KR20200015669A

KR20200015669A - 비이온성 계면활성제를 이용한 막단백질의 선택적 분리방법

Info

Publication number: KR20200015669A
Application number: KR1020200012851A
Authority: KR
Inventors: 최영식; 윤종혁; 정현진; 장재명; 최유라
Original assignee: 재단법인대구경북과학기술원
Priority date: 2020-02-03
Filing date: 2020-02-03
Publication date: 2020-02-12

Abstract

본 발명은 막단백질 분석방법에 관한 것으로서, 비이온성 계면활성제를 이용한 막단백질 분리 및 질량분석 방법에 관한 것이다. 이와 같이, 본 발명은 세포막에 특이적으로 존재하는 막단백질을 비이온성 계면활성제를 이용하여 추출하고 질량분석하여 막에 존재하는 단백질들을 효율적으로 동정하는 방법을 제공한다.

Description

비이온성 계면활성제를 이용한 막단백질의 선택적 분리방법 {A method of selective identification of membrane protein using non-ionic detergents}

본 발명은 막단백질 분석방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 비이온성 계면활성제를 이용한 막단백질 분리 및 정제 방법에 관한 것으로서, 세포막에 특이적으로 존재하는 막단백질을 비이온성 계면활성제를 이용하여 추출하고 질량분석하여 막에 존재하는 단백질들을 효율적으로 동정하는 방법에 관한 것이다.

막단백질은 세포 안팎의 신호를 전달하는 중요한 단백질이며, 다양한 질병과 연관된다. 막단백질은 세포 안팎의 이온농도 차이를 생성하거나, ATP 합성에 이용되며, 신경세포 또는 근육세포에서 전기적 신호의 발생과 전달에 관여한다. 막단백질은 내재성 단백질과 표재성 단백질로 구분되며, 내재성 단백질에 포함된 소수성 곁사슬을 가진 아미노산이 지질층의 지방산기와 결합하여 단백질을 막에 부착시킨다. 내재성 단백질은 일반적으로 하나 이상의 막통과부위를 포함하며, 폴리펩타이드 사슬이 이중층의 양쪽 표면에 노출된 구조를 갖는다. 표재성 단백질의 예로는 원형질막의 세포질 면에 부착된 스펙트린, 액틴, 및 단백질인산화효소C 등이 있다. 막단백질은 기능에 따라 트랜스포터 (transporter), 수용체 (reseptor) 및 앵커 (anchor) 등으로 구분된다. 수용체 단백질중 특히 GPCR (G-protein coupled receptor)는 다양한 질병의 치료제를 개발하기 위한 표적으로 알려져 있다. 그러나, 많은 수의 막단백질은 여전히 잘 알려져 있지 않고 있으며, 이미 알려진 막단백질의 경우에도 이것의 특성 및 기능을 밝히기 위한 분리 및 분석 작업에 어려움이 있어 관련연구가 한계에 부딪혀 있다.

막단백질은 세포질 내에 존재하는 단백질에 비해 소수성이 강하고 지질 이중층에 존재하기 때문에, 추출 및 정제가 용이하지 않다. 막단백질 분리정제 기술로서, 세제를 사용하여 추출하는 방법이 Molloy 등에 의해 개발된 바 있으며, 이는 우레아, 티오우레아, CHAPS 등을 이용한 3단계 추출방법을 특징으로 한다. Molloy 등의 방법에 따르면, 세포 또는 조직을 파쇄하고, 원심분리를 통해 상등액을 제거한 후 막단백질을 포함하는 침전물을 회수하고, 지질층이나 세포벽에 결합된 막단백질을 세제 (detergent)를 이용하여 추출한다. 이 방법에서 주로 이용되는 세제에는 Triton-X100, Nonidet P-40(NP-40), 4-octylbenzoyl amidosulfobetine, ASB14 등이 있다. 막단백질을 분리정제 하는 다른 방법은 시료를 원심분리 하는 것이다. 이 방법에서는 세포를 파쇄하고 원심분리 하여 막단백질 분획을 분리한다. 이 방법의 단점은 추가의 검증과정이 필요하고 장시간이 소요된다는 것이다. 이 밖에 표지 및 크로마토그래피 방법, pH에서 다른 특성을 갖는 한외여과법으로 단백질을 선택적으로 농축하는 방법, 수지 (resin)를 이용하여 포스페이트 펩타이드를 비포스페이트 펩타이드와 분리하여 농축하는 방법, 유리 비드를 이용하여 막단백질을 분별상분리법으로 선택적으로 농축하는 방법기술 (Journal of Biomedicine and Biotechnology, 2003:4 (2003) pp249-255)이 알려져 있다. 그러나, 상기 종래기술 모두 막단백질만을 선택적으로 분리정제함에 만족할 만한 결과를 제시하지 못하고 있는 실정이다.

이에, 본 발명자들은 막단백질을 분리 및 정제함에 있어서 상기 종래기술의 한계 및 문제점을 극복하기 위해, 다양한 방법으로 연구를 수행하였으며, 그 결과 비이온성 계면활성제를 사용함으로써 막단백질을 효과적으로 용해하고 추출할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다. 본 발명은 막단백질 분리 후 동정 및 서열 분석을 위한 질량분석법을 포함한다.

Journal of Biomedicine and Biotechnology, 2003:4 (2003) pp249-255)

본 발명은 막단백질의 선택적 분리 및 정제 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 수용체 및 트랜스포터 단백질을 선택적으로 농축하고, 분리 및 정제하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 막단백질의 동정 및 서열분석을 위한 질량분석법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 비이온성 계면활성제를 이용한 막단백질의 분리 및 정제방법으로서, i) 생체외 분리된 생물학적 시료로부터 멤브레인 분획을 분리하고; ⅱ) 상기 멤브레인 분획을 비이온성 계면활성제에 용해하며; ⅲ) 상기 용해된 멤브레인 분획을 SDS-PAGE 수행하고; ⅳ) 상기 ⅲ)에서 SDS-PAGE 결과물을 겔내 절단 (in-gel digestion) 처리 하는 것을 포함하여, 막단백질을 분리하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 비이온성 계면활성제는 DDM (n-dodecyl-b-D-maltoside) 이며, 0.5 ~ 2% (w/v), 바람직하게는 1%가 사용된다.

본 발명의 다른 일 실시예에서, 상기 막단백질은 수용체 (receptor), 트랜스포터 (transporter), 또는 둘 모두를 포함하고, 이들 단백질이 선택적으로 농축된다.

본 발명의 또 다른 일 실시예에서, 상기 SDS-PAGE 수행 전에 상기 용해된 멤브레인 분획을 소니케이션 하는 것을 추가로 포함하하며, 상기 소니케이션은 10 ~ 20 V의 전압으로 2 ~ 10초간 1 ~ 5회 반복 수행될 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 소니케이션 후에 원심분리 하는 것을 추가로 포함하며, 상기 원심분리는 40 ~ 60 kDa의 공극크기 (pore size)를 갖는 멤브레인 필터를 사용하고, 12,000 ~ 16,000 x g에서 40 ~ 80분간 1 ~ 5회 반복 수행할 수 있다.

본 발명의 비이온성 계면활성제를 사용하는 막단백질의 분리방법은, 세포의 멤브레인 분획에 존재하는 막단백질을 선택적으로 농축하고 분리 및 정제 하는데 있어 매우 효과적이다.

도 1은 본 발명에 따라 생체외 분리된 생물학적 시료의 멤브레인 분획으로부터 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질을 분리 정제하는 방법을 간략하게 표에 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 방법에 따라 동정된 전체 단백질의 수를 그래프로 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 방법에 따라 동정된 막단백질의 수를 그래프로 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 방법에 따라 동정된 전체 단백질의 수 대비 막단백질의 수를 %로 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 방법에 따라 동정된 전체 단백질의 수 대비 수용체 및 트랜스포터의 수를 %로 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 방법에 따라 동정된 막단백질에서 추가의 웨스턴블롯팅을 위해 선정한 8개의 단백질을 표에 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 방법에 따라 동정된 막단백질에서 5개 단백질에 대한 웨스턴블롯팅 수행 결과를 나타낸 것이다.

이하, 실시예에 기초하여 본 발명을 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 도면 및 청구범위를 포함하는 상세한 설명에 기술된 내용으로부터 본 기술이 속하는 분야의 전문가가 용이하게 변형 또는 치환할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 포함됨은 물론이다.

제조예

(1) U118MG로부터 멤브레인 분획의 제조

U118 MG 세포 (입수처: ATCC® HTB15™)를 10% 소태아혈청 (fetal bovine serum) (FBS)이 첨가된 DMEM-F12 배지 (Thermo Fisher Scientific)에서 서브콘플루언트 (subconfluent) 수준으로 배양하고, 5% CO₂ 가습분위기 (humidified atmosphere)에서 37℃로 유지하였다. U118MG 세포를 80% 콘플루언스 (confluence) 상태에서 수거한 후, 세포 펠릿을 80℃로 동결시켰다. U118 MG 교모세포종의 멤브레인 분획은 멤브레인 분리키트 (Cat#539790, Calbiochem, Germany)를 제조자의 지시에 따라 사용하여 수득하였다. 1 ㎖ 얼음냉각 (ice-cold) 추출 완충액I과 5 ㎕ 프로테아제 저해제 칵테일의 혼합물을 상기 동결된 U118MG 세포 펠릿에 즉시 가하였다. 튜브를 가볍게 두드려서 동결된 세포 펠릿을 재현탁 한 후, 용액을 부드럽게 흔들어 주면서 4℃에서 10분간 인큐베이션 하였다. 4℃에서 10분간, 500 x g로 원심분리 한 후, 상등액을 제거하였다. 1 ㎖ 얼음냉각 추출 완충액Ⅱ 및 5 ㎕ 프로테아제 저해제 칵테일을 곧바로 펠릿에 가하였다. 튜브를 가볍게 두드려서 펠릿을 재현탁 한 후, 용액을 부드럽게 흔들어 주면서 4℃에서 30분 동안 인큐베이션 하였다. 다음, 4℃에서 10분간, 500 x g로 원심분리하여 수득한 상등액을 깨끗한 튜브로 옮겼다 (분획 2, 멤브레인 분획). 멤브레인 단백질을 BCA단백질어세이키트 (Thermo Scientific, 미국)를 사용하여 분석하였다. 후속하는 실험에서, 각 방법은 1 ㎍/㎕ 단백질 농도의 멤브레인 분획 샘플 200 ㎕를 사용하였다.

순수한 막단백질을 제조하기 위해, 단백질침전키트 (Cat#539180, Calbiochem, Germany)를 제조자의 지시에 따라 사용하여 단백질 침전을 수행하였다. 멤브레인 분획 200 ㎕를 800 ㎕의 얼음냉각 침전시약과 혼합하였다. 다음, -20℃에서 60분간 인큐베이션 한 후, 용액을 실온에서 10분간 10,000 x g로 원심분리 하였다. 상등액을 흡입하여 제거하고, 펠릿에 500 ㎕ 세척 용액을 가하여 세척하였다. 실온에서 2분간 10,000 x g로 원심분리 한 후, 상등액을 흡입하여 제거하고, 반복하여 세척하였다. 세척한 펠릿을 실온에서 건조하였다.

(2) 멤브레인 분획으로부터 펩타이드 제조 - 제 1 방법

막단백질을 1x TBS (Tris-buffered saline, Sigma-Aldrich) 중의 1% (w/v) DDM (n-dodecyl-b-D-maltoside, cat# D4641 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)으로 용해시켰다. 혼합물을 볼텍싱하고 실온에서 10분간 인큐베이션 하였다. 다음, 혼합물을 15 V에서 5초간 5회 소니케이션 하였다. 혼합물을 10% 베타-메르캅토에탄올 (beta-mercaptoethanol)을 가한 4x SDS 샘플 완충액과 혼합하였다. 10분간 보일링 한 후, 샘플을 SDS-PAGE 처리하였다. 겔플러그 (gel plug)를 30% ACN (acrylonitrile)으로 세척한 후, 56℃에서 30분간 10 mM DTT로 처리하였다. 다시, 겔플러그를 100% ACN으로 세척한 다음, 암실에서 100 mM IAA를 30분간 실온으로 처리하였다. 겔플러그를 100% ACN로 세척한 후, 겔플러그를 동결건조기로 건조하고, 트립신 (1:50 비율)을 37℃에서 16시간 처리하였다.

(3) 멤브레인 분획으로부터 펩타이드 제조 - 제 2 방법

막단백질을 1x TBS 중의 1% (w/v) DDM (n-dodecyl-b-D-maltoside, cat# D4641 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)를 사용하여 용해하였다. 혼합물을 볼텍싱하고 실온에서 10분간 인큐베이션 하였다. 혼합물을 15 V에서 5초간 5회 소니케이션 하였다. 다음, 혼합물을 Filter-Aided Sample Preparation method (Nature Methods 6, 359 - 362 (2009))에 가하였다. 이어서, 혼합물을 YM-10 centrifugal filter unit (Cat# 42407, Millipore)에 로딩한 후, 4% (w/v) SDS, 100 mM Tris/HCl (pH 7.6), 0.1M DTT가 첨가된 SDT 완충액에서 용해시켰다. 다음, 37℃에서 45분간 인큐베이션 한 후, 혼합물을 10분동안 보일링 하였다. 후속하여, 혼합물에 0.1 M Tris/HCl (pH 8.5) 중의 8 M 우레아 (U5128, Sigma-Aldrich) 200 ㎕를 가하고, 60분간 14,000 x g로 3회 연속 원심분리 하였다. 알킬화를 위해, 100 ㎕의 50 mM IAA를 YM-10 멤브레인 상의 막단백질에 처리하고, 암실에서 25℃로 인큐베이션 하였다. 다음, 0.1 M Tris/HCl (pH 8.5) 중의 8 M 우레아 (U5128, Sigma-Aldrich) 200 ㎕를 가하고, 60분간 14,000 x g로 5연속 원심분리한 후, 10 mM 암모늄 비카르보네이트 (bicarbonate) 200 ㎕을 가하였다. 용액을 14,000 x g에서 50 분간 원심분리 하였다. 이 과정을 반복 수행하였다. 다음, 콜렉션 튜브를 교체하고, YM-10 멤브레인 상의 막단백질에 대해 트립신 1:50 (sequencing grade, Promega, Madison, WI)을 처리한 다음, 37℃에서 16시간 인큐베이션 하였다. 트립신 분해된 단백질을 수거하기 위해, 원심분리를 14,000 x g에서 20분간 수행하고, 여과액을 수거하였다. 10 mM 암모늄 비카르보네이트 50 ㎕를 가한 후, 원심분리를 14,000 x g에서 30분간 수행하고 여과액을 수거하였다. 이 과정을 반복하였다. 3개의 여과액을 수거한 후, 질량분석을 위해 건조하였다.

(4) 멤브레인 분획으로부터 펩타이드 제조 - 제 3 방법

막단백질을 4% (w/v) SDS, 100 mM Tris/HCl (pH 7.6), 0.1M DTT가 첨가된 SDT 완충액 200 ㎕로 용해시킨 다음, 혼합물을 YM-10 centrifugal filter unit (Cat# 42407, Millipore)에 로딩하였다. 37℃에서 45분간 인큐베이션 한 후, 혼합물을 10분동안 보일링 하였다. 다음, 혼합물에 0.1 M Tris/HCl (pH 8.5) 중의 8 M 우레아 (U5128, Sigma-Aldrich) 200 ㎕를 가하고, 14,000 x g에서 60분간 3회 연속 원심분리 하였다. 알킬화를 위해, 100 ㎕의 50 mM IAA를 YM-10 멤브레인 상의 막단백질에 처리하고, 암실에서 25℃로 인큐베이션 하였다. 이어서, 0.1 M Tris/HCl (pH 8.5) 중의 8 M 우레아 (U5128, Sigma-Aldrich) 200 ㎕를 가하고, 14,000 x g에서 60분간 5회 연속 원심분리한 후, 10 mM 암모늄 비카르보네이트 200 ㎕을 가하였다. 다음, 용액을 14,000 x g에서 50분간 원심분리 하였다. 이 과정을 반복 수행하였다. 콜렉션 튜브를 교체하고, YM-10 멤브레인 상의 막단백질에 대해 트립신 1:50 (sequencing grade, Promega, Madison, WI)을 처리한 다음, 37℃에서 16시간 인큐베이션 하였다. 트립신 분해된 단백질을 수거하기 위해, 원심분리를 14,000 x g에서 20분 수행하고, 여과액을 수거하였다. 10 mM 암모늄 비카르보네이트 50 ㎕를 가한 후, 원심분리를 14,000 x g에서 30분간 수행하고 여과액을 수거하였다. 이 과정을 반복하였다. 3개의 여과액을 수거한 후, 질량분석을 위해 건조하였다.

(5) 멤브레인 분획으로부터 펩타이드 제조 - 제 4 방법

막단백질을 1x TBS 중의 1% (w/v) DDM (n-dodecyl-b-D-maltoside, cat# D4641 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)를 사용하여 용해시켰다. 혼합물을 볼텍싱 하고 실온에서 10분간 인큐베이션 하였다. 혼합물을 15 V에서 5초간 5회 소니케이션 하였다. 혼합물을 50 kDa MWCO filter (Cat# UFC910024, Millipore Billerica, MA)에 부은 다음, 20℃에서 3분간 13,000 x g로 원심분리 하였다. 혼합물을 10% beta-mercaptoethanol을 가한 4x SDS 샘플 완충액과 함께 혼합하였다. 10분간 보일링 한 후, 샘플을 SDS-PAGE 하였다. 겔플러그를 30% ACN으로 세척한 후, 56℃에서 30분간 10 mM DTT로 처리하였다. 겔플러그를 100% ACN으로 세척한 다음, 암실에서 100 mM IAA를 실온으로 30분간 처리하였다. 겔플러그를 100% ACN로 세척한 후, 겔플러그를 동결건조기를 사용하여 건조한 다음, 트립신 (1:50 비율)을 37℃에서 16시간 처리하였다.

(6) 멤브레인 분획으로부터 펩타이드 제조 - 제 5 방법

막단백질을 10% 베타-메르캅토에탄올 (beta-mercaptoethanol)를 가한 1x SDS 샘플 완충액 중에 용해시켰다. 10분 동안 보일링한 후, 샘플을 SDS-PAGE 하였다. 겔플러그를 30% ACN으로 세척한 후, 56℃에서 30분간 10 mM DTT로 처리하였다. 겔플러그를 100% ACN으로 세척한 다음, 암실에서 100 mM IAA를 실온으로 30분간 처리하였다. 겔플러그를 100% ACN로 세척한 후, 겔플러그를 동결건조기를 사용하여 건조한 다음, 트립신 (1:50 비율)을 37℃에서 16시간 처리하였다.

(7) 질량분석 및 데이터베이스 서치

상기 각각의 펩타이드 제조방법으로부터 얻은 트립신 분해물을 ddH₂O (double-distilled water) 중의 0.1% 포름산 (formic acid) 12 ㎕에 용해시켰다. 트립신 분해물을 나노-전기분무 이온소스 (nano-electrospray ion source)와 연결되는 Q-exactive plus hybrid quadrupole orbit-trap mass spectrometer (Thermo Fisher scientific, San Jose, CA, USA)를 사용하여 분석하였다. 펩타이드를 로딩컬럼으로서 Acclaim PepMap^TM 100 (75 um x 2 cm, Thermo Fisher scientific, San Jose, CA, USA) 및 Acclaim PepMap^TM RSLC (75 um x 15 cm, 100 A resin, Thermo Fisher scientific, San Jose, CA, USA)가 장착된 Ultimate 3000 RSLCnano system (Thermo Fisher scientific, San Jose, CA, USA) 상에서 크로마토그래피를 수행하여 분리하였다. RS auto-sampler로 펩타이드를 로딩하고, 0.1% 포름산을 함유하는 선형구배 ACN/water를 유속 300 nl/min로 사용하여 분리하였다. LC 용리제를 분석컬럼으로부터 직접 전기분무하고, 2.0 kV의 전압을 나노스프레이 소스 (nanospray source)의 액상 교차점을 경유하여 인가하였다. 펩타이드 혼합물을 5% 내지 40% 구배의 ACN으로 40분 동안 분리하였다. 분석방법은, 350 ~ 2,000 m/z 범위의 전체 MS (Mass Spectrometry) 스캐닝, 및 전체 MS 스캐닝 결과로부터 10개의 가장 센 세기의 이온에 대한 데이터-의존적인 MS/MS (MS2)로 구성하였다. 질량분석계는 데이터 의존적인 모드로 결과를 얻도록 프로그래밍 되었다. 제조자의 지시에 따라 제안된 보정 용액을 사용하여 질량분석계를 보정 (calibration) 하였다. 데이터베이스 서치를 위해, 탠덤질량스펙트럼 (tandem mass spectra)을 Thermo Fisher Scientific Proteome Discoverer software version 2.1.1.21로 수행하였다. 스펙트럼 데이터를 인간 Uniprot database에 대해 서치 하였다. 사용된 분석 워크플로우는 4개의 노드, 즉 Spectrum Files (data input), Spectrum Selector (spectrum and feature retrieval), Sequest HT (sequence database search), 및 Percolator (peptide spectral match 또는 PSM Validation 및 FDR analysis)을 포함하였다. 모든 동정된 단백질은 펩타이드 수준에서 계산하여 ≤1%의 FDR (false discovery rate)을 보였다. q-value에 기초하여 평가하였다. 서치 파라미터는, 고정 수식으로서 시스테인의 메틸티오-수식, 및 동적 수식으로서 메티오닌의 산화를 갖는, 최대 2개 미절단의 트립신 특이성을 허용하였다. +1, +2, 및 +3 이온에 대한 질량 서치 파라미터는 전구체 이온에 대해 20 ppm 및 단편 이온 (fragment ion)에 대해 0.6 Da 허용 질량 오차를 포함하였다.

(8) 바이오인포메틱스 (bioinformatics) 분석

DAVID 소프트웨어를 Gene Ontology biological process (GOBP) 및 Gene Ontology cellular component (GOCC)에 대한 기능분석 (functional enrichment analysis)를 위해 사용하였다. 동정된 각 단백질을 제공하고 고정된 값의 파라미터를 사용하여 분석하였다.

(9) 웨스턴블롯팅

상기 각 방법으로부터 얻은 샘플을, 혼합된 SDS 샘플완충액 (Bio-Rad) 및 10% 베타-메르캅토에탄올과 함께 혼합한 다음, 10분 동안 보일링 하였다. SDS-PAGE로 단백질을 분리한 후, Bio-Rad wet transfer system을 사용하여 단백질을 PVDF 멤브레인으로 옮기고, 스킴밀크를 함유하는 PBS-T로 30분간 블로킹한 후, 4℃에서 16시간 동안 인큐베이션 하였다 (도 7 참조). 다음, 멤브레인을 PBS-T로 3회 세척한 후, 블롯을 HRP-컨쥬게이션된 안티-마우스 (horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse) 또는 안티-토끼 항체 (anti-rabbit antibodies)와 함께 인큐베이션 하였다. ImageQuant LAS 4000 (GE Healthcare Life Sciences)를 사용하여 시그널을 검출하였다.

실시예

실시예 1: U118 MG 교모세포종 (glioblastoma cells)으로부터 막단백질의 제조

본 발명자들은 U118 MG 교모세포종로부터의 막단백질을 함유하는 멤브레인 분획을 제조하였다. 200 ㎍의 막단백질을 침전시켜 후속하는 실험을 위한 순수한 막단백질 샘플을 제조하였다. 다음, 같은 양의 막단백질을 포함하도록 샘플을 제조하였다. 본 실시예에서, 최적의 멤브레인 프로테오믹스 방법을 확인하기 위해 5개의 다른 방법을 디자인 하였다 (도 1 참조).

(1-1) 멤브레인 분획으로부터 펩타이드 제조

도 1을 참조하면 제 1 방법에서, 막단백질의 용해를 위해 비이온성 계면활성제 DDM (n-dodecyl-b-D-maltoside)를 사용하였다. 1% DDM에 막단백질을 용해시키고, 인큐베이션 및 소니케이션 처리하였다. 다음, SDS-PAGE 처리한 후, 겔내 분해(in-gel digestion)를 수행하였다. 이어서, Gene Ontology로 스크리닝하여 616개의 막단백질을 포함하여 총 868개의 단백질을 동정하였다. 제 2 방법에서, 1% DDM 용해된 막단백질에 대해 Filter-Aided Sample Preparation (FASP)을 적용한 후 질량석을 하였다. 그 결과로서, 총 12개의 단백질을 동정하였다. 이러한 결과는 비이온성 계면활성제와 FASP 방법을 동시에 사용할 수 없음을 제시한다. 제 3 방법에서, 막단백질을 직접 FASP에 적용하고 질량분석 하였다. 그 결과, Gene Ontology로 스크리닝한 것으로서, 937개의 막단백질을 포함하여 총 1,361개의 단백질을 동정하였다. 제 4 방법에서, 마찬가지로 1% DDM에 단백질을 용해시킨 후 인큐베이션 및 소니케이션을 수행하였다. 샘플을 50 kDa MWCO 필터로 여과한 후, 비이온성 계면활성제로부터 비-특이적인 마이셀 (micelle)을 제거하였다. 여과 후, SDS-PAGE 및 겔내 분해를 수행하였다. 그 결과, Gene Ontology로 스크리닝 한 것으로서, 372개의 막단백질을 포함하여 총 511개의 단백질을 동정하였다. 제 5 방법은 대조를 위한 것으로서, 종래 겔내 분해 프로토콜에 따랐다. 즉, SDS-샘플 완충액으로 막단백질을 직접 용해시키고, SDS-PAGE 및 겔내 분해를 수행하였다. 그 결과, Gene Ontology로 스크리닝한 것으로서, 447개의 막단백질을 포함하여 총 616개의 단백질을 동정하였다.

실시예 2: 비교분석

상기 실시예 1의 5가지 방법의 결과를 비교분석하기 위해, 바이오인포메틱스 분석을 수행하였다. 5가지 방법으로부터 동정된 총 단백질을 비교한 결과, 제 3 방법이 1,361개 단백질로서 가장 많은 수를 나타냈다. 제 1 방법, 제 4 방법 및 제 5 방법은 각각 868, 511 및 616개의 동정된 단백질을 제시하였다 (도 2 참조). 막단백질 동정방법을 평가하기 위해, Gene Ontology에 따른 각각의 질량분석결과로부터 막단백질을 선별하였다. 제 3 방법이 616개의 가장 많은 수의 막단백질을 나타냈다. 제 3 방법, 제 5 방법 및 제 4 방법은 각각 616, 447 및 372개의 막단백질을 나타내었으며, 제 2 방법은 9개 막단백질을 나타냈다 (도 3 참조). 본 발명에서 이용한 각 방법들에 있어서, 전체 동정된 단백질 대비 막단백질의 %는 69% 내지 82% 범위에 해당하였다 (도 4 참조). 제 2 방법의 경우 동정된 단백질 숫자가 미미하여 제외하였다.

수용체 (receptor) 및 트랜스포터 (transporter)은 다양한 세포성 반응에 관여하는 기능성 단백질이다. 본 발명자들은 동정된 단백질로부터 이들 수용체 및 트랜스포터를 분석하였다. 제 1 방법이 17%로서 가장 높은 비율을 나타내었고, 제 3 방법, 제 4 방법 및 제 5 방법이 상대적으로 보다 더 낮은 퍼센트를 나타내었다 (도 5 참조). 추가적인 분석을 위해, 각 동정된 단백질에 대해 웨스턴블롯팅을 수행하였다. 먼저 PSM (peptide spectrum matches)을 사용하여 방법 특이적으로 동정된 단백질 선별하였다. 마찬가지로, 동정된 단백질 숫자가 적은 제 2 방법의 결과는 본 실험에서 제외하였다. 웨스턴블롯팅을 위한 8개의 단백질을 선정하였으며, 이를 도 6에 나타냈다. 웨스턴블롯팅을 수행하기 위해, 본 발명자들은 상기 실시예와 동일한 샘플을 사용하였다. 본 발명자들은 5개 단백질 각각이 질량분석 실험에서와 마찬가지로 뚜렷하게 검출된 것을 확인하였다. Saccharopine dehydrogenase-like oxidoreductase (SCCPDH)는 제 1 방법에서만 동정되었다. H.sapiens ras-related Hrab1A protein (RAB1A) 및 basigin (BSG)은 제 3 방법에서만 동정되었고, RAB1B protein (RAB1B)은 제 4 방법에서만 동정되었으며, ATPase family AAA domain-containing protein 3A (ATAD3A)은 제 5 방법에서만 동정되었다. 도 7은 그 결과를 나타낸다. 상기 결과는, 제 1 방법이 높은 품질의 막단백질 동정에 가장 적합한 것임을 뒷받침한다.

본 발명은 세포막에 포함된 막단백질을 분리 및 동정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 종래 분리 및 분석에 어려움이 있었던 막단백질을 효과적으로 분리하고 분석할 수 있다. 따라서, 본 발명은 막단백질에 관한 연구 및 막단백질을 표적으로 하는 약물 개발에 널리 이용될 수 있다.

Claims

비이온성 계면활성제를 이용한 막단백질 분석 방법으로서,
i) 생체외 분리된 생물학적 시료로부터 멤브레인 분획을 분리하고,
ⅱ) 상기 멤브레인 분획을 비이온성 계면활성제에 용해하며;
ⅲ) 상기 용해된 멤브레인 분획을 SDS-PAGE 수행하고;
ⅳ) 상기 ⅲ)에서 SDS-PAGE 결과물을 겔내 절단 (in-gel digestion) 처리하는 것을 포함하여,
막단백질을 분리하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제는 DDM (n-dodecyl-b-D-maltoside)인 것인, 막단백질을 분리하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 막단백질은 수용체 (receptor), 운반체 (transporter), 또는 둘 모두를 포함하는 것인, 막단백질을 분리하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 SDS-PAGE 수행 전에 상기 용해된 멤브레인 분획을 소니케이션 하는 것을 추가로 포함하는, 막단백질을 분리하는 방법.
제 4항에 있어서, 상기 소니케이션은 10 ~ 20 V의 전압으로 2 ~ 10초간 1 ~ 5회 반복 수행되는 것인, 막단백질을 분리하는 방법.
제 4항에 있어서, 상기 소니케이션 후에 원심분리 하는 것을 추가로 포함하는, 막단백질을 분리하는 방법.
제 6항에 있어서, 상기 원심분리는 40 ~ 60 kDa의 공극 크기 (pore size)를 갖는 멤브레인 필터를 사용하고, 12,000 ~ 16,000 x g에서 40 ~ 80분간 1 ~ 5회 반복 수행하는 것인, 막단백질을 분리하는 방법.