KR20200052619A - 마이크로스피어-줄기세포 하이브리드 및 이의 약제학적 용도 - Google Patents
마이크로스피어-줄기세포 하이브리드 및 이의 약제학적 용도 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20200052619A KR20200052619A KR1020180135787A KR20180135787A KR20200052619A KR 20200052619 A KR20200052619 A KR 20200052619A KR 1020180135787 A KR1020180135787 A KR 1020180135787A KR 20180135787 A KR20180135787 A KR 20180135787A KR 20200052619 A KR20200052619 A KR 20200052619A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- microsphere
- stem cell
- microspheres
- cell hybrid
- pharmaceutical composition
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
- A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
- A61K47/6927—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
- A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
- A61K9/1605—Excipients; Inactive ingredients
- A61K9/1629—Organic macromolecular compounds
- A61K9/1641—Organic macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyethylene glycol, poloxamers
- A61K9/1647—Polyesters, e.g. poly(lactide-co-glycolide)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
- A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
- A61K9/5005—Wall or coating material
- A61K9/5015—Organic compounds, e.g. fats, sugars
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
본 발명은 마이크로스피어-줄기세포 하이브리드 및 이의 약제학적 용도에 대한 것으로, 보다 상세하게는, 본 발명의 마이크로스피어-줄기세포 하이브리드는 단일 세포 단위로 적용되어 정맥내 투여가 가능한 줄기세포 치료제로 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 마이크로스피어-줄기세포 하이브리드 및 이의 약제학적 용도에 대한 것이다.
줄기세포 치료제는 기존의 치료법을 뛰어넘는 새로운 개념의 재생 의학으로, 보건, 의료 및 사회적으로도 줄기세포 치료에 대해 기대가 커짐에 따라 상용화 가능한 줄기세포 치료제 개발에 대한 관심이 증대되고 있다. 실제로, 2012년에 국내에서 줄기세포를 기반으로 한 치료제 3개 품목, 에프씨비파미셀의 하티셀그램-AMI, 메디포스트의 카티스템 및 안트로젠의 큐피스템이 세계 최초로 승인된 이래 줄기세포를 기반으로 한 치료제의 상용화가 본격적으로 진행되고 있으며, 2013년도에 발표된 한 시장조사보고서에 따르면, 세계 줄기세포 치료제 시장규모는 2012년 325억 달러 규모에서 2016년까지 두 배로 증가하는 고속 성장을 이어가 2018년에는 약 1195억 달러에 이를 것으로 예측되고 있다.
이러한 줄기세포 치료제 시장의 급격한 성장에도 현재 임상에 있어서는 성체줄기세포의 생체 내 낮은 생존률과 저하된 분화능 등의 문제로 인하여 기대만큼의 치료 효과를 보여주지 못하고 있다.
본 발명의 목적은 단일 세포 단위로 적용되어 정맥내 투여가 가능한 마이크로스피어-줄기세포 하이브리드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 마이크로스피어-줄기세포 하이브리드의 약제학적 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 폴리도파민이 코팅된 생분해성 마이크로스피어가 표면에 컨쥬게이트 된 줄기세포를 포함하는 마이크로스피어-줄기세포 하이브리드를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 마이크로스피어-줄기세포 하이브리드; 및 약제학적 활성 성분을 포함하는 의약 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 약학적 유효량의 본 발명의 의약 조성물을 그것을 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 암, 염증성 질환 또는 심장질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 마이크로스피어-줄기세포 하이브리드는 단일 세포 단위로 적용되어 정맥내 투여가 가능한 줄기세포 치료제로 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 마이크로스피어-줄기세포 하이브리드의 제조, 전달 및 치료적 용도를 도식화한 도면(a) 및 폴리도파민(pD)이 코팅된 마이크로스피어 매트릭스와 줄기세포의 상호작용을 도식화한 도면(b)이다.
도 2는 pD 코팅된 PLGA 마이크로스피어의 특성 규명 결과를 나타낸 것으로, (a)는 PLGA 마이크로스피어 및 pD 코팅된 PLGA 마이크로스피어의 SEM 이미지, (b)는 pH8.0에서 도파민과 함께 1시간 인큐베이션 후의 마이크로스피어의 색 변화에 대한 광학 이미지, (c)는 PLGA 매트릭스 제거 후 폴리도파민 캡슐의 TEM 이미지이다.
도 3은 마이크로스피어-줄기세포 하이브리드의 형성에서 폴리도파민 코팅의 역할을 나타낸 것으로, (a)는 pH8.0에서 Ms 및 pD-Ms와 함께 20분 인큐베이션 후 ADMSC의 광학 및 형광 이미지, (b)는 ADMSC 및 pD-Ms/ADMSC 하이브리드에 대한 광학 이미지이다.
도 4(a)는 Coumarin-6 표지된 pD-Ms와 컨쥬게이트 된 후 ADMSCs의 광학 및 형광 이미지를, 도 4(b)는 Coumarin-6 표지된 pD-Ms와 ADMSC의 연관성에 대한 FACS 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 컨쥬게이션 후 마이크로스피어의 국소화를 나타낸 것으로, (a)는 마이크로스피어-세포 하이브리드의 CLSM 이미지이고(녹색은 마이크로스피어를 나타내고, 붉은색은 세포막을 나타냄), (b)는 마이크로스피어-세포 하이브리드들의 CLSM 이미지이다(녹색은 마이크로스피어를 나타내고, 붉은색은 리소좀을 나타냄).
도 6은 컨쥬게이션 후 마이크로스피어-세포 하이브리드 중의 마이크로스피어의 안정성을 나타낸 것으로, (a)는 컨쥬게이션 후 1일, 7일 및 14일에 마이크로스피어-세포 하이브리드의 광학 이미지이고, (b)는 컨쥬게이션 후 1일, 3일, 7일, 14일 및 21일에 마이크로스피어-세포 하이브리드의 SEM 이미지이다.
도 7은 Cour6-표지된 Ms 및 Cour6-표지된 pD-Ms와 함께 인큐베이션 후 콜라겐 코팅된 커버슬립의 광학 이미지 및 형광 이미지를 나타낸 것이다.
도 8은 Ms와 pD-Ms의 인큐베이션 후 콜라겐 코팅된 커버슬립의 SEM 이미지를 나타낸 것이다.
도 9는 트랜스웰 분석에 의해 평가된 자유 배지 및 암세포로의 ADMSCs 및 pD-Ms/ADMSCs의 이동 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 hADMSCs와 컨쥬게이션 후 pD-Ms의 침윤 결과를 나타낸 것으로, (a)는 아가로오스 코팅된 96-웰 플레이트에 의한 NCIH-1299 종양 스페로이드의 제조 결과이고, (b)는 아가로오스 코팅된 96-웰 플레이트(8일(a), 3일(b))에서 공배양 18시간 후 종양 스페로이드의 코어로의 pDMs/ADMSCs의 침윤 결과이다. 600 pD-Ms/ADMSCs는 알파-MEM 자유 배지에서 1개의 종양 스페로이드와 함께 배양되었고 18시간 후에 공초점 현미경 하에서 관찰되었다.
도 11은 정맥내 주사로 투여한 후 전신에서 pD-Ms 및 pD-Ms/ADMSCs의 시간별 생체 내 분포 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 pD-Ms의 생체 내 분포를 나타낸 것으로, (a)는 78시간 주사 후 폐, 간, 비장, 심장, 신장, 내장 및 종양의 형광 강도, (b)는 7개 기관의 전체 강도 중 형광 강도이다.
도 13은 ADMSC(녹색 막대), 빈 pD-Ms/ADMSC(파란색 막대) 및 PTX-Ms/ADMSC(빨간색 막대)의 증식 지수를 나타낸 것이다. 마이크로스피어-세포 하이브리드는 증식 분석 전에 전체 DMEM 배지에서 3일 동안 배양되었다.
도 14는 PTX/pD-Ms와의 컨쥬게이션 후 ADMSC의 형태 변화를 나타낸 것이다.
도 2는 pD 코팅된 PLGA 마이크로스피어의 특성 규명 결과를 나타낸 것으로, (a)는 PLGA 마이크로스피어 및 pD 코팅된 PLGA 마이크로스피어의 SEM 이미지, (b)는 pH8.0에서 도파민과 함께 1시간 인큐베이션 후의 마이크로스피어의 색 변화에 대한 광학 이미지, (c)는 PLGA 매트릭스 제거 후 폴리도파민 캡슐의 TEM 이미지이다.
도 3은 마이크로스피어-줄기세포 하이브리드의 형성에서 폴리도파민 코팅의 역할을 나타낸 것으로, (a)는 pH8.0에서 Ms 및 pD-Ms와 함께 20분 인큐베이션 후 ADMSC의 광학 및 형광 이미지, (b)는 ADMSC 및 pD-Ms/ADMSC 하이브리드에 대한 광학 이미지이다.
도 4(a)는 Coumarin-6 표지된 pD-Ms와 컨쥬게이트 된 후 ADMSCs의 광학 및 형광 이미지를, 도 4(b)는 Coumarin-6 표지된 pD-Ms와 ADMSC의 연관성에 대한 FACS 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 컨쥬게이션 후 마이크로스피어의 국소화를 나타낸 것으로, (a)는 마이크로스피어-세포 하이브리드의 CLSM 이미지이고(녹색은 마이크로스피어를 나타내고, 붉은색은 세포막을 나타냄), (b)는 마이크로스피어-세포 하이브리드들의 CLSM 이미지이다(녹색은 마이크로스피어를 나타내고, 붉은색은 리소좀을 나타냄).
도 6은 컨쥬게이션 후 마이크로스피어-세포 하이브리드 중의 마이크로스피어의 안정성을 나타낸 것으로, (a)는 컨쥬게이션 후 1일, 7일 및 14일에 마이크로스피어-세포 하이브리드의 광학 이미지이고, (b)는 컨쥬게이션 후 1일, 3일, 7일, 14일 및 21일에 마이크로스피어-세포 하이브리드의 SEM 이미지이다.
도 7은 Cour6-표지된 Ms 및 Cour6-표지된 pD-Ms와 함께 인큐베이션 후 콜라겐 코팅된 커버슬립의 광학 이미지 및 형광 이미지를 나타낸 것이다.
도 8은 Ms와 pD-Ms의 인큐베이션 후 콜라겐 코팅된 커버슬립의 SEM 이미지를 나타낸 것이다.
도 9는 트랜스웰 분석에 의해 평가된 자유 배지 및 암세포로의 ADMSCs 및 pD-Ms/ADMSCs의 이동 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 hADMSCs와 컨쥬게이션 후 pD-Ms의 침윤 결과를 나타낸 것으로, (a)는 아가로오스 코팅된 96-웰 플레이트에 의한 NCIH-1299 종양 스페로이드의 제조 결과이고, (b)는 아가로오스 코팅된 96-웰 플레이트(8일(a), 3일(b))에서 공배양 18시간 후 종양 스페로이드의 코어로의 pDMs/ADMSCs의 침윤 결과이다. 600 pD-Ms/ADMSCs는 알파-MEM 자유 배지에서 1개의 종양 스페로이드와 함께 배양되었고 18시간 후에 공초점 현미경 하에서 관찰되었다.
도 11은 정맥내 주사로 투여한 후 전신에서 pD-Ms 및 pD-Ms/ADMSCs의 시간별 생체 내 분포 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 pD-Ms의 생체 내 분포를 나타낸 것으로, (a)는 78시간 주사 후 폐, 간, 비장, 심장, 신장, 내장 및 종양의 형광 강도, (b)는 7개 기관의 전체 강도 중 형광 강도이다.
도 13은 ADMSC(녹색 막대), 빈 pD-Ms/ADMSC(파란색 막대) 및 PTX-Ms/ADMSC(빨간색 막대)의 증식 지수를 나타낸 것이다. 마이크로스피어-세포 하이브리드는 증식 분석 전에 전체 DMEM 배지에서 3일 동안 배양되었다.
도 14는 PTX/pD-Ms와의 컨쥬게이션 후 ADMSC의 형태 변화를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.
본 발명은 폴리도파민이 코팅된 생분해성 마이크로스피어가 표면에 컨쥬게이트 된 줄기세포를 포함하는 마이크로스피어-줄기세포 하이브리드에 관한 것이다.
본 발명의 하이브리드는 폴리도파민이 줄기세포의 세포외 기질 단백질(예컨대, 콜라겐 등)의 티올 및 아민 그룹과 반응함으로써 줄기세포 표면에 폴리도파민이 코팅된 생분해성 마이크로스피어가 결합된 구조를 가지는 것을 특징으로 한다. 또한, 생분해성 마이크로스피어는 줄기세포의 생체 내 전달을 가능케 하여 궁극적으로 줄기세포의 조직 재생 효능을 크게 향상시킬 수 있다.
상기 생분해성 마이크로스피어는 줄기세포 및 약물 또는 유전물질의 생체 내 전달에 사용되고, 생체 내 전달 후, 생분해되어야 하며, 이때, 염증반응 등과 같은 부작용이 없는 물질로 이루어져야만 한다.
상기 생분해성 고분자로는 폴리락타이드-코-글리콜라이드, 폴리에틸렌-알트-말레산, 폴리락트산, 폴리락타이드, 폴리포스파진, 폴리이미노카보네이트, 폴리포스포에스테르, 폴리안하이드라이드, 폴리오르쏘에스테르, 락트산과 카프로락톤의 공중합체, 폴리카프로락톤, 폴리하이드록시발레이트, 폴리하이드록시부티레이트, 폴리아미노산, 락트산과 아미노산의 공중합체, 폴리에틸렌글리콜 유도체, 키토산 유도체, 헤파린 유도체 및 이들의 혼합물을 사용할 수 있다. 가장 바람직하게는 PLGA/D-PEMA일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 생분해성 마이크로스피어는 단일 세포 단위로 적용되고, 생체 내 이식이 가능한 크기로 마련되어야 하며, 예컨대, 1 내지 20 ㎛, 보다 구체적으로 1 내지 10 ㎛의 평균 직경을 가질 수 있다.
아울러, 상기 생분해성 마이크로스피어는 줄기세포의 생존능 향상 및 치료 효과를 극대화시키기 위한 구성으로, 약물 또는 유전물질을 추가로 포함할 수 있다. 구형의 마이크로스피어의 형태적 특성상, 상기 약물 또는 유전물질은 봉입된 상태로 포함될 수 있고, 필요한 경우, 단순 혼합 형태로도 제조될 수 있다. 본 발명의 목적상, 상기 약물 또는 유전물질은 줄기세포 생존 유지 또는 대상 질병의 치료에 사용되는 물질일 수 있으며, 이러한 효과와 관련하여 당업계에 이미 알려진 물질이라면, 제한없이 본 발명에 적용될 수 있다.
또한, 상기 줄기세포는 이에 제한되지는 않으나 자가(autologous) 유래 또는 동종(allogenic) 유래일 수 있다. 또한, 상기 줄기세포는 제대(umbilical cord), 제대혈(umbilical cord blood), 골수(bone marrow), 양수(amniotic fluid) 또는 지방(adipose) 조직 유래일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에서 사용되는 용어, "줄기세포"는 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 새로운 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 의미하며, 분화능에 따라 만능 줄기세포(totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cells), 다분화능 줄기세포(multipotent stem cells)로 분류할 수 있고, 줄기세포의 유래조직에 따라 성체 줄기세포, 배아 줄기세포 및 역분화 줄기세포로 분류할 수 있다. 본 발명에서, 상기 줄기세포는 본 발명에서 제공하는 마이크로스피어에 결합할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 바람직하게는 성체로부터 유래된 줄기세포일 수 있고, 보다 바람직하게는 골수, 지방조직, 치아, 치아조직, 혈액, 제대혈, 간장, 피부, 위장관, 태반, 자궁, 태아로부터 유래한 중간엽 줄기세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어 "중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell; MSC)"는 생체내 여러 유형의 중간엽 계통, 예를 들어 골세포(Osteocytes), 연골세포(Chondrocytes), 힘줄세포(Tendinocytes), 지방세포(Adipocytes), 근육세포(Myocytes), 및 섬유아세포(Fibroblasts) 등으로 분화가 가능한 다분화능(multipotency)을 가진 줄기세포를 의미하며, 골수, 지방 조직, 제대혈, 말초혈, 신생아 조직(neonatal tissues), 인간 태반 등의 다양한 성인 조직으로부터 분리될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 마이크로스피어-줄기세포 하이브리드; 및 약제학적 활성 성분을 포함하는 의약 조성물에 관한 것이다.
상기 마이크로스피어는 구형 형태로 내부에 약물을 봉입할 수 있고, 그러한 약물(약제학적 활성 성분)로 항암제, 항생제, 호르몬, 호르몬 길항제, 인터루킨, 인터페론, 성장 인자, 종양 괴사 인자, 엔도톡신, 림포톡시, 유로키나제, 스트렙토키나제, 조직 플라스미노겐 활성제, 프로테아제 저해제, 알킬포스포콜린, 방사선 동위원소 표지 물질, 계면활성제, 심혈관계 약물, 위장관계 약물 또는 신경계 약물 등을 채택할 수 있다.
상기 항암제로는 공지의 항암제 어떠한 것이든 무방하며 예를 들어, 알킬화제, 대사길항제, 천연제제, 호르몬 및 길항제 등의 공지의 화학요법제 및 면역요법제, 유전자치료제 등의 생물학적 제제 등이 사용될 수 있다. 보다 상세하게는, 예를 들어, 나이트로젠 머스타드, 이마티닙, 옥살리플라틴, 리툭시맙, 엘로티닙, 네라티닙, 라파티닙, 제피티닙, 반데타닙, 니로티닙, 세마사닙, 보수티닙, 악시티닙, 세디라닙, 레스타우르티닙, 트라스투주맙, 게피티니브, 보르테조밉, 수니티닙, 카보플라틴, 소라페닙, 베바시주맙, 시스플라틴, 세툭시맙, 비스쿰알붐, 아스파라기나제, 트레티노인, 하이드록시카바마이드, 다사티닙, 에스트라머스틴, 겜투주맵오조가마이신, 이브리투모맙튜세탄, 헵타플라틴, 메칠아미노레불린산, 암사크린, 알렘투주맙, 프로카르바진, 알프로스타딜, 질산홀뮴 키토산, 젬시타빈, 독시플루리딘, 페메트렉세드, 테가푸르, 카페시타빈, 기메라신, 오테라실, 아자시티딘, 메토트렉세이트, 우라실, 시타라빈, 플루오로우라실, 플루다가빈, 에노시타빈, 플루타미드, 데시타빈, 머캅토푸린, 티오구아닌, 클라드리빈, 카르모퍼, 랄티트렉세드, 도세탁셀, 파클리탁셀, 이리노테칸, 벨로테칸, 토포테칸, 비노렐빈, 에토포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 테니포시드, 독소루비신, 이다루비신, 에피루비신, 미톡산트론, 미토마이신, 블레로마이신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 피라루비신, 아클라루비신, 페프로마이신, 템시롤리무스 테모졸로마이드, 부설판, 이포스파미드, 사이클로포스파미드, 멜파란, 알트레트민, 다카바진, 치오테파, 니무스틴, 클로람부실, 미토락톨, 레우코보린, 트레토닌, 엑스메스탄, 아미노글루테시미드, 아나그렐리드, 나벨빈, 파드라졸, 타목시펜, 토레미펜, 테스토락톤, 아나스트로졸, 레트로졸, 보로졸, 비칼루타미드, 로무스틴 또는 카르무스틴 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물이 적용될 수 있는 구체적인 질환으로는 간질환, 심장질환, 혈관질환, 퇴행성 뇌질환, 허혈성 재관류 손상으로 유래되는 질환 및 바이러스 또는 박테리아로 인한 감염질환; 간이식, 간절제술, 간색전술, 간섬유증, 간경변, 알코올성/비알코올성 지방간, 및 바이러스 또는 약물(예. 항암제, 아세트아미노펜 등)로 인한 간염; 부정맥, 심장마비, 심근경색 등의 심장 및 심혈관 질환; 루게릭병, 뇌졸중, 치매, 파킨스씨병 및 헌팅톤 병 등의 퇴행성 뇌질환; 허혈성 재관류 손상에 유래하는 당뇨성 복합증, 동맥경화, 심근경색, 뇌졸중; 인플루엔자, HBV, HCV, HIV 등의 여러 바이러스 감염 또는 여러 박테리아 감염에 의해 유도되는 질환; 암; 염증성 질환 등이 있다. 간질환은 간이식, 간절제술, 간색전술, 간섬유증, 간경변, 알코올성/비알코올성 지방간, 또는 바이러스 또는 약물(예. 항암제, 아세트아미노펜 등)로 인한 간염 등일 수 있다. 심장 또는 심혈관 질환은 부정맥, 심장마비, 심근경색, 심부전증 및 협심증 등일 수 있다. 허혈성 재관류 손상으로 유래된 당뇨성 복합증, 동맥경화 및 뇌졸중 등일 수 있다. 염증성 질환은 부종 등과 같은 일반적인 염증 증상을 포함하여 염증성 장 질환, 복막염, 골수염, 봉소염, 췌장염, 외상 유발 쇼크, 기관지 천식, 알러지성 비염, 낭포성 섬유증, 급성 기관지염, 만성 기관지염, 급성 세기관지염, 만성 세기관지염, 골관절염, 통풍, 척추관절병증, 강직성 척추염, 라이터 증후군, 건선성 관절병증, 장질환 척추염, 연소자성 관절병증, 연소자성 강직성 척추염, 반응성 관절병증, 감염성 관절염, 후-감염성 관절염, 임균성 관절염, 결핵성 관절염, 바이러스성 관절염, 진균성 관절염, 매독성 관절염, 라임 병, '혈관염 증후군'과 관련된 관절염, 결절성 다발동맥염, 과민성 혈관염, 루게릭 육아종증, 류마티스성 다발성근육통, 관절 세포 동맥염, 칼슘 결정 침착 관절병증, 가성 통풍, 비-관절 류마티즘, 점액낭염, 건초염, 상과염(테니스 엘보), 신경병증성 관절 질환(neuropathic joint disease; 또는 'charcot joint'이라고도 함), 출혈성 관절증(hemarthrosic), 헤노흐-쉔라인 자반병, 비후성 골관절병증, 다중심성 세망조직구종, 척추측만증(scoliosis), 혈색소증, 혈색소병증, 고지단백혈증, 저감마글로불린혈증, 가족성 지중해열(familial Mediterranean fever), 베체트 병, 전신성 홍반성 루푸스, 재귀열, 다발성 경화증, 패혈증, 패혈성 쇼크, 급성 호흡곤란 증후군, 다발성 장기부전, 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 급성 폐손상(acute lung injury), 기관지 폐 형성장애(broncho-pulmonary dysplasia), 제2형 당뇨병, 동맥경화, 알츠하이머성 치매, 가족성 한랭 자가염증 증훈군(familial cold autoinflammatory syndrome), 머클-웰스 증후군(Muckle-Wells syndrome), 신생아발병다발염증성질환(neonatal mutisystem inflammatory disease), 만성유아신경피부관절증후군(chronic infantile neurologic cutaneous articular syndrome), 성인발증형 스틸병(adult-onset Still's disease), 접촉성 피부염, 포상기태(hydatidiform mole), PAPA 증후군(syndrome of pyogenic arthritis, pyoderma gangrenosum,and acne), 고면역글로불린 D 증후군(hyperimmunoglobulin d syndrome) 및 크리오피린 관련 주기적 증후군(cryopyrin-associated periodic syndromes)등을 포함할 수 있다. 암의 예로는, 자궁암, 유방암, 위암, 뇌암, 직장암, 대장암, 폐암, 피부암, 혈액암 또는 간암 등이 있으며, 바람직하게는 폐암 또는 만성 폐쇄성 폐질환(COPD)와 같은 폐질환을 들 수 있다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다.
상기 약제학적으로 허용 가능한 담체는 의약 분야에서 통상 사용되는 담체 및 비히클을 포함하며, 구체적으로 이온 교환 수지, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질(예, 사람 혈청 알부민), 완충 물질(예, 각종 인산염, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분적인 글리세라이드 혼합물), 물, 염 또는 전해질(예, 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소캄륨, 염화나트륨 및 아연 염), 교질성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈계 기질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌 글리콜 또는 양모지 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 유화제, 현탁제, 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
한 양태로서, 본 발명에 따른 조성물은 비경구 투여를 위한 수용성 용액으로 제조할 수 있으며, 바람직하게는 한스 용액(Hank's solution), 링거 용액(Ringer's solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 완충 용액을 사용할 수 있다. 수용성 주입(injection) 현탁액은 소듐 카르복시메틸셀룰로즈, 솔비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 기질을 첨가할 수 있다.
본 발명의 조성물은 전신계 또는 국소적으로 투여될 수 있으며, 이러한 투여를 위해 공지의 기술로 적합한 제형으로 제제화될 수 있다.
주사용, 비경구 투여용 등의 각종 제형은 당해 기술 분야 공지된 기법 또는 통용되는 기법에 따라 제조할 수 있다. 제형 투여는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 정맥내 투여용 제형일 수 있다.
본 발명의 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 예컨대, 본 발명의 조성물의 투여량은 성인에게 1일에 0.1 내지 1000 mg/㎏의 양을, 바람직하게는 10 내지 100 mg/㎏의 용량을, 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다.
또한, 본 발명은 약학적 유효량의 본 발명의 의약 조성물을 그것을 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 암, 염증성 질환 또는 심장질환의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
상기 암, 염증성 질환 또는 심장질환의 예방 또는 치료 방법에 사용되는 약학적 조성물 및 투여 방법은 상기에서 기술하였으므로, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
한편, 상기 암, 염증성 질환 또는 심장질환의 예방 또는 치료용 조성물을 투여할 수 있는 대상체는 모든 동물을 포함한다. 예를 들어, 인간, 돼지, 고릴라, 원숭이, 개, 고양이, 생쥐 등의 포유동물일 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 중간엽 줄기마이크로스피어-세포 하이브리드의 제조 및 이의 종양지향성 약물 전달 특성 규명
(실험재료)
폴리(락타이드-코-글리콜라이드(Poly(lactide-co-glycolide)(PLGA), MW=38-54 kDa, LA:GA=50:50), Hank's balanced salt solution(HBSS), 폴리(비닐 알코올)(poly(vinyl alcohol)(PVA), MW=31-50 kDa), 도파민 하이드로클로라이드(dopamine hydrochloride) 및 아세토나이트릴은 Evarmik Industry AG(Darmstadt, Germany)로부터 구입하였다. 디클로로메탄(DCM)은 Junsei(Korea)로부터 구입하였다. 우태아 알부민(FBS), MEM 알파 변형 배지 및 인산 완충 생리 식염수(PBS)는 Hyclone으로부터 구입하였다. 세포 카운팅 키트-8(CCK-8)은 Dojindo Laboratories(Japan)로부터 구입하였다.
(세포배양)
지방 유래 중간엽 줄기세포(ADMSCs)는 10% FBS, 1% 항생제를 함유한 MEM 알파 변형 배지에서 배양하였다. 배양 배지는 2일마다 신선한 배지로 교환되었다. 패시지 번호가 10 이하인 세포만 실험에 사용하였다.
(PLGA 마이크로스피어(Ms)의 제조)
PLGA 마이크로스피어는 에멀젼-증발법에 의해 제조되었다. 간단히 말해, 15mg의 PLGA를 0.5mL의 DCM에 용해시키고, 증류수에 녹인 1% PVA 5mL에 첨가하였다. 그 후 혼합물을 균질화기를 사용하여 22,500rpm에서 5분 동안 균질화시켰다. 그 후, 수득된 에멀젼을 1% PVA 20mL에 붓고, 4시간 동안 뚜껑을 연 채 교반하였다. 5분 동안 3,000rpm에서 원심분리를 5회 적용하고 증류수에서 재구성하여 마이크로스피어를 수득하여 정제하였다. 마지막으로, 마이크로스피어를 동결건조하고, 추가 실험을 위해 -20℃에서 보관하였다. 형광-표지 마이크로스피어를 준비하기 위해, Courmarin-6을 1:40(형광:중합체)의 비율로 중합체 용액에 첨가하였다.
(폴리도파민-코팅된 마이크로스피어(pD-Ms)의 제조)
PLGA 마이크로스피어는 약 알칼리성 조건에서 도파민 하이드로클로라이드의 자가 중합에 의해 폴리도파민 막의 얇은 층으로 코팅되었다. 간단히 말해, 바이카보네이트 완충용액(pH8.0, 10mM) 중 PLGA 마이크로스피어 현탁액(1mg/mL)을 바이카보네이트 완충용액(pH8.0; 10mM)에서 같은 부피의 도파민과 혼합하였다. 이어서, 혼합물을 실온에서 1시간 동안 뚜껑을 연 상태에서 교반시켰다. pD-Ms는 5분 동안 2,000rpm에서 원심분리를 3회 적용하고 증류수로 재구성함으로써 유리 도파민 및 폴리도파민의 유리 미립자로부터 정제되었다. 모인 pD-Ms는 동결건조하여 추가 실험을 위해 -20℃에서 보관하였다.
(pD-Ms의 특성 규명)
Ms와 pD-Ms는 양면 접착테이프를 사용하여 brass tub에 고정시켰다. 이온 스퍼터 시스템(E-1030, 일본 도쿄, 히타치)을 사용하여 샘플을 백금의 얇은 층으로 코팅하고 주사전자현미경(SEM; S-4100; Hitachi, Tokyo, Japan)하에서 관찰하였다. 마이크로스피어의 표면에 폴리도파민 차폐(shield)의 형성을 평가하기 위해, 1mL의 아세토나이트릴에 pD-Ms 10mg을 넣고 2,000rpm에서 원심분리하여 PLGA 매트릭스를 추출하였다. 2,000rpm에서 3회 원심분리하고 아세토나이트릴에서 재구성하여 중합체 매트릭스를 완전히 제거하였다. 폴리도파민에 의해 형성된 캡슐은 투과전자현미경(TEM, JEOL 2011; Hitachi, Tokyo, Japan)하에서 관찰되었다. 10㎕의 폴리도파민 캡슐을 300-메쉬 탄소-코팅 구리 격자 상에 침착시켰다. 샘플을 관찰하기 전에 공기건조시켰다. 대표 이미지는 3 반복 실험으로부터 도시된다.
(ADMSCs의 표면으로의 pD-Ms의 컨쥬게이션)
컨쥬게이션 전에, ADMSC를 트립신 처리에 의해 배양 접시로부터 분리하고, HBSS pH8.0로 3회 세척하였다. 그 후, 106개의 세포를 1mL의 pD-Ms 현탁액(0.5mg/mL)에 재현탁시켰다. 혼합물을 6-웰 플레이트에 넣고 오비탈 쉐이커(FinePCR, USA)를 사용하여 300-400rpm으로 20분 동안 진탕하였다. 다음으로, 1,000rpm으로 1분 동안 원심분리하고 상등액을 제거하여 미결합된 마이크로스피어를 부분적으로 제거하였다. 세포 펠렛을 재현탁하고 12시간 동안 MEM 알파 변형 배지에서 배양하였다. 그런 다음 PBS로 배양 플레이트의 표면을 세척하여 남아있는 미결합된 마이크로스피어를 제거하였다. 이어서, 세포를 트립신 처리에 의해 플레이트로부터 분리하고 광학현미경 하에서 관찰하여 순도를 평가하였다.
(pD-Ms/ADMSCs 하이브리드의 특성 규명)
Courmarin-6으로 표지된 마이크로스피어를 사용하여 pD-Ms와 ADMSCs의 연관성을 평가하였고 형광현미경을 사용하여 마이크로스피어-세포 하이브리드를 관찰하였다. 형광-활성화된 세포 소팅(FACS)을 사용하여 컨쥬게이션 효율을 계산하였다. 마이크로스피어의 위치를 추가로 평가하기 위해, ADMSC의 세포막을 PKH26로 염색하고 ADMSC의 리소좀을 Lysotracker Red로 표지하였다. Courmarin-6으로 표지된 마이크로스피어의 상대 위치는 공초점현미경 하에서 마이크로스피어-세포 하이브리드를 관찰함으로써 평가되었다.
ADMSC의 표면에 대한 pD-Ms의 컨쥬게이션은 SEM을 사용하여 추가로 확인되었다. 간단히 말해, 2Х104 세포를 3㎛ 기공 크기의 트랜스웰 멤브레인에 1시간 동안 씨딩하였다. 그런 다음, 세포를 PBS로 3회 세척하고 4% 파라포름알데히드(PFA)에 1시간 동안 고정시켰다. 그 다음, 트랜스웰 멤브레인을 PBS로 3회 세정하고 PBS 중의 오스뮴 테트록사이드 용액(OsO4; 1%)에 20분간 고정시켰다. 그 후, 세포를 PBS로 5회 세척하고 새로 만든 PBS 중의 카보하이드라자이드 용액(1%)에서 20분 동안 인큐베이션 하였다. 세포를 다시 PBS로 5회 세척하고 OsO4 용액으로 인큐베이션 하였다. 다음으로, 시료를 30%, 50%, 70%, 90% 및 100% 에탄올 용액에 연속적으로 노출시켜 탈수시켰다. 샘플을 바이오 안전성 후드에 배치하고 실온에서 건조시켰다. 마지막으로 세포를 얇은 팔라듐층으로 코팅하고 SEM 시스템(SEM; S-4100, 히타치, 도쿄, 일본) 하에서 관찰하였다.
(ADMSCs의 표면에서의 마이크로스피어의 안정성 평가)
pD-Ms가 컨쥬게이트 된 ADMSCs는 배양 플레이트에서 낮은 밀도로 배양되었다. 1일, 7일 및 14일째에 마이크로스피어의 존재 및 밀도를 광학현미경으로 관찰하여 평가하였다. 1일, 3일, 7일, 14일 및 21일째에 ADMSC의 표면상에 마이크로스피어가 존재함을 SEM 이미지로 더 조사하였다.
(콜라겐 결합 분석)
pD-Ms 및 콜라겐 사이의 상호 작용을 평가하기 위해, 유리 커버슬립을 밤새도록 4℃에서 콜라겐 용액(0.03mg/mL)과 인큐베이션 하였다. 커버슬립을 HBSS pH8.0으로 3회 세척하였다. 비코팅 및 콜라겐 코팅 커버슬립을 6-웰 플레이트에 배치하였다. 그 후, 1mL의 Ms(비코팅) 또는 pD-Ms을 각 웰에 첨가하고, 20분 동안 약하게 교반하였다. 커버슬립을 회수하고, HBSS pH8.0으로 반복 세척하고 형광현미경으로 관찰하였다. 콜라겐 코팅된 표면에서의 마이크로스피어의 존재를 추가로 평가하기 위해, 커버슬립을 실온에서 건조시키고, 얇은 백금 층으로 코팅하고, 주사전자현미경(SEM; S-4100; Hitachi, 도쿄, 일본) 하에서 관찰하였다.
(트랜스웰 이동 분석)
ADMSCs와 pD-Ms/ADMCs의 암세포로의 이동을 평가하기 위해, RPMI-1644(2Х105 cells/mL)의 NCIH-1299 세포 현탁액 500㎕를 하부 챔버에 넣고 12시간 동안 인큐베이션 하였다. 그런 다음 배지를 700㎕의 자유 배지로 교환하였다. 그 후, ADMSC 또는 pD-Ms/ADSMC(5Х104 세포)를 상부 챔버에 넣고 8시간 동안 이동시켰다. 대조군에서는 700㎕의 RPMI-1644 자유 배지를 하부 챔버에 첨가하였다. 그 다음, 상부 챔버의 필터면을 면봉으로 세정하고 2% 에탄올 중의 크리스탈 바이올렛(Sigma)으로 1시간 동안 염색하였다. 그 후 필터를 물에서 부드럽게 씻어 유리 크리스탈 바이올렛을 제거하였다. 필터 기공을 통해 이동하는 세포를 광학현미경으로 계수하였다. 각 이동 조건에 대해 3번 동일한 반복이 수행되었다.
(종양 스페로이드의 제조 및 특성 규명)
NCI-H1299 세포의 3차원 스페로이드를 사용하여 pD-Ms/ADMSCs의 종양 침윤성을 평가하였다. 종양 스페로이드는 세포 부착을 방지하기 위해 PBS 중의 2% 아가로오스 용액으로 미리 코팅된 96-웰 플레이트에서 성장시켰다. 10% FBS, 1% 항생제를 함유하는 RPMI 중의 세포 현탁액 200㎕를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 3일 동안 배양기에 넣고 세포가 스페로이드를 형성하도록 하였다. 그 후, 매일 매일 배양액의 절반을 신선한 배지로 교체하였고, 종양 스페로이드는 성장하여 8일째에 괴사성 코어가 발생하도록 하였다.
(종양 스페로이드 침윤 분석)
종양 스페로이드 형성 8일째에, 각 웰의 배지는 Courmarin 6-표지된 pD-Ms 컨쥬게이트 된 ADMSCs 600개가 들어있는 MEM 알파 변형 배지 200㎕로 대체되었다. 그 후 플레이트를 배양기에 18시간 동안 두었다. 종양 스페로이드에서 마이크로스피어의 국소화는 공초점 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)에 의해 평가되었다.
(세포 생존능의 평가)
세포 카운팅 kit-8 분석은 ADMSCs에서 pD-Ms의 잠재적인 세포 독성을 평가하는 것이다. 100㎕의 완전 배지에서 ADMSCs 또는 pD-Ms/ADMSCs 중 5000개를 96-웰 플레이트에서 24시간 배양하였다. 그 후, WST-8[2-(2-메톡시-4-니트로페닐)-3-(4-니트로페닐)-5-(2,4-디설포페닐)-2H-테트라졸리움, 모노소듐염] 용액 10㎕를 각 웰에 첨가하였다. 오렌지색으로 생성된 포마잔의 흡광도는 플레이트 리더(Spark 10M, Tecan Australia, Port Melbourne, VIC, Australia)를 사용하여 450nm에서 측정되었다.
(pD-Ms 및 pD-Ms/ADMSCs의 생체 내 분포)
종양 이종 이식 모델은 BALB/c 누드 마우스에 인간 비소폐암 세포주 NCI-H1299(2Х106 세포/mL) 100㎕를 피하 주사하여 생성하였다. 5주 후, 적당한 종양 크기를 가진 마우스를 대조군(PBS 주사됨), pD-Ms군(pD-M 주사됨) 및 pDM/ADMSC 군(pD- Ms/ADMSC 주사됨)를 포함하는 3개의 처리군으로 무작위로 나누었다. 제형의 분포를 평가하기 위해, 673nm에서의 여기 파장 및 797nm에서의 방출 파장을 갖는 Cy5.5를 마이크로스피어에 로딩하였다. pD-Ms(238.39㎍) 및 pD-Ms/ADMSCs(106 세포와 컨쥬게이트 된 238.39㎍의 마이크로스피어)를 정맥내 주사로 투여하였다. 형광 인 비보 이미징 시스템(FOBI; NeoScience, Suwon, Korea)을 사용하여 체내에서 제형의 생체 내 시간별 분포를 평가하였다. 78시간 후 마우스를 희생시키고 NEOimaging 소프트웨어(Neoscience, Suwon, Korea)를 사용하여 종양 및 폐, 간, 비장, 심장, 신장 및 내장을 포함한 특정 장기의 형광 강도를 정량적으로 측정하고 분석하였다.
<실험예 1> pD-Ms의 평가
PLGA 마이크로스피어는 에멀젼-증발법에 의해 성공적으로 제조되었고, 구형 형태를 가지며, SEM 이미지에 따르면 1 ~ 4㎛ 범위의 크기를 가지고 있다(도 2a, 왼쪽). SEM 이미지(도 2a)에서 볼 수 있듯이 폴리도파민 코팅 후 마이크로스피어의 표면 특성에 상당한 변화가 있었다. 폴리도파민 코팅된 마이크로스피어는 작은 입자가 풍부한 거친 표면을 가지고 있는 반면, 노출된 마이크로스피어의 표면은 상대적으로 부드러웠다. 또한, 약 알칼리성 조건에서 도파민과 함께 1시간 인큐베이션 후 마이크로스피어의 색은 흰색에서 검은색으로 변하였다(도 2b).
마이크로스피어의 표면에서 폴리도파민의 중합을 확인하기 위해 PLGA 매트릭스를 아세토나이트릴로 완전히 추출하고, 아세토나이트릴에 불용성인 폴리도파민으로 형성된 코팅층의 특성을 규명하기 위해 TEM 이미징을 수행하였다. 흥미롭게도, 도파민의 중합에 의한 코팅 차폐의 형성을 나타내는, TEM 이미지에서 폴리도파민 캡슐이 분명하게 관찰되었다. 특히, 마이크로스피어의 표면상에 형성된 코팅층은 박막과 나노 크기의 입자들이 있는 2개의 부분을 포함하고 있다.
<실험예 2> 마이크로스피어-세포 하이브리드 형성에 대한 pD의 효과
마이크로스피어와 세포의 컨쥬게이션에 대한 폴리도파민 코팅의 역할을 시험하기 위해, PLGA Ms 또는 pD-PLGA Ms 중 어느 하나를 ADMSCs와 함께 20분 동안 약하게 진탕하면서 인큐베이션 하였다.
도 3a는 표면상에 pD가 없는 마이크로스피어는 세포와 안정적으로 결합할 수 없는 반면 pD-PLGA Ms는 효율적으로 세포 표면과 강하게 컨쥬게이션 한다는 것을 명확하게 나타내었다.
<실험예 3> 컨쥬게이션 효율
세포 표면에 대한 pD-Ms의 컨쥬게이션 효율을 평가하기 위해, 마이크로스피어를 Courmarin-6으로 표지하고 ADMSC와 함께 인큐베이션 하였다.
도 4a에 도시된 바와 같이, 강한 형광 강도 및 고밀도 마이크로스피어가 거의 모든 세포에서 발견될 수 있다. 일관 되게, FACS 분석 결과, 세포의 97% 이상이 마이크로스피어와 결합되어 있었다(도 4b).
<실험예 4> 컨쥬게이션 후 마이크로스피어의 국소화
마이크로스피어 영역(도 5a)에서 세포막에 대한 붉은색 형광 표지의 부재 및 마이크로스피어 및 리소좀의 개별적인 국소화(도 5b)는 마이크로스피어가 ADMSC 표면에 존재하고 세포에 내재화되지 않았음을 나타낸다. 이와 동시에 세포 표면에 존재하는 마이크로스피어의 존재도 SEM 이미지에서 분명하게 확인되었다(도 6b).
<실험예 5> 컨쥬게이션 후 마이크로스피어의 안정성
컨쥬게이션 후 3주 동안 광학 이미지와 SEM 이미지 모두에 의해 컨쥬게이션 후 마이크로스피어의 안정성을 평가하였다.
그 결과, 마이크로스피어가 인 비트로 조건에서 3주 후에도 세포 표면에 안정적으로 매여 있음을 명확히 확인하였다. 또한, SEM 이미지는 입자 형태의 현저한 변화에 의한 마이크로스피어의 분해를 나타냈다. 이들 데이터는 중합체의 느린 분해로 인해 치료 효과를 위해 세포의 미세 환경에 약물을 장기간 방출하기 위해 마이크로스피어가 세포 표면에 3주 이상 머물 수 있음을 시사한다.
<실험예 6> 콜라겐 및 pD-Ms 간의 상호 작용
세포 표면에서의 pD-Ms의 안정한 테더링(tethering) 메커니즘을 확인하기 위해, 세포 표면 성분과 pD-Ms의 반응성을 평가하였다. 이전에 보고된 바와 같이, 폴리도파민은 Micheal 부가 반응 및 Schiff 염기 반응에 의해 단백질 내의 티올 및 아민 그룹과 반응할 수 있다. 또한, 세포 표면은 세포 외 기질 단백질(콜라겐, 라미닌, 피브리노겐), 탄수화물(히알루론산, 헤파란 설페이트)으로 구성된다. 콜라겐은 인간 줄기세포의 표면에 있는 세포 외 기질의 주성분으로 보고되어 있다. 따라서, pD-Ms와 콜라겐 사이의 반응은 안정한 pD-Ms/ADMSC 하이브리드의 형성 메커니즘 중 하나일 수 있다.
도 7 및 도 8에 나타낸 바와 같이, pD-Ms는 콜라겐 코팅된 표면에 강하게 결합하는 반면, 비-코팅된 마이크로스피어는 인큐베이션 후 콜라겐 표면에서 거의 발견되지 않았다. 이것은 pD-Ms의 표면상의 폴리도파민과 hADMSC의 표면상의 콜라겐 사이의 반응이 세포 표면상의 pD-Ms의 테더링에 중요한 역할을 한다는 것을 나타내었다.
<실험예 7> pD-Ms/ADMSCs의 이동
트랜스웰 분석을 사용하여 ADMSCs와 pD-Ms/ADMSCs의 이동을 조사하였다. 도 9에서 알 수 있듯이, ADMSCs와 pD-Ms/ADMSCs 모두 암세포의 존재에 따라 더 높은 이동을 보였으며 이는 줄기세포의 종양지향성(tumortropism)을 나타낸다. ADMSCs와 pD-Ms/ADMSCs 군에서 암세포로의 이동 세포 수의 유의한 차이는 없었다. 이 결과는 hADMSC 표면에서의 pD-Ms의 컨쥬게이션은 세포의 이동을 유의적으로 변화시키지 않았음을 시사한다.
<실험예 8> pD-Ms/ADMSCs의 종양 침윤
NCI-H1299 세포의 종양 스페로이드는 아가로오스 코팅된 96-웰 플레이트를 사용하여 구형 형태로 성공적으로 제조되었다. 괴사성 코어는 배양 8일 후에 발생하였다(도 10a). 흥미롭게도, 마이크로스피어-세포 하이브리드와 18시간 인큐베이션 후, 고밀도의 마이크로스피어가 종양 스페로이드의 괴사성 코어에서 명확하게 관찰되었다(도 10b). 이 결과는 케모카인을 감지하고 종양, 특히 종양의 괴사성 코어로 이동하는 줄기세포의 능력에 대한 가설을 강력하게 뒷받침한다. 그것은 줄기세포가 종양의 코어로의 약물의 높은 탑재량을 갖는 마이크론 크기의 입자를 수행 및 전달할 수 있음을 제안한다. 이 발견은 암 치료를 위한 능동적인 전달 시스템의 개발에 있어 효율적인 전략과 새로운 패러다임을 제공할 수 있다.
<실험예 9> pD-Ms/ADMSCs의 생체 내 분포
정맥내 주사 후 pD-Ms와 pD-Ms/ADMSCs의 생체 내 시간별 분포를 조사하여 ADMSC의 종양지향성 효과를 확인하였다. 도 11에 도시된 바와 같이, 주사 후 pD-Ms의 분포는 간에서 현저하고 pD-Ms/ADMSC는 주로 폐에서 축적되는 것으로 밝혀졌다. 이전에 보고된 바와 같이(Anselmo AC et al. ACS Nano. 2013;7:11129-37), 마우스 폐 모세혈관은 평균 직경이 5㎛에 달하며 크기는 1㎛ 정도로 작다. 따라서, 평균 크기가 20㎛인 ADMSC는 폐 미세혈관계에 포획되고 크기가 작은(1 ~ 5㎛) pD-Ms는 폐 혈관을 빠져나가 간에 축적될 수 있다. 24시간 후 폐의 형광 강도가 점차 감소하여 간에서 분포하기 시작했다. 이 현상은 주사 직후에 폐에서 줄기세포가 급속히 포획된다는 이전의 보고와 일치하며, 반감기가 24시간으로 급격히 떨어지며 100시간 이내에 실질적으로 완전히 제거된다. 대조적으로, 형광은 마우스의 체내에서 48시간 후 거의 발견되지 않았으며, 이것은 pD-Ms보다 빠른 제거를 나타낸다. 일관되게 pDMs/ADMSCs의 축적은 종양과 폐 둘 다에서 pD-Ms보다 5배 더 높았다. 그 결과는 pD-Ms와 ADMSC 사이의 상호 작용이 혈류에서 안정적이며, 이는 pD-Ms/ADMSCs와 노출된 ADMSCs의 유사한 분포로 나타났다. 또한, 마이크로스피어-줄기세포 하이브리드를 이용한 pD-Ms의 전달은 체내에서 제형의 체류 시간을 증가시킬 수 있다. 더욱이, 폐에서의 pD-Ms/ADMSCs의 높은 축적 및 ADMSC의 잠재적 종양지향성 효과는 폐암 또는 COPD와 같은 폐질환의 치료에 유익할 수 있다.
<실험예 10> 세포 생존능 및 기능성에 대한 PTX의 효과
암세포 상의 PTX의 IC50은 ADMSC보다 10배 더 높기 때문에 PTX는 본 발명의 시스템에서 항암제로 사용되었다. PTX/pD-Ms는 3.8%의 로딩 용량으로 에멀젼-증발법에 의해 제조되었다. 증식 분석은 pD-Ms 및 ADMSC의 컨쥬게이션 후 3일째에 수행하였다.
도 13에서 알 수 있듯이 ADMC(마이크로스피어가 없는)와 빈 pD-Ms/ADMSC(PTX가 없는 경우) 사이에는 유의한 차이가 없었다. 그러나 제형 내에 PTX가 존재하면, 다른 그룹의 ADMSC와 비교하여 ADMSC의 증식 속도가 유의하게 감소되었다.
또한, 변형된 세포는 개질 되지 않은 ADMSC의 본래의 긴 섬유 형태(도 14)와 비교하여 더 짧은 섬유 형태를 갖기 때문에, ADMSC와 PTX/pD-Ms의 컨쥬게이션 후 7일째에 세포 형태의 약간의 변화가 또한 관찰되었다. 이 결과는 고정된 PTX의 현재 양이 ADMSC의 형태 및 증식에 부정적인 영향을 미칠 수 있음을 제안하였다. 이러한 부정적인 영향을 줄이려면 PTX의 로딩양을 5-10배 줄이거나 다른 약물을 사용하여야 한다.
Claims (10)
- 폴리도파민이 코팅된 생분해성 마이크로스피어가 표면에 컨쥬게이트 된 줄기세포를 포함하는 마이크로스피어-줄기세포 하이브리드.
- 제1항에 있어서,
생분해성 마이크로스피어는 폴리락타이드-코-글리콜라이드, 폴리에틸렌-알트-말레산, 폴리락트산, 폴리락타이드, 폴리포스파진, 폴리이미노카보네이트, 폴리포스포에스테르, 폴리안하이드라이드, 폴리오르쏘에스테르, 락트산과 카프로락톤의 공중합체, 폴리카프로락톤, 폴리하이드록시발레이트, 폴리하이드록시부티레이트, 폴리아미노산, 락트산과 아미노산의 공중합체, 폴리에틸렌글리콜 유도체, 키토산 유도체, 헤파린 유도체 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 생분해성 고분자로 제조되는 것인, 마이크로스피어-줄기세포 하이브리드. - 제1항에 있어서,
생분해성 마이크로스피어는 1 내지 10 ㎛의 평균직경을 갖는 것인, 마이크로스피어-줄기세포 하이브리드. - 제1항에 있어서,
생분해성 마이크로스피어는 약물 또는 유전물질을 더 포함하는, 마이크로스피어-줄기세포 하이브리드. - 제1항에 있어서,
줄기세포는 제대(umbilical cord), 제대혈, 골수, 양수 또는 지방 조직 유래인, 마이크로스피어-줄기세포 하이브리드. - 제1항의 마이크로스피어-줄기세포 하이브리드; 및
약제학적 활성 성분을 포함하는 의약 조성물. - 제6항에 있어서,
약제학적 활성 성분은 마이크로스피어 내에 봉입되는, 의약 조성물. - 제6항에 있어서,
약제학적 활성 성분은 항암제, 항생제, 호르몬, 호르몬 길항제, 인터루킨, 인터페론, 성장 인자, 종양 괴사 인자, 엔도톡신, 림포톡시, 유로키나제, 스트렙토키나제, 조직 플라스미노겐 활성제, 프로테아제 저해제, 알킬포스포콜린, 방사선 동위원소 표지 물질, 계면활성제, 심혈관계 약물, 위장관계 약물 및 신경계 약물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인, 의약 조성물. - 제6항에 있어서,
의약 조성물은 암, 염증성 질환 또는 심장질환 중 어느 하나를 예방 또는 치료하기 위한 것인, 의약 조성물. - 제6항에 있어서,
의약 조성물은 정맥내 투여용 제형인, 의약 조성물.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020180135787A KR102172094B1 (ko) | 2018-11-07 | 2018-11-07 | 마이크로스피어-줄기세포 하이브리드 및 이의 약제학적 용도 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020180135787A KR102172094B1 (ko) | 2018-11-07 | 2018-11-07 | 마이크로스피어-줄기세포 하이브리드 및 이의 약제학적 용도 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20200052619A true KR20200052619A (ko) | 2020-05-15 |
| KR102172094B1 KR102172094B1 (ko) | 2020-10-30 |
Family
ID=70679029
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020180135787A KR102172094B1 (ko) | 2018-11-07 | 2018-11-07 | 마이크로스피어-줄기세포 하이브리드 및 이의 약제학적 용도 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102172094B1 (ko) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20150009669A (ko) * | 2013-07-16 | 2015-01-27 | 연세대학교 산학협력단 | 폴리도파민이 결합된 생리활성 펩타이드로 고정화된 고분자 지지체 및 이의 제조방법 |
| KR20170028566A (ko) | 2015-09-04 | 2017-03-14 | 영남대학교 산학협력단 | 약물을 봉입한 이식 치료용 세포 클러스터 및 이의 제조방법 |
-
2018
- 2018-11-07 KR KR1020180135787A patent/KR102172094B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20150009669A (ko) * | 2013-07-16 | 2015-01-27 | 연세대학교 산학협력단 | 폴리도파민이 결합된 생리활성 펩타이드로 고정화된 고분자 지지체 및 이의 제조방법 |
| KR20170028566A (ko) | 2015-09-04 | 2017-03-14 | 영남대학교 산학협력단 | 약물을 봉입한 이식 치료용 세포 클러스터 및 이의 제조방법 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Mar. Drugs, 13, 6792-6817, 2015.(2015.11.11.)* * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR102172094B1 (ko) | 2020-10-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kusuma et al. | Effect of the microenvironment on mesenchymal stem cell paracrine signaling: opportunities to engineer the therapeutic effect | |
| Machhi et al. | A role for extracellular vesicles in SARS-CoV-2 therapeutics and prevention | |
| KR101475447B1 (ko) | 자기-조립 블록 코폴리머의 베시클 그리고 그것의 제조 및 사용 방법 | |
| Wang et al. | Bone‐targeted exosomes: strategies and applications | |
| CA2743871A1 (en) | Extracellular matrix compositions for the treatment of cancer | |
| CN106619515A (zh) | 脂质体组合物及其用途 | |
| Zeng et al. | Bone mesenchymal stem cell-derived exosomes involved co-delivery and synergism effect with icariin via mussel-inspired multifunctional hydrogel for cartilage protection | |
| Gao et al. | A progressively targeted gene delivery system with a pH triggered surface charge-switching ability to drive angiogenesis in vivo | |
| Han et al. | Three-dimensional-cultured MSC-derived exosome with hydrogel for cerebral ischemia repair | |
| Shin et al. | Stem cell mimicking nanoencapsulation for targeting arthritis | |
| JP4081436B2 (ja) | 核酸導入を促進させる方法 | |
| Sun et al. | An Antisense Oligonucleotide-Loaded Blood–Brain Barrier Penetrable Nanoparticle Mediating Recruitment of Endogenous Neural Stem Cells for the Treatment of Parkinson’s Disease | |
| CA2450650C (en) | Encapsulated cell therapy | |
| Okamura et al. | Can extracellular vesicles as drug delivery systems be a game changer in cardiac disease? | |
| Sun et al. | Engineered extracellular vesicles as a targeted delivery platform for precision therapy | |
| Song et al. | Biomimetic synthesis and optimization of extracellular vesicles for bone regeneration | |
| Pan et al. | Chondrogenic effect of cell-based scaffold of self-assembling peptides/PLGA-PLL loading the hTGFβ3 plasmid DNA | |
| Chen et al. | Precision cardiac targeting: empowering curcumin therapy through smart exosome-mediated drug delivery in myocardial infarction | |
| Zhang et al. | Charge‐Reversed Exosomes for Targeted Gene Delivery to Cartilage for Osteoarthritis Treatment | |
| KR102172094B1 (ko) | 마이크로스피어-줄기세포 하이브리드 및 이의 약제학적 용도 | |
| Dong et al. | ZIF‐8‐Encapsulated Pexidartinib Delivery via Targeted Peptide‐Modified M1 Macrophages Attenuates MDSC‐Mediated Immunosuppression in Osteosarcoma | |
| Wang et al. | The role of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles in inflammation-associated programmed cell death | |
| Yue et al. | Unlocking the potential of exosomes: a breakthrough in the theranosis of degenerative orthopaedic diseases | |
| Wang et al. | Preparation of genetically or chemically engineered exosomes and their therapeutic effects in bone regeneration and anti-inflammation | |
| Zhou et al. | MSC-exosomes in regenerative medicine |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| AMND | Amendment | ||
| E601 | Decision to refuse application | ||
| AMND | Amendment | ||
| X701 | Decision to grant (after re-examination) | ||
| GRNT | Written decision to grant |