KR20200016283A - 혈관화 조직을 유전적으로 변형시키는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 산소 공급부족으로 인해 조직 또는 이의 세포를 손상시키지 않고, 기관일 수 있는 혈관화 조직의 세포를 유적적으로 변형시키기 위한 생체외 방법, 즉, 시험관내 방법을 제공한다. 상기 방법은 예를 들어 바이러스 벡터를 이용하여 세포를 변형시키기에 충분한 시간에 걸쳐서 혈관화 조직을 정상체온 또는 정상체온 미만 온도 상태에서 유지하는 것을 가능하게 한다.

Description

혈관화 조직을 유전적으로 변형시키는 방법
본 발명은 산소 공급 부족으로 인해 조직 또는 이의 세포를 손상시키지 않고 정상체온(normothermic) 또는 정상체온 미만 온도(subnormothermic)의 관류 동안, 기관(organ)일 수 있는 혈관화 조직(vascularised tissue)의 세포를 유전적으로 변형시키기 위한 생체외 방법, 즉 시험관내 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 적혈구가 아닌 산소 운반체에 의해 산소를 공급함으로써 세포를 바이러스 벡터로 유전적으로 변형시키기에 충분한 시간에 걸쳐서 혈관화 조직을 정상체온 또는 정상체온 미만 온도 상태로 유지하는 것을 가능하게 한다. 고형 조직은 혈관화 조직, 바람직하게는 심장, 폐, 신장, 췌장, 팔 또는 다리 또는 이의 일부와 같은 기관이다. 혈관화 조직은 예를 들어 조직 결함의 치료에서 이식물(transplant)로 사용될 수 있다. 혈관 조직의 유전적 변형은 예를 들어 단백질, 예를 들어, MHC 분자 또는 기능 장애 분자의 발현의 억제, 단백질의 발현 및/또는 유전자의 변형일 수 있다. 유전적 변형 방법, 예를 들어, 유전적으로 변형된 바이러스 입자를 이용한 형질 도입 및 CRISPR/Cas9 변형 방법은 일반적으로 알려져 있다.
동종이계 이식 환경(allogeneic transplant setting)에서, 인간 수혜자에 대한 인간 공여자 유래의 조직 또는 기관의 세포는 그 세포의 면역원성이 감소, 최소화 또는 제거되도록 변형될 수 있다. 그 결과. 수헤자의 면역계는 공여자 유래의 조직을 외부 조직으로 인식하지 않고 숙주 대 이식 반응 또는 면역학적 거부를 개시하지 않을 것이다. 이식물은 선택적으로 또 다른 종, 바람직하게는 동일한 종의 또 다른 개체로부터 유래되는 고형 조직 또는 기관, 예를 들어 바람직하게는 또 다른 인간으로부터 유래되는 동종이계 이식물이고, 수혜자는 인간, 예를 들어, 이식이 필요한 인간 환자이다. 혈관화 조직은 예를 들어 후자의 수혜자로부터 유래되는 균질 조직일 수 있고, 유전적 변형은 조직을 변형, 예를 들어 돌연변이 또는 유전적 결함을 기능성 유전자로 변화시키는 핵산 작제물의 도입일 수 있다. 고형 조직 이식물은 혈관화되고, 예를 들어 기관의 일부 또는 전체 기관 또는 손발 또는 손발의 일부일 수 있다.
상기 방법은 수혜자에게 이식하기 전에 이식물을 수혜자의 면역계에 적응시켜서 이식물에 대한 수혜자의 면역 반응을 최소화 또는 없게하는 이점이 있다. 결과적으로, 상기 방법은 바람직하게는 수혜자에게 이식한 후, 면역억제제의 투여를 획기적으로 감소, 바람직하게는 수혜자에게 면역억제제를 투여하지 않으면서 이식물의 존재를 가능하게 하는 이식물을 제공할 수 있다.
동종이계 이식을 위해, 이러한 방법은 MHC 관련 전사체를 표적하는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)를 통합하여 MHC 클래스 I 및 클래스 II 발현을 억제함으로써 조직의 면역원성을 효과적으로 감소시키기 위해 적용되어 왔다. 또한, 이러한 과정은 면역 세포에 대한 면역허용 효과를 매개하는 이식유전자(transgene), 예를 들어 T 세포의 활성화 또는 증식을 예방하거나 예를 들어 보체 인자에 의해 유발되는 세포독성 항체 효과를 예방하는 PD-L1, PD-L2, IDO, IL-10 및/또는 임의의 다른 분자 또는 분자들에 대한 유전자를 전달함으로써 동종이계 이식물일 수 있는 조직 또는 기관의 적어도 몇몇 세포의 면역원성을 감소시키거나, 또는 조직 또는 기관이 자가인 자가 이식 환경에서 조직의 유전적으로 변형된 세포에 대한 자가면역 반응을 감소시킴으로써 자가면역 질환을 적어도 완화시키는 자가 이식물을 생성하는데 적합하다. 혈관화 조직이 T 세포의 활성화 또는 증식을 예방하거나 예를 들어 보체 인자에 의해 유발되는 세포독성 항체 효과를 예방하는 PD-L1, PD-L2, IDO, IL-10 및/또는 임의의 다른 분자 또는 분자들을 발현하도록 유전적으로 변형되는 구체예에서, 상기 조직은 예를 들어 자가면역 질환의 치료에 사용하기 위한 것으로 상기 방법에 의해 생성된 유전적 변형 조직의 나중의 수혜자로부터 유래할 수 있는데, T 세포의 활성화 또는 증식을 예방지하거나 예를 들어 보체 인자에 의해 유발되는 세포독성 항체 효과를 예방하는 PD-L1, PD-L2, IDO, IL-10 및/또는 임의의 다른 분자 또는 분자들의 발현이 상기 조직의 면역원성을 감소시켜서 이러한 조직의 유전적 변형 세포에 대한 자가면역 반응을 감소시키기 때문이다.
또한, 이러한 과정은 그의 단백질이 자가항체의 표적인 유전자를 녹다운 또는 녹아웃시켜서 그의 표적을 제거하고 자가면역 질환을 적어도 완화시키는데 적합하다. 핵산 작제물은 예를 들어 바이러스 벡터에 의해 전달된, 혈관화된 조직을 변형시키는 이식유전자(transgene)를 포함할 수 있고, 그 유전자는 올바른, 즉, 천연 기능성 유전자일 수도 있고, 이 경우 그 기관은 유전자 결함을 보유함으로써, 예를 들어 낭포성 섬유증 막횡단 전도 조절인자((CFTR)를 위한 올바른 유전자를 전달함으로써 그 기관의 유전자 결함을 정정한다. 핵산 작제물은 혈관화 조직의 유전적 변형을 위해, 예를 들어 결함 유전자를 기능성 유전자 암호화 유전자로 변형하기에 적합한 이식유전자와의 조합으로 CRISPR/Cas의 기능을 갖는 단백질을 암호화하는 발현 카세트를 포함할 수 있다.
기술적 수준(state of the art)
미국특허 제 8,236,771 B2호는 수혜자와의 HLA 불일치(mismatch)를 확인하고, 그 불일치 HLA의 발현을 하향조절하기 위해 그 불일치들의 공통 서열(consensus sequence)에 대한 siRNA를 통합 및 발현하는 렌티바이러스 벡터를 조직의 혈관구조를 통해 관류시킴으로써 인간 동종이계 장기 조직의 면역원성을 감소시키는 방법을 기재하고 있다.
미국특허 제 8,361,976 B2호는 면역원성 거부 또는 허혈-유도된 세포자멸사를 유발하는 형질을 하향조절하는 RNAi 작용제로서 췌장을 관류시키는 것이 이식을 위한 췌장 소도를 제조한다고 기재하고 있다.
WO 2005/108572 A1호는 이식물의 면역원성 거부를 감소시키기 위해 HLA 유전자의 발현을 억제하기에 적합한 siRNA 분자의 서열을 기재하고 있는데, 상기 siRNA는 예를 들어 렌티바이러스 벡터로부터 발현될 수 있다. 이것은 다른 유형의 세포에서 MHC 발현을 억제하는 가능성을 입증하였고 MHC-발현억제 세포는 동종이식 또는 수혈 후 개선된 이식 생존을 나타냈다.
US 2014/0219970 A1호는 단일 세포를 분리하기 위해 태반을 PBS로 생체외 관류시키는 것 및 유육종증의 치료를 위한 이러한 분리된 단일 세포의 용도를 기재하고 있다.
WO 2016/057536 A1호는 이식 전에 MHC의 존재를 감소시키기 위해 프로테아제 또는 글리코시다제에 의한 공여 조직을 생체외 처리하는 것을 기재하고 있다.
US 2016/0175462 A1호는 CRISPR/Cas 시스템을 이용한 유기체의 유전자 조작을 기재하고 있다.
WO 2016/196944 A1호는 이식물을 유전적으로 조작하지 않고 보존 용액에서 활성화 단백질 C에 의해 이식물을 체외 처리하는 것을 기재하고 있다.
US 2011/0305772 A2호는 느린 저압 주입을 사용하여 생체 외에서 핵산을 간으로 도입하는 것을 기재하고 있다.
US 2010/0028848 A1호는 핵산 함유 액체에 장기를 관류 또는 침적(bathing)시킴으로써 거부 반응을 억제하기 위해 생체외에서 핵산, 예를 들어 siRNA를 이식 기관 내로 도입하는 것을 기재하고 있다.
US 2002/0127205 A1호는 이식에 사용하기 위한 단일 세포의 유전자 조작을 기재하고 있다.
발명의 목적
본 발명의 목적은 정상체온 미만 온도 또는 정상체온 관류 동안 예를 들어 바이러스 형질도입을 통해 혈관화 조직 또는 기관의 세포를 유전적으로 변형시켜서 산소 공급부족으로 인한 세포 또는 조직 손상을 회피하기 위한 방법을 제공함에 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 목적은 이식물에서 면역원성 단백질의 효율적이고 영구적인 발현을 제공하고 이식물에 대한 수혜자의 면역원성 반응을 감소시키기 위해 이식물에서 면역원성 단백질의 발현을 변형, 특히 이식물을 형성하는 조직에서 HLA의 발현을 변형하기 위한 대안적인 방법을 제공함에 있다.
발명의 설명
유전자 치료 실험실에서 일상적이게 되는 단일 세포 배양물, 단일층 또는 단순 조직의 유전자 변형과는 달리, 지금까지 심장, 폐, 신장, 췌장 또는 팔 또는 다리와 같은 혈관화 조직 또는 고형 기관을 영구적으로 유전적으로 조작할 수 있는 가능성은 주요한 해부학적, 구조적 및 기술적 문제로 인해 거의 불가능한 상태로 남아있었다. 특히, 유해 면역 또는 혈전형성 반응의 주요 표적인 기관 내피는 유전 공학을 위한 중요한 후보이다. 심장을 유전적으로 조작하기 위해 몇몇의 실험적 전략이 수행되어 왔지만, 이들은 에피솜으로 잔류하여 이식유전자의 일시적 발현에만 기여하는 아데노바이러스 관련 벡터(AAV)의 사용에 기반하였다. 그러나, 안정한 치료 효과를 위해, 조직 또는 기관의 세포는 영구적으로 유전적으로 변형될 필요가 있으며, 이는 이식유전자 또는 조절 분자의 안정한 발현을 필요로 한다. 따라서, 렌티바이러스 벡터와 같은 통합 벡터의 사용이 바람직할 것이다. 그러나, 혈관화된 고형 기관의 큰 내피 영역은 많은 양의 렌티바이러스 입자를 필요로 한다. AAV와 달리, 렌티바이러스 벡터는 안정한 유전자 발현에 기여하지만, 큰 기관의 내피를 형질도입시키기에 충분히 높은 농도로 이들 벡터를 생산하는 것은 어렵다. 또한, 렌티바이러스 벡터는 인간 보체에 의해 표적화되므로, 렌티바이러스 입자 농도는 혈액에서 벡터의 재현탁 후 빠르게 감소한다. 또한, 렌티바이러스 입자의 혈액 세포에의 부착은 조직 세포 또는 기관 세포의 효율적인 형질 도입을 불가능하게 한다.
본 발명은 산소 공급부족으로 인한 허혈 손상을 발생하지 않고, 혈액의 부재하에서, 특히 적혈구 및 보체와 같은 혈장 단백질의 부재하에서, 정상체온 또는 정상체온 미만 온도의 조건하에서 생체외 관류에 의해 혈관화 조직의 세포를 유전적으로 변형시키는 방법을 확립한다. 상기 유전적 변형은 바이러스 벡터를 통한 형질도입에 의해 예시된다. 이러한 예에서, 폐 세포 및 특히 내피 세포는 혈액, 예를 들어 표적세포 형질도입을 억제하는 적혈구 또는 보체의 부재하에서 충분한 산소 공급으로 인한 조직의 허혈성 손상이 없이 MHC 클래스 I 및 클래스 II의 발현을 억제하기 위해 shRNA를 암호화하는 렌티바이러스 벡터로 효율적으로 형질도입되었다. 이것은, 표적 세포에 입자를 전달하는 shRNA의 작용을 억제하지 않고 조직에의 산소 공급을 확보하거나, 그렇지 않으면 입자를 흡착하는 혈액 또는 혈액 세포의 사용에 의해 발생하여 표적 세포에의 핵산의 전달을 억제하는 인공 산소 운반체를 적용함으로써 달성되었다.
본원에 기재된 방법은 본원에 렌티바이러스 벡터에 의해 예시되는 유전자 변형용 화합물을 함유하는 보존 용액을 이용하여 정상체온 또는 정상체온 미만 온도의 조건하에서 적어도 12 시간 동안 조직을 관류시킴으로써 혈관화 조직 또는 고형 기관의 세포를 효율적으로 형질도입하는 것을 가능하게 한다. 이러한 전략은 구조 또는 세포 생존력을 손상시키지 않으면서 혈관화 조직 또는 기관의 세포에서 MHC 클래스 I 및 클래스 II 발현의 억제에 의해 예시되는 혈관화 조직의 유전적 변형을 최초로 가능하게 하는 것이다. 게놈 통합 렌티바이러스 벡터(genome integrating lentiviral vector)의 사용은 MHC 발현의 영구적 억제를 가능하게 한다. 특히 내피의 조직 세포 또는 기관 세포에서 MHC 발현을 억제하면 유해한 동종이계 면역 반응을 제거하고 이식 거부를 예방할 수 있다.
이러한 방법은 폐와 신장을 모델로 사용하여 확립되었고 심장 및 췌장뿐만 아니라 팔 또는 다리 또는 이의 일부와 같은 다른 혈관화 기관의 유전자 변형에 적합하다. 이러한 방법은 혈관화 조직 또는 기관을 유전적으로 변형시키고 혈관화 조직 또는 전체 기관의 면역원성을 감소시키는 신규한 방법을 나타낸다.
일반적으로, 혈관화 구조를 통한 조직의 관류는 혈관화 조직에 존재하는 임의의 기관지, 요관 및/또는 장을 관류시키는 것을 포함하는 것이 바람직하다.
이러한 방법은 MHC-관련 전사체를 표적하는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)을 통합하여 MHC 클래스 I 및 클래스 II 발현을 억제함으로써 조직의 면역원성을 효과적으로 감소시키기 위해 적용되어 왔다.
또한, 이러한 방법은 그의 단백질이 자가항체 및/또는 동종반응성 면역 세포의 표적인 유전자의 전사체를 표적하는 짧은 헤어핀 RNA를 전달함으로써 이들의 표적을 제거하고 자가면역 질환을 적어도 완화시키는데 적합하다.
이러한 방법은 내피 세포 및/또는 다른 세포의 유전자 변형, 예를 들어 형질 도입을 용이하게 하므로, 작은 shRNA 또는 마이크로 RNA의 발현뿐만 아니라 정확한 치료 효과를 유도하기 위한 특정 치료 유전자의 발현을 위해 선택적으로 사용될 수 있다. 이러한 유전자는 예를 들어, 동종반응성(alloreactive) 면역 반응의 예방에 중요한 역할을 하는 것으로 판단되는, T 세포의 활성화 또는 증식 또는 예를 들어 보체 인자에 의해 유발된 세포독성 항체 효과를 예방하는 PD-L1(Programmed Death-Ligand 1), PD-L2(Programmed Death-Ligand 2), 인돌라민-2,3-디옥시게나제(IDO), 인터루킨-10(IL-10) 및/또는 임의의 다른 분자 또는 분자들의 서열을 암호화한다. PD-L1 및 PD-L2는 말초 내성의 유지에 중요한 역할을하는 것으로 확인되었다. 이러한 리간드와 이의 수용체인 PD-1의 결합은 동종반응성 T-세포의 활성화를 에방하고 조절 T 세포의 발생을 유도할 수 있는 신호전달 경로를 유발한다. PD-L1 및 PD-L2는 임신, 조직 동종이식편, 자가면역 질환 및 간염과 같은 다른 질환 상태와 같은 특정의 사건 동안 면역계를 억제하는데 주요한 역할을 하는 것으로 추측되어왔다. 일반적으로 면역계는, 림프절 또는 비장에 축적되어 항원특이적 CD8+ T 세포의 증식을 유발하는 외래 항원에 반응한다. PD-1 또는 B7.1에의 PD-L1 또는 PD-L2의 결합은 림프절에서 이들 CD8+ T 세포의 증식을 감소시키는 억제 신호를 전달하고 또한 PD-1에의 추가는 유전자 Bcl-2의 하향 조절에 의해 추가로 매개되는 세포자멸사를 통해 림프절에서의 외래 항원 특이적 T 세포의 축적을 조절할 수 있다. 또한, 트립토판 고갈 효소인 인돌라민-2,3-디옥시게나제(IDO) 및 인터루킨-10(IL-10)은 면역 내성의 조절에 중요하다. 본원에 기재된 방법은 바람직하게는, 기관의 내피 또는 다른 세포에서의 이러한 단백질의 안정한 발현을 가능하게 하여 유전자 발현의 조절의 다른 메커니즘과 조합하여 또는 독립적으로 이식편에 대한 내성 상태를 유도하고 유지한다.
따라서, 이러한 방법은 마찬가지로 PD-L1, PD-L2, IDO 또는 IL-10에 대한 유전자와 같은, 면역 세포에 대한 면역관용 효과를 매개하는 이식유전자를 전달하여, 조직 또는 기관의 적어도 일부의 세포의 면역원성 또는 자가면역 반응을 감소시키거나, 조직의 유전자 변형된 세포에 대한 자가면역 반응을 감소시킴으로써, 자가 면역 질환 또는 동종면역 거부를 적어도 완화시키는데 적합하다.
또한, 바이러스 벡터에 의해 전달된 이식유전자는 올바른 유전자일 수 있고, 이 경우 그 기관은 유전자 결함을 보유함으로써, 예를 들어 낭포성 섬유증 막횡단 전도 조절인자(CFTR)를 위한 올바른 유전자를 전달하여 낭포성 섬유증에서 그 기관의 유전자 결함을 정정한다.
본 발명은 특히 청구범위의 특징에 의해 상기 목적을 달성하고, 예를 들어 이식유전자 또는 shRNA의 안정한 발현을 위해 혈관화 조직을 유전적으로 변형시키거나 게놈 편집 기술에 의해 유전자를 변형시키는 방법을 제공한다. 이식 환경에서, 본 발명은 이식물을 형성하는 혈관화 동종이계 조직에서 예를 들어 일치(matched) 또는 불일치(mismatched) HLA 분자의 면역원성 단백질의 발현을 안정적으로 감소시키는 방법을 제공하고, 그 방법은 적혈구의 부재하에서 정상체온 또는 정상체온 미만 온도의 상태에서 시험관내 단계 동안 조직의 세포에 산소를 공급하여 허혈성 손상을 회피한다. 상기 방법은 생체외, 즉 시험관내 방법으로서,
a) 감소된 혈액 함량 및 감소된 대사활성을 갖는 냉각된 분리된 혈관 조직을 생성하기 위하여, 바람직하게는 분리된 혈관화 조직을 2 내지 10℃의 온도에서 배양하면서 2 내지 10℃의 온도를 갖는 보존 용액으로 상기 분리된 혈관화 조직을 관류시키는 단계;
b) 혈액 및 적혈구가 본질적으로 없고 감소된 대사활성을 갖는 냉각된 분리된 혈관 조직을 생성하기 위하여, 바람직하게는 상기 분리된 혈관화 조직을 2 내지 10℃의 온도에서 배양하면서, 모든 적혈구가 혈관화 조직으로부터 제거될 때 까지 2 내지 10℃의 온도를 갖는 보존 용액 또는 바람직하게는 제 1 관류 용액을 이용하여 상기 혈관화 조직을 예를 들어 관류함으로써 세척하는 단계;
c) 선택적으로 단계 a) 내지 b)는 상기 보존 용액 또는 제 1 관류 용액에 산소를 도입하지 않고 수행되고;
d) 바람직하게는 상기 분리된 혈관화 조직을 2 내지 38℃의 온도에서 배양하면서, 예를 들어 상기 혈관화 조직을 2 내지 38℃의 온도를 갖는 제 2 보존 용액으로 관류시킴으로써, 핵산 작제물을 흡착 또는 흡수하지 않는, 예를 들어, 바이러스 벡터를 흡수하지 않는, 적어도 한 종의 합성 산소 운반체를 함유하는 제 2 관류 용액으로 상기 보존 용액 또는 제 1 관류 용액 각각을 대체하는 단계; 및
e) 예를 들어 산소 결핍에 의해 유발될 수 있는 허혈 손상이 본질적으로 없는 정상체온 미만 온도 또는 정상체온의 분리된 혈관 조직을 생성하기 위하여, 예를 들어 산소공급기(oxygenator)를 상기 분리된 혈관화 조직과 연결함으로써 제 2 산소 관류 용액에 산소를 도입하고, 상기 분리된 혈관화 조직을 통해 산소를 함유하는 제 2 관류 용액을 펌핑하고, 상기 분리된 혈관화 조직을 제 2 관류 용액으로 관류하면서 상기 분리된 혈관화 조직을 예를 들어 가열 장치의 적용을 통해 20 내지 38℃, 바람직하게는 34℃의 온도로 온도 조절하는 단계;
f) 예를 들어 이식 환경에서 상기 분리된 혈관화 조직의 적어도 하나의 MHC 단백질을 암호화하는 mRNA를 RNA 간섭을 통해 저해 또는 차단하는 적어도 한 종의 shRNA인, 관심 서열을 암호화하는 발현 카세트를 포함하는 핵산 작제물을 제 2 관류 용액에 도입하는 단계;
g) 20 내지 38℃, 바람직하게는 34℃의 온도에서 예를 들어 적어도 30 분, 예를 들어 12 시간까지의 시간 동안 상기 도입된 핵산 작제물을 포함하는 제 2 관류 용액으로 상기 분리된 혈관화 조직을 계속 관류시키는 단계; 및
h) 최적 산소 공급을 제공하고 잔류 핵산 작제물을 흡수함으로써 미흡수된 순환 핵산 작제물이 없는 유전적으로 변형된 혈관화 조직을 생성하고, 예를 들어 또한 상기 조직의 후속 적용을 위한 안전성을 향상시키기 위하여, 상기 도입된 핵산 작제물을 포함하는 제 2 관류 용액을 적혈구를 함유하는 혈액으로 대체하고 상기 분리된 혈관화 조직을 20 내지 38℃, 바람직하게는 34℃의 온도에서 상기 혈액으로 관류시키는 단계; 및
i) 감소된 혈액 함량 및 감소된 대사활성을 갖는 냉각된 분리된 혈관 조직을 생성하기 위하여, 상기 혈액을 2 내지 10℃의 온도를 갖는 차가운 보존 용액으로 대체하고, 바람직하게는 2 내지 10℃의 온도에서 배양하면서 2 내지 10℃의 온도에서 상기 분리된 혈관화 조직을 관류시키는 단계;
j) 선택적으로 단계 i)는 보존 용액에 산소를 도입하지 않고 수행되고;
k) 다음에, 발생된 이식 환경에서 면역원성이 감소되고 동종이계 수용자에 대한 이식물로서 사용가능한 혈관화되고 안전한 조직 또는 기관을 갖는 단계를 순차적으로 포함한다.
일반적으로, 정상체온 미만 온도(subnormothermic) 상태는 0℃의 온도 내지는 혈관화 조직이 유래하는 유기체의 정상 심부 체온(core body temperature) 보다 1K 또는 2K 이하의 온도일 수 있다. 예를 들어, 정상체온 미만 온도는 혈관화 조직이 유래하는 유기체의 정상 심부 체온보다 20K 이하 또는 15 또는 10K 이하 내지는 이러한 정상 심부 체온보다 1K 또는 2K 이하의 온도일 수 있다. 정상체온(normothermic) 상태는 혈관화 조직이 유래하는 유기체의 정상 심부 체온보다 2K 또는 1K 이하의 온도 내지는 혈관화 조직이 유래하는 유기체의 정상 심부 체온보다 2K, 바람직하게는 1K 이상의 온도, 또는 혈관화 조직이 유래하는 유기체의 정상 심부 체온까지의 온도일 수 있다.
일반적으로, 상기 방법은 정상체온 미만 온도 상태 내지 정상체온 상태의 범위에서 냉각 및 가열 장치를 구비한 기관 관류 시스템에서 수행되는 것이 바람직하다. 인간의 경우, 정상체온 미만 온도 상태는 20 내지 36℃이고, 정상체온 상태는 36℃ 내지 38℃이다.
바람직하게는, 분리된 혈관화 조직은 전체 방법 동안 연속적으로 관류된다.
보존 용액 및 제 1 관류 용액은 동일한 조성을 가질 수 있고, 바람직하게는 수성 조성물에서 인산 칼륨, 락토바이온산 칼륨, 황산 마그네슘, 히드록시에틸 전분, 라피노스, 아데노신, 글루타티온 및 알로푸리놀(신장 및 간의 경우, HTK, UW, 코토솔(Cortosol), 유로콜린스(Eurocollins Solutions))을 포함하거나 이로 구성되는 것이 바람직하고, 택일적으로 보존 용액 또는 제 1 관류 용액은 수성 조성물에서 염화나트륨, 염화칼륨, 덱스트란, 마그네슘, 글루코스, 인산염 및 염화물을 포함하는 저-칼륨-덱스트란 용액(폐의 경우, OCS 용액, Perfadex, Steen 용액)일 수있다.
제 2 관류 용액은 제 1 관류 용액 및 적어도 한 종의 산소 운반체, 바람직하게는 헤모글로빈계 산소 운반체(HBOX)를 포함하거나 이들로 이루어지는 것이 바람직하다.
제 2 관류 용액에 함유된 적어도 한 종의 합성 산소 운반체는 용해 또는 분산된 것이 바람직하다. 상기 한 종 이상의 합성 산소 운반체는 예를 들어, 합성 또는 분리된 헤모글로빈을 포함하거나 이로 구성되는 군으로부터 선택되고, 선택적으로 중합되어 Hbmp-700와 같은 350 내지 700 nm 범위의 마이크로입자, 퍼플루오로카본 화합물, 예를 들어, 퍼플루오로데칼린 또는 도데카플루오로펜탄, 및/또는 이들 중 둘 이상의 혼합물을 생성한다.
선택적으로, 제 1 관류 용액은 적어도 한 종의 합성 산소 운반체를 함유한다. 추가로 선택적으로, 제 1 관류 용액 및 제 2 관류 용액은 동일한 조성을 갖는다.
선택적으로, 단계 c), d) 및 e)는 제 1 관류 용액을 제 2 관류 용액으로 대체할 때 핵산 구조물이 제 2 관류 용액에 함유되도록 조합될 수 있다.
선택적으로, 제 2 관류 용액은 예를 들어 8 mg/L의 프로타민 설페이트, 10,000 IC 헤파린 및/또는 500 mg/L 메틸 프레드니솔론(예를 들어, Urbason라는 명칭으로 입수가능함)을 함유한다.
일반적으로, 보존 용액(제 1 관류 용액) 및/또는 제 2 관류 용액의 조성은 혈관화 조직에서 감소된 대사 활성을 유도하도록 조절된다. 이러한 조절은 예를 들어 이들 용액이 탄수화물이 없고/없거나 0.05 mM 미만의 포도당을 함유하도록 함으로써 달성된다.
발현 카세트를 함유하는 핵산 작제물은 수혜자의 면역계에 대한 분리된 혈관 화 조직의 면역원성을 감소시키기 위해 이식 환경에서 상기 분리된 혈관화 조직의 MHC를 암호화하는 mRNA를 불활성화시키기 위한 전사체를 암호화한다. MHC를 암호화하는 mRNA를 불활성화하기 위한 전사체는 종래 기술에서 알려진 전사체이거나 또는 분리된 혈관화 조직의 MHC를 암호화하는 알려진 mRNA에 혼성화되는 전사체일 수 있다. 예를 들어, 전사체는 β2-마이크로글로불린 mRNA 및/또는 예를 들어 shRNA 형태의 MHC 클래스 II 전이활성화제(transactivator)를 암호화하는 mRNA에 특이적인 RNA일 수 있다. 전사체는 예를 들어 shRNA(작은 헤어핀 RNA), siRNA(작은 간섭 RNA) 또는 microRNA의 형태일 수 있다. 이러한 전사체의 발현은 RNA 간섭에 의한 MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 발현의 하향 조절로 이어져서, 수혜자에 대한 혈관화 조직의 면역원성을 감소시킨다. 발현 카세트는 바이러스 벡터에 함유될 수 있고, 상기 바이러스 벡터는 바람직하게는 바이러스 입자에 패키지되어, 예를 들어 렌티바이러스 입자에 패키지된 렌티바이러스 벡터로 제공된다.
단계 h)에서 사용된 혈액은 조직 생존력을 지지하는 배지, 예를 들어 관류 용액인 합성 배지 조성물로 선택적으로 희석된 전혈일 수 있거나, 또는 이는 혈장 또는 0.9 % 염화나트륨 용액 또는 PBS 또는 적혈구 기능에 영향을 미치지 않고 관류하고자 하는 조직과 양립할 수 있는 임의의 다른 생리학적 희석제에 선택적으로 희석된 포장된 적혈구일 수 있다.
이식 환경에서, 이러한 방법은 예를 들어 허혈성 손상이 거의 없는, 예를 들어 산소 부족으로 인한 손상이 거의 없는 이식물의 생체외 발생을 결과하는 것으로 확인되었는데, 이때 혈관화된 동종이계 조직은 또한 그의 본래 MHC 분자가 감소된 수준으로 존재하고 바람직하게는 그의 본래 MHC 분자가 그의 발현이 실질적으로 감소되도록, 예를 들어 MHC 분자가 감소된 수준으로 발현되거나 존재하지 않도록 효과적으로 유전자적으로 변형된다.
이러한 방법에 따라 생성된 혈관화 조직은 예를 들어 수혜자에서 적어도 부분적으로 상동성 혈관화 조직을 대체함으로써 고장난 혈관 조직의 치료에서 이식물서 사용하기 위한 것이고, 이때 상기 혈관화 조직은 본래 수혜자에 대하여 동종이형이었다.
상기 방법은 분리되는, 예를 들어 시험관내에서 존재하는 혈관화 조직을 생성하고, 예를 들어 세포자멸성 세포의 함량, 부종의 존재, 엔도텔린-1, IL-6, KLF-2, eNOS 등과 같은 손상 마커의 발현 또는 분비로 결정되는 것으로 허혈성 손상이 본질적으로 없는 장점이 있다.
인간 조직에서 HLA 분자로도 지칭되는 MHC 분자는 바람직하게는 클래스 I 및 클래스 II 분자 모두를 포함한다.
선택적으로, 단계 e)의 방법은 태깅(tagging) 분자를 암호화하는 발현 카세트를 포함하는 핵산 작제물을 혈관 조직에 도입하는 것을 포함할 수 있다. 태깅 분자를 암호화하는 발현 카세트를 포함하는 핵산 작제물은 유일한 핵산 작제물일 수 있거나, 태깅 분자를 암호화하는 발현 카세트를 포함하는 핵산 작제물은 상기 방법, 예를 들어 단계 e)에서 도입될 추가의 핵산 작제물이다.
태깅 분자는 일반적으로 기능적으로 불활성이고, 예를 들어 끝이 잘린(truncated) 천연 수용체, 예를 들어 델타-NGFR(dNGFR), 끝이 잘린 CD34(tCD34) 또는 태아 단백질, 예를 들어 α1- 태아 단백질, 또는 인공 아미노산 서열일 수 있다.
태깅 분자를 암호화하는 발현 카세트의 프로모터는 외부 자극에 의해 유도 될 수 있는 프로모터, 예를 들어, 테트라사이클린-유도성 프로모터, CMV 프로모터, 또는 내피 세포에서 구성적으로 활성인 프로모터, 예를 들어 eNOS 프로모터일 수 있다.
태깅 분자의 발현은 태깅 분자에 대하여 우선적으로 선택적인 친화성을 갖는 화합물이 생체 내에서 혈관화 조직, 특히 이의 내피 세포를 특이적으로 표적하는 것을 가능하게 한다. 따라서, 태깅 분자의 발현은 상기 태깅 분자에 대하여 선택적인 친화성을 갖는 화합물이 이식 조직의 선택적인 치료, 예를 들어 태깅 분자에 대하여 우선적인 친화성을 갖는 화합물의 혈관화 조직에의 흡수, 또는 본 발명의 방법에 의해 얻어질 수 있는 혈관화 조직에 의한 태깅 분자에 대한 친화성을 갖는 화합물의 흡수를 위해 사용되는 것을 가능하게 한다. 태깅 분자에 친화성을 갖는 화합물은 예를 들어 결합 펩티드, 예를 들어 천연 구조를 갖는 항체, 예를 들어 IgG, 또는 인공 구조체, 예를 들어 scFv 또는 Fab 단편, 또는 태깅 분자가 절단된 수용체인 경우 결합 리간드 또는 변형된 결합 리간드, 예를 들어 dNGFR의 경우 뉴로트로핀 또는 이의 기능적으로 불활성인 변이체일 수 있다.
따라서, 본 구체예는 예를 들어 혈관화 조직의 내피 세포상에서 태깅 분자를 구성적으로 또는 유도적으로 발현하는 혈관 조직을 제공하고, 태깅 분자에 대하여 친화성을 갖는 화합물의 투여에 의해 수용자에게 이식될 때 생체내 표적화에 의해 이러한 혈관화 조직의 치료를 가능하게 한다. 본 구체예는 예를 들어 태깅 분자에 대하여 친화성을 갖는 화합물의 전신 투여에서 태깅 분자에 대하여 친화성을 갖는 화합물에 의해 생체내에서 특이적으로 표적화될 수 있는 혈관화 조직 이식물을 제공하는 이점을 갖는다. 일반적으로, 태깅 분자에 대하여 친화성을 갖는 화합물은 이펙터(effector) 화합물에 결합될 수 있거나, 이펙터 화합물과 혼합되어 존재할 수 있고, 상기 이펙터 화합물은 혈관화 조직 이식물의 치료에 사용하기 위해 제공될 수 있다.
이하, 첨부도면을 참조하여 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다.
도 1은 방법의 단계들 및 분리된 혈관화 조직의 외식(explantation)의 이전 단계 및 분리된 혈관 조직의 이식의 후속 단계를 개략적으로 도시하고,
도 2는 예시적인 분리된 혈관화 조직에 동시-형질도입된(co-transduced) 리포터 유전자의 발현의 측정 결과를 도시하고,
도 3은 상기 방법으로부터 얻어지는 예시적인 분리된 혈관화 조직 내에 핵산 작제물의 존재에 대한 PCR 분석의 결과를 도시하고,
도 4는 상기 방법으로부터 얻어지는 예시적인 분리된 혈관화 조직 내에서 β2-마이크로글루불린 및 MHC 클래스 II의 상대적인 발현 수준을 도시한다.
도 1은 동종이계 수혜자에 이식하기에 적합한 혈관화 조직을 제공하기 위하여 기관으로 대표되는 혈관화 외식(explanted) 조직을 보존 용액으로 관류시키는 것에서 출발하는 바람직한 방법을 개략적으로 도시한다.
실시예 1: 이식을 위한 외식된 동종이계 폐의 제조
동종이계의 분리된 혈관화 조직에 대한 일 예로서, 두 마리의 가축 돼지(30 내지 33 kg)의 외식된 폐(좌측 및 우측)를 사용하였는데, 그 조직을 외식 후 즉시 4℃의 온도를 갖는 보존 용액(Perfadex으로 구성됨)으로 플러싱(flush)하였다. 한 마리 돼지의 플러싱된 폐를 배양하고, 적혈구의 완전한 제거를 위해 Perfadex으로 구성된 제 1 관류 용액으로 생체외 관류 시스템(자체 제작되었음, TransMedics, Inc.사의 Organ Care System)을 이용하여 관류시켰다. 이러한 단계 동안, 산소공급기의 막에서 적혈구의 축적을 방지하기 위하여 산소발생기를 관류 시스템에 연결하지 않았는데, 적혈구는 핵산 작제물을 포함하는 렌티바이러스 벡터 입자의 나중의 흡수 및 손실을 초래하는 것으로 간주되기 때문이다. 이러한 광범위한 세척 후, 제 1 관류 용액을, 합성 산소 운반체로서 헤모글로빈 마이크로입자(Hbmp-700)를 포함하는 제 2 관류 용액(Perfadex 또는 OCS 용액으로 구성됨)으로 완전히 대체하였고, 조직에의 산소 공급을 확보하기 위하여 연결된 산소공급기를 이용하여 관류를 계속하였고, 온도는 가열 장치를 이용하여 연속적으로 증기시켰고 37℃에서 유지하였다. 관류는 0.7 L/min의 유속으로 수행하였다.
핵산 작제물은 β2-마이크로글로불린 mRNA를 특이적으로 표적하는 서열번호 1을 암호화하는 shRNA, 및 MHC 클래스 II 전이활성화제(CIITA)를 특이적으로 표적하는 서열번호 2를 암호화하는 shRNA뿐만 아니라, 리포터 유전자로서 분비된 형태의 루시퍼라제를 암호화하는 서열(NanoLuc, Promega사로부터 얻음, 분비된 형태의 오플로포루스 그라실리로스트리스(Oplophorus gracilirostris) 유래의 루시퍼라제)에 대한 발현 카세트를 암호화하였다. β2-마이크로글로불린 mRNA를 표적하는 shRNA는 MHC 클래스 I의 발현억제(silencing)를 유발하고 MHC 클래스 II 전이활성화제(CIITA)를 표적하는 shRNA는 특이적이고 선택적인 방식으로 MHC 클래스 II의 발현억제를 유발한다.
이러한 핵산 작제물을 패키징 세포 내의 렌티바이러스 입자에 패키징하고, 35,000 rpm으로 8 시간 동안 원심분리하여 농축하고 보존 용액에 재현탁하였다. p24 ELISA를 이용하여 역가(titer)를 측정하고, -80℃에서 저장하였다.
제 2 관류 용액에 바이러스 입자를 첨가하기 전에, 포로타민 설페이트를 8 mg/L의 농도까지 첨가하고, 10,000 IE 헤파린 및 500 mg Urbason을 순환하는 제 2 관류 용액(전체 부피: 약 1.5 L)에 첨가하고, 제 2 관류 용액의 온도를 34℃로 상승시켰다.
렌티바이러스 입자를 제 2 관류 용액 1 L 당 1011 개의 바이러스 입자까지 첨가하고, 관류를 34℃에서 8 시간 동안 계속하였다. 이후에, 바이러스 입자가 첨가 된 제 2 관류 용액을 XVIVO 퍼퓨전(Perfusion)으로부터 얻은 덱스트란 40, 인간 혈청 알부민 및 전해질을 함유하는 500 mL Steen 용액과 혼합된 1L 헤파린처리된 말초 전혈로 대체하였다. 다음에, 그 조직을 12 시간까지 관류 시스템에서 유지하였다.
분석을 위해, 폐 조직을 상이한 영역으로부터 취하여 콜라게나제 VI 및 디스파제(둘 모두 Sigma사로부터 얻음)로 소화시켰다. 렌티바이러스 벡터를 제 2 관류 용액에 첨가한 후 96 시간 째에, 폐 거대혈관 및 미소혈관의 내피 세포를 항-CD31로 표지한 후에 자기 분리(magnetic separation)를 위한 상자성 비드(Dynabeads, Thermo Fisher사로부터 얻음)를 사용하여 분리하였다. 동시에, 바이러스 입자가 첨가되지 않은 것을 제외하고는 동일한 방식으로 처리된 형질도입되지 않은 폐로부터 내피 세포를 분리하였다. 분석 결과, 내피 세포는 70% 이상의 순도로 분리된 것으로 확인되었다.
바이러스 입자를 제 2 관류 용액에 첨가한 후 24 시간 째에, 배양 상청액에서 루시퍼라제 활성이 검출되었다. 이러한 생물발광(bioluminescence) 수준은 96 시간의 배양 동안 증가하였다. 놀랍게도, 우측 및 좌측 폐로부터의 세포가 형질도입되어 전체 기관 상피에서 핵산 작제물의 통합 및 활성을 나타냈다. 루시퍼라제 활성을 루시퍼라제 기질(Furimazine, Promega사)을 첨가한 후 측정하였다.
도 2는 배양 동안 좌측 폐의 상이한 영역(샘플 L1 내지 L10) 및 우측 폐의 상이한 영역(샘플 R1 내지 R10) 뿐만 아니라, 형질도입되지 않은 폐(비-형질도입)로부터의 병행 음성 세포 샘플의에 대한 리포터 유전자의 발광(luminescence)을 도시한다.
렌티바이러스 입자는 핵산 작제물로부터 혈관화 조직의 게놈내로의 발현 카세트의 안정적이고 영구적인 통합을 제공하였다.
도 3은 배양된 내피 세포로부터 분리된 DNA, 및 핵산 작제물에 존재하는 우드척(woodchuck) 간염 바이러스 전사후 요소 WPRE에 대하여 특이적인 프라이머를 이용한 실시간 PCR의 결과를 도시한다. 그 결과는 본 발명의 방법에 의해 처리된 내피 세포에서 높은 수준의 WPRE, 및 렌티바이러스 벡터의 첨가 없이 동시에 처리된 폐로부터의 내피 세포의 배경 수준을 보여준다.
분리된 세포를 EBM-2 내피 세포 성장 배지(Lonza사로부터 얻음)에서 배양하였다. 내피 세포를 IFN-γ(100 ng/mL)로 48 시간 동안 자극하였다. 형질 도입되지 않은 병렬 처리의 미소혈관으로부터의 내피 세포는 IFN-γ에 노출시 β2-마이크로글로불린 및 SLA-DR 전사체 수준(p <0.001)을 상향 조절할 수 있었지만, 렌티바이러스 입자에 함유된, 본 발명에 따른 핵산 작제물로 처리된 폐로부터의 미소혈관 내피 세포는 IFN-γ 자극시 증가된 β2-마이크로글로불린 및 SLA-DR 전사체 수준을 나타내지 않은 것으로 확인되었다.
이들 결과는 본 발명의 방법이 산소 공급 부족에 의해 유발될 수 있는 허혈성 손상이 없이 혈관화 조직에서 MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II의 발현을 효과적으로 억제한다는 것을 입증한다.
도 4는 배양된 세포에서 48 시간 동안 IFNγ로 자극한 후 β2-마이크로글로불린의 전사체 및 MHC 클래스 II(SLA-DR)의 전사체에 대하여 RT-PCR에 의해 검출된 수준을 보여준다. 수준은 β-액틴에 대한 전사체 수준으로 표준화하였다(***p <0.001).
실시예 2: 외식된 동질이계 폐의 폐 이식물로서의 용도
동종 이계 혈관화 조직에 대한 일 예로서, 수컷 미니어처 돼지의 외식된 폐로부터 실시예 1의 방법 단계에 의해 제조한 좌측 폐를 암컷 미니어처 돼지의 좌측 폐에 대한 이식물로서 사용하였다.
구체적으로, 암컷 수혜체 미니어처 돼지를 진정시키고 기관내 삽관하였다. 이소플루란을 마취를 위해 투여하였다. 영구 혈관 접근 이중-관강(permanent vascular access double-lumen) 3.2 Quinton 심방 카테터를 우측 경정맥에 삽입하였다. 네 번째 늑간 공간에서 개흉 후 왼쪽 폐 문(hilus)를 절개하고 혈관 및 기관지를 고정하고 폐를 제거하였다. 한편, 유전자 변형된(MHC 발현억제) 또는 변형되지 않은 대조군 공여자 폐는 각각 생체외 관류 시스템에서 냉각하였다. 생체외 관류 시스템으로부터 폐를 제거하고, 새로운 차가운 관류 용액으로 플러싱(flush)하고 이식을 위해 준비하였다. 다음에, 왼쪽 폐를 표준 기술을 사용하여 이식하였다. 관제거(extubation) 후, 동물을 가열 램프, 바닥아래 가열 및 식수를 구비한 상자에 넣었다. 모든 이식된 동물은 28 일 동안 표준 정맥내 약리학적 면역억제제를 투여받았다. 정맥 내 약리학적 면역억제제는 1.5 mg/kg/d의 메틸프레드니솔론 및 16 내지 26 ng/ml의 혈액 최저 수준(blood trough level)으로 조절된 타크롤리무스(Astellas사, 일본)를 포함한다. 탠덤 질량 분석법을 사용하여 타크롤리무스 혈액 최저 수준을 모니터링하였다. 경험적 정맥내 항생제 요법은 4 mg/kg/d의 시프로플록사신(Bayer사, 독일)으로 구성되었다. 28 일 후, 약물을 이용한 치료를 중단하였다; Quinton 카테터를 외식하였고 동물은 흉부 방사선사진 및 기관지 내시경에 의해 거부의 징후에 대해 정기적으로 조절하였다. 규칙적인 시간 간격으로 돼지의 말초 혈액에서의 분비된 루시페라제(NanoLuc) 활성을 측정함으로써 렌티바이러스 벡터-암호화 서열의 발현을 모니터링하였다. 리포터 유전자의 발현을 모니터링하면, 침습적인 과정이 요구되지 않고 이식편에서 MHC 발현억제 효과를 간접적으로 추적할 수 있다.
MHC 발현을 억제하기 위해 유전적으로 변형된 기관을 이식한 동물은 270 일의 관찰 기간 내에 면역학적 기관 거부의 임상적 또는 방사선학적 징후를 나타내지 않은 반면에, 미변형 폐를 이식한 동물은 이식 후 최근 70 일 째에 이식편을 거부 하였다.

Claims (24)

  1. 혈관화 조직을 생체외에서 유전적으로 변형시키기 위한 방법으로서, 정상체온 또는 정상체온 미만 온도 조건에서 하기의 단계를 포함하는, 방법:
    a) 상기 혈관화 조직을 2 내지 10℃의 온도를 갖는 보존 용액으로 관류시키는 단계;
    b) 혈액이 본질적으로 없고 감소된 대사활성을 갖는 냉각된 분리된 혈관 조직을 생성하기 위하여 상기 혈관화 조직으로부터 모든 적혈구가 제거될 때 까지 상기 보존 용액 또는 제 1 관류 용액을 이용하여 상기 혈관화 조직을 관류시킴으로써 세척하는 단계;
    c) 적어도 한 종의 합성 산소 운반체를 함유하는 제 2 관류 용액으로 상기 보존 용액 또는 제 1 관류 용액을 대체하는 단계; 및
    d) 허혈성 손상이 본질적으로 없는 냉각된 분리된 혈관 조직을 생성하기 위하여 상기 제 2 관류 용액에 산소를 도입하는 단계;
    e) 상기 제 2 관류 용액에 핵산 작제물을 도입하는 단계;
    f) 20 내지 38℃의 온도에서, 상기 도입된 핵산 작제물을 함유하고 혈액 세포가 없는 제 2 관류 용액으로 상기 분리된 혈관화 조직을 계속 관류시키는 단계; 및
    g) 상기 도입된 핵산 작제물을 함유하는 제 2 관류 용액을 혈액으로 대체하고 상기 분리된 혈관화 조직을 상기 혈액으로 관류시켜서, 상기 핵산 작제물에 의해 유전적으로 변형되는 혈관화 조직을 생성하는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 보존 용액 및 제 1 관류 용액이 동일한 조성을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항 내지 제 2 항 중 한 항에 있어서, 상기 보존 용액, 제 1 관류 용액 및/또는 제 2 관류 용액이 상기 혈관화 조직에서 감소된 대사활성을 달성하도록 조절되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 한 항에 있어서, 단계 a) 내지 c)가 상기 보존 용액 또는 제 1 관류 용액에 산소를 도입하지 않고 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 한 항에 있어서, 단계 f)가 20 내지 38℃에서 적어도 30 분, 바람직하게는 적어도 8 시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 한 항에 있어서, 관류는 펌프를 상기 분리된 혈관화 조직의 혈관들 중 적어도 하나와 연결하고 상기 적어도 하나의 혈관을 통해 상기 용액을 펌핑함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 한 항에 있어서, 상기 혈관화 조직이 예를 들어 심장, 신장, 간, 폐, 췌장, 소장에서 선택되는 기관이거나, 또는 예를 들어 손, 발, 음경으로부터 선택되는 완전 또는 부분적 말단인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 한 항에 있어서, 상기 혈관화 조직이 예정 수혜자에 대하여 동종이계(allogeneic)이고, 상기 핵산 작제물이 상기 분리된 혈관화 조직의 MHC를 암호화하는 mRNA를 불활성화하는 전사체를 암호화하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 한 항에 있어서, 상기 혈관화 조직이 예정 수혜자에 대하여 자가조직(autologous)인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 한 항에 있어서, 상기 혈관화 조직이 인간 기원이고, 상기 핵산 작제물은 MHC 클래스 I 경쇄(β2-마이크로글로불린)에 대한 조직의 전사체의 보존된 또는 다형성 영역 및/또는 MHC 클래스 I 중쇄에 대한 전사체 및/또는 MHC 클래스 II 전이활성화제 또는 MHC 클래스 II α-사슬 또는 β-사슬의 전사체에 대하여 특이적인 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)를 암호화하고/하거나, 상기 핵산 작제물은 T 세포의 활성화 또는 증식 또는 예를 들어 보체 인자에 의해 유발되는 세포독성 항체 효과를 예방하는 PD-L1, PD-L2, IDO, IL-10 및/또는 임의의 다른 분자 또는 분자들을 암호화하고/하거나, 상기 핵산 작제물은 상기 혈관화 조직의 자가항원을 암호화하는 전사체를 불활성화하는 전사체를 암호화하고/하거나, 상기 혈관화 조직은 기능성 유전자, 예를 들어 폐에서의 낭포성 섬유증 막횡단 전도 조절인자(CFTR)가 결핍되어 있고 상기 핵산 작제물이 낭포성 섬유증 막횡단 전도 조절인자(CFTR)에 대한 기능성 유전자를 암호화하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 한 항에 있어서, 상기 혈관화 조직이 이의 동맥 혈관구조 및 기관지, 요관 및/또는 장과 같은 비혈관구조 도관을 통해 관류되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 한 항에 있어서, 상기 핵산 작제물은 상기 혈관화 조직의 세포의 게놈의 영구 변형에 적합하고/하거나 상기 혈관화 조직의 세포의 게놈내로의 영구 통합에 적합한 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 한 항에 있어서, 상기 혈관화 조직이 인간 기원인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 한 항에 있어서, 상기 혈관화 조직이 예정 수혜자와 면역학적으로 양립가능하고, 예를 들어 예정 수혜자의 외식편인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 한 항에 있어서, 상기 핵산 작제물이 CRISPR/Cas의 기능을 갖는 단백질을 암호화하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 한 항에 있어서, 상기 핵산 작제물이 태깅 분자를 암호화하는 발현 카세트를 포함하거나 그 발현 카세트로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 1 항 내지 제 16 항 중 한 항에 있어서, 추가의 핵산 작제물이 단계 e)에서 도입되고, 상기 추가의 핵산 작제물은 태깅 분자를 암호화하는 발현 카세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 16 항 또는 제 17 항에 있어서, 상기 태깅 분자가 세포 표면에 위치하고 기능적으로 불활성인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 16 항 내지 제 18 항 중 한 항에 있어서, 상기 태깅 분자가 끝이 잘린(truncated) 세포-표면 수용체 및 태아 단백질을 포함하는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 16 항 내지 제 19 항 중 한 항에 있어서, 상기 태깅 분자를 암호화하는 발현 카세트가 상기 태깅 분자를 암호화하는 서열에 기능적으로 연결된 프로모터를 포함하고, 상기 프로모터는 외부 자극에 의해 유도될 수 있거나 내피 세포에서 구성적으로 활성인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 이식물로서 사용하기 위한, 인간 생식 세포를 제외한 분리된 혈관화 조직으로서, 상기 조직은 이의 세포의 적어도 몇몇에서 MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 분자를 발현하지 않도록 유전적으로 변형되는 것을 특징으로 하는 분리된 혈관화 조직.
  22. 제 21 항에 있어서, 상기 조직은 허혈성 손상이 없는 것을 특징으로 하는 분리된 혈관화 조직.
  23. 제 21 항 또는 제 22항에 있어서,
    제 1 항 내지 제 19 항 중 한 항에 따른 방법에 의해 얻어질 수 있는, 분리된 혈관화 조직.
  24. 수혜자(recipient) 내 고장난 혈관화 조직의 치료에서 사용하기 위한 이식물로서 또는 자가면역 반응의 치료에서 인간 수혜자에 사용하기 위한 자가 이식물로서의, 제 1 항 내지 제 20 항 중 한 항에 따른 방법에 의해 얻어질 수 있는 동종이계 혈관화 조직 또는 제 21 항 내지 제 23 항 중 한 항에 따른 혈관화 조직.
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