KR20200061235A - Method for preparing ischemic brain disease model based on brain organoid and use thereof - Google Patents

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Abstract

The present invention relates to a method for manufacturing an ischemic brain disease model based on brain organoids. The method applies a technique of manufacturing and culturing brain organoids by using human embryonic stem cells, so that the technique is commercially available worldwide. Therefore, it is possible to efficiently manufacture the ischemic brain disease model based on brain organoids.

Description

뇌 오가노이드를 기반으로 하는 허혈성 뇌질환 모델의 제조방법 및 이의 용도{Method for preparing ischemic brain disease model based on brain organoid and use thereof}Method for preparing ischemic brain disease model based on brain organoid and use thereof

뇌 오가노이드를 기반으로 하는 허혈성 뇌질환 모델의 제조방법에 관한 것이다.It relates to a method of manufacturing an ischemic brain disease model based on brain organoids.

허혈성 뇌졸중이란 고혈압, 당뇨병, 고지혈증, 흡연 등에 의해 손상된 혈관 내벽에 콜레스테롤이 침착되어 뇌혈관을 점차 좁게 만들어 혈액의 흐름을 방해함으로써 발생하며 혈전에 의해 혈관이 막혀 뇌 조직이 손상될 경우 내과적 치료법이 없는 대표적인 난치성 뇌질환이다. Ischemic stroke is caused by cholesterol deposits on the inner wall of blood vessels damaged by hypertension, diabetes, hyperlipidemia, smoking, etc., which gradually narrows the cerebral blood vessels and interferes with the flow of blood. There is no typical intractable brain disease.

전 세계적으로 허혈성 뇌졸중 예방 및 치료제 개발의 필요성이 강조되고 있으나 허혈성 뇌졸중 예방 및 치료제를 검증할 수 있는 적절한 허혈성 뇌졸중 동물모델이 없는 실정이다. 현재, 허혈성 뇌졸중 예방 및 치료제 후보물질의 스크리닝에 사용되고 있는 허혈성 뇌졸중 모델은 신경세포(neuron cell)에 산소와 글루코스를 결핍시킨 후 약물을 처리하여 세포사멸을 관찰하는 신경세포 모델(in vitro)과 마우스나 랫트의 뇌에 필라멘트(filament)를 삽입하여 혈류를 차단시키는 동물 모델(in vivo)가 가장 많이 이용되고 있다. 그러나 산소 및 글루코스 결핍 세포 모델은 2차원적인 세포 모델로서 3차원의 뇌조직을 구현하지 못한다는 문제점이 있고, 뇌혈류 차단 동물 모델은 동물의 뇌와 인간의 뇌 사이의 약물 효능 차이점으로 인해 약제를 대량으로 스크리닝 하기에 부적합하다는 문제점이 있다. The need for the development and treatment of ischemic stroke has been emphasized worldwide, but there is no suitable ischemic stroke animal model that can verify and prevent the ischemic stroke. Currently, the ischemic stroke model used for screening candidates for ischemic stroke prevention and treatment is a neuronal cell model (in vitro) and a mouse that observes cell death by treating drugs after depleting oxygen and glucose in neurons. Animal models that block blood flow by inserting a filament into the brain of a rat are most frequently used. However, the oxygen and glucose-deficient cell model is a two-dimensional cell model, which has a problem that it cannot implement a three-dimensional brain tissue, and the brain blood-blocking animal model uses drugs due to differences in drug efficacy between the animal brain and the human brain. There is a problem that it is unsuitable for screening in large quantities.

따라서, in vivo physiology의 특징을 가지고 있으면서 약제를 대량으로 스크리닝 하기에 적합한 허혈성 뇌졸중 모델을 개발할 필요성이 있다. Therefore, there is a need to develop an ischemic stroke model that is suitable for screening a large amount of drugs while having the characteristics of in vivo physiology.

일 양상은 줄기세포를 3차원 배양하여 뇌 오가노이드를 제조하는 단계; 및 상기 뇌 오가노이드에서 허혈성 뇌조직의 손상을 발생시키는 단계를 포함하는 허혈성 뇌질환 모델의 제조방법을 제공하는 것이다. One aspect is a three-dimensional culture of stem cells to produce brain organoids; And it is to provide a method of manufacturing an ischemic brain disease model comprising the step of generating damage to the ischemic brain tissue in the brain organoid.

다른 양상은 상기 방법에 의해 제조된 허혈성 뇌질환 모델을 제공하는 것이다. Another aspect is to provide an ischemic brain disease model produced by the above method.

다른 양상은 상기 허혈성 뇌질환 모델에 시험 물질을 접촉시키는 단계; 및 상기 시험 물질이 처리된 허혈성 뇌질환 모델에서 LDH(Lactate dehydrogenase) 단백질의 발현 수준을 대조군 모델과 비교하는 단계를 포함하는 허혈성 뇌질환의 예방 또는 치료제를 스크리닝 하는 방법을 제공하는 것이다. Another aspect includes contacting a test substance to the ischemic brain disease model; And comparing the expression level of LDH (Lactate dehydrogenase) protein with the control model in the ischemic brain disease model treated with the test substance, to provide a method for screening for the prevention or treatment of ischemic brain disease.

일 양상은 줄기세포를 3차원 배양하여 뇌 오가노이드를 제조하는 단계; 및 상기 뇌 오가노이드에서 허혈성 뇌조직의 손상을 발생시키는 단계를 포함하는 허혈성 뇌질환 모델의 제조방법을 제공한다. One aspect is a three-dimensional culture of stem cells to produce brain organoids; And generating an ischemic brain tissue damage in the brain organoid.

본 명세서 내 용어, "오가노이드(organoid)"란 3D 입체구조를 가지는 세포덩어리를 의미하며 동물 등에서 수집, 취득하지 않은 인공적인 배양과정을 통해 제조한 축소되고 단순화된 버전의 기관을 의미한다. 상기 오가노이드는 성체줄기세포(adult stem cell, ASC), 배아줄기세포(embryonic stem cell, ESC) 또는 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPSC) 등의 줄기세포에서 유래될 수 있으며 자가재생 및 분화능력으로 인해 3차원으로 배양될 수 있다. 상기 오가노이드는 세포의 성장 과정에서 주변 환경과 상호 작용하도록 허용되는 환경을 가질 수 있다. As used herein, the term "organoid" refers to a cell mass having a 3D conformation and refers to a reduced and simplified version of an organ manufactured through an artificial culture process that has not been collected and obtained from animals or the like. The organoid may be derived from stem cells such as adult stem cells (ASC), embryonic stem cells (ESC) or induced pluripotent stem cells (iPSC), and may be self-renewal and self-renewal. It can be cultured in three dimensions due to its differentiation ability. The organoid may have an environment that is allowed to interact with the surrounding environment during the cell growth process.

일 양상에 따른 방법은 줄기세포를 3차원 배양하여 뇌 오가노이드를 제조하는 단계를 포함한다. 상기 뇌 오가노이드의 제조는 공지된 방법에 따라 수행될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 방법은 줄기세포 또는 전구세포를 3차원으로 배양함으로써 오가노이드를 유도하는 것일 수 있다. 이 과정에서 3차원 배양 지지체로는 Engelbreth-Holm-Swarm tumor line에 의해 분비되는 라미닌(laminin)이 풍부한 세포 외 기질인 마트리겔(Matrigel)이 사용된다.　이후 마트리겔에 줄기세포를 삽입하여 배양함으로써 오가노이드를 이루는 유기체를 만들 수 있다. 전분화능 줄기세포(Pluripotent stem cell)가 장기 유사체의 형성을 위해 사용될 때, 세포는 특이적으로 배아체(Embryoid body)를 형성한다. 그리고 이러한 배아체는 장기 형성에 있어 삼배엽 형성(Tree germ layers)에 관여하여 실제 장기와 유사한 특성을 부여한다. 또한 장기 유사체는 타겟 기관에서 추출한 성체줄기세포를 이용하여 만들어지고 3D 마트리겔 지지체에서 배양할 수도 있다. The method according to one aspect includes the step of culturing the stem cells in three dimensions to prepare a brain organoid. The brain organoid may be prepared according to a known method. In one embodiment, the method may be to induce organoids by culturing stem cells or progenitor cells in three dimensions. In this process, as the three-dimensional culture support, Matrigel, an extracellular matrix rich in laminin secreted by the Engelbreth-Holm-Swarm tumor line, is used. Then, by inserting and culturing stem cells into the matrigel, an organism constituting an organoid can be made. When Pluripotent stem cells are used for the formation of organ analogs, the cells specifically form an embryoid body. In addition, these embryos are involved in the formation of three germ layers (Tree germ layers) in organ formation, thereby giving characteristics similar to those of an actual organ. In addition, long-term analogs can be made using adult stem cells extracted from target organs and cultured on 3D Matrigel scaffolds.

일 양상에 따른 방법은 상기 뇌 오가노이드에서 허혈성 뇌조직의 손상을 발생시키는 단계를 포함한다. The method according to one aspect includes the step of generating damage to ischemic brain tissue in the brain organoid.

일 구체예에서, 상기 뇌 오가노이드를 0.5 내지 10% 농도의 산소 챔버(chamber)에서 배양하는 것일 수 있다. 예를 들어, 산소의 농도는 0.5 내지 10%, 0.5 내지 8%, 0.5 내지 6%, 1 내지 10%, 1 내지 8%, 1 내지 6%, 또는 2 내지 3.5%일 수 있다. 이때, 산소의 농도가 상기 범위 미만인 경우, 세포 사멸이 심각하게 발생하여 세포 독성이 나타나는 문제점이 있으며 상기 범위를 초과하는 경우, 허혈성 산소 결핍이 충분히 일어나지 않아 적절한 모델의 구축이 어렵다는 문제점이 있다. 또한, 상기 뇌 오가노이드를 상기 배지에서 4 내지 16시간 동안 배양하는 것일 수 있다. 예를 들어, 배양 시간은 4 내지 16시간, 4 내지 14시간, 4 내지 12시간, 4 내지 10시간, 6 내지 16시간, 6 내지 14시간, 6 내지 12시간, 또는 7 내지 8시간일 수 있다. 이때, 배양 시간이 상기 범위 미만인 경우, 허혈성 산소 결핍이 충분히 일어나지 않아 적절한 모델의 구축이 어렵다는 문제점이 있으며 상기 범위를 초과하는 경우, 세포 사멸이 심각하게 발생하여 세포 독성이 나타나는 문제점이 있다. In one embodiment, the brain organoid may be cultured in an oxygen chamber at a concentration of 0.5 to 10%. For example, the concentration of oxygen may be 0.5 to 10%, 0.5 to 8%, 0.5 to 6%, 1 to 10%, 1 to 8%, 1 to 6%, or 2 to 3.5%. At this time, when the concentration of oxygen is less than the above range, there is a problem in that cell death occurs seriously, resulting in cytotoxicity, and when it exceeds the above range, there is a problem that it is difficult to construct an appropriate model because ischemic oxygen deficiency does not occur sufficiently. In addition, the brain organoid may be cultured in the medium for 4 to 16 hours. For example, the culture time may be 4 to 16 hours, 4 to 14 hours, 4 to 12 hours, 4 to 10 hours, 6 to 16 hours, 6 to 14 hours, 6 to 12 hours, or 7 to 8 hours. . At this time, if the incubation time is less than the above range, there is a problem that it is difficult to construct an appropriate model due to insufficient ischemic oxygen deficiency, and if it exceeds the above range, apoptosis occurs seriously and cytotoxicity occurs.

다른 구체예에서, 상기 뇌 오가노이드를 글루코스가 포함되지 않은 배지에서 배양하는 것일 수 있다. 상기 글루코스는 세포의 에너지원 역할을 하는데, 글루코스가 포함되지 않은 배지에서 상기 뇌 오가노이드를 배양함으로써, 허혈성 뇌 손상시에 나타날 수 있는 글루코스 결핍 상태를 재현할 수 있다. 또한, 상기 뇌 오가노이드를 상기 배지에서 6 내지 12시간 동안 배양하는 것일 수 있다. 상기 뇌 오가노이드의 배양 시간은 예를 들어, 6 내지 12시간, 6 내지 11시간, 6 내지 10시간, 6 내지 8시간, 6 내지 7시간, 7 내지 11시간, 8 내지 10시간, 또는 8 내지 9시간일 수 있다. 이때, 배양 시간이 상기 범위 미만인 경우, 허혈성 산소 결핍이 충분히 일어나지 않아 적절한 모델의 구축이 어렵다는 문제점이 있으며 상기 범위를 초과하는 경우, 세포 사멸이 심각하게 발생하여 세포 독성이 나타나는 문제점이 있다. In another embodiment, the brain organoid may be cultured in a medium containing no glucose. The glucose serves as an energy source of cells, and by culturing the brain organoid in a medium that does not contain glucose, it is possible to reproduce a glucose deficiency state that may occur during ischemic brain injury. In addition, the brain organoid may be cultured in the medium for 6 to 12 hours. The incubation time of the brain organoid is, for example, 6 to 12 hours, 6 to 11 hours, 6 to 10 hours, 6 to 8 hours, 6 to 7 hours, 7 to 11 hours, 8 to 10 hours, or 8 to It can be 9 hours. At this time, if the incubation time is less than the above range, there is a problem that it is difficult to construct an appropriate model because ischemic oxygen deficiency does not occur sufficiently, and if it exceeds the above range, there is a problem in that cell death occurs seriously and cytotoxicity occurs.

일 양상에 따른 방법은 상기 오가노이드에 재관류 손상(Reperfusion Injury)를 유발하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. The method according to one aspect may further include a step of causing reperfusion injury to the organoid.

본 명세서 내 용어 "재관류 손상(Reperfusion Injury)"이란 막힌 뇌동맥을 다시 여는 뇌졸중 치료 후, 혈류가 급속히 재개되는 재관류 과정에서 세포와 조직에 손상이 발생하는 것을 의미하며, 허혈성 재관류 손상(Ischemia-reperfusion Injury)이라고도 한다. 상기 손상은 미토콘드리아의 손상, 산화 파괴, 염증 등이 주요 원인이 된다. The term "Reperfusion Injury" in the present specification means damage to cells and tissues during a reperfusion process in which blood flow rapidly resumes after a stroke treatment that reopens a blocked cerebral artery, and ischemic-reperfusion injury. Also known as ). The damage is mainly caused by damage to mitochondria, oxidative destruction, inflammation, and the like.

상기 재관류 손상은 정상 산소 농도의 CO2 인큐베이터에서 상기 뇌 오가노이드를 배양함으로써 유발시킬 수 있다. 상기 배양은 예를 들어 12 내지 24시간, 12 내지 22시간, 12 내지 20시간, 12 내지 17시간, 12 내지 15시간, 15 내지 24시간, 15 내지 20시간, 또는 17 내지 24시간 동안 수행될 수 있다. 이때, 배양 시간이 상기 범위 미만인 경우, 혀혈성 재관류의 손상을 충분히 재현할 수 없다는 문제점이 있으며 상기 범위를 초과하는 경우, 인 문제점이 있다. The reperfusion injury can be caused by culturing the brain organoid in a CO 2 incubator at a normal oxygen concentration. The culture may be performed for, for example, 12 to 24 hours, 12 to 22 hours, 12 to 20 hours, 12 to 17 hours, 12 to 15 hours, 15 to 24 hours, 15 to 20 hours, or 17 to 24 hours have. At this time, when the incubation time is less than the above range, there is a problem that damage to the tongue reperfusion cannot be sufficiently reproduced, and if it exceeds the above range, there is a phosphorus problem.

다른 양상은 상기 방법에 의해 제조된 허혈성 뇌질환 모델을 제공한다. 상기 뇌질환은 뇌졸중, 뇌증후군, 뇌혈전증, 뇌출혈 또는 심정지 이후 재혈류에 의한 허혈성 상태에서 나타나는 뇌질환인 것일 수 있다. Another aspect provides an ischemic brain disease model prepared by the above method. The brain disease may be a brain disease that occurs in an ischemic state due to reflow after stroke, brain syndrome, cerebral thrombosis, brain hemorrhage, or cardiac arrest.

상기 허혈성 뇌질환 모델은 종래 신경세포 모델 및 뇌혈류 차단 동물모델의 단점을 극복한 모델로서, 제조과정이 비교적 간단할 뿐만 아니라, 약제의 대량 스크리닝이 가능하므로 허혈성 뇌질환의 예방 및/또는 치료제 개발에 플랫폼으로 사용될 수 있다. The ischemic brain disease model is a model that overcomes the shortcomings of the conventional neuronal cell model and cerebral blood flow blocking animal model. In addition, the manufacturing process is relatively simple, and since it is possible to screen large amounts of drugs, it is possible to prevent and/or develop therapeutic agents for ischemic brain disease. Can be used as a platform on.

다른 양상은 상기 허혈성 뇌질환 모델에 시험 물질을 접촉시키는 단계; 및 상기 시험 물질이 처리된 허혈성 뇌질환 모델에서 LDH(Lactate dehydrogenase)의 발현 수준 또는 단백질의 활성 수준을 대조군 모델과 비교하는 단계를 포함하는 허혈성 뇌질환의 예방 또는 치료제를 스크리닝 하는 방법을 제공한다. 상기 허혈성 뇌질환 모델의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다. Another aspect includes contacting a test substance to the ischemic brain disease model; And comparing the expression level of LDH (Lactate dehydrogenase) or the activity level of the protein with the control model in the ischemic brain disease model treated with the test substance, and provides a method for screening for the prevention or treatment of ischemic brain disease. Details of the ischemic brain disease model are as described above.

일 양상에 따른 방법은 허혈성 뇌질환 모델에 시험 물질을 접촉시키는 단계를 포함한다. 상기 시험 물질은 허혈성 뇌질환의 치료에 효과를 나타낼 것으로 기대되는 물질로서, 예를 들어, 임의의 물질(substance), 분자(molecule), 원소(element), 화합물(compound), 실재물(entity) 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질, 폴리펩티드, 저분자 유기화합물(small organic molecule), 다당류(polysaccharide), 폴리뉴클레오티드 등을 포함할 수 있다. 또한, 자연 산물(natural product), 합성 화합물 또는 화학 화합물 또는 2개 이상의 물질의 조합일 수 있다.The method according to one aspect comprises contacting the test substance with an ischemic brain disease model. The test substance is a substance expected to have an effect on the treatment of ischemic brain disease, for example, any substance, molecule, element, compound, entity, or Combinations of these. For example, it may include proteins, polypeptides, small organic molecules, polysaccharides, polynucleotides, and the like. It can also be a natural product, a synthetic compound or a chemical compound, or a combination of two or more substances.

일 양상에 따른 방법은 상기 시험 물질이 처리된 허혈성 뇌질환 모델에서 LDH의 발현 수준 또는 단백질의 활성 수준을 대조군 모델과 비교하는 단계를 포함한다. 이때, 상기 LDH 단백질의 활성 수준이 대조군에 비해 감소한 경우, 상기 시험 물질이 허혈성 뇌질환의 예방 또는 치료제인 것으로 판단할 수 있다. 상기 활성 수준의 변화는 상기 허혈성 뇌질환 모델에서의 단백질 활성 수준이 대조군 모델이 비하여 유사한 수준 또는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900% 및 1000% 이상 감소하는 것을 포함할 수 있다.The method according to one aspect includes comparing the expression level of LDH or the activity level of a protein with a control model in the ischemic brain disease model treated with the test substance. At this time, when the activity level of the LDH protein is reduced compared to the control group, it can be determined that the test substance is a preventive or therapeutic agent for ischemic brain disease. The change in the activity level is similar to the level of protein activity in the ischemic brain disease model compared to the control model or 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40% , Including 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900% and 1000% or more reduction can do.

상기 LDH의 발현 수준을 측정하는 단계는 당업계에서 공지된 다양한 방법을 통해 수행될 수 있으며, 예를 들어, 웨스턴 블롯팅(western blotting), 닷 블롯팅(dot blotting), 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbent assay), 방사능 면역분석법(RIA), 방사면역확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역 전기영동, 면역조직화학염색, 면역침전법(immunoprecipitation), 보체 고정 분석법, 유세포 분석법(FACS) 또는 단백질 칩 방법 등이 사용될 수 있다.The step of measuring the expression level of the LDH may be performed through various methods known in the art, for example, western blotting, dot blotting, enzyme immunoassay (enzyme- linked immunosorbent assay), radioimmunoassay (RIA), radioimmunoassay, Oukteroni immune diffusion method, rocket immunoelectrophoresis, immunohistochemical staining, immunoprecipitation, complement fixation assay, flow cytometry (FACS) or Protein chip method or the like can be used.

또한, 상기 LDH 단백질의 활성 수준을 측정하는 단계는 당업계에서 공지된 다양한 방법을 통해 수행될 수 있으며, 예를 들어, 역전사 중합효소 연쇄반응 (reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응 (real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블롯팅, 노던 블롯팅, 효소면역분석법, 방사면역확산법 (radioimmunodiffusion) 및 면역침전법 등이 사용될 수 있다.In addition, the step of measuring the activity level of the LDH protein can be performed through various methods known in the art, for example, reverse transcriptase-polymerase chain reaction, real-time polymerase chain reaction (real time-polymerase chain reaction), Western blotting, Northern blotting, enzyme immunoassay, radioimmunodiffusion and immunoprecipitation can be used.

상기 스크리닝 방법을 통해 얻은, 허혈성 뇌질환 모델에서의 LDH의 발현 수준을 증가시키고 및/또는 LDH 단백질의 활성 수준을 증가시키는 시험 물질은 허혈성 뇌질환의 치료를 위한 유효 물질이 될 수 있다. 이와 같은 허혈성 뇌질환의 치료를 위한 후보 물질은 이후 허혈성 뇌질환 치료제의 개발 과정에서 선도물질 (leading compound)로서 작용하게 되며, 상기 선도물질이 보다 유효한 허혈성 뇌질환의 치료 효과를 나타낼 수 있도록 그 구조를 변형시키고 최적화함으로써, 새로운 허혈성 뇌질환의 치료제를 개발할 수 있다.Test substances that increase the expression level of LDH and/or increase the activity level of LDH protein in the ischemic brain disease model obtained through the screening method may be effective substances for the treatment of ischemic brain disease. The candidate substance for the treatment of ischemic brain disease is to act as a leading compound in the course of the development of a therapeutic agent for ischemic brain disease, and the structure so that the lead substance can exhibit a more effective treatment effect of ischemic brain disease By modifying and optimizing, it is possible to develop new therapeutic agents for ischemic brain disease.

일 양상에 따른 방법은 인간 배아줄기세포를 이용하여 뇌 오가노이드를 제작 및 배양하는 기술을 적용한 것으로서, 상기 기술은 전세계적으로 상용화되어 있는 바 뇌 오가노이드를 기반으로 한 허혈성 뇌졸중 모델을 효율적으로 제작할 수 있다. The method according to one aspect is to apply a technique for producing and culturing brain organoids using human embryonic stem cells, which is commercially available worldwide and efficiently produces an ischemic stroke model based on brain organoids. Can be.

또한, 상기 방법에 의해 제조된 허혈성 뇌졸중 모델은 종래 신경 세포 및 뇌혈류 차단 동물 모델의 단점을 극복한 것으로서 뇌졸중 예방 또는 치료제를 대량으로 스크리닝할 수 있을 뿐만 아니라, 뇌졸중 예방 또는 치료제의 개발을 위한 플랫폼으로 활용될 수 있다.In addition, the ischemic stroke model prepared by the above method overcomes the disadvantages of the conventional neuron and cerebral blood flow blocking animal models, and can not only screen stroke prevention or treatment in large quantities, but also provides a platform for stroke prevention or development of treatment. Can be used as

도 1a는 인간 배아 줄기세포 유래 뇌 오가노이드의 제조과정을 나타낸 사진이다.
도 1b는 인간 배아 줄기세포 유래 뇌 오가노이드를 활용한 허혈성 뇌졸중 모델의 제조 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2a 및 도 2b는 인간 배아 줄기세포 및 뇌 오가노이드에서 발현하는 유전자를 정량적으로 나타낸 그래프이다.
도 3은 뇌 오가노이드에서 발현하는 신경조직을 염색한 사진이다.
도 4a 내지 도 4e는 성숙한 뉴런 세포, 증식 세포 및 뉴런 전구 세포를 나타내는 Tuj1, TH, DCX, p-Histon, PSA-NCAM에 대한 마커를 사용하여 면역조직 화학 염색 결과를 나타낸 사진이다(좌: 4배, 중: 10배, 우: 20배).
도 5a는 산소-글루코스 결핍을 0, 2, 6, 및 12시간 동안 유도한 뇌 오가노이드의 Calcein AM 및 PI 형광 염색 결과를 나타낸 사진이다.
도 5b는 산소-글루코스 결핍을 1 및 2일 동안 유도한 뇌 오가노이드와 정상 조건의 뇌 오가노이드의 Calcein AM 및 PI 형광 염색 결과를 나타낸 사진이다.
도 6a는 1% 산소-글루코스 결핍을 12시간 동안 유도하고, 24시간 동안 재관류를 유도한 뇌 오가노이드의 Calcein AM 및 PI 형광 염색 결과를 나타낸 사진이다.
도 6b는 정상 산소 상태의 뇌 오가노이드 및 1% 산소-글루코스 결핍을 2시간 및 6시간 동안 유도하고, 1일 동안 재관류를 유도한 뇌 오가노이드의 Calcein AM 및 PI 형광 염색 결과를 나타낸 사진이다.
도 6c는 정상 산소 상태의 뇌 오가노이드 및 1% 산소-글루코스 결핍을 12시간 및 24시간 동안 유도하고, 1일 동안 재관류를 유도한 뇌 오가노이드의 Calcein AM 및 PI 형광 염색 결과를 나타낸 사진이다.
도 6d는 정상 산소 상태의 뇌 오가노이드, 1% 산소-글루코스 결핍을 2, 6 12 및 24시간 동안 유도하고, 1일 동안 재관류를 유도한뇌 오가노이드에서의 LDH의 발현 수준을 나타낸 그래프이다.
도 7a는 정상 산소 상태의 뇌 오가노이드, 1% 산소-글루코스 결핍(글루코스 공급)을 12시간 유도한 뇌 오가노이드의 Calcein AM 및 PI 형광 염색 결과 및 1% 산소-글루코스 결핍 (글루코스 공급)을 12시간 유도하고 1일 동안 재관류를 유도한 뇌 오가노이드의 Calcein AM 및 PI 형광 염색 결과를 나타낸 사진이다.
도 7b는 정상 산소 상태의 뇌 오가노이드, 1% 산소-글루코스 결핍(글루코스 결핍)을 12시간 유도한 뇌 오가노이드의 Calcein AM 및 PI 형광 염색 결과; 및 1% 산소-글루코스 결핍(글루코스 결핍)을 12시간 유도하고 1일 동안 재관류를 유도한 뇌 오가노이드의 Calcein AM 및 PI 형광 염색 결과를 나타낸 사진이다.
도 7c는 정상 산소 상태의 뇌 오가노이드, 1% 산소-글루코스 결핍을 12시간 유도한 뇌 오가노이드, 및 1% 산소-글루코스 결핍을 12시간 유도한 후, 1일 동안 재관류를 유도한 뇌 오가노이드의 배지상에서의 글루코스 결핍 유무에 따라 나타나는 LDH 발현 수준을 나타낸 그래프이다.
도 8은 정상 산소 상태의 뇌 오가노이드 및 1% 산소-글루코스 결핍을 12시간 유도하고 24시간 재관류를 유도한 뇌 오가노이드의 Calcein AM 및 PI 형광 염색 결과를 나타낸 사진이다.
도 9a는 MK-801(1 및 5 μM) 및 에다라본(5 및 50 μM)을 처리하고, 5% 산소-글루코스 결핍을 12시간 유도한 뇌 오가노이드의 LDH의 발현 수준을 나타낸 그래프이다.
도 9b는 MK-801(1 및 5 μM) 및 에다라본(5 및 50 μM)를 처리한 후, 1% 산소-글루코스 결핍을 12시간 유도하고 24시간 동안 재관류를 유도한 뇌 오가노이드의 Calcein AM 및 PI 형광 염색 결과를 나타낸 사진이다.
도 9c는 MK-801(1 및 5 μM) 및 에다라본(5 및 50 μM)을 처리한 후 1% 산소-글루코스 결핍을 12시간 유도하고 24 시간 재관류를 유도한 뇌 오가노이드에서의 LDH 발현 수준을 나타낸 그래프이다.Figure 1a is a photograph showing the manufacturing process of human embryonic stem cell-derived brain organoids.
1B is a schematic diagram showing a manufacturing process of an ischemic stroke model using brain embryonic stem cells derived from human embryonic stem cells.
2A and 2B are graphs quantitatively showing genes expressed in human embryonic stem cells and brain organoids.
Figure 3 is a picture of staining the nerve tissue expressed in the brain organoids.
4A to 4E are photographs showing immunohistochemical staining results using markers for Tuj1, TH, DCX, p-Histon, and PSA-NCAM showing mature neuronal cells, proliferating cells, and neuronal progenitor cells (left: 4). Pear, medium: 10 times, right: 20 times).
5A is a photograph showing the results of Calcein AM and PI fluorescence staining of brain organoids that induced oxygen-glucose deficiency for 0, 2, 6, and 12 hours.
5B is a photograph showing the results of Calcein AM and PI fluorescence staining of brain organoids and brain organoids under normal conditions that induced oxygen-glucose deficiency for 1 and 2 days.
6A is a photograph showing the results of Calcein AM and PI fluorescence staining of brain organoids inducing 1% oxygen-glucose deficiency for 12 hours and reperfusion for 24 hours.
FIG. 6B is a photograph showing Calcein AM and PI fluorescence staining results of brain organoids inducing brain organoids and 1% oxygen-glucose deficiency in normal oxygen state for 2 hours and 6 hours, and inducing reperfusion for 1 day.
6C is a photograph showing Calcein AM and PI fluorescence staining results of brain organoids inducing brain organoids and 1% oxygen-glucose deficiency in normal oxygen state for 12 hours and 24 hours, and inducing reperfusion for 1 day.
6D is a graph showing the expression level of LDH in brain organoids in normal oxygen state, 1% oxygen-glucose deficiency induced for 2, 6 12 and 24 hours, and reperfusion for 1 day.
FIG. 7A shows the results of Calcein AM and PI fluorescence staining of brain organoids inducing normal oxygen state, 1% oxygen-glucose deficiency (glucose supply) for 12 hours, and 1% oxygen-glucose deficiency (glucose supply). This is a picture showing the results of Calcein AM and PI fluorescence staining of brain organoids that were time-induced and induced reperfusion for 1 day.
7B is a result of Calcein AM and PI fluorescence staining of brain organoids inducing normal oxygen state of brain organoids and 1% oxygen-glucose deficiency (glucose deficiency) for 12 hours; And 1% oxygen-glucose deficiency (glucose deficiency) for 12 hours and induction of reperfusion for 1 day. Calcein AM and PI fluorescence staining results of brain organoids.
Fig. 7c shows brain organoids in normal oxygen state, brain organoids inducing 1% oxygen-glucose deficiency for 12 hours, and brain organoids inducing reperfusion for 1 day after inducing 1% oxygen-glucose deficiency for 12 hours. It is a graph showing the LDH expression level depending on the presence or absence of glucose deficiency on the medium.
8 is a photograph showing Calcein AM and PI fluorescence staining results of brain organoids inducing brain organoids and 1% oxygen-glucose deficiency in normal oxygen state for 12 hours and inducing reperfusion for 24 hours.
9A is a graph showing the expression level of LDH of brain organoids treated with MK-801 (1 and 5 μM) and edarabon (5 and 50 μM) and induced 5% oxygen-glucose deficiency for 12 hours.
FIG. 9B shows Calcein AM of brain organoids inducing 1% oxygen-glucose deficiency for 12 hours and reperfusion for 24 hours after treatment of MK-801 (1 and 5 μM) and edarabon (5 and 50 μM). And PI fluorescence staining results.
Figure 9c shows LDH expression levels in brain organoids that induce 12% induction of 1% oxygen-glucose deficiency after treatment with MK-801 (1 and 5 μM) and edarabon (5 and 50 μM) and induce 24-hour reperfusion. It is a graph showing.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, preferred embodiments are provided to help understanding of the present invention. However, the following examples are only provided to more easily understand the present invention, and the contents of the present invention are not limited by the following examples.

[실시예][Example]

실시예 1. 뇌 오가노이드의 제조Example 1. Preparation of brain organoids

1-1. 인간 배아 줄기세포 유래 뇌 오가노이드1-1. Brain organoids derived from human embryonic stem cells

인간배아줄기세포를 지지세포 없는 매트릭스(feeder free matrix) 상에서 5일 동안 배양하였다. 이후, 37℃에서 10분 동안 아큐타제(accutase)에 노출시켜 단일 세포 단위로 분리한 후, ultralow attachment 96 well plate의 각 웰 당 9,000~10,000개의 세포를 첨가하여 배상체(Embryoid Body)의 형성을 유도한 후 5일 동안 배양하였다. 이후, 신경 유도 배지(Neural induction media)로 교체하여 5일 동안 분화시키고, 파라필름(parafilm) 위에서 마트리겔(matrigel) 안에 상기 배상체를 1개씩 심어서 인큐베이터에서 20분 동안 굳혔다. 굳혀진 마트리겔 덩어리를 뇌 분화 배지(Cerebral differentiation media)에 넣고 지속적으로 신경상피(Neuroepithelium)를 유도하였다. 이후, 45일 차까지 성장시켜 뇌 오가노이드를 제조하였다. Human embryonic stem cells were cultured for 5 days on a feeder free matrix. Subsequently, the cells were separated by single cell unit by exposure to accutase at 37°C for 10 minutes, and then 9,000-10,000 cells were added to each well of an ultralow attachment 96 well plate to form an embryoid body. After induction, culture was performed for 5 days. Subsequently, the cells were differentiated for 5 days by replacing with neural induction media, and the embryoid bodies were planted one by one in a matrigel on parafilm to harden for 20 minutes in an incubator. The hardened Matrigel mass was placed in the brain differentiation media and the neuroepithelium was continuously induced. Then, brain organoids were prepared by growing until the 45th day.

1-2. 허혈성 뇌졸중 모델 오가노이드의 제조1-2. Preparation of ischemic stroke model organoids

상기 실시예 1-1에서 제조한 뇌 오가노이드를 산소 농도가 1%로 설정된 저산소증 챔버(Hypoxia chamber)에 넣고 글루코스가 포함되지 않은 Neurobasal medium/DMEM 배지에서 12시간 동안 배양하였다. 이후, 정상 산소 농도의 CO2 인큐베이터에 24시간 동안 노출시켜 재관류 손상(Reperfusion Injury)을 유발하여 허혈성 뇌졸중 모델 오가노이드를 제조하였다. The brain organoids prepared in Example 1-1 were placed in a hypoxia chamber having an oxygen concentration set to 1% and cultured in Neurobasal medium/DMEM medium containing no glucose for 12 hours. Thereafter, exposure to a normal oxygen concentration CO 2 incubator for 24 hours caused reperfusion injury to prepare an ischemic stroke model organoid.

실시예 2. 뇌 오가노이드의 특성 확인Example 2. Confirmation of characteristics of brain organoids

2-1. 배아줄기세포 마커 및 뇌 뉴런 마커의 발현 확인2-1. Expression of embryonic stem cell markers and brain neuron markers

상기 실시예 1-2에서 제조한 뇌 오가노이드의 배아줄기세포 마커 및 대뇌 뉴런 마커를 확인하였다. 구체적으로, 인간 배아줄기 세포에서 주로 발현하는 전분화능 마커(Pluripotency marker)인 Oct4, Sox2, Nanog, Myc, Klf4의 발현 양상을 배아줄기세포와 상기 실시예 1-2에서 제조한 뇌 오가노이드에서 각각 관찰하였다. 더 유의적인 비교를 위하여 2가지의 배아줄기세포(CHA15 및 CHA6)를 사용하였다. 실험에 사용한 프라이머를 하기 표 1에 나타냈다. The embryonic stem cell marker and the cerebral neuron marker of the brain organoid prepared in Example 1-2 were identified. Specifically, the expression patterns of Oct4, Sox2, Nanog, Myc, and Klf4, which are mainly pluripotency markers mainly expressed in human embryonic stem cells, are expressed in embryonic stem cells and brain organoids prepared in Examples 1-2, respectively. It was observed. Two embryonic stem cells (CHA15 and CHA6) were used for a more significant comparison. The primers used in the experiment are shown in Table 1 below.

그 결과, 도 2a에 나타난 바와 같이 배아줄기세포 CHA15 및 CHA6과 비교하여 뇌 오가노이드에서 Oct4, Sox2, Nanog, Myc가 유의적으로 적게 발현되는 것을 확인할 수 있었다. As a result, it was confirmed that Oct4, Sox2, Nanog, and Myc are significantly less expressed in brain organoids compared to embryonic stem cells CHA15 and CHA6 as shown in FIG. 2A.

2-2. 신경세포 마커의 발현 확인2-2. Confirmation of expression of neuronal markers

상기 실시예 1-2에서 제조한 뇌 오가노이드의 신경세포에서 발현되는 마커 유전자를 확인하였다. 구체적으로, 뇌 오가노이드에서 주로 발현하는 뉴런 마커인 LHX2, FOXG1, PAX6 및 SOX1의 발현 양상을 배아줄기세포와 상기 실시예 1-2에서 제조한 뇌 오가노이드에서 각각 관찰하였다. 더 유의적인 비교를 위하여 2가지의 배아줄기세포(CHA15 및 CHA6)를 사용하였다. 실험에 사용한 프라이머를 하기 표 1에 나타냈다. The marker gene expressed in neurons of brain organoids prepared in Example 1-2 was confirmed. Specifically, the expression patterns of the neuronal markers LHX2, FOXG1, PAX6, and SOX1 mainly expressed in brain organoids were observed in embryonic stem cells and brain organoids prepared in Examples 1-2, respectively. Two embryonic stem cells (CHA15 and CHA6) were used for a more significant comparison. The primers used in the experiment are shown in Table 1 below.

그 결과, 도 2b에 나타난 바와 같이, 배아줄기세포 CHA15 및 CHA6과 비교하여 뇌 오가노이드에서 LHX2, FOXG1, PAX6, SOX1가 유의적으로 높게 발현되는 것을 확인할 수 있었다. As a result, as shown in Figure 2b, compared to embryonic stem cells CHA15 and CHA6, it was confirmed that LHX2, FOXG1, PAX6, and SOX1 are significantly expressed in brain organoids.

유전자gene 서열번호Sequence number 방향direction 염기서열Sequence Oct4Oct4 서열번호 1SEQ ID NO: 1 정방향Forward 5'-GGA GAA GCT GGA GCA AAA C -3'5'-GGA GAA GCT GGA GCA AAA C -3' 서열번호 2SEQ ID NO: 2 역방향Reverse 5'-ACC TTC CCA AAT AGA ACC CC -3'5'-ACC TTC CCA AAT AGA ACC CC -3' SOX2SOX2 서열번호 3SEQ ID NO: 3 정방향Forward 5'- AGC TAC AGC ATG ATG CAG GA -3'5'- AGC TAC AGC ATG ATG CAG GA -3' 서열번호 4SEQ ID NO: 4 역방향Reverse 5'- GGT CAT GGA GTT GTA CTG CA -3'5'- GGT CAT GGA GTT GTA CTG CA -3' MANOGMANOG 서열번호 5SEQ ID NO: 5 정방향Forward 5'- TGA ACC TCA GCT ACA AAC AG -3'5'- TGA ACC TCA GCT ACA AAC AG -3' 서열번호 6SEQ ID NO: 6 역방향Reverse 5'- TGG TGG TAG GAA GAG TAA AG -3'5'- TGG TGG TAG GAA GAG TAA AG -3' MYCMYC 서열번호 7SEQ ID NO: 7 정방향Forward 5'- ACT CTG AGG AGG AAC AAG AA -3'5'- ACT CTG AGG AGG AAC AAG AA -3' 서열번호 8SEQ ID NO: 8 역방향Reverse 5'- TGG AGA CGT GGC ACC TCT T -3'5'- TGG AGA CGT GGC ACC TCT T -3' KLF4KLF4 서열번호 9SEQ ID NO: 9 정방향Forward 5'- TCT CAA GGC ACA CCT GCG AA -3'5'- TCT CAA GGC ACA CCT GCG AA -3' 서열번호 10SEQ ID NO: 10 역방향Reverse 5'- TAG TGC CTG GTC AGT TCA TC -3'5'- TAG TGC CTG GTC AGT TCA TC -3' LHX2LHX2 서열번호 11SEQ ID NO: 11 정방향Forward 5'- TCG GGA CTT GGT TTA TCA CCT -3'5'- TCG GGA CTT GGT TTA TCA CCT -3' 서열번호 12SEQ ID NO: 12 역방향Reverse 5'- GTT GAA GTG TGC GGG GTA CT -3'5'- GTT GAA GTG TGC GGG GTA CT -3' FOXG1FOXG1 서열번호 13SEQ ID NO: 13 정방향Forward 5'- CCA GAC CAG TTA CTT TTT CCC -3'5'- CCA GAC CAG TTA CTT TTT CCC -3' 서열번호 14SEQ ID NO: 14 역방향Reverse 5'- TGA AAT AAT CAG ACA GTC CCC C -3'5'- TGA AAT AAT CAG ACA GTC CCC C -3' PAX6PAX6 서열번호 15SEQ ID NO: 15 정방향Forward 5'-TGT CCA ACG GAT GTG TGA GTA -3'5'-TGT CCA ACG GAT GTG TGA GTA -3' 서열번호 16SEQ ID NO: 16 역방향Reverse 5'- CAG TCT CGT AAT ACC TGC CCA -3'5'- CAG TCT CGT AAT ACC TGC CCA -3' SOX1SOX1 서열번호 17SEQ ID NO: 17 정방향Forward 5'- TCC TGG AGT ATG GAC TGT CCG -3'5'- TCC TGG AGT ATG GAC TGT CCG -3' 서열번호 18SEQ ID NO: 18 역방향Reverse 5'- GAA TGC AGG CTG AAT TCG G -3'5'- GAA TGC AGG CTG AAT TCG G -3'

2-3. 신경세포의 구조 확인2-3. Checking the structure of nerve cells

상기 실시예 1-2에서 제조한 뇌 오가노이드의 신경세포 구조를 확인하기 위하여, 뉴런 마커로 상기 뇌 오가노이드를 면역염색한 후 Rapiclear에 노출시켜 조직의 투명화를 유도하였다. In order to confirm the neuronal structure of the brain organoids prepared in Example 1-2, the brain organoids were immunostained with neuronal markers and exposed to Rapiclear to induce tissue clarification.

도 3은 뇌 오가노이드에서 발현하는 신경조직을 염색한 사진이다. 도 3에 나타난 바와 같이 뇌 오가노이드에서 신경 전구 마커(Neural progenitor marker)인 Tuj1과, 미성숙 신경 마커(Immature neuron marker)인 DCX가 발현되는 것을 확인할 수 있었다.Figure 3 is a picture of staining the nerve tissue expressed in the brain organoids. As shown in FIG. 3, it was confirmed that Tuj1, which is a neural progenitor marker, and DCX, which is an immature neuron marker, are expressed in brain organoids.

도 4a 내지 도 4e는 성숙한 뉴런 세포(좌), 증식 세포(중) 및 뉴런 전구 세포(우)를 나타내는 Tuj1, TH, DCX, p-Histon, PSA-NCAM에 대한 마커를 사용하여 면역조직 화학 염색을 실시한 결과이다. Tuj11은 신경전구세포 마커를 나타내고, DCX는 미성숙 뉴런 마커를 나타내며 Hoechst는 핵을 염색한 결과이다. 또한, p-Histon는 세포증식마커를 나타내고 PSA-NCAM는 뉴런전구세포 마커를 나타낸다. 도 4a 내지 도 4e에 나타난 바와 같이, 뉴런 전구세포에서부터 도파민 뉴런까지 다양한 뉴런세포들의 존재가 확인 되었다. 특히, 도 4e의 경우 대뇌 피질의 구조를 관찰할 수 있었다. 4A-4E are immunohistochemical staining using markers for Tuj1, TH, DCX, p-Histon, PSA-NCAM showing mature neuronal cells (left), proliferating cells (middle) and neuronal progenitor cells (right). This is the result. Tuj11 represents a neuroprogenitor cell marker, DCX represents an immature neuron marker, and Hoechst is a result of staining the nucleus. In addition, p-Histon represents a cell proliferation marker and PSA-NCAM represents a neuronal progenitor cell marker. 4A to 4E, the presence of various neuron cells from neuronal progenitor cells to dopamine neurons was confirmed. In particular, in the case of Figure 4e it was possible to observe the structure of the cerebral cortex.

실시예 3. 1% 산소-글루코스 결핍 조건에서 뇌 오가노이드의 생존율 확인Example 3. Confirmation of survival rate of brain organoids in 1% oxygen-glucose deficiency condition

상기 실시예 1-2에서 제조한 뇌 오가노이드의 1% 산소-글루코스 결핍(Oxygen-Glucose Deprivation, OGD) 조건에서의 생존율을 측정하였다. 먼저, 상기 뇌 오가노이드를 산소의 농도가 1%로 설정된 저산소증 챔버(Hypoxia chamber)에서 각각 2, 6, 12,24 및 48 시간 동안 노출시켰다. 이후, 상기 오가노이드를 Calcein AM 및 PI로 염색하였다. 24시간 및 48시간 동안 노출시킨 뇌 오가노이드에 대한 대조군은 정상 산소 상태(Normoxia)에서 쉐이킹(shaking) 유무 조건으로 하였다. The survival rate under the condition of 1% oxygen-glucose deprivation (OGD) of brain organoids prepared in Example 1-2 was measured. First, the brain organoids were exposed for 2, 6, 12, 24 and 48 hours, respectively, in a hypoxia chamber where the oxygen concentration was set to 1%. Thereafter, the organoids were stained with Calcein AM and PI. The control group for brain organoids exposed for 24 hours and 48 hours was defined as the presence or absence of shaking in a normal oxygen state (Normoxia).

도 5a는 산소-글루코스 결핍을 1, 2, 6, 및 12시간 동안 유도한 뇌 오가노이드의 Calcein AM 및 PI 형광 염색 결과를 나타낸 사진이다. 도 5a에 나타난 바와 같이, 정상 산소 농도에 노출된 뇌 오가노이드의 경우, Calcein AM의 발현이 전반적으로 나타났으며, 일부 내부에서만 작은 부피로 PI가 염색되는 양상이 나타났다. 반면, 1% 산소 농도에서 저산소 손상을 유도한 뇌 오가노이드의 경우, Calcein AM의 발현이 상대적으로 적게 나타났으며, PI가 전반적으로 염색되는 것을 확인할 수 있었다.5A is a photograph showing the results of Calcein AM and PI fluorescence staining of brain organoids inducing oxygen-glucose deficiency for 1, 2, 6, and 12 hours. As shown in FIG. 5A, in the case of brain organoids exposed to normal oxygen concentration, the expression of Calcein AM was generally observed, and PI was stained in a small volume only in a part. On the other hand, in the case of brain organoids inducing hypoxic damage at 1% oxygen concentration, the expression of Calcein AM was relatively low, and it was confirmed that PI was dyed overall.

도 5b는 산소-글루코스 결핍을 1 및 2일 동안 유도한 뇌 오가노이드와 정상 조건의 뇌 오가노이드의 Calcein AM 및 PI 형광 염색 결과를 나타낸 사진이다. 도 5b에 나타난 바와 같이 1% 산소-글루코스 결핍 조건에서의 뇌 오가노이드는 1일차부터 세포사멸이 일어나는 것을 관찰할 수 있었다. 반면, 대조군의 경우 세포사멸이 상대적으로 적게 발생하는 것을 확인할 수 있었다. 5B is a photograph showing the results of Calcein AM and PI fluorescence staining of brain organoids and brain organoids under normal conditions that induced oxygen-glucose deficiency for 1 and 2 days. As shown in FIG. 5B, it was observed that apoptosis occurs in the brain organoid under the condition of 1% oxygen-glucose deficiency from day 1. On the other hand, in the control group, it was confirmed that apoptosis occurred relatively little.

실시예Example 4. 1% 산소-포도당 결핍 및  4. 1% oxygen-glucose deficiency and 재관류Reperfusion 조건에서 뇌  Brain in condition 오가노이드의Organoid 생존율 확인 Confirm survival rate

4-1. 재관류에 의한 독성 확인4-1. Confirmation of toxicity by reperfusion

상기 실시예 1-2에서 제조한 뇌 오가노이드의 재관류에 의한 독성 차이를 측정하였다. 구체적으로, 상기 오가노이드를 12시간 동안 1% 산소-포도당 결핍을 유도한 후, 정상 산소 상태(20%)에서 24시간 동안 추가로 노출시켜 재관류를 유도하였다. 뇌 오가노이드를 배양한 배지를 수거한 후 96 웰 플레이트에 10㎕/웰 씩 첨가하고 LDH 반응용액(EZ-LDH Cell cytotoxicity assay kit)을 추가로 첨가하여 30분 동안 LDH의 반응을 유도하였다. 이후, 450 ㎚의 파장에서 OD 값을 측정하였다. 상기 오가노이드를 Calcein AM 및 PI로 염색하여 살아있는 세포 및 죽은 세포를 관찰하고, 상기 오가노이드에서 LDH(Lactate dehydrogenase)의 발현을 측정하였다. 이때, 정상 산소 상태(20%)에 노출된 뇌 오가노이드를 대조군으로 하였다.The difference in toxicity caused by reperfusion of brain organoids prepared in Example 1-2 was measured. Specifically, after inducing 1% oxygen-glucose deficiency for 12 hours, the organoid was further exposed for 24 hours at a normal oxygen state (20%) to induce reperfusion. After collecting the medium in which the brain organoids were cultured, 10 µl/well was added to the 96-well plate, and LDH reaction solution (EZ-LDH Cell cytotoxicity assay kit) was further added to induce LDH reaction for 30 minutes. Then, the OD value was measured at a wavelength of 450 nm. The organoids were stained with Calcein AM and PI to observe living and dead cells, and the expression of LDH (Lactate dehydrogenase) in the organoids was measured. At this time, the brain organoid exposed to the normal oxygen state (20%) was used as a control.

그 결과, 도 6a에 나타난 바와 같이, 대조군에 비하여 1% 산소-글루코스 결핍이 유도된 뇌 오가노이드에서 LDH의 발현이 유의적으로 증가한 것을 확인할 수 있었다(상단). 또한, 대조군에 비하여 1% 산소-글루코스 결핍 및 재관류가 추가로 유도된 뇌 오가노이드에서 LDH의 발현이 유의적으로 증가한 것을 확인할 수 있었다(하단). 특히, 1% 산소-글루코스 결핍이 유도된 뇌 오가노이드에 비하여 재관류가 추가로 유도된 오가노이드에서 LDH의 발현의 현저하게 증가한 것으로 보아 재관류를 추가로 유도할 경우 허혈성 뇌졸중 모델로서 더욱 적합함을 확인할 수 있다. As a result, as shown in Figure 6a, it was confirmed that the expression of LDH in the brain organoid induced 1% oxygen-glucose deficiency was significantly increased compared to the control group (top). In addition, it was confirmed that the expression of LDH was significantly increased in the brain organoid in which 1% oxygen-glucose deficiency and reperfusion were further induced compared to the control group (bottom). Particularly, it was found that reperfusion was significantly increased in LDH expression compared to brain organoids in which 1% oxygen-glucose deficiency was induced, which is more suitable as an ischemic stroke model when inducing reperfusion further. You can.

4-2. 1% 산소-글루코스 결핍 유도 시간에 따른 세포 생존율 확인4-2. Confirmation of cell viability according to the induction time of 1% oxygen-glucose deficiency

상기 1-2에서 제조한 뇌 오가노이드의 1% 산소-글루코스 결핍 유도에 따른 세포 생존율을 측정하였다. 구체적으로, 상기 오가노이드를 1% 산소-글루코스 결핍을 각각 2, 6, 12, 및 24시간 동안 유도하였다는 점을 제외하고는 상기 실시예 4-1과 동일한 방법으로 수행하였다. 이때, 정상 산소 상태(20%)에 노출된 뇌 오가노이드를 대조군으로 하였다.Cell viability according to induction of 1% oxygen-glucose deficiency of brain organoids prepared in 1-2 was measured. Specifically, the organoid was performed in the same manner as in Example 4-1, except that 1% oxygen-glucose deficiency was induced for 2, 6, 12, and 24 hours, respectively. At this time, the brain organoid exposed to the normal oxygen state (20%) was used as a control.

그 결과, 도 6b에 나타난 바와 같이, 2 및 6시간 동안 1% 산소-글루코스 결핍을 유도한 뇌 오가노이드에서 PI 염색이 두드러지게 나타나는 것을 확인할 수 있었으며, 도 6c에 나타난 바와 같이 12 및 24시간 동안 1% 산소-글루코스 결핍을 유도한 뇌 오가노이드에서 Calcein AM 염색이 감소되는 것을 확인할 수 있었다.As a result, as shown in FIG. 6B, it was confirmed that PI staining was prominent in brain organoids that induced 1% oxygen-glucose deficiency for 2 and 6 hours, and for 12 and 24 hours as shown in FIG. 6C. It was confirmed that Calcein AM staining was reduced in brain organoids induced 1% oxygen-glucose deficiency.

또한, 도 6d에 나타난 바와 같이, 대조군에 비하여 1% 산소-글루코스 결핍 및 재관류가 유도된 뇌 오가노이드에서 LDH의 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 1% 산소-글루코스 결핍을 유도한 시간 의존적으로 LDH의 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. In addition, as shown in Figure 6d, compared to the control group, it was confirmed that the expression of LDH was increased in brain organoids induced by 1% oxygen-glucose deficiency and reperfusion, and time-dependently induced 1% oxygen-glucose deficiency. It was confirmed that the expression of LDH increased.

4-3. 글루코스 결핍에 따른 세포 독성 확인 4-3. Confirmation of cytotoxicity due to glucose deficiency

상기 실시예 1-2에서 제조한 뇌 오가노이드의 1% 산소-글루코스 결핍 조건에서 글루코스의 공급 유무에 따른 세포 독성 차이를 측정하였다. 구체적으로, 상기 실시예 1-2에서 제조한 뇌 오가노이드를 1% 산소-글루코스 결핍을 글루코스의 공급 또는 공급 없이 유도하였다. 이후, 정상 산소 상태(20%)에서 24시간 동안 추가로 노출시켜 재관류를 유도하였다. 상기 오가노이드를 Calcein AM 및 PI 형광 염색으로 살아있는 세포 및 죽은 세포를 관찰하고, 상기 오가노이드에서 LDH(Lactate dehydrogenase)의 발현을 측정하였다. 이때, 정상 산소 상태(20%)에 노출된 뇌 오가노이드를 대조군으로 하였다.The cytotoxicity difference according to the presence or absence of glucose in the 1% oxygen-glucose deficient condition of the brain organoid prepared in Example 1-2 was measured. Specifically, the brain organoids prepared in Examples 1-2 were induced with or without 1% oxygen-glucose supply of glucose. Thereafter, reperfusion was induced by additional exposure for 24 hours at a normal oxygen state (20%). The organoids were observed with live and dead cells by Calcein AM and PI fluorescence staining, and the expression of LDH (Lactate dehydrogenase) in the organoids was measured. At this time, the brain organoid exposed to the normal oxygen state (20%) was used as a control.

그 결과, 도 7a에 나타난 바와 같이, 글루코스가 공급될 경우 PI 염색 증가 또는 Calcein AM 발현의 감소가 유의적으로 나타나지 않음을 확인할 수 있었다. 그러나, 글루코스가 결핍된 도 7b의 경우,, Calcein AM의 염색이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. As a result, as shown in FIG. 7A, when glucose was supplied, it was confirmed that PI staining increase or Calcein AM expression was not significantly decreased. However, in the case of FIG. 7B lacking glucose, it was confirmed that the staining of Calcein AM decreased.

또한, 도 7c에 나타난 바와 같이 대조군에 비하여 1% 산소-글루코스 결핍이 유도된 오가노이드에서 LDH의 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 1% 산소-글루코스 결핍 및 재관류를 추가로 유도한 뇌 오가노이드에서 LDH의 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 특히 포도당을 공급하지 않은 조건에서 LDH의 발현이 유의적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 글루코스를 공급하지 않은 1% 산소-글루코스 결핍 및 재관류를 추가로 유도한 오가노이드에서 LDH의 발현이 유의적으로 증가하였는바, 허혈성 뇌졸중의 진단 모델로 이용할 수 있다. In addition, as shown in FIG. 7c, it was confirmed that the expression of LDH increased in the organoid in which 1% oxygen-glucose deficiency was induced compared to the control group. In addition, it was confirmed that the expression of LDH increased in brain organoids that additionally induced 1% oxygen-glucose deficiency and reperfusion, and it was confirmed that the expression of LDH increased significantly, especially in the condition where glucose was not supplied. there was. That is, the expression of LDH was significantly increased in organoids that additionally induced 1% oxygen-glucose deficiency and reperfusion without supplying glucose, and thus can be used as a diagnostic model for ischemic stroke.

실시예 5. 허혈성 뇌졸중 오가노이드에 대한 신경보호제의 효과 확인Example 5. Confirmation of the effect of neuroprotective agents on ischemic stroke organoids

5-1. 5% 산소-글루코스 결핍 조건5-1. 5% oxygen-glucose deficiency condition

상기 실시예 1-2에서 제조한 뇌 오가노이드에 대한 신경보호제의 효과를 확인하였다. 먼저, 상기 뇌 오가노이드에 MK-801(1 및 5μM) 및 Edaravone(5 및 50μM)을 농도별로 처리한 후, 5% 산소-글루코스 결핍을 12시간 동안 유도하였다. 이후, 상기 오가노이드에서 LDH(Lactate dehydrogenase)의 발현을 측정하였다. 이때, 정상 산소 상태(20%)에 노출된 뇌 오가노이드를 대조군으로 하였다. The effect of the neuroprotective agent on the brain organoids prepared in Example 1-2 was confirmed. First, after treating the brain organoids with concentrations of MK-801 (1 and 5 μM) and Edaravone (5 and 50 μM) by concentration, 5% oxygen-glucose deficiency was induced for 12 hours. Then, the expression of LDH (Lactate dehydrogenase) in the organoid was measured. At this time, the brain organoid exposed to the normal oxygen state (20%) was used as a control.

그 결과, 도 9a에 나타난 바와 같이, 대조군에 비하여 5% 산소-글루코스 결핍이 유도된 뇌 오가노이드에서 LDH의 발현이 유의적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 특히, MK-801 및 Edaravone을 처리한 경우, 농도 의존적으로 LDH의 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. As a result, as shown in FIG. 9A, it was confirmed that the expression of LDH was significantly increased in the brain organoid in which 5% oxygen-glucose deficiency was induced compared to the control group. Particularly, when MK-801 and Edaravone were treated, it was confirmed that LDH expression increased in a concentration-dependent manner.

5-2. 1% 산소-글루코스 결핍 및 재관류 조건5-2. 1% oxygen-glucose deficiency and reperfusion conditions

상기 실시예 1-2에서 제조한 뇌 오가노이드의 재관류 조건에서 신경보호제에 대한 효과를 확인하였다. 먼저, 상기 뇌 오가노이드에 MK-801(1 및 5μM) 및 Edaravone(5 및 50μM)을 농도별로 처리한 후 1% 산소-글루코스 결핍을 12시간 동안 유도하였다. 이후, 상기 뇌 오가노이드를 정상 산소 상태(20%)에서 24시간 동안 노출시켜 재관류를 유도하였다. 상기 오가노이드를 Calcein AM 및 PI로 염색하여 살아있는 세포 및 죽은 세포를 관찰하고, 상기 오가노이드에서 LDH(Lactate dehydrogenase)의 발현을 측정하였다. 이때, 정상 산소 상태(20%)에 노출된 뇌 오가노이드를 대조군으로 하였다.The effect on the neuroprotective agent in the reperfusion condition of the brain organoids prepared in Example 1-2 was confirmed. First, the brain organoids were treated with MK-801 (1 and 5 μM) and Edaravone (5 and 50 μM) by concentration, and then 1% oxygen-glucose deficiency was induced for 12 hours. Thereafter, the brain organoid was exposed for 24 hours at a normal oxygen state (20%) to induce reperfusion. The organoids were stained with Calcein AM and PI to observe living and dead cells, and the expression of LDH (Lactate dehydrogenase) in the organoids was measured. At this time, the brain organoid exposed to the normal oxygen state (20%) was used as a control.

그 결과, 도 9b에 나타난 바와 같이. 각각의 신경보호제를 처리한 뇌 오가노이드에서 Calcein AM의 발현 감소가 유의적이지 않음을 확인할 수 있었다. As a result, as shown in Fig. 9B. It was confirmed that the decrease in expression of Calcein AM in the brain organoids treated with each neuroprotective agent was not significant.

또한 9c에 나타난 바와 같이, 대조군에 비하여 1% 산소-글루코스 결핍 이 유도된 뇌 오가노이드에서 LDH의 발현이 유의적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 그러나, MK-801 및 Edaravone을 처리하고 1% 산소-글루코스 결핍 및 재관류를 유도한 뇌 오가노이드에서 LDH의 발현이 유의적으로 감소한 것을 확인할 수 있었다. 즉, 일 양상에 따른 뇌 오가노이드는 1% 산소-글루코스 결핍 및 재관류 유도 조건에서 신경보호제에 의한 LDH 발현이 감소하는 바, 허혈성 뇌졸중 치료제의 스크리닝에 이용될 수 있다.In addition, as shown in 9c, it was confirmed that the expression of LDH was significantly increased in the brain organoid in which 1% oxygen-glucose deficiency was induced compared to the control group. However, it was confirmed that the expression of LDH was significantly decreased in brain organoids treated with MK-801 and Edaravone and induced 1% oxygen-glucose deficiency and reperfusion. That is, the brain organoid according to one aspect has a 1% oxygen-glucose deficiency and LDH expression by the neuroprotective agent is reduced in conditions for inducing reperfusion, and thus may be used for screening for therapeutic agents for ischemic stroke.

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Claims (9)

줄기세포를 3차원 배양하여 뇌 오가노이드를 제조하는 단계; 및
상기 뇌 오가노이드에서 허혈성 뇌조직의 손상을 발생시키는 단계를 포함하는 허혈성 뇌질환 모델의 제조방법. Culturing stem cells in three dimensions to produce brain organoids; And
A method of manufacturing an ischemic brain disease model comprising the step of generating damage to ischemic brain tissue from the brain organoid. 청구항 1에 있어서, 상기 뇌 오가노이드를 0.5 내지 10% 농도의 산소 챔버(chamber)에서 배양하는 것인 허혈성 뇌질환 모델의 제조방법.The method of claim 1, wherein the brain organoid is cultured in an oxygen chamber having a concentration of 0.5 to 10%. 청구항 2에 있어서, 상기 뇌 오가노이드를 4 내지 16시간 동안 배양하는 것인 허혈성 뇌질환 모델의 제조방법.The method of claim 2, wherein the brain organoid is cultured for 4 to 16 hours. 청구항 1에 있어서, 상기 뇌 오가노이드를 글루코스가 포함되지 않은 배지에서 배양하는 것인 허혈성 뇌질환 모델의 제조방법.The method of claim 1, wherein the brain organoid is cultured in a medium containing no glucose. 청구항 1에 있어서, 재관류 손상(Reperfusion Injury)을 유발하는 단계를 추가로 포함하는 것인 허혈성 뇌질환 모델의 제조방법.The method of claim 1, further comprising the step of causing reperfusion injury (Reperfusion Injury). 청구항 1의 방법에 의해 제조된 허혈성 뇌질환 모델. Ischemic brain disease model produced by the method of claim 1. 청구항 6에 있어서, 상기 뇌질환은 뇌졸중, 뇌증후군, 뇌혈전증 또는 뇌출혈 인 것인 허혈성 뇌질환 모델의 제조방법.The method of claim 6, wherein the brain disease is stroke, brain syndrome, cerebral thrombosis, or brain hemorrhage. 청구항 7의 허혈성 뇌질환 모델에 시험 물질을 접촉시키는 단계; 및
상기 시험 물질이 처리된 허혈성 뇌질환 모델에서 LDH(Lactate dehydrogenase)의 발현 수준 또는 단백질의 활성 수준을 대조군 모델과 비교하는 단계를 포함하는 허혈성 뇌질환의 예방 또는 치료제를 스크리닝 하는 방법. Contacting the test substance with the ischemic brain disease model of claim 7; And
A method for screening for the prevention or treatment of ischemic brain disease, comprising comparing the expression level of LDH (Lactate dehydrogenase) or the activity level of a protein with a control model in the ischemic brain disease model treated with the test substance. 청구항 8에 있어서, 상기 LDH의 발현 수준 또는 단백질의 활성 수준이 대조군에 비해 감소한 경우, 허혈성 뇌질환의 예방 또는 치료제인 것으로 판단하는 것인 허혈성 뇌질환의 예방 또는 치료제를 스크리닝 하는 방법.
The method according to claim 8, When the expression level of the LDH or the activity level of the protein is reduced compared to the control group, the method for screening for the prevention or treatment of ischemic brain disease is to determine that it is the prevention or treatment of ischemic brain disease.
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