KR20200029819A

KR20200029819A - 스트렙토미세스로부터 유래된 새로운 화합물 및 용도

Info

Publication number: KR20200029819A
Application number: KR1020180108327A
Authority: KR
Inventors: 신희재; 최병규; 이화선; 이희승; 이연주; 이종석; 이지훈
Original assignee: 한국해양과학기술원
Priority date: 2018-09-11
Filing date: 2018-09-11
Publication date: 2020-03-19
Also published as: KR102100431B1; US11878984B2; US20220033413A1; WO2020054946A1

Abstract

본 발명은 해양 방선균 스트렙토미세스로부터 유래된 새로운 화합물에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 새로운 화합물은 LPS로 자극된 BV-2 미세아교세포에 대해 NO 생성 억제 효과가 있어 신경 염증 질병의 예방 및 치료에 활용될 수 있다.

Description

스트렙토미세스로부터 유래된 새로운 화합물 및 용도 {Novel compounds from Streptomyces sp. and use thereof}

본 발명은 스트렙토미세스로부터 유래된 새로운 화합물 및 그 용도에 관한 것이다.

최근 해양 자원, 특히 해양 생물 자원으로부터 새로운 2차 대사물질 연구는 다양한 화학적 구조와 인간의 질병 치료를 위한 선도 물질로서 활용 가능하기 때문에 점점 더 주목을 받고 있다. 이 중에서, 해양 방선균류 (actinobacteria)는 생리활성을 나타내는 천연물에 대한 중요한 공급원으로 알려져 있다. 특히, 미생물로부터 생산된 생리활성을 갖는 천연물 중 상당 부분이 스트렙토미세스 속 (Streptomyces sp.)에 의해 생산되는 것으로 밝혀졌다.

스트렙토미세스는 호기성의 그람 양성균으로서 분지형의 균사를 생산하고, 생산된 균사는 복잡한 구조의 기질 균사를 형성한다. 스트렙토미세스는 특유의 복잡한 2차 대사 과정으로 유명한데, 이러한 과정에서 유래된 천연물들은 항균, 항바이러스, 항암, 항고혈압, 항생 및 면역억제와 같은 광범위한 분야에서 연구되어 왔다. 1952년 왁스먼이 토양의 스트렙토미세스 그리세우스의 대사물질로부터 스트렙토마이신을 처음 발견한 이래, 스트렙토미세스 오레오파시엔스로부터 유래된 오레오마이신, 스트렙토미세스 그리세오크로모게네스로부터 유래된 블라스티사이딘, 스트렙토미세스 아소엔시스로부터 유래된 폴리옥신과 같은 다양한 항생 물질들이 발견, 분리되었고, 스트렙토미세스 배양을 통해 산업 규모로 생산하기에 이르렀지만, 이외에도 여전히 발견되지 않은 새로운 2차 대사물질이 존재할 것으로 여겨져 많은 연구가 진행되고 있다.

미세아교세포 (microglia cell)는 뇌 손상 또는 감염에 대한 면역 반응을 나타내는 뇌의 대식세포이다. 그러나, 미세아교세포의 활성이 제어되지 않거나 과도하게 활성화되는 경우에는 염증 매개성 신경 퇴행과 같은 문제를 유발하게 된다. 따라서, 미세아교세포의 활성화 정도를 적절하게 하향 조절하는 것은 신경 퇴행성 질환의 치료에 직결되는 과제에 해당한다.

본 발명의 목적은 해양 스트렙토미세스로부터 유래된 새로운 2차 대사 물질을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 신경 퇴행성 질환의 예방 또는 치료를 위한 새로운 화합물을 제공하는 것이다.

본 발명에서는 코스라에 섬에서 수집한 망그로브 샘플에서 분리한 스트렙토미세스 균주로부터 생성되는 아래 화학식 1의 새로운 화합물을 제공한다.

[화학식 1]

식 중에서, X₁은 H 또는 OR이고;

R은 H 또는 -Y-Z이고;

Y는 카보닐, 아미도 또는 아마이드, 또는 탄소 수 1 내지 6개의 알킬 또는 알킬렌이고;

Z는 존재하지 않거나, 탄소 수 5 내지 10개의 치환 또는 비치환 아릴이고;

상기 아릴이 치환되는 경우 그 치환기는 하이드록시기, 탄소수 1 내지 6개의 알킬기 및 아미노기로 구성된 군에서 1개 이상 선택되는 것이고;

X₂는 탄소 수 3 내지 12개의 포화 또는 불포화 직선형 또는 분지형 알킬, 또는 탄소수 3 내지 12개의 알케닐이다.

본 발명에 따른 상기 화학식 1의 화합물은 신경 세포에서 NO 생성을 억제하여 신경 퇴행성 질환의 예방 및 치료에 이용될 수 있다.

도 1 (a)는 화합물 1의 부분 구조와 COSY 상관관계 (파란색)를 표시한 것이고, (b)는 화합물 1의 HMBC 상관관계 (빨간색)을 표시한 도면이다.
도 2는 커플링 상수 ³ J _(H3/H4) 및 ROESY 상관관계를 바탕으로 화합물 1의 구조와 입체구조를 도시한 것이다.
도 3은 화합물 1을 환원, 메틸화시킨 유도체의 ¹H NMR 스펙트럼이다.
도 4는 화합물 1을 환원, 메틸화시킨 유도체의 ¹³C NMR 스펙트럼이다.
도 5는 화합물 1을 환원, 메틸화시킨 유도체의 ROESY 스펙트럼이다.
도 6의 좌도는 화합물 1의 실험 ECD 스펙트럼 (검정색), 화합물 1의 가능한 거울상 이성질체 화합물 1A (3S, 4R, 5S 및 14S)의 계산된 ECD 스펙트럼 (빨간색), 및 거울상 이성질체 화합물 1B (3R, 4S, 5R 및 14R)의 계산된 ECD 스펙트럼 (파란색)을 함께 나타낸 것이며, 우도는 화합물 1A 및 1B의 구조를 나타낸 것이다.
도 7은 화합물 3의 주요 COSY (파란색) 및 HMBC 상관관계 (빨간색)를 나타낸 도면이다.
도 8은 화합물 3의 ROESY 스펙트럼이다.
도 9는 LPS로 자극한 BV-2 미세아교세포에 화합물 1 및 2를 각각 처리했을 때 NO 생성량을 나타낸 그래프이다. 막대 그래프 가운데 표시된 선분은 표준편차를 의미한다.
도 10은 LPS로 자극한 BV-2 미세아교세포에 화합물 3 및 4를 각각 처리했을 때 NO 생성량을 나타낸 그래프이다. 막대 그래프 가운데 표시된 선분은 표준편차를 의미한다.
도 11은 LPS로 자극한 BV-2 미세아교세포에 화합물 1 및 2를 각각 처리했을 때 세포 생존도를 나타낸 그래프이다. 막대 그래프 가운데 표시된 선분은 표준편차를 의미한다.
도 12는 LPS로 자극한 BV-2 미세아교세포에 화합물 3 및 4를 각각 처리했을 때 세포 생존도를 나타낸 그래프이다. 막대 그래프 가운데 표시된 선분은 표준편차를 의미한다.

본 발명은 아래 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 이들의 염에 관한 것이다.

[화학식 1]

식 중에서, X₁은 H 또는 OR일 수 있고; R은 H 또는 -Y-Z일 수 있고; Y는 카보닐, 아미도, 또는 아마이드 또는 탄소 수 1 내지 6개의 알킬 또는 알킬렌일 수 있고; Z는 존재하지 않거나, 탄소 수 5 내지 10개의 치환 또는 비치환 아릴일 수 있고; X₂는 탄소 수 3 내지 12개의 포화 또는 불포화 직선형 또는 분지형 알킬, 또는 탄소수 3 내지 12개의 알케닐일 수 있다. 여기서, 상기 아릴이 치환되는 경우 그 치환기는 하이드록시기, 탄소수 1 내지 6개인 알킬기 및 아미노기로 구성된 군에서 1개 이상 선택되는 것일 수 있다.

상기 아릴은 페닐, 톨릴, 크실레닐, 나프틸 및 하이드록시페닐로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다. 여기서 상기 톨릴은 2-톨릴, 3-톨릴 또는 4-톨릴일 수 있고, 크실레닐은 오르토크실레닐 또는 메타크실레닐일 수 있고, 나프틸은 1-나프틸 또는 2-나프틸일 수 있다.

상기 화학식 1의 화합물은 해양미생물 스트렙토미세스로부터 생성 및 분리되는 2차 대사 물질일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 이들의 염을 포함하는 신경 퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 여기서, 상기 신경 퇴행성 질환은 알츠하이머병, 루게릭병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 멜라스 증후군 및 다발성경화증으로 이루어진 군에서 1 종 이상 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

실시예

이하, 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 본 발명의 범위가 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실험 장치

1D (¹H 및 ¹³C), 2D (COSY, ROESY, HSQC, HMBC) NMR 스펙트럼은 Varian Unity 500 MHz 분광기를 이용하여 얻었다. UV 스펙트럼은 Shimadzu UV-1650PC 분광 광도계를 이용하여 얻었다. IR 스펙트럼은 JASCO FT/IR-4100 분광 광도계를 이용하여 얻었다. 선광도는 Rudolph Research Analytical (Autopol III) 편광계를 이용하여 측정하였다. 고해상도 (HR) ESIMS는 Shimadzu LC/MS-IT-TOF 질량분석계를 이용하여 기록하였다. HPLC는 RI-101 (Shodex) 검출기와 PrimeLine Binary 펌프를 이용하여 수행하였다. Semi-preparative HPLC는 ODS 컬럼(YMC-Pack-ODS-A, 250×10 mm, i.d, 5μm) 및 실리카 컬럼 (YMC-Pack-SIL, 250×10 mm, I.d, 5μm)을 이용하여 수행하였다. Analytical HPLC는 ODS 컬럼 (YMC-Pack-ODS-A, 250×4.6 mm, i.d, 5μm)에서 수행하였다.

스트렙토미세스 균주의 대량 배양

코스라에 섬 (Kosrae Island)에서 채집한 망그로브 나무로부터 151KO-143 균주를 분리하였다. 16S rRNA 유전자 서열 분석 (GenBank 등록번호 KY569410) 결과, 상기 균주는 스트렙토미세스 속인 것으로 확인되었다.

분리한 151KO-143 균주를 Bennett (BN) 한천 배지에서 28℃에서 7일 동안 배양하였고, 이후 균주를 50mL의 BN 액체 배지 (증류수 1L 중에 글루코오스 10g, 효모 추출물 1g, 트립톤 2g, 쇠고기 추출물 1g, 글리세롤 5g 및 NaCl 32g 포함)가 들어 있는 플라스크에 접종하여 130rpm으로 28℃에서 7일 동안 배양하였다. 10mL의 배양액을 BN 배지 (1L)가 들어 있는 2L 플라스크에 접종하여 같은 조건으로 7일간 배양하였다. 배양액 1L가 들어 있는 2L 플라스크 (×10) 및 100L 발효기를 이용하여 각각 10L 및 60L로 대규모 배양하였다. 10L 및 60L의 배양액을 28℃에서 각각 7일 및 4일간 배양하였다.

실시예 1. 화합물의 추출 및 분리

배양액 (총 70L)을 원심분리시켜 세포와 상등액으로 분리한 후 에틸아세테이트 (EtOAc)로 상등액을 추출하였다. 에틸아세테이트 추출물을 건조시켜 조추출물 (5g)을 얻었다. 상기 조추출물을 MeOH/H₂O의 조합으로 단계적으로 용출 (1:4, 2:3, 3:2, 4:1 및 100% MeOH) 시키면서 ODS를 이용한 플래시 컬럼 크로마토그래피로 분획하였다.

MeOH/H₂O의 비율을 3:2로 하여 용출시킨 분획을 52% MeOH 수용액으로 등용매 용출 (isocratic elution)시켜 semi-preparative reveresed-phase HPLC (YMC-Pack-ODS-A, 250×10 mm, i.d, 5μm, 유속 3.5 mL/min, RI 검출기)로 정제하여, 점성이 있는 황색 오일의 형태로 화합물 1 (10.4 mg, t_R=36분) 및 화합물 2 (2.9 mg, t_R=24분)를 얻었다.

MeOH/H2O의 비율을 4:1로 하여 용출시킨 분획을 ACN-MeOH-H2O (3:3:4)로 등용매 용출시켜 analytical reversed-phase HPLC (YMC-Pack-ODS-A, 250×4.6 mm, i.d, 5μm, 유속 3.5 mL/min, RI 검출기)로 정제하여, 보라색 무정형 고체 형태로 화합물 3 (2.5 mg, t_R=18.5분) 및 화합물 4 (1.0 mg, t_R=12.5분)를 수득하였다.

실시예 2. 화합물의 구조 결정

화합물 1 내지 4의 광학 순도; IR; UV; HRESIMS 분석 결과를 요약하면 다음과 같다.

화합물 1 : [α]_D ²⁵ -23.3(c 0.1, MeOH); IR ν_max 3606, 2958, 2922, 2869, 1358, 1267, 1163, 1053, 990 cm^-1; UV(MeOH) λ_max(log ε) 236 (2.57)nm; HRESIMS m/z 289.1412 [M + Na]⁺(calcd for 289.1416, C₁₅H₂₂O₄Na).

화합물 2 : [α]_D ²⁵ -30.0(c 0.1, MeOH); IR ν_max 3390, 2914, 1649, 1252, 678 cm^-1; UV(MeOH) λ_max(log ε) 246 (2.59)nm; HRESIMS m/z 287.1262 [M + Na]⁺(calcd for 287.1259, C₁₅H₂₀O₄Na).

화합물 3 : [α]_D ²⁵ -16.6(c 0.1, MeOH); IR ν_max 3702, 2975, 2861, 2355, 1671, 1341, 1064, 1007 cm^-1; UV(MeOH) λ_max(log ε) 240 (3.57), 342 (3.39), 406 (3.24) nm; HRESIMS m/z 384.1813 [M - H]^-(calcd for 384.1811, C₂₂H₂₇NO₅).

화합물 4 : [α]_D ²⁵ -30.0(c 0.1, MeOH); IR ν_max 3698, 2954, 2851, 2366, 1348, 1057, 1011 cm^-1; UV(MeOH) λ_max 240 (3.54), 334 (2.99) nm; HRESIMS m/z 382.1656 [M - H]^- (calcd for 382.1654, C₂₂H₂₅NO₅).

실시예 2-1. 화합물 1의 구조 결정

화합물 1의 구조는 아래 화학식 2와 같으며, 그 구조는 다음과 같이 결정하였다.

[화학식 2]

HRESIMS, NMR 및 HMBC를 통한 구조 분석

HRESIMS 분석 (m/z 289.1412 [M+Na]⁺, 289.1416 계산치)에 의해 화합물 1의 화학식은 C₁₅H₂₂O₄로 결정되었다. 화합물 1의 ¹H NMR 스펙트럼은 δ_H 1.70에서 메틸기, δ_H 5.54×2 및 δ_H 6.00×2에서 올레핀성 양성자 4개, 및 δ_H 4.02, δ_H 3.98, δ_H 3.91, δ_H 3.80, δ_H 3.63, δ_H 3.51에서 산소와 결합된 메틸렌 3개 (양성자 6개)가 존재함을 보여주었다. 화합물 1의 ¹³C NMR 데이터 및 HSQC 스펙트럼을 분석한 결과, 산소와 결합된 메틸렌 3개, 메틸렌 3개, 메틴 6개, 메틸 1개, 및 사차 탄소 2개가 존재하는 것으로 나타났다. 화합물 1의 2D NMR (¹H-¹H COSY, HSQC 및 HMBC) 데이터의 자세한 분석을 통해, 스핀 시스템과 상관관계를 확인하였다. H₂-1/H₂-2/H-3/H-4의 ¹H-¹H COSY 상관관계 및 H₂-1와 H-3로부터 사차 탄소 C-5에의 HMBC 상관관계로부터 3개의 산소 원자와 연결된 6원 고리 시스템 (도 1 (a)의 A 고리)이 존재하는 것을 확인하였다. 또한, 도 1에 나타난 것과 같이 H₂-6/H₂-7/H-8/H-9/H-10/H-11/H₃-12의 양성자 스핀 시스템에 의해 불포화 탄소 사슬이 존재하는 것을 알 수 있었다. H₂-6와 C-5 그리고 H-4와 C-6와의 HMBC 상관관계로부터 이 탄소 사슬이 상기의 6원 고리 시스템 (A 고리)에 연결되는 것을 확인하였다. H₂-13과 C-14 및 C-15 사이 그리고 H₂-15과 C-13 및 C-14와의 HMBC 상관관계로부터 화합물 1이 글리세롤 구조를 가진다는 것을 예상할 수 있었다. 부분 구조들의 연결은 H-4와 C-13 및 C-14와의 HMBC 상관관계 그리고 H₂-15와 C-4 및 C-5와의 HMBC 상관관계로부터 알 수 있었다 (도 2). 최종적으로, 화합물 1이 5의 불포화도를 가지는 것과 자세한 2D NMR 데이터 분석을 통하여, 화합물 1의 평면 구조가 새로운 [6/5/5] 삼환 시스템을 갖는 것을 밝혀냈다. H-8/H-9 및 H-10/H-11의 큰 커플링 상수값 (J = 14.0 Hz)에 의해 이중결합들의 배열 구조가 모두 E임을 알 수 있었다. 화합물 1의 독특한 고리 시스템은 일반적인 입체 화학적 관점으로 볼 때에 고정된 형태를 갖는 것으로 밝혀졌다.

화합물 1의 환원 및 메틸화

화합물 1을 환원시켜 화합물을 메틸화시키는 동안 부생성물이 생성되는 것을 방지하였다. 수소 기체 하에서, 화합물 1 (7.0mg)의 에탄올 (200 μL) 용액에 2시간 동안 Pd/C (0.35mg)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 증발시키고, 실리카겔의 플래시 오픈 컬럼으로 정제하여 Pd/C를 제거하였다. 환원된 화합물 1의 DMF (0.2mL) 용액에 NaH (3mg) 및 MeI (5μL)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 0℃에서 2시간 동안 교반하였다. TLC로 새로운 점을 확인한 후에, 반응 혼합물을 충분한 양의 LiCl로 처리하여 DMF를 제거하고, 에틸아세테이트로 추출하였다. 혼합된 에틸아세테이트 추출물을 감압하에 건조시켰다. 용매를 제거한 추출물을 실리카겔의 플래시 오픈 컬럼으로 정제하여 화학식 3과 같이 환원되고 메틸화된 화합물 1을 점성이 있는 황색 오일의 형태로 수득하였다.

[화학식 3]

화합물 1의 절대 배열 분석

먼저, 화합물 1 및 화합물 1의 메틸화 유도체 (화학식 3)의 양성자-양성자 커플링 상수와 ROESY 상관관계를 분석하여 화합물 1의 상대적인 구조를 결정하였다. H-3와 H-4의 ROESY 상관관계는 이 양성자들이 같은 면에 배치됨을 나타내었다. H-3과 H-4의 커플링 상수 (7.5Hz)는 이들 두 양성자가 syn-배열로 배치됨을 나타내었다 (도 2). 추가적으로, H-4와 H-6b의 강한 ROESY 상관관계는 H-4와 화합물 1의 탄소 사슬이 같은 면에 있음을 나타내었다. 추가적으로, 화합물 1의 메틸화를 통해 C-14-OH의 방향을 결정하였다. 화학물 1의 메틸화된 유도체의 14-OMe와 H-4 사이의 ROESY 상관관계는 C-14-OMe 및 H-4가 같은 면에 있다는 것을 나타내었다 (도 3 내지 5). 따라서, 화합물 1은 3S, 4R, 5S, 14S인 화합물 1A와 3R, 4S, 5R, 14R인 화합물 1B의 2가지 구조만이 가능한 것으로 밝혀졌다.

화합물 1의 절대구조를 분석하기 위해, 화합물 1의 실험 ECD 스펙트럼과 화합물 1이 가질 수 있는 2가지 거울상 이성질체인 1A 및 1B의 ECD 스펙트럼과 비교하였다 (도4). Turbomole 6.5로 모든 원자에 대해 B3LYP/def2-TZVPP//B3LYP/def-SV(P) 레벨에서 TD-DFT로 화합물 1의 2가지 거울상 이성질체의 에너지 최소화된 구조를 계산하였다. 화합물 1의 실험 ECD 스펙트럼은 230 nm에서 양의 코튼 효과를 나타내었고, 이는 화합물 1A의 계산된 ECD 스펙트럼과 일치하는 데에 비해, 다른 거울상 이성질체인 화합물 1B는 반대의 ECD 스펙트럼을 나타냈다 (도 6). 따라서, 화합물 1의 입체 중심의 절대 배열은 화합물 1A (3S, 4R, 5S, 14S)와 같은 것으로 결정되었다.

실시예 2-2. 화합물 2의 구조 결정

화합물 2의 구조는 아래 화학식 4와 같으며, 그 구조는 다음과 같이 결정하였다.

[화학식 4]

화합물 2에 대해서 HRESIMS 분석 (m/z 287.1262 [M+Na]⁺, 287.1259 계산치)한 결과, 화학식은 화합물 1에 비해 분자량 2가 낮은 C₁₅H₂₀O₄로 결정되었다. 화합물 2의 ¹H NMR 데이터는 화합물 1에 비해 2개의 올레핀이 추가적으로 나타나고, 2개의 메틸렌이 사라진 것을 제외하고는 화합물 1의 데이터와 유사하게 나타났다. C-6 및 C-7 포화 탄소에 관한 신호는 각각 δ_C 130.1 및 132.4의 2개의 불포화 탄소로 대체되었다. ¹H-¹H COSY 및 HMBC 상관관계를 분석한 결과, 화합물 2는 화합물 1에 비해 탄소 사슬에 추가적인 하나의 이중 결합이 더 존재하는 것을 확인하였다. 화합물 2의 화학적 이동값과 2D NMR 상관관계는 화합물 1과 거의 동일하게 나타난 점과, 화합물 1 및 2의 화학식을 고려할 때 화합물 2는 추가적인 이중 결합이 존재하는 것 외에는 화합물 1과 동일한 평면구조를 가지는 것을 알 수 있었다. 또한 큰 커플링 상수값 (J =14.0~15.5 Hz)에 의해 화합물 2의 측쇄에 존재하는 이중결합들의 배열 구조가 모두 E임을 알 수 있었다.

실시예 2-3. 화합물 3의 구조 결정

화합물 3의 구조는 아래 화학식 5와 같으며, 그 구조는 다음과 같이 결정하였다.

[화학식 5]

화합물 3의 HRESIMS 분석 (m/z 384.1813 [M-H]^-, 384.1811 계산치)한 결과, 화학식은 C₂₂H₂₇NO₅로 결정되었다. 화합물 3의 ¹H NMR 데이터는 현저하게 다운필드로 이동된 H₂-13 (δ_H 3.75, 4.56)와 H₂-15 (δ_H 4.05, 4.38)를 제외하고는 화합물 1과 비슷한 것으로 나타났다. 화합물 3의 ¹H 및 ¹³C NMR 데이터는 δ_H 6.54, 6.64, 7.32 및 7.94에서 방향족성 양성자 4개와 δ_C 111.4, 149.2 및 170.7에서 사차 탄소 3개에 관한 추가 신호를 보여주었다. 추가적으로, ¹H-¹H COSY 스펙트럼에서 H-4’/H-5’/H-6’/H-7‘의 양성자 스핀 시스템과, H-7’과 C-1’ 및 C-3’ 사이의 HMBC 상관관계 및 H-4’ 및 H-6’과 C-2’사이의 HMBC 상관관계를 관측하여 2-아미노벤조산이 존재하는 것을 확인하였다 (도 7). 최종적으로, H-4’와 H₂-13 및 H₂-15 사이의 ROESY 상관관계 (도 8)에 의해 2-아미노벤조산이 화합물 1의 14-OH에 연결되는 것을 확인하여 화합물 3의 평면 구조를 결정하였다. 이러한 결과는 화합물 3이 화합물 1에 비해 H₂-13과 H₂-15의 ¹H NMR 데이터가 다운필드로 이동된 점에도 부합되는 것이다.

실시예 2-4. 화합물 4의 구조 결정

화합물 4의 구조는 아래 화학식 6과 같으며, 그 구조는 다음과 같이 결정하였다.

[화학식 6]

화합물 4에 대해서 HRESIMS 분석 (m/z 382.1656 [M-H]^-, 382.1654 계산 수치)한 결과, 화학식은 화합물 3보다 분자량 2가 낮은 C₂₂H₂₅NO₅로 결정되었다. 화합물 4에 대한 ¹H NMR 데이터는 화합물 2에서와 같이 2개의 올레핀 신호가 추가적으로 나타난 것을 제외하고는 화합물 3의 데이터와 유사한 것으로 나타났다. C-6 (δ_C 39.3)와 C-7 (δ_C 25.9)의 포화 탄소의 신호는 각각 δ_C 130.1 및 132.4의 2개의 불포화 탄소로 대체되었다. ¹H-¹H COSY 및 HMBC 상관관계 분석 결과, 탄소 사슬에 3개의 이중 결합이 존재하는 것이 확인되었다. 화합물 4의 화학적 이동값과 2D NMR 상관관계가 화합물 3과 거의 동일하게 나타나는 것으로 보아, 화합물 4는 화합물 3에서 추가적인 이중 결합이 존재하는 것 외에는 화합물 3과 동일한 평면 구조를 가지는 것을 알 수 있었다.

화합물 1 내지 4의 선광도와 화학적 이동값을 비교했을 때, 이들 화합물들은 동일한 골격을 가지며, 3S, 4R, 5S, 14S로 동일한 절대 배열 구조를 가지는 것으로 결정되었다.

화합물 1 내지 4의 ¹H NMR (CD₃OD, 500MHz) 및 ¹³C NMR (CD₃OD, 125 MHz) 결과는 아래 표 1 및 2와 같다.

no.	화합물 1		화합물 2
no.	δ_H (J, Hz)	δ_C	δ_H (J, Hz)	δ_C
1a	3.51, dd (11.0, 4.0)	55.0	3.55, dd (11.0, 3.5)	55.2
1b	3.91, dd (11.0, 2.0)		4.01, overlapped
2	1.74, 1.82, m	26.5	1.85,m	26.2
3	4.26, t like (4.0)	74.5	4.29, t (3.5)	74.5
4	2.24, d (7.5)	51.4	2.39, d (7.5)	51.6
5		106.9		104.9
6a	1.74, m	39.2	5.68, d (15.5)	132.4
6b	1.80, m
7	2.16, m	25.9	6.41, dd (15.5, 10.5)	130.1
8	5.54, m	130.8	6.12, dd (14.5, 11.0)	108.8
9	6.00, dd (14.0, 10.0)	130.3	6.27, dd (14.5, 10.5)	134.6
10	6.00, dd (14.0, 10.0)	131.6	6.12, dd (14.5, 10.5)	130.3
11	5.55, m	126.0	5.76, m	131.4
12	1.70, d (6.0)	16.7	1.77, d (7.0)	16.9
13a	3.80, d (9.5)	77.2	3.80, dd (9.0, 1.5)	77.8
13b	3.63, d (9.5)		3.66, dd(9.5, 1.5)
14		87.5		87.2
15a	4.02, d (9.5)	77.3	4.01, overlapped	77.1
15b	3.98, d (9.5)		4.01, overlapped

no.	화합물 3		화합물 4
no.	δ_H (J, Hz)	δ_C	δ_H (J, Hz)	δ_C
1a	3.54, dd (11.5, 2.5)	55.1	3.59, dd (11.0, 3.0)	55.2
1b	4.00, dd (12.5, 2.5)		4.10, t (10.0)
2	1.83, m	26.2	1.87, m	25.9
3	4.25, t (4.0)	73.6	4.32, t like (4.0)	73.7
4	2.53, d (7.5)	53.0	2.71 d (7.5)	52.9
5		106.5		104.7
6a	1.72, m	39.3	5.65, d (15.5)	131.8
6b	1.80, m
7	2.16, dt (9.5, 7.5)	25.9	6.38, dd (15.5, 10.5)	130.1
8	5.51, m	130.8	6.07, dd (14.5, 11.0)	130.6
9	5.96, dd (14.0, 10.0)	130.4	6.22, dd (14.5, 10.5)	134.8
10	5.96, dd (14.0, 10.0)	131.6	6.07, dd (14.5, 10.5)	128.6
11	5.51. m	126.1	5.73, m	131.4
12	1.68, d (6.5)	16.7	1.74, d (6.5)	16.9
13a	4.56, d (9.0)	77.7	4.59, d (9.0)	78.2
13b	3.75, d (9.0)		3.80, d (9.0)
14		71.1		70.9
15a	4.38, d (9.0)	77.3	4.43, d (9.0)	77.4
15b	4.05, d (9.0)		4.02, d (9.0)
1’		170.7		170.5
2’		111.4		111.4
3’		149.2		149.1
4’	6.54, d (8.5)	112.5	6.56, d (8.5)	112.4
5’	7.32, t (7.0)	134.1	7.32, t (7.0)	134.0
6’	6.64, t (7.5)	115.4	6.62, t (7.5)	115.3
7’	7.94, d (8.0)	132.4	7.91, d (8.0)	132.3

실험예

BV-2 미세아교세포의 배양

BV-2 미세아교세포를 5% 우태아혈청 및 페니실린/스트렙토마이신 1% 100 units/mL이 첨가된 Dulbecco’s modified Eagle 배지를 이용하여, 37℃에서 가습된 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다.

실험예 1. 세포 독성 및 NO 생성 억제 효과 확인

실시예 1에 따른 화합물 1 내지 3을 각각 12.5, 25, 50, 100μM 농도로 준비하고, 화합물 4를 1, 2, 4, 8μM 농도로 준비하였다. 24-웰 플레이트에 1.25 X 10⁵cell/well로 분주된 BV-2 미세아교세포에 다양한 농도의 화합물을 이용하여 1시간 동안 전처리하고, LPS (200 ng/mL)로 24시간 동안 전처리하였다. 각 웰에 MTT (2mg/mL) 20μL를 첨가하였다. 1시간 후에, 상등액을 흡입해내고, 포르마잔 결정을 DMSO에 용해시켰다. 마이크로플레이트 리더 (Tecan Trading AG)를 이용하여 550 nm에서 광학 밀도를 측정하고, 대조군 세포와 비교하였다.

아질산염 분석을 위해서, 24-웰 플레이트에 BV-2 미세아교세포를 1.25×10⁵ cell/well의 밀도로 분주하고, 화합물 1 내지 4로 1시간 동안 전처리 하고, LPS (200 ng/mL)로 24시간 동안 전처리 하였다. 각 시료에 대해 아질산염의 양으로 표준 곡선을 얻기 위해 아질산나트륨 희석액을 사용하였다. 마이크로플레이트 리더 (Tecan Trading AG)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

도 9 및 10에 나타난 것과 같이, 100μM의 화합물 1을 처리한 경우 NO 생성량이 대조군에 비해 약 22% 저감되는 것으로 나타났고, 100μM의 화합물 2를 처리한 경우에는 약 25% 저감되는 것으로 나타났다. 100μM의 화합물 3를 처리한 경우에는 약 50%가 저감되는 것으로 나타났으며, 화합물 4의 경우 1 내지 8μM의 저농도를 처리하였음에도 불구하고 약 93% 저감되는 것으로 나타났다. 화합물 1 내지 3을 처리한 경우 대조군과 유사한 수준의 세포 생존력을 보였으나, 화합물 4의 경우 80% 미만의 생존률을 나타냈다. 화합물 4는 10μM 미만의 저농도에서 강한 NO 생성 억제 효과를 나타냄과 동시에 세포독성을 나타냈다 (도 12).

이상과 같이 실시예를 통하여 본 발명을 설명하였다. 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 상술한 실시예들은 모든 면에 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해되어야 한다. 본 발명의 범위는 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

아래 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 이들의 염:
[화학식 1]

식 중에서,
X₁은 H 또는 OR이고;
R은 H 또는 -Y-Z이고;
Y는 카보닐, 아미도 또는 아마이드, 또는 탄소 수 1 내지 6개의 알킬 또는 알킬렌이고;
Z는 존재하지 않거나, 탄소 수 5 내지 10개의 치환 또는 비치환 아릴이고;
상기 아릴이 치환되는 경우 그 치환기는 하이드록시기, 탄소수 1 내지 6개의 알킬기 및 아미노기로 구성된 군에서 1개 이상 선택되는 것이고;
X₂는 탄소 수 3 내지 12개의 포화 또는 불포화 직선형 또는 분지형 알킬, 또는 탄소수 3 내지 12개의 알케닐이다.
제1항에 있어서,
상기 Y는 카보닐인, 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 이들의 염.
제1항에 있어서,
상기 아릴은 페닐 또는 나프틸인, 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 이들의 염.
제1항에 있어서,
상기 치환기는 아미노기인, 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 이들의 염.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 이들의 염을 포함하는 신경 퇴행성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.