KR20200052017A - 나노 복합체 및 이의 제조 장치 - Google Patents

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Abstract

본 출원은 나노 복합체 및 이의 제조 장치에 관한 것으로, 본 출원의 나노 복합체는 생체 적합성이 우수하고, 목적하는 암 세포의 표적화가 가능하며, 우수한 광열 치료 효율을 나타낼 수 있다.

Description

나노 복합체 및 이의 제조 장치{NANO COMPOSITE AND MANUFACTURING DEVICE THEREOF}
본 출원은 나노 복합체 및 이의 제조 장치에 관한 것이다.
다양한 크기, 형태, 구조, 또는 조성물의 유기 및 무기 성분을 포함하는 다양한 생기능성 나노 복합체(Biofunctional nanocomposite)가 외부 에너지의 적용에 의해 제어되는 자극-반응 암 치료제로서 사용되어왔다. 특히, 금 나노 구조(Au NS)는 대용량의 플라즈마 특성(국부적인 표면 플라즈몬 공명[LSPR] 및 선폭)에 비해 더 넓은 제어 기능을 갖춘 광 반응성 변환을 설계하기 위한 전망을 가지고 있는 복합 재료이다. 최근 다른 금속 성분과의 결합을 기반으로 국부적인 표면 플라즈마 공명(LSPR)을 조율함으로써 광대역 광 흡수 스펙트럼을 생성하는데 Au 기반의 바이메탈 나노 구조를 사용하고 있다. 두 성분 사이의 선형 관계를 이용하여 LSPR 특성을 제어하기 위하여 Au 및 은(Ag), 또는 Au 및 구리(Cu)와 같은 바이메탈 나노 구조의 결정 구조를 조율하였다. Au의 생체 적합성과 결합되어 조율 가능한 광학 특성은 수많은 치료 및 진단 분야에서 Au 기반의 나노 바이메탈이 사용될 수 있음을 의미한다. 그러나, 진보된 생체 의학 분야에서 요구하는 고도의 선택성, 투과성의 침투 방지 특성을 생산하기 위하여 나노 바이메탈 상에 표적화, 탐침(Probing) 및/또는 치료제로서, 유기 성분을 담지하는 것은 필수적이다.
유기 및 무기 재료 간 조합의 상승 효과로 인해 이러한 복합 재료는 진보된 테라노스틱스(Theranostics)로서의 가능성을 나타내지만, 수요가 증가함에 따라 생산에 필요한 혹독하고, 비용이 많이 드는 위험한 일괄 처리 방식으로 인해 어려움을 겪고 있다. 구체적으로, 복합체의 제조는 금속 나노 구조를 생산하고, 표적화 및 치료층을 적재하며, 생체 응용을 위한 준비 단계에서 정제, 분리 및 안정화를 위하여 여러 공정을 필요로 한다. 이는 또한 인체 및 환경적 위험을 초래하는 원치않는 유해한 부산물 및 폐기물을 생성한다. 따라서 이러한 복합 재료를 효율적으로 생산하기 위하여 스케일 업과 자동화를 가능하게 하는 연속 흐름 공정의 개발이 요구되고 있다.
보다 최근에는, 주문형 의약품을 생산하기 위하여 열수 반응의 디지털화가 도입되어 급격한 수요 또는 성분 변화에 대응할 수 있는 제어 가능한 반응 장치로 시스템이 설계 및 구축되었다. 그러나, 무기 나노 입자의 제조를 용이하게 하는 디지털화 가능한 공정에 대한 반응의 추가는 아직 시도되지 않았다. 또한, 합성 의약품을 생산하기 위해 바이메탈 나노 구조를 사용하는 것은 보다 복잡한 공정이 될 수 있으며 이러한 합성물을 실현할 수 있는 시스템을 구축하는 것은 향후 테라노스틱스(Theranostics)에 대한 중요한 도전 과제가 될 것이다. 최근, 가스 흐름에서 전기 방전을 사용하는 경우, 전기 에너지 및 방전 반복률의 변조에 의해 순도가 높은 바이메탈 나노 구조를 생성하였다. 마찬가지로, 서로 다른 금속 막대 사이의 불활성 기체 흐름에서 전기 방전으로 인해 기화된 금속의 핵 형성 및 응축과 온도 구배 하에서의 열역학적 형성은 바이메탈 나노 구조의 형성을 유도하였다. 비록 나노 구조를 생산하기 위하여 전기 온-오프 제어가 가능할지라도, 현재 생체 의학 분야에서의 사용에 대한 관련 보고서는 없다. Au 및 Cu의 유리한(Advantageous) 플라즈몬 특성(장파장 영역에서의 광 흡수)으로 인한 AuCu 나노 바이메탈은 광학 자극 시스템의 실현 가능한 성분일 수 있다. 또한, 다른 귀금속과 비교할 때 Cu가 저렴하고 쉽게 접근할 수 있기 때문에 진보된 치료법의 실현 가능성을 나타낸다. 그러나, 생리 조건 하에서 귀금속 나노 구조의 불활성 특성으로 인해, 표적화, 탐침, 보호 및/또는 치료제로 로딩될 수 있는 접합 가능한 플랫폼을 생산하기 위하여 연속 생산 구성에서 주문형 표면 기능화가 여전히 요구되고 있다.
본 출원의 과제는 생체 적합성이 우수하고, 목적하는 암 세포의 표적화가 가능하며, 광열 치료 효율이 우수한 나노 복합체 및 상기 나노 복합체의 제조 장치를 제공하는 것이다.
본 출원은 나노 복합체에 관한 것이다. 예시적인 본 출원의 나노 복합체에 의하면, 생체 적합성이 우수하고, 목적하는 암 세포의 표적화가 가능하며, 우수한 광열 치료 효율을 나타낼 수 있다.
본 명세서에서 「나노」는 나노 미터(nm) 단위의 크기를 의미할 수 있고, 예를 들어, 0.1 내지 1,000 nm의 크기를 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 명세서에서 「나노 입자」는 나노 미터(nm) 단위의 평균 직경을 갖는 입자를 의미할 수 있고, 예를 들어, 0.1 내지 1,000 nm의 평균 직경을 갖는 입자를 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 명세서에서 「나노 복합체」는 나노 미터(nm) 단위의 평균 직경을 가지며, 2 종류 이상의 물질을 조합한 물질로써 물리적 또는 화학적으로 원래 소재와는 다른 우수한 기능을 갖는 물질을 의미할 수 있다. 예를 들어, 상기 나노 복합체는 1 내지 1,000 nm의 평균 직경을 갖는 복합체를 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 첨부된 도면을 참조로 본 출원의 나노 복합체를 설명하며, 첨부된 도면은 예시적인 것으로, 본 출원의 나노 복합체가 첨부된 도면에 제한되는 것은 아니다.
도 1은 본 출원의 일 구현예에 따른 나노 복합체를 예시적으로 나타낸다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 상기 나노 복합체는 코어부(1100), 쉘부(1200) 및 링커(1300)를 포함한다. 하나의 예시에서, 상기 나노 복합체는 코어-쉘의 2중 구조를 가지는 입자일 수 있다.
상기 「코어」는 상기 2중 구조의 가장 내측에 존재하는 부분을 의미한다. 또한, 상기 「쉘」은 상기 코어를 둘러싸며 상기 2중 구조의 최 외측 부분을 의미한다.
상기 코어부(1100)는 바이메탈(1110) 및 약물(1120)을 포함한다.
상기 바이메탈(1110)은 제 1 금속(1111) 및 제 2 금속(1112)을 포함할 수 있다. 상기 바이메탈(Bimetal)은 열팽창 계수가 서로 상이한 이 종의 금속이 결합된 물질을 의미한다. 예를 들어, 상기 제 1 금속(1111)은 상기 제 2 금속(1112)에 비해 상대적으로 열팽창 계수가 낮을 수 있다. 상기 제 1 금속 및 제 2 금속이 바이메탈을 형성함으로써, 광열 치료 시 광대역의 광을 흡수할 수 있다.
상기 제 1 금속(1111)은 금, 백금, 팔라듐, 루테늄, 로듐, 은, 오스뮴 또는 이리듐으로 이루어질 수 있다. 또한, 상기 제 2 금속은 상기 제 1 금속에 기재된 전이 금속을 제외한 전이 금속 또는 희토류 원소를 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 제 2 금속은 구리, 티타늄, 코발트, 니켈, 철, 스칸듐, 이트륨, 란타넘 또는 악티늄을 포함할 수 있다. 상기 제 1 금속(1111) 및 제 2 금속(1112)이 바이메탈(1110)을 형성함으로써, 포도 송이와 같은 번치(Bunch) 형태를 가질 수 있다. 이에 따라, 상기 나노 복합체는 바이메탈(1110)에 의해 특유의 구조적 형상을 나타내는 코어부(1100)를 포함할 수 있다. 상기 바이메탈(1110)이 번치 형태를 가짐으로써, 아주 작은 입자들이 번치 형태로 모여, 하나의 큰 덩어리 형태와 달리, 입자의 기능을 수행한 후 아주 작은 입자들로 분리되어(Disintegration) 체외 배출 및 분해가 보다 용이한 형태로 변환될 수 있다.
상기 바이메탈(1110)은 제 1 금속(1111) 및 제 2 금속(1112)이 5 중량% 내지 95 중량%:95 중량% 내지 5 중량%로 이루어질 수 있다. 구체적으로, 상기 제 1 금속(1111) 및 제 2 금속(1112)의 중량비는 10 중량% 내지 90 중량%:90 중량% 내지 10 중량%, 20 중량% 내지 80 중량%:80 중량% 내지 20 중량%, 30 중량% 내지 70 중량%:70 중량% 내지 30 중량%, 40 중량% 내지 60 중량%:60 중량% 내지 40 중량% 또는 45 중량% 내지 55 중량%:55 중량% 내지 45 중량%일 수 있다. 상기 제 1 금속 및 제 2 금속이 전술한 중량비로 바이메탈을 형성함으로써, 외부 자극, 예를 들어, NIR에 다양한 강도로 감응할 수 있어, 우수한 광열 치료 효율을 나타낼 수 있다.
상기 약물(1120)은 상기 바이메탈(1110)에 담지된다. 본 명세서에서 「담지된다」는 어떤 물질이 또 다른 어떤 물질에 침투하여 담긴 상태를 의미하며, 예를 들어, 상기 약물(1120)이 상기 바이메탈(1110)에 침투하여 담긴 상태를 의미한다.
상기 약물(1120)로는 항암제를 사용할 수 있다. 상기 항암제는 예를 들어, 독소루비신(Doxorubicin), 파클리탁셀(Paclitaxel), 빈크리스틴(Vincristine), 다우노루비신(Daunorubicin), 빈블라스틴(Vinblastine), 액티노마이신-D(Actinomycin-D), 도세탁셀(Docetaxel), 에토포사이드(Etoposide), 테니포사이드(Teniposide), 비산트렌(Bisantrene), 이마티닙(Imatinib), 시스플라틴(Cisplatin), 5-플루오로우라실(15-Fluorouracil), 아드리아마이신(Adriamycin), 메토트렉세이트(Methotrexate), 부설판(Busulfan), 클로람부실(Chlorambucil), 시클로포스파미드(Cyclophosphamide), 멜팔란(Melphalan), 니트로겐 머스터드(Nitrogen mustard) 및 니트로소우레아(Nitrosourea)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.
하나의 예시에서, 상기 바이메탈(1110)은 약물(1120)의 담지 용량(Loading capacity, LC)이 10% 내지 40%일 수 있다. 구체적으로, 상기 바이메탈(1110)의 약물(1120) 담지 용량은 12% 내지 35%, 15% 내지 30% 또는 17% 내지 27%일 수 있다. 상기 나노 바이메탈의 약물 담지 용량이 전술한 범위를 만족함으로써, 우수한 광열 치료 효율을 나타낼 수 있다.
상기 쉘부(1200)는 상기 코어부(1100)를 둘러싸고, 표적 물질을 포함한다. 본 명세서에서 「둘러싼다」는 입자의 바깥 표면이 실질적으로 덮이도록 형성되는 것을 의미하며, 상기에서 바깥 표면이 실질적으로 덮이도록 형성되는 것은 예를 들면, 바깥 표면의 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상이 덮이도록 형성되는 것을 의미한다.
상기 표적 물질은 목적하는 암세포에 표적화가 가능한 물질을 의미한다. 예를 들어, 상기 표적 물질로는 엽산, RGD 펩타이드, NGR 펩타이드, 트랜스페린(transferrin), 양이온성 물질 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.
상기 양이온성 물질은 양이온성 작용기를 가지는 물질을 의미하며, 예를 들어, 폴리에틸렌이민, 폴리-L-라이신, 키토산, 폴리아미도아민, 폴리아르기닌, 폴리아크릴아미드, 폴리(N-이소프로필아크릴아미드) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
상기 링커(1300)는 상기 코어부(1100)와 쉘부(1200)를 연결한다.
하나의 예시에서, 상기 링커(1300)는 양이온성 작용기 및 음이온성 작용기를 갖는 양쪽성 이온(Zwitterion)물질일 수 있다. 상기 「양쪽성 이온 물질」은 전해질 내에서 이온화되어 전기적으로 양성과 음성을 모두 나타내는 물질을 의미하며, 상기 양쪽성 이온 물질은 양이온성 작용기 및 음이온성 작용기를 모두 가질 수 있다.
상기 양쪽성 이온 물질로는 생체 적합성을 가지며, 양이온성 작용기 및 음이온성 작용기를 가지는 것을 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 양쪽성 이온 물질은 시스테인, 양쪽성 이온 키토산, 3-[N,N-디메틸(3-미리스토일아미노프로필)암모니오]프로판설포네이트, 3-[(3-콜라미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트, 3-[(3-콜라미드프로필)디메틸암모니오]-2-히드록시-1-프로판설포네이트, N-데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판설포네이트, N-도데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판설포네이트, N-테트라데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판설포네이트, 아미도설포베타인-16, 4-n-옥틸벤조일아미도-프로필-디메틸암모니오설포베타인, 3-(1-피리디노)-1-프로판 설포네이트, 설포베타인 메타크릴레이트, 카르복시베타인 메타크릴레이트, 알라닌, 아스파라긴, 글루타민, 글리신, 프롤린, 세린, 티로신, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 트립토판, 발린, 히스티딘 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 양쪽성 이온 물질은 시스테인(c)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 시스테인은 양이온성 작용기로 아민기를 가지고, 음이온성 작용기로 티올기를 가질 수 있다. 하나의 예시에서, 상기 시스테인은 상기 음이온성 작용기로 포함되는 티올기가 양이온으로 대전된 바이메탈과 정전기적 인력에 의해 결합될 수 있고, 상기 양이온성 작용기로 포함되는 아민기가 음이온으로 대전된 표적 물질과 정전기적 인력에 의해 결합될 수 있다.
이에 따라, 본 출원의 나노 복합체는 혈소판 구조를 가질 수 있다. 본 명세서에서 『혈소판 구조』는 혈소판과 같이, 쉘부가 부착 물질로 이루어져 암 세포와의 부착을 주도하는 역할을 수행하고, 코어부에 항암제와 같은 약물이 담지된 구조를 의미한다. 상기 나노 복합체가 혈소판 구조를 가짐으로써, 목적하는 암 세포의 표적화가 가능하며, 우수한 광열 치료 효율을 나타낼 수 있다.
상기 나노 복합체는 pH 5.5의 엔도리소좀(Endo-lysosomal) 내에서 50% 함량의 약물을 방출하는데 걸리는 시간이 3 시간 내지 9 시간일 수 있다. 구체적으로, 상기 조건에서 상기 나노 복합체의 약물 방출 시간은 4 시간 내지 8 시간 또는 5 시간 내지 7 시간일 수 있다. 상기 나노 복합체는 전술한 조건에서 전술한 범위의 약물 방출 시간을 가짐으로써, 우수한 광열 치료 효율을 나타낼 수 있다.
또한, 상기 나노 복합체는 상기 바이메탈(1110)에 10 ㎍/mL의 약물을 담지할 때, 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT) 분석을 이용하여 A549 세포에 대하여 측정한 세포 생존율이 30% 이하일 수 있다. 구체적으로, 상기 조건에서 측정한 나노 복합체의 세포 생존율은 28% 이하, 26% 이하, 24% 이하, 22% 이하 또는 20% 이하일 수 있고, 하한이 5% 이상, 6% 이상, 7% 이상, 8% 이상, 9% 이상 또는 10% 이상일 수 있다. 상기 나노 복합체가 전술한 조건에서 전술한 범위의 세포 생존율을 나타냄으로써, 암세포와 같은 세포의 사멸 효과가 우수할 수 있다. 상기 A549 세포는 폐암세포의 한 종류일 수 있다.
본 출원은 또한, 나노 복합체의 제조 장치에 관한 것이다. 상기 나노 복합체의 제조 장치는 전술한 나노 복합체를 제조하는 장치에 관한 것으로서, 후술하는 나노 복합체에 대한 구체적인 내용은 상기 나노 복합체에서 기술한 내용이 동일하게 적용될 수 있다.
도 2는 본 출원의 일 구현예에 따른 나노 복합체의 제조 장치를 예시적으로 나타낸 도면이다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 상기 나노 복합체의 제조 장치는 방전부(2100), 분무부(2200), 용매 추출부(2300), 제 1 반응부(2400) 및 제 2 반응부(2500)를 포함한다.
상기 방전부(2100)는 방전에 의해 금속 나노 입자를 발생시키며, 바이메탈(21)을 형성하는 부분으로서, 제 1 금속 전극(2111) 및 제 2 금속 전극(2112)을 포함한다.
또한, 상기 제 1 금속 전극(2111) 및 제 2 금속 전극(2112)은 서로 소정 간격을 두고 이격 배치되어 간극을 형성하고 있다. 본 명세서에서 용어 「간극」은 움직이거나 고정된 두 부품 사이의 틈을 의미하며, 예를 들어, 상기 간극은 서로 이격 배치 되어 있는 제 1 금속 전극(2111) 및 제 2 금속 전극(2112) 사이의 틈을 의미한다.
본 명세서에서 「방전」은 전기가 거의 통하지 않는 절연체가 강한 전기장 속에 있을 때, 절연성을 잃고 그 속으로 전류가 흐르는 현상을 의미한다. 상기 방전으로 스파크 방전 또는 아크 방전을 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 하나의 예시에서, 상기 방전으로는 스파크 방전을 이용할 수 있다. 상기 「스파크 방전」은 상압에서 kV-mA 모드로 수행되는 고주파 방전 방식을 의미하고, 「아크 방전」은 진공에서 V-A 모드로 수행되는 고전류 방전 방식을 의미한다.
하나의 예시에서, 상기 방전은 질소 또는 비활성 기체로 이루어진 반응 가스의 흐름 하에 수행될 수 있고, 상기 비활성 기체는 아르곤(Ar), 네온(Ne) 또는 헬륨(He)일 수 있다.
상기 바이메탈(21)은 상기 방전에 의해 발생된 금속 나노 입자 간에 충돌에 의해 응집되어 형성될 수 있다. 구체적으로, 상기 바이메탈(21)은 전술한 반응 가스의 흐름 하에서 상기 금속 나노 입자간에 브라운 열 충돌(Brownian thermal collision)을 통해 연속적으로 응집되어 형성될 수 있다.
상기 제 1 금속 전극(2111) 및 제 2 금속 전극(2112)은 바이메탈 형태를 갖기 위하여, 열팽창 계수가 서로 상이한 금속으로 이루어 질 수 있다. 예를 들어, 상기 제 1 금속 전극(2111)은 상기 제 2 금속 전극(2112)에 비해 상대적으로 열팽창 계수가 낮은 금속을 사용할 수 있다. 상기 제 1 금속 전극 및 제 2 금속 전극이 바이메탈을 형성함으로써, 광열 치료 시 광대역의 광을 흡수할 수 있다.
하나의 예시에서, 상기 제 1 금속 전극(2111)은 금, 백금, 팔라듐, 루테늄, 로듐, 은, 오스뮴 또는 이리듐으로 이루어진 제 1 금속을 포함할 수 있다. 또한, 상기 제 2 금속 전극(2112)은 상기 제 1 금속에 기재된 전이 금속을 제외한 전이 금속 또는 희토류 원소를 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 제 2 금속 전극(2112)은 구리, 티타늄, 코발트, 니켈, 철, 스칸듐, 이트륨, 란타넘 또는 악티늄을 포함할 수 있다.
하나의 예시에서, 상기 제 1 금속 전극(2111) 및 제 2 금속 전극(2112)은 원형 또는 다각형의 단면을 가지는 막대(Rod) 형태로 형성될 수 있다. 또한, 상기 제 1 금속 전극(2111) 및 제 2 금속 전극(2112)의 직경 및 길이는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 상기 제 1 금속 전극(2111) 및 제 2 금속 전극(2112)의 직경은 0.5 내지 20 mm 또는 1 내지 10 mm일 수 있고, 길이는 10 내지 200 mm 또는 50 내지 150 mm일 수 있다.
하나의 예시에서 상기 나노 복합체 제조 장치는 전원부(2120)를 더 포함할 수 있다. 상기 전원부(2120)는 상기 각각의 제 1 금속 전극(2111) 및 제 2 금속 전극(2112)에 전압을 공급하기 위한 부분이다. 상기 전원부(2120)는 상기 제 1 금속 전극(2111) 및 제 2 금속 전극(2112) 각각에 전기적으로 연결되어 있을 수 있다.
하나의 예시에서, 상기 전원부(2120)는 상기 제 1 금속 전극(2111) 및 제 2 금속 전극(2112) 각각에 전원을 인가할 수 있다. 예를 들면, 상기 전원부(2120)는 상기 제 1 금속 전극(2111) 및 제 2 금속 전극(2112) 각각에 교류 전원 또는 직류 전원을 연결하여 신호를 인가할 수 있다. 이에 따라, 입자의 결정성을 보다 다양하게 조절함으로써, 입자의 결정성에 따라 달라지는 안전성을 확보할 수 있다.
하나의 예시에서, 상기 전원부(2120)에서 제어되는 전원은 직류 전원일 수 있고, 상기 직류 전원의 전기장은 5 kV/cm 내지 50 kV/cm일 수 있다. 구체적으로, 상기 직류 전원의 전기장은 10 kV/cm 내지 40 kV/cm 또는 20 kV/cm 내지 30 kV/cm일 수 있다. 상기 제 1 금속 전극(2111) 및 제 2 금속 전극(2112) 각각에 인가되는 직류 전원의 전기장을 전술한 범위 내로 제어함으로써, 아크(Arc) 방전 방식이 아닌 스파크(spark) 방전을 이용하여 무기 입자를 제조하더라도, 상기 제 1 금속 전극(2111) 및 제 2 금속 전극(2112)으로부터 발생되는 입자의 직경을 나노미터 단위로 유지함과 동시에 방전 시, 제 1 금속 나노 입자 및 제 2 금속 나노 입자를 목적하는 비율로 발생시킬 수 있다.
또한, 상기 나노 복합체 제조 장치는 캐리어 기체 공급 시스템(Carrier Air Supply System) 등의 기체 공급 장치(미도시)와, MFC(Mass Flow Controller) 등의 유량계(미도시)를 포함할 수 있다. 또한, 상기 기체 공급 장치 및 유량계에 의해 반응 가스가 상기 제 1 금속 전극(2111) 및 제 2 금속 전극(2112) 사이의 간극으로 정량적으로 공급될 수 있다.
상기 분무부(2200)는 상기 방전부(2100)에서 형성된 바이메탈(21)을 링커를 포함하는 용액에 주입하고 분사하여 액적(22)을 형성하기 위한 부분이다. 구체적으로, 상기 바이메탈(21)은 반응 가스의 흐름에 함유되어 분무부(2200)로 이동하고, 반응 가스 흐름에 함유된 바이메탈(21)은 분무 작업을 수행하기 위한 작동 가스로서, 상기 링커를 포함하는 용액에 주입된다. 이후, 상기 링커를 포함하는 용액을 분무하면 상기 바이메탈(21)이 상기 링커를 포함하는 용액에 삽입되어 하이브리드 액적(22)을 형성할 수 있다.
하나의 예시에서, 상기 링커를 포함하는 용액은 농도가 0.01 mg/mL 내지 1 mg/mL일 수 있다. 구체적으로, 상기 링커를 포함하는 용액의 농도는 0.03 mg/mL 내지 0.8 mg/mL, 0.05 mg/mL 내지 0.6 mg/mL, 0.07 mg/mL 내지 0.4 mg/mL 또는 0.09 mg/mL 내지 0.2 mg/mL일 수 있다. 상기 링커를 포함하는 용액은 전술한 범위의 농도를 가짐으로써, 상기 바이메탈을 충분히 삽입시켜 액적을 형성할 수 있고, 후술하는 용매 추출부에서 링커를 바이메탈에 목적하는 양으로 결합시킬 수 있다.
상기 용매 추출부(2300)는 상기 반응 가스의 흐름에 따라 상기 분무부(2200)에서 형성된 액적(22)으로부터 용매를 제거하고, 상기 액적(22) 내에 존재하는 바이메탈(21) 및 링커를 결합하여 결합체(23)를 형성하기 위한 부분이다.
하나의 예시에서, 상기 용매 추출부(2300)에서는 상기 액적(22)에 자외선을 조사하여, 전술한 작업을 수행할 수 있다. 상기 자외선은 150 nm 내지 200 nm의 파장을 3 초 내지 10 초 동안 조사하여 전술한 작업을 수행할 수 있다. 구체적으로, 상기 자외선은 165 nm 내지 195 nm 또는 180 내지 190 nm의 파장을 4 초 내지 9 초, 5 초 내지 8 초 또는 6 초 내지 7 초 동안 조사할 수 있다. 상기 용매 추출부(2300)에서 상기 액적(22)에 전술한 범위의 조건으로 자외선을 조사함으로써, 용매를 제거할 수 있고, 상기 바이메탈(21)에 링커를 결합시켜 결합체(23)를 형성할 수 있다.
상기 결합체(23)는 전술한 자외선 조사에 의해 상기 액적(22)에 포함된 상기 바이메탈(21) 및 상기 링커를 정전기적 인력에 의해 결합하여 형성할 수 있다. 구체적으로, 상기 액적(22)에 자외선을 조사하면, 상기 바이메탈(21)은 양이온으로 대전되어, 상기 링커에 포함된 양쪽성 이온기 중 음이온성 작용기와 정전기적 인력에 의해 결합되어 결합체(23)를 형성할 수 있다.
상기 제 1 반응부(2400)는 상기 결합체(23) 내부에 상기 약물을 담지하여 약물이 담지된 결합체(24)를 형성하는 부분이다. 상기 제 1 반응부(2400)는 약물을 포함하는 용액을 포함한다. 구체적으로, 상기 용매 추출부(2300)에서 형성된 결합체(23)는 전술한 작동 가스의 흐름 하에 상기 제 1 반응부(2400)로 유입되어 상기 약물을 포함하는 용액에 분산시켜 상기 약물을 상기 결합체(23)에 담지할 수 있다.
상기 약물은 상기 결합체(23), 바람직하게 바이메탈(21)에 모세관 흡입에 의해 담지될 수 있고, 또한 정전기적 인력에 의해 결합되어 담지될 수 있다. 구체적으로, 상기 약물은 양이온을 나타내어, 상기 링커에 포함된 양쪽성 이온기 중 음이온성 작용기와 정전기적 인력에 의해 결합되어 담지될 수 있다.
상기 약물을 포함하는 용액은 전술한 종류의 약물이 용매에 용해된 용액일 수 있다. 상기 용매로는 예를 들어, 물, 알코올, 아세톤, N-메틸 피롤리돈, N,N-디메틸포름아미드, 아세토니트릴, 디메틸 아세트아미드, 디메틸 술폭시드, 프로필렌 카보네이트 및 디클로로메탄으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.
하나의 예시에서, 상기 약물을 포함하는 용액의 농도는 0.1 mg/mL 내지 5 mg/mL일 수 있고, 구체적으로, 0.5 mg/mL 내지 3 mg/mL 또는 0.9 mg/mL 내지 2 mg/mL일 수 있다. 상기 약물을 포함하는 용액의 농도가 전술한 범위를 만족함으로써, 상기 결합체에 목적하는 양의 약물을 담지할 수 있고, 바람직하게는 상기 결합체에 포함된 바이메탈에 목적하는 양의 약물을 담지할 수 있다.
상기 제 2 반응부(2500)는 상기 약물이 담지된 결합체(24)의 외부에 표적 물질을 결합하여 나노 복합체(25)를 형성하는 부분이다. 상기 제 2 반응부(2500)는 표적 물질을 포함하는 용액을 포함한다. 구체적으로, 상기 제 1 반응부(2400)에서 약물이 담지된 결합체(24)는 전술한 작동 가스의 흐름 하에 상기 제 2 반응부(2500)로 유입되어 상기 표적 물질을 포함하는 용액에 분산시켜 상기 표적 물질을 상기 약물이 담지된 결합체(24)의 외부에 결합시킬 수 있다.
상기 표적 물질을 포함하는 용액은 전술한 종류의 표적 물질이 용매에 용해된 용액일 수 있다. 상기 용매로는 예를 들어, 물, 알코올, 아세톤, N-메틸 피롤리돈, N,N-디메틸포름아미드, 아세토니트릴, 디메틸 아세트아미드, 디메틸 술폭시드, 프로필렌 카보네이트 및 디클로로메탄으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.
하나의 예시에서, 상기 표적 물질을 포함하는 용액의 농도는 0.1 mg/mL 내지 2 mg/mL일 수 있고, 구체적으로, 0.5 mg/mL 내지 1.5 mg/mL 또는 0.8 mg/mL 내지 1 mg/mL일 수 있다. 상기 표적 물질을 포함하는 용액의 농도가 전술한 범위를 만족함으로써, 상기 결합체에 목적하는 양의 표적 물질을 결합시킬 수 있다.
상기 나노 복합체(25)는 상기 액적에 포함된 표적 물질 및 상기 링커가 정전기적 인력에 의해 결합되어 형성될 수 있다. 구체적으로, 상기 상기 표적 물질은 양이온을 나타내어, 상기 링커에 포함된 양쪽성 이온기 중 음이온성 작용기와 정전기적 인력에 의해 결합되어 나노 복합체(25)를 형성할 수 있다.
본 출원의 나노 복합체는 생체 적합성이 우수하고, 목적하는 암 세포의 표적화가 가능하며, 우수한 광열 치료 효율을 나타낼 수 있다.
도 1은 본 출원의 일 구현예에 따른 나노 복합체를 예시적으로 나타낸 도면이다.
도 2는 본 출원의 일 구현예에 따른 나노 복합체의 제조 장치를 예시적으로 나타낸 도면이다.
도 3은 AuCu 바이메탈에 시스테인의 삽입을 확인하기 위하여 금(Au), 구리(Cu), 실시예에서 제조된 AuCu 바이메탈 및 실시예에서 제조된 AuCu-c 결합체의 SMPS 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 AuCu 바이메탈에 시스테인의 삽입을 확인하기 위하여 실시예에서 제조된 AuCu 바이메탈 및 실시예에서 제조된 AuCu-c 결합체의 DLS 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5 내지 도 7은 AuCu 바이메탈에 대한 시스테인(c)의 직접 삽입 및 엽산(FA)의 후속 접합을 통한 형태학적 변화를 관찰하기 위하여, 각각 실시예에서 제조된 AuCu 바이메탈, 실시예에서 제조된 AuCu-c 결합체 및 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체의 TEM 이미지이다.
도 8은 3D AFM을 이용하여 촬영한 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체의 표면 정밀 사진이다.
도 9 및 도 10은 각각 실시예에서 제조된 AuCu 바이메탈 및 실시예에서 제조된 AuCu-c 결합체의 저배율 및 고배율 TEM 이미지이다.
도 11 및 도 12는 각각 실시예에서 제조된 AuCu-c 결합체 및 비교예에서 제조된 AuCu-cFA 나노 복합체의 표면 및 광 흡수 특성을 관찰하기 위한 XPS 스펙트럼을 나타낸 그래프이다.
도 13 및 도 14는 각각 실시예에서 제조된 AuCu 바이메탈 및 실시예에서 제조된 AuCu-c 결합체의 UV-vis 스팩트럼 결과를 나타낸 그래프 및 디지털 이미지이다.
도 15는 실시예에서 제조된 AuCu-c 결합체, 비교예에서 제조된 AuCu-cFA 나노 복합체 및 개별 시스테인(c)의 FTIR 스펙트럼을 나타낸 그래프이다.
도 16은 비교예에서 제조된 AuCu-cFA 나노 복합체에 2.5 W/cm2의 출력 밀도를 가지는 레이저를 5 분간 3 회 반복 조사하는 동안의 광 흡수 변화를 나타낸 그래프이다.
도 17은 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체의 분산 안정성을 분석하기 위하여, 30 일 동안 실온에서 PBS의 UV-vis 스펙트럼을 나타낸 그래프이다.
도 18은 실시예에서 제조된 AuCu-c 결합체, 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체 및 실시예에서 제조된 AuCu-c-DOXFA 나노 복합체의 TGA 곡선 결과를 나타낸 그래프이다.
도 19는 PBS에 농도 별로 분산된 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체에 808 nm 파장에서 2.5 W/cm2의 출력 밀도로 조사되는 NIR 레이저의 조사 시간에 따른 온도 상승 결과를 나타낸 그래프이다.
도 20은 PBS에 0.15 mg/mL의 농도로 분산된 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체에 808 nm 파장에서 조사되는 NIR 레이저의 출력 밀도 별로, 조사 시간에 따른 온도 상승 결과를 나타낸 그래프이다.
도 21은 PBS에 0.15 mg/mL의 농도로 분산된 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체에 온(2.5 W/cm2의 출력 밀도로 5 분간 NIR 레이저를 조사)/오프(온도 평원을 나타낼 때까지) 모드를 3 회 수행하여 조사 시간에 따른 온도 상승 결과를 나타낸 그래프이다.
도 22는 PBS에 0.15 mg/mL의 농도로 분산된 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체에 2.5 W/cm2의 출력 밀도로 5 분간 NIR 레이저를 3회 반복 조사하여 광흡수 변화를 나타낸 그래프이다.
도 23은 실시예에서 제조된 AuCu-cDOXFA 나노 복합체의 pH 의존 DOX 방출 결과를 나타낸 그래프이다.
도 24는 NIR 조사 하에 실시예에서 제조된 AuCu-c-DOXFA 나노 복합체로부터의 독소루비신(DOX)의 방출 결과를 나타낸 그래프이다.
도 25 내지 도 27은 각각, MDA-MB-231, MCF-7 및 A549 세포주를 48 시간 배양한 후, 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT) 분석을 이용하여, 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체, 실시예에서 제조된 AuCu-c-DOXFA 나노 복합체 및 개별 독소 루비신(DOX)의 세포 독성을 평가한 그래프이다.
도 28은 MDA-MB-231, MCF-7 및 A549 세포주에 대하여, 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체의 세포 흡수를 측정하기 위한 FACS 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 29는 엽산(FA)의 전처리 유무에 따라 FITC가 담지된 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체로 처리한 세포의 공촛점 이미지를 나타낸다.
도 30은 NIR 조사 유무에 따른 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체의 생/사 분석 결과를 나타낸 역 형광 현미경 이미지이다(스케일 바: 200 ㎛).
도 31은 7-AAD 세포 사멸 키트를 이용하여, MDA-MB-231, MCF-7 및 A549 세포주에 대하여, 개별 독소루비신(DOX), NIR을 미조사한 실시예에서 제조된 AuCu-c-DOXFA 나노 복합체 및 NIR을 조사한 실시예에서 제조된 AuCu-c-DOXFA 나노 복합체로 처리한 후의 세포 사멸 결과를 나타낸다.
도 32는 NIR 조사에 의해 세포 내 활성 산소 종(ROS) 생성에 반응하여 DCF의 녹색 형광을 나타내는 실시예에서 제조된 AuCu-c 결합체와 배양된 세포의 형광 이미지이다.
도 33은 세포 내 DCF의 형광 강도를 측정하여 ROS 생성을 나타낸 유세포 분석 결과 그래프이다.
도 34는 상이한 처리 구성에 따른 BAX, GAPDH, p53의 웨스턴 블롯 이미지이다.
도 35는 MDA-MD-231, MCF-7 및 A549 세포에 대하여, 산화 환원 염료를 사용하여 개별 독소루비신(DOX) 및 실시예에서 제조된 AuCu-c-DOXFA 나노 복합체로 처리한 후의 세포주기 분석 결과를 나타낸 이미지 및 그래프이다.
도 36은 SD 쥐의 적혈구 분산액에서 AuCu 바이메탈과 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체의 용혈 분석을 나타낸 그래프이다.
도 37은 상이한 그룹으로부터 치료된 쥐 그룹에서 상대적 종양 부피 변화를 20일 간 모니터링하고, 5 개 내지 6 개의 샘플의 평균을 나타낸 그래프이다.
도 38은 상이한 그룹으로부터 치료된 쥐 그룹에서 절제된 종양의 평균 무게를 측정하고, 3 개의 샘플의 평균을 나타낸 그래프이고, 도 38의 삽화는 상이한 그룹으로부터 절제된 종양의 디지털 이미지를 나타낸다.
도 39는 상이한 그룹으로부터 20 일 동안 치료된 쥐 그룹의 체중을 나타낸 그래프이다.
도 40은 Cy5.5가 접합된 실시예에서 제조된 AuCu-c 결합체 및 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체의 정맥 내 투여 후 MDA-MB-231 이종 이식 보유 누드 BALB/c 쥐의 생체 내 생체 분포를 측정한 스캔 이미지이다.
도 41은 Cy5.5가 접합된 실시예에서 제조된 AuCu-c 결합체 및 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체의 정맥 내 투여 후 주요 장기 및 종양에서의 생체 외 형광 분포를 측정한 스캔 이미지이다.
도 42는 실시예에서 제조된 AuCu-c 결합체와 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체 3 개의 샘플에 대하여 주요 장기 및 종양의 해당 평균 형광 강도를 나타낸 그래프이다.
도 43은 PBS 및 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체를 투여한 쥐의 종양에 NIR 레이저를 5분 동안 조사한 후 생체 내 광열 이미지를 나타낸다.
도 44는 대조군(Control), NIR을 미조사한 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체, NIR을 조사한 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체, 개별 독소루비신(DOX), NIR을 미조사한 실시예에서 제조된 AuCu-c-DOXFA 나노 복합체 및 NIR을 조사한 실시예에서 제조된 AuCu-c-DOXFA 나노 복합체에 대한 조직 병리학적 및 면역 조직 화학적 분석을 나타낸 광학 현미경 이미지이다.
도 45는 상이한 그룹으로 처리한 후 H&E로 염색한 암컷 BALB/c 흉선 누드 쥐의 주요 장기의 대표적인 조직 병리학적 이미지이다(스케일 바: 120 ㎛).
이하 실시예 및 비교예를 통하여 상기 기술한 내용을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 출원의 범위가 하기 제시된 내용에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예
나노 복합체의 제조
도 2에 나타낸 바와 같이, 방전부(2100), 분무부(2200), 용매 추출부(2300), 제 1 반응부(2400) 및 제 2 반응부(2500)로 구성되고, 단일 통과 가스 흐름으로 직접 연결된 플러그 및 플레이(Plug-and-play) 시스템을 이용한 나노 복합체의 제조 장치를 통해 AuCu-c 결합체를 제조하였다.
구체적으로, 27 cm3 부피의 반응기 내부에서 직경 3 mm의 금(AU-172561, Nilaco, Japan)으로 이루어진 제 1 금속 전극 및 직경 3 mm의 구리(CU-112564, Nilaco, Japan)로 이루어진 제 2 금속 전극 사이의 간극으로 방전에 의해 형성된 1 mm 이하의 직경 및 5500℃ 이하의 고온 채널은 디지털 유량계(Kojima Instruments, Japan)에 의해 1.57 L/min로 제어된 질소 가스 흐름 하에 증발, 응축 및 응집을 통해 AuCu 바이메탈을 제조하였다.
이후, AuCu 바이메탈을 함유하는 흐름을 0.1 mg/mL 농도의 시스테인(c) 용액을 포함하는 분무 장치의 작동 가스로 사용하였다. 장치 내 노즐 근처의 가스 가압을 통해 상기 AuCu 바이메탈을 상기 시스테인(c) 용액에 주입하여, 시스테인을 함유한 AuCu 바이메탈 하이브리드 액적을 분무하였다. 상기 AuCu 바이메탈에 시스테인을 삽입하고 동시에 용매를 추출하기 위해 47℃의 가스 온도에서 6.4 초 동안 185 nm의 자외선(UV)에 상기 하이브리드 액적을 직접 노출시켰다. 광 이온화를 통한 바이메탈에서의 전자 분리는 양으로 대전된 AuCu와 음으로 대전된 시스테인의 티올(SH-)기 사이의 정전기적 인력을 유도하여 AuCu-c 결합체를 형성하였다. 분말 형태로 연마된 알루미늄 막대 상의 정전기 침전을 통해 가스 흐름으로부터 상기 AuCu-c 결합체를 분리하였다.
상기 AuCu-c 결합체를 먼저 독소루비신(DOX)이 1 mg/mL 농도로 용해된 탈 이온수에 분산시키고, 밤새 교반하여 상기 AuCu-c 결합체에 독소루비신(DOX)을 적재하여 코어부를 형성하였다. 이후, 상기 독소루비신(DOX)이 적재된 AuCu-c 결합체를 엽산(FA) 용액에 첨가하였다. 구체적으로, 상기 엽산(FA) 용액은 초음파 조사 하에 5 mL의 디메틸 술폭시드에 4.5 mg의 엽산(FA)을 용해시켜 제조하였다. 엽산(FA)의 카르복실기를 활성화시키기 위하여, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드(EDC, Tokyo Chemical Industry, Japan) 및 N-하이드록시숙신이미드(NHS, Tokyo Chemical Industry, Japan)의 몰수의 1.2 배로 상기 엽산(FA) 용액을 더 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 교반하였다.
최종적으로 상기 독소루비신(DOX)이 담지된 AuCu-c 결합체 분산액을 엽산 용액에 첨가한 다음 3 시간 동안 교반하였다.
엽산(FA) 상의 카르복실기에 남겨진 EDC 및 NHS는 독소루비신(DOX)과의 정전기적 결합에 대해 AuCu-c-DOXFA 음성의 표면 전하를 유발하는 AuCu-c 결합체 상의 아민기와 접합시켰다.
이후, 엽산과 반응된 AuCu-c-DOXFA 나노 복합체를 원심 분리에 의해 수집하고, PBS로 3 회 세척한 후, AuCu-c-DOXFA 나노 복합체 분산액을 특성화 및 생체 분석을 위해 4℃로 저장하였다.
비교예
나노 복합체의 제조
상기 AuCu-c 결합체를 독소루비신(DOX)이 용해된 탈 이온수 대신 독소루비신(DOX)이 용해되지 않은 탈 이온수에 분산시킨 후, 엽산(FA) 용액에 첨가한 것을 제외하고 실시예와 동일한 방식으로 AuCu-c-FA 나노 복합체를 제조하였다.
실험예 1. 특성화
1) 크기 분포
(1) 실험 방법
AuCu-c-FA 나노 복합체로의 시스테인(c)의 삽입을 확인하기 위해, 각각, 0.1 L/min의 샘플링 유속 및 1.0 L/min의 피복 유속으로 작동하는 주사식 입도 분석기(Scanning Mobility Particle Sizer, SMPS, 3936, TSI, USA)를 이용하여 기체 상에서 크기 분포의 이동을 분석하였다. 이때, 스캔 시간은 135 초였다. 또한, AuCu 바이메탈 또는 AuCu-c 결합체를 PBS에 분산시킨 후 663 nm 파장의 He-Ne 레이저 및 90°의 산란 각도를 갖는 동적 광산란법(DLS, Nano-ZS, Malvern Instruments, UK)을 이용하여 크기 분포의 이동을 조사하였다.
(2) 실험 결과
그 결과를 하기 표 1 및 도 3에 나타내었다. 방전 시, 두 개의 다른 전극이 사용되었으나, 제품은 균일한 Au 또는 Cu 방전과 유사한 단일 모드의 나노 크기 분포를 나타내어, 이종(Heterogeneous) 방전에 의해 잘 결합된 AuCu 나노 바이메탈을 생성한다는 것을 입증하였다. 생성된 AuCu 바이메탈은 가스 가압을 통해 분무부의 노즐에서 하이브리드 액적을 형성하기 위하여 시스테인(c) 용액과 혼합하고, 이어서 단일 통과 가스 스트림으로 AuCu-c 결합체를 생성하기 위하여 광자 장치에서 6.2eV의 광자에 노출시켰다. 또한, SMPS를 사용하여 가스 흐름에서 AuCu-c 결합체의 크기 분포를 측정하였으며, 그 결과, 단일 분자 분포를 나타내어 시스테인 분자가 AuCu 바이메탈을 고르게 코팅하는 것을 나타냈다. 이러한 특성은 도 4에 나타낸 바와 같이, 인산염 완충 식염수(PBS)에 분산된 실시예에서 제조된 AuCu 바이메탈 또는 AuCu-c 결합체의 동적 광산란(DLS, Nano ZS, Malvern Instruments, UK) 분석을 통해 확인하였다. 또한 DLS 측정 시 사용된 AuCu 바이메탈 및 AuCu-c 결합체는 다중 산란을 유도하여 농도가 상당히 높기 때문에 평균 크기의 차이가 있었지만 결과는 단일 크기 분포를 나타내었다. 또한, 도 3에 나타낸 바와 같이, 조립 시 더 큰 크기 및 더 작은 농도 방식으로 큰 변화를 유발하는 시스테인 액적에 여러 개의 AuCu 바이메탈이 포함되어 있으므로, AuCu 바이메탈과 AuCu-c 결합체 사이의 크기 분포에서 상당한 차이를 나타냈다. 즉, AuCu 바이메탈 또는 Au, 및 시스테인 또는 Cu 사이의 결합은 이종 구조를 유지하기 위해 수상(Aqueous phase)에서도 충분히 견고하다는 것을 의미하였다. 또한, AuCu 바이메탈 및 AuCu-c 결합체의 표면 전하는 각각 - 7.3 mV 및 - 16.4 mV인 것으로 나타났다. 시스테인의 양쪽성 이온(Zwitterionic) 특성으로 인해, AuCu-c 결합체는 더욱 음의 값을 나타낼 수 있다.
Au Cu AuCu AuCu-c
기하 평균 직경(GMD) (nm) 41.11 41.96 43.35 120.12
기하 표준 편차(GSD) 1.37 1.45 1.46 1.66
총 수 농도(TNC)(particles/cm3) 6.43Х106 7.36Х106 7.97Х106 2.38Х106
2) 형태학
(1) 실험 방법
투과 전자 현미경(TEM, Tecnai G2 F20 S-TWIN, FEI, USA)을 이용하여 실시예에서 제조된 AuCu 바이메탈, 실시예에서 제조된 AuCu-c 결합체 및 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체 샘플의 형태를 관찰하였다. 실시예에서 제조된 AuCu 바이메탈 및 실시예에서 제조된 AuCu-c 결합체의 직접 기상 증착 또는 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체의 AuCu-c-FA 용액 적하 및 후속 건조를 통해 200 메쉬의 탄소가 코팅된 구리 격자(Tedpella, USA) 상에 샘플을 수집하였다. 운모판에 증착된 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체의 3 차원 영상은 반경 10 nm의 상용 피라미드형 실리콘 팁 및 0.1 N/m의 공칭(Nominal) 힘의 상수를 갖는 탭핑(Tapping) 모드에서 AFM(Nanoscope IIIa, Digital Instruments Co., USA)을 사용하여 수행하였다.
(2) 실험 결과
도 5 내지 도 7에 나타낸 바와 같이, 형태학적 진화는 투과 전자 현미경 측정을 이용하여 평가하였다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 동시에 기화된 Au 및 Cu의 핵 생성 및 응축으로 인해 1 차적으로 Au 입자 및 Cu 입자를 생성하였다. 이후, 상기 Au 입자 및 Cu 입자는 가스 흐름에서 브라운 열 충돌(Brownian thermal collision)을 통해 연속적으로 응집되어 AuCu 바이메탈을 형성하였다. 또한, 도 6에 나타낸 바와 같이, 시스테인(c) 분자의 존재 하에서 광자 조사는 상기 AuCu 바이메탈을 AuCu-c 결합체로 전환시키고, 또한, 도 7에 나타낸 바와 같이, 상기 AuCu-c 결합체를 엽산(FA) 용액에 담금으로써 엽산(FA)이 결합되어 상기 AuCu 바이메탈이 혈소판 구조를 갖는 AuCu-c-FA 나노 복합체로 변형되었다. 또한, 원자력 현미경(AFM, Nanoscope IIIa, Digital Instruments Co., USA)을 이용하여 상기 AuCu-c-FA 나노 복합체의 혈소판 구조를 확인하였다. 도 8에 나타낸 바와 같이, AuCu-c 결합체와의 타이트한 엽산(FA) 결합이 가능한지를 나타내며, 혈소판 구조에서는 AuCu 점이 거의 나타나지 않았다. 즉, AuCu-c 결합체 표면의 아민기는 수성 상에서 엽산(FA)과의 결합이 가능함을 알 수 있었다. 시스테인(c)의 삽입 및 후속 엽산의 결합에서 크기의 증가는 SMPS 및 DLS 분석의 결과와 일치하였다.
도 9에 나타낸 바와 같이, AuCu 바이메탈의 고배율 TEM 이미지는 Au(밀러 [111] 면심 입방(fcc) Au 면에 대한 0.234 nm의 d-간격) 및 Cu([111] 면심 입방(fcc) Cu 면에 대한 0.210 nm의 d-간격)의 개별 결정 구조를 나타내었다. 이는 다른 열역학적 성질, 즉, 융점에 의해 AuCu는 합금이 아닌 바이메탈 특성을 나타냄을 입증하였다. 도 10에 나타낸 바와 같이, AuCu-c 결합체의 고배율 TEM 이미지는 대부분 두 개의 다른 결정을 나타내었다. 그러나, 상기 Au 및 Cu 각각의 d-간격은 0.285 nm 및 0.224 nm로서, fcc Au 면 및 Cu 면과 일치하지 않았다. 이러한 차이점은 결정형 Au 또는 Cu 매트릭스에 직접 시스테인(c)의 삽입이 광 반응을 통해 이루어질 수 있음을 나타내며, 결합 가능한 광 반응 플랫폼 조립을 위한 플러그 앤 플레이(Plug-and-play) 방식의 실현 가능성을 입증하였다. 또한, AuCu로 시스테인(c)의 삽입을 확인하기 위해 개별 Au 및 Cu 원자, 실시예에서 제조된 AuCu 바이메탈 및 AuCu-c 결합체의 원자가 상태를 결정하였다. 도 11은 84.3 eV 및 87.7 eV의 결합 에너지에서 전형적인 이중선으로 분해될 수 있는 AuCu 바이메탈의 Au 4f 코어 신호를 나타내며, 각각 0 원자가 상태의 4f7/2의 벌크 Au 원자 및 Au 4f5/2의 표면 Au 원자에 기여하였다. AuCu 바이메탈에서 Cu와의 전기적 상호 작용으로 인해, Au 4f7/2의 경우 84.1 eV로 Au 4f5/2의 경우 87.6 eV로 피크가 약간 이동하였다.
AuCu-c 결합체를 형성하기 위한 광자 조사에 의해 시스테인(c)과의 AuCu 반응에서 Au 결합 에너지는 4f7/2의 경우 83.1 eV로, 4f5/2의 경우 86.9 eV로 현저히 감소하였고, 밴드 폭이 넓어졌다. 이는 AuCu 바이메탈로 시스테인(c)의 삽입이 원자가 상태의 변화를 유도하여 단일 통과 가스 흐름에서 광 반응이 AuCu 바이메탈을 직접 결합할 수 있음을 나타내었다. 도 12에 나타낸 바와 같이, 광 반응 후에 Cu 2p 코어 신호로 유사한 결과가 획득되었으나, 9.23 eV의 개별 Au와 비교하여, 개별 Cu는 7.73 eV의 낮은 이온화 포텐셜로 인해 Cu2+의 존재 하에 약 943 eV 및 962 eV에서 위성 피크를 나타냈다. 그러나, AuCu 신호는 위성 밴드를 나타내지 않아 전기 방전으로 이온화하는 금속이 더 낮은 이온화 포텐셜을 위해 바람직하다는 것을 확인하였다.
3) 광학, 표면 및 열 중량 특성
(1) 실험 방법
PBS에 분산된 실시예에서 제조된 AuCu 바이메탈 및 실시예에서 제조된 AuCu-c 결합체 샘플의 광 흡수 스펙트럼을 UV-vis 분광 광도계(T60, PG Instruments, UK)를 사용하여 측정하였다. 실시예에서 제조된 AuCu 바이메탈 및 실시예에서 제조된 AuCu-c 결합체의 표면 구조는 X-선 광전자 분광 광도계(XPS, Axis-HIS, Kratos Analytical, Japan)를 사용하여 평가하였다.
개별 시스테인(c) 및 엽산(FA)을 포함하는 실시예에서 제조된 AuCu-c 결합체 및 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체의 표면 화학은 600 cm-1 내지 4000 cm-1의 흡광도 모드에서 푸리에 변환 적외선(FTIR, iS-10, Thermo Electron, USA)을 사용하여 분석하였다.
실시예에서 제조된 AuCu-c-DOXFA 나노 복합체에서 결합된 FA와 DOX의 함량을 측정하기 위해, PerkinElmer Diamond TG/DTA 장비를 사용하여 실온에서 700℃로 10℃/min의 속도로 질소 하에서 열중량분석(Thermogravimetric Analysis, TGA)을 수행하였다.
(2) 실험 결과
도 13 및 도 14에 나타낸 바와 같이, 실시예에서 제조된 AuCu 바이메탈 또는 실시예에서 제조된 AuCu-c 결합체를 PBS에 분산시킨 후 UV-vis 분광 광도계를 이용하여 상기 실시예에서 제조된 AuCu 바이메탈 또는 실시예에서 제조된 AuCu-c 결합체의 광 반응 후 광 흡수 스펙트럼의 변화 여부를 결정하였다. 바이메탈 형태의 플라즈몬 결합은 개별 Au 및 Cu 보다 더 넓은 NIR 흡수 창을 명확하게 유도하였다. Au-Cu 내에 시스테인이 삽입되는 입자간의 결합을 통해 AuCu 바이메탈의 공명(Resonance) 스펙트럼에서 확장을 유도하는 반응 동안 양극성으로 대전된 Au 또는 Cu, 및 음극성으로 대전된 티올에 의한 c 분자 사이의 결합으로 인해 6.4 초 동안 광 반응 후 약 550 nm에서 AuCu 바이메탈의 특성 밴드가 넓어졌다.
도 15에 나타낸 바와 같이, 푸리에 변환 적외선 분광법(FTIR, iS-10, iS-10, Thermo Electron, USA)을 사용하여 시스테인(c) 삽입과 연속적인 엽산(FA)의 결합을 개별 시스테인(c) 및 엽산(FA)과 비교하였다. 시스테인(c)의 스펙트럼은 2700 cm-1 내지 3300 cm-1의 광대역을 나타내었고, 이는 아민기의 NH 스트레칭 모드에 할당될 수 있으며, 약 2550 cm-1에서 SH-기에 할당될 수 있는 상대적으로 작은 피크를 나타내었다. 이러한 특성 밴드의 크기는 약간의 밴드 위치의 변화로 인해, 실시예에서 제조된 AuCu-c 결합체의 스펙트럼이 현저하게 감소되었고, 단일 통과 광 반응에서 직접 시스테인(c)의 삽입이 달성되었음을 나타내었다. 엽산(FA)의 스펙트럼은 약 1600 cm-1에서 강한 피크를 나타내었는데, 이는 엽산(FA)의 아미드기 및 산성기로부터 카보닐의 스트레칭 진동에 기인하였다. 약 1500 cm-1에서 다른 피크는 각각 벤조 진동 및 방향족 고리 스트레칭 진동에 기인하였다. 유사하게, 이들 주요 피크는 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체에서 위치 이동 및 강도 감소를 나타내어, 엽산(FA)이 AuCu-c 결합체 상에 담지되었음을 확인하였다. 도 16에 나타낸 바와 같이, 실시예에서 제조된 AuCu-c 결합체, 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체 및 개별 엽산(FA)을 비교하기 위하여 UV-vis 스펙트럼으로 엽산(FA) 결합을 확인하였다. 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체는 약 350 nm에서 엽산(FA)의 특성 흡수 피크가 검출되었으나, AuCu-c 결합체는 특징 없는 스펙트럼을 생성하여, 엽산(FA)이 실제로 AuCu-c 결합체와 결합되었음을 나타내었다. 400 nm보다 긴 파장에서 광대역 흡수 스펙트럼은 현저하게 변화하지 않았다. 이는, 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체가 세포 표적화를 위해 엽산 수용체(FR)를 이용하고 광열 전환을 위한 광을 흡수하는데 모두 활성일 수 있음을 의미하였다. 도 17에 나타낸 바와 같이, 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체의 콜로이드 안정성은 PBS에 분산 시 UV-vis 스펙트럼을 모니터링하여 조사하였으며, 한 달 동안의 전체 실험 기간 동안 유의한 변화가 발견되지 않았다. 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체의 단극 표면 전하는 반발력을 통해 이러한 안정성을 유도할 수 있으며, 이는 또한 엽산(FA)과 AuCu-c 결합체의 효과적인 결합을 나타낼 수 있음을 의미하였다.
도 18에 나타낸 바와 같이, 질소 흐름 하에 25℃ 내지 750℃의 온도 범위에서 실시예에서 제조된 AuCu-c 결합체, 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체 및 실시예에서 제조된 AuCu-c-DOXFA 나노 복합체의 열중량분석(TGA, Diamond TG / DTA, PerkinElmer, USA)을 수행하였다. 비교에에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체에 비해 담지된 독소루비신(DOX) 열분해와 관련이 있는 실시예에서 제조된 AuCu-c-DOXFA 나노 복합체는 27.35%의 중량 손실을 나타냈다. 또한, 열중량분석(TGA)은 결합된 엽산(FA)의 양이 6.77%임을 제공하였다. 플라즈몬 표면에 근접하여 켄칭되는 것으로 알려진 형광 분석법인 분광 분석법은 엽산(FA)의 함량을 결정하는데 사용되지 않았다.
공지된 양의 동결 건조 AuCu-c-DOXFA 나노 복합체로부터 독소루비신(DOX)을 용해함으로써 AuCu-c-FA 나노 복합체 상으로의 독소루비신(DOX)의 담지 용량을 결정하였다. 이는 21.9 ± 4.6 w/w%인 것으로 나타났고, TGA에 의해 결정된 값과 일치하였다. 이러한 용량은 양이온 독소루비신(DOX)이 시스테인(c)의 카복실기에 정전기적으로 결합한 것뿐만 아니라, 삽입된 1 차 Au 입자 및 Cu 입자 사이의 공극으로부터 모세관(Capillary) 흡입에 의해 나타났다.
4) 광열 활성
(1) 실험 방법
808 nm 섬유 결합 IR 다이오드 레이저 모듈(FC-W-808 nm-30 W, Changchun New Industries Optoelectronics Technology, China)을 이용하여 NIR 레이저 조사에 의한 PBS에 분산된 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체의 온도 상승을 분석하였다. 조사 거리는 10 cm로 고정하고, 레이저 모듈은 10 cm의 고정 거리에서 연속 모드로 작동시켰다. 열 화상 및 등고선은 열 화상 카메라(Therm-App TH, Opgal Optronic Industries Ltd., Israel)를 사용하여 기록하였다.
(2) 실험 결과
비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체의 광열 활성은 808 nm의 파장 및 2.5 W/cm2의 출력 밀도의 근적외선(NIR) 레이저를 5 분간 조사하여 검사하였다. 도 19에 나타낸 바와 같이, 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체를 포함하는 분산액은 각각 0.10 mg/mL, 0.15 mg/mL 및 0.20 mg/mL의 농도에서 각각 4.04℃/min, 5.66℃/min 및 6.54℃/min의 온도 상승을 나타내었다. 또한, 도 20에 나타낸 바와 같이, 0.15 mg/mL의 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체를 포함하는 분산액은 NIR에 노출되었을 때 각각 1.8 W/cm2, 2.5 W/cm2 및 3.0 W/cm2의 출력 밀도로 증가함에 따라 각각 3.72℃/min, 5.66℃/min 및 6.58℃/min의 온도 상승률을 나타냈다. 도 21에 나타낸 바와 같이, 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체를 반복적으로 조사하면 반복적인 온도 상승이 발생했음에도 불구하고, 각각 순차적으로 5 분씩 노출할 때마다 높이의 크기가 약간 감소하였다. 이는, 용융에 의해 변형되고, 근적외선 흡수 능력을 잃는 Au로 이루어진 제 1 금속 전극과는 달리, 반복적인 NIR 노출 후에도 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체가 광열 능력을 유지한다는 것을 의미하였다. 도 22에 나타낸 바와 같이, 이러한 광 안정성은 각 노출 후에 UV-vis 스펙트럼을 기록하여 더 확인하였다. 808 nm의 파장에서 흡광도는 각각 반복적인 노출 후에 현저하게 감소하지 않았지만, 400 nm 및 800 nm 사이의 밴드 강도는 눈에 띄게 감소하였다. 이러한 강도의 감소는 주문되거나 무질서화된 AuCu 합금을 형성하기 위하여 증가된 광열 온도에서 Cu가 Au로의 고상 확산을 암시하거나, 또는 시스테인(c)과의 추가 반응을 통해 Cu2S를 형성할 수 있음을 나타내었다.
5) 시험관 내(In vitro) 약물 방출
(1) 실험 방법
pH 5.5(ABS, 0.14 M NaCl, 0.1% Tween 20, 종양 내 환경 시뮬레이션) 및 pH 7.4(PBS, 0.14 M NaCl, 0.1% Tween 20, 종양 외 생리적 환경 시뮬레이션)에서 실시예에서 제조된 AuCu-c-DOXFA 나노 복합체로부터 독소루비신(DOX)의 시험관 내 방출 프로파일을 측정하였다. 실시예에서 제조된 AuCu-c-DOXFA 나노 복합체를 투석 주머니(MWCO: 4000-6000 Da, Spectra/Por®, USA)에 넣고, 양 끝을 밀봉한 후, 20 mL의 ABS 또는 PBS가 들어있는 50 mL의 튜브에 담갔다. 이후, 37℃에서 100 rpm으로 작동하는 수조 진탕기(HST-205 SW, Hanbaek ST Co., Korea)에 넣고, 투석을 수행하였다. 방출 매질의 분취량을 소정의 시간 간격으로 회수하고, UV-vis 분광 광도계(U-2800, PerkinElmer, USA)를 사용하여 표준 비색법으로 독소루비신(DOX)의 양을 측정하였다. 독소루비신(DOX)의 방출 패턴도 5분 동안 4 W/cm2으로 NIR 조사한 후 측정하였다.
(2) 실험 결과
도 23에 나타낸 바와 같이, 생리 조건을 모방한 pH 7.4의 인산염 완충 식염수(PBS)와 pH 5.5의 엔도리소좀(endo-lysosomal) 조건을 모방한 아세테이트 완충 식염수에 의해 DOX 방출 프로필을 조사하였다. 실시예에서 제조된 AuCu-c-DOXFA 나노 복합체는 pH 5.5에서 t1/2(50% 함량의 DOX를 방출하는데 필요한 시간)가 약 6 시간 동안 지속된 방출을 나타내었고, pH 7.4에서 t1/2는 약 18 시간 동안 지속된 방출을 나타냈다. 이 pH 의존성 방출은 혈액에서 실시예에서 제조된 AuCu-c-DOXFA 나노 복합체의 장기간 순환 동안 현저히 적은 양의 독소루비신(DOX)이 침출(Leach out)되기 때문에 적합하다. 종양 간질 및 세포 내 엔도리소좀 구획의 낮은 pH는 촉진된 독소루비신(DOX) 방출을 유발하는 동안 보다 효과적인 화학 치료 효과를 나타내었다.
도 24에 나타낸 바와 같이, NIR 조사에 의해 유발되는 실시예에서 제조된 AuCu-c-DOXFA 나노 복합체로부터의 독소루비신(DOX)의 주문형(On-demand) 방출을 추가로 조사하였다. 실시예에서 제조된 AuCu-c-DOXFA 나노 복합체의 분산액에 1 시간 간격으로 5 분간 2 회를 2.5 W/cm2의 출력 밀도로 NIR을 조사하였다. 첫 번째 조사는 독소루비신(DOX)의 21%의 폭발적인 방출을 유도하였고, 두 번째 조사는 또 다른 25%의 갑작스런 방출을 유도하였다. 두 번의 NIR 노출 후 독소루비신(DOX)의 총 방출량은 70 분 동안 85%를 나타냈고, NIR 조사가 없는 경우, 같은 기간 동안 방출 된 전체 방출량은 26%에 불과하였다. 이러한 pH와 광에 의한 방출 특성은 화학 광열 치료로 사용하기 위한 실시예에서 제조된 AuCu-c-DOXFA 나노 복합체의 타당성을 입증하였다.
실험예 2. 생체 분석
1) 시험관 내(In vitro) 세포 독성
(1) 실험 방법
MTT 분석을 이용하여 MCT-7, MDA-MB-231 및 A549 세포에서 NIR 조사 유무에 따른 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체, 실시예에서 제조된 AuCu-c-DOXFA 나노 복합체 및 개별 독소 루비신(DOX)의 시험관 내 세포 독성을 평가하였다. 구체적으로, 96-웰 플레이트(Becton Dickinson Labware, USA)에 높은 포도당 Dulbecco's 변형 이글 배지(DMEM)에 분산된 2Х104의 생존 세포를 접종하고, 배양 표면에 세포를 부착하기 위해 37℃에서 밤새 배양하였다. 샘플의 농도에 따라 상기 세포를 48 시간 동안 처리하였다. 이후, 세포를 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척하고, Dulbecco's 변형 이글 배지(DMEM)에 1.25 mg/mL의 농도로 희석된 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT) 용액 100 μL을 각 웰에 첨가하였다. 어두운 곳에서 3 시간 동안 배양한 후, 세포를 용해시키고, 100 μL의 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 사용하여 살아있는 세포에 의해 형성된 포르마잔(Formazan) 결정을 용해시켰다. 마이크로 플레이트 판독기(Multiskan EX, Thermo Scientific, USA)를 사용하여 570 nm에서 상기 포르마잔의 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율은 하기 일반식 1을 사용하여 계산하였다.
[일반식 1]
세포 생존율(%) = (ODsample - ODblank)/(ODcontrol - ODblank) Х 100
상기 일반식 1에서, ODsample은 570 nm에서 각각 측정한 실시예에서 제조된 AuCu-c-DOXFA 나노 복합체 및 개별 독소 루비신(DOX)의 광학 밀도이고, ODblank는 570 nm에서 측정한 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체의 광학 밀도이며, ODcontrol은 570 nm에서 측정한 인산염 완충 식염수의 광학 밀도이다.
808 nm의 파장 및 0.8 W/cm2의 출력 밀도로 근적외선(NIR)을 150 초 동안 조사한 후 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체 및 실시예에서 제조된 AuCu-c-DOXFA 나노 복합체의 MTT 분석을 수행하였다.
(2) 실험 결과
도 25 내지 도 27 각각에 나타낸 바와 같이, MDA-MB-231, MCF-7 및 A549 세포주를 48 시간 배양한 후, 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT) 분석을 이용하여, 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체, 실시예에서 제조된 AuCu-c-DOXFA 나노 복합체 및 개별 독소 루비신(DOX)의 세포 독성을 평가하였다. 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체는 실험한 농도의 모든 세포주에서 80% 초과의 세포 생존률을 나타내어, 전신 투여를 위한 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체의 생체 적합성을 입증하였다. 이는 AuCu 바이메탈로의 시스테인(c)의 삽입 및 후속 엽산(FA)의 결합에 기인할 수 있다. 독소루비신(DOX)은 모든 세포주에서 1 μg/mL의 IC50으로 모든 세포주에서 용량 의존적 세포 독성을 나타냈다. 하기 표 2에 나타낸 바와 같이, 동등한 양의 독소루비신(DOX)을 함유한 실시예에서 제조된 AuCu-c-DOXFA 나노 복합체와 함께 세포가 배양되었을 때, IC50 값은 절반으로 감소하였다. 이는 엽산(FA)의 결합 및 결과적으로 페이로드(Payload)의 막 횡단(Transmembrane) 전달이 독소루비신(DOX) 전달 효율을 증가시킨다는 것을 의미하였다. 캡슐화된 독소루비신(DOX)은 약물 내성 세포에서 과다 발현될 수 있는 막 횡단 P-glycoprotein 펌프를 통해 세포 유출을 피할 수 있었다. 그럼에도 불구하고, 48 시간 동안의 배양은 배양 중 비특이적인 엔도시틱(Endocytic) 경로를 통한 세포 내 유입으로 인한 것일 수 있는 FR 과발현, 완만한 FR 발현 및 FR 음성의 세 가지 세포주에서 유사한 세포 독성을 유도하였다.
비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체 및 실시예에서 제조된 AuCu-c-DOXFA 나노 복합체의 배양 후 NIR 노출의 효과를 평가하여 화학-광열 활성을 측정하였다. 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체로 배양하고, 0.8 W/cm2의 출력밀도의 NIR을 조사한 모든 세포주는 20 ㎍/mL에서 40% 내지 50%의 세포 사멸을 나타냈으므로 모든 세포 유형에서 광열 사멸이 효과적이었다. 이는, NIR 조사 시, 실시예에서 제조된 AuCu-c-DOXFA 나노 복합체로부터 버스트(Burst) 방출된 독소루비신(DOX)에 세포가 노출되기 때문에, DOX의 존재에 의해 세포 사멸이 더욱 향상되었음을 나타내었다.
IC50 값(㎍/mL)
세포
MDA-MB-231 MCF-7 A549
DOX 1.17356 1.19582 1.05084
NIR을 미조사한 AuCu-c-DOXFA 0.68026 0.58601 0.72399
NIR을 조사한 AuCu-c-DOXFA 0.36488 0.40633 0.5949
2) 세포 내 흡수(Intracellular uptake)
(1) 실험 방법
암 세포에 의한 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체의 세포 흡수는 CLSM(TCS SP2, Leica, Germany)을 사용하여 관찰하였다. MCT-7, MDA-MB-231 및 A549 세포주를 5Х104 cell/mL의 밀도로 둥근 커버 슬립 상에 접종하고, 세포 단층을 형성하기 위해 24 시간 동안 배양하였다. 이후, FITC가 담지된 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체를 각 웰에 첨가하였다. 1 시간 후, 100 ng의 리소트레커 레드(LysoTracker Red)를 첨가하고 10 분간 배양하였다. 이후, 어두운 곳에서 4%의 파라포름알데히드(Paraformaldehyde) 용액으로 커버 슬립을 고정시킨 후, 유리 슬라이드 상에 놓고, 글리세린(Glycerin)으로 밀봉하였다. 수용체 매개 엔도시토시스(Endocytosis)를 평가하기 위하여 FITC가 담지된 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체로 처리하기 전에 5 mM의 엽산(FA)으로 세포를 전처리함으로써 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노복합체의 세포 흡수 분석을 수행하였다.
유세포 분석을 이용하여 암세포의 세포 흡수를 측정하였다. 2Х105의 밀도에서 6-웰 플레이트에 MDA-MB-231, MCF-7 및 A549 세포를 개별적으로 뿌리고, 24 시간 동안 배양하였다. 이후, 세포 흡수의 시간 의존성을 측정하기 위하여, 배양 시간을 변화시키면서 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체를 배양하였다.
이후, 상기 세포를 세척하고, 획득하며, 형광 활성 세포 분류(FACS) 분석(BD FACS Verse, BD Biosciences, USA)을 위해 1 mL의 차가운 PBS에 다시 분산시켰다. 미처리된 세포의 자동 형광을 내부 통제(Internal control)로 사용하였다. 유사하게, 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체에 노출되기 전에 5 mM 엽산 용액으로 세포를 전처리함으로써 섭취에서의 엽산 수용체(FR)의 역할을 분석하였다.
(2) 실험 결과
3 개의 세포주에서 형광-활성 세포 분류(FACS, BD FACS Verse, BD Biosciences, USA) 분석을 이용하여 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)가 담지된 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체의 세포 내 흡수를 모니터링하였다. 도 28에 나타낸 바와 같이, 엽산 수용체(FR)는 MDA-MB-231 세포에서 고도로 발현되고, MCF-7 세포에서는 적당히 발현되며, A549 세포에서는 발현되지 않는 것으로 알려져 있다. 상기 모든 세포주는 FITC가 담지된 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체의 시간 의존적 세포 흡수를 나타내지만, 엽산 수용체(FR) 발현 세포는 비-발현 세포 A549와 동일한 배양 시간에서 MDA-MB-231 > MCF-7 순으로 보다 높은 형광 이동을 나타내었다. 이는 엽산 수용체(FR) 매개 엔도시토시스(Endocytosis)가 중요한 흡수 메커니즘(Mechanism)임을 나타내었다. 이는 엽산 수용체(FR) 과발현 암의 표적화가 AuCu-c 결합체에 대한 FA의 접합에 의해 달성될 수 있음을 의미하였다.
비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체의 표적화 메커니즘을 더 검증하기 위하여 경쟁적 결합 실험을 수행하였다. FITC가 담지된 비교에에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체와 45 분간 배양하기 전에 엽산 수용체(FR)를 완전히 차단하기 위하여 1 시간 동안 과량의 엽산(FA)으로 MDA-MB-231 및 MCF-7 세포를 전처리하였다. 형광 강도는 현저히 감소하여, 이전 엽산 수용체(FR)의 포화 결과로서, 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체의 흡수가 감소되었음을 나타내었다. 또한, 도 29에 나타낸 바와 같이, 공 촛점 현미경(A1Si, Nikon, Japan)을 이용하여 세포 내 지역화(Localization) 연구에 의해 상기 결과를 확인하였다. MDA-MB-231 세포는 FITC가 담지된 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체(녹색 형광)로 배양하고, 리소트레커 레드(Lysotracker Red)(리소/엔도솜에 대한 적색 형광)와 동시에 염색하여, 적색 형광과 중복되는 고강도의 녹색 형광이 관찰되었다. 이는 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체의 엽산 수용체(FR) 매개 엔도솜 내재화가 향상됨을 시사하였다. 대조적으로, 적색 형광과 함께 비 균일한 공동 지역화를 갖는 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체에서 엽산(FA)으로 전처리된 세포는 비교적 약한 녹색 형광 신호를 생성하였다.
MCF-7 세포 또는 FR-음성 A549 세포로 전처리된 엽산(FA)에서 엽산(FA)이 결합된 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체가 엽산 수용체(FR) 발현 암세포에 선택적으로 결합하여 내재화될 수 있음을 확인하는 유사한 경향이 관찰되었다. FACS 및 공 촛점 현미경 분석 모두는 FR 발현 세포 및 FR 음성 세포 둘 모두에서 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체의 세포 흡수를 나타내었다. 이는 비특이적 엔도시토시스가 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체의 세포 내 흡수에 관여하는 것을 확인하였다.
3) 생/사(Live/Dead) 분석
(1) 실험 방법
3Х105 cell/well의 MDA-MB-231, MCF-7 및 A549 세포를 6-웰 플레이트에 뿌리고 24 시간 동안 배양하였다. 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체 100 μg을 상기 6-웰 플레이트에 첨가하고 37℃에서 3 시간 동안 배양하였다. 상기 세포를 세척한 후, 플레이트를 NIR 레이저 초점 하에 놓고, 808 nm의 파장 및 4 W/cm2의 출력 밀도로 2 mm의 빔 직경 하에 1.5 분 간 조사하였다. 이후, 세포를 세척하고, 신선한 DMEM 배지로 교체한 후, 3 시간 동안 배양하였다. 이후, 상기 세포의 단층(Monolayer)은 Calcein-AM(살아있는 세포, 녹색 형광) 및 EthD-1(죽은 세포, 적색 형광) 5 ㎕로 염색된 후, 역 형광 현미경(Eclipse Ti, Nikon, Japan)을 사용하여 관찰하였다.
(2) 실험 결과
도 30에 나타낸 바와 같이, 생/사 분석에 의해 동일한 3 개의 세포주에서 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체의 광 치료 성능을 조사하였다. 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체로 배양된 세포 단층에 2.5 W/cm2의 출력 밀도를 갖는 NIR 레이저 빛을 5 분간 집중시킬 때, 에티듐 호모다이머(Ethidium homodimer, [EthD]-1)에 의해 적색으로 염색된 죽은 세포의 원형 영역이 모든 세포 주에서 나타났다. 오직 조사된 영역에서만 세포 사멸이 일어나는 반면, 처리되지 않은 세포의 조사 후에는 현저한 세포 사멸이 없음을 나타내어, 빔 스팟 및 Calcein-AM에 의해 녹색으로 염색된 살아있는 세포 사이의 뚜렷한 경계가 입증되었다. 이는 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체를 이용한 광열 치료가 인접한 건강 조직을 손상시키지 않으면서 표면 고형 종양에 고도로 국한될 수 있음을 나타내었다.
4) 세포 사멸(Apoptosis)
(1) 실험 방법
PE-annexin V/7-amino actinomycin D(7-AAD) 세포 사멸 키트(BD Biosciences, USA)를 사용하여 MDA-MB-231, MCF-7 및 A549 세포의 세포 사멸(Apoptosis) 분석을 수행하였다. 웰 당 3Х105 세포를 6-웰 플레이트에 올리고, 12 시간 동안 배양하였다. 이후, 상기 6-웰 플레이트에 개별 독소 루비신(DOX)과 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체 및 실시예에서 제조된 AuCu-c-DOXFA 나노 복합체를 첨가하였다. 24 시간 후, 상기 세포를 스크래퍼(Scrapper)로 수거하고 세척한 후, 세포 사멸 측정 키트 사용 절차에 포함된 1Х annexin V 결합 완충액 90 μL에 재 분산시키며, 어두운 곳에서 10 분 동안 3 mL의 PE-Annexin-V 및 7-AAD로 염색하였다. 그 다음, 세포를 0.91 mL의 1 x annexin V 결합 완충액으로 희석하고, 유동 세포 계측기(BD FACS Verse, BD Bioscience, USA)를 사용하여 분석하였다. 또한, 1 W/cm2의 출력 밀도에서 808 nm NIR 레이저를 150 초 조사한 결과를 조사하였다.
(2) 실험 결과
도 31에 나타낸 바와 같이, 상기 세 세포주에서 세포 사멸 정도를 측정하여 실시예에서 제조된 AuCu-c-DOXFA의 세포 독성 메커니즘을 조사하였다. 모든 세포주에서 독소루비신(DOX)은 초기 세포 사멸(EA) 및 후기 세포 사멸(LA) 세포 집단을 증가시켰다. 실시예에서 제조된 AuCu-c-DOXFA 나노 복합체로 배양하고, NIR 레이저 광선을 조사한 세포는 MDA-MB-231(34.87% LA, 49.21% EA) > MCF-7(21.32% LA, 41.25% EA) > A549 (8.51% LA, 28.63% EA) 순으로 세포 사멸을 훨씬 더 많이 나타냈고, 이는 엽산 수용체(FR) 발현 수준과 상관 관계가 있음을 나타냈다. 이는 실시예에서 제조된 Au-C-DOXFA 나노 복합체의 엽산 수용체(FR) 매개 세포 흡수가 고부하 독소루비신(DOX) 전달 및 그에 따른 독소루비신(DOX)이 유도된 세포 사멸의 증진에 중요한 역할을 한다는 것을 의미하였다. NIR 조사만으로는 괴사성 세포 집단을 나타내는 도 31의 각각의 사분면에서 왼쪽 위에 표시된 것처럼 3% 미만의 약간의 괴사가 유발됨을 나타냈다.
5) 새포내 활성 산소 종(ROS) 수준
(1) 실험 방법
2 x 105의 세포를 6- 웰 플레이트에 뿌렸다. 24 시간 배양 후, 세포를 NIR 조사 유무에 따른 실시예에서 제조된 AuCu-c 결합체 및 AuCu-c-DOXFA 나노 복합체로 처리하고, 6 시간 동안 배양하였다. 이후, 세포를 추출하고, PBS로 세척 한 후, 어두운 곳에서 30 분 동안 배지에 10 μM의 농도로 희석된 2',7'-디클로로디하이드로플루오레신 디아세테이트(H2DCFDA)로 염색하였다. 유동 세포 계측법을 이용하여, 세포 내 산화된 생성물, 즉, DCF의 형광을 분석하였다. 세포를 NIR 조사 유무에 따른 실시예에서 제조된 AuCu-c 결합체 및 AuCu-c-DOXFA 나노 복합체로 처리한 후, 형광 현미경(Eclipse Ti, Nikon, Japan)을 이용하여 세포 내 DCF의 형광을 직접 관찰하였다.
(2) 실험 결과
NIR 조사에 의한 실시예에서 제조된 AuCu-c 결합체 및 AuCu-c-DOXFA 나노 복합체의 세포 내 활성 산소 종(ROS) 생성에 대하여 조사 하였다. 도 32에 나타낸 바와 같이, NIR 조사 하에서 실시예에서 제조된 AuCu-c 결합체로 처리한 세포에서 ROS의 생성을 나타내는 2',7'-디클로로플루오레세신(DCF)의 녹색 형광이 분명하게 나타났다. 또한, 도 33에 나타낸 바와 같이, 상기 처리 구성으로 인한 ROS의 생성은 개별 독소루비신(DOX)으로 처리한 것 보다 더 큰 것을 확인하였다. 이는 효과적인 광열 치료를 위한 실시예에서 제조된 AuCu-c 결합체의 감광 용량을 의미하였다. 따라서, 이 특성은 DOXFA가 AuCu-c와 결합되었을 때 특히 MDA-MB-231 및 MCF-7 세포에서 ROS 생성을 위한 바람직한 상승 작용 활성을 유도하였다.
6) 웨스턴 블롯(Western blot)
(1) 실험 방법
MDA-MB-231, MCF-7 및 A549 세포를 4Х105 밀도로 6-웰 플레이트에 뿌리고, 24 시간 동안 배양하였다. 그 후, 세포를 처리하였다. 세포를 수확하고, 용해시키며, 프로테이나제(Proteinase) 억제제로 처리하고, 얼음에서 40 분 동안 배양하며, 4℃에서 13,000 rpm으로 20 분간 원심 분리하고, 단백질을 함유하는 상등액을 수집하였다. BSA 단백질 분석 키트(Thermo Scientific, USA)를 사용하여 단백질을 정량화하였다. 210 mA의 소듐 도데실 설페이트(Sodium dodecyl sulfate)-10% 폴리아크릴아미드 겔(Polyacrylamide gel)(SDA-PAGE)로 상기 단백질을 전기 영동으로 분리한 후, 폴리비닐리덴 플루오라이드(Polyvinylidene fluoride)(PVDF) 막 (Millipore, Billerica, USA)에 전이시켰다. 1% Tween 20(TBST)을 함유하는 트리스 완충 식염수에서 5% 무 지방 탈지유 현탁액으로 상기 막을 차단하고,
BAX, p53 및 GAPDH(Santa Cruz Biotechnology, Inc., USA) 단백질에 대한 1차 항체로 4℃에서 밤새 배양하였다. 이어서 상기 막을 2 차 항체로 1 시간 동안 배양하고, 화학 발광제를 사용하여 처리하며, 발광 이미지 분석기(LAS-4000 mini, Fujifilm, Japan)를 이용하여 촬영하였다.
(2) 실험 결과
도 34에 나타낸 바와 같이, 독소루비신(DOX)은 국소이성질화효소(Topoisomerase) II를 억제함으로써 DNA 손상을 유도하고, 다기능 전사 인자 p53의 상향 조절을 수반하는 투여량 및 세포 유형에 따라 몇 가지 분자 경로를 세포 사멸로 활성화시켰다. MCF-7과 A549 세포에서 미처리된 대조군에 비해 독소루비신(DOX) 및 실시예에서 제조된 AuCu-c-DOXFA 나노 복합체는 p53 수준을 증가시켜 p53 의존성 항암 메커니즘을 나타냈다. 그러나, MDA-MB-231 세포는 기능적으로 불활성인 돌연변이 p53 유전자를 보유하고 있다. 따라서 이들 세포에서 친-세포 사멸 마커 BAX의 발현을 조사하였다. 레이저 조사 시, 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체로 배양된 세포는 또한 대조군에 비해 p53 또는 BAX 밴드 강도를 증가시켰다. 암세포의 세포 사멸 절제를 조절하는데 광 치료를 사용할 수 있다는 것을 증명하였다. 세포 사멸의 유도와는 별개로, 세포 증식 억제 약물 및 독소루비신(DOX)에 의한 DNA 손상은 또한 암 세포에서 세포주기를 정지시켰다.
7) 세포 주기
(1) 실험 방법
독소루비신(DOX)과 실시예에서 제조된 AuCu-c-DOXFA 나노 복합체를 0.1 μg/mL의 동일한 농도로 처리한 후, 세포 시계 분석(Biocolor Ltd., UK)를 이용하여 MDA-MB-231, MCF-7 및 A549 세포의 세포주기 상을 분석하였다. 상기 세포 4Х105 cell/well를 6-웰 플레이트에 뿌리고, 37℃에서 12 시간 배양한 후, 상기 독소루비신(DOX)과 실시예에서 제조된 AuCu-c-DOXFA 나노 복합체로 처리하고, 24 시간 동안 배양하였다.
이후, 상기 6-웰 플레이트에 150 μL의 세포 시계 염료 시약을 첨가하고, 1 시간 동안 배양한 후, PBS로 세척하고, 역 형광 현미경(Eclipse Ti, Nikon, Japan)으로 측정하였다. G2/M, S 및 G0/G1 상의 세포는 각각 어두운 청색, 녹색 및 황색으로 염색되어 관찰되었다. imageJ 소프트웨어를 사용하여 광학 이미지로부터 상이한 세포 주기 상을 나타내는 상이한 색상의 픽셀을 정량화하였다.
(2) 실험 결과
도 35에 나타낸 바와 같이, 산화 환원(Redox) 염료를 사용하여 실시예에서 제조된 AuCu-c-DOXFA 나노 복합체로 처리 후 상기 세 세포주의 세포주기 분석을 수행하였다. MDA-MB-231 세포에서, 독소루비신(DOX)은 주로 G1 상의 세포 주기를 정지시켰다. 독소루비신(DOX)으로 배양된 MCF-7 세포는 G1 상에서 주요 분획, G2M 상에서 작은 분획을 나타내었고, 반면, 독소루비신(DOX)으로 처리된 A549 세포는 G1 검사 지점에서 세포의 유의하게 높은 부분 집단을 나타냈다. 독소루비신(DOX)은 다른 유전적 이상으로부터의 세포의 다양한 발현으로 인해 여러 상에서 세포주기를 파악하였다. 모든 세포에서, DOX의 세포 내재화를 촉진하는 실시예에서 제조된 AuCu-c-DOXFA 나노 복합체로 처리함으로써 이러한 경향이 과장되었다. 한편, 동일한 농도의 DOX를 함유한 실시예에서 제조된 AuCu-c-DOXFA 나노 복합체로 처리한 MCF-7 세포는 G1 상과 비교하여 G2M 상에서 세포의 현저하게 높은 수준을 나타내었으며, 이는 엽산 수용체(FR) 발현 정도와 관련이 있음을 나타냈다.
8) 용혈(Hemolysis)
(1) 실험 방법
건강한 SD 쥐(Sprague Dawley Rat)에서 채취한 신선한 혈액을 사용하여, 용혈 분석을 수행하였다. 구체적으로, 3000Хg의 세기로, 10 분간 원심 분리하여 헤파린 튜브(Heparinized tube)에 상기 적혈구(RBC)를 모으고, 인산염 완충 식염수(PBS)로 3회 세척한 후, 10 % w/v의 정상 식염수로 재현탁하였다. 이후, 0.3 mL의 적혈구 상등액을 상이한 농도의 실시예에서 제조된 AuCu 바이메탈 및 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체와 혼합하고, 37℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 이후, 상기 샘플을 3000Хg, 5 분간 원심 분리하하고, UV-vis 분광 광도계(T60, PG Instruments, UK)를 사용하여 540 nm에서 상등액의 흡광도를 측정하였다. 이후, 용혈률은 하기 일반식 2로 계산하였다.
[일반식 2]
용혈률(%) = (AS-AN)/(AP-AN)Х100
상기 일반식 2에서, AS는 샘플의 흡광도이고, AN은 음성 대조군의 흠광도이며, AP는 양성 대조군의 흡광도이다.
이때, 음성 대조군은 0.3 mL의 적혈구 상등액과 1.2 mL의 인산염 완충 식염수와 혼합된 혼합물이고, 양성 대조군은 0.3 mL의 적혈구 상등액과 1.2 mL의 1% Triton X-100이 혼합된 혼합물이다.
(2) 실험 결과
도 36에 나타낸 바와 같이, 실시예에서 제조된 AuCu-c-DOXFA 나노 복합체의 정맥 내 투여 가능성을 고려하여, 용혈 분석을 통해 적혈구(RBC)와의 상호 작용을 평가하였다. 100 μg/mL 고농도의 미처리된 AuCu 바이메탈은 적혈구에서 약 16%의 막 용해를 유도하는 반면, 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체는 미코팅된 AuCu 바이메탈과 비교하여 같은 농도에서 막 손상과 5% 미만의 용해를 현저하게 감소시켜, 혈액 응고를 향상시켰다.
9) 항 종양 활성
(1) 실험 방법
1 Х 107 세포가 분산된 PBS와 Corning Matrigel Matrix 100 μL이 혼합된 혼합물 100 μL를 5 내지 6 주령의 암컷 BALB/c 누드 쥐(Orient Ltd., South Korea)의 오른쪽 옆구리에 피하 주사하여 MDA-MB-231 이종 이식 쥐 모델을 생성하였다. 종양 체적이 약 100 mm3에 이르면, 쥐를 무작위로 4 내지 6 마리씩 5 그룹으로 나누었다. 한 그룹은 대조군(그룹 1)으로 지정 하고, 생리 식염수를 주입하였다. 반면, 5 그룹, 독소루비신(DOX) 그룹(그룹 2), NIR을 미조사한 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체 그룹(그룹 3), NIR을 조사한 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체 그룹(그룹 4), NIR을 미조사한 실시예에서 제조된 AuCu-c-DOXFA 나노 복합체 그룹(그룹 5) 및 NIR을 조사한 실시예에서 제조된 AuCu-c-DOXFA 나노 복합체 그룹(그룹 6)을 5 mg/kg 쥐 체중에 상당하는 용량으로 쥐의 꼬리 정맥을 통해 3 일 마다 3 번 반복 투여하였다. 그룹 4 및 그룹 6의 쥐는 종양 결절에 808 nm의 파장 및 2.5 W/cm2의 출력 밀도의 NIR 레이저를 3 분 간 조사하였다. 종양 결절의 길이 및 폭은 디지털 버니어 캘리퍼스로 측정하였고, 종양 체적은 하기 일반식 3으로 계산하였다.
[일반식 3]
종양 체적=
Figure pat00001
마찬가지로, 종양 성장 저해율(%)은 하기 일반식 4로 계산하였다.
[일반식 4]
종양 성장 저해율(%)=(Vcontrol-Vtest)/(Vcontrol)Х100
상기 일반식 4에서, Vcontrol은 특정 시간에서 측정한 대조군의 평균 종양 부피이고, Vtest는 동일한 시간에서 측정한 처리 그룹의 평균 종양 부피이다.
쥐는 영남 대학교의 기관 동물 윤리위원회에서 승인한 프로토콜에 따라 처리하였다.
(2) 실험 결과
엽산 수용체(FR)를 표출하는 MDA-MB-231 이종 이식 보유 BALB/c 누드 쥐에서 24 시간 동안 NIR을 조사하거나 미조사한 후 비교에에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체 및 실시예에서 제조된 AuCu-c-DOXFA 나노 복합체의 생체 내 항 종양 효능을 평가하였다. 도 37에 나타낸 바와 같이, 정맥 내 주사 후 시간의 함수로서 상대 종양 부피의 변화를 관찰하였다. 미처리한 대조군은 종양 체적이 급격히 증가하는 것을 나타냈다. NIR을 조사한 비교에에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체 그룹은 14.2%로 종양 부피가 감소하였으나, 대조군, NIR을 미조사한 비교에에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체 그룹 및 NIR을 조사한 비교에에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체 그룹과 같이 독소루비신(DOX)이 없는 그룹 간에는 상당한 차이가 없었다.
대조적으로, 20 일 동안의 실험이 끝날 때까지, 개별 독소루비신 그룹, NIR을 미조사한 실시예에서 제조된 AuCu-c-DOXFA 나노 복합체 그룹 및 NIR을 조사한 실시예에서 제조된 AuCu-c-DOXFA 나노 복합체 그룹과 같이 독소루비신(DOX)이 담지된 그룹은 각각 62.2%, 73.9% 및 87.5%의 감소를 나타냈다. 따라서, 독소루비신(DOX)이 담지된 실시예에서 제조된 AuCu-c-DOXFA 나노 복합체는 표적화 성능으로 인해 개별 독소루비신(DOX)에 비해 종양 퇴행 시 매우 효과적이었고, NIR 조사 시 촉진된 독소루비신(DOX)의 버스트 방출에 의해 더욱 향상되었다. 도 38에 나타낸 바와 같이, 각 그룹에서 임의로 선택된 3 마리의 쥐의 평균 종양 무게 결과는 종양 부피 모니터링과 일치하였다. 도 39은 전신 독성의 지표로서, 각 그룹에서 쥐의 상대적 체중을 측정하고 변화 프로파일을 나타내었다. 개별 독소루비신(DOX) 그룹은 대부분의 날에 약 15%의 체중 감소를 보였으며, 마침내 8% 초과로 안정화되었다. 그러나 다른 그룹에서는 유의한 체중 감소를 나타내지 않았다.
10) 생체 분포
(1) 실험 방법
형광 생체 내 영상 시스템(FOBITM, Neoscience, Korea)을 이용하여 BALB/c 쥐를 갖는 MDA-MB-231 이종 이식편의 주요 장기 및 원발성 종양(Primary tumor)에서 정맥 내 투여된 실시예에서 제조된 AuCu-c 결합체 및 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체의 생체 내 분포를 조사하였다. 쥐의 꼬리 정맥을 통해 접종하기 전에, 시아닌 5.5(Cy5.5) 및 양이온성 NIR 형광 프로브를 실시예에서 제조된 AuCu-c 결합체 및 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체와 결합하였다. 쥐는 마취 하에 억제되었고, 마취 주사 후 6, 12, 24 시간에 825-nm 방출 필터로 스캔하였다. 그 후 쥐를 CO2 질식으로 희생시키고, 종양 및 주요 장기(심장, 폐, 간, 신장 및 비장)의 외관을 절제하며, PBS로 세척한 후, FOBITM으로 스캐닝하였다. 또한, NEOimage 소프트웨어를 사용하여 종양 및 장기의 형광 강도를 측정하였다.
(2) 실험 결과
도 40에 나타낸 바와 같이, 정맥 내 주사 후 피하 MDA-MB-231 이종 이식 종양 보유 쥐에서 Cy5.5-가 결합된 실시예에서 제조된 AuCu-c 결합체 및 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체의 생체 내 생체 분포 영상을 조사하였다. 상부 패널은 6, 12 및 24 시간 주사 후 살아있는 쥐에서 Cy5.5-가 결합된 실시예에서 제조된 AuCu-c 결합체 및 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체의 형광 신호를 나타내었다. 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체가 주입된 쥐에서 Cy5.5 신호는 6 시간에 종양 노드에서 쉽게 나타났고, 실시예에서 제조된 AuCu-c 결합체가 주입된 쥐에서는 신호가 검출되지 않았다. 이는 엽산(FA) 리간드의 엽산 수용체(FR)의 귀한(Homing) 능력이 엽산 수용체(FR)-rich 종양 부위에 대한 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체의 조기 지역화(Localization)를 가져온다는 것을 나타냈다. 실시예에서 제조된 AuCu-c 결합체 및 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체가 종양에 점차적으로 축적됨에 따라, 두 쥐에서 신호 강도는 점차적으로 증가하여 각각 12 시간과 24 시간에서 명확하게 식별할 수 있었다. 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체를 주입한 쥐는 24 시간 동안 주입 후, 인접한 비 종양 조직 사이의 명확한 경계를 갖는 종양 노드 전체에 걸쳐 현저히 높은 형광 신호 강도를 나타냈다. 대조적으로, 실시예에서 제조된 AuCu-c 결합체를 주입한 쥐는 약한 형광 신호 강도와 비교적 작은 영역을 나타냈다. 그럼에도 불구하고, 실시예에서 제조된 AuCu-c 결합체와 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체는 정맥 내 투여 후 장기간의 순환과 양립할 수 있었다. 특히, 실시예에서 제조된 AuCu-c 결합체를 주입한 쥐의 종양 부위에서 형광 신호가 집중적으로 나타나므로, 누출된 미세 혈관을 통해 종양의 간질에 들어갈 수 있는 나노 크기의 입자의 강화된 침투 및 유지 효과라는 메커니즘을 통해 비특이적 및 수동 종양 관류(Passive tumor perfusion)를 발생할 수 있었다. 도 41에 나타낸 바와 같이, 24 시간 후 이산화탄소 질식으로 살아있는 쥐를 희생시켰고, 생체 외 영상을 위해 주요 장기와 원발 종양을 분리하였다. 간, 폐, 신장 및 비장에서 실시예에서 제조된 AuCu-c 결합체와 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체 모두를 확인하였다. 신호는 심장에서 인지할 수 없었다. 독소루비신(DOX)은 심장에서 독성이 높은 것으로 알려져 있기 때문에 독소루비신(DOX) 전달에 임상적으로 유리하였다. 도 42에 나타낸 바와 같이, 주요 장기 및 종양 결절 3 개의 샘플의 형광 신호를 정량화하였다. 주요 장기에서 실시예에서 제조된 AuCu-c 결합체와 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체 사이의 형광 강도에는 유의한 차이가 없었지만, 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체는 실시예에서 제조된 AuCu-c 결합체보다 종양에서 유의하게 큰 형광 강도를 나타냈다. 이는 엽산(FA) 리간드가 엽산 수용체(FR)-음성 정상 조직에 대한 비특이적 결합에 영향을 미치지 않았음을 나타내었다. 엽산 수용체(FR)는 정상 조직 및 상피(Epithelia)에서도 발견되지만, 정점 상피로의 국소화로 인해 순환하는 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체에 비교적 접근하기가 어려웠다.
11) 광열 이미지
(1) 실험 방법
MDA-MB-231 이종 이식을 보유한 누드 BALB/c 쥐에서 생체 내 광열 온열 전위(Photothermal hyperthermia pothential)를 조사하였다. 쥐의 꼬리 정맥을 통해 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 분산액과 별도로 투여하였다. 24 시간 후, 쥐를 마취시키고, 4.0 W/cm2의 출력 밀도로 808 nm의 NIR 레이저에 종양 결절을 노출시켰다. 디지털 열 화상 카메라(Therm-App TH, Israel)를 사용하여 온도 윤곽 화상을 1 분 간격으로 기록하였다.
(2) 실험 결과
도 43에 나타낸 바와 같이, 광열 치료에서 실용 가능성에 대한 추가적인 증거를 제공하기 위해, 꼬리 정맥을 통한 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체 또는 대조군으로서 PBS 주사 시의 약 2000 mm3의 피하 MDA-MB-231 이종 이식 종양 보유 쥐에서 생체 내 광열 온도 상승을 조사하였다. 24 시간 후, 쥐를 억제하고, 종양 결절을 NIR 레이저로 비추었다. 열 화상 카메라(Therm-App TH, Opgal Optronic Industries Ltd., Israel)를 사용하여 실시간 열 화상을 기록하였다. NIR 조사 하에서 5 분 이내에 주변 온도인 29.1℃에서 48.9℃로 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체로 처리한 종양의 국지적 표면 온도가 선형적으로 증가하는 반면, 대조군 쥐에서는 25.4℃에서 32.2℃로 약간 증가함을 나타냈다.
12) 조직 병리학적 및 면역 조직 화학적 분석
(1) 실험 방법
항 종양 연구에서 상이한 쥐 그룹으로부터 무작위로 선택된 MDA-MB-231 이종 이식 종양에서 조직 병리학적 및 조직 형질 변화를 조사하였다. 종양을 안락사 시킨 쥐를 수집하고, 포르말린에 고정시키며, 파라핀에 끼워 놓고, 3 ㎛ 내지 4 ㎛의 마이크로 섹션으로 슬라이스(Slice)하며, 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색하였다. 이후, 미세 절편을 광학 현미경(Nikon, Japan) 하에서 관찰하고, 자동 영상 분석기(iSolution FL ver 9.1, IMT i-solution Inc., Canada)를 사용하여 종양 세포 부피 및 손상되지 않은 종양 세포 점유 영역(종양 질량의 %/mm2)을 측정하였다. 아비딘(Avidin)-비오틴(Biotin)-과산화효소(Peroxidase) 복합체(ABC) 기반의 면역 조직 화학 염색을 통해 종양 미세 조직에서 세포 사멸 마커인 c-Caspase-3 및 절단된(Cleaved) poly(ADP-ribose) polymerase(c-PARP), 혈관 신생 마커(Angiogenetic marker)인 CD31 및 증식 마커(Proliferation marker)인 Ki67을 결정하였다. 자동화된 이미지 분석기 및 SPSS(SPSS Inc., USA)를 사용하여 c-Caspase-3 면역 표지 세포, 및 c-PARP 양성 세포, CD31 양성 세포 및 Ki67 양성세포에 의해 발생된 mm2 영역 당 평균 백분율을 측정하였다.
또한, H&E 염색을 이용하여, 상이한 처리로부터 MDA-MB-231 이종 이식 Balb/c 쥐의 주요 장기, 즉, 심장, 간, 비장, 폐 및 신장의 조직 병리학적 손상을 검사하였다. 주사 후 20 일 간의 항 종양 연구 후, 장기를 절제하고, 10%의 중성 완충 포르말린에 고정시킨 후, 세 부분으로 잘라 내고, 파라핀에 끼우며, 마이크로톰(Microtome)을 사용하여 3 ㎛ 내지 4 ㎛의 슬라이스로 절단한 다음 마지막으로 분석을 위해 H&E로 염색 하였다.
(2) 실험 결과
도 44에 나타낸 바와 같이, 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색을 이용하여 항 종양 연구에서 쥐로부터의 종양 절편에 대한 생체 외 조직학적 분석을 수행하였다. 대조군과 비교하여, 실시예에서 제조된 AuCu-c-DOXFA 나노 복합체로 처리된 쥐는 세포 사멸 응축 및 괴사와 같은 다른 미세 구조 변화와 함께 현저하게 감소된 종양 세포 부피를 나타냈다. 제자리에서(In situ) 면역 조직 화학적 분석은 종양 미세 절편의 단백질에서 c-절단된 Caspase-3, c-poly(ADP-ribose) polymerase(PARP), Ki67 및 CD31(혈소판 내피 세포 분자 1[PECAM-1])의 발현과 일치하는 갈색 염색을 나타내었다. 대조군 및 다른 처리 그룹에 비해 실시예에서 제조된 AuCu-c-DOXFA 나노 복합체 조사 그룹의 종양 샘플에서 세포 사멸 마커인 c-Caspase-3 및 c-PARP는 증가하였고, 이에 반해 혈관 신생 마커인 Ki67 및 증식 마커인 CD31은 유의하게 감소하였다. 조직학적 및 면역 조직 화학적 분석을 위해 요약된 데이터는 하기 표 3에 나타내었다.
그룹 종양 세포 부피
(%/mm2)		 면역 반응 세포 백분율 (종양 질량의 %/mm2)
Caspase-3 PARP Ki-67 CD31(PECAM-1)
대조군 84.73±10.27 2.03±1.05 2.43±1.07 73.20±10.15 57.56±10.17
처리
NIR을 미조사한 AuCu-c-FA 83.47±10.24 2.33±1.08 2.62±1.09 74.70±11.09 53.63±14.45
NIR을 조사한 AuCu-c-FA 80.49±12.46 2.15±0.78 2.92±1.10 76.11±11.31 55.78±14.52
개별 독소루비신 59.07±10.72fgi 20.79±3.34fgh 29.40±4.27fgh 50.03±10.56abc 29.67±6.06fgh
NIR을 미조사한 AuCu-c-DOXFA 42.63±5.46fghk 37.37±7.15fghj 41.32±4.59fghj 29.85±8.04abcd 19.63±2.36fghj
NIR을 미조사한 AuCu-c-DOXFA 32.11±4.80fghjl 60.05±10.05fghjl 67.12±8.41fghjl 18.10±3.26abcde 12.10±3.42fghjl
값은 6 개의 종양 질량 조직학 분야의 평균 ± 표준편차(SD)로 표현된다.
ap는 LDS 테스트에 의한 대조군에 비해서 0.01 미만
bp는 LDS 테스트에 의한 NIR을 미조사한 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체에 비해서
0.01 미만
cp는 LDS 테스트에 의한 NIR을 조사한 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체에 비해서 0.01
미만
dp는 LDS 테스트에 의한 개별 독소루비신(D)에 비해서 0.01 미만
ep는 LDS 테스트에 의한 NIR을 미조사한 실시예에서 제조된 AuCu-c-DOXFA 나노 복합체에 비해서 0.05 미만
fp는 MW 테스트에 의한 대조군과 비교하여 0.01 미만
gp는 MW 테스트에 의한 NIR을 미조사한 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체에 비해서
0.01 미만
hp 및 ip는 각각 MW 테스트에 의한 NIR을 조사한 비교예에서 제조된 AuCu-c-FA 나노 복합체에
비해서 0.01 미만 및 0.05 미만
jp 및 kp는 각각 MW 테스트에 의한 개별 독소루비신(D)과 비교하여 0.01 미만 및 0.05 미만
lp는 MW 테스트에 의한 NIR을 미조사한 실시예에서 제조된 AuCu-c-DOXFA 나노 복합체와
비교하여 0.01 미만
또한, 도 45에 나타낸 바와 같이, 주요 장기의 H&E로 염색된 얇은 절편(Microsection)의 조직 병리학적 관찰을 통해 NIR 조사 유무에 따른 실시예에서 제조된 AuCu-c-DOXFA 나노 복합체, 실시예에서 제조된 AuCu-c 결합체 및 개별 독소루비신(DOX)의 효과를 추가로 분석하였다. 대조군과 개별 독소루비신(DOX) 그룹과 비교하여, 실시예에서 제조된 AuCu-c-DOXFA 나노 복합체 및 AuCu-c 결합체 처리 그룹에서 유의한 조직 병리학적 소견(병변, 위축, 세포 분열 또는 부종)이 관찰되지 않았다. 이는 독소루비신(DOX)의 효과적인 담지, 최소 조기(Premature) 및 바깥 영역으로의 방출을 제안하였다.
13) 통계 분석
결과는 평균 ± 표준편차(SD)로 표시하였다. 스튜던트 t-test 및 여러 군에 대한 일원 분산 분석(one-way ANOVA)을 사용하여 그룹 간의 통계적 유의 수준을 결정하였으며, 데이터는 p<0.05에서 통계적으로 유의하다고 간주하였다.
1100: 코어부
1110, 21: 바이메탈
1120: 약물
1111: 제 1 금속
1112: 제 2 금속
1200: 쉘부
1300: 링커
2100: 방전부
2111: 제 1 금속 전극
2112: 제 2 금속 전극
2200: 분무부
2300: 용매 추출부
2400: 제 1 반응부
2500: 제 2 반응부
22: 액적
23: 결합체
24: 약물이 담지된 결합체
25: 나노 복합체

Claims (19)

  1. 바이메탈 및 상기 바이메탈에 담지되는 약물을 포함하는 코어부;
    상기 코어부를 둘러싸고, 표적 물질을 포함하는 쉘부; 및
    상기 코어부와 쉘부를 연결하는 링커를 포함하는 나노 복합체.
  2. 제 1 항에 있어서, 바이메탈은 금, 백금, 팔라듐, 루테늄, 로듐, 은, 오스뮴 또는 이리듐으로 이루어진 제 1 금속 및 구리, 티타늄, 코발트, 니켈, 철, 스칸듐, 이트륨, 란타넘 또는 악티늄을 포함하는 제 2 금속으로 이루어진 나노 복합체.
  3. 제 2 항에 있어서, 바이메탈은 제 1 금속 및 제 2 금속이 5 중량% 내지 95 중량%:96 중량% 내지 5 중량%로 이루어진 나노 복합체.
  4. 제 1 항에 있어서, 약물은 독소루비신(Doxorubicin), 파클리탁셀(Paclitaxel), 빈크리스틴(Vincristine), 다우노루비신(Daunorubicin), 빈블라스틴(Vinblastine), 액티노마이신-D(Actinomycin-D), 도세탁셀(Docetaxel), 에토포사이드(Etoposide), 테니포사이드(Teniposide), 비산트렌(Bisantrene), 이마티닙(Imatinib), 시스플라틴(Cisplatin), 5-플루오로우라실(15-Fluorouracil), 아드리아마이신(Adriamycin), 메토트렉세이트(Methotrexate), 부설판(Busulfan), 클로람부실(Chlorambucil), 시클로포스파미드(Cyclophosphamide), 멜팔란(Melphalan), 니트로겐 머스터드(Nitrogen mustard) 및 니트로소우레아(Nitrosourea)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 항암제를 포함하는 나노 복합체.
  5. 제 1 항에 있어서, 바이메탈은 약물 담지 용량이 10 중량% 내지 40 중량%인 나노 복합체.
  6. 제 1 항에 있어서, 표적 물질은 엽산, RGD 펩타이드, NGR 펩타이드, 트랜스페린(transferrin), 양이온성 물질 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 나노 복합체.
  7. 제 1 항에 있어서, 링커는 양이온성 작용기 및 음이온성 작용기를 갖는 양쪽성 이온(Zwitterion)물질인 나노 복합체.
  8. 제 7 항에 있어서, 양쪽성 이온 물질은 시스테인, 양쪽성 이온 키토산, 3-[N,N-디메틸(3-미리스토일아미노프로필)암모니오]프로판설포네이트, 3-[(3-콜라미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트, 3-[(3-콜라미드프로필)디메틸암모니오]-2-히드록시-1-프로판설포네이트, N-데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판설포네이트, N-도데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판설포네이트, N-테트라데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판설포네이트, 아미도설포베타인-16, 4-n-옥틸벤조일아미도-프로필-디메틸암모니오설포베타인, 3-(1-피리디노)-1-프로판 설포네이트, 설포베타인 메타크릴레이트, 카르복시베타인 메타크릴레이트, 알라닌, 아스파라긴, 글루타민, 글리신, 프롤린, 세린, 티로신, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 트립토판, 발린, 히스티딘 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 나노 복합체.
  9. 제 8 항에 있어서, 양쪽성 이온 물질은 시스테인이며, 양이온성 작용기는 아민기이고, 음이온성 작용기는 티올기인 나노 복합체.
  10. 제 1 항에 있어서, 혈소판 구조를 가지는 나노 복합체.
  11. 제 1 항에 있어서, pH 5.5의 엔도리소좀(endo-lysosomal) 내에서 50% 함량의 약물을 방출하는데 걸리는 시간이 3 시간 내지 9 시간인 나노 복합체.
  12. 제 1 항에 있어서, 바이메탈에 10 ㎍/mL의 약물을 담지할 때, 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT) 분석을 이용하여 A549 세포에 대하여 측정한 세포 생존율이 30% 이하인 나노 복합체
  13. 방전에 의해 제 1 금속 전극 및 제 2 금속 전극 사이의 간극으로부터 금속 나노 입자를 발생시키며, 바이메탈을 형성하는 방전부;
    상기 방전부에서 형성된 바이메탈을 링커를 포함하는 용액에 주입하고 분사하여 액적을 형성하는 분무부;
    상기 분부무에서 형성된 액적에 자외선을 조사하여 용매를 추출하고, 상기 바이메탈에 링커가 결합된 결합체를 형성하는 용매 추출부;
    상기 용매 추출부에서 형성된 결합체를 약물을 포함하는 용액에 분산시켜, 상기 결합체 내부에 상기 약물을 담지하는 제 1 반응부; 및
    상기 제 1 반응부에서 약물이 담지된 결합체를 표적 물질을 포함하는 용액에 분산시켜, 상기 약물이 담지된 결합체의 외부에 상기 표적 물질이 결합된 나노 복합체를 형성하는 제 2 반응부를 포함하는 나노 복합체 제조 장치.
  14. 제 13 항에 있어서, 제 1 금속 전극은 금, 백금, 팔라듐, 루테늄, 로듐, 은, 오스뮴 또는 이리듐으로 이루어진 제 1 금속을 포함하고, 제 2 금속 전극은 구리, 티타늄, 코발트, 니켈, 철, 스칸듐, 이트륨, 란타넘 또는 악티늄을 포함하는 제 2 금속을 포함하는 나노 복합체 제조 장치.
  15. 제 13 항에 있어서, 방전부는 질소 또는 비활성 기체로 이루어진 반응 가스의 흐름 하에 방전을 수행하는 나노 복합체 제조 장치.
  16. 제 13 항에 있어서, 링커를 포함하는 용액은 농도가 0.01 mg/mL 내지 1 mg/mL인 나노 복합체 제조 장치.
  17. 제 13 항에 있어서, 자외선은 150 nm 내지 200 nm의 파장을 3 초 내지 10 초 동안 조사하는 나노 복합체 제조 장치.
  18. 제 13 항에 있어서, 결합체는 상기 바이메탈 및 상기 링커가 정전기적 인력에 의해 결합하여 형성되는 나노 복합체 제조 장치.
  19. 제 13 항에 있어서, 나노 복합체는 상기 결합체 및 표적 물질이 정전기적 인력에 의해 결합하여 형성되는 나노 복합체 제조 장치.
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