KR20200072247A

KR20200072247A - 멜라토닌을 이용한 배아 품질 및 착상률 향상 방법

Info

Publication number: KR20200072247A
Application number: KR1020180160215A
Authority: KR
Inventors: 최향순; 뉴잉제; 신경태; 쩌우원쥔
Original assignee: 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2018-12-12
Filing date: 2018-12-12
Publication date: 2020-06-22
Also published as: KR102176125B1

Abstract

본 발명은 체외에서 배양되거나 숙성되는 배아에 멜라토닌을 처리하여 산화적 스트레스에 대한 배아 품질과 착상률을 향상시키는 배아 생산 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 포유동물로부터 분리된 난자로부터 수정란을 제조하는 단계 및, 상기 수정란을 멜라토닌이 포함된 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 멜라토닌을 이용한 배아 품질 및 착상률 향상 방법에 대하여 개시된다.

Description

멜라토닌을 이용한 배아 품질 및 착상률 향상 방법{method of Improving embryo quality and implantation rate using melatonin}

본 발명은 멜라토닌을 이용한 배아 품질 및 착상률 향상 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 멜라토닌을 처리하여 체외 숙성되는 배아를 산화적 스트레스에 대한 배아 품질과 착상률을 향상시키는 배아 생산 방법에 관한 것이다.

일반적으로 난자의 성숙과 배아의 발달은 새로운 생명체의 발생 기반이 된다. 난자의 성숙과 배아의 발달은 암컷의 난소, 난관 등 생식기관에서 일어나는데, 이러한 발생에서 환경적으로 저산소 환경을 이루고 있으며 에너지를 발생시키는 미토콘드리아가 손상되게 되면 난자 및 배아에서 에너지를 생성하기 어려워지며 산화적 스트레스 및 예정 세포사가 발생되어 난자 및 배아의 발달을 크게 저하시킨다.

미토콘드리아는 세포내 소기관에서 에너지를 생성하는 기관으로 외막, 내막, 기질, 크리스타로 이루어져 있으며 외막과 내막 사이에 막사이 공간이 있어 산화적 인산화 반응을 일으키는 중요한 역할을 한다. 주요 에너지 생산기능은 당류, 지방산, 아미노산, 뉴클레오타이드 등과 같은 물질들을 산화적 인산화를 통해 3가지 과정에 의해서 ATP로 전환되고, ATP는 동, 식물의 대사에 매우 중요한 역할을 한다.

이러한 미토콘드리아는 산화적 스트레스에 의해 손상이 일어나게 되면 에너지 생산에 문제가 발생된다. 또한, 미토콘드리아의 손상은 다세포 생물에서 일어나는 계획된 세포 죽음으로써 세포 형태를 변화시키며 세포사(apoptosis)를 발생시키게 된다.

따라서, 체외 배양이 이루어진 배아는 체내에서 보다 산소와의 접촉이 많이 일어나게 되고 이러한 상황에서 산화적 스트레스가 발생된다. 이 산화적 스트레스는 막사이 공간에 존재하는 사이토크롬 C의 방출을 유도하게 되며, 이것이 세포사멸사를 유도시키게 되어 배아의 발생을 저해하게 되어 최종적으로 배아의 질을 떨어뜨린다.

멜라토닌은 생물학적인 반응의 주기와 관련된 분자로, N-아세틸-5-메톡시트립타민(N-Acetyl-5-methoxytryptamine)으로 알려져 있다. 포유동물에서 멜라토닌은 뇌에서 존재하는 송과선으로부터 합성되어 혈액으로 분비된다. 생체 리듬을 조절해 우리 몸이 밤에 잠들게 해준다. 합성량이 너무 많거나 오랜 시간 생체 내에 작용하면 우울증이 발생되고, 반대로 합성량이 적으면 불면증을 유발한다.

체외에서 성숙되는 배아는 체내에서 성숙되는 배아에 비해 산소와의 접촉이 많으며, 이에 따라 산화적 스트레스가 발생된다. 현재 알려진 정보로는 체외에서 배아의 발달 중에 발생한 산화적 스트레스에 의해 배아의 발달이 저해되는 연구 결과들이 보고되고 있으며, 멜라토닌의 경우 멜라토닌이 산화 방지 효과를 갖기 때문에, 체외에서 포유동물의 미성숙 난자의 성숙과 배아가 발달될 때 멜라토닌이 이용된다고 밝혀져 있다.

대한민국 공개특허 제10-2006-0117457호 대한민국 공개특허 제10-2017-0082859호

따라서, 본 발명의 목적은, 배아에 멜라토닌을 처리하여 배아의 품질과 착상률을 향상시킬 수 있는 포유동물 배아 생산 방법을 제공한다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 멜라토닌을 포함하는 배아 생산용 배지 조성물을 제공한다.

전술한 목적을 달성하기 위해 본 발명의 일실시예에 따르면, 포유동물로부터 분리된 난자로부터 수정란을 제조하는 단계 및 상기 수정란을 멜라토닌이 포함된 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 착상률이 증가된 포유동물 배아 생산 방법을 제공한다.

여기서, 상기 배지는 멜라토닌이 10^-6M (1uM)~10^-3M (1mM) 농도일 수 있다.

또한, 상기 포유동물은 돼지, 양, 개, 소, 말 또는 염소 중에 하나일 수 있다.

또한, 상기 배아는 4세포기 내지 배반포기일 수 있다.

본 일실시예에서 배반포 내 미토콘드리아 생합성 촉진 효과를 갖는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 배양은 수정란을 체외 수정용 배지에서 24시간 동안 1차 배양하는 단계 및, 1차 배양된 배양물에서 4세포기 배아를 회수하여, 멜라토닌을 포함하는 배아 배양용 배지에서 2차 배양하는 단계를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 멜라토닌을 포함하는 착상률이 증가된 배아 생산용 배지 조성물을 제공한다.

여기서 배지에 포함된 멜라토닌은 10^-6M (1uM)~10^-3M (1mM) 농도일 수 있다.

전술한 바와 같은 본 발명에 따르면, 산화적 스트레스로부터 보호할 수 있으며, 미토콘드리아 생합성을 촉진하여 미토콘드리아 역할과 기능을 향상시킬 수 있는 효과가 있어, 포유동물 배아의 품질과 착상률을 향상시킬 수 있다.

이상에서의 본 발명에 따른 효과는 상기에 한정되는 것은 아니며, 기타 본 발명의 효과들은 후술할 실시예 및 청구범위에 기재된 사항을 통하여 본 발명이 속하는 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 분명하게 이해될 수 있을 것이다.

도 1은 로테논과 멜라토닌 처리에 따른 체외 성숙 배아의 발달과정을 나타낸 것이다.
도 2는 로테논과 멜라토닌 처리에 다른 체외성숙 2세포기의 발달률을 나타낸 것이다.
도 3은 로테논과 멜라토닌 처리에 따른 체외성숙 4세포기의 발달률을 나타낸 것이다.
도 4는 로테논과 멜라토닌 처리에 따른 체외성숙 배반포기의 발달률을 나타낸 것이다.
도 5는 로테논과 멜라토닌 처리에 따른 체외성숙 배반포기의 배아 직경을 나타낸 것이다.
도 6은 로테논과 멜라토닌 처리에 따른 체외성숙 배반포기의 부화율을 나타낸 것이다.
도 7은 로테논과 멜라토닌 처리에 따른 체외성숙 배반포의 총 세포수를 나타낸 것이다.
도 8은 로테논과 멜라토닌 처리에 따른 배반포의 산화적 스트레스에 미치는 영향을 타나낸 것이다.
도 9는 로테논과 멜라토닌 처리에 따른 배반포 내 미토콘드리아의 수에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 10은 로테논과 멜라토닌 처리에 따른 미토콘드리아의 생합성에 관여하는 유전자들의 mRNA 유전자 발현량을 나타낸 것이다.
도 11은 로테논과 멜라토닌 처리에 따른 SIRT 유전자의 단백질 발현량을 조사한 웨스턴 블롯 결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명에 대하여 보다 상세하게 설명하도록 한다.

본 발명은 멜라토닌을 이용한 배아 품질 및 착상률 향상 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 체외에서 배양되거나 숙성되는 배아에 멜라토닌을 처리하여 산화적 스트레스에 대한 배아 품질과 착상률을 향상시키는 배아 생산 방법에 관한 것이다.

본 발명의 일실시예에 따르면 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)을 감소시키고 배아의 미토콘드리아 생합성을 촉진하여 체외 배양에 따른 산화적 스트레스로부터 배아 품질과 착상률을 향상시킬 수 있도록 한다.

본 발명에서 “착상”은 수정된 배아가 자궁 내벽에 붙어 모체로부터 산소 및 영양분을 받을 수 있는 상태를 의미한다. “착상 전”이라함은 정자와 난자의 결합으로 수정란이 형성되고 영양외배엽과 내부세포피가 발달하는 배반포 단계까지의 시기를 말한다. 종에 따라 미미한 차이가 있으나 일반적으로 수정후 2일째 2 내지 4세포기 형성, 3일째 6 내지 8세포기 4일째 상실배 형성, 5일째 배반포 형성시기로 분류한다.

본 발명에서 “체외성숙” 이라 함은 배아를 성숙화 시키기 위해 체외에서 배양하는 과정을 의미하며, 바람직하게는 착상 전까지 배아를 배양하는 것을 의미할 수 있다.

본 발명에서 배아 배양은 수정초기로부터 착상 전 단계까지 수행될 수 있고, 전핵기, 2세포기, 4세포기, 6세포기, 8세포기, 상실배, 배반포 시기 구분없이 실시할 있으며, 바람직하게는 2세포기 내지 배반포시기이며, 더욱 바람직하게는 4세포기 내지 배반포시기에서 수행될 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.

보다 구체적으로는 본 발명의 일실시예에 따른 착상률이 증가된 포유동물 배아 생산 방법은 포유동물로부터 분리된 난자로부터 수정란을 제조하는 단계 및, 상기 수정란을 멜라토닌이 포함된 배지에서 배양하는 단계를 포함한다.

본 발명에서 “수정란”은 포유동물로부터 분리되는 미성숙 난자를 체외성숙 배양액에서 성숙을 유도하고, 이후 성숙된 난자 배양액에 정자를 첨가하여 체외 수정을 유도하여 이루어질 수 있으며, 이외에 다양한 수정란을 준비할 수 있다. 바람직하게는 수정란 제조는 후행되는 배아 배양과 연속된 과정으로 이루어질 수 있으며, 각각 분리된 과정으로 이루어질 수도 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.

본 발명에서의 배지는 포유동물 배아나 수정란의 배양에 사용되는 기본배지를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 배지는 포유동물의 종에 따라 차이가 있으나, 무기염류, 탄소원, 아미노산, 소 혈청 알부민 및 보조인자로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하며, 당업자에게 알려진 일반적인 배지를 모두 포함한다. 상기 무기염류로는 NaCl, KCl, 및 NaHCO₃ 등을 사용할 수 있고, 탄소원으로는 글루코오스, 나트륨, 피루베이트 및 젖산칼슘염 등을 사용할 수 있으며, 아미노산으로는 글루타민을 비롯한 필수 아미노산 및 비필수 아미노산, 보조인자로는 기타 미량원소 및 완충액 등을 사용할 수 있다. 본 발명에서 배아의 체외성숙을 위해 배양에 사용되는 배지는 항생제를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 배지에 포함되는 멜라토닌의 농도는 특별히 한정되지 않으며 당업자는 포유동물 배아의 생합성을 촉진하여 배아의 품질 향상 또는 착상률 향상을 위한 적합한 농도를 선택 및 결정할 수 있다. 상기 배지에 포함되는 멜라토닌의 농도는 10^-6M (1uM)~10^-3M (1mM) 농도가 바람직하다.

포유동물은 바람직하게는 인간을 제외한 포유동물이다. 여기서, 포유동물은 돼지, 양, 개, 소, 말 또는 염소 중에 하나일 수 있으며, 바람직하게는 소, 돼지, 양이며, 더욱 바람직하게는 돼지이나, 이에 한정하는 것은 아니다.

여기서 상기 배양은 수정란을 체외 수정용 배지에서 24시간 동안 1차 배양하는 단계; 및, 1차 배양된 배양물에서 4세포기 배아를 회수하여, 멜라토닌을 포함하는 배아 배양용 배지에서 2차 배양하는 단계;를 포함한다.

본 발명의 일실시예에 따르면 멜라토닌을 포함하는 착상률이 향상된 배아 생산용 배지 조성물을 제공한다. 여기서 배지 조성물에 포함되는 멜라토닌은 10^-6M (1uM)~10^-3M (1mM) 농도가 바람직하다.

본 발명에 있어 상기 기재한 성분, 멜라토닌을 포함함으로써 배아 배양에서 허용 가능한 배아 배양용 배지 조성물로서 제공할 수 있다.

본 발명에 따르면 배아의 체외성숙을 통해 배아 내 미토콘드리아 생합성 촉진 효과를 가져 배아 품질 및 착상률을 향상시킬 수 있어, 기능적으로 향상된 배아를 제공할 수 있다.

이하, 본 발명의 실시예를 첨부된 도면을 참고하여 보다 상세하게 설명하도록 한다. 그러나, 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 구체화 하기 위한 것일 뿐, 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아닐 것이다.

<실시예 1> 멜라토닌 처리에 따른 체외성숙 배아의 단계별 발달률

멜라토닌이 농도에 따른 체외성숙 배아의 배반포 까지의 발달률을 확인하기 위해, 미성숙 돼지 난자를 정자로 체외 수정을 유도하고, 수정란을 배양 배지에서 배양하였다. 배지는 각각 일반적인 배아 배양 배지, 로테논(Rotenone)을 함유하는 배아 배양 배지, 그리고 로테논과 멜라토닌을 함께 함유하는 배아 배양 배지를 준비하고 수정란의 성숙을 유도하였다. 이후 8일간 배양하면서 배반포까지의 발달률을 조사하였다. 로테논(Rotenone)은 콩과식물 데리스(Derris elliptica)의 뿌리에서 얻어지는 화학식물로써 전자전달계 복합체Ⅰ에서 유비퀴논으로 전자가 이동하는 것을 방해한다. NADH는 전자전달계 복합체Ⅰ으로 전자를 전달할 수가 없게 됨으로써 NAD+를 재생산 할 수 없어서 TCA회로가 돌지 않게 되고 최종적으로는 에너지를 생성하기 어려워지게 된다. 선행 연구에서는 T98G cell에서 로테논이 ATP 생성과 활성산소영역 형성, 미토콘드리아 막전위에 부정적인 영향을 끼친다고 알려져 있다.

도 1은 로테논과 멜라토닌 처리에 따른 체외 성숙 배아의 발달과정을 보여준다. 로테논을 처리한 그룹에서 배아의 발달률이 감소한 것을 확인할 수 있었으며, 로테논과 멜라토닌을 함께 처리하였을 때, 대조군과 같이 발달률이 회복되는 것이 확인되었다.

도 2는 로테논과 멜라토닌 처리에 다른 체외성숙 2세포기의 발달률을 나타낸 것이다. 로테논과 멜라토닌 처리에 따른 체외 성숙 2-세포기의 발달률에서 로테논을 처리한 그룹, 로테논과 멜라토닌을 함께 처리한 그룹은 대조군과 비교하여 유의적인 차이가 나타나지 않았음을 확인하였다.

도 3은 로테논과 멜라토닌 처리에 따른 체외성숙 4세포기의 발달률을 나타낸 것이다. 로테논을 처리한 그룹은 대조군과 비교하여 사세포기 발달률이 유의적으로 감소하였으며, 로테논과 멜라토닌을 함께 처리한 그룹은 로테논을 단독으로 처리한 그룹과 비교하여 4세포기 발달률이 유의적으로 증가하였다.

도 4는 로테논과 멜라토닌 처리에 따른 체외성숙 배반포기의 발달률을 나타낸 것이다. 로테논을 단독으로 처리한 그룹은 대조군과 비교하여 배반포기의 발달률이 유의적으로 감소하였으며, 로테논과 멜라토닌을 함께 처리한 그룹은 로테논을 단독으로 처리한 그룹에 비교하여 배반포기의 발달률이 유의적으로 증가하였다.

도 5는 로테논과 멜라토닌 처리에 따른 체외성숙 배반포기의 배아 직경을 나타낸 것이다. 로테논을 단독으로 처리한 그룹은 대조군과 비교하여 배반포의 직경이 유의적으로 감소하였으며 로테논과 멜라토닌을 함께 처리한 그룹은 로테논을 단독으로 처리한 그룹에 비교하여 배반포의 직경이 유의적으로 증가하였다.

도 6은 로테논과 멜라토닌 처리에 따른 체외성숙 배반포기의 부화율을 나타낸 것이다. 로테논을 처리한 그룹은 대조군과 비교하여 부화율이 유의적으로 감소하였으며, 로테논과 멜라토닌을 함께 처리한 그룹은 로테논을 단독으로 처리한 그룹에 비교하여 부화율이 유의적으로 증가하였다.

도 7은 로테논과 멜라토닌 처리에 따른 체외성숙 배반포의 총 세포수를 나타낸 것이다. 로테논을 단독 처리한 그룹은 대조군과 비교하여 배반포의 총 세포 수가 유의적으로 감소하였으며, 로테논과 멜라토닌을 함께 처리한 그룹은 로테논을 단독으로 처리한 그룹에 비교하여 배반포의 총 세포 수가 유의적으로 증가하였다.

<실시예 2> 멜라토닌 처리에 따른 체외성숙 배아의 산화적 스트레스 보호

멜라토닌 처리에 따른 체외성숙 배아의 산화적 스트레스에 대한 보호효과를 확인하기 위하여, 미성숙 소 수정란을 체외성숙 배아 배지에서 체외성숙을 유도하였으며, 산화적 스트레스를 유발하기 위하여 로테닌을 단독으로 처리한 군과 로테닌과 멜라토닌을 함께 처리한 군을 비교하였다.

도 8은 로테논과 멜라토닌 처리에 따른 배반포의 산화적 스트레스에 미치는 영향을 타나낸 것이다. 로테논을 단독으로 처리한 그룹은 대조군과 비교하여 산화적 스트레스가 유의적으로 증가하였으며, 로테논과 멜라토닌을 함께 처리한 그룹은 로테논을 단독으로 처리한 그룹에 비교하여 ROS(Reactive oxygen species) 영향이 유의적으로 감소하였다.

<실시예 3> 멜라토닌 처리에 따른 체외성숙 배아의 미토콘드리아 생합성 촉진

멜라토닌이 미토콘드리아에 미치는 영향을 확인하기 위하여 로테논과 멜라토닌 처리에 따른 배반포에서 mtDNA 복제 수, 미토콘드리아 관련 유전자 발현량 및, SIRT 유전자의 단백질 발현량을 확인하였다.

도 9는 로테논과 멜라토닌 처리에 따른 배반포 내 미토콘드리아의 수에 미치는 영향을 나타낸 것으로 로테논을 처리한 그룹은 대조군과 비교하여 배반포 내 미토콘드리아 수가 유의적으로 감소하였으며, 로테논과 멜라토닌을 함께 처리한 그룹은 로테논을 단독으로 처리한 그룹에 비교하여 배반포 내 미토콘드리아의 수가 유의적으로 증가하였다.

도 10은 로테논과 멜라토닌 처리에 따른 미토콘드리아의 생합성에 관여하는 유전자들의 mRNA 유전자 발현량을 나타낸 것이다. 로테논을 처리한 그룹은 대조군과 비교하여 PGC1α, TFAM, NRF1, POLG mRNA 발현량이 유의적으로 감소하였으며, 로테논과 멜라토닌을 함께 처리한 그룹은 로테논을 단독으로 처리한 그룹과 비교하여 PGC1α, TFAM, NRF1, POLG mRNA 발현량이 유의적으로 증가하였다.

도 11은 로테논과 멜라토닌 처리에 따른 SIRT 유전자의 단백질 발현량을 조사한 웨스턴 블롯 결과를 나타낸 것이다. 로테논을 단독으로 처리한 그룹은 대조군과 비교하여 SIRT1 유전자의 단백질 발현량이 감소하였으며 로테논과 멜라토닌을 함께 처리한 그룹은 로테논을 처리한 그룹에 비교하여 SIRT1 유전자의 단백질 발현량이 증가하였다.

이를 통해 본 실시예에서는 멜라토닌이 미토콘드리아 생합성을 촉진함으로써, 미토콘드리아의 ATP 생성 기능, 세포 유지기능을 향상시킬 수 있음을 확인하였다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 구체적인 실시예를 상세하게 설명되었으나, 본 발명의 사상을 이해하는 당업자는 동일한 사상의 범위 내에서 다른 구성요소를 추가, 변경, 삭제 등을 통하여, 퇴보적인 다른 발명이나 본 발명 사상의 범위 내에 포함되는 다른 실시예를 용이하게 제안할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상술한 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구의 범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구의 범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

포유동물로부터 분리된 난자로부터 수정란을 제조하는 단계; 및
상기 수정란을 멜라토닌이 포함된 배지에서 배양하는 단계; 를 포함하는, 착상률이 증가된 포유동물 배아 생산 방법.
제1항에 있어서,
상기 배지는 멜라토닌이 10^-6M (1uM)~10^-3M (1mM) 농도인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 포유동물은 돼지, 양, 개, 소, 말 또는 염소 중에 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 배아는 4세포기 내지 배반포기인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 방법은 배반포 내 미토콘드리아 생합성 촉진 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 배양은 수정란을 체외 수정용 배지에서 24시간 동안 1차 배양하는 단계; 및
1차 배양된 배양물에서 4세포기 배아를 회수하여, 멜라토닌을 포함하는 배아 배양용 배지에서 2차 배양하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
멜라토닌을 포함하는 착상률이 증가된 배아 생산용 배지 조성물.
제6항에 있어서,
멜라토닌은 10^-6M (1uM)~10^-3M (1mM) 농도인 것을 특징으로 하는 배지 조성물.