KR20200038844A - System for monitoring post-translational modification of protein using bio-sensor with gap and manufactureing method for bio-sensor - Google Patents

System for monitoring post-translational modification of protein using bio-sensor with gap and manufactureing method for bio-sensor Download PDF

Info

Publication number
KR20200038844A
KR20200038844A KR1020190084599A KR20190084599A KR20200038844A KR 20200038844 A KR20200038844 A KR 20200038844A KR 1020190084599 A KR1020190084599 A KR 1020190084599A KR 20190084599 A KR20190084599 A KR 20190084599A KR 20200038844 A KR20200038844 A KR 20200038844A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
electrode
impedance
antibody
sensor
post
Prior art date
Application number
KR1020190084599A
Other languages
Korean (ko)
Other versions
KR102265379B1 (en
Inventor
이수현
강지윤
임혜원
이이재
서혜원
Original Assignee
한국과학기술연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국과학기술연구원 filed Critical 한국과학기술연구원
Priority to US16/579,852 priority Critical patent/US11668709B2/en
Publication of KR20200038844A publication Critical patent/KR20200038844A/en
Application granted granted Critical
Publication of KR102265379B1 publication Critical patent/KR102265379B1/en

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/48707—Physical analysis of biological material of liquid biological material by electrical means
    • G01N33/48721—Investigating individual macromolecules, e.g. by translocation through nanopores
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
    • G01N27/3275—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction
    • G01N27/3278—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction involving nanosized elements, e.g. nanogaps or nanoparticles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2440/00—Post-translational modifications [PTMs] in chemical analysis of biological material

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Investigating Or Analyzing Materials By The Use Of Electric Means (AREA)

Abstract

The present invention provides a system for monitoring post-translational modification of protein. The system for monitoring post-translational modification of protein includes: a sensor(100) including a first electrode(140), a second electrode(160) spaced apart from the first electrode(140) to form a gap(G), and at least one monitoring unit(110) comprising an organic dielectric layer(180) covering a part of the first electrode(140) and a part of the second electrode(160) so that an opening(117) communicating with the gap(G) may be formed; and a controlling device(200) including a power applying unit(220) for applying predetermined voltage between the first electrode(140) and the second electrode(160), an impedance measuring unit(230) for measuring impedance(Z) of each of at least two test samples introduced to the sensor(100), and a calculating unit(240) for calculating a change in impedance(Z) by a predetermined method based on the impedance(Z) measured by the impedance measuring unit(230).

Description

갭을 갖는 바이오 센서를 이용한 단백질 번역 후 변형 모니터링 시스템 및 바이오 센서의 제조 방법{SYSTEM FOR MONITORING POST-TRANSLATIONAL MODIFICATION OF PROTEIN USING BIO-SENSOR WITH GAP AND MANUFACTUREING METHOD FOR BIO-SENSOR}TECHNICAL METHODS OF PROTEIN USING BIO-SENSOR WITH GAP AND MANUFACTUREING METHOD FOR BIO-SENSOR

본 출원은 갭을 갖는 바이오 센서를 이용한 단백질 번역 후 변형 모니터링 시스템 및 바이오 센서의 제조 방법에 관한 것이다.The present application relates to a post-translational strain monitoring system using a biosensor having a gap and a method for manufacturing the biosensor.

전 세계에서 알츠하이머 환자는 약 4,680만명으로 추산되고, 20년을 주기로 그 숫자가 2배씩 증가할 것으로 예상되어 2050년에는 약 1억 3,150만명이 될 것으로 예상되며, 알츠하이머 관련 소모 비용도 약 2조 달러에 이를 것으로 추산되고 있다.Alzheimer's patients in the world are estimated at about 46.8 million, and the number is expected to double every 20 years, so that it is expected to be approximately 131.5 million in 2050, and the cost associated with Alzheimer's is about $ 2 trillion. It is estimated to reach.

현재 알츠하이머 질환 치료제는 없으며, 진행 정도를 지연시키는 약물만이 존재하는 실정이다. 따라서, 정확한 진단을 통해 알츠하이머 질환의 진행속도를 파악하고 진행속도를 지연시키는 것이 가장 중요하다.Currently, there is no cure for Alzheimer's disease, and only drugs that delay progression exist. Therefore, it is most important to determine the progression rate of Alzheimer's disease and delay the progression rate through accurate diagnosis.

타우(tau) 단백질의 응집은 알츠하이머 질환(Alzheimer's Disease, AD) 및 여러 신경퇴행성 질환들(타우병증(taupathies)이라 지칭됨)에 있어서 주된 특징으로 알려져 있다. 건강한 신경에서, 타우 단백질은 축색돌기(axon)으로부터의 성장 및 신경 세포 분극화(polarization)를 촉진함으로써 마이크로세관(microtubules)을 안정화한다. 또한 병리학적으로, 타우 단백질이 과다인산화(hyperphosphorylation)되는 경우에, 타우 단백질은 마이크로세관으로부터 분리되어 불용성 응집물을 생성하는 것이 알려져 있다.Aggregation of tau protein is known to be a major feature in Alzheimer's Disease (AD) and several neurodegenerative diseases (referred to as taupathies). In healthy nerves, Tau protein stabilizes microtubules by promoting growth from axons and nerve cell polarization. It is also known pathologically that when Tau protein is hyperphosphorylated, Tau protein is separated from microtubules to produce insoluble aggregates.

알츠하이머 환자들의 뇌에서 비정상적으로 과다인산화된 타우 단백질 및 타우 단백질의 응집체들이 발병원으로서 관찰되며, 타우 단백질의 과다인산화는 일반적으로 타우 단백질의 응집의 원인으로 간주되고 있다.In the brain of Alzheimer's patients, abnormally overphosphorylated tau protein and aggregates of tau protein are observed as pathogens, and hyperphosphorylation of tau protein is generally considered to be the cause of aggregation of tau protein.

또한, 최근 연구 결과에 따르면 타우 단백질의 여러 번역 후 변형(Post Translational Modification, PTM) 형태 중 과다인산화와 O-글리코실화(O-glycosylation)되는 것이 서로 반비례 관계에 있다는 것이 밝혀지고 있다.In addition, a recent study revealed that hyperphosphorylation and O-glycosylation among several types of post translational modification (PTM) of Tau protein are inversely related to each other.

이렇듯, 타우 단백질의 과다인산화 정도 또는 O-글리코실화 정도를 측정할 수 있다면, 알츠하이머 질환의 진행속도나 예후를 판단할 수 있는 데 이용할 수 있다. 또한, 신약 개발에 의해 그 약효를 검증하는 데에도 이용할 수 있다.As such, if the degree of hyperphosphorylation or O-glycosylation of Tau protein can be measured, it can be used to determine the progression rate or prognosis of Alzheimer's disease. It can also be used to verify the efficacy of new drugs.

하지만, 타우 단백질뿐만 아니라 질환 진단의 근거되는 물질의 정량적 분석을 통하여서는 그 결과가 질환을 진단할 수 있을 만큼의 상관성을 보여주지 못하고 있다. 이는 환자 개개인의 개체 차이로 인한 것으로 보이며, 정확한 진단을 위해 정량적 분석보다는 다른 분석 방법이 요구되고 있는 실정이다.However, through quantitative analysis of not only Tau protein, but also a substance for diagnosis of disease, the results do not show a correlation sufficient to diagnose the disease. This seems to be due to individual differences in individual patients, and other analysis methods are required rather than quantitative analysis for accurate diagnosis.

한국공개특허공보 10-2013-0091288호 (2013.02.07)Korean Patent Publication No. 10-2013-0091288 (2013.02.07)

FLEXTau: Quantifying Post-translational Modifications of Tau Protein in Vitro and in Human Disease(W. Mair et al., Anal. Chem. 2016, 88, 3704-3714)FLEXTau: Quantifying Post-translational Modifications of Tau Protein in Vitro and in Human Disease (W. Mair et al., Anal. Chem. 2016, 88, 3704-3714)

본 출원은 센서에 투입되는 샘플의 임피던스를 각각 측정하고, 측정된 임피던스의 변화율을 연산하여 임피던스 측정 대상이 되는 단백질과 관련된 질환에 대한 진단을 높은 신뢰도로 수행하는 갭을 갖는 바이오 센서를 이용한 단백질 번역 후 변형 모니터링 시스템 및 이에 이용되는 바이오 센서의 제조 방법에 관한 것이다.In the present application, a protein is translated using a biosensor having a gap that measures the impedance of a sample input to a sensor and calculates the rate of change of the measured impedance to perform a diagnosis of a disease related to a protein to be measured with high reliability. It relates to a post-strain monitoring system and a method for manufacturing a biosensor used therein.

상기와 같은 과제를 해결하기 위한 본 출원의 일 실시예는, 제1 전극(140), 간극(G)을 형성하도록 상기 제1 전극(140)과 소정 거리 이격되는 제2 전극(160), 및 상기 간극(G)과 연통하는 개구(117)를 형성하도록 상기 제1 전극(140)의 일부와 상기 제2 전극(160)의 일부를 커버하는 유기 절연층(180)을 포함하는 측정 단위부(110)를 하나 이상 포함하는 센서(100) 및 상기 제1 전극(140)과 상기 제2 전극(160) 사이에 기 설정된 전압을 인가하는 전원 인가부(220), 상기 센서(100)에 투입되는 적어도 2개의 측정 대상 샘플의 임피던스(Z)를 각각 측정하는 임피던스 측정부(230), 및 상기 임피던스 측정부(230)에 의해 측정된 임피던스(Z)에 기초하여 기 설정된 방법에 의해 임피던스 변화율(△Z)을 연산하는 연산부(240)를 포함하는 제어 장치(200)를 포함하는, 단백질 번역 후 변형 모니터링 시스템을 제공한다.One embodiment of the present application for solving the above problems, the first electrode 140, the second electrode 160 spaced a predetermined distance from the first electrode 140 to form a gap (G), and A measurement unit part including an organic insulating layer 180 covering a part of the first electrode 140 and a part of the second electrode 160 to form an opening 117 communicating with the gap G ( A sensor 100 including one or more 110, a power supply unit 220 for applying a predetermined voltage between the first electrode 140 and the second electrode 160, and is input to the sensor 100 The impedance change rate (△) by a predetermined method based on an impedance measurement unit (230) for measuring the impedance (Z) of at least two measurement target samples, and the impedance (Z) measured by the impedance measurement unit (230), respectively. Computation monitoring after protein translation, including a control device 200 including a computation unit 240 for calculating Z) Provide a system.

일 실시예에 있어서, 상기 제1 전극(140) 사이와 상기 제2 전극(160) 사이의 간극(G)은 1μm 이하일 수 있다.In one embodiment, the gap G between the first electrode 140 and the second electrode 160 may be 1 μm or less.

일 실시예에 있어서, 상기 간극(G)에 놓여지는 측정 대상 물질은, 마이크로 비드(b) 및 상기 마이크로 비드(b)에 결합되는 제1 항체(10)를 포함하는 제1 결합체(S1), 상기 마이크로 비드(b), 상기 마이크로 비드(b)에 결합되는 제1 항체(10) 및 상기 제1 항체(10)에 결합되는 타겟 단백질(20)을 포함하는 제2 결합체(S2) 및 상기 마이크로 비드(b), 상기 마이크로 비드(b)에 결합되는 상기 제1 항체(10), 상기 제1 항체(10)에 결합되는 상기 타겟 단백질(20) 및 상기 타겟 단백질(20)의 제1 변형 부위에 결합되는 제2 항체(30)를 포함하는 제3 결합체(S3)를 포함할 수 있다.In one embodiment, the measurement target material placed in the gap (G) is a first conjugate (S1) comprising a microbead (b) and a first antibody (10) bound to the microbead (b), The micro-bead (b), the second conjugate (S2) and the micro-comprising the first antibody (10) bound to the micro-bead (b) and the target protein (20) bound to the first antibody (10) Bead (b), the first antibody (10) bound to the microbead (b), the target protein (20) bound to the first antibody (10) and the first modified region of the target protein (20) It may include a third conjugate (S3) comprising a second antibody (30) that is bound to.

일 실시예에 있어서, 상기 간극(G)에 놓여지는 측정 대상 물질은, 상기 마이크로 비드(b), 상기 마이크로 비드(b)에 결합되는 상기 제1 항체(10), 상기 제1 항체(10)에 결합되는 상기 타겟 단백질(20) 및 상기 타겟 단백질(20)의 제2 변형 부위에 결합되는 제3 항체(40)를 포함하는 제4 결합체(S4)를 더 포함하며, 상기 타겟 단백질(20)의 상기 제1 변형 부위의 양과 상기 제2 변형 부위의 양은 서로 반비례할 수 있다.In one embodiment, the measurement target material placed in the gap G is the microbead (b), the first antibody (10) bound to the microbead (b), and the first antibody (10). It further includes a fourth conjugate (S4) comprising a target antibody (20) and a third antibody (40) coupled to a second modification site of the target protein (20), the target protein (20) The amount of the first modified region and the amount of the second modified region may be inversely proportional to each other.

일 실시예에 있어서, 상기 간극(G)에 놓여지는 물질의 임피던스(Z)는, 상기 마이크로 비드(b)에 결합된 물질의 양과 종류가 증가할수록 감소할 수 있다.In one embodiment, the impedance (Z) of the material placed in the gap (G) may decrease as the amount and type of the material bound to the microbead (b) increases.

일 실시예에 있어서, 상기 센서(100)에 상기 제2 결합체(S2)를 포함하는 제1 샘플이 투입되었을 때 측정되는 임피던스를 Z1, 상기 센서(100)에 상기 제3 결합체(S3)를 포함하는 제2 샘플이 투입되었을 때 측정되는 임피던스를 Z2이라 할 때, 상기 연산부(240)에 의해 연산되는 임피던스 변화율은 Z1-Z2/Z1으로 연산될 수 있다.In one embodiment, the impedance measured when the first sample including the second coupling member (S2) is input to the sensor 100 is Z 1 , and the third coupling member (S3) is connected to the sensor 100. When the impedance measured when the containing second sample is input is Z 2 , the impedance change rate calculated by the calculator 240 may be calculated as Z 1 -Z 2 / Z 1 .

일 실시예에 있어서, 상기 센서(100)에 상기 제2 결합체(S2)를 포함하는 제1 샘플이 투입되었을 때 측정되는 임피던스를 Z1, 상기 센서(100)에 상기 제3 결합체(S3)를 포함하는 제2 샘플이 투입되었을 때 측정되는 임피던스를 Z2, 상기 센서(100)에 상기 제4 결합체(S4)를 포함하는 제3 샘플이 투입되었을 때 측정되는 임피던스를 Z3이라 할 때, 상기 연산부(240)에 의해 연산되는 임피던스 변화율(△Z)은 Z1-Z2/Z1-Z3으로 연산될 수 있다.In one embodiment, the impedance measured when the first sample including the second coupling member (S2) is input to the sensor 100 is Z 1 , and the third coupling member (S3) is connected to the sensor 100. When the impedance measured when the second sample containing is input is Z 2 , and the impedance measured when the third sample containing the fourth assembly S4 is input to the sensor 100 is Z 3 , the impedance is measured. The impedance change rate (ΔZ) calculated by the calculator 240 may be calculated as Z 1 -Z 2 / Z 1 -Z 3 .

일 실시예에 있어서, 상기 제어 장치(200)는, 상기 연산부(240)에 의해 연산되는 임피던스 변화율(△Z)을 저장하는 데이터베이스(250)를 더 포함하며, 상기 연산부(240)는 제1 시점에서 연산된 임피던스 변화율(△Z1)과 상기 제1 시점 이후의 제2 시점에서 연산된 임피던스 변화율(△Z2)을 비교함으로써, 비교 결과 데이터를 더 연산할 수 있다.In one embodiment, the control device 200 further includes a database 250 that stores an impedance change rate (ΔZ) calculated by the operation unit 240, and the operation unit 240 is a first viewpoint , comparison may further operation the resulting data by comparing the impedance change rate (△ Z 1) and wherein the impedance change rate calculated at a second time after the first point in time (△ Z 2) in operation.

일 실시예에 있어서, 상기 마이크로 비드(b)는 자성 비드이고, 상기 자성 비드가 상기 개구(117)를 통해 상기 간극(G)에 놓여지도록 안내하는 자성체(300)를 더 포함할 수 있다.In one embodiment, the micro-bead (b) is a magnetic bead, and may further include a magnetic body 300 that guides the magnetic bead to be placed in the gap G through the opening 117.

일 실시예에 있어서, 상기 타겟 단백질(20)은 타우(tau) 단백질일 수 있다.In one embodiment, the target protein 20 may be a tau protein.

일 실시예에 있어서, 상기 타겟 단백질(20)의 상기 제1 변형 부위는 인산화(phosphorylation)된 부분을 포함하고, 상기 제2 변형 부위는 0-글리코실화(O-glycosylation)된 부분을 포함할 수 있다.In one embodiment, the first modified portion of the target protein 20 includes a phosphorylated portion, and the second modified portion may include a 0-glycosylated portion. have.

일 실시예에 있어서, 상기 제2 항체(30)는 상기 타겟 단백질(20)의 상기 인산화된 부분에 결합하는 항체이고, 상기 제3 항체(40)는 상기 타겟 단백질(20)의 상기 O-글리코실화된 부분에 결합하는 항체일 수 있다.In one embodiment, the second antibody 30 is an antibody that binds to the phosphorylated portion of the target protein 20, and the third antibody 40 is the O-glyco of the target protein 20 It may be an antibody that binds to the silanized portion.

또한 본 출원은 기판 상에 제1 금속층을 형성하는 단계, 상기 제1 금속층 위에 제1 포토레지스트 패턴을 형성하는 단계, 상기 제1 금속층을 식각하여, 제1 전극을 형성하고, 상기 제1 포토레지스트 패턴 하부에 언더컷을 형성하는 단계, 상기 제1 금속층이 제거된 영역 및 상기 제1 포토레지스트 패턴 위에 제2 금속층을 형성하는 단계, 상기 제1 포토레지스트 패턴 및 상기 제1 포토레지스트 패턴 위에 배치된 제2 금속층을 제거하는 단계, 상기 제1 전극 및 잔류하는 제2 금속층 위에 제2 포토레지스트 패턴을 형성하는 단계, 상기 잔류하는 제2 금속층을 식각하여, 상기 제1 전극과 소정 거리 이격된 제2 전극을 형성하는 단계 및 상기 제1 전극의 일부와 상기 제2 전극의 일부를 커버하며, 상기 제1 전극과 상기 제2 전극 사이의 간극 위에 개구를 형성하는 유기 절연층을 형성하는 단계를 포함하는, 나노 갭을 갖는 센서의 제조 방법을 제공한다.In addition, the present application includes forming a first metal layer on a substrate, forming a first photoresist pattern on the first metal layer, etching the first metal layer, forming a first electrode, and forming the first photoresist Forming an undercut under the pattern, forming a second metal layer on the first photoresist pattern and the area where the first metal layer is removed, and the first photoresist pattern and the first photoresist pattern 2 removing the metal layer, forming a second photoresist pattern on the first electrode and the remaining second metal layer, etching the remaining second metal layer, and a second electrode spaced a predetermined distance from the first electrode Forming an opening and covering a portion of the first electrode and a portion of the second electrode, and forming an opening over a gap between the first electrode and the second electrode A method of manufacturing a sensor having a nanogap, comprising forming a soft layer.

일 실시예에 있어서, 상기 제1 금속층은, 상기 기판 위에 배치된 무기 절연층 위에 형성될 수 있다.In one embodiment, the first metal layer may be formed on an inorganic insulating layer disposed on the substrate.

일 실시예예 있어서, 상기 제1 전극 사이와 상기 제2 전극 사이의 간극은 1μm 이하일 수 있다.In one embodiment, a gap between the first electrode and the second electrode may be 1 μm or less.

본 출원에 따르면, 서로 반비례 관계를 갖는 타겟 단백질의 번역후 변형 부위에 결합하는 서로 상이한 항체를 이용하여 이들이 결합된 결합체에 대한 임피던스를 각각 측정하고, 그 비율의 변화를 지표로 이용함으로써, 목적하는 번역후 변형에 대응되는 타겟 단백질의 증감 여부 및 증감 정도에 대하여 신뢰성 있는 검출 결과를 얻을 수 있다.According to the present application, by using different antibodies that bind to post-translational modification sites of target proteins having an inverse relationship to each other, the impedances of the conjugates to which they are bound are measured, and the change in the ratio is used as an index to achieve the desired Reliable detection results can be obtained with respect to the increase and decrease of the target protein corresponding to the post-translational modification.

특히, 임피던스 변화율 지표를 이용하여 타겟 단백질과 관련된 질환의 위험도, 진행 속도, 정상 질환과의 구별이 명확히 가능함에 따라, 종래 ELISA를 이용하여 타겟 단백질의 정량적 분석을 통해서는 진단이 명확히 이루어지지 않았던 단점을 해결하였다.Particularly, as it is possible to clearly distinguish the risk, progression rate, and normal disease of a disease related to a target protein using an impedance change rate index, a diagnosis was not made clearly through quantitative analysis of a target protein using a conventional ELISA. Solved.

또한, 어느 하나의 타겟 단백질에 국한되는 것이 아닌, 서로 반비례 관계에 있는 제1 변형 부위 및 제2 변형 부위를 포함하는 타겟 단백질이면 어느 것이든 적용될 수 있어, 단백질 이상과 관련된 질환의 진단에 포괄적으로 이용할 수 있다는 장점을 갖는다.In addition, any target protein including a first modified region and a second modified region that are not limited to any one target protein and inversely related to each other can be applied, and thus can be comprehensively used for diagnosis of diseases related to protein abnormalities. It has the advantage of being available.

또한 서로 반비례 관계를 갖는 번역후 변형 타겟 단백질뿐만 아니라, 하나의 번역후 변형 형태에 대해서도 그 변형 정도를 측정할 수 있어, 단백질 종류와 관계없이 폭넓게 이용이 가능하다는 장점을 갖는다.In addition, since it is possible to measure the degree of modification not only for a post-translational modified target protein having an inverse relationship with each other, but also for one post-translational modification, it has an advantage that it can be widely used regardless of the protein type.

도 1은 본 출원의 실시예에 따른 단백질 번역 후 변형 모니터링 시스템의 구성을 설명하기 위한 개략도이다.
도 2는 도 1의 측정 단위부(110)를 설명하기 위한 도면이다.
도 3은 도 2의 측정 단위부(110)를 설명하기 위한 단면도이다.
도 4는 임피던스 측정 대상이 되는 물질을 설명하기 위한 도면이다.
도 5는 검증 실험 1에 따른 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 검증 실험 2에 따른 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 검증 실험 3에 따른 결과를 나타낸 도면이다.
도 8은 검증 실험 4에 따른 결과를 나타낸 도면이다.
도 9는 검증 실험 5에 따른 결과를 나타낸 도면이다.
도 10은 검증 실험 6에 따른 결과를 나타낸 도면이다.
도 11은 검증 실험 7에 따른 결과를 나타낸 도면이다.
도 12는 임피던스 변화율에 따른 인지 장애 정도의 관계를 나타낸 그래프이다.
도 13은 검증 실험 8-1에 따른 결과를 나타낸 도면이다.
도 14는 검증 실험 8-2에 따른 결과를 나타낸 도면이다.
도 15는 검증 실험 8-3에 따른 결과를 나타낸 도면이다.
도 16은 검증 실험 8-4에 따른 결과를 나타낸 도면이다.
도 17은 검증 실험 8-5에 따른 결과를 나타낸 도면이다.
도 18 및 19는 검증 실험 9에 따른 결과를 나타낸 도면이다.
도 20은 검증 실험 10에 따른 결과를 나타낸 도면이다.
도 21은 본 출원의 실시예에 따른 나노 갭을 갖는 센서의 제조 방법을 설명하기 위한 도면이다.1 is a schematic diagram for explaining the configuration of a protein modification post-translation monitoring system according to an embodiment of the present application.
2 is a view for explaining the measurement unit 110 of FIG. 1.
3 is a cross-sectional view illustrating the measurement unit 110 of FIG. 2.
4 is a view for explaining a material to be measured for impedance.
5 is a view showing the results according to the verification experiment 1.
6 is a view showing the results according to the verification experiment 2.
7 is a view showing the results according to the verification experiment 3.
8 is a view showing the results according to the verification experiment 4.
9 is a view showing the results according to the verification experiment 5.
10 is a view showing the results according to the verification experiment 6.
11 is a view showing the results of the verification experiment 7.
12 is a graph showing the relationship between the degree of cognitive impairment according to the rate of change in impedance.
13 is a view showing the results according to the verification experiment 8-1.
14 is a view showing the results according to the verification experiment 8-2.
15 is a view showing the results according to the verification experiment 8-3.
16 is a view showing the results according to the verification experiment 8-4.
17 is a view showing the results according to the verification experiment 8-5.
18 and 19 are diagrams showing the results according to the verification experiment 9.
20 is a view showing the results of the verification experiment 10.
21 is a view for explaining a method of manufacturing a sensor having a nanogap according to an embodiment of the present application.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 출원을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present application will be described in detail with reference to the accompanying drawings.

1. 단백질 번역 후 변형 1. Modification after protein translation 모니터링monitoring 시스템 system

도 1 내지 도 4를 참조하여, 본 출원의 실시예에 따른 단백질 번역 후 변형 모니터링 시스템을 보다 상세히 설명한다.1 to 4, the post-translational protein modification monitoring system according to an embodiment of the present application will be described in more detail.

도 1은 본 출원의 실시예에 따른 단백질 번역 후 변형 모니터링 시스템의 구성을 설명하기 위한 개략도이고, 도 2는 도 1의 측정 단위부(110)를 설명하기 위한 도면이며, 도 3은 도 2의 측정 단위부(110)를 설명하기 위한 단면도이고, 도 4는 임피던스 측정 대상이 되는 물질을 설명하기 위한 도면이다.1 is a schematic view for explaining the configuration of a protein-translational modification monitoring system according to an embodiment of the present application, FIG. 2 is a view for explaining the measurement unit 110 of FIG. 1, and FIG. 3 is a view of FIG. It is a cross-sectional view for explaining the measurement unit 110, and FIG. 4 is a view for explaining a material to be measured for impedance.

도 1을 참조하면, 단백질 번역 후 변형 모니터링 시스템은 센서(100), 제어 장치(200), 자성체(300) 및 디스플레이(400)를 포함한다.Referring to FIG. 1, the post-translational strain monitoring system includes a sensor 100, a control device 200, a magnetic body 300, and a display 400.

센서(100)는 임피던스 측정 대상 물질이 놓여지는 하나 이상의 단위 측정부(110)를 포함한다. The sensor 100 includes one or more unit measurement units 110 on which an impedance measurement target material is placed.

도 2 및 3을 참조하여, 단위 측정부(110)에 대해 보다 상세히 설명한다. 도 2는 도 1의 센서(100)에서 단위 측정부(110)의 평면도이고, 도 3은 단위 측정부(110)의 단면도이다.2 and 3, the unit measurement unit 110 will be described in more detail. 2 is a plan view of the unit measurement unit 110 in the sensor 100 of FIG. 1, and FIG. 3 is a cross-sectional view of the unit measurement unit 110.

단위 측정부(110)는 기판(120), 기판 위에 배치되는 무기 절연층(130), 무기 절연층(130) 위에 각각 배치되며 간극(G)을 형성하도록 서로 소정 거리 이격되어 배치되는 제1 전극(140) 및 제2 전극(160), 간극(G)과 연통하는 개구(117)를 형성하도록 제1 전극(140)의 일부와 제2 전극(160)의 일부를 커버하는 유기 절연층(180)을 포함한다.The unit measurement unit 110 includes a substrate 120, an inorganic insulating layer 130 disposed on the substrate, and a first electrode disposed on the inorganic insulating layer 130 and spaced apart from each other to form a gap G An organic insulating layer 180 covering a portion of the first electrode 140 and a portion of the second electrode 160 to form an opening 117 communicating with the 140 and the second electrode 160 and the gap G ).

여기서, 기판(120)은 실리콘, 유리, 쿼츠, 고분자 등과 같은 절연 물질을 포함할 수 있다. 보다 바람직하게는, 기판(120)은 투명한 물질로 형성될 수 있으며 이 경우 마이크로 비드(b)가 배치되는 지 여부를 광학적으로 확인할 수 있다는 장점을 갖는다.Here, the substrate 120 may include an insulating material such as silicon, glass, quartz, and polymer. More preferably, the substrate 120 may be formed of a transparent material, and in this case, it has an advantage of optically checking whether the microbeads (b) are disposed.

제1 전극(140)과 제2 전극(160) 사이의 간극(G)에는 측정 대상 물질이 놓여진다. The material to be measured is placed in the gap G between the first electrode 140 and the second electrode 160.

도 4를 참조하여, 제1 전극(140)과 제2 전극(160) 사이의 간극(G)에 놓여지는 측정 대상 물질에 대해 보다 구체적으로 설명한다.Referring to FIG. 4, the measurement target material placed in the gap G between the first electrode 140 and the second electrode 160 will be described in more detail.

혈액, 혈장, 혈청, 타액, 소변, 눈물, 콧물, 척수액 등과 같은 샘플 내에 존재하는 타겟 단백질(20)의 임피던스를 측정하여 번역후 변형 정도를 측정하기 위해, 제1 결합체(S1), 제2 결합체(S2), 제3 결합체(S3) 및 제4 결합체(S4)가 간극(G)에 놓여질 수 있다.To measure the degree of post-translational deformation by measuring the impedance of the target protein 20 present in a sample such as blood, plasma, serum, saliva, urine, tears, runny nose, spinal fluid, etc., the first conjugate (S1), the second conjugate (S2), the third coupling member (S3) and the fourth coupling member (S4) may be placed in the gap (G).

제1 결합체(S1)는 마이크로 비드(b)와, 마이크로 비드(b)의 표면에 결합된 하나 이상의 제1 항체(10)를 포함한다.The first conjugate (S1) comprises a microbead (b) and one or more first antibodies (10) bound to the surface of the microbead (b).

여기서, 마이크로 비드(b)는 금속, 고분자 등으로 이루어진 자성 비드일 수 있다. 예를 들어, 마이크로 비드(b)의 직경은 1μm 내지 5μm일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 검출하고자 하는 대상에 따라 10μm 이상의 것이 사용될 수도 있다.Here, the microbead (b) may be a magnetic bead made of metal, polymer, or the like. For example, the diameter of the microbead (b) may be 1 μm to 5 μm, but is not limited thereto, and 10 μm or more may be used depending on the object to be detected.

제1 항체(10)는 타겟 단백질(20)과 결합이 가능한 항체로서, 마이크로 비드(b)는 제1 항체(10)가 결합될 수 있도록 토실레이트 처리되거나, 아민처리되거나, 카르복실기가 처리될 수 있다. 여기서, 타겟 단백질(20)은 타우(tau) 단백질일 수 있으며, 제1 항체(10)는 타우 단백질과 결합할 수 있는 항체일 수 있으며, 보다 구체적으로는 타겟 단백질(20)의 번역후 변형 부위가 아닌 부위(공통 부위)에 결합하는 것일 수 있다. 하지만, 이에 제한되지 않고 타겟 단백질(20)에서 번역후 변형부위가 2개 이상 존재하고, 어느 하나의 번역후 변형 부위의 양과 다른 하나의 번역후 변형 부위의 양이 서로 반비례(즉, 어느 하나의 번역후 변형 부위의 양이 증가하는 경우 다른 하나의 번역후 변형 부위의 양이 감소하는 관계)하는 관계에 있는 타겟 단백질이면 어느 것이든 적용될 수 있다.The first antibody 10 is an antibody capable of binding the target protein 20, and the microbead (b) can be tosylate-treated, amine-treated, or carboxyl-treated so that the first antibody 10 can be bound. have. Here, the target protein 20 may be a tau protein, the first antibody 10 may be an antibody capable of binding the tau protein, and more specifically, a post-translational modification site of the target protein 20 It may be to bind to a non-common part (common part). However, the present invention is not limited thereto, and there are two or more post-translational modification sites in the target protein 20, and the amount of one post-translational modification site and the other post-translational modification site are inversely proportional to each other (ie, any one When the amount of the post-translational modification site increases, any target protein having a relationship (in which the amount of the other post-translational modification site decreases) can be applied.

또한, 번역후 변형 정도가 얼마나 이루어졌는지 측정하기 위해, 타겟 단백질(20)은 번역후 변형 부위가 하나 이상 존재하는 형태의 단백질이고, 하나 이상의 번역후 변형 중 어느 하나의 변형만을 측정하는 것도 얼마든지 가능하다. In addition, in order to measure how much the degree of post-translational modification has been achieved, the target protein 20 is a protein in which at least one post-translational site exists, and it is also possible to measure only one of the post-translational modifications. It is possible.

제2 결합체(S2)는 마이크로 비드(b)와, 마이크로 비드(b)의 표면에 결합된 하나 이상의 제1 항체(10), 제1 항체(10)에 결합되는 타겟 단백질(20)을 포함한다.The second conjugate (S2) includes a microbead (b), one or more first antibodies (10) bound to the surface of the microbeads (b), and a target protein (20) bound to the first antibody (10). .

제3 결합체(S3)는 마이크로 비드(b)와, 마이크로 비드(b)의 표면에 결합된 하나 이상의 제1 항체(10), 제1 항체(10)에 결합되는 타겟 단백질(20) 및 타겟 단백질(20)의 제1 변형 부위에 결합되는 제2 항체(30)를 포함한다.The third conjugate (S3) is a microbead (b), one or more first antibodies (10) bound to the surface of the microbead (b), a target protein (20) and a target protein bound to the first antibody (10) It includes a second antibody (30) that is bound to the first modified region of (20).

여기서, 제1 변형 부위는 타겟 단백질(20)의 인산화(phosphorylation)된 부분일 수 있으며, 제2 항체(20)는 타우 단백질의 인산화된 부분에 결합되는 Phospho-Tau(Ser202, Thr205) Antibody(AT8) MN1020(Thermo Fisher), Anti-Tau(phosphor S396) antibody [EPR2731]/ab109390(abcam), Phospho-Tau(ser202_ Antibody, #11834)(Cell signaling), Phospho-Tau(ser396) (PHF13) Mouse mAb, #9632(Cell signaling) 중 어느 하나일 수 있다. 하지만, 이에 제한되지 않으며 타우 단백질의 인산화된 부분에 결합될 수 있는 항체이면 어느 것이든 이에 해당한다고 할 것이다.Here, the first modified region may be a phosphorylated portion of the target protein 20, and the second antibody 20 may be a Phospho-Tau (Ser202, Thr205) Antibody (AT8) bound to the phosphorylated portion of the Tau protein. ) MN1020 (Thermo Fisher), Anti-Tau (phosphor S396) antibody [EPR2731] / ab109390 (abcam), Phospho-Tau (ser202_ Antibody, # 11834) (Cell signaling), Phospho-Tau (ser396) (PHF13) Mouse mAb , # 9632 (Cell signaling). However, the present invention is not limited thereto, and any antibody capable of binding to the phosphorylated portion of Tau protein will be said to be applicable.

제4 결합체(S4)는 마이크로 비드(b)와, 마이크로 비드(b)의 표면에 결합된 하나 이상의 제1 항체(10), 제1 항체(10)에 결합되는 타겟 단백질(20) 및 타겟 단백질(20)의 제2 변형 부위에 결합되는 제3 항체(40)를 포함한다.The fourth conjugate (S4) is a microbead (b), one or more first antibodies (10) bound to the surface of the microbead (b), a target protein (20) and a target protein bound to the first antibody (10) It includes a third antibody (40) that is bound to the second modified site of (20).

여기서, 제2 변형 부위는 타겟 단백질(20)의 O-글리코실화(O-glycosylation)된 부분일 수 있으며, 제3 항체(30)는 타우 단백질의 O-글리코실화된 부분에 결합되는 항체로서, O-GlcNAc(CTD110.6) Mouse mAB, #9875(Cell signaling)일 수 있다.Here, the second modified region may be an O-glycosylated portion of the target protein 20, and the third antibody 30 is an antibody bound to the O-glycosylated portion of the tau protein, O-GlcNAc (CTD110.6) Mouse mAB, # 9875 (Cell signaling).

상술한 측정 대상 물질이 놓여지는 간극(G)은 마이크로 비드(b)가 놓여지기 위해 마이크로 비드(b)의 직경보다는 작은 것이 바람직하며, 그 수치는 1μm 이하일 수 있다. 하지만, 이에 제한되지 않고 임피던스 측정을 위해 적용되는 마이크로 비드(b)에 따라 그 이상의 수치를 가질 수도 있다.The gap G on which the material to be measured is placed is preferably smaller than the diameter of the microbead b in order to place the microbead b, and its value may be 1 μm or less. However, the present invention is not limited thereto, and may have a value higher than that according to the microbead (b) applied for impedance measurement.

마이크로 비드(b)는 개구(117)를 통하여 간극(G)에 놓여질 수 있는데, 개구(117)의 직경은 마이크로 비드(b)의 직경보다는 크고 마이크로 비드(b) 직경의 2배보다는 작은 것이 바람직하다. 이를 통하여 하나의 개구(117)마다 하나의 마이크로 비드(b)가 투입되는 것이 보다 효율적으로 이루어질 수 있다(검증 실험 1 참조).The microbead (b) can be placed in the gap (G) through the opening (117), the diameter of the opening (117) being larger than the diameter of the microbead (b) and preferably smaller than twice the diameter of the microbead (b) Do. Through this, one micro bead (b) may be more efficiently injected into each opening 117 (see verification experiment 1).

제1 전극(140)과 제2 전극(160)은 전원 인가부(220)에 전기적으로 연결된다.The first electrode 140 and the second electrode 160 are electrically connected to the power supply unit 220.

전원 인가부(220)는 제1 전극(140)과 제2 전극(160) 사이에 기 설정된 전압을 인가하게 된다. 구체적으로, 전원 인가부(200)는 제1 전극(140)과 제2 전극(160) 사이에 50mVsin(w)의 교류 전압을 인가할 수 있다. 즉, 간극(G)에 측정 대상 물질이 놓여짐에 따라, 제1 전극(140), 제2 전극(160), 전원 인가부(220) 및 측정 대상 물질이 서로 전기적으로 연결되어 하나의 전기 회로를 형성할 수 있는 것이며, 이 전기 회로에 흐르는 전류 또는 전압을 측정하여 측정 대상 물질의 임피던스(Z)를 측정할 수 있는 것이다. 다시 말하면, 마이크로 비드(b)를 포함하는 측정 대상 물질이 개구(117)를 통해 투입되어 간극(G)에 놓여져, 센서(100)에 전압을 인가함으로써 기 설정된 방법에 의하여 연산되는 전기화학적 임피던스(electrochemical impedance)를 측정하게 되는 것이다.The power applying unit 220 applies a predetermined voltage between the first electrode 140 and the second electrode 160. Specifically, the power applying unit 200 may apply an alternating voltage of 50mVsin (w) between the first electrode 140 and the second electrode 160. That is, as the material to be measured is placed in the gap G, the first electrode 140, the second electrode 160, the power applying unit 220, and the material to be measured are electrically connected to each other to form one electrical circuit. It is possible to form, it is possible to measure the impedance (Z) of the material to be measured by measuring the current or voltage flowing in the electrical circuit. In other words, the material to be measured, including the microbead (b), is input through the opening 117 and placed in the gap G, thereby applying a voltage to the sensor 100 to calculate the electrochemical impedance calculated by a predetermined method ( electrochemical impedance).

도 1을 참조하여, 센서(100)에 대해 다시 설명한다.Referring to FIG. 1, the sensor 100 will be described again.

센서(100)는 전술한 단위 측정부(110)를 복수 개 포함하며, 각각의 단위 측정부(110)는 전원 인가부(200)에 의해 기 설정된 전압이 인가되는 제1 종방향 메인 전선(111) 및 제2 종방향 메인 전선(114)에 연결된다.The sensor 100 includes a plurality of unit measurement units 110 described above, and each unit measurement unit 110 is a first longitudinal main wire 111 to which a predetermined voltage is applied by the power supply unit 200. ) And the second longitudinal main wire 114.

제1 종방향 메인 전선(111)과 제2 종방향 메인 전선(114)은 센서(100)의 y축과 평행할 수 있다.The first longitudinal main wire 111 and the second longitudinal main wire 114 may be parallel to the y-axis of the sensor 100.

제1 종방향 메인 전선(111)은, 제1 종방향 메인 전선(111)으로부터 분지되며 센서(100)의 x축 방향과 평행한 복수의 제1 횡방향 메인 전선(112)과 연결되고, 이 복수의 제1 횡방향 메인 전선(112)은, 이로부터 다시 분지되어 센서(100)의 y축 방향과 평행한 복수의 제1 종방향 서브 전선(113)과 연결된다. 제1 종방향 서브 전선(113)은 측정 단위부(110)의 제1 전극(140)에 전기적으로 연결된다.The first longitudinal main wire 111 is branched from the first longitudinal main wire 111 and connected to a plurality of first transverse main wires 112 parallel to the x-axis direction of the sensor 100, and The plurality of first transverse main electric wires 112 are branched again from this, and are connected to the plurality of first longitudinal sub electric wires 113 parallel to the y-axis direction of the sensor 100. The first longitudinal sub-wire 113 is electrically connected to the first electrode 140 of the measurement unit 110.

제2 종방향 메인 전선(114)은, 제2 종방향 메인 전선(114)으로부터 분지되며 센서(100)의 x축 방향과 평행한 복수의 제2 횡방향 메인 전선(115)과 연결되고, 이 복수의 제2 횡방향 메인 전선(115)은, 이로부터 다시 분지되어 센서(100)의 y축 방향과 평행한 복수의 제2 종방향 서브 전선(116)과 연결된다. 제2 종방향 서브 전선(116)은 측정 단위부(110)의 제2 전극(160)에 전기적으로 연결된다.The second longitudinal main wire 114 is branched from the second longitudinal main wire 114 and connected to a plurality of second transverse main wires 115 parallel to the x-axis direction of the sensor 100, and The plurality of second transverse main electric wires 115 are branched again from this, and are connected to the plurality of second longitudinal sub electric wires 116 parallel to the y-axis direction of the sensor 100. The second longitudinal sub-wire 116 is electrically connected to the second electrode 160 of the measurement unit 110.

즉, 전술한 전선들(111, 112, 113, 114, 115, 116)에 의해 센서(100)에 포함된 모든 측정 단위부(110)의 전극(140, 160)에 전원 인가부(220)에 의한 전압이 인가될 수 있는 것이다.That is, the above-described wires (111, 112, 113, 114, 115, 116) by the power supply unit 220 to the electrodes (140, 160) of all the measurement unit unit 110 included in the sensor 100 Voltage can be applied.

각각의 측정 단위부(110)에 형성된 개구(117)에 마이크로 비드(b)를 안내하기 위해, 센서(100)의 하부에는 자성체(300)가 구비된다. 자성체(300)는 자성을 지닌 물체로서, 영구자석 또는 전자석 등이 여기에 해당할 수 있다. 이 때, 마이크로 비드(b)는 자성체(300)의 움직임을 통해 인력에 의하여 이동할 수 있는 자성 비드 형태로 구비되는 것이 바람직하다.In order to guide the micro-bead (b) to the opening 117 formed in each measurement unit 110, a magnetic body 300 is provided under the sensor 100. The magnetic body 300 is a magnetic object, and may be a permanent magnet or an electromagnet. At this time, the micro-bead (b) is preferably provided in the form of a magnetic bead that can be moved by the attraction force through the movement of the magnetic body 300.

제어 장치(200)는 센서(100)에 인가되는 전압의 제어, 간극(G)에 놓여진 측정 대상 물질의 임피던스 측정, 자성체(300)의 구동을 제어하는 부분이다.The control device 200 is a part that controls the control of the voltage applied to the sensor 100, the impedance measurement of the measurement target material placed in the gap G, and the driving of the magnetic body 300.

도 1을 참조하면, 제어 장치(200)는 구동부(210), 전원 인가부(220), 임피던스 측정부(230), 연산부(240), 데이터베이스(250) 및 진단부(260)를 포함한다.Referring to FIG. 1, the control device 200 includes a driving unit 210, a power application unit 220, an impedance measurement unit 230, a calculation unit 240, a database 250, and a diagnosis unit 260.

구동부(210)는 자성체(300)와 전기적으로 연결되어, 자성체(300)의 움직임을 제어하는 부분이다. 구체적으로는, 자성 비드인 마이크로 비드(b)가 개구(117)에 투입될 수 있도록 자성체(300)의 움직임을 제어할 수 있다.The driving unit 210 is a part that is electrically connected to the magnetic body 300 and controls movement of the magnetic body 300. Specifically, the movement of the magnetic body 300 can be controlled so that the microbead (b), which is a magnetic bead, can be introduced into the opening 117.

전원 인가부(220)는 이에 전기적으로 연결된 전선들에 기 설정된 전압을 인가하는 부분이다. 구체적으로, 전선들에 기 설정된 전압, 구체적으로 50mVsin(w)의 전압을 인가할 수 있다.The power applying unit 220 is a part that applies a predetermined voltage to the wires electrically connected thereto. Specifically, a predetermined voltage may be applied to the electric wires, specifically, 50 mVsin (w).

제1 전극(140)과 제2 전극(160) 사이의 간극(G)에 측정 대상 물질이 놓여진 상태에서, 전원 인가부(220)가 전압을 인가하게 되면, 간극(G)에는 전원 인가부(220)에 의해 인가된 만큼의 전압이 인가된다.When the material to be measured is placed in the gap G between the first electrode 140 and the second electrode 160, when the power applying unit 220 applies a voltage, the power applying unit ( 220) is applied as much as the voltage applied.

임피던스 측정부(230)는 간극(G)에 놓여진 측정 대상 물질의 임피던스(Z)를 측정하는 부분이다. 임피던스 측정 방법으로서, 전원 인가부(220) 및 센서(100)가 서로 전기적으로 연결되어 하나의 전기 회로를 이룬다고 가정하였을 때, 전극(140, 160)에 인가되는 전압의 값을 전기 회로에 흐르는 전류의 값으로 나눈 방법이 적용될 수 있다.The impedance measurement unit 230 is a portion for measuring the impedance Z of the measurement target material placed in the gap G. As an impedance measurement method, when it is assumed that the power supply unit 220 and the sensor 100 are electrically connected to each other to form one electrical circuit, the value of the voltage applied to the electrodes 140 and 160 flows through the electrical circuit. A method divided by the value of the current can be applied.

연산부(240)는 임피던스 측정부(230)가 측정한 임피던스(Z)에 기초하여 기 설정된 방법에 의해 임피던스 변화율(△Z)을 연산하는 부분이다.The calculating unit 240 is a part that calculates the impedance change rate (ΔZ) by a predetermined method based on the impedance Z measured by the impedance measuring unit 230.

임피던스 변화율(△Z)을 연산하는 방법으로서, 다양한 방법이 가능하나 일 예로서, 센서(100)에 상기 제2 결합체(S2)를 포함하는 제1 샘플이 투입되었을 때 측정되는 임피던스를 Z1, 센서(100)에 상기 제3 결합체(S3)를 포함하는 제2 샘플이 투입되었을 때 측정되는 임피던스를 Z2, 센서(100)에 상기 제4 결합체(S4)를 포함하는 제3 샘플이 투입되었을 때 측정되는 임피던스를 Z3이라 할 때, 임피던스 변화율(△Z)은 Z1-Z2/Z1-Z3(taumeter)으로 연산될 수 있다. 이는, 타겟 단백질(20)의 제1 변형 부위의 양과, 제2 변형 부위의 양이 서로 반비례 관계 있다는 점에 착안한 것으로서, 상기 수식은 제1 변형 부위 및 제2 변형 부위의 변화량을 모두 반영함에 따라, 타겟 단백질(20)과 연관된 질환의 진단을 보다 정확히 이룰 수 있다는 장점을 갖게 된다.As a method of calculating the impedance change rate (ΔZ), various methods are possible, but as an example, the impedance measured when the first sample including the second combination (S2) is input to the sensor 100 is Z 1 , The impedance measured when the second sample containing the third coupling member S3 is introduced into the sensor 100 is Z 2 , and the third sample including the fourth coupling member S4 is introduced into the sensor 100. When the measured impedance is Z 3 , the impedance change rate (△ Z) can be calculated as Z 1 -Z 2 / Z 1 -Z 3 (taumeter). This is based on the fact that the amount of the first modified region and the amount of the second modified region of the target protein 20 are inversely related to each other, and the above formula reflects both changes in the first modified region and the second modified region. Accordingly, it has the advantage of being able to more accurately diagnose the disease associated with the target protein 20.

데이터베이스(250)는 연산부(240)에 의해 연산된 임피던스 변화율(△Z)이 저장되는 부분이다. 즉, 연산부(240)가 연산한 제1 시점에서의 임피던스 변화율(△Z)이 데이터베이스(250)에 저장되고, 제1 시점 이후의 제2 시점에서 동일 개체로부터 획득한 샘플로부터 다시 임피던스 변화율(△Z)을 연산하여 두 시점의 데이터를 비교하는 것이 가능해진다. 즉, 샘플 획득 시점마다의 데이터가 저장되고 이를 비교함으로써 질환의 진행 속도 등의 지속적인 모니터링이 가능하다.The database 250 is a portion in which the impedance change rate (ΔZ) calculated by the calculation unit 240 is stored. That is, the impedance change rate (ΔZ) at the first time point calculated by the operation unit 240 is stored in the database 250, and the impedance change rate (△) is again obtained from the sample obtained from the same individual at the second time point after the first time point. It becomes possible to compare the data of two viewpoints by calculating Z). That is, data is stored for each sample acquisition time point, and by comparing it, it is possible to continuously monitor disease progression rate and the like.

진단부(260)는 임피던스 변화율(△Z)을 이용하여 임피던스 측정의 대상이 되는 타겟 단백질(20)에 관련된 질환에 대한 위험도, 진행 속도 등의 질환 관련 정보를 연산하는 부분이다. 예를 들어, 임피던스 변화율(△Z)이 높을수록 알츠하이머 질환의 위험이 높다고 연산할 수 있으며, 제1 시점과 제2 시점의 임피던스 변화율(△Z)을 비교하여 알츠하이머 질환의 진행 속도를 연산할 수 있다.The diagnosis unit 260 is a part that calculates disease-related information such as a risk and progress rate for a disease related to a target protein 20 that is a target of impedance measurement using an impedance change rate (ΔZ). For example, the higher the rate of change in impedance (△ Z), the higher the risk of Alzheimer's disease, and compare the rate of change in impedance (ΔZ) at the first and second time points to calculate the rate of progression of Alzheimer's disease. have.

디스플레이(400)는 모니터 등으로 구현될 수 있으며, 제어 장치(200)에 의해 연산된 정보들이 출력되는 부분이다. The display 400 may be implemented as a monitor or the like, and is a part in which information calculated by the control device 200 is output.

2. 검증 실험2. Verification experiment

2-1. 제1 결합체(S1)(마이크로 2-1. First binding body (S1) (micro 비드Bead + 제1 항체)의 준비 + Preparation of the first antibody)

토실레이트 처리된 자성 비드(Thermo Fisher, Dynabead M-280, 직경 2.8㎛, 14203)와 타우 단백질 결합 항체(abcam, Anti-Tau(Phosphor S262) antibody, ab64193, 50㎕/250㎕)를 0.1M의 PBS 버퍼에 넣고, 37℃의 인큐베이터 안에 배치한 후, 롤 믹서 위에서 24시간 동안 인큐베이션하였다.0.1 m of tosylate-treated magnetic beads (Thermo Fisher, Dynabead M-280, diameter 2.8 μm, 14203) and Tau protein binding antibody (abcam, Anti-Tau (Phosphor S262) antibody, ab64193, 50 μl / 250 μl) It was placed in PBS buffer, placed in an incubator at 37 ° C, and incubated on a roll mixer for 24 hours.

다음으로, 상기 타우 단백질 결합 항체와 결합된 자성 비드를 0.4% Block ACE (AbD serotec, USA)로 세척하고, 0.2M의 트리스 버퍼로 블록 처리하였다. 상기 자성 비드 용액 30mg/mL를 0.4% Block Ace가 포함된 PBST(Phosphate Buffered Saline with Tween-20, 0.01% Tween-20)에 넣어서 보관하였다.Next, the magnetic beads bound with the tau protein-binding antibody were washed with 0.4% Block ACE (AbD serotec, USA) and blocked with 0.2M Tris buffer. The magnetic bead solution 30mg / mL was stored in PBST (Phosphate Buffered Saline with Tween-20, 0.01% Tween-20) containing 0.4% Block Ace.

2-2. 제2 결합체(S2)(마이크로 2-2. Second combination (S2) (micro 비드Bead + 제1 항체 +  + First antibody + 타겟target 단백질)의 준비 Preparation of protein)

5250ng/mL 농도의 타우 단백질을 0.1% PBST를 이용하여, 다양한 농도 (0.5fg/mL ~ 50pg/mL)로 1/10씩 희석하고, 필요에 따라 O-GlcNAcase를 저해하는 Thiamet G 처리 또는 O-GlcNAcase를 촉진하는 BZX2로 처리하였다.Thiamet G treatment with O-GlcNAcase or O-diluted 5250ng / mL concentration of tau protein in 0.1 / 10 PBST at various concentrations (0.5fg / mL ~ 50pg / mL) and O-GlcNAcase as needed. It was treated with BZX2 to promote GlcNAcase.

상기 타우 단백질 결합 항체와 결합된 자성 비드를 0.1% PBST를 이용하여, 300㎕/ml로 희석한 후, 상기 타우 단백질(희석액)과 상기 자성 비드(희석액)를 1:2의 농도로 혼합하고, 냉장고 안에서 22시간 동안 반응하였다.After diluting the magnetic beads bound to the tau protein-binding antibody to 300 μl / ml using 0.1% PBST, the tau protein (diluent) and the magnetic beads (diluent) are mixed at a concentration of 1: 2, The reaction was carried out in the refrigerator for 22 hours.

다음으로, 상기 타우 단백질과 결합된 지성 비드를 0.1% PBST를 이용하여, 2회 세척하고, PBS(Phosphate Buffered Saline)를 이용하여, 2회 세척한 후, PBS를 이용하여 자성 비드 농도가 60㎕/ml가 되도록 희석하였다.Next, the oily beads bound to the Tau protein were washed twice using 0.1% PBST, and washed twice using PBS (Phosphate Buffered Saline), and then the magnetic bead concentration was 60 μl using PBS. Diluted to / ml.

2-3. 제3 결합체(S3)(마이크로 2-3. Third binder (S3) (micro 비드Bead + 제1 항체 +  + First antibody + 타겟target 단백질 + 제2 항체) Protein + second antibody)

2-2와 동일한 방법으로 타우 단백질과 결합된 자성 비드(300㎕/ml)를 준비하였다.Magnetic beads (300 μl / ml) combined with Tau protein were prepared in the same manner as in 2-2.

상기 자성 비드를, 타우 단백질의 인산화된 부분에 결합이 가능한 제2 항체(Thermo Fisher, Phospho-Tau(Ser202, Thr205) Antibody(AT8), MN1020) 10ng와 혼합하고, 냉장고 안에서 22시간 동안 반응하였다.The magnetic beads were mixed with 10 ng of a second antibody (Thermo Fisher, Phospho-Tau (Ser202, Thr205) Antibody (AT8), MN1020) capable of binding to the phosphorylated portion of Tau protein, and reacted in a refrigerator for 22 hours.

상기 제2 항체와 결합된 자성 비드를 0.1% PBST를 이용하여, 2회 세척하고, PBS를 이용하여, 2회 세척한 후, PBS를 이용하여 비드 농도가 60㎕/ml가 되도록 희석하였다.The magnetic beads bound to the second antibody were washed twice with 0.1% PBST, washed twice with PBS, and then diluted with PBS to a concentration of 60 µl / ml.

2-4. 제4 결합체(S4)(마이크로 2-4. 4th conjugate (S4) (micro 비드Bead + 제1 항체 +  + First antibody + 타겟target 단백질 + 제3 항체) Protein + third antibody)

2-2와 동일한 방법으로 타우 단백질과 결합된 자성 비드(300㎕/ml)를 준비하였다.Magnetic beads (300 μl / ml) combined with Tau protein were prepared in the same manner as in 2-2.

상기 자성 비드를, 타우 단백질의 O-글리코실화된 부분에 결합이 가능한 제3 항체(Cell signaling, O-GlcNAc(CTD110.6) Mouse mAB, #9875) 10.4ng와 혼합하고, 냉장고 안에서 22시간 동안 반응하였다.The magnetic beads were mixed with 10.4 ng of a third antibody (Cell signaling, O-GlcNAc (CTD110.6) Mouse mAB, # 9875) capable of binding to the O-glycosylated portion of Tau protein, for 22 hours in a refrigerator. Reacted.

상기 제3 항체와 결합된 자성 비드를 0.1% PBST를 이용하여, 2회 세척하고, PBS를 이용하여, 2회 세척한 후, PBS를 이용하여 자성 비드 농도가 60㎕/ml가 되도록 희석하였다.The magnetic beads bound to the third antibody were washed twice using 0.1% PBST, washed twice using PBS, and then diluted with PBS to a magnetic bead concentration of 60 µl / ml.

2-5. 검증 실험 12-5. Verification experiment 1

본 출원의 실시예에 따른 단백질 번역 후 변형 모니터링 시스템에서, 하나의 개구(117)에 하나의 마이크로 비드(b)가 높은 효율로 투입되도록 하는 직경을 찾기 위해 검증 실험을 실시하였다(도 5).In the post-translational strain monitoring system according to the embodiment of the present application, a verification experiment was conducted to find a diameter such that one micro bead (b) was injected into one opening 117 with high efficiency (FIG. 5).

20 x 20 배열을 갖는 센서(100)에서, 각각의 개구(117)의 직경을 9μm로 형성하여, (a) 2.8μm 직경을 갖는 마이크로 비드(b) (b) 4.5μm 직경을 갖는 마이크로 비드(b)를 투입하여, 각 개구(117)마다 몇 개의 마이크로 비드(b)가 투입되는지를 카운팅하였다.In the sensor 100 having a 20 x 20 arrangement, the diameter of each opening 117 is formed to be 9 μm, (a) microbeads having a diameter of 2.8 μm (b) (b) microbeads having a diameter of 4.5 μm ( b) was added, and how many micro beads (b) were added for each opening 117 was counted.

실험 결과, (a)의 경우 개구(117)에 투입되는 마이크로 비드(b)의 분포가 일정하지 않았으나, (b)의 경우 하나의 개구(117)에 3개 이상의 마이크로 비드(b)가 투입되는 것이 관찰되지 않았으며, 높은 확률로 각각의 개구(117)마다 하나의 마이크로 비드(b)가 투입될 수 있음을 확인하였다.As a result of the experiment, in the case of (a), the distribution of the microbeads (b) injected into the opening 117 was not constant, but in the case of (b), three or more microbeads (b) were injected into one opening 117 It was not observed, it was confirmed that one micro bead (b) can be injected for each opening 117 with high probability.

검증 실험 1을 통하여, 개구(117)의 직경은 마이크로 비드(b)의 직경보다는 크되, 마이크로 비드(b)의 직경의 2배 이하인 것임 바람직함을 확인하였다.Through the verification experiment 1, it was confirmed that the diameter of the opening 117 is larger than the diameter of the microbead (b), but preferably less than twice the diameter of the microbead (b).

2-6. 검증 실험 22-6. Verification experiment 2

본 출원의 실시예에 따른 단백질 번역 후 변형 모니터링 시스템에서 마이크로 비드(b)에 물질들이 더 결합됨에 따라 측정되는 임피던스(Z)의 경향을 알아보고자 검증 실험을 실시하였다(도 6).In the post-translational protein modification monitoring system according to an embodiment of the present application, a verification experiment was conducted to investigate the tendency of the impedance (Z) measured as materials are further bound to the microbead (b) (FIG. 6).

제1 전극(140)과 제2 전극(160) 사이의 간극(G)에 배치되는 측정 대상 물질이 (a) 마이크로 비드(b) (b) 제1 결합체(S1)(마이크로 비드 + 제1 항체) (c) 제2 결합체(S2)(마이크로 비드 + 제1 항체 + 타겟 단백질) 및 (d) 제3 결합체(마이크로 비드 + 제1 항체 + 타겟 단백질 + 제2 항체) 또는 제4 결합체(마이크로 비드 + 제1 항체 + 타겟 단백질 + 제3 항체)인 경우를 비교하여 임피던스를 측정하였다.The material to be measured disposed in the gap G between the first electrode 140 and the second electrode 160 is (a) microbead (b) (b) first conjugate (S1) (microbead + first antibody) ) (c) second conjugate (S2) (microbead + first antibody + target protein) and (d) third conjugate (microbead + first antibody + target protein + second antibody) or fourth conjugate (microbead) + 1st antibody + target protein + 3rd antibody) was compared to measure impedance.

임피던스 측정 결과, (a)에서 (d)로 갈수록, 즉, 마이크로 비드(b)에 제1 항체(10), 타겟 단백질(20), 제2 항체(30) 및 제3 항체(40) 등이 더 결합될수록 측정되는 임피던스의 값이 감소하는 경향을 확인할 수 있었다.As a result of impedance measurement, from (a) to (d), that is, the first antibody 10, the target protein 20, the second antibody 30, the third antibody 40, etc. in the microbead (b) It was confirmed that the more the combined value, the tendency of the measured impedance value to decrease.

2-7. 검증 실험 32-7. Verification experiment 3

본 출원의 실시예에 따른 단백질 번역 후 변형 모니터링 시스템에서 타겟 단백질(20)의 검출 한계를 검증하기 위해 검증 실험을 실시하였다(도 7).After the protein translation according to the embodiment of the present application, a verification experiment was conducted to verify the detection limit of the target protein 20 in the strain monitoring system (FIG. 7).

센서(100)에 투입되는 샘플에 포함되는 타우 단백질의 농도를 0.5fg/ml, 5fg/ml, 50fg/ml. 500fg/ml, 5pg/ml, 50pg/ml로 조절하면서 50mVsin(w) 전압을 인가하고, 1Hz, 10Hz, 100Hz의 주파수에서 임피던스(Z)를 측정하였다.The concentration of Tau protein contained in the sample input to the sensor 100 is 0.5fg / ml, 5fg / ml, 50fg / ml. 50 mVsin (w) voltage was applied while adjusting to 500 fg / ml, 5 pg / ml, and 50 pg / ml, and impedance (Z) was measured at frequencies of 1 Hz, 10 Hz, and 100 Hz.

임피던스(Z) 측정 결과, 도 7과 같은 결과를 얻을 수 있었다.As a result of measuring the impedance Z, the results shown in FIG. 7 were obtained.

PBS의 경우 마이크로 비드(b)를 포함하지 않은 PBS 용액만이 센서(100)에 투입된 경우를 의미하며, Neg의 경우 제1 결합체(S1)를 포함하는 PBS 용액이 센서(100)에 투입되었으나 타우 단백질이 투입되지 않은 경우를 의미한다.In the case of PBS, it means that only the PBS solution that does not contain the microbead (b) was put into the sensor 100, and in the case of Neg, the PBS solution containing the first conjugate (S1) was put into the sensor 100, but Tau It means that no protein is added.

실험 결과, 타우 단백질의 농도가 높을수록, 즉 제1 결합체(S1)에 결합하는 타우 단백질이 많아질수록 임피던스(Z)가 감소하는 것을 확인할 수 있었다.As a result of the experiment, it was confirmed that the higher the concentration of Tau protein, that is, the more Tau protein bound to the first conjugate (S1), the lower the impedance (Z).

또한, Neg의 경우 측정되는 임피던스를 ZNeg라고 하고, 실제 측정된 임피던스를 Z라고 할 때 △Z=ZNeg-Z/ZNeg x 100(%)로 정의되는 임피던스 변화율(△Z)을 연산하였을 때, 샘플에 포함된 타우 단백질의 농도가 0.5fg/ml 이더라도 유의미한 임피던스 변화율(△Z)이 나타남을 확인하였다.In the case of Neg, when the measured impedance is called Z Neg and the actual measured impedance is Z, the impedance change rate (△ Z) defined by △ Z = Z Neg -Z / Z Neg x 100 (%) was calculated. At this time, it was confirmed that a significant impedance change rate (ΔZ) appeared even when the concentration of tau protein contained in the sample was 0.5fg / ml.

즉, 본 출원의 실시예에 따른 단백질 번역 후 변형 모니터링 시스템의 검출 한계는 0.5fg/ml임을 확인하였으며, 이는 종래 단백질 검출에 이용되는 ELISA(Enzyme Linked Immunospecific Assay) 방법과 Digital ELISA(quantarix)에서의 검출 한계가 각각 10pg/ml, 19fg/ml인 점과 비교하였을 때, 적은 농도의 샘플이 투입되더라도 검출이 가능하다는 것을 확인할 수 있었다.That is, it was confirmed that the detection limit of the post-translational modification monitoring system according to the embodiment of the present application is 0.5 fg / ml, which is used in the conventional Enzyme Linked Immunospecific Assay (ELISA) method and Digital ELISA (quantarix) used for protein detection. When compared with the point that the detection limits are 10 pg / ml and 19 fg / ml, respectively, it was confirmed that detection is possible even with a small concentration of sample.

2-8. 검증 실험 42-8. Verification experiment 4

본 출원의 실시예에 따른 단백질 번역 후 변형 모니터링 시스템을 이용하여 O-GlcNAcase를 저해하는 물질의 유무에 따른 임피던스(Z)를 측정하였다.Impedance (Z) according to the presence or absence of a substance that inhibits O-GlcNAcase was measured using a post-translational strain monitoring system according to an embodiment of the present application.

제2 결합체(S2)(마이크로 비드 + 제1 항체 + 타우 단백질)을 포함하는 샘플과, 타우 단백질의 O-글리코실화된 부분에 결합이 가능한 항체(제3 항체, O-g Antibody)를 센서(100)에 투입하였으며, 타우 단백질의 농도를 각각 0.5fg/ml, 5.24fg/ml, 52.4fg/ml, 524fg/ml로 조절하면서 각각의 경우마다 (a) O-GlcNAcase를 저해하는 물질인 Thiamet G 100μM 처리 및 (b) Thiamet G 미처리한 경우 각각의 임피던스(Z)를 측정하였다.A sample containing a second conjugate (S2) (microbead + first antibody + tau protein), and an antibody capable of binding to the O-glycosylated portion of the tau protein (third antibody, Og Antibody) sensor 100 The concentration of Tau protein was 0.5fg / ml, 5.24fg / ml, 52.4fg / ml, and 524fg / ml, respectively, while in each case (a) treated with 100 μM Thiamet G, a substance that inhibits O-GlcNAcase. And (b) Thiamet G, respectively, the impedance (Z) was measured.

임피던스(Z) 측정은, 제2 결합체(S2)를 포함하는 제1 샘플이 센서(100)에 투입되었을 때, 제4 결합체(S4)를 포함하는 제3 샘플이 센서(100)에 투입되었을 때 각각의 임피던스를 측정하는 방식으로 이루어졌다.Impedance (Z) measurement, when the first sample containing the second assembly (S2) is input to the sensor 100, when the third sample containing the fourth assembly (S4) is input to the sensor (100) It was done by measuring the impedance of each.

실험 결과, 도 8과 같은 결과를 얻을 수 있었다.As a result of the experiment, the results shown in FIG. 8 were obtained.

Thiamet G를 처리하여 타우 단백질의 O-글리코실화된 부분의 감소를 억제하는 경우, 처리하지 않을 때보다 임피던스의 차이(Z1-Z3)가 커짐을 확인하였으며, 타우 단백질의 농도가 높아질수록 임피던스의 차이(Z1-Z3)가 증가함을 확인할 수 있었고, 특히 0.5fg/ml의 낮은 농도에서도 임피던스 차이가 유의미한 값을 나타냄을 확인할 수 있었다.When the reduction of the O-glycosylated portion of the Tau protein was suppressed by treating Thiamet G, it was confirmed that the difference in impedance (Z 1 -Z 3 ) is greater than when it is not treated, and the higher the concentration of the Tau protein, the higher the impedance. It was confirmed that the difference (Z 1 -Z 3 ) increased, and the impedance difference showed a significant value even at a low concentration of 0.5 fg / ml.

2-9. 검증 실험 52-9. Verification experiment 5

본 출원의 실시예에 따른 단백질 번역 후 변형 모니터링 시스템을 이용하여 O-GlcNAcase를 저해하는 물질과 촉진하는 물질의 처리에 따른 임피던스(Z)를 측정하였다.The impedance (Z) according to the treatment of the substance that inhibits the O-GlcNAcase and the substance that promotes it was measured using the post-translational transformation monitoring system according to the embodiment of the present application.

제2 결합체(S2)(마이크로 비드 + 제1 항체 + 타우 단백질)을 포함하는 샘플과, 타우 단백질의 인산화된 부분에 결합이 가능한 항체(제2 항체, AT-8 Antibody)를 센서(100)에 투입하였으며, 타우 단백질의 농도를 각각 0.5fg/ml, 5fg/ml, 50fg/ml, 500fg/ml로 조절하면서 각각의 경우마다 (a) O-GlcNAcase를 저해하는 물질인 Thiamet G 100μM 처리 및 (b) O-GlcNAcase를 촉진하는 BZX2 100μM 처리한 경우 각각의 임피던스(Z)를 측정하였다.A sample containing the second conjugate (S2) (microbead + first antibody + tau protein) and an antibody (second antibody, AT-8 Antibody) capable of binding to the phosphorylated portion of the tau protein are provided to the sensor 100 The concentration of Tau protein was adjusted to 0.5fg / ml, 5fg / ml, 50fg / ml, 500fg / ml, respectively, and in each case (a) 100 μM Thiamet G, a substance that inhibits O-GlcNAcase, and (b ) In the case of treatment with 100 μM of BZX2 that promotes O-GlcNAcase, each impedance (Z) was measured.

임피던스(Z) 측정은, 제2 결합체(S2)를 포함하는 제1 샘플이 센서(100)에 투입되었을 때, 제3 결합체(S3)를 포함하는 제2 샘플이 센서(100)에 투입되었을 때 각각의 임피던스를 측정하는 방식으로 이루어졌다.Impedance (Z) measurement, when the first sample containing the second assembly (S2) is input to the sensor 100, when the second sample containing the third combination (S3) is input to the sensor (100) It was done by measuring the impedance of each.

실험 결과, 도 9와 같은 결과를 얻을 수 있었다.As a result of the experiment, the results shown in FIG. 9 were obtained.

타우 단백질의 O-글리코실화된 부분의 양이 감소할수록, 타우 단백질의 인산화된 부분의 양이 증가하는 반비례 관계 때문에, (b)에서 BZX2를 처리하였을 때 제3 결합체(S3)의 양이 증가하여, 타우 단백질의 농도가 높아질수록 임피던스의 차이(Z1- Z2)가 증가함을 확인할 수 있었다. 특히 0.5fg/ml의 낮은 농도에서도 임피던스 차이가 유의미한 값을 나타냄을 확인할 수 있었다.As the amount of the O-glycosylated portion of the Tau protein decreases, the amount of the third conjugate (S3) increases when the BZX2 is treated in (b) due to an inversely proportional relationship in which the amount of the phosphorylated portion of the Tau protein increases. , As the concentration of tau protein increased, it was confirmed that the difference in impedance (Z 1 -Z 2 ) increased. In particular, it was confirmed that the impedance difference showed a significant value even at a low concentration of 0.5fg / ml.

2-10. 검증 실험 62-10. Verification experiment 6

본 출원의 실시예에 따른 단백질 번역 후 변형 모니터링 시스템을 이용하여 O-GlcNAcase를 저해하는 물질의 유무에 따른 임피던스(Z)를 측정하였다.Impedance (Z) according to the presence or absence of a substance that inhibits O-GlcNAcase was measured using a post-translational strain monitoring system according to an embodiment of the present application.

센서(100)에 (a) 타우 단백질 5pg/ml 투입 (b) 타우 단백질 5pg/ml + 제2 항체(AT-8 Antibody) 투입 및 (c) 타우 단백질 5pg/ml + 제3 항체(O-g Antibody) 를 각각 투입하였고, 각 경우를 PBS, Neg, Thiamet G 미처리, Thiamet G 100μM 처리한 샘플에 투입하여, 임피던스(Z)를 측정하였다.Sensor (100) (a) Tau protein 5pg / ml input (b) Tau protein 5pg / ml + second antibody (AT-8 Antibody) and (c) Tau protein 5pg / ml + third antibody (Og Antibody) Was added, and each case was put into a sample treated with PBS, Neg, Thiamet G untreated, and Thiamet G 100 μM, and impedance (Z) was measured.

실험 결과, 도 10과 같은 결과를 얻을 수 있었다.As a result of the experiment, the results shown in FIG. 10 were obtained.

O-GlcNAcase를 저해하는 Thiamet G를 처리함에 따라, 타우 단백질의 O-글리코실화된 부분이 증가하여, (c) 제3 항체(O-g Antibody)를 투입함에 따라 측정되는 임피던스(Z3)가 38.27MΩ에서 35.0MΩ로 감소함을 확인하였고, 타우 단백질의 O-글리코실화된 부분의 증가에 따라 타우 단백질의 인산화된 부분이 감소하여 (b) 제2 항체(AT-8 Antibody)를 투입함에 따라 측정되는 임피던스(Z2)가 33.65MΩ에서 37.65MΩ로 증가함을 확인하였다.As the Thiamet G that inhibits O-GlcNAcase is treated, the O-glycosylated portion of the tau protein increases, and (c) the impedance (Z 3 ) measured by adding a third antibody (Og Antibody) is 38.27MΩ It was confirmed that the decrease to 35.0 MΩ, and the phosphorylated portion of the tau protein decreases with the increase of the O-glycosylated portion of the tau protein (b), which is measured by adding the second antibody (AT-8 Antibody). It was confirmed that the impedance (Z 2 ) increased from 33.65 MΩ to 37.65 MΩ.

즉, 검증 실험 6을 통해 서로 반비례 관계에 있는 제1 변형 부위와 제2 변형 부위에 대한 임피던스(Z) 측정 결과가 어느 한쪽이 증가하는 경우 다른 한쪽이 감소하는 일정한 경향성을 나타내는 것을 검증하였다.That is, through the verification experiment 6, it was verified that the impedance (Z) measurement results for the first modified portion and the second modified portion, which are inversely related to each other, show a certain tendency to decrease when the other increases.

2-11. 검증 실험 72-11. Verification experiment 7

본 출원의 실시예에 따른 단백질 번역 후 변형 모니터링 시스템을 이용하여 정상 개체(Control)와 알츠하이머 질환을 갖는 개체(Patient)에서 샘플을 채취하여 임피던스(Z)를 측정하였다.Impedance (Z) was measured by taking samples from normal subjects (Control) and individuals with Alzheimer's disease using a post-translational strain monitoring system according to an embodiment of the present application.

센서(100)에 (a) 샘플 투입 (b) 샘플 + 제2 항체(AT-8 Antibody) 투입 및 (c) 샘플 + 제3 항체(O-g Antibody)를 투입하여 각각의 임피던스(Z)를 측정하였다.Each impedance (Z) was measured by inputting (a) a sample (b) a sample + a second antibody (AT-8 antibody) and (c) a sample + a third antibody (Og antibody) to the sensor 100. .

실험 결과 도 11과 같은 결과를 얻을 수 있었다.As a result of the experiment, the results shown in FIG. 11 were obtained.

알츠하이머 환자(Patient)의 경우, 정상인(Control)보다 샘플에 포함된 인산화 타우 단백질의 비율이 높기 때문에, (b)에서 측정된 임피던스(Z2)가 정상인(Control)보다 더 낮게 측정됨을 확인하였다.In the case of Alzheimer's patient (Patient), since the proportion of phosphorylated tau protein contained in the sample is higher than that of the normal person (Control), it was confirmed that the impedance (Z 2 ) measured in (b) is lower than that of the normal person (Control).

반대로 말하면, 알츠하이머 환자(Patient)의 경우 정상인(Control)보다 샘플에 포함된 타우 단백질의 O-글리코실화된 부분의 비율이 낮기 때문에, (c)에서 측정된 임피던스(Z3)가 정상인(Control)보다 더 높게 측정됨을 확인하였다.Conversely, in the case of Alzheimer's patients (Patient), the ratio of the O-glycosylated portion of the tau protein contained in the sample is lower than that of the normal person (Control), so the impedance measured in (c) (Z 3 ) is normal (Control) It was confirmed that the measurement was higher.

또한, 샘플만을 센서(100)에 투입하였을 때 측정되는 임피던스(Z1)를 이용하여, △Z=Z1-Z2/Z1-Z3로 연산되는 임피던스 변화율을 연산한 결과, 알츠하이머 환자(Patient)에서 더 높은 임피던스 변화율을 나타냄을 확인하였다.In addition, as a result of calculating the impedance change rate calculated as ΔZ = Z 1 -Z 2 / Z 1 -Z 3 by using the impedance (Z 1 ) measured when only the sample is put into the sensor 100, Alzheimer's patients ( Patient).

또한, 도 12에 나타난 바와 같이 연산된 임피던스 변화율(△Z)을 이용하여 알츠하이머 질환의 진단, 진행 경과 관찰, 진행 속도의 관찰이 가능함을 입증하였다.In addition, it was proved that diagnosis of Alzheimer's disease, progression progress, and progression rate can be observed using the calculated impedance change rate (ΔZ) as shown in FIG. 12.

2-12. 검증 실험 82-12. Verification experiment 8

본 출원의 실시예에 따른 단백질 번역 후 변형 모니터링 시스템을 사용하여 실제로 알츠하이머 질환 진단에 이용할 수 있는지 검증하기 위해 실험을 실시하였다.An experiment was conducted to verify whether the post-translational modification monitoring system according to the embodiment of the present application can be actually used for diagnosis of Alzheimer's disease.

2-12-1. 세포 용해(Cell 2-12-1. Cell lysis (Cell LysisLysis )(검증 실험 8-1)) (Verification experiment 8-1)

세포를 용해한 후, 용출되는 타우 단백질을 5pg/ml 농도로 센서(100)에 투입하고, 센서(100)에 추가로 투입되는 물질이 (a) 없는 경우 (b) O-GlcNAcase를 저해하는 Thiamet G 100μM 처리 (c) O-GlcNAcase를 촉진하는 BZX2를 100μM 처리한 경우에서 각각의 임피던스(Z)를 측정하고, 각각의 임피던스 변화율을 연산하였다.After lysing the cells, the eluted tau protein is introduced into the sensor 100 at a concentration of 5 pg / ml, and when there is no additional material (a) added to the sensor 100 (b) Thiamet G inhibiting O-GlcNAcase 100 μM treatment (c) In the case of 100 μM treatment of BZX2 that promotes O-GlcNAcase, each impedance (Z) was measured, and each impedance change rate was calculated.

실험 결과, (a)에서 측정되는 임피던스(Z1)는 거의 변화가 없었으나, 타우 단백질의 인산화된 부분의 증감에 따라 임피던스 변화율의 변화가 뚜렷이 나타났으며, 임피던스 변화율의 연산을 통하여 타우 단백질의 인산화된 부분과 타우 단백질의 O-글리코실화된 부분의 증감을 모니터링할 수 있다는 점을 검증하였다(도 13).As a result of the experiment, the impedance (Z 1 ) measured in (a) was almost unchanged, but the change in the rate of change of the impedance was apparent according to the increase or decrease in the phosphorylated portion of the tau protein. It was verified that the increase or decrease of the phosphorylated portion and the O-glycosylated portion of the tau protein can be monitored (FIG. 13).

2-12-2. 마우스 뇌 용해(Mouse Brain 2-12-2. Mouse brain lysis lysislysis )(검증 실험 8-2)) (Verification experiment 8-2)

야생형(Wild Type, WT) 마우스 1마리(전체 타우 단백질 농도 0.4μg/ml)와 알츠하이머 질환 유전자변형(Transgenic, TG) 마우스 2마리(전체 타우 단백질 농도 9.8μg/ml, 20.1μg/ml)를 이용하여, 마우스의 뇌를 용해하고, 그 추출물을 추출하였으며, 전체 타우 단백질 농도가 4pg/ml가 되도록 PBS 용액으로 희석하였다.One wild type (WT) mouse (total protein concentration of 0.4 μg / ml) and two Alzheimer's disease transgenic (TG) mice (total protein concentration of 9.8 μg / ml, 20.1 μg / ml) were used. Then, the brain of the mouse was dissolved, the extract was extracted, and diluted with PBS solution so that the total tau protein concentration was 4 pg / ml.

각각의 샘플을 센서(100)에 투입하고, 각각의 임피던스(Z1, Z2, Z3)를 측정하였으며, 이를 이용하여 임피던스 변화율을 연산하였다.Each sample was put into the sensor 100, and each impedance (Z 1 , Z 2 , Z 3 ) was measured, and the impedance change rate was calculated using this.

실험 결과, 임피던스 변화율을 통해 야생형(WT)과 유전자변형(TG) 마우스의 구별이 가능하다는 것을 검증하였으며, 본 출원의 실시예에 따른 단백질 번역 후 변형 모니터링 시스템을 이용하여 정상 개체와 질환 개체의 구분이 가능함을 입증하였다(도 14).As a result of the experiment, it was verified that the discrimination between wild type (WT) and genetically modified (TG) mice is possible through the impedance change rate, and the normal and disease individuals are distinguished using a protein-translational transformation monitoring system according to an embodiment of the present application. This was proved possible (Fig. 14).

2-12-3. 마우스 혈액(검증 실험 8-3)2-12-3. Mouse blood (verification experiment 8-3)

3개월 야생형(WT) 마우스(전체 타우 단백질 농도 140.8pg/ml), 12개월 야생형(WT) 마우스(전체 타우 단백질 농도 193.8pg/ml), 3개월 유전자변형(TG) 마우스(전체 타우 단백질 농도 196.8pg/ml), 12개월 유전자변형(TG) 마우스(전체 타우 단백질 농도 188.0pg/ml)를 이용하여, 각각의 마우스로부터 혈액을 채취하고 PBS 용액을 사용하여 전체 타우 단백질 농도가 각각 14.08pg/ml, 19.38pg/ml, 19.68pg/ml, 18.80pg/ml가 되도록 희석하였다.3 month wild type (WT) mouse (total Tau protein concentration 140.8 pg / ml), 12 month wild type (WT) mouse (total Tau protein concentration 193.8 pg / ml), 3 month genetically modified (TG) mouse (total Tau protein concentration 196.8 pg / ml), using 12-month transgenic (TG) mice (total Tau protein concentration of 188.0 pg / ml), blood from each mouse was collected, and total Tau protein concentration was 14.08 pg / ml using PBS solution. , 19.38pg / ml, 19.68pg / ml, and diluted to 18.80pg / ml.

각각의 샘플을 센서(100)에 투입하고, 각각의 임피던스(Z1, Z2, Z3)를 측정하였으며, 이를 이용하여 임피던스 변화율을 연산하였다.Each sample was put into the sensor 100, and each impedance (Z 1 , Z 2 , Z 3 ) was measured, and the impedance change rate was calculated using this.

실험 결과, 야생형(WT)의 경우 3개월과 12개월 마우스의 임피던스 변화율이 거의 차이가 없었으나, 유전자변형(TG)의 경우 유의미한 임피던스 변화율 차이가 있음을 확인하였다.As a result of the experiment, in the case of wild type (WT), there was almost no difference in the impedance change rate between 3 and 12 month mice, but in the case of genetic modification (TG), it was confirmed that there was a significant difference in impedance change rate.

실험 결과, 임피던스 변화율을 통해 야생형(WT)과 유전자변형(TG) 마우스의 구별이 가능하다는 것을 검증하였으며, 본 출원의 실시예에 따른 단백질 번역 후 변형 모니터링 시스템을 이용하여 정상 마우스와 알츠하이머 질환을 갖는 마우스의 구분이 가능함을 입증하였다(도 15).As a result of the experiment, it was verified that it is possible to distinguish between wild type (WT) and genetically modified (TG) mice through the rate of change of impedance, and a normal mouse and Alzheimer's disease using a post-translational strain monitoring system according to an embodiment of the present application It was demonstrated that it is possible to distinguish mice (FIG. 15).

2-12-4. 인간 혈액(정상 인간 개체 vs 2-12-4. Human blood (normal human individual vs 경도인지장애Mild cognitive impairment 인간 개체)(검증 실험 8-4) Human subjects) (verification experiment 8-4)

정상 인간 개체와 경도인지장애(Mild Cognitive Impairment, MCI)를 갖는 인간 개체로부터 혈액을 채취하고, 이를 센서(100)에 투입하여 각각의 임피던스(Z1, Z2, Z3)를 측정하였으며, 이를 이용하여 임피던스 변화율을 연산하였다.Blood was collected from a normal human subject and a human subject having Mild Cognitive Impairment (MCI), and this was injected into the sensor 100 to measure the impedance (Z 1 , Z 2 , Z 3 ), and The impedance change rate was calculated.

실험 결과, 도 16과 같은 결과를 얻을 수 있었다.As a result of the experiment, the results shown in FIG. 16 were obtained.

정상 인간 개체(Taumeter: 0.4468, Taumeter=타우 단백질의 인산화된 부분의 임피던스 변화율/타우 단백질의 O-글리코실화된 부분의 임피던스 변화율)에 비해, 경도인지장애를 갖는 인간 개체(Taumeter: 1.5926)에서 더 높은 값을 갖는 것을 확인할 수 있었다.Compared to normal human subjects (Taumeter: 0.4468, Taumeter = rate of impedance change of phosphorylated portion of tau protein / rate of change of O-glycosylated portion of tau protein), more human subjects with mild cognitive impairment (Taumeter: 1.5926) It was confirmed that it had a high value.

실험 결과, Taumeter의 연산을 통해 정상 인간 개체와 경도인지장애를 갖는 인간 개체의 구별이 가능하다는 것을 검증하였다.As a result of the experiment, it was verified that it is possible to distinguish between normal human subjects and human subjects with mild cognitive impairment through calculation of Taumeter.

2-12-5. 인간 혈액(정상 인간 개체 vs 알츠하이머 질환 인간 개체)(검증 실험 8-5)2-12-5. Human blood (normal human subject vs Alzheimer's disease human subject) (verification experiment 8-5)

정상 인간 개체와 알츠하이머 질환을 갖는 인간 개체로부터 혈액을 채취하고, 이를 센서(100)에 투입하여 각각의 임피던스(Z1, Z2, Z3)를 측정하였으며, 이를 이용하여 임피던스 변화율을 연산하였다.Blood was collected from normal human subjects and human subjects with Alzheimer's disease, and the impedances (Z 1 , Z 2 , and Z 3 ) were measured by inputting them into the sensor 100, and the impedance change rate was calculated using them.

실험 결과, 도 17과 같은 결과를 얻을 수 있었다.As a result of the experiment, the results shown in FIG. 17 were obtained.

정상 인간 개체(Taumeter: 0.4364, Taumeter=타우 단백질의 인산화된 부분의 임피던스 변화율/타우 단백질의 O-글리코실화된 부분의 임피던스 변화율)에 비해, 알츠하이머 질환을 갖는 인간 개체(Taumeter: 6.8571)에서 더 높은 값을 갖는 것을 확인할 수 있었다.Higher in human subjects with Alzheimer's disease (Taumeter: 6.8571) compared to normal human subjects (Taumeter: 0.4364, Taumeter = impedance change rate of phosphorylated portion of Tau protein / impedance change rate of O-glycosylated portion of Tau protein) It was confirmed that it had a value.

실험 결과, Taumeter의 연산을 통해 정상 인간 개체와 알츠하이머 질환을 갖는 인간 개체의 구별이 가능하다는 것을 검증하였다.As a result of the experiment, it was verified through the calculation of Taumeter that it is possible to distinguish between normal human subjects and human subjects with Alzheimer's disease.

2-13. 검증 실험 92-13. Validation Experiment 9

정상 인간 개체, 경도인지장애 인간 개체, 알츠하이머 질환을 갖는 인간 개체로부터 혈액을 채취하여 (a) ELISA, 본 출원의 실시예에 따른 센서(100)를 이용하여 (b) 임피던스 변화(Z1-Z2, Z1-Z3), (c) Taumeter 연산하는 방법으로 실험을 진행하였다.Blood is collected from normal human subjects, human subjects with mild cognitive impairment, and human subjects with Alzheimer's disease (a) using ELISA, the sensor 100 according to an embodiment of the present application (b) impedance change (Z1-Z2, Z1-Z3), (c) Taumeter was used to calculate the experiment.

실험 결과, 정상, 경도인지장애, 알츠하이머 질환 유무에 관계 없이 전체 타우 단백질의 임피던스(Z1)는 거의 변화가 없었고, (a) ELISA를 이용한 타우 단백질의 농도를 측정하는 방법 또한 정상 인간 개체와 다른 개체의 구별이 어려움을 확인할 수 있었다. 하지만 (b) 임피던스 변화 및 (c) Taumeter를 이용한 경우 정상 인간 개체와 경도인지장애 인간 개체, 알츠하이머 질환을 갖는 인간 개체의 구별이 명확함을 확인할 수 있었다.As a result of the experiment, regardless of the presence of normal, mild cognitive impairment, or Alzheimer's disease, the impedance (Z 1 ) of the total tau protein was almost unchanged, and (a) the method of measuring the concentration of tau protein using ELISA was also different from that of normal human subjects Difficulty in distinguishing individuals was confirmed. However, when (b) impedance change and (c) Taumeter were used, it was confirmed that the distinction between normal human subjects, mild cognitive impaired human subjects, and human subjects with Alzheimer's disease was clear.

실험 결과, 본 출원의 실시예에 따른 단백질 번역 후 변형 모니터링 시스템을 이용하는 경우 정상 인간 개체와 경도인지장애 인간 개체, 그리고 알츠하이머 질환을 갖는 인간 개체의 구별이 명확하게 이루어질 수 있음을 확인할 수 있었다(도 18 및 19).As a result of the experiment, it was confirmed that the distinction between a normal human subject, a human subject with mild cognitive impairment, and a human subject with Alzheimer's disease can be clearly made when using the post-translational modification monitoring system according to the embodiment of the present application (FIG. 18 and 19).

2-14. 검증 실험 102-14. Validation Experiment 10

타우 단백질의 인산화된 부분의 임피던스 변화율(Z1-Z2/Z1)과, 타우 단백질의 인산화된 부분 및 타우 단백질의 O-글리코실화된 부분의 임피던스 변화율(Z1-Z2/Z1-Z3) 값의 민감성(Sensitivity) 및 특이성(Specificity)을 확인하였다.The rate of change in impedance of the phosphorylated portion of tau protein (Z 1 -Z 2 / Z 1 ) and the rate of change in impedance of the phosphorylated portion of tau protein and the O-glycosylated portion of tau protein (Z 1 -Z 2 / Z 1- Z 3 ) Sensitivity and specificity of the values were confirmed.

실험 결과, 타우 단백질의 인산화된 부분의 임피던스 변화율을 이용(민감성 84.6%, 특이성 81.8%)하였을 때보다 타우 단백질의 인산화된 부분 및 타우 단백질의 O-글리코실화된 부분의 임피던스 변화율(Z1-Z2/Z1-Z3)을 이용(민감성 92.3%, 특이성 90.9%)하였을 때 보다 높은 정확도로 알츠하이머 질환을 진단할 수 있다는 점을 검증하였다(도 20).As a result of the experiment, the impedance change rate of the phosphorylated portion of the tau protein and the O-glycosylated portion of the tau protein (Z 1 -Z) than when the impedance change rate of the phosphorylated portion of the tau protein was used (84.6% sensitivity, specificity 81.8%) 2 / Z 1 -Z 3 ) It was verified that Alzheimer's disease can be diagnosed with higher accuracy when using (92.3% sensitivity, 90.9% specificity) (FIG. 20).

3. 3. 갭을Gap 갖는 바이오 센서의 제조 방법 Manufacturing method of biosensor having

도 21(a) 내지 21(g)는 본 출원의 일 실시예에 따른 단백질의 번역후 변형 모니터링을 위한 시스템의 센서(100)의 제조 방법을 도시한 단면도들이다.21 (a) to 21 (g) are cross-sectional views illustrating a method of manufacturing a sensor 100 of a system for monitoring post-translational modification of a protein according to an embodiment of the present application.

도 21(a)를 참조하면, 기판(120) 위에 무기 절연층(130)을 형성한다. 상기 무기 절연층(130) 위에 제1 금속층(140)을 형성한다. 상기 제1 금속층(140) 위에 제1 포토레지스트 패턴(150)을 형성한다.21 (a), an inorganic insulating layer 130 is formed on the substrate 120. A first metal layer 140 is formed on the inorganic insulating layer 130. A first photoresist pattern 150 is formed on the first metal layer 140.

예를 들어, 상기 기판(120)은, 실리콘, 유리, 쿼츠, 고분자 등을 포함할 수 있다.For example, the substrate 120 may include silicon, glass, quartz, polymer, and the like.

예를 들어, 상기 무기 절연층(130)은, 실리콘 산화물, 실리콘 질화물 등의 절연 물질을 포함할 수 있다. For example, the inorganic insulating layer 130 may include an insulating material such as silicon oxide and silicon nitride.

상기 제1 금속층(140)은, 금, 은, 백금, 크롬, 구리, 티타늄, 이들의 합금 등을 포함할 수 있으며, 단일층 또는 서로 다른 금속층의 적층 구조를 가질 수 있다. 일 실시예에서, 상기 제1 금속층(140)은 크롬/금의 이층 구조를 가질 수 있다. The first metal layer 140 may include gold, silver, platinum, chromium, copper, titanium, and alloys thereof, and may have a single layer or a stacked structure of different metal layers. In one embodiment, the first metal layer 140 may have a two-layer structure of chromium / gold.

상기 제1 포토레지스트 패턴(150)은 상기 제1 금속층(140)을 부분적으로 커버하여, 상기 제1 금속층(140)의 상면을 부분적으로 노출시킨다.The first photoresist pattern 150 partially covers the first metal layer 140 to partially expose the top surface of the first metal layer 140.

도 21(b)를 참조하면, 상기 제1 금속층(140)을 식각하여, 제1 전극(140)을 형성한다. 상기 식각은, 습식 식각에 의한 등방성 식각으로 이루어진다. 따라서, 상기 제1 전극(140)은, 제1 포토레지스트 패턴(150)에 대하여 언더컷을 형성한다.Referring to FIG. 21 (b), the first metal layer 140 is etched to form the first electrode 140. The etching is made of isotropic etching by wet etching. Therefore, the first electrode 140 forms an undercut with respect to the first photoresist pattern 150.

도 21(c)를 참조하면, 상기 제1 포토레지스트 패턴(150) 및 상기 무기 절연층(130)의 노출된 상면 위에 제2 금속층(160)을 형성한다. 상기 제2 금속층(160)은 스퍼터링, 원자빔증착 등과 같은 증착에 의해 형성될 수 있으며, 언더컷이 형성된 상기 제1 포토레지스트 패턴(150)의 아래에는 형성되지 않는다. Referring to FIG. 21 (c), a second metal layer 160 is formed on the exposed top surfaces of the first photoresist pattern 150 and the inorganic insulating layer 130. The second metal layer 160 may be formed by deposition, such as sputtering or atomic beam deposition, and is not formed under the first photoresist pattern 150 on which an undercut is formed.

상기 제2 금속층(160)은, 금, 은, 백금, 크롬, 구리, 티타늄, 이들의 합금 등을 포함할 수 있으며, 단일층 또는 서로 다른 금속층의 적층 구조를 가질 수 있다. 일 실시예에서, 상기 제2 금속층(160)은 크롬/금의 이층 구조를 가질 수 있다.The second metal layer 160 may include gold, silver, platinum, chromium, copper, titanium, and alloys thereof, and may have a single layer or a stacked structure of different metal layers. In one embodiment, the second metal layer 160 may have a two-layer structure of chromium / gold.

도 21(d)를 참조하면, 상기 제1 포토레지스트 패턴(150) 및 그 위에 배치된 상기 제2 금속층(160)을 제거한다. 따라서, 상기 제1 전극(140)과 잔류하는 제2 금속층(160) 사이에는 간극(G)이 형성될 수 있다. 상기 나노 갭은, 포토리소그라피 공정의 노광 후, 마스크를 이용한 식각에 의해 형성되지 않고, 언더컷 형성 후 리프트 오프에 의해 형성되므로, 포토리소그라피의 critical dimension의 한계 보다 작아질 수 있으며, 웨이퍼 레벨의 대면적 공정이 가능하다.Referring to FIG. 21 (d), the first photoresist pattern 150 and the second metal layer 160 disposed thereon are removed. Therefore, a gap G may be formed between the first electrode 140 and the remaining second metal layer 160. Since the nanogap is not formed by etching using a mask after exposure of the photolithography process, but is formed by lift-off after undercut formation, it may be smaller than a limit of a critical dimension of photolithography, and a large area at the wafer level The process is possible.

도 21(e)를 참조하면, 상기 제1 전극(140) 및 잔류 제2 금속층(160) 위에 제2 포토레지스트 패턴(170)을 형성한다. 상기 제2 포토레지스트 패턴(170)은 상기 간극(G)을 커버하고, 상기 제2 금속층(160)을 부분적으로 노출할 수 있다.Referring to FIG. 21 (e), a second photoresist pattern 170 is formed on the first electrode 140 and the remaining second metal layer 160. The second photoresist pattern 170 covers the gap G, and partially exposes the second metal layer 160.

도 21(f)를 참조하면, 상기 제2 포토레지스트 패턴(170)을 마스크로 이용하여, 상기 잔류 제2 금속층(160)을 식각하여, 제2 전극(160)을 형성한다. Referring to FIG. 21 (f), the second metal layer 160 is etched using the second photoresist pattern 170 as a mask to form the second electrode 160.

도 21(g)를 참조하면, 상기 제1 전극(140) 및 상기 제2 전극(160) 위에 유기 절연층(180)을 형성한다. 상기 유기 절연층(180)은 상기 간극(G)을 노출하는 개구(117)를 형성할 수 있다. Referring to FIG. 21 (g), an organic insulating layer 180 is formed on the first electrode 140 and the second electrode 160. The organic insulating layer 180 may form an opening 117 exposing the gap G.

이상, 본 명세서에는 본 출원을 당업자가 용이하게 이해하고 재현할 수 있도록 도면에 도시한 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당업자라면 본 출원의 실시예로부터 다양한 변형 및 균등한 타 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 출원의 보호범위는 청구범위에 의해서 정해져야 할 것이다. As described above, the present specification has been described with reference to the embodiments shown in the drawings so that those skilled in the art can easily understand and reproduce the present application, but this is only exemplary, and those skilled in the art can make various modifications and equivalents from the embodiments of the present application. It will be understood that embodiments are possible. Therefore, the protection scope of the present application should be defined by the claims.

10: 제1 항체
20: 타겟 단백질
30: 제2 항체
40: 제3 항체
100: 센서
110: 측정 단위부
111: 제1 종방향 메인 전선
112: 제1 횡방향 메인 전선
113: 제1 종방향 서브 전선
114: 제2 종방향 메인 전선
115: 제2 횡방향 메인 전선
116: 제2 종방향 서브 전선
117: 개구
120: 기판
130: 무기 절연층
140: 제1 전극
150: 제1 포토레지스트 패턴
160: 제2 전극
170: 제2 포토레지스트 패턴
180: 유기 절연층
200: 제어 장치
210: 구동부
220: 전원 인가부
230: 임피던스 측정부
240: 연산부
250: 데이터베이스
260: 진단부
300: 자성체
400: 디스플레이
b: 마이크로 비드
S1: 제1 결합체
S2: 제2 결합체
S3: 제3 결합체
S4: 제4 결합체10: first antibody
20: target protein
30: second antibody
40: third antibody
100: sensor
110: unit of measurement
111: first longitudinal main wire
112: first transverse main wire
113: first longitudinal sub-wire
114: second longitudinal main wire
115: second transverse main wire
116: second longitudinal sub-wire
117: opening
120: substrate
130: inorganic insulating layer
140: first electrode
150: first photoresist pattern
160: second electrode
170: second photoresist pattern
180: organic insulating layer
200: control device
210: driving unit
220: power supply
230: impedance measurement unit
240: operation unit
250: database
260: diagnostic unit
300: magnetic material
400: display
b: micro bead
S1: first conjugate
S2: second conjugate
S3: third binder
S4: fourth combination

Claims (15)

제1 전극(140), 간극(G)을 형성하도록 상기 제1 전극(140)과 소정 거리 이격되는 제2 전극(160), 및 상기 간극(G)과 연통하는 개구(117)를 형성하도록 상기 제1 전극(140)의 일부와 상기 제2 전극(160)의 일부를 커버하는 유기 절연층(180)을 포함하는 측정 단위부(110)를 하나 이상 포함하는 센서(100); 및
상기 제1 전극(140)과 상기 제2 전극(160) 사이에 기 설정된 전압을 인가하는 전원 인가부(220), 상기 센서(100)에 투입되는 적어도 2개의 측정 대상 샘플의 임피던스(Z)를 각각 측정하는 임피던스 측정부(230), 및 상기 임피던스 측정부(230)에 의해 측정된 임피던스(Z)에 기초하여 기 설정된 방법에 의해 임피던스 변화율(△Z)을 연산하는 연산부(240)를 포함하는 제어 장치(200);를 포함하는,
단백질 번역 후 변형 모니터링 시스템.
The first electrode 140, the second electrode 160 spaced a predetermined distance from the first electrode 140 to form a gap G, and the openings 117 communicating with the gap G are formed to A sensor 100 including one or more measurement unit parts 110 including an organic insulating layer 180 covering a part of the first electrode 140 and a part of the second electrode 160; And
Power supply unit 220 for applying a predetermined voltage between the first electrode 140 and the second electrode 160, the impedance (Z) of at least two samples to be measured to be input to the sensor 100 Impedance measurement unit 230 for measuring each, and a calculation unit 240 for calculating the impedance change rate (ΔZ) by a predetermined method based on the impedance (Z) measured by the impedance measurement unit 230 Control device 200; including,
Post-translational strain monitoring system.
제1항에 있어서,
상기 제1 전극(140) 사이와 상기 제2 전극(160) 사이의 간극(G)은 1μm 이하인,
단백질 번역 후 변형 모니터링 시스템.
According to claim 1,
The gap G between the first electrode 140 and the second electrode 160 is 1 μm or less,
Post-translational strain monitoring system.
제1항에 있어서,
상기 간극(G)에 놓여지는 측정 대상 물질은,
마이크로 비드(b) 및 상기 마이크로 비드(b)에 결합되는 제1 항체(10)를 포함하는 제1 결합체(S1);
상기 마이크로 비드(b), 상기 마이크로 비드(b)에 결합되는 제1 항체(10) 및 상기 제1 항체(10)에 결합되는 타겟 단백질(20)을 포함하는 제2 결합체(S2); 및
상기 마이크로 비드(b), 상기 마이크로 비드(b)에 결합되는 상기 제1 항체(10), 상기 제1 항체(10)에 결합되는 상기 타겟 단백질(20) 및 상기 타겟 단백질(20)의 제1 변형 부위에 결합되는 제2 항체(30)를 포함하는 제3 결합체(S3);를 포함하는,
단백질 번역 후 변형 모니터링 시스템.
According to claim 1,
The material to be measured placed in the gap G,
A first conjugate (S1) comprising a microbead (b) and a first antibody (10) bound to the microbead (b);
A second conjugate (S2) comprising the microbead (b), a first antibody (10) bound to the microbead (b) and a target protein (20) bound to the first antibody (10); And
The microbead (b), the first antibody 10 bound to the microbead (b), the target protein 20 bound to the first antibody 10 and the first of the target protein 20 Containing; a third conjugate (S3) comprising a second antibody (30) bound to the modification site; containing,
Post-translational strain monitoring system.
제3항에 있어서,
상기 간극(G)에 놓여지는 측정 대상 물질은,
상기 마이크로 비드(b), 상기 마이크로 비드(b)에 결합되는 상기 제1 항체(10), 상기 제1 항체(10)에 결합되는 상기 타겟 단백질(20) 및 상기 타겟 단백질(20)의 제2 변형 부위에 결합되는 제3 항체(40)를 포함하는 제4 결합체(S4);를 더 포함하며,
상기 타겟 단백질(20)의 상기 제1 변형 부위의 양과 상기 제2 변형 부위의 양은 서로 반비례하는,
단백질 번역 후 변형 모니터링 시스템.
According to claim 3,
The material to be measured placed in the gap G,
The microbead (b), the first antibody (10) bound to the microbead (b), the target protein (20) bound to the first antibody (10) and the second of the target protein (20) It further includes a fourth conjugate (S4) comprising a third antibody (40) that is bound to the modification site,
The amount of the first modified region and the amount of the second modified region of the target protein 20 are inversely proportional to each other,
Post-translational strain monitoring system.
제3항 또는 제4항에 있어서,
상기 간극(G)에 놓여지는 물질의 임피던스(Z)는,
상기 마이크로 비드(b)에 결합된 물질의 양과 종류가 증가할수록 감소하는,
단백질 번역 후 변형 모니터링 시스템.
The method of claim 3 or 4,
The impedance Z of the material placed in the gap G is
As the amount and type of the material bound to the microbead (b) increases, it decreases,
Post-translational strain monitoring system.
제3항에 있어서,
상기 센서(100)에 상기 제2 결합체(S2)를 포함하는 제1 샘플이 투입되었을 때 측정되는 임피던스를 Z1,
상기 센서(100)에 상기 제3 결합체(S3)를 포함하는 제2 샘플이 투입되었을 때 측정되는 임피던스를 Z2이라 할 때,
상기 연산부(240)에 의해 연산되는 임피던스 변화율(△Z)은 Z1-Z2/Z1으로 연산되는,
단백질 번역 후 변형 모니터링 시스템.
According to claim 3,
The impedance measured when the first sample including the second coupling member (S2) is introduced into the sensor 100 is Z 1 ,
When the impedance measured when the second sample including the third coupling member S3 is introduced into the sensor 100 is Z 2 ,
The impedance change rate (ΔZ) calculated by the calculator 240 is calculated as Z 1 -Z 2 / Z 1 ,
Post-translational strain monitoring system.
제4항에 있어서,
상기 센서(100)에 상기 제2 결합체(S2)를 포함하는 제1 샘플이 투입되었을 때 측정되는 임피던스를 Z1,
상기 센서(100)에 상기 제3 결합체(S3)를 포함하는 제2 샘플이 투입되었을 때 측정되는 임피던스를 Z2,
상기 센서(100)에 상기 제4 결합체(S4)를 포함하는 제3 샘플이 투입되었을 때 측정되는 임피던스를 Z3이라 할 때,
상기 연산부(240)에 의해 연산되는 임피던스 변화율(△Z)은 Z1-Z2/Z1-Z3으로 연산되는,
단백질 번역 후 변형 모니터링 시스템.
According to claim 4,
The impedance measured when the first sample including the second coupling member (S2) is introduced into the sensor 100 is Z 1 ,
The impedance measured when the second sample including the third coupling member (S3) is introduced into the sensor 100 is Z 2 ,
When the impedance measured when the third sample including the fourth coupling member S4 is introduced into the sensor 100 is Z 3 ,
The impedance change rate (ΔZ) calculated by the calculating unit 240 is calculated as Z 1 -Z 2 / Z 1 -Z 3 ,
Post-translational strain monitoring system.
제6항 또는 제7항에 있어서,
상기 제어 장치(200)는, 상기 연산부(240)에 의해 연산되는 임피던스 변화율(△Z)을 저장하는 데이터베이스(250)를 더 포함하며,
상기 연산부(240)는 제1 시점에서 연산된 임피던스 변화율(△Z1)과 상기 제1 시점 이후의 제2 시점에서 연산된 임피던스 변화율(△Z2)을 비교함으로써, 비교 결과 데이터를 더 연산하는,
단백질 번역 후 변형 모니터링 시스템.
The method of claim 6 or 7,
The control device 200 further includes a database 250 storing an impedance change rate (ΔZ) calculated by the operation unit 240,
By comparing the operation section 240 is an impedance change rate calculated at a second time after the impedance change rate calculated in the first time point (△ Z 1) and the first point in time (△ Z 2), the comparison result further operational data ,
Post-translational strain monitoring system.
제6항 또는 제7항에 있어서,
상기 마이크로 비드(b)는 자성 비드이고,
상기 자성 비드가 상기 개구(117)를 통해 상기 간극(G)에 놓여지도록 안내하는 자성체(300)를 더 포함하는,
단백질 번역 후 변형 모니터링 시스템.
The method of claim 6 or 7,
The microbead (b) is a magnetic bead,
Further comprising a magnetic body 300 for guiding the magnetic beads to be placed in the gap G through the opening 117,
Post-translational strain monitoring system.
제6항 또는 제7항에 있어서,
상기 타겟 단백질(20)은 타우(tau) 단백질인,
단백질 번역 후 변형 모니터링 시스템.
The method of claim 6 or 7,
The target protein 20 is a tau protein,
Post-translational strain monitoring system.
제10항에 있어서,
상기 타겟 단백질(20)의 상기 제1 변형 부위는 인산화(phosphorylation)된 부분을 포함하고, 상기 제2 변형 부위는 0-글리코실화(O-glycosylation)된 부분을 포함하는,
단백질 번역 후 변형 모니터링 시스템.
The method of claim 10,
The first modified portion of the target protein 20 includes a phosphorylated portion, and the second modified portion comprises a 0-glycosylated portion,
Post-translational strain monitoring system.
제11항에 있어서,
상기 제2 항체(30)는 상기 타겟 단백질(20)의 상기 인산화된 부분에 결합하는 항체이고,
상기 제3 항체(40)는 상기 타겟 단백질(20)의 상기 O-글리코실화된 부분에 결합하는 항체인,
단백질 번역 후 변형 모니터링 시스템.
The method of claim 11,
The second antibody 30 is an antibody that binds to the phosphorylated portion of the target protein 20,
The third antibody 40 is an antibody that binds to the O-glycosylated portion of the target protein 20,
Post-translational strain monitoring system.
기판 상에 제1 금속층을 형성하는 단계;
상기 제1 금속층 위에 제1 포토레지스트 패턴을 형성하는 단계;
상기 제1 금속층을 식각하여, 제1 전극을 형성하고, 상기 제1 포토레지스트 패턴 하부에 언더컷을 형성하는 단계;
상기 제1 금속층이 제거된 영역 및 상기 제1 포토레지스트 패턴 위에 제2 금속층을 형성하는 단계;
상기 제1 포토레지스트 패턴 및 상기 제1 포토레지스트 패턴 위에 배치된 제2 금속층을 제거하는 단계;
상기 제1 전극 및 잔류하는 제2 금속층 위에 제2 포토레지스트 패턴을 형성하는 단계;
상기 잔류하는 제2 금속층을 식각하여, 상기 제1 전극과 소정 거리 이격된 제2 전극을 형성하는 단계; 및
상기 제1 전극의 일부와 상기 제2 전극의 일부를 커버하며, 상기 제1 전극과 상기 제2 전극 사이의 간극 위에 개구를 형성하는 유기 절연층을 형성하는 단계;를 포함하는,
나노 갭을 갖는 센서의 제조 방법.
Forming a first metal layer on the substrate;
Forming a first photoresist pattern on the first metal layer;
Etching the first metal layer to form a first electrode, and forming an undercut under the first photoresist pattern;
Forming a second metal layer on the region from which the first metal layer is removed and the first photoresist pattern;
Removing the first photoresist pattern and a second metal layer disposed on the first photoresist pattern;
Forming a second photoresist pattern on the first electrode and the remaining second metal layer;
Etching the remaining second metal layer to form a second electrode spaced a predetermined distance from the first electrode; And
And forming an organic insulating layer covering a portion of the first electrode and a portion of the second electrode and forming an opening over a gap between the first electrode and the second electrode.
Method for manufacturing a sensor having a nanogap.
제13항에 있어서,
상기 제1 금속층은,
상기 기판 위에 배치된 무기 절연층 위에 형성되는,
나노 갭을 갖는 센서의 제조 방법.
The method of claim 13,
The first metal layer,
Is formed on the inorganic insulating layer disposed on the substrate,
Method for manufacturing a sensor having a nanogap.
제13항에 있어서,
상기 제1 전극 사이와 상기 제2 전극 사이의 간극은 1μm 이하인,
나노 갭을 갖는 센서의 제조 방법.The method of claim 13,
The gap between the first electrode and the second electrode is 1 μm or less,
Method for manufacturing a sensor having a nanogap.
KR1020190084599A 2018-10-04 2019-07-12 System for monitoring post-translational modification of protein using bio-sensor with gap and manufactureing method for bio-sensor KR102265379B1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US16/579,852 US11668709B2 (en) 2018-10-04 2019-09-24 System for monitoring post-translational modification of protein using bio-sensor with gap and manufacturing method for bio-sensor

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20180118415 2018-10-04
KR1020180118415 2018-10-04

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20200038844A true KR20200038844A (en) 2020-04-14
KR102265379B1 KR102265379B1 (en) 2021-06-16

Family

ID=70291480

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020190084599A KR102265379B1 (en) 2018-10-04 2019-07-12 System for monitoring post-translational modification of protein using bio-sensor with gap and manufactureing method for bio-sensor

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102265379B1 (en)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20220005788A (en) 2020-07-07 2022-01-14 연세대학교 산학협력단 Energy Concentration Apparatus having center hole and micro slit
KR20220096604A (en) * 2020-12-31 2022-07-07 주식회사 바이오소닉스 Method of detecting antigen for bio-sensor using multi frequencies

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013521942A (en) * 2010-03-16 2013-06-13 メドトロニック ミニメド インコーポレイテッド Analyte sensor device with improved electrode configuration, method of making and using the device
KR20130091288A (en) 2012-02-07 2013-08-16 (주)나노몰 A system for detecting tau aggregation
KR20150081841A (en) * 2014-01-07 2015-07-15 한국과학기술연구원 Electrode Array for analyzing electrical characteristics of Cell Spheroid
KR20170054171A (en) * 2015-11-09 2017-05-17 한국과학기술연구원 Ultra-highly sensitive electrochemical biosensor using beads and method for manufacturing the same
KR20180089849A (en) * 2017-02-01 2018-08-09 한국과학기술연구원 Method for monitoring post-translational modification of protein

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013521942A (en) * 2010-03-16 2013-06-13 メドトロニック ミニメド インコーポレイテッド Analyte sensor device with improved electrode configuration, method of making and using the device
KR20130091288A (en) 2012-02-07 2013-08-16 (주)나노몰 A system for detecting tau aggregation
KR20150081841A (en) * 2014-01-07 2015-07-15 한국과학기술연구원 Electrode Array for analyzing electrical characteristics of Cell Spheroid
KR20170054171A (en) * 2015-11-09 2017-05-17 한국과학기술연구원 Ultra-highly sensitive electrochemical biosensor using beads and method for manufacturing the same
KR20180089849A (en) * 2017-02-01 2018-08-09 한국과학기술연구원 Method for monitoring post-translational modification of protein

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FLEXTau: Quantifying Post-translational Modifications of Tau Protein in Vitro and in Human Disease(W. Mair et al., Anal. Chem. 2016, 88, 3704-3714)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20220005788A (en) 2020-07-07 2022-01-14 연세대학교 산학협력단 Energy Concentration Apparatus having center hole and micro slit
KR20220096604A (en) * 2020-12-31 2022-07-07 주식회사 바이오소닉스 Method of detecting antigen for bio-sensor using multi frequencies
WO2022145976A1 (en) * 2020-12-31 2022-07-07 주식회사 바이오소닉스 Method by which biosensor device detects antigen by using multiple frequencies

Also Published As

Publication number Publication date
KR102265379B1 (en) 2021-06-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Teunissen et al. Novel diagnostic cerebrospinal fluid biomarkers for pathologic subtypes of frontotemporal dementia identified by proteomics
Papafilippou et al. Protein corona fingerprinting to differentiate sepsis from non-infectious systemic inflammation
KR102265379B1 (en) System for monitoring post-translational modification of protein using bio-sensor with gap and manufactureing method for bio-sensor
WO2012058334A1 (en) Morphology & protein specific reagents as diagnostics for neurodegenerative diseases
CA2981533A1 (en) Method for predicting risk of cognitive deterioration
ES2918773T3 (en) Methods and compositions related to neurodegenerative diseases
Liang et al. Glycosylation of human plasma clusterin yields a novel candidate biomarker of Alzheimer’s disease
Dutta et al. Development of a novel Electrochemiluminescence ELISA for quantification of α-Synuclein phosphorylated at Ser129 in biological samples
Lee et al. Fibrinogen gamma-A chain precursor in CSF: a candidate biomarker for Alzheimer's disease
KR102103284B1 (en) Method for monitoring post-translational modification of protein
EP1120654A2 (en) Detection of Alzheimer's disease from cerebrospinal fluid using an immunoassay method
KR102313791B1 (en) Biomarker composition for diagnosis of degenerative brain disease
US11668709B2 (en) System for monitoring post-translational modification of protein using bio-sensor with gap and manufacturing method for bio-sensor
KR20200025195A (en) Biomarker composition for diagnosing Alzheimer's dementia and use thereof
Kim et al. Screening for cerebral amyloid angiopathy based on serological biomarkers analysis using a dielectrophoretic force-driven biosensor platform
Roy et al. Implementation of an ultra-sensitive microwell-based electrochemical sensor for the detection of Alzheimer’s disease
US20180284126A1 (en) A method of detecting molecules in proximity to a target molecule in a sample
US20200088743A1 (en) Method for monitoring post-translational modification of protein
KR102466943B1 (en) Method and System for Monitoring Parkinson's Disease using Bio-Sensor with Gap
WO2022125501A1 (en) Graphene-based sensor for detection of prostate biomarkers
JP7106810B2 (en) Novel lung cancer marker
KR101818296B1 (en) Method of diagnosis for bisphosphonate-related osteonecrosis of the jaw
US11300576B2 (en) DARPin reagents that distinguish Alzheimer's disease and Parkinson's disease samples
Vervuurt et al. Proximity extension assay in cerebrospinal fluid identifies neurofilament light chain as biomarker of neurodegeneration in sporadic cerebral amyloid angiopathy
Pidal et al. Dual on-the-move electrochemical immunoassays for the simultaneous determination of amyloid-β (1-42) and Tau in Alzheimer's patient samples

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E90F Notification of reason for final refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant