/ℓ 농도의 KNO3, 75~275 ㎎/ℓ 농도의 CaCl2·2H2O, 300~500 ㎎/ℓ 농도의 MgSO4·7H2O, 10~50 ㎎/ℓ 농도의 Fe-EDTA·3H2O, 5~25 ㎎/ℓ 농도의 MnSO4·H2O, 1~15 ㎎/ℓ 농도의 H3BO3, 0.2~4 ㎎/ℓ 농도의 KI, 0.2~4 ㎎/ℓ 농도의 ZnSO4·7H2O, 0.05~1 ㎎/ℓ농도의 CuSO4·5H2O, 0.01~0.25 ㎎/ℓ 농도의 Na2MoO4·2H2O, 0.01~0.25 ㎎/ℓ 농도의 CoCl2·6H2O, 10~250 ㎎/ℓ 농도의 미오이노시톨(myo-inositol), 0.1~2.5 ㎎/ℓ 농도의 니코틴산(Nicotinic acid), 0.1~2.5 ㎎/ℓ 농도의 피리독신염산염(Pyridoxine HCl), 1~25 ㎎/ℓ 농도의 티아민염산염(Thiamine HCl), 10~35 g/ℓ 농도의 수크로스(Sucrose), 0.1~1.5 g/ℓ 농도의 카제인 가수분해물(Casein hydrolysate), 0.1~1.5 g/ℓ 농도의 MES[2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid], 0.1~1.5 g/ℓ 농도의 글루콘산칼슘(Calcium gluconate), 0.2~2.5 μM 농도의 AVG[L-α-(2-aminoethoxyvinyl)glycine], 200~900 ㎎/ℓ 농도의 오그멘틴(Augmentin; Amoxicillin clavulanate) 및 1~5 g/ℓ 농도의 젤란검(Gellan gum)를 포함하고, 바람직하게는 0.8~2μM 농도의 1-나프탈아세트산(1-Naphthaleneacetic acid, NAA), 1.8~2.5μM 농도의 티디아주론, 250~350 ㎎/ℓ 농도의 (NH4)H2PO4·H2O, 2200~2800 ㎎/ℓ 농도의 KNO3, 120~240 ㎎/ℓ 농도의 CaCl2·2H2O, 350~450 ㎎/ℓ 농도의 MgSO4·7H2O, 15~40 ㎎/ℓ 농도의 Fe-EDTA·3H2O, 8~15 ㎎/ℓ 농도의 MnSO4·H2O, 2~8 ㎎/ℓ 농도의 H3BO3, 0.5~2.5 ㎎/ℓ 농도의 KI, 0.5~2.5 ㎎/ℓ 농도의 ZnSO4·7H2O, 0.1~0.5 ㎎/ℓ농도의 CuSO4·5H2O, 0.05~0.2 ㎎/ℓ 농도의 Na2MoO4·2H2O, 0.05~0.2 ㎎/ℓ 농도의 CoCl2·6H2O, 50~200 ㎎/ℓ 농도의 미오이노시톨(myo-inositol), 0.5~2 ㎎/ℓ 농도의 니코틴산(Nicotinic acid), 0.5~2 ㎎/ℓ 농도의 피리독신염산염(Pyridoxine HCl), 5~20 ㎎/ℓ 농도의 티아민염산염(Thiamine HCl), 15~30 g/ℓ 농도의 수크로스(Sucrose), 0.2~1.0 g/ℓ 농도의 카제인 가수분해물(Casein hydrolysate), 0.2~1.0 g/ℓ 농도의 MES[2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid], 0.2~1.0 g/ℓ 농도의 글루콘산칼슘(Calcium gluconate), 0.5~2.0 μM 농도의 AVG[L-α-(2-aminoethoxyvinyl)glycine], 250~800 ㎎/ℓ 농도의 오그멘틴(Augmentin; Amoxicillin clavulanate) 및 2~4 g/ℓ 농도의 젤란검(Gellan gum)를 포함한다.The medium composition for generating somatic embryos of the Medicago plant of the present invention, in addition to 1-naphthaleneacetic acid (NAA) and tidiazuron, when considering somatic embryogenesis efficiency (NH 4 )H 2 PO 4 H 2 O, KNO 3 , CaCl 2 · 2H 2 O, MgSO 4 ·7H 2 O, Fe-EDTA · 3H 2 O, MnSO 4 ·H 2 O, H 3 BO 3 , KI, ZnSO 4 ·7H 2 O , CuSO 4 ·5H 2 O, Na 2 MoO 4 ·2H 2 O, CoCl 2 ·6H 2 O, myo-inositol, nicotinic acid, pyridoxine HCl, thiamine HCl ), Sucrose, Casein hydrolysate, MES[2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid], Calcium gluconate, AVG[L-α-(2-aminoethoxyvinyl)glycine] , Augmentin (Augmentin; Amoxicillin clavulanate) and gellan gum (Gellan gum) may be further included. In addition, the medium composition for generating somatic embryos of the Medicago plant of the present invention is 1-naphthaleneacetic acid (NAA) at a concentration of 0.5 to 4 μM based on the total volume of the medium composition when considering somatic embryogenesis efficiency. ), 1.5 ~ of 3μM concentration tea dia juron, 200 ~ 400 ㎎ / ℓ concentration of (NH 4) H 2 PO 4 · H 2 O, 2000 - 3000 ㎎ / ℓ concentration of KNO 3, 75 ~ 275 ㎎ / ℓ concentration CaCl 2 · 2H 2 O, MgSO 4 at a concentration of 300 to 500 mg/ℓ · 7H 2 O, Fe-EDTA at a concentration of 10 to 50 mg/ℓ · 3H 2 O, MnSO 4 at a concentration of 5 to 25 mg/ℓ · H 2 O, H 3 BO 3 at a concentration of 1 to 15 mg/ℓ, KI at a concentration of 0.2 to 4 mg/ℓ, ZnSO 4 at a concentration of 0.2 to 4 mg/ℓ, 7H 2 O, at a concentration of 0.05 to 1 mg/ℓ CuSO 4 ·5H 2 O, Na 2 MoO 4 ·2H 2 O at a concentration of 0.01 to 0.25 mg/ℓ, CoCl 2 ·6H 2 O at a concentration of 0.01 to 0.25 mg/ℓ, Myoinositol at a concentration of 10 to 250 mg/ℓ ( myo-inositol), nicotinic acid at a concentration of 0.1 to 2.5 mg/ℓ, pyridoxine hydrochloride at a concentration of 0.1 to 2.5 mg/ℓ, thiamine HCl at a concentration of 1 to 25 mg/ℓ, 10 Sucrose at a concentration of ~35 g/ℓ, Casein hydrolysate at a concentration of 0.1 to 1.5 g/ℓ, MES[2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid] at a concentration of 0.1 to 1.5 g/ℓ, Calcium gluconate at a concentration of 0.1 to 1.5 g/ℓ, AVG [L-α-(2-aminoethoxyvinyl)glycine at a concentration of 0.2 to 2.5 μM], and augmentin at a concentration of 200 to 900 mg/ℓ (Augmentin; Amoxicillin clavulanate) and 1 to 5 g/ℓ concentration of Gellan gum, preferably 0.8 ~ 2μM concentration of 1-ethyl naphthalimide (1-Naphthaleneacetic acid, NAA) , 1.8 ~ 2.5μM concentration of tea dia juron, 250 ~ 350 ㎎ / ℓ concentration of (NH 4) H 2 PO 4 · H 2 O, KNO 3 at a concentration of 2200-2800 ㎎/ℓ, CaCl 2 ·2H 2 O at a concentration of 120-240 ㎎/ℓ, MgSO 4 ·7H 2 O at a concentration of 350–450 ㎎/ℓ, Fe at a concentration of 15-40 ㎎/ℓ -EDTA·3H 2 O, MnSO 4 ·H 2 O at a concentration of 8 to 15 mg/ℓ, H 3 BO 3 at a concentration of 2 to 8 mg/ℓ, KI at a concentration of 0.5 to 2.5 mg/ℓ, 0.5 to 2.5 mg/ ZnSO 4 ·7H 2 O at ℓ concentration, CuSO 4 ·5H 2 O at 0.1 to 0.5 mg/ℓ concentration, Na 2 MoO 4 ·2H 2 O at 0.05 to 0.2 mg/ℓ concentration, 0.05 to 0.2 mg/ℓ concentration CoCl 2 ·6H 2 O, myo-inositol at a concentration of 50 to 200 mg/ℓ, nicotinic acid at a concentration of 0.5 to 2 mg/ℓ, pyridoxine hydrochloride at a concentration of 0.5 to 2 mg/ℓ ), 5 to 20 mg/ℓ concentration of Thiamine HCl, 15 to 30 g/ℓ concentration of Sucrose, 0.2 to 1.0 g/ℓ concentration of Casein hydrolysate, 0.2 to 1.0 MES[2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid] at a concentration of g/ℓ, Calcium gluconate at a concentration of 0.2 to 1.0 g/ℓ, AVG[L-α-(2-aminoethoxyvinyl) at a concentration of 0.5 to 2.0 μM )glycine], augmentin at a concentration of 250 to 800 mg/ℓ (Augmentin; Amoxicillin clavulanate) and gellan gum at a concentration of 2 to 4 g/l.
본 발명의 메디카고속(Medicago) 식물의 체세포배 발생용 배지 조성물은 형질전환 체세포배만을 선별하기 위한 체계로서 카나마이신, 히그로마이신(Hygromycin), 바스타(Basta) 등과 같은 형질전환 선별용 화합물을 더 포함할 수 있다. 본 발명의 메디카고속(Medicago) 식물의 체세포배 발생용 배지 조성물에서 형질전환 선별용 화합물의 농도는 1~100 ㎎/ℓ의 농도에서 선택되는 것이 바람직하다. 예를 들어, 본 발명의 메디카고속(Medicago) 식물의 체세포배 발생용 배지 조성물에서 상기 카나마이신의 농도는 20~80 ㎎/ℓ인 것이 바람직하고 30~60 ㎎/ℓ인 것이 더 바람직하다. 또한, 본 발명의 메디카고속(Medicago) 식물의 체세포배 발생용 배지 조성물에서 상기 바스타(Basta)의 농도는 2~10 ㎎/ℓ인 것이 바람직하고 3~8 ㎎/ℓ인 것이 더 바람직하다.The media composition for generating somatic embryos of Medicago plants of the present invention further includes a compound for transformation selection such as kanamycin, hygromycin, basta, etc. as a system for selecting only transformed somatic embryos can do. The concentration of the compound for transformation selection in the medium composition for generating somatic embryos of the medicago plant of the present invention is preferably selected from a concentration of 1 to 100 mg/L. For example, the concentration of the kanamycin in the medium composition for generating somatic embryos of the Medicago plant of the present invention is preferably 20 to 80 mg/L and more preferably 30 to 60 mg/L. In addition, in the medium composition for generating somatic embryos of the Medicago plant of the present invention, the concentration of the Basta is preferably 2-10 mg/L, more preferably 3-8 mg/L.
본 발명의 메디카고속(Medicago) 식물의 체세포배 발생용 배지 조성물은 바람직하게는 매질로 물을 포함한다. 본 발명의 메디카고속(Medicago) 식물의 체세포배 발생용 배지 조성물은 바람직하게는 오토클레이브 등으로 멸균 후 냉각하면 구성성분 중 하나인 검류에 의해 고체상으로 존재한다.The medium composition for generating somatic embryos of the Medicago plant of the present invention preferably contains water as a medium. The medium composition for generating somatic embryos of the Medicago plant of the present invention is preferably in a solid phase by gum, which is one of the constituents when sterilized by autoclave or the like and cooled.
본 발명의 메디카고속(Medicago) 식물의 체세포배 발생용 배지 조성물은 메디카고속(Medicago) 식물로부터 형성한 캘러스의 체세포배 발생을 유도하는데에 적용되며, 상기 메디카고속(Medicago) 식물은 그 종류가 크게 제한되지 않으며 약 90 여개의 종(Species)이 보고되었다. 본 발명의 메디카고속(Medicago) 식물의 체세포배 발생용 배지 조성물은 바람직하게는 메디카고 트런카툴라(Medicago truncatula)로부터 형성한 캘러스의 체세포배 발생을 유도하는데에 적용되며, 더 바람직하게는 메디카고 트런카툴라 유전형 A17(Medicago truncatula genotype A17)로부터 형성한 캘러스의 체세포배 발생을 유도하는데에 적용된다.The media composition for somatic embryogenesis of medicago plants of the present invention is applied to induce somatic embryogenesis of callus formed from medicago plants, and the medicago plants of Medicago are large It is not limited and about 90 Species have been reported. The medium composition for somatic embryogenesis of the Medicago plant of the present invention is preferably Medicago Truncatula ( Medicago truncatula ) is applied to induce somatic embryogenesis of callus formed, more preferably Medicago Truncatula genotype A17 ( Medicago It is applied to induce somatic embryogenesis of callus formed from truncatula genotype A17).
본 발명의 일 측면은 메디카고속(Medicago) 식물의 형질전환 방법에 관한 것이다. 본 발명의 일 예에 따른 메디카고속(Medicago) 식물의 형질전환 방법은 메디카고속 식물체의 외식편(Explant)을 형질전환 유전자가 도입된 아그로박테리움속 균과 공동배양하는 단계; 상기 공동배양한 외식편을 캘러스 형성용 배지에서 배양하여 캘러스를 형성하는 단계; 상기 캘러스를 전술한 체세포배 발생용 배지 조성물에서 배양하여 체세포배를 발생시키는 단계; 및 상기 체세포배를 식물체로 발달시키는 단계를 포함한다. 또한, 본 발명의 다른 예에 따른 메디카고속(Medicago) 식물의 형질전환 방법은 메디카고속 식물체의 외식편(Explant)을 캘러스 형성용 배지에서 배양하여 캘러스를 형성하는 단계; 상기 캘러스를 형질전환 유전자가 도입된 아그로박테리움속 균과 공동배양하는 단계; 상기 공동배양한 캘러스를 전술한 체세포배 발생용 배지 조성물에서 배양하여 체세포배를 발생시키는 단계; 및 상기 체세포배를 식물체로 발달시키는 단계를 포함한다. 본 발명의 일 예에 따른 메디카고속(Medicago) 식물의 형질전환 방법은 메디카고속 식물체의 외식편(Explant)을 형질전환 유전자가 도입된 아그로박테리움속 균으로 감염시켜 형질전환시키는 방법인 반면, 본 발명의 다른 예에 따른 메디카고속(Medicago) 식물의 형질전환 방법은 메디카고속 식물체의 외식편(Explant)으로부터 형성한 캘러스를 형질전환 유전자가 도입된 아그로박테리움속 균으로 감염시켜 형질전환시키는 방법이다. 이하, 본 발명의 일 예에 따른 메디카고속(Medicago) 식물의 형질전환 방법을 단계별로 나누어 설명한다. 본 발명의 다른 예에 따른 메디카고속(Medicago) 식물의 형질전환 방법은 상기 차이점을 제외하고 본 발명의 일 예에 따른 메디카고속(Medicago) 식물의 형질전환 방법과 기술적 특징이 동일하므로 구체적인 설명을 생략한다.One aspect of the present invention relates to a method for transforming Medicago plants. Medicago plant transformation method according to an embodiment of the present invention comprises the steps of co-culturing the explants of the plant of the Medica genus (Agrobacterium genus with a transgene); Culturing the co-cultured explants in a callus forming medium to form a callus; Culturing the callus in the above-described medium composition for somatic embryogenesis to generate somatic embryogenesis; And developing the somatic embryo into a plant. In addition, transformation methods of high-speed Medica (Medicago) plant in accordance with another embodiment of the present invention to form a callus by culturing the explants (Explant) of the high-speed Medica plant in a culture medium for callus formation; Co-culturing the callus with Agrobacterium bacteria into which a transforming gene has been introduced; Culturing the co-cultured callus in the above-described medium composition for generating somatic embryos to generate somatic embryos; And developing the somatic embryo into a plant. Medicago plant transformation method according to an embodiment of the present invention is a method of transforming by infecting the explant of the medica plant ( Medicago ) plant with Agrobacterium bacteria into which the transforming gene has been introduced. Medicago plant transformation method according to another example of the invention is a method of transforming the callus formed from explants of the medica plant, the Agrobacterium fungus introduced with a transgene. . Hereinafter, a method of transforming a Medicago plant according to an example of the present invention will be described in stages. Medicago plant transformation method according to another example of the present invention has the same technical characteristics as the transformation method of the medicago plant ( Medicago ) plant according to an example of the present invention, except for the above-described differences, and thus a detailed description is omitted do.
메디카고속Medica Express 식물체의 Plant 외식편(Explant)을Explant 형질전환 유전자가 도입된 Transformed gene 아그로Agro 박테리움속 균과 공동배양하는 단계Co-cultivation with bacteria in Bacterium
본 발명의 메디카고속(Medicago) 식물의 형질전환 방법에서 상기 메디카고속 식물체의 외식편(Explant)은 메디카고속 식물체의 조직 또는 기관을 절제한 단편으로서, 캘러스를 형성할 수 있는 것이라면 메디카고속 식물체의 다양한 부위에서 얻을 수 있고, 바람직하게는 잎 절편이다. 또한, 본 발명에서 사용된 잎 절편은 성숙한 메디카고 트런카툴라, 더 바람직하게는 메디카고 트런카툴라 A17 식물체의 잎이며, 잎자루, 줄기, 꽃잎과 뿌리, 유식물체 또는 유식물의 떡잎과 하배축 등도 동일한 방법으로 사용할 수 있다. 본 발명에서 최적의 식물 재료로는 무균 상태에서 생장한 잎을 사용하는 것이 좋다. 또한, 일반적으로 온실이나 배양기에서 생육시킨 식물체의 잎을 채취하여 적절한 살균 처리를 한 후 사용할 수 있다. 예를 들어, 식물체에서 분리한 잎을 70% 농도의 에탄올 수용액에 1~3분 동안 담근 후, 10~50% 농도의 락스 용액에 10~30분 동안 담가서 살균한 후, 멸균된 증류수로 씻어서 잎 절편의 재료로 사용할 수 있다. 메스를 이용하여 적당한 크기로 잘라 잎 절편을 준비한다.In the method for transforming a medicago plant of the present invention, the explant of the medica plant of medicago is a fragment obtained by excising the tissue or organ of the plant of medica plant, as long as it can form a callus. It can be obtained from the site, and is preferably a leaf segment. In addition, the leaf section used in the present invention is a leaf of a mature Medicago truncatorula, more preferably a Medicago truncatorula A17 plant, and also has a petiole, stem, petal and root, a plant or cotyledon, and a hypocotyl. It can be used in the same way. As an optimal plant material in the present invention, it is preferable to use leaves grown in aseptic conditions. In addition, in general, the leaves of plants grown in a greenhouse or incubator can be used after appropriate sterilization treatment. For example, a leaf separated from a plant is immersed in an aqueous ethanol solution having a concentration of 70% for 1 to 3 minutes, and then immersed in a 10-50% concentration of lacx solution for 10-30 minutes, and then washed with sterile distilled water to leave Can be used as a sectioning material. Prepare a leaf slice by cutting it into a suitable size using a scalpel.
본 발명의 메디카고속(Medicago) 식물의 형질전환 방법 상기 형질전환 유전자는 그 종류가 크게 제한되지 않으며 공지의 다양한 형질전환 유전자에서 선택될 수 있다. 예를 들어, 상기 형질전환 유전자는 항생제 저항성 유전자, 제초제 저항성 유전자, 병 저항성 유전자, 바이러스 저항성 유전자, 스트레스 저항성 유전자, 효소 생합성 유전자, 재조합 단백질 발현 유전자 또는 식물 생장 촉진 유전자에서 선택되는 1종 이상으로 구성될 수 있다. 상기 항생제는 카나마이신, 히그로마이신 등 공지의 다양한 항생제에서 선택될 수 있다. 또한, 상기 제초제는 바스타(Basta) 등 공지의 다양한 제초체에서 선택될 수 있다. 본 발명의 메디카고속(Medicago) 식물의 형질전환 방법에서 사용될 수 있는 형질전환 유전자의 구체적인 예로는 가뭄 스트레스 저항성 유전자, 피토엔 생합성 효소(phytoene synthase, PSY ) 유전자, RECA1 유전자, 퍼옥시다제 유전자, 대장균 장독소 B 서브유닛 유전자, 식물의 생장을 촉진하는 gul1/sur2-7 유전자, OsRAF 유전자, 안토시아닌 생합성 조절 유전자 AtbHLH113, 병 저항성 유전자 CaChitIV(Capsicum annuum Chitinase class IV), 병 저항성 유전자 CaMLO2(Capsicum annuum mildew resistance locus O2), 병 저항성 유전자 CaGRP1(Capsicum annuum Glycine-rich RNA-binding Protein 1), 에이브이알비에스티 (avrBsT) 유전자, 병 저항성 유전자 CaADC1 (Capsicum annuum Arginine Decarboxylase 1), 병 저항성 CaALDH1 (Capsicum annuum Aldehyde Dehydrogenase 1), 음지 내성 또는 염 저항성 유전자인 세로토닌 N-아세틸전이효소2 유전자, 저온 저항성 단백질 15A(COR15A), 톡소플라빈 분해 효소 오전자(toxoflavin lyase: tflA), 자일라나제 유전자, 토코트리에놀(tocotrienol) 생합성 유전자 HGGT(homogentisic acid geranylgeranyl transferase), OsGlu2 유전자, 열 충격 저항성 유전자, 산화 스트레스 저항성 유전자, 액티빈 A 유전자, 내건성 단백질 BrDST28, 온도 스트레스 저항성 유전자 AtP3B, 식물 성장 촉진용 CYP705A13 유전자, 열충격 전사인자 유전자 CaHsfB1, HOX25 유전자, 염 스트레스 저항성 유전자 BrGI(Brassica rapa GIGANTEA) 유전자, 뿌리 발달 관련 유전자 CRF2 또는 CRF3, COMT(caffeic acid O-methyltransferase) 효소를 코딩하는 유전자, 식물체 생장조절 blp 키메라 유전자, 콩 모자이크 바이러스(Soybean mosaic virus) 유래의 HC-Pro(helper component-proteinase) 유전자, 중금속 저항성 유전자 카멜리나 HMA3 유전자, 열충격단백질을 코딩하는 분리된 유전자(CaHSP70), 저온 스트레스 저항성 유전자 grxC 유전자, TTG1 유전자, OsFKBP16-3(Oryza sativa FK506-binding protein 16-3) 단백질 코딩 유전자, 택사디엔 신타아제 (taxadiene synthase) 유전자, CaSGT1(Capsicum annuum Suppressor of G Two allele of SKP1 1) 등이 있다.Transformation method of Medicago plant of the present invention The type of transformation gene is not greatly limited and can be selected from various known transformation genes. For example, the transformation gene is composed of one or more selected from antibiotic resistance genes, herbicide resistance genes, disease resistance genes, virus resistance genes, stress resistance genes, enzyme biosynthesis genes, recombinant protein expression genes or plant growth promoting genes. Can be. The antibiotic may be selected from various known antibiotics such as kanamycin and hygromycin. In addition, the herbicide may be selected from various known herbicides such as Basta. Specific examples of the transgene that can be used in the transformation method of the Medica plant of the present invention (Medicago) are drought stress resistance gene, phytoene synthase (PSY) gene, RECA1 gene, peroxidase gene, E. coli Enterotoxin B subunit gene, plant growth-promoting gul1/sur2-7 gene, OsRAF gene, anthocyanin biosynthesis regulatory gene AtbHLH113, disease resistance gene CaChitIV (Capsicum annuum Chitinase class IV), disease resistance gene CaMLO2 (Capsicum annuum mildew resistance) locus O2), disease resistance gene CaGRP1 (Capsicum annuum Glycine-rich RNA-binding Protein 1), avBsT gene, disease resistance gene CaADC1 (Capsicum annuum Arginine Decarboxylase 1), disease resistance CaALDH1 (Capsicum annuum Aldehyde Dehydrogenase 1 ), the tone resistance or salt resistance gene serotonin N-acetyltransferase 2 gene, cold resistance protein 15A (COR15A), toxoflavin lyase (tflA), xylanase gene, tocotrienol biosynthesis Gene HGGT (homogentisic acid geranylgeranyl transferase), OsGlu2 gene, heat shock resistance gene, oxidative stress resistance gene, activin A gene, resistant protein BrDST28, temperature stress resistance gene AtP3B, CYP705A13 gene for promoting plant growth, heat shock transcription factor gene CaHsfB1, HOX25 gene, salt stress resistance gene BrGI (Brassica rapa GIGANTEA) gene, root development related gene CRF2 or CRF3, COMT (caffei c acid O-methyltransferase (enzyme encoding) gene, plant growth regulation blp chimeric gene, soybean mosaic virus derived HC-Pro (helper component-proteinase) gene, heavy metal resistance gene camelina HMA3 gene, heat shock protein Isolated gene (CaHSP70), cold stress resistance gene grxC gene, TTG1 gene, OsFKBP16-3 (Oryza sativa FK506-binding protein 16-3) protein coding gene, taxadiene synthase gene, CaSGT1( Capsicum annuum Suppressor of G Two allele of SKP1 1).
본 발명의 메디카고속(Medicago) 식물의 형질전환 방법에서 상기 형질전환 유전자는 형질전환 유전자를 포함하는 벡터 시스템을 통해 아그로박테리움속 균에 도입된다. 본 발명에서 이용되는 벡터 시스템은 식물체 형질전환에 적합한 다양한 재료를 이용할 수 있으며, 식물체에서 작동하는 프로모터와 형질전환 유전자 구조 및 형질전환 식물체의 선발을 위한 선발마커를 포함한다. 상기 형질전환 유전자 구조는 목적 유전자 과발현, 프로모터 및 유전자의 형광단백질이나 uid 유전자와의 결합, microRNA, shRNA 및 lhRNA를 이용한 유전자침묵 중의 하나일 수 있다. 상기 벡터 시스템은 식물체 선발을 위한 마커 유전자로서 카나마이신(Kanamycin) 저항성 유전자, 히그로마이신(Hygromycin) 저항성 유전자, 제초제 저항성 유전자 등을 포함할 수 있다. 그러나 이 예시에 국한되는 것은 아니며 업계에 공지된 다양한 벡터 시스템을 포함할 수 있다.In the transformation method of the Medicago plant of the present invention, the transforming gene is introduced into Agrobacterium bacteria through a vector system containing the transforming gene. The vector system used in the present invention can use a variety of materials suitable for plant transformation, and includes a promoter operating in the plant and a selection marker for selection of the transgene structure and the transgenic plant. The transformed gene structure may be one of gene overexpression of a target gene, binding of a promoter and a gene to a fluorescent protein or a uid gene, and gene silencing using microRNA, shRNA and lhRNA. The vector system may include a kanamycin resistance gene, a hygromycin resistance gene, and a herbicide resistance gene as marker genes for plant selection. However, it is not limited to this example, and may include various vector systems known in the art.
본 발명의 메디카고속(Medicago) 식물의 형질전환 방법에서 상기 형질전환 유전자가 도입되는 아그로박테리움속 균은 식물체의 외식편을 감염시켜 외식편을 형질전환시킬 수 있는 공지의 다양한 아그로박테리움속 균에서 선택될 수 있으며, 형질전환 효율 등을 고려할 때 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)인 것이 바람직하다.The Agrobacterium genus in which the transforming gene is introduced in the transformation method of Medicago plants of the present invention is a variety of known Agrobacterium genus which can transform explants by infecting explants of plants. Agrobacterium tumefaciens is preferable when considering transformation efficiency and the like.
본 발명의 메디카고속(Medicago) 식물의 형질전환 방법에서 잎 절편에 형질전환 벡터를 도입하는 방법은 공지된 통상적인 아그로박테리움 튜메파시엔스를 이용한 식물형질전환 방법에 따라 실시될 수 있으며, 전기천공, 유전자 총 등 당 업계에 공지된 유전자 도입 방법을 포함할 수 있다.The method of introducing a transformation vector into a leaf segment in the method of transforming a Medica plant of the present invention can be carried out according to a plant transformation method using a conventional Agrobacterium tumefaciens, and electroporation. , Gene guns, etc., and methods for introducing genes known in the art.
본 발명의 메디카고속(Medicago) 식물의 형질전환 방법에서 외식편을 형질전환 유전자가 도입된 아그로박테리움속 균과 공동배양하거나 캘러스를 형질전환 유전자가 도입된 아그로박테리움속 균과 공동배양하는 경우 다양한 공동배양 배지가 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용하는 공동배양 배지는 당 업계에 공지된 MS 배지 또는 SH 배지를 사용할 수 있으며, 그 조성은 (NH4)2SO4, KNO3, CaCl2, MgSO4, Fe-EDTA, MnSO4, HBO3, KI, ZnSO4, CuSO4, Na2MoO4, CoCl2, myoinositol, nicotinic acid, pyridoxine, thiamine HCl, Glycine, casein hydrolysates, calcium gluconate, MES, acetosyringone, 당류, 옥신, 사이토키닌 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에서 사용하는 공동배양 배지는 바람직하게는 아가, 아가로스 또는 Gelrite 등과 같은 검류를 포함할 수 있다. 상기 공동배양 배지의 pH 조절을 위해 MES를 0.2-2 g/ℓ의 농도, 바람직하게는 0.5 g/ℓ 농도로 첨가할 수 있으며, 공동배양 배지의 pH는 5.7~5.8로 조절하여 사용할 수 있다. 또한, 공동배양 배지에는 아그로박테리움 튜메파시엔스와 캘러스의 생장을 촉진하기 위한 casein hydrolysates, calcium gluconate, 아미노산인 프롤린과 시스테인 등이 각각 0.1~2 g/ℓ의 농도로 첨가될 수 있다. 또한, 공동배양 배지에는 아그로박테리움 튜메파시엔스의 형질전환 활성을 촉진하기 위해 acetoryringone이 50-200 μM 범위로 첨가될 수 있다. 또한, 공동배양 배지에서 사용되는 당류는 당 업계에서 공지된 식물 형질전환에 사용되는 당류 중 하나일 수 있으며, 바람직하게는 5~50 g/ℓ의 농도 범위에서 수크로스(sucrose)가 사용할 수 있다. 또한, 공동배양 배지의 구성성분으로 사용되는 옥신과 사이토키닌은 당 업계에서 공지된 식물 형질전환에 사용되는 옥신과 사이토키닌 화합물 중 하나일 수 있으며, 바람직하게는 NAA와 BAP를 1~20 μM 농도로 조합하여 사용할 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시 예에 따르면, 잎 절편을 아그로박테리움 튜메파시엔스와 공동배양하면, 잎 절편이 아그로박테리움 튜메파시엔스으로 감염되고 아그로박테리움 튜메파시엔스에 도입된 형질전환 유전자 또는 이를 포함하는 벡터가 잎 절편에 도입되어 잎 절편이 형질전환된다.In the case of co-cultivation of explants with Agrobacterium genus into which a transgene has been introduced, or co-cultured callus with Agrobacterium genus into which a transformation gene has been introduced, in the method for transforming a plant of the Medicago plant of the present invention Various co-culture media can be used. The co-culture medium used in the present invention may use MS medium or SH medium known in the art, the composition of which is (NH 4 ) 2 SO 4 , KNO 3 , CaCl 2 , MgSO 4 , Fe-EDTA, MnSO 4 , HBO 3 , KI, ZnSO 4 , CuSO 4 , Na 2 MoO 4 , CoCl 2 , myoinositol, nicotinic acid, pyridoxine, thiamine HCl, Glycine, casein hydrolysates, calcium gluconate, MES, acetosyringone, sugars, auxin, cytokinin, etc. It may include. In addition, the co-culture medium used in the present invention may preferably include gums such as agar, agarose, or gelrite. To adjust the pH of the co-culture medium, MES may be added at a concentration of 0.2-2 g/L, preferably 0.5 g/L, and the pH of the co-culture medium may be adjusted to 5.7-5.8. In addition, in the co-culture medium, agrobacterium tumefaciens and casein hydrolysates for promoting the growth of callus, calcium gluconate, amino acids proline and cysteine, etc. may be added at a concentration of 0.1 to 2 g/ℓ, respectively. In addition, in the co-culture medium, acetoryringone may be added in the range of 50-200 μM to promote the transformation activity of Agrobacterium tumefaciens. In addition, the saccharide used in the co-culture medium may be one of saccharides used in plant transformation known in the art, preferably sucrose in a concentration range of 5 to 50 g/L. . In addition, auxin and cytokinin used as components of the co-culture medium may be one of auxin and cytokinin compounds used for plant transformation known in the art, and preferably NAA and BAP are 1-20. It can be used in combination with μM concentration. According to a specific embodiment of the present invention, when a leaf segment is co-cultured with Agrobacterium tumefaciens, the leaf segment is infected with Agrobacterium tumefaciens and contains a transforming gene introduced into Agrobacterium tumefaciens or the same The vector is introduced into a leaf segment, and the leaf segment is transformed.
공동배양한 Co-cultured 외식편을Eat out 캘러스Callus 형성용 배지에서 배양하여 Cultured in the forming medium 캘러스를Callus 형성하는 단계 Forming step
본 발명의 메디카고속(Medicago) 식물의 형질전환 방법에서 캘러스 형성 단계는 아그로박테리움 튜메파시엔스에 감염된 잎 절편을 적절한 옥신과 사이토키닌을 포함하는 캘러스 형성용 배지에서 배양하여 배 발생이 가능한 캘러스 (embryogenic callus) 세포의 형성과 생장을 유도하는 단계이다. 상기 캘러스 형성용 배지는 옥신인 NAA를 2-50 μM, 사이토키닌인 BAP를 1-25 μM 의 농도로 포함할 수 있다. 또한, 상기 캘러스 형성용 배지는 배 발생 캘러스의 형성을 촉진하기 위하여 당 업계에 공지된 화합물인 L-alpha-(2-aminoethoxyvinyl) glycine(AVG)을 0.2~5 μM 농도로 포함할 수 있다. 또한, 상기 캘러스 형성용 배지는 아그로박테리움 튜메파시엔스의 생장을 억제하기 위하여, 적절한 항생제, 예컨대 Augmentin, Timentin, Carbenicillin, Cefotaxime에서 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있고, 바람직하게는 400~800 mg/ℓ 농도의 Augmentin을 포함할 수 있다. 또한, 상기 캘러스 형성용 배지는 아가, 아가로스 또는 Gelrite 등과 같은 검류를 포함할 수 있다.In the transformation method of the medicago plant of the present invention, the callus forming step is performed by culturing a leaf segment infected with Agrobacterium tumefaciens in a callus forming medium containing appropriate auxin and cytokinin to generate embryos. (embryogenic callus) It is a stage that induces cell formation and growth. The callus-forming medium may include auxin NAA at a concentration of 2-50 μM and cytokinin BAP at a concentration of 1-25 μM. In addition, the callus forming medium may contain a compound known in the art, L-alpha-(2-aminoethoxyvinyl) glycine (AVG), in a concentration of 0.2 to 5 μM in order to promote the formation of embryogenic callus. In addition, the callus forming medium may contain at least one selected from appropriate antibiotics, such as Augmentin, Timentin, Carbenicillin, Cefotaxime, to inhibit the growth of Agrobacterium tumefaciens, preferably 400-800 Augmentin at a concentration of mg/L. In addition, the callus-forming medium may include gums such as agar, agarose, or gelrite.
본 발명의 메디카고속(Medicago) 식물의 형질전환 방법에서 상기 캘러스 형성용 배지는 배 발생이 가능한 캘러스의 형성 효율을 고려할 때 바람직하게는 1-나프탈아세트산(1-Naphthaleneacetic acid, NAA), 6-벤질아미노푸린(6-Benzylaminopurine, BAP), (NH4)H2PO4·H2O, KNO3, CaCl2·2H2O, MgSO4·7H2O, Fe-EDTA·3H2O, MnSO4·H2O, H3BO3, KI, ZnSO4·7H2O, CuSO4·5H2O, Na2MoO4·2H2O, CoCl2·6H2O, 미오이노시톨(myo-inositol), 니코틴산(Nicotinic acid), 피리독신염산염(Pyridoxine HCl), 티아민염산염(Thiamine HCl), 수크로스(Sucrose), 카제인 가수분해물(Casein hydrolysate), MES[2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid], 글루콘산칼슘(Calcium gluconate), AVG[L-α-(2-aminoethoxyvinyl)glycine], 오그멘틴(Augmentin; Amoxicillin clavulanate) 및 젤란검(Gellan gum)을 포함한다. 또한, 본 발명의 메디카고속(Medicago) 식물의 형질전환 방법에서 상기 캘러스 형성용 배지는 배지 조성물 총 부피를 기준으로 2~20μM 농도의 1-나프탈아세트산(1-Naphthaleneacetic acid, NAA), 1~8μM 농도의 6-벤질아미노푸린(6-Benzylaminopurine, BAP), 200~400 ㎎/ℓ 농도의 (NH4)H2PO4·H2O, 2000~3000 ㎎/ℓ 농도의 KNO3, 75~275 ㎎/ℓ 농도의 CaCl2·2H2O, 300~500 ㎎/ℓ 농도의 MgSO4·7H2O, 10~50 ㎎/ℓ 농도의 Fe-EDTA·3H2O, 5~25 ㎎/ℓ 농도의 MnSO4·H2O, 1~15 ㎎/ℓ 농도의 H3BO3, 0.2~4 ㎎/ℓ 농도의 KI, 0.2~4 ㎎/ℓ 농도의 ZnSO4·7H2O, 0.05~1 ㎎/ℓ농도의 CuSO4·5H2O, 0.01~0.25 ㎎/ℓ 농도의 Na2MoO4·2H2O, 0.01~0.25 ㎎/ℓ 농도의 CoCl2·6H2O, 10~250 ㎎/ℓ 농도의 미오이노시톨(myo-inositol), 0.1~2.5 ㎎/ℓ 농도의 니코틴산(Nicotinic acid), 0.1~2.5 ㎎/ℓ 농도의 피리독신염산염(Pyridoxine HCl), 1~25 ㎎/ℓ 농도의 티아민염산염(Thiamine HCl), 10~35 g/ℓ 농도의 수크로스(Sucrose), 0.1~1.5 g/ℓ 농도의 카제인 가수분해물(Casein hydrolysate), 0.1~1.5 g/ℓ 농도의 MES[2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid], 0.1~1.5 g/ℓ 농도의 글루콘산칼슘(Calcium gluconate), 0.2~2.5 μM 농도의 AVG[L-α-(2-aminoethoxyvinyl)glycine], 400~800 ㎎/ℓ 농도의 오그멘틴(Augmentin; Amoxicillin clavulanate) 및 1~5 g/ℓ 농도의 젤란검(Gellan gum)를 포함하고, 바람직하게는 4~15μM 농도의 1-나프탈아세트산(1-Naphthaleneacetic acid, NAA), 2~6μM 농도의 6-벤질아미노푸린(6-Benzylaminopurine, BAP), 250~350 ㎎/ℓ 농도의 (NH4)H2PO4·H2O, 2200~2800 ㎎/ℓ 농도의 KNO3, 120~240 ㎎/ℓ 농도의 CaCl2·2H2O, 350~450 ㎎/ℓ 농도의 MgSO4·7H2O, 15~40 ㎎/ℓ 농도의 Fe-EDTA·3H2O, 8~15 ㎎/ℓ 농도의 MnSO4·H2O, 2~8 ㎎/ℓ 농도의 H3BO3, 0.5~2.5 ㎎/ℓ 농도의 KI, 0.5~2.5 ㎎/ℓ 농도의 ZnSO4·7H2O, 0.1~0.5 ㎎/ℓ농도의 CuSO4·5H2O, 0.05~0.2 ㎎/ℓ 농도의 Na2MoO4·2H2O, 0.05~0.2 ㎎/ℓ 농도의 CoCl2·6H2O, 50~200 ㎎/ℓ 농도의 미오이노시톨(myo-inositol), 0.5~2 ㎎/ℓ 농도의 니코틴산(Nicotinic acid), 0.5~2 ㎎/ℓ 농도의 피리독신염산염(Pyridoxine HCl), 5~20 ㎎/ℓ 농도의 티아민염산염(Thiamine HCl), 15~30 g/ℓ 농도의 수크로스(Sucrose), 0.2~1.0 g/ℓ 농도의 카제인 가수분해물(Casein hydrolysate), 0.2~1.0 g/ℓ 농도의 MES[2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid], 0.2~1.0 g/ℓ 농도의 글루콘산칼슘(Calcium gluconate), 0.5~2.0 μM 농도의 AVG[L-α-(2-aminoethoxyvinyl)glycine], 500~700 ㎎/ℓ 농도의 오그멘틴(Augmentin; Amoxicillin clavulanate) 및 2~4 g/ℓ 농도의 젤란검(Gellan gum)를 포함한다.In the method for transforming Medicago plants of the present invention, the callus forming medium is preferably 1-naphthaleneacetic acid (NAA), 6- benzylamino purine (6-Benzylaminopurine, BAP), (NH 4)
또한, 본 발명의 메디카고속(Medicago) 식물의 형질전환 방법에서 상기 캘러스 형성용 배지는 유전자 형질전환이 일어난 세포의 선택적 생장을 위해 형질전환 선별용 화합물, 예를 들어 카나마이신, 히그로마이신(Hygromycin), 바스타(Basta) 등에서 선택되는 하나를 포함할 수 있다. 상기 캘러스 형성용 배지에서 형질전환 선별용 화합물의 농도는 1~100 ㎎/ℓ의 농도에서 선택되는 것이 바람직하다. 예를 들어, 상기 캘러스 형성용 배지에서 상기 카나마이신의 농도는 20~80 ㎎/ℓ인 것이 바람직하고 30~60 ㎎/ℓ인 것이 더 바람직하다. 또한, 상기 캘러스 형성용 배지에서 상기 바스타(Basta)의 농도는 2~10 ㎎/ℓ인 것이 바람직하고 3~8 ㎎/ℓ인 것이 더 바람직하다. In addition, in the method for transforming Medicago plants of the present invention, the callus-forming medium is a compound for transforming selection for selective growth of cells in which genetic transformation has occurred, for example, kanamycin, hygromycin. , Basta (Basta), and the like. The concentration of the compound for transformation selection in the callus forming medium is preferably selected from a concentration of 1 to 100 mg/ℓ. For example, the concentration of the kanamycin in the callus forming medium is preferably 20 to 80 mg/L and more preferably 30 to 60 mg/L. In addition, the concentration of the basta (Basta) in the callus forming medium is preferably 2-10 mg/L, and more preferably 3-8 mg/L.
또한, 본 발명의 메디카고속(Medicago) 식물의 형질전환 방법에서 상기 캘러스 형성용 배지는 바람직하게는 매질로 물을 포함한다. 본 발명의 메디카고속(Medicago) 식물의 형질전환 방법에서 상기 캘러스 형성용 배지는 바람직하게는 오토클레이브 등으로 멸균 후 냉각하면 구성성분 중 하나인 검류에 의해 고체상으로 존재한다.In addition, in the method for transforming Medicago plants of the present invention, the culture medium for callus formation preferably contains water as a medium. In the method for transforming a Medicago plant of the present invention, the culture medium for forming the callus is preferably in a solid state by gum, which is one of the constituents when it is cooled after sterilization with an autoclave or the like.
캘러스를Callus 체세포배Somatic embryo 발생용 배지 조성물에서 배양하여 Cultured in the development medium composition 체세포배를Somatic embryo 발생시키는 단계 Generating steps
본 발명의 메디카고속(Medicago) 식물의 형질전환 방법에서 체세포배를 발생시키는 단계는 전술한 소정의 체세포배 발생용 배지 조성물을 사용하는 것을 특징으로 한다. 상기 체세포배 발생용 배지 조성물에 대한 기술적 특징은 전술한 내용을 참조하며, 구체적인 설명을 생략한다.The step of generating somatic embryos in the method of transforming a Medicago plant of the present invention is characterized by using the above-described medium composition for generating somatic embryos. Technical features of the somatic embryogenesis medium composition refer to the above, and detailed description is omitted.
본 발명의 메디카고속(Medicago) 식물의 형질전환 방법에서 체세포배를 발생시키는 단계는 체세포배의 수를 늘리거나 균일한 식물체 발달을 얻기 위하여 2차 배 발생(secondary somatic embryogenesis)을 반복하는 것으로 구성될 수 있다.The step of generating somatic embryos in the method of transforming a Medicago plant of the present invention may consist of repeating secondary somatic embryogenesis to increase the number of somatic embryos or to obtain uniform plant development. Can.
체세포배를Somatic embryo 식물체로 발달시키는 단계 Plant development stages
본 발명의 메디카고속(Medicago) 식물의 형질전환 방법에서 체세포배를 식물체로 발달시키는 단계는 구체적으로 체세포배가 발생한 캘러스 또는 잎 절편을 식물발달 배지로 옮기고 배양하여 체세포배의 반복 형성을 억제하고 식물체로의 발달을 유도하는 것으로 구성된다. 상기 식물발달 배지는 공지의 다양한 배지에서 선택될 수 있으며, 바람직하게는 체세포배의 반복 형성을 억제하기 위해 옥신과 사이토키닌을 포함하지 않고, 당류의 농도가 체세포배 발생용 배지 조성물에 비해 줄어드는 것을 특징으로 한다. 상기 식물발달 배지에서 당류인 수크로스(Sucrose)의 농도는 2~15 g/ℓ인 것이 바람직하고 5~12 g/ℓ인 것이 더 바람직하다. 상기 식물발달 배지의 교환은 2~6주 간격으로 수행할 수 있으며, 바람직하게는 2~3주 간격으로 교체함으로써 체세포배 발생용 배지 조성물에서 흡수한 호르몬의 영향을 신속하게 감쇠시키는 효과를 얻을 수 있다. 또한, 본 발명의 메디카고속(Medicago) 식물의 형질전환 방법에서 체세포배를 식물발달 배지에서 약 2~4주 배양하면 뿌리가 형성된 식물체로 발달하고, 뿌리가 형성된 식물체를 체세포배 군집 또는 식물체 군집에서 분리하여 당류를 제외한 기본 배지 또는 토양을 담은 화분에 식재함으로써 형질전환 식물체를 획득할 수 있다.The step of developing a somatic embryo into a plant in the transformation method of a Medicago plant of the present invention specifically moves and cultures a callus or a leaf fragment in which a somatic embryo has occurred in a plant development medium to suppress repetitive formation of somatic embryos and into a plant. It consists of inducing the development of. The plant development medium may be selected from a variety of known media, preferably does not contain auxin and cytokinin to suppress the repetitive formation of somatic embryos, the concentration of saccharides is reduced compared to the medium composition for somatic embryogenesis It is characterized by. The concentration of sucrose (Sucrose) in the plant development medium is preferably 2 to 15 g/L, and more preferably 5 to 12 g/L. The plant development medium can be exchanged at intervals of 2 to 6 weeks, and preferably replaced at intervals of 2 to 3 weeks to quickly attenuate the effects of hormones absorbed from the somatic embryonic medium composition. have. In addition, in the method for transforming a medicago plant of the present invention, culturing somatic embryos in a plant development medium for about 2 to 4 weeks develops into root-formed plants and root-formed plants in somatic cell colonies or plant colonies. The transformed plant can be obtained by separating and planting in a basic medium excluding saccharides or in a pot containing soil.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 기술적 특징을 명확하게 예시하기 위한 것 일뿐, 본 발명의 보호범위를 한정하는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. However, the following examples are only for clearly illustrating the technical features of the present invention, and are not intended to limit the protection scope of the present invention.
1. One. 메디카고Medicargo 트런카툴라Truncatula (( MedicagoMedicago truncatulatruncatula ) A17의 A17's 체세포배Somatic embryo 발생을 위한 최적 조건 규명 Identifying optimal conditions for occurrence
(1) 식물 형질전환용 벡터가 도입된 아그로박테리움 (1) Agrobacterium introduced with a plant transformation vector 튜메파시엔Tumefacieen 스(S Agrobacterium tumefaciensAgrobacterium tumefaciens )의 준비)
카나마이신(Kanamycin) 저항성 유전자 NPT Ⅱ와 녹색형광단백질(Green fluorescent protein, GFP) 유전자가 포함된 식물 형질전환용 벡터 pK7WG2D[Karimi et al., Trends Plant Sci. 2002 May;7(5):193-5.]를 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens EHA105)에 전기천공법으로 도입하였다. 이후, 식물 형질전환용 벡터가 도입된 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens EHA105)를 항생제인 스펙티노마이신(Spectinomycin)이 100 ㎎/ℓ의 농도로 첨가된 TY/Ca 배지에 접종하고 28℃에서 배양한 후, 후술하는 공동배양 배지 CCM3에 OD600(Optical Density at 600nm)의 값이 0.5가 되도록 희석하여 아그로박테리움 현탁액을 조제하였다. 이하, 식물 형질전환용 벡터가 도입된 아그로박테리움 튜메파시엔스를 '아그로박테리움'으로 간략하게 표기한다.Plant transformation vector pK7WG2D containing Kanamycin resistance gene NPT II and Green fluorescent protein (GFP) gene [Karimi et al., Trends Plant Sci. 2002 May;7(5):193-5.] was introduced into the Agrobacterium tumefaciens EHA105 by electroporation. Subsequently, Agrobacterium tumefaciens EHA105, introduced with a vector for plant transformation, was inoculated into a TY/Ca medium in which the antibiotic Spectinomycin was added at a concentration of 100 mg/ℓ and at 28°C. After cultivation, the Agrobacterium suspension was prepared by diluting the value of OD600 (Optical Density at 600nm) to 0.5 in the co-culture medium CCM3 described later. Hereinafter, Agrobacterium tumefaciens in which a plant transformation vector is introduced is briefly referred to as'Agrobacterium'.
(2) (2) 메디카고Medicargo 트런카툴라Truncatula (( MedicagoMedicago truncatulatruncatula ) A17의 잎 절편과 아그로박테리움 ) A17 leaf slice and Agrobacterium 튜메파시엔스Tumefacience (( AgrobacteriumAgrobacterium tumefacienstumefaciens )의 공동배양)
약 2개월 동안 성장한 메디카고 트런카툴라 유전형 A17 (Medicago truncatula cultivar Jemalong A17) 식물체에서 잎을 채취하고, 채취한 잎을 70% 에탄올에서 1분 동안 침지하고 20% 락스 수용액(유효염소농도는 약 1%임)에 20분 동안 침지하여 표면을 소독하였다. 이후, 메스를 이용하여 한 개의 잎에서 3개씩, 직사각형 모양의 잎 절편을 제작하였다. 이후, 잎 절편을 앞에서 조제한 아그로박테리움 현탁액 현탁액에 침지하고, 20 InHg의 진공에서 20분 동안 처리하여 감염이 이뤄지도록 하였다. 이후, 잎 절편에 묻은 아그로박테리움 현탁액을 종이타월에 흡수시켜 제거하고, 아그로박테리움으로 감염된 잎 절편을 공동배양 배지 CCM3에 치상한 후 22℃의 암 조건에서 3일 동안 공동배양하였다. 하기 표 1에 공동배양 배지 CCM3의 구성성분과 농도를 나타내었다. Medicago Truncatula genotype A17 ( Medicago truncatula cultivar Jemalong A17) grown for about 2 months, leaves were harvested from plants, immersed in 70% ethanol for 1 minute, and a 20% aqueous solution of Lax (effective chlorine concentration is about 1 %) for 20 minutes to disinfect the surface. Subsequently, a leaf section of a rectangular shape was produced by using a scalpel, one by three. Thereafter, the leaf sections were immersed in the suspension of the Agrobacterium suspension prepared earlier, and treated for 20 minutes in a vacuum of 20 InHg to achieve infection. Thereafter, the Agrobacterium suspension on the leaf sections was removed by absorbing it on a paper towel, and the leaf sections infected with Agrobacterium were placed in a co-culture medium CCM3 and co-cultured for 3 days at 22° C. under dark conditions. Table 1 below shows the components and concentrations of the co-culture medium CCM3.
* MES : 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid* MES: 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid
* NAA : 1-Naphthaleneacetic acid* NAA: 1-Naphthaleneacetic acid
* BAP : 6-Benzylaminopurine* BAP: 6-Benzylaminopurine
* GELRITE : Gellan gum* GELRITE: Gellan gum
하기 표 2에 공동배양 배지 CCM3의 구성성분으로 사용된 Schenk and Hildebrandt Basal Salt(1×)의 조성을 나타내었다. 또한, 하기 표 3에 공동배양 배지 CCM3의 구성성분으로 사용된 B5 vitamins 용액(1,000×)의 조성을 나타내었다. 공동배양 배지 CCM3에는 표 3에 표시된 B5 vitamins 용액(1,000×)이 1/1,000 농도로 첨가되었다.Table 2 below shows the composition of Schenk and Hildebrandt Basal Salt (1×) used as a component of the co-culture medium CCM3. In addition, Table 3 below shows the composition of the B5 vitamins solution (1,000×) used as a component of the co-culture medium CCM3. In the co-culture medium CCM3, the B5 vitamins solution (1,000×) shown in Table 3 was added at a concentration of 1/1,000.
(3) (3) 캘러스Callus 형성 조건의 최적화 Optimization of forming conditions
상기의 공동배양 후, 잎 절편에 형성된 아그로박테리움을 멸균된 증류수로 씻어낸 후, 300 ㎎/ℓ 농도의 항생제 오그멘틴(Augmentin : Amoxicillin/clavulanic acid) 황산염 수용액에 담그고 실온에서 약 4 hr 동안 교반하였다. 또한, 캘러스 형성용 기본 배지에 40 ㎎/ℓ 농도의 카나마이신(Kanamycin)과 호르몬을 조합하여 다양한 캘러스 형성용 배지를 준비하였다. 이어서 잎 절편의 물기를 제거하고, 다양한 캘러스 형성용 배지에 치상한 후, 약한 광 조건에서 4주 동안 배양한 결과, 모든 조합의 호르몬 조건에서 캘러스가 형성되었다. After the above co-cultivation, the Agrobacterium formed in the leaf section was washed with sterile distilled water, and then immersed in an aqueous solution of 300 mg/l antibiotic augmentin (Augmentin: Amoxicillin/clavulanic acid) sulfate and stirred at room temperature for about 4 hr. Did. In addition, various culture media for callus formation were prepared by combining 40 mg/L concentration of kanamycin and hormone in the basic medium for callus formation. Subsequently, the leaf slices were drained, and after being placed on various callus-forming media, the cells were cultured for 4 weeks under weak light conditions.
하기 표 4에 캘러스 형성용 기본 배지의 구성성분과 농도를 나타내었다. Schenk and Hildebrandt Basal Salt(1×)의 조성과 B5 vitamins 용액(1,000×)의 조성은 공동배양 배지에서 설명한 내용과 동일하므로 구체적인 설명을 생략한다.Table 4 below shows the components and concentrations of the basic medium for callus formation. The composition of Schenk and Hildebrandt Basal Salt (1×) and the composition of B5 vitamins solution (1,000×) are the same as those described in the co-culture medium, so detailed description is omitted.
* MES : 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid* MES: 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid
또한, 하기 표 5에 캘러스 형성용 기본 배지에 첨가한 다양한 호르몬 조합을 사이토키닌(Cytokinin)과 옥신(Auxin)류으로 나누어 나타내었다. 상기 사이토키닌은 식물 호르몬의 한 종류로 식물의 생장을 조절하고 세포분열을 촉진하는 역할을 하는 물질을 가르킨다. 사이토키닌의 종류로는 키네틴, 제아틴(Zeatin), 6-벤질아미노퓨린(6-benzylaminopurine, BAP)과 같은 아데닌 유도체형과 디페닐우레아(diphenylurea)와 티디아주론(thidiazuron, TDZ)와 같은 페닐요소(phenylurea) 유도체형이 있다. 또한, 상기 옥신은 식물의 성장을 촉진하는 식물 생장 호르몬 중 하나로서 협의로는 인돌아세트산(Indole acetic acid, IAA)을 가리키나 광의로는 인돌아세트산과 같은 작용을 하는 천연 화합물 및 합성 화합물을 모두 포함하며, 광의의 옥신을 옥신류(Auxins)라고 한다. 상기 옥신류에는 PAA(2-phenylacetic acid), IBA(Indole-3-butyric acid), IPA(Indole-3-propionic acid)와 같은 천연 화합물뿐만 아니라 2,4-D(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid); NAA(1-Naphthalene acetic acid); 2,4,5-T(2,4,5-Trichlorophenoxyacetic acid) 등과 같은 합성 화합물이 모두 포함된다.In addition, in Table 5, various hormone combinations added to the basic medium for callus formation are shown as Cytokinin and Auxin. The cytokinin is a type of plant hormone, and refers to a substance that regulates plant growth and promotes cell division. Types of cytokinins include adenine derivatives such as kinetin, zeatin and 6-benzylaminopurine (BAP), and diphenylurea and thidiazuron (TDZ). There is a derivative type of phenylurea. In addition, the auxin is one of the plant growth hormones that promote the growth of plants.In narrow terms, it refers to indole acetic acid (IAA), but broadly includes both natural and synthetic compounds that act like indole acetic acid. The broad auxin is called auxins. The auxins include 2,4-D (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid) as well as natural compounds such as 2-phenylacetic acid (PAA), indole-3-butyric acid (IBA), and indole-3-propionic acid (IPA). ; NAA (1-Naphthalene acetic acid); Synthetic compounds such as 2,4,5-T (2,4,5-Trichlorophenoxyacetic acid) are all included.
* TDZ : Thidiazuron* TDZ: Thidiazuron
* BAP : 6-Benzylaminopurine* BAP: 6-Benzylaminopurine
* 2,4-D : 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid* 2,4-D: 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid
* NAA : 1-Naphthaleneacetic acid* NAA: 1-Naphthaleneacetic acid
상기의 모든 캘러스 형성용 배지에서 캘러스가 형성되었지만, 형성된 캘러스(캘러스가 형성된 잎 절편 또는 분리된 캘러스 덩어리)를 후술하는 최적 체세포배 발생용 배지 EID3에 옮겨 배양한 결과 10 μM의 NAA와 4μM의 BAP 호르몬 조합을 갖는 캘러스 형성용 배지에서 캘러스를 형성한 후 체세포배 발생용 배지 EID3에 배양하였을 때 가장 높은 배 발생 캘러스 빈도를 보였다. 구체적으로, 다양한 호르몬 조합의 캘러스 형성형 배지에서 형성된 캘러스를 40 ㎎/ℓ 농도의 카나마이신(Kanamycin)이 첨가된 체세포배 발생용 배지 EID3으로 옮겨 4주 동안 배양하였다. 그 결과, 10 μM NAA와 4 μM BAP의 조합을 가진 캘러스 형성용 배지에서 캘러스를 형성한 후 체세포배 발생용 배지 EID3에 배양하였을 때 배 발생 캘러스가 형성된 잎 절편의 비율은 38%이고 잎 절편당 발생한 체세포배의 수는 2.875개로 다른 호르몬 조합의 캘러스 형성용 배지에 비해 현저히 높은 값을 보였다. 하기 표 6에 캘러스 형성용 배지의 호르몬 조합 조건에 따른 배 발생 캘러스가 형성된 잎 절편의 비율(%)을 나타내었고 하기 표 7에 캘러스 형성용 배지의 호르몬 조합 조건에 따른 잎 절편당 배 발생 캘러스의 수를 나타내었다.Callus was formed in all of the above callus forming medium, but the formed callus (the callus-formed leaf slice or the separated callus clump) was transferred to culture medium EID3 for optimal somatic embryogenesis described below, and cultured as a result of 10 μM NAA and 4 μM BAP After forming the callus in a callus forming medium with a hormone combination, it showed the highest embryogenic callus frequency when cultured in somatic embryogenesis medium EID3. Specifically, callus formed in callus-forming medium of various hormone combinations was transferred to medium EID3 for somatic embryogenesis with kanamycin at a concentration of 40 mg/l and cultured for 4 weeks. As a result, when the callus was formed in a callus-forming medium having a combination of 10 μM NAA and 4 μM BAP, and when cultured in EID3 for somatic embryogenesis, the proportion of leaf segments in which embryogenic callus was formed was 38% and per leaf segment The number of somatic embryos generated was 2.875, which was significantly higher than that of other hormone combinations. Table 6 below shows the percentage (%) of embryonic callus-forming leaf sections according to the hormone combination conditions of the callus forming medium, and Table 7 below shows the embryonic calli per leaf section according to the hormone combination conditions of the callus forming medium. Number.
상기 표 6 및 표 7의 결과로부터 10 μM NAA와 4 μM BAP의 호르몬 조합을 가진 캘러스 형성용 배지를 최적 배지로 선택하고 상기 배지를 CIM3으로 명명하였다. 하기 표 8에 최적 캘러스 형성용 배지인 CIM3의 구성성분과 농도를 나타내었다.From the results of Tables 6 and 7, the culture medium for callus formation with a hormone combination of 10 μM NAA and 4 μM BAP was selected as the optimal medium, and the medium was named CIM3. Table 8 below shows the components and concentrations of CIM3, which is an optimal callus forming medium.
(4) (4) 체세포배Somatic embryo 발생 조건의 최적화 Optimization of occurrence conditions
체세포배 발생용 기본 배지에 40 ㎎/ℓ 농도의 카나마이신(Kanamycin)과 호르몬을 조합하여 다양한 체세포배 발생용 배지를 준비하였다. 캘러스 형성용 배지 CIM3에서 4주 동안 배양하여 캘러스가 형성된 잎 절편 또는 분리된 캘러스 덩어리를 다양한 체세포배 발생용 배지로 옮기고, 광 조건 및 28℃의 온도 조건에서 4주 동안 배양하여 체세포배 발생을 유도하였다.Various mediums for somatic embryogenesis were prepared by combining 40mg/l concentration of kanamycin and hormone in the basic medium for somatic embryogenesis. Callus forming medium CIM3 was incubated for 4 weeks to transfer callus-formed leaf segments or separated callus masses into various somatic embryogenesis mediums, and incubated for 4 weeks under light conditions and a temperature of 28°C to induce somatic embryogenesis. Did.
하기 표 9에 체세포배 발생용 기본 배지의 구성성분과 농도를 나타내었다. Schenk and Hildebrandt Basal Salt(1×)의 조성과 B5 vitamins 용액(1,000×)의 조성은 공동배양 배지에서 설명한 내용과 동일하므로 구체적인 설명을 생략한다.Table 9 below shows the components and concentrations of the basic medium for somatic embryogenesis. The composition of Schenk and Hildebrandt Basal Salt (1×) and the composition of B5 vitamins solution (1,000×) are the same as those described in the co-culture medium, so detailed description is omitted.
* MES : 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid* MES: 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid
또한, 하기 표 10에 체세포배 발생용 기본 배지에 첨가한 다양한 호르몬 조합을 나타내었다.In addition, Table 10 below shows various hormone combinations added to the basic medium for somatic embryogenesis.
다양한 체세포배 발생용 배지에서 캘러스를 4주 동안 배양한 후, 체세포배가 발달한 잎 절편의 수와, 잎 절편당 발생한 체세포배의 수를 측정하여 최적의 호르몬 조합을 선택하였다. 도 1은 메디카고 트런카툴라 유전형 A17 (Medicago truncatula cultivar Jemalong A17) 식물체의 잎 절편을 식물 형질전환용 벡터가 도입된 아그로박테리움 튜메파시엔스로 감염시키고 공동배양 배지 CCM3에서 공동배양한 후, 캘러스 형성용 배지인 CIM3에서 배양하여 캘러스를 형성하고, 형성한 캘러스를 다양한 호르몬 조합의 체세포배 발생용 배지에서 배양하였을 때 체세포배가 발생한 잎 절편의 비율(%)를 나타낸 것이다. 도 2는 메디카고 트런카툴라 유전형 A17 (Medicago truncatula cultivar Jemalong A17) 식물체의 잎 절편을 식물 형질전환용 벡터가 도입된 아그로박테리움 튜메파시엔스로 감염시키고 공동배양 배지 CCM3에서 공동배양한 후, 캘러스 형성용 배지인 CIM3에서 배양하여 캘러스를 형성하고, 형성한 캘러스를 다양한 호르몬 조합의 체세포배 발생용 배지에서 배양하였을 때 잎 절편당 발생한 체세포배의 수를 나타낸 것이다. 도 1 및 도 2에서 보이는 바와 같이 1 μM NAA와 2 μM TDZ의 호르몬 조합을 가진 체세포배 발생용 배지에서 체세포배가 발생한 잎 절편의 비율이 88%이고 잎 절편당 체세포배의 수가 5.1개로 가장 높았다. 이는 다음으로 높은 빈도를 보인 4 μM NAA와 2 μM TDZ의 호르몬 조합을 가진 체세포배 발생용 배지에 비해 현저히 높은 효과이다.After incubating the callus for 4 weeks in various somatic embryogenesis media, the optimal combination of hormones was selected by measuring the number of somatic embryonic leaf segments and the number of somatic embryos generated per leaf segment. 1 is a Medicago Truncatula genotype A17 ( Medicago truncatula cultivar Jemalong A17) plant leaf sections infected with Agrobacterium tumefaciens introduced with a vector for plant transformation, co-cultured in co-culture medium CCM3, callus It shows the ratio (%) of leaf fragments in which somatic embryos occurred when cultured in CIM3, a culture medium, to form a callus, and when the formed callus were cultured in a medium for generating somatic embryos of various hormone combinations. FIG. 2 shows Medicargo Trunkatula genotype A17 ( Medicago truncatula cultivar Jemalong A17) Infect the leaf sections of plants with Agrobacterium tumefaciens introduced with a plant transformation vector, co-culture in co-culture medium CCM3, and incubate in CIM3, a medium for forming callus, to form callus, It shows the number of somatic embryos generated per leaf section when the formed callus was cultured in a medium for generating somatic embryos of various hormone combinations. As shown in Figures 1 and 2, the ratio of leaf sections in which somatic embryos occurred in the somatic embryogenesis medium having a hormone combination of 1 μM NAA and 2 μM TDZ was 88%, and the number of somatic embryos per leaf segment was highest at 5.1. This is a remarkably high effect compared to the medium for somatic embryogenesis with the next high frequency hormone combination of 4 μM NAA and 2 μM TDZ.
도 1 및 도 2에 보이는 결과로부터 1 μM NAA와 2 μM TDZ의 호르몬 조합을 가진 체세포배 발생용 배지를 최적 배지로 선택하고 상기 배지를 EID3으로 명명하였다. 하기 표 11에 최적 체세포배 발생용 배지인 EID3의 구성성분과 농도를 나타내었다.From the results shown in FIGS. 1 and 2, a medium for generating somatic embryos with a hormone combination of 1 μM NAA and 2 μM TDZ was selected as an optimal medium, and the medium was named EID3. Table 11 below shows the components and concentrations of EID3, an optimal somatic embryonic medium.
2. 2. 카나마이신Kanamycin (( KanamycinKanamycin ) 저항성 유전자에 의해 형질전환된 ) Transformed by resistant genes 메디카고Medicargo 트런Trun 카툴라(Katula ( Medicago truncatulaMedicago truncatula ) A17 식물체의 생산) A17 Plant production
(1) 형질전환 유전자 재조합 벡터의 제작 및 재조합 벡터가 도입된 아그로박테리움 (1) Construction of recombinant vector for transforming gene and Agrobacterium introduced with recombinant vector 튜메파시엔스Tumefacience (( AgrobacteriumAgrobacterium tumefacienstumefaciens )의 준비)
카나마이신(Kanamycin) 선발 체계로서, 메디카고 지베렐린(Gibberellin) 분해효소인 GA2-oxidase 10(MtGA2ox10) 유전자의 과발현 벡터를 제작하고, 이를 아그로박테리움 튜메파시엔스 EHA105에 도입하여 메디카고 트런카툴라(Medicago truncatula) A17의 형질전환에 사용하였다. 구체적으로, 먼저 메디카고의 first strand cDNA을 주형으로 하여 MtGA2ox10 유전자를 증폭하고, GatewayTM (Invitrogen, USA) 실험절차에 따라 pDONR221 플라스미드에 클로닝 한 후, 이것을 다시 바이너리 벡터인 pK7WG2D(Karimi et al., 2002)에 재조합한 플라스미드 GA2ox10-OX를 제작하였다. 상기 pK7WG2D 벡터는 식물 선발마커로서 카나마이신(Kanamycin) 저항성 유전자 NPT Ⅱ와 녹색형광단백질(Green fluorescent protein, GFP) 유전자를 지니고 있다. 또한, 상기 MtGA2ox10 유전자를 증폭를 증폭하기 위한 프라이머 및 염기서열은 다음과 같다.As a kanamycin selection system, an overexpression vector of the GA2-oxidase 10 (MtGA2ox10) gene, a Medicago gibberellin degrading enzyme, was produced, and introduced into the Agrobacterium tumefaciens EHA105 to introduce Medicago Truncatula ( Medicago) truncatula ) A17. Specifically, the first strand cDNA of Medicago was used as a template to amplify the MtGA2ox10 gene, cloned into the pDONR221 plasmid according to the GatewayTM (Invitrogen, USA) experiment procedure, and then again, the binary vector pK7WG2D (Karimi et al., 2002 A recombinant plasmid GA2ox10-OX was prepared. The pK7WG2D vector is a plant selection marker and has a kanamycin resistance gene NPT II and a green fluorescent protein (GFP) gene. In addition, primers and nucleotide sequences for amplifying the MtGA2ox10 gene are as follows.
* 순방향 프라이머 : 5'-AAAAAGCAGGCTtcATGATTGACTCAAATCCACC-3'* Forward primer: 5'-AAAAAGCAGGCTtcATGATTGACTCAAATCCACC-3'
* 역방향 프라이머 : 5'-AGAAAGCTGGGTcCTAAGCCATGGTCGTTGTGT-3'* Reverse primer: 5'-AGAAAGCTGGGTcCTAAGCCATGGTCGTTGTGT-3'
이후, 아그로박테리움 튜메파시엔스 EHA105 (Agrobacterium tumefaciens EHA105)에 GA2ox10-OX 플라스미드를 전기천공법으로 도입하고, 항생제인 스펙티노마이신(Spectinomycin)이 100 ㎎/ℓ의 농도로 첨가된 TY/Ca 배지에 접종하고 28℃에서 배양한 후, 공동배양 배지 CCM3에 OD600(Optical Density at 600nm)의 값이 0.5가 되도록 희석하여 아그로박테리움 현탁액을 조제하였다.Subsequently, Agrobacterium tumefaciens EHA105 ( Agrobacterium GA2ox10-OX plasmid was introduced into tumefaciens EHA105) by electroporation, inoculated into TY/Ca medium in which the antibiotic Spectinomycin was added at a concentration of 100 mg/L, incubated at 28° C., and co-cultured. Agrobacterium suspension was prepared by diluting the medium CCM3 to a value of OD600 (Optical Density at 600nm) of 0.5.
(2) (2) 메디카고Medicargo 트런카툴라Truncatula (( MedicagoMedicago truncatulatruncatula ) A17의 잎 절편과 아그로박테리움 ) A17 leaf slice and Agrobacterium 튜메파시엔스Tumefacience (( AgrobacteriumAgrobacterium tumefacienstumefaciens )의 공동배양)
메디카고 트런카툴라 유전형 A17 (Medicago truncatula cultivar Jemalong A17)을 화분에서 약 2개월 동안 키운 후, 잎을 채취하였다. 이후, 채취한 잎을 70% 에탄올에서 1분 동안 교반하여 표면을 소독하였고, 이어서 20% 락스 수용액(유효염소농도는 약 1%임) 및 약간의 Tween-20으로 구성된 용액에 첨가한 후 20분 동안 살균하였다. 이후, 락스 수용액을 제거하고, 멸균 증류수로 잎을 세척하여 잎 표면에 존재하는 락스 성분을 모두 제거하였다. 이후, 살균처리 한 잎의 물기를 종이 타월로 제거하였다. 이후, 메스를 이용하여 한 개의 잎에서 3개씩, 직사각형으로 잎 절편을 제작하였다. 이후, 앞에서 조제한 아그로박테리움 현탁액 현탁액에 잎 절편을 담그고, 진공자에 넣어 20분간 약 20 InHg의 진공을 걸어 감염이 이뤄지도록 하였다. 진공을 해제한 후, 잎 절편에 묻은 아그로박테리움 현탁액을 종이타월에 흡수시켜 일부 제거하고 공동배양 배지 CCM3에 치상하고 22℃의 암 조건에서 3일 동안 공동배양하였다. Medicago Truncatula genotype A17 ( Medicago truncatula After cultivar Jemalong A17) was grown in a pot for about 2 months, the leaves were harvested. Thereafter, the harvested leaves were stirred in 70% ethanol for 1 minute to disinfect the surface, and then added to a solution composed of a 20% aqueous solution of Lax (effective chlorine concentration is about 1%) and a little Tween-20 for 20 minutes. During sterilization. Thereafter, the aqueous lacx solution was removed, and the leaves were washed with sterile distilled water to remove all lacx components present on the surface of the leaves. Thereafter, the leaves of the sterilized leaves were removed with a paper towel. Subsequently, leaf segments were produced in a rectangular shape using a scalpel, one by three. Subsequently, the leaf fragments were immersed in the Agrobacterium suspension suspension prepared above, and then put in a vacuum to apply a vacuum of about 20 InHg for 20 minutes to cause infection. After releasing the vacuum, the Agrobacterium suspension on the leaf section was partially removed by absorbing it on a paper towel, placed in a co-culture medium CCM3 and co-cultured for 3 days at 22° C. in dark conditions.
(3) (3) 캘러스Callus 형성 유도 Induction of formation
상기의 공동배양 후, 잎 절편의 표면에 콜로니를 형성한 아그로박테리움을 제거하고, 캘러스 형성용 배지 CIM3에 치상하여 배 발생 캘러스의 형성을 유도하였다. 구체적으로, 잎 절편 표면의 아그로박테리움을 제거하기 위하여, 잎 절편을 4~5차례 반복하여 멸균증류수에 담그고 교반하여 아그로박테리움을 씻어내고, 300 ㎎/ℓ 농도의 오그멘틴 황산염 수용액에 담그고 실온에서 4 hr 동안 교반하여 항생제가 잎 절편으로 흡수되도록 하였다. 이후, 잎 절편을 종이 타월에 닿게 하여 물기를 제거하고, 40 ㎎/ℓ 농도의 카나마이신(Kanamycin)이 첨가된 캘러스 형성용 배지 CIM3에 치상하고, 약한 광 조건에서 배양하였다. 약 2~3주 후 새로운 배지로 옮겨주었으며, 아그로박테리움이 자라나온 경우는 위의 방법에 따라 아그로박테리움을 제거하고 새로운 배지로 옮겨 주었다. 약 4~6주 후 대부분의 잎 절편에 캘러스가 형성되었다.After the above co-cultivation, Agrobacterium having formed colonies on the surface of leaf sections was removed, and dendritic callus was induced by dendritic formation on callus forming medium CIM3. Specifically, in order to remove the agrobacterium on the surface of the leaf slice, the leaf slice is repeatedly soaked in sterile distilled
(4) (4) 체세포배Somatic embryo 발생 유도 및 형질전환 식물체의 수득 Induction of development and obtaining of transformed plants
캘러스가 형성된 잎 절편 또는 분리한 캘러스 덩어리를 40 ㎎/ℓ 농도의 카나마이신(Kanamycin)이 첨가된 체세포배 발생용 배지 EID3로 옮기고 배양하였다. 그 결과, 체세포배 발생용 배지 EID3에서 배양한 지 약 2주 경과 후, 체세포배의 발달이 관찰되었고, 6~8주 후 2차 배 발생으로 진전되어 다발 내지 군집을 형성하였다. 이후, 일차 체세포배 또는 이차 체세포배의 다발 내지 군집을 50 ㎎/ℓ 농도의 카나마이신(Kanamycin)이 첨가된 식물발달 배지 SDM3으로 옮겨 배양하였고, 그 결과 완전한 식물체로 발달하였다. 도 3은 카나마이신(Kanamycin) 저항성 유전자에 의해 형질전환된 메디카고 트런카툴라(Medicago truncatula) A17 식물체의 생산 과정 중 체세포배 발생 및 식물체로의 발달 과정을 나타낸 것이다. 도 3의 A는 캘러스를 체세포배 발생용 배지 EID3로 옮기고 4주간 배양하였을 때 체세포배가 발생한 모습을 나타낸 것이고, 도 3의 B는 체세포배 발생용 배지 EID3 상에서 발생한 일차 체세포배(primary somatic embryo) 및 이차 배 형성(secondary embryogenesis)이 반복되는 것을 화살표로 표시한 것이고, 도 3의 C는 식물발달 배지 SDM3으로 옮겨 배양하였을 때 발달한 식물체의 모습을 나타낸 것이다.The callus-formed leaf slices or the separated callus lumps were transferred to incubation medium EID3 containing 40mg/L kanamycin and cultured. As a result, after about 2 weeks of culturing in the medium for generating somatic embryos EID3, the development of somatic embryos was observed, and after 6-8 weeks, the development of secondary embryos progressed to form clusters or clusters. Subsequently, the bundles or clusters of primary somatic embryos or secondary somatic embryos were transferred to SDM3, a plant development medium to which 50 mg/L concentration of kanamycin was added, and cultured as a result. FIG. 3 is Medicago Truncatula transformed by Kanamycin resistance gene. truncatula ) A17 shows the process of somatic embryogenesis and development into plants during the production of plants. 3A shows the appearance of somatic embryos when the callus is transferred to somatic embryogenesis medium EID3 and cultured for 4 weeks, and FIG. 3B shows primary somatic embryos generated on somatic embryogenesis medium EID3 and Repeated secondary embryogenesis (secondary embryogenesis) is indicated by arrows, and FIG. 3C shows the appearance of plants developed when transferred to the plant development medium SDM3 and cultured.
줄기와 잎이 완전히 전개되고 뿌리가 발달한 식물체를 화분 토양에 심어 생장시켜 메디카고 트런카툴라(Medicago truncatula) A17의 형질전환 식물체를 수득하였다. 하기 표 12에 식물발달 배지 SDM3의 구성성분과 농도를 나타내었다.It stems and leaves are fully developed and planted to grow the plant roots have developed a planter soil Medicare cargo agent reonka Tula (Medicago A transgenic plant of truncatula ) A17 was obtained. Table 12 below shows the components and concentrations of the plant development medium SDM3.
(5) 식물체의 형질전환 여부 검증(5) Verification of plant transformation
앞에서 수득한 메디카고 트런카툴라(Medicago truncatula) A17의 형질전환 식물체의 형질전환 여부를 형질전환 벡터에 포함된 녹색형광단백질(Green fluorescent protein, GFP)이 식물체에 도입되었는지 여부로 검증하였다. 구체적으로, 수득한 메디카고 트런카툴라(Medicago truncatula) A17의 형질전환 식물체를 형광현미경으로 검사하여 녹색 형광이 나타나는지 여부를 관찰하였다. 또한, 중합효소연쇄반응(PCR)을 이용하여 수득한 메디카고 트런카툴라(Medicago truncatula) A17의 형질전환 식물체로부터 GFP 유전자를 증폭하고 증폭 산물에 GFP 유전자가 존재하는지 여부를 측정하였다. 상기 메디카고 트런카툴라(Medicago truncatula) A17의 형질전환 식물체로부터 GFP 유전자를 증폭하기 위해 사용한 프라이머 및 염기서열은 다음과 같다. Medicago Truncatula obtained earlier The transformation of the transformed plant of truncatula ) A17 was verified by whether the green fluorescent protein (GFP) contained in the transformation vector was introduced into the plant. Specifically, the obtained Medicago Truncatula ( Medicago The transformed plant of truncatula ) A17 was examined with a fluorescence microscope to observe whether green fluorescence appeared. In addition, Medicago Truncatula obtained using polymerase chain reaction (PCR) truncatula ) A17 Amplified the GFP gene from the transgenic plant and measured whether the GFP gene is present in the amplification product. Medicago Truncatula truncatula ) Primers and nucleotide sequences used to amplify the GFP gene from the transformed plant of A17 are as follows.
* 순방향 프라이머 : 5'-TTCATCTGCACCACCGGCAAG-3'* Forward primer: 5'-TTCATCTGCACCACCGGCAAG-3'
* 역방향 프라이머 : 5'-GATCGCGCTTCTCGTTGGGGT-3'* Reverse primer: 5'-GATCGCGCTTCTCGTTGGGGT-3'
(6) 실험 결과(6) Experimental results
도 4는 카나마이신(Kanamycin) 저항성 유전자에 의해 형질전환된 메디카고 트런카툴라(Medicago truncatula) A17 식물체의 생산 과정을 단계별로 나타낸 것이다. 도 4에 나타난 각 단계별 내용은 다음과 같다.4 illustrates a step-by-step transformed Medi cargo agent reonka Tula production of (Medicago truncatula) A17 plant by kanamycin (Kanamycin) resistance gene. The contents of each step shown in FIG. 4 are as follows.
* 단계 A : 메디카고 트런카툴라(Medicago truncatula) A17 식물체의 잎 절편을 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)로 감염시키고 공동배양 배지 CCM3에 치상한 모습이다.* Step A: Medicago Truncatula ( Medicago truncatula ) A17 leaf fragment of Agrobacterium ( Agrobacterium) tumefaciens ) and infected with co-culture medium CCM3.
* 단계 B : 공동배양한 잎 절편을 캘러스 형성용 배지 CIM3로 옮겨 배양하고 캘러스 형성을 유도하는 모습으로서, 위쪽은 배양 2주차 모습이고 아래쪽은 형광현미경으로 녹색형광단백질(Green fluorescent protein, GFP) 형광을 관찰한 모습이다.* Step B: The culture of the co-cultured leaf sections is transferred to CIM3 for the formation of callus and cultured to induce callus formation. The upper side is the 2nd week of culture, and the lower side is a fluorescent microscope to fluoresce green fluorescent protein (GFP). It is the state that observed.
* 단계 C : 캘러스가 형성된 잎 절편을 체세포배 발생용 배지 EID3로 옮겨 배양하였을 때 체세포배가 발생한 모습이다.* Step C: This is the state in which somatic embryos occurred when the callus-formed leaf sections were transferred to EID3 for somatic embryogenesis.
* 단계 D : 체세포배 발생용 배지 EID3 상에서 이차 배 발생이 반복되어 체세포배 다발을 형성한 모습이다.* Step D: This is a state in which secondary embryo development is repeated on the medium EID3 for somatic embryogenesis to form a somatic embryonic bundle.
* 단계 E : 식물발달 배지 SDM3 상에서 식물체 줄기와 잎이 형성된 모습이다.* Step E: Plant stem and leaf are formed on plant development medium SDM3.
* 단계 F : 화분에 심어 생육시킨 카나마이신(Kanamycin) 저항성 유전자에 의해 형질전환된 메디카고 트런카툴라(Medicago truncatula) A17 식물체의 모습이다.* Step F: Medicago Truncatula transformed by Kanamycin resistance gene, planted and grown in pots truncatula ) This is the shape of the A17 plant.
도 5는 카나마이신(Kanamycin) 저항성 유전자에 의해 형질전환된 메디카고 트런카툴라(Medicago truncatula) A17 식물체의 녹색형광단백질(Green fluorescent protein, GFP) 형광을 관찰한 결과이다. 도 5의 A는 형광을 조사하기 전의 모습이고 도 5의 B는 형광현미경으로 관찰한 모습이다. 도 5에서 보이는 바와 같이 형질전환 식물체는 형광현미경 검사에서 잎의 줄기 부분에 뚜렷한 녹색 형광을 나타내었다.Figure 5 shows the observed results of kanamycin (Kanamycin) transformed Medi cargo agent reonka by the resistance genes Tula (Medicago truncatula) green fluorescent protein of the plant A17 (Green fluorescent protein, GFP) fluorescence. 5A is a state before irradiation with fluorescence and FIG. 5B is a state observed with a fluorescence microscope. As shown in Figure 5, the transformed plant showed a clear green fluorescence on the stem part of the leaf under fluorescence microscopy.
도 6은 연쇄중합효소반응(PCR)을 이용하여 카나마이신(Kanamycin) 저항성 유전자에 의해 형질전환된 메디카고 트런카툴라(Medicago truncatula) A17 식물체 내의 녹색형광단백질(Green fluorescent protein, GFP) 유전자를 확인한 결과이다. 도 6에서 보이는 바와 같이 조사 대상 23개의 형질전환 식물체 모두에서 양성 대조시료로 사용한 벡터 플라스미드 GA2ox10-OX와 동일한 514 bp 크기의 증폭 DNA를 나타내었다. 따라서, 모든 식물체에서 형질전환이 일어났음을 알 수 있다.Figure 6 is a Medicago trancatula transformed by Kanamycin resistance gene using a chain polymerase reaction (PCR) ( Medicago truncatula ) This is the result of confirming the green fluorescent protein (GFP) gene in A17 plants. As shown in FIG. 6, amplified DNA having the same size as 514 bp was used as the vector plasmid GA2ox10-OX used as a positive control sample in all 23 transgenic plants under investigation. Therefore, it can be seen that transformation occurred in all plants.
3. 3. 바스타Basta (( BastaBasta ) 저항성 유전자에 의해 형질전환된 ) Transformed by resistant genes 메디카고Medicargo 트런카툴라Truncatula (( Medicago Medicago truncatulatruncatula ) A17 식물체의 생산) A17 Plant production
(1) 형질전환 유전자 재조합 벡터의 제작 및 재조합 벡터가 도입된 아그로박테리움 튜메파시엔스((1) Construction of recombinant vector for transforming gene and Agrobacterium tumefaciens introduced with recombinant vector ( Agrobacterium tumefaciensAgrobacterium tumefaciens )의 준비)
바스타(Basta) 선발 체계로서, CRISPR/Cas9 벡터인 pGK3304 플라스미드를 아그로박테리움 튜메파시엔스 EHA105에 도입하여 메디카고 트런카툴라(Medicago truncatula) A17의 형질전환에 사용하였다. 상기 바스타(Basta)는 글루포시네이트(Glufosinate) 성분의 제초제 상품 브랜드이다. 또한, 상기 pGK3304 플라스미드는 식물 선발마커로서 바스타(Basta) 저항성 유전자 Bar, 녹색형광단백질(Green fluorescent protein, GFP) 유전자 및 Cas9 유전자를 지니고 있다. 아그로박테리움 튜메파시엔스 EHA105 (Agrobacterium tumefaciens EHA105)에 pGK3304 플라스미드를 전기천공법으로 도입하고, 항생제인 스펙티노마이신(Spectinomycin)이 100 ㎎/ℓ의 농도로 첨가된 TY/Ca 배지에 접종하고 28℃에서 배양한 후, 공동배양 배지 CCM3에 OD600(Optical Density at 600nm)의 값이 0.5가 되도록 희석하여 아그로박테리움 현탁액을 조제하였다.As a selection system for Basta, the CRISPR/Cas9 vector, pGK3304 plasmid, was introduced into Agrobacterium tumefaciens EHA105, and Medicara Truncatula ( Medicago truncatula ) A17. The Basta is a herbicide product brand made of glufosinate. In addition, the pGK3304 plasmid is a plant selection marker and has a Basta resistance gene Bar, a green fluorescent protein (GFP) gene, and a Cas9 gene. Agrobacterium tumefaciens EHA105 ( Agrobacterium After introducing pGK3304 plasmid into tumefaciens EHA105) by electroporation, and inoculating the TY/Ca medium in which the antibiotic Spectinomycin was added at a concentration of 100 mg/L and incubating at 28° C., co-culture medium CCM3 The OD600 (Optical Density at 600nm) was diluted to a value of 0.5 to prepare an Agrobacterium suspension.
(2) (2) 메디카고Medicargo 트런카툴라Truncatula (( MedicagoMedicago truncatulatruncatula ) A17의 잎 절편과 아그로박테리움 튜메파시엔스() A17 leaf slice and Agrobacterium tumefaciens( Agrobacterium tumefaciensAgrobacterium tumefaciens )의 공동배양)
메디카고 트런카툴라 유전형 A17 (Medicago truncatula cultivar Jemalong A17)을 화분에서 약 2개월 동안 키운 후, 잎을 채취하였다. 이후, 채취한 잎을 70% 에탄올에서 1분 동안 교반하여 표면을 소독하였고, 이어서 20% 락스 수용액(유효염소농도는 약 1%임) 및 약간의 Tween-20으로 구성된 용액에 첨가한 후 20분 동안 살균하였다. 이후, 락스 수용액을 제거하고, 멸균 증류수로 잎을 세척하여 잎 표면에 존재하는 락스 성분을 모두 제거하였다. 이후, 살균처리 한 잎의 물기를 종이 타월로 제거하였다. 이후, 메스를 이용하여 한 개의 잎에서 3개씩, 직사각형으로 잎 절편을 제작하였다. 이후, 앞에서 조제한 아그로박테리움 현탁액 현탁액에 잎 절편을 담그고, 진공자에 넣어 20분간 약 20 InHg의 진공을 걸어 감염이 이뤄지도록 하였다. 진공을 해제한 후, 잎 절편에 묻은 아그로박테리움 현탁액을 종이타월에 흡수시켜 일부 제거하고 공동배양 배지 CCM3에 치상하고 22℃의 암 조건에서 3일 동안 공동배양하였다. Medicago Truncatula genotype A17 ( Medicago truncatula After cultivar Jemalong A17) was grown in a pot for about 2 months, the leaves were harvested. Thereafter, the harvested leaves were stirred in 70% ethanol for 1 minute to disinfect the surface, and then added to a solution composed of a 20% aqueous solution of Lax (effective chlorine concentration is about 1%) and a little Tween-20 for 20 minutes. During sterilization. Thereafter, the aqueous lacx solution was removed, and the leaves were washed with sterile distilled water to remove all lacx components present on the surface of the leaves. Thereafter, the leaves of the sterilized leaves were removed with a paper towel. Subsequently, leaf segments were produced in a rectangular shape using a scalpel, one by three. Subsequently, the leaf fragments were immersed in the Agrobacterium suspension suspension prepared above, and then put in a vacuum to apply a vacuum of about 20 InHg for 20 minutes to cause infection. After releasing the vacuum, the Agrobacterium suspension on the leaf section was partially removed by absorbing it on a paper towel, placed in a co-culture medium CCM3 and co-cultured for 3 days at 22° C. in dark conditions.
(3) 캘러스 형성 유도(3) Callus formation induction
상기의 공동배양 후, 잎 절편의 표면에 콜로니를 형성한 아그로박테리움을 제거하고, 캘러스 형성용 배지 CIM3에 치상하여 배 발생 캘러스의 형성을 유도하였다. 구체적으로, 잎 절편 표면의 아그로박테리움을 제거하기 위하여, 잎 절편을 4~5차례 반복하여 멸균증류수에 담그고 교반하여 아그로박테리움을 씻어내고, 300 ㎎/ℓ 농도의 오그멘틴 황산염 수용액에 담그고 실온에서 4 hr 동안 교반하여 항생제가 잎 절편으로 흡수되도록 하였다. 이후, 잎 절편을 종이 타월에 닿게 하여 물기를 제거하고, 3 ㎎/ℓ 농도의 바스타(Basta)가 첨가된 캘러스 형성용 배지 CIM3에 치상하고, 약한 광 조건에서 배양하였다. 약 2~3주 후 새로운 배지로 옮겨주었으며, 아그로박테리움이 자라나온 경우는 위의 방법에 따라 아그로박테리움을 제거하고 새로운 배지로 옮겨 주었다. 약 4~6주 후 대부분의 잎 절편에 캘러스가 형성되었다.After the above co-cultivation, Agrobacterium having formed colonies on the surface of leaf sections was removed, and dendritic callus was induced by dendritic formation on callus forming medium CIM3. Specifically, in order to remove the agrobacterium on the surface of the leaf slice, the leaf slice is repeatedly soaked in sterile distilled
(4) 체세포배 발생 유도 및 형질전환 식물체의 수득(4) Inducing somatic embryogenesis and obtaining transformed plants
캘러스가 형성된 잎 절편 또는 분리한 캘러스 덩어리를 5 ㎎/ℓ 농도의 바스타(Basta)가 첨가된 체세포배 발생용 배지 EID3로 옮기고 배양하였다. 그 결과, 체세포배 발생용 배지 EID3에서 배양한 지 약 2주 경과 후, 체세포배의 발달이 관찰되었고, 6~8주 후 2차 배 발생으로 진전되어 다발 내지 군집을 형성하였다. 이후, 일차 체세포배 또는 이차 체세포배의 다발 내지 군집을 5 ㎎/ℓ 농도의 바스타(Basta)가 첨가된 식물발달 배지 SDM3으로 옮겨 배양하였고, 그 결과 완전한 식물체로 발달하였다. 줄기와 잎이 완전히 전개되고 뿌리가 발달한 식물체를 화분 토양에 심어 생장시켜 메디카고 트런카툴라(Medicago truncatula) A17의 형질전환 식물체를 수득하였다. The callus-formed leaf slices or the separated callus lumps were transferred to a medium for generating somatic embryo EID3 to which 5 mg/l concentration of Basta was added and cultured. As a result, after about 2 weeks of culturing in the medium for generating somatic embryos EID3, the development of somatic embryos was observed, and after 6-8 weeks, the development of secondary embryos progressed to form clusters or clusters. Thereafter, the bundle or cluster of primary somatic embryos or secondary somatic embryos was transferred to SDM3, a plant development medium to which 5 mg/L concentration of Basta was added, and cultured as a result. It stems and leaves are fully developed and planted to grow the plant roots have developed a planter soil Medicare cargo agent reonka Tula (Medicago A transgenic plant of truncatula ) A17 was obtained.
(5) 식물체의 형질전환 여부 검증(5) Verification of plant transformation
앞에서 수득한 메디카고 트런카툴라(Medicago truncatula) A17의 형질전환 식물체의 형질전환 여부를 형질전환 벡터에 포함된 녹색형광단백질(Green fluorescent protein, GFP)이 식물체에 도입되었는지 여부로 검증하였다. 구체적으로, 수득한 메디카고 트런카툴라(Medicago truncatula) A17의 형질전환 식물체를 형광현미경으로 검사하여 녹색 형광이 나타나는지 여부를 관찰하였다. 또한, 중합효소연쇄반응(PCR)을 이용하여 수득한 메디카고 트런카툴라(Medicago truncatula) A17의 형질전환 식물체로부터 GFP 유전자를 증폭하고 증폭 산물에 GFP 유전자가 존재하는지 여부를 측정하였다. 상기 메디카고 트런카툴라(Medicago truncatula) A17의 형질전환 식물체로부터 GFP 유전자를 증폭하기 위해 사용한 프라이머 및 염기서열은 다음과 같다. Medicago Truncatula obtained earlier The transformation of the transformed plant of truncatula ) A17 was verified by whether the green fluorescent protein (GFP) contained in the transformation vector was introduced into the plant. Specifically, the obtained Medicago Truncatula ( Medicago The transformed plant of truncatula ) A17 was examined with a fluorescence microscope to observe whether green fluorescence appeared. In addition, Medicago Truncatula obtained using polymerase chain reaction (PCR) truncatula ) A17 Amplified the GFP gene from the transgenic plant and measured whether the GFP gene is present in the amplification product. Medicago Truncatula truncatula ) Primers and nucleotide sequences used to amplify the GFP gene from the transformed plant of A17 are as follows.
* 순방향 프라이머 : 5'-TTCATCTGCACCACCGGCAAG-3'* Forward primer: 5'-TTCATCTGCACCACCGGCAAG-3'
* 역방향 프라이머 : 5'-GATCGCGCTTCTCGTTGGGGT-3'* Reverse primer: 5'-GATCGCGCTTCTCGTTGGGGT-3'
(6) 실험 결과(6) Experimental results
도 7은 바스타(Basta) 저항성 유전자에 의해 형질전환된 메디카고 트런카툴라(Medicago truncatula) A17 식물체의 생산 과정을 단계별로 나타낸 것이다. 도 7에 나타난 각 단계별 내용은 다음과 같다.Figure 7 shows the step-by-step production process of a Medicago truncatula A17 plant transformed with a Basta resistance gene. The contents of each step shown in FIG. 7 are as follows.
* 단계 A : 메디카고 트런카툴라(Medicago truncatula) A17 식물체의 잎 절편을 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)로 감염시키고 공동배양 배지 CCM3에 공동배양한 후 잎 절편을 캘러스 형성용 배지 CIM3로 옮겨 배양하고 캘러스 형성을 유도하는 모습으로서, 위쪽은 배양 2주차 모습이고 아래쪽은 형광현미경으로 녹색형광단백질(Green fluorescent protein, GFP) 형광을 관찰한 모습이다.* Step A: Medicago Truncatula ( Medicago truncatula ) A17 leaf fragment of Agrobacterium ( Agrobacterium) tumefaciens ), and then co-cultured in co-culture medium CCM3, the leaf sections are transferred to CIM3 medium for callus formation and cultured to induce callus formation.The upper side is the second week of culture, and the lower side is a green fluorescent protein (fluorescence microscope) Green fluorescent protein (GFP).
* 단계 B : 캘러스 형성용 배지 CIM3에서 4주간 배양하였을 때 배 발생 캘러스가 형성된 모습(화살표로 표시함)을 나타낸 것이다.* Step B: Shows the appearance of embryonic callus (indicated by an arrow) when cultured for 4 weeks in culture medium for callus formation.
* 단계 C : 캘러스가 형성된 잎 절편을 체세포배 발생용 배지 EID3로 옮겨 4주간 배양하였을 때 체세포배가 발생한 모습이다.* Step C: This is the state in which somatic embryos were formed when the callus-formed leaf sections were transferred to EID3 for somatic embryogenesis and cultured for 4 weeks.
* 단계 D : 체세포배가 발생한 캘러스를 식물발달 배지 SDM3 상에서 옮겨 배양하였을 때 식물체로 발달 중인 모습이다.* Step D: The callus with somatic embryos is being developed as a plant when transferred and cultured on the plant development medium SDM3.
* 단계 E : 화분에 심어 생육시킨 바스타(Basta) 저항성 유전자에 의해 형질전환된 메디카고 트런카툴라(Medicago truncatula) A17 식물체의 모습이다.* Step E: Medicago Truncatula transformed by Basta resistance gene, planted and grown in pots truncatula ) This is the shape of the A17 plant.
도 8은 바스타(Basta) 저항성 유전자에 의해 형질전환된 메디카고 트런카툴라(Medicago truncatula) A17 식물체의 녹색형광단백질(Green fluorescent protein, GFP) 형광을 관찰한 결과이다. 도 8의 A는 형광을 조사하기 전의 모습이고 도 8의 B는 형광현미경으로 관찰한 모습이다. 도 8에서 보이는 바와 같이 형질전환 식물체는 형광현미경 검사에서 잎의 줄기 부분에 뚜렷한 녹색 형광을 나타내었다.8 is a result of observing the Basta (Basta) transformed Medi cargo agent reonka by the resistance genes Tula (Medicago truncatula) green fluorescent protein of the plant A17 (Green fluorescent protein, GFP) fluorescence. 8A is a state before irradiation with fluorescence and FIG. 8B is a state observed with a fluorescence microscope. As shown in Figure 8, the transformed plant showed a distinct green fluorescence on the stem part of the leaf under fluorescence microscopy.
도 9는 연쇄중합효소반응(PCR)을 이용하여 바스타(Basta) 저항성 유전자에 의해 형질전환된 메디카고 트런카툴라(Medicago truncatula) A17 식물체 내의 녹색형광단백질(Green fluorescent protein, GFP) 유전자를 확인한 결과이다. 도 9에서 보이는 바와 같이 조사 대상 23개의 형질전환 식물체 모두에서 양성 대조시료로 사용한 벡터 플라스미드 pGK3304와 동일한 514 bp 크기의 증폭 DNA를 나타내었다. 따라서, 모든 식물체에서 형질전환이 일어났음을 알 수 있다.Figure 9 is a Medicago trancatula transformed by a Basta resistance gene using a chain polymerase reaction (PCR) ( Medicago truncatula ) This is the result of confirming the green fluorescent protein (GFP) gene in A17 plants. As shown in FIG. 9, amplified DNA having the same size of 514 bp as the vector plasmid pGK3304 used as a positive control sample was shown in all 23 transgenic plants under investigation. Therefore, it can be seen that transformation occurred in all plants.
4. 종래 4. Conventional 체세포배Somatic embryo 발생 방법과의 형질전환 효율 비교 Comparison of transformation efficiency with development method
종래 방법 중에서 체세포배 발생 효율이 높고 메디카고 트런카툴라 A17 유전형에 적용이 가능하다고 주장된 방법의 체세포배 발생용 배지 P4 10:4:1:5(Nolan et al., 2014, PLOS ONE, Volume 9, Issue 6, e99908)를 본 발명의 체세포배 발생용 배지인 EID3와 비교하였다. 하기 표 13에 체세포배 발생용 배지 P4 10:4:1:5의 구성성분과 농도를 나타내었다.Somatic embryogenesis medium P4 10:4:1:5 (Nolan et al., 2014, PLOS ONE, Volume) of the method claimed to have a high efficiency of somatic embryogenesis among conventional methods and applicable to the Medicago
* NAA : 1-Naphthaleneacetic acid* NAA: 1-Naphthaleneacetic acid
* BAP : 6-Benzylaminopurine* BAP: 6-Benzylaminopurine
* ABA : Abscisic Acid* ABA: Abscisic Acid
* GA : Gibberellic Acid* GA: Gibberellic Acid
체세포배 발생용 배지 P4 10:4:1:5의 특징은 10 μM NAA 및 4 μM BAP의 호르몬 조합에 체세포배 발생 촉진을 위해서 1 μM ABA와 5 μM의 GA를 추가한 것으로서, 메디카고 트런카툴라 2HA 유전형에서 높은 체세포배 발생 효율을 나타내었고, A17 유전형에도 낮은 효율로 체세포배가 발생한다고 주장된 바 있다.The characteristic of somatic embryogenesis medium P4 10:4:1:5 is the addition of 1 μM ABA and 5 μM GA to promote somatic embryogenesis to the hormone combination of 10 μM NAA and 4 μM BAP. The Tula 2HA genotype showed high somatic embryogenesis efficiency, and the A17 genotype was claimed to have somatic embryogenesis with low efficiency.
종래의 체세포배 발생용 배지 P4 10:4:1:5 와 본 발명의 체세포배 발생용 배지 EID3의 메디카고 트런카툴라 A17에 대한 체세포배 발생 효율을 비교하기 위해 캘러스 형성용 배지로 Nolan et al.에서 사용한 P4 10:4(10 μM NAA, 4 μM BAP)를 사용하고 체세포배 발생용 배지로 Nolan et al.에서 사용한 P4 10:4:1:5를 사용한 것을 제외하고는 앞에서 기술한 방법과 동일한 방법으로 카나마이신(Kanamycin) 저항성 유전자에 의해 형질전환된 메디카고 트런카툴라(Medicago truncatula) A17 식물체 및 바스타(Basta) 저항성 유전자에 의해 형질전환된 메디카고 트런카툴라(Medicago truncatula) A17 식물체를 생산하였다. 종래의 방법과 본 발명의 체세포배 발생 효율을 체세포배가 발생한 잎 절편의 비율(%) 및 잎 절편당 발생한 체세포배의 수로 평가하였다. 도 10은 Nolan et al.의 캘러스 형성용 배지 및 체세포배 발생용 배지를 사용하여 카나마이신(Kanamycin) 저항성 유전자에 의해 형질전환된 메디카고 트런카툴라(Medicago truncatula) A17 식물체를 생산하였을 때와 본 발명의 캘러스 형성용 배지 및 체세포배 발생용 배지를 사용하여 카나마이신(Kanamycin) 저항성 유전자에 의해 형질전환된 메디카고 트런카툴라(Medicago truncatula) A17 식물체를 생산하였을 때의 체세포배 발생을 나타낸 것이다. 도 10에서 왼쪽은 종래의 방법을 사용하였을 때의 결과이고 오른쪽은 본 발명의 방법을 사용하였을 때의 결과이다. 종래 방법으로 카나마이신(Kanamycin) 저항성 유전자에 의해 형질전환된 메디카고 트런카툴라(Medicago truncatula) A17 식물체를 생산하였을 때, 체세포배가 발생한 잎 절편의 비율(%)은 약 8%이고 잎 절편당 발생한 체세포배의 수는 약 0.1개인 것으로 나타났다. 반면, 본 발명의 방법으로 카나마이신(Kanamycin) 저항성 유전자에 의해 형질전환된 메디카고 트런카툴라(Medicago truncatula) A17 식물체를 생산하였을 때, 체세포배가 발생한 잎 절편의 비율(%)은 약 86%이고 잎 절편당 발생한 체세포배의 수는 약 4.78개인 것으로 나타났다. Nolan et al.의 캘러스 형성용 배지 및 체세포배 발생용 배지를 사용하여 바스타(Basta) 저항성 유전자에 의해 형질전환된 메디카고 트런카툴라(Medicago truncatula) A17 식물체를 생산하였을 때와 본 발명의 캘러스 형성용 배지 및 체세포배 발생용 배지를 사용하여 바스타(Basta) 저항성 유전자에 의해 형질전환된 메디카고 트런카툴라(Medicago truncatula) A17 식물체를 생산하였을 때에도 유사한 결과를 보였다. 결과적으로, 본 발명의 체세포배 발생용 배지 EID3는 종래의 체세포배 발생용 배지 P4 10:4:1:5에 비해 약 10배 이상 높은 체세포배 발생 효율을 보였다.Nolan et al as a medium for callus formation to compare the somatic embryogenesis efficiency for Medicago Truncatula A17 of the conventional somatic embryogenesis medium P4 10:4:1:5 and the somatic embryogenesis medium EID3 of the present invention The P4 10:4 (10 μM NAA, 4 μM BAP) used in. And the method described above except that P4 10:4:1:5 used in Nolan et al. was used as a medium for somatic embryogenesis. Medicago Truncatula transformed by Kanamycin resistance gene in the same way truncatula ) A17 plants and Medicago truncatula A17 plants transformed with the Basta resistance gene were produced. The efficiency of somatic embryogenesis of the conventional method and the present invention was evaluated by the ratio (%) of somatic embryogenous leaf sections and the number of somatic embryos generated per leaf segment. FIG. 10 shows the present invention and when the Medicago truncatula A17 plant transformed by Kanamycin resistance gene was produced using Nolan et al. callus forming medium and somatic embryogenesis medium. Medicago transformed by Kanamycin resistance gene using Callus formation medium and somatic embryogenesis medium truncatula ) It shows somatic embryogenesis when A17 plants were produced. In FIG. 10, the left is a result when using the conventional method and the right is a result when using the method of the present invention. Medicago Truncatula transformed by Kanamycin resistance gene in the conventional method truncatula ) When A17 plants were produced, the proportion (%) of somatic embryonic leaf sections was about 8% and the number of somatic embryos per leaf section was about 0.1. On the other hand, when the Medicago truncatula A17 plant transformed with the kanamycin resistance gene by the method of the present invention was produced, the proportion (%) of leaf fragments with somatic embryos was about 86% and leaves The number of somatic embryos per section was found to be about 4.78. When the Medicago truncatula A17 plant transformed by Basta resistance gene was produced using Nolan et al. callus forming medium and somatic embryogenesis medium, and the callus formation of the present invention Medicago Truncatula transformed by Basta resistance gene using medium and somatic embryogenesis medium truncatula ) similar results were also produced when A17 plants were produced. As a result, the somatic embryogenesis medium EID3 of the present invention showed about 10 times higher somatic embryogenesis efficiency than the conventional somatic embryogenesis medium P4 10:4:1:5.
이상에서와 같이 본 발명을 상기의 실시예를 통해 설명하였지만 본 발명이 반드시 여기에만 한정되는 것은 아니며 본 발명의 범주와 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변형실시가 가능함은 물론이다. 따라서, 본 발명의 보호범위는 본 발명에 첨부된 특허청구의 범위에 속하는 모든 실시 형태를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.As described above, the present invention has been described through the above embodiments, but the present invention is not necessarily limited thereto, and various modifications can be made without departing from the scope and spirit of the present invention. Accordingly, the protection scope of the present invention should be construed to include all embodiments falling within the scope of the claims appended to the present invention.
Claims (16)
상기 옥신은 1-나프탈아세트산(1-Naphthaleneacetic acid, NAA)이고 상기 사이토키닌은 티디아주론(Thidiazuron, TDZ)이며,
배지 조성물 총 부피를 기준으로 상기 1-나프탈아세트산의 농도는 0.4~5μM이고 티디아주론의 농도는 1.5~5μM인 것을 특징으로 하는 메디카고속(Medicago) 식물의 체세포배 발생용 배지 조성물.
A medium composition comprising auxin and cytokinin,
The auxin is 1-naphthaleneacetic acid (NAA) and the cytokinin is thidiazuron (TDZ),
Medium composition Based on the total volume of the 1-naphthalic acid concentration of 0.4 ~ 5μM, the concentration of tidiazuron is 1.5 ~ 5μM, Medica high speed ( Medicago ) medium composition for generating somatic embryos of plants.
According to claim 1, Based on the total volume of the medium composition, the concentration of the 1-naphthalic acid is 0.5-4 μM and the concentration of tidiazuron is 1.5-3 μM, somatic embryogenesis of Medicago plants is generated. Dragon medium composition.
According to claim 2, 1-naphthaleneacetic acid (1-Naphthaleneacetic acid, NAA) and thidiazuron (NH 4 )H 2 PO 4 ·H 2 O, KNO 3 , CaCl 2 ·2H 2 O, MgSO 4 · 7H 2 O, Fe-EDTA·3H 2 O, MnSO 4 ·H 2 O, H 3 BO 3 , KI, ZnSO 4 ·7H 2 O, CuSO 4 ·5H 2 O, Na 2 MoO 4 ·2H 2 O, CoCl 2 , 6H 2 O, myo-inositol, nicotinic acid, pyridoxine HCl, thiamine HCl, sucrose, casein hydrolysate, MES[ 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid], calcium gluconate, AVG[L-α-(2-aminoethoxyvinyl)glycine], augmentin (Aoximentin; Amoxicillin clavulanate) and gellan gum Medium composition for somatic embryogenesis of Medicago plants, characterized in that.
According to claim 3, 1-naphthaleneacetic acid (NAA) at a concentration of 0.5 to 4 μM based on the total volume of the medium composition, tidiazuron at a concentration of 1.5 to 3 μM, at a concentration of 200 to 400 mg/l ( NH 4 )H 2 PO 4 ·H 2 O, KNO 3 at a concentration of 2000 to 3000 mg/ℓ, CaCl 2 ·2H 2 O at a concentration of 75 to 275 mg/ℓ, MgSO 4 ·7H at a concentration of 300 to 500 mg/ℓ 2 O, 10 ~ 50 ㎎ / of ℓ concentration of Fe-EDTA · 3H 2 O, 5 ~ 25 ㎎ / MnSO of ℓ concentration of 4 · H 2 O, 1 ~ 15 ㎎ / of ℓ concentration of H 3 BO 3, 0.2 ~ 4 of ㎎ / ℓ concentration of KI, 0.2 ~ 4 ㎎ / ℓ concentration of ZnSO 4 · 7H 2 O, 0.05 ~ 1 ㎎ / of ℓ concentration of CuSO 4 · 5H 2 O, 0.01 ~ 0.25 ㎎ of / ℓ concentration of Na 2 MoO 4 · 2H 2 O, CoCl 2 at a concentration of 0.01 to 0.25 mg/ℓ, 6H 2 O, myo-inositol at a concentration of 10 to 250 mg/ℓ, nicotinic acid at a concentration of 0.1 to 2.5 mg/ℓ, 0.1 Pyridoxine HCl at a concentration of ∼2.5 ㎎/ℓ, Thiamine HCl at a concentration of 1-25 ㎎/ℓ, Sucrose at a concentration of 10 to 35 g/ℓ, 0.1 to 1.5 g/ℓ concentration Casein hydrolysate of MES [2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid] at a concentration of 0.1 to 1.5 g/ℓ, calcium gluconate at a concentration of 0.1 to 1.5 g/ℓ, 0.2 to 2.5 μM Concentrations of AVG [L-α-(2-aminoethoxyvinyl)glycine], augmentin (Augmentin; Amoxicillin clavulanate) at a concentration of 200 to 900 mg/L, and gellan gum at a concentration of 1 to 5 g/L Medica high-speed ( Medicago ) plant medium composition for somatic embryogenesis of plants.
The method of claim 4, wherein the Medicago ( Medicago ) plant Medicago Truncatula ( Medicago truncatula ), characterized in that the Medica Medicago ( Medicago ) plant medium composition for somatic embryogenesis.
The method of claim 5, wherein the Medicago Truncatula is Medicago truncatula genotype A17 ( Medicago truncatula genotype A17), a medium composition for somatic embryogenesis of Medicago plants, characterized in that it is.
상기 공동배양한 외식편을 캘러스 형성용 배지에서 배양하여 캘러스를 형성하는 단계;
상기 캘러스를 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 체세포배 발생용 배지 조성물에서 배양하여 체세포배를 발생시키는 단계; 및
상기 체세포배를 식물체로 발달시키는 단계를 포함하는, 메디카고속 식물의 형질전환 방법.
Co-culturing the explant of Medica high-speed plant with Agrobacterium bacteria into which a transgene has been introduced;
Culturing the co-cultured explants in a callus forming medium to form a callus;
Culturing the callus in a medium composition for generating somatic embryos according to any one of claims 1 to 6 to generate somatic embryos; And
A method of transforming a plant of the Medica genus, comprising the step of developing the somatic embryo into a plant.
[8] The method of claim 7, wherein the explant is a leaf segment.
The method of claim 8, wherein the transformation gene is antibiotic resistance gene, herbicide resistance gene, disease resistance gene, virus resistance gene, stress resistance gene, enzyme biosynthesis gene, recombinant protein expression gene or one or more selected from plant growth promoting gene Medica fast plant transformation method, characterized in that consisting of.
The method of claim 9, wherein the bacterium Agrobacterium is Agrobacterium tumefaciens ( Agrobacterium tumefaciens ).
The method of claim 10, wherein the callus-forming medium is 1-naphthaleneacetic acid (NAA), 6-benzylaminopurine (6-Benzylaminopurine, BAP), (NH 4 )H 2 PO 4 ·H 2 O, KNO 3 , CaCl 2 ·2H 2 O, MgSO 4 ·7H 2 O, Fe-EDTA · 3H 2 O, MnSO 4 ·H 2 O, H 3 BO 3 , KI, ZnSO 4 ·7H 2 O, CuSO 4 5H 2 O, Na 2 MoO 4 ·2H 2 O, CoCl 2 ·6H 2 O, myo-inositol, Nicotinic acid, Pyridoxine HCl, Thiamine HCl, Water Sucrose, Casein hydrolysate, MES[2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid], Calcium gluconate, AVG[L-α-(2-aminoethoxyvinyl)glycine], Augmentin (Augmentin; Amoxicillin clavulanate) and the method of transformation of the plant of the genus Medica, characterized in that it comprises a gellan gum (Gellan gum).
The method of claim 11, wherein the callus-forming medium is 1-naphthaleneacetic acid (NAA) at a concentration of 2-20 μM based on the total volume of the medium composition, 6-benzylaminopurine at a concentration of 1-8 μM (6 -Benzylaminopurine, BAP), (NH 4 )H 2 PO 4 ·H 2 O at a concentration of 200 to 400 mg/ℓ, KNO 3 at a concentration of 2000 to 3000 mg/ℓ, CaCl 2 ·2H at a concentration of 75 to 275 mg/ℓ 2 O, MgSO 4 ·7H 2 O at a concentration of 300 to 500 mg/ℓ, Fe-EDTA·3H 2 O at a concentration of 10 to 50 mg/ℓ, MnSO 4 ·H 2 O, 1 at a concentration of 5 to 25 mg/ℓ. H 3 BO 3 at a concentration of ~15 mg/ℓ, KI at a concentration of 0.2 to 4 mg/ℓ, ZnSO 4 ·7H 2 O at a concentration of 0.2 to 4 mg/ℓ, CuSO 4 ·5H 2 at a concentration of 0.05 to 1 mg/ℓ O, Na 2 MoO 4 ·2H 2 O at a concentration of 0.01 to 0.25 mg/ℓ, CoCl 2 ·6H 2 O at a concentration of 0.01 to 0.25 mg/ℓ, Myo-inositol at a concentration of 10 to 250 mg/ℓ, Nicotinic acid at a concentration of 0.1 to 2.5 mg/ℓ, pyridoxine hydrochloride at a concentration of 0.1 to 2.5 mg/ℓ, thiamine HCl at a concentration of 1 to 25 mg/ℓ, 10 to 35 g/ℓ Sucrose at a concentration, Casein hydrolysate at a concentration of 0.1 to 1.5 g/ℓ, MES[2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid] at a concentration of 0.1 to 1.5 g/ℓ, 0.1 to 1.5 g/ Calcium gluconate at a concentration of ℓ, AVG[L-α-(2-aminoethoxyvinyl)glycine] at a concentration of 0.2 to 2.5 μM, augmentin at 400 to 800 mg/ℓ, and 1~ Medica high-speed plant, characterized in that it contains a gellan gum (Gellan gum) of a concentration of 5 g / ℓ Transformation method.
상기 캘러스를 형질전환 유전자가 도입된 아그로박테리움속 균과 공동배양하는 단계;
상기 공동배양한 캘러스를 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 체세포배 발생용 배지 조성물에서 배양하여 체세포배를 발생시키는 단계; 및
상기 체세포배를 식물체로 발달시키는 단계를 포함하는, 메디카고속 식물의 형질전환 방법.
Culturing the callus by culturing the explant of the Medica high-speed plant in a callus forming medium;
Co-culturing the callus with Agrobacterium bacteria into which a transforming gene has been introduced;
Generating the somatic embryo by culturing the co-cultured callus in the medium composition for generating somatic embryo according to any one of claims 1 to 6; And
A method of transforming a plant of the Medica genus, comprising the step of developing the somatic embryo into a plant.
The method of claim 13, wherein the bacterium Agrobacterium is Agrobacterium tumefaciens ( Agrobacterium tumefaciens ).
15. The method of claim 14, The callus formation medium is 1-naphthaleneacetic acid (NAA), 6-benzylaminopurine (6-Benzylaminopurine, BAP), (NH 4 )H 2 PO 4 ·H 2 O, KNO 3 , CaCl 2 ·2H 2 O, MgSO 4 ·7H 2 O, Fe-EDTA · 3H 2 O, MnSO 4 ·H 2 O, H 3 BO 3 , KI, ZnSO 4 ·7H 2 O, CuSO 4 5H 2 O, Na 2 MoO 4 ·2H 2 O, CoCl 2 ·6H 2 O, myo-inositol, Nicotinic acid, Pyridoxine HCl, Thiamine HCl, Water Sucrose, Casein hydrolysate, MES[2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid], Calcium gluconate, AVG[L-α-(2-aminoethoxyvinyl)glycine], Augmentin (Augmentin; Amoxicillin clavulanate) and the method of transformation of the plant of the genus Medica, characterized in that it comprises a gellan gum (Gellan gum).
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|---|
| Hoori, F. et al., Pakistan Journal of Biological Sciences (2007) 10(3):481-485* * |
| Iantcheva, A. et al., In Vitro Cell.Dev.Biol.-Plant (2014) 50:149-157* * |
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