KR20200011439A - 테르미날리아 페르디난디아나 추출물 및 테르미날리아 페르디난디아나 추출물을 함유하는 항균 또는 항박테리아 적용을 위한 제품 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간 또는 동물에서 미생물/박테리아 감염, 바람직하게는 B. 안트라시스 또는 C. 퍼프린젠스 또는 편모충 감염의 치료에 사용하기 위한 항균제 또는 항박테리아제로서 테르미날리아 페르디난디아나 (T. ferdinandiana)의 추출물을 포함하는 조성물 또는 약제를 제공한다. 추출물은 T. 페르디난디아나 잎 추출물일 수 있거나 또는 포함할 수 있다. 추출물은 적어도 하나의 항산화제, 예를 들어 엘라그산 또는 트리메틸 엘라그산을 포함할 수 있으며, 적어도 하나의 탄닌 및/또는 적어도 하나의 플라본 및/또는 케불산, 코릴라겐, 케불린산 또는 케불라그산 및/또는 적어도 하나의 플라본 또는 플라보노이드를 포함할 수 있다.

Description

테르미날리아 페르디난디아나 추출물 및 테르미날리아 페르디난디아나 추출물을 함유하는 항균 또는 항박테리아 적용을 위한 제품

본 발명은 테르미날리아 페르디난디아나 (Terminalia ferdinandiana; T. ferdinandiana)의 천연 추출물 및/또는 유도체에 관한 것이다.

특히, 본 발명은 전적으로는 아니지만, 테르미날리아 페르디난디아나 잎의 천연 추출물 및/또는 유도체를 이용한다.

본 발명은 인간 및 동물에서 감염 치료용 항박테리아 또는 항균 제품 또는 용도에 적용된다.

이하, 테르미날리아 페르디난디아나는 쉽게 참조할 수 있도록 T. 페르디난디아나라고 할 수 있다.

T. 페르디난디아나는 일반적으로 북부 특별지구 및 서부 호주(Northern Territory and Western Australia)에 있는 호주의 북부 지역의 아열대 삼림 지대에 광범위하게 야생 성장하는 작은 낙엽수(deciduous tree)이다.

T. 페르디난디아나는 작은 자두와 같은 과일의 풍부한 농작물을 맺는다. 과일은 매우 높은 비타민 C 함량을 갖는 것으로 알려져 있으며, 항산화제, 엽산 및 철분의 공급원이다. 과일 및 과일 추출물은 식품, 식이 보충제(dietary supplements) 및 의약품에 사용된다.

T. 페르디난디아나 과일의 가장 일반적인 용도는 미식가 잼, 소스, 주스, 아이스크림, 화장품, 향료 및 의약품을 위한 것이다.

T. 페르디난디아나 과일 추출물의 화장용 비히클의 예는 유럽 특허 문헌 EP 1581513에 제안되었다. 다른 특허 문헌 US 7175862는 T. 페르디난디아나 식물의 과일로부터 아스코르브산 (비타민 C), 항산화제 및 식물화학물질(phytochemicals)을 함유하는 분말의 제조 방법을 개시하고 있다. US 7175862는 인체에서 자유 라디칼의 감소를 위해 분말화된 T. 페르디난디아나 과일의 용도를 언급한다.

또한, T. 페르디난디아나 과일은 항균 특성을 갖는 것으로 알려져 있다. 호주 북부의 천연 과일로서, 이 과일은 식품 및 약제로 호주 원주민들에 의해 오랫동안 사용되어 왔다. 이 과일은 고영양 식품의 공급원으로 호주 원주민들에 의해 긴 사냥 여행 동안 먹었다. T. 페르디난디아나의 의학적 특성은 잘 이해되지 않았거나 또는 완전히 평가되지 않았다.

T. 페르디난디아나 과육(fruit pulp)의 항균 특성의 평가에 관한 I. E. Cock 및 S. Mohanty의 연구는 Pharmacgnosy Journal 2011 [vol 3 | issue 20]에 발표되었다. 이 연구는 T. 페르디난디아나 과육의 박테리아 성장 저해 가능성에 초점을 맞추었으며, T. 페르디난디아나 과일의 다른 의학적으로 중요한 생체활성을 조사하기 위해 추가 연구가 필요하다는 것을 인식하였다.

과일의 성장 저해 활성이 보고되었음에도 불구하고, 수많은 병원균 (pathogens)은 그들의 성장을 저해하는 능력에 대해 아직 평가되지 않았다.

특히, T. 페르디난디아나의 잎 추출물의 항균 특성은 실현되지 않은 채 남아있다.

많은 박테리아는 인간 및 동물을 감염시킬 수 있다. 클로스트리듐 퍼프린젠스(Clostridium perfringens)와 같은 일부 박테리아는 혐기성 활성이다. 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis)와 같은 기타 박테리아는 호기성 또는 혐기성 활성이다.

클로스트리듐 퍼프린젠스는 근육 조직에 특이적인 괴사성 손상의 질병인, 근괴사증(myonecrosis)을 야기한다. C. 퍼프린젠스 또는 무수한 토양-매개 혐기성 박테리아에 감염된 경우가 종종 있다. 박테리아는 특정 외독소에 의해 근괴사증을 야기한다. 이러한 미생물은 기회감염적(opportunistic)이며, 일반적으로 상당한 피부 손상을 통해 신체에 들어간다. 토양-매개 박테리아에 의한 괴저성 감염(Gangrenous infection)은 비-멸균 현장 수술 및 심각한 발사체 상처(projectile wounds) 관리의 기본 특성 때문에, 20세기까지 병사들의 전투 부상에서 흔하게 발생하였다.

클로스트리듐 퍼프린젠스 (C. 퍼프린젠스)는 내생포자-형성(endospore-forming), 그람-양성 박테리아 및 클로스트리듐 근괴사증 및 괴사성 장염 (enteritis necroticans)을 포함하는 다양한 질환의 병인체(etiological agent)이다.

C. 퍼프린젠스 박테리아는 (비록 내기성(aero-tolerant)이지만) 엄격하게 혐기성으로 성장하며, 천연 미생물 무리(natural microbial flora)의 일부로 환경에서 어디에서나 발견된다. 박테리아는 종종 인간 및 다른 척추 동물의 소화관에도 존재한다.

가혹한 환경 주변과 같은 스트레스 하에서 또는 필요한 영양소가 부족한 경우, C. 퍼프린젠스는 조건이 다시 한번 세포 증식에 유리할 때까지 방어 기전으로서 대사적으로 휴면 상태에 놓이는 내생포자를 생성할 수 있다.

C. 퍼프린젠스 박테리아의 환경 건전성(environmental robustness)은 중요한 임상적 의미를 가지며, 무산소 조건 하에서 광범위한 질환의 원인이 되고, 그 중 일부는 매우 치명적이다.

클로스트리듐 근괴사증 (또는 가스 괴저(gas gangrene))는 여러 외독소-생성 클로스트리듐 종에 의해 야기된 골격근의 급속히 진행되는 매우 치명적인 감염이다. 클로스트리듐 속 (C. 셉티쿰(septicum), C. 히스토리티쿰(histolyticum) 또는 C. 노비이(novyi) 포함) 내의 여러 종에 의해 야기되지만, 가스 괴저의 주된 원인은 C. 퍼프린젠스를 통해 발생하며, 이는 문서화된 사례의 가장 큰 비율 (이러한 사례의 80% 내지 90%)에서 원인 물질(causative agent)이 되는 것으로 추정된다.

C. 퍼프린젠스 박테리아는 혐기성 조건에 의존하므로, 감염은 주로 외상 또는 수술 후 깊은 조직에서 발생한다. 이후에, 관련 외독소가 생성되고, 이들은 주변 조직을 괴사시켜 근육 분해를 야기한다. 신속한 치료가 시행되지 않는 한, 이후 증상은 급성 신부전, 쇼크, 혼수 상태 및 궁극적으로 사망을 포함할 수 있다.

C. 퍼프린젠스 유도 가스 괴저의 치료에서 현재의 전략은 항생제 요법 및 침습성 외과적 변연절제술(aggressive surgical debridement)의 조합을 포함한다.

신속한 치료 없이는 가스 괴저가 매우 치명적이므로, 숙주 사망의 가능성을 감소시키기 위해 괴사된 조직의 제거가 종종 필요하다. 최근에는 효과적인 백신 생산에 중점을 두고 있으나, 이는 치료 요법보다 예방 조치로 여겨지므로 일단 감염이 시작되면 아무 소용이 없다. 또한, 병원균의 산발적, 기회감염적 특성으로 인해 예방 접종을 받아야 하는 사람을 예측하기가 어려워진다.

따라서, 가스 괴저의 주된 치료 방법은 현재 감염이 감지되자마자 페니실린 및 클린다마이신의 조합의 투여를 포함한다. 박테리아가 항생제에 비교적 취약한 상태로 남아있지만, 항생제 내성 C. 퍼프린젠스에 대한 보고가 나왔으므로 가스 괴저의 치료를 위한 대안적인 화학요법 방안을 발견하고 개발할 필요성이 계속 증가하고 있다.

인수공통감염(Zoonotic infections)은 인간과 동물 사이에 간접적으로 또는 직접적으로 전염될 수 있는 질환이며 건강과 경제적 관점 모두에서 중대한 부담이다. 이러한 질환은 길들여진 동물 및 야생 동물로부터 인간에게 퍼질 수 있으며, 직접 접촉, 동물 분비물에 의한 식수의 오염 또는 오염된 육류 제품의 소비를 통해 전염될 수 있다. 전통적으로 집단 면역(herd immunity) 및 감염된 개체의 격리의 효과적인 전략이 실현 가능하지 않기 때문에, 이러한 질환은 감염의 조절 및 치료에 특별한 문제를 제기한다.

또한, 구별할 수 없는 증상을 말로 표현할 수 있는 인간과는 달리, 감염된 동물은 눈에 띄지 않고 질환의 확산에 더 기여할 수 있다. 1940년부터 2004년까지, 모든 신종 감염성 질환의 약 60%가 야생 동물에서 유래한 대다수의 인수 특성인 것으로 생각된다. 따라서, 종간 치료의 개발은 인수공통감염병(zoonotic diseases)의 효과적인 조절 및 박멸에 핵심적인 역할을 한다.

예를 들어, 탄저균(anthrax)의 병인체인 바실러스 안트라시스 (B. anthracis)는 토양에서 주로 발견되는 포자형성(sporulating) 그람-양성 박테리아이다. 바실러스 속 내의 다른 유기체와 유사하게, B. 안트라시스는 조건이 다시 성장에 유리할 때까지 몇년 동안 휴면 상태를 유지할 수 있는 내생포자를 생성할 수 있다. 이러한 포자는 대사적으로 비활성이며, 온도, 건조 및 효소 파괴를 포함하여 영양 세포(vegetative cells)를 사멸시킬 환경 조건에서 생존할 수 있다.

인간 탄저병의 4가지 형태는 인체로의 입문을 기반으로 인식된다: 1. 가장 흔한 형태인 피부 (95%)는 국소적, 염증성, 검은색의 괴사성 병변 (괴사딱지 (eschar))을 야기한다; 2. 드물지만 매우 치명적인 형태의 흡입은 독감과 같은 증상, 흉부 불편(chest discomfort), 발한(diaphoresis) 및 몸살(body aches)을 특징으로 한다; 3. 드물지만 치명적인 (25% 사멸 야기함) 유형의 위장관은 탄저균 포자의 섭취에 기인한다. 증상으로는 열과 오한, 목의 붓기, 고통스러운 삼키기, 쉰 목소리(hoarseness), 구역질 및 구토 (특히, 혈액 구토), 설사, 홍조 및 충혈된 눈 (red eyes), 복부 팽만(swelling of abdomen)을 포함한다; 4. 주사, 증상은 피부 탄저병의 증상과 유사하나, 주사 탄저병은 피부 탄저병에 비해 신체 전체에 더 빨리 퍼져서 인식하고 치료하기가 더 어려울 수 있다.

식물성 B. 안트라시스 세포는 질환과 관련된 독소를 생성하지만, 감염은 일반적으로 포자가 흡입, 섭취 또는 열린 상처(open wounds)와의 직접적인 접촉을 통해 숙주에 도입될 때 개시된다. 일단 내면화되면, 포자는 생존 세포로 되돌아 가서 증식하고 치명적인 탄저균 독소를 생산하기 시작한다.

이 질환은 주의깊은 관찰 및 강력한 박멸 조치를 통해 국제적으로 다양한 수준으로 조절되었다. 그러나, 탄저병은 전 세계적으로 풍토병(endemic)이며, 감염이 발생하면 종종 치명적이다.

탄저병 치료의 현재 전략은 일반적으로 감염과 싸우기 위한 항생제 요법 및 관련 증상을 관리하기 위한 지지 요법의 조합을 포함한다.

정맥 또는 경구 항생제의 투여는 일반적으로 탄저병 관리에 효과적이나, 박테리아가 약물 내성을 일으킬 수 있는 내재적 위험(inherent risk)이 항상 존재한다. 따라서, 새로운 화합물의 설계 및 합성을 통해, 또는 기존의(pre-existing) 천연 자산 내의 항균제의 조사를 통해, 신약(new drugs)의 발견은 매우 중요하다.

편모충증(Giardiasis)은 전 세계의 인간과 가축에서 전염성 설사의 주요 원인이다. 편모충증은 편모충(Giardia) 속의 원생동물 기생충(protozoal parasites)의 위장 감염에 의해 야기된다. 이 질환의 화학요법 치료에 이용할 수 있는 약물의 범위는 제한되어 있으며, 이들은 임상 진단 후에만 사용되고 예방에는 사용되지 않는다.

이러한 약물의 대부분은 편모충 원생동물의 일부 생애 주기(life stages)에 대해 비효과적이며, 독성이 있고, 불쾌한 부작용이 있으며, 개발 도상국에서 이용이 제한될 수 있다. 치료 실패 및 기생충 저항성은 더 큰 효능 및 덜 심각한 부작용을 갖는 편모충증에 대해 새로운 화학요법 치료의 개발의 중요성을 강조한다.

천연 식물 유래 화합물을 이용한 편모충증의 치료는, 식물의 약효(medicinal qualities)가 매우 효과적일 수 있기 때문에 매력적인 전망이다.

약용 식물의 항균 효과는 활성 화합물을 동정하고, 편모충증의 치료를 위한 새로운 항균제 및 항-B. 안트라시스 제제의 개발의 가능성을 제공하기 위해, 많은 배양물 및 식물화학물질 분석에 의해 오랫동안 인식되어 왔다.

따라서, 천연 자산의 개발은 질환 유발 미생물, 예를 들어 탄저병, 편모충증 또는 클로스트리듐(clostridium)을 야기하는 박테리아를 관리하는데 효과적인 화합물의 발견에 큰 가능성을 제공한다.

상기 언급된 박테리아 및 박테리아 감염을 염두에 두고 본 발명을 개발하였다.

본 발명의 하나 이상의 형태에 따른 T. 페르디난디아나 과일 및 잎 추출물을 평가하는 방법/시험은, T. 페르디난디아나 잎 추출물을 함유하는 제품이 박테리아, 예를 들어 그람-양성 혐기성 박테리아 클로스트리듐 퍼프린젠스 (C. 퍼프린젠스) 또는 바실러스 안트라시스 (B. 안트라시스)는 또는 람블 편모충(Giardia duodenalis)과 같은 편모충(Giardia) 속과 같은 미생물의 성장을 저해하는데 효과적이라는 것을 알았다.

본 발명의 일 측면은 인간 또는 동물에서 미생물 또는 박테리아 감염의 치료용 약제에 사용하기 위한 테르미날리아 페르디난디아나(T. ferdinandiana)의 추출물을 제공한다.

본 발명의 다른 측면은 테르미날리아 페르디난디아나(T. ferdinandiana)의 추출물을 포함하는 약제를 제공한다.

바람직하게는, 추출물은 T. 페르디난디아나 잎 추출물을 포함한다.

본 발명의 또 다른 측면은 인간 또는 동물에서 미생물 또는 박테리아 감염의 치료용 약제에 사용하기 위한 조성물을 제공하며, 상기 약제는 항박테리아제로서 테르미날리아 페르디난디아나(T. ferdinandiana) 잎으로부터 유래된 추출물을 함유한다.

약제 또는 조성물은 하나 이상의 알약, 정제, 캡슐 또는 액체 형태로 사용하기 위해 제공될 수 있다.

약제는 T. 페르디난디아나 잎 추출물 이외에 T. 페르디난디아나 과일 추출물을 포함할 수 있다.

바람직하게는, T. 페르디난디아나 잎 추출물은 메탄올/에탄올 추출물, 수성 추출물, 에틸아세테이트 추출물, 클로로포름 추출물 또는 헥산 추출물 중 하나 이상을 포함한다.

T. 페르디난디아나 잎 추출물은 적어도 하나의 항산화제의 부분을 포함할 수 있다.

적어도 하나의 항산화제는 엘라그산 또는 트리메틸 엘라그산 중 하나 이상을 포함할 수 있다.

추출물, 약제 또는 조성물은 인간 또는 동물에서 박테리아 감염 치료용 항균제로서 제공된다.

바람직하게는, 추출물, 약제 또는 조성물은 T. 페르디난디아나 잎 추출물을 포함하는, 알약 형태, 캡슐 형태, 또는 액체로 제공된다.

추출물, 약제 또는 조성물은 적어도 하나의 탄닌 및/또는 적어도 하나의 플라본을 포함할 수 있다.

추출물, 약제 또는 조성물은 케불산(chebulic acid), 코릴라겐(corilagen), 케불린산(chebulinic acid) 및 케불라그산(chebulagic acid) 중 하나 또는 둘 이상의 조합을 포함할 수 있다.

추출물, 약제 또는 조성물은 적어도 하나의 플라본 또는 플라보노이드를 포함할 수 있다.

추출물, 약제 또는 조성물은 하나 이상의 항산화제를 포함할 수 있다. 적어도 하나의 항산화제는 엘라그산을 포함할 수 있다. 엘라그산은 엘라그산 이수화물 및/또는 트리메틸 엘라그산을 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 테르미날리아 페르디난디아나 (T. 페르디난디아나) 잎으로부터 유래된 추출물을 함유하는 항균 조성물을 제공한다.

바람직하게는, 추출물 또는 약제는 인간 또는 동물에서 B. 안트라시스 또는 C. 퍼프린젠스 또는 편모충 감염의 치료용 약제에 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면은 인간 또는 동물에서 미생물 또는 박테리아 감염 치료용 약제 또는 조성물의 제조에서 테르미날리아 페르디난디아나 (T. ferdinandiana)의 추출물의 용도를 제공한다. 상기 용도는 T. 페르디난디아나 잎 추출물을 포함하는 추출물을 포함할 수 있다.

이하, 첨부 도면 및 표를 참조하여 본 발명의 하나 이상의 실시예를 기재할 것이다:
도 1은 저해 구역 (mm)으로서 측정된 C. 퍼프린젠스 환경 분리주에 대한 T. 페르디난디아나 과일 및 잎 식물 추출물의 성장 저해 활성의 도표를 나타낸다.
도 2는 24시간 노출 후 아르테미아 프란시스카나 나우플리이 (Artemia franciscana nauplii)에 대한 호주 식물 추출물 (2000 μg/mL) 및 중크롬산칼륨 (potassium dichromate) 대조군 (1000 μg/mL)의 치사율의 도표를 나타낸다.
도 3은 T. 페르디난디아나 잎 메탄올 추출물의 2 μl 주입의 총 화합물 크로마토그램 (TCC)의 양이온 RP-HPLC (도 3a) 및 음이온 RP-HPLC (도 3b)를 나타낸다.
도 4는 T. 페르디난디아나 잎 에틸아세테이트 추출물의 2 μl 주입의 총 화합물 크로마토그램 (TCC)의 양이온 RP-HPLC (도 4a) 및 음이온 RP-HPLC (도 4b)를 나타낸다.
도 5는 메탄올 및/또는 에틸아세테이트 추출물에서 검출된 T. 페르디난디아나 잎 탄닌 화합물의 화학 구조를 나타낸다: (a) 케불산; (b) 프로토카테큐산 (protocatechuic acid); (c) 엘라그산 이수화물; (d) 푸니칼라긴(punicalagin); (e) 엘라그산; (f) 케불라그산(chebulagic acid); (g) 카스탈라긴(castalagin); (h) 코릴라겐; (i) 푸니칼린(punicalin); (j) 케불린산; (k) 푸니칼린 (punicalin); (l-m) 트리메틸 엘라그산 이성질체.
도 6은 저해 구역 (mm)으로서 측정된 B. 안트라시스 환경 분리주에 대한 T. 페르디난디아나 식물 추출물의 성장 저해 활성의 도표를 나타낸다. FW = T. 페르디난디아나 과일 수성 추출물; FM = T. 페르디난디아나 과일 메탄올 추출물; FC = T. 페르디난디아나 과일 클로로포름 추출물; FH = T. 페르디난디아나 과일 헥산 추출물; FE = T. 페르디난디아나 과일 에틸아세테이트 추출물; LW = T. 페르디난디아나 잎 수성 추출물; LM = T. 페르디난디아나 잎 메탄올 추출물; LC = T. 페르디난디아나 잎 클로로포름 추출물; LH = T. 페르디난디아나 잎 헥산 추출물; LE = T. 페르디난디아나 잎 에틸아세테이트 추출물; PC = 페니실린 (2 μg); AMP = 암피실린 (10 μg). 결과는 평균 저해 구역 ± SEM으로 나타낸다.
도 7은 24시간 노출 후 아르테미아 프란시스카나 나우플리이에 대한 T. 페르디난디아나 과일 및 잎 식물 추출물 (2000 μg/mL) 및 중크롬산칼륨 대조군 (1000 μg/mL)의 치사율의 도표를 나타낸다. FW = T. 페르디난디아나 과일 수성 추출물; FM = T. 페르디난디아나 과일 메탄올 추출물; FC = T. 페르디난디아나 과일 클로로포름 추출물; FH = T. 페르디난디아나 과일 헥산 추출물; FE = T. 페르디난디아나 과일 에틸아세테이트 추출물; LW = T. 페르디난디아나 잎 수성 추출물; LM = T. 페르디난디아나 잎 메탄올 추출물; LC = T. 페르디난디아나 잎 클로로포름 추출물; LH = T. 페르디난디아나 잎 헥산 추출물; LE = T. 페르디난디아나 잎 에틸아세테이트 추출물; PC = 중크롬산칼륨 대조군; SW = 해수 대조군. 결과는 평균 % 사망률 ± SEM으로 나타낸다.
도 8은 T. 페르디난디아나 과일 에틸아세테이트 추출물의 0.5μL 주입의 헤드 스페이스 기체 크로마토그램을 나타내는 도표를 나타낸다. 추출물을 건조시키고 분석을 위해 메탄올에 재현탁시켰다.
도 9는 T. 페르디난디아나 잎 메탄올 추출물의 0.5μL 주입의 헤드 스페이스 기체 크로마토그램을 나타내는 도표를 나타낸다. 추출물을 건조시키고 분석을 위해 메탄올에 재현탁시켰다.
도 10a 내지 10n은 잎 및 과일 추출물에 존재하는 화합물의 예, 예를 들어 하나 이상의 퓨란 및/또는 탄닌을 나타낸다.
도 11a 내지 11k는 본 발명의 적어도 하나의 실시예에 따른 항-편모충 활성과 일치하는 특성을 갖는 T. 페르디난디아나 잎에 존재하는 화합물의 예를 나타낸다.
도 12는 미처리 대조군의 백분율로 측정된 람블 편모충 영양형 (Giardia duodenalis trophozoites)의 3개의 균주에 대한 T. 페르디난디아나 추출물 및 순수한 화합물의 저해 활성을 나타낸다.
도 13a 내지 13c은 (a) 양 S2, (b) 기준 메트로니다졸 민감성 (ATCC203333) 및 (c) 기준 메트로니다졸 내성 (ATCC PRA-251) 람블 편모충(G. duodenalis) 균주에 대해 다양한 비로 시험된 갈산 및 아스코르브산의 조합에 대한 이소볼로그램을 나타낸다.
도 14a 내지 14c는 성장 저해 활성 및 DPGA 축 사이의 연관성의 이소볼로그램을 나타낸다.

본 발명의 하나 이상의 실시예에 대한 T. 페르디난디아나의 추출물(들) 및/또는 유도체를 얻는 하나 이상의 방법이 이후에 기재될 것이다. 그러나, 본 발명의 일반성은 하기의 구체적인 설명의 특정 범위에 의해 제한되지 않아야한다는 것을 이해하고 인식해야 한다.

T. 페르디난디아나의 과일 및 잎을 이용하여 용매 추출물 및 수성 추출물을 제조하였다.

클로스트리듐 퍼프린젠스 (C. 퍼프린젠스)

C. 퍼프린젠스의 임상 균주에 대한 디스크 확산 분석에 의해, T. 페르디난디아나 과일 및 잎의 용매 추출물 및 수성 추출물을 성장 저해 활성에 대해 조사하였다.

이들의 최소 저해 농도 (MIC) 값은 이들의 효능을 정량화하고 비교하기 위해 측정되었다.

아르테미아 프란시스카나 나우플리이 생물검정을 이용하여 독성을 측정하였다. 조(crude) T. 페르디난디아나 과일 및 잎 추출물에서 개별 성분의 동정 및 특성을 위해, 비-표적화 고성능 액체 크로마토그래피 - 사중극자 비행 시간형 (High Performance Liquid Chromatography - Quadrupole Time-of-Flight; HPLC-QTOF) 질량 분석법 (3개의 화합물 데이터베이스에 대한 스크리닝)에 의해 활성 추출물을 분석하였다.

T. 페르디난디아나 과일 및 잎의 메탄올 추출물 및 수성 추출물, 및 잎 에틸아세테이트 추출물은 C. 퍼프린젠스에 대한 디스크 확산 분석에서 성장 저해 활성을 나타내었다.

과일 수성 추출물이 잎 수성 추출물보다 실질적으로 더 큰 효능을 가졌지만, 잎 추출물은 일반적으로 상응하는 과일 추출물보다 더 강력한 성장 저해제였다.

잎의 메탄올 추출물 및 에틸아세테이트 추출물은 각각 206 및 117 μg/ml의 MIC 값으로 강력한 성장 저해제였다.

또한, 과일 메탄올 추출물은 716 μg/ml의 MIC로 우수한 효능을 나타내었다.

대조적으로, 과일 및 잎 둘 다의 클로로포름 추출물 및 헥산 추출물은 성장 저해 활성이 완전히 없었다.

모든 T. 페르디난디아나 추출물은 아르테미아 프란시스카나 생물검정에서 무독성이거나 또는 독성이 낮았다. 잎의 메탄올 추출물 및 에틸아세테이트 추출물의 비-편재된 식물화학물질 분석은 높은 상대 수준의 다양한 갈로- 및 엘라지- 탄닌의 존재를 나타내었다.

T. 페르디난디아나 추출물의 낮은 독성 및 C. 퍼프린젠스에 대한 잎 메탄올 및 에틸아세테이트 추출물의 강력한 성장 저해 생체활성은 클로스트리듐 근괴사증 및 괴사성 장염의 치료 및 예방에서 약제로서 이들의 가능성을 나타낸다. 대사체학 프로파일링(Metabolomic profiling) 연구는 이러한 추출물이 다양한 탄닌을 함유함을 나타낸다.

식물 공급원 및 추출: T. 페르디난디아나 과일, 잎 및 과육을 얻었다. 과육을 운송 전에 동결하고, 가공될 때까지 -10℃로 유지시켰다. 잎을 탈수기에서 광범위하게 탈수시키고, 건조된 물질을 -30℃에서 저장하였다. 과일 및 잎 물질을 완전히 건조시키고, 사용 전에 거친 분말로 분쇄하였다. 1g의 분쇄된 분말을 50 mL의 탈이온수, 메탄올, 클로로포름, 헥산 또는 에틸아세테이트에서 부드럽게 흔들면서 4℃에서 24시간 동안 광범위하게 추출하였다. 추출물을 여과지 (Whatman No. 54)를 통해 여과하고, 실온에서 공기 건조시켰다. 수성 추출물을 농축기에서 회전 증발에 의해 동결건조시켰다. 결과로 생성된 펠렛을 (0.5% DMSO를 함유하는) 탈이온수 10 mL에 용해시켰다. 추출물을 0.22 μm 여과기 (Sarstedt)를 통과시키고, 사용 시까지 4℃에서 저장하였다.

정성 식물화학물질 연구(Qualitative phytochemical studies): 트리테르페노이드, 탄닌, 사포닌, 피토스테로이드, 페놀성 화합물, 플라보노이드, 강심 배당체 (cardiac glycosides), 안트라퀴논 및 알칼로이드의 존재에 대한 추출물의 식물화학물질 분석을 이전에 기재된 분석에 의해 수행하였다.

항산화능(Antioxidant capacity): 각 시료의 항산화능은 변형된 2,2-디페닐-1-피크릴히드라질 (DPPH) 자유 라디칼 소거 방법을 이용하여 평가하였다. 아스코르브산 (웰당 0-25 μg)을 기준으로 사용하였고, 흡광도를 515 nm에서 측정하고 기록하였다. 모든 시험은 각 플레이트에서 대조군과 함께 완료하였고, 모두 3회 수행하였다. DPPH 자유 라디칼 소거능에 기초한 항산화능은 각 추출물에 대해 측정하였고, 추출된 원래의 식물 물질의 그램 당 μg 아스코르브산 당량으로 나타내었다.

항박테리아 스크리닝(Antibacterial screening): 임상 클로스트리듐 퍼프린젠스 스크리닝: C. 퍼프린젠스의 임상 균주를 얻었다.

항균 활성의 평가: 모든 T. 페르디난디아나의 과일 및 잎 식물 추출물의 항균 활성을 변형된 디스크 확산 분석을 이용하여 평가하였다. 간략하게, 100 μL의 C. 퍼프린젠스를 ~10⁸ 세포/mL의 계수에 도달할 때까지 10 mL의 신선한 티오글리콜레이트 배지에서 성장시켰다. 100μL의 박테리아 현탁액을 영양 한천 플레이트 상에 도말하고, 6 mm 멸균된 여과지 디스크를 이용하여 항박테리아 활성에 대해 추출물을 시험하였다. 디스크에 10 μL의 T. 페르디난디아나 추출물을 주입하고, 건조시킨 다음, 접종된 플레이트 상에 놓았다. 플레이트를 4℃에서 2시간 동안 방치한 후, 30℃에서 24시간 동안 배양하였다. 저해 구역의 직경은 가장 가까운 전체 밀리미터로 측정되었다. 각 분석은 적어도 3회 수행하였다. 평균값 (± SEM)은 본 연구에서 기록된다. 페니실린 (2μg) 및 암피실린 (10 μg)의 표준 디스크를 얻었고, 항박테리아 활성을 비교하기 위한 양성 대조군으로 사용하였다. 10 μL의 증류수로 주입된 여과기 디스크를 음성 대조군으로 사용하였다.

최소 저해 농도 (MIC) 측정: 추출물의 최소 저해 농도는 상기 기재된 대로 측정하였다. 간략하게, T. 페르디난디아나 과일 및 잎 식물 추출물을 탈이온수에 희석시키고, 다양한 농도에서 시험하였다. 디스크에 10 μL의 추출물 희석액을 주입하고, 건조시킨 다음, 접종된 플레이트 상에 놓았다. 상술한 바와 같이 분석을 수행하고, 저해 구역 대 농도의 그래프를 플롯팅하였다. 선형 회귀를 사용하여 MIC 값을 결정하였다.

독성 스크리닝: 독성 스크리닝을 위한 기준 독소: 중크롬산칼륨 (K₂Cr₂O₇)을 증류수 (4mg/mL)에서 제조하고, 아르테미아 프란시스카나 나우플리이 생물검정에 사용하기 위해 인공 해수에 연속 희석하였다.

아르테미아 프란시스카나 나우플리이 독성 스크리닝

변형된 아르테미아 프란시스카나 나우플리이 치사율 분석을 이용하여 독성을 시험하였다. 간략하게, ~ 43 (평균 43.2, n = 155, SD 14.5) A. 프란시스카나 나우플리이를 함유하는 해수 400 μL를 48 웰 플레이트의 웰에 첨가하고, 생물검정에 즉시 사용하였다. 400 μL의 기준 독소 또는 희석된 식물 추출물을 웰로 옮기고, 인공 조명 (1000 Lux) 하에 25 ± 1 ℃에서 배양하였다. 각 플레이트에 대해, 음성 대조군 (400 μL의 해수)을 3회 실행하였다. 모든 처리는 적어도 3회 수행하였다. 웰을 일정한 간격으로 확인하고, 죽은 수를 계수하였다. 10초 이내에 부속물 (appendages)의 움직임이 감지되지 않으면 나우플리이는 죽은 것으로 간주되었다. 24시간 후, 모든 나우플리이를 희생시키고 계수하여 웰당 총 % 사망률을 결정하였다. 각 처리군에 대해 95% 신뢰 한계(confidence limits)를 갖는 LC₅₀를 프로빗 분석(probit analysis)을 이용하여 계산하였다.

비-표적화 HPLC-MS QTOF 분석: 크로마토그래피 분리를 위해, 2 μL의 시료를 컬럼 (2.1 x 100 mm, 1.8 μm 입자 크기)이 장착된 HPLC 시스템에 주입하였다. 이동상은 0.7 mL/min의 유속에서 (A) 초순수 및 (B) 95:5 아세토니트릴/물로 구성되어 있다. 두 이동상은 양성 모드에서 질량 분석을 위해 0.1% (v/v) 빙초산으로, 및 음성 모드에서 분석을 위해 5 mM 암모늄 아세테이트로 변형시켰다. 연구에 이용된 크로마토그래피 조건은 5% B에서 등용매적으로 첫 5분 실행으로 구성되었고, 5% 내지 100%의 (B)의 구배를 5분 내지 30분에 적용한 후, 100%에서 등용매적으로 3분 적용하였다. 양성 및 음성 모드 둘 다에서 전기분무 이온화 공급원이 장착된 사중 극자 비행 시간형 분광계(quadrapole time-of-flight spectrometer; QTOF MS)에서 질량 분석법 분석을 수행하였다.

알려진 정성 분석 소프트웨어를 이용하여 자료를 분석하였다. 각각의 용매 추출 시스템을 이용한 블랭크를 소프트웨어 패키지에서 '분자 특징 찾기' 알고리즘을 이용하여 분석하여 10,000 이상 계수의 양을 갖는 분자의 화합물 목록을 생성하였다. 그 다음, 이것을 제외 목록으로 사용하여 추출물 분석에서 배경 오염 물질을 제거하였다. 그 다음, '분자 특징 찾기' 기능을 이용하여 동일한 매개변수를 이용하여 각 추출물을 분석하여 추출물에서 추정적 화합물 목록을 생성하였다. 그 다음, 화합물 목록을 3가지 정확한 질량 데이터베이스에 대해 스크리닝하였다: 본 연구를 위해 구체적으로 생성된 치료적 중요성을 갖는 알려진 식물 화합물의 데이터베이스 (800개의 화합물); 알려진 대사체학 데이터베이스 (24,768개의 화합물); 및 알려진 법독성학 데이터베이스(Forensic Toxicology Database) (7,509개의 화합물). 미동정 화합물의 실험식은 소프트웨어 패키지에서 화학식 찾기 기능을 이용하여 결정되었다.

통계 분석: 자료는 적어도 3회의 독립 실험의 평균 ± SEM으로 나타낸다.

액체 추출 수율 및 정성 식물화학물질 스크리닝

다양한 용매를 이용한 T. 페르디난디아나 식물 추출 (1 g)은 18 mg 내지 483 mg (과일 추출물) 및 58 mg 내지 471 mg (잎 추출물) 범위의 건조된 식물 추출물을 얻었다 (표 1 참조).

[표 1]

T. 페르디난디아나 추출물의 건조된 추출된 물질의 질량, 탈이온수에서 재현탁 후 농도, 정성 식물화학물질 스크리닝 및 항산화능

상기 표 1에서, +++는 큰 반응을 나타내고; ++는 중간 반응을 나타내며; +는 작은 반응을 나타내고; -는 분석에서 반응이 없음을 나타낸다. KFW = T. 페르디난디아나 과일 수성 추출물; KFM = T. 페르디난디아나 과일 메탄올 추출물; KFC = T. 페르디난디아나 과일 클로로포름 추출물; KFH = T. 페르디난디아나 과일 헥산 추출물; KFE = T. 페르디난디아나 과일 에틸아세테이트 추출물; KLW = T. 페르디난디아나 잎 수성 추출물; KLM = T. 페르디난디아나 잎 메탄올 추출물; KLC = T. 페르디난디아나 잎 클로로포름 추출물; KLH = T. 페르디난디아나 잎 헥산 추출물; KLE = T. 페르디난디아나 잎 에틸아세테이트 추출물. 항산화능은 DPPH 환원으로 측정되었고, 추출된 식물 물질 (g) 당 아스코르브 산 (mg) 당량으로 나타내었다.

수성 및 메탄올 추출물은, 낮거나 중간(low to moderate) 정도의 수율을 제공하는 클로로포름, 에틸아세테이트 및 헥산 대응물에 비해 상당히 더 큰 수율의 추출된 물질을 제공하였다. 건조된 추출물을 10 mL의 탈이온수 (1% DMSO 함유)에 재현탁시켜, 표 1에 제시된 농도를 나타내었다.

항산화제 함량: 식물 추출물에 대한 항산화능 (표 1)은 추출된 건조된 식물 물질 (과일 메탄올 추출물) 그램 당 0.4 mg (잎 헥산 추출물) 내지 660 mg의 아스코르브산 당량의 범위였다. 수성 및 메탄올 추출물은 일반적으로 상응하는 클로로포름, 헥산 및 에틸아세테이트 추출물보다 높은 항산화능을 가졌다.

항균 활성: C. 퍼프린젠스 성장을 저해하는 과일 및 잎의 조 추출물의 능력을 결정하기 위하여, 디스크 확산 분석을 이용하여 10 μL의 각 추출물을 스크리닝하였다.

도 1의 도표에 나타난 바와 같이, 스크리닝된 10개의 추출물 중 5개의 추출물에 의해 박테리아 성장이 강하게 저해되었다 (50%).

16 ± 0.6 mm의 저해 구역을 갖는 잎의 메탄올 추출물은 (저해 구역에 의해 판단되는) 가장 강력한 성장 저해제였다. 이는 각각 12.3 ± 0.3 및 13 ± 1.0 mm의 저해 구역을 갖는 페니실린 (2 μg) 및 암피실린 대조군 (10 μg)과 유리하게 비교된다.

≥ 9 mm의 저해 구역을 갖는, 잎의 수성 및 에틸아세테이트 추출물뿐만 아니라 과일의 메탄올 추출물도 C. 퍼프린젠스 성장의 우수한 저해를 나타내었다.

일반적으로, 잎 추출물은 이들의 상응하는 과일 추출물 대응물보다 C. 퍼프린젠스 성장의 더 강력한 저해제였다.

도 1은 저해 구역 (mm)으로서 측정된 C. 퍼프린젠스 환경 분리주에 대한 T. 페르디난디아나 과일 및 잎 식물 추출물의 성장 저해 활성의 도표를 나타낸다. KFW = T. 페르디난디아나 과일 수성 추출물; KFM = T. 페르디난디아나 과일 메탄올 추출물; KFC = T. 페르디난디아나 과일 클로로포름 추출물; KFH = T. 페르디난디아나 과일 헥산 추출물; KFE = T. 페르디난디아나 과일 에틸아세테이트 추출물; KLW = T. 페르디난디아나 잎 수성 추출물; KLM = T. 페르디난디아나 잎 메탄올 추출물; KLC = T. 페르디난디아나 잎 클로로포름 추출물; KLH = T. 페르디난디아나 잎 헥산 추출물; KLE = T. 페르디난디아나 잎 에틸아세테이트 추출물; PC = 페니실린 (2 μg); AMP = 암피실린 (10 μg). 결과는 평균 저해 구역 ± SEM으로 나타낸다.

T. 페르디난디아나 추출물에 대한 MIC 값의 측정을 통해 항균 효능을 더 정량화하였다 (표 2).

하기 표 2는 T. 페르디난디아나 과일 및 잎 추출물의 최소 저해 농도 (μg/mL) 및 아르테미아 나우플리이 생물검정에서 LC₅₀ 값 (μg/mL)을 나타낸다 (숫자는 3회 측정의 평균 MIC 및 LC₅₀ 값을 나타낸다. -는 저해 없음을 나타낸다):

[표 2]

일반적으로 <1000 μg/ml (디스크에 함침된 <10 μg)의 MIC 값을 갖는, 잎 에틸아세테이트 추출물뿐만 아니라 (과일 및 잎 둘 다) 수성 및 메탄올 추출물은 C. 퍼프린젠스 성장을 저해하는데 효과적이었다.

각각 206 μg/mL (디스크에 대략 2.1 μg 주입) 및 117 μg/mL (디스크에 대략 1.2 μg 주입)의 MIC 값을 갖는, 잎의 메탄올 및 에틸아세테이트 추출물이 특히 강력하였다.

이들 결과는 각각 2 μg 및 10 μg에서 시험된 페니실린 및 암피실린 대조군의 성장 저해 활성과 잘 비교된다.

과일 메탄올 추출물도 강력한 C. 퍼프린젠스 성장 저해제였다 (716 μg/ml의 MIC 값).

덜 강력하지만, 과일 수성 추출물도 우수한 성장 저해 활성을 나타내었다 (1192 μg/ml의 MIC 값).

대조적으로, 과일의 에틸아세테이트 추출물뿐만 아니라 클로로포름 및 헥산 추출물은 모두 분석에서 활성이 없거나 또는 단지 효능이 낮았다.

독성의 정량화: 처음에 분석에서 2000 μg/mL에서 모든 추출물을 스크리닝하였다 (도 2 참조).

기준 독소로서, 중크롬산칼륨도 생물검정에서 시험하였다. 중크롬산칼륨 기준 독소는 사망률의 시작이 빨랐고, 노출 후 처음 3시간 이내에 나우플리이 사망을 유도하였으며, 4-5시간 이내에 100% 사망률이 명백하였다 (결과 생략).

잎의 에틸 아세테이트 추출물뿐만 아니라 모든 수성 및 메탄올 추출물은 24시간에 >90% 사망률을 나타내었다.

잎의 클로로포름 추출물을 제외하고, 다른 추출물은 24시간에 <10% 사망률을 나타내었다.

독소 농도가 사망률의 개시에 미치는 영향을 더 정량화하기 위하여, 추출물을 인공 해수에 연속 희석하여 24시간에 아르테미아 프란시스카나 나우플리이 생물검정에서 일련의 농도에 걸쳐 시험하였다. A. 프란시스카나에 대한 T. 페르디난디아나 추출물의 LC₅₀ 값을 표 2에 나타내었다. 모든 시험된 농도에서 <50% 사망률이 관찰되었기 때문에, 과일의 헥산 또는 클로로포름 추출물, 또는 과일 에틸아세테이트 추출물에 대해 LC₅₀ 값이 보고되지 않았다.

아르테미아 나우플리이에 대하여 1000 μg/ml 보다 큰 LC₅₀ 값을 갖는 추출물은 이 분석에서 무독성인 것으로 정의되었다. 과일의 에틸아세테이트 추출물만이 < 1000 μg/ml의 LC₅₀ 값을 가지므로, 다른 모든 추출물은 무독성인 것으로 간주되었다. 잎의 에틸아세테이트 추출물의 LC₅₀ 값은 < 1000 μg/ml 이지만, 767 μg/ml의 값은 낮거나 중간 정도의 독성을 나타낸다.

도 2는 24시간 노출 후 아르테미아 프란시스카나 나우플리이에 대한 호주 식물 추출물 (2000 μg/mL) 및 중크롬산칼륨 대조군 (1000 μg/mL)의 치사율의 도표를 나타낸다. KFW = T. 페르디난디아나 과일 수성 추출물; KFM = T. 페르디난디아나 과일 메탄올 추출물; KFC = T. 페르디난디아나 과일 클로로포름 추출물; KFH = T. 페르디난디아나 과일 헥산 추출물; KFE = T. 페르디난디아나 과일 에틸아세테이트 추출물; KLW = T. 페르디난디아나 잎 수성 추출물; KLM = T. 페르디난디아나 잎 메탄올 추출물; KLC = T. 페르디난디아나 잎 클로로포름 추출물; KLH = T. 페르디난디아나 잎 헥산 추출물; KLE = T. 페르디난디아나 잎 에틸아세테이트 추출물. PC = 중크롬산칼륨 대조군; SW = 해수 대조군. 결과는 평균 % 사망률 ± SEM으로 나타낸다.

메탄올 추출물은 에탄올 추출물을 포함하는 것으로 이해될 것이다.

HPLC-MS QTOF 분석: 잎의 메탄올 및 에틸아세테이트 추출물이 가장 큰 항박테리아 효능을 가지므로 (MIC에 의해 측정됨), 이들은 추가의 식물화학물질 분석을 위한 가장 유력한 추출물로 간주되었다. 또한, T. 페르디난디아나 잎 추출물의 분석에 대해 이전에 사용된 최적화된 HPLC-MS QTOF 매개변수를 잎의 메탄올 및 에틸아세테이트 추출물 화합물 프로파일의 측정에 사용하였다. 메탄올 및 에틸아세테이트 추출물의 총 화합물 크로마토그램은 각각 도 3a, 3b 및 4a, 4b에 나타내었다.

T. 페르디난디아나 메탄올 추출물 양이온 (도 3a) 및 음이온 (도 3b) 총 화합물 크로마토그램은 극성 화합물의 용출에 상응하는 크로마토그램의 초기 단계에서 다중 중첩 피크를 나타내었다.

추출물 화합물의 대부분은 크로마토그램의 12분 이내에 용출되었다 (약 32% 아세토니트릴에 해당).

그러나, 크로마토그램 둘 다에서 12 내지 16분, 및 24 내지 30분 (51-66% 아세토니트릴)의 몇몇 현저한 피크는 이 추출물에서 화합물의 극성의 광범위한 확산을 나타낸다.

잎 에틸아세테이트 양이온 (도 4a) 크로마토그램은, 피크가 더 적음에도 불구하고, 상응하는 메탄올 추출물과 유사한 용출 프로파일을 가졌다.

이 크로마토그램에서 많은 피크는 메탄올 추출물에서 유사한 용출 부피에서의 피크에 해당하며, 이는 많은 화합물이 두 용매에 의해 추출되었음을 나타낸다.

대조적으로, 잎 에틸아세테이트 음이온 크로마토그램에서 훨씬 적은 피크가 나타났다 (도 4b).

그러나, 이 크로마토그램은 이 모드에서 음이온의 이온화로 인해 양이온 크로마토그램보다 현저한 배경 흡광도 수준을 가졌으며, 이는 일부 피크에 대한 신호를 차폐할 수 있다.

도 4는 T. 페르디난디아나 잎 에틸아세테이트 추출물의 2 μl 주입의 총 화합물 크로마토그램 (TCC)의 양이온 RP-HPLC (도 4a) 및 음이온 RP-HPLC (도 4b)를 나타낸다.

전체적으로, T. 페르디난디아나 잎 메탄올 및/또는 에틸아세테이트 추출물에 대해 54개의 고유 질량 신호가 관찰되었다 (표 3).

검출된 54개의 고유 분자 질량 신호는 모두 '메틀린' 대사체학, 법독성학 (Agilent) 및 식물화학물질 (이 실험실에서 개발됨) 데이터베이스와 비교하여 추정 적으로 확인되었다.

17개의 화합물 및 8개의 화합물은 각각 메탄올 추출물 및 에틸아세테이트 추출물에서만 검출되었다. 나머지 29개의 화합물은 두 추출물 모두에 존재하였다.

잎의 메탄올 및 에틸아세테이트 추출물에서 추정적으로 동정된 14개의 탄닌 화합물과 함께, 탄닌 화합물의 다양성은 주목할 만하다.

특히, 케불산 (도 5a), 프로토카테큐산 (도 5b), 엘라그산 이수화물 (도 5c), 푸니칼라긴 (도 5d), 엘라그산 (도 5e), 케불라그산 (도 5f), 카스탈라긴 (도 5g), 코릴라겐 (도 5h), 푸니칼린 (도 5i), 케불린산 (도 5j), 푸니칼린 (도 5k), 트리메틸 엘라그산 이성질체 (도 5l 및 도 5m)는 추정적으로 동정되었다.

표 3은 T. 페르디난디아나 잎 메탄올 및 에틸아세테이트 추출물의 정성 HPLC-MS/MS 분석, 실험식의 설명 및 화합물의 추정적 동정을 나타낸다.

[표 3]

상기 표 3에서, + 및 -는 화합물이 검출된 관련 이온화 모드를 나타낸다. KLM = T. 페르디난디아나 잎 메탄올 추출물; KLE = T. 페르디난디아나 잎 에틸아세테이트 추출물.

T. 페르디난디아나 잎의 메탄올 및 에틸아세테이트 추출물에서 엘라지탄닌 (ellagitannins)의 다양성은 특히 주목할 만하다.

엘라그산으로부터 이수화된 및 트리메틸화된 유도체뿐만 아니라, 더 복잡하고 고분자량 화합물인 (j) 케불린산 및 푸니칼린도 추정적으로 동정되었으며, 이들 추출물의 C. 퍼프린젠스 성장 저해 활성에 기여할 것으로 보인다.

엘라지탄닌은 62.5 μg/ml의 낮은 MIC 값을 갖는 광범위한 박테리아의 성장에 대한 강력한 저해제로 확인되었다.

T. 페르디난디아나 추출물은 아르테미아 프란시스카나에 대해 독성이 낮은 것으로 나타났다. 실제로, 잎 에틸아세테이트 추출물 (MIC 767 μg/mL)을 제외하고, 모든 추출물의 LC₅₀ 값은 1000 μg/mL를 초과하여 무독성이었다.

바실러스 안트라시스 (B. 안트라시스)

B. 안트라시스의 성장을 저해하는 능력은 디스크 확산 분석을 이용하여 조사하였다.

과일 및 잎 추출물의 최소 저해 농도 (MIC) 값은 이들의 효능을 정량화하고 비교하기 위해 측정되었다.

아르테미아 프란시스카나 나우플리이 생물검정을 이용하여 독성을 측정하였다.

조(crude) T. 페르디난디아나 추출물에서 개별 성분의 동정 및 특성을 위해, 알려진 비-표적화 기체 크로마토그래피/질량 분석 - GC-MS 헤드스페이스 분석 (화합물 데이터베이스에 대한 스크리닝)을 이용하여 가장 강력한 T. 페르디난디아나 과일 및 추출물을 조사하였다.

결과: T. 페르디난디아나 과일 및 잎의 용매 추출물은 B. 안트라시스에 대한 디스크 확산 분석에서 우수한 성장 저해 활성을 나타내었다.

T. 페르디난디아나의 과일 에틸아세테이트 추출물 및 잎 메탄올 추출물은 각각 451 및 377 μg/mL의 MIC 값으로 특히 강력한 성장 저해제였다.

과일의 메탄올 및 클로로포름 추출물, 및 잎의 수성 추출물도 B. 안트라시스 성장의 우수한 저해제였다 (각각 1800 및 1414 μg/mL의 MIC 값).

과일 수성 추출물 및 잎 클로로포름 추출물만이 낮은 저해 활성을 가졌다.

다른 모든 추출물은 성장 저해 활성이 완전히 없었다.

또한, 성장 저해 활성을 갖는 모든 추출물은 아르테미아 프란시스카나 생물검정에서 >1000 μg/mL의 LC₅₀ 값으로 무독성이었다. 가장 활성인 추출물 (과일 에틸아세테이트 추출물 및 잎 메탄올 추출물)의 비-편재된 GC-MS 식물화학물질 분석은 이들 추출물의 B. 안트라시스의 성장을 저해하는 능력에 기여할 수 있는 몇몇 화합물을 추정적으로 동정하고 강조하였다.

T. 페르디난디아나 과일 에틸아세테이트 추출물 및 잎 메탄올 추출물의 낮은 독성, 및 B. 안트라시스에 대한 이들의 강력한 성장 저해 생체활성은, 탄저병의 치료 및 예방에서 약제로서 이들의 이전에 실현되지 않은 적합성을 나타낸다.

정성 식물화학물질 연구: 알칼로이드, 안트라퀴논, 강심 배당체, 플라보노이드, 페놀성 화합물, 피토스테로이드, 사포닌, 탄닌 및 트리테르페노이드의 존재에 대한 추출물의 식물화학물질 분석을 수행하였다.

항산화능: 각 시료의 항산화능은 변형된 DPPH 자유 라디칼 소거 방법을 이용하여 평가하였다.

아스코르브산 (웰당 0-25 μg)을 기준으로 사용하였고, 흡광도를 515 nm에서 기록하였다.

모든 시험은 각 플레이트에서 대조군과 함께 완료하였고, 모두 3회 수행하였다. DPPH 자유 라디칼 소거능에 기초한 항산화능은 각 추출물에 대해 측정하였고, 추출된 원래의 식물 물질의 그램 당 μg 아스코르브산 당량으로 나타내었다.

항박테리아 스크리닝: 환경 바실러스 안트라시스 스크리닝: 바실러스 안트라시스의 환경 균주를 분리하고 동정하였다. 모든 성장 연구는 변형된 펩톤/효모 추출물 (PYE) 한천 [필요할 때, 1 g/L 펩톤, 1.5 g/L 효모 추출물, 7.5 g/L NaCl, 1 g/L 과황산암모늄(ammonium persulfate), 2.4 g/L HEPES 완충액 (pH 7.5) 및 16g/L 세균학적 한천(bacteriological agar)]을 이용하여 수행하였다. 30℃에서 배양하였으며, 보존 배양물(stock culture)을 계대 배양하고 PYE 배지에서 4℃로 유지시켰다.

항균 활성의 평가: 모든 식물 추출물의 항균 활성을 변형된 디스크 확산 분석을 이용하여 측정하였다. 간략하게, 100 μL의 시험 박테리아를 ~10⁸ 세포/mL의 계수에 도달할 때까지 10 mL의 신선한 영양 액체 배지(nutrient broth media)에서 성장시켰다.

100μL의 박테리아 현탁액을 영양 한천 플레이트 상에 도말하고, 5 mm 멸균된 여과지 디스크를 이용하여 항박테리아 활성에 대해 추출물을 시험하였다. 디스크에 10 μL의 시험 시료를 주입하고, 건조시킨 다음, 접종된 플레이트 상에 놓았다. 플레이트를 4℃에서 2시간 동안 방치한 후, 30℃에서 24시간 동안 배양하였다.

저해 구역의 직경은 가장 가까운 전체 밀리미터로 측정되었다.

각 분석은 적어도 3회 수행하였다. 평균값 (± SEM)은 본 연구에서 기록된다. 페니실린 (2μg) 및 암피실린 (10 μg)의 표준 디스크를 얻었고, 항박테리아 활성에 대해 양성 대조군으로 사용하였다. 10 μL의 증류수로 주입된 여과기 디스크를 음성 대조군으로 사용하였다.

최소 저해 농도 (MIC) 측정: 추출물의 최소 저해 농도 (MIC)는 상기 기재된 대로 측정하였다.

간략하게, 식물 추출물을 탈이온수에 희석시키고, 다양한 농도에서 시험하였다. 디스크에 10 μL의 추출물 희석액을 주입하고, 건조시킨 다음, 접종된 플레이트 상에 놓았다.

상술한 바와 같이 분석을 수행하고, 저해 구역 대 농도의 그래프를 플롯팅하였다. 선형 회귀를 사용하여 MIC 값을 결정하였다.

독성 스크리닝: 독성 스크리닝을 위한 기준 독소: 중크롬산칼륨 (K₂Cr₂O₇)을 증류수 (4mg/mL)에서 제조하고, 아르테미아 프란시스카나 나우플리이 생물검정에 사용하기 위해 인공 해수에 연속 희석하였다.

아르테미아 프란시스카나 나우플리이 독성 스크리닝: 변형된 A. 프란시스카나 나우플리이 치사율 분석을 이용하여 독성을 시험하였다. 간략하게, 대략 43 (평균 43.2, n = 155, SD 14.5) A. 프란시스카나 나우플리이를 함유하는 해수 400 μL를 48 웰 플레이트의 웰에 첨가하고, 생물검정에 즉시 사용하였다.

400 μL의 기준 독소 또는 희석된 식물 추출물을 웰로 옮기고, 인공 조명 (1000 Lux) 하에 25 ± 1 ℃에서 배양하였다. 각 플레이트에 대해, 음성 대조군 (400 μL의 해수)을 3회 실행하였다. 모든 처리는 적어도 3회 수행하였다.

웰을 일정한 간격으로 확인하고, 죽은 수를 계수하였다.

10초 이내에 부속물(appendages)의 움직임이 관찰되지 않으면 나우플리이는 죽은 것으로 간주되었다. 24시간 후, 모든 나우플리이를 희생시키고 계수하여 웰당 총 % 사망률을 결정하였다. 각 처리군에 대해 95% 신뢰 한계를 갖는 LC₅₀를 프로빗 분석을 이용하여 계산하였다.

비-표적화 GC-MS 헤드스페이스 분석: 질량 선택 검출기 시스템을 이용하여 분리 및 정량화를 수행하였다. 간략하게, 시스템은 디비닐벤젠/카보왁스/폴리디메틸실록산 (DVB/CAR/PDMS)을 이용한 고체상 미량추출 섬유(solid phase micro-extraction fiber; SPME) 처리 시스템이 장착된 자동-샘플러가 장착되었다. 5% 페닐, 95% 디메틸폴리실록산 (30 m x 0.25 mm id x 0.25 um) 모세관 컬럼을 이용하여 크로마토그래피 분리를 수행하였다. 0.79 ml/min의 유속으로 운반 기체로서 헬륨 (99.999%)을 사용하였다. 분사기 온도를 230℃로 설정하였다.

샘플링은 5초 동안 500 rpm에서 교반 단계로 구성된 SPME 주기를 이용하였다.

섬유를 시료에 10분 동안 노출시켜 흡수되도록 한 다음, 주입구에서 250℃에서 1분 동안 탈착시켰다. 초기 컬럼 온도를 2분 동안 30℃에서 유지시키고, 5분 동안 140℃로 증가시킨 다음, 3분 동안 270℃로 증가시키고, 분석 기간 동안 그 온도에서 유지시켰다.

GC-MS 인터페이스를 스플리트-리스 모드(split-less mode)에서 주입 후 1분 동안 획득된 신호없이 200℃로 유지시켰다. 질량 분광계는 70 eV에서 전자 이온화 모드에서 작동시켰다. 그 다음, 분석물을 총 이온수 (TIC) 모드로 기록하였다. TIC는 45 - 450 m/z의 질량 범위를 이용하여 1분 후 및 45분 동안 획득되었다.

통계 분석: 자료는 적어도 3회의 독립 실험의 평균 ± SEM으로 나타낸다.

결과

액체 추출 수율 및 정성 식물화학물질 스크리닝: 다양한 용매로 다양한 건조된 T. 페르디난디아나 과일 및 잎 식물 물질 (1 g)을 추출하여 18 mg (과일 헥산 추출물) 내지 483 mg (과일 수성 추출물) 범위의 건조된 식물 추출물을 얻었다 (표 4).

메탄올 및 수성 추출물은 낮거나 중간 정도의 수율을 제공하는 클로로포름, 헥산 및 에틸아세테이트 대응물에 비해 상당히 더 큰 수율의 건조된 추출된 물질을 제공하였다. 건조된 추출물을 10 mL의 탈이온수 (1% DMSO 함유)에 재현탁시켜, 표 4에 나타낸 추출물 농도를 얻었다.

[표 4]

T. 페르디난디아나 추출물의 건조된 추출된 물질의 질량, 탈이온수에서 재현탁 후 농도, 정성 식물화학물질 스크리닝 및 항산화능

상기 표 4에서, +++는 큰 반응을 나타내고; ++는 중간 반응을 나타내며; +는 작은 반응을 나타내고; -는 분석에서 반응이 없음을 나타낸다. FW = T. 페르디난디아나 과일 수성 추출물; FM = T. 페르디난디아나 과일 메탄올 추출물; FC = T. 페르디난디아나 과일 클로로포름 추출물; FH = T. 페르디난디아나 과일 헥산 추출물; FE = T. 페르디난디아나 과일 에틸아세테이트 추출물; LW = T. 페르디난디아나 잎 수성 추출물; LM = T. 페르디난디아나 잎 메탄올 추출물; LC = T. 페르디난디아나 잎 클로로포름 추출물; LH = T. 페르디난디아나 잎 헥산 추출물; LE = T. 페르디난디아나 잎 에틸아세테이트 추출물. 항산화능은 DPPH 환원으로 측정되었고, 추출된 식물 물질 (g) 당 아스코르브 산 (mg) 당량으로 나타내었다.

항균 활성: B. 안트라시스 성장을 저해하는 T. 페르디난디아나 과일 및 잎의 조 추출물의 능력을 결정하기 위하여, 디스크 확산 분석을 이용하여 각 추출물의 분취량 (10 μL)을 스크리닝하였다.

스크리닝된 10개의 추출물 중 7개의 추출물에 의해 박테리아 성장이 강하게 저해되었다 (70%) (도 6).

15.3 ± 0.6 mm의 저해 구역을 갖는 잎의 메탄올 추출물은 (저해 구역에 의해 판단되는) B. 안트라시스 성장의 가장 강력한 성장 저해제였다. 이는 각각 8.3 ± 0.6 및 10.0 ± 0.7 mm의 저해 구역을 갖는 페니실린 (2 μg) 및 암피실린 대조군 (10 μg)과 유리하게 비교된다.

≥ 8 mm의 저해 구역을 갖는, 잎의 에틸아세테이트 및 수성 추출물뿐만 아니라 과일의 메탄올 추출물도 B. 안트라시스 성장의 우수한 저해를 나타내었다.

일반적으로, 잎 추출물은 이들의 과일 추출물 대응물보다 B. 안트라시스 성장의 더 강력한 저해제였다.

T. 페르디난디아나 추출물에 대한 MIC 값의 측정을 통해 항균 효능을 더 정량화하였다 (도 5).

대부분의 추출물은 몇몇 추출물에 대해 <1000 μg/ml (디스크에 함침된 <10 μg)의 MIC 값으로, B. 안트라시스 성장을 저해하는데 효과적이었다.

각각 451 μg/mL (디스크에 대략 4.5 μg 주입) 및 377 μg/mL (디스크에 대략 3.8 μg 주입)의 MIC 값을 갖는, 과일의 에틸아세테이트 추출물 및 잎의 메탄올 추출물이 특히 강력하였다.

이들 결과는 각각 2 μg 및 10 μg에서 시험된 페니실린 및 암피실린 대조군의 성장 저해 활성과 잘 비교된다.

과일 메탄올 추출물도 강력한 B. 안트라시스 성장 저해제였다 (877 μg/ml의 MIC 값).

덜 강력하지만, 과일 클로로포름 추출물 및 잎 수성 추출물도 우수한 성장 저해 활성을 가졌다 (각각 1800 및 1414 μg/ml의 MIC 값).

대조적으로, 잎의 클로로포름, 헥산 및 에틸아세테이트 추출물뿐만 아니라, 과일의 수성 및 헥산 추출물은 분석에서 활성이 없거나 또는 단지 효능이 낮았다.

하기 표 5는 T. 페르디난디아나 과일 및 잎 추출물의 최소 저해 농도 (μg/mL) 및 아르테미아 나우플리이 생물검정에서 LC₅₀ 값 (μg/mL)을 나타낸다.

[표 5]

독성의 정량화: 모든 추출물은 처음에 분석에서 2000 μg/mL에서 스크리닝되었다 (도 7 참조). 비교를 위해, 기준 독소 중크롬산칼륨 (1000 μg/mL)도 생물검정에서 시험되었다.

중크롬산칼륨 기준 독소는 사망률의 시작이 빨랐고, 노출 후 처음 3시간 이내에 나우플리이 사망을 유도하였으며, 4-5시간 후에 100% 사망률이 명백하였다 (결과를 나타내지 않음).

잎의 에틸 아세테이트 추출물에서와 같이, 모든 메탄올 및 수성 추출물은 24시간에 >90% 사망률을 나타내었다. 잎의 클로로포름 추출물을 제외하고, 나머지 추출물은 24시간에 <10% 사망률을 나타내었다.

독소 농도가 사망률의 유도에 미치는 영향을 더 정량화하기 위하여, 추출물을 인공 해수에 연속 희석하여 24시간에 아르테미아 나우플리이 생물검정에서 다양한 농도에서 시험하였다.

A. 프란시스카나에 대한 T. 페르디난디아나 추출물의 LC₅₀ 값을 표 5에 나타내었다. 모든 시험된 농도에서 50% 미만의 사망률이 관찰되었기 때문에, 과일의 클로로포름 및 헥산 추출물, 또는 과일 에틸아세테이트 추출물에 대해 LC₅₀ 값이 보고되지 않았다.

아르테미아 나우플리이에 대하여 1000 μg/ml 보다 큰 LC₅₀ 값을 갖는 추출물이 이 분석에서 무독성인 것으로 정의되었다.

과일의 에틸아세테이트 추출물만이 < 1000 μg/ml의 LC₅₀ 값을 가지므로, 다른 모든 추출물은 무독성인 것으로 간주되었다. 잎의 에틸아세테이트 추출물의 LC₅₀ 값은 1000 μg/ml 이지만, 767 μg/ml의 값은 낮거나 중간 정도의 독성을 나타낸다.

T. 페르디난디아나 과일 및 잎 추출물의 비-표적화 GC-MS 헤드스페이스 분석: 과일 에틸아세테이트 추출물 및 잎 메탄올 추출물이 B. 안트라시스에 대해 가장 큰 성장 저해 효능을 가지므로 (MIC에 의해 측정됨; 표 5 참조), 이들은 추가의 식물화학물질 분석을 위한 가장 유력한 추출물로 간주되었다. 최적화된 GC-MS 매개변수를 개발하고 사용하여 이 추출물의 식물화학물질 조성을 확인하였다.

과일 에틸아세테이트 추출물 및 잎 메탄올 추출물에 대한 결과의 기체 크로마토그램은 각각 도 8 및 도 9에 나타내었다. 과일 에틸아세테이트 추출물에서 대략 15.1분 (3,3-디메틸-헥산, 7.1% 상대 존재비(relative abundance)), 19.7분 (2-메틸-2-페닐-옥시란, 14.6% 상대 존재비), 20.9분 (m-디-tert-부틸벤젠, 22% 상대 존재비) 및 28.9분 (3,5-비스(1,1-디메틸에틸)-페놀, 19.4% 상대 존재비)에서 몇몇 주요 피크가 관찰되었다. 또한, 크로마토그램의 중간 단계에서 10-25분에 다수의 중첩 피크가 명백하였다. 전체적으로, T. 페르디난디아나 과일 에틸아세테이트 추출물에 대해 42개의 고유 질량 신호가 관찰되었다 (표 6). 이들 화합물 모두에 대해 추정적 실험식 및 동정이 이루어졌다.

하기 표 6은 T. 페르디난디아나 과일 에틸아세테이트 추출물의 정성 GC-MS 분석, 실험식의 설명 및 각 화합물의 추정적 동정을 나타낸다:

[표 6]

이 표 6에 나타낸 상대 존재비는 모든 크로마토그래피 피크 하에서 총 면적의 %로 나타낸 피크 아래 면적의 측정치이다.

잎 메탄올 추출물 (도 9)에 대한 기체 크로마토그램은 과일 에틸아세테이트 추출물 (도 8)보다 현저히 적은 피크를 나타내었다. 전체적으로, 잎 메탄올 추출물 크로마토그램에서 19개의 고유 질량 신호가 관찰되었다.

대략 11.3분 (메톡시-페닐-옥심, 22.7% 상대 존재비), 13.7분 (1-옥텐-3-올, 2.4% 상대 존재비), 14.4분 (2-(1,1-디메틸에톡시)-에탄올, 27.7% 상대 존재비), 19.5분 (2-메틸-2-페닐-옥시란, 11.4% 상대 존재비) 및 21.5분 (3,5-디메틸-벤즈알데히드, 15.6% 상대 존재비)에서 몇몇 주요 피크가 제시되었다.

크로마토그램 전체에 걸쳐 몇몇 작은 피크도 눈에 띄었다. 19개의 고유 질량 신호 중 16개의 화합물에 대해 추정적 실험식 및 동정이 이루어졌다.

하기 표 7은 T. 페르디난디아나 잎 메탄올 추출물의 정성 GC-MS 분석, 실험식의 설명 및 각 화합물의 추정적 동정을 나타낸다:

[표 7]

표 7에 나타낸 상대 존재비는 모든 크로마토그래피 피크 하에서 총 면적의 %로 나타낸 피크 아래 면적의 측정치이다.

가장 강력한 B. 안트라시스 성장 저해제인 T. 페르디난디아나 추출물 (과일 에틸아세테이트 추출물 및 잎 메탄올 추출물)의 정성 GC-MS 헤드스페이스 분석은 다수의 흥미로운 화합물을 동정하였다.

퓨란 화합물인 1-(2-퓨라닐)-에탄온 (도 10a) 및 에틸 2-(5-메틸-5-비닐테트라히드로퓨란-2-일) 카보네이트 (도 10b)의 존재가 주목할 만하다. 니트로 퓨란은 특히 핵산 합성의 저해를 통해 작용하는 항균 메카니즘을 잘 연구하였다.

유사하게, 합성 퓨란 유도체 (로다닌 부분의 첨가에 의해 변형됨)는 일부 종에 대해 2 μg/mL의 낮은 MIC 값을 갖는, 다중 약물 내성 박테리아의 성장의 강력한 저해제인 것으로 알려져 있다.

T. 페르디난디아나 추출물에 존재하는 2개의 퓨란 유도체에 대한 항-박테리아 활성에 대한 보고는 알려져 있지 않으며, 2개의 퓨란 유도체는 본 추출물의 효과에 기여할 가능성이 있다.

다른 식물화학물질 종류도 이들 추출물의 성장 저해 특성에 기여할 가능성이 있다. 식물화학물질 스크리닝은 폴리페놀, 플라보노이드, 사포닌 및 테르펜이 T. 페르디난디아나 추출물에 존재함을 나타낸다.

갈산 (도 5c) 및 엘라그산 (도 5d) 및 이들의 메틸화 유도체, 케불산 (도 5e), 갈로일 피로갈롤 (도 5f), 코릴라겐 (도 5g), 푸니칼린 (도 5h), 카스탈라긴 (도 5i) 및 케불라그산 (도 5j)은 각각의 연구에서 T. 페르디난디아나 추출물에서 검출되었다. 이러한 탄닌은 다양한 박테리아 종에 대해 강력하고 광범위한 성장 저해 활성을 가진다.

갈로탄닌은 특히 저해 특성이 잘 보고되어 있다. 이들은 세포 표면 단백질과의 상호 작용 및 세포 내 효소와의 상호 작용을 둘 다 포함하는 다수의 메커니즘을 통해 기능한다.

또한, 엘라지탄닌은 세포 단백질과 상호 작용하여 박테리아 세포벽의 파괴를 유도한다.

레스베라트롤 (도 10k) 및 글리코실화 레스베라트롤 유도체 피세이드 (piceid) (도 10l), 디에틸스틸베스트롤 모노설페이트 (도 10m) 및 콤브레타스타틴 A1 (도 10n)은 추정적으로 동정되었다. 콤브레타스타틴 A1의 동정은, 콤브레타스타틴이 암 세포 진행을 차단하고 세포 내 튜불린에 결합함으로써 아폽토시스를 유도하여 미세소관(microtubule) 형성을 파괴하는 이들의 강력한 능력으로 인해 최근에 관심을 끌었기 때문에, 특히 흥미로웠다.

도 10 (10a-n)은 (a) 1-(2-퓨라닐)-에탄온, (b) 에틸 2-(5-메틸-5-비닐테트라히드로퓨란-2-일) 카보네이트, (c) 갈산, (d) 엘라그산, (e) 케불산, (f) 갈로일 피로갈롤, (g) 코릴라겐, (h) 푸니칼린, (i) 카스탈라긴, (j) 케불라그산, (k) 레스베라트롤, (l) 피세이드, (m) 디에틸스틸베스트롤 모노설페이트, (n) 콤브레타스타틴 A1의 각 화학 구조를 나타낸다.

T. 페르디난디아나 추출물에서도 몇몇 중요한 테르페노이드가 동정되었다.

T. 페르디난디아나 잎 에틸아세테이트 추출물을 제외하고, 본 명세서에 보고된 결과는 T. 페르디난디아나 추출물이 실질적으로 >1000 μg/mL의 LC₅₀ 값으로, 아르테미아 프란시스카나 나우플리이에 대해 무독성이었음을 나타낸다.

아르테미아 나우플리이에 대하여 >1000 μg/mL의 LC₅₀ 값을 갖는 추출물은 무독성인 것으로 정의되었다. 상당한 사망률을 유도한 잎 에틸아세테이트 추출물조차도 이의 중간 정도의 LC₅₀ 값으로 인해 독성이 낮거나 중간 정도인 것으로 간주되었습니다.

독성 연구는 이들 추출물이 B. 안트라시스 성장 저해제로 사용하기에 안전할 수 있음을 나타내었지만, 이러한 추출물의 안전성을 더 평가하기 위해 인간 세포주를 이용한 연구가 필요하다.

편모충 증식 및/또는 편모충증 조절의 저해제로서 T. 페르디난디아나 추출물

특히, 비-제한적이지만, T. 페르디난디아나 추출물 및 순수한 화합물에 의한 람블 편모충(Giardia duodenalis) 증식의 저해가 하기에 기재될 것이다. 본 발명의 하나 이상의 형태는 단지 람블 편모충(Giardia duodenalis) (Giardia lamblis 및 Giardia intestinalis 로도 알려짐)의 조절 또는 저해에 한정되는 것이 아니라 다른 편모충 및 미생물/박테리아 균주의 조절 또는 저해에 한정되는 것으로 이해되어야 한다.

도 12에 나타낸 시험 결과에서 예로서 나타난 바와 같이, 미처리 대조군의 백분율로 측정된 람블 편모충 영양형 (Giardia duodenalis trophozoites)의 3개의 균주에 대해 T. 페르디난디아나 추출물 및 순수한 화합물의 저해 활성을 시험하였다.

강력한 람블 편모충(G. duodenalis) 성장 저해 활성을 갖는 T. 페르디난디아나 과일 추출물에서 동정된 11개의 화합물은 람블 편모충 증식을 저해하는 능력에 대해 조사하였다.

11개의 화합물 중 8개의 화합물이 모든 3개의 람블 편모충 균주의 성장을 저해하였다.

DPGA는 126μM (38mg/mL)의 낮은 IC₅₀ 값을 갖는, 가장 강력한 항편모충 (antigiardial) 화합물이었다. 특히, DPGA는 메트로니다졸 민감성 균주에 대해 측정된 것과 유사한 효능으로 메트로니다졸 내성 람블 편모충 균주를 저해하였다.

또한, DPGA의 효능은 아스코르브산과 조합하여 시험될 때, 메트로니다졸 민감성 람블 편모충 균주에 대해 약 17μM (5mg/mL) 및 내성 균주에 대해 40μM (12mg/mL)까지 크게 강화되었다.

T. 페르디난디아나 탄닌 (갈산 및 케불산)도 아스코르브산과 조합하여 시험될 때, 향상된 활성 수준을 갖는 람블 편모충 성장의 저해제인 것으로 밝혀졌다.

시험된 모든 화합물 (및 아스코르브산과 이들의 조합)은 낮은 독성을 나타내었고, 모든 화합물은 거의 위반하지 않고 리핀스키의 5 규칙(Lipinski's rules of 5)을 따랐으며, 이는 편모충증의 치료 및 예방을 위한 선도 약물 및 화학요법으로서의 이들의 가능성을 나타낸다.

푸린 유사체 (도 11a)는 성장 저해 활성을 갖는 모든 추출물에서 동정되었다.

흥미롭게도, 다수의 연구는 람블 편모충이 푸린 또는 피리미딘 뉴클레오티드 자체를 합성할 수 없으며, 핵산 합성을 위한 뉴클레오티드를 그들에게 공급하기 위해 회수 경로(salvage pathways)에 의존한다고 보고하였다.

또한, 람블 편모충은 푸린 뉴클레오티드 사이의 상호 전환(interconversion)이 불가능하므로, 복제를 위해 정확한 푸린 뉴클레오티드를 필요로 한다. 실제로, 푸린 유사체는 람블 편모충의 성장을 저해하고, 편모충증에 대한 잠재적인 화학요법제로서 강조되어 왔다.

도 11a 내지 11k는 항-증식성 T. 페르디난디아나 과일의 메탄올 추출물 및 수성 추출물에서 보고된 화합물의 각 화학 구조를 나타낸다: (a) 푸린; (b) 갈산; (c) 케불산; (d) 리보노락톤(ribonolactone); (e) 아스코르브산; (f) 글루코노락톤; (g) 글루코헵톤산(glucoheptonic acid)-1,4-락톤; (h) 퀸산(quinic acid), (i) 유자보닉산(eujavonic acid); (j) 5-(4-히드록시-2,5-디메틸페녹시)-2,2-디메틸-펜탄산 (HMDP); (k) 2,3-디히드록시페닐 B-D-글루코피라노시두론산 (glucopyranosiduronic acid) (DPGA).

생체활성 T. 페르디난디아나 추출물에서 풍부한 자연적으로 발생하는 탄닌, 특히 높은 수준의 갈산 (도 11b) 및 케불산 (도 11c)이 관찰된다.

갈로탄닌은 세포 표면 리포테이코산(lipoteichoic acid) 및 프롤린-풍부 막 단백질의 결합을 통해 및 글루코실트랜스퍼라제 효소를 저해함으로써 다수의 미생물 종의 성장을 저해한다.

현재 사용되는 다수의 항-편모충 화학요법 약물이 락톤 함유 화합물, 특히 락톤 치환된 니트로이미다졸 (예를 들어, 메트로니다졸, 세크니다졸(secnidazole), 티니다졸(tinidazole), 오르니다졸(ornidazole) 및 알벤다졸(albendazole))이기 때문에, 락톤 부분으로서 T. 페르디난디아나의 추출물에 존재하는 리보노락톤 (도 11d), 아스코르브산 (도 11e), 글루코노락톤 (도 11f) 및 글루코헵톤산-1,4-락톤 (도 11g)은 가치가 있다.

락톤 부분을 함유하는 화합물은 편모충 지질(giardial lipid) 탈아실화/재아실화 경로를 차단함으로써 증식을 저해하는 것으로 이해된다. 편모충 종(Giardia spp.)은 새로운 경로에 의해 지질을 합성할 수 없기 때문에, 이들은 탈아실화/재아실화 반응에 의한 막 및 세포 지질의 합성을 위해 숙주 위장 전구체 지질을 사용해야 한다.

따라서, T. 페르디난디아나 추출물에서 락톤 함유 화합물은 지질 대사 경로의 저해를 통한 람블 편모충 성장 저해에 기여하는 것으로 이해될 수 있다.

T. 페르디난디아나 추출물에서 퀸산 (도 11h)이 관찰되었다. 치환된 퀸산 화합물은 람블 편모충 세포에서 류실-tRNA 합성효소(synthase) 활성을 차단할 수 있다. 아미노아실-tRNA 합성효소는 각각의 tRNA에 정확한 아미노산을 부착함으로써 유전자 코드의 번역에 필수적이므로, 류실-tRNA 합성효소 활성의 차단은 비효율적 인 Leu-tRNA 생성을 야기하여 단백질 합성의 저해를 야기한다. 따라서, 퀸산은 T. 페르디난디아나 과일 추출물의 항편모충 활성에 기여하는 것으로도 이해될 수 있다.

유자보닉산 (도 11i), 5-(4-히드록시-2,5-디메틸페녹시)-2,2-디메틸-펜탄산 (HMDP) (도 11j) 및 2,3-디히드록시페닐 B-D-글루코피라노시두론산 (DPGA) (도 11k)은 추가의 항편모충 화합물이다.

또한, T. 페르디난디아나 과일은 비교적 높은 아스코르브산 함량을 가지므로, 아스코르브산은 개별 성분의 성장 저해 활성을 변경 및/또는 향상시키는데 효과적일 수 있다.

따라서, 모든 화합물은 또한 아스코르브산과 조합하여 평가되어 이들 성분의 활성에 대한 이의 효과를 정량화하였다.

T. 페르디난디아나 과일 추출 수율 및 정성 식물화학물질 스크리닝.

1g의 건조된 T. 페르디난디아나 과일을 메탄올 및 탈이온수로 추출하여 비교적 많은 양의 건조된 추출된 물질을 얻었다 (메탄올 추출물 및 수성 추출물에 대해 각각 370μg/mL 및 290μg/mL). 건조된 추출물을 10 mL의 탈이온수 (0.5% DMSO 함유)에 재현탁시켜, 하기 표 8에 나타낸 추출물 농도를 얻었다.

[표 8]

+++는 큰 반응을 나타내고; ++는 중간 반응을 나타내며; +는 작은 반응을 나타내고; -는 반응이 없음을 나타낸다. 값은 각각 3회 측정된 3개의 실험의 평균 IC₅₀ 또는 LC₅₀ 값을 나타낸다. M = 메탄올 추출물; W = 수성 추출물.

정성 식물화학물질 연구 (표 8)는 두 추출물 모두 중간 수준에서 높은 수준의 탄닌뿐만 아니라, 높은 수준의 페놀 및 플라보노이드를 함유하고 있음을 나타내었다. 또한, 사포닌은 낮거나 중간 수준으로 존재하였다. 트리테르펜 및 알칼로이드는 낮은 수준으로 존재하였다.

또한, 순수한 T. 페르디난디아나 과일 화합물 중 몇몇은 300 μg/mL에서 시험될 때 람블 편모충 영양형(G. duodenalis trophozoite) 증식을 유의하게 저해하였다 (도 12).

DPGA는 100%의 영양형 성장을 차단하는, 특히 우수한 성장 저해제인 것으로 알려져 있다.

DPGA는 민감성 균주에 대한 것처럼 메트로니다졸 내성 람블 편모충 균주에 대해 효과적이었으며, 이는 DPGA가 메트로니다졸과 다른 메커니즘에 의해 편모충 성장을 차단할 수 있음을 나타낸다.

또한, 다른 화합물 중 몇몇은 낮은 효능에도 불구하고, 람블 편모충 영양형 증식을 유의하게 저해하였다. 갈산 (~50% 증식 저해), 케불산 (~40% 저해), 퀸산 (~30% 저해), 유자보닉산 (~20% 저해) 및 5-(4-히드록시-2,5-디메틸페녹시)-2,2-디메틸펜탄산 (~20% 저해)은 각각 메트로니다졸 내성 균주를 포함하여 3개의 람블 편모충 균주를 모두 저해하였다.

다른 T. 페르디난디아나 과일 화합물 중 2개의 화합물 (아스코르브산, ~15% 저해; 글루코헵톤산 락톤, ~30% 저해)도 메트로니다졸 민감성 람블 편모충 균주를 유의하게 저해하였지만, 메트로니다졸 내성 람블 편모충 균주의 비효과적인 저해제였다.

푸린, 리보노락톤 및 글루코노락톤은 람블 편모충 균주의 성장에 크게 영향을 미치지 않았다.

T. 페르디난디아나 과일의 메탄올 및 물 추출물은 강력한 저해 활성을 나타내었으며, 각각 편모충 성장을 100% 저해하였다 (미처리 대조군에 비해).

람블 편모충 성장을 50% 저해하는데 필요한 농도 (IC₅₀)를 측정하여, 추출물의 효능을 더 평가하였다. 143 μg/mL의 IC₅₀를 갖는 물 추출물은 람블 편모충 증식의 특히 우수한 저해제였다. 덜 강력하지만, 메탄올 추출물도 우수한 항-편모충 활성을 나타내었다 (704 μg/mL).

도 12: 미처리 대조군의 백분율로 측정된 람블 편모충 영양형의 3개의 균주에 대한 T. 페르디난디아나 추출물 및 순수한 화합물의 저해 활성. NC = 음성 대조군; M = 메탄올 추출물; W = 물 추출물; 1 = 푸린; 2 = 갈산; 3 = 케불산; 4 = 리보노락톤; 5 = 아스코르브산; 6 = 글루코노락톤; 7 = 글루코헵톤산 락톤; 8 = 퀸산; 9 = 유자보닉산; 10 = HMDP; 11 = DPGA; PC = 메트로니다졸 대조군 (50 μg/ml). 결과는 내부 3회 측정을 이용한 3회의 독립 실험의 평균 ± SEM으로 나타낸다 (n = 9). *, # 및 ^는 각각 양 S2, ATCC 203333 및 ATCC PRA-251 람블 편모충 균주에 대한 미처리 대조군과 유의하게 상이한 결과를 나타낸다 (p <0.01).

순수한 T. 페르디난디아나 화합물에 대한 IC ₅₀ 의 정량화

순수한 T. 페르디난디아나 화합물의 항-증식성 활성을 다양한 농도에서 추가로 시험하여, 람블 편모충 영양형에 대한 IC₅₀ 값을 측정하였다 (표 9).

[표 9]

>1000 μg/mL의 IC₅₀ 값을 갖는 대부분의 화합물은, 단지 중간 내지 낮은 정도의 람블 편모충 저해 활성을 야기하였다. 상이한 균주에 대해 38-72 μg/mL (126-238μM) 범위의 IC₅₀ 값을 갖는 DPGA는, 다른 화합물보다 람블 편모충 증식의 실질적으로 더 강력한 저해제였다. 흥미롭게도, DPGA는 T. 페르디난디아나 수성 추출물 및 메탄올 추출물의 비교적 적은 성분으로 총 추출물 질량의 0.1% 미만을 차지하므로 (결과는 나타내지 않음), DPGA 단독으로는 조 수성 추출물 (143 μg/mL)의 강한 활성을 설명할 것 같지는 않다. 대신에, 추출물 중의 다른 화합물이 하나 이상의 항-증식성 T. 페르디난디아나 화합물의 활성을 상승시킬 가능성이 있다.

T. 페르디난디아나 과일은 매우 높은 아스코르브산 함량을 가지므로, 아스코르브산은 하나 이상의 T. 페르디난디아나 화합물과 상승적 상호 작용을 할 수 있다. 따라서, 이들 화합물은 아스코르브산과 조합하여 추가로 조사하여 발생할 수 있는 임의의 상호 작용을 확인하였다.

람블 편모충 증식에 대한 T. 페르디난디아나 화합물 및 아스코르브산의 조합 효과

T. 페르디난디아나 추출물 성분 및 아스코르브산 사이에 다양한 조합 효과가 관찰되었다 (표 9).

특히, 두 조합은 상승적 상호 작용 (갈산 + 아스코르브산; DPGA + 아스코르브산)을 야기하였다. 일부 조합은 화합물 단독의 활성에 비해 대략 10배의 활성 증가를 야기하였다. 아스코르브산과 조합한 DPGA의 활성의 증가는, 단독시 47μg/mL (156μM)에서 아스코르브산과 조합시 5μg/mL (17μM)로의 감소하는 IC₅₀ 값과 함께, 양 S2 람블 편모충 균주에 대해 특히 주목할 만하였다. 단독시 38μg/mL (126μM)에서 아스코르브산과 조합시 6μg/mL (20μM)로의 IC₅₀의 감소와 함께, 메트로니다졸 민감성 기준 람블 편모충 균주 (ATCC203333)에 대해 유사한 효능 증가가 기록되었다. 메트로니다졸 내성 람블 편모충 균주 (ATCC PRA-251)에 대해 약간 덜 강력하지만, DPGA + 아스코르브산 조합도 12μg/mL (40μM)의 임상적으로 관련된 IC₅₀ 값을 야기하였다. 모든 람블 편모충 균주에 대한 갈산 + 아스코르브산 조합에 대해서도 상당한 효능 증가가 기록되었다. 단독시 1150μg/mL (6795μM)에서 아스코르브산과 조합시 146μg/mL (858μM)로의 양 S2 균주에 대한 IC₅₀의 감소는 주목할 만하다. 이 조합은 다른 람블 편모충 균주에 대해서도 상승적이었다. 흥미롭게도, IC₅₀ 값은 대략 250μg/mL (1469μM)의 IC₅₀ 값으로, 메트로니다졸 민감성 및 내성 람블 편모충 균주 모두에서 유사하였다.

대부분의 다른 조합은 부가 효과를 야기하였다. 따라서, 이들 조합은 별도로 사용되는 경우 어느 한 성분에 비해 향상된 효능을 야기하기 때문에, 편모층증의 치료에 유익할 수도 있다.

추가의 조합 (글루코헵톤산 락톤)은 비-상호적(non-interactive)이었다. 이러한 조합이 화합물 단독의 것보다 현저한 치료적 이점을 제공하지는 않지만, 성분들도 서로의 효과를 길항하지 않으므로, 두 성분이 동시에 투여된다면 유해하지 않을 것이다. 특히, 어떠한 조합도 길항 효과를 나타내지 않았다.

갈산 및 아스코르브산 사이의 상승적 상호 작용

갈산/아스코르브산 조합이 상승적 상호 작용을 유도함에 따라 (표 9), 다양한 갈산:아스코르브산 비에서 이소볼로그램(isobologram) 분석을 이용하여 상기 조합을 추가로 조사하여, 상승 작용을 얻기 위한 이상적인 비를 확인하였다.

3개의 람블 편모충 균주 모두에 대해 유사한 감수성 프로파일이 명백하였다.

모든 경우에, 자료는 아스코르브산 축보다 갈산 축과 더 밀접한 상관 관계가 있으며, 이는 항-증식성 활성이 갈산에 가장 의존적임을 나타낸다.

그러나, 30-60%의 갈산을 함유하는 비는 상승적 반응을 유도하는 반면, 더 낮은 비 (≤20%) 및 더 높은 비 (≤70%)는 일반적으로 부가 효과를 야기하였다.

이러한 반응은 개별 성분 단독 중 어느 하나보다 크므로, 이들은 편모충증의 치료에 유익할 것이다.

상승 작용은 ΣFIC₅₀ 식을 이용하여 결정되었으므로, 상승 작용은 개별 성분 단독의 반응보다 적어도 4배 큰 반응으로 정의된다. 따라서, 상승적 반응을 유도하는 비는 다른 비와 비교하여 항편모충 요법으로서 훨씬 바람직하다. 따라서, 편모충증의 치료를 위한 이상적인 갈산/아스코르브산 비는 바람직하게는 30-60% 갈산을 함유하는 조합을 포함할 수 있다.

도 13a 내지 13c에 의해 나타난 바와 같이, (a) 양 S2, (b) 기준 메트로니다졸 민감성 (ATCC203333) 및 (c) 기준 메트로니다졸 내성 (ATCC PRA-251) 람블 편모충(G. duodenalis) 균주에 대해 다양한 비로 시험된 갈산 및 아스코르브산의 조합에 대한 이소볼로그램을 나타낸다. GA = 갈산; AA = 아스코르브산. 결과는 각각 3회의 반복 실험으로 구성된 3회의 독립 실험 (즉, 각 비에 대해 9개의 자료점(data points))의 평균 FIC₅₀ 값을 나타낸다. 0.5/0.5 선 위 또는 아래에 있는 비는 상승적인 것으로 간주된다 (ΣFIC₅₀ ≤ 0.5). 0.5/0.5 및 1.0/1.0 선 사이의 임의의 점은 부가적인 것으로 간주된다 (ΣFIC₅₀ > 0.5-1.0).

2,3-디히드록시페닐-B-글로코피라노시두론산 (DPGA) 및 아스코르브산 사이의 상승적 상호 작용

DPGA도 아스코르브산과 조합하여 시험될 때, 상승적 람블 편모충 성장 저해를 유도하였다 (표 9).

성장 저해 활성과 DPGA 축 사이의 연관성은 갈산보다 훨씬 더 두드러졌으며 (도 14a 내지 14c), 이는 이 화합물이 이 조합의 항-증식성 활성에 대해 아스코르브산보다 더 중요하다는 것을 나타낸다. 이는 DPGA의 IC₅₀을 아스코르브산의 IC₅₀의 약 5%로 보고하는 화합물에 대한 IC₅₀ 자료와 일치한다 (표 9). 따라서, DPGA는 성분을 별도로 시험할 때 아스코르브산보다 약 20배 더 강력한 람블 편모충 성장 저해제이다. 흥미롭게도, ≤60% DPGA를 함유하는 모든 조합은 메트로니다졸 민감성 람블 편모충 균주에 대한 상승적 성장 저해를 야기하였다 (도 14a 및 14b). 따라서, DPGA의 효과를 효과적으로 상승시키기 위해서는 ≥40% 아스코르브산이 필요하다.

메트로니다졸 내성 람블 편모충 균주에 대한 성장 저해 이소볼로그램은 다른 경향을 나타낸다 (도 14c). 조합비의 대부분은 이 균주에 대한 부가적인 상호 작용을 야기하였다. 조합의 성장 저해 활성이 어느 한 성분 단독의 성장 저해 활성보다 더 크기 때문에, 이들 비는 여전히 편모충증을 치료하는데 유익할 것이다. 그러나, 이들 비에 대해 치료 효능이 증가되지만, 비교적 적은 증가가 있다. 대조적으로, 30-50% DPGA를 함유하는 조합은 실질적으로 효능이 증가하였다 (단독 시험된 화합물의 합과 비교하여 ≥4배의 효능 증가). 따라서, 메트로니다졸 내성 람블 편모충 균주에 대한 편모충증의 치료 및 예방을 위한 이상적인 상승 비는 아스코르브산과 조합하는 30-50% DPGA인 것으로 확인되었다.

도 14a 내지 14c는 (a) 양 S2, (b) 기준 메트로니다졸 민감성 (ATCC203333) 및 (c) 기준 메트로니다졸 내성 (ATCC PRA-251) 람블 편모충 균주에 대해 다양한 비로 시험된 DPGA 및 아스코르브산의 조합에 대한 이소볼로그램을 나타낸다. DPGA = 2,3-디히드록시페닐-B-글루코피라노시두론산; AA = 아스코르브산. 결과는 각각 3회의 반복 실험으로 구성된 3회의 독립 실험 (즉, 각 비에 대해 9개의 자료점)의 평균 FIC₅₀ 값을 나타낸다. 0.5/0.5 선 위 또는 아래에 있는 비는 상승적인 것으로 간주된다 (ΣFIC₅₀ ≤ 0.5). 0.5/0.5 및 1.0/1.0 선 사이의 임의의 점은 부가적인 것으로 간주된다 (ΣFIC₅₀ > 0.5-1.0).

독성의 정량화

아르테미아 나우플리이 치사율 분석 (ALA) 및 인간 진피 섬유아세포 분석 (HDF)을 이용하여 다양한 농도에서 모든 추출물을 스크리닝하였다 (표 10).

비교를 위해, 기준 독소 중크롬산칼륨 (1000 μg/mL)도 시험하였다.

50% 미만의 사망률이 두 분석에서 시험된 이들 화합물의 모든 농도에 대해 관찰되었기 때문에, 푸린, 리보노락톤, 글루코노락톤, 글루코헵톤산 락톤, 퀸산, 유자보닉산, HMDP, 또는 DPGA에 대한 LC₅₀ 값은 보고되지 않았다.

따라서, 이들 화합물은 모두 무독성인 것으로 간주되었다. 대조적으로, 갈산, 케불산 및 아스코르브산은 24시간 노출 후에 두 분석에서 명백한 독성을 나타내었다. 그러나, 본 연구에서 검출된 독성은 일반적으로 산성 성분과 상관 관계가 있음이 주목할 만하다. 산성 pH는 미토콘드리아 단백질 합성 속도를 억제할 수 있으며 잠재적으로 아르테미아 나우플리이 및 HDF 세포의 성장과 발달에 치명적일 수 있다. 실제로, 이전 연구는 아스코르브산 함량이 높은 추출물이 잘못된 독성 측정을 제공할 수 있다고 보고하였다. 따라서, 이 분석은 이들 화합물의 독성을 과대평가하였을 수 있다.

[표 10]

아르테미아 치사율 분석 (ALA) 및 인간 진피 섬유아세포 (HDF) 세포독성 분석에 의해 측정된 T. 페르디난디아나 화합물 단독 및 아스코르브산과의 조합의 독성

치료 지수 및 약물 유사 특성

치료제로서 T. 페르디난디아나 화합물의 적합성을 결정하기 위해, 리핀스키의 5 규칙을 참조하여 약물-유사 특성을 조사하였다.

모든 화합물은 ≤10 H 결합 수용체(bond acceptors), 분자량 <500 Da 및 옥탄올-물 계수 ≤5를 가졌다. 또한, 대부분의 화합물은 ≤5 H 결합 공여체(bond donors)를 가졌다.

이 규칙을 위반한 유일한 화합물 (케불산 및 DPGA)은, 단독으로 및 아스코르브산과 조합하여, 가장 큰 람블 편모충 항-증식성 활성을 갖는 화합물 (DPGA)을 포함하였다. DPGA 및 케불산 둘 다 6 H 결합 공여체를 가지므로, 1 H 결합 공여체에 의해 리핀스키의 5 규칙을 초과한다. 그러나, 다른 모든 범주에서 적합성을 감안할 때, 이들 화합물은 우수한 약물-유사 특성을 갖는 것으로 간주되었다.

또한, 치료 지수 (TI)는 순수한 화합물 및 조합에 대해 계산되었다. 이들 화합물 중 어느 것도 시험된 임의의 농도에서 독성을 나타내지 않았기 때문에, 우리는 푸린, 리보노락톤, 글루코노락톤, 글루코헵톤산 락톤, 퀸산, 유자보닉산, HMDP, 및 DPGA에 대한 TI를 계산할 수 없었다. 그러나, DPGA를 제외하고, 이들 화합물은 일반적으로 낮은 람블 편모충 항-증식성 활성만을 나타내므로, 치료적으로 거의 사용되지 않았다. DPGA의 경우, 이러한 명백한 독성의 결여는 화합물이 높은 TI를 가질 것이므로 유력한 선도 약물임을 나타낸다. DPGA가 시험된 용량 범위가 LC₅₀을 결정하기 위해 더 높은 농도를 시험하도록 확장된다면, TI는 비교적 높을 것이다.

갈산의 TI에 대한 흥미로운 경향이 관찰되었다. 이 화합물 단독의 TI는 이의 명백한 독성으로 인해 비교적 낮았으며 (0.3), 이는 치료 가능성이 제한적일 수 있음을 나타낸다. 그러나, 갈산의 TI가 아스코르브산과 조합하여 결정되었을 때, 이것은 실질적으로 2.3으로 증가하였다. 따라서, 아스코르브산은 DPGA와 조합하여 이중 혜택을 제공할 수 있다: 이것은 DPGA의 항-증식성 활성을 상승시킬뿐만 아니라 세포의 독성으로부터 세포를 보호할 수 있다.

[표 11]

T. 페르디난디아나 화합물 단독 및 아스코르브산과의 조합의 약물 유사 특성 및 치료 지수.

Claims (17)

1. 인간 또는 동물에서 박테리아 감염 치료용 조성물로서,
   상기 조성물은 항균제 또는 항박테리아제로서 테르미날리아 페르디난디아나 (T. ferdinandiana)로부터 유래된 추출물을 함유하는 약제를 포함하는, 조성물.
2. 제 1항에 있어서, T. 페르디난디아나 잎 추출물을 포함하는, 조성물.
3. 제 2항에 있어서, T. 페르디난디아나 잎 추출물 이외에 T. 페르디난디아나 과일 추출물을 더 포함하는, 조성물.
4. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, T. 페르디난디아나 잎 추출물은 메탄올 또는 에탄올 추출물, 수성 추출물, 에틸아세테이트 추출물, 클로로포름 추출물 또는 헥산 추출물 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
5. 제 2항에 있어서, T. 페르디난디아나 잎 추출물은 적어도 하나의 항산화제의 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
6. 제 5항에 있어서, 적어도 하나의 항산화제는 엘라그산 또는 트리메틸 엘라그산 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물, 약제 또는 추출물은 알약 형태, 캡슐 형태, 또는 액체로 제공되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 탄닌 및/또는 적어도 하나의 플라본을 포함하는, 조성물.
9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 케불산(chebulic acid), 코릴라겐(corilagen), 케불린산(chebulinic acid) 및 케불라그산(chebulagic acid) 중 하나 또는 둘 이상의 조합을 포함하는, 조성물.
10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 플라본 또는 플라보노이드를 포함하는, 조성물.
11. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 또는 동물에서 B. 안트라시스 또는 C. 퍼프린젠스 또는 편모충 감염의 치료에 사용하기 위한 것인, 조성물.
12. 인간 또는 동물에서 박테리아 감염 치료용 항균제 또는 항박테리아제로서 테르미날리아 페르디난디아나 (T. ferdinandiana)의 추출물을 포함하는, 약제.
13. 제 12항에 있어서, 인간 또는 동물에서 B. 안트라시스 또는 C. 퍼프린젠스 또는 편모충 감염의 치료에 사용하기 위해 제공되는, 약제.
14. 인간 또는 동물에서 미생물 또는 박테리아 감염 치료용 약제에서 사용하기 위한 테르미날리아 페르디난디아나(T. ferdinandiana)의 추출물.
15. 제 14항에 있어서, 인간 또는 동물에서 B. 안트라시스 또는 C. 퍼프린젠스 또는 편모충 감염의 치료에 사용하기 위한, 추출물.
16. 인간 또는 동물에서 박테리아 감염 치료용 약제 또는 조성물의 제조에서 테르미날리아 페르디난디아나(T. ferdinandiana)의 추출물의 용도.
17. 제 16항에 있어서, 추출물은 T. 페르디난디아나 잎 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 용도.

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